KR20230001984A - 토복령 추출물 유래 성분을 포함하는 전립선암 전이 억제용 조성물 내지 이의 용도 - Google Patents

토복령 추출물 유래 성분을 포함하는 전립선암 전이 억제용 조성물 내지 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토복령 추출물 유래 성분을 포함함으로써 콜라겐 매개의 전립선암 전이 내지 이주를 억제할 수 있는 조성물 내지 이의 용도에 대한 것이다.
본 발명은 토복령 추출물, 특히 토복령 추출물 유래 5-O-카페오일퀴닉산(5-O-caffeoylquinic acid)이 콜라겐에 대한 수용체 분자인 α2β1 인테그린(α2β1 integrin)의 발현을 선택적으로 저해하여, 전이 대상세포의 세포외 기질(Extracellular matrix; ECM)인 콜라겐(Collagen)에 의해 매개되는 전립선 암세포의 부착(Adhesion) 및 이주(Migration)을 특이적으로 약화시킴으로써 전립선 암세포의 전이(Metastasis)를 억제할 수 있으므로, 전립선암 전이 억제용 조성물, 전립선암 예방, 치료 또는 개선을 위한 조성물 내지 항암보조제로서 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

토복령 추출물 유래 성분을 포함하는 전립선암 전이 억제용 조성물 내지 이의 용도 {Composition for prostate cancer metastasis comprising extract of Smilax glabra Roxb derived component and uses thereof}
본 발명은 토복령 추출물 유래 성분을 포함함으로써 콜라겐 매개의 전립선암 전이 내지 이주를 억제할 수 있는 조성물 내지 이의 용도에 대한 것이다.
전립선 암은 남성에게 두 번째로 흔한 암으로 65 세 이후에 80 % 이상의 사례가 발견된다. 전립선 암이 초기에 발견되면 전립선 절제술과 안드로겐 박탈 요법 (ADT)을 포함한 여러 치료법 중 하나로 치료할 수 있는 것으로 간주된다. 그러나 반복적으로 ADT로 치료를 받는 전립선 암 환자는 거세 저항성 전립선 암 (CRPC, castration-resistant prostate cancer)이라고 하는 불치병 상태로 발전할 수 있다. 대부분의 전이성 질환 환자는 호르몬 박탈 요법에 반응하지만 CRPC는 테스토스테론없이 성장할 수 있으며 대부분의 CRPC 사례는 전립선 암 환자의 높은 사망률을 일으키는 전이성 전립선 암으로 발전한다. 전이성 전립선 암은 주로 림프절과 골격으로 이동한다. 암세포가 전이를 시작하면, 원발성 종양의 작은 집단이 주변 조직을 침범한 다음 순환계를 혈관 내로 침투한다. 이동하는 암 세포는 결국 세포 외 기질 (ECM)과 상호 작용하여 먼 장기에 대량으로 증식한다. 암 환자를 위한 대부분의 화학 요법제는 암세포 증식을 약화시키고/거나 아폽토시스를 유도하기 위해 개발되었기 때문에 상대적으로 많은 양의 약제가 암 치료에 자주 사용되는데, 이는 정상 세포에서 세포 독성을 유발하여 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 따라서 세포 독성이 낮고 세포 이동 및 침습과 같은 전이성 사건의 억제를 표적으로 하는 항암 치료제의 개발은 전립선 암, 특히 전이성 CRPC (mCRPC)에 대한 효과적인 치료로 이어질 수 있다.
인테그린(Integrin)은 잘 알려진 이량체 막관통 수용체(heterodimeric transmembrane receptor)로 cell-to-ECM 상호 작용을 담당한다. 이들은 독특한 리간드 결합 특성을 가진 24 개의 고유한 αβ복합체를 구성하는 α 및 β 서브 유닛으로 구성된다. 인테그린이 콜라겐이나 피브로넥틴과 같은 리간드와 상호 작용할 때, 리간드 결합 특이성을 생성하기 위해 구조적 변화를 겪고 FAK(focal adhesion kinase) 분자와 같은 다양한 세포 내 신호 전달을 활성화한다. 이러한 신호 전달은 라 멜리 포듐 형성, 세포 부착 및 ECM의 세포 이동에 기여하는 것으로 알려져 있다. 인테그린의 발현이 인간 암의 단계와 관련이 있다고 보고되었기 때문에 인테그린은 항암 치료제 개발의 잠재적인 표적으로서 연구의 초점이 되어왔다.
기존의 항암제는 주로 세포의 사멸을 유도하는 목적으로 개발되며 세포의 사멸을 유도할 수 있는 고농도의 약재를 사용하기때문에 정상세포에게도 영향을 주는 부작용을 야기한다. 따라서 일반세포에게는 영향을 주지 않는 저농도의 효과적인 암억제 조성물 개발이 시급한 실정이다.
