KR20220163936A - 신경퇴행성 병태의 바이오마커로서 키나제 - Google Patents

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KR20220163936A
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KR
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neurodegenerative
kinase
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protein
signaling
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KR1020227026640A
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토마스 엔 체이스
캐슬린 클래런스-스미스
Original Assignee
체이스 테라퓨틱스 코포레이션
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Abstract

신호전달 키나제를 단독으로 또는 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태와 조합하여 사용하는 어세이는 a) 대상체로부터 생물학적 샘플, 예를 들어, 혈액 샘플을 제공하는 단계; b) 혈액 샘플로부터 뉴런 (예를 들어, 중추 신경계 ("CNS"))에서 유래된 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 농축하는 단계; c) 단리된 엑소솜의 표면으로부터 단백질을 제거하여 스크러빙된 엑소솜을 생성시키는 단계; d) 단리된 내부 내용물 중에서, (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는 (2) 복수의 상이한 신호전달 키나제를 포함하는 바이오마커 세트를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

신경퇴행성 병태의 바이오마커로서 키나제
관련 출원의 참조
본 출원은 2019년 12월 31일 출원된, 미국 가출원 제62/956,029호의 우선일의 이득을 청구하고, 이의 내용은 그들 전문이 본 명세서에 편입된다.
신경퇴행성 질환은 뉴런의 기능 상실 및 사멸을 포함한 뇌에서의 퇴행적 변화를 특징으로 한다. 신경퇴행성 질환은 제한없이, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증 및 루이 소체 치매를 포함한다.
다양한 신호전달 키나제가 신경퇴행성 질환에 연루되었다. 예를 들어, 하기 문헌들을 참조한다: Mehdi, S.J. et al., "Protein Kinases and Parkinson's Disease", Int J Mol Sci. 2016 Sep; 17(9): 1585 (doi: 10.3390/ijms17091585); Martin, L. et al., "Tau protein kinases: Involvement in Alzheimer's disease", Ageing Research Reviews, Volume 12, Issue 1, January 2013, Pages 289-309 (doi.org/10.1016/j.arr.2012.06.003); 및 Bowles, K. R. et al., "Kinase Signaling in Huntington's Disease", Journal of Huntington's Disease 3 (2014) 9-123 (DOI 10.3233/JHD-140106).
많은 신경퇴행성 질환은 단백질의 올리고머 형태의 이상 축적을 특징으로 한다. 이들 올리고머 형태는 뉴런 퇴화 및 사망의 원인이 된다고 여겨진다. 특히, 파킨슨병은 알파 시뉴클레인의 올리고머 형태의 축적을 특징으로 한다. 알파 시뉴클레인은 다른 단백질, 예컨대 타우 및 아밀로이드 베타와 공중합체를 형성하도록 응집될 수 있다는 것을 더욱 발견하였다.
도 1을 참조하면, 키나제에 대한 어세이는 하기 작업을 포함한다: 대상체로부터의 체액 샘플, 예컨대 혈액 또는 타액 샘플을 수득한다 (100). 혈액 샘플을 처리하여 혈액 분획, 예를 들어, 혈장 샘플을 제공할 수 있다. 혈액 샘플은 뉴런-유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜 (예를 들어, 뉴런 유래 엑소솜은 혈액 샘플로부터 단리됨)에 대해 농축된다 (110). 이것은 전체 엑소솜을 단리하는 제1 단계 (111), 및 전체 엑소솜으로부터 뉴런 유래 엑소솜을 농축하는 제2 단계 (112)를 포함하는, 2-단계 작업일 수 있다. 단리된 엑소솜은 그들 내부 내용물에 대해 농축된다 (120). 이것은 그들 표면에 부착된 단백질을 제거하도록 스크러빙 (scrubbing)하는 단계를 포함할 수 있다 (121). 엑소솜의 내부에 농축된 내용물이 분석을 위해 방출된다 (122). 분석은 샘플 중에서 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제, 및 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태 (예를 들어, 올리고머 알파 시뉴클레인)의 양, 또는 (2) 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각의 양 (예를 들어, 활성)으로부터 선택된 바이오마커를 측정하는 단계를 포함한다. 임의로, 신경퇴행성 단백질, 예를 들어, 단량체 α 시뉴클레인 및/또는 올리고머 α 시뉴클레인 및 타우 또는 아밀로이드 베타 중 하나 이상의 형태의 양이 또한 측정될 수 있다. 올리고머 형태와 조합하여, 키나제의 측정은 거짓 양성 분류를 감소시킬 수 있다.
이들 바이오마커의 측정은 특정 신경퇴행성 병태 (예를 들어, 시뉴클레인병증성 병태) 또는 이의 누적 중증도의 부재 또는 존재 또는 현재 진행 속도를 결정하거나, 또는 정상적인 양에 대해서 본 명세서에 기술된 하나 이상의 바이오마커 단백질의 양 또는 상대량을 변경시키는 약물의 효능을 결정하는 진단 검사에서 사용될 수 있다.
본 명세서는 특히, 신경퇴행성 병태, 예컨대 시뉴클레인병증성 병태, 아밀로이드병증성 병태, 타우병증 및 헌팅톤병, 및 이와 관련된 신경퇴행에 대한 바이오마커 프로파일을 개시한다. 일정 구현예에서, 바이오마커 프로파일은 적어도 하나의 신호전달 키나제를 포함하고, (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택될 수 있는 바이오마커 세트의 측정치를 포함한다. 바이오마커 프로파일은 신경퇴행성 단백질, 예컨대 알파-시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우 또는 헌팅틴의 하나 이상의 올리고머 형태의 측정치를 포함할 수 있다.
측정된 신호전달 키나제는 하나 또는 복수의 키나제일 수 있다. 그들은 동일한 신호전달 경로, 예컨대 mTOR 경로, 또는 상이한 신호전달 경로로부터 선택될 수 있다.
측정된 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 형태의 컬렉션, 예컨대 전체 올리고머 알파 시뉴클레인, 또는 개별 올리고머 형태, 예컨대 알파 시뉴클레인의 사량체, 또는 복수의 형태, 예컨대 알파 시뉴클레인 이량체, 삼량체 및 사량체일 수 있다. 신경퇴행성 단백질의 단량체 형태가 또한 측정될 수 있다. 그래서, 예를 들어, 바이오마커 프로파일은 (I) 적어도 하나의 올리고머 형태; (II) 복수의 올리고머 형태 (예를 들어, 패턴); (III) 적어도 하나의 올리고머 형태 및 적어도 하나의 단량체 형태; (IV) 복수의 올리고머 형태 및 적어도 하나의 단량체 형태; (V) 적어도 하나의 올리고머 형태 및 복수의 단량체 형태; 및 (VI) 복수의 올리고머 형태 및 복수의 단량체 형태로부터 선택되는 하나 또는 복수의 신경퇴행성 단백질 형태의 각각의 측정치를 포함할 수 있다.
또한 본 명세서는 신경퇴행성 병태, 예컨대 시뉴클레인병증성 병태, 아밀로이드병증성 병태, 타우병증성 병태, 및 헌팅톤병의 치료를 위한 약제를 개발하는 방법이 개시된다. 방법은 병태에 대한 후보 약제의 효과를 결정하기 위해 바이오마커 프로파일을 사용하는 단계를 포함한다. 바이오마커 프로파일은 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함하는 바이오마커 세트의 측정치를 포함한다. 바이오마커 단백질은 대상체의 혈액으로부터의, 예를 들어, 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜으로부터 정량될 수 있다.
일정 구현예에서, 단백질 종은 예를 들어, 혈액, 타액, 또는 소변으로부터 단리된, 이하 엑소솜이라고 하는, 뉴런 유래 세포외 소포체로부터 측정된다. 조사된 종은 엑소솜의 내부 구획, 예를 들어, 표면 단백질이 제거된 엑소솜으로부터 유래될 수 있다. 이러한 방식으로 측정된, 바이오마커 프로파일은 측정을 위한 비교적 단순하고 비침습적인 수단을 의미한다.
이와 같이, 신경퇴행성 병태에 대한 바이오마커 프로파일을 측정하기 위한 이 개시의 방법은 때때로 본 명세서에서 추정 신경보호제라고 지칭되는, 약물 후보의 신경보호 효능을 검사하기 위한 약물 개발에 유용하다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 방법은 키나제 활성의 후속 효과를 더 이해하고, 효과적인 치료 전략의 개발을 가속화시키는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 또한 임상 실험에 등록을 위한 대상체를 확인하고, 시뉴클레인병증성 병태의 진단, 예후, 진행 또는 발병 위험성을 결정하는데 유용하다. 또한 본 명세서는 본 개시의 방법을 통해서, 시뉴클레인병증성 병태와 연관된 신경퇴행을 갖거나 또는 그것이 발병될 위험성이 있는 것으로 결정된 대상체를 치료하는 신규 방법, 특히, 신경보호적 치료를 제공한다.
일 구현예에서 본 명세서는 a) 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해서 생물학적 샘플의 컬렉션 중 각각의 생물학적 샘플을 농축시키는 단계로서, (i) 생물학적 샘플의 컬렉션은 대상체의 코호트 중 대상체로부터 유래되고, 코호트는 (1) 복수의 상이한 질환 병기의 각각에서 신경퇴행성 병태로 진단된 복수의 대상체로서, 진단된 대상체의 각각은 추정 신경보호제를 투약받은 적이 있는 것인 복수의 대상체, 및/또는 (2) 생물학적 샘플이 추정 신경보호제의 투여 이전 및 다시 투여 동안, 및 임의로 투여 이후에 하나 이상의 시간에, 수집된 복수의 건강한 대조군 대상체를 포함하는 대상체를 포함하는 것인, 단계; b) 미세입자, 예를 들어, 엑소솜의 내부 구획으로부터 단백질 내용물을 단리하여, 바이오마커 샘플을 생성시키는 단계; c) 데이터세트를 생성시키기 위해서 바이오마커 샘플 중에서, 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는 (i) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는 (ii) 복수의 상이한 신호전달 키나제를 포함하는 것인, 단계; 및 d) (i) 질환 진행 속도 또는 추정 신경보호제에 대한 반응 정도를 예측하는 진단 알고리즘을 결정하도록 시간 경과에 따라 개별 대상체에서; 또는 (ii) (1) 병원성 진단을 하거나, (2) 임상적으로 유사하지만 병인학적으로 상이한 신경퇴행성 장애 서브그룹을 분리하거나, 또는 (3) 대상체가 추정 신경보호제에 반응할 가능성이 있는지 여부 또는 정도를 예측하는 진단 알고리즘을 결정하도록 상이한 대상체에서, 바이오마커 세트 내 차이를 비교하기 위해 데이터세트에 대한 통계 분석을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다. 일 구현예에서 방법은 농축 단계 이전에, I) 대상체의 코호트를 제공하는 단계로서, 코호트는 (i) 복수의 상이한 질환 병기의 각각에서 신경퇴행성 병태로 진단된 복수의 대상체, 및/또는 (ii) 복수의 건강한 대조군 대상체를 포함하는 대상체를 포함하는 것인 단계; II) 진단된 대상체의 각각에게 추정 신경보호제를 투여하는 단계; III) 추정 신경보호제의 투여 이전 및 다시 투여 동안, 및 임의로, 투여 후에, 하나 이상의 시간에, 코호트 중 대상체의 각각으로부터 생물학적 샘플을 수집하는 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제이다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20이다. 다른 구현예에서 방법은 e) 표준 임상 측정에 대한 진단 알고리즘 중 하나 이상을 검증하는 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서 통계 분석은 상관분석, 피어슨 상관계수, 스피어먼 상관계수, 카이-제곱 검정, 평균의 비교 (예를 들어, 대응 T-검정, 독립 T-검정, ANOVA) 회귀 분석 (예를 들어, 단순 회귀, 다중 회귀, 선형 회귀, 비-선형 회귀, 로지스틱 회귀, 다항 회귀, 단계적 회귀, 리지 (ridge) 회귀, 라쏘 (lasso) 회귀, 엘라스틱넷 회귀) 또는 비-모수적 분석 (예를 들어, 윌콕슨 (Wilcoxon) 순위-총합 검정, 윌콕슨 부호-순위 검정, 부호 검정)을 포함한다. 다른 구현예에서 통계 분석은 컴퓨터에 의해 실행된다. 다른 구현예에서 통계 분석은 기계 학습을 포함한다. 다른 구현예에서 대상체는 인간이다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 병태는 시뉴클레인병증 장애이다. 다른 구현예에서 시뉴클레인병증 장애는 파킨슨병이다. 다른 구현예에서 시뉴클레인병증 장애는 루이 소체 치매이다. 다른 구현예에서 표준 임상 측정은 UPDRS 점수, CGI 점수 및 방사선학적 소견으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 병태는 아밀로이드병증, 타우병증 또는 헌팅톤병이다. 다른 구현예에서 생물학적 샘플은 정맥 혈액 샘플을 포함한다. 다른 구현예에서 상이한 질환 병기는 의심, 초기, 중기, 및 임상적 후기 중 하나 이상을 포함한다. 다른 구현예에서 투여 동안 또는 투여 이후 시간은 치료 후 1개월, 2개월, 3개월, 또는 그 이상의 개월로부터 선택된다. 다른 구현예에서 농축 단계는 하나 이상의 뇌-특이적 단백질 마커를 사용하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서 뇌-특이적 마커 중 적어도 하나는 K1cam을 포함한다. 다른 구현예에서 단리 단계는 각각의 농축된 샘플 중 엑소솜을 세척하여 표면 막-결합된 단백질을 제거하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서 엑소솜은 PBS로 세척한다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질의 형태는 겔 전기영동, 웨스턴 블롯 또는 형광 기술을 통해 측정된다.
다른 양태에서 본 명세서는 a) 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해서 대상체로부터의 생물학적 샘플을 농축하는 단계; b) 미세입자, 예를 들어, 엑소솜의 내부 구획으로부터 단백질 내용물을 단리하여, 바이오마커 샘플을 생성시키는 단계; c) 데이터세트를 생성시키기 위해서 바이오마커 샘플 중에서, 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는 (2) 복수의 상이한 신호전달 키나제를 포함하는 것인, 단계; 및 d) 하기 중 하나를 수행하기 위해서 데이터세트를 사용하는 단계: (1) 병원성의 진단, (2) 복수의 임상적으로 유사하지만 병인학적으로 상이한 신경퇴행성 장애 서브그룹 중 하나로 대상체의 분류, 또는 (3) 대상체가 추정 신경보호제에 반응할 가능성이 있는지 여부 또는 정도의 예측. 다른 구현예에서 사용하는 단계는 데이터세트에 대해서 본 명세서에 기술된 바와 같은 진단 알고리즘을 실행하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제이다. 다른 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20이다. 다른 구현예에서 뉴런 유래 엑소솜을 단리하는 단계는 (i) 초-원심분리; (ii) 밀도 구배 원심분리; 또는 (iii) 크기 배제 크로마토그래피를 포함한다. 다른 구현예에서 뉴런 유래 엑소솜을 단리하는 단계는 뇌-특이적 단백질에 결합하는 결합 모이어티를 사용하여 뉴런 유래 엑소솜을 포획하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서 뇌-특이적 단백질은 L1CAM이다. 다른 구현예에서 단리된 엑소솜의 표면으로부터 단백질을 제거하는 단계는 단리된 엑소솜을 수성 용액 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수 ("PBS"))으로 세척하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질의 양을 결정하는 단계는 i) 올리고머 α-시뉴클레인의 종을 복수의 분획으로 분리하는 단계; ii) 하나 또는 복수의 분리된 올리고머 α-시뉴클레인 종의 각각, 및 임의로, 단량체 α-시뉴클레인, 타우-시뉴클레인 공중합체, 아밀로이드 베타-시뉴클레인 공중합체 및 타우-아밀로이드 베타-시뉴클레인 공중합체로부터 선택되는 하나 또는 복수의 종을 측정하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서 종을 복수의 분획으로 분리하는 단계는 전기영동을 통해 분리하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서 종을 복수의 분획으로 분리하는 단계는 크로마토그래피를 통해 분리하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서 분리된 종 중에서, 2 내지 약 100 단량체 단위, 4 내지 16 단량체 단위, 및 약 30 이하의 단량체 단위를 갖는 형태로부터 선택되는 α-시뉴클레인의 적어도 하나의 올리고머 형태를 결정한다. 다른 구현예에서 분리된 종 중에서, 단량체 α-시뉴클레인의 정량적 측정치를 결정한다. 다른 구현예에서 분리된 종 중에서, 복수의 상이한 올리고머 α-시뉴클레인 종을 측정한다. 다른 구현예에서 분리된 종 중에서 α-시뉴클레인 및 타우를 포함하는 공중합체를 측정한다. 다른 구현예에서 분리된 종 중에서, α-시뉴클레인 및 아밀로이드 베타를 포함하는 공중합체의 정량적 측정치를 결정한다. 다른 구현예에서 분리된 종을 측정하는 단계는 면역어세이를 통해서 하나 또는 복수의 분리된 종을 검출하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서 면역어세이는 면역블롯팅을 포함한다. 다른 구현예에서 면역어세이는 웨스턴 블롯을 포함한다. 다른 구현예에서 면역어세이는 직접 표지에 커플링된 항체를 사용한다. 다른 구현예에서 면역어세이는 간접 표지에 커플링된 항체를 사용한다. 다른 구현예에서 방법은 I) 추정 신경보호제의 투여 이전 및 이후에 대상체에서 바이오마커를 측정하는 단계; 및 II) 단백질의 양 또는 바이오마커의 패턴에서 변화를 결정하는 단계로서, 정상적인 양 또는 패턴 대비 변화는 신경보호제의 효능을 의미하는 것인 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서 방법은 2회의 상이한 시간에 대상체에서 바이오마커를 측정하는 단계; 및 단백질의 양 또는 바이오마커의 패턴에서 변화를 결정하는 단계로서, 변화는 신경퇴행성 상태의 변화를 의미하는 것인 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서 방법은 일정 시간 기간 동안 대상체로부터 복수의 생물학적 샘플을 수집하는 단계를 포함하고, 임의로 대상체는 일정 시간 기간 동안 추정 또는 기지 신경보호제를 투약받고, 진단 알고리즘은 질환 진행 속도 또는 추정 신경보호제에 대한 반응 정도를 예측한다.
다른 양태에서, 본 명세서는 a) 복수의 대상체 각각에 대한, (1) 신경퇴행성 병태의 상태, 및 (2) 바이오마커 세트의 측정치를 의미하는 값을 포함하는 데이터세트를 제공하는 단계로서, 바이오마커 세트는 (i) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는 (ii) 복수의 상이한 신호전달 키나제를 포함하는 것인 단계; 및 b) 개체에서 신경퇴행성 병태의 상태를 추론하는 모델을 개발하도록 데이터세트에 대해 통계 분석을 수행하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제이다. 다른 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20이다. 다른 구현예에서 통계 분석은 컴퓨터에 의해 수행된다. 다른 구현예에서 통계 분석은 컴퓨터에 의해 수행되지 않는다. 다른 구현예에서 통계 분석은 상관분석, 피어슨 상관계수, 스피어먼 상관계수, 카이-제곱 검정, 평균의 비교 (예를 들어, 대응 T-검정, 독립 T-검정, ANOVA) 회귀 분석 (예를 들어, 단순 회귀, 다중 회귀, 선형 회귀, 비-선형 회귀, 로지스틱 회귀, 다항 회귀, 단계적 회귀, 리지 회귀, 라쏘 회귀, 엘라스틱넷 회귀) 또는 비-모수적 분석 (예를 들어, 윌콕슨 순위-총합 검정, 윌콕슨 부호-순위 검정, 부호 검정)을 포함한다. 다른 구현예에서 통계 분석은 데이터세트에 대한 기계 학습 알고리즘을 훈련하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서 기계 학습 알고리즘은 인공 신경망 (예를 들어, 역전파 네트워크), 결정 트리 (예를 들어, 재귀 분할 과정, CART), 랜덤 포레스트, 판별 분석 (예를 들어, 베이지안 (Bayesian) 분류기 또는 피셔 (Fischer) 분석), 선형 분류기 (예를 들어, 다중 선형 회귀 (MLR), 부분 최소 제곱 (PLS) 회귀, 주성분 회귀 (PCR)), 혼합 또는 램덤-효과 모델, 비모수 분류기 (예를 들어, k-최근접 이웃), 서포트 벡터 머신, 및 앙상블 방법 (예를 들어, 배깅, 부스팅)으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 상태는 신경퇴행성 병태의 진단, 병기, 예후 또는 진행으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 상태는 범주형 변수 (예를 들어, 이진 상태 또는 복수의 범주형 상태 중 하나)로서 측정된다. 다른 구현예에서 범주는 신경퇴행성 병태를 갖는 것과 일치되는 진단 (예를 들어, 양성 또는 갖는다고 진단) 및 신경퇴행성 병태를 갖는 것과 불일치되는 진단 (예를 들어, 음성 또는 갖지 않는다고 진단)을 포함한다. 다른 구현예에서 범주는 신경퇴행성 병태의 상이한 병기를 포함한다. 다른 구현예에서 상태는 연속 변수 (예를 들어, 척도 상에서)로서 측정된다. 다른 구현예에서 연속 변수는 신경퇴행성 병태의 범위 또는 정도이다. 다른 구현예에서 대상체는 동물, 예를 들어, 어류, 조류, 양서류, 파충류, 또는 포유동물, 예를 들어, 설치류, 영장류 또는 인간이다. 다른 구현예에서 복수의 대상체는 10, 25, 50, 100, 200, 400 또는 800 중 적어도 어느 하나이다. 다른 구현예에서, 각 대상체에 대해서, 정량적 측정치가 결정된 샘플은 제1 시점에 채취되고 신경퇴행성 병태의 상태는 제2, 이후 시점에 결정된다. 다른 구현예에서 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈액 분획 (예를 들어, 혈장 또는 혈청)을 포함한다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 병태는 시뉴클레인병증, 예를 들어, 파킨슨병 또는 루이 소체 치매이다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 병태는 아밀로이드병증, 예를 들어, 알츠하이머병, 타우병증, 예를 들어, 알츠하이머병 또는 헌팅톤병이다.
다른 양태에서 본 명세서는 신경퇴행성 단백질을 특징으로 하는 신경퇴행성 병태의 발병 위험성, 진단, 병기, 예후, 또는 진행을 추론하는 방법을 제공하고, 방법은 a) 데이터세트를 생성시키기 위해서 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 농축된 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터, 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는 (2) 복수의 상이한 신호전달 키나제를 포함하는 것인 단계; 및 b) 신경퇴행성 병태의 발병 위험성, 진단, 병기, 예후, 또는 진행을 추론하기 위해서 데이터세트에 대해, 모델, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 모델을 실행하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제이다. 다른 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20이다. 다른 구현예에서 정량적 측정치가 결정된 신경퇴행성 단백질 형태는 (I) 적어도 하나의 올리고머 형태; (II) 복수의 올리고머 형태; (III) 적어도 하나의 올리고머 형태 및 적어도 하나의 단량체 형태; (IV) 복수의 올리고머 형태 및 적어도 하나의 단량체 형태; (V) 적어도 하나의 올리고머 형태 및 복수의 단량체 형태; 및 (VI) 복수의 올리고머 형태 및 복수의 단량체 형태로부터 선택된다. 다른 구현예에서 올리고머 형태 중 적어도 하나는 신경퇴행성 단백질의 종의 컬렉션을 포함한다. 다른 구현예에서 모델은 신경퇴행성 단백질의 단량체 형태에 대한 올리고머 형태의 상대량을 통계적으로 유의한 수의 대조군 개체에서의 상대량과 비교하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서 모델은 모델이 추론한 복수의 올리고머 형태의 상대량의 패턴을 검출하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서 대상체는 신경퇴행성 병태에 대해 무증상이거나 또는 전임상이다. 다른 구현예에서 대상체는 의료 제공자, 예컨대 의사에게, 통상의 사무실 방문 동안 또는 의사의 일상 진료의 일부로서 진찰을 받는다. 다른 구현예에서 모델은 컴퓨터에 의해 실행된다. 다른 구현예에서 모델은 컴퓨터에 의해 실행되지 않는다.
