KR20220162201A - Manufacturing method of intestinal organoid comprising stem cell derived from intestine and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 소장 오가노이드에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing small intestine organoids containing small intestine-derived stem cells and small intestine organoids prepared by the method.
특정 조직 세포로 분화할 수 있는 능력을 지닌 줄기세포는 3차원(3D) 구조을 형성할 수 있어 재생의학 분야 및 생물학 연구에 사용되고 있다(Kretzschmar K and Clevers H: Organoids. Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Dev Cell. 2016;38:590-600). 특히, 이러한 오가노이드(organoid) 기반 시스템은 동물 생명공학 분야의 생산성 향상을 목적으로 하는 사료 효율 측정을 위한 영양 연구 및 질병 모델링 기반 호스트-병원성 상호작용를 결정하는데 사용될 수 있다(Rahmani S et al. Intestinal organoids: A new paradigm for engineering intestinal epithelium in vitro. Biomaterials.2019;194:195-214, Wallach TE and Bayrer JR. Intestinal Organoids: New Frontiers in the Study of Intestinal Disease and Physiology. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2017;64:180-185). 최근 동물에서 실제 응용을 위해 소장과 간 등 3D 오가노이드를 기반으로 생리학적으로 관련성이 있는 체외 시스템을 구축하려는 노력이 이루어졌고, 그 결과, 동물실험이 줄어들고 있으며 동물실험의 대체가 이루어지고 있다(Li Y et al. Next-Generation Porcine Intestinal Organoids: an Apical-Out Organoid Model for Swine Enteric Virus Infection and Immune Response Investigations. J Virol. 2020;94:e01006-20, Marrella A, et al. In vitro demonstration of intestinal absorption mechanisms of different sugars using 3D organotypic tissues in a fluidic device. ALTEX. 2020;37:255-264). 그러나, 인간 및 마우스에 비해, 가축으로부터 분리된 성체 줄기세포의 기능적 특성화와 3D 확장에 대한 연구는 미약한 상태이다. Stem cells with the ability to differentiate into specific tissue cells can form three-dimensional (3D) structures and are used in regenerative medicine and biological research (Kretzschmar K and Clevers H: Organoids. Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Dev Cell. 2016;38:590-600). In particular, this organoid-based system can be used to determine host-pathogenic interactions based on nutritional research and disease modeling for measuring feed efficiency for the purpose of improving productivity in the field of animal biotechnology (Rahmani S et al. Intestinal Organoids: A new paradigm for engineering intestinal epithelium in vitro.Biomaterials.2019;194:195-214, Wallach TE and Bayrer JR.Intestinal Organoids: New Frontiers in the Study of Intestinal Disease and Physiology.J Pediatr Gastroenterol Nutr.2017;64 :180-185). Recently, efforts have been made to build physiologically relevant in vitro systems based on 3D organoids such as the small intestine and liver for practical applications in animals, and as a result, animal experiments are decreasing and replacing them ( Li Y et al.Next-Generation Porcine Intestinal Organoids: an Apical-Out Organoid Model for Swine Enteric Virus Infection and Immune Response Investigations.J Virol.2020;94:e01006-20, Marrella A, et al.In vitro demonstration of intestinal absorption mechanisms of different sugars using 3D organotypic tissues in a fluidic device. ALTEX. 2020;37:255-264). However, compared to humans and mice, studies on functional characterization and 3D expansion of adult stem cells isolated from livestock are in a weak state.
오가노이드는 장기 유사체로서, 장기로부터 분리한 줄기 세포를 3D 배양을 통해 다시 응집·재조합하여 만든 작은 배양체이며, 조직 또는 기관의 형태와 기능 모두를 재현한다. 이러한 오가노이드는 기관 또는 조직을 구성하는 여러 특이적 세포 집단들을 포함하고 있고, 실제 조직 또는 기관과 유사한 형태 및 구조적 조직화가 이루어져 있으며, 각 기관이 가지는 특수한 기능을 재현할 수 있다. 오가노이드는 공통적인 일련의 과정에 의해 형성되는데, 기능이 같은 세포들끼리 뭉쳐 적절한 위치로 배치되며, 세포들의 구획이 분리된 후에는 더욱 세부적인 분화가 일어난다. 이를 계통 특성화(lineage specification)라고 하며, 실제 기능을 수행할 수 있도록 전구체가 완전한 성체 세포로 분화되는 것이다.Organoids are organoids, which are small cultures made by aggregating and recombining stem cells isolated from organs through 3D culture, and reproduce both the shape and function of tissues or organs. These organoids contain various specific cell populations constituting organs or tissues, have a morphology and structural organization similar to actual tissues or organs, and can reproduce the specific functions of each organ. Organoids are formed by a series of common processes. Cells with the same function are grouped together and placed in appropriate positions. After cell compartments are separated, further differentiation occurs. This is called lineage specification, and the precursors are differentiated into complete adult cells that can perform their actual function.
오가노이드는 장, 신장, 폐, 간, 췌장 및 뇌와 같은 다양한 장기의 장기 제한 성체 줄기 세포 (organ restricted adult stem cells)와, 배아 줄기 세포(embryonic stem cells) 및 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cells)를 포함하는 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cells)의 줄기 세포 공급원에서 성공적으로 개발되었다(Lancaster MA and Knoblich JA. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2014;9:2329-2340). 2009년의 첫 번째 보고서(Sato T et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009;459:262-265) 이후, mini-gut와 같은 장 오가노이드는 다양한 목적의 사용을 위한 생체 내 모델의 대안으로 발전해왔다(Rallabandi HR, et al. Evaluation of Intestinal Epithelial Barrier Function in Inflammatory Bowel Diseases Using Murine Intestinal Organoids. Tissue Eng Regen Med. 2020;17:641-650). 이들은 흡수성 장세포(enterocyte), 파네스 세포(paneth cells), 장내 내분비 세포(enteroendocrine cells) 및 배세포(goblet cells)로 이루어진 소장 세포를 포함하는 생체 내 소장 상피의 구조와 세포 구성을 생체와 거의 동일하게 복제할 수 있다(Derricott H et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell Tissue Res. 2019;375:409-424). 따라서, 체외 3D 오가노이드 시스템은 체내 시스템과 동일한 기능 및 특성을 가지기 때문에 현재 대체 연구 도구로 사용되고 있다.Organoids are organ restricted adult stem cells, embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells of various organs such as intestine, kidney, lung, liver, pancreas and brain. cells) have been successfully developed from stem cell sources of pluripotent stem cells (Lancaster MA and Knoblich JA. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2014;9:2329-2340 ). Since the first report in 2009 (Sato T et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009;459:262-265), intestinal organoids such as mini-gut have been It has been developed as an alternative in vivo model for purposeful use (Rallabandi HR, et al. Evaluation of Intestinal Epithelial Barrier Function in Inflammatory Bowel Diseases Using Murine Intestinal Organoids. Tissue Eng Regen Med. 2020;17:641-650). They reproduce the structure and cellular composition of the small intestine epithelium in vivo, including small intestine cells composed of absorptive enterocytes, paneth cells, enteroendocrine cells and goblet cells, almost as well as in vivo. It can be replicated identically (Derricott H et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell Tissue Res. 2019;375:409-424). Therefore, in vitro 3D organoid systems are currently used as alternative research tools because they have the same functions and characteristics as in vivo systems.
한편, 여러 가지 기능을 동시에 처리하는 소장의 상피세포는 소화 효소를 분비해 음식물을 소화시키고 음식물로부터 영양소를 흡수할 뿐만 아니라 생명에 치명적인 미생물이나 발암물질로부터 소장을 보호하는 기능을 수행한다. 소장의 크립트(crypt) 아래쪽에 존재하는 줄기세포는 변화 증폭 세포(transit-amplifying cell; TA cell)로 분화되고, 분화된 세포는 융털(villi) 쪽으로 올라가면서 여러 종류의 세포로 더 분화되어 각자의 기능을 다하고 죽게 되는데, 이러한 과정은 5일 이내에 일어나며 인간의 소장에서는 하루 평균 1011개의 소장 상피세포가 죽고 줄기세포에서 유래한 새로운 상피세포로 다시 채워진다고 알려져 있다. 따라서 소장 줄기세포의 자가 증식 능력을 유지하면서 동시에 분화할 수 있는 능력은 재생 의학을 위한 좋은 연구 대상이 될 수 있으며, 이러한 능력을 이해하는 것이 미래의 장기 이식 기술 개발 및 질병 치료에 있어 중요한 첫걸음이 될 수 있다. On the other hand, epithelial cells of the small intestine, which simultaneously handle various functions, secrete digestive enzymes to digest food and absorb nutrients from food, as well as protect the small intestine from life-threatening microorganisms or carcinogens. Stem cells present in the lower part of the crypt of the small intestine differentiate into transit-amplifying cells (TA cells), and the differentiated cells further differentiate into various types of cells as they move up to the villi, It is known that this process occurs within 5 days, and in the human small intestine, an average of 1011 small intestine epithelial cells per day die and are repopulated with new epithelial cells derived from stem cells. Therefore, the ability of small intestine stem cells to differentiate while maintaining their self-renewal capacity can be a good research target for regenerative medicine, and understanding this ability is an important first step in the development of future organ transplant technology and disease treatment. This can be.
