KR20220156040A - 미스폴드 sod1 어세이 - Google Patents

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마르셀 마이어
미하엘 잘츠만
얀 그림
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에이엘-에스 파마 아게
뉴리뮨 아게
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Abstract

대상체의 체액, 특히 뇌척수액에서 미스폴드 SOD1을 어세이하기 위한 새로운 고감도 방법이 제공된다. 이 방법은 SOD1의 고유한 에피토프 및 상응하는 항-SOD1 항체를 사용하는 새로운 고감도 면역어세이를 기반으로 한다. 또한, 면역어세이의 성분을 포함하는 키트가 제공된다.

Description

미스폴드 SOD1 어세이
본 발명은 일반적으로 대상체의 체액, 특히 뇌척수액(CSF)에서 미스폴드 SOD1(mSOD1)을 어세이하는 새로운 고감도 방법에 관한 것으로, mSOD1에 대한 고감도 면역어세이 뿐만 아니라 이러한 어세이에서 사용하기 위한 키트를 제공한다.
근위축성 측삭 경화증(ALS)은 효과적인 치료법이 없는 매우 이질적인 질환이다. 또한 이것은 ALS의 원인이 크게 알려져 있지 않기 때문에, ~90%의 경우가 산발성(sALS)이고 ~10%만이 가족성 ALS(fALS)이다. 1990년대 이후 집중적인 연구는 운동 뉴런 퇴행과 관련된 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 했다. 이러한 연구는 ALS가 여러 전신 매개변수의 조합에 의해 유발되는 복잡한 질환임을 시사한다. 현재까지, ALS의 단일 유전자 원인으로 최대 30개의 유전자가 기술되어 있으며, 가장 흔한 것은 C9orf72, SOD1, FUS, 및 TARDBP/TDP43이다; 검토를 위해 문헌 [Vijayakumar et al., Front. Neurol. 10 (2019):400. doi: 10.3389/fneur.2019.00400]을 참조한다. 유전적 연관 및 이에 따른 유전적 마커는 fALS에 대한 민감성의 예측 및 상관관계 결정에 적합할 수 있지만, sALS 뿐만 아니라 약물 개발의 평가는 조기 진단을 돕고, 표적 참여를 입증하고, 질환 진행을 모니터링하고, 및/또는 치료의 효능을 평가하기 위한 대리 종점 역할을 할 수 있는 바이오마커의 부족으로 인해 방해를 받았다. 유체 기반 바이오마커는 잠재적으로 이러한 문제를 해결할 수 있다. 이상적인 바이오마커는 ALS를 대조군(적절한 질환 유사체 및 기타 신경계 질환) 집단과 구별하기 위해 높은 특이성과 민감성을 나타내야 하고 개별 환자 내에서 질환 진행을 모니터링해야 한다. ALS 바이오마커를 찾기 위해 뇌척수액, 혈청, 및 혈장을 이용하여 상당한 진전이 있었으며, 소변 및 타액 바이오마커는 아직 개발 초기 단계에 있다. 이러한 바이오마커 후보 중 일부는 환자 계층화, 질환 경과(빠른 진행 vs. 느린 진행) 및 중증도 예측에서 사용이 입증되었거나, 전임상 및 임상 적용에 사용되었다. 그러나, ALS 바이오마커 발견은 지난 10년 동안 엄청난 발전을 보였지만, 바이오마커를 검증하고 이를 임상으로 옮기는 것은 여전히 어려운 일이다; 검토를 위해 문헌 [Vu and Bowser, Neurotherapeutics 14 (2017), 119-134]을 참조한다.
이 기술적 문제에 대한 해결책은 청구범위에서 특징지어지고 아래에서 발명의 설명에서 추가로 개시되는 구현예에 의해 제공된다.
본 발명은 일반적으로, SOD1의 특정 에피토프를 지향하는 항-SOD1 항체를 포획 항체로 포함하는 면역어세이를 사용하여 대상체로부터의 체액에서 미스폴드 SOD1(mSOD1)의 존재 및 수준을 각각 결정하는 새로운 고감도 방법에 관한 것이다. 첨부된 실시예 및 도면에 예시된 바와 같이, 본 발명의 방법으로 mSOD1을 검출하거나 대조군 시료에 비해 mSOD1의 증가된 수준을 어세이한 것은 ALS에 대한 지표이다. 더 구체적으로, 본 발명의 어세이는 지금까지는 거의 불가능했던, sALS를 갖는 환자를 높은 정확도로 식별하는 것이 가능하다.
