KR20230002086A - Platform for screening effective intestinal bacterial strains to alleviate Alzheimer’s disease pathology - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 알츠하이머병 (Alzheimer’s disease, AD)의 뇌 내 병리 완화에 효과적인 균주를 찾기 위한 스크리닝 플랫폼에 관한 것이다. AD의 예방 및 치료제 효능을 나타내는 장내 세균을 발굴하는 데 본 발명에서 구축한 스크리닝 플랫폼을 적용할 수 있다. The present invention relates to a screening platform for finding strains effective in mitigating pathology in the brain of Alzheimer's disease (AD). The screening platform constructed in the present invention can be applied to discover intestinal bacteria exhibiting efficacy in preventing and treating AD.
알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)는 치매의 가장 흔한 형태에 속한 퇴행성 뇌 질환이다. AD 환자는 초기 기억력 저하를 비롯하여 병이 진행될수록 언어능력, 판단력 등의 여러 인지적 기능이 점진적으로 감퇴하고 이는 결국 일상생활에 심각한 문제를 일으키게 된다. 아직까지 알츠하이머병의 정확한 발병 원인과 기전은 밝혀지지 않았지만, 뇌 조직 내 베타 아밀로이드 단백질 (Amyloid beta protein, Aβ)과 타우 단백질 (Tau protein, Tau)의 비정상적인 축적으로 인한 신경세포의 손상과 이로 인한 뇌 속 면역세포의 과도한 활성이 주된 원인으로 알려져 있다. AD는 이러한 주요 가설들을 원인으로 하는 대표적인 뇌 질환이기 때문에 현재 사용되고 있는 치료제의 대부분은 뇌신경세포간 신호 전달 문제를 해결하기 위한 약물이고, 치료제 개발을 위한 연구가 주로 뇌 안에 국한되어 진행되고 있다. Alzheimer's disease (AD) is a degenerative brain disease that belongs to the most common form of dementia. In AD patients, as the disease progresses, including early memory decline, various cognitive functions such as language ability and judgment gradually decline, which eventually causes serious problems in daily life. Although the exact cause and mechanism of Alzheimer's disease have not yet been identified, damage to nerve cells due to abnormal accumulation of amyloid beta protein (Aβ) and tau protein (Tau) in brain tissue and resulting brain damage. Excessive activity of the genus immune cells is known to be the main cause. Since AD is a representative brain disease caused by these major hypotheses, most of the currently used treatments are drugs to solve the problem of signal transmission between brain neurons, and research for the development of a treatment is mainly confined to the brain.
많은 연구 결과에 따르면, 장내 미생물이 장과 뇌 사이의 내분비계, 신경계, 면역계를 통한 양방향성 소통에 결정적 역할을 한다고 밝혀졌다. 장내 미생물의 구성과 대사산물의 변화가 전신 면역, 호르몬, 신경전달물질 등을 매개로 하여 식욕, 수면, 기분 조절뿐만 아니라 기억력이나 학습 등의 뇌 기능에도 직접 영향을 미치는 세부 기전들이 확인되었다. 장과 뇌의 상관관계가 명백해지면서 다양한 뇌 질환에서 장내 미생물의 역할을 확인한 결과가 잇따라 보고되었고, 파킨슨병이나 AD과 같은 퇴행성 뇌 질환에서도 식이조절, 무균 동물, 항생제, 프로바이오틱스 등을 이용한 장-뇌 축을 설명하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 하지만 AD에서 장내 미생물과 숙주의 상호 관계를 확인하기 위한 동물 실험은 장내 미생물과 뇌 병변의 연관관계를 이해하는 데 중요한 역할을 하였지만 치료 후보의 특정 미생물을 발굴하거나 그의 정확한 작용 기전을 밝히는 데에는 체내 생리 작용의 다양성으로 인한 한계가 존재한다.Numerous studies have revealed that the gut microbiome plays a critical role in bidirectional communication between the gut and the brain through the endocrine, nervous, and immune systems. Detailed mechanisms by which changes in the composition of gut microbes and metabolites directly affect not only appetite, sleep, and mood control but also brain functions such as memory and learning through systemic immunity, hormones, and neurotransmitters have been identified. As the correlation between the gut and the brain became clear, results confirming the role of gut microbes in various brain diseases have been reported one after another, and even in degenerative brain diseases such as Parkinson's disease and AD, gut-brain using diet control, germ-free animals, antibiotics, and probiotics, etc. Research is being actively conducted to explain the axis. However, animal experiments to confirm the mutual relationship between the gut microbes and the host in AD have played an important role in understanding the relationship between the gut microbes and brain lesions. There are limitations due to the diversity of actions.
본 발명자들은 알츠하이머의 발병과 장내 미생물과의 연관관계를 연구하고자, 장-뇌 축과 관련된 알츠하이머의 병리 현상을 재현할 수 있는 장 오가노이드를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 알츠하이머 모델 동물의 장 움(crypt)에서 유래한 살아있는 세포를 포함하는 오가노이드(인 비트로 세포구조체)를 제작하고, 이들이 야생형 동물의 장에서 유래한 오가노이드와 차이가 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. In order to study the relationship between the onset of Alzheimer's disease and gut microbes, the present inventors have made intensive research efforts to develop intestinal organoids capable of reproducing the pathology of Alzheimer's associated with the gut-brain axis. As a result, by preparing organoids (in vitro cell structures) containing live cells derived from the intestine crypt of Alzheimer's model animals, and identifying that they are different from organoids derived from the intestine of wild-type animals, this study invention was completed.
따라서, 본 발명의 목적은 알츠하이머 모델 동물 또는 알츠하이머 환자의 장 움(crypt) 조직에서 분리된 살아있는 세포를 포함하는 인 비트로 세포구조체를 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to provide an in vitro cell construct comprising live cells isolated from Alzheimer's model animals or intestinal crypt tissues of Alzheimer's patients.
본 발명의 다른 목적은 알츠하이머 모델 동물 또는 알츠하이머 환자의 장 움(crypt) 조직으로부터 분리된 세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 인 비트로 세포구조체의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing an in vitro cell construct comprising the step of three-dimensionally culturing cells isolated from intestinal crypt tissues of Alzheimer's model animals or Alzheimer's patients.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인 비트로 세포구조체를 이용하여 알츠하이머 병리 완화 효능이 있는 균주의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for screening strains having the efficacy of alleviating Alzheimer's pathology using the in vitro cell construct.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 알츠하이머 모델 동물 또는 알츠하이머 환자의 장 움(crypt) 조직에서 분리된 살아있는 세포를 포함하는 인 비트로 세포구조체를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides an in vitro cell construct comprising living cells isolated from Alzheimer's model animals or intestinal crypt tissues of Alzheimer's patients.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 인 비트로 세포구조체는 구(sphere)의 형태를 띄고, 내강을 가진다.In one embodiment of the present invention, the in vitro cell structure takes the form of a sphere and has a lumen.
장에는 수많은 움 (crypt)의 끝부분에 성체 줄기 세포가 존재한다. 따라서 상기 장 움 조직에서 분리된 살아있는 세포는 장 상피세포, 장 상피 줄기세포, 또는 이들의 조합이나, 이에 한정되는 것은 아니다. Adult stem cells are present at the ends of numerous crypts in the intestine. Therefore, the living cells isolated from intestinal tissue are intestinal epithelial cells, intestinal epithelial stem cells, or a combination thereof, but are not limited thereto.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 알츠하이머 모델 동물은 ALDPAPT 마우스이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the Alzheimer's model animal is an ALDP APT mouse, but is not limited thereto.
