KR20230021614A - 에스터기를 포함하는 신규 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

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유정수
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비세압히나브순닐
이웅희
김경원
임정은
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Abstract

본 발명은 에스터기를 포함하는 신규 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 체내 장기별 에스터라제의 활성 차이를 이용하여 종양에서의 우수한 시각화능을 발휘하는 신규 화합물 및 이의 암 진단 또는 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 화학식 1 내지 8의 신규 화합물은 구조 내 에스터 잔기로 인해 장기별 에스터라제 활성 차이에 따른 선택성을 나타내어, 췌장암 등을 시각하는데 매우 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

Description

에스터기를 포함하는 신규 화합물 및 이의 용도{Novel compounds comprising ester group and uses thereof}
본 발명은 에스터기를 포함하는 신규 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 체내 장기별 에스터라제의 활성 차이를 이용하여 종양에서의 우수한 시각화능을 발휘하는 신규 화합물 및 이의 암 진단 또는 치료 용도에 관한 것이다.
이상적인 종양 조영제는 주변 조직 및 장기의 배경 잡음 없이 종양만을 시각화해야 한다. 그러나 다른 장기에서 조영제 흡수를 억제하면서 선택적인 종양 표적화는 실제로 이루어지지 않았다. 최근에 다양한 나노입자는 높은 로딩 효능, 표적화 잔기로의 용이한 표면 변형, 넓은 약동학적 조절, 크기 및 형태의 용이한 제어와 같은 좋은 특성으로 인해 종양 흡수를 증가시키기 위해 광범위하게 연구되고 있다. 다양한 나노 플랫폼 중에서, 리포좀은 입증된 생체 적합성, 생분해성 및 낮은 독성으로 인해 임상적으로 성공을 거두었다. 그러나 현재 임상에서 진단 영상에 사용할 수 있는 리포좀 제제는 초음파 증강제로 사용되는 지질 코팅된 마이크로버블 외에는 없다.
간 및 비장과 같은 단핵 식세포계(MPS)의 기관으로 나노입자의 불가피한 높은 흡수로 인해 조영제 향상이 주로 방해를 받아왔다. 종양 흡수는 첨단 나노기술로 개선될 수 있지만, 종종 간 및 비자에서의 흡수가 종양에서의 흡수에 비해 상당히 높기 때문에 종양 대 배경의 비율, 특히, 종양 대 간 및 종양 대 비장 비율에서 약간의 향상이 달성되었을 뿐이다. 따라서, 최근의 연구는 종양 흡수를 증가시키는 대신 배경 노이즈를 감소시켜 고대비를 달성하는 데 중점을 두고 있다. 구체적으로, 나노입자 크기를 ~5 nm로 감소시켜 나노입자가 MPS 기관으로의 흡수를 최소화하면서 신장 시스템에 의해 효율적으로 여과되고 요로에서 빠르게 배설될 수 있도록 한다. Pretargeting imaging 전략 및 제거제(clearance agent)는 특히 혈액에서 배경 소음을 줄이는 데 성공적으로 적용되었다. 그러나 신장 클리어런스를 가속화하여 높은 종양 흡수에 필요한 혈액 순환 시간을 달성하지 못했다. 또한 두 전략 모두 까다로운 화학 물질과 두 번째 주입 단계가 필요하여 일상적인 임상 사용에 적용이 제한되었다. 따라서, 종양 흡수에 영향을 미치지 않으면서 배경 노이즈를 선택적으로 줄이는 것은 아직까지 만족할 만한 성과를 내지 못하고 있다.
한편, 췌장암은 여전히 생명을 위협하는 암으로 남아 있다. 약 10%에 달하는 5년 생존율은 지난 40년 동안 거의 증가하지 않은 반면, 다른 암의 생존율은 조기 발견과 최근 개발된 치료 도구로 인해 2배가 되었다. 췌장암은 조기 진단이 어렵다. 췌장은 복부 깊숙한 곳에 위치하고 다른 큰 장기로 둘러싸여 있기 때문이다. 크기가 1cm 미만인 췌장암은 기존의 초음파, CT 또는 MRI 영상으로는 거의 발견되지 않다. FDG-PET 핵 영상도 췌장암은 특이도가 낮기 때문에 췌장암 진단에 효율적이지 못하다.
본 발명에서는, 종양 및 MPS 기관에서 차등적으로 발현하는 에스테라제 활성을 활용하여 종양 대 배경 비율을 극적으로 향상시키는 이미징 전략을 제공하고자 에스터기를 구조 내에 포함하는 신규 방사성 화합물을 개발하였다. 이들 신규 방사성 화합물은 간, 비장 등 세망내피계와 비교하여 낮은 수준의 에스터라제 활성을 나타내는 췌장에서 특히 우수한 시각화능을 나타낸다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 신규 방사성 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure pat00001
[화학식 2]
Figure pat00002
[화학식 3]
Figure pat00003
[화학식 4]
Figure pat00004
[화학식 5]
Figure pat00005
[화학식 6]
Figure pat00006
[화학식 7]
Figure pat00007
[화학식 8]
Figure pat00008
(상기 화학식 1 내지 8에서,
X는 43Sc,　44Sc,　51Mn,　52Mn,　64Cu,　67Ga,　68Ga,　86Y,　89Zr,　94mTc,　99mTc,　111In,　152Tb,　155Tb,　201Tl,　203Pb,　18F,　76Br,　77Br,　123I,　124I 및　125I로 이루어진 군에서 선택된 진단 활성 방사성 동위원소; 또는 47Sc,　67Cu,　89Sr,　90Y,　153Sm,　149Tb,　161Tb,　177Lu,　186Re,　188Re,　212Pb,　213Bi,　223Ra,　225Ac,　226Th,　227Th,　131I 및 211At로 이루어진 군에서 선택된 치료 활성 방사성 동위원소이고,
k는 5 내지 30의 정수이다.)
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 지질을 포함하는 리포좀을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 또는 상기 리포좀을 포함하는 생체 내 영상화를 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 또는 상기 리포좀을 포함하는 암 진단용 조성물 및 암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 9 또는 10의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다:
[화학식 9]
Figure pat00009
[화학식 10]
Figure pat00010
(상기 화학식 9 및 10에서, 상기 k는 5 내지 30의 정수이다.)
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 신규 방사성 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00011
[화학식 2]
Figure pat00012
[화학식 3]
Figure pat00013
[화학식 4]
Figure pat00014
[화학식 5]
Figure pat00015
[화학식 6]
Figure pat00016
[화학식 7]
Figure pat00017
[화학식 8]
Figure pat00018
(상기 화학식 1 내지 8에서,
X는 43Sc,　44Sc,　51Mn,　52Mn,　64Cu,　67Ga,　68Ga,　86Y,　89Zr,　94mTc,　99mTc,　111In,　152Tb,　155Tb,　201Tl,　203Pb,　18F,　76Br,　77Br,　123I,　124I 및　125I로 이루어진 군에서 선택된 진단 활성 방사성 동위원소; 또는 47Sc,　67Cu,　89Sr,　90Y,　153Sm,　149Tb,　161Tb,　177Lu,　186Re,　188Re,　212Pb,　213Bi,　223Ra,　225Ac,　226Th,　227Th,　131I 및 211At로 이루어진 군에서 선택된 치료 활성 방사성 동위원소이고,
k는 5 내지 30의 정수이다.)
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화학식 1 내지 8의 화합물은 구조 내에 에스터기를 포함하고 있기 때문에 에스터라제 활성이 상대적으로 낮은 췌장암 조직 등에서 오랜 시간 잔류하여 안전하고 효과적으로 종양을 시각화할 수 있는 것으로 확인되었다.
상기 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로나 생리학적으로 허용되는 다양한 유기산 또는 무기산에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 적합한 유기산으로는, 예를 들면 카르복실산, 포스폰산, 술폰산, 아세트산, 프로피온산, 옥탄산, 데칸산, 글리콜산, 락트산, 푸마르산, 숙신산, 아디프산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 글루탐산, 아스파르트산, 말레산, 벤조산, 살리실산, 프탈산, 페닐아세트산, 벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 메틸황산, 에틸황산, 도데실황산 등을 사용할 수 있고, 적합한 무기산으로는, 예를 들면 염산, 황산 또는 인산 등을 사용할 수 있다.
상기 화학식 1 내지 8에 결합되어 있거나 배위결합 되어 있는 방사성 동위원소가 진단 활성 방사성 동위원소인 경우 상기 화합물들은 에스터라제 활성이 상대적으로 낮은 장기, 예를 들면 췌장에서의 질병을 진단하기 위한 영상화제로 활용이 될 수 있고, 상기 방사성 동위원소가 치료 활성 동위원소인 경우 상기 화합물들은 에스터라제 활성이 상대적으로 낮은 장기, 예를 들면 췌장에서의 질병을 치료하게 위한 치료제로서 활용이 될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 지질을 포함하는 리포좀을 제공한다.
본 발명에서 상기 지질은 상기 지질은 (a) 콜레스테롤(Cholesterol); (b) 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC); 및 (c) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000(DSPE-PEG2000)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 본 발명에서 상기 화학식 1 내지 8의 화합물은 리포좀의 인지질 이중층에 탑재되며 인지질과 직접적으로 결합(conjugate)된 것이 아니라는 점(즉, 본 발명의 조영제는 인지질과 비결합 형태로 리포좀 내에 포함됨)에서 다른 리포좀 시스템과 구별될 수 있다.
본 발명의 리포좀에 있어서, 리포좀은 운반체로서의 역할을 하고 실질적으로 리포좀에 탑재된 화학식 1 내지 8의 조영물질의 움직임이 종양진단에 있어서 더 중요한 역할을 하는 것으로, 종양조직에서는 본 발명의 리포좀 자체 또는 상기 리포좀으로부터 빠져나온 화학식 1 내지 8의 조영물질이 종양 조직내부에 축적되는 반면에 세망내피계(reticuloendothelial system)에서는 흡수된 리포좀으로부터 화학식 1 내지 8의 조영물질이 빠져나와 빠르게 체외로 배출되어지는 방식으로 작용하는 것을 특징으로 한다.
이러한 작용 방식을 부여하기 위해서는, 상기 화합물이 운반되는 시간동안 체내의 환경(특히, 혈액 운반 중)을 견딜 수 있도록 리포좀이 적절한 내구성을 유지할 것과, 목적 위치에서 리포좀으로부터 화합물이 방출되거나 또는 리포좀 자체가 분해 될 수 있도록 감응성을 가질 것 등이 요구되며, 이에 따라 본 발명에서 사용되는 화학식 1 내지 8의 화합물에 특이적으로 상기 작용 방식을 부여할 수 있는 특유의 지질 조성이 요구된다.
이에 본 발명은 상기 화학식 1 내지 8의 화합물에 이러한 체내 작용 방식을 부여할 수 있는 리포좀 조성으로서, (a) 콜레스테롤; (b) DPPC; 및 (c) DSPE-PEG2000의 지질로 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 지질 (a):(b):(c)는 1 : 5 내지 25 : 3 내지 15의 몰비로 이루어지는 것이 특징이며, 바람직하게는 1 : 8 내지 20 : 4 내지 13의 몰비로 이루어지는 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 1 : 10 내지 20 : 6 내지 10의 몰비로 이루어지는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 : 14 내지 18 : 6 내지 8의 몰비로 이루어지는 것일 수 있다.
상기 (a), (b) 및 (c)의 지질 조성을 가지는 본원 발명의 리포좀조영제는 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물의 세망내피계(reticuloendothelial system)에서 흡수 감소 및 종양에서 흡수 및 축적 증가를 특징으로 한다. 즉, RES 장기 대비 종양에서의 조영제 흡수율(Tumor-to-organ uptake ratio) 및 축적률(보유율)이 현저히 상승되었다. 즉, 본 발명에서 제공하는 특유의 지질 조성으로 화학식 1 내지 8의 조영물질을 탑재한 리포좀 시스템을 제작하는 경우 종양 특이적으로 상기 조영물질의 효율적 전달, 방출 및 축적이 가능함과 동시에 다른 조직에서의 배경 잡음(background noise)이 현저히 감소된다. 또한 본 발명의 리포좀은 PET을 이용한 촬영 시 화학식 1 내지 8의 화합물을 이용한 종양 이미지 수득 시간을 현저하게 단축할 수 있다.
한편, 본 발명의 리포좀을 구성하는 상기 지질 중 (c) DSPE-PEG2000은, 리포좀 내에 포함되는 전체 DSPE-PEG2000 중 일부가 엽산과 부착된 것일 수 있다.
즉, 본 발명의 리포좀은 지질 구성이 (a) 콜레스테롤(Cholesterol); (b) 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC); (c-1) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000(DSPE-PEG2000); ] (c-2) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000-엽산(DSPE-PEG2000-folate)로 이루어지는 것 일 수 있다.
