KR20230012429A - Method for overproduction Pseurotin A from Aspergillus fumigatus - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A의 대량합성을 유도하여 이를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for mass-producing serotin A by inducing mass synthesis of Aspergillus fumigatus.
슈로틴 A(Pseurotin A)는 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 및 다른 진균류가 생산하는 이차대사산물이지만, 마우스 B 세포에 의한 IgE 생산을 억제하는 것으로도 알려져 있고, 쥐 갈색 세포종에서 신경세포 생성을 활성화시키는 것으로도 알려져 있다. 또한 선충을 제거하는 활성(살 선충)이 있는 것으로도 알려져 있다. 그러나 종래 일반적인 조건에서 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A의 생산량이 매우 낮은 단점이 있어, 유용한 생리활성을 갖는 슈로틴 A의 생산을 증가시킬 수 있는 새로운 기술의 개발이 필요한 실정이다.Pseurotin A is a secondary metabolite produced by Aspergillus fumigatus and other fungi, but is also known to inhibit IgE production by mouse B cells, and in mouse pheochromocytoma neurons. It is also known to activate production. It is also known to have activity (killing nematodes) to remove nematodes. However, there is a disadvantage in that the production of serotin A from Aspergillus fumigatus is very low under conventional general conditions, so there is a need to develop a new technology capable of increasing the production of serotin A having useful physiological activity.
이에 본 발명자들은 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A의 생산량을 증가시키기 위한 연구를 진행하던 중, 배양배지에 아연을 첨가할 경우, 슈로틴 A의 생산이 아연을 첨가하지 않은 군에 비해 124배나 증가됨을 확인하였고, 글리오톡신(gliotoxin)의 생합성에 관여하는 GliZ 유전자가 결손될 경우, 슈로틴 A의 생산이 더 증가되는 것으로 확인하였다. 따라서 본 발명자들은 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A의 대량합성을 유도하는 방법 및 이를 통한 슈로틴 A의 대량생산 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, while the present inventors were conducting a study to increase the production of serotin A from Aspergillus fumigatus, when zinc was added to the culture medium, the production of serotin A was 124 It was confirmed that the production of serotin A was further increased when the GliZ gene involved in the biosynthesis of gliotoxin was deleted. Accordingly, the present inventors completed the present invention by establishing a method for inducing mass synthesis of serotin A from Aspergillus fumigatus and a method for mass production of serotin A through the method.
그러므로 본 발명의 목적은 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A를 대량생산하는 방법을 제공하는 것이다.Therefore, an object of the present invention is to provide a method for mass-producing serotin A from Aspergillus fumigatus.
본 발명의 다른 목적은 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 배양배지에 아연이 첨가된, 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A(pseurotin A)의 생산 증진용 배지 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a medium composition for promoting production of pseudotin A from Aspergillus fumigatus, in which zinc is added to a culture medium of Aspergillus fumigatus.
그러므로 본 발명은 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 배양배지에 아연을 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A(pseurotin A)를 대량생산하는 방법을 제공한다.Therefore, the present invention provides a method for mass-producing pseudotin A from Aspergillus fumigatus, comprising the step of culturing by adding zinc to a culture medium of Aspergillus fumigatus. do.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아연은 배지에 대하여 1~10uM의 농도로 첨가하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the zinc may be added at a concentration of 1 ~ 10uM with respect to the medium.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)는 Gliz 유전자가 결손되어 있는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the Aspergillus fumigatus may have a Gliz gene deletion.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Gliz 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the Gliz gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 일실시예에 있어서, Gliz 유전자 결손은 슈로틴 A(pseurotin A)의 생산을 조절하는 fumR의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, Gliz gene deletion may increase the expression of fumR, which regulates the production of pseudotin A.
또한 본 발명은 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 배양배지에 아연이 첨가된, 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A(pseurotin A)의 생산 증진용 배지 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a medium composition for promoting production of pseudotin A from Aspergillus fumigatus, in which zinc is added to a culture medium of Aspergillus fumigatus.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아연은 배지에 대하여 1~10uM의 농도로 첨가하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the zinc may be added at a concentration of 1 ~ 10uM with respect to the medium.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양배지는 크자펙-독스(Czapek-Dox) 배지일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the culture medium may be Czapek-Dox medium.