상기 ADLPAPT 마우스는 Aβ와 Tau의 축적이 함께 일어나는 질환 모델 동물로서 AD의 신경학적 병리 및 인지적 장애를 실제 환자와 가장 비슷한 수준으로 재현한 모델이다. 실제 정상인과 AD 환자의 장내 미생물 군집의 구성에 차이가 있다는 기존 연구 결과와 같이, 뇌 내 AD 병리 현상을 나타내는 ADLPAPT 마우스의 장내 미생물 군집도 ADLPWT 마우스와 그의 구성이 다르다고 알려져 있다. 또한, 장내 미생물의 불균형과 함께 ADLPAPT 마우스는 장 조직세포의 노화, 높은 장벽 투과도와 장내 염증을 나타낸다. ADLPAPT 마우스의 높은 투과성의 장 상피세포는 제대로 된 장벽 기능을 수행하지 못하기 때문에 장관 내의 세균 유래 물질이 혈액으로 새어나가 전신 염증반응을 야기한다. 이러한 ADLPAPT 마우스의 장내 환경의 변화와 전신 염증을 ADLPWT 마우스의 건강한 장내 미생물을 이식하여 회복시켰을 때, 뇌 내 AD 병리와 인지 장애가 완화되었다. 장벽 약화에 의한 전신 염증이 AD의 중증도와 함께 나타났으며, 건강한 장내 환경을 재건하여 ADLPAPT 마우스의 장 장벽을 온전하게 하는 것이 뇌의 AD 병리를 완화시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다. The ADLP APT mouse is a disease model animal in which Aβ and Tau accumulate together, and is a model that reproduces the neurological pathology and cognitive impairment of AD at a level most similar to that of an actual patient. It is known that the composition of the gut microbiome of ADLP APT mice exhibiting AD pathology in the brain is different from that of ADLP WT mice, as in previous studies showing that there is a difference in the composition of the gut microbiome of normal subjects and AD patients. In addition, along with an imbalance of gut microbiota, ADLP APT mice exhibit senescence of intestinal histocytes, high barrier permeability and intestinal inflammation. Since the highly permeable intestinal epithelial cells of ADLP APT mice do not function properly as a barrier, bacteria-derived substances in the intestinal tract leak into the blood and cause a systemic inflammatory response. When these changes in the intestinal environment and systemic inflammation of ADLP APT mice were restored by transplanting healthy intestinal microflora of ADLP WT mice, AD pathology and cognitive impairment in the brain were alleviated. Systemic inflammation due to barrier weakening appeared with the severity of AD, and it was found that intact intestinal barrier in ADLP APT mice by rebuilding a healthy intestinal environment could alleviate AD pathology in the brain.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포는 미세융모(microvilli)가 있는 정단부(apical surface)가 세포구조체의 내강을 향하고, 기저부(basal surface)가 세포구조체의 외측을 향하는 극성(polarity)을 가진 것이다.In one embodiment of the present invention, the cell has a polarity in which the apical surface with microvilli faces the lumen of the cell structure and the basal surface faces the outside of the cell structure. will be.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 세포는 미세융모(microvilli)가 있는 정단부(apical surface)가 세포구조체의 외측을 향하고, 기저부(basal surface)가 세포구조체의 내강을 향하는 극성(polarity)을 가진 것이다.In another embodiment of the present invention, the cell has a polarity such that the apical surface with microvilli faces the outside of the cell structure and the basal surface faces the lumen of the cell structure. will be.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포구조체는 i) Muc2, Itln1, Ang4, 및 Reg3g로 이루어진 군으로부터 선택되는 술잔세포 특이적 항균 펩타이드; ii) Zo-1 및 E-cadherin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 밀착연접(tight junction) 특이 단백질; 또는 iii) 이들의 조합의 발현양이 야생형 동물의 장 움 조직에서 분리된 살아있는 세포를 포함하는 인 비트로 세포구조체에서의 발현양보다 더 적은 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the cellular construct is i) a goblet cell-specific antibacterial peptide selected from the group consisting of Muc2, Itln1, Ang4, and Reg3g; ii) a tight junction specific protein selected from the group consisting of Zo-1 and E-cadherin; or iii) the expression level of a combination thereof is lower than that of an in vitro cell construct including living cells isolated from intestinal tissue of a wild-type animal.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 알츠하이머 모델 동물 또는 알츠하이머 환자의 장 움(crypt) 조직으로부터 분리된 세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 인 비트로 세포구조체의 제조방법을 제공한다. According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing an in vitro cell construct comprising the step of three-dimensionally culturing cells isolated from intestinal crypt tissue of an Alzheimer's model animal or an Alzheimer's patient.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 장 움 조직으로부터 분리된 세포는 장 상피 줄기세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the cells isolated from intestinal tissue include, but are not limited to, intestinal epithelial stem cells.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 3차원 배양은 세포외기질을 포함하는 배양 물질에서 배양된다. 본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 세포외기질을 포함하는 배양 물질은 매트리젤(Matrigel)이다.In one embodiment of the present invention, the three-dimensional culture is cultured in a culture material containing an extracellular matrix. In a specific embodiment of the present invention, the culture material containing the extracellular matrix is Matrigel.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포외 기질은 라미닌, 엘라스틴, 제4형 콜라겐, 제1형 콜라겐, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 및 황산 헤파란으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the extracellular matrix is at least one selected from the group consisting of laminin, elastin,
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 배양은 B27, N2, N-Acetylcysteine로 이루어진 군으로부터 선택된 보충물; Wnt 작용제; BMP 억제제; EGF(epidermal growth factor); 및 Rho kinase 저해제; 또는 이들의 조합을 포함하는 배지 내에서 이루어지나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the culture is a supplement selected from the group consisting of B27, N2, N-Acetylcysteine; Wnt agonists; BMP inhibitors; epidermal growth factor (EGF); and Rho kinase inhibitors; or in a medium containing a combination thereof, but is not limited thereto.
본 발명의 세포구조체의 제조를 위하여 세포를 배양함에 있어서, 상기 세포외 기질을 포함하는 배양 물질과 상기 배지는 함께 또는 각각 사용될 수 있다. In culturing cells for the preparation of the cell construct of the present invention, the culture material and the medium containing the extracellular matrix may be used together or separately.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 Wnt 작용제는 R-spondin1, Wnt3a 및 Wnt surrogate-Fc fusion protein으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In a specific embodiment of the present invention, the Wnt agonist is selected from the group consisting of R-spondin1, Wnt3a and Wnt surrogate-Fc fusion protein, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 BMP 억제제는 Noggin이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In a specific embodiment of the present invention, the BMP inhibitor is Noggin, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 Rho kinase 저해제는 Y-27632, 및 H-1152로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.In a specific embodiment of the present invention, the Rho kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632 and H-1152, but is not limited thereto.
보다 구체적으로, 상기 배양은 Wnt (Frizzled/LRP ligand), R-spondin 1 (Lgr4/5 ligand, Wnt agonist), Noggin (BMP antagonist), 및 EGF (Epidermal growth factor)를 포함하는 미세환경 인자를 포함하는 배지 내에서 이루어지나, 이에 한정되는 것은 아니다.More specifically, the culture includes microenvironmental factors including Wnt (Frizzled/LRP ligand), R-spondin 1 (Lgr4/5 ligand, Wnt agonist), Noggin (BMP antagonist), and EGF (Epidermal growth factor) It is made in a medium that does, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 배양시 배양 배지는 2일 내지 3일 주기로 교체된다.In one embodiment of the present invention, during the culture, the culture medium is replaced every 2 to 3 days.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 배양시 배양 기간은 5일 내지 15일, 5일 내지 14일, 5일 내지 12일, 5일 내지 10일, 5일 내지 8일, 6일 내지 15일, 6일 내지 14일, 6일 내지 12일, 6일 내지 10일, 6일 내지 8일, 7일 내지 15일, 7일 내지 14일, 7일 내지 12일, 7일 내지 10일, 또는 7일 내지 8일 동안 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In one embodiment of the present invention, the culture period during the culture is 5 days to 15 days, 5 days to 14 days, 5 days to 12 days, 5 days to 10 days, 5 days to 8 days, 6 days to 15 days , 6 to 14 days, 6 to 12 days, 6 to 10 days, 6 to 8 days, 7 to 15 days, 7 to 14 days, 7 to 12 days, 7 to 10 days, or It may be made for 7 to 8 days, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, ADLPWT 마우스와 ADLPAPT 마우스의 장 움 (crypt) 조직 절편을 분리하여 얻은 상피 줄기 세포를 주요 미세 환경 성분으로 하는 배지와 세포외기질 인자를 제공하는 환경에서 배양하면 생체 내 장 조직과 유사한 구조와 기능을 가진 장 오가노이드를 생산할 수 있다. 본 발명자들은 직접 배양한 3차원 형태의 오가노이드가 장 조직 특이적 단백질을 발현하는지 확인해 봄으로써 장 오가노이드 모델을 검증하였다. 장 상피 줄기세포를 확인하기 위해 증식하는 세포에서 특이적으로 발현하는 Ki67과, 장 상피세포에서 특이적으로 발현하는 Mucin5B를 각각에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하면 면역형광염색법으로 발현을 확인할 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, epithelial stem cells obtained by separating intestinal crypt tissue sections of ADLP WT mice and ADLP APT mice are cultured in an environment that provides a medium and extracellular matrix factors as major microenvironmental components It is possible to produce intestinal organoids with structures and functions similar to those of in vivo intestinal tissue. The present inventors verified the intestinal organoid model by checking whether the directly cultured three-dimensional organoid expresses intestinal tissue-specific proteins. In order to identify intestinal epithelial stem cells, using antibodies that bind specifically to Ki67, which is specifically expressed in proliferating cells, and Mucin5B, which is specifically expressed in intestinal epithelial cells, respectively, expression can be confirmed by immunofluorescence staining. there is.
상기 세포외기질을 포함하는 배양 물질에서 세포구조체를 배양하면 미세융모(microvilli)가 있는 정단부(apical surface)가 세포구조체의 내강을 향하고, 기저부(basal surface)가 세포구조체의 외측을 향하는 극성(polarity)을 갖는 세포 구조체가 제작된다. 이러한 극성을 갖는 세포구조체는 basal-out형의 세포구조체라고 표현될 수 있다. When the cell structure is cultured in a culture material containing the extracellular matrix, the apical surface with microvilli faces the lumen of the cell structure, and the basal surface faces the outside of the cell structure. ) A cell construct having a is fabricated. A cell structure having such a polarity can be expressed as a basal-out type cell structure.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 세포구조체의 제조방법은 세포외 기질을 포함하는 배양물질을 제거하고 현탁배양 하는 단계를 추가적으로 포함한다. 상기 세포외 기질을 포함하는 배양물질을 제거하고 현택배양을 하면 미세융모(microvilli)가 있는 정단부(apical surface)가 세포구조체의 외측을 향하고, 기저부(basal surface)가 세포구조체의 내강을 향하는 극성(polarity)을 가진 세포구조체가 제작된다. 이러한 극성을 갖는 세포구조체는 apical-out형의 세포구조체라고 표현될 수 있다.In another embodiment of the present invention, the method for producing the cell construct additionally includes the step of removing the culture material including the extracellular matrix and culturing the suspension. When the suspension culture is performed after removing the culture material containing the extracellular matrix, the apical surface with microvilli faces the outside of the cell structure, and the basal surface faces the lumen of the cell structure. A cellular structure with polarity is fabricated. A cell structure having such a polarity can be expressed as an apical-out type cell structure.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 현탁 배양은 기본 배양 배지에 B27 supplement, N2 supplement, N-Acetylcysteine, R-spondin 1, Wnt, Noggin, EGF, Y-27632, 또는 이들의 조합을 보충물 또는 성장인자로 포함하는 배양 배지내에서 이루어질 수 있다. In one embodiment of the present invention, the suspension culture is supplemented with B27 supplement, N2 supplement, N-Acetylcysteine, R-
상기 기본 배양 배지는 Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM), F-12, DMEM/F-12, Iscove's Modified Dulbecco 's Media(IMDM), Fischer' Medium, Minimum Essential Media Eagle (MEM), MEM alpha MEM, RPMI 1640, Williams' Medium, Media 199(M199)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The basal culture medium is Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM), F-12, DMEM/F-12, Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM), Fischer' Medium, Minimum Essential Media Eagle (MEM), MEM alpha MEM, RPMI 1640, Williams' Medium, and may be selected from the group consisting of Media 199 (M199), but is not limited thereto.