소장 상피(intestinal epithelium)는 점막 표면에 위치한 세포의 단층에 의해 형성된다. 소장 상피 세포(IEC, Intestinal epithelial cells)는 유해한 장내 성분(미생물, 독소, 식품 항원)에 대한 물리적이고 면역적인 장벽으로 작용하면서 식품 소화 및 영양소 흡수에 기여한다. 소장 상피의 기능은 영양소 흡수(흡수성 장세포(enterocyte)), 호르몬 분비(장내 내분비 세포(enteroendocrine cells)), 항균 펩타이드 분비(파네스 세포(Paneth cells)) 또는 점액 분비(배세포(goblet cells))에 특화된 상피 세포에 의해 조절된다. 이러한 모든 분화된 IEC 유형은 상피 크립트의 아래에 위치한 소장 상피 줄기세포(IESC, intestinal epithelial stem cells)에서 유래한다. 파네스 세포는 크립트의 바닥에 남아 있는 반면 다른 소장 상피 세포(IEC) 유형은 루멘으로 이동하는 동안 분화된다. 상피 세포의 분포는 또한 소장의 길이에 따라 다르며, 이는 소화기 부위의 기능적 전문화를 반영한다. 소장은 십이지장(duodenum), 공장(jejunum), 회장(ileum)의 세 부분으로 나뉜다. 십이지장은 화학 소화를 완성하기 위해 음식물 유미즙(food chyme), 담즙, 췌장 분비물을 받아들인다. 공장은 영양소 흡수를 위한 주요 장소이고, 반면에 회장은 잔류 영양소, 비타민, 결합 담즙산을 흡수한다. 가축 종에서 소장 상피에 대한 연구는 농업(사료 효율 향상), 수의학(장내 병원균에 대한 내성) 또는 생물의학(예: 인간 질병의 대형 동물 모델) 연구에 큰 영향을 미친다. The intestinal epithelium is formed by a monolayer of cells located on the mucosal surface. Intestinal epithelial cells (IEC) contribute to food digestion and nutrient absorption while acting as a physical and immune barrier against harmful intestinal components (microorganisms, toxins, food antigens). The function of the epithelium of the small intestine is to absorb nutrients (absorbent enterocytes), secrete hormones (enteroendocrine cells), secrete antibacterial peptides (Paneth cells) or secrete mucus (goblet cells). ) is regulated by specialized epithelial cells. All these differentiated IEC types originate from intestinal epithelial stem cells (IESCs) located beneath the epithelial crypts. Panes cells remain at the bottom of the crypt while other small intestinal epithelial cell (IEC) types differentiate while migrating into the lumen. The distribution of epithelial cells also varies along the length of the small intestine, reflecting the functional specialization of digestive regions. The small intestine is divided into three parts: the duodenum, the jejunum, and the ileum. The duodenum receives food chyme, bile, and pancreatic secretions to complete chemical digestion. The jejunum is the primary site for nutrient absorption, while the ileum absorbs residual nutrients, vitamins, and combined bile acids. The study of small intestinal epithelium in livestock species has great implications for agricultural (feed efficiency improvement), veterinary (resistance to enteric pathogens) or biomedical (eg large animal models of human disease) research.
기존의 소장 오가노이드는 2009년 Hans Clevers 연구실에서 분리된 소장 줄기세포를 마트리겔(Matrigel)을 이용한 3차원 배양에 처음으로 성공하여 소장 줄기 세포로부터 생체 내 소장의 구조와 비슷하게 크립트(crypt)-융모(villi) 구조를 가지고 있는 소장 오가노이드를 스스로 형성한다는 것을 보여준 바가 있으며, 이렇게 형성된 소장 오가노이드는 배양되는 수 년 동안 그 성질이 유지될 수 있다고 보고되었다. 이러한 오가노이드는 소장 줄기세포인 성체줄기세포를 이용하여 생산되며, 성체 줄기세포로부터 유래한 오가노이드는 조직이 자기복제 되거나 손상으로부터 회복될 때 체내 줄기 세포가 갖는 미세 환경(niche)을 모방하면 분화된 세포가 형성될 수 있다. 특히 상피 성체 줄기세포의 정상적인 역할 수행에는 윈트(Wnt) 신호가 아주 중요하다. 그러므로 Wnt 신호의 활성화물질인 Wnt3a, R-스폰딘(R-spondin) 등은 성체 줄기세포 배양 프로토콜에 주요한 요소로 포함되며, 이런 배양환경에서 Lgr5+ 세포가 항상 나타나게 된다. 여기서 Lgr5는 Wnt 신호의 표적 유전자이자 Wnt 신호를 증폭시키는 R-spondin의 수용체로 작동하는 인자이고, 성체 줄기세포의 활성도를 나타내는 지표이기도 하다. Lgr5+ 세포는 대부분의 조직 및 장기에서 유래한 오가노이드 형성에서 관찰되는 매우 중요한 성체줄기세포이다. 하지만 얻을 수 있는 세포 수에 한계가 있어 효율적 생산과 연구에 제한이 있으므로, 소장의 발달, 분화 및 성숙에 대한 연구에 있어 새로운 모델이 필요하다. Existing small intestine organoids were the first to successfully culture small intestine stem cells isolated in Hans Clevers' laboratory in 2009 using Matrigel for the first time, and crypt-villi similar to the structure of the small intestine in vivo from small intestine stem cells It has been shown that small intestine organoids having a villi structure are formed by themselves, and it has been reported that the small intestine organoids thus formed can maintain their properties for several years in culture. These organoids are produced using adult stem cells, which are stem cells of the small intestine, and organoids derived from adult stem cells differentiate by mimicking the microenvironment (niche) of stem cells in the body when tissues self-replicate or recover from damage. cells can be formed. In particular, Wnt signaling is very important for the normal role of epithelial adult stem cells. Therefore, Wnt signal activators such as Wnt3a and R-spondin are included as major factors in adult stem cell culture protocols, and Lgr5+ cells always appear in such a culture environment. Here, Lgr5 is a target gene for Wnt signaling, a factor that acts as a receptor for R-spondin that amplifies Wnt signaling, and is also an indicator of the activity of adult stem cells. Lgr5+ cells are very important adult stem cells observed in organoid formation derived from most tissues and organs. However, since the number of cells that can be obtained is limited, efficient production and research are limited. Therefore, a new model is needed to study the development, differentiation, and maturation of the small intestine.
소는 전 세계적으로 우유와 육류 생산에 있어 경제적으로 중요한 가축이다. 그러나 소는 실험 동물로서 매우 비싸고 노동 집약적이며 특히 도축에서 54 개의 다른 조직을 채취하고 분리할 때 더욱 그러하다(Baek Y-C et al. Effects of Short-term Acute Heat Stress on Physiological Responses and Heat Shock Proteins of Hanwoo Steer (Korean Cattle). J Anim Reprod Biotechnol. 2019;34:173-182). 또한, 불멸화(immortalized) (Miyazawa K et al. Characterization of newly established bovine intestinal epithelial cell line. Histochem Cell Biol. 2010;133:125-134) 및 복제된 (Zhan K et al. Establishment of primary bovine intestinal epithelial cell culture and clone method. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2017;53:54-57) 소장 상피 세포주와 같은 시험관 내 2D 배양 시스템은 생리적 관련성이 부족하고 소장 상피로 구성된 세포 다양성으로 인해 현재 한계를 가지고 있다. 따라서 가축의 다양한 장기에서 장기 제한 성체 줄기 세포(organ restriced adult stem cells)를 유도하는 강력한 3D 배양 시스템을 위한 신뢰할 수 있는 방법의 개발이 시급하다.Cattle are economically important livestock for milk and meat production worldwide. However, cattle as laboratory animals are very expensive and labor intensive, especially when harvesting and isolating 54 different tissues from slaughter (Baek Y-C et al. Effects of Short-term Acute Heat Stress on Physiological Responses and Heat Shock Proteins of Hanwoo Steer (Korean Cattle. J Anim Reprod Biotechnol. 2019;34:173-182). In addition, immortalized (Miyazawa K et al. Characterization of newly established bovine intestinal epithelial cell line. Histochem Cell Biol. 2010;133:125-134) and cloned (Zhan K et al. Establishment of primary bovine intestinal epithelial cell line. In Vitro Cell Dev Biol Anim. Therefore, it is urgent to develop a reliable method for a robust 3D culture system to induce organ restricted adult stem cells in various organs of livestock.
한편, 본 발명자들은 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드를 제조하기 위한 방법에 관한 연구를 계속하던 중, 소장 오가노이드를 제조할 수 있는 최적의 제조방법을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.Meanwhile, the inventors of the present invention completed the present invention by confirming an optimal method for preparing small intestine organoids while continuing research on a method for preparing small intestine organoids containing small intestine-derived stem cells.
본 발명의 목적은 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드의 제조 방법를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method for preparing small intestine organoids containing small intestine-derived stem cells.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide small intestine organoids containing the small intestine-derived stem cells prepared by the above preparation method.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 소장 오가노이드를 포함하는 사료 성분 분석 및 효율 검증을 위한 모델을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a model for analyzing components of a feed containing the small intestine organoid and verifying its efficiency.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 소장 유래 줄기세포를 소장에서 분리하는 단계; 및 2) 상기 분리한 줄기세포를 포함한 배지와 마트리겔(metrigel)을 혼합하여 3차원 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드의 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is 1) isolating the small intestine-derived stem cells from the small intestine; and 2) mixing the medium containing the isolated stem cells with Matrigel and performing three-dimensional culture.
