KR20230019276A - 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자의 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 수용성 대두 다당류 및 키토산을 이용한 파이토케미칼 나노입자의 제조방법은 제조과정에서 비수용성인 약물을 용해하기 위한 유기용매를 사용하지 않아 인체에 사용하기 위한 기능성 물질로서의 안전성을 더욱 증가시키고, 유기용매를 증발하기 위한 복잡한 과정을 생략하고, pH를 조절하는 간단한 방법으로 나노입자를 형성시킴으로써, 유기용매를 증발시키는 복잡한 과정을 생략하고 나노입자의 제조과정을 간소화하였으며, 수용성 키토산을 추가함으로써 나노입자의 안정성을 더욱 증진시키는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 제조방법으로 제조된 나노입자는 수용성이 증진되어, 플라보노이드계 물질의 단점이었던 낮은 생체 이용률과 비수용성을 극복하는 효과가 있으므로, 본 발명의 나노입자는 항산화, 항염 및 피부세포 재생용 화장품; 암의 치료제; 및 항산화, 항염 및 피부세포 재생용 건강기능식품의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자의 제조방법 및 이의 용도{Method for producing phytochemical nanoparticle with increased particle stability and solubility and uses thereof}
본 발명은 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
파이토케미칼(phytochemical)은 식물성을 의미하는 '파이토(phyto)'와 화학을 의미하는 '케미칼(chemical)'의 합성어로, 건강에 도움을 주는 생리활성이 있는 식물성 화학물질을 의미한다. 또한, 파이토케미칼은 건강에만 중요한 역할을 하는 것이 아니라 식물의 독특한 맛, 향, 색깔을 부여해 각각의 음식 고유의 개성을 나타내주기도 한다.
파이토케미칼은 생명유지를 위해 반드시 섭취해야 하는 필수영양소는 아니지만 파이토케미칼의 섭취가 지속적으로 부족할 경우 건강에 좋지 않은 영향을 미칠 수 있다. 최근에 이에 대한 연구가 활발히 이루어지면서 건강유지에 필요한 성분으로 더 주목 받고 있다.
하지만 퀘르세틴(quercetin)을 포함한 플라보노이드계 화합물들은 대부분 열 및 산화 조건에 대한 불안정성과 불수용성에 관한 문제점이 지속적으로 제기되어 왔다. 또한, 경구 흡수성 및 생체 내 흡수율이 낮아 플라보노이드 화합물을 단일물질로서 체내 활용하는데 한계가 있다. 따라서 상기 한계를 극복하기 위한 다양한 연구들이 진행 중이다.
나노입자(nanoparticle)는 적어도 한 차원이 100nm 이하인 입자이며, 금속, 세라믹, 폴리머, 지방 또는 단백질 등 다양한 물질로 제조할 수 있다. 나노입자는 기능성 물질 또는 약물을 실어 우리 체내의 다양한 장벽[예컨대, 혈액뇌장벽(blood-brain barrier)]을 통과하여 원하는 곳으로 전달할 수 있게 한다. 이러한 장점은 플라보노이드계 화합물의 가장 큰 단점인 체내 흡수율을 극복해 줄 수 있는 기술로 주목받고 있다. 하지만, 대부분 나노입자 제조기술 과정에서 기능성 물질 또는 약물을 용해하기 위해 유기용매를 사용하는 방법이 널리 이용되고 있어, 유기용매의 사용 없이 안전하고 손쉬운 나노입자의 제조방법을 개발할 필요성이 있다.
한편, 한국등록특허 제2076769호에는 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트, 이를 포함하는 나노입자 및 이의 제조방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1996713호에는 진세노사이드 및 인지질 기반 지질나노입자 및 이의 제조방법이 개시되어 있지만, 본 발명의 수용성 대두 다당류 및 키토산을 이용하여 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자를 제조하는 방법 및 이의 증진된 항산화, 항염, 피부세포 재생 및 항암 용도에 관해서는 전혀 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 수용성 대두 다당류 및 키토산을 이용한 파이토케미칼 나노입자의 제조방법을 제공하고, 상기 제조방법으로 제조된 파이토케미칼 나노입자의 입자 안정성 및 수용성, 항산화, 항염, 피부세포 재생 및 항암 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은
1) 알칼리화된 대두 다당류 수용액에 파이토케미칼(phytochemical)을 첨가하여 1차 혼합물을 획득하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 1차 혼합물의 pH를 조절하여 중화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 중화된 1차 혼합물에 키토산 수용액을 첨가하여 2차 혼합물을 획득하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 2차 혼합물을 원심분리한 후 나노입자가 포함되어 있는 상층액을 획득하는 단계;를 포함하는 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자를 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 수용성 대두 다당류 및 키토산을 이용한 파이토케미칼 나노입자의 제조방법은 비수용성 약물을 용해하는 과정에서 유기용매를 사용하지 않아 인체에 사용하기 위한 기능성 물질로서의 안전성을 더욱 증가시키고, 유기용매를 증발하기 위한 복잡한 과정을 생략하고, pH를 조절하는 간단한 방법을 통해 나노입자를 형성시킴으로써, 나노입자의 제조과정을 간소화하였으며, 수용성 키토산을 추가함으로써 나노입자의 안정성을 더욱 증진시키는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 제조방법으로 제조된 나노입자는 수용성이 증진되므로, 플라보노이드계 물질의 단점이었던 낮은 생체 이용률과 비수용성을 극복하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 제조방법으로 제조된 파이토케미칼(퀘르세틴) 나노입자의 캡슐화 효율(EE, encapsulation efficiency)을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 제조방법으로 제조된 파이토케미칼(퀘르세틴) 나노입자(QN)를 투과전자현미경(TEM, transmission electron microscopy)으로 관찰한 결과(A) 및 동적광산란광도계(DLS, dynamic light scattering)를 이용하여 나노입자의 크기를 측정한 결과(B)이다. Free SSPS(before pH cycle)는 pH 처리되지 않은 대두 다당류 수용액이다.