상기 현탁배양은 2일 내지 5일, 2일 내지 4일, 2일 내지 3일, 3일 내지 5일, 3일 내지 4일, 2일, 3일, 4일, 또는 5일간 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The suspension culture may be performed for 2 to 5 days, 2 to 4 days, 2 to 3 days, 3 to 5 days, 3 to 4 days, 2 days, 3 days, 4 days, or 5 days, It is not limited to this.
상기 현탁배양은 유가식 배양 또는 연속식 배양으로 이루어질 수 있다. 유가식 배양은 세포배양 시 배양액의 교체 없이 배양액을 매일 10% 내지 30%씩 추가하여 배양하는 방식이고, 연속식 배양은 세포배양 시 배양액의 25% 내지 75%를 2 내지 3일 간격으로 교체하여 배양하는 방식이다. The suspension culture may be performed by fed-batch culture or continuous culture. Fed-batch culture is a method of culturing by adding 10% to 30% of the culture medium every day without replacing the culture medium during cell culture, and continuous culture is by replacing 25% to 75% of the culture medium at intervals of 2 to 3 days during cell culture. way of cultivating.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 알츠하이머 병리 완화 효능이 있는 균주의 스크리닝 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for screening strains having the efficacy of alleviating Alzheimer's pathology comprising the following steps:
(a) 알츠하이머 모델 동물 또는 알츠하이머 환자의 장 움(crypt) 조직에서 분리된 살아있는 세포를 포함하는 인 비트로 세포구조체에 시험 균주를 처리하는 단계; 및(a) treating a test strain with an in vitro cell construct containing living cells isolated from Alzheimer's model animals or intestinal crypt tissues of Alzheimer's patients; and
(b) 상기 세포구조체의 i) Muc2, Itln1, Ang4, 및 Reg3g로 이루어진 군으로부터 선택되는 술잔세포 특이적 항균 펩타이드; ii) Zo-1 및 E-cadherin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 밀착연접(tight junction) 특이 단백질; 또는 iii) 이들의 조합의 발현양을 측정하는 단계:(b) i) a goblet cell-specific antimicrobial peptide selected from the group consisting of Muc2, Itln1, Ang4, and Reg3g; ii) a tight junction specific protein selected from the group consisting of Zo-1 and E-cadherin; or iii) measuring the expression level of a combination thereof:
상기 (b) 단계에서 측정한 i), ii), 또는 iii)의 발현양이 상기 시험 균주를 처리하기 전과 비교하여 증가된 경우 알츠하이머 병리 완화 효능이 있는 균주로 판정함.If the expression level of i), ii), or iii) measured in step (b) is increased compared to before treatment with the test strain, it is determined as a strain having an effect of alleviating Alzheimer's pathology.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 스크리닝 방법에서 사용된 인 비트로 세포구조체는 apical-out 형의 세포구조체이다.In one embodiment of the present invention, the in vitro cell construct used in the screening method is an apical-out type cell construct.
본 발명의 장 오가노이드 모델은 AD 질환 모델 마우스에서 확인된 장내 환경을 모사할 수 있다. ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드와 ADLPWT 마우스 유래 장 오가노이드를 비교하면 줄기세포 자체의 수에는 큰 차이가 없지만, 장내 미생물이 장 상피 세포에 부착하여 증식하게 하거나, 장내 미생물로부터 장벽을 보호하는 기능을 하는 술잔 세포의 수와 기능성 술잔 세포가 분비하는 항균펩타이드 관련 유전자 발현 양이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드는 장벽을 이루는 단백질들의 배열이 불규칙 하였다.The intestinal organoid model of the present invention can mimic the intestinal environment found in AD disease model mice. Comparing the intestinal organoids derived from ADLP APT mice and those derived from ADLP WT mice, there is no significant difference in the number of stem cells themselves, but the ability of intestinal microorganisms to adhere to and proliferate on intestinal epithelial cells or to protect the intestinal barrier from intestinal microorganisms It was confirmed that the number of goblet cells and the amount of antibacterial peptide-related gene expression secreted by functional goblet cells decreased. In addition, the intestinal organoids derived from ADLP APT mice had irregular arrangements of barrier proteins.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 알츠하이머 병리 완화 효능이 있는 균주의 스크리닝 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for screening strains having the efficacy of alleviating Alzheimer's pathology comprising the following steps:
(a) 알츠하이머 모델 동물 또는 알츠하이머 환자의 장 움(crypt) 조직에서 분리된 살아있는 세포를 포함하는 인 비트로 세포구조체의 내강에 시험 균주 및 형광물질을 처리하는 단계; 및(a) treating a test strain and a fluorescent material in the lumen of an in vitro cell construct containing living cells isolated from Alzheimer's model animals or intestinal crypt tissues of Alzheimer's patients; and
(b) 상기 형광물질이 세포구조체의 내강으로부터 새어 나오는 양을 측정하는 단계:(b) measuring the amount of the fluorescent material leaking from the lumen of the cell structure:
상기 (b) 단계에서 측정한 형광물질이 내강으로부터 새어 나오는 양이 상기 시험 균주를 처리하기 전과 비교하여 감소된 경우 알츠하이머 병리 완화 효능이 있는 균주로 판정함.If the amount of the fluorescent material leaked from the lumen measured in step (b) is reduced compared to before treatment with the test strain, it is determined as a strain having an effect of alleviating Alzheimer's pathology.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 형광물질은 Fluorescein isothiocyanate (FITC)를 포함하는 것이다. 구체적으로 상기 형광물질은 FITC-Dextran일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the fluorescent material includes Fluorescein isothiocyanate (FITC). Specifically, the fluorescent material may be FITC-Dextran, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 스크리닝 방법에서 사용된 인 비트로 세포구조체는 basal-out 형의 세포구조체이다.In one embodiment of the present invention, the in vitro cell construct used in the screening method is a basal-out type cell construct.
본 발명의 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드에서 형광 물질의 주입을 통해 장 투과도를 측정한 결과, ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드의 장 투과도가 ADLPWT 마우스 유래 장 오가노이드보다 더욱 증가되어 있는 것을 확인하였다.As a result of measuring the intestinal permeability of the ADLP APT mouse-derived intestinal organoid of the present invention by injecting a fluorescent material, it was confirmed that the intestinal permeability of the ADLP APT mouse-derived intestinal organoid was more increased than that of the ADLP WT mouse-derived intestinal organoid. .
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
본 발명은 알츠하이머 모델 동물 또는 알츠하이머 환자의 장 움(crypt) 조직에서 분리된 살아있는 세포를 포함하는 인 비트로 세포구조체와 이의 제조방법, 및 상기 인 비트로 세포구조체를 이용한 알츠하이머 병리 완화 효능이 있는 균주의 스크리닝 방법을 제공한다.The present invention relates to an in vitro cell construct comprising live cells isolated from intestinal crypt tissues of Alzheimer's model animals or Alzheimer's patients, a method for producing the same, and screening of strains having an efficacy in alleviating Alzheimer's pathology using the in vitro cell construct provides a way
본 발명의 인 비트로 세포구조체는 알츠하이머 모델 동물 또는 알츠하이머 환자의 장을 모사한 세포구조체이므로, 본 발명의 인 비트로 세포구조체는 장-뇌 축과 관련된 알츠하이머의 병리 현상을 재현할 수 있어 알츠하이머의 발병과 장내 미생물과의 연관관계를 연구하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 예컨대 알츠하이머 병리 완화 효능이 있는 균주의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다. Since the in vitro cell structure of the present invention is a cell structure that mimics the intestine of an Alzheimer's model animal or an Alzheimer's patient, the in vitro cell structure of the present invention can reproduce the pathological phenomenon of Alzheimer's related to the gut-brain axis, thereby reducing the onset of Alzheimer's and It can be usefully used to study the relationship with intestinal microbes, and can be usefully used, for example, to screen strains that have an effect of alleviating Alzheimer's pathology.
도 1a는 ADLPWT 마우스 및 ADLPAPT- 마우스로부터 분리된 장 움 세포로부터 제작된 오가노이드의 장 줄기세포 특징적 유전자의 발현을 비교하여 나타낸 도이다. 도 1b는 ADLPWT 마우스 및 ADLPAPT- 마우스로부터 분리된 장 움 세포로부터 제작된 오가노이드의 장 줄기세포 항상성에 필수적인 Wnt 신호 전달 경로에 의해 활성화되는 유전자의 발현을 비교하여 나타낸 도이다. 도 1c는 ADLPWT 마우스 및 ADLPAPT- 마우스로부터 분리된 장 움 세포로부터 제작된 오가노이드의 술잔 세포 특이적 유전자의 발현을 비교하여 나타낸 도이다.
도 2는 ADLPWT 마우스 및 ADLPAPT- 마우스로부터 유래한 장 움 세포로부터 제작된 장 오가노이드의 극성을 basal-out 형태에서 apical-out 형태로 전환한 후의 오가노이드의 유전자 발현을 비교하여 나타낸 도이다.
도 3은 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드의 adherent junctions, tight junctions의 대표적인 단백질인 E-cadherin과 Zo-1을 면역 형광 염색하여 관찰한 도이다.
도 4는 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드의 투과도 평가하기 위하여, 장 오가노이드 내강 쪽에 형광 물질을 주입하고 새어나가는 정도를 측정하는 방법으로 장 투과도를 평가한 도이다.
도 5a는 알츠하이머 병리를 완화시키는 후보 균주의 효능을 평가하기 위하여 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드에 후보 균주를 처리한 후의 Muc2 유전자 발현을 분석하여 나타낸 도이다. 도 5b는 알츠하이머 병리를 완화시키는 후보 균주의 효능을 평가하기 위하여 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드에 후보 균주를 처리한 후의 Zo1 유전자 발현을 분석하여 나타낸 도이다.
도 6a는 알츠하이머 병리를 완화시키는 후보 균주 L6의 효능을 평가하기 위하여 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드의 장 투과도를 평가한 도이다. 도 6b는 알츠하이머 병리를 완화시키는 후보 균주 L7의 효능을 평가하기 위하여 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드의 장 투과도를 평가한 도이다. 도 6c는 알츠하이머 병리를 완화시키는 후보 균주 L8의 효능을 평가하기 위하여 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드의 장 투과도를 평가한 도이다.