대한민국 특허출원 제10-2017-0162407호 대한민국 특허출원 제10-2016-0075792호
본 발명은 전립선암세포에 독성을 보이지 않는 농도의 토복령 추출물, 특히 토복령 추출물 유래 5-O-카페오일퀴닉산(5-O-caffeoylquinic acid)이 전립선 암세포의 발달과정에 중요한 과정인 콜라겐 특이 부착을 억제할 수 있으며, 이는 전립선암세포의 베타-1-인테그린(beta-1 integrin)의 발현을 특이적으로 억제하여 세포내 FAK 인산화를 억제하는 작용기작에 의한 것임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명의 목적은, 본 발명은 토복령 추출물 유래 성분을 포함함으로써 콜라겐 매개의 전립선암 전이 내지 이주를 억제할 수 있는 조성물 내지 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 토복령(Smilax glabra Roxb, SGR) 추출물을 포함하는 전립선암 전이 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물 을 용매로 하여 추출된 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 추출물은 감압고온추출, 열탕추출, 환류추출, 열수추출, 상온추출, 초음파 추출 및 증기추출 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 추출된 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 토복령 추출물은 토복령 추출물 유래 5-O-카페오일퀴닉산(5-O-caffeoylquinic acid), 4-O-카페오일퀴닉산(4-O-caffeoylquinic acid) 및 3-O-카페오일퀴닉산(3-O-caffeoylquinic acid) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 콜라겐에 대한 수용체 분자인 α2β1 인테그린(α2β1 integrin)의 발현을 선택적으로 저해하여, 전이 대상세포의 세포외 기질(Extracellular matrix; ECM)인 콜라겐(Collagen)에 의해 매개되는 전립선 암세포의 부착(Adhesion) 및 이주(Migration)을 특이적으로 약화시킴에 따라, 전립선 암세포의 전이(Metastasis)를 억제하는 것이다.
또한, 본 발명은 토복령(Smilax glabra Roxb, SGR) 추출물을 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 토복령(Smilax glabra Roxb, SGR) 추출물을 포함하는 전립선암 전이 억제용 항암보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 토복령(Smilax glabra Roxb, SGR) 추출물을 포함하는 전립선암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 토복령 추출물, 특히 토복령 추출물 유래 5-O-카페오일퀴닉산(5-O-caffeoylquinic acid)이 콜라겐에 대한 수용체 분자인 α2β1 인테그린(α2β1 integrin)의 발현을 선택적으로 저해하여, 전이 대상세포의 세포외 기질(Extracellular matrix; ECM)인 콜라겐(Collagen)에 의해 매개되는 전립선 암세포의 부착(Adhesion) 및 이주(Migration)을 특이적으로 약화시킴으로써 전립선 암세포의 전이(Metastasis)를 억제할 수 있으므로, 전립선암 전이 억제용 조성물, 전립선암 예방, 치료 또는 개선을 위한 조성물 내지 항암보조제로서 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1a 는 토복령 물 추출물(WESGR) 의 PC3 (A) 및 LNCaP (B) 전립선 암 세포에 대한 농도별 세포독성을 나타낸다. 모든 값은 3 개 웰의 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표현된다. * 및 **는 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다. * = p <0.050 및 ** = p <0.001.
도 1b 는 토복령 물 추출물(WESGR) 의 PC3 (A) 및 LNCaP (B) 전립선 암 세포에 대한 배양시간별 세포독성을 나타낸다. 모든 값은 3 개 웰의 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표현된다. * 및 **는 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다. * = p <0.050 및 ** = p <0.001.
도 2는 토복령 물 추출물(WESGR) 에 의해 억제된 PC3 (A) 및 LNCaP (B) 세포에서 콜라겐 매개 부착(adhesion)을 나타낸다. 표시된 데이터는 최소 세 번의 독립적 인 실험을 나타낸다. 오차 막대는 평균의 SD를 나타낸다. 막대 = 200 μm. * 및 **는 대조군(무처리)과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다. * = p <0.050 및 ** = p <0.001.
도 3a 는 토복령 물 추출물(WESGR) 에 의해 억제된 PC3 (A) 및 LNCaP (B) 세포의 콜라겐 의존적 이주(migration)를 나타낸다. 막대 = 200 μm. * 및 **는 대조군(무처리)과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다. * = p <0.050 및 ** = p <0.001.
도 3b 는 혈청 (A) 또는 콜라겐 (B) 코팅된 플레이트에 시드된 PC3 세포에 토복령 물 추출물(WESGR) 을 처리 또는 처리하지 않은 경우 상처 치유(scratch wound) 분석 결과를 나타낸다. 표시된 데이터는 최소 세 번의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 4는 PC3 (A 및 B) 및 LNCaP (C 및 D)의 α2 및 β1 인테그린의 발현을 나타낸다. 표시된 데이터는 최소 세 번의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 5는 토복령 물 추출물(WESGR) 에 의해 억제된 FAK의 콜라겐 의존적 활성화/인산화 를 나타낸다. * 대조군과 비교할 때 p <0.05.
도 6a 및 도 6b 는 토복령 물 추출물(WESGR) 을 HPLC-MS/MS로 분석한 결과를 나타낸다. 세 개의 주요 피크 (tR 2.1, 14.1 및 17.3 분)의 분자량은 각각 191.3 (A), 363.5 (B) 및 707.3 (C) Da로 추정되었다.
도 7은 PC3 전립선 암 세포에서 5-O-카페오일퀴닉산(5-O-caffeoylquinic acid)의 세포 독성을 나타낸다. 모든 값은 3 개 웰의 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표현되었다. * 은 대조군(무처리)과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다; * = p <0.05.
