KR20230019567A - 활성산소종 유도 및 이로 인해 자가활성화되는 다공성 실리콘 나노입자 기반의 약물 전달체 및 이의 제조방법 - Google Patents

활성산소종 유도 및 이로 인해 자가활성화되는 다공성 실리콘 나노입자 기반의 약물 전달체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

이소티오시아네이트 모이어티가 표면에 부착된 다공성 실리콘 나노입자는 생체적합성이 높아 부작용이 낮고, 외부 개시제 없이 세포 내에서 활성산소종을 발생시킬 수 있으며, 이로 인해 분해가 촉진되어 담지된 약물 방출이 촉진될 수 있다.

Description

활성산소종 유도 및 이로 인해 자가활성화되는 다공성 실리콘 나노입자 기반의 약물 전달체 및 이의 제조방법 {Porous silicon nanoparticle-based drug delivery system inducing reactive oxygen species and self-activation thereof, and method for preparing the same}
본 발명은 활성산소종 유도 및 이로 인해 자가활성화되는 다공성 실리콘 나노입자 기반의 약물 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
종양에 대한 화학 요법에서 세포내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 증가는 세포 주기 억제 및 세포 사멸 유도를 통해 종양 성장을 억제할 수 있기 때문에 내재적 항암제 후보로 여겨졌다.
세포 내 ROS 수치는 화학 요법/방사선 요법을 통해서 증가시킬 수 있으며, 이로 인한 ROS 스트레스는 암세포를 파괴하는데 기여한다. 현재까지 항암 치료방법으로써 ROS를 증가시키는 방법은 크게 두 가지 영역으로 분류할 수 있다.
첫 번째는 외부개시제로 ROS 생성을 유도하는 방법이다. 광동역학치료(photodynamic therapy, PDT)에서, 감광제(photosensitizer) 또는 이의 나노제형을 투여하고 외부 개시제인 빛을 가하여 ROS를 생성시킬 수 있다. 그러나 빛과 같은 외부개시제는 내부 장기에 위치한 암에 적용하기 불편한 단점이 있다.
두 번째는 세포 내 개시제에 의한 ROS 생성이다. 금속 기반의 나노입자는 세포 내 과산화수소에 의해 ROS를 생성시킬 수 있다. 이 반응은 외부 개시제가 필요없이 세포 내 과산화수소와 같은 내부 개시제에 의해서 히드록실라디칼을 생성시킬 수 있는 장점이 있으나, 금속계 나노입자 고유의 독성 및 비분해성에 의해 부작용이 크다는 단점이 있다
또한 기존의 ROS 생성 나노제형은 암세포에서 과발현된 글루타티온(glutathione), 시스테인(cysteine)과 같은 바이오티올(biothiol)로 인해 ROS 농도가 감소된다는 한계점이 있다.
따라서, 외부 개시제 없이 세포 내에서 ROS를 생성시킬 수 있고, 특정 암세포를 표적화할 수 있으며, 치료 효과를 향상시키기 위해 항암제를 전달하며, 생체 독성이 낮고 생분해성이 높은 나노 약물전달체가 필요하다.
대한민국 공개공보 제10-1990214호(2019.06.11)
ACS Appl. Mater. Interfaces 2021, 13, 26, 30359-30372 (2021.06.18)
일 구체예에 따르면 외부개시제 없이 특정 세포 내에서 활성산소종을 유도하고 및 이로 인해 자가활성화되어 담지된 약물 방출이 촉진되는 다공성 실리콘 나노입자 기반의 약물 전달체를 제공한다.
일 양상은 다공성 실리콘 나노입자; 및 상기 다공성 실리콘 나노입자 표면에 접합(conjugate)된 이소티오시아네이트(isothiocyanate) 모이어티; 를 포함하는, 약물전달체를 제공한다.
상기 다공성 실리콘 나노입자는 약물을 담지할 수 있고, 생체적합성 및 생분해성이 높아 부작용이 낮다. 또한 이소티오시아네이트 모이어티가 표면에 접합됨으로써 외부 개시제 없이 세포 내에서 활성산소종을 발생시킬 수 있고, 활성산소종 발생으로 인해 다공성 실리콘 나노입자의 분해가 촉진되어 담지된 약물 방출이 가속화될 수 있는 장점이 있다.
상기 다공성 실리콘 나노입자는 2 내지 50 nm의 기공을 갖는 메조기공성(mesoporous) 구조이거나, 2 nm 이하의 기공을 갖는 마이크로기공성(microporous) 구조이거나, 또는 이들이 혼재된 구조를 가질 수 있다.
상기 다공성 실리콘 나노입자의 평균 직경은 100 내지 200nm일 수 있다.
상기 약물전달체의 평균 직경은 100 내지 500 nm일 수 있다.
상기 이소티오시아네이트(isothiocyanate, ITC)는 -N=C=S 구조를 갖는 작용기이다. 도 1 및 도 3에 따르면, 상기 약물전달체는 혈액에서 활성화되지 않으나, 세포 내로 침투하면 이소티오시아네이트기와 글루타티온(GSH)이 결합하여 외부개시제 없이 세포내 활성산소종 수준을 증가시킬 수 있다.
일 실시예에 따르면, 이소티오시아네이트계 화합물을 다공성 실리콘 나노입자와 반응시켜 다공성 실리콘 나노입자 표면에 이소티오시아네이트계 모이어티가 접합 또는 결합된 약물전달체를 제조할 수 있다.
상기 이소티오시아네이트계 화합물(isothiocyanate-based compound)은 실리콘 나노입자 표면에 접합 또는 결합되어 이소티오시아네이트계 모이어티를 형성할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 상기 이소티오시아네이트계 화합물은 예를 들면 트리에톡시(3-이소티오시아나토프로필)실란 (triethoxy(3-isothiocyanatopropyl)silane), 트리에톡시(2-이소티오시아나토에틸)실란(triethoxy(2-isothiocyanatoethyl)silane), 트리에톡시(4-이소티오시아나토부틸)실란(triethoxy(4-isothiocyanatobutyl)silane), 트리에톡시(5-이소티오시아나토펜틸)실란(triethoxy(5-isothiocyanatopentyl)silane), 디에톡시-(2-이소티오시아나토에틸)-메틸실란(diethoxy-(2-isothiocyanatoethyl)-methylsilane), 디에톡시-(3-이소티오시아나토프로필)-메틸실란(diethoxy-(3-isothiocyanatopropyl)-methylsilane) 디에톡시-(4-이소티오시아나토부틸)-메틸실란(diethoxy-(4-isothiocyanatobutyl)-methylsilane), 4-시오티오시아나토부틸(트리메톡시)실란(4-isothiocyanatobutyl(trimethoxy)silane), 에톡시카보닐이소티오시아네이트(ethoxycarbonyl isothiocyanate), 3-이소티오시아나토벤젠아민(3-Isothiocyanatobenzenamine) 일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 이소티오시아네이트 모이어티는 상기 다공성 실리콘 나노입자 표면에 직접 접합된 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 약물전달체는 다공성 실리콘 나노입자에 담지된 약물 또는 전구약물(prodrug)을 더 포함할 수 있다. 상기 약물 또는 전구약물은 다공성 실리콘 나노입자의 무게 대비 20% 이상 담지될 수 있다.
상기 약물은 다공성 실리콘 나노입자에 담지될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
상기 약물은 항암제일 수 있다. 상기 항암제는 예를 들면, 켐토세신 계열 항암제, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(7-Ethyl-10-hydroxycamptothecin, SN-38), 파클리탁셀 (paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cis-platin), 도데탁셀(docetaxel), 타목시펜(tamoxifen), 캄토세신(camtothecin), 아나스테로졸(anasterozole), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 베로테칸(belotecan), 이리노테칸(irinotecan), 글리벡(gleevec), 모노메칠 오리스타틴 E(MMAE), 머탄신(DM1), 소라브탄신(DM4) 및 빈크리스틴(vincristine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 전구약물(prodrug)은 약리학적으로 활성이 낮거나 비활성이지만, 특정 조건에서 약리학적 활성을 갖는 약물로 전환될 수 있는 것을 의미한다. 상기 전구약물은 모약물(parent drug)의 유도체이거나, 또는 모약물과 프로모이어티(promoiety)가 에스터기(ester), 카보네이트기(carbonate), 카바메이트기(carbamate), 우레아기(urea), 아마이드기(amide) 또는 포스페이트기(phosphate)를 매개로 결합된 것일 수 있다. 모약물은 상기 항암제일 수 있으나, 특별히 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에 따르면, 상기 전구약물은 암세포 내 환경에서 세포 독성을 나타내는 약물로 전환되는 것일 수 있다. 상기 전구약물은 활성 산소종(ROS) 또는 에스테라아제(esterase)에 의해 모 약물과 에스터 결합된 프로모이어티(promoiety)가 제거됨으로써 활성을 갖는 약물로 전환되는 것일 수 있다. 상기 프로모이어티는 인도메타신(Indomethacin), 아세클로페낙(Aceclofenac), 니프룸산(Niflumic acid), 케토프로펜(Ketoprofen), 2-(6-Methoxy-2-naphthyl)propanoic acid, 페노프로펜(Fenoprofen), 플루페남산(Flufenamic acid), 플루르비프로펜(Flurbiprofen), 이부프로펜(Ibuprofen), 록소프로펜(Loxoprofen), 메페남산(Mefenamic acid) 및 톨페남산(Tolfenamic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물일 수 있다. 예를 들면, 상기 전구 약물은 메페남산과 SN-38이 에스터 결합된 JS-11일 수 있다. 상기 JS-11은 하기 구조를 가질 수 있다.