이때 상기 지질 (a):(b):(c-1):(c-2)는 1 : 5 내지 25 : 2 내지 8 : 1 내지 7의 몰비로 이루어지는 것이 특징이며, 바람직하게는 1 : 8 내지 20 : 3 내지 8 : 1 내지 5의 몰비로 이루어지는 것 일 수 있으며, 더 바람직하게는 1 : 10 내지 20 : 4 내지 6 : 1 내지 4의 몰비로 이루어지는 것 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 : 14 내지 18 : 4 내지 6 : 1 내지 3의 몰비로 이루어지는 것 일 수 있다.
상기 (a), (b), (c-1) 및 (c-2)의 지질 조성을 가지는 본원 발명의 리포좀은 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물의 세망내피계(reticuloendothelial system)에서 흡수(축적) 감소 및 엽산수용체 과발현 종양에서 흡수(축적) 증가를 특징으로 한다.
상기 엽산수용체 과발현 종양은 췌장암, 유방암, 난소암, 폐암, 자궁경부암, 대장암, 흑색종, 신장암, 뇌종양, 골수성 백혈병 및 두경부암으로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게 본 발명에서 종양 또는 암은 췌장암, 유방암, 대장암, 난소암, 자궁경부암, 흑색종을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명의 지질 시스템은 다른 종양보다도 특히 췌장암, 유방암, 난소암, 대장암, 자궁경부암, 흑색종이 가지는 특유의 조직적 특성에 따라 진단적 가치가 높다.
본 발명의 리포좀은 화학식 1 내지 8의 화합물을 이미징(imaging) 또는 영상화 할 수 있는 수단이라면 그 용도가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 광학적 이미지 촬영용, 양전자 단층촬영(PET)용, 또는 단일광자 단층촬영(SPECT)용으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 또는 상기 리포좀을 포함하는 생체 내 영상화를 위한 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 화합물 또는 리포좀은 전신적으로 또는 국소적으로 이미징되는 종양, 기관 또는 조직에 투여될 수 있다. 일반적으로, 상기 화합물 또는 리포좀은 종양, 조직 또는 기관의 원하는 광학 이미지를 달성하는데 효과적인 용량으로 투여된다. 이러한 용량은 이미징 방법을 받는 종양, 조직 또는 기관, 사용된 이미징 장치 등에 의존하여 매우 광범위할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 상기 화합물 또는 리포좀은, 제한되는 것은 아니지만, 종양의 이미징, 기관의 단층촬영 이미징, 기관 기능의 모니터링, 관상 동맥 혈관 촬영법, 형광 내시경 검사법, 레이저 가이드 수술, 광청각 및 음형광 방법 등을 포함하는 다양한 생의학적 용도에서 조직 및 기관들의 생체내 광학적 이미징 작용물질로서 사용된다.
이미징 방법의 예는 자기공명이미징(MRI), MR 분광기, 방사선 사진법, CT, 초음파, 평면 감마 카메라 이미징, 단일 광자 방출 단층 촬영(SPECT), 양전자 방사 단층 촬영, 다른 핵의학 기반 이미징, 가시광선을 사용하는 광학적 이미징, 루시퍼라제를 사용하는 광학적 이미징, 형광단을 사용하는 광학 이미징, 다른 광학 이미징, 근적외선을 사용하는 이미징 또는 적외선을 사용하는 이미징을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 구체예는 피험자에서 외과적 방법 동안 조직을 이미징하는 단계를 추가로 포함한다.
이미징을 위한 다양한 기술은 당업자에게 알려져 있다. 임의의 이런 기술은 검출 가능한 표지로부터 신호를 측정하는 본 발명의 이미징 방법에 적용될 수 있다. 예로서, 광학적 이미징은 특정 의학 영역에서 광범위하게 허용되는 하나의 이미징 양상이다. 예는 세포 성분의 광학적 표지화 및 플루오레세인 혈관조영법(fluorescein angiography), 형광안저혈관조영술(indocyanine green angiography)과 같은 혈관 조영술을 포함한다.
세포 생존력과 같은 세포 수준의 정보에 속하는 정보를 제공하는 이미징 양상은 양전자 방출 단층 촬영(positron emission tomography : PET) 및 단일 광자 방출 계산된 단층촬영(single-photon emission computed tomography : SPECT)을 포함한다. PET에서, 환자는 물질이 신체를 통해 이동함에 따라 모니터링 될 수 있는 양성자들을 방출하는 방사성 물질을 흡수하거나 또는 그것과 함께 주입된다.
단일 광자 방출 계산된 단층 촬영 또는 SPECT가 PET와 밀접하게 관련되어 있다. 2가지의 주된 차이점은 양성자를 방출하는 물질 대신 SPECT는 고에너지 광자를 방출하는 방사성 추적자를 사용한다는 것이다.
PET에 대해, 통상적으로　11C,　13N,　15O,　18F,　82Rb,　62Cu 및　68Ga과 같은 양성자 방출자가 표지된 화합물이 이용될 수 있다. SPECT에 대해 상기 화합물은　99mTc,　201Tl,　67Ga 및　111In과 같은 양성자 방출자로 표지될 수 있다.
동물 및 인간의 비침입성 형광 이미징은 또한 생체내 진단적 정보를 제공하며, 매우 다양한 임상적 전문 분야에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 형광단의 UV 여기에 이어 진보된 장치를 사용하는 복잡한 분광학적 이미징(예를 들어, 문헌[Andersson-Engels et al, 1997]을 참조)에 이르기까지 단순한 관찰을 포함하는 기술들이 수년에 걸쳐 개발되었다. 예를 들어, 형광단 또는 형광 단백질의 생체 내 검출을 위해 당업계에 알려진 특정 장치 또는 방법은, 제한되는 것은 아니지만, 생체 내 근적위선 형광법, 생체 내 형광 이미징 시스템, 플라잉 스팟 스캐너 등을 포함한다.
광학 반응을 검출하는 다른 방법 또는 장치는, 제한 없이, 시각적 관찰, CCD 카메라, 비디오 카메라, 사진 필름, 레이저 스캐닝 장치, 형광계, 감광성 반도체 소자, 양자 계측기, 형광외 현미경, 주사형 현미경, 유세포분석기, 형광 미세 혈소판 판독기, 또는 광전자 증배관을 이용하는 신호 증폭을 포함한다.
일 양상에 따른 화합물은 신규하며, 다른 양상에 따른 상기 화합물, 상기 리포좀 또는 이들을 포함하는 조성물의 경우, 생체 내에서 방사능 동위원소를 이용하여 생체 내 뚜렷한 영상을 만들 수 있으며, 이를 통한 질병 진단이 가능한 효과가 있다. 나아가, 상기 화합물을 이용한 선표적 영상 기법을 수행하는 경우, 백그라운드 신호 없이 깨끗하게 종양만 나타난 영상을 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 또는 상기 리포좀을 포함하는 암 진단용 조성물 및 암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 화합물이 치료진단 방법에 사용되는 것이 또한 본 발명의 범위에 속한다. 진단학의 개념은 치료제를 치료 약물의 임상 용도를 증가시킬 수 있는 상응하는 진단 시험과 합하는 것이다. 진단학의 개념은 점점 더 매력적이며, 의사가 주어진 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 환자를 확인하고 따라서 불필요한 치료를 피하는 것을 돕는 것에 의해 약물 치료의 효율을 개선시키는 핵심으로 널리 간주된다.
진단학의 개념은 의사가 주어진 요법으로부터 가장 이익을 얻을 환자를 식별하는 것을 가능하게 하는 진단 시험과 치료제를 합하는 것이다. 한 실시양태에서 및 본원에 바람직하게 사용된 본 발명의 화합물은 환자의 진단, 즉 원발성 종양 덩어리뿐만 아니라 잠재적 국부 및 원격 전이의 확인 및 국재화에 사용된다. 또한, 종양 부피는 특히 3차원 진단 양식, 예컨대 SPECT 또는 PET를 이용하여 측정될 수 있다. 주어진 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 환자만이 특정한 요법을 위해 선택되고, 이로 인해 불필요한 치료는 회피된다. 한 특정 실시양태에서, 화학적으로 동일한 종양-표적화 진단제, 바람직하게는 섬광조영술, PET 또는 SPECT 및 방사선치료제에 대한 영상화 진단제가 적용된다. 이러한 화합물은 단지 방사성 핵종에서만 상이하고, 따라서 통상적으로 동일하지 않더라도 매우 유사한 약동학적 프로파일을 갖는다. 이는 킬레이트화제 및 진단용 또는 치료용 방사성금속을 사용하여 실현될 수 있다. 대안적으로, 이는 진단 또는 치료 방사성핵종을 사용한 방사성표지 및 방사성표지를 위한 전구체를 사용하여 실현될 수 있다. 한 실시양태에서, 진단 영상화는 바람직하게는 진단 방사성핵종의 방사선의 정량화 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 후속 선량측정 및 취약성 부작용 기관과 비교한 종양에서의 약물 농도의 예측에 의해 사용된다. 따라서, 환자에 대한 진정으로 개별화된 약물 투여 요법이 달성된다.
한 실시양태에서 및 본원에 바람직하게 사용된 치료진단 방법은 진단상 검출가능한 방사선 (예를 들어, 양전자 또는 감마선) 뿐만 아니라 치료상 유효한 방사선 (예를 들어, 전자 또는 알파 입자)을 방출하는 방사성 핵종으로 표지된 본 발명의 화합물과 같은 단지 1종의 치료 활성 화합물로 실현될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 융합 단백질 외에 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 물질을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 비강내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 “경피 투여”는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 암 예방 또는 치료하는 효과가 있는 공지의 물질과 병용하여 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1 내지 8의 신규 화합물은 구조 내 에스터 잔기로 인해 장기별 에스터라제 활성 차이에 따른 선택성을 나타내어, 췌장암 등을 시각하는데 매우 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 방사성 화합물 및 이를 포함하는 리포좀의 구조(a), 방사성 화합물의 합성법(b), 방사성 화합물의 radio-TLC 프로파일(c), [131I]HIB-리포좀 ([131I]L1)의 직경 측정 결과(d), 및 HIB-리포좀(L1)의 Cryo-TEM 이미지(e)를 나타낸 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 제조한 방사성 화합물들의 종양 흡수 및 체내 배출을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 방사성 화합물들의 대사 연구 수행 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 엽산-접합된 [124/131I]HIB-liposome (L4)를 췌장암 세포가 이식된 xenograft 동물모델에 투여한 후 체내 동태를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 64Cu-DOTA-Benzene-HIB의 생체 내 배출 속도를 알아보기 위하여 마우스에 64Cu-DOTA-Benzene-HIB를 주입하고 7시간 후 체내분포를 확인한 결과이다.
도 6은 64Cu-DOTA-Benzene-HIB 주입하고, 3.5 시간과 7시간을 PET/CT 이미징을 수행한 결과이다.
도 7은 64Cu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome을 CT26 종양세포가 이식된 xenograft 마우스 모델에 주입한 후 종양 uptake를 확인한 결과이다.
도 8은 64Cu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome을 CT26 종양세포가 이식된 xenograft 마우스 모델에 주입하고, 16시간을 뒤 PET/CT 이미징을 수행한 결과이다.
도 9는 177Lu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome의 생체 내 배출 속도를 알아보기 위해서 마우스에 64Cu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome을 주입하고 24시간 뒤 생체분포를 확인한 결과이다.
도 10은 177Lu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome의 종양 uptake를 확인하기 위하여 177Lu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome를 종양 마우스 모델에 주입하고 24시간 뒤 생체분포를 확인한 결과이다.
도 11 내지 도 13은 131I-HIB-sulfate-Liposome의 종양 uptake를 확인하기 위하여 종양 마우스 모델에 131I-HIB-sulfate-Liposome를 주입하고 24시간 뒤 생체분포를 확인한 결과이다.
도 14는 131I-nido-Carborane-HIB의 생체 내 배출 속도를 알아보기 위해서 마우스에 131I-nido-Carborane-HIB를 주입하고 24시간 뒤 생체분포를 확인한 결과이다.
도 15는 131I-nido-Carborane-HIB의 생체 내 배출 과정을 PET/CT 분석을 통해 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
I. 실시예 1
실험방법
1. IPH (4-iodophenyl heptadecanoate)의 합성
디클로로메탄(20mL) 중 p-요오도페놀(176mg, 0.83mmol) 및 헵타데칸산(270mg, 0.91mmol)의 혼합물을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)(174mg, alc 0.91mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)(121mg, 1mmol)에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. IPH의 형성은 TLC(실리카 TLC, 헥산/EtOAc 20:1)로 확인하였다. 이어서, 반응 혼합물을 물로 세척하고, 수집된 유기 층을 MgSO4로 건조시키고 증발 건조시켰다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 IPH를 백색 고체로서 수득하였다(276 mg, 73%).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3 H), 1.21-1.41 (m, 26 H), 1.70-1.77 (m, 2 H), 2.53 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 6.84 (d, J = 10 Hz, 2 H), 7.67 (d, J = 9.6 Hz, 2 H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 14.1, 22.7, 24.9, 29.1, 29.2, 29.4, 29.5, 29.59, 29.64, 29.67, 29.68, 29.70, 31.9, 34.3, 89.7, 123.8, 124.1, 138.4, 150.6, 171.9; HRMS (FAB): m/z calcd. for C23H38IO2 [M+H]+: 473.1916; found: 473.0576.