또한, 본 발명은 상기 소장 오가노이드의 제조방법에 의해 제조된 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드를 제공한다.In addition, the present invention provides small intestine organoids containing small intestine-derived stem cells prepared by the method for preparing small intestine organoids.
나아가, 본 발명은 상기 소장 오가노이드를 포함하는 사료 성분 분석 및 효율 검증을 위한 모델을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a model for analysis of feed components and efficiency verification including the small intestine organoid.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 소장 오가노이드는 소장 유래 줄기세포를 포함하고, 소장 줄기세포 마커인 Lgr5(leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5), 소장 상피 세포 마커(Lgr5, Bmi1, F-actin, E-cadherin, Chromogranin A 및 Mucin2) 및 영양소 흡수 관련 마커(SGLT1, PEPT1, Glut2, GLP1 및 TGR5)를 발현하며, 세포 투과성을 가져 생체 내 소장과 유사한 특성 및 기능을 보인다.The small intestine organoids prepared according to the production method of the present invention include small intestine-derived stem cells, and small intestine stem cell markers Lgr5 (leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5), small intestine epithelial cell markers (Lgr5, Bmi1, It expresses F-actin, E-cadherin, Chromogranin A and Mucin2) and nutrient absorption-related markers (SGLT1, PEPT1, Glut2, GLP1 and TGR5), and exhibits characteristics and functions similar to those of the small intestine in vivo due to its cell permeability.
도 1은 소의 소장 줄기세포를 포함하는 크립트(crypt)의 분리 및 3차원 배양 방법을 나타낸 도이다.
도 2는 mouse intestical organoid medium으로 3차원 배양했을 때 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 소장 오가노이드의 동결 조건에 따른 생존률을 나타낸 그래프이다.
도 3b는 동결 및 해동 후에 소장 오가노이드를 나타낸 도이다.
도 4a는 소의 소장 줄기세포를 포함하는 크립트가 오가노이드를 형성하는 과정을 나타낸 도이다.
도 4b는 소장 오가노이드의 상세 구조를 2일차부터 8일차까지 나타낸 도이다.
도 4c는 P1(passage 1)부터 P10까지 소장 오가노이드의 수를 나타낸 그래프이다.
도 4d는 20회 계대 배양(P20) 후 3일째와 6일째의 오가노이드를 나타낸 도이다.
도 4e는 세포 증식 마커인 Ki67의 발현을 소장 오가노이드에서 나타낸 도이다.
도 5a는 십이지장(duodenum)과 회장(ileum) 사이의 4개의 다른 위치(위치 #1. #2, #3 및 #4)에서 공장(jejunum)을 절개한 후 각각의 위치에서 크립트와 융모(villus)의 구조를 나타낸 도이다.
도 5b는 4개의 다른 위치에서 절개한 공장의 vertical view와 horizontal view를 나타낸 도이다.
도 5c는 4개의 다른 위치에서 절개한 공장에서 분리한 크립트가 오가노이드를 형성한 수를 나타낸 그래프이다.
도 6a는 위치 #1의 공장으로부터 분리한 크립트로 제조된 소장 오가노이드에서 소장 줄기 세포마커인 Lgr5(leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5) 및 Bmi1(B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homology)와 소장 상피세포 마커인 F-actin 및 Chromogranin A의 발현을 나타낸 도이다.
도 6b는 소장 상피 세포 마커인 E-cadherin, Bmi1, Mucin2 및 cytokeratin 19의 발현을 나타낸 도이다.
도 6c는 P5의 소장 오가노이드에서 Lgr5, Bmi1, F-actin, E-cadherin, Chromogranin A 및 Mucin2의 발현을 나타낸 도이다.
도 7a는 P5의 소장 오가노이드에서 영양소 흡수 관련 마커로 알려진 SGLT1(sodium-dependent glucose transporter), PEPT1(proton-coupled peptide transporter), Glut2(glucose transporter), GLP1(glucagon-like peptide 1) 및 TGR5(bile acid receptor)의 발현을 나타낸 도이다.
도 7b는 소장 오가노이드에 FITC-dextran 4kDa 또는 FITC-dextran 40kDa 처리한 후 세포 투과성을 확인한 도이다.
도 7c는 FITC-dextran 4kDa가 오가노이드의 루멘(lumen)으로 확산되는 것을 실시간으로 모니터링한 도이다.
도 8a는 P5와 P10의 소장 오가노이드의 Principal component analysis(PCA)을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 8b는 P5와 P10의 소장 오가노이드의 히트 맵(heat map)을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 8c는 P5의 소장 오가노이드와 소장에서 산란도(scatter plot)을 수행한 결과를 도이다.1 is a diagram showing a method for isolating and 3-dimensionally culturing crypts containing bovine small intestine stem cells.
Figure 2 is a diagram showing the results of three-dimensional culture with mouse intestical organoid medium.
3A is a graph showing survival rates of small intestine organoids according to freezing conditions.
Figure 3b is a diagram showing small intestine organoids after freezing and thawing.
4A is a diagram illustrating a process in which crypts including bovine small intestine stem cells form organoids.
4B is a diagram showing the detailed structure of small intestine organoids from
4C is a graph showing the number of small intestine organoids from P1 (passage 1) to P10.
Figure 4d is a diagram showing organoids on
4E is a diagram showing the expression of Ki67, a cell proliferation marker, in small intestine organoids.
Figure 5a shows crypts and villi at each position after incising the jejunum at four different positions (
5B is a diagram showing vertical and horizontal views of a jejunum cut at four different locations.
5C is a graph showing the number of organoids formed by crypts isolated from jejunum cut at four different locations.
Figure 6a shows the small intestine stem cell markers Lgr5 (leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5) and Bmi1 (B lymphoma Mo-
6B is a diagram showing the expression of E-cadherin, Bmi1, Mucin2, and
6C is a diagram showing the expression of Lgr5, Bmi1, F-actin, E-cadherin, Chromogranin A, and Mucin2 in P5 small intestine organoids.
7a shows sodium-dependent glucose transporter (SGLT1), proton-coupled peptide transporter (PEPT1), glucose transporter (Glut2), glucagon-like peptide 1 (GLP1), and TGR5 (known as markers related to nutrient absorption in small intestine organoids of P5). It is a diagram showing the expression of bile acid receptor).
7B is a diagram showing cell permeability after treatment of small intestine organoids with FITC-
7C is a diagram illustrating real-time monitoring of diffusion of FITC-dextran 4kDa into the lumen of organoids.
8A is a diagram showing the results of principal component analysis (PCA) of P5 and P10 small intestine organoids.
8B is a diagram showing the results of performing a heat map of P5 and P10 small intestine organoids.
8c shows the results of performing a scatter plot on the small intestine organoids and the small intestine of P5.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
성체 소장의 성숙한 소장 상피는 다양한 생리기능, 소장 상피 구조 및 항상성을 조절하고 유지해야 한다. 소장 상피 세포는 물리적, 면역학적 장벽 역할을 하며, 4가지 주요 특수세포(흡수성 장세포(enterocyte), 파네스 세포(Paneth cells), 장내 내분비 세포(enteroendocrine cells) 및 배세포(goblet cells))에 의해 형성된다. 소장 상피 세포의 단층(monolayer of intestinal epithelial cells, IEC)은 영양소의 소화 및 흡수에 중요한 역할을 하며 유해미생물 및 독성물질에 대한 1차 방어선을 제공한다. 소장에 있는 모든 분화된 세포 유형과 그 주변 환경은 성체(adult) 소장의 복잡한 구조와 기능의 성숙과 유지에 기여한다. 그러나, 구조적, 생리학적으로 복잡성이 높은 성숙한 성체 소장의 다양한 생리학적 과정에 관여하는 발달, 기능, 질병 및 세포 간 신호전달 경로를 연구하는 것은 어려움이 있다. The mature small intestinal epithelium of the adult small intestine must regulate and maintain various physiological functions, small intestinal epithelial structure, and homeostasis. Small intestinal epithelial cells serve as a physical and immunological barrier, and contain four major specialized cells: enterocytes, Paneth cells, enteroendocrine cells, and goblet cells. is formed by The monolayer of intestinal epithelial cells (IEC) plays an important role in the digestion and absorption of nutrients and provides the first line of defense against harmful microorganisms and toxic substances. All differentiated cell types in the small intestine and their surroundings contribute to the maturation and maintenance of the complex structure and function of the adult small intestine. However, it is difficult to study the development, function, disease, and intercellular signaling pathways involved in various physiological processes of the mature adult small intestine due to its high structural and physiological complexity.