본 발명은 SOD1의 특정 에피토프 및 그것을 지향하는 치료적 항-SOD1 항체가 각각 ALS를 앓거나 발병할 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체 및 ALS 환자로부터의 체액 시료에서 mSOD1의 검출에서 특히 진단적 가치도 있다는 예상치 못한 발견을 기반으로 하며, fALS 및 sALS를 검출하고 및/또는 이들을 구별할 수도 있다.
인간 Cu/Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD1)는 32kDa 동종이량체 금속효소이고, 염색체 21에 유전자 좌가 있으며, 세포질, 핵 및 퍼옥시좀 뿐만 아니라 진핵 세포의 미토콘드리아 막간 공간에도 주로 위치한다. 그것은 촉매 구리 이온 및 구조적 아연 이온을 결합시키는 활성 부위를 함유한다. SOD1의 기능적 역할은 슈퍼옥사이드 라디칼을 이산소 및 과산화수소로 불균일화(dismutation)시키는 것을 촉매하는 항산화 효소로 작용하여 슈퍼옥사이드의 정상 상태 농도와 세포에 대한 산화 스트레스를 낮추는 것이다(문헌 [Fridovich, Science 201 (1978), 875-879]).
SOD1을 코딩하는 유전자의 돌연변이는 가족성 근위축성 측삭 경화증(fALS) 사례의 약 20%와 산발성 ALS(sALS) 사례의 작은 비율을 차지한다(문헌 [Rosen et al., Nature 362 (1993), 59-62; Chio et al., Neurology 70 (2008), 533-537; Kwon et al., Neurobiol. Aging 33 (2012), e1017-1023]). ALS는 수의근을 제어하는 역할을 하는 뉴런, 특히 척수, 뇌간, 및 운동 피질의 운동 뉴런을 공격하는 빠르게 진행되고, 변함없이 치명적인 신경계 질환이다(문헌 [Bruijn et al., Annu. Rev. Neurosci. 27 (2004), 723-749]). SOD1의 돌연변이가 ALS로 이어지는 메커니즘은 완전히 이해되지 않았지만, 독성 기능 획득 메커니즘에 대한 증거가 있으며 여기서 SOD1의 돌연변이-유발 미스폴딩은 운동 뉴런의 변성을 유발하는 독성과 연관이 있다(문헌 [Julien, Cell 104 (2001), 581-591]).
그러나, 야생형(wt) SOD1의 미스폴딩은 대부분의 sALS 사례와 연관이 있는 것으로도 여겨진다(문헌 [Bosco et al., Nature Neuroscience 13 (2010), 1396-1403]). 야생형 SOD1은 서브유닛 이량체화, 잔기 Cys57 및 Cys146 사이의 서브유닛 내 이황화 결합의 구축, 및 구리와 아연의 배위와 같은, 대규모의 번역 후 변형의 대상이다. 이러한 과정의 중단은 모두 wt SOD1을 응집시키는 것으로 나타났으며(문헌 [Durazo et al., J. Biol. Chem. 277 (2009), 15923-15931; Est
Figure pct00001
vez et al., Science 286 (1999), 2498-2500; Rakhit et al., J. Biol. Chem. 279 (2004), 15499-15504; Lindberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004), 15893-15898]) 따라서 자발적인 ALS 형태에 대한 가능한 병원성 모델을 제공한다. wt SOD1의 비정상적인 변화는 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD)과 같은 다른 신경퇴행성 질환에서도 보고되었다.