도 8은 5-O-카페오일퀴닉산(5-O-caffeoylquinic acid) 에 의해 억제된 PC3 세포에서 콜라겐 매개 부착을 나타낸다. 오차 막대는 평균의 표준 편차 (SD)를 나타낸다. 막대 = 200 μm. * 대조군과 비교할 때 p <0.05.
도 9 는 토복령 물 추출물(WESGR) 에 의해 약화된 PC3 및 LNCaP 세포에서의 콜라겐 유도 액틴 형성을 나타낸다. PC3 및 LNCaP 세포를 6 시간 동안 WESGR을 사용하거나 사용하지 않고 전처리 한 다음 혈청 또는 콜라겐 코팅된 커버 유리에 시드했다. CO2 인큐베이터에서 37 ℃ 에서 30 분 (PC3) 또는 3 시간 (LNCaP) 동안 추가 인큐베이션 한 후, 세포를 4 % 파라포름알데히드로 고정한 다음 Hoechst 33342 (파란색) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), TRITC(Tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate)-conjugated phalloidin(적색) (Merck Millipore, Middlesex County, MA, USA) 로 실온에서 2 시간 동안 염색하였다. 세포를 PBS로 2 회 세척하고, 공 초점 레이저 스캐닝 현미경 (Nikon, Tokyo, Japan)으로 형광 이미지를 촬영하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
토복령(Smilax glabra Roxb, SGR)은 브루셀라증과 매독에 대한 전통 의학으로 사용되었다. 본 발명에서는 WESGR의 무독성 수준이 혈청에 대한 PC3 및 LNCaP 세포 부착을 약화시키지 않았지만 콜라겐에서는 유의하게 약화시킨다는 것을 확인하였다. 또한, Boyden 챔버 분석을 사용하여 WESGR의 무독성 수준이 PC3 및 LNCaP 세포의 혈청 코팅 영역으로의 이동을 억제하지 않았지만 콜라겐 코팅 영역으로의 이동을 현저하게 약화시켰음을 확인하였다. 흥미롭게도 콜라겐의 알려진 수용체인 α2β1 인테그린의 발현은 WESGR의 이소성 투여에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나 WESGR은 β1 인테그린의 발현을 유의하게 약화시켰지만 PC3 및 LNCaP 세포를 콜라겐 코팅된 플레이트에 놓았을 때 α2 인테그린은 약화시키지 못했으며, FAK 인산화를 약화시켰다. 마지막으로 5-O-caffeoylquinic acid는 WESGR의 항 전립선 암 효과를 담당하는 기능성 단일 성분으로 결정되었다. 종합하면, 본 발명은 콜라겐에 대한 이동 및 부착과 같은 특정 단계에서 WESGR 매개 전립선 항암 효과에 대한 새로운 분자 메커니즘을 제안하며, 전립선 암 진행에 대한 WESGR의 치료적 사용 가능성을 제공할 수 있다.
전립선 암은 남성의 암으로 인한 두 번째로 높은 사망률을 유발하며 전립선 암으로 인한 전이는 전립선 암으로 사망하는 남성에게서 쉽게 발견될 수 있는 뼈 병변으로 이어진다고 보고되었다. 유사 분열 방추 형성을 약화시켜 세포 증식을 억제하는 파클리탁셀(paclitaxel), 빈블라스틴(vinblastine), 도세탁셀(docetaxel)과 같은 여러 항암제가 개발되었지만, 이러한 약물에 대한 내성이 전립선 암 세포의 일부에서 발생할 수 있어 mCRPC(metastatic CRPC)가 발생한다. 또한, 고용량의 항암제를 사용하여 치명적인 독성에 도달하는 데에는 한계가 있다. 이러한 용량은 정상 세포의 생존력에 영향을 미치고 심각한 부작용을 초래할 수 있기 때문이다. 따라서 증식 감쇠를 목표로 하는 항 전립선 암 치료제만으로는 전립선 암을 완전히 제거하기가 매우 어려운 실정이다.
부착(adhesion)과 이주(migration)는 전립선 암 진행의 중요한 단계 중 하나이기 때문에 부착 및 이주와 같은 특정 단계를 표적으로 하는 항 전립선 암제는 mCRPC 뿐만 아니라 전립선 암으로 고통받는 환자를 치료하는 효과적인 대체 치료가 될 수 있다. 본 발명의 토복령 추출물(WESGR)의 무독성 용량의 전처리는 PC3 및 LNCaP 세포(각각 25 및 50 ㎍/㎖ 의 콜라겐으로의 이주를 억제했지만 혈청으로의 이주는 억제하지 않았다.