다른 양태에서 신경퇴행성 병태의 치료에서 치료 중재술의 유효성을 결정하기 위한 방법을 제공하고, 방법은 (a) (1) 데이터세트를 생성시키기 위해 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 농축된 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터, 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는 (i) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는 (ii) 복수의 상이한 신호전달 키나제를 포함하는 것인, 단계; 및 (2) 모델, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 모델을 사용하여 초기 상태를 추론하는 단계를 통해서, 복수의 대상체를 포함하는 집단의 각 대상체에서, 신경퇴행성 병태의 초기 상태를 추론하는 단계; (b) 추론 단계 이후에, 대상체에게 치료 중재술을 투여하는 단계; (c) 투여 단계 이후에, (1) 데이터세트를 생성시키기 위해 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 농축된 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는 (i) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는 (ii) 복수의 상이한 신호전달 키나제를 포함하는 것인 단계; 및 (2) 모델을 사용하여 후속 상태를 추론하는 단계를 통해서, 집단의 각 대상체 개체에서, 신경퇴행성 병태의 후속 상태를 추론하는 단계; 및 (d) 집단에서 초기 및 후속 추론을 기반으로, 후속 추론이 초기 추론과 비교하여 정상 상태를 향한 통계적으로 유의한 변화를 나타내면 치료 중재술이 유효하거나, 또는 후속 추론이 정상 상태를 향해 초기 추론과 비교하여 통계적으로 유의한 변화를 나타내지 않으면 치료 중재술이 유효하지 않다고 결정하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제이다. 다른 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20이다. 다른 구현예에서 치료 중재술은 약물 또는 약물의 병용물의 투여를 포함한다. 다른 구현예에서 집단은 적어도 20명, 적어도 50명, 적어도 100명 또는 적어도 200 대상체를 포함하고, 대상체의 적어도 20%, 적어도 35%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 초기에 단백질의 단량체 형태에 대한 단백질의 올리고머 형태의 상승된 상대량을 갖는다. 다른 구현예에서 대상체의 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 또는 적어도 35%, 적어도 50%, 적어도 66%, 적어도 80%, 또는 100% 는 초기에 신경퇴행성 병태의 진단을 받는다. 다른 구현예에서 추론은 컴퓨터에 의한다. 다른 구현예에서 추론은 컴퓨터에 의하지 않는다.
다른 양태에서 본 명세서는 신경퇴행성 병태의 치료 또는 예방을 위한 치료 중재술의 임상 시험을 위해 대상체를 한정하기 (qualifying) 위한 방법을 제공하고, 방법은 a) (1) 데이터세트를 생성시키기 위해 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 농축된 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터, 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는 (i) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는 (ii) 복수의 상이한 신호전달 키나제를 포함하는 것인 단계; (2) 대상체가 신경퇴행성 병태에 대해 비정상인 것을 추론하기 위해 프로파일에 대해, 모델, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 모델을 실행하는 단계에 의해서, 대상체가 신경퇴행성 병태에 대해 비정상임을 결정하는 단계; 및 b) 상기 신경퇴행성 병태에 대한 잠재적 치료 중재술의 임상 실험에 대상체를 등록시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제이다. 다른 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20이다. 다른 구현예에서 모델은 컴퓨터에 의해 실행된다. 다른 구현예에서 모델은 컴퓨터에 의해 실행되지 않는다.
다른 양태에서 본 명세서는 신경퇴행성 병태에 대한 치료 중재술 시에 대상체의 진행을 모니터링하는 방법을 제공하고, 방법은 (a) (1) 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 농축된 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터, 바이오마커 세트의 측정치를 결정하는 단계로서, 바이오마커 세트는 (i) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는 (ii) 복수의 상이한 신호전달 키나제를 포함하는 것인 단계; 및 (2) 초기 신경퇴행성 병태의 상태를 추론하기 위해, 모델, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 모델을 실행하는 단계를 통해서, 신경퇴행성 병태의 초기 상태를 대상체에서 추론하는 단계; (b) 추론 단계 이후에, 대상체에게 치료 중재술을 투여하는 단계; (c) 투여 단계 이후에, (1) 데이터세트를 생성시키기 위해, 뉴런 유래 마이크로솜 입자에 대해 농축된 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터, 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각의 양을 포함하는 바이오마커 프로파일을 결정하는 단계; 및 (2) 신경퇴행성 병태의 후속 상태를 추론하기 위해, 모델, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 모델을 실행하는 단계를 통해서, 신경퇴행성 병태의 후속 상태를 대상체에서 추론하는 단계; (d) 초기 및 후속 상태 추론을 기반으로, 후속 추론이 초기 추론과 비교하여 정상 상태를 향해 변화를 나타내면 대상체가 치료 중재술에 양성으로 반응하거나, 또는 후속 추론이 정상 상태를 향해 초기 추론과 비교하여 변화를 나타내지 않으면 치료 중재술이 유효하지 않다고 결정하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제이다. 다른 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20이다. 다른 구현예에서 모델은 컴퓨터에 의해 실행된다. 다른 구현예에서 모델은 컴퓨터에 의해 실행되지 않는다.
다른 양태에서 본 명세서는 (a) 대상체가 신경퇴행성 병태를 갖는다고 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법을 통해 결정하는 단계, 및 (b) 병태를 치료하는데 효과적인 완화적 또는 신경보호적 치료 중재술을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서 치료 중재술은 대상체의 바이오마커 프로파일을 정상을 향해 이동시키고, 정상을 향한 이동은 신경보호를 의미한다.
다른 양태에서 본 명세서는 병태를 치료하는데 효과적인 완화적 또는 신경보호적 치료 중재술을 바이오마커의 비정상적 패턴을 갖는 것으로 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법으로 결정된 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서 대상체는 신경퇴행성 병태에 무증상이거나 또는 전임상이다.
다른 양태에서 본 명세서는 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는 (2) 복수의 상이한 신호전달 키나제를 검출하기에 충분한 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 일 구현예에서 시약은 항체를 포함한다.
다른 양태에서 본 명세서는 신경퇴행성 병태의 발병 위험성, 진단, 병기, 예후, 또는 진행을 추론하는 방법을 제공하고, 방법은 a) 데이터세트를 생성시키기 위해, 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 농축된 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는 (2) 복수의 상이한 신호전달 키나제를 포함하는 것인 단계; 및 b) 신경퇴행성 병태의 발병 위험성, 진단, 병기, 예후, 또는 진행과 데이터세트를 상관짓는 단계를 포함한다. 일 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제이다. 다른 구현예에서 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20이다.
다른 양태에서 본 명세서는 (a) 신경퇴행성 병태를 갖거나 또는 신경퇴행성 병태에 대한 치료에 양성적으로 반응할 가능성이 있는 대상체를 확인하는 단계로서, 확인은 (1) 바이오마커 프로파일을 생성시키기 위해, 뉴런 유래 엑소솜 (예를 들어, 엑소솜의 내부 내용물 유래)에 대해 농축된 대상체로부터의 샘플에서, 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는 하나 또는 복수의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태를 포함하는 것인 단계; 및 (2) 비정상적 바이오마커 프로파일을 기반으로, 대상체가 신경퇴행성 병태를 앓는다고 결정하는 단계를 포함하는 것인 단계; 및 (b) 신경퇴행성 병태를 치료하기 위해 약학 조성물의 유효량을 확인된 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서 신경퇴행성 병태는 시뉴클레인병증성 병태이고, 약학 조성물은 도파민 효현제 (예를 들어, 프라미펙솔 (예를 들어, Mirapex™), 로피니롤 (예를 들어, Requip), 로티고틴 (예를 들어, Neupro), 아포모르핀 (예를 들어, Apokyn)), 레보도파, 카르비도파-레보도파 (예를 들어, Rytary, Sinemet), MAO-B 억제제 (예를 들어, 셀레길린 (예를 들어, Eldepryl, Zelapar) 또는 라사길린 (예를 들어, Azilect)), 카테콜-O-메틸트랜스퍼라제 (COMT) 억제제 (예를 들어, 엔타카폰 (Comtan) 또는 톨카폰 (Tasmar)), 항콜린제 (예를 들어, 벤즈트로핀 (예를 들어, Cogentin) 또는 트리헥시페니딜), 아만타딘 또는 콜린에스터라제 억제제 (예를 들어, 리바스티그민 (Exelon))를 포함한다. 다른 구현예에서 시뉴클레인병증성 병태는 파킨슨병이다. 다른 구현예에서 약학 조성물은 도파민 효현제를 포함한다. 다른 구현예에서 약학 조성물은 NK1-길항제를 더 포함한다. 다른 구현예에서 도파민 효현제는 6-프로필아미노-4,5,6,7-테트라히드로-1,3-벤조티아졸-2-아민이고 NK1-길항제는 아프레피탄트 또는 롤라피탄트이다. 다른 구현예에서 약학 조성물은 5HT3-길항제를 더 포함한다. 다른 구현예에서 도파민 효현제는 6-프로필아미노-4,5,6,7-테트라히드로-1,3-벤조티아졸-2-아민이고 5HT3 길항제는 온단세트론 히드로클로라이드 이수화물이다.
다른 양태에서 본 명세서는 신경퇴행성 병태를 의미하는 바이오마커 프로파일을 갖거나 또는 신경퇴행성 병태에 대한 치료에 양성적으로 반응할 가능성이 있는 것을 특징으로 하는 대상체에게, 신경퇴행성 병태를 치료하기 위한 약학 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 바이오마커 패널은 뉴런 유래 엑소솜 (예를 들어, 엑소솜의 내부 내용물 유래)에 대해 농축된 대상체로부터의 샘플로부터 측정되는 하나 또는 복수의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태를 포함하는 바이오마커 세트를 포함한다. 일 구현예에 따라서, 다른 구현예에서 신경퇴행성 병태는 파킨슨병이고, 약학 조성물은 도파민 효현제를 포함한다.
일정 구현예에서, 바이오마커는 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제 및, 임의로, 하나 또는 복수의 신경퇴행성 단백질의 각각의 하나 또는 복수의 단량체 및/또는 올리고머 형태로부터 선택된다.
본 개시의 다른 목적은 하기 명세서 및 청구항을 읽으면 당업자에게 자명해질 것이다.
본 개시의 신규 특성은 첨부된 청구항에 특히 기재된다. 본 개시의 특성 및 장점의 더 나은 이해는 본 개시의 원리를 이용하는 예시적인 구현예를 기재한 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조하여 수득될 것이다:
도 1 은 키나제 및, 임의로, 엑소솜 유래 신경퇴행성 단백질 형태를 검출하는 예시적인 방법의 흐름도를 도시한다.
도 2 는 약물 효능을 검증하기 위한 예시적인 프로토콜의 흐름도를 도시한다.
도 3 은 신경퇴행성 병태를 진단하기 위한 진단 모델을 창출하고 검증하는 예시적인 흐름도를 도시한다.
도 4 는 진단 알고리즘, 또는 모델을 바이오마커 프로파일에 대해 실행하여 임의의 몇가지 상태에 따라 대상체를 분류하기 위한 예시적인 흐름도를 도시한다.
I. 신경퇴행성 병태에 대한 바이오마커
본 명세서에 개시되는 방법은 다양한 신경퇴행성 병태의 진단 및 약물 개발에 유용하다. 이들은 제한없이, 시뉴클레인병증 (예를 들어, 파킨슨병, 루이 소체 치매, 다계통 위축증), 아밀로이드병증 (예를 들어, 알츠하이머병), 타우병증 (예를 들어, 알츠하이머병, 진행성 핵상 마비, 피질기저 퇴화), 및 헌팅톤병을 포함한다.
A. 바이오마커 및 바이오마커 프로파일
바이오마커는 특정 병태와 조합하여 또는 단독으로, 양성적으로 또는 음성적으로 연관된 피분석물이다. 바이오마커로서 기능할 수 있는 피분석물은 대상체 또는 대상체 샘플에서 검출가능한 임의의 생물학적 분자 또는 유기 또는 무기 분자를 포함한다. 바이오마커로서 제공될 수 있는 생물학적 분자는 제한없이, 예를 들어, 단백질 및 펩티드를 포함한, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "바이오마커 프로파일"은 하나 또는 복수의 바이오마커의 각각의 측정치를 의미하는 데이터를 의미한다. 본 명세서에 기술된 방법의 일정 구현예에서 사용되는 바이오마커 프로파일은 하나 또는 복수의 상이한 키나제의 활성의 측정치를 포함한다. 일정 구현예에서, 바이오마커 프로파일은 하나 이상의 신경퇴행성 단백질 형태의 측정치를 더 포함할 수 있다. 바이오마커 프로파일은 바이오마커에 대한 데이터를 포함하는 데이터세트의 형태이다.
용어 "바이오마커 프로파일"은 또한 모델이 신경퇴행성 병태의 진단, 병기, 진행, 속도, 예후, 약물 반응도 및 발병 위험성과 연관된 것으로 추론하는 프로파일 내 특정 패턴을 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
변수, 예컨대 키나제 활성의 측정은 숫자 및 단어의 임의 조합일 수 있다. 측정치는 명목 (예를 들어, 명칭 또는 범주), 서수 (예를 들어, 범주의 계층적 순서), 간격 (주문 구성원 간 거리), 비율 (의미있는 "0"과 비교된 간격), 또는 세트 내 사물 수를 세는 기수 측정을 포함하여, 임의 척도일 수 있다. 명목 척도 상에서 변수의 측정은 "건강한" 또는 "건강하지 않은", "나이 든" 또는 "어린", "형태 1" 또는 "형태 2", "대상체 1... 대상체 n" 등 같은 범주 또는 명칭을 의미한다. 서수 척도로 변수의 측정은 순위, 예컨대 "제1", "제2", "제3"; 또는 "가장 어린" 내지 "가장 나이 든", 또는 최대에서 최소의 순서를 생성한다. 비율 척도의 측정은 예를 들어, 사전 정의된 척도의 임의 측정치, 예컨대 질량, 신호 강도, 농도, 연령 등을 비롯하여 통계적 측정 예컨대 빈도, 평균, 중앙, 표준 편차, 또는 분위수를 포함한다. 비율 척도의 측정은 상대량 또는 정규화된 측정치일 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 바이오마커 프로파일은 제1 및 제2 신호전달 키나제의 상대량을 포함한다. 다른 구현예에서 바이오마커 프로파일은 2개 상이한 바이오마커 단백질의 양의 비율을 포함한다.
비정상적 프로파일 (예를 들어, 다양한 신호전달 키나제의 비정상적 절대량 또는 상대량)은 병리학적 활성 (또는 병원성 과정에 대한 특징적 신체 반응) 및 따라서 향후 임상 개시까지 시간 및 임상 진행의 후속 속도를 의미한다. 게다가, 바이오마커 프로파일의 정상으로의 복귀 (예를 들어, 신호전달 키나제 및/또는 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태의 절대량 또는 상대량의 감소)는 후보 신경보호 중재술의 효능을 반영한다. 따라서, 본 명세서에 기술된 바이오마커 프로파일은 그들 신경보호 효과에 대한 약물 후보의 효능을 결정하는데 유용하다. 실질적 문제로서, 그들은 시간 및 비용 둘 모두의 절감뿐만 아니라 이의 임상 징후보다는 병원성 과정에 대한 효능 정량의 결정적 수단의 관점에서 신경보호 약물 시험의 실제 수행에 필수적인 것으로 간주될 수 있다.
따라서, 바이오마커 프로파일은 현존하는 병리학적 상태의 진단뿐만 아니라 예를 들어 대상체가 증상전 또는 전임상, 예를 들어, 질환 진단에 불충분한 징후 또는 증상을 가질 때, 임상 발병 전 병리의 감시자로서 기능한다. 이것은 신경보호적 치료의 상대적 성공이 종종 그들의 가장 빠른 가능한 투여와 관련된 것으로 나타나기 때문에 관련있다. 또한, 이들 바이오마커 프로파일이 신경퇴행성 병태의 병기 (예를 들어, 뉴런 상실의 속도 또는 누적량)를 의미한다고 여겨진다. 따라서, 바이오마커 프로파일의 결정은 예를 들어, 임상 시험에서, 치료의 유효성을 결정하고, 개체에서 예를 들어, 시뉴클레인병증, 아밀로이드병증, 타우병증 또는 헌팅톤병을 포함한 신경퇴행을 치료하는데 유효한 것으로 여겨지는 치료 중재술에 매우 중요할 수 있다.
B. 신호전달 키나제
이들 질환은 특정 신호전달 키나제의 활성의 비정상적인 변화 (증가 또는 감소)를 특징으로 한다. 대상체에서 이들 신호전달 키나제의 활성 측정은 진단, 예후, 환자 진행, 환자 계층화 및 약물 개발 및 시험에 사용될 수 있다.
키나제는 신호전달 경로에 관여되는 임의 키나제를 포함한다.
파킨슨병의 증상에 영향을 미치는 약물 (예를 들어, 프라미펙솔 (6-프로필아미노-4,5,6,7-테트라히드로-1,3-벤조티아졸-2-아민))의 투여 또는 파킨슨병과 연관된 키나제는 제한없이, mTOR (mechanistic target of rapamycin), 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린 류신-풍부 반복부 키나제 2 (LRRK2), c-Jun N-말단 키나제 신호전달 경로 (JNK)의 구성원 (MAPK 세린-트레오닌 키나제), 및 포스파타제 및 텐신 상동체 (PTEN)-유도 추정 키나제 1 (PINK1)을 포함한다.
알츠하이머병와 연관된 키나제는 제한없이, 타우 단백질 키나제 예컨대 프롤린-지정 단백질 키나제 (PDPK), 단백질 키나제 비-PDPK 및 티로신 단백질 키나제 (TPK)를 포함한다.
헌팅톤병과 연관된 키나제는 제한없이, 미토겐-활성화된 단백질 키나제, MEK, ERK, JNK, IKK, 세포 분열 단백질 키나제 5 (CDK5), AKT, MKP1을 포함한다.
이들 질환은 또한 독성 올리고머 폴리펩티드 종, 및 일부 경우에 비정상적 인산화 올리고머 또는 단량체 형태의 축적, 및 뉴런 유래 엑소솜에서 이러한 형태를 검출하는 능력을 공통으로 공유한다.
C. 신경퇴행성 단백질
본 명세서에서 사용되는 용어 "신경퇴행성 단백질"은 올리고머화된 형태로, 신경퇴행과 연관된 단백질을 의미한다. 신경퇴행성 단백질은 제한없이, 알파-시뉴클레인, 타우, 아밀로이드 베타 및 헌팅틴을 포함한다.
뇌 폴리펩티드의 일정 올리고머화된 형태 또는 비정상적 인산화 형태는 다양한 신경퇴행성 병태의 근간이 된다고 여겨진다. 이것은 예를 들어, 시뉴클레인병증성 병태에서 알파-시뉴클레인, 아밀로이드병증성 병태에서 아밀로이드 베타, 타우병증성 병태에서 타우 및 헌팅톤병에서 헌팅틴의 역할을 포함한다. 특히, 현재 증거는 α-시뉴클레인 올리고머가 PD 및 다른 시뉴클레인병증에서 독성 종으로서 작용할 수 있다는 것을 시사한다. 일정 구현예에서, 검출된 올리고머 종은 비정상적 인산화 종이다.
신경퇴행성 단백질의 형태는 제한없이, (I) 적어도 하나의 올리고머 형태; (II) 조합된 복수의 올리고머 형태 (예를 들어, 모든 올리고머 형태 또는 함께 측정된 올리고머 형태의 서브세트, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-14), (III) 각각의 복수의 상이한 올리고머 형태; (IV) 적어도 하나의 올리고머 형태 및 적어도 하나의 단량체 형태; (V) 복수의 올리고머 형태 및 적어도 하나의 단량체 형태; 및 (VI) 적어도 하나의 올리고머 형태 및 복수의 단량체 형태를 포함한다. 신경퇴행성 단백질의 형태는 특히, 신경퇴행성 병태 또는 신경퇴행성 병태로의 진행을 추론하기 위한 모델에서 사용될 수 있는데, 전형적으로 모델에 포함된 하나 이상의 올리고머 형태는 질환의 존재 및 활성 또는 질환으로의 진행을 의미한다. 이것은 시뉴클레인병증의 존재 및 활성, 또는 시뉴클레인병증으로의 진행을 의미하는 올리고머 알파-시뉴클레인 형태의 상대량 증가; 아밀로이드병증의 존재 및 활성, 또는 아밀로이드병증으로의 진행을 의미하는 올리고머 아밀로이드 베타의 상대량 증가, 타우병증의 존재 및 활성, 또는 타우병증으로의 진행을 의미하는 올리고머 또는 비정상적 인산화 타우의 상대량 증가, 및 헌팅톤병의 존재 및 활성, 또는 현팅톤병으로의 진행을 의미하는 올리고머 헌팅틴의 상대량 증가를 포함한다. 따라서, 이러한 올리고머의 비정상적 프로파일은 신경퇴행의 과정을 의미한다.
신경퇴행성 단백질 형태는 하나 이상의 올리고머 형태 및, 임의로, 하나 이상의 단량체 형태를 포함할 수 있다. 이것은 올리고머 및, 임의로, 단량체 알파-시뉴클레인; 올리고머 및, 임의로, 단량체 아밀로이드 베타, 올리고머 및, 임의로 과인산화 및, 임의로, 단량체 타우; 및 올리고머 및, 임의로, 단량체 헌팅틴의 종의 양을 포함한다. 예를 들어, 바이오마커 프로파일은 (I) 적어도 하나의 올리고머 형태; (II) 복수의 올리고머 형태; (III) 적어도 하나의 올리고머 형태 및 적어도 하나의 단량체 형태; (IV) 복수의 올리고머 형태 및 적어도 하나의 단량체 형태; (V) 적어도 하나의 올리고머 형태 및 복수의 단량체 형태; 및 (VI) 복수의 올리고머 형태 및 복수의 단량체 형태를 포함할 수 있다.
단백질 형태는 개별 단백질 종 또는 종의 컬렉션을 의미할 수 있다. 예를 들어, 알파-시뉴클레인의 6량체는 알파 백스페이스-시뉴클레인의 형태이다. 또한, 알파-시뉴클레인의 6량체 내지 18량체의 컬렉션은 집합적으로 알파-시뉴클레인의 형태일 수 있다.