SOD1은 잠재적인 바이오마커로 간주되었지만 상충되는 결과가 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Jacobsson et al., Brain 124 (2001), 1461-1466]은 D90A 및 기타 SOD1 돌연변이를 보유하는 ALS 환자와 그러한 돌연변이가 없는 환자로부터의 CSF에서 SOD1의 양, 활성 및 분자 형태를 결정했으며, 37개의 신경계 대조군, 54개의 산발성 및 12개의 가족성 ALS 사례, 및 D90A 돌연변이에 대해 동형접합자인 10개의 사례에서 SOD1의 단백질 및 효소 활성의 양에서 차이를 발견하지 못했다. 마찬가지로, 위에서, 문헌 [Vu and Bowser, (2017)]에 요약된 바와 같이, 또 다른 연구는 ALS를 갖는 환자와 신경계 질환 대조군 사이의 CSF SOD1 수준을 측정했지만 그룹 간의 유의미한 차이를 발견하지 못했고 SOD1 CSF 수준은 ALS에 대한 진단 바이오마커가 아님을 나타냈다. 또한, mSOD1 종의 상이한 서열 세그먼트와 반응하는 항체를 이용한 ELISA 어세이를 통한 ALS 환자 및 대조군으로부터의 CSF의 분석에 대한 후기 연구는 ALS 환자와 대조군 사이에 유의미한 차이가 없음을 보여주었다(문헌 [Zetterstrom et al., J. Neurochem. 117 (2011), 91-99]). 저자는 CNS의 간질에서 mSOD1의 추정 농도가 모델 시스템에서 감지할 수 있는 세포독성에 필요한 농도보다 1000배 더 낮다고 상정했다. 따라서 Zetterstrom et al.은 이러한 결과가 ALS에서 세포외 mSOD1의 직접적인 세포독성 역할에 반대되며 따라서 CSF에서 mSOD1은 효소에 돌연변이가 있는 환자 및 그러한 돌연변이가 없는 환자에서 ALS의 바이오마커로 사용될 수 없다고 결론을 내렸다.
최근에, Tokuda et al. (문헌 [Tokuda et al. Molecular Neurodegeneration (2019) 14:42 https://doi.org/10.1186/s13024-019-0341-5])은 sALS의 뇌척수액에서 미스폴드 야생형 SOD1에 대한 ELISA 어세이를 설명했다. 그러나, 사용된 포획항체인 항체 C4F6은 G93A 돌연변이가 있는 재조합 SOD1을 이용하여 생성된 단일클론성 항체로, 변성된 G93A에 대해서는 강한 면역반응성을 보이지만 다른 hSOD1 변이체에 대해서는 반응성이 훨씬 더 낮고, 변성된 WT hSOD1에 대해서는 반응성이 매우 낮은 것으로 보고되었다. 또한, C4F6 항체는 A4V fALS 사례에서 척수 조직을 염색하는 것으로 설명되었지만 sALS 사례에서는 그렇지 않았다; 항체 C4F6의 특성화에 대해 문헌 [Ayers et al. Acta Neuropathologica Communications 2014, 2:55 Page 2 of 13 http://www.actaneurocomms.org/content/2/1/55]을 참조한다. 따라서, 문헌 [Tokuda et al. (2019)]에 설명된 항체 C4F6 및 ELISA 어세이가 신뢰할 수 있고 임상으로 개발하기에 적합한지 여부는 여전히 확인할 것이 남아있다.
대조적으로, 본 발명의 범위 내에서 수행된 편향되지 않은 실험 결과 mSOD1에 대해 모두 높지만 다른 결합 친화도를 가지고 상이한 에피토프를 덮는 상이한 블라인드된 항-mSOD1 항체의 서브세트 중에서, NI-204.B 및 NI-204.O로 지정된 2개의 항체만 조직, 세포 및 체액 시료에서 mSOD1을 안정적으로 검출하는 것으로 밝혀졌지만, 다른 후보들은 그렇지 않았으며 이들 중 일부는 기존 ELISA 어세이에서 결정된 바와 같이 변성, 산화된 재조합 SOD1에 대해 상당히 더 낮은 EC50 값을 나타냈으며, 따라서 mSOD1에 대한 면역어세이에서 포획 항체로 사용하기 위한 첫 번째 선택사항이 되었다.