[JS-11의 구조]
Figure pat00001
상기 전구약물 JS-11은 암세포에 흡수되면 높은 ROS 수준 또는 과발현된 옥시게나아제에 의해 메페남산이 제거되고 항암제 SN-38로 전환되어 세포 독성을 나타낼 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 다공성 실리콘 나노입자의 표면에 접합된 종양 호밍 펩타이드를 더 포함할 수 있다. 상기 종양 호밍 펩타이드(Tummor Homing Peptide, THP)는 종양 표적 펩타이드로도 불리우며, 종양에 존재하는 수용체에 특이적으로 결합하는 고리형 또는 선형 펩타이드이다. 상기 종양 호밍 펩타이드는 다공성 실리콘 나노입자 표면 또는 링커에 접합될 수 있고 종양 특이성을 나타내는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 상기 종양 호밍 펩타이드는 700여개가 넘는 종류가 알려져 있으며, 예를 들면 CGKRK-함유 펩타이드(서열번호 1), CREKA-함유 펩타이드(서열번호 2), 및 RGR-함유 펩타이드(서열번호 3)로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 종양 호밍 펩타이드는 다공성 실리콘 나노입자의 표면에, 또는 표면에 부착된 링커에 접합될 수 있으며, 펩타이드의 N말단 또는 C말단이 접합될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 약물전달체는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 화학식 1에서, pSiNP는 다공성 실리콘 나노입자이고, 상기 R1은 탄소수 1 내지 8의 알킬기일 수 있다. 상기 R1은 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 약물전달체는 하기 화학식 2로 표시될 수 있다:
[화학식 2]
Figure pat00003
상기 화학식 2에서, pSiNP는 다공성 실리콘 나노입자이고, 상기 R1은 탄소수 1 내지 8의 알킬기이고, 상기 THP는 종양 호밍 펩타이드(Tumor Homing Peptide)이고, 상기 L은 링커이며, X는 0 또는 1이다. 상기 R1은 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기일 수 있다. 상기 THP는 링커를 경유하거나, 또는 경유하지 않고 pSiNP에 결합할 수 있다. 상기 링커는 통상기술자에게 알려진 링커를 사용할 수 있으며, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG); 폴리에틸렌옥사이드(PEO); 폴리에틸렌이민(PEI); 폴리비닐알콜(PVA); 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 수용성 고분자 링커일 수 있다. 상기 공중합체의 예를 들면 PEO-PPO-PEO, PEO-PPO-PEO, PEG-PEI, PEG-PVA, PEG-PEI-PVA 및 PEI-PVA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 수용성 고분자를 사용할 수 있다. 상기 링커가 PEG라면, PEG의 분자량은 500 내지 20,000 달톤, 500 내지 약 10,000 달톤, 500 내지 6,000 달톤 또는 평균 5,000 달톤의 평균 분자량을 가질 수 있으나 특별히 한정되는 것은 아니다.
상기 화학식 1 또는 화학식 2에서, R1-N=C=S는 이소티오시아네이트 모이어티일 수 있다. 상기 R1은 이소티오시아네이트계 화합물에서 유래한 것일 수 있다. 예를 들어 트리에톡시(3-이소티오시아나토프로필)실란과 pSiNP를 축합반응시키면, R1은 트리에톡시(3-이소티오시아나토프로필)실란로부터 유래한 프로필기일 수 있다.
상기 화학식 1 또는 화학식 2에서, pSiNP 표면에 결합된 이소티오시아네이트 모이어티와 종양 호밍 펩타이드는 편의상 1개씩 표시되었으나, 복수개가 접합될 수 있음은 자명할 것이다.
일 실시예에 따르면, 표면에 이소티오시아네이트 모이어티 및 CGKRK 펩타이드가 접합되고, JS-11을 담지한 다공성 실리콘 나노입자는 1) 췌장암 세포에 특이적으로 결합하여 세포 내부로 침투하고, 2) 외부 개시제 없이 활성산소종 수준을 증가시키고, 3) 활성산소종 수준 증가에 의해 다공성 실리콘 나노입자의 분해가 촉진되어 전구약물 방출이 촉진되며, 4) 방출된 전구약물이 항암제로 전환됨으로써 췌장암 세포를 특이적이고 효율적으로 사멸시킬 수 있다.
다른 양상은, 상기 약물전달체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암은 예를 들면, 전립선암(prostate cancer), 직장암(rectal cancer), 신장암(renal cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 유방암(breast cancer), 대장암(colon cancer), 방광암(bladder cancer), 뇌암(brain cancer), 신경교세포암(glial cancer), 흑색종암(melanoma cancer), 송과체암(pineal gland cancer) 또는 폐암(lung cancer)일 수 있으나, 특별히 한정되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사로 투여할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 통상기술자에게 알려진 방법에 따라 비경구 투여용 제형으로 제제화할 수 있으며, 예를 들면 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또 다른 양상은, 다공성 실리콘 나노입자를 준비하는 단계; 및 이소티오시아네이트 모이어티를 상기 다공성 실리콘 나노입자 표면에 접합(conjugate)시키는 단계; 를 포함하는 약물전달체 제조방법을 제공한다.
상기 다공성 실리콘 나노입자, 이소티오시아네이트 모이어티에 대한 자세한 설명은 상술한 내용과 동일하다.
다공성 실리콘 나노입자는 통상 기술자에게 알려진 방법으로 준비할 수 있다. 예를 들면, 상기 다공성 실리콘 나노입자는 붕소 도핑된 p++ 형 실리콘 웨이퍼를 전기화학적 에칭하고 초음파 분쇄하여 제작할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에 따르면, 이소티오시아네이트 모이어티를 다공성 실리콘 나노입자 표면에 접합하는 단계는 다공성 실리콘 나노입자의 표면에 이소티오시아네이트계 화합물을 반응시켜 수행할 수 있다. 예를 들면, 이소티오시아네이트계 화합물은 축합반응에 의해 다공성 실리콘 나노입자의 Si에 직접 결합할 수 있으며, 이들이 접합된 구조의 예시는 실시예의 화학식 3을 참고할 수 있다. 이소티오시아네이트계 화합물의 예는 상술한 내용과 동일하다.
상기 제조방법은 상기 다공성 실리콘 나노입자에 약물 또는 전구약물을 담지시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 담지는 예를 들면 다공성 실리콘 나노입자에 약물 또는 전구약물을 혼합하고 볼텍스 믹싱하여 수행할 수 있다. 상기 약물 또는 전구약물을 담지시키는 단계는 이소티오시아네이트 모이어티를 다공성 실리콘 나노입자 표면에 부착하기 전에 실시할 수 있다. 상기 약물 또는 전구약물에 대한 설명은 상술한 바와 동일하다.
상기 제조방법은 종양 호밍 펩타이드를 상기 다공성 실리콘 나노입자 표면에 접합시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 접합은 종양 호밍 펩타이드가 다공성 실리콘 나노입자 표면 또는 표면에 접합된 링커에 결합하는 것일 수 있다. 상기 종양 호밍 펩타이드를 접합시키는 단계는 이소티오시아네이트 모이어티를 다공성 실리콘 나노입자 표면에 접합하기 전 또는 후에 실시할 수 있다.
또 다른 양상은, 상기 약물전달체를 개체에게 약제학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 “약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료 기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 투여는 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 동맥내 투여, 또는 직장내 투여일 수 있으나 특별히 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 따른 약물전달체는 외부개시제 없이 세포 내 활성산소종을 유도하고 및 이로 인해 자가활성화되어 담지된 약물 방출이 촉진될 수 있다.
일 구체예에 따른 약물전달체는 암세포 특이적이며, 외부개시제 없이 활성산소종을 유도하고, 이로 인해 담지된 약물 또는 전구약물의 방출이 암세포 특이적으로 촉진됨으로써 항암 효과가 우수하면서도 부작용을 감소시킬 수 있다.
일 구체예에 따른 약물전달체는 세포 및 동물 실험에서 우수한 치료 효과를 나타내면서도, 생체적합성이 우수하고 암세포 선택적인 약물 방출이 일어나므로 기존 항암제 및 ROS 생성 나노제형보다 부작용이 낮은 장점이 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 약물전달체가 세포 내에서 자가활성화 되는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 TEPITC, pSiNP, JS-11, 및 CGKRK 펩타이드로 제작한 약물 전달체를 나타낸 것이다.
