KR20230017894A - 줄기세포를 이용한 노화 조절 유효인자 구축 방법, 및 그를 이용하여 노화 조절 물질을 스크리닝 하는 방법, 및 그에 의해 도출된 항노화 물질 - Google Patents

줄기세포를 이용한 노화 조절 유효인자 구축 방법, 및 그를 이용하여 노화 조절 물질을 스크리닝 하는 방법, 및 그에 의해 도출된 항노화 물질 Download PDF

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Abstract

줄기세포를 이용한 노화 조절 유효인자 구축 방법, 및 그를 이용하여 노화 조절 물질을 스크리닝 하는 방법, 및 그에 의해 도출된 항노화 물질(삼채 또는 흑삼채 추출물)에 관한 것으로서, 줄기세포의 고갈이 방지될 수 있으므로, 항노화 유효인자의 선별이 용이하다.

Description

줄기세포를 이용한 노화 조절 유효인자 구축 방법, 및 그를 이용하여 노화 조절 물질을 스크리닝 하는 방법, 및 그에 의해 도출된 항노화 물질{A method for constructing an aging-regulating effect factor using stem cells, a method for screening an aging-regulating substance using the same, and an anti-aging substance obtained thereof}
줄기세포를 이용한 노화 조절 유효인자 구축 방법, 및 그를 이용하여 노화 조절 물질을 스크리닝 하는 방법, 및 그에 의해 도출된 항노화 물질(삼채 또는 흑삼채 추출물)에 관한 것이다.
우리 몸은 항상 일정한 상태를 유지하고자 한다. 그러나, '노화'를 거치면서 항상성이 깨지기 시작하는데, 여기서 노화란 병적인 조건과 상태를 이겨낼 수 없게 인체의 각 요소가 퇴화하는 것을 의미한다. 노화가 진행되면 체내 단백질 수치가 감소하고 에너지 대사를 변화시키며 DNA에 손상을 입게 된다. 즉, 체내 호르몬 양에 변화가 생겨 세포 노화가 진행되고, 조직의 재생 능력이 감소하므로 인체의 항상성을 유지하는 능력이 감소하게 된다. 따라서, 인체 조직의 재생능력을 되돌리고 항상성을 유지하기 위해 줄기세포 활성에 영향을 주는 건강 보조 식품을 통해 체내 줄기세포의 노화를 방지하는 것이 답이 될 수 있다. 최근 들어, '안티에이징(anti-aging)'에 대한 관심이 증대하면서 노화를 방지하고자 줄기세포를 이용한 항노화 제품이 새롭게 떠오르고 있다. 따라서, 줄기세포 항노화 제품은 단순히 화장품과 같이 얼굴의 노화만 막아주는 것이 아니라, 신체의 노화 및 무기력한 삶에 에너지를 불어넣는 치료로서 한층 젊어지고 건강한 일상을 만들어 주는 노화 대응책이 될 수 있을 것이다.
일 양상은 줄기세포를 이용한 노화 조절 유효인자 구축 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 줄기세포를 이용한 노화 조절 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
일 양상은 줄기세포의 배양액을 수득하는 단계; 상기 수득된 줄기세포의 배양액에 대해 LC-MS(Liquid chromatography-mass spectrometry) 분석을 수행하여 상기 줄기세포의 배양액에 대한 LC-MS 데이터를 획득하는 단계; 상기 획득된 LC-MS 데이터를 인간 대사체 데이터베이스의 질량 정보와 매칭하는 단계; 및 상기 매칭 결과, 줄기세포 배양액에서 통계적으로 유의하게 증가한 대사체를 선별하는 단계를 포함하는 줄기세포를 이용한 항노화 유효인자를 구축하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "줄기세포(stem cell)"는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로서, 일 구체예에서는 인간 태반으로부터 줄기세포를 추출하였는 바, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)의 의미한다. 또한, 상기 줄기세포는 계대 1(passage 1) 내지 계대 100의 줄기세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 줄기세포는 계대 1 내지 계대 30의 성체줄기세포(adult stem cell)일 수 있고, 계대 1 내지 계대 100의 배아줄기세포(embryonic stem cell)일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 골수, 제대혈, 골수, 혈액 또는 지방에서 추출해낸 것일 수 있다.