인테그린(Integrin)은 ECM 단백질에 대한 잘 알려진 이종이합체 수용체이며 세포 이동 및 부착에 중요한 역할을 한다. WESGR이 콜라겐 매개 이동 및 부착을 현저하게 약화시킬 수 있음을 확인한 후, 본 발명자들은 WESGR이 α2β1 인테그린의 발현을 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다. WESGR의 이소성 투여는 PC3 및 LNCaP 세포에서 α2β1 인테그린의 발현에 영향을 미치지 않았다. 그러나 WESGR을 사용한 전처리는 PC3 및 LNCaP 세포를 콜라겐 코팅 플레이트에 놓았을 때 β1 인테그린의 콜라겐 유도 발현을 억제하여 WESGR이 부착 과정에서 β1 인테그린 발현을 활성화하기 위해 콜라겐 매개 세포 내 신호를 약화시킬 수 있음을 시사한다. β1 인테그린의 발현이 하향 조절되면 α2β1 의 이종이량체화가 중단되어야하며, 이어서 FAK와 같은 인테그린 매개 세포 내 신호 전달이 비활성화되어야하는데, WESGR을 사용한 전처리는 β1 인테그린의 콜라겐 매개 발현과 FAK의 인산화를 약화시켰다. 또한 WESGR의 전처리는 라멜리포듐(lamellipodium) 형성에 중요한 PC3 및 LNCaP 세포에서 콜라겐 매개 액틴 형성을 억제한다는 것을 확인하였다(도 9). 이러한 데이터는 WESGR이 콜라겐 매개 전립선 암 세포의 이주 및 부착을 효과적으로 억제 할 수 있음을 시사했다.
WESGR의 주요 성분을 확인하기 위해 HPLC/MS/MS 분석을 수행했으며, 카페오일퀴닉산(caffeoylquinic acid), 즉 5-O-caffeoylquinic acid, 4-O-caffeoylquinic acid 및 3-O-caffeoylquinic acid가 WESGR의 주요 구성 요소가 될 수 있다. 카페 오일퀴닉산은 퀴닉산 코어와 하나 이상의 카페 오일 그룹으로 구성된다. 암세포의 증식은 카페오일퀴닉산에 의해 직접적으로 약화되는 것으로 보였는데, 5-O-caffeoylquinic acid의 전처리가 콜라겐 매개 PC3 세포 부착을 효과적으로 약화 시킨다는 것을 확인했다. 또한, 콜라겐 유도 β1 인테그린 발현과 FAK 활성화는 5-O-카페오일퀴닉산의 전처리에 의해 약화되었다. 따라서 5-O-caffeoylquinic acid가 WESGR의 항 종양 효과를 설명하는 활성 성분이 될 수 있다.
따라서, 본 발명은 토복령(Smilax glabra Roxb, SGR) 추출물을 포함하는 전립선암 전이 억제용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출된 것일 수 있다. 바람직하게는 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하며 가장 바람직하게는 물을 용매로 하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 추출물은 감압고온추출, 열탕추출, 환류추출, 열수추출, 상온추출, 초음파 추출 및 증기추출 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 추출된 것일 수 있으며, 바람직하게는 열수추출의 방법으로 추출된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 토복령 추출물은 토복령 추출물 유래 카페오일퀴닉산(caffeoylquinic acid)일 수 있으며, 바람직하게는 5-O-카페오일퀴닉산(5-O-caffeoylquinic acid), 4-O-카페오일퀴닉산(4-O-caffeoylquinic acid) 및 3-O-카페오일퀴닉산(3-O-caffeoylquinic acid) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 토복령 추출물은 토복령 추출물 유래 5-O-카페오일퀴닉산(5-O-caffeoylquinic acid) 인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 콜라겐에 대한 수용체 분자인 α2β1 인테그린(α2β1 integrin)의 발현을 선택적으로 저해하여, 전이 대상세포의 세포외 기질(Extracellular matrix; ECM)인 콜라겐(Collagen)에 의해 매개되는 전립선 암세포의 부착(Adhesion) 및 이주(Migration)을 특이적으로 약화시킴에 따라, 전립선 암세포의 전이(Metastasis)를 억제하는 것이다.
또한, 본 발명은 토복령(Smilax glabra Roxb, SGR) 추출물을 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 토복령 추출물은 상기 전립선암 전이 억제용 조성물에서 사용된 것과 동일하므로 설명은 상기 기재로 대신한다.
본 발명의 '예방' 이란, 본 발명의 토복령 추출물로 인해 전립선암이 억제되거나 그 발병이 지연되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 '개선' 또는 '치료' 란, 본 발명의 토복령 추출물로 인해 전립선암과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도가 호전되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 향료, 유화제, 가용화제, 분산제, 향미제, 항산화제, 포장제, 안료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 또는 경피 투여제 등의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.
상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 경피 투여는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여 시 토복령 추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여 시는 본 발명의 토복령 추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 토복령(Smilax glabra Roxb, SGR) 추출물을 포함하는 전립선암 전이 억제용 항암보조제를 제공한다.
상기 토복령 추출물은 상기 전립선암 전이 억제용 조성물에서 사용된 것과 동일하므로 설명은 상기 기재로 대신한다.
본 발명의 항암보조제는 항암제의 항암효과를 증대시키거나 항암제의 부작용을 억제 또는 개선시키기 위한 모든 형태를 의미한다. 본 발명의 항암보조제는 다양한 종류의 항암제 또는 항암보조제와 병용투여될 수 있으며, 병용투여시 통상적인 항암제의 투여량보다 낮은 수준으로 항암제를 투여하더라도 동등한 수준의 항암치료효과를 나타낼 수 있으므로 보다 안전한 항암치료를 수행할 수 있다.