소장의 상피세포는 영양분은 흡수하지만 미생물 및 바람직하지 않은 거대분자의 통과는 억제시키는 선택적 배리어로서 작용한다. 이러한 배리어를 유지하는 것이 중요한 이유는 소장에서 혈류로 병원성 미생물이 이동하는 것을 차단하기 때문이다. 소장의 투과성이 증가되면 장점막의 파라세포성(paracellular) 운반 시스템이 손상을 입게 되는 결과, 내독소 및 (병원성) 박테리아의 전이(translocation)가 일어나는 것으로 추정된다. 이러한 장 점막의 손상은 거대 분자의 흡수를 가능케 하여 알레르기 반응을 유발할 수 있다. The epithelial cells of the small intestine act as a selective barrier that absorbs nutrients but inhibits the passage of microorganisms and undesirable macromolecules. Maintaining this barrier is important because it blocks the movement of pathogenic microorganisms from the small intestine into the bloodstream. Increased permeability of the small intestine is presumed to result in damage to the paracellular transport system of the intestinal mucosa, resulting in translocation of endotoxins and (pathogenic) bacteria. This damage to the intestinal mucosa can lead to the absorption of macromolecules, leading to allergic reactions.
소장 오가노이드(organoid)는 속이 빈 루멘을 둘러싸고 있는 편광 소장 상피 세포(IEC, intestinal ephithelial cell)의 단일층으로 구성된 자체 조직된 3D 구조이다. 이 혁신적인 모델은 체외 상피의 다세포 구성, 크립트 도메인이 있는 상피의 구조와 영양소 흡수 및 장벽 기능과 같은 주요 역할을 반복하는(recapitulate) 능력을 가진다. 중요한 것은 소장 오가노이드는 원래부터의 소화 부위의 체외 표현형 특징을 유지한다는 것이다. 소장 오가노이드 배양은 Lgr5+ IESC의 유지와 증식에 관련된 신호 경로를 확인한 후 마우스와 인간에서 처음 개발되었다. 소장 오가노이드 배양은 체외에서 소장 상피 줄기 세포(IESC, intestinal ephithelial stem cell) 미세환경 (niche)에 의해 조절된다. 이 과정에서 Wnt pathway가 활성화되고 epidermal growth factor(EGF) signaling은 자극되며 bone morphogenic protein(BMP) pathway는 억제된다. 소장 상피 세포는 3D 성장을 위한 구조적 발판을 제공하고 세포 생존을 촉진하는 세포외 매트릭스 단백질(extracellular matrix protein)(예: Matrigel™)의 겔에 분주된다. 인간과 마우스의 소장 오가노이드는 소장 상피 줄기 세포에서 도출된 장 조직이나 유도 만능 줄기 세포(iPS, induced pluripotent stem cells) 또는 배아 줄기 세포(ES, embryonic stem cells) 세포에서 도출될 수 있다. 조직 유도 소장 상피 줄기 세포에서 유래한 오가노이드는 상피 세포로만 구성되어 있다. 대조적으로, 상피세포와 중피세포(예: 근섬유종)는 모두 유도 만능 줄기 세포(iPS)와 배아 줄기 세포(ES)에서 파생된 소장 오가노이드에 존재하나 태아와 같은 미성숙한 상태로 남아 있다. Intestinal organoids are self-organized 3D structures composed of a single layer of polarized intestinal epithelial cells (IEC) surrounding a hollow lumen. This innovative model has the ability to recapitulate the multicellular organization of the in vitro epithelium, the structure of the epithelium with crypt domains and key roles such as nutrient absorption and barrier function. Importantly, small intestine organoids retain the in vitro phenotypic characteristics of the original digestive site. Small intestine organoid cultures were first developed in mice and humans after identifying signaling pathways involved in the maintenance and proliferation of Lgr5+ IESCs. Intestinal organoid culture is controlled in vitro by the intestinal epithelial stem cell (IESC) microenvironment (niche). During this process, the Wnt pathway is activated, epidermal growth factor (EGF) signaling is stimulated, and the bone morphogenic protein (BMP) pathway is inhibited. Intestinal epithelial cells are seeded on gels of extracellular matrix proteins (eg Matrigel™) that provide a structural scaffold for 3D growth and promote cell survival. Human and mouse small intestine organoids can be derived from intestinal tissue derived from small intestinal epithelial stem cells, or from induced pluripotent stem cells (iPS) or embryonic stem cells (ES) cells. Organoids derived from tissue-derived small intestinal epithelial stem cells are composed exclusively of epithelial cells. In contrast, both epithelial cells and mesothelial cells (eg, myofibromas) are present in small intestine organoids derived from induced pluripotent stem cells (iPS) and embryonic stem cells (ES), but remain immature, fetal-like.
소장에서 모든 상피세포 계통(lineage)을 생성하는 LGR5+ 줄기세포의 능력은 소장 상피의 흥미롭고 생리적으로 관련된 체외 모델의 개발을 통해 이용되었다. 소장 크립트 또는 개별 LGR5+ 소장 줄기세포는 필수적인 homeostatic support factor인 EGF, Noggin, R-spondin 1이 있는 라미닌이 풍부한 마트리겔 매트릭스에서 배양된다. 이러한 배양에서 크립트들은 처음에는 체내에서 크립트 분열과 유사한 여러 크립트의 버딩(budding) 이벤트를 겪는 마트리겔 돔를 형성하기 위해 폐쇄 형태를 보인다. 추가 확장에 따라, 3D 소장 오가노이드 또는 "미니 장(mini gut)"이 형성되며, 많은 크립트의 버드(bud) 도메인과 함께 중앙 폐쇄 루멘을 둘러싸고 있는 단일층의 소장 상피세포를 구성한다. 중요한 것은, 이러한 소장 오가노이드의 배양 방법은 체내 소장 상피 내에 존재하는 세포의 다양성을 상당 부분 유지한다는 것이다. 소장 상피의 세포 분화와 기능을 연구하기 위해 많은 연구소에서 소장 오가노이드 배양 방법을 사용하고 있지만 유도가 잘 되고 효율이 좋은 배양 방법을 위한 연구가 필요한 실정이다.
The ability of LGR5+ stem cells to generate all epithelial cell lineages in the small intestine has been exploited through the development of an exciting and physiologically relevant in vitro model of the small intestine epithelium. Small intestinal crypts or individual LGR5+ small intestinal stem cells are cultured in a laminin-rich Matrigel matrix with essential homeostatic support factors EGF, Noggin, and R-
소는 전 세계 많은 나라에서 경제적으로 중요한 가축 종이다. 소의 소장 상피 세포의 분화와 유지에 영향을 미치는 인자에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 또한, 개별 소의 소장 상피 세포 집단을 구별하는 신뢰성 있는 세포 특정 마커는 거의 밝혀지지 않았다. 소에서 소장 상피 세포의 분화와 유지에 영향을 미치는 인자와 다른 병원체들에 대한 효과적인 통제는 경제적으로 중요한 영향을 미치며, 또한 많은 수의 동물원성 감염증의 가능성이 있기 때문에 식량 안보에 중요하다. 장내 병원체와 소의 소장 상피 세포 사이의 상호작용을 정확하게 연구하기 위해 생리적으로 관련된 체외 시스템은 거의 없으며, 대부분의 데이터는 상피 세포 라인이나 1차 상피 세포의 2D 단층 분석으로부터 도출되었다. Cattle are an economically important livestock species in many countries around the world. Little is known about the factors that affect the differentiation and maintenance of bovine small intestinal epithelial cells. In addition, few reliable cell-specific markers have been identified that distinguish individual bovine small intestinal epithelial cell populations. In cattle, effective control of factors affecting the differentiation and maintenance of small intestinal epithelial cells and other pathogens has important economic implications and is also important for food security because of the potential for a large number of zoonotic infections. There are few physiologically relevant in vitro systems to accurately study the interactions between enteric pathogens and bovine small intestinal epithelial cells, and most data have been derived from epithelial cell lines or 2D monolayer analyzes of primary epithelial cells.
본 발명은 1) 소장 유래 줄기세포를 소장에서 분리하는 단계; 및The present invention comprises the steps of 1) isolating small intestine-derived stem cells from the small intestine; and
2) 상기 분리한 줄기세포를 포함한 배지와 마트리겔(metrigel)을 혼합하여 3차원 배양하는 단계;2) three-dimensional culture by mixing the medium containing the separated stem cells with Matrigel;
를 포함하는, 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드의 제조방법을 제공한다.It provides a method for preparing small intestine organoids comprising small intestine-derived stem cells.
상기 단계 1)의 줄기세포는 크립트(crypt)이나, 이에 제한되지 않는다.The stem cells in step 1) are crypts, but are not limited thereto.
상기 단계 1)의 줄기세포를 분리한 소는 16개월 이상이거나 20개월 이상일 수 있으나 바람직하게는 24개월 이상이다.The cows from which the stem cells in step 1) were isolated may be 16 months or older or 20 months or older, but are preferably 24 months or older.
상기 단계 2)의 배지와 마트리겔의 혼합비는 1 : 2 이거나 1 : 1.5 일 수 있으나, 바람직하게는 1 : 1 이다.The mixing ratio of the medium and Matrigel in step 2) may be 1:2 or 1:1.5, but is preferably 1:1.
또한, 본 발명은 상기 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드의 제조방법에 의해 제조된 소장 오가노이드를 제공한다.In addition, the present invention provides small intestine organoids prepared by the method for preparing small intestine organoids containing the small intestine-derived stem cells.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 24개월 이상의 성체 소의 소장에서 크립트를 분리하여 크립트를 포함한 배지와 마트리겔을 1 : 1의 비율로 혼합하여 3차원 배양을 수행하였다(도 1 및 2).In a specific embodiment of the present invention, the present inventors isolated crypts from the small intestine of adult cattle aged 24 months or older and mixed a medium containing crypts with Matrigel at a ratio of 1: 1 to perform 3-dimensional culture (FIGS. 1 and 2). .