도 3은 본 발명의 퀘르세틴과 수용성 대두 다당류 및 키토산의 상용성 여부 및 형성된 퀘르세틴 나노입자의 열적 특성을 확인하기 위한 DSC(differential scanning calorimetry) 측정 결과이다.
도 4는 본 발명의 제조방법으로 제조된 파이토케미칼(퀘르세틴) 나노입자(+Chito) 및 키토산을 추가하는 과정이 생략된 파이토케미칼(퀘르세틴) 나노입자(-Chito)의 입자 안정성을 나노입자 제조 20일 후까지 확인한 사진이다.
도 5는 본 발명의 제조방법으로 제조된 파이토케미칼(퀘르세틴) 나노입자(QN), 종래 퀘르세틴 단일입자(FQ) 및 파이토케미칼이 포함되지 않은 다당류 바이오 폴리머(SSPS with chitosan)의 물에 대한 용해도를 확인한 사진이다.
도 6은 본 발명의 제조방법으로 제조한 후 동결건조한 파이토케미칼(퀘르세틴) 나노입자(QN) 및 종래 퀘르세틴 단일입자(FQ)를 액체 배지에 분산시킨 후 세포에 처리하여 현미경으로 관찰한 결과이다. HCT-116은 인간 대장암 세포주이고, U2OS는 인간 골육종 세포주이다.
도 7은 본 발명의 제조방법으로 제조된 파이토케미칼(퀘르세틴) 나노입자(QN), 종래 퀘르세틴 단일입자(FQ) 및 파이토케미칼이 포함되지 않은 다당류 바이오 폴리머(SSPS with chitosan)의 세포 내 항산화 효과를 루시퍼라아제 분석을 통해 확인한 결과이다. ***은 media 처리군에 비해 FQ 및 QN 처리군의 루시퍼라아제 발현이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다. ##은 FQ 처리군에 비해 QN 처리군의 루시퍼라아제 발현이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.01이다.
도 8은 본 발명의 제조방법으로 제조된 파이토케미칼(퀘르세틴) 나노입자(QN), 종래 퀘르세틴 단일입자(FQ) 및 파이토케미칼이 포함되지 않은 다당류 바이오 폴리머(SSPS with chitosan)의 항암 효과를 인간 골육종 세포주인 U2OS(A 및 B) 및 인간 대장암 세포주인 HCT-116(C 및 D)에서 시료 처리 농도별로 확인한 결과이다. *, **, ***은 QN 처리군의 세포 생존율이 SSPS with chitosan 또는 FQ 처리군의 세포 생존율에 비해 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이다.
도 9는 본 발명의 제조방법으로 제조된 파이토케미칼(퀘르세틴) 나노입자(QN), 종래 퀘르세틴 단일입자(FQ) 및 파이토케미칼이 포함되지 않은 다당류 바이오 폴리머(SSPS with chitosan)의 피부세포 재생효과를 확인한 결과이다. CCD-986sk는 인간 섬유아세포주이다. *, ***은 QN 처리군의 세포 생존율이 SSPS with chitosan 또는 FQ 처리군의 세포 생존율에 비해 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, ***은 p<0.001이다.
도 10은 본 발명의 제조방법으로 제조된 파이토케미칼(퀘르세틴) 나노입자(QN)의 항염효과를 확인한 결과이다. (M)은 분자 크기 마커, Media는 배지 처리군, SSPS with chitosan은 파이토케미칼이 포함되지 않은 다당류 바이오 폴리머 처리군이다. LPS(Lipopolysaccharide)를 처리하여 염증반응을 유도하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 알칼리화된 대두 다당류 수용액에 파이토케미칼(phytochemical)을 첨가하여 1차 혼합물을 획득하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 1차 혼합물의 pH를 조절하여 중화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 중화된 1차 혼합물에 키토산 수용액을 첨가하여 2차 혼합물을 획득하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 2차 혼합물을 원심분리한 후 나노입자가 포함되어 있는 상층액을 획득하는 단계;를 포함하는 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자의 제조방법에 관한 것이다.