바이오마커 프로파일은 단백질의 복수의 형태를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 바이오마커 프로파일은 복수의 올리고머 형태의 각각 및 신경퇴행성 단백질의 단량체 형태의 정량적 측정치를 포함할 수 있다. 그래서, 예를 들어, 바이오마커 프로파일은 이량체, 삼량체, 사량체, 5량체, 6량체, 7량체, 8량체, 9량체, 10량체, 11량체, 12량체, 13량체, 14량체, 15량체, 16량체, 19량체, 20량체, 24량체, 50량체 등의 각각의 정량적 측정치를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "시뉴클레인 바이오마커 프로파일"은 올리고머 및, 임의로, 단량체 알파-시뉴클레인을 포함하는 프로파일을 의미하고, 용어 "아밀로이드 바이오마커 프로파일"은 올리고머 및, 임의로, 단량체 베타-아밀로이드를 포함하는 프로파일을 의미하고, 용어 "타우 바이오마커 프로파일"은 올리고머 및, 임의로, 단량체 타우를 포함하는 프로파일을 의미하고, 용어 "헌팅틴 바이오마커 프로파일"은 올리고머 및, 임의로, 단량체 헌팅틴을 포함하는 프로파일을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단량체 단백질/폴리펩티드"는 이의 임의 종, 예컨대 인산화 종을 포함한, 단일, 비응집 단백질 또는 폴리펩티드 분자를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고머 단백질/폴리펩티드"는 인산화 종을 포함한, 개별 올리고머 종 또는 복수의 올리고머 종을 포함한 응집체를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는, 단백질의 올리고머 형태의 측정은 모든 올리고머 형태 (전체 올리고머 형태) 또는 특정한 올리고머 형태의 측정을 의미할 수 있다는 것을 의미한다. 특정한 올리고머 형태는 예를 들어, 특정 크기 범위 또는 물리적 상태 내의 형태 예컨대 예를 들어 가용성 원섬유를 포함할 수 있다.
각각의 이들 조건에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 올리고머화/응집화 형태는 이들 폴리펩티드의 올리고머 형태 및, 임의로, 단량체 형태를 포함하는 바이오마커 프로파일이 모델에서 병리적 활성을 추론하는 기능을 한다는 점에서 뉴런에 독성이라고 여겨진다. 특히, 단량체 형태와 비교하여 올리고머 형태의 증가된 상대량은 병리학을 의미한다. 이들 바이오마커의 측정치는 존재하거나 또는 개발 중인 요법에 대한 대상체 반응을 추적할뿐만 아니라 질환의 발병 또는 현존 질환의 상태 또는 진행을 추적하는데 사용될 수 있다.
II. 신경퇴행성 병태 및 연관 단백질
A. 시뉴클레인병증
1. 병태
본 명세서에서 사용되는 용어 "시뉴클레인병증" 및 "시뉴클레인병증성 병태"는 알파-시뉴클레인의 비정상적인 응집된 형태인, 올리고머 알파-시뉴클레인의 비정상적 프로파일을 특징으로 하는 병태를 의미한다. 일정 구현예에서, 시뉴클레인병증은 임상적으로 분명한 시뉴클레인병증 질환 예컨대, 예를 들어, PD, 루이 소체 치매, 다계통 위축증 및 일부 형태의 알츠하이머병뿐만 아니라, 다른 희귀 신경퇴행성 장애 예컨대 다양한 신경축삭 이영양증으로서 나타난다. 시뉴클레인병증 질환의 임상 진단에 충분한 징후, 및 임의로 증상은 이러한 임상 진단을 하도록 이러한 병태를 진단하는 당업자에게 일반적으로 충분하다.
파킨슨병 ("PD")은 60세 이상의 성인 집단에서 1% 내지 2%의 유병률을 갖는 중추 신경계 (CNS)의 진행성 장애이다. PD는 떨림, 강직, 자세 불안정성 및 자발적 움직임의 둔화를 포함한, 운동 증상을 특징으로 한다. 전체 PD 사례의 90% 초과를 구성하는, 질환의 특발성 형태의 원인은 여전히 불분명하지만, 이제 환경적 및 유전적 요인 둘 모두를 포함하는 것으로 간주된다. 운동 증상은 흑질에서 도파민-생산 뉴런의 점진적 퇴행과 분명하게 관련된다. 보다 최근에, PD는 기저핵 (예를 들어, PD), 또는 대뇌 피질 (예를 들어, 루이 소체 치매), 또는 기저핵, 뇌간 및 척수 (예를 들어, 다계통 위축증)에 주로 영향을 미치고, 알파-시뉴클레인이라고 하는 뇌 단백질로 주로 이루어진 세포내 침착물 (루이 소체)의 존재와 모두 연관된 다계통 장애의 그룹 중 하나로 인식되었다. 따라서, 이들 장애는 할러보덴-스파츠 증후군, 신경축삭 이영양증, 및 외상성 뇌손상과 함께, 종종 "시뉴클레인병증"이라고 한다.
PD의 징후 및 증상은 예를 들어, 휴식 시 떨림, 강직, 운동완서, 자세 불안정 및 파킨슨병성 가속보행을 포함할 수 있다. PD의 한 증상은 카르비도파-레보도파에 대한 이들 운동 기능장애에서의 양성 반응이다.
파킨슨병의 임상적으로 인식되는 병기는 다음을 포함한다: 병기 1 - 경증; 병기 2 - 중등도; 병기 3 - 중간 병기; 병기 4-중증; 병기 5 - 후기.
프라미펙솔 (상표명 Mirapex™ 하에 판매)은 특발성 파킨슨증을 치료할 수 있는 약물이다. 프라미펙솔은 세포외 신호-조절 키나제 (ERK) 효현제로서 활성을 갖는다. 따라서, 키나제 활성에 대한 프라미펙솔, 및 다른 키나제 조절제의 효과의 결정은 파킨슨병에 대한 약물의 유효성 결정에 유용하다.
현재, PD의 진단은 수정된 Hoehn 및 Yahr 병기결정 척도 (Hoehn and Yahr, 1967, Neurology, 17:5, 427-442) 및 통합 파킨슨병 등급 척도 (Unified Parkinson's Disease Rating Scale) (UPDRS)의 사용을 통해서 종종 정량화되는 신체 검사의 결과에 주로 의존한다. PD 대 파킨슨증의 다른 형태, 예를 들어, 진행성 핵상 마비 (PSP)의 감별 진단은 어려운 것으로 증명될 수 있고 따라서 환자의 최대 25%에서 오진이 일어날 수 있다. 게다가, PD는 일반적으로 초기 임상 진단이 내려지기 전에 수년 동안 미검출된 채로 남을 수 있다. 이런 일이 일어난 경우, 흑질에서 도파민 뉴런의 상실은 이미 50%를 초과하고 70%에 접근할 수 있다. PD 또는 임의의 관련 시뉴클레인병증에 대한 혈액 검사는 아직 검증되지 않았다. 양전자 방출 단층촬영 (PET) 또는 MRI를 사용한 영상 연구가 신경퇴행성 과정의 위치 및 정도에 관한 정보를 제공하여 PD의 진단에서 사용되어 왔지만, 관찰된 퇴행의 발병기전에 대한 정보는 거의 또는 전혀 제공하지 않고, 특정 시뉴클레인병증-특이적 중재술의 선택에 지침을 주지 못한다.
루이 소체 치매 (LBD)는 미국에서 약 130만명에서 발병된다. 증상은 예를 들어, 치매, 인지 변동, 파킨슨병, 수면 장애 및 환각을 포함한다. 알츠하이머병에 이어서 치매의 두번째로 흔한 형태이고 일반적으로 50세 이후에 발병된다. 파킨슨병과 마찬가지로, LBD는 뇌에서 알파-시뉴클레인의 비정상적인 침착을 특징으로 한다.
다계통 위축증 (MSA)은 파킨슨병 유형 및 소뇌 유형의 2개 유형으로 분류된다. 파킨슨병 유형은 예를 들어, PD의 파킨슨병 증상을 특징으로 한다. 소뇌 유형은 예를 들어, 운동 및 조정 손상, 구음 장애, 시각 장애 및 연하곤란을 특징으로 한다. MSA 증상은 뇌의 손상된 영역, 특히 흑질, 선조체, 하부 올리브핵, 및 소뇌에서 세포 상실 및 신경교증 또는 성상세포의 증식을 반영한다. 비정상적 알파-시뉴클레인 침착이 특징적이다.
PD 및 다른 시뉴클레인병증에 대한 진단 오류율은 효과적인 질환 변경 요법, 예컨대 신경보호 요법의 도입과 함께 중요해질 수 있는 상황인, 특히 그들 초기 병기에서 상대적으로 높을 수 있다.
2. 알파-시뉴클레인
알파-시뉴클레인은 인간 뇌에서 발견되는 단백질이다. 인간 알파-시뉴클레인 단백질은 140 아미노산으로 구성되고 SNCA 유전자 (PARK1이라고도 함)에 의해 코딩된다 (알파-시뉴클레인: 유전자 ID: 6622; Homo sapiens; Cytogenetic Location: 4q22.1).
본 명세서에서 사용되는 용어 "알파-시뉴클레인"은 정상 (비변형) 종을 비롯하여 변형된 종을 포함한다. 알파-시뉴클레인은 단량체 또는 응집 형태로 존재할 수 있다. 알파-시뉴클레인 단량체는 올리고머로 비정상적으로 응집될 수 있고, 올리고머 알파-시뉴클레인은 원섬유로 응집될 수 있다. 원섬유는 더욱 응집되어서 루이 소체라고 하는 세포내 침착물을 형성할 수 있다. 단량체 알파-시뉴클레인 및 이의 다양한 올리고머는 평형 상태로 존재한다고 여겨진다. 뇌에서 알파-시뉴클레인 처리는 또한 세린 129에서 인산화된 알파-시뉴클레인 ("p129 알파-시뉴클레인")을 생산한다.
알파-시뉴클레인은 인간 중추 신경계 (CNS)에서 풍부하게 발현되고 다양한 다른 장기에서는 더 적은 정도로 발현된다. 뇌에서, 알파-시뉴클레인은 주로 신경 말단, 특히 대뇌 피질, 해마, 흑질 및 소뇌에서 발견되고, 신경전달물질 방출 조절에 기여한다. 정상 상황 하에서, 이러한 가용성 단량체 단백질은 응집에 저항하는 안정하게 폴딩된 사량체를 형성하는 경향이 있다. 그러나, 특정 병리학적 조건에서, 알 수 없는 이유로, 알파-시뉴클레인은 비정상적으로 베타 플리트, 미스폴딩, 올리고머화, 및 응집되어서 궁극적으로 고도의 세포독성 중간체를 산출할 수 있는 대사 경로인 원섬유를 형성한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단량체 알파-시뉴클레인"은 이의 임의 종을 포함하여, 단일, 비응집 알파-시뉴클레인 분자를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고머 알파-시뉴클레인"은 복수의 알파-시뉴클레인 단백질 분자를 포함하는 응집체를 의미한다. 이것은 전체 올리고머 알파-시뉴클레인 및 이의 형태 또는 선택된 종을 포함한다. 올리고머 알파-시뉴클레인은 프로토원섬유 형태까지 적어도 2개 단량체 단위를 갖는 형태를 포함한다. 이것은 예를 들어, 2 내지 약 100 단량체 단위, 예를 들어, 4 내지 16 단량체 단위 또는 적어도 2, 3, 4 또는 5 다스의 단량체 단위를 갖는 올리고머 형태를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "비교적 저중량 시뉴클레인 올리고머"는 30 이하의 단량체 단위를 포함하는 시뉴클레인 올리고머 (30량체)를 의미한다. 전형적으로, 비교적 저중량 시뉴클레인 올리고머는 가용성이다. 일정 구현예에서, 알파-시뉴클레인은 특정 검출 방법을 통해서 검출되는 형태 또는 형태들을 의미한다. 예를 들어 형태들은 알파-시뉴클레인의 특정 단량체 또는 올리고머 형태에 대해 생성된 항체로 검출가능한 것들일 수 있다.
올리고머화된 형태로 비정상적으로 처리된 알파-시뉴클레인의 신경독성 잠재성은 이제 상기 언급된 병리학적 병태, 특히 PD, 루이 소체 치매, 다계통 위축증, 및 몇몇 다른 장애의 증상의 발병 및 후속 진행의 원인이 되는 것으로 여겨진다. 이들은 일반적으로 그 일부가 독성을 나타내고 상기 언급된 장애의 발병기전의 원인이 될 수 있는 비정상적인 알파-시뉴클레인 응집체의 세포내 축적을 부분적으로 특징으로 하는 신경퇴행성 장애의 그룹으로서 정의된다. 산화 스트레스, 미토콘드리아 손상, 및 기공 형성같은 요인들의 역할은 제안된 바 있지만, 정확히 알파-시뉴클레인의 일정 올리고머화된 형태가 어떻게 신경퇴행을 야기할 수 있는가는 아직 알려지지 않았다. 그럼에도 불구하고, 이제 많은 이들은 알파-시뉴클레인 올리고머화 및 응집을 초래하는 과정이 이들 장애에서 발생되는 세포 손상 및 파괴에 핵심적일 수 있다고 여겨진다.
일부 연구들은 프리원섬유 시뉴클레인 올리고머 및 프로토원섬유가 특히 신경독성을 부여하는 경향이 있다는 것을 보여주었다 (Loov et al., "α-Synuclein in Extracellular Vesicles: Functional Implications and Diagnostic Opportunities", M. Cell Mol Neurobiol. 2016 Apr;36(3):437-48. doi: 10.1007/s10571-015-0317-0). 다른 이들은 더 낮은 차수의 올리고머 시뉴클레인 종이 일차적으로 원인이 될 수 있다고 제안하지만, 단일 또는 다수 병리학적 기전을 통해 협력하여 또는 단독으로 작용하는, 정확히 어떠한 시뉴클레인 종, 또는 상이한 베타-시트 배열과 종의 어떠한 앙상블이 PD 또는 임의의 관련 시뉴클레인병증에서 가장 신경독성인지는 여전히 거의 확실하지 않은 채로 남아있다 (Wong et al., "α-synuclein toxicity in neurodegeneration: mechanism and therapeutic strategies", Nat Med. 2017 Feb 7;23(2):1-13. doi: 10.1038/nm.4269).
일정한 이의 대사 생산물과 함께, 세포내 시뉴클레인의 일부분이 엑소솜 소포체 내에 포장되고 뇌의 세포내 액으로 방출되어서 뇌척수액 (CSF) 및 말초 혈액 순환으로 통과된다. 알파-시뉴클레인은 인간 뇌에 존재하는 단백질이다. 인간 알파-시뉴클레인 단백질은 140 아미노산으로 구성되고 SNCA 유전자 (PARK1이라고도 함)에 의해 코딩된다 (알파-시뉴클레인: 유전자 ID: 6622; Homo sapiens; Cytogenetic Location: 4q22.1.).
B. 아밀로이드병증
1. 병태
본 명세서에서 사용되는 용어 "아밀로이드병증"은 뇌에 아밀로이드 중합체의 축적을 특징으로 하는 병태를 의미한다. 아밀로이드병증은 제한없이, 알츠하이머병 및 일정 다른 신경퇴행성 장애 예컨대 후기 병기 PD를 포함한다. 알츠하이머병은 치매의 가장 우세한 형태이다. 이것은 해부학적 수준에서 신경원섬유 매듭을 비롯하여, 베타-아밀로이드의 응집된 형태로 만들어진 아밀로이드 플라크의 축적을 특징으로 한다. 진행성 기억 상실, 인지 저하 및 신경행동 변화가 특징적인 증상이다. 알츠하이머는 진행성이고 현재 질환을 중단시키거나 또는 반전시키는 알려진 방법은 없다.
2.아밀로이드 베타
아밀로이드 베타 (아밀로이드-β, Aβ, A-베타 및 베타-아밀로이드라고도 함)는 아밀로이드 전구체 단백질의 펩티드 단편이다. 아밀로이드 베타는 전형적으로 36 내지 43 아미노산을 갖는다. 아밀로이드 베타는 응집되어서 몇몇 형태로 존재할 수도 있는 가용성 올리고머를 형성한다. 아밀로이드 베타의 미스폴딩된 올리고머가 다른 아밀로이드 베타 분자가 미스-폴딩된 올리고머 형태를 취하게 한다고 여겨진다. A-베타1-42 는 아미노산 서열: DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA [SEQ ID NO: 1]을 갖는다.
알츠하이머병에서, 아밀로이드-β 및 타우 단백질은 올리고머화되어 뇌 조직에 축적되고 여기서 그들은 뉴런 손상 및 상실을 야기하는 것으로 보이며; 실제로, 일부는 이러한 가용성 응집 중간체, 또는 올리고머가 독성을 매개하고 질환에서 파종 및 확산의 근간이 되는 핵심 종이라고 주장한다 (The Amyloid-β Oligomer Hypothesis: Beginning of the Third Decade. Cline EN, Bicca MA, Viola KL, Klein WL. J Alzheimers Dis. 2018;64(s1):S567-S610; "Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer's and Parkinson's diseases" Choi ML, Gandhi S. FEBS J. 2018 Jun 20). 아밀로이드 β 올리고머는 AD의 발병 및 진행에서 핵심적이고, 아마도 가장 직접적인 바이오마커인, 인기 약물 표적을 대표한다. 타우 단백질도 역시 비정상적으로 과인산화될 수 있다.
A-베타의 단량체 및 올리고머 형태를 정량하는데 현재 사용되는 방법은 효소 연결 면역흡착 어세이 (ELISA), 단일 올리고머 검출 방법, 및 주로 바이오센서-기반 방법 등이 포함된다 ("Methods for the Specific Detection and Quantitation of Amyloid-β Oligomers in Cerebrospinal Fluid", Schuster J, Funke SA. J Alzheimers Dis. 2016 May 7;53(1):53-67).
표면-기반 형광 강도 분포 분석 (sFIDA)은 고도로 특이적이고 민감한 올리고머 정량뿐만 아니라 단량체에 대한 총 둔감성 둘 모두를 특징으로 한다 ("Advancements of the sFIDA method for oligomer-based diagnostics of neurodegenerative diseases", Kulawik A. et al., FEBS Lett. 2018 Feb;592(4):516-534).
C. 타우병증
1. 병태
본 명세서에서 사용되는 용어 "타우병증"은 신경퇴행과 연관된 축적 및 응집을 특징으로 하는 병태를 의미한다. 타우병증은 제한없이, 알츠하이머병 ("AD"), 진행성 핵상 마비, 피질기저 퇴화, 염색체 17 관련된 파킨슨병 동반 전두측두엽 치매, 및 피크병을 포함한다.
AD는 또한 두번째 병리학적 특징인, 신경원섬유 매듭 (NFT)을 특징으로 한다. NFT는 NFT 형성 과정을 뉴런 손상 및 뇌 기능이상과 연결시키는, 뉴런 손상과 해부학적으로 연관된다. NFT의 주요 성분은 마이크로튜불-연관 단백질인, 타우의 과인산화된 형태이다. NFT 형성 동안, 타우는 타우 올리고머를 포함한, 다양한 상이한 응집 종을 형성한다. 증가하는 증거는 타우 올리고머 형성이 신경원섬유 매듭의 출현에 선행하고 중요하게 신경 뉴런 상실의 원인이 된다고 시사한다 (J Alzheimers Dis. 2013;37(3):565-8 "Tauopathies and tau oligomers" Takashima A).
비원섬유, 가용성 다량체는 섬유형 타우로 구성된 신경원섬유 매듭에 비해 더 독성으로 나타난다.
전두측두엽 치매에서, 전체 길이 TAR DNA 결합 단백질 ("TDP-43")은 전두뇌 영역에 축적되는 독성 아밀로이드 올리고머를 형성한다. 근위축성 측삭 경화증 (ALS)을 또한 포함하는, TDP-43 단백질병증은 폴리유비퀴틴화 및 과인산화 전체 길이 및 절두된 TDP-43에 의해 형성된 봉입체를 특징으로 한다. 재조합 전체 길이 인간 TDP-43은 항-아밀로이드 올리고머-특이적 항체와 공통 에피토프를 공유하는 구조적으로 안정한, 구형 올리고머를 형성한다. TDP-43 올리고머는 시험관 내 및 생체내 둘 모두에서 신경독성인 것으로 확인되었다 (Nat Commun. 2014 Sep 12;5:4824. Full-length TDP-43 forms toxic amyloid oligomers that are present in frontotemporal lobar dementia-TDP patients). TDP-43 올리고머의 존재 및 풍부도의 결정은 FTLD-TDP의 상이한 아형 중에서 TDP-O라고 하는 특이적 TDP-43 아밀로이드 올리고머 항체를 사용해 수행될 수 있다 ("Detection of TDP-43 oligomers in frontotemporal lobar degeneration-TDP" Kao PF, Ann Neurol. 2015 Aug;78(2):211-21).
2. 타우
타우는 가장 긴 타우 이소폼 상에 79 잠재적 세린 (Ser) 및 트레오닌 (Thr) 인산화 부위를 갖는 인단백질이다. 타우는 그들의 결합 도메인 개수로 구별되는, 6개 이소폼으로 존재한다. 3개 이소폼은 3개 결합 도메인을 갖고 나머지 3개는 4개 결합 도메인을 갖는다. 이소폼은 타우 유전자의 엑손 2, 3, 및 10에서 선택적 스플라이싱에 의해 생성된다. 타우는 11개 엑손을 갖는 MAPT 유전자에 의해 코딩된다. 하플로그룹 H1은 일정 치매, 예컨대 알츠하이머병의 증가된 확률과 연관된 것으로 보인다.
6량체 내지 18량체 범위의 것을 포함한, 다양한 타우 올리고머 종은 타우병증 뇌 장애와 연관되고 웨스턴 블롯 및 단일 분자 형광을 포함한 다른 기술에 의해 측정되는 신경독성 과정에 연루되었다.
올리고머 타우 종을 측정하는 방법은 면역어세이를 포함한다. 타우는 일반 발현에 이어서 크로마토그래피, 예컨대 친화성, 크기-배제, 및 음이온-교환 크로마토그래피를 통해서 단리될 수 있다. 이러한 형태를 사용하여 동물을 면역화시켜서 항체를 생성시킬 수 있다. 타우의 응집은 아라키돈산을 사용해 유도시킬 수 있다. 올리고머는 수크로스 단계 농도구배에서 원심분리를 통해 정제될 수 있다. 타우의 올리고머 형태는 또한 동물을 면역화시켜서 항체를 생성시키는데 사용될 수 있다. 타우 올리고머-특이적 TOC1 항체를 이용하는 샌드위치 효소-연결 면역흡착 어세이를 사용해 올리고머 타우를 검출할 수 있다. 타우 올리고머 복합체 1 (TOC1)　항체는 트리스 불용성, 사르코실 가용성 분획에서, 올리고머 타우 종을 특이적으로 확인한다.
D. 헌팅톤병
1. 헌팅톤병
헌팅톤병은 헌팅틴 유전자 내 상염색체 우성 돌연변이에 의해 야기되는 유전 질환이다. 돌연변이는 CAG 삼중항의 중복을 특징으로 한다. 이것은 진행성 신경퇴행을 특징으로 한다. 증상은 운동 장애, 예컨대 비자발적 움직임, 보행 장애, 및 연하 및 말하기 곤란을 포함한다. 또한 진행성 인지 저하를 특징으로 한다.
2. 헌팅틴 단백질
헌팅톤 단백질은 HTT 또는 HD라고도 하는 현팅톤 유전자에 의해 코딩된다. 정상 헌팅톤 단백질은 약 3144 아미노산을 갖는다. 단백질은 보통 약 300 KdA이다.