본 발명은 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 배양배지에 아연을 첨가하여 배양하는 것을 포함하는 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A(pseurotin A)를 대량생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 GliZ 유전자를 결손시키고 동시에 배양 배지에 아연을 첨가하는 경우, 슈로틴 A를 매우 효과적으로 대량 생산할 수 있음을 확인함으로써, 종래 슈로틴 A의 생산량이 매우 낮은 문제점을 해결할 수 있고, 유용한 생리활성을 갖는 슈로틴 A를 대량생산할 수 있는 효과가 있다.The present invention relates to a method for mass-producing pseudotin A from Aspergillus fumigatus, which comprises adding zinc to a culture medium of Aspergillus fumigatus and culturing the same. In the present invention, when the GliZ gene of Aspergillus fumigatus is deleted and zinc is added to the culture medium at the same time, it is confirmed that serotin A can be mass-produced very effectively, thereby increasing the conventional production of serotin A. It can solve very low problems and has the effect of mass-producing serotin A having useful physiological activity.
도 1은 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 이차대사산물을 분리 및 정제한 크로마토그래피 및 각 이차대사산물의 구조식을 나타낸 것이다.
도 2는 아스퍼질러스 푸미가투스 배양배지에 아연을 농도별로 처리한 후, 생산된 이차대사산물의 생산량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 GliZ 유전자의 결손 여부에 따른 이차대사산물의 생산량 정도를 비교 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 GliZ 유전자의 결손에 따른 FumR 유전자의 발현유도 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 GliZ 유전자가 결손된 재조합 아스퍼질러스 푸미가투스 균주 제조를 위한 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 GliZ 유전자의 결손 및 아연 첨가에 따른 슈로틴 A 생합성 유도 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.Figure 1 shows the chromatogram for separating and purifying secondary metabolites from Aspergillus fumigatus and the structural formulas of each secondary metabolite.
2 is a graph showing the analysis of the production of secondary metabolites produced after treatment with zinc in Aspergillus fumigatus culture medium by concentration.
Figure 3 shows a graph comparing and analyzing the degree of production of secondary metabolites according to the presence or absence of GliZ gene deletion.
Figure 4 shows the results of analyzing the changes in FumR gene expression induction according to GliZ gene deletion.
5 shows a schematic diagram for preparing a recombinant Aspergillus fumigatus strain lacking the GliZ gene.
6 shows the results of analyzing the degree of induction of serotin A biosynthesis according to GliZ gene deletion and zinc addition.
본 발명은 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A의 대량합성 유도를 통해 슈로틴 A를 대량생산할 수 있는 새로운 방법을 규명하였다.The present invention identified a new method capable of mass-producing serotin A from Aspergillus fumigatus by inducing mass synthesis of serotin A.
구체적으로 본 발명은 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 배양배지에 아연을 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A(pseurotin A)를 대량생산하는 방법을 제공함에 특징이 있다.Specifically, the present invention provides a method for mass-producing pseudotin A from Aspergillus fumigatus, comprising the step of culturing by adding zinc to a culture medium of Aspergillus fumigatus. Features are provided.
본 발명의 일실시예에서는 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 이차대사산물들의 생산을 증진시키기 위한 방법으로, 배양 배지에 다양한 종류의 금속을 다양한 농도로 처리하고, 배양한 다음 아스퍼질러스 푸미가투스에서 생산되는 이차대사산물의 생산량을 분석하였다.In one embodiment of the present invention, as a method for enhancing the production of secondary metabolites from Aspergillus fumigatus, various types of metals are treated with various concentrations in a culture medium, cultured, and then in Aspergillus fumigatus The production of secondary metabolites produced was analyzed.
그 결과, 배지에 아연을 첨가하여 배양한 군의 경우, 다른 금속 종류를 첨가하여 배양한 군에 비해 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 이차대사산물의 생산이 현저하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었고, 특히, 이차대사산물 중 슈로틴 A의 생산이 월등히 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the production of secondary metabolites from Aspergillus fumigatus was remarkably increased in the group cultured with zinc added to the medium, compared to the group cultured with the addition of other metals. , it was confirmed that the production of serotin A among the secondary metabolites was remarkably increased.