상기 단계 1)의 알칼리화된 대두 다당류 수용액은 pH 11~13인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 pH 12의 대두 다당류 수용액인 것이지만, 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 제조방법은
1) pH 11~13의 알칼리화된 1.5~2.5%(w/v) 대두 다당류 수용액 1mL에 0.2~1.5mg의 파이토케미칼(phytochemical)을 첨가하여 1차 혼합물을 획득하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 1차 혼합물을 HCl을 사용하여 pH 7로 중화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 중화된 1차 혼합물을 3~7분 동안 교반한 다음 0.03~0.1%(w/v) 키토산 수용액을 첨가하고 그 후 50~70분 동안 추가 교반하여 2차 혼합물을 획득하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 2차 혼합물을 원심분리하여 불순물 및 캡슐화되지 않은 파이토케미칼 단일입자를 제거한 후, 나노입자가 포함되어 있는 상층액을 획득하는 단계;를 포함할 수 있고,
바람직하게는
1) pH 12의 알칼리화된 1.8~2.2%(w/v) 대두 다당류 수용액 1mL에 0.5~1.2mg의 파이토케미칼(phytochemical)을 첨가하고, 20~40분 동안 교반하여 1차 혼합물을 획득하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 1차 혼합물을 HCl을 사용하여 pH 7로 중화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 중화된 1차 혼합물을 4~6분 동안 교반한 다음 0.05~0.1%(w/v) 키토산 수용액을 전체 용량 대비 13~17%(v/v)가 되도록 첨가하고 그 후 55~65분 동안 추가 교반하여 2차 혼합물을 획득하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 2차 혼합물을 2900~2950g에서 8~12분 동안 원심분리하여 불순물 및 캡슐화되지 않은 파이토케미칼 단일입자를 제거한 후, 나노입자가 포함되어 있는 상층액을 획득하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있고,
더 바람직하게는
1) pH 12의 알칼리화된 2%(w/v) 대두 다당류 수용액 1mL에 0.5mg의 파이토케미칼(phytochemical)을 첨가하고, 30분 동안 교반하여 1차 혼합물을 획득하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 1차 혼합물을 HCl을 사용하여 pH 7로 중화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 중화된 1차 혼합물을 5분 동안 교반한 다음 0.05%(w/v) 키토산 수용액을 전체 용량 대비 15%(v/v)가 되도록 첨가하고 그 후 60분 동안 추가 교반하여 2차 혼합물을 획득하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 2차 혼합물을 2920g에서 10분 동안 원심분리하여 불순물 및 캡슐화되지 않은 파이토케미칼 단일입자를 제거한 후, 나노입자가 포함되어 있는 상층액을 획득하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 파이토케미칼 나노입자의 캡슐화 효율은 90% 이상일 수 있고, 더 바람직하게는 95% 이상인 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 파이토케미칼은 하이드록시기(-OH)를 가진 파이토케미칼인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 벤조산(benzoic acid), 엘라그산(ellagic acid), 갈산(gallic acid), 바닐릭산(vanillic acid), 카페익산(caffeic acid), 시아니딘(cyanidin), 펠라르고니딘(pelargonidin), 페니딘(penidin), 부테인(butein), 잔토휴몰(xanthohumol), 플로레틴(phloretin), 퀘르세틴(quercetin), 카테킨(catechin), 갈로카테킨(gallocatechin), 나린제닌(naringenin), 아피제닌(apigenin), 바이칼레인(baicalein), 크리신(chrysin), 루테올린(luteolin), 갈란긴(galangin), 아이소람네틴(isorhamnetin), 캠퍼롤(kaempferol), 미리세틴(myricetin), 람네틴(rhamnetin), 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein), 글리시테인(glycitein), 레스베라트롤(resveratrol), 커큐민(curcumin), 카테콜(catechol), 쿠메스트롤(coumestrol), 페세틴(fesetin), 루틴(rutin), 실리빈(silybin), 에리오딕티올(eriodictyol), 아카세틴(acacetin), 디오스메틴(diosmetin), 피오니딘(peonidin), 델피니딘(delphinidin), 말비딘(malvidin), 피노실빈(pinosylvin), 피세아타놀(piceatannol), 클로로겐산(chlorogenic acid), 페룰산(ferulic acid), 하이드록시타이로솔(hydroxytyrosol), 진저롤(gingerol), 캡사이신(capsaicin), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate), 모린(morin) 및 고시페틴(gossypetin) 중에서 선택된 하나 이상인 것이며, 더욱더 바람직하게는 퀘르세틴인 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 파이토케미칼 나노입자는 입자 안정성이 우수하고, 종래의 파이토케미칼 입자에 비해 수용성이 증진되는 특징이 있다.
본 발명의 나노입자는 직경이 10~100nm일 수 있고, 바람직하게는 직경이 15~35nm일 수 있으며, 더 바람직하게는 직경이 20~30nm인 것이고, 가장 바람직하게는 평균 24.4nm의 직경을 가지는 나노입자인 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 화장료 조성물은 항산화, 항염 및 피부세포 재생 효과가 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액, 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 암은 바람직하게는 대장암 또는 골육종이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당하는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염 및 피부세포 재생용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 또는 음료의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
재료 및 방법
1. 재료
수용성 대두 다당류(SOYAFIBE S-CA700, Fuji Oil Co. Ltd, Osaka, Japan)는 (주)남영상사(Seoul, Korea)로부터 제공받았다. 본 발명의 수용성 대두 다당류는 탈지 대두를 이용하여 분리 대두 단백질을 제조하는 과정에서 추출된 불용성 식물섬유로부터 추출, 정제 및 살균하여 제조된 것이다. 본 발명은 4℃에서 16시간 동안 탈이온수(deionized water)에 용해시킨 2%(w/v) 수용성 대두 다당류 수용액을 사용하였다.
수용성 키토산은 속초 바이오텍(Sokcho-si, Gangwon-do, Republic of Korea)에서 구매하였다. 상기 수용성 키토산은 간략히, 게 껍질에서 탈염, 탈단백질화 및 탈아세틸화 단계를 거쳐 제조된 키토산(탈아세틸화도 93%, 분자량 330,000)을 증류수에 혼합된 20%(v/v) HCl 용액에 녹인 후, pH 5.6에서 3시간 동안 교반한 다음, 연속 막 여과 공정을 거친 후 투과액을 동결건조하여 획득한 것이다. 본 발명은 4℃에서 16시간 동안 탈이온수(deionized water)에 용해시킨 0.05%(w/v) 수용성 키토산 수용액을 사용하였다.
퀘르세틴(Q4951; 순도≥95%) 및 HCl(304174)은 시그마 알드리치(St. Louis, MO, USA)로부터 구매하였다. NaOH는 덕산약품(Gyeonggi-do, Korea)으로부터 구매하였다.
1차 항체는 iNOS(D6B6S)(13120S; Cell signaling; 1:1000) 및 β-actin(C4)(sc-47778; Santa Cruz Biotechnology; 1:1000)을 사용하였다.