헌팅톤병 (HD)에서, 더 작은, 가용성 응집-경향 mHtt 단편으로 전체 길이 돌연변이체 헌팅틴 (mHtt) 단백질의 절단은 이러한 장애의 병리생리학에서 핵심 과정인 것으로 보인다. 실제로, 확장된 수의 폴리글루타민 (폴리Q) 반복부를 함유하는 돌연변이체 단백질의 응집 및 세포독성은 HD 이외에도, 몇몇 질환의 특징이다. 세포 내에서, 돌연변이체 헌팅틴 (mHtt) 및 다른 폴리글루타민 폴리글루타민 확장 돌연변이체 단백질은 단량체, 가용성 올리고머, 및 불용성 봉입체로서 존재한다 (J Huntingtons Dis. 2012;1(1):119-32. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. Sontag EM, et al., Brain Sci. 2014 Mar 3;4(1):91-122. Monomeric, oligomeric and polymeric proteins in Huntington disease and other diseases of polyglutamine expansion. Hoffner G. et al.). 일정 구현예에서, 올리고머는 2-10 nm 길이 및 2.5 미만의 종횡비 (가로에서 가장 긴 거리 대 가로에서 가장 짧은 거리)여서 구형 구조를 의미한다.
III. 신호전달 키나제 및 신경퇴행성 단백질의 검출 및 측정
A. 생물학적 샘플
본 명세서에서 사용되는 용어 "샘플"은 피분석물을 포함하는 조성물을 의미한다. 샘플은 피분석물이 이의 천연 형태 (예를 들어, 원료 재료)로 다른 재료와 혼합되는 원료 샘플, 피분석물이 적어도 부분적으로 농축된 분별 샘플, 또한 피분석물이 적어도 실질적으로 순수한 정제된 샘플일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 샘플"은 예를 들어, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 다당류, 지질, 및 고차 수준의 이들 재료 예컨대, 엑소솜 세포, 조직 또는 장기를 포함한, 생물학적 재료를 포함한 샘플을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "미세입자"는 약 50 내지 약 5000 nm의 유체역학 직경을 갖는 세포외 미세소포체 또는 지질 래프트 단백질 응집체를 의미한다. 이러한 용어 미세입자는 엑소솜 (약 50 내지 약 100 nm), 미세소포체 (약 100 내지 약 300 nm), 엑토솜 (약 50 내지 약 1000 nm), 세포자멸체 (약 50 내지 약 5000 nm) 및 동일 치수의 지질 단백질 응집체를 포괄한다. 본 명세서에서 사용되는, 값에 대해 사용되는 용어 "약"은 그 값의 90% 내지 110%를 의미한다. 예를 들어, 약 1000 nm의 직경은 900 nm 내지 1100 nm 범위 내 직경이다.
신호전달 키나제를 비롯하여, 신경퇴행성 단백질의 형태, 예컨대 알파-시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우 및 헌팅틴은 대상체로부터의 체액 샘플로부터의 엑소솜에서 검출될 수 있다. 보다 특히, 뉴런 유래 엑소솜의 단리물은 시뉴클레인병증성 병태의 검출 및 분석을 위한 엑소솜의 바람직한 서브세트이다. 특히, 엑소솜의 내부 구획으로부터의 단백질이 유용하다.
엑소솜은 대상체로부터의 다양한 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있다. 일정 구현예에서 생물학적 샘플은 체액이다. 엑소솜의 체액 공급원은 예를 들어, 혈액 (예를 들어, 전체 혈액 또는 이의 분획 예컨대 혈청 또는 혈장, 예를 들어, 말초 정맥 혈액), 뇌척수액, 타액, 모유 및 소변, 또는 이의 분획을 포함한다.
엑소솜의 공급원으로서 정맥 혈액의 사용은 의료 환경에서 통상의 정맥천자의 안전성, 허용가능성, 및 편리성 덕분에 성인 및 어린이 모두에서 사용을 위해 예정된 진단 검사에서 바람직한 샘플이다. 표적 피분석물이 혈액 중에 소량으로 존재할 수 있으므로, 대량 샘플을 채취할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 적어도 5 mL, 적어도 10 mL, 적어도 20 mL의 혈액을 가질 수 있다. 혈청은 전체 혈액이 응고되게 하고 응혈을 예를 들어 원심분리를 통해 제거하여 제조될 수 있다. 혈장은 예를 들어, 전체 혈액을 항응고제, 예컨대 EDTA로 처리하고, 예를 들어, 원심분리를 통해 혈액 샘플을 제거하여 제조될 수 있다. 혈액 샘플은 샘플을 대상체로부터 채취하거나 또는 대상체로부터 혈액이 채취된 사람으로부터의 샘플을 수용하여 제공될 수 있다. 혈액 샘플은 전형적으로 냉장, 예를 들어, 얼음에서 저장되거나 또는 -80℃에 냉동될 수 있다.
B. 신호전달 키나제 및 신경퇴행성 단백질의 측정 방법
1. 신호전달 키나제
키나제는 기질의 인산화로 ATP를 ADP로 전환시킨다. 키나제 활성을 측정하기 위한 다양한 어세이 유형이 당분야에 공지되어 있다.
a) 방사능 섬광
방사능 섬광 어세이는 키나제에 의한 기질로 32P의 도입을 측정한다.
b) FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
이들 어세이 중 일부는 키나제 활성의 지시자로서 ATP 또는 ADP의 양을 사용한다. 이러한 한 어세이에서, 키나제 활성에 대해 시험되는 샘플, 키나제에 대한 기질 및 ATP가 배합된다. 키나제가 존재하면, ATP를 사용해 기질을 인산화하게 된다. 나머지 ADP는 다양한 어세이를 통해 검출될 수 있다. 이러한 한 어세이가 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 어세이이고 여기서 반응 이후 샘플 중 ADP는 도너 또는 억셉터 형광단 중 하나로 태그화된다. ADP에 결합하고 쌍의 나머지 형광단, 즉 억셉터 또는 도너 형광단을 포함하는 항체는 혼합물에 첨가된다. 항체는 ADP에 결합한다. 여기 시에, 도너 형광단은 에너지를 억셉터 형광단에 전달하여, 형광발광하고 검출할 수 있다.
c) 면역검출
다른 어세이에서, 특이적 키나제는 키나제에 특이적인 항체를 사용해 면역침전될 수 있다. 침전된 키나제는 키나제의 기질과 인간화 반응에서 사용된다. 키나제 반응의 생산물은 웨스턴 블롯을 통해 검출된다.
d) 상업적으로 이용가능한 키나제 어세이
많은 키나제 어세이는 상업적으로 이용가능하다. 이들은 복수의 상이한 키나제에 특이적인, 예를 들어, Promega (Promega.com)에서 입수가능한 어세이를 포함한다. 다른 예는 Thermo Fisher Scientific (ThermoFisher.com)에서 입수가능한 Adapta® Universal 키나제 어세이 시스템이다. PerkinElmer™ (PerkinElmer.com)은 FRET를 통해 검출가능한, 인산화 생산물을 인식하기 위해서 형광 표지된 기질 및 유로퓸-표지된 항-포스포 항체를 사용하는, LANCE(R) 키나제 어세이를 상업화한다. Samdi Tech, Inc. (SamdiTech.com)는 질량 분광법을 사용하는 무표지 어세이를 상업화한다.
2. 신경퇴행성 단백질
단백질의 단량체 및 올리고머 형태는 제한없이, 면역어세이 (예를 들어, ELISA), 질량 분광법, 크기 배제 크로마토그래피, 웨스턴 블롯 및 형광-기반 방법 (예를 들어, 형광 분광법 또는 FRET) 및 근접 결찰 어세이를 포함하여, 당업자에게 공지된 임의 방법으로 검출될 수 있다.
웨스턴 블롯에서, 혼합물 중 단백질은 전기영동을 통해서 분리된다. 분리된 단백질은 고형 지지체, 예컨대 니트로셀룰로스 필터 상에, 전형적으로 전기블롯팅을 통해서 블롯팅된다. 블롯팅된 단백질은 α 시뉴클레인 올리고머에 대한 결합제와 직접 결합을 통해서, 또는 예를 들어, 올리고머와 결합을 허용하는, α-시뉴클레인 올리고머에 대한 표지된 1차 항체와 블롯을 접촉시키는, 간접 결합을 통해서 검출될 수 있다. 전형적으로, 블롯을 세척하여, 미결합된 항체를 제거한다. 다음에, 올리고머 형태는 1차 항체에 대한 표지된 항체 (전형적으로 2차 항체라고 함) 또는 1차 항체에 부착된 태그를 사용해 검출된다.
표지는 예를 들어, 금 나노입자, 라텍스 비드, 형광 분자, 발광 단백질 및 기질로부터 검출가능한 생산물을 생성하는 효소를 포함할 수 있다. 태그는 예를 들어, 바이오틴을 포함할 수 있다.
대안적으로, 혼합물 중 올리고머 종은 서로로부터 분리될 수 있고 후속하여 검출할 수 있다. 혼합물 중 올리고머 종은 몇가지 방법을 통해 분리될 수 있다. 한 방법에서, 종은 전기영동을 통해 분리된다. 이것은 겔 전기영동을 포함한다. 전기영동 방법은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 ("PAGE") 및 아가로스 겔 전기영동을 포함한다. 한 방법에서, 천연 PAGE 또는 블루 천연 PAGE가 사용된다. 천연 PAGE Bis-Tris 겔은 예를 들어, ThermoFisher®에서 입수가능하다. 충전된-모세관 전기영동, 또는 "pCE"라고 불리는 방법에서, 모세관에 비다공성 콜로이드 실리카를 충전시켜서 임의 폭의 기공을 생성시킨다. 대안적으로, 종들은 크로마토그래피, 예컨대 크기 배제 크로마토그래피, 액상 크로마토그래피 또는 가스 크로마토그래피를 통해서 분리될 수 있다.
분리되면, α-시뉴클레인의 특이적 올리고머 형태를 구별할 수 있다. 이것은 그들이 이미 분리되었기 때문에 특정 올리고머 형태에 특이적으로 결합하는 결합제에 대한 필요성없이 수행될 수 있고, 그러므로 구별가능하다. 일반적으로, α-시뉴클레인 올리고머에 결합하는 결합제는 형태들을 검출하는데 사용될 수 있다. 겔 상에서 그들 위치, 또는 컬럼으로부터의 시간 또는 용출을 사용하여 검출된 측정 형태를 표지할 수 있다. 예를 들어, 더 큰 올리고머는 전형적으로 더 작은 올리고머에 비해서 겔에서 훨씬 더 느리게 이동한다.
a) 알파-시뉴클레인
단량체 알파-시뉴클레인 및 올리고머 알파-시뉴클레인의 양은 개별적으로 결정할 수 있다. 대안적으로, 샘플 중 전체 알파-시뉴클레인은 단량체 알파-시뉴클레인 또는 올리고머 알파-시뉴클레인 중 하나로 측정될 수 있고 다른 종의 양은 편차를 기반으로 결정할 수 있다.
단량체, 올리고머 및 전체 알파-시뉴클레인은 예를 들어, 면역어세이 (예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯), 질량 분광법 또는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 검출할 수 있다. 알파-시뉴클레인에 대한 항체는 예를 들어, Abcam (Cambridge, MA), ThermoFisher (Waltham, MA) 및 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX)로부터 상업적으로 입수가능하다.
하기 참조들은 전체 알파-시뉴클레인 내용물을 측정하는 방법을 기술하였다. Mollenhauer 등 (Movement Disorders, 32:8 p. 1117 (2017))은 체액으로부터 전체 알파-시뉴클레인을 측정하는 방법을 기술한다. Loov 등 (Cell Mol. Neurobiol., 36:437-448 (2016))은 혈장으로부터 L1CAM 양성 엑소솜을 단리하기 위한 항체의 사용을 기술한다. Abd-Elhadi 등 (Anal Bioanal Chem. (2016) Nov;408(27):7669-72016)은 지질-ELISA를 통해 결정되는 인간 혈액 세포, CSF, 및 타액 중 전체 알파-시뉴클레인 수준을 결정하는 방법을 기술한다.
전체 알파-시뉴클레인은 예를 들어, 포획을 위해 항-인간 α-syn 단일클론 항체 211 (Santa Cruz Biotechnology, USA) 및 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)-연결된 화학발광 어세이를 통한 검출을 위해 항-인간 α-syn 다클론 항체 FL-140 (Santa Cruz Biotechnology, USA)를 사용한 ELISA에서 검출될 수 있다. 이러한 접근법은 단량체 α-시뉴클레인의 검출을 피하지만, 상이한 다량체 형태들을 구별하지는 않는다.
알파-시뉴클레인의 단량체 및 올리고머 형태는 예를 들어, 형태에 특이적인 항체를 사용하는 면역어세이를 통해서 검출될 수 있다 (참조: 예를 들어, Williams et al. ("Oligomeric alpha-synuclein and β-amyloid variants as potential biomarkers for Parkinson's and Alzheimer's diseases", Eur J Neurosci. (2016) Jan;43(1):3-16) 및 Majbour et al. ("Oligomeric and phosphorylated alpha-synuclein as potential CSF biomarkers for Parkinson's disease", Molecular Neurodegeneration (2016) 11:7). El-Agnaf O. 등 (FASEB J. 2016;20:419-425)은 PD에 대한 잠재적 바이오마커로서 인간 혈장에서 알파-시뉴클레인 단백질의 올리고머 형태의 검출을 기술한다.
알파-시뉴클레인 단량체 및 올리고머에 대한 항체는 알파-시뉴클레인 단량체 또는 올리고머로 동물을 면역화하여 생산될 수 있다 (참조: 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2016/0199522 (Lannfelt et al.), 2012/0191652 (El-Agnaf). 알파-시뉴클레인 올리고머는 El Agnaf (U.S. 2014/0241987)의 방법을 통해 제조될 수 있는데, 여기서는 신선하게 제조된 α-시뉴클레인 용액을 도파민과 1:7 몰비율 (α-시뉴클레인:도파민)로 혼합하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 알파-시뉴클레인의 상이한 올리고머 형태에 대한 항체가 또한 Emadi et al. ("Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity", J Mol Biol. 2007; 368:1132-1144. [PubMed: 17391701]) (이량체 및 사량체) 및 Emadi et al. ("Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein", J Biol Chem. 2009; 284:11048-11058. [PubMed: 19141614]) (삼량체 및 육량체)에 기술되어 있다. 프로토원섬유-결합 항체는 예를 들어, U.S. 2013/0309251 (Nordstrom et al.)에 기술되어 있다.
단량체 알파-시뉴클레인은 시뉴클레인의 올리고머 형태에 의해 고유하게 인식되는 항체를 사용한 면역어세이를 통해서 중합체 알파-시뉴클레인과 구별할 수 있다. 다른 방법은 예를 들어 질량 분광법을 사용한, 질량 편차의 검출을 포함한다. 형광 방법을 사용할 수 있다 (참조: 예를 들어, Sangeeta Nath, et al., "Early Aggregation Steps in α-Synuclein as Measured by FCS and FRET: Evidence for a Contagious Conformational Change" Biophys J. 2010 Apr 7; 98(7): 1302-1311, doi: 10.1016/j.bpj.2009.12.4290; 및 Laura Tosatto et al., "Single-molecule FRET studies on alpha-synuclein oligomerization of Parkinson's disease genetically related mutants", Scientific Reports 5, December 2015). 다른 방법은 전체 알파 시뉴클레인을 측정한 다음에, 비병리학적 알파 시뉴클레인의 프로테이나제 K 분해 및 나머지 알파 시뉴클레인의 검출을 포함한다. 다른 방법은 알파 시뉴클레인 근접 결찰 어세이를 포함한다. 단백질 결찰 어세이 프로브는 관심 단백질(들)에 대해 생성된 항체로부터 생성되고, 추정 상호작용에 관여되는 단백질의 각각에 대한 것은 짧은 올리고뉴클레오티드에 접합된다. 프로브가 상호작용 단백질에 결합되면, 올리고뉴클레오티드는 태그화된 올리고뉴클레오티드에 의해 검출될 수 있고 점 신호로서 관찰될 수 있는, 증폭 반응을 프라이밍하기에 충분하게 가깝고, 각각의 점은 상호작용을 의미한다 (Roberts RF et al., "Direct visualization of alpha-synuclein oligomers reveals previously undetected pathology in Parkinson's disease brain. Brain", 2015;138:1642-1657. doi: 10.1093/brain/awv040, 및 Nora Bengoa-Vergniory et al., "Alpha-synuclein oligomers: a new hope", Acta Neuropathol. 2017; 134(6): 819-838).
단량체에 대한 알파-시뉴클레인의 올리고머 형태의 상대량은 비율로서 표시될 수 있다.
분량 또는 양은 예를 들어, 부피 당 질량의 관점에서, 예를 들어 표준 곡선으로부터, 전환 이후 절대량으로서 또는 어세이로부터의 신호 출력으로서 표시될 수 있다.
샘플 중 알파-시뉴클레인 종은 계층화될 수 있다. 예를 들어, 올리고머 종은 저차수 올리고머, 예를 들어, 2 내지 24 단량체 단위, 고차수 올리고머, 예를 들어, 24 내지 100 단량체 단위, 또는 프로토원섬유 등으로 분류될 수 있다.
b) 아밀로이드 베타
올리고머 및 단량체는 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA)를 사용해 구별할 수 있다. 이러한 어세이는 샌드위치 ELISA와 비슷하다. Aβ 단량체는 하나의 에피토프를 함유하는데 반해서, 올리고머는 복수의 이들 에피토프를 함유한다. 그리하여, 상기 고유한 에피토프에 대한 에피토프-중복 항체가 항체의 포획 및 검출에 사용되면, 특이적이고 고유한 에피토프에 대한 결합은 이들 2개 항체 간 경쟁을 일으키게 될 것이다. 달리 말해서, 단량체는 둘 모두가 아닌, 포획 또는 검출 항체에 의해 점유될 것이다 ("Oligomeric forms of amyloid-β protein in plasma as a potential blood-based biomarker for Alzheimer's disease", Wang MJ et al. Alzheimers Res Ther. 2017 Dec 15;9(1):98. "Potential fluid biomarkers for pathological brain changes in Alzheimer's disease: Implication for the screening of cognitive frailty", Ruan Q et al., Mol Med Rep. 2016 Oct;14(4):3184-98. "Methods for the Specific Detection and Quantitation of Amyloid-β Oligomers in Cerebrospinal Fluid", Schuster J, Funke SA. J Alzheimers Dis. 2016 May 7;53(1):53-67).
검출을 위한 아밀로이드 베타의 올리고머 형태는 예를 들어, 아밀로이드 베타의 4량체-24량체를 포함한다.
c) 타우
생물학적 유체, 예를 들어, CSF 중 타우 올리고머는 항-타우 올리고머 항체를 사용하는 ELISA 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 측정될 수 있다 (Sengupta U, et al., "Tau oligomers in cerebrospinal fluid in Alzheimer's disease", Ann Clin Transl Neurol. 2017 Apr; 4(4): 226-235).
검출을 위한 타우의 올리고머는 예를 들어, 저분자량 올리고머, 예를 들어, 20량체 이하, 예를 들어, 3량체-18량체를 포함한다. 뇌척수액 중 가용성 올리고머의 존재는 웨스턴 블롯 및 샌드위치 효소-연결 면역흡착 어세이 (sELISA)로 단일클론 항-올리고머 항체를 사용해 검출할 수 있다 (David, MA et al., "Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients", Front Neurol. 2014 Dec 2;5:251). 타우의 올리고머 형태는 올리고머 타우의 과인산화된 형태를 포함한다.
d) 헌팅틴
최근의 정량 연구는 TR-FRET-기반 면역어세이를 사용하였다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 시간-분해 형광 공명 에너지 전달 (TR-FRET)을 조합한 한 검출 방법은 뇌에서 천연 가용성 mHtt 종 및 불용성 응집체의 형성, 및 응집의 분해 및 정의를 가능하게 한다 ("Fragments of HdhQ150 mutant huntingtin form a soluble oligomer pool that declines with aggregate deposition upon aging", Marcellin D. et al., PLoS One. 2012;7(9):e44457).
예를 들어, 복수의 면역반응성 올리고머를 제공하는, 아가로스 겔 전기영동 (AGE) 분석 (천연 또는 경미한 변성, 0.1% SDS 조건 또는 천연 조건 하 Blue-Native PAGE)을 포함한, 다양한 공개 기술을 사용해 올리고머 헌팅틴 종을 어세이하였고, 항-헌팅틴 항체는 특이적 헌팅틴 올리고머를 차등적으로 인식한다.
1-단계 TR-FRET-기반 면역어세이는 세포 및 조직 균질물 중에서 가용성 및 응집된 mHtt를 정량하기 위해 개발되었다 (TR-FRET-based duplex immunoassay reveals an inverse correlation of soluble and aggregated mutant huntingtin in Huntington's disease. Baldo B, et al., chem Biol. 2012 Feb 24;19(2):264-75).
TR-FRET (Time-resolved Forster energy transfer)-기반 어세이는 관심 단백질의 정량을 위해 광범위하게 적용되는 고속-대량 처리의 균질하고, 민감한 면역어세이를 나타낸다. TR-FRET는 작은 거리에 극도로 민감하므로 선택적 항체에 의해 인식되는 표적 단백질 상에 존재하는 에피토프의 상대적 위치 및 노출의 검출을 기반으로 입체배열 정보를 제공할 수 있다. 우리는 상이한 아미노-말단 HTT 에피토프에 특이적인 항체의 사용을 기반으로 HTT 단백질을 정량하기 위한 TR-FRET 어세이를 이전에 보고한 바 있다 (Fodale, V. et al., "Polyglutamine- and temperature-dependent conformational rigidity in mutant huntingtin revealed by immunoassays and circular dichroism spectroscopy", PLoS One. 2014 Dec 2;9(12):e112262. doi: 10.1371/journal.pone.0112262. eCollection 2014).
C. 엑소솜의 단리
엑소솜은 원형질막과, 중간 세포내이입 구획, 다중소포체 (MVB)의 융합 시에 세포로부터 방출되는 것으로 여겨지는 세포외 소포체이다. 이러한 과정에서 방출되는 소포체를 엑소솜이라고 한다. 엑소솜은 전형적으로 약 20 nm 내지 약 100 nm 범위이다.
엑소솜을 단리하는 많은 방법들이 당분야에 공지되어 있다. 이들은 예를 들어, 면역친화성 포획 방법, 크기-기반 단리 방법, 차등 초원심분리, 엑소솜 침전, 및 미세유체-기반 단리 기술을 포함한다 (Loov et al., "α-Synuclein in Extracellular Vesicles: Functional Implications and Diagnostic Opportunities", M. Cell Mol Neurobiol. 2016 Apr;36(3):437-48. doi: 10.1007/s10571-015-0317-0).
샘플 중 엑소솜의 양은 임의의 다수 방법을 통해 결정할 수 있다. 이들은 예를 들어, (a) 면역친화성 포획 (IAC), (b) 비대칭 흐름장-흐름 분획화 (AF4), (c) 나노입자 추적 (NTA), (d) 동적 광산란 (DLS), 및 (e) 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 포함한다 [66] (허가로 재인쇄됨). 면역친화성 포획 (IAC)은 간접 단리 방법을 사용하는 면역친화성을 통한 엑소솜 포획 기술이다. IAC는 색상, 형광, 또는 전기화학 신호를 분석하여 엑소솜을 정량한다. 비대칭 흐름장-흐름 분획화 (AF4)는 장-흐름 분획 및 확산을 사용해 분자를 분리하고 정량한다. 나노입자 추적 분석 (NTA)은 그들 크기에 따라서 입자를 분리하고 정량한다. NTA는 입자를 분석하기 위해 브라운 운동 속도를 사용한다. 이러한 기술은 또한 광-산란 기술을 사용해 엑소솜의 농도 및 크기를 추적한다. 동적 광산란 (DLS)은 브라운 운동을 나타내는 입자에 의해 산란된 빛을 통해서 입자 크기를 결정한다. 표면 플라스몬 공명 (SPR)은 SPR 센서 표면 상의 수용체로 엑소솜을 포획하는 면역친화성-기반 어세이이다. 결합은 수용체의 광학 신호를 변화시키고 그들 공명은 이후 광원을 통해 정량될 수 있다. 다른 방법에서, 엑소솜은 예를 들어, Zeiss LSM 200 투과 전자 현미경에서 120 kV로 시각화하여, 전자 현미경을 통해 조사할 수 있다.