도 7은 동물 실험의 개요도 및 실험에 사용한 동물군을 나타낸 도이다.
도 8a은 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드를 이용해 스크리닝한 균주 L7의 알츠하이머 병리 완화 효과를 나타낸 것으로, 발광 물질의 경구 투여 후 장관 내 존재하는 발광 물질의 양을 측정해 실험 동물의 장벽 투과도를 평가한 것이다. 도 8b은 장 내 잔류하는 발광 물질의 양을 정량한 결과를 나타낸다. 도 8c는 형광 물질의 경구 투여 후 마우스의 혈청을 분리해 혈청 내 형광 물질의 세기를 측정한 결과를 나타낸다.
도 8d은 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드를 이용해 스크리닝한 균주 L7의 알츠하이머 병리 완화 효과를 나타낸 것으로, 개방된 팔에 출입하는 총 진입 횟수를 기초로 한 인지적 행동 분석 결과를 나타낸다. 도 8e는 실험 동물이 연속적으로 세 개의 다른 팔에 들어가는 자발적 교대 수를 기초로 한 인지적 행동 분석 결과를 나타낸다.
도 8f는 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드를 이용해 스크리닝한 균주 L7의 알츠하이머 병리 완화 효과를 나타낸 것으로, 뇌 내 Aβ 플라크 면역 염색 결과 이미지를 나타낸다. 도 8h는 뇌 내 Aβ 플라크 면역 염색 결과를 정량한 것이다.
도 8h는 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드를 이용해 스크리닝한 균주 L7의 알츠하이머 병리 완화 효과를 나타낸 것으로, ELISA를 통해 뇌 내 soluble/insoluble Aβ40 및 Aβ42를 정량 분석한 결과를 나타낸다.1a is a diagram showing the comparison of the expression of intestinal stem cell-specific genes in organoids prepared from intestinal cells isolated from ADLP WT mice and ADLP APT- mice. 1B is a diagram showing the comparison of the expression of genes activated by the Wnt signaling pathway essential for intestinal stem cell homeostasis in organoids prepared from intestinal cells isolated from ADLP WT mice and ADLP APT- mice. 1c is a diagram showing the comparison of goblet cell-specific gene expression in organoids prepared from intestinal cells isolated from ADLP WT mice and ADLP APT- mice.
Figure 2 is a diagram showing the comparison of gene expression of intestinal organoids prepared from intestinal cells derived from ADLP WT mice and ADLP APT- mice after converting the polarity from basal-out form to apical-out form. .
FIG. 3 is a diagram showing E-cadherin and Zo-1, which are representative proteins of adherent junctions and tight junctions, of intestinal organoids derived from ADLP APT mice by immunofluorescence staining.
4 is a view illustrating intestinal permeability evaluated by injecting a fluorescent substance into the lumen of the intestinal organoid and measuring the degree of leakage in order to evaluate the permeability of the intestinal organoid derived from the ADLP APT mouse.
FIG. 5a is a diagram showing analysis of Muc2 gene expression after treating intestinal organoids derived from ADLP APT mice with a candidate strain in order to evaluate the efficacy of the candidate strain for alleviating Alzheimer's pathology. 5B is a diagram showing analysis of Zo1 gene expression after treatment of candidate strains with intestinal organoids derived from ADLP APT mice in order to evaluate the efficacy of candidate strains in alleviating Alzheimer's pathology.
6a is a diagram illustrating intestinal permeability of intestinal organoids derived from ADLP APT mice in order to evaluate the efficacy of candidate strain L6 for alleviating Alzheimer's pathology. 6B is a diagram illustrating intestinal permeability of intestinal organoids derived from ADLP APT mice in order to evaluate the efficacy of candidate strain L7 for alleviating Alzheimer's pathology. 6C is a diagram illustrating intestinal permeability of intestinal organoids derived from ADLP APT mice in order to evaluate the efficacy of candidate strain L8 for alleviating Alzheimer's pathology.
7 is a schematic diagram of an animal experiment and a diagram showing animal groups used in the experiment.
Figure 8a shows the Alzheimer's pathology alleviation effect of strain L7 screened using ADLP APT mouse-derived intestinal organoids. will be. Figure 8b shows the result of quantifying the amount of the luminescent material remaining in the intestine. FIG. 8C shows the result of measuring the intensity of the fluorescent substance in the blood serum of mice after oral administration of the fluorescent substance.
8d shows the Alzheimer's pathology alleviation effect of strain L7 screened using intestinal organoids derived from ADLP APT mice, and shows the results of cognitive behavioral analysis based on the total number of entry into and out of the open arm. 8E shows the result of cognitive behavioral analysis based on the number of spontaneous alternations in which the experimental animal successively entered three different arms.
8f shows the Alzheimer's pathology mitigating effect of strain L7 screened using ADLP APT mouse-derived intestinal organoids, and shows images of Aβ plaque immunostaining in the brain. 8h quantifies the results of Aβ plaque immunostaining in the brain.
8h shows the Alzheimer's pathology alleviation effect of strain L7 screened using ADLP APT mouse-derived intestinal organoids, and shows the results of quantitative analysis of soluble/insoluble Aβ 40 and Aβ 42 in the brain through ELISA.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for explaining the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
실시예Example
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.Throughout this specification, unless otherwise specified, "%" used to indicate the concentration of a particular substance is (weight/weight) % for solids/solids, (weight/volume) % for solids/liquids, and liquid/liquid is (volume/volume) %.
실시예 1: 알츠하이머 동물 모델 (ADLPExample 1: Alzheimer's animal model (ADLP APTAPT ))
본 발명자들은 AD를 일으키는 주요 원인 단백질인 Aβ와 Tau 단백질이 함께 뇌 내 발현되도록 제작한 AD 모델 동물 (ADLP 형질 전환 마우스)을 본 실험에 이용하였다. ADLP 형질 전환 마우스는 뇌 내 Aβ의 축적을 유도하기 위해 인간 아밀로이드 전구체 단백질 유전자와 Presenilin 1 유전자에 총 5개의 돌연변이를 갖는 5XFAD 마우스와, 뇌 내 과인산화된 Tau 단백질의 축적을 일으키는 JNPL3 마우스를 교배하여 제작하였다. ADLPWT 마우스와 비교하여, 비정상적인 Aβ와 Tau 단백질이 동시에 축적되는 ADLPAPT 마우스는 실제 환자와 비슷한 신경 병리학적 특징이 나타나고 인지적 장애를 동반한다(Kim et al., Molecular Neurodegeneration (2018) 13:2). 본 발명에서는 심각한 AD 병리를 나타내는 6~7개월령의 암컷 마우스를 이용하였다. The present inventors used an AD model animal (ADLP transgenic mouse) designed to express both Aβ and Tau protein, which are major causative proteins that cause AD, in the brain. ADLP transgenic mice were developed by crossing 5XFAD mice with a total of 5 mutations in the human amyloid precursor protein gene and
실시예 2. 장 오가노이드 배양Example 2. Intestinal organoid culture
장 오가노이드는 ADLPWT 마우스와 ADLPAPT 마우스의 장 움(crypt) 조직 절편 내 상피줄기세포로부터 배양하였다. 장 조직을 파쇄한 후, 효소가 없는 세포 해리 시약 (Gentle cell dissociation reagent, STEM CELL Technologies)에 20분 동안 배양하여 조직 연화 과정을 거쳤다. 이때 조직을 커버 글라스를 이용하여 눌러주면 물리적으로 움(crypt) 절편의 분리가 가능하다. 분리된 조직에는 상피줄기세포가 포함되어 있고, 이러한 움 조직 절편을 세포외기질 (extracellular matrix) 인자를 제공해주는 메트리젤 (matrigel) 내에서 배양하였다. 그 결과 움 조직 절편에 존재하는 상피줄기세포는 matrigel 내에서 Wnt (Frizzled/LRP ligand), R-spondin 1 (Lgr4/5 ligand, Wnt agonist), Noggin (BMP antagonist), EGF (Epidermal growth factor) 등의 주요한 미세 환경 인자가 포함된 배지에서 장 조직 특이적으로 분화되고 3차원 형태의 실제 장 상피세포의 구조와 기능을 모사한 오가노이드로 배양되었다. Intestinal organoids were cultured from epithelial stem cells in intestinal crypt tissue sections of ADLP WT mice and ADLP APT mice. After disrupting the intestinal tissue, it was cultured in an enzyme-free cell dissociation reagent (STEM CELL Technologies) for 20 minutes to soften the tissue. At this time, if the tissue is pressed using a cover glass, it is possible to physically separate the crypt section. The isolated tissue contains epithelial stem cells, and these cell tissue sections were cultured in matrigel providing extracellular matrix factors. As a result, the epithelial stem cells present in the tissue slices can express Wnt (Frizzled/LRP ligand), R-spondin 1 (Lgr4/5 ligand, Wnt agonist), Noggin (BMP antagonist), EGF (Epidermal growth factor), etc. within matrigel. Organoids were differentiated specifically for intestinal tissue in a medium containing major microenvironmental factors and cultured as organoids that mimicked the structure and function of 3-dimensional intestinal epithelial cells.
장 오가노이드 배양에 이용한 기본 배지는 1% Penicillin/streptomycin (Sigma), 10 mM HEPES (Gibco) 및 GlutaMAX (Gibco, 100X)를 포함하는 Advanced DMEM F12 (Gibco, 1X)이다. 기본 배지에 추가된 보충물과 성장인자는 B27 supplement (Gibco, 50X), N2 supplement (Gibco, 100X), N-Acetylcysteine (Sigma), R-spondin1 conditioned media, Wnt surrogate-Fc fusion protein (U-Protein Express), mouse Noggin (Peprotech), mouse EGF (Peprotechl) 및 Y-27632 (STEM CELL Technologies)이다. 배지는 3일마다 교체하고 7-8일 정도 배양한 장 오가노이드를 실험에 이용하였다. The basic medium used for intestinal organoid culture was Advanced DMEM F12 (Gibco, 1X) containing 1% Penicillin/streptomycin (Sigma), 10 mM HEPES (Gibco) and GlutaMAX (Gibco, 100X). The supplements and growth factors added to the basal medium were B27 supplement (Gibco, 50X), N2 supplement (Gibco, 100X), N-Acetylcysteine (Sigma), R-spondin1 conditioned media, Wnt surrogate-Fc fusion protein (U-Protein Express), mouse Noggin (Peprotech), mouse EGF (Peprotechl) and Y-27632 (STEM CELL Technologies). The medium was changed every 3 days, and intestinal organoids cultured for 7-8 days were used in the experiment.