또한, 일 구체예의 방법은 상기 선별된 대사체와 단백질 사이의 상호작용 정보를 획득하는 단계; 상기 대사체와 단백질 상호작용 정보에서 선택된 단백질의 리스트에 ORA(Over-representation analysis) 분석을 통해 통계적으로 유의하게 상호작용 네트워크 상의 단백질이 모이는 대사 경로를 확인하는 단계; 및 상기 대사 경로 중, 세포 증식 또는 세포 노화와 관련된 단백질과, 상기 단백질과 반응할 것으로 예상되는 대사체를 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 대사체를 선별하는 단계는 상기 대사체의 생물학적 기능을 중심으로 선별되는 것일 수 있다. 이때, 상기 생물학적 기능은 생물학적 경로분석 방법을 이용하여 상기 대사체 및 단백질 상호작용에서 획득한 정보로부터 상기 대사체와 상호작용할 것으로 예상되는 단백질의 생물학적 기능을 확인함으로써 획득할 수 있다. 예를 들어, Sirtuin6 (SirT6) 단백질은 줄기세포 유래 대사체에 영향을 받을 것으로 예상되면서, 세포 증식(cell proliferation)을 포함하여 항노화에 관여하는 단백질에 해당된다. 또한, 상기 선별된 대사체와 상호작용이 예측되는 단백질은 특정 대사경로에 속하는 것으로서, 단백질과의 상호작용을 통하여 대사 경로에 영향을 끼칠 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항노화 유효인자"는 항노화 관련 유전자를 의미하며, 상기 유전자의 발현을 증가 또는 감소시킴으로써 여러 가지 스트레스에 대한 저항성을 높일 수 있는 바, 항노화 활성을 갖는다. 상기 항노화 유효인자는 하기 표 3에 기재된 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 일 수 있다:
[표 3]
Figure pat00001
또한, 상기 항노화 유효인자는 삼채 또는 흑삼채 추출물을 처리한 노화 세포에서 발현이 증가할 수 있다. 즉, 삼채 또는 흑삼채 추출물은 노화 세포에서 항노화 유효 인자의 발현을 증가시킴으로써, 항노화 활성을 가짐을 알 수 있다.
다른 양상은 삼채 또는 흑삼채 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화 또는 항염증용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "항노화"란 세포 또는 개체의 노화를 지연 또는 방지하거나, 노화된 세포(senescent cell)를 그보다 젊은 세포(young cell)로 전환시키는 것을 포함한다. 구체적으로 "세포의 노화(senescence of cell)"는 표준 세포(reference cell)에 비하여 세포 증식능의 감소, PCNA 또는 SirT1 단백질의 발현 감소, P53 단백질의 발현 증가, P16 및 P21 유전자의 발현 증가 중 하나 이상을 포함하는 것을 나타낸다. "젊은 세포"란 표준 세포에 비하여 세포 증식능의 증가, PCNA 또는 SirT1 단백질의 발현 증가, P53 단백질의 발현 감소, P16 및 P21 유전자의 발현 감소 중 하나 이상을 포함하는 것을 나타낸다.
구체적으로, 상기 조성물은 노화와 연관된 증상의 치료를 위한 것일 수 있다. 이때, 상기 노화와 연관된 증상은 피부주름, 상처 재생 저하, 근감소증, 조기노화증(Hutchinson-Gilford progeria syndrome), 기억력 저하, 근육 저하, 또는 그 조합인 것일 수 있다.
또한, 본 명세서에서 용어, "항염증"이란 염증 유도된 세포에서의 염증유도 인자(pro-inflammatory factor)의 조절 및 염증 억제 인자(anti-inflammatory factor)의 조절 효능 여부를 통해 염증 유도를 방지하거나, 염증 억제를 증진시키는 것을 포함한다. 일 실시예에서는 삼채 또는 흑삼채 추출물과 함께 배양된 세포에 LPS로 염증 유도한 결과, 대조군에 비하여 inducible nitric oxide synthase (iNOS), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6)의 발현이 감소하였고, interleukin-10(IL-10), Transforming growth factor-β(TGF-β)의 발현이 증가하였음을 확인하였다.