항체 프로브의 디코딩은 NI-204.B 및 NI-204.O가 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열 73-GGPKDEERHVGD-84 내에서 유사한 SOD1 에피토프를 공유한다는 것을 밝혀냈다. 본 발명에 따른 검출을 위한 면역어세이를 조사하는 경우, 항체 NI-204.B 및 NI-204.O가 각각 포획 항체로 사용되는 샌드위치 ELISA가 확립될 수 있고 항체 NI-204.B 및 NI-204.O에 대해 실시예에서 예시된 ALS 환자로부터의 CSF 시료에서 mSOD1을 안정적으로 검출하는 것으로 밝혀졌다. 원칙적으로, 적합한 포획 항체를 식별하기 위한 사전-어세이 및 후속 면역어세이는 문헌 [Gill et al., Sci. Rep. 9 (2019), 6724, https://doi.org/10.1038/s41598-019-43164-z](실시예에 예시된 CSF와 같은 체액에서 mSOD1의 검출을 위한 추가 수정이 있는 "방법" 섹션 참조)에 설명된 mSOD1에 대한 어세이를 기반으로 한다.
특히, 문헌 [Tokuda et al. (2019)]에서 사용된 항체 C4F6과 대조적으로, 항체 NI-204.B 및 NI-204.O에 의해 인식되는 에피토프는 돌연변이 SOD1 단백질과 반드시 연관되는 것은 아니며 A4V fALS 환자뿐만 아니라 sALS 및 C9ORF72 헥사뉴클레오타이드 반복 확장 또는 알려지지 않은 유전적 돌연변이를 보유한 fALS 환자의 척수 조직에서도 인식된다; 문헌 [Maier et al., Sci. Transl. Med. 10, eaah3924 (2018) 5]을 참조한다.
따라서, 문헌 [Tokuda et al. (2019)]에 설명된 ELISA 어세이가 작동한다면, 그 ELISA 어세이보다 본 발명의 어세이가 광범위한 ALS 환자에 적용할 수 있을 것으로 기대해 볼 수 있다.
따라서, 본 발명은 일반적으로 면역어세이를 사용하여 인간 대상체의 체액에서 mSOD1을 어세이하는 신규한 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 면역어세이는 ELISA 어세이이고 체액, 바람직하게는 CSF는 포획 항체로서의 제1 항-SOD1 항체 및 검출 항체로서의 제2 항-SOD1 항체와 접촉된다.
이 혁신적인 어세이는, 환자의 체액에서 mSOD1을 어세이함으로써 fALS 뿐만 아니라 sALS 둘 다 진단할 수 있기 때문에 특히 중요하고, 여기서 mSOD1은 바이오마커 역할을 한다. 이것은 fALS 사건의 대부분이 유전적 마커에 의해 결정될 수 있지만 sALS가 있는 환자의 식별은 훨씬 더 어렵기 때문에 중요하다. 따라서, 새로운 면역어세이를 이용하면 항-SOD1 항체 및/또는 ALS 및 그 증상의 치료에 현재 사용되는 다른 약물을 이용한 각각의 치료를 위해 ALS, 특히 산발성 ALS를 가진 환자를 식별 및 선택할 수 있다.
본 발명의 어세이는 체액, 바람직하게는 CSF에서 mSOD1 수준의 약력학적 변화를 모니터링하는 데에도 사용될 수 있으며, 이것은 ALS를 갖는 환자의 치료 또는 증상의 완화에 유용한 치료제의 용량 최적화를 도울 수 있다. 후보 치료제의 임상 시험에서 저농도의 mSOD1을 정확하고 정밀하게 정량화할 수 있을 만큼 충분히 민감한 어세이는 ALS 연구 노력에 도움이 될 것이다.
도 1: ALS 환자로부터의 체액의 시료에서 mSOD1의 검출. CSF에서 mSOD1의 정량적 측정을 위해, 오손 바이오시스템즈(Aushon BioSystems)에서 제조한 시라플렉스(Ciraplex)TM 휴먼 울트라센서티브 mSOD1 1-플렉스 면역어세이 키트(싱글플렉스(singleplex) 샌드위치 ELISA)를 사용하였다. 10명의 fALS 환자(도 1a), 6명의 sALS 환자(도 1b) 및 10명의 비-신경계 대조군 참가자(도 1c)로부터의 시료를 분석하고 결과를 막대 차트(도 1d 및 도 1e)에 나타낸다; *p<0.05 (misSOD1 양성/음성 사례의 카이-제곱 검정; 또는 크루스칼-왈리스/던의 다중 비교 검정).