따라서 본 발명자들은 아스퍼질러스 푸미가투스를 배양하는 배지에 아연을 첨가하여 배양하면 슈로틴 A를 대량생산할 수 있음을 알 수 있었다.Accordingly, the present inventors have found that serotin A can be mass-produced by adding zinc to a medium in which Aspergillus fumigatus is cultured.
이때 상기 아연은 배지에 대하여 1~10uM의 농도로 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 3~7uM의 농도로 첨가할 수 있고, 더욱 바람직하게는 5uM의 농도로 첨가할 수 있다.In this case, the zinc may be added at a concentration of 1 to 10 uM, preferably at a concentration of 3 to 7 uM, and more preferably at a concentration of 5 uM, relative to the medium.
상기 아연을 1uM 미만으로 첨가하게 되면, 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A의 생산이 증가되는 효과를 도출할 수 없는 문제점이 있으며, 반면 10uM 초과 농도로 첨가하게 되면 아스퍼질러스 푸미가투스의 생장에 문제점이 발생할 수 있다. 따라서 아연은 상기 기술된 범위의 농도 안에서 배지에 첨가하는 것이 바람직하다.When the zinc is added at a concentration of less than 1uM, there is a problem in that the effect of increasing the production of serotin A from Aspergillus fumigatus cannot be derived, whereas when the zinc is added at a concentration exceeding 10uM, Aspergillus fumigatus Growing problems can occur. Therefore, it is preferable to add zinc to the medium within the concentration range described above.
또한, 상기 배지는 아스퍼질러스 푸미가투스를 배양할 수 있는 배지라면 모두 사용 가능하며, 본 발명의 일실시예에서는 크자펙-독스(Czapek-Dox) 배지를 사용하였다.In addition, any medium capable of culturing Aspergillus fumigatus can be used as the medium, and in one embodiment of the present invention, Czapek-Dox medium was used.
나아가 본 발명은 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A를 생산할 수 있는 또 다른 방법으로, 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 게놈 유전자에서 Gliz 유전자를 결손시킬 경우, 대조군에 비해 슈로틴 A의 생산이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.Furthermore, the present invention is another method capable of producing serotin A from Aspergillus fumigatus. When the Gliz gene is deleted in the genomic gene of Aspergillus fumigatus, compared to the control, serotin A It was confirmed that the production of
따라서 본 발명은 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 게놈 DNA에서 Gliz 유전자를 결손시킨 아스퍼질러스 푸미가투스를 배양하는 단계를 포함하는, 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A(pseurotin A)를 대량생산하는 방법을 제공할 수 있다. Therefore, the present invention relates to Aspergillus fumigatus, which includes culturing Aspergillus fumigatus in which the Gliz gene is deleted in genomic DNA of Aspergillus fumigatus. ) can provide a method for mass production.
상기 Gliz 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.The Gliz gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 일실시예에서는 아스퍼질러스 푸미가투스에서 슈로틴 A의 생산에 관여하는 분자기전을 확인하기 위한 실험을 수행하였는데, 아연 첨가에 따른 이차대사산물의 생산량 변화 분석 결과에서 아연의 농도가 낮을 때 이차대사물질인 gliotoxin의 생합성은 활성화되는 것으로 나타나, gliotoxin과 슈로틴 A의 생합성 관련성을 분석하였는데, 그 결과, gliotoxin의 생합성을 조절하는 Gliz 유전자를 결손시킬 경우, 슈로틴 A의 생산은 증가하는 것으로 나타났고 뿐만 아니라 슈로틴 A의 생산을 조절하는 fumR의 발현도 증가하는 것으로 나타났다.In one embodiment of the present invention, an experiment was performed to confirm the molecular mechanism involved in the production of serotin A in Aspergillus fumigatus. As a result of analyzing the production change of secondary metabolites according to the addition of zinc, the zinc concentration was When low, the biosynthesis of gliotoxin, a secondary metabolite, was found to be activated, and the relationship between gliotoxin and serotin A biosynthesis was analyzed. As a result, when the Gliz gene, which regulates gliotoxin biosynthesis, was deleted, the production of serotin A increased. In addition, the expression of fumR, which regulates the production of serotin A, was also increased.
