KR20230000985A - 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 시체 추출물은 치은섬유모세포에서 LPS에 의해 증가된 IL-6의 발현을 감소시키는 효과가 있고, 파골세포의 분화를 억제하는 효과가 우수하며, 치주균인 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 및 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)의 생장을 억제하는 효과가 우수하므로, 치주질환의 치료제, 치주질환 개선용 건강기능식품 또는 구강 위생 용품의 소재로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 시체(감 꼭지) 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
치주질환(Periodontal disease)은 치아를 지지하는 치은과 치골에 영향을 미치는 질환으로, 치은염(gingivitis)과 치주염(periodontitis) 등을 포함한다. 치은염은 잇몸의 연조직에 염증이 생기는 초기 치주질환으로 비교적 증상이 가볍고 회복이 가역적인 상태이다. 치주염은 치은염이 치료되지 않고 염증이 잇몸과 치골 주변까지 진행된 경우로 세균의 독소에 의해 자극된 만성 염증반응이 진전되면 잇몸과 치아 사이에서 분리되어 감염된 치주낭(periodontal pocket)이 형성되고, 치주염이 심할수록 치주낭의 깊이가 깊어져서 결국 치주인대에 염증이 생기게 되고 골 소실이 일어난다. 또한, 치조골에서 여러 가지 요인에 의해 골 흡수가 골 형성을 초과하여 골량이 한계 이하로 감소하면 치조골다공증과 같은 치조골 형성 장애가 발생한다.
치주질환의 치료는 환자의 개선된 구강위생의 확립, 비외과적 혹은 외과적인 치석제거술, 치근활택술, 치은소파술과 신부착을 응용한 치주 조직의 재생술들이 이용되어져 왔다. 그러나 이런 외과적인 치료 방법은 치료가 번거롭고, 효과적인 치료가 어려우며, 병의 예방보다는 병이 어느 정도 진행되었을 경우 행하는 치료에 국한되어 있어, 치료를 하지 않을 경우 만성으로 진행되는 경우가 대부분이다.
또한, 부가적인 치료로 전신적인 항생제의 복용과 국소 서방형 제재가 사용되어 왔으나, 불필요한 부위에도 약물이 너무 많이 전달되어 그로 인한 부작용이 있고, 최근 사용되는 항생제에 대한 내성을 나타내는 치주질환 균이 분리된 예가 보고되고 있어 심각한 문제점을 안고 있다.
게다가, 치주질환은 일반적인 염증, 관절염 등과 다르게 치조골의 손실, 염증, 진지발리스와 같은 치주염 균에 의한 복합적인 유발원인을 가지는 특징이 있어, 항균 및 항염증, 조골세포의 골세포로의 촉진 등의 복합적 치료 방법이 필요하나, 이러한 치료를 위한 약물 내지 치료법이 개발되어 있지 않다. 따라서 부작용이 적으면서 치주질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 물질에 대한 개발이 필요한 실정이다.
시체(감 꼭지)는 감나무과(Ebenaceae)에 속하는 낙엽관목교목인 감나무(Diospyros kaki THUNB.)의 과실 꽃받침인 감 꼭지를 일컫는다. 시체는 가장자리가 얇게 넷으로 갈라진 넓적한 꽃받침으로 지름 15~25㎜, 두께 1~4㎜이다. 열편은 난원형 또는 삼각상 및 넓은 난형이며 위쪽으로 대개 말려져 있고 합편부의 중앙은 좀 두껍다. 겉면은 회갈색 또는 적갈색이고 흔히 네 개의 융기선이 있으며 과병의 잔기가 붙어 있거나 떨어진 자리가 오목하게 남아 있는 것도 있다. 안쪽 면의 합편부를 확대경으로 보면 갈색의 짧은 털이 밀생하고 중앙 부위에는 열매가 떨어진 흔적이 나타난다.
시체와 관련된 선행기술로는 한국등록특허 제0537914호에 감 꼭지 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2018-0087479호에 감 꼭지 추출물을 함유하는 피부장벽강화용 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관해 전혀 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 상기 시체 추출물의 항염증 효과, 치조골 손상 억제 효과 및 치주균에 대한 항균 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 개선용 구강 위생 조성물을 제공한다.