또한, 본 발명의 실시예로 제조한 오가노이드의 동결 및 해동 후에 정상상태 유지를 확인하였다(도 3).In addition, it was confirmed that organoids prepared according to the examples of the present invention were maintained in a steady state after freezing and thawing (FIG. 3).
또한, 오가노이드의 반복하는(recapitulating) 능력은 10 회(P10) 이상 계대 동안의 안정적인 성장과 장기 유지에 의해 입증되었으며 특히 소장 오가노이드에서 증식 세포 마커인 Ki67이 발현하는 것을 확인하였고, 이를 통해 오가노이드가 생체 내 장기 생리학을 밀접하게 모방하며 크립트의 반복 능력을 잃지 않고 통제된 조건에서 온전한 상태로 유지되는 것을 확인하였다(도 4).In addition, the recapitulating ability of organoids was demonstrated by stable growth and long-term maintenance for more than 10 passages (P10), and it was confirmed that Ki67, a proliferating cell marker, was especially expressed in small intestine organoids. It was confirmed that the oid closely mimics the organ physiology in vivo and remains intact under controlled conditions without losing the crypt's repeatability (Fig. 4).
또한, 소장 오가노이드의 효율적인 분리 및 유도를 위한 위치를 확인하기 위해, 십이지장과 회장 사이의 공장에서 4 개의 다른 위치를 절개하였으며(위치 #1, #2, #3 및 #4) 십이지장에 가까운 공장 (위치 # 1 및 # 2)에서 소장 오가노이드의 유도에 대한 가장 큰 성장 잠재력을 확인하였다(도 5). In addition, to identify the location for efficient isolation and derivation of small intestine organoids, four different locations were incised in the jejunum between the duodenum and the ileum (
또한, 성체의 소장에서 유래한 소장 오가노이드에서 소장 줄기세포 및 상피 세포와 관련된 여러 특정 마커들을 확인한 결과, 소장 오가노이드에서 LGR5, Bmi1, Mucin2, ,E-cadherin, F-actin, Chromogranin A 및 Cytokeratin 19의 발현을 확인하였다(도 6).In addition, as a result of confirming several specific markers related to small intestine stem cells and epithelial cells in small intestine organoids derived from adult small intestine, LGR5, Bmi1, Mucin2, ,E-cadherin, F-actin, Chromogranin A and Cytokeratin Expression of 19 was confirmed (FIG. 6).
또한, 소장 오가노이드에서 영양소 흡수 관련 마커인 SGLT1, PEPT1, Glut2, GLP1 및 TGR5의 발현을 확인하였으며, FITC-dextran 4kDa의 화합물에 대한 높은 투과성을 확인하여 소장 오가노이드의 생체 내 소장 흡수 특성과 생리학적 관련성을 확인하였다(도 7).In addition, the expression of SGLT1, PEPT1, Glut2, GLP1, and TGR5, which are markers related to nutrient absorption, were confirmed in small intestine organoids, and high permeability to FITC-
또한, 소장 오가노이드의 유전적 특성을 확인하기 위해 실시한 대규모 유전자 발현 프로파일링을 통해,소장 오가노이드의 유전적 특성이 생체 내 소장의 유전적 특성과 매우 유사하다는 것을 확인하였다(도 8).In addition, through large-scale gene expression profiling conducted to confirm the genetic characteristics of the small intestine organoids, it was confirmed that the genetic characteristics of the small intestine organoids were very similar to those of the small intestine in vivo (FIG. 8).
따라서, 본 발명에 따른 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 소장 오가노이드는 사료 성분 분석 및 효율 검증 모델로서 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the method for preparing small intestine organoids containing small intestine-derived stem cells according to the present invention and the small intestine organoids prepared by the method can be usefully used as a feed component analysis and efficiency verification model.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are only to illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.
실시예 1. 소의 소장으로부터 크립트 분리와 3차원 배양Example 1. Crypt isolation and three-dimensional culture from bovine small intestine
소장의 공장 조직을 한우에서 분리하여 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (Sigma-Aldrich, NY, USA)을 넣은 차가운 인산염 완충 식염수 (PBS)가 포함된 세척 완충액에 모았다. 분리된 공장 조직을 세로로 자르고 잔해를 제거하기 위해 세척 완충액으로 철저히 세척하고 유리 슬라이드를 사용하여 점막 및 점막하 층을 부드럽게 긁어 냈다. 남은 근육층을 3 ~ 5mm 조각으로 자른 후 세척 완충액 30ml가 들어있는 50ml 튜브에 모아서 세게 흔들어 세척하고 상층액이 맑아질때까지 300g에서 원심분리하였다. 수집된 펠릿을 25ml의 Cell Disassociation Solution (StemCell Technologies, Vancouver, Canada)에 재현탁하고 로커에서 40 분 동안 실온에서 인큐베이션하여 크립트를 방출하였다. 피펫팅 및 300g에서 5 분 동안 원심분리한 후 크립트를 수집했다. 펠릿을 1ml의 human intestical organoid medium (StemCell Technologies)에 재현탁하고, 도립 현미경 (inverted microscope)으로 크립트를 계수하였다. 100-150개의 크립트가 있는 배지와 1 : 1 비율의 마트리겔(matrigel)로 구성된 분주 믹스를 준비한 다음 24 웰 플레이트 중간에 놓았다. 세포를 인큐베이터에 되돌려 마트리겔을 중합하고, 20 분 후 1ml의 오가노이드 성장 배지를 각 웰에 부드럽게 첨가하였다. 이를 도 1의 모식도로 나타냈다.Small intestine jejunum tissues were isolated from Korean cattle and collected in wash buffer containing cold phosphate buffered saline (PBS) containing 1% penicillin/streptomycin (Sigma-Aldrich, NY, USA). The isolated jejunal tissues were cut lengthwise, washed thoroughly with wash buffer to remove debris, and the mucosal and submucosal layers were gently scraped using glass slides. The remaining muscle layer was cut into 3-5 mm pieces, collected in a 50 ml tube containing 30 ml of washing buffer, washed with vigorous shaking, and centrifuged at 300 g until the supernatant became clear. The collected pellet was resuspended in 25 ml of Cell Disassociation Solution (StemCell Technologies, Vancouver, Canada) and incubated on a rocker for 40 minutes at room temperature to release the crypts. Crypts were collected after pipetting and centrifugation at 300g for 5 minutes. The pellet was resuspended in 1 ml of human intestical organoid medium (StemCell Technologies) and crypts were counted under an inverted microscope. An aliquot mix consisting of medium with 100-150 crypts and matrigel in a 1:1 ratio was prepared and placed in the middle of a 24-well plate. The cells were returned to the incubator to polymerize the Matrigel, and 1 ml of organoid growth medium was gently added to each well after 20 minutes. This is shown in the schematic diagram of FIG. 1 .
비교예 1. 배지에 따른 소장 오가노이드 형성 능력Comparative Example 1. Small intestine organoid formation ability according to medium
소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드 형성에 있어, 최적의 배지 조건을 찾기 위해 mouse intestical organoid medium (StemCell Technologies)을 사용하여 실시예 1과 동일한 과정으로 3차원 배양을 수행하였다.In the formation of small intestine organoids containing small intestine-derived stem cells, 3-dimensional culture was performed in the same manner as in Example 1 using mouse intestinal organoid medium (StemCell Technologies) to find the optimal medium conditions.
그 결과, 도 2와 같이 mouse intestical organoid medium로 배양했을 때에는 소장 오가노이드를 형성하지 못하였고 배양 후 6일째에는 모든 세포가 죽는 것을 확인하였다(도 2).As a result, when cultured with mouse intestical organoid medium as shown in FIG. 2, small intestine organoids were not formed, and it was confirmed that all cells died on
실시예 2. 소장 오가노이드의 동결 조건 확립 및 해동 후 정상상태 유지 여부 확인Example 2. Establishment of freezing conditions for small intestine organoids and confirmation of maintenance of normal state after thawing
장기적이고 다양한 독립적인 오가노이드의 사용을 위해서는 오가노이드가 생존력을 거의 잃지 않고 장기간 보존되고 동결 및 해동 후에 다시 사용할 수 있어야 한다. 이를 확인하기 위해 동결을 위한 최적의 조건을 찾고 동결 및 해동 후의 오가노이드의 형태를 확인하였다.For the long-term and diverse use of independent organoids, organoids must be preserved for a long period of time with little loss of viability and can be reused after freezing and thawing. To confirm this, the optimal conditions for freezing were found and the morphology of organoids after freezing and thawing was confirmed.