상기 조성물은 유효성분인 삼채 또는 흑삼채 이외에 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 경구투여 제제를 포함하며, 비경구투여 제제로서 주사제 또는 국소 투여용 제제 등이 포함된다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 혹은 그 이외의 약제학적으로 허용할 수 있는 용매를 사용한 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체 혹은 매체, 예를 들어 멸균수, 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형체, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적당히 조합하여, 일반적으로 인정되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화할 수 있다. 상기 제제는 통상의 방법에 따라 경구 또는 비경구적으로 투여될 수 있으며, 구체적으로는 비경구적으로 투여될 수 있다. 상기 비경구 투여는 국부적 또는 전신적 투여를 포함한다. 상기 국부적 투여는, 직접적으로 병변 또는 그 주변에 투여하는 것, 예를 들면 병변인 뇌 또는 척수, 그 주변 또는 그 반대쪽 부위에 직접 투여하는 것일 수 있다. 상기 전신적 투여는 척수액, 정맥 또는 동맥에 투여하는 것을 포함한다. 상기 척수액은 뇌척수액을 포함한다. 상기 동맥은 병변에 혈액을 공급하는 부위일 수 있다. 상기 조성물의 1일 투여량은 체중에 따라 1 ng/㎏ 내지 100 g/㎏, 예를 들면 0.5 g/㎏ 내지 1 g/㎏일 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 조성물의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 증감이 가능하다. 상기 조성물의 투여 형태는 조성물의 투여 형태는 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 또한 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
다른 양상은 삼채 또는 흑삼채 추출물을 유효성분으로 포함하는 SirT6(Sirtuin6) 증가용 조성물을 제공한다. 상기 삼채 또는 흑삼채 추출물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 SirT6는 DNA damage repair, 대사항상성 조절 (포도당 대사 및 지방대 사), 염증반응 조절, 세포 증식 및 다양한 수명관련 기전 조절의 기능을 갖고 있는 것으로 알려져 있으며, Sirtuin 멤버들 중 특히 노화 및 노화 관련 질환과의 밀접한 연관성을 나타내는 단백질이다. 일 실시예에서는 노화된 줄기세포에 삼채 또는 흑삼채 추출물을 처리한 결과, SirT6 단백질의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 흑삼채를 처리한 경우, 노화된 세포에서 젊은 세포보다 SirT6 단백질의 발현이 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 일 구체예의 조성물은 노화 세포에서 SirT6의 단백질 발현량을 증가시킴으로써, 노화 방지를 방지할 수 있다.
다른 양상은 인 비트로(in vitro)에서 삼채 또는 흑삼채 추출물을 세포에 처리하는 단계; 또는 삼채 또는 흑삼채 추출물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 세포 내 또는 개체 내 SirT6(Sirtuin 6)의 발현 또는 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 삼채 또는 흑삼채 추출물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 예를 들면, 경구, 직장, 정맥, 비강, 복강, 피하 또는 국소 투여일 수 있으며, 국소 투여는 예를 들면 병변에 직접, 또는 병변 주위에 투여 일 수 있다. 상기 투여는 상기 질환을 예방 또는 치료하기 위한 유효량을 투여하는 것일 수 있다. 이러한 유효한 양은 선택되는 질환의 조건에 따라 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수 있다.
일 양상에 따른 항노화 유효인자를 구축하는 방법은 인간 태반 줄기세포에서 통계적으로 유의하게 증가한 대사체를 선별하는 단계를 포함하는 것으로서, 상기 태반의 줄기세포 능력이 뛰어나 줄기세포의 고갈이 방지되므로, 항노화 유효인자의 선별이 용이하다. 또한, 삼채 또는 흑삼채 추출물은 상기 방법에 의해 선별된 유효인자의 발현을 변화시키는 바, 노화 방지에 탁월한 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 삼채 또는 흑삼채 추출물의 미세교세포주에서의 세포독성을 분석한 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 삼채 또는 흑삼채 추출물의 미세교세포주에서의 항염증 활성을 분석한 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 삼채 또는 흑삼채 추출물의 미세교세포주에서의 Caspase 3를 분석한 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 줄기세포의 노화 단계를 나타낸 사진이다.
도 5는 일 구체예에 따른 줄기세포의 노화 단계에 따른 노화 관련 인자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 일 구체예에 따른 삼채 또는 흑삼채 추출물의 줄기세포에서의 항노화 효능을 분석한 결과이다.
도 7은 일 구체예에 따른 삼채 또는 흑삼채의 줄기세포에서의 노화 마커 P16에의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8은 일 구체예에 따른 삼채 또는 흑삼채의 줄기세포에서의 노화 마커 P21에의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 9은 일 구체예에 따른 줄기세포에 의한 유효 대사체 선별 과정을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 10은 일 구체예에 따른 상호작용 네트워크 구축의 방법을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 11은 일 구체예에 따른 대사체와 단백질의 상호작용 네트워크 분석결과를 나타낸 도면이다.
도 12은 일 구체예에 따른 삼채 또는 흑삼채 추출물의 줄기세포에서의 Sirt6에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 삼채 및 흑삼채의 미세교세포주를 이용한 효능 분석
본 명세서의 실시예에 있어서, 삼채 및 흑삼채는 ㈜다움푸드앤케어로부터 동결 건조된 샘플을 제공받아 사용하였다. 미세교세포주에서 삼채 및 흑삼채의 항염증 또는 항산화 효능을 분석은 다음과 같이 수행하였다.