1. 면역친화성 포획
면역친화성 포획 방법은 추출 모이어티에 부착되는 항체를 사용하여 엑소솜에 결합하고 그들을 샘플 중 다른 재료로부터 분리시킨다. 고형 지지체는 예를 들어, 자성으로 끌어당일 수 있는 미세입자일 수 있다. 라텍스 면역비드가 사용될 수 있다.
Qiagen은 엑소솜 및 다른 세포외 소포체를 혈청, 혈장, 세포 배양 상청액 및 다른 생물학적 유체로부터 효율적으로 단리하기 위한 막 친화성 스핀 컬럼을 사용하는 이의 exoEasy Maxi 키트를 기재한다.
2. 크기-기반 방법
크기-기반 단리 방법은 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 및 한외여과를 포함한다. 크기 배제 크로마토그래피에서 다공성 고정상을 사용해 크기 기반으로 엑소솜을 분리한다. 한외여과에서, 다공성 막 필터를 사용해 그들 크기 또는 무게를 기반으로 2개 별개 엑소솜을 사용한다.
3. 차등 초원심분리
차등 초원심분리는 샘플 내 다른 성분과 그들 밀도 및 크기 차이를 기반으로 엑소솜을 분리하기 위해 상이한 원심력 및 지속기간의 일련의 원심분리 사이클을 포함한다. 원심력은 예를 들어, ∼100,000 내지 120,000 Х g일 수 있다. 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 방지하기 위해 사용될 수 있다. 사전 정리 단계를 사용하여 샘플로부터 다른 거대 물질을 제거할 수 있다.
4. 밀도 구배 초원심분리
밀도 구배 초원심분리는 농도구배 매질, 예컨대 수크로스, Nycodenz (아이오헥솔), 및 아이오딕사놀을 사용해 엑소솜을 분류한다. 엑소솜은 농도구배 매질의 밀도가 엑소솜의 것과 동등한 층으로 초원심분리를 통해 단리된다.
5. 중합체-기반 방법
엑소솜은 그들의 가용성 또는 분산성을 변경시켜 생물학적 물질의 용액으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 중합체 예컨대 예를 들어 분자량의 8000 Da인, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 첨가를 사용해 엑소솜을 용액으로부터 침전시킬 수 있다.
6. 미세유체-기반 방법
미세유체-기반 방법을 사용해 엑소솜을 단리할 수 있다. 이들은 예를 들어, 음향, 전기영동 및 전자기 방법을 포함한다. 예를 들어, 음향 나노필터는 그들 크기 및 밀도에 따라서 샘플 중 엑소솜을 분리하도록 초음파 정상파를 사용한다.
7. 기타 방법
뉴런 유래 엑소솜을 단리하는 다른 방법은 예를 들어, [Kanninnen, KM et al., "Exosomes as new diagnostic tools in CNS diseases", Biochimica et Biophysica Acta, 1862 (2016) 403-410]에 기술되어 있다.
8. 뉴런-유래 엑소솜의 농축
뉴런 유래 엑소솜은 뉴런에 의해 생산된 엑소솜이다. 바람직하게, 연구 대상은 CNS-유래 엑소솜으로서, 즉, 말초 신경계와 구별되는, 중추 신경계에서 생산된 엑소솜이다. 본 명세서에 기술된 방법은 뉴런-유래 엑소솜, 및 확장하여, CNS 유래 엑소솜에 대해서 엑소솜을 포함하는 생물학적 샘플을 농축한다.
면역친화성 방법은 뇌-특이적 바이오마커 (예를 들어, 신경 및 신경교 마커)를 사용해 뉴런 유래 엑소솜을 단리하는데 유용하고 이러한 한 마커는 L1CAM이다. 다른 마커는 KCAM이다. 다른 상대적으로 뇌-특이적인 단백질이 또한 이러한 능력을 제공할 수 있다. 뉴런 유래 엑소솜은 예를 들어, KCAM, L1CAM 및 NCAM 및 DAT (도파민 수송체)를 포함하여, 뇌와 연관된 단백질 마커를 특징으로 한다 (참조: 예를 들어, US 2017/0014450, US 2017/0102397, US 9,958,460). 뉴런 유래 엑소솜은 친화성 포획 방법을 사용해 단리될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 특이적 마커 예컨대 L1 CAM에 대한 항체에 부착된 상자성 비드를 포함한다 (참조: 예를 들어, Shi et al., "Plasma exosomal α-alpha-synuclein is likely CNS derived and increased in Parkinson’s disease", Acta Neuropathol. 2014 November; 128(5): 639-650).
D. 엑소솜 내용물
인간 신경퇴행성 질환의 발병기전과 연관된, 키나제를 포함한, 많은 단백질은 CNS 외부를 비롯하여 뇌의 내부에서 발생되고, 혈액 뇌 장벽을 통과하여 말초 순환계로 들어가는 엑소솜의 외부 표면에 부착될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 방법의 일정 구현예에서, 엑소솜 분획은 엑소솜 표면에 결합된 분자를 제거하도록 처리된다. 이것은 예를 들어, 엄격 세척 절차를 통해서, 예컨대 포스페이트 완충 용액 (PBS)으로 수행될 수 있다. 이러한 처리과정 이후에, 엑소솜의 내용물은 어세이를 위해 처리될 수 있다.
이후 스크러빙된 엑소솜을 용해시키고, 그들 내부 내용물이 분석을 위해 방출될 수 있다.
IV. 신경퇴행성 병태의 진단, 병기, 진행, 예후, 및 발병 위험성의 결정
(1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각로부터 선택되는 생물학적 샘플 중 바이오마커의 양을 포함하는 바이오마커 프로파일, 및 시간 경과에 따른 프로파일의 변화는 신경퇴행성 유형의 신경퇴행성 병태의 존재, 중증도 및 방향을 의미한다. 특히, 본 명세서에 개시된 단백질 바이오마커의 비정상적 비율, 예를 들어, 상승된 양은 신경퇴행 과정을 의미한다. 이러한 과정은 검토되지 않으면, 시뉴클레인병증성 병태의 현저한 증상을 초래할 수 있다. 따라서, 본 명세서는 하나 이상의 바이오마커 단백질의 비정상적인 양을 특징으로 하는 신경퇴행성 병태 (각각 본 명세서에서, "신경병증성 상태", 예를 들어, "시뉴클레인병증성 상태", "아밀로이드병증성 상태", "타우병증성 상태", "헌팅톤 상태"라고 함)의 진단, 병기, 진행, 속도, 예후, 약물 반응도, 및 발병 위험을 확인하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "진단"은 예를 들어 그 병태의 병기를 포함하여, 특정 병원성 병태를 갖거나 또는 갖지 않는 것으로 개체의 분류를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "임상적으로 유사하지만 병인학적으로 상이한"은 임상 징후 및/또는 증상을 공유하지만, 상이한 생물학적 원인으로부터 발생되는 병태를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "병기"는 병태의 중증도의 상대적 정도, 예를 들어, 의심 질환, 초기 병기, 중간 병기 또는 후기 병기를 의미한다. 병기결정은 병인학, 병태생리학, 중증도 등을 기반으로 환자를 그룹화하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "진행"은 시간 경과에 따른 병태의 병기 또는 중증도에서 변화, 또는 이의 결여를 의미한다. 이것은 병태의 중증도의 증가, 감소, 또는 정지를 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 진행 속도, 즉 시간 경과에 따른 변화가 측정된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예후"는 병태의 예측 과정, 예를 들어, 진행 가능성을 의미한다. 예를 들어, 예후는 병태의 중증도가 향후 일부 시점에 증가되거나, 감소되거나 또는 동일하게 남아있을 가능성이 있다는 예측을 포함할 수 있다. 본 개시의 문맥에서, 예후는 개체가 (1) 신경퇴행성 병태가 발병되거나, (2) 병태의 한 병기에서 다른, 보다 후기의 병기로 진행하거나, (3) 병태의 중증도의 감소를 나타내거나, (4) 일정 속도로 기능적 저하를 나타내거나, (5) 일정 시간 기간 동안 병태를 가진 채로 생존 (예를 들어, 생존률)하거나, 또는 (6) 병태가 재발할 가능성을 의미할 수 있다. 병태는 시뉴클레인병증성 병태 (예를 들어, PD, 루이 소체 치매, 다계통 위축증 또는 일부 관련 시뉴클레인병증), 아밀로이드병증성 병태 (예를 들어, 알츠하이머병), 타우병증성 병태 (예를 들어, 알츠하이머병), 및 헌팅톤병일 수 있다. 이들 용어는 의료 진단 분야의 임의 숙련가가 이해하게 되는 바와 같이, 절대적인 것이 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발병 위험성"은 무증상이거나 또는 전임상인 개체가 질환의 확정 진단으로 발전하게 될 확률을 의미한다. 확률의 결정은 정확한 확률 및 상대적 확률, 예컨대 "가능성 있음", "가능성 높음", "가능성 낮음", 또는 %확률, 예를 들어, "90%"를 포함한다. 위험성은 연령, 성별, 유전적 위험성, 및 환경 위험 요인 중 어느 하나를 기반으로 대상체와 일치되는 집단 또는 일반 집단과 비교될 수 있다. 이러한 경우에, 대상체는 집단의 다른 구성원과 비교하여 증가되거나 또는 감소된 위험성으로 결정될 수 있다. 신경퇴행성 병태가 발병될 위험성이 높은 대상체는 예를 들어, 병태의 발병 예방, 병태의 발생 지연 또는 병태와 연관된 증상의 중증도 또는 이환율의 감소를 통해서, 신경퇴행성 병태에 대한 치료에 양성적으로 반응할 가능성이 있다.
V. 신경퇴행성 병태의 진단, 병기, 진행, 예후, 및 발병 위험성을 추론하기 위한 키나제의 프로파일 모델링
신경퇴행성 병태의 진단, 병기, 진행 속도, 예후 및 위험성의 결정은 대상체를 상이한 병태 또는 상태 내 상이한 클래스 또는 병태로, 예컨대 질환/건강 (진단), 병기 I/병기 II/병기 III (병기), 관해될 가능성/진행할 가능성 (예후)으로 분류하거나 또는 범위 상 점수를 할당하는 과정이다. 바이오마커 프로파일을 사용한 분류 방법은 상이한 상태를 특징으로 하는 프로파일을 확인하는 단계 및 대상체로부터의 프로파일을 클래스 또는 상태와 상관짓는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 프로파일을 확인하는 단계는 상이한 상태에 속하는 대상체로부터의 바이오마커 프로파일의 분석 단계 및 프로파일 간 패턴 또는 차이를 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 분석은 프로파일의 육안 검사 또는 통계 분석에 의해 수행될 수 있다.
A. 통계 분석
전형적으로, 분석은 통계적으로 의미있는 결과를 제공하도록 충분히 많은 수의 샘플의 통계 분석을 포함한다. 당분야에 공지된 임의의 통계 방법이 이러한 목적에 사용될 수 있다. 이러한 방법, 또는 도구는 제한없이, 상관분석, 피어슨 상관계수, 스피어먼 상관계수, 카이-제곱 검정, 평균의 비교 (예를 들어, 대응 T-검정, 독립 T-검정, ANOVA) 회귀 분석 (예를 들어, 단순 회귀, 다중 회귀, 선형 회귀, 비-선형 회귀, 로지스틱 회귀, 다항 회귀, 단계적 회귀, 리지 회귀, 라쏘 회귀, 엘라스틱넷 회귀) 또는 비-모수적 분석 (예를 들어, 윌콕슨 순위-총합 검정, 윌콕슨 부호-순위 검정, 부호 검정)을 포함한다. 이러한 도구는 상업적으로 입 수가능한 통계 패키지 예컨대 MATLAB, JMP 통계 소프트웨어 및 SAS에 포함된다. 이러한 방법은 특정 바이오마커 프로파일을 특정 상태로 분류하는데 사용할 수 있는 모델 또는 분류기를 생성한다.
통계 분석은 운영자 구현되거나 또는 기계 학습에 의해 구현될 수 있다.
B. 기계 학습
일정 구현예에서 통계 분석은 기계 학습 도구의 사용을 통해 강화된다. 이러한 도구는 관련 변수 또는 변수들은 상이한 가능한 상태에서 측정되고, 상태를 구별하는 패턴을 결정하여 검사 대상체를 분류하는데 사용되는, 학습 알고리즘을 적용한다. 따라서, 본 개시의 임의의 분류 방법은 특정 시뉴클레인병증성 상태 내에서 다양한 병태에 속하는 대상체의 하나 이상의 변수의 측정치를 비교하여 개발될 수 있다. 이것은 예를 들어, 진단, 병기, 진단, 예후, 약물 반응도 또는 위험성의 예측을 허용하는 다양한 시점에 다양한 병기에서 또는 다양한 진단을 받은 대상체에서, (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커의 양을 포함하는 바이오마커 프로파일을 결정하는 단계를 포함한다. 다른 변수들, 예컨대 가족력, 생활습관, 화학물에 노출, 다양한 표현형적 형질 등을 역시 포함할 수 있다.
1. 훈련 데이터세트
훈련 데이터세트는 전형적으로 복수의 대상체 (보다 일반적으로 대상이라고 함)의 각각에 대한 복수의 특징 각각에 대한 측정치의 벡터를 포함하는 데이터세트이다. 특징 중 하나는 대상체의 분류, 예를 들어, 진단 또는 척도 상에서 정도의 측정치일 수 있다. 이것은 감독된 학습 방법에서 사용할 수 있다. 다른 특징은 예를 들어, (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커의 측정된 양일 수 있다. 그래서, 예를 들어, 개별 대상체에 대한 벡터는 신경퇴행성 병태의 진단 (예를 들어, 파킨슨병을 갖거나 또는 갖지 않는다는 진단) 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 복수의 바이오마커의 각각의 측정을 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 분류기를 생성시키는데 사용되는 훈련 데이터세트는 적어도 100명, 적어도 200명, 또는 적어도 400명 상이한 대상체로부터의 데이터를 포함한다. 분류된 대상체의 비율은 적어도 2:1, 적어도 1:1, 또는 적어도 1:2일 수 있는 병태를 갖는 경우 대 갖지 않는 경우의 비율을 갖는다. 대안적으로, 병태를 갖는 것으로 사전 분류된 대상체는 대상체의 66% 이하, 50% 이하, 33% 이하 또는 20% 이하를 포함할 수 있다.
2. 학습 알고리즘
기계 학습 알고리즘이라고도 하는, 학습 알고리즘은 분석 모델 구축, 예를 들어, 클러스터링, 분류 또는 프로파일 인식을 자동화하는 컴퓨터-실행 알고리즘이다. 학습 알고리즘은 알고리즘에 제공되는 훈련 데이터세트에 대한 분석을 수행한다.
학습 알고리즘은 분류기, 분류 알고리즘 또는 진단 알고리즘이라고도 하는 모델을 출력한다. 모델은 입력으로서 검사 데이터를 수용하고, 출력으로서, 척도 상에서 하나 또는 다른 클래스, 클러스터 그룹 또는 위치에 속하는 입력 데이터의 추론 또는 분류, 예컨대 진단, 병기, 예후, 질환 진단, 약물에 대한 반응도 등을 생성한다.
다양한 기계 학습 알고리즘는 대상체의 병태 또는 상태를 추론하는데 사용될 수 있다. 기계 학습 알고리즘은 감독될 수 있거나 또는 감독되지 않을 수 있다. 학습 알고리즘는 예를 들어, 인공 신경망 (예를 들어, 역전파 네트워크), 판별 분석 (예를 들어, 베이지안 분류기 또는 피셔 분석), 서포트 벡터 머신, 결정 트리 (예를 들어, 재귀 분할 과정 예컨대 CART - 분류 및 회귀 트리), 랜덤 포레스트, 선형 분류기 (예를 들어, 다중 선형 회귀 (MLR), 부분 최소 제곱 (PLS) 회귀 및 주성분 회귀 (PCR)), 계층적 클러스터링 및 클러스터 분석을 포함한다. 학습 알고리즘은 추론, 예를 들어, 대상체의 질환 상태에 관한 추론을 하는데 사용될 수 있는 모델 또는 분류기를 생성시키게 된다.
3. 검증
모델은 검증 데이터세트를 사용하여 후속적으로 검증될 수 있다. 검증 데이터세트는 전형적으로 훈련 데이터세트와 동일한 특성에 대한 데이터를 포함한다. 모델은 훈련 데이터세트 상에서 실행되고 참 양성, 참 거짓, 거짓 양성 및 거짓 음성의 개수는 모델의 성능의 측정치로서 결정된다.
다음으로 모델은 이의 유용성을 결정하기 위해서 검증 데이터세트 상에서 검사되었다. 전형적으로, 학습 알고리즘은 복수의 모델을 생성시키게 된다. 일정 구현예에서, 모델은 고려되는 병태를 진단하기 위해 사용되는 표준 임상 측정에 대한 충실도를 기반으로 검증될 수 있다. 이들 중 하나 이상은 이의 성능 특징을 기반으로 선택될 수 있다.
C. 컴퓨터
본 명세서에 기술된 임의의 상태를 기반으로 대상체의 병태의 분류는 프로그램가능한 디지탈 컴퓨터를 통해서 수행될 수 있다. 컴퓨터는 대상체에서, 적어도 단백질 바이오마커 (예를 들어, 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질)의 하나 또는 복수의 올리고머 형태 및, 임의로 단량체 형태의 측정을 수용하고, 임의로 저장하는 유형 메모리 및 분류 알고리즘을 구현하는 코드의 실행을 통해 이 데이터를 처리하는 프로세서를 포함할 수 있다. 분류 알고리즘은 운영자-구현 또는 기계 학습-구현 통계 분석의 결과일 수 있다.
시스템은 데이터를 컴퓨터에 전송하고/하거나 검사 결과, 예컨대 본 명세서에 기술된 바와 같은 분류를 원격 컴퓨터로 전송하도록 구성된 통신 네트워크와 통신하는 기술된 바와 같은 제1 컴퓨터를 포함한다. 통신 네트워크는 예를 들어, 제한없이, 디지탈 가입자 회선 (DSL), 케이블 모뎀, 광섬유, 무선, 위성 및, 전력선을 통한 광대역 (BPL)을 포함한 고속 전송 네트워크를 이용할 수 있다. 시스템은 통신 네트워크를 통해서 제1 컴퓨터에 연결된 원격 컴퓨터를 더 포함할 수 있다.
D. 모델 실행 및 추론
선택된 모델은 운영자 실행 통계 분석 또는 기계 학습에 의한 결과일 수 있다. 임의의 경우에, 모델은 검사 대상체에 관해 추론 (예를 들어, 예측)하기 위해 사용될 수 있다. 모델에 의해 사용되는 특징의 값을 함유하는, 예를 들어, 벡터를 포함하는, 예를 들어, 검사 데이터세트의 형태로, 바이오마커 프로파일은 검사 대상체로부터 채취된 샘플로부터 생성될 수 있다. 검사 데이터세트는 훈련 데이터세트에서 사용되는 모든 동일한 특징, 또는 이들 특징의 서브세트를 포함할 수 있다. 다음으로 모델은 검사 데이터세트에 적용하거나 또는 그에 대해 실행된다. 바이오마커 프로파일을 병태, 질환 상태, 예후, 진행 위험성, 약물 반응 가능성 등과 상관짓는 것은 모델을 실행하는 형태이다. 상관짓는 단계는 사람 또는 기계를 통해서 수행될 수 있다. 선택은 상관 작업의 복잡성에 의존적일 수 있다. 이것은 추론, 예를 들어, 클래스 또는 클러스터 그룹에 속하는 것으로 대상체의 분류 (예컨대 진단), 또는 척도 상의 위치 (예컨대 치료 중재술에 대한 반응 가능성)를 생성시킨다.
일정 구현예에서 분류기는 복수의 올리고머 단백질 형태 및, 전형적으로, 반드시는 아니지만, 신경퇴행성 단백질의 하나 이상의 단량체 형태를 포함하게 된다. 분류기는 예를 들어, AX+BY+CZ = N의 형태의 선형 모델일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있고, 여기서 A, B 및 C는 형태 X, Y 및 Z의 측정된 양이다. 분류기는 예를 들어, 서포트 벡터 머신 분석을 요구할 수 있다. 예를 들어, 추론 모델은 바이오마커 프로파일은 정상 및 비정상 사이의 척도 상에 위치되는 패턴 인식을 수행할 수 있고, 다양한 프로파일은 정상을 향하거나 또는 비정상을 향하는 경향이 있다. 따라서, 분류기는 프로파일이 정상 또는 비정상인 신뢰 수준을 의미할 수 있다. 비정상 바이오마커 프로파일은 분류 알고리즘에 의해 분석될 때, 대상체를 비정상 범주, 예컨대 질환 존재, 또는 증가된 질환 위험성으로 분류하는 프로파일일 수 있다. 바이오마커의 측정치는 측정치가 정상으로 간주되는 범주 밖에 위치되는 경우, 예를 들어, 통계적으로 유의한 정상 범위로부터의 편차이면, 비정상일 수 있다.
분류기 또는 모델은 하나로부터 또는 측정된 복수의 형태로부터, 모델로서 기능하는 단일 진단 번호를 생성시킬 수 있다. 신경병리학적 상태, 예를 들어, 시뉴클레인병증성 상태 (예를 들어, 진단, 병기, 진행, 예후 및 위험성)의 분류는 진단 번호가 한계치 ("진단 수준") 이상 또는 이하인지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 진단 번호는 2개의 상이한 신호전달 키나제의 상대량일 수 있다. 그 한계치는 예를 들어, 신경퇴행성, 예를 들어, 시뉴클레인병증, 병태의 임의 징후가 없는 정상 개체 이상의 진단 번호의 일정 편차를 기반으로, 결정할 수 있다. 진단 번호의 평균, 중앙치, 또는 방식같은 중심 경향의 측정치는 정상 및 비정상 개체의 통계적으로 유의한 수에서 결정될 수 있다. 정상량 이상의 컷오프는 신경퇴행성, 예를 들어, 시뉴클레인병증성, 병태의 진단 수준으로서 선택될 수 있다. 그 수는 예를 들어, 중심 경향의 측정치로부터의 일정 편차 정도, 예를 들어, 분산 또는 표준 편차일 수 있다. 일 구현예에서 편차의 측정치는 정상 평균으로부터의 표준 편차의 수 또는 Z 점수이다.
모델은 바람직한 수준의 민감도, 특이도 또는 양성 예측력을 제공하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 진단 수준은 80%, 90%, 95% 또는 98% 중 적어도 어느 하나의 민감도 및/또는 80%, 90%, 95% 또는 98% 중 적어도 어느 하나의 특이도, 및/또는 80%, 90%, 95% or 98% 중 적어도 어느 하나의 양성 예측값을 제공할 수 있다. 검사의 민감도는 양성으로 검사된 실제 양성의 백분율이다. 검사의 특이도는 음성으로 검사된 실제 음성의 백분율이다. 검사의 양성 예측값은 양성으로 검사된 대상체가 실제 양성일 확률이다.