상기 항암보조제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 항암보조제는 목적하는 바에 따라 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 경구 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 항암보조제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 항암보조제는 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 항암보조제로 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 항암치료 보조제에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항암보조제는 경구 또는 비경구 투여를 위한 제제일 수 있으며, 제제에 대한 설명은 상기 약학적 조성물의 제제에 대한 기재로 대신한다.
또한, 본 발명은 토복령(Smilax glabra Roxb, SGR) 추출물을 포함하는 전립선암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 토복령 추출물은 상기 전립선암 전이 억제용 조성물에서 사용된 것과 동일하므로 설명은 상기 기재로 대신한다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 토복령 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 본 발명의 토복령 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 본 발명의 토복령 추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 토복령 추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 토복령 추출물과 전립선암 예방 또는 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 토복령 추출물을 건강음료로 이용하는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
또한, 본 발명의 토복령 추출물은 전립선암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 전립선암 예방 또는 개선 작용을 달성하기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%인 것이 바람직하다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 토복령 추출물과 함께 전립선암에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
토복령 물 추출물(WESGR) 제조
토복령(Smilax glabra Roxb.; SGR)은 대한민국 서울 경동 시장에서 구입하였으며 2L의 온수로 200g의 SGR을 추출하였다. 상청액을 수확, 여과 및 회전 증발 시스템 (Heidolph Instruments GmbH & Co., Schwabach, Germany)을 사용하여 농축했다. 최종 농축액을 동결 건조하고 사용할 때까지 냉장고에서 -80 ℃ 에 보관했다. 건조된 추출물의 수율은 약 6.8 g/L 이었다.
토복령 추출물의 세포독성 확인
PC3 및 LNCaP 전립선 암 세포에서 WESGR의 무독성 수준은 배양에서 대사 활성 세포를 검출할 수 있는 WST-1 분석 키트로 측정되었다.
구체적으로, ATCC(American Type Culture Collection; Manassas, VA, USA)에서 얻은 PC3 및 LNCaP 세포를 96-웰 플레이트 (PC3 세포의 경우 5 x 103 세포/웰, LNCaP 세포의 경우 4 x 104 세포/웰)에 접종하고 10 % 소 태아 혈청 (FBS) (HyClone Laboratories, Logan, UT, USA) 및 1 % 페니실린-스트렙토마이신 용액 (BioWhittaker Inc., Walkersville, MD, USA)이 보충된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지에서 24 시간 동안 배양하였다. RPMI 1640 배지로 세척 한 후, WESGR을 다양한 농도 (PC3 세포의 경우 50 ~ 400 ㎍/㎖ LNCaP 세포의 경우 10 ~ 500 ㎍/㎖로 각 웰에 첨가하고 CO2 인큐베이터에서 24 시간 동안 37 ℃ 에서 배양했다. 이어서 WST-1(2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt) 용액 (Dozen, Seoul, Korea)을 각 웰에 추가하고 세포를 추가로 2 시간 동안 배양하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더 (Model 680 Microplate Reader, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 450nm 에서 측정되었다.
그 결과, [도 1a]에서 볼 수 있듯이 100 및 50 ㎍/㎖ 농도까지의 WESGR은 각각 PC3 및 LNCaP 세포에 대한 세포 독성을 나타내지 않았다. 그러나 PC3 및 LNCaP 세포에 각각 200 및 100 ㎍/㎖ WESGR을 첨가하면 생존력이 크게 감소했다. 또한, WESGR의 세포 독성 가능성은 96 시간의 인큐베이션 동안 추가로 평가되었다. WESGR (PC3의 경우 100 ㎍/㎖ LNCaP의 경우 50 ㎍/㎖은 배양 72 시간까지 PC3 및 LNCaP 세포의 생존력에 영향을 미치지 않았다 (도 1b). 이러한 결과를 바탕으로 본 발명자들은 WESGR의 무독성 수준 (PC3 세포의 경우 25-100 ㎍/㎖ LNCaP 세포의 경우 25-50 ㎍/㎖이 세포 부착 및 이동에 미치는 영향을 조사했다.
토복령 추출물의 전립선암 세포 부착 및 이동 억제 효과
<3-1> 토복령 추출물의 콜라겐에의 정착 약화 효과
ECM 단백질 중 PC3 및 LNCaP 세포의 가장 많은 이동이 콜라겐으로 이동하는 것으로 보고되었기 때문에, WESGR이 콜라겐과 PC3 및 LNCaP 세포 간의 상호 작용을 약화시키면 전립선 암 종양의 유착 또는 이동과 같은 형성 및 전이의 이벤트를 약화시키는 전립선 암 약물로 개발될 수 있다고 생각했다. 따라서 먼저 WESGR의 무독성 수준이 콜라겐 의존적 부착을 약화시킬 수 있는지 여부를 조사했다.
구체적으로, 전립선 암 세포 (PC3 및 LNCaP)를 WESGR (50㎍/㎖로 6 시간 동안 전처리하거나, 전처리 없이 콜라겐 I (10㎍/㎖ 또는 20 % FBS 코팅 96 웰 플레이트 (PC3 세포의 경우 2 × 105 세포/웰, LNCaP 세포의 경우 1 × 105 세포/웰)에 로딩하였다. 실온에서 15 분 (PC3 세포) 및 3 시간 (LNCaP 세포) 동안 추가 배양한 후, 플레이트를 PBS로 1 회 세척하였다. 나머지 세포는 파라포름알데히드 용액 (4 % w/v)으로 고정한 다음 크리스탈 바이올렛 용액 (5 % w/v)으로 염색했다. 부착된 세포의 수는 현미경으로 세었다.