2. 캡슐화 효율(EE, encapsulation efficiency)
파이토케미칼(퀘르세틴) 나노입자(QN) 내의 퀘르세틴 농도를 측정하기 위해 침전물에 포함된 캡슐화되지 않은 퀘르세틴을 메탄올(106009; Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 용해시키고, UV-VIS 분광 광도계(Multiskan Sky Microplate Spectrophotometer, Thermo Fisher)를 사용하여 파이토케미칼(퀘르세틴) 농도를 측정하였다. 침전물에 포함된 파이토케미칼(퀘르세틴)의 농도는 415nm에서 측정된 용액의 흡광도를 기준으로 정량하였다. 농도는 메탄올에 용해된 다양한 농도의 퀘르세틴 용액의 흡광도로 확립된 표준곡선을 참조하여 계산되었다. EE는 하기 식 1에 의해 계산하였다.
[식 1]
퀘르세틴 나노입자 캡슐화 효율(EE, %)=[총 퀘르세틴 양(mg)-침전된 퀘르세틴 양(mg)]/총 퀘르세틴 양(mg)×100
3. 투과전자현미경(TEM, transmission electron microscopy)
pH 변화를 주기 전 수용성 대두 다당류(Free SSPS)의 형태 및 제조예 1의 파이토케미칼(퀘르세틴) 나노입자(QN)의 형태를 TEM으로 측정하기 위해, 시료를 탈이온수(deionized water)로 10배 희석한 후, 우라늄이 없는 EM 염색 용액(uranyless EM stain solution, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)으로 염색된 400메쉬 구리 그리드(grid)의 글로우 방전 탄소 필름에 떨어뜨렸다. 그 후 시료는 120kV에서 작동하는 LIBRA 120(Carl Zeiss, Germany)으로 촬영되었다.
4. 나노입자의 크기 및 제타전위(zeta-potential) 측정
나노입자의 크기 및 제타전위(zeta-potential)는 Zetasizer Nano-ZS90(Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK)로 측정하였다. 시료는 탈이온수(deionized water)로 20배 희석한 후 사용하였으며, 각 시료는 평균 입자 크기 및 제타전위를 결정하기 위해 3번 반복 실험하였다.
5. 시차주사열량분석법(DSC, Differential scanning calorimetry)
동결건조된 시료의 열적 특성은 시차주사열량계(DSC 4000, Perkin Elmar, Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 측정하였다. 간략히, 모든 시료를 알루미늄 팬으로 밀봉한 후, 30℃에서 1분 동안 유지한 다음, 1분당 10℃씩 증가하는 속도로 최종 350℃까지 가열하였다. 시작 온도는 열 흐름에 의한 유리전이로부터 결정되었고, 피크 온도는 최대 열 흐름에서 결정되었으며, 엔탈피 변화는 곡선의 피크에서 계산되었다. 빈 알루미늄팬이 참조로 사용되었다.
6. 세포 배양
HCT-116, U2OS 및 Raw264.7은 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구매하였고, CCD-986-sk는 한국 세포주 은행으로부터 구매하였다.
HCT-116(인간 대장암 세포주) 및 U2OS(인간 골육종 세포주)는 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum, Thermo Fisher Scientific, USA) 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific, USA)이 포함된 McCoy's 5A 배지로 배양하였고, Raw264.7(마우스 대식세포주) 및 CCD-986-sk(인간 섬유아세포주)는 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)으로 배양하였다.
모든 세포는 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
7. 이중 루시퍼라아제 분석(Dual-Luciferase assay)
이중 루시퍼라아제 분석은 Dual-Luciferase reporter assay 키트(Promega, WI, USA)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었다. 간략히, HCTT-116 세포를 24웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 배양한 후, PolyjetTM 체외(in vitro) DNA 형질주입 시약(SignaGen, Frederick, MD, USA)을 사용하여 pARE-luc 벡터(vector)와 pRL-null 벡터(vector)를 함께 형질주입(transfection)하였다. 형질주입 후 배지에 용해된 제조예 1의 파이토케미칼(퀘르세틴) 나노입자(QN)를 24시간 동안 처리하였다. 종래 퀘르세틴 단일입자(FQ) 및 파이토케미칼이 포함되지 않은 다당류 바이오 폴리머(SSPS with chitosan)는 대조군으로서, 동일하게 실험을 진행하였다. 세포에 처리한 QN 및 FQ의 퀘르세틴 최종 농도는 50㎍/mL이었다. 상대적인 루시퍼라아제 활성도는 SynergyTM HTX multi-mode microplate reader(Biotek Instruments, Winooski, VT, USA)를 사용하여 측정하였다.
8. 세포 증식 분석
HCT-116, U2OS 및 CCD-986-sk를 96웰 플레이트에서 배양하였고, 제조예 1의 파이토케미칼(퀘르세틴) 나노입자(QN), 종래 퀘르세틴 단일입자(FQ) 및 파이토케미칼이 포함되지 않은 다당류 바이오 폴리머(SSPS with chitosan)를 50㎍/mL의 농도로 72시간 동안 처리하였다. 세포 증식 분석은 CellTiter 96® AQueous One Solution(Promega, USA)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다. 72시간 후, 20㎕ One Solution 시약을 각 웰에 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 추가 배양하였다. 그 후, Multiskan FC spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 490nm에서 흡광도에 따른 세포 생존율을 추정하여 세포 증식을 분석하였다.
9. 웨스턴 블랏(Western blot) 분석
시료와 함께 배양된 세포는 단백질분해효소 억제제 및 탈인산화 효소 억제제가 포함된 RIPA 버퍼(GenDEPOT, Katy, TX, USA)를 사용하여 수확하였다. 단백질 농도는 BCA 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 측정하였다.