먼저, 삼채 및 흑삼채 동결건조 샘플을 1 g/㎖가 될 수 있게 DPBS 넣고 60에 30분간 녹이며, 1000 rpm에서 3분간 원심분리 한 후 필터를 통해 불순물을 제거하여 사용하였다.
삼채 및 흑삼채 시료에 대한 세포독성은 Dozen사의 방법에 기준하여 Ez-cytox cell viability assay kit를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 마우스 뇌 유래 미세교세포주 BV2 세포를 96-웰 플레이트(Nunclon Surface, Denmark)에 세포수가 5 X 103 cell/well이 되게 분주하여 10% FBS와 1% P/S페니실린/스트렙토마이신(Gibco)을 포함한 DMEM 고글루코오스 배지(high glucose medium) 배지에서 37, 5% CO2 조건하에 24시간 배양하였다. 이후에, 시료를 농도별 (100 ㎎ ~ 1 ng/㎖)로 처리하여 다시 12시간 동안 37, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 다음으로, Ez-Cytox 10 ㎕/well 처리하여 2 시간 반응 시킨 후 450 nm 흡광도 변화를 측정하였고, 삼채 및 흑삼채 처리되지 않은 조건에서 배양한 대조군을 기준으로 처리군의 세포생존율을 확인 하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
삼채 및 흑삼채 시료에 대한 항염증 활성 분석을 위해, 면역세포주인 미세교세포주에 삼채 또는 흑삼채 추출물이 포함된 배지에 배양 후 염증 환경 유도를 위해 LPS(lipopolysaccharide)(Sigma Aldrich, USA)를 처리하고, quantitative polymerase chain reaction (qPCR)을 통해 염증관련 인자인 iNOS(inducible nitric oxide synthase), TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β), IL-6(interleukin-6), 및 카스파아제 3(Caspase 3)를 확인하였다.
구체적으로, BV2 세포를 6-웰 플레이트(FALCON)에 세포수가 1 X 105 cell/well이 되게 분주하여 37, 5% CO2 조건하에 24시간 배양하였다. 이후에, 삼채 및 흑삼채 시료 배양액를 농도별 (100 ㎎ ~ 1 ng/㎖)로 처리하여 16시간 동안 추가적으로 배양하였다. 배양액을 제거한 후 새로운 DMEM 배지로 교환하여 LPS(lipopolysaccharide)(Sigma Aldrich, USA)(1 μM/mL)를 처리하고 6시간 동안 배양하여 염증 환경을 유도하였다. 이후에, 배양세포로부터 RNA 분리는 트리졸(Trizol)을 넣고 3분 동안 방치한 후 클로로포름(chloroform)을 넣고 12,000 rpm에서 15분간 원심분리 하였다. 다음으로, 상층액을 얻어 이소프로판올(isopropanol)을 혼합하여 12,000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 침전시킨 후 DEPC (diethyl pyrocarbonate)-DW 100 ㎕에 녹여 RT-PCR에 사용하였다. 1 ㎍의 RNA를 Oligo dT Primer (Intron, Korea)를 이용하여 45에서 60분, 95에서 5분간 반응시켜 cDNA로 역전사 하였다. 이후에, PCR kit (Bioneer, Korea)와 PCR machine (Bioneer, Exicycler™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block, Korea)을 사용하여 유전자 발현 레벨을 분석하였고, 각각의 프라이머 염기서열을 하기 표 1에 나타내었으며, 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
유전자 프라이머 서열
iNOS 정방향(서열번호 1) CACCTTGGAGTTCACCCAGT
역방향(서열번호 2) ACCACTCGTACTTGGGATGC
TNF-α 정방향(서열번호 3) GCTCCAGTGAATTCGGAAAG
역방향(서열번호 4) GATTATGGCTCAGGGTCCAA
IL-1β 정방향(서열번호 5) CTGTTCTGTGTAATGAAAGACGG
역방향(서열번호 6) GCTCTGCTTGTGAGGTGCTGA
IL-6 정방향(서열번호 7) TTCCATCCAGTTGCCTTCTT
역방향(서열번호 8) ATTTCCACGATTTCCCAGAG
caspase3 정방향(서열번호 9) CTTCTTCAGAGGCGACTACTGCC
역방향(서열번호 10) CCAGGAATAGTAACCAGGTGCTG
TGF-β 정방향(서열번호 11) ACCAACTATTGCTTCAGCTC
역방향(서열번호 12) GGGTTGTGTTGGTGTAGAG
IL-10 정방향(서열번호 13) CAGTGGAGCAGGTGAAGAGTG
역방향(서열번호 14) CAAGGAGTTGTTTCCGTTAGC
GAPDH 정방향(서열번호 15) TCACTGCCACCCAGAAGA
역방향(서열번호 16) GACGGACACATTGGGGGTAG
도 1은 일 구체예에 따른 삼채 또는 흑삼채 추출물의 미세교세포주에서의 세포독성을 분석한 그래프이다. 도 2는 일 구체예에 따른 삼채 또는 흑삼채 추출물의 미세교세포주에서의 항염증 활성을 분석한 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 삼채 또는 흑삼채 추출물의 미세교세포주에서의 Caspase 3를 분석한 그래프이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 삼채, 흑삼채 두 시료 모두 농도에 따른 세포 생존율이 정상 대조군에 비해 감소를 보이지 않아 세포독성이 나타나지 않는 것으로 확인하였다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 삼채 및 흑삼채 시료를 처리 하였을 때, 농도에 따라 대조군 대비 염증 유도 인자가 감소하고, 염증 억제 인자는 증가하는 경향을 나타내었다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 삼채 및 흑삼채 시료를 처리하였을 때, 세포 사멸 효소인 Caspase 3가 억제되는 것을 알 수 있었다.