따라서 상기 Gliz 유전자 결손은 슈로틴 A(pseurotin A)의 생산을 조절하는 fumR의 발현을 증가시키는 것으로 나타났고, 이를 통해 슈로틴 A(pseurotin A)의 합성이 더 증가되는 것으로 나타났다.Therefore, the Gliz gene deletion was found to increase the expression of fumR, which regulates the production of pseurotin A, and through this, the synthesis of pseurotin A was further increased.
나아가 본 발명은 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 배양배지에 아연이 첨가된, 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A(pseurotin A)의 생산 증진용 배지 조성물을 제공할 수 있다. Furthermore, the present invention can provide a culture medium composition for promoting production of pseudotin A from Aspergillus fumigatus, in which zinc is added to a culture medium of Aspergillus fumigatus.
상기 아연은 배지에 대하여 1~10uM의 농도로 첨가할 수 있고, 바람직하게는 3~7uM의 농도로 첨가할 수 있고, 더욱 바람직하게는 5uM의 농도로 첨가할 수 있다.The zinc may be added at a concentration of 1 to 10 uM to the medium, preferably at a concentration of 3 to 7 uM, and more preferably at a concentration of 5 uM.
본 발명의 일실시예에서는, 아연의 농도를 5uM로 배지에 처리하였을 경우 슈로틴 A의 생산이 아연을 첨가하지 않은 경우에 비해 약 220배 증가한 것을 확인할 수 있었다.In one embodiment of the present invention, when the medium was treated with a zinc concentration of 5uM, it was confirmed that the production of serotin A increased about 220 times compared to the case where zinc was not added.
나아가 본 발명자들은 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A의 생산을 극대화하기 위한 조건으로서, Gliz 유전자 결손된 아스퍼질러스 푸미가투스를 아연이 첨가된 배지에서 배양할 경우, 가장 많은 양의 슈로틴 A를 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하였다.Furthermore, as a condition for maximizing the production of serotin A from Aspergillus fumigatus, the present inventors found that when Aspergillus fumigatus having a Gliz gene deletion was cultured in a medium supplemented with zinc, the highest amount of serotin A was obtained. It was confirmed that A could be produced effectively.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are intended to explain the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
<실시예 1><Example 1>
아연 첨가 배지를 이용한 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A의 대량 생산Mass production of serotin A from Aspergillus fumigatus using zinc-supplemented medium
본 발명자들은 병원성 진균인 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 이차대사물질의 생산과 금속대사의 연관성을 연구하여, 이차대사물질을 대량생산할 수 있는 최적의 조건을 규명하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해 다양한 금속 및 금속의 농도를 달리한 배양배지에서 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 생산되는 이차대사물질의 생산량을 비교 분석하였다. 또한 이차대사물질은 gliotoxin, fumagillin 및 pseurotin A을 분석하였고, 배지로는 Czapec-Dox 액체 배지를 이용하였고, 상기 배지의 구성 성분은 하기 표 1에 나타내었다. 본 실험에 사용한 아스퍼질러스 푸미가투스는 우석대학교 연구실에서 분양 받은 균주 및 생물자원센터(KCTC)로부터 구입한 균주를 사용하였다.The present inventors studied the relationship between the production of secondary metabolites and metal metabolism from the pathogenic fungus Aspergillus fumigatus, and conducted experiments to identify optimal conditions for mass production of secondary metabolites. To this end, the production of secondary metabolites produced from Aspergillus fumigatus in culture media with different metal concentrations was compared and analyzed. In addition, gliotoxin, fumagillin and pseurotin A were analyzed as secondary metabolites, Czapec-Dox liquid medium was used as the medium, and the components of the medium are shown in Table 1 below. Aspergillus fumigatus used in this experiment was used as a strain purchased from Woosuk University's laboratory and purchased from the Center for Biological Resources (KCTC).