도 3은 일 실시예에 따른 약물 전달체가 혈액 내에서는 활성화되지 않고 종양 세포 내에서 활성화되어 약물을 방출하는 과정을 나타낸 것으로, 종양 세포 내에서 ROS 증가, 프로드럭 방출, 및 프로드럭의 활성화로 이어지는 상승 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 TEPITC가 췌장암 세포(BxPC-3) 내 ROS 수준에 미치는 영향을 DCF 형광으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 TEPITC가 췌장암 세포(BxPC-3) 내 ROS 수준에 미치는 영향을 CLSM 이미지로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 TEPITC의 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 7은 TEPITC가 BxPC-3 세포의 Nrf2 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 TEPITC가 BxPC-3 세포의 Nrf2 발현에 미치는 영향을 면역형광으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 TEPITC가 BxPC-3 세포의 HO-1 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 이소티오사이아네이트 모이어티, 종양 호밍 펩타이드, 프로드럭을 포함하는 다공성 실리콘 나노입자 약물전달체를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 11은 pSiNP, pSiNP(JS-11), 및 ROSG-pSiNP(JS-11)의 직경 및 제타전위를 나타낸 것이다.
도 12는 pSiNP와 ROSG-pSiNP(JS-11)의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 13은 pSiNP, pSiNP(JS-11), 및 ROSG-pSiNP(JS-11)의 ATR-FTIR 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 과산화수소의 농도에 따라 ROSG-pSiNP가 분해되는 정도 및 ROSG-pSiNP로부터 방출된 JS-11이 SN-38로 전환되는 정도를 확인한 결과이다.
도 15는 과산화수소의 환경에 따른 ROSG-pSiNP의 분해 및 형태 변화를 TEM으로 확인한 결과이다.
도 16은 ROSG-pSiNP(JS-11)이 췌장암 세포(BxPC-3) 내 ROS 수준에 미치는 영향을 DCF 형광으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 ROSG-pSiNP(JS-11)이 췌장암 세포(BxPC-3) 내 ROS 수준에 미치는 영향을 CLSM 이미지로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 ROSG-pSiNP(JS-11)이 BxPC-3 세포의 Nrf2 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 BxPC-3 세포에 pSiNP, pSiNP-NCS, 및 ROSG-pSiNP(JS-11)가 흡수(uptake)되는 정도를 CLSM 이미지로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 BxPC-3 세포주에 대해 pSiNP, JS-11, pSiNPs(JS-11) 및 ROSGpSiNP(JS-11)의 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 췌장암 이종이식 마우스에 대해 pSiNP, pSiNP(JS-11), 및 ROSG-pSiNP(JS-11)를 투여하는 실험과정을 나타낸 것이다.
도 22는 췌장암 이종이식 마우스에 대해 pSiNP, pSiNP(JS-11), 및 ROSG-pSiNP(JS-11)를 정맥주사하고 2시간 후의 장기 및 종양 분포 정도를 확인한 결과이다.
도 23은 췌장암 이종이식 마우스에 대해 pSiNP, pSiNP(JS-11), 및 ROSG-pSiNP(JS-11)를 정맥주사하고 장기 및 종양 분포 정도를 PL 신호로 나타낸 것이다.
도 24 및 도 25는 췌장암 이종이식 마우스에 pSiNP, JS-11, pSiNP(JS-11), 또는 ROSG-pSiNP(JS-11)를 투여하고 종양의 크기 변화를 확인한 결과이다.
도 26은 췌장암 이종이식 마우스에 pSiNP, JS-11, pSiNP(JS-11), 또는 ROSG-pSiNP(JS-11)를 투여하고 혈장 내 AST/ALT 수치 및 간독성을 확인한 결과이다.
도 27은 췌장암 이종이식 마우스에 pSiNP, JS-11, pSiNP(JS-11), 또는 ROSG-pSiNP(JS-11)를 투여하고 종양 조직의 Nrf2/HO-1 단백질 발현을 면역 조직 화학(immunohistochemistry) 실험으로 관찰한 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법
1-1. 세포배양
BxPC-3, AsPC-1 및 PANC-1 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, U.S.A.)로부터 입수했다. 세포는 10%(v/v) 태아 소 혈청(FBS), 100U/mL 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640에서 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양되었다.
1-2. PEITC/TEPITC로 유도된 세포내 ROS 생성 분석
2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA/H2DCFDA) 세포 ROS 검출 분석 키트를 사용하여 세포들의 세포내 ROS 수준(intracellular ROS level)을 분석하였다. BxPC-3, AsPC-1 및 PANC-1 세포(1 x 105 cells/mL, 100 ㎕/well)를 96웰 블랙 플레이트에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 세포를 각각 1.25, 2.5, 5, 10 및 20μM의 PEITC 또는 TEPITC로 처리한 다음 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 양성대조군으로 과산화수소(H2O2)를 처리한 세트를 준비하였다. 그런 다음, 세포를 37℃에서 45분 동안 20μM DCFDA(100㎕)로 처리했다. 485/535nm의 여기/방출 파장을 마이크로플레이트 리더(Fluorostar Omega, BMG labtech, Germany)로 측정하였다. 세포 내 ROS 생성은 BxPC-3 세포를 사용하여 CLSM(LSM800, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 이미징으로 평가하였다. BxPC-3 세포(1 x 105 cells/mL, 2mL)를 공초점 접시에 접종했다. 24시간 인큐베이션 후, 세포를 2시간 동안 20μM PEITC 및 TEPITC로 처리하였다. 그 다음 세포를 37℃에서 45분 동안 20μM DCFDA(200μL)로 염색한 다음 PBS로 3회 세척하고, DAPI로 10분 동안 염색했다. 3회 세척한 후 세포를 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정하였다. 여기 및 방출 채널은 다음과 같다: DAPI(405 nm, 400-520 nm band filter), ROS(488 nm, 400-585 nm band filter).
1-3. 다공성 실리콘 나노 입자 준비
붕소가 고농도로 도핑된 p++-type 단결정 실리콘 웨이퍼에 48% 수성 불산(HF) 및 에탄올(absolute ethanol)이 3:1 부피비로 혼합된 전해질 용액을 처리하고 전기화학적으로 에칭하여 다공성 희생층(porous sacrificial layer)을 생성시켰다. 이어서, 2M 수산화칼륨 용액(KOH)을 사용하여 다공성 희생층을 제거하였다.
그 다음 천공 에칭 파형(perforated etching waveform)을 적용하여 다공성 실리콘 층을 형성시켰다. 1.8초 동안 46 mA cm-2의 낮은 전류 밀도와 0.4초 동안 334 mA cm-2의 높은 전류 밀도 펄스를 300 사이클 반복했다. 그 다음 에탄올 중 7.5% 수성 HF로 구성된 용액에서 3 mA cm-2의 전류 밀도를 300초 동안 적용하여 다공성 실리콘층을 실리콘 웨이퍼로부터 분리(lift-off step)하여 pSi 필름을 얻었다.
pSi 필름을 탈이온수(DI H2O, 6mL)가 들어 있는 밀봉된 유리 바이알(22.18mL 크기, VWR, 제품 번호 66011-143, Radnor, PA, USA)에 넣고 24시간 동안 초음파 베쓰(VWR, 모델 번호 VWRA142-0307, Radnor, PA, USA)에서 파쇄하여 다공성 실리콘 나노 입자(pSiNPs)를 얻었다.
다공성 실리콘 나노 입자(pSiNPs)를 DI H2O(12mL)에서 25℃에서 10일 동안 인큐베이션하여 표면에 실리콘 산화물 층을 형성한 다음 0.22 ㎛ 주사기 필터(Millipore, Millex 주사기 필터 유닛, 220 nm 모델 번호 SLGP033RS, Burlington, MA, USA)로 필터링하였다. 그 다음 여과된 pSiNP를 원심분리(14,000rpm, 30분)하여 수집하고 EtOH로 재분산/세척(3회)했다.
1-4. pSiNP(JS-11) 준비
pSiNP(~1 mg) 및 JS-11 스톡 용액(20 mg/mL DMSO, 50㎕)을 EtOH(1.45 mL)에 분산시키고, 볼텍스 믹서(600 rpm, Scientific Industries, Inc., Vortex-Genie 2, 모델 번호 SI-0246, Bohemia, NY, USA)로 25°C에서 24시간 혼합하였다. JS-11이 로딩된 pSiNP를 원심분리(14,000rpm, 15분)하고 EtOH로 세척(3회)하여 로딩되지 않은 유리 JS-11을 제거했다.
JS-11 로딩 효율을 분석하기 위해 분광광도계(Agilent Technologies Cary 8454, U.S.A.)를 사용하여 UV/vis 흡수 스펙트럼을 측정하여 각 원심분리 단계의 상등액을 분석했다.