그 결과, [도 2] 는 WESGR의 무독성 수준이 혈청 코팅 플레이트에서 PC3 및 LNCaP 세포 부착에 영향을 미치지 않았음을 보여준다. 그러나 PC3 및 LNCaP 세포의 50 % 이상이 무독성 수준의 WESGR (50 ㎍/㎖로 처리한 후 콜라겐 코팅 바닥 영역에 부착할 수 없게 되었다. 이러한 결과는 WESGR의 무독성 수준의 사용이 콜라겐에 대한 전립선 암 세포 부착과 같은 특정 단계 동안 전립선 암의 진행을 약화시키는 효과적인 방법이 될 수 있음을 시사한다.
<3-2> 토복령 추출물의 콜라겐으로의 이동 약화 효과
WESGR이 PC3 및 LNCaP 세포의 콜라겐으로의 이동을 약화시킬 수 있는지 여부를 조사했다.
구체적으로, PC3 및 LNCaP 세포의 콜라겐 의존적 이동에 대한 WESGR의 항 이동 효과는 Transwell Permeable Supports (BD Biosciences, San Jose, A, USA)를 사용하여 측정되었다. Transwell 막의 바닥 영역을 PBS에서 4 ℃ 에서 하루동안 혈청 (20 % w/v) 또는 콜라겐 I (10 ㎍/㎖ Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로 코팅했다. PC3 세포 (5 × 104 세포/웰) 및 LNCaP 세포 (2 × 105 세포/웰)를 각각 25 및 50 ㎍/㎖ WESGR로 6 시간 동안 전처리한 다음 트랜스 웰 챔버(8 μm pore size)의 상부에 추가했다. PC3 세포는 6 시간 (혈청 코팅 Transwell) 또는 2 시간 (콜라겐 코팅 Transwell) 동안, LNCaP 세포는 18 시간 (혈청 코팅 Transwell) 또는 6 시간 (콜라겐 코팅 Transwell) 동안 37 ℃ 의 CO2 인큐베이터에서 추가로 배양하였다. 바닥층으로 이동한 PC3 및 LNCaP 세포는 파라포름알데히드 (4 % w/v)로 고정한 다음 크리스탈 바이올렛 (0.5 % w/v)으로 염색했다.
그 결과, [도 3a] 은 WESGR의 무독성 수준이 PC3 및 LNCaP 세포가 막의 상부에서 혈청으로 코팅된 하부로 이동하는 것을 감소시키지 않았음을 보여준다. 그러나 PC3 및 LNCaP 세포의 콜라겐 코팅 바닥 영역으로의 이동은 WESGR 처리에 의해 용량 의존적으로 약화되었다. 이러한 결과는 WESGR의 무독성 수준의 사용이 전립선 암 세포가 콜라겐으로 이동하는 것과 같은 특정 단계에서 전립선 암의 진행을 약화시키는 효과적인 방법이 될 수 있음을 시사한다. 추가적으로, WESGR의 투여가 콜라겐 코팅 플레이트에서 PC3 세포의 이동을 억제했지만 상처 치유 분석에 의해 혈청 코팅 플레이트에서는 억제되지 않았음을 확인하였다 (도 3b). 이러한 결과는 WESGR 처리에 의한 손상된 세포 이동이 손상된 세포 운동성 및 기계적 탄력성 때문임을 시사한다.
토복령 추출물의 콜라겐 의존적 β1 인테그린 발현 억제 효과
WESGR의 무독성 수준이 PC3 및 LNCaP 세포 이동을 약화시킬 수 있음을 확인한 후 콜라겐에 대해서만 WESGR의 무독성 수준이 콜라겐과 전립선 암 세포 (PC3 및 LNCaP) 간의 직접적인 상호 작용을 약화시킬 수 있는지 조사했다.
구체적으로, 약 70 % 포화된(confluent) PC3 및 LNCaP 세포를 PBS로 2 회 세척하고 트립신/EDTA 용액 (HyClone Laboratories, Logan, UT, USA)으로 처리하여 단일 세포로 분리하였다. 트립신의 활성은 글리신 맥스 대두(glycine max soybean; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)의 트립신 억제제로 처리하여 비활성화되었다. PC3 및 LNCaP 세포는 WEGST (PC3의 경우 100 ㎍/㎖ LNCaP의 경우 50 ㎍/㎖로 30 분 (PC3 세포) 또는 2 시간 (LNCaP 세포)으로 전처리하거나 하지않고, 콜라겐 I (10 ㎍/㎖ 코팅 플레이트에 시드하였다. PC3 세포는 배양 후 0, 15, 30 또는 60분 후, LNCaP 세포는 배양 후 0, 1, 2 또는 3 시간 후 세포를 수확하고 총 단백질을 20mM Tris-HCl (pH 7.4), Nonidet P-40 (1 % w/v), 150mM NaCl, 5mM EDTA, 10mM NaF, 5mM sodium pyrophosphate, 1mM sodium orthovanadate, 10mM β-glycerophosphate, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride 및 프로테아제 억제제 혼합물(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 로 구성된 용해 완충액으로 가용화했다. 세포 용해물을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리하고 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 옮겼다. 막은 항 포스포-FAK 항체 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), 마우스 항-FAK 항체 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), 토끼 항-α2 인테그린 항체 (Merck Millipore, Gibbstown, NJ, USA), 항-β1 인테그린 항체 (sc-374429) (Santa Cruz, CA, USA) 및 마우스 항-β-actin 항체 (Santa Cruz, CA, USA), 이어서 양 겨자무과산화효소(HRP)-접합된 항 토끼 면역 글로불린 G (IgG) 으로 각각 배양되었다. ECL 시약 (Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA)을 사용하여 신호를 활성화했다.