2. 4-(tributylstannyl)phenyl heptadecanoate의 합성
헥사부틸디틴(0.38g, 0.66mmol)과 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(2.6mg)을 무수 톨루엔(10mL)에 녹인 IPH(0.21g, 0.44mmol)의 교반 용액에 차례로 첨가하고, 혼합물을 16시간 동안 환류시켰다. 그 다음, 흑색 혼합물을 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 톨루엔을 진공에서 증발시키고 생성된 흑색 오일을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 4-(트리부틸스타닐)페닐 헵타데카노에이트를 무색 오일(178 mg, 63% 수율)로 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 0.89-1.00 (m, 20 H), 1.28-1.39 (m, 32 H), 1.48-1.67 (m, 6 H), 2.38 (m, 2 H), 6.64 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 7.53 (d, J = 8.5 Hz, 2 H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 13.7, 14.1, 22.7, 25.7, 27.5, 29.37, 29.42, 29.6, 29.70, 29.71, 30.6, 31.9, 32.7, 117.9, 122.3, 138.4, 155.8, 170.6; HRMS (FAB): m/z calcd. for C35H64O2Sn [M+H]+: 637.4007; found: 637.4027.
3. 4-(tributylstannyl)phenyl heptadecanoate)의 합성
N,N-디메틸포름아미드(5mL) 중 p-요오도페놀(161mg, 0.74mmol) 및 1-요오도헥사데칸(312mg, 0.89mmol)의 혼합물을 K2CO3(126mg, 1mmol)에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. HIB-에테르의 형성은 TLC(실리카 TLC, 헥산/EtOAc 20:1)에 의해 확인되었다. 이어서, 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 여과하고, 진공에서 증발시키고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 수집하고, MgSO4로 건조하고, 증발 건조시켰다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 HIB-에테르를 백색 고체로서 52% 수율(169 mg)로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3 H), 1.20-1.46 (m, 26 H), 1.72-1.78 (m, 2 H), 3.88 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 6.64 (d, J = 10 Hz, 2 H), 7.51 (d, J = 10 Hz, 2 H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 14.1, 22.5, 26.0, 29.2, 29.4, 29.58, 29.61, 29.68, 29.72, 31.9, 68.0, 82.4, 116.9, 138.1, 159.0; HRMS (FAB): m/z calcd. for C22H37IO [M+Na]+ 467.1787; found 467.1755.
4. tributyl(4-(hexadecyloxy)phenyl)stannane의 합성
헥사부틸디틴(0.25g, 0.44mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(1.2mg)을 무수 톨루엔(10mL) 중 1-(헥사데실옥시)-4-요오도벤젠(0.13g, 0.29mmol)의 교반 용액에 순차적으로 첨가하고, 혼합물을 16시간 동안 환류시켰다. 그 다음, 흑색 혼합물을 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 톨루엔을 진공에서 제거하고 생성된 흑색 오일을 컬럼 크로마토그래피(실리카 TLC, 헥산/EtOAc 20:1)로 정제하여 무색 오일로서 트리부틸(4-(헥사데실옥시)페닐)스탄난을 수득하였다(103 mg, 58% 수율) .
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 0.90-1.00 (m, 21 H), 1.28-1.36 (m, 34 H), 1.48-1.07 (m, 3 H), 3.69 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 6.64 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 7.52 (d, J = 8.5 Hz, 2 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 13.7, 14.1, 22.7, 25.7, 29.0, 29.3, 29.37, 29.44, 29.6, 29.66, 29.67, 29.70, 30.6, 31.9, 32.8, 63.1, 115.4, 118.2, 139.7, 160.0; HRMS (FAB): m/z calcd. for C34H64OSn [M+Na]+: 631.3877; found: 631.3285
5. [ 124/131 I]HIB (1), [ 124/131 I]IPH (2), or [ 124/131 I]HIB-ether (3)의 합성
100 μg의 헥사데실-4-트리부틸스탄닐벤조에이트, 4-(트리부틸스탄닐)페닐 헵타데카노에이트 또는 트리부틸(4-(헥사데실옥시)페닐)스탄난 용액을 1 N HCl, [124/131I]NaI(18.5- 185MBq), 3% H2O2. 70℃에서 30분간 교반한 후, NaHSO3로 반응을 종결시켰다. 반응 용매 및 유리 방사성요오드를 60℃에서 진공에서 제거하였다. 그 후, 방사성 표지된 [124/131I]HIB(1), [124/131I]IPH(2) 또는 [124/131I]HIB-에테르(3)를 아세토니트릴로 추출하고 진공에서 증발 건조시켰다. 정제된 방사성 추적자(1-3)는 다음 리포좀 제조를 위해 클로로포름에서 재구성되었으며, 방사성 TLC 이미징 스캐너(AR- 2000, Bioscan, 미국)를 이용하여 방사성화학 순도를 분석하였다.
6. 방사성 추적자가 탑재된 리포좀의 제조(L1-L4)
리포좀 성분을 최적화하고 종양 흡수의 선택성을 증가시키기 위해, 상이한 DPPC, DPPG, 콜레스테롤 및 DSPE-mPEG2000 몰비로 구성된 리포좀 조성물을 클로로포름에서 제조하였다. 방사성 추적자가 장착된 리포좀은 이전 방법에 따라 제조되었다.
간략하게, [124/131I]HIB(1)를 둥근 바닥 플라스크에서 리포좀 성분과 혼합한 다음 20분 동안 진공에서 증발시켜 지질 박막을 형성했다. 이후, 지질의 전이 온도에서 20분 동안 인산완충식염수(PBS; 1 mL)로 처리하여 지질막을 수화시켰다. 그런 다음, ~1mL의 지질 분산액을 미니 압출기(Avanti Polar lipids, USA)에 의해 다양한 기공 크기(1000, 400, 200 및 100nm)를 갖는 폴리카보네이트 멤브레인 필터(Whatman, Kent, UK)를 통해 21회 압출했다. 합성된 리포좀을 원심 여과(YM-100, Millipore, St. Louis, MO, USA)에 의해 정제하고 농축시켰다. [124/131I]HIB-리포좀(L1), [124/131I]IPH-리포좀(L2) 및 [124/131I]HIB-에테르-리포좀(L3) 제조를 위한 DPPC(587μg, 0.8μmol), 콜레스테롤(19μg, 0.05μmol) 및 DSPE-mPEG2000(977μg, 0.35μmol)의 몰비는 16:1:7이었다.
췌장암 영상을 위한 엽산 결합 [124/131I]HIB-리포좀은 DPPC와 콜레스테롤의 몰비를 바꾸지 않고 DSPE-mPEG2000을 DSPE-mPEG2000-엽산으로 부분적으로 대체하여 제조했다.
L4의 최적 리포좀 조성은 587 μg의 DPPC(0.8 μmol), 19 μg의 콜레스테롤(0.05 μmol), 698 μg의 DSPE-mPEG2000(0.25 μmol), 323 μg의 DSPE-mPEG2000-엽산(0.1μmol)에 해당하는 16:1:5:2였다.
7. 세포 배양 및 동물
쥐 결장직장암 CT26 세포는 ATCC에서 권장하는 대로 37°C, 5% CO2에서 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 두 개의 인간 췌장암 세포주, 즉 PANC-1(FR+) 및 MIA PaCa-2(FR-)(FR: 엽산 수용체)를 사용했다. 모든 동물 실험은 경북대학교 동물윤리위원회 규정(승인번호 2014-0154, 2017-0096, 2020-0079)에 따라 진행되었다. BALB/c 마우스(수컷, 5주, 16-20g)는 효창사이언스(대구, 한국)에서 구입했으며 BALB/c 누드 마우스(수컷, 5주, 16-19g)는 오리엔트 바이오(성남, 한국)에서 구입하였다. 모든 동물은 충분한 물과 상업용 사료 공급 하에 12시간 주야간 주기 동안 20-24°C에서 유지되었다.
8. 종양 마우스 모델
CT26 세포(5 Х 106 세포/마우스)를 BALB/c 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양의 직경이 ~6-8mm(접종 후 12일)에 도달하면 CT26 종양 모델이 생체 내 연구에 사용되었다. 췌장암 세포에서 FR 발현 정도에 따른 L4의 표적화 능력을 평가하기 위해 PANC-1(FR+) 및 MIA PaCa-2(FR-) 세포(각각 5 Х 106) 각각을 BALB/c 누드 마우스의 좌우 측면에 접종하였다. 양측 종양의 직경이 4-6mm에 도달했을 때 췌장 이종이식 모델은 양전자 방출 단층 촬영(PET) 영상을 받았다.
PANC-1 및 MIA PaCa-2 세포는 또한 생체 분포 연구를 위한 종양 함유 이종이식 모델을 확립하기 위해 마우스 오른쪽 옆구리에만 별도로 접종되었다(5 Х 106 세포/마우스). 동소성 췌장 종양 모델은 BALB/c 누드 마우스의 췌장 꼬리에 PANC-1/Luc+ 세포(50 μL DMEM 배지에서 1 x 106 세포)를 접종하여 준비했다. 접종 후 13일에 생물발광 IVIS Lumina-XR(PerkinElmer, Waltham, USA)을 사용하여 D-루시페린(60mg/kg)을 사용한 영상화를 수행하여 종양의 확립을 확인했다.
9. 전체 제거율(Whole body clearance)
L1, L2 및 L3의 제거율을 정량적으로 모니터링하기 위해 CT26 종양이 있는 BALB/c 마우스에 각 리포좀(6.7-9.3MBq/마우스)을 정맥 주사했다. 전신 방사능은 10분, 20분, 30분, 45분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간 및 24시간에 선량 교정기(CRC-25R, Capintec, Ramsey, NJ, USA)를 사용하여 측정되었다.
10. 대사 연구
시험관내 대사 연구는 PBS 중 돼지 간 에스테라제의 25U/mL 용액을 사용하여 수행되었다. [131I]HIB(1), [131I]IPH(2) 또는 [131I]HIB-에테르(3)(각각 3.7MBq)도 10% DMSO가 포함된 PBS에 용해되었다. 그런 다음 Esterase(2.5U)를 각 방사성 추적자 용액에 첨가하고 용액을 37°C에서 부드럽게 흔들었다. 각 방사성 추적자의 가수분해 속도는 1분, 5분, 10분, 1시간, 2시간, 4시간, 16시간 및 24시간에 radio-TLC(실리카 TLC, Hexane/EtOAc 20:1)로 측정되었다.
마우스 간 S9 분획 및 마이크로솜을 사용한 시험관 내 대사 연구의 경우, 방사성 추적자 1-3(3.7 MBq)을 10% DMSO가 포함된 PBS에 용해시키고 마우스 간 S9 분획(10 μL 중 0.2 mg) 또는 마이크로솜(0.2 mg)과 혼합했다. NADPH(0.25mM)로 10 μL). 반응은 37℃에서 550rpm으로 진탕시키면서 수행하였다. 각 방사성 추적자의 가수분해 속도는 최대 24시간 동안 radio-TLC로 측정되었다.
CT26 종양 모델에서 수집한 마우스 조직의 균질액을 사용하여 다른 기관에서 조사된 방사성 추적자의 절단 속도를 결정하기 위한 생체 외 연구를 수행했다. 간, 비장 및 종양 조직을 수집하고 무게를 측정했다. 1:1(w/w)의 비율로 빙냉 PBS 용액을 첨가한 후, 조직을 빙냉 조건에서 균질화기(Ultra-Turrax, IKA, Selangor, Malaysia)로 균질화하였다. 그런 다음 조 균질액을 2,000g에서 원심분리하고 침전물을 버렸다. 조직 균질액이라고 하는 각 상청액(300μL)을 10% DMSO가 포함된 PBS에 용해된 각 방사성 추적자(3.7MBq)와 즉시 혼합했다. 그 다음, 반응은 37℃에서 550rpm으로 진탕시키면서 수행되었고, 각 방사성 추적자의 가수분해 속도는 최대 24시간 동안 radio-TLC에 의해 측정되었다. 방사성 대사 산물의 소변 및 대변 배설을 분석하기 위해 [131I]HIB-리포좀([131I]L1)(10% DMSO가 포함된 200 μL PBS에서 17-21 MBq)을 정상 BALB/c 마우스(n = 6) 대사 케이지(2마리의 마우스/케이지)에 보관되었다. 소변 및 대변 샘플은 주사 후 0.5, 1, 2, 4, 8, 16 및 24시간에 별도로 수집되었고, 이들의 방사능은 용량 교정기(CRC-Ultra; Capintec, Florham Park, NJ, USA)로 측정되었다. 채취한 시료 중 방사능이 가장 높은 [131I]L1 주입 3시간 후 채취한 소변 시료를 이용하여 [131I]HIB 대사산물을 radio-TLC(silica TLC, dichloromethane/acetic acid 9 :1) 그것의 radio-TLC 피크를 유리 I-131 및 4-[131I]요오도벤조산과 비교한다. [131I]HIB(200μL 아세토니트릴 중 3.7MBq)를 90°C에서 3시간 동안 1M NaOH(200μL)로 처리하여 [131I]HIB를 4-[131I]요오도벤조산(3.3MBq)으로 가수분해했다. 동일한 소변 샘플을 HPLC[Luna C8 컬럼(4.6 Х 50mm, 5μm), 0.1% TFA/H2O(용매 A) 및 0.1% TFA/아세토니트릴(용매 B)]로 10- 5분 동안 100% B, 27분 동안 10% B, 1mL/min의 유속으로 최대 45분 동안 계속되었다.