표면 개질 단계 동안 JS-11의 방출을 방지하기 위해 JS-11이 담지된 pSiNP(pSiNP(JS-11), 1 mg/100㎕의 DI H2O)를 90분 동안 2M CaCl2 스톡 용액(900 ㎕)과 혼합했다. pSiNP(JS-11)는 DI H2O, 30% EtOH, 70% EtOH 및 100% EtOH를 이용하여 원심분리(14,000rpm, 15분)를 통해 정제되었다.
1.5 ROSG-pSiNP(JS-11) 준비
pSiNP(JS-11)(~1mg) 및 3-아미노프로필디메틸에톡시실란(APDMES, 20㎕)을 EtOH(1mL)에 혼합하고, 볼텍스 믹서(600rpm, Scientific Industries, Inc., Vortex-Genie 2, 모델 번호 SI-0246, Bohemia, NY, U.S.A.)를 사용하여 25℃에서 4시간 동안 볼텍싱했다.
아민 말단을 갖는 나노입자를 원심분리(14,000rpm, 15분)로 분리하고 EtOH로 세척(3회)한 다음 100 ㎕의 maleimide-PEG-N-hydroxysuccinimide(MAL-PEG-NHS, MW = 5 kDa)(EtOH에서 10 mg/mL)와 혼합하여 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 생성된 입자를 원심분리(14,000rpm, 15분)하고 EtOH로 세척(3회)하여 미반응 MAL-PEG-NHS를 제거하였다. 생성된 입자를 EtOH(1 mL)에 재현탁하고, 3-isothiocyanatopropyltriethoxysilane(TEPITC, 20 ㎕)을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 4시간 동안 볼텍싱(600rpm, Scientific Industries, Inc., Vortex-Genie 2, 모델 번호 SI-0246, Bohemia, NY, USA)한 다음 원심분리(14 000rpm, 15분)하고 EtOH로 3회 세척하였다.
표적화 펩타이드 접합을 위해, 나노입자 함유 EtOH(100μL)를 CGKRK 펩타이드 스톡 용액(DI H2O 중 1mg/mL, 100㎕)에 첨가하고 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션했다. 마지막으로, 생성된 나노입자를 EtOH(3회)로 원심분리하여 정제하고 DI H2O(10㎕, 사용 전 4℃에서 보관)에 분산시켰다.
1-6. 나노입자 특성 확인(characterization)
pSiNP, pSiNP(JS-11), 및 ROSG-pSiNP(JS-11)의 유체역학적 크기 및 제타전위는 Malvern Instruments Zetasizer Nano ZS90(Worcestershire, UK)으로 분석하였다. 나노입자의 형태는 한국기초과학센터(고려대학교, 대한민국 서울)에서 투과전자현미경(TEM, Tecnai, G2 F30ST, FEI Company, OR, U.S.A.)으로 관찰하였다. 감쇠 전반사 푸리에 변환 적외선 분광학(Attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR spectroscopy) 결과는 Thermo Scientific Nicolet iS 5 FT-IR 분광계 기기(64 스캔, Waltham, MA, U.S.A.)으로 얻었다.
1-7. 세포 흡수(cellular uptake)에 대한 CLSM 분석
나노 입자의 세포내 분포 및 세포내 ROS 분석은 BxPC-3 세포와 CLSM(confocal laser scanning microscopy)를 사용하여 평가했다. 세포를 1 x 105 cells/mL의 밀도로 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 2mL의 RPMI-1640을 포함하는 공초점 접시에 파종했다. 37℃에서 24시간 배양 후, 배지를 100 ㎍/mL fluorescein-loaded pSiNP, TEPITC 기능화를 포함하는 fluorescein-loaded pSiNP 및 TEPITC/CGKRK 기능화를 포함하는 fluorescein-loaded pSiNP를 포함하는 RPMI-1640로 교체하였다. 24시간 후, 세포를 PBS(pH 7.4)로 3회 세척하고, 핵 및 막 염색을 위해 염료(DAPI 및 cell mask plasma membrane)를 사용하였다. PBS(pH 7.4)로 3회 세척한 후 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 20분간 인큐베이션하였다. 여기 및 방출 채널은 다음과 같다: DAPI(405 nm, 400-520 nm band filter), 플루오레세인(488 nm, 400-585 nm band filter) 및 세포막(640/670 ± 20 nm).
1-8. 나노입자에 의해 유도된 세포내 ROS 생성 분석
나노 입자 유도 세포 내 ROS는 제조업체의 프로토콜에 따라 DCFDA/H2DCFDA 세포 ROS 검출 분석 키트를 사용하여 측정하였다. BxPC-3 세포(웰당 1 x 105개 세포)를 96웰 블랙 플레이트에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 세포를 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 ㎍/mL의 pSiNP, JS-11, pSiNP(JS-11) 및 ROSG-pSiNP(JS-11)로 처리하고 5시간 동안 배양했다.(JS-11양은 pSiNP(JS-11))의 로딩 효율을 사용하여 계산되었다) 인큐베이션 후 20μM DCFDA 시약(100 ㎕)을 각 웰에 첨가한 다음 37℃에서 45분 동안 인큐베이션했다.
형광 여기/방출 파장(485/535 nm)은 마이크로플레이트 리더(FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Germany)를 사용하여 측정하였다. 나노 입자 유도 세포 내 ROS 생성은 BxPC-3 세포의 CLSM 이미징에 의해 모니터링되었다.
세포(1 Х 105 cells/mL, 2 mL)를 공초점 접시에 파종했다. 24시간 배양 후, 세포를 37℃에서 2시간 동안 100㎍/mL pSiNP 및 ROSG-pSiNP(JS-11 제외)로 처리한 다음 37℃에서 45분 동안 20μM DCFDA(200μL)로 염색했다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후 DAPI로 10분 동안 염색하였다. 3회 더 세척한 후 세포를 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정하였다. 마지막으로 세포내(intracellular) ROS를 관찰하였다. 여기 및 방출 채널은 각각 DAPI(405nm, 400-520nm band filter) 및 ROS(488nm, 400-585nm band filter)였다.
1-9. 실험동물 준비
BALB/c 누드 마우스(암컷 및 수컷, 4주 및 5주령)는 대한민국 경기도 나라(주)로부터 상업적으로 입수하였다. BxPC-3 세포(5 Х 106 세포, RPMI 배지와 Matrigel의 100㎕ 혼합물에 현탁, 1:1)를 각 마우스의 옆구리 뒤에 피하 주사했다. 모든 동물 실험은 대한민국 경희대학교 동물관리위원회(IACUC) 지침에 따라 수행되었다.
1-10. 생물분포 분석 (Biodistribution Analysis)
이종이식(xenograft) 마우스에서 나노 입자의 생체 분포를 확인하기 위해 IVIS 이미징을 수행했다. 이종이식 종양이 있는 마우스를 무작위로 4개 그룹으로 지정했다(암컷, 그룹당 n = 3). IVIS 영상 실험은 피하 종양의 가장 긴 직경이 ~10mm에 도달했을 때 수행되었다. 각 그룹의 마우스를 다음 4개 그룹으로 나누었다. (1) 대조군(PBS 정맥주사(i.v.)), (2) pSiNP 그룹(pSiNP 정맥주사), (3) pSiNP(JS-11) 그룹(pSiNP(JS-11) 정맥주사) 및 (4) ROSG-pSiNP 그룹 (JS-11)(ROSG-pSiNP(JS-11) 정맥주사). 입자(100㎕ PBS 현탁액 중 20 mg/kg)를 마우스에 정맥내 주사(i.v.)하고 2시간 후에 마우스를 희생시켰다. 절제된 종양/주요 장기(폐, 심장, 간, 비장, 신장)의 형광 신호는 VISQUE In Vivo Smart LF 발광 및 형광 동물 영상 시스템(Vieworks Co., Ltd., 대한민국)을 사용하여 측정하였으며 GFP 여기(λex = 390-490 nm) 및 ICG 방출 필터(λem = 810-860 nm)를 사용하였다.
1-11. 치료효율 분석(Therapeutic Efficacy Assay)
종양이 있는 마우스(tumor-bearing mice)를 무작위로 5개 그룹(그룹당 n = 5)로 나누고, (1) PBS만, (2) pSiNP만, (3) JS-11, (4) pSiNP(JS-11), (5) ROSG-pSiNP(JS-11)를 각각 100 ㎕씩 20 mg/kg의 용량(dose)으로 3일 간격으로 4회 정맥주사(i.v.)로 투여하였다.
실험이 끝날 때까지 3일마다 마우스 종양의 크기를 기록하고 V = [(종양 길이) Х (종양 너비)2]/2.44의 공식으로 종양 부피를 계산했다. 실험 종료 시점(22일째)에 각 마우스의 몸을 디지털 카메라로 촬영하여 체중을 측정하였다.
IACUC의 종말점 모니터링 및 인도적 종료에 대한 지침(Guidelines for Endpoint Monitoring and Humane Termination)에 따라 대조군의 조건을 고려하여 실험을 종료하였다. 각 마우스의 종양은 마취(anesthesia) 후 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 코팅 튜브를 사용하여 전혈 관류(whole blood perfusion) 후 수집되었다.