본 발명은 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 시체 추출물은 치은섬유모세포에서 LPS에 의해 증가된 IL-6의 발현을 감소시키는 효과가 있고, 파골세포의 분화를 억제하는 효과가 우수하며, 치주균인 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 및 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)의 생장을 억제하는 효과가 우수하므로, 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 또는 구강 위생 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 치은섬유모세포(HGF-1, human gingival fibroblast)에서, 추출 용매에 따른 시체 추출물의 세포 생존율을 확인한 결과이다. A는 시체 물 추출물, B는 시체 70%(v/v) 에탄올 추출물, C는 시체 30%(v/v) 에탄올 추출물, D는 시체 메탄올 추출물이다.
도 2는 추출 용매에 따른 시체 추출물의 IL-6 발현 억제 효과를 확인한 결과이다. LPS를 처리하여 IL-6의 발현을 증가시켰다. A는 시체 물 추출물, B는 시체 70%(v/v) 에탄올 추출물, C는 시체 30%(v/v) 에탄올 추출물, D는 시체 메탄올 추출물이다. *, **, ***은 시체 추출물 처리에 의해 IL-6의 발현이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이다.
도 3은 파골세포에서 추출 용매에 따른 시체 추출물의 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 4는 파골세포에서 추출 용매에 따른 시체 추출물의 TRAP 활성 억제 효과를 확인한 결과이다. ***은 시체 추출물 처리에 의해 TRAP 활성이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, ***은 p<0.001이다.
도 5는 시체 추출물의 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)에 대한 항치주균 효과를 확인한 결과이다. A는 시체 30%(v/v) 에탄올 추출물, B는 시체 70%(v/v) 에탄올 추출물, C는 시체 메탄올 추출물이다. *, ***은 시체 추출물 처리에 의해 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스의 증식이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, ***은 p<0.001이다.
도 6은 시체 추출물의 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 대한 항치주균 효과를 확인한 결과이다. A는 시체 30%(v/v) 에탄올 추출물, B는 시체 70%(v/v) 에탄올 추출물, C는 시체 메탄올 추출물이다.
도 2는 추출 용매에 따른 시체 추출물의 IL-6 발현 억제 효과를 확인한 결과이다. LPS를 처리하여 IL-6의 발현을 증가시켰다. A는 시체 물 추출물, B는 시체 70%(v/v) 에탄올 추출물, C는 시체 30%(v/v) 에탄올 추출물, D는 시체 메탄올 추출물이다. *, **, ***은 시체 추출물 처리에 의해 IL-6의 발현이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이다.
도 3은 파골세포에서 추출 용매에 따른 시체 추출물의 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 4는 파골세포에서 추출 용매에 따른 시체 추출물의 TRAP 활성 억제 효과를 확인한 결과이다. ***은 시체 추출물 처리에 의해 TRAP 활성이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, ***은 p<0.001이다.
도 5는 시체 추출물의 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)에 대한 항치주균 효과를 확인한 결과이다. A는 시체 30%(v/v) 에탄올 추출물, B는 시체 70%(v/v) 에탄올 추출물, C는 시체 메탄올 추출물이다. *, ***은 시체 추출물 처리에 의해 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스의 증식이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, ***은 p<0.001이다.
도 6은 시체 추출물의 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 대한 항치주균 효과를 확인한 결과이다. A는 시체 30%(v/v) 에탄올 추출물, B는 시체 70%(v/v) 에탄올 추출물, C는 시체 메탄올 추출물이다.
본 발명은 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 추출물의 추출 용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있고, 바람직하게는 에탄올 또는 메탄올인 것이며, 더 바람직하게는 메탄올을 용매로 사용한 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 치주질환은 치아를 지지하는 치은과 치골에 영향을 미치는 질환으로, 치은염, 치주염, 치주염에 의한 치조골 파손 및 치주염에 의한 치조골 형성 장애 중 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 치조골 형성 장애는 치조골다공증(alveolar bone osteoporosis), 치조 골연화증(alveolarbone osteomalacia) 또는 치조골감소증(alveolar bone osteopenia)을 포함할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 치주질환은 염증에 의한 것일 수 있고, 치조골 손상에 의한 것일 수 있으며, 치주균에 의한 것일 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 시체 추출물은 항염증 효과가 있고, 치조골 손상을 억제할 수 있으며, 치주균에 대한 항균 효과가 있다.