실시예 3. 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time polymerase chain reaction)을 통한 유전자 분석Example 3. Gene analysis through real-time polymerase chain reaction
ADLPWT 마우스와 ADLPAPT 마우스의 장 움(crypt) 조직으로부터 장 오가노이드를 각각 제조하고, 이들의 유전자 발현을 확인하였다.Intestinal organoids were prepared from intestinal crypt tissues of ADLP WT mice and ADLP APT mice, respectively, and their gene expression was confirmed.
먼저 RNeasy mini kit (Qiagen, USA)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 Maxime RT premic Kit (iNtRON Biotech)를 이용하여 cDNA(complementary DNA)로 합성한 후, 관심 유전자 발현의 정량적 비교를 위해 KAPA SYBR ABI Prism qPCR Kit (KAPA Biosystem)을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. First, RNA was extracted using RNeasy mini kit (Qiagen, USA). After synthesizing the extracted RNA into cDNA (complementary DNA) using the Maxime RT premic Kit (iNtRON Biotech), real-time PCR was performed using the KAPA SYBR ABI Prism qPCR Kit (KAPA Biosystem) for quantitative comparison of gene expression of interest. .
장 오가노이드는 여러 세대를 거듭하여도 본래의 자기 재생 능력과 분화 능력이 유지되기 때문에 ADLPWT 마우스와 ADLPAPT 마우스로부터 배양한 장 오가노이드의 관련 유전자 발현을 분석함으로써 질환 모델링 구축을 검증하였다. 장 줄기세포 특징적 유전자(Lgr5, Ki67, Olfm4, Smoc2)와 장 줄기세포 항상성에 필수적인 Wnt 신호 전달 경로에 의해 활성화되는 유전자(Myc, Ephb2, Sox9, Axin2)의 발현 양을 확인하였다. 또한, 장 상피 세포 중 뮤신(Mucin)을 분비하여 장내 미생물이 장 상피 세포에 부착하여 증식하게 하거나, 장내 미생물로부터 장벽을 보호하는데 필수적인 술잔 세포 (Goblet cell)의 기능을 확인하기 위해 술잔 세포 특이적 유전자(Muc2, Itln1, Ang4, Reg3g)의 발현 양을 확인하였다. 결과는 도 1에 나타내었다. Since intestinal organoids maintain their original self-renewal and differentiation capabilities over several generations, the construction of disease modeling was verified by analyzing the expression of related genes in intestinal organoids cultured from ADLP WT mice and ADLP APT mice. The expression levels of intestinal stem cell-specific genes ( Lgr5, Ki67, Olfm4, Smoc2) and genes activated by the Wnt signaling pathway essential for intestinal stem cell homeostasis ( Myc, Ephb2, Sox9, Axin2 ) were confirmed. In addition, to secrete mucin among intestinal epithelial cells to allow intestinal microorganisms to adhere to and proliferate, or to identify the function of goblet cells essential for protecting the barrier from intestinal microorganisms, goblet cell-specific Expression levels of genes ( Muc2, Itln1, Ang4, Reg3g ) were confirmed. The results are shown in Figure 1.
각 유전자의 발현을 확인한 결과, ADLPAPT 마우스와 ADLPWT 마우스 유래 장 오가노이드의 줄기세포의 수에는 큰 차이가 없었지만, 술잔 세포의 수와 술잔 세포가 분비하는 항균 펩타이드 (Antimicrobial peptide. AMP) (i.e. Muc2, Itln1의 발현이 ADLPWT 마우스 유래 장 오가노이드보다 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드에서 유의하게 감소하였다. As a result of checking the expression of each gene, there was no significant difference in the number of stem cells in the intestinal organoids derived from ADLP APT mice and ADLP WT mice, but the number of goblet cells and antimicrobial peptide (AMP) secreted by goblet cells (ie Expressions of Muc2 and Itln1 were significantly decreased in intestinal organoids derived from ADLP APT mice than those derived from ADLP WT mice.
실시예 4. 오가노이드 극성 전환법 (Organoid polarity switching)Example 4. Organoid polarity switching
장 상피 세포는 극성이 있어 그를 구성하는 단백질들에 의해 선택적 투과성을 나타내고, 세포의 극성은 세포의 형태를 유지하거나, 외부 유해균의 침임을 막아 세포를 보호하는 등의 중요한 역할을 한다. 이러한 특징을 고려했을 때, ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드 내강 쪽에 균주가 처리되어야 균주 스크리닝이 가능하다. 따라서, 3차원 구조를 유지한 상태에서 장 오가노이드의 내강 쪽에 균주를 처리하기 위해서는 극성을 인위적으로 전환시켜 내강 쪽의 apical-surface가 밖을 향하도록 하는 배양이 필요하였다. 이에 3차원 형태로 배양 중인 ADLPWT 마우스와 ADLPAPT 마우스의 유래 장 오가노이드를 Cell recovery solution (Corning)을 이용하여 메트리젤로부터 제거한 다음, 상기 실시예 2에 사용된, 보충물 및 성장인자를 포함시킨 기본 배지를 이용하여 3일 동안 현탁 배양(suspension culture)하여 장 오가노이드의 극성을 apical-out 형태로 전환시켰다.Intestinal epithelial cells have polarity, so they show selective permeability by their constituent proteins, and cell polarity plays an important role, such as maintaining cell shape or protecting cells from invasion by external harmful bacteria. Considering these characteristics, strain screening is possible only when the strain is treated in the lumen of the intestinal organoid derived from ADLP APT mice. Therefore, in order to treat the strain on the luminal side of the intestinal organoid while maintaining the three-dimensional structure, it was necessary to artificially switch the polarity so that the apical-surface of the luminal side faces outward. Therefore, the intestinal organoids derived from ADLP WT mice and ADLP APT mice, which are being cultured in three-dimensional form, are removed from Matrigel using Cell recovery solution (Corning), and then supplements and growth factors used in Example 2 are included. The polarity of the intestinal organoids was converted to an apical-out form by suspension culture for 3 days using the basal medium prepared in the previous study.
다음으로 상기 실시예 3에서 확인한 술잔세포의 기능성과 관련된 유전자의 발현양을 측정하였다. 결과는 도 2에 나타내었다. 상기 실시예 3에서 확인하였던 술잔 세포의 수와 술잔 세포가 분비하는 항균 펩타이드 관련 유전자 발현의 변화가, 극성이 basal-out 오가노이드에서 apical-out 오가노이드로 전환된 ADLPWT 마우스와 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드에서도 유사하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 극성이 전환된 오가노이드는 균주 처리를 위한 장 오가노이드로 사용될 수 있음을 확인하였다. Next, the expression levels of genes related to the functionality of goblet cells identified in Example 3 were measured. The results are shown in Figure 2. The change in the number of goblet cells and the expression of antibacterial peptide-related genes secreted by goblet cells confirmed in Example 3 was derived from ADLP WT mice and ADLP APT mice whose polarity was switched from basal-out organoids to apical-out organoids. It was confirmed that the intestinal organoids also appeared similarly. Therefore, it was confirmed that the polarity-switched organoid of the present invention can be used as an intestinal organoid for treating strains.
실시예 5. 면역 형광 염색법 (Immunofluorescence staining)을 통한 장 상피세포의 구조 및 장벽 기능 단백질 발현 확인Example 5. Confirmation of intestinal epithelial cell structure and barrier functional protein expression through immunofluorescence staining
3차원 형태의 장 오가노이드는 장 상피세포의 구조와 장벽 기능 면에서도 체내 장과 근접한 생리 활성을 나타낼 수 있는 장점이 있다. 본 발명자들은 ADLPWT 마우스와 ADLPAPT 마우스로부터 배양한 장 오가노이드의 장벽을 이루고 있는 세포의 구조를 확인하기 위해 관련 단백질 발현을 면역 형광 염색을 통해 직접 관찰하였다. Intestinal organoids in three-dimensional form have the advantage of being able to exhibit physiological activity close to the intestine in the body in terms of the structure and barrier function of intestinal epithelial cells. The present inventors directly observed the expression of related proteins through immunofluorescence staining to confirm the structure of the cells forming the barrier of intestinal organoids cultured from ADLP WT mice and ADLP APT mice.