그 결과, [도 2] 에서 볼 수 있듯이 WESGR의 무독성 수준은 콜라겐 의존성 PC3 및 LNCaP 세포 부착을 현저하게 억제했다. 이 결과를 바탕으로 PC3 및 LNCaP 세포의 콜라겐 수용체로 알려진 α2β1 인테그린의 발현에 대한 WESGR의 효과를 조사했다. 200 및 100 ㎍/㎖ 농도까지 WESGR의 이소성 투여는 각각 이미 부착된 PC3 및 LNCaP 세포에서 α2β1 인테그린의 발현에 영향을 미치지 않았다 (도 4 A, C). 흥미롭게도, WESGR (100 ㎍/㎖ 로 전처리하면 β1 인테그린의 발현이 상당히 약화되었지만 콜라겐 코팅된 플레이트에 PC3 세포가 부착되는 과정에서 α2 인테그린 발현이 감소하지 않았다 (도 4 B). 또한 콜라겐이 코팅된 플레이트에 파종 후 3 시간 후 LNCaP 세포에서 α2 인테그린의 발현은 WESGR (50 ㎍/㎖ 전처리에 의해 감소되었으며, β1 인테그린의 발현은 WESGR (50 ㎍/㎖) 전처리에 의해 콜라겐 코팅 플레이트에 LNCaP 세포가 부착되는 과정동안 약화되었다(도 4 D). β1 인테그린의 발현은 부착 과정에서 점진적으로 증가하는 것으로 보이며 (도 4 B, D) 세포가 매트릭스에 부착되면 β1 인테그린의 발현이 포화된 것처럼 보인다 (도 4 C). 종합하면, 이러한 데이터는 부착 과정에서 WESGR의 투여가 전립선 암 세포 (PC3 및 LNCaP)와 β1 인테그린 발현 유도를 담당하는 콜라겐 간의 직접적인 상호 작용을 억제할 수 있음을 시사한다.
토복령 추출물의 콜라겐 의존적 FAK 신호 억제 효과
콜라겐에 대한 이동 및 부착에 대한 WESGR 매개 조절의 상세한 분자 메커니즘을 추가로 조사하기 위해 본 발명자들은 상기 <실시예 4> 의 방법을 이용하여 PC3 및 LNCaP 세포에서 인테그린 의존성 이동 및 부착에 중요한 역할을 하는 FAK의 콜라겐 매개 활성화가 WESGR 처리에 의해 조절되는지 여부를 조사했다.
그 결과, [도 5] 에서 볼 수 있듯이 PC3 및 LNCaP 세포를 콜라겐 코팅 플레이트가 있는 막에 배치하면 대조군(무처리) PC3 및 LNCaP 세포에서 FAK의 활성화/인산화가 점차 증가했다. 그러나 무독성 수준의 WESGR로 처리된 PC3 및 LNCaP 세포는 콜라겐에 대한 부착 과정에서 FAK의 약화된 인산화를 나타냈다. 이러한 결과는 콜라겐이 풍부한 ECM 영역에 대한 PC3 및 LNCaP 세포 부착을 늦추기 위해 WESGR에 의해 인테그린 의존적 신호 전달이 효과적으로 억제 될 수 있음을 나타낸다.
토복령 추출물 성분 분석
HPLC-MS/MS 분석을 수행하여 WESGR의 주요 성분을 결정했다. WESGR의 기능적 단일 구성 요소를 추정하기 위해 먼저 HPLC (도 6a)로 분리하고 3 개의 주요 피크 (tR 2.1, 14.1 및 17.3 분)를 질량 분석법 (도 6b)으로 추가 분석했다. 각 질량 결과의 주요 피크를 선택하고 MS/MS 분석에 의해 추가로 특성화했다.
구체적으로, 분석은 LTQ 이온 트랩 질량 분석기 (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)와 결합된 Ultimate 3000 RS 시스템 (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)에서 수행되었다. WESRG는 40 ℃에서 0.2 ㎖min의 유속을 사용하여 Phenomenex Kinetex C18 컬럼 (150mm, 2.10mm, 1.7um, Phenomenex Inc., USA)에서 분리되었다. 용리액 A의 이동상은 포름산 수용액 0.1 % v/v 이었고 용리액 B의 이동상은 포름산 0.1 % v/v가 있는 메탄올이었다. 용출에는 구배 프로그램이 사용되었다: 0-30 분, A는 99 %에서 0 %, B는 1 %에서 100 % 이다. 이온 트랩 MS 및 스프레이 챔버 조건은 모세관 온도 300 ℃ 및 소스 전압 3.5kV 이었다.