10. 생체분포 연구
CT26 종양이 있는 BALB/c 마우스를 사용하여 [131I]HIB-리포좀(L1), [131I]IPH-리포좀(L2) 및 [131I]HIB-에테르-리포좀(L3)의 생체 분포를 비교했다. 3개의 리포좀을 꼬리 정맥(0.5-0.8 MBq/마우스)을 통해 CT26 종양 모델에 정맥내 주사하고, 종양 보유 마우스를 O2 중 1-2% 이소플루란으로 마취하고 1, 4 및 24시간 후 안락사시켰다. 그런 다음 장기 조직을 수집하고 즉시 무게를 재고 γ-카운터(Wallach, Turku, Finland)에서 측정했다. 생체 분포 데이터는 그램당 주사된 용량의 백분율(%ID/g)로 표시되었다.
엽산-[131I]HIB-리포좀(L4)의 생체 분포를 결정하기 위해 PANC-1(FR+) 또는 MIA PaCa-2(FR-)가 있는 췌장 이종이식 모델의 꼬리 정맥에 0.5-1.0 MBq/마우스로 정맥 주사했다. 주사 후 24시간에 마우스를 마취 하에 안락사시키고, 기관 및 조직을 수집하고, 즉시 체중을 측정하고, γ-카운터에서 측정하였다. 주입 후 1, 4 및 24시간에 동소성 췌장 종양 모델에서 L4(0.5-1.0 MBq)의 생체 분포가 동일한 과정에 따라 평가되었다.
11. 동물 이미징
CT26 종양 모델에서 [124I]L1-L3의 PET 이미지는 Inveon Acquisition Workplace 소프트웨어(버전 1.5)를 사용하여 Inveon PET/CT 스캐너(Siemens, Knoxville, USA)로 얻었다. 이미징 매개변수는 다음과 같다. 검출기 픽셀 간격, 1.6 Х 1.6 mm2; 시야, 10 Х 12.7 cm(축방향 Х 축방향); γ선 에너지 창, 350-650keV. PET 이미지는 OSEM3D/MAP(ordered-subsets Expectation maximization 3D maximum a posteriori) 알고리즘을 사용하여 재구성한 다음 Inveon Research Workplace 4.0을 사용하여 의학에서 디지털 이미징 및 통신 형식으로 변환했다.
마지막으로 Mediso InterView Fusion 소프트웨어 패키지를 사용하여 PET 이미지를 분석했다. PET 이미지의 방사능은 표준화된 섭취 값으로 보정되었다. 다른 모든 PET/CT 이미지는 다음 이미징 매개변수를 사용하여 nanoScan PET/CT 스캐너(PET 82S, Mediso, Budapest, Hungary)로 얻었다. 검출기 픽셀 간격, 0.9 Х 0.9 mm2; 시야, 8 Х 10 cm(축 방향 Х 축 방향); 5ns 일치 창이 있는 15 일치 모드; γ선 에너지 창, 400-600keV. PET 스캐닝은 주입 후 1시간 및 4시간에 20분 동안 수행되었지만 주입 후 24시간에 이미지의 경우 스캐닝 시간이 45분으로 증가했다.
PET 스캐닝 동안 마우스를 O2에 1-2% 이소플루란으로 마취하고 엎드린 자세로 설정했다. CT 스캔은 해부학적 참조를 얻고 PET 이미지의 감쇠를 보정하기 위해 ~10분 동안 조영제 없이 수행되었다. 그런 다음 상호 작용 깊이, 방사성 핵종 붕괴, 검출기 정규화, 수정 불감 시간 및 감쇠에 대한 수정이 포함된 Mediso Tera-Tomo 3D 반복 알고리즘을 사용하여 3개의 하위 집합으로 4회 반복하여 PET 이미지를 1-3 일치 모드로 재구성했다. PET 및 CT 이미지는 Mediso InterView Fusion 소프트웨어 패키지를 사용하여 자동으로 공동 등록 및 분석되었다. PET 이미지의 방사능은 표준화된 섭취 값으로 보정되었다.
[124I]L1-L3의 종양 표적화 및 제거 패턴을 비교하기 위해 CT26 종양 모델에 3개의 다른 리포좀(6.7-9.3MBq/마우스)을 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하고 PET 이미지를 주사 후 1, 4 및 24시간에 얻었다. [124I]HIB(10% DMSO가 포함된 200μL PBS 중 7.4MBq) 및 4-[124I]요오도벤조산(200μL PBS 중 7.4MBq)도 CT26 종양 모델에 정맥 주사하고 종양을 표적으로 삼는 그들의 빠른 제거 및 무력화를 확인하고자 해당 PET 이미지를 주사 후 1, 4 및 24시간에 기록되었다.
PANC-1(FR+) 및 MIA PaCa-2(FR-) 종양을 모두 포함하는 췌장 이종이식 모델의 PET/CT 영상화를 위해, 마우스는 주사 후 24시간에 양쪽 종양의 직경이 4-6mm에 도달했을 때 [124I]L4(200μL PBS에서 6.7-9.3MBq)로 영상화되었다.
동소성 췌장 종양 모델에서 종양의 확립은 D-루시페린(60 mg/kg)을 사용한 생물발광 영상으로 췌장 꼬리에 PANC-1/Luc+ 세포를 접종한 후 13일째에 확인되었다. 다음날, [18F]FDG-PET/CT(FDG: fluorodeoxyglucose) 이미징을 주사(7.4MBq/마우스) 후 1시간에 20분 동안 수행했다. [18F]FDG 영상화 2일 후, [124I]L4(200μL PBS 중 6.3-9.3MBq)를 동일한 마우스의 꼬리 정맥에 투여하고 1, 4 및 24시간 후 PET/CT 영상을 획득했다.
주입 후 24시간에 PET 영상화 직후, 방사성 신호의 정확한 위치를 시각적으로 확인하기 위해 개방 복부 조건에서 IVIS Lumina-XR(PerkinElmer, Waltham, USA)을 사용하여 Cerenkov 발광 이미지를 획득했다. Cerenkov 발광 신호는 여기가 없고 다음 조건에서 생물 발광 채널에서 획득되었다. 개방 방출 필터; 노출 시간, 5분; 비닝, 중간: 8; 시야, D(22.5 Х 22.5cm); f/stop, 1. 리빙 이미지 소프트웨어로 이미지를 정량적으로 분석했다.
동소성 췌장 종양의 PET, Cerenkov 발광 및 생물 발광 신호 간의 일관성을 확인하기 위해 D-루시페린(60 mg/kg)의 복강 내 주사 후 10분 후에 생물 발광 이미지도 획득했다. 생물발광 영상화 조건은 다음과 같았다: 개방 방출 필터; 노출 시간, 10초; 비닝, 배지 8; 시야, D(22.5 Х 22.5cm); f/stop, 1.
생물발광 영상화 후, 마우스를 즉시 희생시키고 동일한 조건에서 생체외 생물발광 영상화를 위해 조직을 절제하였다. I-131은 또한 다중 핀홀 시준기로 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT) 이미지를 획득하는 데 사용되었다. 주입 후 24시간에 동소성 췌장 종양 모델 및 NuclineTM 소프트웨어를 사용하여 100분 동안 4개의 헤드 NanoSPECT/CT 스캐너(Mediso, Budapest, 헝가리)로 SPECT 이미지를 획득했다. 이미징 매개변수는 다음과 같다. 등방성 복셀 크기, 100μm; 10핀홀 마우스 뇌 구멍; 핀홀 직경, 1.0mm; 24개 예상; 축 방향 시야, 20.9mm. 획득한 SPECT 이미지는 InterView?? Fusion 소프트웨어로 재구성되었으며, 스캔하는 동안 동물을 이소플루란(O2 중 1-2%)으로 마취하여 CT 이미지를 얻었으며, 이는 SPECT 이미지와 자동으로 공동 등록되었다.
실험결과
높은 신호 대 노이즈 비율은 질병 진단을 용이하게 하고 모든 영상 모드에서 오판 가능성을 최소화한다. 이론상으로 신호 대 노이즈 비율은 표적에 대한 선택적 전달을 향상시키고 배경에서는 감소시킴으로서 증가될 수 있다. 종양 이미징의 경우 20-200 nm의 다양한 나노 입자가 열악한 종양 신생혈관에서 향상된 투과성 및 유지(EPR) 효과로 인해 좋은 종양 흡수를 나타냈다. 수동 EPR 효과 외에도 나노 입자의 표적화 능력은 나노 입자 표면에 종양 특이적 생체 분자를 부착하여 더욱 증가해왔다. 그러나 이러한 전략을 사용하여 종양 신호를 증가시킬 수 있지만 주변 장기에서 영상 제제의 동반 흡수는 피할 수 없는 배경 노이즈를 생성한다. 특히 주입된 나노입자는 극히 일부만이 종양에 전달되었고 대부분은 간과 비장에 갇혀 있다. 최근 메타분석에서도 주입된 나노입자의 1% 미만이 종양에 도달하는 것으로 나타났다. 반면 99%는 단핵 식세포 및 신장 시스템에 의해 흡수 및/또는 제거된다. 간은 주입된 나노 물질의 최대 70%를 격리한다.
본 발명자는 종양 및 기타 기관에서 방사성 추적자의 차등 제거의 기본 메커니즘을 설명하기 위해 연구를 계속했다.
본 발명자는 먼저 리포좀 성분 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DPPC), 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho(1'-rac-글리세롤)(DPPG), 콜레스테롤 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-mPEG2000)의 비율을 체계적으로 변경하여 선택적 종양 흡수를 추가로 증가시키려고 시도했다(도 1a).
종양에서 그램당 주사된 용량의 백분율(%ID/g)을 비교하면 리포좀 성분 비율이 종양 흡수에 유의하게 영향을 미치는 것으로 나타났는데, 그 비율은 0.11 ± 0.08 ~ 3.97 ± 0.27 %ID/g 범위인 것으로 확인되었다. 특히 음이온성 DPPG가 콜레스테롤과 DSPE-mPEG2000의 비율을 변경하지 않고 중성 DPPC로 대체되었을 때 종양 흡수는 1.32 ± 0.27에서 3.97 ± 0.27 %ID/g으로 증가했다(구성 6). 대조적으로, 간 및 비장 흡수는 리포좀 성분 비율에 관계없이 더 작은 정도로 변화했다.
이러한 결과는 리포좀 조성의 최적화가 종양 흡수를 증가시킬 수 있지만 MPS 기관으로부터의 활성 제거에 크게 영향을 미치지 않음을 시사한다.
다음 가능성은 방사성 추적자 [124I]HIB 그 자체였다. 친유성 [124I]HIB는 높은 친유성(log P = 2.19 ± 0.04) 때문에 간담도관에서 제거될 것으로 예상된다. 대변이 아닌 소변에서 [124I]HIB가 간에서 분해되고 친수성 대사산물이 혈류로 재진입되어 신장 시스템에 의해 배설됨을 강력하게 시사한다. 친수성 4-[124I]요오도벤조산과 친유성 1-헥사데칸올을 제공하기 위해 생체 내에서 대사될 수 있는 [124I]HIB의 에스터 결합에 주목했다.
직접 비교를 통해 가설을 검증하기 위해 본 발명자는 두 가지 방사성 추적자 4-[124/131I]요오도페닐 헵타데카노에이트([124/131I]IPH, 2) 및 1-(헥사데실옥시)-4-[124/131I]요오도벤젠([124/131I]HIB-에테르, 3)를 합성하였다(도 1a). 방사성 추적자 1과 유사하게, 방사성 추적자 2는 4-요오도페닐과 헥사데실 알킬 그룹 사이에 에스터 결합을 포함했지만 반대 방향이다. 대조적으로, 방사성 추적자 3의 4-요오도벤젠 및 헥사데실 알킬기는 에테르 결합을 통해 연결되었다.
[124/131I]IPH 및 [124/131I]HIB-에테르의 합성을 위해, p-요오도페놀이 헵타데칸산 및 1-요오도헥사데칸과 반응하여 각각 4-요오도페닐 헵타데카노에이트 및 1-(헥사데실옥시)-4-요오도벤젠을 생성하였다. 이러한 비방사성 화합물은 헥사부틸디틴 및 촉매량의 Pd(PPh3)4와의 반응 시 방사성 요오드화를 위해 4-(트리부틸스탄닐)페닐 전구체로 전환되었다(도 1b).