각 시료 처리군별 세포용해물(lysate)에 들어있는 단백질을 동량(30㎍) 로딩하여 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide electrophoresis) 과정에서 크기별로 분리하였고, 니트로 셀룰로오스 멤브레인(GVS Filter Technology, Sanford, ME, USA)으로 단백질을 옮겨주었다. 그 후, 멤브레인을 5%(w/v) 탈지분유가 포함된 TBS-T[0.05%(v/v) 트윈 20이 포함된 트리스 완충 식염수]로 실온에서 1시간 동안 반응(blocking)시킨 다음 5%(w/v) 탈지분유가 포함된 TBS-T에 희석된 1차 항체를 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 그 후 TBS-T에 희석된 2차 항체(1:5000)를 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, TBS-T로 세척하였고, 세척된 멤브레인에 ECL(enhanced chemiluminescence) 시약(Thermo Fisher Scientific, USA)을 분주한 다음 Alliance Q9 Advanced system(UVTEC CAMBRIDGE, Cambridge, England, UK)을 사용하여 단백질 발현을 시각화하였다.
10. 통계 분석
모든 실험은 최소 3회 이상 독립적으로 수행하였다. 통계 분석은 Microsoft Office Excel 및 GraphPad Prism 8을 사용하여 수행하였고, 값은 ±SD 또는 SEM으로 표시하고, 데이터는 student's t-test를 사용하여 분석하였다. P-값(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001)은 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
제조예 1. 파이토케미칼 나노입자의 제조
1) 파이토케미칼 나노입자의 제조(QN)
4.0M NaOH를 이용하여 pH 12로 알칼리화된 2%(w/v) 대두 다당류 수용액 1mL에 0.25, 0.5, 1 및 2mg의 파이토케미칼(퀘르세틴)을 첨가하고, 30분 동안 교반하여 1차 혼합물을 획득하였다. 그 후, 상기 1차 혼합물에 1.0M HCl을 첨가하여 1차 혼합물의 pH를 7로 중화시켰다. 그 후 상기 중화된 1차 혼합물을 5분 동안 교반한 다음 0.05%(w/v) 키토산 수용액을 전체 혼합물 용량 대비 15%(v/v)가 되도록 첨가하고. 60분 동안 추가 교반하여 2차 혼합물을 획득하였다. 상기 2차 혼합물은 2920g(중력가속도)에서 10분 동안 원심분리하여 불순물 및 캡슐화되지 않은 파이토케미칼(퀘르세틴) 단일입자가 포함되어 있는 침전물을 제거하고, 나노입자가 포함된 상층액을 획득하여 동결건조한 후, 이하 실험에 사용하였다.
2) 파이토케미칼이 포함되지 않은 다당류 바이오 폴리머의 제조(대조군, SSPS with chitosan)
4.0M NaOH를 이용하여 pH 12로 알칼리화된 2%(w/v) 대두 다당류 수용액을 30분 동안 교반한 후, 1.0M HCl을 첨가하여 pH를 7로 중화시키고 5분 동안 교반하였다. 그 후 0.05%(w/v) 키토산 수용액을 중성화된 대두 다당류 수용액 전체 용량 대비 15%(v/v)가 되도록 첨가하고 60분 동안 추가 교반한 후, 2920g에서 10분 동안 원심분리하였으며, 침전물을 제거한 상층액을 획득하여 동결건조한 후, 이후 실험에 대조군으로 사용하였다.
3) 키토산을 포함하지 않는 파이토케미칼 나노입자의 제조(대조군, QN without chitosan)
4.0M NaOH를 이용하여 pH 12로 알칼리화된 2%(w/v) 대두 다당류 수용액 1mL에 0.25, 0.5, 1 및 2mg의 파이토케미칼(퀘르세틴)을 첨가하고, 30분 동안 교반하여 1차 혼합물을 획득하였다. 그 후, 상기 1차 혼합물에 1.0M HCl을 첨가하여 1차 혼합물의 pH를 7로 중화시켰다. 그 후 5분 동안 교반한 다음 2920g에서 10분 동안 원심분리하여, 불순물 및 캡슐화되지 않은 파이토케미칼(퀘르세틴) 단일입자가 포함되어 있는 침전물을 제거한 상층액을 획득하여 동결건조한 후, 이후 실험에 대조군으로 사용하였다.
4) 키토산 및 파이토케미칼을 포함하지 않는 다당류 바이오 폴리머의 제조(대조군, SSPS without chitosan)
4.0M NaOH를 이용하여 pH 12로 알칼리화된 2%(w/v) 대두 다당류 수용액을 30분 동안 교반한 후, 1.0M HCl을 첨가하여 pH를 7로 중화시키고 5분 동안 교반한 다음 2920g에서 10분 동안 원심분리하였으며, 침전물을 제거한 상층액을 획득하여 동결건조한 후, 이후 실험에 대조군으로 사용하였다.
실시예 1. 나노입자의 캡슐화 효율(EE, encapsulation efficiency)
퀘르세틴 나노입자(QN) 내의 퀘르세틴 농도를 측정하기 위해 제조예 1에서 원심분리 후 남은 침전물에 포함된 퀘르세틴을 메탄올에 용해시키고, UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 퀘르세틴 농도를 측정한 후 상기 식 1에 대입하여 계산하였다.
그 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 나노입자 제조시 퀘르세틴의 캡슐화 효율은 알칼리화된 2%(w/v) 대두 다당류 수용액 1mL 당 1mg의 퀘르세틴 농도까지는 95% 이상이었고, 2mg의 퀘르세틴 농도부터는 캡슐화 효율이 약 80%로 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 2. 나노입자 특성
상기 제조예 1에서 제조된 나노입자의 형태, 크기, 제타전위(zeta-potential) 및 열적 특성을 확인하였다.
1) 투과전자현미경(TEM, transmission electron microscopy)을 이용한 파이토케미칼 나노입자의 형태 관찰
pH 조절 전 수용성 대두 다당류(Free SSPS)의 형태 및 상기 제조예 1의 퀘르세틴 나노입자(QN)의 형태를 TEM으로 측정하였다.
그 결과, 도 2A에 개시된 바와 같이 pH 조절 단계에 의해 기존 단일 분자 형태로 있던 다당류가 응집되며 10~100nm 크기의 구 모양 바이오폴리머 나노입자가 형성된 것을 확인할 수 있었다.