상기 표 1의 Czapek-Dox 배지에 다양한 금속을 처리한 결과, 아연을 첨가한 배지를 이용할 경우, 이차대사물질의 생산량이 가장 효과적으로 증가하는 것으로 나타났는데, 아연을 상기 배지에 5uM의 농도로 처리하였을 경우 슈로틴 A의 생산이 220배 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 1 및 도 2 참조).As a result of treating the Czapek-Dox medium in Table 1 with various metals, it was found that the production of secondary metabolites increased most effectively when the medium containing zinc was used. In this case, it was confirmed that the production of serotin A increased 220 times (see FIGS. 1 and 2).
특히 도 1에서 3번 피크는 슈로틴 A를 나타내는데 0.1uM의 아연 농도에서는 3번 피크가 보이지 않았으나 아연 농도가 1uM에서는 슈로틴 A의 피크가 나타났고, 5uM에서는 최고점의 피크를 확인할 수 있었다.In particular, peak No. 3 in FIG. 1 represents serotin A. No. 3 peak was not seen at a zinc concentration of 0.1uM, but a peak of serotin A appeared at a zinc concentration of 1uM, and the highest peak was confirmed at 5uM.
이를 정량 그래프로 변환하여 나타낸 도 2를 보면, 슈로틴 A의 양은 아연의 첨가로 인해 약 124배 증가한 것으로 나타났다. 반면 다른 이차대사물질인 글리오톡신(gliotoxin)은 오히려 아연의 첨가에 의해 생산양이 감소하는 것으로 나타났다. 다른 종류의 이차대사산물인 푸마질린(fumagillin)도 슈로틴 A와 같이 아연 첨가에 의해 생산량이 증가하는 것으로 나타났다.Referring to Figure 2, which was converted into a quantitative graph, it was found that the amount of serotin A increased by about 124 times due to the addition of zinc. On the other hand, the production of another secondary metabolite, gliotoxin, was rather reduced by the addition of zinc. Another type of secondary metabolite, fumagillin, was also shown to increase in production by adding zinc, like serotin A.
나아가 본 발명자들은 이러한 이차대사산물의 검출을 위해 HPLC 분석을 수행하였고, 분석 조건은 다음과 같다.Furthermore, the present inventors performed HPLC analysis to detect these secondary metabolites, and the analysis conditions are as follows.
Czapek-Dox 배지에서 72 시간 동안 배양한 아스퍼질러스 푸미가투스의 배양 상층액으로부터 2차 대사산물을 추출하였다. 상기 2차 대사산물의 추출은 100 mL의 Czapek-dox 배지(3% Sucrose, 0.3% Sodium Nitrate, 0.05% Magnesium Sulfate. 0.05% Potassium Chloride, 0.1% Potassium Phosphate Dibasic, Ferrous 0.001% Sulfate (w/v), 최종 pH 7.3±0.2)에 아스퍼질러스 푸미가투스 A1163의 포자를 1X107 개 접종한 뒤, 37°C의 온도에서 200rpm의 속도로 진탕 배양을 72시간동안 수행하였다. 고온 살균한 면포로 아스퍼질러스 푸미가투스 A1163 포자를 걸러서 얻은 상층액에 상층액과 동량의 클로로포름을 첨가한 뒤, 용액을 Rotator를 이용하여 60rpm의 속도로 10분간 혼합하였다. 3500 rpm으로 5분간 원심분리 후 아래층의 클로로포름층과 위의 배지층으로 분리된 층 중에서 클로로포름층만 새 튜브로 옮겨서 진공농축기로 건조시켰다. 건조한 펠렛을 메탄올로 녹여준 뒤, 실험에 사용하기 전까지 저온상태(+4 ~ -72°C)에 보관하였다. 상기 방법으로 추출된 이차대사산물 추출물은 UV 검출기와 C18 컬럼(Agilent Eclipse XDB-C18 (5 μm) 4.6 x 250 mm)이 있는 역상 RP-HPLC를 사용하여 1mL/min 유속으로 분석하였다. HPLC 분석을 위한 이동상 구배 시스템은 표 2에 나타낸 바와 같다. gliotoxin, pseurotin A 및 fumagillin의 검출을 위해 254 nm, 254 nm 및 351 nm의 파장에서 각각 분석하였다.Secondary metabolites were extracted from the culture supernatant of Aspergillus fumigatus cultured in Czapek-Dox medium for 72 hours. Extraction of the secondary metabolites was performed using 100 mL of Czapek-dox medium (3% Sucrose, 0.3% Sodium Nitrate, 0.05% Magnesium Sulfate, 0.05% Potassium Chloride, 0.1% Potassium Phosphate Dibasic, Ferrous 0.001% Sulfate (w/v) , Final pH 7.3 ± 0.2) after inoculating 1X10 7 spores of Aspergillus fumigatus A1163, shaking culture was performed at a temperature of 37 ° C and a