상기 치주균은 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitan), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 타네렐라 포시티아 (Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus), 펩토스트렙토코커스 마이크로스(Peptostreptococcus micros), 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens) 및 유박테리움 노다툼(Eubacterium nodatum) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 및 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 중에서 선택된 하나 이상인 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 상기 추출물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 시체 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calciumcarbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당하는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하 주사, 정맥 주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다.
또한, 본 발명은 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 개선용 구강 위생 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 구강 위생 조성물은 구강의 위생을 위하여 사용할 수 있는 모든 종류 및 제형을 포함할 수 있고, 바람직하게는 치약, 구강 세정제, 구강용 스프레이, 구강용 연고제, 구강용 패치 및 검으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 제형을 갖는 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 구강위생 조성물이 치약류인 경우, 유효성분으로 2-메톡시신남알데하이드를 포함하는 것 외에, 연마제, 점결제, 보습제, 발포제, 감미료, 미백제 또는 향미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 연마제로는 수산화알루미늄, 무수규산, 규산알루미늄, 제2인산칼슘 2 수산화물 및 무수물, 제3인산칼슘, 탄산칼슘, 피로인산칼슘, 불용성 메타인산나트륨, 제3인산마그네슘, 탄산마그네슘, 황산칼슘, 폴리메타아크릴산메틸 등을 단독 또는 복합적으로 사용할 수 있다. 상기 연마제의 함량은 전체 조성물을 기준으로 통상 20 중량% 내지 90 중량%일 수 있으나, 상기 함량에 의해 한정되는 것은 아니다.
상기 구강위생 조성물이 페이스트상 조성물일 경우에는 상기 점결제는 가라기닌, 각종 점증용 셀룰로오스 유도체, 잔탄검, 트라가칸트 검(tragacanth gum) 등의 검류, 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴산 나트륨, 폴리아크릴산/말레인산 공중합체, 카르복시비닐 폴리머 등의 합성 고분자 유도체 등의 유기계 점결제와 실리카, 라포나이트 등의 무기계 점결제 등을 단독 또는 복합적으로 사용할 수 있다. 상기 점결제의 함량은 전체 조성물을 기준으로 통상 0.3 중량% 내지 5 중량%일 수 있으나, 상기 함량에 의해 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 구강위생 조성물에는 그 제조시 보습제로 솔비톨, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리에테르 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 구강위생 조성물에는 향료 또는 감미제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 감미제는 수크로즈, 락토오즈, 말토오즈, 솔비톨, 크실리톨, 나트륨시클라메이트, 글리세린, 사카린나트륨, 스테비오사이드, 아스파탐 등일 수 있고, 상기 향료는 페퍼민트, 멘톨, 아네톨, 오이게놀, 리모넨, 시트로네놀, 알파터피네올, 살리실메틸, 시네올, 리나롤, 에틸리나롤, 바닐린, 티몰, 스피아민트유, 세지유, 로즈마리유, 계피유 등일 수 있으며, 상기 감미제 또는 향료는 단독으로 또는 복합적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 구강위생 조성물에는 발포성분으로 사용되는 계면활성제나 추가 효능성분이 단독으로 또는 복합적으로 포함될 수 있다. 상기 발포성분으로 사용되는 계면활성제는 음이온 계면활성제, 비이온 계면활성제 및 양이온 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 구강위생 조성물이 치약인 경우에는, 유효성분으로 시체 추출물을 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 치약 제조방법으로 제조될 수 있으며, 본 발명의 구강 위생 조성물이 양치용액인 경우에는 통상적인 용액제에 시체 추출물을 혼합하고 양치용액으로 제형화하여 제조될 수 있으며, 하루 2 내지 10회 구강을 세척함으로써 구강질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명의 구강위생 조성물이 치약 크림인 경우에는, 물과 보습제를 포함하는 액체, 겔화제 또는 수불용성 광택제, 감미료, 향료 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 구강위생 조성물이 구강 세척제(세정제)인 경우에는, 치약 담체, 보다 상세하게는 비독성 알코올을 추가로 포함할 수 있다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예 1. 시체 추출물의 제조
시체 분쇄물 3g에 100㎖의 물, 30%(v/v) 에탄올, 70%(v/v) 에탄올 또는 100%(v/v) 메탄올을 용매로 첨가하여 30분 동안 침지한 후 3시간 동안 환류 추출하였다. 그 후 상기 추출물을 감압농축하고, 동결건조하여 시체 물 추출물, 시체 30%(v/v) 에탄올 추출물, 시체 70%(v/v) 에탄올 추출물 또는 시체 100%(v/v) 메탄올 추출물을 각각 191mg(수율 6.4%), 314.2mg(수율 10.5%), 332mg(수율 11.1%), 368.3mg(수율 12.3%) 수득하였다.