그런 다음 합성된 전구체의 tributylstannyl 그룹을 아세트산과 3% H2O2가 있는 상태에서 [131I]NaI 또는 [124I]NaI(18.5-185 MBq)로 교체하여 방사성 요오드화를 수행했다(도 1b). 각각의 방사성 표지 수율과 정제 후 [124/131I]IPH 및 [124/131I]HIB-ether 모두에 대한 방사화학적 순도는 각각 51-69% 및 >98%였다(도 1c).
그런 다음 준비된 방사성 추적자를 기존 방법을 약간 수정하여 최적화된 PEG화 리포좀에 통합했다(도 1a). 특히, 각 방사성 추적자는 클로로포름 내 DPPC, 콜레스테롤 및 DSPE-mPEG2000 용액에 16:1:7의 몰비로 추가되었다. 잘 섞인 용액을 천천히 건조시켜 얇은 지질막을 형성하고, 50℃에서 PBS로 수화하고, 1000, 400, 200, 100 nm의 기공 크기를 갖는 멤브레인 필터를 통해 순차적으로 압출하였다. 사용하기 전에 합성된 리포좀을 원심 여과(YM-100, Millipore, St. Louis, MO, USA)에 의해 정제하고 농축시켰다.
[124I]HIB-리포좀(L1), [124I]IPH-리포좀(L2) 및 [124I]HIB-에테르-리포좀(L3)의 평균 추적자 통합 수율은 46.5%에서 58.8% 사이였다. [131I]L1의 유체역학적 크기와 제타 전위는 각각 112.4 ± 37 nm 및 -31.4 ± 5.1 mV에서 동적 광산란(DLS) 크기 분석기를 사용하여 결정되었다(도 1d). 유사한 크기(103.4 ± 0.5 nm)도 나노입자 추적 분석에 의해 결정되었다. 3개의 리포좀의 음성 염색 cryo-TEM 이미지는 ~100 nm의 직경에서 구형 모양을 나타내었으며, 이는 DLS 결정과 완전히 일치한다(도 1e).
그 다음으로, [124I]L1-L3의 종양 흡수 및 신체 클리어런스를 주입 후 1, 4 및 24시간에 기록된 동물 PET 이미지를 사용하여 CT26 종양 보유 BALB/c 마우스에서 비교했다(도 2a).
에스터 결합 방사성 추적자가 있는 L1 및 L2가 유사한 높은 흡수 및 제거 패턴을 나타내었지만, 에테르 결합 방사성 추적자가 로드된 리포좀 L3은 다른 생체내 거동을 보여주었다.
주사 후 1시간에 L1 및 L2의 MIP-PET 이미지는 복부 병변에서 높은 흡수율과 종양에서 일부 활성을 보여주었다. 그러나 4시간 후 복부 방사능은 크게 감소한 반면 방광의 요 방사능은 계속 증가했다. 그 시점에서 종양 주변의 배경 방사능이 종양 방사능보다 더 빨리 제거되기 때문에 종양이 고대비로 명확하게 시각화되었다. 주사 후 24시간에 복부 영역에서 비정상적으로 낮은 배경 방사능으로 종양만이 명확하게 시각화되었다.
그러나 [124I]HIB-ether-liposomes(L3)의 PET 이미지에서 간과 비장으로부터의 제거는 다른 리포좀보다 훨씬 느렸다(도 2a, 하단). 4시간까지 극적인 제거는 관찰되지 않았고 간과 비장에서 L3의 방사능은 높게 유지되었다. 24시간에 더 많은 방사능이 복부에서 배출되어 종양이 더 명확하게 시각화되었다. 그러나 L1 및 L2에 비해 L3의 MPS 기관에서 상당한 방사능이 여전히 관찰되었다.
[131I]L1-L3의 거동은 동일한 CT26 종양 모델에 대한 생체 내 분포 연구에 의해 추가로 분석되었다(도 2b-c, S15a 및 표 S2). 생체 분포 데이터는 PET 영상 결과와 잘 일치했다.
주입 후 1시간에 모든 기관에서 L1-L3의 흡수는 오류 범위 내에서 비슷했으며, 이는 방사성 추적자의 초기 생체 분포 패턴이 리포좀에 의해서만 지배되었고 추적자가 해리 없이 리포좀과 함께 움직였음을 시사한다.
그러나 4시간째에 간과 비장에서 에스터와 에테르 연결 방사성 추적자 사이에 독특한 흡수 패턴이 관찰되었다. 구체적으로, L1 및 L2의 방사능의 75% 이상이 3시간 이내에 간에서 제거된 반면, L3의 방사능에서는 44% 미만의 감소가 관찰되었다. 24시간 후, L1과 L2의 방사능은 <0.5 %ID/g으로 더 감소했고, 주사 후 1시간에 방사능의 ~2%만이 간에서 검출되었다. 대조적으로, 간에서 L3의 방사능은 6배 이상 더 높았다. 비장에서도 유사한 제거 패턴이 관찰되었다. 그러나 종양에서 L1, L2 및 L3의 제거 패턴에서는 유의한 차이가 관찰되지 않은 반면, 제거 속도는 모든 리포좀에서 훨씬 더 느렸다. 주사 후 1시간째에서 방사능의 50% 미만이 주사 후 24시간에 제거되었다. 주입된 방사능의 1% 이상이 주입 후 24시간에 여전히 종양에 남아 있었고, 이는 L1 및 L2에서 전체 신체 활성의 ~20%를 차지한다. 주입 후 24시간에 L1과 L2의 종양 대 근육 흡수 비율은 ~50이었고, 이는 L3보다 2배 더 높았다(도 2c). ester-linked 방사성 추적자(L1 및 L2)의 종양 대 간 비율은 ether-linked 방사성 추적자(L3)에 비해 5배 이상 높았다.
더 빠른 클리어런스를 나타내는 ester-linked 방사성 추적자는 시간 경과에 따라(24시간) 종양 보유 마우스 내 잔여 방사능을 조사함으로써 명확하게 나타났다(도 2d). L1과 L2는 신체 클리어런스 패턴이 매우 유사했다. 주입 후 4시간에 초기 L1 및 L2 방사능의 ~43%가 신체에서 배설된 반면 주입된 방사능의 17%만이 L3에서 제거되었다. 24시간째에 L1 및 L2 처리된 마우스에 비해 주사 후 24시간째에 L3 처리된 마우스에서 약 3배 더 높은 방사능이 발견되었다.
위의 모든 PET 영상 및 생체 분포 데이터는 특정 결합(에스터 또는 에테르)과 관련된 일부 대사 경로가 이러한 차등 제거 패턴에 밀접하게 관련되어 있으며 대사 활성이 조직 및 기관에 크게 의존한다는 것을 강력하게 암시한다.
이러한 가설을 염두에 두고 본 발명자는 체계적인 기계론적 연구를 수행했다. 먼저 에스테라제 효소 분석을 수행했다. 세 가지 방사성 추적자, [131I]HIB, [131I]IPH 및 [131I]HIB-ether는 모두 10% DMSO/PBS에서 37°C에서 에스테라제(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 함께 개별적으로 배양되었다. 혼합물 및 반응의 진행은 radio-TLC에 의해 24시간 동안 모니터링되었다(도 3a).
예상대로 두 에스터 결합 방사성 추적자, [131I]HIB 및 [131I]IPH에서 빠른 결합 절단이 관찰되었다. 4시간 이내에 [131I]HIB 및 [131I]IPH의 >80%가 분해되었고 절단 백분율은 24시간에 >96%로 증가했다. 그러나 ether-linked 방사성 추적자인 [131I]HIB-ether는 4시간과 24시간에 각각 15.9%와 20.3%의 분해를 보여 [131I]HIB와 [131I]IPH에서 나타난 분해보다 5배 낮았다. 종합하면, 에스테라제는 [131I]HIB와 [131I]IPH의 에스터 결합을 효과적으로 가수분해하지만 [131I]HIB-에테르의 에테르 결합에는 영향을 미치지 않음을 보여주었다.
결과를 추가로 검증하기 위해 마우스 간 S9 분획과 마이크로솜을 사용하여 동일한 절단 실험을 반복했다. 둘 다 다양한 효소의 함량이 높기 때문에 간 대사 연구에 널리 사용되었다. 간의 S9 분획은 마이크로솜 및 세포질 분획을 포함한다.
세 가지 방사성 추적자의 일반적인 절단 패턴은 에스테라제와 매우 유사했다(도 3b). 2개의 ester-linked 방사성 추적자([131I]HIB 및 [131I]IPH)는 ether-linked 방사성 추적자([131I]HIB-에테르)보다 훨씬 빠른 절단 속도를 보여주었다. 배양 4시간 이내에 [131I]HIB 및 [131I]IPH의 절단 비율은 S9 분획에서 각각 89.7% 및 91.3%, 마이크로솜에서 85.3% 및 87.3%로 증가했다. 대조적으로, [131I]HIB-ether는 4시간에서 S9 및 마이크로솜에서 19.3% 및 16.0% 절단만을 나타내었고, 24시간에서 약간 더 증가하였다. 흥미롭게도 모든 방사성 추적자는 마이크로솜보다 S9에서 5-20% 더 높은 절단율을 보여 세 가지 방사성 추적자의 결합 절단에 관여하는 대부분의 효소가 세포질에서 유래한 것이 아니라 마이크로솜에서 유래했음을 시사한다. 이러한 데이터는 카르복실에스테라제가 주로 마이크로솜의 주요 구성요소인 소포체의 내강 쪽에서 발견되는 반면, 세포질에서 그들의 풍부함은 낮다는 사실과 일치한다.
그 다음으로, 본 발명자는 다른 기관에서 에스테라제 활성에 대한 생체 외 비교 연구를 수행했다. 3개의 방사성 추적자의 절단율은 새로 준비된 간, 비장 및 CT26 종양 균질액에서 측정되었다. 예상대로 간 균질물의 절단 속도는 S9 및 마이크로솜의 절단 속도와 매우 유사했다(도 3c). ester-linked 방사성 추적자 [131I]HIB 및 [131I]IPH는(~75% [4 시간], ~88% [24 시간]) ether-linked [131I]HIB-에테르(23% [4 시간], 25% [24시간]) 보다 훨씬 빠른 절단을 나타냈다. 4시간 및 24시간에 [131I]HIB 및 [131I]IPH의 절단율이 간보다 ~18% 낮았지만 동일한 절단 패턴이 비장 균질액에서도 관찰되었다. 간 균질물과 유사하게, 비장에서 [131I]HIB-ether의 절단 백분율은 ester-linked 방사성 추적자보다 현저히 낮았다. 대조적으로, 종양에 있는 모든 방사성 추적자의 절단율은 4시간에 <20%, 24시간에 <23%로 비슷했으며, 이는 종양의 에스테라제 활성이 간과 비장보다 훨씬 낮음을 강력하게 시사한다.
마지막으로 소변과 대변 샘플에서 [131I]HIB의 대사 산물을 직접 분석했다. 대부분의 방사능은 대변보다는 소변으로 배설되었다. 대변의 방사능은 소변의 방사능의 5% 미만이었다(도 3d). 주사 후 3시간에 수집된 소변 샘플의 라디오-TLC 분석은 에스테라제에 의한 [131I]HIB의 에스터 결합 절단에서 생성될 수 있는 4-[131I]요오도벤조산의 형성을 나타냈다(도 3e). TLC 플레이트의 원점에서 추적자 피크는 유리 131I 이온에 할당되었다. 소변 샘플의 [131I]HIB 대사 산물은 4-요오도벤조산을 표준 화합물로 사용하는 HPLC에 의해 추가로 확인되었다(도 3f). 소변 샘플의 radio-HPLC 피크는 4-iodobenzoic acid의 UV 피크와 정확히 일치했다.
이러한 결과는 리포좀에 로딩된 친유성 [131I]HIB가 주로 간과 비장에서 에스테라제에 의해 친수성 4-[131I]요오도벤조산으로 대사된 후 간담도관이 아닌 신장계를 통해 배설됨을 분명히 보여주었다.
esterase-labile 방사성 추적자의 차등 제거의 기본 메커니즘을 결정한 후, 본 발명자는 충족되지 않은 임상 요구를 해결하는 데 이 발견을 활용하기로 결정했다. 이 차등 제거 메커니즘은 다른 암 유형에서 일반적인 현상일 수 있기 때문에, 이 발견을 사용하여 대비가 상당히 개선된 조기 암 발견의 영상 전략을 개발할 수 있다고 생각했다.
특히, 복부 영역의 종양 탐지는 이 영상화 전략의 이점을 얻을 수 있다. 이 분석을 위해 췌장암을 선택했다. 췌장암은 모든 주요 암 중에서 사망률이 가장 높다. 진단 후 평균 생존 기간은 6개월에 불과한다. 게다가 5년 생존율은 지난 40년 동안 ~10%로 개선되지 않은 상태를 유지하고 있다. 췌장은 복부 깊숙이 위치하고 간, 신장, 위 등 다른 주요 기관들에 의해 위치하고 있기 때문에, 크기가 1cm 미만인 췌장암은 초음파, CT, MRI 등 현대의 의료영상기술로도 진단하기 매우 어렵다. FDG-PET는 다양한 암의 조기 발견에 매우 효과적이지만, 췌장암에는 민감도와 특이도가 부족하다.