종양 성장 억제 T/C 비율(대조군에 대한 처리군의 평균 종양 중량의 비율)을 사용하여 치료 효능을 계산하였다. 종양 성장 억제 T/C 비율 방정식은 다음과 같다. T/C 비율 = (Tt/T0)/(Ct/C0) (여기서, Tt = 시간 t에서 치료된 종양 부피 중앙값, T0 = 시간 0에서 치료된 종양 부피 중앙값, Ct = 시간 t에서 대조군의 중앙 종양 부피, 및 C0 = 시간 0에서 대조군의 중앙 종양 부피).
조직학적 분석을 위해 절개된 장기(간, 신장, 비장, 심장 및 폐) 및 종양을 10% 포르말린 용액에 침지시켰다. 혈액 응고 후, 혈액학적 분석을 위해 즉시 4,000 xg에서 30분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 동물을 이용한 모든 실험은 대한민국 서울 경희대학교 IACUC의 승인된 지침 및 프로토콜에 따라 수행되었다.
실시예 1: 자가활성화 치료용 나노입자 설계
ITC에 의한 ROS 생성에 기초하여, 하기 4개의 주요 구성요소로 구성된 SATN(self-activating therapeutic nanoparticles) 시스템인 ROSG-pSiNP-(JS-11)를 제작했다. (도 2 참고)
(i) 3-Isothiocyanatopropyltriethoxysilane(TEPITC): ROS 생성 모이어티이다. TEPITC 모이어티는 에탄올 용매에서 축합 반응을 통해 pSiNP의 표면에서 기능화될 수 있다. 구체적으로, TEPITC 모이어티의 트리에톡시실란(triethoxysilane, (C2H5O)3Si)과 pSiNP 표면의 실란올(silanol, Si-OH)의 에탄올 용매에서의 축합 반응을 통해 pSiNP 표면이 기능화될 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 표면이 기능화 된 pSiNP는 하기 화학식 3으로 표시될 수 있다:
[화학식 3]
Figure pat00004
(ii) pSiNP(porous Si Nanoparticle): ROS에 반응하여 분해되는 약물전달 플랫폼이다. pSiNP는 생리적 환경에서 분해 가능하며 ROS에 노출되면 분해가 가속화될 수 있다.
(iii) JS-11: 메페남산(mefenamic acid)과 SN-38이 접합된 ROS-반응성 프로드럭이다. JS-11의 메페남산 에스테르 모이어티는 ROS에 의해 절단되어 항암제인 SN-38를 방출할 수 있다. 프로드럭 형태 및 나노입자 캡슐화에 의한 이중차폐 제형(double-shielded formulation)은 SN-38의 치료 효과를 증가시키고 부작용을 줄일 수 있다.
(iv) CGKRK: 암-표적화 펩티드이다. CGKRK는 신생혈관 내피 세포(neovascular endothelial cell)에 대한 결합 친화도가 높기 때문에 나노입자의 혈관내 침투(intravasation)를 강화할 수 있으며, 나노입자의 세포 침투(cell penetration)도 강화할 수 있다.
상기 (i) 내지 (iv)이 조합된 나노입자는 암 표적화, ROS 매개 치료를 위한 in situ ROS 자가생성, ROS 매개 자가활성화(나노입자의 분해, 프로드럭의 방출, 및 방출된 프로드럭의 약물로의 전환)의 앙상블 작용을 일으킬 수 있을 것으로 예상했다(도 3 참고). 표적 내에서의 자가활성화 및 턴온형(turnon-type) 약물방출이 가능한 약물전달체는 기존의 DDS 플랫폼이 가지는 비특이적 분해에 의한 약물 방출 및 비암(noncancer) 표적화에 따른 문제점을 해결할 수 있다.
실시예 2: Isothiocyanate 모이어티의 세포내 ROS 상향조절(upregulate) 및 세포독성
2-1. 이소티오시아네이트의 세포내 ROS 상향조절
세포에 ITC를 접촉시키고 세포내 ROS 생성을 평가하였다. 인간 췌장 세포주 BxPC-3, AsPC-1 및 PANC-1에 TEPITC로 처리하고 DCFDA/DCF 키트를 사용하여 ROS 수준을 측정했다. 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate(DCFDA)는 세포 내로 확산되면 세포 에스테라아제에 의해 H2DCF로 탈아세틸화되며, H2DCF가 ROS와 접촉하면 녹색 형광의DCF로 전환된다. Phenethyl isothiocyanate(PEITC) 및 H2O2를 양성대조군으로 사용하였다. 각각의 화학 물질(TEPITC, PEITC 및 H2O2, 농도 = 0 ~ 20 μM)을 세포주에 처리하고 2시간 동안 인큐베이션하였다.
도 4에 따르면, TEPITC를 처리한 세포는 세포질 내에서 형광이 크게 증가하였으므로 in situ ROS 수준이 상향조절(upregulate)되었음을 알 수 있다. 화학물질 처리 전과 비교하면 형광 강도 기반 향상 인자(fluorescence intensity-based enhancement factor)는 TEPITC(20μM) 처리군에서 6.34배, PEITC(20μM) 처리군에서 3.67배 더 높았다. 형광 분석 및 CLSM(confocal laser scanning microscopy) 이미지에 따르면, TEPITC는 세포 내 ROS 수준을 상향 조절하며, 항암 효과가 알려진 PEITC 보다 효과가 우수하였다. (도 5 참고)
2-2. 이소티오시아네이트의 세포 독성
다음으로, TEPITC의 세포독성을 분석하였다. BxPC-3 세포에 TEPITC 또는 PEITC를 0 내지 10 μM 처리하고 24시간 동안 인큐베이션하고, CCK-8 분석으로 세포독성 및 생존을 분석했다. 도 6에 따르면, TEPITC 및 PEITC 모두 용량 의존적으로 유사한 세포독성 결과를 나타내었으며, 10μM TEPITC를 처리한 BxPC-3 세포의 세포독성은 미처리군 세포에 비해 최대 80%까지 현저하게 증가하였다. AsPC-1 및 PANC-1을 포함한 다른 세포주에서도 유사한 결과가 관찰되었다.
2-3. 이소티오시아네이트의 Nrf2/HO-1 산화적 스트레스 신호전달과의 관계
TEPITC 처리와 세포내 ROS 상향조절 사이의 연관성을 확인하기 위해 산화 스트레스 관련 신호 전달 경로를 분석했다. PEITC를 양성 대조군으로 사용하였다. PEITC는 인간 전립선암 PC-3 세포에서 Nrf2 축적을 유도하고 내인성 헴 옥시게나아제-1(heme oxygenase-1, HO-1) 단백질의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
도 7의 A에 따르면, BxPC-3 세포에 TEPITC 20μM 또는 PEITC 20μM를 처리하고 0 내지 4시간 동안 인큐베이션한 결과, 산화적 스트레스에 대한 세포 저항성의 조절인자인 Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)의 발현이 크게 증가하였다. TEPITC 처리군 및 PEITC 처리군 모두 인큐베이션 후 30분이 경과한 시점에서 Nrf2 발현이 가장 크게 증가하였다. 주목할만한 점은, TEPITC 처리군의 Nrf2 발현은 인큐베이션 시작 후 30분이 경과했을 때 최대였지만, 1시간 후부터 감소하였다. 이는 세포의 산화 스트레스 신호 전달 경로에 대한 TEPITC의 자극이 시간의 제약을 받을 수 있음을 나타낸다. 도 7의 B에 따르면 TEPITC를 0 내지 20μM 농도로 처리한 결과 TEPITC에 의한 Nrf2 수준 증가는 2.5 내지 10 μM의 범위에서 농도 의존적인 것으로 관찰되었다.
CLSM 이미징을 사용하여 TEPITC가 세포질 Nrf2의 핵 전위(nuclear translocation)를 유도하는지 검증했다. BxPC-3 세포에 TEPITC(0-10 μM)를 처리하여 30분간 배양하고 Nrf2 항체 및 DAPI를 처리하여 시각화했다.
도 8에 따르면, 면역형광 결과는 웨스턴 블롯 결과와 일치했다. TEPITC(2.5μM) 처리군에서는 세포질에서 Nrf2 발현의 증가가 관찰되었으며, 이보다 2배 높은 농도의 TEPITC(5μM) 처리군에서는 핵 내 Nrf2 발현이 관찰되었다. 이보다 4배 높은 농도의 TEPITC(10μM) 처리군에서 핵에서의 Nrf2 신호가 약화되었고 주로 세포질에서 Nrf2 신호가 나타났다.
산화 스트레스에 대한 세포 보호에 필수적인 항산화 효소인 HO-1의 발현 수준도 분석하였다. TEPITC(5μM)를 세포에 처리하고 0-6시간 인큐베이션하였다. 도 9에 따르면, TEPITC에 의해 세포내 HO-1의 발현 수준이 크게 증가하였다. 이는 Nrf2가 HO-1의 발현을 조절하는 전사인자이기 때문으로 생각된다. Nrf2 수준은 0.5 내지 1h 지점에서 최대 수준이었던 반면에, HO-1의 발현량은 2시간과 4시간에서 가장 높았으나 6시간부터는 감소하였다.