실시예 1. 시체 추출물의 세포 독성 및 항염증 효과 확인
(1) 세포 독성
시체 추출물의 치은섬유모세포(HGF-1, human gingival fibroblast)에 대한 세포 독성을 확인하기 위해, HGF-1 세포를 96웰 플레이트에 각 웰당 1X105개를 분주한 후, 12시간 동안 배양하였다. 그 후 1%(v/v) FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 2시간 동안 혈청 고갈(serum-starvation) 상태를 유지하였다. 2시간 후 상기 제조예 1에서 획득한 다양한 시체 추출물을 2시간 동안 처리한 다음, 1㎍/㎖의 LPS를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포 계수 키트-8(Cell counting Kit-8; CCK-8. Dojindo Inc.)을 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.
그 결과 도 1에 개시된 바와 같이, 25㎍/㎖ 이하의 처리 농도에서는 모든 추출물에서 세포 독성이 전혀 나타나지 않았다.
(2) 항염 효과 확인
항염증 효과는 HGF-1 세포에 LPS 및 시체 추출물 처리 후 IL-6 발현 변화를 통해 확인하였다. 구체적으로 HGF-1 세포를 48웰 플레이트에 각 웰당 2X105개로 분주한 후, 12시간 동안 배양하였고, 그 후 1%(v/v) FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 2시간 동안 혈청 고갈(serum-starvation) 상태를 유지하였다. 2시간 후 상기 제조예 1의 시체 추출물을 2시간 동안 처리한 다음, 1㎍/㎖의 LPS를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배양액을 수거한 다음 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 분석을 수행하여 염증 관련 사이토카인인 IL-6의 발현량을 측정하였다.
그 결과 도 2에 개시된 바와 같이, 본 발명의 시체 추출물은 LPS 처리에 의해 증가된 IL-6의 발현을 효과적으로 억제하였다.
실시예 2. 시체 추출물의 파골세포에 대한 세포 독성 및 분화 억제 효과 확인
파골세포는 불필요하게 된 뼈 조직을 파괴 및 흡수하는 다핵세포이다. 따라서 시체 추출물의 파골세포에 대한 세포 독성을 확인하고, 파골세포 특이마커인 TRAP 활성도를 평가하여 시체 추출물의 골 손실 억제 효과를 확인하였다.
(1) 세포 독성
마우스 골수세포를 60ng/㎖의 M-CSF(macrophage colony stimulating factor)와 10%(v/v) FBS를 함유한 α-MEM 배지에 3일 동안 배양하여 골수세포 유래 대식세포(bone marrow-derived macrophages, BMM)를 수득하였다. 상기 수득한 골수세포 유래 대식세포(BMM)를 M-CSF(60ng/㎖) 및 다양한 농도의 시체 추출물을 함유하는 배지에서 1일 동안 배양한 후, 세포 계수 키트-8(Cell counting Kit-8; CCK-8. Dojindo Inc.)을 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.
그 결과 도 3에 개시된 바와 같이, 시체 추출물은 100㎍/㎖ 농도까지 세포생존율에 영향을 주지 않았다.