이상의 결과로, 삼채 또는 흑삼채 추출물은 미세교세포주에서 세포독성이 없으며, 항염증 활성 및 세포 사멸 억제 효능이 있음을 알 수 있었다.
실시예 2. 줄기세포를 이용한 항노화 또는 항산화 활성 분석
2.1. 줄기세포의 배양
태반 유래 줄기세포를 배양하기 위하여 인간 태반에서 분리한 인간 줄기세포를 사용하였다. 구체적으로, 인간 태반에서 분리한 줄기세포를 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1㎍/㎖ 헤파린, 25ng/㎖의 섬유아세포성장인자-4(fibroblast growth factor-4, FGF4)가 첨가된 alpha-MEM 배지를 사용하여 37, 5% CO2 배양 조건에서 배양하였다. 줄기세포는 ㎠당 6000 내지 7000 세포를 계수하여 접종하고, 이틀에 한 번씩 배지를 교체하면서 약 3~4일 정도 배양하였다. 플라스크에 줄기세포가 80% 이상 자라면 인산완충액(phosphate-buffered saline, PBS)을 사용하여 세척한 후, 0.25%의 트립신/EDTA를 이용해 2분간 효소 처리한 다음, 소 태아혈청을 가하여 효소반응을 정지시키고, 1,200rpm에서 약 5분 동안 원심 분리한 뒤 상층액을 제거하여 세포들을 수확하였다. 수확된 세포는 다시 ㎠당 6000 내지 7000 세포로 계수하여 동일한 방법을 계대배양을 수행하였고, 이후의 실험에서 이 줄기세포를 사용하였다.
2.2. 줄기세포의 노화 관련 인자 분석
먼저 줄기세포에서의 항노화 인자를 확인하기 위해, 상기 실시예 2.1.의 줄기세포를 3개의 단계로 나누어 노화 관련 마커의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 인간으로부터 분리하여 배양을 시작하여 세포 안정화 시기인 P1~P5을 Early 단계, 이후 세포 증식이 활발한 시기, 예를 들어, P7의 배양세포를 Middle 단계, 세포의 증식률이 떨어지면서 노화가 시작되어 시점을 Late 단계로 정의한다. 노화된 세포는 campisi lab에서 노화된 세포에서 pH 6.0에서 감지될 수 있는 β-galactosidase의 활성의 존재를 통해 확인할 수 있으며, β-galactosidase의 활성을 측정하는 방법은 노화된 세포임을 표지 하는 쉽고 확연한 방법으로 널리 쓰이고 있다. β-galactosidase의 활성 측정법은 x-gal을 포함한 pH6.0의 PBS를 배양된 세포에 가하고 일정시간 반응시킨 뒤 x-gal을 분해하는 효소의 반응을 푸른 염색의 침착 여부로 확인할 수 있으며, 이 방법은 배양된 세포의 노화뿐만 아니라 조직 내 세포에서도 양성 반응을 보이므로 노화세포의 확인에 유용하다.
구체적으로 3 개의 단계는 하기 표 2과 같다.