VI. 신경퇴행성 병태를 치료하기 위한 치료 중재술의 개발
다른 양태에서, 본 명세서는 신경퇴행성 병태, 예를 들어, 시뉴클레인병증성 병태, 아밀로이드병증성 병태, 타우병증성 병태, 및 헌팅톤병에 대한 치료 중재술의 실제 개발을 가능하게 하는 방법을 제공한다. 방법은 특히, 임상 시험을 위한 대상체를 선택하는 단계 및 대상체 세트에서 치료 중재술의 유효성을 결정하는 단계를 포함한다.
신경퇴행성 단백질의 바이오마커 프로파일을 모니터링하는 단계를 포함하는 방법은 실험적 치료 중재술이 시뉴클레인병증의 임상적 발병을 예방하거나 또는 후속 진행을 억제하는데 유효한지 여부, 또는 대상체가 이러한 병태를 치료하기 위한 약물 후보의 효능을 검사하기 위한 임상 시험에 참여해야 하는지 여부를 결정하는데 유용하다. 신경퇴행성 단백질의 바이오마커 프로파일 또는 바이오마커 프로파일의 변화는 예를 들어, 기본 질환 과정을 포함한, 병태에 대한 치료 과정의 직접 결정을 가능하게 한다.
A. 대상체 등록
임상 시험은 잠재적 치료 중재술, 예컨대 약제의 효능 및 안전성을 검사하기 위한 대상체의 등록을 포함한다. 전형적으로, 대상체는 상이한 상태의 병태를 갖도록 선택되고, 예를 들어, 질환 진단을 받거나 또는 받지 않거나, 상이한 질환 병기 또는 상이한 질환 아형 또는 상이한 예후의 대상체이다. 임상 시험 대상체는 동일하거나 또는 상이하게 치료하려는 상이한 그룹으로 계층화될 수 있다. 계층화는 질환의 병기를 포함한, 임의 수의 요인들을 기반으로 할 수 있다. 질환 병기결정은 병인학, 병태생리학 및 중증도와 같은 요인을 기반으로 환자의 클러스터를 생성시키기 위해 진단 소견을 사용하는 분류 체계이다. 이것은 진료 품질, 임상 결과의 분석, 자원의 활용성, 및 대체 치료의 효능을 평가하기 위해 임상적으로 균질한 환자를 클러스터링하기 위한 기초로서 제공될 수 있다.
한 방법에서, 잠재적 임상 시험 대상체는 바이오마커 프로파일 상에서 적어도 부분적으로 계층화된다. 따라서, 예를 들어, 상이한 바이오마커 프로파일 (예를 들어, 더 높고 더 낮은 상대량)을 갖는 대상체는 상이한 그룹으로 배정될 수 있다.
임상 시험에서 대상체의 집단은 약물이 결과에서 통계적으로 유의한 차이를 생성시키는지 여부를 확인하기에 충분해야 한다. 이러한 파워 수준에 따라서, 시험에서 개체수는 적어도 20명, 적어도 100명 또는 적어도 500명 대상체일 수 있다. 이들 중에서, 신경퇴행성 병태를 갖는 것과 일관된 바이오마커 프로파일 (예를 들어, 바이오마커의 증가된 수준)을 나타내는 유의한 수의 개체가 존재해야만 한다. 예를 들어, 대상체의 적어도 20%, 적어도 35%, 적어도 50%, 또는 적어도 66%는 초기에 이러한 바이오마커 프로파일 (예를 들어, 다양한 종의 신호전달 키나제 포함)을 가질 수 있다. 또한, 유의한 수의 대상체는 클래스 상태 간에 분류되어야 한다. 예를 들어, 대상체의 적어도 20%, 적어도 35%, 적어도 50%, 적어도 66% 또는 100%는 초기에 신경퇴행성 병태 (예를 들어, 시뉴클레인병증성 병태 (예를 들어, PD), 아밀로이드병증성 병태, 타우병증성 병태 및 헌팅톤병)의 진단을 받을 수 있다.
B. 약물 개발
임상 시험의 개시 시에 상이한 계층화 그룹에 대한 치료 중재술의 유효성은 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함하는 바이오마커 프로파일에 대한 효과의 함수로서 신속하게 결정될 수 있다. 보다 특히, 바이오마커 프로파일의 변화는 치료 중재술의 임상 유효성을 예측한다. 방법은 일반적으로 첫째로 신호전달 키나제, 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질을 포함하는 바이오마커 프로파일을 결정하기 위해서 개체를 검사하는 단계를 포함한다. 측정 이후에, 치료 중재술, 예를 들어, 실험 약물은 적어도 대상체의 서브세트에 투여된다. 전형적으로, 적어도 대상체의 서브세트는 위약이 제공되거나 또는 치료를 받지 않는다. 일부 경우에, 대상체는 그들 자신의 대조군으로서, 먼저 위약을 받고, 그 다음에 비교를 위해서, 실험 중재술, 또는 그 반대를 받는다. 일부 예에서, 이것은 이미 인정된 치료 형태의 투여와 함께 수행될 수 있다. 집단은 치료 중재술의 투여의 투약량, 시기 및 속도 관점에서 나눌 수 있다. 윤리적 고려 사항은 윤리적으로 유의한 개선이 검사 대상체에서 확인될 때 연구의 중지를 요구할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "실험 약물" 및 "약물 후보"는 치료 효과를 갖거나 또는 치료 효과에 대해 검사되는 작용제를 의미한다. "추정 신경보호제"는 신경보호 작용을 갖거나 또는 신경보호 작용에 대해 검사되는 작용제를 의미한다.
치료 중재술의 투여 이후에, 바이오마커 프로파일을 다시 결정한다.
치료 중재술은 약물 후보의 투여일 수 있다. 표준 통계 방법을 사용하여, 치료 중재술이 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함하는 바이오마커 프로파일에 대해서 의미있는 영향을 갖는지 여부를 결정할 수 있다. 일반적으로, 초기 바이오마커 프로파일과 비교하여, 통계적으로 유의한 변화, 특히 정상 프로파일로의 이동은 치료 중재술이 신경보호적이고 따라서 신경퇴행성 병태 (예를 들어, 시뉴클레인병증성 병태, 아밀로이드병증성 병태, 타우병증성 병태, 헌팅톤병)의 임상 발병을 지연시키거나, 또는 진행을 둔화시키거나 또는 바람직하게 반전시키게 되는 것을 의미한다.
따라서, (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함하는 바이오마커 프로파일을 측정할 수 있는 대상체는 예를 들어, (1) 신경퇴행성 병태 (예를 들어, 시뉴클레인병증성 병태, 아밀로이드병증성 병태, 타우병증성 병태, 헌팅톤병)에 무증상인 대상체; (2) 최소의 신경퇴행성 질환 증상을 갖고 신경퇴행성 병태를 암시하는 징후가 없는 (예를 들어, 특히 일정 유전적 및/또는 환경적 위험 요인이 확인되었을 때, 신경퇴행성 병태가 "의심"되거나 또는 "전임상"으로 진단될 수 있는) 대상체 ; (3) "가능성 있는" 신경퇴행성 병태의 진단을 받은 대상체 및 신경퇴행성 병태로 진단 ("확정 진단") 받은 대상체를 포함한다. 이들은 예를 들어, (1) 시뉴클레인병증성 병태에 무증상인 대상체, (2) 최소 파킨슨병 증상을 갖고 시뉴클레인병증성 병태를 암시하는 징후가 없는 (예를 들어, 특히 일정 유전적 및/또는 환경적 위험 요인이 확인되었을 때, PD 또는 일부 관련 시뉴클레인병증에 대해 "의심"되거나 또는 "전임상"으로 진단될 수 있는) 대상체; (3) "가능성있는" 시뉴클레인병증 (예를 들어, PD)의 진단을 받은 대상체 및 시뉴클레인병증성 병태로 진단 ("확정 진단")받은 대상체를 포함한다
대상체는 전형적으로 인간이고 또한 인간 이외의 동물, 예를 들어, PD 모델에 사용되는 것들, 예컨대, 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트), 고양이, 개, 다른 가축화된 네발 동물 (예컨대, 말, 양 및 돼지) 및 비인간 영장류 (예를 들어, 원숭이)를 포함한다. 동물 모델은 유전적 모델 및 신경독소의 투여를 기반으로 하는 모델 둘 모두를 포함한다. 이러한 모델에서 사용되는 신경독소는 예를 들어, 6-히드록시도파민 (6-OHDA) 및 1-메틸-1,2,3,6- 테트라히드로피리딘 (MPTP) 투여, 및 파라콰트 및 로테논을 포함한다. 유전적 모델은 SNCA (α-syn, PARK1, 및 4), PRKN (파킨 RBR E3 유비퀴틴 단백질 리가제, PARK2), PINK1 (PTEN-유도 추정 키나제 1, PARK6), DJ-1 (PARK7), 및 LRRK2 (류신-풍부 반복부 키나제 2, PARK8)에 유전적 돌연변이를 포함한다.
신경퇴행성 병태, 예컨대 시뉴클레인병증을 위한 신경보호 요법에 대한 임상 시험은 잠재적 요법의 유효성을 신속하게 표시하는 측정치를 요구한다. 달리, 임상 관측을 기반으로 약물 효능의 결정은 일반적으로 수 개월이 걸린다. 신경퇴행성 단백질 올리고머 및, 임의로 단량체를 포함하는 바이오마커 프로파일은 이러한 측정치를 제공하여서, 치명적인 뇌 장애 예컨대 PD를 앓는 대상체에서 약물 효능을 변형시키는 질환의 실질적 평가를 가능하게 한다.
C. 검증
대상체는 그들이 임상 증상의 임상적으로 유의한 변화를 보이는 경우에 요법에 반응한다고 한다. 검사되는 약물의 효능은 전형적으로 임상 측정에 의해서, 예를 들어, 질환 증상, 징후 및 병기를 결정하여 검증된다. 이러한 임상 측정치는 본 명세서에 기술된 것들, 예컨대 수정 Hoehn 및 Yahr 병기결정 척도 및 통합 파킨슨병 등급 척도 (UPDRS)를 포함한다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 바이오마커 프로파일은 또한 요법에 대한 반응의 지표를 제공하고 다른 형태의 임상 평가에 비해서 훨씬 더 이른 기간에 그렇게 할 수 있다. 이것은 전형적으로 약물이 전통적인 방법을 사용해 검증된 이후에 일어나게 된다. 그러나, 바이오마커 프로파일은 대상체 또는 대상체의 집단에서 약물의 효능을 결정하기 위해서 임상 마커이외에도 또는 그 대신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 요법의 개시 이후에 오직 약 18개월에 전형적인 수단으로 검출할 수 있는 반응은 요법의 개시 이후에 최소 12개월, 6개월 또는 3개월에 바이오마커 프로파일에서 검출할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 요법에 대한 반응의 결정은 제1 시점에 대상체의 제1 바이오마커 프로파일을 결정하는 단계, 치료 중재술을 대상체에게 투여하는 단계; 치료 중재술의 투여 이후에 예를 들어, 요법 개시의 약 1개월, 3개월, 6개월, 9개월, 12개월, 15개월, 또는 18개월 중 어느 하나 이내에 제2 바이오마커 프로파일을 결정하는 단계; 및 변화를 확인하기 위해서 제1 및 제2 바이오마커 프로파일을 비교하는 단계를 포함한다. 바이오마커 프로파일의 통계적으로 유의한 편차가 없음은 요법에 대한 무반응을 의미한다. 정상 바이오마커 프로파일을 향한 통계적으로 유의한 변화는 요법에 대한 양성 반응을 의미하는 한편 정상 프로파일로부터 멀어지는 통계적으로 유의한 변화는 요법에 대한 음성 반응, 또는 질환의 진행을 의미한다. 정상 프로파일이 치료 중재술을 개시하기 전에 알려진 경우, 제1 바이오마커 프로파일의 측정은 생략될 수 있고 결정은 제2 바이오마커 프로파일에 의존적일 수 있다.
VII. 치료 방법
대상체가 본 명세서에 기술된 바와 같은 바이오마커 프로파일을 기반으로 분류되는 신경퇴행성 병태 (예를 들어, 시뉴클레인병증성 병태, 아밀로이드병증성 병태, 타우병증성 병태, 헌팅톤병)의 병기 또는 클래스에 의존하여, 대상체는 치료 중재술을 필요로 할 수 있다. 본 명세서는 병태를 치료하는데 유용한 치료 중재술을 사용하여, 신경퇴행성 병태 (예를 들어, 시뉴클레인병증성 병태, 및 아밀로이드병증성 병태, 타우병증성 병태, 헌팅톤병)를 나타낸다고, 본 명세서에 개시된 방법을 통해서, 결정된 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 변화하는 치료 중재술 및 특히 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 수준을 복귀시키는 것은 유효한 치료, 예를 들어, 본 명세서의 방법으로 개발되고 임상적으로 검증된 치료 중재술을 반응한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료 중재술", "요법" 및 "치료"는 치료적 효과를 생성시키는 (예를 들어, "치료적으로 유효한") 중재술을 의미한다. 치료적으로 유효한 중재술은 질환, 예컨대 시뉴클레인병증성 병태를 예방하거나, 병태의 진행을 둔화시키거나, 증상의 발병을 지연시키거나, 병태를 개선 (예를 들어, 관해 야기)시키거나, 증상을 개선시키거나, 또는 치유한다. 치료 중재술은 예를 들어, 치료의 투여, 약제의 투여, 또는 치료 목적이 있는 생물제제 또는 기능식품 물질을 포함할 수 있다. 치료 중재술에 대한 반응은 완전할 수 있거나 또는 부분적일 수 있다. 일부 양태에서, 질환의 중증도는 예를 들어, 투여 전 개체 또는 치료를 겪지 않은 대조군 개체와 비교하여 적어도 10% 만큼 감소된다. 일부 양태에서 질환의 중증도는 적어도 25%, 50%, 75%, 80%, 또는 90% 만큼 감소되거나, 또는 일부 경우에, 표준 진단 기술을 사용해 더 이상 검출가능하지 않다. 대상체의 일정 하위 그룹이 요법에 반응하지 않을 수 있다는 것을 인식하면, 치료 유효성의 한 측정치는 적어도 100명 대상체에 대해 중재술을 받은 대상체의 적어도 90%에 대한 유효성일 수 있다.
치료 중재술 ("유효 치료" 또는 "유효한 치료") 또는 약제학적 약물의 양 ("유효량")을 수식하는 본 명세서에서 사용되는 용어 "유효한"은 상기 기술된 바와 같이, 장애를 호전시키기 위한 치료 또는 양을 의미한다. 예를 들어, 소정 매개변수 경우에, 치료적 유효량은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 또는 적어도 100%의 매개변수의 증가 또는 감소를 보일 것이다. 치료적 효능은 또한 "-배" 증가 또는 감소로서 표시될 수 있다. 예를 들어, 치료적 유효량은 대조군에 비해서 적어도 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 5-배, 또는 그 이상의 효과를 가질 수 있다. 현재, 파킨슨병 대상체에서 운동 증상의 중증도에 대한 임상적 효능은 UPDRS 및 Hoehn 및 Yahr 척도와 같은 표준화된 척도를 사용해 측정할 수 있고; 금속 및 인지 증상 경우에 ADAS-cog 또는 MMPI 척도로 측정할 수 있다 (이러한 척도의 유용성은 질환 병태의 근원이 되는 성질 또는 유형에 반드시 의존할 필요는 없다는 것을 인식함).
따라서, 일부 방법에 따라서 대상체는 첫째로 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태 및/또는 단량체 형태를 포함하는 바이오마커 프로파일에 대해 검사된다. 적절한 병태 또는 클래스로 분류는 바이오마커 프로파일을 기반으로 결정된다. 분류를 기반으로 대상체에게 최적으로 유효한 치료 중재술을 투여하는 유형, 양, 경로, 및 시기에 관해 결정할 수 있다.
A. 시뉴클레인병증성 병태
일정 구현예에서, PD에 대한 증상 변경 치료 중재술 (즉, 증상 또는 완화 치료)은 도파민 효현제 (예를 들어, 프라미펙솔 (예를 들어, Mirapex™), 로피니롤 (예를 들어, Requip), 로티고틴 (예를 들어, Neupro), 아포모르핀 (예를 들어, Apokyn)), 레보도파, 카르비도파-레보도파 (예를 들어, Rytary, Sinemet), MAO-B 억제제 (예를 들어, 셀레길린 (예를 들어, Eldepryl, Zelapar) 또는 라사길린 (예를 들어, Azilect)), 카테콜-O-메틸트랜스퍼라제 (COMT) 억제제 (예를 들어, 엔타카폰 (Comtan) 또는 톨카폰 (Tasmar)), 항콜린제 (예를 들어, 벤즈트로핀 (예를 들어, Cogentin) 또는 트리헥시페니딜), 아만타딘 또는 콜린에스터라제 억제제 (예를 들어, 리바스티그민 (Exelon)) 또는 일부 유사한 작용제 또는 작용제의 그룹으로부터 선택되는 약물의 투여를 포함한다.
다른 구현예에서, 약물은 NK1-길항제 및 6-프로필아미노-4,5,6,7-테트라히드로-1,3-벤조티아졸-2-아민의 병용물이다. 예를 들어, NK1-길항제는 롤라피탄트 또는 아프레피탄트일 수 있고, 6-프로필아미노-4,5,6,7-테트라히드로-1,3-벤조티아졸-2-아민은 프라미펙솔 디히드로클로라이드 일수화물일 수 있다. 예를 들어, 아프레피탄트의 일일 용량은 10 mg 내지 250 mg일 수 있고, 프라미펙솔 디히드로클로라이드 일수화물의 일일 용량은 1.5 mg 내지 45 mg일 수 있다 (참조: 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2020/0147097). 다른 구현예에서, 약물은 6-프로필아미노-4,5,6,7-테트라히드로-1,3-벤조티아졸-2-아민의 치료적으로 유효한 일일 용량과 병용하여 5HT3-길항제의 전달을 포함하는 병용 산물, 예를 들어, 온단세트론 히드로클로라이드 이수화물 및 프라미펙솔 디히드로클로라이드 일수화물의 병용물이다. 온단세트론 히드로클로라이드 이수화물의 일일 용량은 4 mg 내지 32 mg일 수 있고 프라미펙솔의 일일 용량은 1.5 mg 내지 42 mg일 수 있다 (참조: 예를 들어, 미국 특허 제10,799,484호). 일정 구현예에서, PD에 대한 신경보호적 또는 질환 변경 치료 중재술은 그들 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 임의의 하기 특허 가출원에 기술된 바와 같은 추정 질환 변경 약물의 투여를 포함한다: 2017년 3월 27일 출원된 가출원 제62/477187호; 2017년 4월 10일 출원된 가출원 제 62/483,555호; 2017년 4월 13일 출원된 가출원 제62/485,082호; 2017년 5월 26일 출원된 가출원 제62/511,424호; 2017년 7월 3일 출원된 가출원 제62/528,228호; 2017년 4월 24일 출원된 가출원 제62/489,016호; 2017년 6월 30일 출원된 가출원 제62/527,215호.
B. 아밀로이드병증성 병태
일정 구현예에서, 아밀로이드병증성 병태에 대한 증상 변경 치료 중재술 (즉, 증상 또는 완화 치료)은 약물 예컨대 Razadyne® (갈란타민), Exelon® (리바스티그민), 및 Aricept® (도네페닐)의 투여를 포함한다.
C. 타우병증성 병태
일정 구현예에서, 타우병증성 병태에 대한 증상 변경 치료 중재술 (즉, 증상 또는 완화 치료)은 약물 예컨대 Razadyne® (갈란타민), Exelon® (리바스티그민), 및 Aricept® (도네페닐) 또는 PD의 증상 치료에 사용되는 본 명세서에 인용된 것들의 투여를 포함한다.
D. 헌팅톤병
일정 구현예에서, 헌팅톤병에 대한 증상 변경 치료 중재술 (즉, 증상 또는 완화 치료)은 약물 예컨대 테트라베나진 (Austedo® (듀테트라베나진), IONIS-HTTRx 를 비롯하여, 다양한 신경이완제 및 벤조디아제핀의 투여를 포함한다.
VIII. 치료 중재술에 대한 반응도 평가 방법
신경퇴행성 장애 (예를 들어, 시뉴클레인병증성 병태, 아밀로이드병증성 병태, 타우병증성 병태, 헌팅톤병)를 앓는 대상체에서, 치료 중재술의 유효성 또는 치료 중재술에 대한 대상체의 반응도는 바이오마커 프로파일에 대한 치료 중재술의 효과를 평가하여 결정할 수 있다. 이것은 임의의 신경퇴행성 상태, 예를 들어, 진단, 병기, 진행, 예후 및 위험성의 유효성을 포함한다. 보다 정상적인 프로파일로 바이오마커 프로파일의 변화는 치료 중재술의 유효성을 의미한다.
(1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커 세트를 포함하는 바이오마커 프로파일의 사용은 이러한 상황에서 치료 효능을 판단하기 위한 통상의 수단 (예를 들어, 증상학, 기능적 척도 또는 방사선 스캔의 변화)에 비해서 장점을 부여한다. 효능을 판단하는 그러한 통상의 수단은 둔감하고 부정확하며 반정량적일뿐만 아니라, 전형적으로 정확하게 측정하기 위해 충분한 규모가 되기 전에 오랜 기간 (예를 들어, 수년)을 요구한다. 따라서, 검사된 잠재적으로 유용한 치료의 수는 유의하게 감소되고, 임상 시험의 비용 및 따라서 유용한 약물의 최종 비용이 실질적으로 증가된다.
일정 구현예에서, 단백질 바이오마커 종의 바이오마커 프로파일은 전형적으로 치료 중재술의 투여 이전, 그 동안 및 그 이후에 복수 횟수로, 또는 치료 중재술 이후 다수 시점에 측정된다.
IX. 키트
다른 양태에서, 본 명세서는 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택된 바이오마커를 검출하고, 그렇게 수득된 결과를 해석하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 체액으로부터 엑소솜을 단리하기 위한 시약을 수용하는 용기, 모든 엑소솜으로부터 뉴런 유래 엑소솜을 우선적으로 단리하기 위한 시약, 및 키나제 및/또는 신경퇴행성 단백질의 형태를 검출하기에 충분한 시약을 포함할 수 있다.
예를 들어, 생물학적 샘플에서 시뉴클레인병증성 질환 상태를 검출하고 병기를 결정하는데 사용을 위한 키트는 이러한 목적에 특이적인 시약, 완충제, 효소, 항체 및 다른 조성물을 포함할 수 있다. 키트는 또한 전형적으로 사용 설명서를 비롯하여 데이터 분석 및 해석을 위한 소프트웨어를 포함할 수 있다. 키트는 규범적 표준으로서 제공되는 샘플을 더 포함할 수 있다. 각각의 용액 또는 조성물은 바이알 또는 병에 함유될 수 있고 모든 바이알은 상업적 판매를 위해 상자 내 밀폐부에 수용될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 예시로 제한없이 제공된다.