본 발명은 대상체의 체액에서 mSOD1을 검출하기 위한 신규한 고감도 면역어세이에 관한 것으로, 여기서 어세이는 mSOD1 응집체에 배치된 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하고 이 어세이는 건강한 지원자로부터 ALS를 앓거나 ALS가 발병할 위험이 있는 대상체를 구별할 수 있다. 더 구체적으로, 본 발명은 발명의 설명에 개시되고 하기 실시예 및 도면에 추가로 예시되며, 청구범위에서 특징지어지는 구현예에 관한 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 용어는 Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, revised 2000 and reprinted 2003, ISBN 0 19 850673 2; Second edition published 2006, ISBN 0-19-852917-1 978-0-19852917-0에 제공된 정의를 따른다.
명세서 전체에 걸쳐 사용된 mSOD1을 "어세이하는 것"이라는 용어는 mSOD1 및 관련 발현물을 정량화하는 것 뿐만 아니라 mSOD1의 존재/양/수준/농도를 결정 또는 측정하는 것을 포함한다.
또한, 달리 언급되지 않는 한, 본 발명을 특징짓기 위해 본 명세서에서 사용된 용어 및 표현은 그 개시 내용이 본 명세서에 참조로서 명시적으로 포함되는, WO 2012/080518 A1, 특히 10 내지 30페이지의 하위섹션 "I. 정의"에 제공된 정의에 주어진다. 항체 등에 대한 WO 2012/080518 A1에 개시된 일반적인 구현예에도 동일하게 적용된다.
본 기술분야에 공지된 바와 같이, 상이한 신경퇴행성 질환은 mSOD1의 발생을 보여주거나 이것과 관련이 있으며, 예를 들어, ALS, 알츠하이머병(AD), ALS/파킨슨증-치매 콤플렉스(ALS-PDC), 다운 증후군 및 파킨슨병(PD)이다. 따라서, mSOD1의 존재 또는 상승된 수준은 상기 질환에 대한 지표일 수 있다. 또한, 위에서 언급한 바와 같이, SOD1을 코딩하는 유전자의 돌연변이는 미스폴딩을 유발할 수 있고 fALS 사례의 약 20% 및 sALS 사례의 적은 백분율을 차지하지만, wt SOD1의 미스폴딩은 sALS 사례와 연관이 있다. 따라서, mSOD1의 존재 또는 상승된 수준은 ALS에 대한 지표이다.
따라서, 본 발명의 방법은 ALS, AD, ALS-PDC, 다운 증후군 또는 PD를 진단하기 위한 방법으로서 사용될 수 있으며, 여기서 상기 방법은 진단될 대상체의 시료에서 mSOD1을 어세이하는 것을 포함하고, 여기서 각각, 시료 내 mSOD1의 존재는 상기 대상체의 상기 언급된 질환에 대한 지표이고 대조군 대비 시료 내 mSOD1의 증가된 수준은 상기 대상체의 상기 언급된 질환에 대한 지표이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법으로 진단되는 질환은 ALS이다.
SOD1의 미스폴딩이 fALS를 갖는 환자 뿐만 아니라 sALS를 갖는 환자에서 관찰되었고 mSOD1이 본 발명의 방법에서 사용된 항체에 의해 검출될 수 있기 때문에, 상기 방법은 fALS 및 sALS를 갖는 환자를 진단하는 데 사용될 수 있다.
진단되는 대상체는 질환에 대해 무증상이거나 전임상일 수 있다.
본 발명의 방법은 환자의 체액 시료에서 mSOD1을 스크리닝하는 것을 포함한다. 본 발명의 어세이로 분석될 시료는 예를 들어 혈액, CSF, 또는 소변 시료와 같이 병리학적으로 mSOD1을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 체액일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 시료는 전혈 용해물 또는 CSF, 바람직하게는 CSF이다.