Young Early 세포 분리 후 안정화 시기
Middle 세포 증식이 활발한 시기
Old Late 노화가 시작되는 세포
이후에 3개의 단계의 줄기세포에 대해 세포증식인자로 알려져 있는 PCNA와 항노화 인자로 알려진 SirT1, 및 노화 마커인 P53의 발현을 면역 블랏팅을 통해 확인하였다. 구체적으로, PBS에 세척하여 수확한 세포에 단백질 분해효소 억제제(protease inhibitor)가 포함된 라이시스 버퍼를 이용하여 세포를 용해 시켰다. 이후에, 세포의 용해액을 Bradford (bio-red)용액을 이용하여 제조사에 지시에 따라 단백질의 양을 정량화 하였다. 20ug의 단백질을 10~15% SDS-PAGE gel에 전기영동기를 사용하여 단백질을 전개하였고 PVDF 막에 단백질을 전달 후 PCNA, SirT1, P53, GAPDH 항체를 4에서 밤새 반응시킨 후 HRP-접합된 이차 항체와 함께 실온에서 1시간 반응시켰다. 다음으로, ECL Western Blotting system (Millipore)와 Ez-Capture MG (ATTO)기기를 사용하여 면역반응을 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 5는 일 구체예에 따른 줄기세포의 노화 단계에 따른 노화 관련 인자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 줄기세포는 노화가 진행될수록, PCNA 및 SirT1의 단백질 발현은 줄어들었고 노화 마커인 P53의 발현은 증가되었음을 확인할 수 있었다.
2.3. 삼채 및 흑삼채의 항노화 효능 분석
상기 실시예 2.2의 결과에 기초하여 삼채 및 흑삼채 추출물이 줄기세포에서 항산화 활성을 갖는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2.1.의 줄기세포 배양액에 100㎎ ~ 1ng/㎖ 의 삼채, 흑삼채를 첨가한 후 36일간 계대 배양 하였고, 상기 실시예 2.2.와 동일한 방법으로 면역 블랏팅을 수행하였다. 이상의 결과는 도 5에 나타내었다.
도 6은 일 구체예에 따른 삼채 또는 흑삼채 추출물의 줄기세포에서의 항노화 효능을 분석한 결과이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 증식인자인 PCNA은 노화된 줄기세포에서 단백질 발현이 감소하지만 삼채 및 흑삼채가 처리된 세포 내에서는 증가된 발현을 보였다. 또한, 항노화 인자인 SirT1 단백질도 노화된 줄기세포에서는 발현이 감소하지만 그와 비교하여 삼채와 흑삼채 처리 세포에서는 발현이 증가되었으며, 노화된 줄기세포에서 증가하는 P53은 흑삼채 처리 세포에서 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 삼채 또는 흑삼채 추출물의 줄기세포에서 항노화 효능을 나타낸다는 것을 의미한다.
추가적으로, 삼채 또는 흑삼채가 노화마커로 알려진 P16, 및 P21의 발현에 미치는 영향을 분석하였다. 구체적으로, TRIzol 을 이용하여 세포로부터 RNA를 추출하였고, 1㎍의 정제된 총 RNA를 SuperScriptTMIII (Invitrogen), Oligo-d(T) 12-18 primer, DTT, 및 dNTPs를 이용하여 cDNA로 합성하였다. SYBR-green (enzynomics) 반응 키트를 이용하여 제조사의 지시에 따라 CFX Connect　(Bio-rad)기기를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였으며 표적 유전자 발현 값을 하우스키핑 유전자 (RPL22)에 대응하여 정규화 하였다. 대조군의 발현 값을 표준으로 부여하고 다른 조건의 샘플들의 상대적 발현 수준을 계산하였고, 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 7은 일 구체예에 따른 삼채 또는 흑삼채의 줄기세포에서의 노화 마커 P16에의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8은 일 구체예에 따른 삼채 또는 흑삼채의 줄기세포에서의 노화 마커 P21에의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 노화된 줄기세포에서 P16, 및 P21의 유전자 발현이 증가되나 삼채 또는 흑삼채 처리 세포 내에서 P16 및 P21의 유전자 발현이 노화세포와 비교하여 줄어들었음을 확인할 수 있다.
실시예 3. 줄기세포를 이용한 대사체 분석 및 라이브러리 구축
3.1. 시료의 분석과 정량적 통계분석을 통한 적절한 유효인자 후보군의 선정
줄기세포는 세포 증식이 활발한 시기로 P1~P20 사이의 분화가 활발하게 진행되는 세포를 젊은 세포라고 한다. 상기 젊은 세포는 배양시 발생 단계에 관련이 있는 인자를 많이 배출하며, 노화 및 손상을 재생하는데 유효한 인자를 많이 분비한다. 따라서, 노화와 반대되는 세포 증식 및 분화, 재생 등에 관련된 항노화 유효인자 후보군을 선정하기에 적합한 시기이다. 실시예 3.1에서는 줄비세포 분비물이 없는 대조군 대비 줄기세포가 분비한 대사체를 1차적으로 선정하여 대사체 분석을 하고, 이후 공공 데이터 베이스를 이용하여 세포 증식과 관련된 유효인자 후보군을 선정하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2.2.에서 제조한 줄기세포에 대하여 시료의 분석과 정량적 통계분석을 통한 적절한 유효인자 후보군의 선정을 위해 인간 태반 유래 줄기세포를 80 내지 90%의 콘플루언시(confluency)로 배양하였다. 이후에, 상기 세포를 1xP/S만 보충한 α-MEM에 24시간 배양하여 줄기세포에서 분비되는 인자가 포함된 배양액을 수득하였다. 얻어낸 배양액을 원심분리 및 필터링을 통하여 세포를 완전히 제거하고, 동결건조하여 줄기세포 배양액의 분말을 수득하였다. 줄기세포 배양액의 대조군으로 1xP/S만 보충된 α-MEM을 사용하였다. 이후에 유효 대사체 분석을 위해 도 8과 같이 수행하였다.