I. 실시예 1: 키나제는 시뉴클레인병증성 병태에서 상이하게 활성화된다
시뉴클레인병증성 병태로 진단받고 활성 치료 중재술을 받고 나서 상이한 아마도 불활성으로 알려진 것을 받거나, 또는 그 반대로 받은 코호트가 연구 대상체이다. 또는, 시뉴클레인병증성 병태로 진단된 복수의 대상체에서 시뉴클레인병증성 병태에 무증상인 복수의 대상체를 포함하는 코호트가 연구의 대상체이다. 양쪽 경우에, 정맥 혈액 샘플은 기준점 또는 대조군 (예를 들어, 불활성 중재 치료) 병태 및 다시 잠재적 활성 (예를 들어, 실험 중재술) 치료의 투여 동안을 포함하여, 다양한 시점에 정맥천자를 통해서 각 대상체로부터 채취된다. 뉴런 유래 엑소솜은 본 명세서에 기술된 방법을 사용해 혈액으로부터 단리된다. 단리된 엑소솜 내에 함유된, (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커의 양이 측정된다. 발현 패턴을 결정한다. 결과는 시뉴클레인병증성 병태로 진단된 대상체의 코호트에서 신호전달 키나제 및 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태의 활성은 통계적으로 유의한 정도로 상이하다는 것을 보여준다. 이 바이오마커 어세이의 결과에서 유의한 변화를 갖는 것으로 확인된 것들은 이후에 임상 상태에서 비례적인 변화를 갖는 것으로 확인된다.
II. 실시예 2: 대상체 계층화/임상 시험
PD가 없고 PD가 있는 지원자 대상체는 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택된 바이오마커의 양을 뉴런 유래 엑소솜에서 결정하기 위해 검사된다. 결정된 양을 기반으로 하고, 상기 실시예에서 결정된 컷오프를 사용하여, 대상체는 몇개 검사 그룹으로 클러스터링된다. 일정 검사 그룹은 위약을 받는다. 다른 검사 그룹은 임상 시험에서 상이한 양의 화합물이 투여된다. 투여 동안 및/또는 이후에, 검사를 반복한다. 수집된 측정값을 분석한다. 치료 중재술은 신호전달 키나제의 활성 및 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태의 양에 통계적으로 유의한 변화를 일으키는 것으로 결정된다.
III. 실시예 3: 시뉴클레인병증에 대해 신경보호적인 약물 후보의 임상 시험
제II상 연구의 목표는 PD 및 관련 장애를 갖는 환자에서, 아프레피탄트과, 임의로 로바스타틴 또는 유사하게 유효한 약물과 함께 또는 없이, 프라미펙솔의 안전성, 내약성 및 초기 효능을 평가하는 것이다. PD (PD), 다계통 위축증 (MSA), 루이 소체 치매 (LBD), 또는 관련 시뉴클레인병증 장애를 갖는 30명 이하의 환자에서 순차적 치료, 증량, 교차, 외래 환자 시험이 수행된다. 참가자 중 누구도 의학적으로 허용되는 것으로 간주되는 정도까지 시험 전반에서 안정한 용량으로 유지되는, 레보도파-카르비도파 (Sinemet)를 제외하고, 연구 진입 전 3개월 동안 도파민 효현제 또는 다른 중추 활성 약제로 치료받은 것을 허용하지 않는다. 통합 PD 등급 척도 (UPDRS-파트 III) 및 바이오마커 단백질 결정을 포함한, 기준점 임상 및 실험실 평가에 따라, 등록 기준을 충족하는 동의 개체는 그들 예비-연구 PD 치료 용법에서 프라미펙솔 ER 및 아프레피탄트를 포함하는 것으로 전환된다. 프라미펙솔 ER 용량은 최적 내약성 (또는 최대 9 mg/일)으로 적정된 다음에 최대 약 12주 내지 16주 동안 안정하게 유지된다. 다음으로 이의 최대 승인 용량으로 제공되는 추가 약물 (예를 들어, 스타틴)과의 공동 치료는 임상적으로 적절하다고 간주되는 추가 3개월 동안 시작될 수 있고, 이 시간에 모든 대상체는 그들의 입원전 치료 용법으로 돌아간다. 시험 동안, 기준점 효능 및 안전성 측정은 바이오마커 수준의 결정을 포함하여 정기적인 간격으로 반복되었다. 효능은 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함하는 바이오마커 프로파일의 정상을 향한 통계적으로 유의한 변화의 함수로서 결정된다.
IV. 실시예 4: 진단
대상체는 이러한 질병의 많은 구별되는 임상 특징이 여전이 결여될 때 PD와 일치하지만, 전임상 수준으로 일정 증상을 갖는 것으로 나타난다. 혈액은 정맥천자를 통해서 대상체로부터 채취된다. (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커의 양은 혈액 중 뉴런 유래 엑소솜으로부터 측정된다. 바이오마커 프로파일이 결정된다. 진단 알고리즘은 PD의 진단과 일치하도록 프로파일을 분류한다. 대상체는 PD로 진단받고, 증상을 완화시키기 위한 완화제, 또는 신경보호의 목적을 위한 병인학에 대한 치료인, 치료 용법에 배치된다.
V. 실시예 5: 병기결정
대상체는 PD의 진단을 받도록 참석한다. 의사는 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함하는 바이오마커 프로파일을 결정하기 위해 대상체에 대해 혈액 검사를 주문한다. 바이오마커 프로파일을 기반으로, 의사는 대상체가 PD의 초기 병기에 있고 따라서 특정 치료 중재술에 더 반응성이라고 결정한다.
VI. 실시예 6: 예후/진행
대상체는 PD의 진단을 받도록 참석한다. 의사는 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함하는 바이오마커 프로파일을 결정하도록 수 개월 간격으로 대상체에 대한 1차 및 2차 혈액 검사를 주문한다. 바이오마커 프로파일을 기반으로, 의사는 대상체의 질환이 서서히 진행되고 대상체가 위험한 치료 중재술없이도, 수년간 유효 수명을 가질 것으로 예상된다고 결정한다.
VII. 실시예 7: 위험성 평가
대상체는 시뉴클레인병증성 질환의 증상을 갖지 않는 신체 검사를 위해 참석한다. 이러한 경우에, 이 개체는 유전적 또는 환경적 위험 요인을 알고 있다. 의사는 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함하는 바이오마커 프로파일을 결정하기 위해 대상체에 대한 혈액 검사를 주문한다. 일부 또는 모든 측정가능한 종의 상대적으로 정상인 바이오마커 프로파일을 기반으로, 건강한 대조군 개체와 비교하여, 의사는 대상체가 낮은 PD 발병 확률을 갖는다고 결정한다.
VIII. 실시예 8: 요법에 대한 반응
대상체는 PD 진단을 받도록 참석한다. 의사는 치료를 시작하기 전에 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함하는 바이오마커 프로파일을 결정하기 위해 대상체에 대한 초기 혈액 검사를 주문한다. 일련의 치료 이후에, 임상 증상이 변화되기 전에, 의사는 2차 혈액 검사를 주문한다. 프로파일에서 정상을 향한 변화를 기반으로, 의사는 치료가 유효하거나 또는 용량을 변화시키거나 또는 반복할 필요가 있는지 여부를 결정한다.
IX. 실시예 9: 진단의 개발
상이한 진단 병기에 PD를 갖고 PD를 갖지 않는 지원자 대상체는 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함하는 바이오마커 프로파일을 결정하기 위해 검사된다. 결정된 바이오마커 프로파일을 기반으로, 대상체는 질환의 존재 또는 부재 및 임의로 질환의 병기를 나타내는 것으로 분류된다. 프로파일은 데이터 분석 이후에, 진단을 추론하는 분류 알고리즘을 생성시키는 컴퓨터화된 학습 알고리즘을 사용해 결정된다. 추론 모델은 바람직한 민감도 및 특이도를 갖는 검사를 생성시키도록 선택된다.
X. 실시예 10: 바이오마커 프로파일은 시뉴클레인병증성 병태에서 변화된다
연구의 대상체인 개체의 코호트는 시뉴클레인병증성 병태로 진단받았다. 대상체는 활성 치료 중재술을 받은 다음 상이한, 아마도 불활성으로 알려진 것을 받는다. 대안적으로, 중재술은 역순으로 제공될 수 있다. 또는 시뉴클레인병증성 병태로 진단된 복수의 대상체에서 시뉴클레인병증성 병태에 무증상인 복수의 대상체를 포함하는 코호트가 연구의 대상체이다. 양쪽 경우에, 정맥 혈액 샘플은 기준점 또는 대조군 (예를 들어, 불활성 중재 치료) 병태 하에서 및 다시 잠재적으로 활성 (예를 들어, 실험 중재) 치료의 투여 동안을 포함하여, 다양한 시점에 정맥천자를 통해 각 대상체로부터 채취된다. 뉴런 유래 엑소솜은 본 명세서에 기술된 방법을 사용해 혈액으로부터 단리된다. 단리된 엑소솜 내에 함유된 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택된 바이오마커의 양을 측정한다. 이들 데이터는 데이터세트로 조합된다. 데이터세트는 대상체를 시뉴클레인병증성 병태를 갖거나 또는 갖지 않는다고 분류해야하는지 여부를 추론하는 모델을 개발하기 위해서, 이 경우에, 학습 알고리즘, 예를 들어, 서포트 벡터 머신을 훈련시키는데 사용되는, 통계 방법을 사용해 분석된다. 결과는 시뉴클레인병증성 병태로 진단된 대상체의 코호트에서 신호전달 키나제의 일정 종이 다른 신호전달 키나제에 비해 통계적으로 유의한 정도로 상이한 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 또한, 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태도 역시 통계적으로 유의한 정도로 변화된다. 이러한 바이오마커 어세이의 결과에서 유의한 변화를 갖는 것으로 확인된 것들은 이후에 임상 상태에서 비례적 변화를 갖는 것으로 확인된다.
XI. 실시예 11: 대상체 계층화/임상 시험
PD를 갖지 않고 PD를 갖는 지원자 대상체는 뉴런 유래 엑소솜 중 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택된 바이오마커를 포함하는 바이오마커 프로파일을 결정하기 위해 검사된다. 결정된 바이오마커 프로파일을 기반으로, 상기 실시예에서 결정된 분류기를 사용하여, 대상체는 몇개 검사 그룹으로 클러스터링된다. 일정 검사 그룹은 위약을 받는다. 다른 검사 그룹은 임상 시험에서 상이한 양의 화합물이 투여된다. 투여 동안, 및 임의로 투여 이후에, 검사가 반복된다. 수집된 측정치를 분석한다. 치료 중재술은 바이오마커 프로파일의 정상을 향한 통계적으로 유의한 변화를 생성한다고 결정된다.
XII. 실시예 12: 시뉴클레인병증에 대한 신경보호적 약물 후보에 대한 임상 시험
제II상 연구의 목표는 PD 및 관련 장애를 갖는 환자에서, 아프레피탄트와, 임의로 로바스타틴 또는 유사하게 유효한 약물과 함께 또는 없이, 제공되는, 프라미펙솔의 안전성, 내약성 및 초기 효능을 평가하는 것이다. PD (PD), 다계통 위축증 (MSA), 루이 소체 치매 (LBD), 또는 관련 시뉴클레인병증 장애를 갖는 30명 이하의 환자에서 순차적 치료, 증량, 교차, 외래 환자 시험이 수행된다. 어떠한 참가자도 의학적으로 허용된다고 간주되는 정도까지 시험 전반에서 안정한 용량으로 유지되는, 레보도파-카르비도파 (Sinemet)를 제외하고, 연구 진입 전 3개월 동안 도파민 효현제 또는 다른 중추 활성 약제로 치료된 것이 허용되지 않는다. 통합 PD 등급 척도 (UPDRS-파트 III) 및 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함한 바이오마커 결정을 포함한, 기준점 임상 및 실험실 평가에 따라서, 등록 기준을 충족하는 동의 개체는 그들의 예비-연구 PD 치료 용법에서 프라미펙솔 ER 및 아프레피탄트를 포함한 것으로 전환한다. 프라미펙솔 ER 용량은 최적 내약성 (또는 최대 9 mg/일)으로 적정된 다음에 최대 약 12주 내지 16주 동안 안정하게 유지된다. 다음으로 이의 최대 승인 용량으로 제공된 추가 약물 (예를 들어, 스타틴)과의 공동 치료는 임상적으로 적절하다고 간주되는 추가 3개월 동안 시작될 수 있고, 이 시간에 모든 대상체는 그들 입원전 치료 용법으로 복귀한다. 시험 동안, 기준점 효능 및 안전성 측정은 바이오마커 수준의 결정을 포함하여 정기적인 간격으로 반복하였다. 효능은 바이오마커 프로파일의 정상을 향한 통계적으로 유의한 변화의 함수로서 결정된다.
XIII. 실시예 13: 진단
대상체는 PD와 일치하지만, 이러한 질병의 많은 구별되는 임상 특징이 여전히 결여될 때 전임상 수준으로 일정 증상을 갖는 것으로 나타난다. 혈액은 정맥천자를 통해 대상체로부터 채취된다. (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커의 양은 혈액 중 뉴런 유래 엑소솜으로부터 측정된다. 바이오마커 프로파일이 결정된다. 진단 알고리즘은 PD의 진단과 일치하도록 프로파일을 분류한다. 대상체는 PD로 진단받고, 증상을 완화시키기 위한 완화제, 또는 신경보호 목적을 위한 질환의 병인학에 대한 치료인, 치료 용법에 배치된다.
XIV. 실시예 14: 병기결정
대상체는 PD의 진단을 받도록 참석한다. 의사는 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함하는 바이오마커 프로파일을 결정하기 위해 대상체에 대해 혈액 검사를 주문한다. 바이오마커 프로파일을 기반으로, 의사는 대상체가 PD의 초기 병기이고 따라서 특정 치료 중재술에 더 반응성이라고 결정한다.
XV. 실시예 15: 예후/진행
대상체는 PD의 진단을 받도록 참석한다. 의사는 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함하는 바이오마커 프로파일을 결정하도록 수개월 간격으로 대상체에 대해 1차 및 2차 혈액 검사를 주문한다. 바이오마커 프로파일을 기반으로, 의사는 대상체의 질환이 서서히 진행되고 대상체가 위험한 치료 중재술없이도, 수년의 유효 수명을 가질 것으로 예상된다고 결정한다.
XVI. 실시예 16: 위험성 평가
대상체는 시뉴클레인병증성 질환의 증상이 없는 신체 검사를 위해 참석한다. 이러한 경우에, 이 개체는 유전적 또는 환경적 위험 요인을 알고 있다. 의사는 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함한 바이오마커 프로파일을 결정하기 위해 대상체에 대해 혈액 검사를 주문한다. 건강한 대조군 개체와 비교하여 바이오마커의 일부 또는 모든 측정가능한 종의 상대적으로 비정상적인 바이오마커 프로파일을 기반으로, 의사는 대상체가 낮은 PD 발병 확률을 갖는다고 결정된다.
XVII. 실시예 17: 요법에 대한 반응
대상체는 PD의 진단을 받도록 참석한다. 의사는 치료를 시작하기 전에 (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태, 또는 (2) 하나 또는 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각으로부터 선택되는 바이오마커를 포함한 바이오마커 프로파일을 결정하기 위해 대상체에 대한 초기 혈액 검사를 주문한다. 일련의 치료 이후에, 임상 증상이 변화되기 전에, 의사는 2차 혈액 검사를 주문한다. 정상을 향한 변화를 기반으로, 의사는 치료가 유효하거나 또는 용량이 변화 또는 반복을 필요로 하는지 여부를 결정한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시하지 않으면 하기 의미들이 적용된다. 단어 "할 수 있다"는 의무적 의미 (즉, 해야한다 의미)라기 보다는, 허용적 의미 (즉, 잠재성을 갖는다는 의미)로 사용된다. 단어 "포함하다", "포함하는", 및 "포함한다" 등은 포함하는을 의미하지만, 이에 제한되지 않는다. 단수형 "한", "하나", 및 "그"는 복수 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "한 구성요소"에 대한 참조는 하나 이상의 구성요소에 대한 다른 용어 및 어구, 예컨대 "하나 이상"의 사용에도 불구하고, 둘 이상의 구성요소의 조합을 포함한다. 용어 "또는"은 달리 표시하지 않으면, 비배타적이고, 다시 말해서, "및"과 "또는" 둘 모두를 포괄한다. 수식어 및 배열 사이에서 용어 "어느 하나"는 수식어가 배열의 각 구성원을 수식한다는 것을 의미한다. 그래서, 예를 들어, 어구 "1, 2 또는 3 중 적어도 언어느 하나"는 "적어도 1, 적어도 2 또는 적어도 3"을 의미한다. 어구 "적어도 하나의"는 "복수의"를 포함한다. 용어 "본질적으로 이루어지는"은 나열된 구성요소 및 청구된 조합의 기본 및 신규 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 구성요소의 포함을 의미한다.
본 발명의 일정 구현예가 본 명세서에 표시되고 기술되었지만, 이러한 구현예는 오직 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 자명하다. 본 발명을 벗어나지 않고 수많은 변동, 변화 및 대체가 당업자에게 일어날 것이다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명의 실시에서 적용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 하기 청구항이 본 발명의 범주를 한정하고 이들 청구항의 범주 내에 속하는 방법 및 구조 및 그들 균등물을 이에 포괄하고자 한다.
본 명세서에 언급되는 모든 공개물 및 특허 출원은 각각의 개별 공개물 또는 특허 출원이 특별히 개별적으로 참조로 편입시킨다고 표시한 바와 동일한 정도로 참조로 본 명세서에 편입된다.

Claims (130)

  1. a) 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 생물학적 샘플의 컬렉션 중 각각의 생물학적 샘플을 농축하는 단계로서,
    (i) 생물학적 샘플의 컬렉션은 대상체의 코호트 중 대상체로부터 유래되고, 코호트는
    (1) 복수의 상이한 질환 병기의 각각에서 신경퇴행성 병태로 진단된 복수의 대상체로서, 진단된 대상체의 각각은 추정 신경보호제를 투약받은 적이 있는 것인 복수의 대상체, 및/또는
    (2) 복수의 건강한 대조군 대상체
    를 포함하는 대상체를 포함하고,
    생물학적 샘플은 추정 신경보호제의 투여 이전 및 다시 그 동안 및, 임의로, 그 이후 하나 이상의 시간에 수집되는 것인, 단계;
    b) 바이오마커 샘플을 생성시키기 위해, 미세입자, 예를 들어, 엑소솜의 내부 구획으로부터 단백질 내용물을 단리하는 단계;
    c) 데이터세트를 생성시키기 위해 바이오마커 샘플 중에서 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는
    (i) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는
    (ii) 복수의 상이한 신호전달 키나제
    를 포함하는 것인 단계; 및
    d) (i) 질환 진행 속도 또는 추정 신경보호제에 대한 반응 정도를 예측하는 진단 알고리즘을 결정하기 위해 시간 경과에 따라 개별 대상체에서; 또는
    (ii) (1) 병원성 진단을 하거나, (2) 임상적으로 유사하지만 병인학적으로 상이한 신경퇴행성 장애 서브그룹을 분리하거나, 또는 (3) 대상체가 추정 신경보호제에 반응할 가능성이 있는지 여부 또는 정도를 예측하는 진단 알고리즘을 결정하기 위해 상이한 대상체 간에
    바이오마커 세트의 차이를 비교하기 위해 데이터세트에 대해 통계 분석을 수행하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 농축 단계 전에,
    I) 대상체의 코호트를 제공하는 단계로서, 코호트는 (i) 복수의 상이한 질환 병기의 각각에서 신경퇴행성 병태로 진단된 복수의 대상체, 및/또는 (ii) 복수의 건강한 대조군 대상체를 포함하는 대상체를 포함하는 것인 단계;
    II) 진단된 대상체의 각각에게 추정 신경보호제를 투여하는 단계;
    III) 추정 신경보호제의 투여 이전 및 다시 그 동안 및, 임의로, 그 이후에 하나 이상의 시간에, 코호트의 대상체의 각각으로부터 생물학적 샘플을 수집하는 단계
    를 더 포함하는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택되는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택되는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20인, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    e) 표준 임상 측정에 대해 하나 이상의 진단 알고리즘을 검증하는 단계
    를 더 포함하는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 통계 분석은 상관분석, 피어슨 상관계수, 스피어먼 상관계수, 카이-제곱 검정, 평균의 비교 (예를 들어, 대응 T-검정, 독립 T-검정, ANOVA) 회귀 분석 (예를 들어, 단순 회귀, 다중 회귀, 선형 회귀, 비-선형 회귀, 로지스틱 회귀, 다항 회귀, 단계적 회귀, 리지 회귀, 라쏘 회귀, 엘라스틱넷 회귀) 또는 비-모수적 분석 (예를 들어, 윌콕슨 순위-총합 검정, 윌콕슨 부호-순위 검정, 부호 검정)을 포함하는 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 통계 분석은 컴퓨터에 의해 실행되는 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 통계 분석은 기계 학습을 포함하는 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 신경퇴행성 병태는 시뉴클레인병증성 장애인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 시뉴클레인병증성 장애는 파킨슨병인, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 시뉴클레인병증성 장애는 루이 소체 치매인, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 표준 임상 측정은 UPDRS 점수, CGI 점수 및 방사선학적 소견으로부터 선택되는 것인, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 신경퇴행성 병태는 아밀로이드병증, 타우병증 또는 헌팅톤병인, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플은 정맥 혈액 샘플을 포함하는 것인, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상이한 질환 병기는 의심, 초기, 중간, 및 임상적 후기 중 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 투여 동안 또는 이후 시간은 치료 이후 1개월, 2개월, 3개월 또는 그 이상의 개월로부터 선택되는 것인, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 농축 단계는 하나 이상의 뇌-특이적 단백질 마커를 사용하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 적어도 하나의 뇌-특이적 마커는 K1cam을 포함하는 것인, 방법.
  22. 제1항에 있어서, 단리 단계는 표면 막-결합된 단백질을 제거하기 위해 각각의 농축된 샘플 중 엑소솜을 세척하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 엑소솜은 PBS로 세척하는 것인, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 신경퇴행성 단백질의 형태는 겔 전기영동, 웨스턴 블롯 또는 형광 기술을 통해 측정하는 것인, 방법.
  25. a) 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 대상체로부터의 생물학적 샘플을 농축하는 단계;
    b) 바이오마커 샘플을 생성시키기 위해, 미세입자, 예를 들어, 엑소솜의 내부 구획으로부터 단백질 내용물을 단리하는 단계;
    c) 데이터세트를 생성시키기 위해 바이오마커 샘플 중에서 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는
    (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는
    (2) 복수의 상이한 신호전달 키나제
    를 포함하는 것인, 단계; 및
    d) (1) 병원성 진단, (2) 복수의 임상적으로 유사하지만 병인학적으로 상이한 신경퇴행성 장애 서브그룹 중 하나로 대상체의 분류, 또는 (3) 대상체가 추정 신경보호제에 반응할 가능성이 있는지 여부 또는 정도의 예측 중 하나를 수행하기 위해 데이터세트를 사용하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 사용 단계는 데이터세트에 대해서, 제1항의 진단 알고리즘을 실행하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제인, 방법.
  28. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택되는 것인, 방법.
  29. 제25항에 있어서, 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택되는 것인, 방법.
  30. 제25항에 있어서, 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20인, 방법.
  31. 제25항에 있어서, 뉴런 유래 엑소솜을 단리하는 단계는
    (i) 초-원심분리;
    (ii) 밀도 구배 원심분리; 또는
    (iii) 크기 배제 크로마토그래피
    를 포함하는 것인, 방법.
  32. 제25항에 있어서, 뉴런 유래 엑소솜을 단리하는 단계는 뇌-특이적 단백질에 결합하는 결합 모이어티를 사용하는 뉴런 유래 엑소솜을 포획하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 뇌-특이적 단백질은 L1CAM인, 방법.