speed of 200 rpm for 72 hours. After adding the same amount of chloroform as the supernatant to the supernatant obtained by filtering Aspergillus fumigatus A1163 spores with a high-temperature sterilized cotton cloth, the solution was mixed for 10 minutes at a speed of 60 rpm using a rotator. After centrifugation at 3500 rpm for 5 minutes, only the chloroform layer among the layers separated into the lower chloroform layer and the upper medium layer was transferred to a new tube and dried in a vacuum concentrator. After dissolving the dried pellets in methanol, they were stored at low temperature (+4 ~ -72°C) until use in experiments. Secondary metabolite extracts extracted by the above method were analyzed at a flow rate of 1 mL/min using a reverse phase RP-HPLC with a UV detector and a C18 column (Agilent Eclipse XDB-C18 (5 μm) 4.6 x 250 mm). The mobile phase gradient system for HPLC analysis is as shown in Table 2. For detection of gliotoxin, pseurotin A and fumagillin, wavelengths of 254 nm, 254 nm and 351 nm were analyzed, respectively.
:20mMAmmoniumformate(pH5.2)A solvent
:20mMAmmonium formate (pH5.2)
:Methanol(>99.9%HPLCgrade)B solvent
:Methanol (>99.9% HPLC grade)
<실시예 2><Example 2>
GliZ 유전자 결손에 의한 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A의 대량 생산Mass production of serotin A from Aspergillus fumigatus by GliZ gene deletion
본 발명자들은 슈로틴 A의 생합성에 미치는 영향을 분자적 수준에서 규명하기 위하여 다른 이차대사물질의 생산과의 연관성을 살펴보았다. 상기 실시예 1의 결과를 통해 본 발명자들은 이차대사물질인 gliotoxin은 아연의 농도가 낮을 때 생합성이 활성화된다는 것을 확인하였다. 따라서 gliotoxin의 생산과 슈로틴 A의 생합성의 연관성을 분석하기 위해, gliotoxin의 생합성을 조절하는 GliZ 유전자를 결손시킨 아스퍼질러스 푸미가투스와 야생형 아스퍼질러스 푸미가투스의 슈로틴 A 생산량을 비교 분석하였다. GliZ 유전자를 결손시킨 아스퍼질러스 푸미가투스는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 먼저 PyrG 마커를 포함하는 벡터를 준비하고, 아스퍼질러스 푸미가투스의 GliZ 유전자(AFUB_075680) ORF의 5’ 말단과 3’ 말단 쪽 유전자를 600~800bp 길이로 PCR한 뒤, 5’ 말단 fragment와 3’ 말단 fragment 사이에 PyrG 마커가 존재하도록 플라스미드를 클로닝 하였다. 이후 클로닝한 플라스미드를 Protoplast 상태의 아스퍼질러스 푸미가투스 auxotroph에 형질전환을 수행하여 아스퍼질러스 푸미가투스 내에서 GliZ 유전자의 5’, 3’ 양쪽 말단과, 플라스미드에 존재하는 5’, 3’, 유전자 fragment 사이에서 상동성 재조합(homologous recombination)이 발생하여 게놈 상에 존재하던 GliZ 유전자가 플라스미드의 PyrG 마커로 치환되도록 하여 GliZ 유전자가 결손된 아스퍼질러스 푸미가투스를 제조하였다. 또한, GliZ 유전자가 PyrG 마커로 잘 치환되었는지 확인하기 위해, Uracil과 Uridine이 존재하지 않는 배지에서 콜로니를 형성하는 아스퍼질러스 푸미가투스 만을 선별하였고, PyrG 마커 안 쪽과 GliZ 유전자 바깥에 특이적인 염기서열의 프라이머를 제작하여 PCR 산물 여부를 통해 GliZ 유전자의 결손을 재확인하였다.The present inventors examined the relationship with the production of other secondary metabolites in order to investigate the effect on the biosynthesis of serotin A at the molecular level. Through the results of Example 1, the present inventors confirmed that the biosynthesis of gliotoxin, a secondary metabolite, is activated when the concentration of zinc is low. Therefore, in order to analyze the relationship between gliotoxin production and serotin A biosynthesis, Aspergillus fumigatus deficient in the GliZ gene that regulates gliotoxin biosynthesis and wild-type Aspergillus fumigatus were compared and analyzed for serotin A production. did Aspergillus fumigatus in which the GliZ gene was