구체적으로 3차원으로 배양한 장 오가노이드를 Cell recovery solution (Corning)을 이용하여 ECM으로부터 제거한 다음, 4% 파라포름알데히드 용액에서 20분 동안 상온에서 고정하였다. Phosphate buffered saline (PBS)로 4차례 세척한 후, Bovine serum albumin (BSA), 0.3% TritonX100, 5% Horse serum이 함유된 용액에 1시간 동안 넣어 항체의 투과성을 높이고 블로킹 과정을 거쳤다. 전처리된 장 오가노이드는 4℃에서 16시간 이상 1차 항체와 반응시켰다. 사용한 1차 항체는 anti-Ki67 antibody (abcam), anti-Mucin5B antibody (santa-cruz), anti-E-cadherin antibody (BD Transduction Lab.), anti-Zo-1 antibody (Invitrogen)였다. 1차 항체와의 반응 후, 장 오가노이드는 PBS로 몇 차례 세척하고 Alexa flurophore로 표지된 2차 항체 (Life Technologies)와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로, 핵을 염색하기 위한 DAPI(4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)를 이용하여 염색하였다. 염색 과정을 마친 장 오가노이드는 슬라이드 글라스(slide glass) 위에 올려진 후, 공초점 레이저 현미경 (LSM700, Zeiss Intermational)을 통해 관찰함으로써 각 단백질의 발현을 확인하였다. Specifically, three-dimensionally cultured intestinal organoids were removed from the ECM using a cell recovery solution (Corning), and then fixed in a 4% paraformaldehyde solution for 20 minutes at room temperature. After washing four times with Phosphate buffered saline (PBS), the cells were placed in a solution containing Bovine serum albumin (BSA), 0.3% TritonX100, and 5% Horse serum for 1 hour to increase antibody permeability and undergo a blocking process. The pretreated intestinal organoids were reacted with the primary antibody for 16 hours or longer at 4°C. The primary antibodies used were anti-Ki67 antibody (abcam), anti-Mucin5B antibody (santa-cruz), anti-E-cadherin antibody (BD Transduction Lab.), and anti-Zo-1 antibody (Invitrogen). After reaction with the primary antibody, the intestinal organoids were washed several times with PBS and reacted with an Alexa flurophore-labeled secondary antibody (Life Technologies) for 1 hour at room temperature. Finally, DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) was used to stain the nuclei. After the staining process was completed, the intestinal organoids were placed on a slide glass, and then the expression of each protein was confirmed by observing them through a confocal laser microscope (LSM700, Zeiss Intermational).
결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 장 상피세포에서 장벽을 구성하는 adherent junctions, tight junctions의 대표적인 단백질인 E-cadherin과 Zo-1은 ADLPWT 마우스 유래 장 오가노이드와 비교하여 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드에서 불규칙한 배열로 발현이 되는 것을 확인하였다. The results are shown in Figure 3. As shown in Figure 3, E-cadherin and Zo-1, which are representative proteins of adherent junctions and tight junctions constituting the barrier in intestinal epithelial cells, were found in intestinal organoids derived from ADLP APT mice compared to intestinal organoids derived from ADLP WT mice. It was confirmed that the expression was in an irregular arrangement.
실시예 6. 형광물질의 미세 주입(Microinjection)을 통한 장 투과도 측정Example 6. Measurement of intestinal permeability through microinjection of fluorescent material
장 오가노이드의 구조뿐만 아니라 장벽 기능을 확인하기 위해 ADLPWT 마우스와 ADLPAPT 마우스 유래 3차원 구조의 장 오가노이드 내강 쪽에 형광 물질을 주입하고 새어나가는 정도를 측정하는 방법으로 장 투과도를 평가하였다. In order to confirm the barrier function as well as the structure of the intestinal organoids, the intestinal permeability was evaluated by injecting a fluorescent material into the lumen of the 3-dimensional intestinal organoids derived from ADLP WT mice and ADLP APT mice and measuring the degree of leakage.
먼저 실시예 4에 나타낸 것과 동일한 방법으로 장 오가노이드의 극성을 basal-out 형태에서 apical-out 형태로 전환시켰다. 나노인젝터 (Nanoinjector, Micro2T, WPI)를 이용하여 3 차원 형태의 장 오가노이드의 내강에 4 kDa의 형광 물질 (FITC-dextran, 1 mg/ml) 40 nl를 주입하였다. 형광 물질이 주입된 장 오가노이드를 24시간 배양한 후, 형광이 새어나간 정도를 형광 현미경으로 관찰하고 남아있는 형광의 세기를 Image J 소프트웨어 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 측정함으로써 투과도 정도를 확인하였다.First, the polarity of intestinal organoids was converted from the basal-out form to the apical-out form in the same manner as in Example 4. 40 nl of a 4 kDa fluorescent substance (FITC-dextran, 1 mg/ml) was injected into the lumen of the 3-dimensional intestinal organoid using a nanoinjector (Micro2T, WPI). After culturing the intestinal organoids injected with fluorescent materials for 24 hours, the degree of leakage of fluorescence was observed under a fluorescence microscope and the intensity of the remaining fluorescence was measured using Image J software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). The degree of transmittance was confirmed by measuring.
결과는 도 4에 나타내었다. The results are shown in Figure 4.
도 4에 나타낸 바와 같이, ADLPWT 마우스 유래 장 오가노이드 보다 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드의 내강에 남아있는 형광의 세기가 유의하게 감소되었다. 따라서, ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드의 장 투과도가 더 증가되어 있음을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 4 , the intensity of fluorescence remaining in the lumen of the intestinal organoids derived from ADLP APT mice was significantly reduced compared to the intestinal organoids derived from ADLP WT mice. Therefore, it was confirmed that the intestinal permeability of the intestinal organoids derived from ADLP APT mice was further increased.
실시예 7. 알츠하이머 병리 완화를 위한 후보 균주의 스크리닝Example 7. Screening of Candidate Strains for Alleviation of Alzheimer's Pathology
상술한 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드 모델을 이용하여 장벽 강화능을 나타내는 후보 균주의 효능을 유전자 발현 분석을 통해 평가하였다. Using the above-described ADLP APT mouse-derived intestinal organoid model, the efficacy of candidate strains exhibiting barrier enhancing ability was evaluated through gene expression analysis.
ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드의 극성을 전환시킨 후 배지에 균주를 처리하여 술잔 세포 특이적 유전자 (Muc2)와 장벽 기능과 관련된 유전자 (Zo1)의 발현 양을 실시간 RT-PCR을 통하여 확인하였다. After converting the polarity of the intestinal organoids derived from ADLP APT mice, the culture medium was treated with the strain, and the expression levels of the goblet cell-specific gene (Muc2) and the gene related to the barrier function (Zo1) were confirmed by real-time RT-PCR.
상기 RT-PCR 실험에 이용한 primer는 다음과 같았다:The primers used in the RT-PCR experiment were as follows:
- mouse Muc2 (Forward): GGTGACTGTGACTGTTTCTGC (SEQ ID NO: 1), mouse Muc2 (Reverse): CTTCAGGTCCTCATCATAGATG (SEQ ID NO: 2),- mouse Muc2 (Forward): GGTGACTGTGACTGTTTCTGC (SEQ ID NO: 1), mouse Muc2 (Reverse): CTTCAGGTCCTCATCATAGATG (SEQ ID NO: 2),
- mouse Zo1 (Forward): GACTCCAGACAACATCCCGAA (SEQ ID NO: 3), mouse Zo1 (Reverse): AACGCTGGAAATAACCTCGTTC (SEQ ID NO: 4)- mouse Zo1 (Forward): GACTCCAGACAACATCCCGAA (SEQ ID NO: 3), mouse Zo1 (Reverse): AACGCTGGAAATAACCTCGTTC (SEQ ID NO: 4)
이중 유전자 발현이 증가되어 술잔 세포 특이적 유전자 및 장벽 기능과 관련된 유전자의 발현이 증가된 균주를 선발하였다. 결과는 도 5a 및 도 5b에 나타내었다. A strain with increased expression of a goblet cell-specific gene and a gene related to barrier function was selected due to increased double gene expression. The results are shown in Figures 5a and 5b.
도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 균주 L1 은 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드의 Muc2의 유전자 발현을 회복시키는 경향을 나타내었고, 균주 L2 는 유의하게 회복시켰으며 두 균주 모두 Zo1의 유전자 발현의 감소에 영향을 미치지 않았다. 한편, 균주 L3 내지 L5 의 경우는 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드의 Muc2의 유전자 발현을 회복시키지 못하였고 균주 L3 및 L4 는 Zo1의 유전자 발현을 오히려 감소시켰다. 예비 실험 결과 균주 L3 및 L4 보다는 균주 L1, L2 가 AD 개선 효능이 있는 균주로 예상되었다.As shown in Fig. 5a and Fig. 5b, strain L1 showed a tendency to restore the gene expression of Muc2 in intestinal organoids derived from ADLP APT mice, and strain L2 recovered significantly, and both strains showed a decrease in the gene expression of Zo1. did not affect On the other hand, strains L3 to L5 did not restore Muc2 gene expression in intestinal organoids derived from ADLP APT mice, whereas strains L3 and L4 rather reduced Zo1 gene expression. As a result of the preliminary experiment, strains L1 and L2 were expected to have AD improving efficacy rather than strains L3 and L4.
또한, 상술한 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드 모델을 이용하여 장벽 강화능을 나타내는 후보 균주의 효능을 장 투과도 분석을 통해 평가하였다. In addition, the efficacy of candidate strains exhibiting barrier enhancing ability was evaluated through intestinal permeability analysis using the above-described ADLP APT mouse-derived intestinal organoid model.
상시 실시예 6에 나타낸 것과 동일하게, ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드의 내강에 후보 균주와 형광 물질을 함께 미세 주입한 후 새어나가는 정도를 확인하였다. 이중 장 투과도 평가에서 질환 모델 유래 장 오가노이드에서 증가한 장 투과도를 회복시키는 균주를 선발하였다. 결과는 도 6a 내지 도 6c에 나타내었다.As shown in Example 6, the candidate strain and the fluorescent material were microinjected into the lumen of the ADLP APT mouse-derived intestinal organoid, and the degree of leakage was confirmed. In the double intestinal permeability evaluation, strains that restore the increased intestinal permeability in disease model-derived intestinal organoids were selected. The results are shown in Figures 6a to 6c.
도 6a 및 6c에 나타낸 바와 같이, 균주 L6 및 L8 은 ADLPWT 마우스 유래 장 오가노이드보다 ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드에서 증가한 투과도를 유의하게 회복시키지 않았지만, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 균주 L7 은 장 투과도를 유의하게 회복시키는 결과를 확인하였다. As shown in Figures 6a and 6c, strains L6 and L8 did not significantly restore the increased permeability in intestinal organoids derived from ADLP APT mice than in intestinal organoids derived from ADLP WT mice, but as shown in Figure 6b, strain L7 The result of significantly recovering permeability was confirmed.