여기에서는 췌장암에 대한 종양 표적화 효율을 높이기 위해 [124I]HIB-리포좀(L1)의 리포좀 표면을 엽산으로 최적화했다. 비타민 B9로도 알려진 엽산은 세포 증식에 필수적이며 세포막의 엽산 수용체(FR)를 통해 세포 내에서 운반된다. 췌장암을 포함한 여러 유형의 암에서 FR의 과발현을 고려할 때 이러한 수용체는 수십 년 동안 종양 진단 및 치료를 위한 적절한 표적을 구성한다. 엽산-[124I]HIB-리포좀(L4)의 최적화된 리포좀 조성은 16:1:5:2 비율의 DPPC, 콜레스테롤, DSPE-mPEG2000 및 DSPE-mPEG2000-엽산으로 이루어지며, 여기서 DSPE-mPEG2000-엽산은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[엽산(폴리에틸렌 글리콜))-2000]이다(도 4a). ~100 nm의 유체역학적 크기와 L4의 구형은 각각 DLS 및 cryo-TEM에 의해 확인되었다. 엽산-[131I]HIB-리포좀(L4)은 PBS에서 최대 2주까지 방사화학적 안정성뿐만 아니라 우수한 리포좀 완전성을 나타냈다.
[124I]L4의 표적화 효율은 인간 췌장암 세포주 PANC-1(FR 과발현, FR+) 및 MIA PaCa-2(FR 결핍, FR-)를 포함하는 종양 이종이식 모델에서 동물 PET 이미징을 통해 먼저 평가되었다. 예상대로 오른쪽 옆구리의 PANC-1 종양은 주입 후 24시간에 왼쪽 옆구리의 MIA PaCa-2보다 더 높은 흡수율을 보였다(도 4b). CT26 종양 모델에서 L1의 PET 이미지와 유사하게(도 2a), 방사능은 요로를 통해 간과 비장에서 빠르게 제거되었다. 같은 시점의 별도의 생체 분포 연구에서는 PANC-1의 종양 흡수가 MIA PaCa-2의 종양 흡수보다 3.6배 더 높았으며, 이는 PANC-1(FR+)의 더 높은 종양 흡수가 [124I]L4의 표면에 있는 엽산에 의한 것이다(도 4c). 간, 비장 및 신장의 종양(PANC-1) 대 장기 비율은 배경으로부터의 빠른 제거로 인해 높았지만(T/L 5.6, T/S 2.9 및 T/K 43) 종양 대 혈액 및 종양 대 근육 비율은 예외적으로 높았다(T/B 212 및 T/M 270).
상기 이종이식(xenograft) 종양 모델의 결과에 이어, 본 발명자는 동소성(orthotopic) 췌장암 모델을 이용한 실험을 진행했다. 루시페라제(PANC-1/Luc+)로 형질감염된 PANC-1 세포를 BALB/c 누드 마우스의 췌장 꼬리에 동소 주사하였다. 접종 후 2주에 L4를 꼬리 정맥을 통해 주입하고 마우스를 PET 영상화로 영상화했다(도 4d).
주사 후 1시간에 췌장 병변 주변의 열반이 명확하게 인식되었지만 복부 부위, 특히 간과 비장에서도 높은 방사능이 발견되었다. 가장 높은 방사능은 방광에서 발견되었으며, 이는 친수성 [124I]HIB 대사산물의 빠른 신장 제거를 나타낸다. 주사 4시간 후 대부분의 복부 방사능은 방광으로 배설되어 췌장 종양만 뚜렷하게 가시화된 반면 24시간에는 모든 장기의 방사능이 유의하게 감소하여 배경신호 없이 종양만 검출할 수 있었다.
그러나 동일한 마우스가 [18F]FDG-PET로 이미지화되었을 때 종양은 거의 감지되지 않았고 다른 포도당 열성 기관에서 높은 흡수가 관찰되었다(도 4d).
24시간 PET 영상화 직후 마우스 복부 장기를 노출시키고 Cerenkov 영상화로 영상화하여 검출된 국소 핫스팟이 동소 접종된 췌장 종양에서 유래되었음을 확인했다. 방사성 동위원소 I-124는 민감한 CCD 카메라로 몇 초 안에 감지할 수 있는 비교적 강한 Cerenkov 방사선을 방출한다. 여기에서 본 발명자는 Cerenkov 이미지에서 두 개의 초점 신호를 감지했다(도 4e, 중간). 췌장에 하나, 방광에 하나. 마취된 마우스에 생물발광 이미징을 위해 D-루시페린을 복강 내 추가로 주사했다(도 4e, 오른쪽). Cerenkov 이미징의 핫스팟과 정확히 동일한 위치에서 단일 초점이 감지되었으며, 주입 후 24시간에 강한 PET 신호가 췌장에서 발생했으며 특히 동소적으로 접종된 PANC-1/Luc+ 세포에서 유래했음을 확인했다. 이러한 결과는 절제된 기관의 생체 발광 이미징에 의해 추가로 확인되었으며, 췌장 꼬리에서 ~2mm 종양만 명확하게 감지되었지만 정상 췌장 조직을 포함한 다른 모든 기관에서는 감지 가능한 신호가 관찰되지 않았다(도 4f).
동소 췌장 종양 모델에서 엽산-[131I]HIB-리포좀([131I]L4)의 생체 분포 데이터는 PET 영상과 잘 일치했다. 초기 시점(1시간)에 가장 높은 흡수율은 비장에서 발견되었으며 그 다음으로 혈액과 간에서 발견되었다(도 4g). 췌장 종양의 방사능은 네 번째로 높았다. 근육은 수집된 장기 중 가장 낮은 흡수율을 보였다. 주사 후 4시간에 종양에서의 흡수는 혈액에서 다음으로 두 번째로 높았다. 처음 3시간 동안 1시간에 방사능의 27%만이 종양에서 제거되었지만 1시간 방사능의 67%, 73% 및 77%가 혈액, 비장 및 간에서 각각 제거되었다. 24시간에 종양과 비장을 제외한 모든 기관의 대부분의 활동이 지워져 1%ID/g 미만으로 남게 되었다(도 4g, 삽입). 24시간에 1시간 방사능의 38%가 종양에 남아 있었고 1시간 방사능의 93% 이상이 비장과 간에서 제거되었다. 주사 후 24시간에 종양 대 혈액, 종양 대 근육, 종양 대 간, 종양 대 신장 및 종양 대 비장 비율은 각각 49, 65, 24, 6.3 및 2.2로 계산되었다. 이는 리포좀 이미징 프로브를 사용한 종양 이미징에서 매우 높은 수치이다.
주입된 방사능의 종양 흡수율은 주입 후 1, 4 및 24시간에 1.1%에서 0.8%로, 0.4%로 천천히 감소했지만, 전체 신체 방사능에 대한 백분율로서의 종양 방사능은 1, 4 및 24시간에서 각각 2.0%, 2.6% 및 9.0%로 빠르게 증가했다(도 4h). 동소성 종양 무게가 전체 체중의 0.03%에 불과한 것을 고려할 때, 종양에서 9.0% 방사능의 국소화는 매우 높은 값이다.
I-124 및 PET 이미징 스캐너에 비해 I-131(또는 I-123) 방사성 동위원소 및 SPECT(단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영) 스캐너의 접근성이 더 높다는 점을 고려할 때 131I-표지 엽산-[131I]HIB-리포좀([131I]L4)는 향후 임상 적용에서 훌륭한 대안이 될 것이다. 동소성 췌장 종양 모델이 [131I]L4 주입 후 SPECT로 영상화되었을 때 PET 영상과 유사하게 24시간에 최소한의 배경으로 매우 깨끗한 종양 영상을 얻었다(도 4i).
II. 실시예 2: DOTA-Benzene-HIB의 합성 및 이의 활용
1. 실험물질의 합성
1) Boc-4-aminobenzoic acid
(1) Boc-4-aminobenzoic acid의 합성
Figure pat00019
파라-아미노벤조산(p-Aminobenzoic acid)(1.5 g, 1 당량)을 메탄올(Methanol) 100 mL에 용해시키고, 디-터트-부틸 디카보네이트(Di-tert-butyl dicarbonate)(4.5g, 2 당량) 및 트리에틸아민(Et3N)(5 mL, 2 당량)을 0 ℃에서 용액에 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 농축하고 헥산(hexane) 및 포화 수성 중탄산나트륨(aqueous sodium bicarbonate)으로 추출하였다. 그런 다음 10 % 시트르산(10% citric acid)으로 pH 4로 산성화하여 백색 고체를 얻었다(1.321 g, 수율 - 50.2 %).
(2)hexadecyl 4-((tert-butoxycarbonyl)amino)benzoate의 합성
Figure pat00020
Boc-4-아미노벤조산(Boc-4-aminobenzoic acid)(1.32 g, 1 당량)을 100ml의 DCM 및 1-헥사데칸올(1-hexadecanol)(1.473 g, 1.1 당량), EDC.HCl(1.261 g, 1.2 당량) 및 DMAP(4-Dimethylaminopyridine)(67.5 mg, 0.1 당량)을 0 ℃에서 용액에 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 그 다음, 용액을 농축하고 DCM으로 추출하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체(1.39 g, 수율 - 51.4 %)를 얻었다.
(3) hexadecyl 4-aminobenzoate의 합성
Figure pat00021
hexadecyl 4-((tert-butoxycarbonyl)amino)benzoate(헥사데실 4-((터트-부톡시카르보닐)아미노)벤조에이트)(1.20 g, 1 eq)를 5 mL의 DCM에 용해시키고 5 mL의 트리플루오르아세트산(Trifluoroacetic acid)를 0 ℃에서 용액에 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 그 다음, 용액을 농축하고 DCM으로 추출하였다. NaHCO3 용액으로 세척하였다. 백색 고체(0.88 g, 수율 - 93.7 %).
(4) DOTA-Benzene-HIB의 합성
Figure pat00022
헥사데실 4-아미노벤조산(hexadecyl 4-aminobenzoate)(2.37 mg, 1 당량)를 0.2 mL의 DMF에 용해시킨 다음 DIPEA(11μL, 10 당량)를 첨가하였다. 그런 다음 0.8mL DMF에 DOTA-NHS ester(5.5 mg 1.1 당량)를 추가했다. 반응 용액을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. Waters HPLC를 사용하여 정제를 수행하였다. 백색 고체(250 μg).
(5) 64Cu-DOTA-Benzene-HIB의 제조
동위원소 Cu-64를 합성된 DOTA-Benzene-HIB에 표지하였으며, Radio-TLC로 표지율을 확인하였으며, 표지율은 96.06 % 였다.
(6) 64Cu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome 제조
100 mL Round flask에 0.5 mM 농도의 DPPC 800 μL, DSPE-PEG2000 350 μL, Cholesterol 50 μL 투입했다. (chloroform 용매 사용) 5초 정도 가볍게 교반 후, Evaporator 이용하여 thin film 진행하였다. 감압 농축이 끝난 뒤, Round flask에 PBS 1mL 투입하였다. Heating bath 55 ℃에서 hydration 진행하였다. Hydration이 끝난 PBS용액 Glass syringe로 추출 후, 50 ℃에서 400 nm, 100 nm 크기 extrusion 각각 19회 진행하였다.
2. 64 Cu-DOTA-Benzene-HIB 생체 내 실험
(1) 생체내 배출 연구
64Cu-DOTA-Benzene-HIB의 생체 내 배출 속도를 알아보기 위해서 실험을 진행했다. 마우스에 64Cu-DOTA-Benzene-HIB를 주입하고 7시간 뒤 biodistribution 진행했다. biodistribution 결과 혈액과 심장에 낮은 uptake를 확인하였고, 간, 신장, 장에서 높은 uptake 보여서 전형적인 생체 내 배출 패턴을 확인했다(도 5).
(2) PET/CT 이미징
64Cu-DOTA-Benzene-HIB 주입하고, 3.5 시간과 7시간을 PET/CT 분석을 진행했다. PET/CT 분석으로 얻은 결과 3.5시간 마우스 생체 내 잔류 Activity는 74%였으며, 7시간 뒤 생체 내 잔류 Activity는 56% 였다. 간, 신장, 장에서 높은 uptake 보여서 전형적인 생체 내 배출 패턴을 이미지로 확인할 수 있었다. 심장 쪽의 시그널이 3.5시간 보다 7시간 약한 것으로 보아 생체 내에서 아직 순환되고 있다는 것을 확인할 수 있었다. biodistribution의 결과와 동일한 생체 내의 배출 패턴을 확인했다(도 6).