deleted was prepared as follows. First, a vector containing the PyrG marker is prepared, PCR is performed on the 5' end and 3' end of the ORF of Aspergillus fumigatus GliZ gene (AFUB_075680) in a length of 600-800 bp, and the 5' end fragment and 3 ' The plasmid was cloned so that the PyrG marker was present between the terminal fragments. Then, the cloned plasmid was transformed into Aspergillus fumigatus auxotroph in Protoplast state, and both 5' and 3' ends of the GliZ gene in Aspergillus fumigatus and 5' and 3' plasmids present in the plasmid were transformed. , Homologous recombination occurred between the gene fragments to replace the GliZ gene present on the genome with the PyrG marker of the plasmid, thereby preparing Aspergillus fumigatus having a GliZ gene deletion. In addition, to confirm that the GliZ gene was well substituted with the PyrG marker, only Aspergillus fumigatus forming colonies in a medium without Uracil and Uridine were selected, and specific bases inside the PyrG marker and outside the GliZ gene were selected. Primers of the sequence were prepared and the deletion of the GliZ gene was reconfirmed through the presence or absence of the PCR product.
분석 결과, 야생주에 비해 gliotoxin의 생합성을 조절하는 GliZ 유전자가 결손된 경우, 슈로틴 A의 생산이 증가하는 것으로 나타났다(도 3). 또한 GliZ 유전자의 결손으로 인해 gliotoxin A의 생산을 조절하는 유전자인 FumR의 발현도 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 이러한 유전자의 발현 증가가 결국 슈로틴 A의 생산을 증가시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 4).As a result of the analysis, it was found that the production of serotin A increased when the GliZ gene that regulates the biosynthesis of gliotoxin was deleted compared to the wild strain (FIG. 3). In addition, it was confirmed that the expression of FumR, a gene that regulates the production of gliotoxin A, was also increased due to the deletion of the GliZ gene, and it was found that the increased expression of these genes could eventually increase the production of serotin A (Fig. 4).
<실시예 3><Example 3>
아연 첨가 배지에서 GliZ 유전자를 결손시킨 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A의 대량 생산Mass production of serotin A from Aspergillus fumigatus deficient in the GliZ gene in zinc-supplemented media
상기 실시예 2의 결과를 통해 본 발명자들은 아연을 첨가한 배지를 이용할 경우, 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A의 생산을 증가시킬 수 있으며, 상기 실시예 3의 결과를 통해 GliZ 유전자를 결손시킨 아스퍼질러스 푸미가투스의 경우, 야생형 균주에 비해 슈로틴 A의 생산을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 GliZ 유전자가 결손된 아스퍼질러스 푸미가투스를 아연이 첨가된 배지에서 배양할 경우, 슈로틴 A의 생산 증가량을 분석하였다.Through the results of Example 2, the present inventors found that the production of serotin A from Aspergillus fumigatus can be increased when using a medium supplemented with zinc, and the GliZ gene is deleted through the results of Example 3. In the case of Aspergillus fumigatus, it was confirmed that the production of serotin A can be increased compared to the wild type strain. Accordingly, the present inventors analyzed the increased production of serotin A when Aspergillus fumigatus having a GliZ gene deficiency was cultured in a zinc-supplemented medium.