정리하면, 이소티오시아네이트는 세포 내 ROS 수준을 증가시킴으로서 Nrf2/HO-1 신호전달 체계에 영향을 미치고, 세포 독성을 나타냄으로써 암세포 사멸 효과를 가질 수 있다.
실시예 3: ROSG-pSiNP-(JS-11)의 제작 및 특성 분석
TEPITC에 의한 세포내 ROS 생성 결과에 기초하여, pSiNP의 표면에 TEPITC를 기능화하고, pSiNP 기공에는 ROS 반응성 프로드러그 JS-11을 함유하는 SATN 제형을 제작했다.
도 10을 참고하여 제작과정을 설명한다. 붕소가 고농도로 도핑된 p++-type 실리콘 웨이퍼를 전기화학적 에칭하여 다공성 실리콘 필름을 제작하고, 이를 초음파 분쇄(ultrasonic fragmentation)하여 pSiNPs를 제조하였다. 프로드럭 JS-11를 칼슘 이온(Ca2+)과 함께 pSiNPs와 혼합하고 볼텍스 믹싱하여 pSiNP의 기공에 JS-11을 로딩하였다. pSiNP(JS-11)에 (3-아미노프로필)-디메틸에톡시실란(APDMES)를 처리하여 pSiNP의 표면에 1차 아민 그룹이 생성되도록 개질하였다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커인 MAL-PEG-NHS(maleimide-PEG-N-hydroxysuccinimide)(5kDa)를 아미드 커플링을 통해 pSiNP(JS-11) 표면의 1차 아민에 접합(conjugate)시켰다. 다음으로, 가수분해 축합을 통해 TEPITC를 나노입자 표면에 그래프팅하였다. 마지막으로, CGKRK 종양 표적화 펩타이드를 PEG의 말레이미드(maleimide) 말단과 펩타이드의 시스테인 말단 사이의 티올-엔(thiolene) 커플링 반응에 의해 접합시켰다. 제작된 나노입자는 ROSG-pSiNP(JS-11)로 명명하였다.
ROSG-pSiNP(JS-11)를 투여하면 CGKRK의 호밍(homing) 특성으로 인해 종양 부위에 ROSG-pSiNP(JS-11)가 축적될 수 있고, 암세포 내부로 침투하여 in situ ROS를 생성하고, ROS에 의해 pSiNP 분해를 유도함으로써 이에 담지된 전구약물(prodrug)을 방출하며, 마지막으로 ROS에 의해 전구약물이 약물로 전환될 수 있으므로 암세포 특이적이고 높은 치료 효과 및 부작용 감소를 기대할 수 있다.
JS-11은 메페남산(mefenamic acid)과 7-에틸-10-하이드록시캄프토테신(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin, SN-38)의 카보디이미드 커플링 반응으로 합성했다. (수율 95.5%). 메페남산은 통증 치료제인 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs)의 한 종류이다. 메페남산과 SN-38가 에스테르 결합된 JS-11은 H2O2 처리에 의해 절단되어 SN-38로 전환될 수 있으므로 ROS에 반응하는 프로드럭으로 사용될 수 있다. JS-11의 순도는 1H/13C 핵자기공명(NMR) 및 고분해능 질량분석기(HR-MS)로 확인하였다.
JS-11가 ROS에 의해 SN-38로 전환되는지를 확인하기 위해 37℃에서 H2O2를 사용한 JS-11의 방출 스파이크(emission spike) 변화를 측정했다. JS-11은 전자 푸시-풀(push-pull) 능력이 없기 때문에 수성 매체에서는 방출이 없지만 H2O2에 노출되면 분해되어 560nm에서 형광을 나타내었다. JS-11은 H2O2에만 반응하였으며, 금속 이온, 생체 분자 및 다양한 pH(pH 3-10) 조건에서는 SN-38로의 전환을 나타내지 않았다.
pSiNP 나노입자들의 직경 및 제타전위(zeta potential)를 측정하였다. 도 11에 따르면, pSiNP는 평균적인 유체역학적 직경이 균일한 것으로 나타났다(172.2 ± 56.7 nm, PDI(polydispersity index) = 0.105). 제타전위는 DLS(dynamic light scattering)으로 측정한 결과 -35.4 ± 7.75 mV의 음의 제타전위 값을 나타냈다. JS-11이 탑재된 나노입자인 pSiNP(JS-11)는 크기(194.3 ± 86.7 nm, PDI = 0.229)가 약간 증가하고, 음의 표면 전하(-26.7 ± 7.66mV)가 약간 감소했다. APDMES로 변형된 pSiNP(JS-11)는 APDMES의 양성 1차 아민 작용기로 인해 제타 전위 값이 크게 변화하였다(25.9 ± 9.22 mV). MAL-PEG-NHS이 접합된 pSiNP(JS-11)는 약간 감소된 제타 전위(13.7 ± 5.7 mV)를 나타냈다. TEPITC가 부착된 나노입자는 유의미한 표면 전하 변화(9.4 ± 4.2 mV)가 발생하지 않았다. TEPITC 및 CGKRK 펩타이드가 모두 결합된 최종 제형인 ROSG-pSiNP(JS-11)는 약간의 표면 전하(+0.61 ± 3.31 mV)와 함께 증가된 입자 크기(303.2 ± 84.2 nm, PDI = 0.318)를 나타냈다.
인산완충식염수(PBS, pH 7.4)와 세포배양배지(DMEM) 환경에서, ROSG-pSiNP(JS-11)는 크기 분포가 유사하고(PBS: 337.7 ± 81.4 nm, DMEM: 350.8 ± 90.9 nm), 음의 표면 전하를 나타냈다(PBS: 4.69 ± 7.2 mV, DMEM: 5.64 ± 6.2 mV).
그리고 ROSG-pSiNP(JS-11)는 DI H2O, PBS, 및 DMEM에서 입자 응집 또는 빠른 분해가 관찰되지 않았다. 이는 ROSG-pSiNP(JS-11)의 높은 콜로이드 안정성을 나타낸다.
도 12는 pSiNP와 ROSG-pSiNP(JS-11)의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 나타낸 것이다. 이에 따르면, pSiNP의 형태와 크기의 균일성은 약물 로딩 및 ROS 생성 모이어티/펩티드 접합 후에도 유지되었다.
도 13에 따르면, pSiNPs의 ATR-FTIR(Attenuated Total Reflectance Fourier Transform Infrared) 스펙트럼은 ν(OH) 신축(stretching)에 해당되는 3550-3200 cm-1 및 ν(Si-O) 신축(stretching)에 해당되는 1065 cm-1 두 가지 특성 밴드가 나타났다. 약물 로딩 후, pSiNP(JS-11) 제형은 지방족 사슬의 ν(C-H) 신축 진동에 해당되는 2950-2860 cm-1, ν(C=O) 신축에 해당되는 1710-1680 cm-1, 및 방향족 에스테르의 ν(C-O)에 대한 신축 진동에 해당되는 1310-1250 cm-1에서 밴드를 나타냈다. 이는 JS-11이 pSiNP에 성공적으로 로딩되었음을 시사한다. ROSG-pSiNP(JS-11) 나노입자는 2140 및 1650 cm-1에서 특성적인 밴드를 나타냈다. 이는 isothiocyanate의 굽힘(bending) 모드 및 아미드 결합의 신축(stretching) 진동에 기인한 것으로 TEPITC와 CGKRK 펩티드가 성공적으로 접합되었음을 나타낸다.
ROSG-pSiNP(JS-11)는 ~26.7 ± 2.3%에서 JS-11의 로딩 효율을 나타냈다. JS-11의 로딩 효율은 하기 식 1에 의해 계산하였다.
[식 1]
Figure pat00005
로딩되지 않은 JS-11의 농도는 표준 흡수 곡선에서 계산되었다. 나노입자에 로딩된 JS-11이 pSiNP(JS-11)의 표면 개질 단계에서 방출되지 여부를 확인하기 위해 각 표면 개질 단계 [(1) 칼슘 처리, (2) APDMES 개질, (3) NHS-PEG-MAL 접합(conjugation), (4) TEPITC modify, (5) CGKRK 펩타이드 접합]을 UV/vis 흡수 스펙트럼을 측정하여 분석하였다.
각 표면 개질 단계에서 JS-11의 특징적인 흡수 피크가 관찰되지 않았기 때문에, pSiNP에 로딩된 JS-11는 표면 개질 단계 동안 방출되지 않은 것으로 확인되었다.
나노 입자의 특성 확인 후, ROSG-pSiNP를 소량의 H2O2와 함께 37℃에서 인큐베이션하고 ROS에 의해 입자 분해가 유도되는지, 그리고 ROS에 의해 JS-11에서 SN-38로 전환되는지 여부를 확인했다. pSiNP는 Si 골격에 의해 405 nm에서 흡수를 나타내며, pSiNP는 분해됨에 따라 투명도가 증가한다.