3. 64 Cu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome tumor uptake
마우스 옆구리 양쪽에 CT26 tumor가 있으며, 64Cu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome을 이용하여 종양 uptake를 평가했다. 64Cu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome 주입하고 4시간 뒤 마우스의 tumor uptake가 약 약 2 % 정도였으며, 64Cu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome 주입하고 24시간 뒤 마우스의 tumor uptake보다 수치상 높아 보이지만 생체 내 순환하고 Liposome으로 인해 Blood 대비 tumor를 확인했 때 높지 않은 것을 확인할 수 있었다. 4시간에서 간의 uptake 양이 24시간 간에서 uptake 양과 차이가 큰 것으로 보아 빠르게 빠져나가고 있음을 확인했다(도 7).
4. 64 Cu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome PET/CT
64Cu-DOTA-Benzene-HIB 주입하고, 16시간을 뒤 PET/CT 분석을 진행했다. PET/CT 분석으로 얻은 결과 16시간 뒤 생체 내 잔류 Activity는 12.2 % 였습니다. 간, 신장, 장 에서 높은 uptake 보여서 전형적인 생체 내 배출 패턴을 이미지로 확인 할 수 있었다. 심장 쪽의 시그널이 약한 것으로 몸에서 배출이 잘 되는 것을 알 수 있었다. Tumor uptake의 결과와 동일한 생체 내의 배출 패턴을 확인했다(도 8).
5. 177 Lu-DOTA-Benzene-HIB의 제조
방사성 표지는 76.51 % 방사성 표지를 나타내는 0.25 M NH4OAc 완충액을 사용하여 처음에 수행되었다. 방사성 표지의 전환은 radio-TLC iTLC(Bioscan 2000 이미징 스캐너)에 의해 모니터링되었다.
동위원소 Lu-177를 합성된 DOTA-Benzene-HIB에 표지 하였으며, Radio-TLC로 표지율을 확인하였으며, 표지율은 76.51 % 였다.
6. 177 Lu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome 제조
100 mL Round flask에 0.5 mM 농도의 DPPC 800 μL, DSPE-PEG2000 350 μL, Cholesterol 50 μL 투입했다. (chloroform 용매 사용) 5초 정도 가볍게 교반 후, Evaporator 이용하여 thin film 진행하였다. 감압 농축이 끝난 뒤, Round flask에 PBS 1mL 투입하였다. Heating bath 55 ℃에서 hydration 진행하였다. Hydration이 끝난 PBS용액 Glass syringe로 추출 후, 50 ℃에서 400 nm, 100 nm 크기 extrusion 각각 19회 진행하였다.
7. 177 Lu-DOTA-Benzene-HIB Liposome 생체 내 실험
(1) Clearance
177Lu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome의 생체 내 배출 속도를 알아보기 위해서 실험을 진행했다. 마우스에 64Cu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome을 주입하고 24시간 뒤 biodistribution 진행했다. biodistribution 결과 혈액과 심장에서 uptake를 확인하였고, 이는 리포좀이 생체 내에서 순환하고 있음을 확인했다. 64Cu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome이 64Cu-DOTA-Benzene-HIB 대비간 낮은 uptake 확인하였고 약 1.5배 빠르게 배출되는 것을 확인했다(도 9).
(2) Tumor uptake
177Lu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome tumor uptake을 확인하기 위해서 biodistribution을 진행했다. 177Lu-DOTA-Benzene-HIB-Liposome을 주입하고 24시간 뒤 biodistribution 확인했다. 결과 control과 Liposome의 종양 uptake는 1 % 이하로 거의 되지 않은 것으로 확인했다. 또한 비장에서의 uptake가 높아서 Liposome이 깨진 것으로 예상할 수 있었다(도 10).
III. 실시예 3: ATSM-mono-hexadecyl benzoate의 합성
(1) hexadecyl 4-isothiocyanatobenzoate의 합성
Figure pat00023
헥사데실 4-아미노벤조에이트(Hexadecyl 4-aminobenzoate)(0.15 g, 1 당량)를 에틸 아세테이트 50 mL에 용해시키고 Et3N(0.13 mL, 2.2 당량)을 0 ℃에서 용액에 첨가하였다. 그 다음, 티오포스겐(thiophosgene)(0.056 g 1.1 당량)을 0 ℃에서 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응 용액을 실온에서 12시간 동안 교반 후, 용액을 농축하고 EtOAc로 추출하였다. 황색 액체(0.88 g, 수율 - 93.7 %). 추가 정제 없이 다음 단계에 즉시 사용하였다.
(2) ATSM-mono-hexadecyl benzoate의 합성
Figure pat00024
ATSM 중간체(75 mg, 1 당량) 화합물을 메탄올(15 mL)에 용해시키고 엔씨에스-헥사데실 벤조에이트(NCS-hexadecyl benzoate)((150 mg, 1.01 mmol, 5 mL)의 메탄올 용액에 적가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간에 걸쳐 교반하였다. 황색 침전물이 형성되었고 이를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 최종 화합물 에이티에스엠-모노-헥사데실-벤조에이트(ATSM-mono-hexadecyl benzoate)(69 mg, 수율 - 29.2 %)를 수득하였다.
(3) 64Cu-ATSM-mono-hexadecyl benzoate의 제조
ATSM-HIB와 64Cu의 착물화는 0.01 M HCl(1-5 μL)에 무담체 64CuCl2(18.5-111 MBq)를 에탄올(100 μL)에 녹인 킬레이터(10 μg) 용액을 혼합하여 수행되었다. 이어 Thermomixer 800 rpm에서 5-10분 동안 60 °C에서 반응했다. 방사성 표지의 전환은 radio-TLC(Bioscan 2000 이미징 스캐너)[Silica TLC 에틸 아세테이트:메탄올 = 95:5]에 의해 모니터링되었으며 최종 방사성 화학적 순도는 ≥ 97%였다. 동위원소 Cu-64를 합성된 에이티에스엠-모노-헥사데실-벤조에이트 (ATSM-mono-hexadecyl benzoate)에 표지 하였으며, Radio-TLC로 표지율을 확인하였으며, 표지율은 97.60 % 였다.
IV. 실시예 4: ATSM-mono-hexadecyl benzene sulfonate의 합성
(1) 4-isothiocyanatobenzne sulfonic acid의 합성
Figure pat00025
4-아미노벤조산 설폰산(4-aminobenzoic sulfonic acid)(3.0 g, 1 당량)을 50 mL의 THF에 용해시키고 0 ℃에서 용액에 첨가하였다. 그런 다음 티오포스겐(thiophosgene)(2.1 g, 1.1 당량)을 0 ℃에서 30분에 걸쳐 적가하였다. 모든 출발 물질을 용해시킨 3 M HCl 용액을 추가하고 24시간 반응 보낸 후, Silica-TLC (에틸 아세테이트:헥산=9:1) 확인 결과 새로운 스팟을 확인할 수 있었다. 컬럼을 사용하여 정제하여 백색 고체를 얻었다 (1.60 g, 수율 - 43 %)
(2) 4-aminobenzene-1-sulfonyl chloride의 합성
Figure pat00026
4-이소티오시아나벤젠 설폰산(4-isothiocyanatobenzne sulfonic acid)(100 mg, 1 당량)의 용액을 DCM(20 mL)에 용해시키고 0 ℃에서 C2O2Cl2(0.295 g, 5 당량)를 첨가하였다. 그런 다음 촉매로 DMF 10 μL를 추가했다. 실온에서 약 72시간 동안 용액을 교반시켜주었다. 컬럼으로 정제하였다. 57.8 mg 얻었다.
(3) Hexadecyl 4-isothiocyanatobenzene sulfonate의 합성
Figure pat00027
1-헥사데칸올(1-hexadecanol)(600 mg, 1 당량), Et3N(0.758 ml, 2 당량), DMAP(28.8 mg, 10 mol%) I n DCM 10 mL의 용액에 4-엔씨에스-벤젠 설포닐 클로라이드(4-NCS-Benzene sulfonyl chloride)(640 mg, 1.1 당량)를 0 °C에서 조금씩 추가했다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 헥산:에틸 아세테이트 = 9:1를 사용하여 컬럼으로 정제했다. 305 mg 수득하였다.
(4) ATSM-mono-hexadecyl benzene sulfonate의 합성
Figure pat00028
ATSM 중간체(25 mg, 1 당량)를 메탄올(15 mL)에 용해시키고 엔씨에스-헥사데실 벤젠 설포네이트(NCS-hexadecyl benzene sulfonate)(64.5 mg, 1.01 mmol, 5 mL)의 메탄올 용액에 적가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간에 걸쳐 교반하였다. 황색 침전물이 형성되었고 이를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 최종 화합물 에이티에스엠-모노-헥사데실 벤젠 설포네이트(ATSM-mono-hexadecyl benzene sulfonate)(28.2 mg)를 황색 고체로서 수득하였다.
(5) 64Cu-ATSM-mono-hexadecyl benzene sulfonate 표지
Figure pat00029
ATSM-sulfate-HIB와 64Cu의 복합화는 0.01 M HCl(1-5 μL)에 담체를 첨가하지 않은 64CuCl2(18.5-111 MBq)를 에탄올에 녹인 킬레이트제(chelator)(10 μg) 용액을 혼합하여 수행했다. (100 μL) 다음에 Thermomixer 800 rpm에서 5-10분 동안 60°C에서 배양했다. 방사성 표지의 전환은 radio-TLC(Bioscan 2000 이미징 스캐너)[Silica TLC 에틸 아세테이트:메탄올 = 95:5]에 의해 모니터링되었으며 최종 방사성 화학적 순도는 ≥ 98%였다.
V. 실시예 5: HIB-sulfate의 합성 및 이의 활용
1. HIB-sulfate 합성
(1) cold-HIB-sulfonic acid의 합성
Figure pat00030
CH2Cl2에 용해된 4-요오도 벤젠 설포 클로라이드(4-Iodo benzene sulfo chloride)(0.935 g, 1.5 당량)를 CH2Cl2(5 mL)에 녹인 헥사데칸올(hexadecanol)(0.5 g, 1 당량), Et3N(0.57 ml, 2 당량), DMAP(25 mg, 10% mol)의 용액에 적가했다. 0 °C에서 생성된 혼합물을 실온에서 24시간 동안 격렬하게 교반했다. TLC로 반응을 모니터링했다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3(10 mL)로 처리했다. 반응 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반했다. 반응 혼합물에 에틸 아세테이트(20 mL)를 추가하고 유기층을 분리했다. 용매를 증발시킵니다. 실리카겔 크로마토그래피로 조 생성물을 정제했다.
(2) Stannylation of HIB-sulfonic acid의 합성
Figure pat00031
톨루엔에 용해된 4-요오도 벤젠 헥사데실 설포네이트(4-Iodo benzene hexadecyl sulfonate)(0.1 g, 1.0 당량)를 실온에서 Bu6Sn2(0.125 g, 1.1 당량), Pd(PPh3)4의 용액에 적가했다. 생성된 혼합물을 100℃에서 24시간 동안 격렬하게 저어줬다. 반응 종료 후 용액을 여과하고 회전 증발기로 농축했다. 헥산:에틸 아세테이트 = 20:1를 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제했다.
(3) 131I-HIB-sulfate 표지
Figure pat00032
100μl AcOH에 용해된 스태닐레이트 HIB-sulphate 전구체(100 μg)를 Na131I(500 μCi)에 첨가했니다. 그 다음, Iodobeads를 첨가하여 방사성 요오드화를 개시하고 반응 혼합물을 몇 분 와동시키고 25 ℃, 550rpm, 30분에서 반응을 보냈다. 반응의 진행은 Radio-TLC(Silica TLC 헥산:에틸 아세테이트=20:1)에 의해 모니터링되었다. Na2S2O5를 사용하여 반응을 켄칭했다. 회전 증발기를 사용하여 증발 정제하여 정제된 131I-HIB-sulfate를 CHCl3 1 mL을 이용하여서 추출했으며, 리포좀 준비를 진행했다.
동위원소 I-131를 합성된 HIB-sulfate에 표지 하였으며, Radio-TLC로 표지율을 확인하였으며, 표지율은 91.23 % 였다.
(4) 131I-HIB-sulfate-Liposome 제조
100 mL Round flask에 0.5 mM 농도의 DPPC 800 μL, DSPE-PEG2000 350 μL, Cholesterol 50 μL 투입했다. (chloroform 용매 사용) 5초 정도 가볍게 교반 후, Evaporator 이용하여 thin film 진행하였다. 감압 농축이 끝난 뒤, Round flask에 PBS 1mL 투입하였다. Heating bath 55 ℃에서 hydration 진행하였다. Hydration이 끝난 PBS용액 Glass syringe로 추출 후, 50 ℃에서 400 nm, 100 nm 크기 extrusion 각각 19회 진행하였다.