구체적으로, 동결 보존을 위해서 오가노이드를 배지와 디메틸 설폭 사이드 (DMSO, dimethyl sulfoxide) (Sigma-Aldrich)로 구성된 보존 용액에 재현탁하고 -80 °C에서 24 시간 동안 보관하고 장기 보관을 위해 액체 질소 탱크로 옮겼다. 37℃ water bath에서 급속 해동 후 동결 시 첨가한 DMSO를 제거하기 위해 human intestical organoid medium(4.5ml)을 첨가하여 centrifuge(1200 rpm, 5 min)를 진행하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하였으며, 오가노이드 펠렛에 배지 1ml을 첨가하여 세포 카운팅 후 동등 볼륨의 마트릴겔을 첨가하여 돔 형성 및 3차원 배양하였다.Specifically, for cryopreservation, organoids were resuspended in a preservation solution consisting of medium and dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma-Aldrich), stored at -80 °C for 24 h, and stored in liquid nitrogen for long-term storage. transferred to the tank. After rapid thawing in a 37 ° C water bath, human intratestical organoid medium (4.5ml) was added to remove DMSO added during freezing and centrifuge (1200 rpm, 5 min) was performed. After centrifugation, the supernatant was removed, and 1 ml of medium was added to the organoid pellet for cell counting, and an equivalent volume of matril gel was added to form a dome and culture in three dimensions.
그 결과, 도 3a와 같이 10% DMSO와 90% 배지의 보존 용액에 동결한 오가노이드가 해동 후에도 90% 이상 생존하는 것을 확인하였다. 또한, 해동 후에도 형태학적으로 정상 상태의 오가노이드와 유사하였으며 안정적인 계대 배양이 가능하였다(도 3b). As a result, as shown in FIG. 3a , it was confirmed that the organoids frozen in a preservation solution of 10% DMSO and 90% medium survived more than 90% even after thawing. In addition, even after thawing, organoids were morphologically similar to normal organoids and stable subculture was possible (Fig. 3b).
실험예 1. 소장 오가노이드의 반복(recapitulating) 능력 확인Experimental Example 1. Confirmation of recapitulating ability of small intestine organoids
상기 실시예로 제조된 소장 오가노이드가 오가노이드의 형태를 유지하면서 얼마나 많은 passage 동안 지속되는지 계대 배양을 통해 확인하였다.How many passages the small intestine organoid prepared in the above example maintained while maintaining the organoid shape was confirmed through subculture.
소장 오가노이드는 대략 일주일에 한 번 정도 성숙된 상태에서 계대시켰다. 간단히 말해서, 배지를 부드럽게 흡인하고 오가노이드가 형성한 마트리겔 돔을 망가뜨리지 않고 차가운 PBS로 헹구었다. 오가노이드를 채취하기 위해, 10 배 부피의 무효소 세포 해리 완충액 (1ml)을 각 웰의 마트리겔 돔 (100μl)에 첨가하고 인큐베이터에서 10 분 동안 배양했다. 오가노이드는 부드러운 피펫팅에 의해 수거되고 300g에서 5 분 동안 원심 분리하여 수집했다. 펠릿을 원하는 양의 배지와 마트리겔에 1 : 1 비율로 재현탁하고 각 웰 (140 - 150개의 오가노이드)을 다음 계대에서 세 부분으로 분배하고 24 웰 플레이트에 분주하였다.Small intestine organoids were passaged approximately once a week in a mature state. Briefly, the medium was gently aspirated and the organoids formed Matrigel. The dome was rinsed with cold PBS without breaking it. To collect organoids, 10-fold volume of enzyme-free cell dissociation buffer (1 ml) was added to the matrigel dome (100 μl) of each well and incubated in an incubator for 10 minutes. Organoids were harvested by gentle pipetting and collected by centrifugation at 300 g for 5 min. The pellet was resuspended in the desired amount of medium and Matrigel at a 1:1 ratio, and each well (140 - 150 organoids) was divided into three portions in the next passage and seeded into 24 well plates.
또한, 제조된 소장 오가노이드가 지속적인 증식을 통해 반복 능력을 유지하고 있는지 확인하기 위해 세포 증식 마커인 Ki67의 발현을 확인하였다.In addition, expression of Ki67, a cell proliferation marker, was checked to confirm that the prepared small intestine organoids maintained their repeatability through continuous proliferation.
면역 조직 화학 분석(immunohistochemical analysis)을 위해 공장 조직을 PBS에 0.1 % Triton X-100을 넣어 5 분 동안 투과시키고 0.1 % 정상 염소 혈청과 1 시간 동안 배양하여 조직을 구연산 나트륨 버퍼 용액에서 끓여서 항원 회수 후 비특이적 결합을 차단하였다. 샘플을 4 °C에서 밤새 적절한 1 차 항체 희석액과 함께 배양하였다. Ki67의 발현 확인하기 위해 항 Ki67 antibody(D3B5, Cell Signaling Technology)을 사용하였다. 세척 후 샘플을 각각 실온에서 1 시간 동안 Alexa Fluor-488 및 Alexa Fluor-594 (Molecular Probes / Life Technologies, Waltham, MA, 미국)에 결합된 항 마우스 및 항 토끼 2 차 항체와 반응시켰다. 이러한 형광 샘플은 diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 대조 염색되었다. 이미지는 Olympus X100 공초점 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 캡처되었다.For immunohistochemical analysis, jejunum tissues were permeabilized with 0.1% Triton X-100 in PBS for 5 minutes, incubated with 0.1% normal goat serum for 1 hour, and tissues were boiled in sodium citrate buffer solution to recover antigens. Non-specific binding was blocked. Samples were incubated with appropriate primary antibody dilutions overnight at 4 °C. To confirm Ki67 expression, anti-Ki67 antibody (D3B5, Cell Signaling Technology) was used. After washing, the samples were reacted with anti-mouse and anti-rabbit secondary antibodies coupled to Alexa Fluor-488 and Alexa Fluor-594 (Molecular Probes/Life Technologies, Waltham, MA, USA) for 1 hour at room temperature, respectively. These fluorescent samples were counterstained with diamidino-2-phenylindole (DAPI). Images were captured using an Olympus X100 confocal microscope (Olympus, Tokyo, Japan).
오가노이드의 반복(recapitulating) 능력은 10 회(P10) 이상 계대 동안의 안정적인 성장과 장기 유지에 의해 입증되었다. 도 4a와 같이, 이러한 오가노이드는 P1에서 P4 세대의 초기 계대에서 루멘을 둘러싼 뚜렷한 크립트 및 융모 구조 (분기 구조)를 보여주었다. 이후에 소장에서 크립트를 분리하고 배양한 후 8일째의 완전히 성장한 구조의 모습을 나타내었다(도 4b). 또한, 그들은 각 세대에서 P1에서 P10까지 기저막 마트리겔 돔 당 평균 130-150개의 오가노이드에서 건강하고 일관된 성장을 보였으며, 이는 크립트의 반복 능력을 나타낸다(도 4c). 특히, 20 회(P20) 계대에서도 소장 오가노이드의 반복 능력 및 구조가 유지되는 것을 확인하였다(도 4d). 또한, P5의 소장 오가노이드에서 증식 세포 마커인 Ki67이 발현하는 것을 확인하였다(도 4e).The organoid's recapitulating ability was demonstrated by stable growth and long-term maintenance over 10 passages (P10). As shown in Fig. 4a, these organoids showed distinct crypt and villous structures (branching structures) surrounding the lumen at early passages from P1 to P4 generations. Thereafter, after the crypts were isolated from the small intestine and cultured, the fully grown structure was shown on the 8th day (Fig. 4b). In addition, they showed basement membrane matrigel from P1 to P10 in each generation. dome Healthy and consistent growth was seen at an average of 130-150 organoids per cell, indicating the ability of the crypts to repeat (Fig. 4c). In particular, it was confirmed that the repeating ability and structure of small intestine organoids were maintained even after 20 passages (P20) (FIG. 4d). In addition, it was confirmed that Ki67, a proliferative cell marker, was expressed in P5 small intestine organoids (FIG. 4e).
따라서, 소장 크립트에서 분리되고 배양된 소장 오가노이드는 반복 능력을 잃지 않고 장기간 유지된다는 것을 확인하였다.Therefore, it was confirmed that the small intestine organoids isolated and cultured from the small intestine crypts were maintained for a long period of time without losing their repeatability.
실험예 2. 공장 위치에 따른 오가노이드의 유도 효율Experimental Example 2. Induction efficiency of organoids according to plant location
소장 유래 소장 오가노이드의 효율적인 분리 및 배양을 위한 공장의 최적의 위치를 찾기 위해, 십이지장과 회장 사이의 공장에서 4 개의 다른 위치를 선택했다. To find the optimal location of the jejunum for efficient isolation and culture of small intestine-derived small intestine organoids, we selected four different locations in the jejunum between the duodenum and the ileum.
공장 조직은 차가운 PBS로 강하게 세척한 후 10 % 중성 완충 포르말린 (Sigma-Aldrich)에 의해 고정되었다. 조직은 이후 파라핀 블록에 매립되고 파라핀에 매립된 공장 조직은 3-5 μm의 두께로 수직 및 수평으로 절편되었다. 그런 다음 절편을 자일렌에서 탈 파라핀화하고 서로 다른 농도별 알코올을 통해 물로 재수화하였다. 소장 조직 절편을 해마톡실린 및 에오신(haematoxylin and eosin) (Merck, Darmstadt, Germany)조직염색을 통해 해부학적 분석을 수행하여 뚜렷한 크립토와 융모 구조를 확인했다.The jejunum tissue was washed vigorously with cold PBS and then fixed with 10% neutral buffered formalin (Sigma-Aldrich). The tissue was then embedded in a paraffin block and the paraffin-embedded jejunum tissue was sectioned vertically and horizontally at a thickness of 3-5 μm. Sections were then deparaffinized in xylene and rehydrated in water with different concentrations of alcohol. Small intestine tissue sections were subjected to anatomical analysis by tissue staining with haematoxylin and eosin (Merck, Darmstadt, Germany) to confirm distinct crypto and villous structures.