도 14의 A에 따르면, pSiNPs의 흡수 강도는 분해로 인해 시간 경과에 따라(0-60분) 감소했으며, H2O2의 농도(0-1000μM)가 높을수록 감소폭이 증가했다.
ROSG-pSiNP(JS-11)의 JS-11 방출 및 SN-38 전환 프로파일을 분석했다. ROSG-pSiNP(JS-11)를 H2O2(1mM)를 함유한 PBS(pH 7.4)에서 인큐베이션하고 SN-38의 형광 신호를 일정한 시간 간격(0-24시간)으로 측정하였다.
도 14의 B에 따르면, H2O2가 있는 실험군은 24시간 경과 후 SN-38가 90% 이상 전환된 반면, H2O2가 없는 실험군은 24시간 경과 후에도 SN-38가 20% 미만으로 전환된 것으로 나타났다.
추가로 도 15의 TEM 분석 결과에 따르면, pSiNP에 PBS 또는 H2O2로 처리한 후 1시간이 경과한 후에, PBS에서는 나노입자의 형태의 변화가 없으나, H2O2에서는 분해가 진행되어 형태가 크게 변화되었다. 이로서 pSiNP가 ROS에 노출되면 분해가 가속화되는 것을 알 수 있다. 이는 ROS에 의한 표면의 silanol (Si-OH) 형성 및 orthosilicic acid (Si(OH)4)으로의 전환과 관련이 있다.
실시예 4: ROSG-pSiNP(JS-11)의 in vitro 세포 독성 평가
상기 실시예 3의 In vitro 분석에 따르면, ROSG-pSiNP(JS-11)가 종양 내에서 ROS에 의한 자가 활성화 후에 약물을 방출할 수 있다는 이론적 근거가 준비되었다.
BxPC-3 세포에 대한 ROSG-pSiNP(JS-11)의 세포 내 ROS 생성 능력을 확인하기 위해 DCFDA/DCF 분석을 수행했다. BxPC-3 세포에 pSiNP, JS-11, pSiNP(JS-11) 및 ROSG-pSiNP(JS-11)(나노입자 농도는 0~100 μg/mL)를 각각 처리하고 5시간 동안 인큐베이션하였다.
도 16에 따르면, ROSG-pSiNPs(JS-11) 처리군은 용량 의존적으로 DCF 형광신호의 강도가 증가하였다. ROSG-pSiNP(JS-11)를 100㎍/mL 처리한 세포의 ROS 수준은 PBS 대조군보다 8.3배 높았으며, 그 값은 325 μM H2O2를 처리한 세포의 ROS 수준과 일치했다. 또한 JS-11이 없는 ROSG-pSiNP 제형이 ROS 생성 특성을 가지고 있음을 확인했다.
도 17의 CLSM 세포 이미징에 따르면, ROSG-pSiNP 처리된 실험군은 PBS 및 pSiNP를 처리한 실험군보다 DCF의 형광 신호가 높게 관찰되었다. 이는 세포 독성 분석 및 형광 신호 분석의 결과와 일치했다.
ITC로 표면 개질된 나노입자가 세포 내 ROS 수준을 증가시킨다는 가설을 검증하기 위해, BxPC-3 세포를 ROSG-pSiNP(JS-11)(농도 0~100 ㎍/mL)와 함께 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하고 GSH 수준 및 글루타티온 퍼옥시다제(GPx) 효소 활성을 분석하였다. ROSG-pSiNP(JS-11)를 처리한 세포는 용량 의존적으로 GSH가 75%까지 고갈되었고, 세포 내 GPx 활성도 크게 감소했다. 이러한 결과는 ITC 기능화된 나노입자(ROSG-pSiNP(JS-11))가 세포 내 GSH 수준을 고갈시킬 뿐만 아니라 GPx 활성을 억제하여 BxPC-3 세포에서 심각한 ROS 축적을 유도함을 나타낸다.
도 18에 따르면, ROSG-pSiNP 처리군은 인큐베이션 시작 후 2시간이 경과한 시점에 Nrf2 발현이 나타났고, 그 결과는 DCF 분석 결과와 일치하였다. JS-11이 로딩되지 않은 pSiNP를 사용하여 CLSM 이미징 및 Nrf2 발현 수준을 분석한 결과, 세포 내 산화 스트레스 및 ROS 생성은 JS-11에 의해 유도된 것이 아님을 확인했다.
ROSG-pSiNP(JS-11)의 암 표적화 능력을 추가로 조사했다. BxPC-3 세포를 (i) fluorescein 로딩된 pSiNP, (ii) fluorescein 로딩된 TEPITC 기능화 pSiNP, 및 (iii) fluorescein 로딩된 TEPITC/CGKRK 기능화 pSiNP와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. DAPI 염색 및 세포 마스크 원형질막 염색을 진행하고 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 이미징을 사용하여 fluorescein의 형광 신호를 분석하고 나노입자의 세포 흡수 및 세포내 국소화를 확인했다.
도 19에 따르면, 표적화 나노입자인 ROSG-pSiNP(TEPITC/CGKRK 기능화를 포함하는 fluorescein 로드 pSiNP)는 비표적화 나노입자(fluorescein 로딩된 pSiNP 및 fluorescein 로딩된 TEPITC 기능화 pSiNP)보다 BxPC-3 세포내 흡수량이 더 높은 것으로 나타났다. DAPI 및 세포 마스크 원형질막 염료가 포함된 이미지에서는 fluorescein 신호(녹색)가 세포질에서 주로 관찰되었으며, 이는 입자가 세포에 효율적으로 침투하였음을 의미한다.
다음으로, BxPC-3 세포주에 대해 pSiNP, JS-11, pSiNPs(JS-11) 및 ROSG-pSiNP(JS-11)의 세포 독성을 평가했다. pSiNP(JS-11) 및 ROSG-pSiNP(JS-11)의 처리량은 JS-11(0-10μM)의 농도로 보정하였다.
도 20에 따르면, 음성대조군인 pSiNP는 세포 독성이 매우 낮았으나, 나머지는 용량 의존적으로 유의한 독성을 나타냈다. ROSG-pSiNP(JS-11) 처리군은 가장 높은 독성을 나타냈다. 결과는 다음과 같았다: (i) 낮은 농도(0.625μM JS-11)에서: JS-11는 21.6%; pSiNP(JS-11)는 31.11%; 및 ROSG-pSiNP(JS-11)는 42.5%이고, (ii) 고농도(10μM JS-11)에서: JS-11는 42.4%; pSiNP(JS-11)는 54.3%; 및 ROSG-pSiNP(JS-11)는 79.1%이다.
JS-11 및 TEPITC의 상승적 세포 독성 효과를 확인하기 위해 pSiNP-NCS(JS-11 없음, TEPITC 개질) 및 pSiNP-NCS/CGKRK(JS-11 없음, TEPITC 및 CGKRK 개질)의 두 가지 나노제제의 세포 독성을 추가로 분석했다. 저농도(0.625μM JS-11, 12.5μg/mL 나노입자)에서, pSiNP-NCS 및 pSiNP-NCS/CGKRK는 JS-11 나노제형을 함유한 나노입자보다 낮은 독성을 나타냈다. pSiNP-NCS는 16.7%, pSiNP-NCS/CGKRK는 33.1%인 반면, pSiNP(JS-11)는 31.11%이고 ROSG-pSiNP(JS-11)는 42.5%로 나타났다. 고농도(10μM JS-11, 100μg/mL 나노입자)에서 pSiNP-NCS(53.1%) 및 pSiNP-NCS/CGKRK(67.1%)의 세포독성도 ROSG-pSiNP(JS-11)(79.1%)보다 낮았다.
JS-11보다 pSiNP(JS-11)의 독성이 더 높은 것은 세포 침투가 향상되었기 때문이며, ROSG-pSiNPs(JS-11)의 독성이 더 높은 것은 pSiNP(JS-11) 및 JS-11이 없는 나노입자(pSiNP-NCS 및 pSiNP NCS/CGKRK)보다 독성이 더 높기 때문이다. 이는 CGKRK 펩타이드에 의한 세포 침투력 향상, TEPITC 모이어티에 의한 in situ ROS 생성, 및 세포내에서 JS-11에서 SN-38로의 전환들이 복합적으로 작용하여 상승효과를 일으키는 것으로 판단된다.
실시예 5: ROSG-pSiNP(JS-11)의 in Vivo 항암 효능 평가
췌장암 이종이식(xenograft) 마우스 모델에서 ROSG-pSiNP(JS-11)의 암 특이적 치료 효능을 입증했다.
먼저 ROSG-pSiNP(JS-11)의 용혈성(hemolytic properties)을 조사하여 정맥주사(intravenous injection)시 안전성을 확인하였다. 적혈구를 ROSG-pSiNP(JS-11)가 0.1mg/mL 함유된 용액에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 및 Triton X-100을 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용했다. ROSG-pSiNP(JS-11)는 적혈구에서 <1%의 무시할 수 있는 용혈 비율을 나타냈으므로(p<0.001) 정맥 주사에 대한 안전성이 우수한 것으로 확인되었다.