실시예 8. 동물 실험을 통한 장 오가노이드를 이용한 알츠하이머 병리 완화용 균주 스크리닝 방법의 효율성 검증Example 8. Efficiency verification of strain screening method for alleviating Alzheimer's pathology using intestinal organoids through animal experiments
ADLPAPT 마우스 유래 장 오가노이드에서 장 상피세포의 성장 및 장벽 유지 효능을 보인 균주(L7)을 알츠하이머병 모델 동물에 투여한 후 알츠하이머병의 치료 효능을 평가하였다. L7 균주를 5개월 동안 주 5회씩 실험 동물에 경구 투여한 후, 장벽 투과도 감소 여부를 기초로 장내 환경 개선 여부를 판단하고, 아밀로이드베타(amyloid beta, Aβ) 플라크 형성 정도를 측정해 알츠하이머병의 뇌 병변이 완화되었는지 평가하였다. After administering a strain (L7) showing intestinal epithelial cell growth and barrier maintenance effects in ADLP APT mouse-derived intestinal organoids to Alzheimer's disease model animals, the treatment efficacy of Alzheimer's disease was evaluated. After orally administering L7 strain to
8-1. 실험 동물에 대한 균주의 투여8-1. Administration of strains to laboratory animals
2개월 령의 알츠하이머병 모델 동물(ADLPAPT 마우스) 및 정상 모델 동물 (ADLPWT 마우스) 각각에 5개월 동안 주 5회씩 경구로 200μl의 L7 균주(1x105 CFU/ml) 또는 200μl의 PBS를 투여하였다 (도 7).2 month old Alzheimer's disease model animals (ADLP APT mice) and normal model animals (ADLP WT mice) were administered orally 5 times a week for 5 months with 200 μl of L7 strain (1× 10 5 CFU/ml) or 200 μl of PBS. (FIG. 7).
8-2. 실험 동물의 장벽 투과도 평가8-2. Assessment of barrier permeability in laboratory animals
4kDa의 발광 또는 형광 물질을 이용해 균주 투여 후 실험 동물의 장벽 투과도를 평가하였다. 실험 동물은 장벽 투과도 평가 전 4시간 동안 금식 시킨 후, 실험동물의 체중 1g당 0.6mg의 4kDa의 발광 또는 형광 물질 (0.6mg/g)을 경구로 투여하였다. 발광 물질을 투여하고 60분 또는 120분 후, 실험 동물의 장관 내에 존재하는 발광 물질의 양을 측정함으로써 장벽 투과도를 평가하였다. 장 내 잔류하는 발광 물질의 양이 낮을수록 장벽 투과도가 높다고 평가된다. Barrier permeability of experimental animals was evaluated after administration of the strain using a 4 kDa luminescent or fluorescent material. The experimental animals were fasted for 4 hours before the barrier permeability was evaluated, and then 0.6 mg of a 4 kDa luminescent or fluorescent substance (0.6 mg/g) per 1 g of the animal's body weight was orally administered. Barrier permeability was evaluated by measuring the amount of the luminescent material present in the test animal's
결과는 도 8a 및 도 8b에 나타내었다. The results are shown in Figures 8a and 8b.
도 8a의 영상을 분석한 결과, 장관 내 물질의 양을 정량 하였을 때, PBS를 투여한 ADLPWT 마우스에 비해 PBS 투여한 ADLPAPT 마우스는 장관 내 남아있는 물질의 양이 줄어들지만, L7 균주를 투여한 ADLPAPT 마우스는 장관 내 물질의 양이 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 발광 물질 투여 후 60분, 120분이 경과하였을 때, 장관 내 물질의 잔류량은 ADLPWT 마우스에 비해 ADLPAPT 마우스에서 각각 31.8%, 34.9% 높았다. 상기 결과로부터 L7 균주를 투여한 군에서는 장벽 투과도가 완화되었음을 확인하였다.As a result of analyzing the image of FIG. 8a, when the amount of material in the intestinal tract was quantified, compared to ADLP WT mice administered with PBS, ADLP APT mice administered with PBS reduced the amount of material remaining in the intestinal tract , but L7 strain was administered In one ADLP APT mouse, the amount of material in the intestinal tract was maintained. At 60 and 120 minutes after administration of the luminescent material, the residual amount of the substance in the intestinal tract was 31.8% and 34.9% higher in ADLP APT mice than in ADLP WT mice, respectively. From the above results, it was confirmed that the barrier permeability was alleviated in the group administered with the L7 strain.
또한, L7 균주 투여 후 4kDa의 형광 물질을 경구 투여하고 120분 후, 장관에서 혈액으로 새어 나온 형광 물질의 세기를 측정해 장벽 투과도를 평가하였다. 형광 물질이 장에서 새어 나와 혈청 내 많이 존재할 수록 장벽 투과도가 높다고 평가된다. In addition, after administration of the L7 strain, a 4 kDa fluorescent substance was orally administered, and 120 minutes later, the intensity of the fluorescent substance leaked from the intestinal tract into the blood was measured to evaluate the barrier permeability. The more the fluorescent substance leaks out from the intestine and exists in serum, the higher the barrier permeability is evaluated.
결과는 도 8c에 나타내었다. The results are shown in Figure 8c.
도 8c에 나타낸 바와 같이, PBS 투여한 ADLPAPT 마우스에 비해 L7 균주를 투여한 ADLPAPT 마우스의 혈청 내 형광물질의 세기가 감소하였음을 확인할 수 있었다. 이는 L7 균주의 투여로 장벽 투과도가 완화되었음을 보여준다.As shown in FIG. 8c , it was confirmed that the intensity of fluorescence in the serum of ADLP APT mice administered with L7 strain was decreased compared to ADLP APT mice administered with PBS. This shows that the barrier permeability was alleviated by administration of the L7 strain.
8-3. Y-미로 시험(Y-maze test)를 통한 인지적 행동 분석8-3. Cognitive behavioral analysis through the Y-maze test
실험 동물의 단기 기억 능력 및 공간 지각 능력을 평가하기 위해 Y-미로 시험을 수행하였다. Y-미로 시험을 수행하기 하루 전에 실험 동물을 시험실과 미로 장치에 적응하도록 하였다. 다음 날, 자발적 교대 행동을 평가하기 위해 실험 동물을 Y-미로의 중앙에 배치하고 8분 동안 미로 장치의 세 팔을 모두 탐색할 수 있도록 하였다. 총 진입 수는 실험 동물이 팔에 들어갔을 때 계산되고, 자발적 교대 수는 실험 동물이 연속적으로 세 개의 다른 팔에 들어갔을 때 계산되었다. 교대 비율은 교대 횟수/교대 가능 횟수(총 진입 횟수 -2) Х 100으로 계산하였다. A Y-maze test was performed to evaluate the short-term memory ability and spatial perception ability of the experimental animals. One day prior to performing the Y-maze test, the experimental animals were acclimated to the testing room and maze apparatus. The next day, the animals were placed in the center of the Y-maze and allowed to explore all three arms of the maze apparatus for 8 minutes to evaluate voluntary alternation behavior. The total number of entries was counted when the test animal entered the arm, and the number of spontaneous alternations was counted when the test animal entered three different arms in succession. The shift ratio was calculated as the number of shifts/number of possible shifts (total number of entries -2)
결과는 도 8d 및 도 8e에 나타내었다. The results are shown in Figures 8d and 8e.
도 8d 및 도 8e에 나타낸 바와 같이, L7 균주 투여 후 인지적 행동 기능을 평가하기 위해 Y 미로를 이용하여 ADLP mice의 자발적 교대 행동을 측정하였을 때, 그룹 간 개방된 팔에 출입하는 총 횟수에는 큰 차이가 없었으나(도 8d), PBS 투여한 ADLPWT 마우스에 비하여 PBS 투여한 ADLPAPT 마우스에서 낮았던 자발적 교대 비율이 L7 균주 투여에 의해 증가한 결과를 통해 L7 균주로 인한 인지 능력 장애 회복을 확인할 수 있었다(도 8e).As shown in FIGS. 8D and 8E, when the voluntary alternation behavior of ADLP mice was measured using the Y maze to evaluate the cognitive behavioral function after administration of the L7 strain, the total number of accesses to the open arm between groups was large. Although there was no difference (FIG. 8d), the low spontaneous alternation rate in PBS-administered ADLP APT mice compared to PBS-administered ADLP WT mice was increased by L7 strain administration, confirming the recovery of cognitive impairment due to L7 strain. (Fig. 8e).
8-4. 뇌 내 Aβ 플라크 (plaque) 면역 염색 (Immunohistochemistry, IHC)8-4. Aβ plaque immunostaining in the brain (Immunohistochemistry, IHC)
균주 투여를 마친 실험 동물을 틸레타민-졸라제팜(Tiletamine-Zolazepam)과 자일라진(Xylazine) (1.2mg/kg)의 혼합물로 마취시키고 PBS로 관류 (perfusion) 시켰다. 실험 동물의 뇌 조직은 면역 형광 염색을 위해 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, PFA)로 24시간 동안 고정한 후 30% 수크로오즈 용액에서 약 72시간 동안 탈수 시켰다. 전 처리된 뇌 조직은 -80℃에서 동결시킨 다음 -25℃저온 유지가 가능한 마이크로톰 (microtome)을 통해 관상 절편으로 절단하였다. 뇌 조직 절편은 PBS 세척 후 블로킹(blocking)과 투과화(permeabilization) 과정을 거친 후 1차 항체와 반응시켰다. 실험에 이용한 1차 항체는 Aβ plaque에 특이적으로 결합하는 Biotin-labeled 4G8 (1:700, Covance, SIG-39240)이다. 1차 항체와 반응시킨 뇌 조직 절편은 PBS 세척 후 형광 물질이 표지된 2차 항체와 추가적으로 반응시킨 후 공초점 현미경으로 관찰하였다. Experimental animals after strain administration were anesthetized with a mixture of Tiletamine-Zolazepam and Xylazine (1.2 mg/kg) and perfused with PBS. For immunofluorescence staining, the brain tissue of experimental animals was fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) for 24 hours and then dehydrated in 30% sucrose solution for about 72 hours. The pre-treated brain tissue was frozen at -80 °C and then cut into coronal sections using a microtome capable of maintaining a low temperature of -25 °C. Brain tissue sections were reacted with primary antibodies after washing with PBS, blocking and permeabilization. The primary antibody used in the experiment is Biotin-labeled 4G8 (1:700, Covance, SIG-39240) that binds specifically to Aβ plaques. The brain tissue sections reacted with the primary antibody were washed with PBS, further reacted with the secondary antibody labeled with a fluorescent material, and then observed under a confocal microscope.