2) 파이토케미칼 나노입자의 크기 및 제타전위(zeta-potential) 확인
키토산 포함 유무에 따른 상기 제조예 1의 퀘르세틴 나노입자(QN)의 크기 및 제타전위(zeta-potential)는 Zetasizer Nano-ZS90(Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK)로 측정하였다.
그 결과, 도 2B 및 표 1에 개시된 바와 같이 상기 제조예 1의 퀘르세틴 나노입자(QN)의 크기는 10~100nm 범위로 확인되었고, 입자 평균 크기는 24.438nm였다. 반면, 표 1에 개시된 바와 같이 키토산이 포함되지 않는 퀘르세틴 나노입자(QN without chitosan)의 크기는 평균 20.24nm였다.
한편, 입자 사이에서 반발력이나 인력을 기반으로 하는 양전하 밀도 차이에서 유래되는 전기역학적인 전위차를 나타내는 수치인 제타전위(ζ)는 용액 내 입자의 분산 혹은 응집의 정도를 평가하는데 적용되며, 일반적으로 전위차의 절대값이 클수록 나노입자가 안정된 상태라고 평가한다.
본 발명의 제조예 1의 나노입자의 제타전위의 절대값을 분석한 결과, 수용성 대두 다당류 및 퀘르세틴이 결합한 나노입자에 키토산을 추가함으로써 제타전위의 절대값이 상승한 것을 확인하였고, 이에 따라서 키토산에 의해 나노입자의 안정성이 더욱 증가하였다는 것을 확인하였다.
한편, 다분산지수(PDI, polydispersity index)는 분자량 분포의 넓이를 나타내는 기준이 되며, 수평균 분자량에 대한 무게 평균 분자량의 비로 정의된다. DLS 측정에서 PDI 값이 0에 가까울수록 단분산 형태이며, 1에 가까울수록 다분산형태를 의미한다.
본 발명에서는 표 1에 개시된 바와 같이 키토산을 추가하는 구성에 의해 나노입자가 더욱 균일한 단일 입자 형태로 응집되었다는 것을 확인하였다.
키토산 유무에 따른 퀘르세틴 나노입자의 비교
평균 크기 PDI ζ-전위
QN 24.44±4.33 0.59±0.02 -24.5±1.75
QN without chitosan 20.24±5.71 0.80±0.01 -17.5±0.85
실시예 3. 시차주사열량분석법(DSC, differential scanning calorimetry)
DSC는 시료 물질과 기준 물질을 동시에 가열/냉각시킴으로써 시료의 열 출입을 측정하는 방법이다. 기준 물질은 가열로의 온도 조절에 따라 함께 조절되나 시료 물질은 주어지는 온도에 의해 흡열/발열 반응이 이루어지므로 기준 물질과 온도 차이가 생기게 된다. 따라서 온도 차이에 의해 열량 값을 획득할 수 있게 된다. 열에 의한 곡선이 각각 발열 피크와 흡열 피크로 나타나게 되면, 시료의 특성에 따라 유리전이 온도, 결정화 온도, 녹는점, 수화반응, 산화반응 등 시료의 열적 특성을 확인할 수 있다.
본 발명에서는 퀘르세틴과 수용성 대두 다당류 및 키토산의 상용성 여부 및 형성된 퀘르세틴 나노입자(QN)의 열적 특성을 확인하기 위해 DSC 측정을 진행하였다. 그 결과, 도 3 및 표 2에 개시된 바와 같이 원 재료인 수용성 대두 다당류(SSPS), 퀘르세틴 단일입자(FQ) 및 수용성 키토산(Chitosan)은 단일 물질 자체의 특징적인 강한 흡열 피크가 검출되었다. 수용성 대두 다당류(SSPS)는 198℃에서 흡열 피크를 가지고, 수용성 키토산(Chitosan)은 193, 213 및 313℃에서 3개의 흡열 피크를 나타냈다. 퀘르세틴 단일입자(FQ)는 127 및 324℃에서 두개의 흡열 피크를 나타냈으며, 이를 통해 각각의 피크 온도에서 탈수 및 용융작용을 나타내는 상변화를 일으킨 것을 알 수 있었다.
한편, 키토산이 결합된 퀘르세틴 나노입자(QN) 및 키토산은 결합되고, 퀘르세틴은 포함하지 않은 다당류 바이오 폴리머(SSPS with chitosan)는 특징적인 피크 없이 부드러운 열 곡선을 가졌다. 퀘르세틴 나노입자(QN)의 분석결과에서 퀘르세틴 단일입자의 특징적인 피크가 나타나지 않고, 대조군(키토산은 결합되고, 퀘르세틴은 포함하지 않은 다당류 바이오 폴리머, SSPS with chitosan)과 유사한 형태의 피크를 가지고 있는 것으로 보아, 퀘르세틴은 수용성 대두 다당류 및 키토산 바이오폴리머에 성공적으로 캡슐화되었다는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 키토산 및 퀘르세틴을 포함하지 않는 다당류 바이오 폴리머(SSPS without Chitosan); 및 키토산을 포함하지 않는 퀘르세틴 나노입자(QN without chitosan)는 각각 두개의 흡열 피크가 검출되었다.
4개의 샘플(SSPS without chitosan, SSPS with chitosan, QN without chitosan, QN) 모두에서 완만하고 넓은 범위의 형태를 나타낸 첫번째 흡열피크는 유리전이의 상변화 상태를 의미하는데, 키토산을 포함한 퀘르세틴 나노입자(QN)의 유리전이 개시온도(133.9℃)와 최대 온도 구간(179.7~224.4℃)은 대조군인 퀘르세틴은 포함하지 않은 다당류 바이오 폴리머(SSPS with chitosan)과 비교했을 때 더 높고 넓은 흡열 피크를 나타냈다. 또한, 두번째 흡열 피크는 두 샘플(QN, SSPS with chitosan) 모두 252~270℃ 사이에서 검출되었고, 두번째 흡열 피크 엔탈피는 대조군(SSPS with chitosan)에 퀘르세틴을 추가해줌으로써 9.4J/g에서 73.6J/g으로 크게 증가하였다. 이러한 결과는 나노입자 내 SSPS, 키토산 및 퀘르세틴이 서로 상호작용함으로써 상대적으로 고온의 녹는점을 가지게 한다는 것을 시사한다.