2. 131 I-HIB-sulfate-Liposome 생체 내 실험
(1) tumor uptake (1)
131I-HIB-sulfate-Liposome tumor uptake을 확인하기 위해서 biodistribution을 진행했다. 마우스 옆구리 양쪽에 CT26 tumor가 있으며, 131I-HIB-sulfate-Liposome을 주입하고 24시간 뒤 biodistribution 확인했다. 결과 24시간 뒤 혈액과 심장의 잔류 Activity는 거의 없었으며, 생체 내 배출이 잘 이루어진 것을 확인했다. 간, 신장, 장기의 uptake가 높은 것을 보아 전형적인 생체 내 배출 패턴을 확인했다. 종양 uptake는 1 % 미만 낮은 uptake를 확인할 수 있었다. 하지만, Thyroid에 uptake가 높은 것으로 Free-I 이 있는 것으로 예상되며, 이는 Liposome이 깨지면서, HIB-sulfate에서 표지 된 Iodine이 떨어져 나온 것으로 예상했다(도 11).
(2) tumor uptake (2)
131I-HIB-sulfate-Liposome tumor uptake을 확인하기 위해서 biodistribution을 진행했다. 마우스 옆구리 양쪽에 CT26 tumor가 있으며, 131I-HIB-sulfate-Liposome을 주입하고 24시간 뒤 biodistribution 확인했다. 결과 24시간 뒤 혈액과 심장의 잔류 Activity는 거의 없었으며, 생체 내 배출이 잘 이루어진 것을 확인했다. 간, 신장, 장기의 uptake가 높은 것을 보아 전형적인 생체 내 배출 패턴을 확인했다. 종양 uptake는 1 % 미만 낮은 uptake를 확인할 수 있었다. 하지만, Thyroid에 uptake가 높은 것으로 Free-I 이 있는 것으로 예상되며, 이는 Liposome이 깨지면서, HIB-sulfate에서 표지 된 Iodine이 떨어져 나온 것으로 예상했다(도 12).
(3) tumor uptake (3)
131I-HIB-sulfate-Liposome tumor uptake을 확인하기 위해서 biodistribution을 진행했다. 사용된 tumor model은 EMT6이며, 131I-HIB-sulfate-Liposome을 주입하고 24시간 뒤 biodistribution 확인했다. 결과 24시간 뒤 혈액과 심장의 잔류 Activity는 거의 없었으며, 생체 내 배출이 잘 이루어진 것을 확인했다. 간, 신장, 장기의 uptake가 높은 것을 보아 전형적인 생체 내 배출 패턴을 확인했다. 종양 uptake는 2 % 미만 낮은 uptake를 확인할 수 있었고, CT26 tumor model과 비교했을 시, 조금 나은 tumor uptake를 확인했다. 하지만, Thyroid에 uptake가 높은 것으로 Free-I 이 있는 것으로 예상되며, 이는 Liposome이 깨지면서, HIB-sulfate에서 표지 된 Iodine이 떨어져 나온 것으로 예상했다(도 13).
VI. 실시예 6: HIB-sulfate-amide의 합성
(1) cold HIB-sulfonic acid amide의 합성
Figure pat00033
CH2Cl2에 용해된 4-요오도 벤젠 설포닐 클로라이드(4-Iodo benzene sulfonyl chloride)(1 g, 1.1 당량)를 0℃에서 1-아미노 헥사데칸(1-Amino hexadecane)(0.75 g, 1 당량), Et3N(0.345 g, 1.1 당량)의 용액에 적가했다. 생성된 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반했다. 반응 완료 후 TLC로 반응을 모니터링했다. 회전 증발기로 모든 용매를 증발시키고 헥산:에틸 아세테이트 = 95:5 용리제을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 조 생성물을 정제했다.
(2) Stannylation of HIB-sulfonic acid amide의 합성
Figure pat00034
4-요오도 벤젠 헥사데실 설포닐 아미드(4-Iodo benzene hexadecyl sulfonyl amide)(0.1 g, 1.0 당량)를 톨루엔에 용해된 Bu6Sn2(0.125 g, 1.1 당량), Pd(PPh3)4 용액에 실온에서 적가했다. 생성된 혼합물을 100℃에서 24시간 동안 격렬하게 저어줬다. 반응 종료 후 용액을 여과하고 회전 증발기로 농축했다. 헥산:에틸 아세테이트 = 20:1를 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제했다.
(3) 131I-HIB-sulfate-amide의 표지
Figure pat00035
Stannylated HIB-sulphate amid 전구체(100 μg)를 100 μL AcOH에 용해한 다음 Na131I(500 μCi)에 추가했다. 그 다음, Iodobeads를 첨가하여 방사성 요오드화를 개시하고 반응 혼합물을 몇 분 와동시키고 25 ℃, 550 rpm, 30분에서 반응했다. 반응의 진행은 Radio-TLC(Silica TLC 헥산:에틸 아세테이트 = 20:1)로 관찰하였으며, Na2S2O5를 이용하여 반응을 켄칭하였다.
동위원소 I-131를 합성된 HIB-sulfate (2)에 표지 하였으며, Radio-TLC로 표지율을 확인하였으며, 표지율은 85.59 % 였다.
VII. 실시예 7: nido -Carborane-HIB의 합성 및 이의 활용
1. nido -Carborane-HIB의 합성
(1) Carborane-HIB의 합성
Figure pat00036
카르보란 카르복실산(carborane carboxylic acid)(0.1 g, 1 당량), 엔,엔-디시클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide)(0.13 g, 1.2 당량), 헥사데실 알코올(hexadecyl alcohol)(0.14 g, 1.2 당량) 및 4-디메틸후노피리딘(4-dimethyhuninopyridine)0.060 g, 1.2 당량)을 건조한 디클로로메탄(25 mL)에 녹인 후 아르곤 하에서 56시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 후 정제를 수행하였다
(2) nido-carborane-HIB의 합성
Figure pat00037
에탄올(10mL) 중 o-carborane-HIB(30mg, 1eq) 및 세슘 플루오라이드(cesium fluoride)(63mg, 2eq)의 혼합물을 환류 조건 하에 24시간 동안 교반했다. 투명한 용액을 회전 증발기로 건조하여 백색 고체를 수득하고, 이를 10 mL의 아세톤에 용해시켰다. 용액을 유리 프릿으로 여과하여 백색 붕산염을 제거하고 동일한 용매로 여러 번 세척하였다. 진공에서 여액의 용매를 제거하여 백색 생성물을 얻었다.
(3) 131I-nido-Carborane-HIB 표지
Figure pat00038
nido-Carborane-HIB(100 μg/10 μL DI water) 용액을 [131I]NaI 용액(540 μCi)에 첨가한 다음 H2O(100 μL)에 5 % AcOH를 첨가했다. 새로 제조된 클로라민-T(chloramine-T)(5 μL; 5 mg/mL) 용액을 첨가하여 반응을 개시하고 반응 혼합물을 교반시키고 실온에서 30분 동안 반응을 보냈다. 반응 완료를 radio-TLC: C18, ACN: H2O = 1:1로 모니터링했다.
동위원소 I-131를 합성된 nido-Carborane-HIB에 표지 하였으며, Radio-TLC로 표지율을 확인하였으며, 표지율은 98.21 % 였다.
2. 131 I- nido -Carborane-HIB 생체 내 실험
(1) clearance
131I-nido-Carborane-HIB의 생체 내 배출 속도를 알아보기 위해서 실험을 진행했다. 마우스에 131I-nido-Carborane-HIB를 주입하고 24시간 뒤 biodistribution 진행했다. biodistribution 결과 생체 내의 잔류 Activity는 67 %이며, 배출이 잘 이루어 지지 않음을 확인했다. Blood의 uptake가 높은 것으로 보아 생체 내에 순환하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 다양한 장기에서 uptake 양상을 확인한 결과 그 중에서 gall bladder 쓸개에 높은 uptake를 확인했다. 또한, brain에 uptake가 낮은 것으로 보아 Blood-Brain Barrier를 통과하지 못하는 것을 확인했다. 방광과 소변에서 uptake가 높은 것으로 소변으로 Activity가 빠져나가는 것을 확인했다(도 14).
(2) PET/CT 이미징
I-131과 동일한 표지 방법으로 I-124를 표지하여서, 생체 내의 배출 과정을 PET/CT 분석을 통해서 확인했다. 생체 내 잔류 Activity는 1시간에 93 %, 4시간에 83 %, 24시간에 54 %로 시간에 따라서 일정하게 빠지는 것은 확인하였고, 간, 신장, 장에서 높은 uptake 보여서 전형적인 생체 내 배출 패턴을 이미지로 확인할 수 있었고 생체 내 배출 속도가 느린 것을 확인했다. 생체 내 Activity 배출은 소변으로 대부분 배출되는 것을 확인했다. 하지만, 심장 쪽의 시그널이 강하게 잡히는 것으로 보아 생체 내 순환이 활발하게 되고 있음을 확인했다(도 15).
VIII. 실시예 8: C-OH- nido -Carborane-HIB의 합성
(1) C-OH-carborane-HIB의 합성
Figure pat00039
Dry DCM(5 mL) 중 C-OH-carborane-carboxylic acid(25 g, 1 당량), N,N-디시클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide)(13 mg), 헥사데실 알코올(hexadecyl alcohol)(14 mg) 및 4-디메틸아미노피리딘(4- dimethylaminopyridine)(6 mg)의 용액을 실온에서 교반하였다. 아르곤 하에서 56시간 동안 정제는 헥산:에틸 아세테이트 = 20:1를 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 수행하였다.
(2) C-OH-nido-carborane-HIB의 합성
Figure pat00040
에탄올(10mL) 중 C-OH nido-carborane-HIB(30 mg, 1 당량) 및 세슘 플루오라이드(cesium fluoride)(63 mg, 2 당량)의 혼합물을 환류 조건 하에 24시간 동안 교반하였다. 투명한 용액을 회전 증발기로 건조하여 백색 고체를 수득하고, 이를 10 mL의 아세톤에 용해시켰다. 용액을 유리 프릿으로 여과하여 백색 붕산염을 제거하고 동일한 용매로 여러 번 세척하였다. 진공에서 여액의 용매를 제거하여 백색 생성물을 얻었다.
(3) 131I-C-OH-nido-carborane-HIB 표지
Figure pat00041
C-OH nido-carborane-HIB(100 μg/10 μl DI water) 용액을 Na131I 용액(540 μCi)에 추가한 다음 H2O(100 μL)에 5 % AcOH를 추가했다. 새로 제조된 클로라민-T(chloramine-T)(5 μL; 5 mg/mL) 용액을 첨가하여 반응을 개시하고 반응 혼합물을 와동시키고 실온에서 30분 동안 반응을 진행했다. 반응 완료를 Radio-TLC: C18, ACN: H2O= 1:1로 모니터링했다.
본 발명에 따른 화학식 1 내지 8의 신규 화합물은 구조 내 에스터 잔기로 인해 장기별 에스터라제 활성 차이에 따른 선택성을 나타내어, 췌장암 등을 시각하는데 매우 우수한 효과를 나타낼 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 신규 방사성 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure pat00042


    [화학식 2]
    Figure pat00043


    [화학식 3]
    Figure pat00044

    [화학식 4]
    Figure pat00045

    [화학식 5]
    Figure pat00046

    [화학식 6]
    Figure pat00047

    [화학식 7]
    Figure pat00048

    [화학식 8]
    Figure pat00049

    (상기 화학식 1 내지 8에서,
    X는 43Sc,　44Sc,　51Mn,　52Mn,　64Cu,　67Ga,　68Ga,　86Y,　89Zr,　94mTc,　99mTc,　111In,　152Tb,　155Tb,　201Tl,　203Pb,　18F,　76Br,　77Br,　123I,　124I 및　125I로 이루어진 군에서 선택된 진단 활성 방사성 동위원소; 또는 47Sc,　67Cu,　89Sr,　90Y,　153Sm,　149Tb,　161Tb,　177Lu,　186Re,　188Re,　212Pb,　213Bi,　223Ra,　225Ac,　226Th,　227Th,　131I 및 211At로 이루어진 군에서 선택된 치료 활성 방사성 동위원소이고,
    k는 5 내지 30의 정수이다.)
  2. 제1항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 지질을 포함하는 리포좀.
  3. 제2항에 있어서, 상기 지질은 (a) 콜레스테롤(Cholesterol); (b) 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC); 및 (c) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000(DSPE-PEG2000)을 포함하는 것을 특징으로 하는 리포좀.
  4. 제2항에 있어서, 상기 지질의 (c) DSPE-PEG2000은 리포좀 내에 포함되는 전체 DSPE-PEG2000 중 일부가 엽산과 부착된 것을 특징으로 하는 리포좀.
  5. 제1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 또는 제2항에 따른 리포좀을 포함하는 생체 내 영상화를 위한 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 영상화는 CT(computed tomography), 자기 공명 이미징(Magnetic resonance　imaging: MRI), 양전자 방출 단층 촬영(positron emission tomography:　PET) 및 단일 광자 방출 계산된 단층촬영(single-photon emission computed tomography: SPECT)을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 또는 제2항에 따른 리포좀을 포함하는 암 진단용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 또는 제2항에 따른 리포좀을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  10. 하기 화학식 9 또는 10의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 9]
    Figure pat00050

    [화학식 10]
    Figure pat00051

    (상기 화학식 9 및 10에서, 상기 k는 5 내지 30의 정수이다.)
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