결과는 도 8f 및 도 8g에 나타내었다. Results are shown in Figures 8f and 8g.
도8f 및 도 8g에 나타낸 바와 같이, PBS를 투여한 ADLPAPT 마우스에 비하여 L7 균주를 투여한 ADLPAPT 마우스의 뇌 내 Aβ plaque가 차지하는 영역이 감소하였음을 확인하였다.As shown in FIGS. 8f and 8g, it was confirmed that the area occupied by Aβ plaques in the brain of ADLP APT mice administered with L7 strain was reduced compared to ADLP APT mice administered with PBS.
8-5. 인간 Aβ 효소결합면역흡착검사(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)8-5. Human Aβ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
균주 투여후 실험 동물을 틸레타민-졸라제팜(Tiletamine-Zolazepam)과 자일라진(Xylazine) (1.2mg/kg)의 혼합물로 마취시키고 PBS로 관류 (perfusion) 시킨다. 실험 동물의 뇌 조직은 ELISA 실험을 위해 RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 1% Nonidet P-40; 0.1% SDS; 0.5% deoxycholic acid sodium salt)에서 균질화한 다음 조직 추출물의 상층액 내 단백질 농도를 정량하였다. 100μg의 단백질을 초원심분리하여 RIPA-soluble과 RIPA-insoluble로 분리하였다. RIPA-insoluble 부분은 70% 포름산(formic acid)에 재현탁하고 ELISA 실험 전에 1M Tris-base 용액으로 중화시켰다. RIPA-soluble Aβ40/Aβ42 과RIPA-insoluble Aβ40/Aβ42의 농도는 human Aβ 특이적 ELISA Kit의 프로토콜에 따라 측정하였다. After strain administration, experimental animals are anesthetized with a mixture of Tiletamine-Zolazepam and Xylazine (1.2 mg/kg) and perfused with PBS. Brain tissues of experimental animals were homogenized in RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 1% Nonidet P-40; 0.1% SDS; 0.5% deoxycholic acid sodium salt) for ELISA experiments, and tissue extracts The protein concentration in the supernatant was quantified. 100 μg of protein was separated into RIPA-soluble and RIPA-insoluble by ultracentrifugation. The RIPA-insoluble portion was resuspended in 70% formic acid and neutralized with 1M Tris-base solution before ELISA experiments. The concentrations of RIPA-soluble Aβ40/Aβ42 and RIPA-insoluble Aβ40/Aβ42 were measured according to the protocol of the human Aβ-specific ELISA Kit.
결과는 도 8h에 나타내었다. The results are shown in Figure 8h.
도 8h에 나타낸 바와 같이, ELISA로 뇌 내 soluble/insoluble Aβ40과 Aβ42 의 정량적 분석을 수행하였을 때, PBS를 투여한 ADLPAPT 마우스에 비하여 L7 균주를 투여한 ADLPAPT 마우스는 soluble Aβ40과 Aβ42가 유의하게 감소하였고 insoluble Aβ40 도 감소하는 경향을 보였다.As shown in FIG. 8h, when quantitative analysis of soluble/insoluble Aβ 40 and Aβ 42 in the brain was performed by ELISA, compared to ADLP APT mice administered with PBS, ADLP APT mice administered with the L7 strain showed higher levels of soluble Aβ 40 and Aβ in the brain. 42 was significantly decreased, and insoluble Aβ 40 also showed a tendency to decrease.
동물 실험 결과를 통해 본 발명의 장 오가노이드를 이용한 스크리닝 방법으로 찾은 균주가 알츠하이머병의 치료 및 완화에 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 이는 본 발명의 오가노이드 또는 이를 이용한 스크리닝 방법을 활용하면 알츠하이머병 치료 물질을 발굴할 수 있음을 나타낸다.Through animal experiment results, it was confirmed that the strain found by the screening method using the intestinal organoid of the present invention is effective in treating and alleviating Alzheimer's disease. Therefore, this indicates that a substance for treating Alzheimer's disease can be discovered by using the organoid of the present invention or a screening method using the organoid.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Platform for screening effective intestinal bacterial strains to alleviate Alzheimer's disease pathology <130> PN210229P <150> KR 10-2021-0083312 <151> 2021-06-25 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Muc2 (Forward) <400> 1 ggtgactgtg actgtttctg c 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Muc2 (Reverse) <400> 2 cttcaggtcc tcatcataga tg 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Zo1 (Forward) <400> 3 gactccagac aacatcccga a 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Zo1 (Reverse) <400> 4 aacgctggaa ataacctcgt tc 22 <110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Platform for screening effective intestinal bacterial strains to alleviate Alzheimer's disease pathology <130> PN210229P <150> KR 10-2021-0083312 <151> 2021-06-25 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> mouse Muc2 (Forward) <400> 1 ggtgactgtg actgtttctg c 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> mouse Muc2 (Reverse) <400> 2 cttcaggtcc tcatcataga tg 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> mouse Zo1 (Forward) <400> 3 gactccagac aacataccccga a 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> mouse Zo1 (Reverse) <400> 4 aacgctgggaa ataacctcgt tc 22
Claims (18)
An in vitro cell construct comprising living cells isolated from Alzheimer's model animals or intestinal crypt tissues of Alzheimer's patients.
The in vitro cell structure according to claim 1, wherein the in vitro cell structure has a sphere shape and has a lumen.
The in vitro cell construct according to claim 1, wherein the living cells isolated from the intestinal tissue are intestinal epithelial cells, intestinal epithelial stem cells, or a combination thereof.
The in vitro cellular construct according to claim 1, wherein the Alzheimer's model animal is an ALDP APT mouse.
The method of claim 1, wherein the cell has a polarity such that the apical surface with microvilli faces the lumen of the cell structure and the basal surface faces the outside of the cell structure. In vitro cellular constructs.
The method of claim 1, wherein the cell has a polarity such that an apical surface with microvilli faces the outside of the cell structure and a basal surface faces the lumen of the cell structure. In vitro cellular constructs.
According to claim 1, wherein the cell structure i) goblet cell specific antibacterial peptide selected from the group consisting of Muc2, Itln1, Ang4, and Reg3g; ii) a tight junction specific protein selected from the group consisting of Zo-1 and E-cadherin; or iii) an in vitro cellular construct in which the expression level of a combination thereof is lower than the expression level in an in vitro cellular construct comprising living cells isolated from intestinal tissue of a wild-type animal.
A method for producing an in vitro cell construct comprising the step of three-dimensionally culturing cells isolated from intestinal crypt tissues of Alzheimer's model animals or Alzheimer's patients.
The method of claim 8, wherein the cells isolated from the intestinal tissue include intestinal epithelial stem cells.
The method of claim 8, wherein the three-dimensional culture is cultured in a culture material containing an extracellular matrix.
11. The method of claim 10, wherein the culture comprises a supplement selected from the group consisting of B27, N2, N-Acetylcysteine; Wnt agonists; BMP inhibitors; epidermal growth factor (EGF); and Rho kinase inhibitors; Or a method for producing a cell structure, which is made in a medium containing a combination thereof.
The method of claim 11, wherein the Wnt agonist is selected from the group consisting of R-spondin1, Wnt3a and Wnt surrogate-Fc fusion protein.
The method of claim 11, wherein the BMP inhibitor is Noggin.
The method of claim 11, wherein the Rho kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632 and H-1152.
11. The method according to claim 10, further comprising the step of removing the culture material containing the extracellular matrix and culturing the suspension in vitro.
(a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 인 비트로 세포구조체에 시험 균주를 처리하는 단계; 및
(b) 상기 세포구조체의 Muc2, Itln1, Ang4, 및 Reg3g로 이루어진 군으로부터 선택되는 술잔세포 특이적 항균 펩타이드; ii) Zo-1 및 E-cadherin으로 이루어진 군으부터 선택되는 밀착연접(tight junction) 특이 단백질; 또는 iii) 이들의 조합의 발현양을 측정하는 단계:
상기 (b) 단계에서 측정한 i), ii), 또는 iii)의 발현양이 상기 시험 균주를 처리하기 전과 비교하여 증가된 경우 알츠하이머 병리 완화 효능이 있는 균주로 판정함.
A method for screening strains capable of alleviating Alzheimer's pathology comprising the following steps:
(a) processing the test strain to the in vitro cell construct of any one of claims 1 to 7; and
(b) a goblet cell-specific antimicrobial peptide selected from the group consisting of Muc2, Itln1, Ang4, and Reg3g of the cell structure; ii) a tight junction specific protein selected from the group consisting of Zo-1 and E-cadherin; or iii) measuring the expression level of a combination thereof:
If the expression level of i), ii), or iii) measured in step (b) is increased compared to before treatment with the test strain, it is determined as a strain having an effect of alleviating Alzheimer's pathology.
(a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 인 비트로 세포구조체의 내강에 시험 균주 및 형광물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 형광물질이 세포구조체의 내강으로부터 새어나오는 양을 측정하는 단계:
상기 (b) 단계에서 측정한 형광물질이 내강으로부터 새어나오는 양이 상기 시험 균주를 처리하기 전과 비교하여 감소된 경우 알츠하이머 병리 완화 효능이 있는 균주로 판정함.
A method for screening strains capable of alleviating Alzheimer's pathology comprising the following steps:
(a) treating the test strain and a fluorescent material in the lumen of the in vitro cell structure of any one of claims 1 to 7; and
(b) measuring the amount of the fluorescent substance leaking from the lumen of the cell structure:
If the amount of the fluorescent substance leaked from the lumen measured in step (b) is reduced compared to before treatment with the test strain, it is determined that the strain has an effect of alleviating Alzheimer's pathology.
The screening method according to claim 17, wherein the fluorescent material includes Fluorescein isothiocyanate (FITC).
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