도 9은 일 구체예에 따른 줄기세포에 의한 유효 대사체 선별 과정을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 9을 참조하여 구체적으로 설명하면, 동결건조분말 상태의 줄기세포 배양액을 10㎎/㎖의 농도로 증류수(distilled water)에 녹여 질량분석용 시료를 제조하였다. 비교군으로 α-MEM 분말을 똑같이 10㎎/㎖의 농도로 증류수(distilled water)에 녹여 사용하였다. 시료는 LC-MS(Liquid chromatography-mass spectrometry) 방법을 이용해 분석하였으며, positive mode를 사용하였다. LC-MS raw data는 R-program을 이용해 xcms와 CAMERA package(bioconductor)를 이용해 분석하였다. LC-MS raw data의 피크는 xcms package에서 제공하는 matchedFilter 알고리즘을 이용해 선택되었으며, CAMERA package를 이용해 raw data의 pseudospectra와 isotope를 주석(annotation)하였다. 이후에, 인간 대사체 데이터베이스(Human metabolite Database)(http://www.hmdb.ca/)로부터 대사체의 질량정보를 불러와 상기 분석된 LC-MS data와 매칭하였다. LC-MS data는 isotope, adduct 등을 고려해 neutral mass를 추정하였으며 0.005 이하의 m/z값 오차를 가진다. 대사체가 주석(annotation)된 특징만 가지고 통계적 분석을 수행하였으며, welch's t-test를 이용해 통계적으로 유의하게 줄기세포 배양액에서 증가한 대사체만 선택하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure pat00002
3.2. 공공 데이터베이스를 이용한 상호작용 네트워크의 구축과 대사경로 분석
상기 실시예 3.1.의 줄기세포로부터 분비된 인자들을 포함한 배양액에서 통계적으로 유의하게 증가한 대사체들과 상호작용한다고 알려진 단백질을 조사하여 상호작용 네트워크를 구축하였다. 구체적으로 도 9에 나타낸 바와 같은 방법으로 서브네트워크를 구성하였다.
도 9는 일 구체예에 따른 상호작용 네트워크 구축의 방법을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 9를 참조하여 설명하면, 대사체와 단백질의 상호작용은 KEGG reaction database에 등록된 대사체와 효소 사이의 상호작용 정보를 불러 들어와 처리하였다. 대사체와 상호작용이 예측되는 효소들은 특정 대사경로에 속하며 매칭된 대사체와의 상호작용을 통해 속한 대사경로에 영향을 끼칠 것으로 가정하였다. 줄기세포로부터 분비된 인자들을 포함한 배양액에서 증가한 줄기세포 유래 대사체가 어떠한 생물학적 경로에 영향을 끼쳤는지 검증하기 위해, 대사체-단백질 상호작용 네트워크에서 선택된 효소들의 리스트에 DAVID (https://david.ncifcrf.gov)를 사용해 Over-representation analysis를 실행하여 통계적으로 유의하게 상호작용 네트워크 상의 단백질들이 모이는 대사경로를 확인하였다. 통계적으로 유의한 대사경로 중, 세포 노화와 관련된 세포 증식(Cell proliferation)을 타겟으로 연관된 효소와, 그 효소와 반응할 것으로 예상되는 대사체를 다시 추출하여 서브네트워크를 구성하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11은 일 구체예에 따른 대사체와 단백질의 상호작용 네트워크 분석결과를 나타낸 도면이다.
상기 표 2 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 줄기세포 대사체에 의해 영향을 받으며 세포 증식에 관여할 것으로 예상되는 후보 유효 인자를 도출하였다.