또한, 키토산을 포함한 퀘르세틴 나노입자(QN)의 두번째 흡열 엔탈피(73.6J/g)는 키토산을 넣지 않은 샘플(QN without chitosan)의 엔탈피(42.4J/g)보다 더 높은 값을 가졌다. 이것은 키토산의 첨가가 QN을 더 완성도 높은 바이오폴리머 결정 구조를 가지게 함으로써, 상대적으로 낮은 온도에서의 열에 의한 상전이를 방지하고, QN을 더욱 안정하게 만든다는 것을 의미한다.
시차주사열량분석 결과(To-상전이 개시온도, Tp-상전이 최대온도, Tc-상전이 종료온도)
Onset(To, ℃) Peak(Tp, ℃) End(Tc, ℃) ΔH(J/g)
SSPS peak 1 198.6 200.8 209.5 208.1
FQ(Free Quercetin) peak 1 127.5 138.9 147.5 72.6
peak 2 324.7 328.2 330.6 144.3
Chitosan peak 1 193.9 199.2 212.5 169.7
peak 2 213.1 213.5 220.2 149.3
peak 3 313.9 334.5 342.2 52.5
SSPS without Chitosan peak 1 85.3 132.1 177.1 202.7
peak 2 256.2 264.8 268.4 6.7
SSPS with chitosan peak 1 129.8 148.6 174.36 111.1
peak 2 252.3 257.1 258.6 9.4
QN without chitosan peak 1 105.9 144.2 182.1 132.3
peak 2 252.5 266.3 270.9 42.4
QN peak 1 133.9 179.7 224.4 142.4
peak 2 252.3 259.6 262.9 73.6
실시예 4. 키토산 유무에 따른 나노입자 안정성
기간의 경과에 따른 키토산 포함 나노입자 안정성을 확인하였다.
그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 키토산이 포함된 본 발명의 퀘르세틴 나노입자는 20일 후에도 퀘르세틴이 분해되지 않고 캡슐화한 형태로, 안정적인 나노입자가 형성되어 있는 반면, 키토산이 포함되지 않은 퀘르세틴 나노입자는 1일이 경과된 시점에도 퀘르세틴 단일 입자가 분해되어 빠져나와 가라앉아 있었다. 그러므로, 키토산을 포함하는 본 발명의 퀘르세틴 나노입자(QN)는 입자 안정성이 키토산을 포함하지 않는 퀘르세틴 나노입자(QN without chitosan)에 비해 현저히 우수하다는 것을 확인하였다.
실시예 5. 나노입자의 수용성
퀘르세틴을 포함한 플라보노이드계 화합물들은 물에 대한 용해도가 낮다는 단점이 있다. 따라서 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 퀘르세틴 나노입자의 물에 대한 용해도가 상승하는지 확인하고자, 본 발명의 퀘르세틴 나노입자(QN), 종래의 퀘르세틴 단일입자(FQ) 및 퀘르세틴이 포함되지 않은 다당류 바이오 폴리머(SSPS with chitosan)를 물에 용해시켰다.
그 결과, 도 5에 개시된 바와 같이 종래의 퀘르세틴 단일입자(FQ)는 물과 혼합시 대부분 물에 녹지않고 가라앉은 것을 확인할 수 있었고, 본 발명의 퀘르세틴 나노입자(QN)는 가라앉는 것 없이 물에 모두 분산되어 안정한 수용액 상태로 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 퀘르세틴 나노입자(QN) 및 종래의 퀘르세틴 단일입자(FQ)를 액체 배양 배지에 분산시킨 후 세포에 처리하여 현미경으로 관찰한 결과, 도 6에 개시된 바와 같이 종래의 퀘르세틴 단일입자(FQ)는 배지에 녹지 못하고 결정 상태로 발견되었지만, 본 발명의 퀘르세틴 나노입자(QN)는 배지에 모두 분산되어 녹지 못한 나노입자 결정을 발견할 수 없었다.
실시예 6. 나노입자의 항산화 효과
본 발명의 제조방법으로 제조된 나노입자의 세포 내 항산화 효과를 이중 루시퍼라아제 분석(Dual-Luciferase assay)을 통해 확인하였다. Nrf2 단백질은 유전자 프로모터의 ARE 영역에 결합하여 산화적 손상으로부터 세포를 보호하는 항산화제 및 phase Ⅱ 효소의 발현을 유도한다. 따라서, Nrf2 반응성 리포터 유전자(responsive reporter gene)인 ARE (Antioxidant response element, 항산화반응요소)의 발현 정도를 정량함으로써 세포 내 항산화 활성도를 비교할 수 있다.
HCCT-116 세포에 ARE(antioxidant response element) 유래성 루시퍼라아제 유전자를 형질도입한 후, 동일한 농도의 퀘르세틴 나노입자(QN), 종래의 퀘르세틴 단일입자(FQ) 또는 퀘르세틴이 포함되지 않은 다당류 바이오 폴리머(SSPS with chitosan)를 세포에 처리하여 24시간 동안 배양한 다음 세포의 루시퍼라아제 발현량을 비교하였다.