(2) TRAP 활성도 평가
시체 추출물이 파골세포의 TRAP 활성도에 미치는 영향을 확인하기 위해, 60ng/㎖의 M-CSF(macrophage colony stimulating factor)와 10%(v/v) FBS를 함유한 α-MEM 배지에서 마우스 골수세포를 3일 동안 배양하여 골수세포 유래 대식세포(bone marrow-derived macrophages, BMM)를 수득하였다. 상기 수득한 골수세포 유래 대식세포(BMM)를 M-CSF(60ng/㎖) 및 RANKL(100ng/㎖)을 포함하는 배지에 4일 동안 배양하였고, 그 후 같은 배양조건에서 BMM에 시체 추출물을 다양한 농도로 각각 처리한 다음 4일 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 10%(v/v) 포르말린으로 고정하고, 나프톨 AS-MS 포스페이트 및 패스트 레드 바이올렛 LB 염(fast red violet LB salt)을 이용하여 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색을 실시하여 TRAP 활성과 연관되어 있는 핵이 3개 이상인 TRAP 양성 세포(파골세포, osteoclast)를 확인하였다.
그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 시체 추출물에 의해 농도 의존적으로 TRAP 활성도가 현저히 감소하는 것을 확인하여, 시체 추출물이 파골 세포로의 분화를 억제하는데 우수한 효과가 있다는 것을 확인하였다.
실시예 3. 시체 추출물의 항치주균 효과 확인
시체 추출물의 항균 효과를 확인하기 위하여, 공격적인(aggressive) 치주염 유발에 관여하는 대표적인 세균인 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 또는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 상기 제조예 1의 시체 추출물을 농도별로 처리하였고, 이후, 상기 균주의 생장 억제율을 확인하였다. 구체적으로, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 또는 포르피로모나스 진지발리스를 FBS 10%(v/v)와, 헤민(Hemin) 및 메나디온(Menadione)이 각각 1%(w/v) 함유된 TBS(Tryptic Soy broth)에 접종한 후, 37℃ 혐기챔버에서 배양하였다. 그 후, 균 배양액을 흡광도 600nm에서 0.1이 되도록 희석 후 배양액을 TSB에 10%(v/v) 접종하였다. 배양액을 U-타입 96웰에 분주 후, 시체 추출물을 농도별로 처리하여 37℃ 혐기챔버에서 24시간 동안 배양하고 흡광도 값(OD 600nm)을 측정하였다.
아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스에 대한 항균 효과를 확인한 결과, 도 5에 개시된 바와 같이, 시체 70%(v/v) 에탄올 추출물은 500㎍/㎖의 농도에서 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스에 대한 항균 효과가 나타났으며, 시체 30%(v/v) 에탄올 추출물은 250㎍/㎖의 농도에서 가장 항균 효과가 우수하였다. 또한, 시체 메탄올 추출물은 250㎍/㎖ 이상의 농도에서 항균 효과가 나타났으며, 500㎍/㎖에서 현저하였다.
또한, 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균 효과를 확인한 결과, 도 6에 개시된 바와 같이 시체 30%(v/v) 에탄올 추출물은 1000㎍/㎖의 농도에서 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균 효과가 나타났고, 시체 70%(v/v) 에탄올 추출물 및 시체 메탄올 추출물은 125㎍/㎖의 농도에서도 우수한 항균 효과를 나타냈다.
Claims (10)
- 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물의 추출 용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 치주질환은 치은염, 치주염, 치주염에 의한 치조골 파손 및 치주염에 의한 치조골 형성 장애 중 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 치주질환은 염증에 의한 것임을 특징으로 하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 치주질환은 치조골 손상에 의한 것임을 특징으로 하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 치주질환은 치주균에 의한 것임을 특징으로 하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 치주균은 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 및 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 개선용 구강 위생 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 구강 위생 조성물은 치약, 구강 세정제, 구강용 스프레이, 구강용 연고제, 구강용 패치 및 검으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 치주질환의 예방 또는 개선용 구강 위생 조성물.
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