그 결과, 야생균주를 정상조건에서 배양한 경우, 슈로틴 A는 2.38ug/100ml culture로 생산되는 것으로 나타났으나, GliZ 유전자 결손 균주를 아연이 첨가된 배지에서 배양한 경우, 이보다 약 229배 증가한 546ug/100ml culture의 슈로틴 A를 생산하는 것을 확인할 수 있었다(도 6).As a result, when the wild strain was cultured under normal conditions, serotin A was found to be produced at 2.38ug/100ml culture, but when the GliZ gene-defective strain was cultured in a zinc-supplemented medium, it increased about 229 times. It was confirmed that 546ug/100ml culture of serotin A was produced (FIG. 6).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 GliZ 유전자를 결손시킨 아스퍼질러스 푸미가투스를 아연이 첨가된 배지에서 배양함으로써 유용한 생리활성 물질인 슈로틴 A를 대량 생산할 수 있음을 알 수 있었다.From these results, the present inventors found that Aspergillus fumigatus having a GliZ gene deletion can be cultured in a zinc-added medium to mass-produce serotin A, a useful physiologically active substance.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, the present invention has been looked at with respect to its preferred embodiments. Those skilled in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered from an illustrative rather than a limiting point of view. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the equivalent scope will be construed as being included in the present invention.
Claims (8)
아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A(pseurotin A)를 대량생산하는 방법.Including the step of culturing by adding zinc to a culture medium of Aspergillus fumigatus,
A method for mass-producing pseudotin A from Aspergillus fumigatus.
상기 아연은 배지에 대하여 1~10uM의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는, 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A(pseurotin A)를 대량생산하는 방법.According to claim 1,
The method for mass-producing pseudotin A from Aspergillus fumigatus, characterized in that the zinc is added at a concentration of 1 ~ 10uM with respect to the medium.
상기 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)는 Gliz 유전자가 결손되어 있는 것을 특징으로 하는, 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A(pseurotin A)를 대량생산하는 방법.According to claim 1,
The Aspergillus fumigatus is a method for mass-producing pseudotin A from Aspergillus fumigatus, characterized in that the Gliz gene is missing.
상기 Gliz 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A(pseurotin A)를 대량생산하는 방법.According to claim 3,
The method for mass-producing pseudotin A from Aspergillus fumigatus, characterized in that the Gliz gene consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
Gliz 유전자 결손은 슈로틴 A(pseurotin A)의 생산을 조절하는 fumR의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A(pseurotin A)를 대량생산하는 방법.According to claim 3,
A method for mass-producing pseudotin A from Aspergillus fumigatus, wherein the deletion of the Gliz gene increases the expression of fumR, which regulates the production of pseurotin A.
상기 아연은 배지에 대하여 1~10uM의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는, 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A(pseurotin A)의 생산 증진용 배지 조성물.According to claim 6,
The medium composition for enhancing the production of pseudotin A from Aspergillus fumigatus, characterized in that the zinc is added at a concentration of 1 ~ 10uM with respect to the medium.
상기 배양배지는 크자펙-독스(Czapek-Dox) 배지인 것을 특징으로 하는, 아스퍼질러스 푸미가투스로부터 슈로틴 A(pseurotin A)의 생산 증진용 배지 조성물.According to claim 6,
The culture medium is a medium composition for promoting production of pseurotin A from Aspergillus fumigatus, characterized in that the Czapek-Dox medium.
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2022
- 2022-07-13 KR KR1020220086379A patent/KR20230012429A/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100936277B1 (en) | 2007-11-20 | 2010-01-13 | 한국과학기술연구원 | The co-culture method of Sphingomonas sp. Bacterial strain and Aspergillus sp. fungus strain, new anti-cancer and antibiotic glionitrins derived from this co-culture method, and pharmaceutical composition containing glionitrins or pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient |
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