그 결과, 도 7에 개시된 바와 같이 본 발명의 퀘르세틴 나노입자(QN), 종래의 퀘르세틴 단일입자(FQ) 및 퀘르세틴이 포함되지 않은 다당류 바이오 폴리머(SSPS with chitosan) 처리에 의해 루시퍼라아제 발현량이 증가하였으며, 특히 종래의 퀘르세틴 단일입자(FQ) 대비 본 발명의 퀘르세틴 나노입자(QN) 처리군의 루시퍼라아제 발현량이 현저히 증가하였다. 이는 본 발명의 퀘르세틴 나노입자(QN)의 ARE 프로모터 기반 Nrf2 단백질의 항산화 활성 효과가 종래의 퀘르세틴(FQ)에 대비하여 현저하다는 것을 의미한다.
실시예 7. 나노입자의 항암 효과
본 발명의 제조방법으로 제조된 나노입자의 항암 효과를 인간 대장암 세포주인 HCT-116 및 인간 골육종 세포주인 U2OS를 대상으로 확인하였다.
그 결과, 도 8에 개시된 바와 같이 본 발명의 퀘르세틴 나노입자(QN) 처리군은 종래의 퀘르세틴 단일입자(FQ) 및 퀘르세틴이 포함되지 않은 다당류 바이오 폴리머(SSPS with chitosan) 처리군에 비해 세포 사멸효과가 현저하므로, 본 발명의 퀘르세틴 나노입자(QN)는 대장암 및 골육종에 대한 항암 효과가 우수하다는 것을 확인하였다.
실시예 8. 나노입자의 피부세포 재생 효과
본 발명의 제조방법으로 제조된 나노입자의 피부세포 재생 효과를 인간 섬유아세포주인 CCD-986sk를 대상으로 확인하였다.
그 결과, 도 9에 개시된 바와 같이 본 발명의 퀘르세틴 나노입자(QN) 처리군은 종래의 퀘르세틴 단일입자(FQ) 및 퀘르세틴이 포함되지 않은 다당류 바이오 폴리머(SSPS with chitosan) 처리군에 비해 세포 증식 효과가 현저하므로, 본 발명의 퀘르세틴 나노입자(QN)는 피부세포 재생 효과가 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9. 나노입자의 항염 효과
본 발명의 제조방법으로 제조된 나노입자의 항염증 효과를 마우스 대식 세포인 Raw264.7에서 확인하였다.
그 결과, 도 10에 개시된 바와 같이 본 발명의 퀘르세틴 나노입자(QN) 처리군은 퀘르세틴이 포함되지 않은 다당류 바이오 폴리머(SSPS with chitosan) 처리군에 비해 LPS에 의해 증가된 iNOS의 발현을 감소시키는 효과가 현저하므로, 본 발명의 퀘르세틴 나노입자(QN)는 항염증 효과가 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (10)

1) 알칼리화된 대두 다당류 수용액에 파이토케미칼(phytochemical)을 첨가하여 1차 혼합물을 획득하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 1차 혼합물의 pH를 조절하여 중화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 중화된 1차 혼합물에 키토산 수용액을 첨가하여 2차 혼합물을 획득하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 2차 혼합물을 원심분리한 후 나노입자가 포함되어 있는 상층액을 획득하는 단계;를 포함하는 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 알칼리화된 대두 다당류 수용액은 pH 11~13인 것을 특징으로 하는 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자의 제조방법.
제1항에 있어서,
1) pH 11~13의 알칼리화된 1.5~2.5%(w/v) 대두 다당류 수용액 1mL에 0.2~1.5mg의 파이토케미칼(phytochemical)을 첨가하여 1차 혼합물을 획득하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 1차 혼합물을 HCl을 사용하여 pH 7로 중화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 중화된 1차 혼합물을 3~7분 동안 교반한 다음 0.03~0.1%(w/v) 키토산 수용액을 첨가하고 그 후 50~70분 동안 추가 교반하여 2차 혼합물을 획득하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 2차 혼합물을 원심분리하여 불순물 및 캡슐화되지 않은 파이토케미칼 단일입자를 제거한 후, 나노입자가 포함되어 있는 상층액을 획득하는 단계;를 포함하는 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 파이토케미칼은 벤조산(benzoic acid), 엘라그산(ellagic acid), 갈산(gallic acid), 바닐릭산(vanillic acid), 카페익산(caffeic acid), 시아니딘(cyanidin), 펠라르고니딘(pelargonidin), 페니딘(penidin), 부테인(butein), 잔토휴몰(xanthohumol), 플로레틴(phloretin), 퀘르세틴(quercetin), 카테킨(catechin), 갈로카테킨(gallocatechin), 나린제닌(naringenin), 아피제닌(apigenin), 바이칼레인(baicalein), 크리신(chrysin), 루테올린(luteolin), 갈란긴(galangin), 아이소람네틴(isorhamnetin), 캠퍼롤(kaempferol), 미리세틴(myricetin), 람네틴(rhamnetin), 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein), 글리시테인(glycitein), 레스베라트롤(resveratrol), 커큐민(curcumin), 카테콜(catechol), 쿠메스트롤(coumestrol), 페세틴(fesetin), 루틴(rutin), 실리빈(silybin), 에리오딕티올(eriodictyol), 아카세틴(acacetin), 디오스메틴(diosmetin), 피오니딘(peonidin), 델피니딘(delphinidin), 말비딘(malvidin), 피노실빈(pinosylvin), 피세아타놀(piceatannol), 클로로겐산(chlorogenic acid), 페룰산(ferulic acid), 하이드록시타이로솔(hydroxytyrosol), 진저롤(gingerol), 캡사이신(capsaicin), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate), 모린(morin) 및 고시페틴(gossypetin) 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자.
제5항의 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항산화, 항염 및 피부세포 재생 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제5항의 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제8항에 있어서, 상기 암은 대장암 또는 골육종인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제5항의 입자 안정성 및 수용성이 증가된 파이토케미칼 나노입자를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염 및 피부세포 재생용 건강기능식품 조성물.
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