번호 tR
(분)		 λmax
(nm)		 Observed Mass Main Peak Main Peak 의 LC-MS2 Compounds(MW)
1 2.1 340 133.3, 179.4, 191.3, 225.3, 290.5, 371.5, 439.5, 479.6, 533.6, 605.6, 632.5, 707.5, 769.5, 805.4, 863.3, 943.2, 967.4 191.3 58.9, 70.9, 83.0, 84.9, 92.9, 98.9, 109.0, 110.0, 127.0, 137.0, 153.0, 155.0, 171.0, 173.0, 174.0, 191.1 N.D.
2 14.1 340 191.3, 289.5, 353.5, 451.5, 485.7, 531.4, 707.1, 729.3, 839.3, 1009.3, 1115.2, 1219.2, 1366.1, 1494.7, 1551.3, 1721.6, 1841.2, 1981.5 353.5 135.0, 160.9, 172.9, 191.0, 192.1, 197.1, 217.2 - Catechin (289.5)
- Epicatechin (289.5)
- 5-O-Caffeoylquinic acid (353.086)
- 4-O-Caffeoylquinic acid (353,086)
- 3-O-Caffeoylquinic acid (353.086)
- Cinchonain Ib (451.5)
3 17.3 340 191.3, 263.4, 353.5, 449.5, 517.6, 647.3, 707.3, 739.4, 823.3, 901.3, 1027.4, 1224.7, 1338.3, 1439.0, 1510.8, 1654.9, 1846.7, 1913.5 707.1 307.0, 351.1, 353.1, 353.7, 452.3, 514.3, 555.2, 617.1, 658.1, 689.3 - Neoastilbin (449.5)
- Astilbin (449.5)
WESRG의 3 개 주요 피크의 질량과 LC-MA/MS의 결과를 상기 [표 1] (N.D: not determined)에 나타냈다. 보고된 데이터를 참조하면 5-O-caffeoylquinic acid, 4-O-caffeoylquinic acid 및 3-O-caffeoylquinic acid는 WESGR의 주요성분일 수 있다.
5-O-카페오일퀴닉산의 효능 확인
WESGR의 여러 단일 성분 중 5-O-카페오일퀴닉산(5-O-caffeoylquinic acid)의 부착 방지 특성을 상기 실시예 2 내지 5 와 동일한 방법으로 조사했다.
그 결과, [도 7] 에 나타나는 바와 같이 5-O-카페오일퀴닉산 은 100 μM 이상 농도에서부터 세포 독성을 나타냈다. 또한, [도 8 A] 에 나타난 바와 같이, 5-O-카페오일퀴닉산(25 및 50 μM)의 무독성 수준의 전처리는 콜라겐 매개 PC3 세포 부착을 약화시켰지만 혈청 코팅 플레이트에서 PC3 세포 부착에는 영향을 미치지 않았다. 또한, 5-O-caffeoylquinic acid의 무독성 수준의 전처리는 β1 인테그린의 발현을 약화시켰지만 PC3 세포 부착 과정에서 α2 인테그린 발현을 억제하지 않아 FAK의 인산화가 손상되었다 (도 8 B). 이러한 결과는 5-O-caffeoylquinic acid가 WESGR의 항 전립선 암 효과를 설명하는 WESGR의 주요 기능성 단일 성분임을 시사한다.
[통계 분석]
통계 분석은 Prism 5 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. 두 샘플 간의 통계적 유의성은 unpaired student's t-test 를 사용하여 분석되었다. 결과는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시된다. 0.05 미만의 p 값은 중요한 것으로 간주되었다.

Claims (8)

  1. 토복령(Smilax glabra Roxb, SGR) 추출물을 포함하는 전립선암 전이 억제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물 을 용매로 하여 추출된 것을 특징으로 하는 전립선암 전이 억제용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 감압고온추출, 열탕추출, 환류추출, 열수추출, 상온추출, 초음파 추출 및 증기추출 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 추출된 것을 특징으로 하는 전립선암 전이 억제용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 토복령 추출물은 토복령 추출물 유래 5-O-카페오일퀴닉산(5-O-caffeoylquinic acid), 4-O-카페오일퀴닉산(4-O-caffeoylquinic acid) 및 3-O-카페오일퀴닉산(3-O-caffeoylquinic acid) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 전립선암 전이 억제용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 콜라겐에 대한 수용체 분자인 α2β1 인테그린(α2β1 integrin)의 발현을 선택적으로 저해하여, 전이 대상세포의 세포외 기질(Extracellular matrix; ECM)인 콜라겐(Collagen)에 의해 매개되는 전립선 암세포의 부착(Adhesion) 및 이주(Migration)을 특이적으로 약화시킴에 따라, 전립선 암세포의 전이(Metastasis)를 억제하는 것을 특징으로 하는, 전립선암 전이 억제용 조성물.
  6. 토복령(Smilax glabra Roxb, SGR) 추출물을 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 토복령(Smilax glabra Roxb, SGR) 추출물을 포함하는 전립선암 전이 억제용 항암보조제.
  8. 토복령(Smilax glabra Roxb, SGR) 추출물을 포함하는 전립선암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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