3.3. 대사체 분석을 통해 발굴된 항노화 유효 인자를 삼채 및 흑삼채를 처리한 줄기세포에서 변화 확인
상기 실시예 3.1 및 3.2를 통해 도출된 노화 관련 후보인자인 Sirt6에 대해 삼채 또는 흑삼채 추출물이 미치는 영향을 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2.3.과 동일한 방법으로 Sirt6의 발현을 변화를 분석하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12는 일 구체예에 따른 삼채 또는 흑삼채 추출물의 줄기세포에서의 Sirt6에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
Sirt6는 SirT1과 함께 세포 증식, 노화 등에 관련되어 항노화 인자로 알려져 있다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 삼채와 흑삼채를 처리한 노화세포에서 Sirt6의 발현이 떨어진 노화 세포와 비교하여 발현이 증가되었음을 알 수 있었다. 특히 흑삼채의 경우 젊은 세포보다 높은 발현양을 보였다. 이 결과로 Sirt6 유전자는 Sirt1과 함께 삼채 또는 흑삼채에 의해 조절되는 항노화 관련 효능을 보이는 유효인자임을 알 수 있었다.
이상의 결과로 일 구체예에 따른 줄기세포를 이용한 효능평가 방법에 의하면, 항노화와 관련된 유효 인자를 도출할 수 있고, 이의 변화를 확인함으로써, 항노화 물질의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 계대 1(passage 1) 내지 계대 20인 줄기세포의 배양액에 삼채 또는 흑삼채 추출물을 처리한 후 줄기세포를 계대 배양하는 단계;
    상기 삼채 또는 흑삼채 추출물을 포함하는 줄기세포 배양액을 수득하는 단계;
    상기 수득된 줄기세포의 배양액에 대해 LC-MS(Liquid chromatography-mass spectrometry) 분석을 수행하여 상기 줄기세포의 배양액에 대한 LC-MS 데이터를 획득하는 단계;
    상기 획득된 LC-MS 데이터를 인간 대사체 데이터베이스의 질량 정보와 매칭하는 단계; 및
    상기 매칭 결과, 줄기세포 배양액에서 삼채 또는 흑삼채 추출물을 포함하지 않는 줄기세포 배양액에 비하여 통계적으로 유의하게 증가한 대사체를 선별하는 단계로서, 상기 대사체는 계대가 증가함에 따라 감소하는 것인 단계;를 포함하는 줄기세포를 이용한 항노화 유효인자를 구축하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 선별된 대사체와 단백질 사이의 상호작용 정보를 획득하는 단계;
    상기 대사체와 단백질 상호작용 정보에서 선택된 단백질의 리스트에 ORA(Over-representation analysis) 분석을 통해 통계적으로 유의하게 상호작용 네트워크 상의 단백질이 모이는 대사 경로를 확인하는 단계; 및
    상기 대사 경로 중, 세포 증식 또는 세포 노화와 관련된 단백질과, 상기 단백질과 반응할 것으로 예상되는 대사체를 선별하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항노화 유효인자는 PCNA, SirT1, 및 SirT6 로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 대사체를 선별하는 단계는 상기 대사체의 생물학적 기능을 중심으로 선별되는 것인 방법.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 선별된 대사체는 특정 대사 경로에 속하며 단백질과의 상호작용을 통해 속한 대사 경로에 영향을 끼치는 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 단백질은 상기 선별된 대사체와 상호작용을 통하여 항노화 활성을 가지는 것인 방법.
  7. 계대 1(passage 1) 내지 계대 20인 줄기세포의 배양액을 수득하는 단계;
    상기 수득된 줄기세포의 배양액에 대해 LC-MS(Liquid chromatography-mass spectrometry) 분석을 수행하여 상기 줄기세포의 배양액에 대한 LC-MS 데이터를 획득하는 단계;
    상기 획득된 LC-MS 데이터를 인간 대사체 데이터베이스의 질량 정보와 매칭하는 단계;
    상기 매칭 결과, 후보 물질을 처리하지 않은 줄기세포 배양액에 비하여 통계적으로 유의하게 줄기세포 배양액에서 증가한 대사체를 선별하는 단계로서, 상기 대사체는 계대가 증가함에 따라 감소하는 것인 단계;
    상기 선별된 대사체가 후보 물질이 처리된 줄기세포에서 후보 물질을 처리하지 않은 줄기세포 대비 변화하는지 여부를 확인하는 단계; 및
    상기 후보 물질이 후보 물질을 처리하지 않은 줄기세포 대비 상기 선별된 대사체를 변화시키는 경우 노화 조절 물질로 선별하는 단계를 포함하는 줄기세포를 이용한 노화 조절 물질을 스크리닝 하는 방법으로서, 상기 후보 물질은 삼채 또는 흑삼채 추출물인 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 후보 물질을 처리한 후 세포 내에서 하기 표 3에 기재된 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 조절되는지 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법:

    Figure pat00003
    .
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