  34. 제25항에 있어서, 단리된 엑소솜의 표면으로부터 단백질을 제거하는 단계는 수성 용액 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수 ("PBS"))으로 단리된 엑소솜을 세척하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  35. 제25항에 있어서, 신경퇴행성 단백질의 양을 결정하는 단계는
    i) 올리고머 α-시뉴클레인의 종을 복수의 분획으로 분리하는 단계;
    ii) 하나 또는 복수의 분리된 올리고머 α-시뉴클레인 종의 각각 및, 임의로, 단량체 α-시뉴클레인, 타우-시뉴클레인 공중합체, 아밀로이드 베타-시뉴클레인 공중합체 및 타우-아밀로이드 베타-시뉴클레인 공중합체로부터 선택되는 하나 또는 복수의 종을 측정하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 종을 복수의 분획으로 분리하는 단계는 전기영동을 통해 분리하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 종을 복수의 분획으로 분리하는 단계는 크로마토그래피를 통해 분리하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  38. 제35항에 있어서, 분리된 종 중에서, 2 내지 약 100 단량체 단위, 4 내지 16 단량체 단위 및 약 30 이하의 단량체 단위를 갖는 형태로부터 선택되는 α-시뉴클레인의 적어도 하나의 올리고머 형태를 결정하는 것인, 방법.
  39. 제35항에 있어서, 분리된 종 중에서, 단량체 α-시뉴클레인의 정량적 측정치를 결정하는 것인, 방법.
  40. 제35항에 있어서, 분리된 종 중에서, 복수의 상이한 올리고머 α-시뉴클레인 종을 측정하는 것인, 방법.
  41. 제35항에 있어서, 분리된 종 중에서 α-시뉴클레인 및 타우를 포함하는 공중합체를 측정하는 것인, 방법.
  42. 제35항에 있어서, 분리된 종 중에서, α-시뉴클레인 및 아밀로이드 베타를 포함하는 공중합체의 정량적 측정치를 결정하는 것인, 방법.
  43. 제35항에 있어서, 분리된 종을 측정하는 단계는 하나 또는 복수의 분리된 종을 면역어세이를 통해 검출하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 면역어세이는 면역블롯팅을 포함하는 것인, 방법.
  45. 제43항에 있어서, 면역어세이는 웨스턴 블롯을 포함하는 것인, 방법.
  46. 제43항에 있어서, 면역어세이는 직접 표지에 커플링된 항체를 사용하는 것인, 방법.
  47. 제43항에 있어서, 면역어세이는 간접 표지에 커플링된 항체를 사용하는 것인, 방법.
  48. 제25항에 있어서,
    I) 추정 신경보호제의 투여 이전 및 이후에 대상체에서 바이오마커를 측정하는 단계; 및
    II) 단백질의 양 또는 바이오마커의 패턴에서 변화를 결정하는 단계로서, 정상적인 양 또는 패턴을 향한 변화는 신경보호제의 효능을 의미하는 것인 단계
    를 더 포함하는 것인, 방법.
  49. 제25항에 있어서,
    2회의 상이한 시간에 대상체에서 바이오마커를 측정하는 단계; 및
    단백질의 양 또는 바이오마커의 패턴에서 변화를 결정하는 단계로서, 변화는 신경퇴행성 상태의 변화를 의미하는 것인 단계
    를 더 포함하는 것인, 방법.
  50. 제25항에 있어서, 시간 기간 동안 대상체로부터 복수의 생물학적 샘플을 수집하는 단계를 포함하고, 임의로 대상체는 시간 기간 동안 추정 또는 기지 신경보호제를 투약받고, 진단 알고리즘은 질환 진행 속도 또는 추정 신경보호제에 대한 반응 정도를 예측하는 것인, 방법.
  51. a) 복수의 대상체의 각각에 대해서, (1) 신경퇴행성 병태의 상태, 및 (2) 바이오마커 세트의 측정치를 의미하는 값을 포함하는 데이터세트를 제공하는 단계로서, 바이오마커 세트는
    (i) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는
    (ii) 복수의 상이한 신호전달 키나제
    를 포함하는 것인 단계; 및
    b) 개체에서 신경퇴행성 병태의 상태를 추론하는 모델을 개발하기 위해 데이터세트에 대해 통계 분석을 수행하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제인, 방법.
  53. 제51항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택되는 것인, 방법.
  54. 제51항에 있어서, 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택되는 것인, 방법.
  55. 제51항에 있어서, 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20인, 방법.
  56. 제51항에 있어서, 통계 분석은 컴퓨터에 의해 수행되는 것인, 방법.
  57. 제51항에 있어서, 통계 분석은 컴퓨터에 의해 수행되지 않는 것인, 방법.
  58. 제51항에 있어서, 통계 분석은 상관분석, 피어슨 상관계수, 스피어먼 상관계수, 카이-제곱 검정, 평균의 비교 (예를 들어, 대응 T-검정, 독립 T-검정, ANOVA) 회귀 분석 (예를 들어, 단순 회귀, 다중 회귀, 선형 회귀, 비-선형 회귀, 로지스틱 회귀, 다항 회귀, 단계적 회귀, 리지 회귀, 라쏘 회귀, 엘라스틱넷 회귀) 또는 비-모수적 분석 (예를 들어, 윌콕슨 순위-총합 검정, 윌콕슨 부호-순위 검정, 부호 검정)을 포함하는 것인, 방법.
  59. 제52항에 있어서, 통계 분석은 데이터세트에 대해 기계 학습 알고리즘을 훈련하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 기계 학습 알고리즘은 인공 신경망 (예를 들어, 역전파 네트워크), 결정 트리 (예를 들어, 재귀 분할 과정, CART), 랜덤 포레스트, 판별 분석 (예를 들어, 베이지안 분류기 또는 피셔 분석), 선형 분류기 (예를 들어, 다중 선형 회귀 (MLR), 부분 최소 제곱 (PLS) 회귀, 주성분 회귀 (PCR)), 혼합 또는 램덤-효과 모델, 비모수 분류기 (예를 들어, k-최근접 이웃), 서포트 벡터 머신, 및 앙상블 방법 (예를 들어, 배깅, 부스팅)으로부터 선택되는 것인, 방법.
  61. 제51항에 있어서, 상태는 신경퇴행성 병태의 진단, 병기, 예후 또는 진행으로부터 선택되는 것인, 방법.
  62. 제51항에 있어서, 상태는 범주형 변수 (예를 들어, 이진 상태 또는 복수의 범주형 상태 중 하나)로서 측정되는 것인, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 범주는 신경퇴행성 병태를 갖는 것과 일치되는 진단 (예를 들어, 양성 또는 갖는다고 진단) 및 신경퇴행성 병태를 갖는 것과 불일치되는 진단 (예를 들어, 음성 또는 갖지 않는다고 진단)을 포함하는 것인, 방법.
  64. 제62항에 있어서, 범주는 신경퇴행성 병태의 상이한 병기를 포함하는 것인, 방법.
  65. 제51항에 있어서, 상태는 연속 변수 (예를 들어, 척도 상에서)로서 측정되는 것인, 방법.
  66. 제61항에 있어서, 연속 변수는 신경퇴행성 병태의 범위 또는 정도인, 방법.
  67. 제51항에 있어서, 대상체는 동물, 예를 들어, 어류, 조류, 양서류, 파충류, 또는 포유동물, 예를 들어, 설치류, 영장류 또는 인간인, 방법.
  68. 제51항에 있어서, 복수의 대상체는 10, 25, 50, 100, 200, 400 또는 800 중 적어도 어느 하나인, 방법.
  69. 제51항에 있어서, 각각의 대상체에 대해서, 정량적 측정치가 결정된 샘플은 제1 시점에 채취되고 신경퇴행성 병태의 상태는 제2, 이후 시점에 결정되는 것인, 방법.
  70. 제51항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈액 분획 (예를 들어, 혈장 또는 혈청)을 포함하는 것인, 방법.
  71. 제51항에 있어서, 신경퇴행성 병태는 시뉴클레인병증, 예를 들어, 파킨슨병 또는 루이 소체 치매인, 방법.
  72. 제51항에 있어서, 신경퇴행성 병태는 아밀로이드병증, 예를 들어, 알츠하이머병, 타우병증, 예를 들어, 알츠하이머병 또는 헌팅톤병인, 방법.
  73. 신경퇴행성 단백질을 특징으로 하는 신경퇴행성 병태의 발병 위험성, 진단, 병기, 예후, 또는 진행을 추론하는 방법으로서, 방법은
    a) 데이터세트를 생성시키기 위해, 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 농축된 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터, 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는
    (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는
    (2) 복수의 상이한 신호전달 키나제
    를 포함하는 것인 단계; 및
    b) 신경퇴행성 병태의 발병 위험성, 진단, 병기, 예후, 또는 진행을 추론하기 위해, 데이터세트에 대해 모델, 예를 들어, 제51항의 모델을 실행하는 단계를 포함하는 것인, 추론 방법.
  74. 제73항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제인, 추론 방법.
  75. 제73항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택되는 것인, 추론 방법.
  76. 제73항에 있어서, 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택되는 것인, 추론 방법.
  77. 제73항에 있어서, 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20인, 추론 방법.
  78. 제73항에 있어서, 정량적 측정치가 결정된 신경퇴행성 단백질 형태는
    (I) 적어도 하나의 올리고머 형태;
    (II) 복수의 올리고머 형태;
    (III) 적어도 하나의 올리고머 형태 및 적어도 하나의 단량체 형태;
    (IV) 복수의 올리고머 형태 및 적어도 하나의 단량체 형태;
    (V) 적어도 하나의 올리고머 형태 및 복수의 단량체 형태; 및
    (VI) 복수의 올리고머 형태 및 복수의 단량체 형태
    로부터 선택되는 것인, 추론 방법.
  79. 제73항에 있어서, 적어도 하나의 올리고머 형태는 신경퇴행성 단백질의 종의 컬렉션을 포함하는 것인, 추론 방법.
  80. 제73항에 있어서, 모델은 신경퇴행성 단백질의 단량체 형태에 대한 올리고머 형태의 상대량을 통계적으로 유의한 수의 대조군 개체에서의 상대량과 비교하는 단계를 포함하는 것인, 추론 방법.
  81. 제73항에 있어서, 모델은 추론이 이루어지는 모델로부터 복수의 올리고머 형태의 상대량의 패턴을 검출하는 단계를 포함하는 것인, 추론 방법.
  82. 제73항에 있어서, 대상체는 신경퇴행성 병태에 대해 무증상이거나 또는 전임상인, 추론 방법.
  83. 제73항에 있어서, 대상체는 의료 제공자, 예컨대 의사에게, 통상의 사무실 방문 동안 또는 의사의 일상 진료의 일부로서 진찰받는 것인, 추론 방법.
  84. 제73항에 있어서, 모델은 컴퓨터에 의해 실행되는 것인, 추론 방법.
  85. 제73항에 있어서, 모델은 컴퓨터에 의해 실행되지 않는 것인, 추론 방법.
  86. 신경퇴행성 병태의 치료에서 치료 중재술의 유효성을 결정하기 위한 방법으로서, 방법은
    (a) 복수의 대상체를 포함하는 집단의 각 대상체에서,
    (1) 데이터세트를 생성시키기 위해, 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 농축된 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터, 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는
    (i) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는
    (ii) 복수의 상이한 신호전달 키나제
    를 포함하는 것인, 단계; 및
    (2) 모델, 예를 들어, 제51항의 모델을 사용해 초기 상태를 추론하는 단계
    를 통해서, 신경퇴행성 병태의 초기 상태를 추론하는 단계;
    (b) 추론 단계 이후에, 치료 중재술을 대상체에게 투여하는 단계;
    (c) 투여 단계 이후에, 집단의 각 대상체 개체에서,
    (1) 데이터세트를 생성시키기 위해, 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 농축된 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터, 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는
    (i) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는
    (ii) 복수의 상이한 신호전달 키나제
    를 포함하는 것인, 단계; 및
    (2) 모델을 사용해 후속 상태를 추론하는 단계
    를 통해서, 신경퇴행성 병태의 후속 상태를 추론하는 단계; 및
    (d) 집단의 초기 및 후속 추론을 기반으로, 후속 추론이 초기 추론과 비교하여 정상 상태를 향한 통계적으로 유의한 변화를 나타내면 치료 중재술이 유효하거나, 또는 후속 추론이 정상 상태를 향해 초기 추론과 비교하여 통계적으로 유의한 변화를 나타내지 않으면 치료 중재술이 유효하지 않다고 결정하는 단계
    를 포함하는 것인, 결정 방법.
  87. 제86항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제인, 결정 방법.
  88. 제86항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택되는 것인, 결정 방법.
  89. 제86항에 있어서, 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택되는 것인, 결정 방법.
  90. 제86항에 있어서, 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20인, 결정 방법.
  91. 제86항에 있어서, 치료 중재술은 약물 또는 약물의 병용물의 투여를 포함하는 것인, 결정 방법.
  92. 제86항에 있어서, 집단은 적어도 20명, 적어도 50명, 적어도 100명, 또는 적어도 200명 대상체를 포함하고, 대상체의 적어도 20%, 적어도 35%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 초기에 단백질의 단량체 형태에 대한 단백질의 올리고머 형태의 상승된 상대량을 갖는 것인, 결정 방법.
  93. 제86항에 있어서, 대상체의 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 또는 적어도 35%, 적어도 50%, 적어도 66%, 적어도 80%, 또는 100%는 초기에 신경퇴행성 병태의 진단을 받은 것인, 결정 방법.
  94. 제86항에 있어서, 추론은 컴퓨터에 의해 이루어지는 것인, 결정 방법.
  95. 제86항에 있어서, 추론은 컴퓨터에 의해 이루어지는 것인 아닌, 결정 방법.
  96. 신경퇴행성 병태의 치료 또는 예방을 위한 치료 중재술의 임상 시험을 위해 대상체를 한정하기 위한 방법으로서,
    a) (1) 데이터세트를 생성시키기 위해, 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 농축된 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는
    (i) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는
    (ii) 복수의 상이한 신호전달 키나제
    를 포함하는 것인 단계;
    (2) 대상체가 신경퇴행성 병태에 대해 비정상인 것을 추론하기 위해 프로파일에 대해 모델, 예를 들어, 제51항의 모델을 실행하는 단계
    를 통해서, 대상체가 신경퇴행성 병태에 대해 비정상인 것을 결정하는 단계; 및
    b) 상기 신경퇴행성 병태에 대한 잠재적 치료 중재술의 임상 실험에 대상체를 등록시키는 단계
    를 포함하는 것인, 한정 방법.
  97. 제96항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제인, 한정 방법.
  98. 제96항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택되는 것인 한정 방법.
  99. 제96항에 있어서, 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택되는 것인, 한정 방법.
  100. 제96항에 있어서, 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20인, 한정 방법.
  101. 제96항에 있어서, 모델은 컴퓨터에 의해 실행되는 것인, 한정 방법.
  102. 제96항에 있어서, 모델은 컴퓨터에 의해 실행되지 않는 것인, 한정 방법.
  103. 신경퇴행성 병태에 대한 치료 중재술 시에 대상체의 진행을 모니터링하는 방법으로서,
    (a) 대상체에서,
    (1) 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 농축된 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터, 바이오마커 세트의 측정치를 결정하는 단계로서, 바이오마커 세트는
    (i) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는
    (ii) 복수의 상이한 신호전달 키나제
    를 포함하는 것인 단계; 및
    (2) 신경퇴행성 병태의 초기 상태를 추론하기 위해, 모델, 예를 들어, 제51항의 모델을 실행하는 단계
    를 통해서, 신경퇴행성 병태의 초기 상태를 추론하는 단계;
    (b) 추론 단계 이후에, 대상체에게 치료 중재술을 투여하는 단계;
    (c) 투여 단계 이후에, 대상체에서,
    (1) 데이터세트를 생성시키기 위해, 뉴런 유래 마이크로솜 입자에 대해 농축된 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터, 복수의 상이한 신호전달 키나제의 각각의 양을 포함하는 바이오마커 프로파일을 결정하는 단계; 및
    (2) 신경퇴행성 병태의 후속 상태를 추론하기 위해, 모델, 예를 들어, 제51항의 모델을 실행하는 단계
    를 통해서, 신경퇴행성 병태의 후속 상태를 추론하는 단계;
    (d) 초기 및 후속 상태 추론을 기반으로, 후속 추론이 초기 추론과 비교하여 정상 상태를 향해 변화를 나타내면 대상체가 치료 중재술에 양성적으로 반응하거나, 또는 후속 추론이 정상 상태를 향해 초기 추론과 비교하여 변화를 나타내지 않으면 치료 중재술이 유효하지 않다고 결정하는 단계
    를 포함하는 것인, 모니터링 방법.
  104. 제103항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제인, 모니터링 방법.
  105. 제103항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택되는 것인, 모니터링 방법.
  106. 제103항에 있어서, 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택되는 것인, 모니터링 방법.
  107. 제103항에 있어서, 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20인, 모니터링 방법.
  108. 제103항에 있어서, 모델은 컴퓨터에 의해 실행되는 것인, 모니터링 방법.
  109. 제103항에 있어서, 모델은 컴퓨터에 의해 실행되지 않는 것인, 모니터링 방법.
  110. (a) 제73항의 방법을 통해, 대상체가 신경퇴행성 병태를 갖는다고 결정하는 단계; 및
    (b) 병태를 치료하는데 효과적인 완화적 또는 신경보호적 치료 중재술을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  111. 제110항에 있어서, 치료 중재술은 정상을 향해 대상체의 바이오마커 프로파일을 이동시키고, 정상을 향한 이동은 신경보호를 의미하는 것인, 방법.
  112. 바이오마커의 비정상적 패턴을 갖는 것으로, 제73항의 방법을 통해 결정된 대상체에게, 병태를 치료하기에 유효한 완화적 또는 신경보호적 치료 중재술을 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  113. 제112항에 있어서, 대상체는 신경퇴행성 병태에 대해 무증상이거나 또는 전임상인, 방법.
  114. (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는
    (2) 복수의 상이한 신호전달 키나제
    를 검출하기에 충분한 시약을 포함하는 키트.
  115. 제114항에 있어서, 시약은 항체를 포함하는 것인 키트.
  116. 신경퇴행성 병태의 발병 위험성, 진단, 병기, 예후, 또는 진행을 추론하는 방법으로서, 방법은
    a) 데이터세트를 생성시키기 위해, 뉴런 유래 미세입자, 예를 들어, 엑소솜에 대해 농축된 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터, 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는
    (1) 적어도 하나의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태; 또는
    (2) 복수의 상이한 신호전달 키나제
    를 포함하는 것인, 단계; 및
    b) 신경퇴행성 병태의 발병 위험성, 진단, 병기, 예후, 또는 진행과 데이터세트를 상관짓는 단계
    를 포함하는 것인, 추론 방법.
  117. 제116항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 키나제인, 추론 방법.
  118. 제116항에 있어서, 적어도 하나의 신호전달 키나제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 또는 MEK), 세포외 신호-조절 키나제 (ERK), 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3B), AKT 키나제 및 베클린으로부터 선택되는 것인, 추론 방법.
  119. 제116항에 있어서, 신경퇴행성 단백질은 알파 시뉴클레인, 아밀로이드 베타, 타우, 또는 헌팅틴으로부터 선택되는 것인, 추론 방법.
  120. 제116항에 있어서, 신경퇴행성 단백질의 올리고머 형태는 올리고머 형태의 컬렉션, 예를 들어, 알파 시뉴클레인의 올리고머, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 2-50, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-30, 예를 들어, 알파 시뉴클레인 4-20인, 추론 방법.
  121. (a) 신경퇴행성 병태를 갖거나 또는 신경퇴행성 병태에 대한 치료에 양성적으로 반응할 가능성이 있는 대상체를 확인하는 단계로서, 확인은
    (1) 바이오마커 프로파일을 생성시키기 위해, 뉴런 유래 엑소솜 (예를 들어, 엑소솜의 내부 내용물 유래)에 대해 농축된 대상체로부터의 샘플에서, 바이오마커 세트를 측정하는 단계로서, 바이오마커 세트는 하나 또는 복수의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태를 포함하는 것인, 단계; 및
    (2) 비정상적인 바이오마커 프로파일을 기반으로, 대상체가 신경퇴행성 병태를 앓는다고 결정하는 단계
    를 포함하는 것인, 단계; 및
    (b) 확인된 대상체에게 신경퇴행성 병태를 치료하기 위한 약학 조성물의 유효량을 투여하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  122. 제121항에 있어서, 신경퇴행성 병태는 시뉴클레인병증성 병태이고, 약학 조성물은 도파민 효현제 (예를 들어, 프라미펙솔 (예를 들어, Mirapex™), 로피니롤 (예를 들어, Requip), 로티고틴 (예를 들어, Neupro), 아포모르핀 (예를 들어, Apokyn)), 레보도파, 카르비도파-레보도파 (예를 들어, Rytary, Sinemet), MAO-B 억제제 (예를 들어, 셀레길린 (예를 들어, Eldepryl, Zelapar) 또는 라사길린 (예를 들어, Azilect)), 카테콜-O-메틸트랜스퍼라제 (COMT) 억제제 (예를 들어, 엔타카폰 (Comtan) 또는 톨카폰 (Tasmar)), 항콜린제 (예를 들어, 벤즈트로핀 (예를 들어, Cogentin) 또는 트리헥시페니딜), 아만타딘 또는 콜린에스터라제 억제제 (예를 들어, 리바스티그민 (Exelon))를 포함하는 것인, 방법.
  123. 제121항에 있어서, 시뉴클레인병증성 병태는 파킨슨병인, 방법.
  124. 제123항에 있어서, 약학 조성물은 도파민 효현제를 포함하는 것인, 방법.
  125. 제124항에 있어서, 약학 조성물은 NK1-길항제를 더 포함하는 것인, 방법.
  126. 제125항에 있어서, 도파민 효현제는 6-프로필아미노-4,5,6,7-테트라히드로-1,3-벤조티아졸-2-아민이고, NK1-길항제는 아프레피탄트 또는 롤라피탄트인, 방법.
  127. 제124항에 있어서, 약학 조성물은 5HT3-길항제를 더 포함하는 것인, 방법.
  128. 제127항에 있어서, 도파민 효현제는 6-프로필아미노-4,5,6,7-테트라히드로-1,3-벤조티아졸-2-아민이고, 5HT3 길항제는 온단세트론 히드로클로라이드 이수화물인, 방법.
  129. 신경퇴행성 병태를 의미하는 바이오마커 프로파일을 갖거나 또는 신경퇴행성 병태에 대한 치료에 양성적으로 반응할 가능성이 있는 것을 특징으로 하는 대상체에게, 신경퇴행성 병태를 치료하기 위한 약학 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서, 바이오마커 패널은 뉴런 유래 엑소솜 (예를 들어, 엑소솜의 내부 내용물 유래)에 대해 농축된 대상체로부터의 샘플로부터 측정된 하나 또는 복수의 신호전달 키나제 및, 임의로, 신경퇴행성 단백질의 적어도 하나의 올리고머 형태를 포함하는 바이오마커 세트를 포함하는 것인, 방법.
  130. 제129항에 있어서, 신경퇴행성 병태는 파킨슨병이고, 약학 조성물은 도파민 효현제를 포함하는 것인, 방법.
KR1020227026640A 2019-12-31 2020-12-29 신경퇴행성 병태의 바이오마커로서 키나제 KR20220163936A (ko)

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