그 결과, 도 5a와 같이, 소장 오가노이드의 세부 구조는 위치 # 1 및 # 2가 위치 # 3 및 # 4보다 더 잘 발달되었다. 위치 # 1 및 # 2의 vertical view와 horizontal view는 바닥의 크립트 및 정점 측면의 손가락 모양 융모와 같은 소장 상피 샘(epithelium gland)의 구조를 나타냈다(도 5b). 또한, 4 개의 다른 위치에서 소장 오가노이드의 유도 효율을 확인하기 위해 소장 오가노이드를 배양하였다. 기저막 마트리겔 돔 당 소장 오가노이드의 수는 위치 # 1에서 가장 높았으며(도 5c), 이는 소장 오가노이드의 유도에 대한 가장 큰 성장 잠재력을 나타낸다.As a result, as shown in Fig. 5a, the detailed structures of the small intestine organoids at
실험예 3. 소장 오가노이드의 소장 조직 특이적 단백질 발현 확인Experimental Example 3. Confirmation of small intestine tissue-specific protein expression of small intestine organoids
소장 오가노이드는 소장 줄기세포, 파네스 세포(paneth cells), 장내 내분비 세포(enteroendocrine cells), 배세포(goblet cells) 및 흡수성 장세포(enterocyte)를 포함한 소장 세포 유형으로 구성된다는 것이 잘 알려져 있으므로 성체의 소장에서 유래한 소장 오가노이드의 세포 잠재력을 특성화하기 위해, 소장 줄기세포 및 상피세포와 관련된 여러 특정 마커의 공간적 발현을 P5 소장 오가노이드에서 확인하였다.Since it is well known that small intestinal organoids are composed of small intestinal cell types including small intestinal stem cells, paneth cells, enteroendocrine cells, goblet cells and absorptive enterocytes, adult To characterize the cellular potential of small intestine organoids derived from the small intestine of , the spatial expression of several specific markers related to small intestine stem cells and epithelial cells was confirmed in P5 small intestine organoids.
구체적으로, 오가노이드는 성숙될 때까지 24 웰 플레이트에서 유지되었다. 고정 배지를 웰에서 흡인하고, 오가노이드를 차가운 PBS로 철저히 세척하고 중성 완충된 4 % 파라포름알데히드 (Sigma-Aldrich)로 30 분 동안 실온에서 배양하였다. 그 후, 오가노이드를 PBS 중의 0.5 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich)을 함유하는 완충액으로 30 분 동안 실온에서 투과시켰다. 차단 단계는 PBS 중 3 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 사용하여 실온에서 1 시간 동안 수행되었다. 오가노이드를 PBS로 철저히 헹구고 적절한 희석액으로 표 1에 표시된 적절한 1 차 항체와 함께 4 °C에서 밤새 배양하였다. 마커 유전자 발현은 샘플을 AlexaFluor-488 및 AlexaFluor-594 (Molecular Probes / Life Technologies)에 결합된 해당 2 차 항체와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하여 검출되었다. 이러한 형광 샘플은 디아미디노 -2- 페닐인돌 (DAPI)로 대조 염색하고 ProLong Gold antifade (Life Technologies, Waltham, MA, USA) 고정 배지를 사용하여 유리 슬라이드에 고정하였다. 이미지는 Olympus X100 공초점 현미경(confocal microscope) (Olympus)으로 캡처되었다.Specifically, organoids were maintained in 24 well plates until maturation. The fixed medium was aspirated from the wells, and the organoids were thoroughly washed with cold PBS and incubated in neutral buffered 4% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) for 30 minutes at room temperature. Organoids were then permeabilized with buffer containing 0.5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) in PBS for 30 min at room temperature. The blocking step was performed for 1 h at room temperature using 3% bovine serum albumin (BSA) in PBS. Organoids were rinsed thoroughly with PBS and incubated overnight at 4 °C with appropriate primary antibodies indicated in Table 1 in appropriate dilutions. Marker gene expression was detected by incubating the samples with the corresponding secondary antibodies coupled to AlexaFluor-488 and AlexaFluor-594 (Molecular Probes/Life Technologies) for 1 hour at room temperature. These fluorescent samples were counterstained with diamidino-2-phenylindole (DAPI) and immobilized on glass slides using ProLong Gold antifade (Life Technologies, Waltham, MA, USA) fixation medium. Images were captured with an Olympus X100 confocal microscope (Olympus).
도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, 오가노이드에서 소장 줄기 세포 마커인 LGR5 및 Bmi1의 뚜렷한 발현을 확인하였다. 더욱이, 형광 염색된 오가노이드에서 상피 장벽 무결성(epithelial barrier integrity)에 기여하는 배세포(goblet cells)의 마커인 Mucin2, adherent junctions의 마커인 E-cadherin, 소장 상피 세포 골격의 마커인 F-actin, 장내 내분비 세포(enteroendocrine cells)의 마커인 Chromogranin A 및 흡수성 장 세포(enterocytes)의 마커인 Cytokeratin 19와 같은 상피 특이적 마커의 발현(도 6c)을 확인하였다. As shown in FIGS. 6A and 6B , distinct expression of small intestine stem cell markers, LGR5 and Bmi1, was confirmed in organoids. Furthermore, in fluorescently stained organoids, Mucin2, a marker of goblet cells contributing to epithelial barrier integrity, E-cadherin, a marker of adherent junctions, F-actin, a marker of the small intestine epithelial cytoskeleton, Expression of epithelial-specific markers such as Chromogranin A, a marker for enteroendocrine cells, and
따라서, 소장 크립트에서 유래된 소장 오가노이드에서 소장 줄기 세포 마커 및 소장 상피 세포 마커의 발현을 확인하였다.Therefore, the expression of small intestine stem cell markers and small intestine epithelial cell markers was confirmed in small intestine organoids derived from small intestine crypts.
실험예 4. 소장 오가노이드의 영양소 흡수능 확인Experimental Example 4. Confirmation of nutrient absorption capacity of small intestine organoids
소장 상피는 막을 통한 영양소 흡수 및 장 장벽을 통한 소분자의 확산에 중요한 역할을 하여 영양소 흡수를 통한 건강을 보장하고 혈류를 통한 세균 전위를 방지하므로 몇 가지 대표적인 영양 흡수 마커와 상피층의 세포 투과성 특성을 확인하였다.Since the small intestine epithelium plays an important role in membrane nutrient absorption and diffusion of small molecules across the intestinal barrier, ensuring health through nutrient absorption and preventing bacterial translocation through the bloodstream, several representative markers of nutrient absorption and cell permeability characteristics of the epithelial layer have been identified. did
영양소 흡수 관련 마커들의 발현을 확인하기 위해 실험예 3과 동일한 실험을 실시하였으며 표 1에 나타낸 항체들을 사용하였다. In order to confirm the expression of nutrient absorption-related markers, the same experiment as in Experimental Example 3 was performed, and the antibodies shown in Table 1 were used.
세포 투과성을 확인하기 위해, 상피 장벽 기능은 분말형 Fluorescein isothiocyanate (FITC) - dextran (4 및 40kDa) (Sigma-Aldrich)을 뉴클레이즈가 없는 물에 희석해 테스트하여 1mg / ml 작업 용액을 생성하였다. 오가노이드를 24 웰 플레이트에 넣고 크립트와 융모 구조로 완전히 발달할 때까지 성장하도록 두었다. 그 다음, 25 ng / ml FITC-dextran을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 정상적인 성장 조건에서 배양하였다. 투과성은 루미 날 흡수를 사용하여 관찰하고 라이카 CTR6000 형광 현미경 (Leica, Wentzler, Germany) 하에서 30 분 간격으로 180 분 이상 기록하였다.To confirm cell permeability, epithelial barrier function was tested by diluting powdered Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (4 and 40 kDa) (Sigma-Aldrich) in nuclease-free water to create a 1 mg/ml working solution. . Organoids were placed in 24 well plates and allowed to grow until fully developed into crypts and villous structures. Then, 25 ng/ml FITC-dextran was added to each well and the plate was incubated under normal growth conditions. Permeability was observed using luminal absorption and recorded over 180 min at 30 min intervals under a Leica CTR6000 fluorescence microscope (Leica, Wentzler, Germany).