다음으로, ROSG-pSiNP(JS-11), pSiNP(empty), 및 JS-11이 로드된 pSiNP의 생체 분포를 확인했다. 상기 나노입자를 췌장암 모델 마우스에 20 mg/kg의 용량으로 정맥내(i.v.) 주사하였다. (도 21 참고) 나노입자 주사 1시간 및 2시간 후, 내부 장기(심장, 폐, 간, 신장 및 비장) 및 종양을 수득하고 pSiNP 고유의 광발광(intrinsic photoluminescence, PL)을 분석하였다.
주입 1시간 후 장기 및 종양의 경우, 대조군(PBS injected)은 조직 자가형광 신호를 나타내지 않았으나, 모든 나노제형(pSiNP, pSiNP(JS-11) 및 ROSG-pSiNP-(JS-11))은 종양 부위에 비해 심장, 폐, 간 및 신장에서 강한 신호를 나타냈다.
그러나 주입 2시간 후, 간 및 신장에서의 축적이 극적으로 감소했다. 또한 도 22 및 도 23에 따르면, 비표적 나노제형(pSiNP 및 pSiNP(JS-11))은 종양 보다 심장, 폐, 신장 및 간 내에서 강한 PL 신호를 나타냈지만, 표적 나노제형 ROSG-pSiNP(JS-11)는 장기들에서 나타나는 신호가 감소하고 종양 부위 내에서 신호가 더 강하게 나타냈다.
ROSG-pSiNP(JS-11)가 생체 내에서 제거되는 과정을 분석했다. ROSG-pSiNP(JS-11)를 BALB/c 마우스에 20 mg/kg의 용량으로 정맥 주사하고, 2시간 및 24시간 순환 후 마우스를 희생시켰다. 주요 장기(폐, 심장, 간, 비장 및 신장)를 수득하고 pSiNP의 PL 신호를 측정했다. 2시간 순환 시점에서는 ROSG-pSiNP(JS-11)가 주로 간과 신장에 축적되었다. 그러나 24시간 순환 시점에서는 장기에 축적된 ROSG-pSiNP(JS-11)가 현저하게 제거되었다. pSiNP의 제거 메커니즘은 가용성 규산(Si(OH)4)으로 분해된 후 배설되는 것으로 알려져 있으므로 ROSG-pSiNP(JS-11)도 동일한 메커니즘에 의해 체내에서 제거될 것으로 생각된다.
마지막으로 췌장암 이종이식 모델 마우스에서 ROSG-pSiNP(JS-11)의 암 치료 효능을 평가했다. 췌장 종양을 유도하기 위해 0일째에 BxPC-3 세포를 마우스의 옆구리(flank) 뒤 피하(subcutaneous) 부위에 주사하였다. BxPC-3 세포를 주사하고 4주가 경과한 후의 종양 크기는 약 150 mm3였다. 종양 주사 후 34일, 37일, 40일, 및 43일째에 췌장 종양이 있는 마우스에 PBS, JS-11, pSiNP(JS-11) 및 ROSG-pSiNP(JS-11)를 꼬리 정맥(tail vein)을 통해 20 mg/kg의 용량으로 투여했다. 마우스의 종양 부피와 체중 변화를 모니터링하고 실제 적용을 위한 독성 효과를 조사했다.
도 24에 따르면, ROSG-pSiNP(JS-11)를 투여한 실험군은 빈 pSiNP, JS-11 및 pSiNP(JS-11)를 투여한 실험군과 비교하면 51일 기준으로 종양 부피가 유의하게 감소한 것으로 나타냈다.
도 25에 따르면, pSiNP와 pSiNP(JS-11)는 종양 크기를 약간 감소시켰지만 ROSG-pSiNP(JS-11)는 종양 크기를 극적으로 감소시켰다. ROSG-pSiNP(JS-11) 처리군의 평균 종양 부피는 93.5 ± 22.7 mm3인 반면, pSiNP, JS-11 및 pSiNP(JS-11) 처리군의 평균 종양 부피는 각각 259.6 ± 57.8 mm3, 183.1 ± 40.8 mm3 및 179.0 ± 37.6 mm3였다. 나노 입자를 주사한 모든 마우스에서 유의한 체중 변화는 일어나지 않았다.
간독성 마커인 ALT(alanine transferase) 및 AST(aspartate transaminase)의 혈장 수준을 측정하여 pSiNP, JS-11, pSiNP(JS-11), 및 ROSG-pSiNP(JS-11)의 간독성(hepatotoxicity)을 분석하였다. 췌장암 이종이식 모델 마우스의 꼬리 정맥에 20 mg/kg의 나노입자(pSiNP, pSiNP(JS-11) 및 ROSG-pSiNP(JS-11)) 및 해당 농도의 JS-11(5.2 mg/kg)을 주입했다. BxPC-3 세포 접종 후 51일째에 혈장 내 AST/ALT 수치를 분석하였다.
도 26에 따르면, PBS, pSiNP, pSiNP(JS-11), 및 ROSG-pSiNP(JS-11) 처리군에서는 간독성이 나타나지 않았는데(AST < 200 U/L, ALT < 60 U/L), JS-11 처리군은 PBS 대조군보다 AST 및 ALT 수준이 각각 2.8배 및 3.5배 더 높게 나타났다. 실험결과에 따르면, pSiNP(JS-11) 및 ROSG-pSiNP(JS-11)이 간 대사 과정에 서 약물방출이 일어나지 않기 때문에 간독성이 높은 항암제인 JS-11을 종양 특이적으로 전달함으로써 부작용을 낮추고 치료 효과를 높일 수 있음을 시사한다.
면역 조직 화학(immunohistochemistry) 실험으로 종양 조직의 산화 스트레스와 관련된 Nrf2/HO-1 단백질 발현을 관찰했다.
도 27에 따르면, ROSG-pSiNP 제형으로 투여된 종양 조직에서 Nrf2 및 HO-1 단백질의 발현 증가를 확인했으며 이는 in vitro 결과와 일치하였다. 실험결과를 종합하면, ROSG-pSiNP(JS-11) 제제는 종양 특이적으로 ROS 생성을 유도하고 산화 스트레스를 유발함으로써 체중 감소 및 간독성 없이 췌장암 크기를 선택적이고 유의하게 감소시킬 수 있다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Porous silicon nanoparticle-based drug delivery system inducing reactive oxygen species and self-activation thereof, and method for preparing the same <130> CDP20210561 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tumor homing peptide <400> 1 Cys Gly Lys Arg Lys 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tumor homing peptide <400> 2 Cys Arg Glu Lys Ala 1 5 <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tumor homing peptide <400> 3 Arg Gly Arg 1

Claims (11)

  1. 다공성 실리콘 나노입자;
    및 상기 다공성 실리콘 나노입자 표면에 접합된 이소티오시아네이트(isothiocyanate) 모이어티; 를 포함하는,
    약물전달체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 실리콘 나노입자에 담지된 약물 또는 전구약물을 더 포함하는,
    약물전달체.
  3. 제3항에 있어서,
    상기 전구약물은 활성 산소종에 의해 약물로 전환되는 것인,
    약물전달체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 실리콘 나노입자의 표면에 접합된 종양 호밍 펩타이드를 더 포함하는,
    약물전달체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 종양 호밍 펩타이드는 RGR-함유 펩타이드, CGKRK-함유 펩타이드 및 CREKA-함유 펩타이드으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상인,
    약물전달체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 약물전달체는 하기 화학식 1로 표시되는, 약물전달체:
    [화학식 1]
    Figure pat00006

    상기 화학식 1에서, pSiNP는 다공성 실리콘 나노입자이고,
    상기 R1은 탄소수 1 내지 8의 알킬기이다.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 약물전달체는 하기 화학식 2로 표시되는, 약물전달체:
    [화학식 2]
    Figure pat00007

    상기 화학식 2에서, pSiNP는 다공성 실리콘 나노입자이고,
    상기 R1은 탄소수 1 내지 8의 알킬기이고,
    상기 THP는 종양 호밍 펩타이드(Tumor Homing Peptide)이고,
    상기 L은 링커이며, X는 0 또는 1이다.
  8. 다공성 실리콘 나노입자, 및 상기 다공성 실리콘 나노입자 표면에 접합된 이소티오시아네이트(isothiocyanate) 모이어티를 포함하는 약물전달체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  9. 다공성 실리콘 나노입자를 준비하는 단계; 및
    이소티오시아네이트 모이어티를 상기 다공성 실리콘 나노입자 표면에 접합시키는 단계; 를 포함하는 약물전달체 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 다공성 실리콘 나노입자에 약물 또는 전구약물을 담지시키는 단계를 더 포함하는,
    약물전달체 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 다공성 실리콘 나노입자 표면에 종양 호밍 펩타이드를 접합시키는 단계를 더 포함하는,
    약물전달체 제조방법.
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