그 결과, P5의 소장 오가노이드는 여러 대표적인 영양소 흡수 마커, 예를 들면 sodium-dependent glucose transporter (SGLT1), proton-coupled peptide transporter (PEPT1), glucose transporter (Glut2), glucagon-like peptide 1 (GLP1) 및 bile acid receptor (TGR5)에 대한 항체에 면역 반응을 보였다(도 7a). 소장 오가노이드의 세포 투과성을 확인하기 위해 형광 추적자(fluorescent tracer)를 처리 후 4 시간까지 확인하여 상피층의 파라세포성(paracellular permeability)을 확인하였다. FITC-dextran 4kDa은 오가노이드 루멘을 라벨링하여 포도당, 펩타이드 및 지방산과 같은 최대 4kDa의 화합물에 대한 높은 투과성을 보여 주었지만 FITC-dextran 40kDa는 오가노이드 루멘에 들어가지 못했다(도 7b). FITC의 농도는 지속적으로 유지되었고 FITC dextran 4 kDa의 느린 확산은 1.5 시간에 오가노이드 루멘으로 들어가기 시작하여 (도 7c), 장벽 기능과 영양 흡수에 중요한 역할을 하는 점액층(Mucin 2)의 존재를 나타냈다. 점막 장벽 기능 결과, 고블렛 세포에 의한 점액 분비가 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 소장 오가노이드가 소장의 기능 및 표현형 특성을 보존하고 영양 연구에서 영양소 흡수의 생리학적 지표로 사용될 수 있음을 나타낸다.As a result, the small intestine organoids of P5 showed several representative nutrient absorption markers, such as sodium-dependent glucose transporter (SGLT1), proton-coupled peptide transporter (PEPT1), glucose transporter (Glut2), and glucagon-like peptide 1 (GLP1). and bile acid receptor (TGR5) antibodies showed an immune response (FIG. 7a). In order to confirm the cell permeability of small intestine organoids, the paracellular permeability of the epithelial layer was confirmed by checking the fluorescent tracer up to 4 hours after treatment. FITC-
실험예 5. 소장 오가노이드의 유전자 발현 프로파일링Experimental Example 5. Gene expression profiling of small intestine organoids
대규모 유전자 발현 프로파일링을 통한 소장 오가노이드의 유전적 특성을 확인하기 위해 QuantSeq 3’mRNA-Seq. 라이브러리를 구성하였다. QuantSeq 3’mRNA-Seq for genetic characterization of small intestine organoids through large-scale gene expression profiling. library was constructed.
소장 오가노이드를 포함하는 샘플에 대한 총 RNA는 TRIzol 시약 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 분리하였다. RNA 품질은 RNA 6000 나노칩 (Agilent Technologies, Amstelveen, The Netherlands)을 사용하여 Agilent 2100 바이오 분석기로 평가하였으며, RNA 정량화는 ND 2000 Spectrophotometer (Thermo Inc., DE, USA)를 사용하여 수행되었다. 제어 및 테스트 RNA의 경우 제조업체의 지침에 따라 QuantSeq 3 'mRNA-Seq. Library Prep Kit (Lexogen, Inc., Austria)를 사용하여 라이브러리 구성을 수행하였다. 간단히 말해서, 500ng의 총 RNA를 각각 준비하고 5 '말단에 Illumina 호환 서열을 포함하는 oligo-dT 프라이머를 RNA에 혼성화하고 역전사를 수행하였다. RNA 주형의 분해 후, 두 번째 가닥 합성은 5 '말단에 Illumina 호환 링커 서열을 포함하는 랜덤 프라이머에 의해 시작되었다. 이중 가닥 라이브러리는 모든 반응 성분을 제거하기 위해 자기 비드(magnetic bead)를 사용하여 정제되었다. 클러스터 생성에 필요한 전체 어댑터 시퀀스를 추가하기 위해 라이브러리를 증폭하였다. 완성된 라이브러리는 PCR 구성 요소로 정제되었다. High-throughput 시퀀싱은 NextSeq 500 (Illumina, Inc., USA)에서 single-end 75 sequencing 으로 수행되었다.Total RNA for samples containing small intestine organoids was isolated using TRIzol reagent (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). RNA quality was assessed with an Agilent 2100 bioanalyzer using an RNA 6000 nanochip (Agilent Technologies, Amstelveen, The Netherlands), and RNA quantification was performed using an ND 2000 Spectrophotometer (Thermo Inc., DE, USA). For control and test RNA,
QuantSeq 3` mRNA-Seq. 판독은 Bowtie2를 사용하여 정렬되었다. Bowtie2 인덱스는 게놈 및 전사체에 대한 정렬을 위해 게놈 어셈블리 서열 또는 대표적인 전 사체 서열로부터 생성되었다. 정렬 파일은 전사체를 조립하고, 그 존재비를 추정하고, 유전자의 차별적 발현을 감지하는 데 사용되었다. 차별적으로 발현된 유전자는 Bedtools의 커버리지 명령을 사용하여 고유하고 다중적인 정렬의 카운트를 기반으로 결정되었다. RC (read count) 데이터는 Bioconductor를 사용하여 R (R Development Core Team, 2016) 내 EdgeR을 사용하는 quantile normalization 방법을 기반으로 처리되었다. 유전자 분류는 DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) 및 Medline 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 수행된 검색을 기반으로 하였다.
그 결과, 도 8a에서 나타나듯이 주성분 분석 (PCA, Principal componeent analysis)은 소장 오가노이드와 소장 사이의 거리가 소의 근육에 비해 상대적으로 가깝다는 것을 나타낸다. 또한 히트 맵(heat map)은 Tight Junction, Adhesion Junction, 데스모솜(Desmosome) 및 GAP Junction과 같은 상피 특성 범주의 많은 유전자가 근육에 비해 P5, P10의 소장 오가노이드 및 소장에서 유의하게 발현되는 것을 확인하였다(도 8b). 또한, 산란도(scatter plot)에서 소장 줄기세포 마커인 LGR5, Achaete-Scute Family BHLH Transcription Factor 2 (ASCL2), EPH Receptor B2 (EPHB2), Pleckstrin Homology like Domain Family A Member 1 (PHLDA1), SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX9) 및 Olfactomedin 4 (OLFM4)가 소장과 유사하게 P5 소장 오가노이드에서도 크게 상향 조절되는 것을 확인하였다(도 8c). 따라서, 이러한 결과는 소장 오가노이드의 유전적 특성이 소의 생체 내의 유전적 특성과 매우 유사하다는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 8A, principal component analysis (PCA) indicates that the distance between the small intestine organoid and the small intestine is relatively close compared to that of bovine muscle. In addition, the heat map confirmed that many genes in epithelial trait categories, such as tight junction, adhesion junction, desmosome, and GAP junction, were significantly expressed in small intestine organoids and small intestine at P5 and P10 compared to muscle. (Fig. 8b). In addition, in the scatter plot, small intestine stem cell marker LGR5, Achaete-Scute Family BHLH Transcription Factor 2 (ASCL2), EPH Receptor B2 (EPHB2), Pleckstrin Homology like Domain Family A Member 1 (PHLDA1), SRY-Box It was confirmed that Transcription Factor 9 (SOX9) and Olfactomedin 4 (OLFM4) were significantly up-regulated in P5 small intestine organoids, similar to the small intestine (Fig. 8c). Therefore, these results confirm that the genetic characteristics of the small intestine organoids are very similar to the genetic characteristics of cattle in vivo.
Claims (12)
2) 상기 분리한 줄기세포를 포함한 배지와 마트리겔(metrigel)을 혼합하여 3차원 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드의 제조방법.
1) isolating small intestine-derived stem cells from the small intestine; and
2) A method for producing small intestine organoids containing stem cells derived from the small intestine, comprising the step of three-dimensional culture by mixing the medium containing the isolated stem cells with Matrigel.
The method of claim 1, wherein the stem cells in step 1) are crypts.
The method for preparing small intestine organoids containing small intestine-derived stem cells according to claim 1, wherein the stem cells in step 1) are isolated from cattle aged 24 months or older.
The method of claim 1, wherein the stem cells in step 1) are isolated from a jejunum close to the duodenum.
The method of claim 1, wherein the mixing ratio of the medium and Matrigel in step 2) is 1:1.
A small intestine organoid comprising small intestine-derived stem cells prepared by the method of claim 1.
상기 소장 오가노이드는 소장 줄기세포 마커인 Lgr5(leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5)을 발현하는 것을 특징으로 하는 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드.
According to claim 6,
The small intestine organoid comprising small intestine-derived stem cells, characterized in that the small intestine organoid expresses the small intestine stem cell marker Lgr5 (leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5).
상기 소장 오가노이드는 영양소 흡수 관련 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드.
According to claim 6,
The small intestine organoid comprising small intestine-derived stem cells, characterized in that the small intestine organoid expresses a nutrient absorption related marker.
상기 영양소 흡수 관련 마커는 sodium-dependent glucose transporter (SGLT1), proton-coupled peptide transporter (PEPT1), glucose transporter (Glut2), glucagon-like peptide 1 (GLP1) 및 bile acid receptor (TGR5) 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드.
According to claim 8,
The nutrient absorption related marker is selected from the group consisting of sodium-dependent glucose transporter (SGLT1), proton-coupled peptide transporter (PEPT1), glucose transporter (Glut2), glucagon-like peptide 1 (GLP1) and bile acid receptor (TGR5) Small intestine organoids comprising small intestine-derived stem cells, characterized in that.
상기 소장 오가노이드는 세포 투과성을 가지는 것을 특징으로 하는 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드.
According to claim 6,
The small intestine organoid comprising small intestine-derived stem cells, characterized in that the small intestine organoid has cell permeability.
상기 소장 오가노이드는 동결 및 해동 후 분화 및 증식을 유지하는 것을 특징으로 하는 장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드.
According to claim 6,
The small intestine organoid comprising intestine-derived stem cells, characterized in that the small intestine organoid maintains differentiation and proliferation after freezing and thawing.
상기 소장 오가노이드를 포함하는 사료 성분 분석 및 효율 검증을 위한 모델.
According to claim 6,
A model for analyzing feed components and verifying efficiency including the small intestine organoid.
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