본 발명의 방법은 체액을 제1 항-SOD1 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 면역어세이를 적용하며, 여기서 이 제1 항-SOD1 항체는 포획 항체로서 사용된다. 실험 과정 동안, 2개의 항체는 본 발명의 방법에 적합한 것으로 확인되었으며, 둘 다 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열 73-GGPKDEERHVGD-84 내의 SOD1의 에피토프에 결합한다. 이들 2개의 항체는 NI-204.B 및 NI-204.O로 지정된다. 상기 언급한 바와 같이, NI-204.B는 WO 2012/080518 A1에 개시된 항체 NI-204.12G7로 밝혀졌으며, 이것은 WO 2012/080518 A1의 서열번호 51에 제시된 아미노산 서열 73-GGPKDEERHVG-83을 포함하는 SOD1의 에피토프에 결합한다. NI-204.O는 아미노산 서열 76-KDEERHVGD-84 (서열번호 13)를 포함하는 SOD1의 에피토프에 결합한다.
원칙적으로, 포획 항체는 에피토프 73-GGPKDEERHVGD-84 (서열번호 11), 바람직하게는 아미노산 서열 73-GGPKDEERHVG-83 (서열번호 12)을 포함하는 에피토프 및/또는 아미노산 서열 76-KDEERHVGD-84 (서열번호 13)를 포함하는 에피토프를 인식하는 임의의 항체 또는 항체 포맷일 수 있다. 원칙적으로, 이러한 항체는 마우스, 토끼, 염소, 또는 다클론성 또는 단일클론성 항체를 생산하는 데 일반적으로 사용되는 기타 동물에서 상응하는 항원에 대해서, 또는 Fv, Fab 또는 완전한 IgG 라이브러리를 스크리닝함으로써 생성될 수 있다. 바람직하게는, 포획 항체는 단일클론성 항체이거나 단일클론성 항체로부터 유래된다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서 포획 항체는 인간 항체 NI-204.12G7로부터 유래되고 그의 가변 영역, 즉 결합 도메인에 WO 2012/080518 A1의 도 1B에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것을 특징으로 하거나, 또는 여기서 CDR 중 하나 이상이 WO 2012/080518 A1의 도 1B에 제시된 것과 아미노산 서열에 있어서 CDR2 및 CDR3의 경우 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 아미노산이 상이할 수 있고, 여기서 포획 항체는 WO 2012/080518 A1의 실시예에 예시된 항-SOD1 항체 NI-204.12G7과 실질적으로 같거나 동일한 면역학적 특성을 나타낸다. CDR의 위치는 WO 2012/080518 A1의 도 1B에 도시되어 있고 도 1에 대한 도면 범례에 설명되어 있다. 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 WO 2012/080518 A1의 54페이지의 표 II에 제시되어 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 프레임워크 영역 또는 완전한 VH 및/또는 VL 쇄는 WO 2012/080518 A1의 도 1B에 나타낸 프레임워크 영역과 80% 동일하고, 바람직하게는 WO 2012/080518 A1의 도 1B에 각각 나타낸, 프레임워크 영역 및 VH 및/또는 VL 쇄와 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 또한, 항체 NI-204.B의 클로닝 및 발현은 WO 2012/080518 A1의 84-88페이지에 "재료 및 방법" 섹션에 설명된 바와 같이 수행되었고, 따라서 이 방법은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
특히 바람직한 구현예에서, 포획 항체는 WO 2012/080518 A1의 도 1B에 나타낸 VH 및/또는 VL 쇄를 특징으로 한다.
따라서, 포획 항체는 바람직하게는 다음을 포함한다:
(i) VH 상보적 결정 영역(CDR) 1, 2, 및 3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및/또는 VL CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 가변 경쇄(VL), 여기서
(a) VH-CDR1은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(b) VH-CDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(c) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(d) VL-CDR1은 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(e) VL-CDR2는 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고, 및
(f) VL-CDR3은 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고; 및/또는
(ii) VH 쇄 및/또는 VL 쇄, 여기서
(a) VH 쇄는 서열번호 1 또는 2에 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고; 및
(b) VL 쇄는 서열번호 6 또는 7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고;
바람직하게는 VH 및 VL 쇄 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 또는 2 및 6 또는 7과 적어도 90% 동일하다.
원칙적으로, 포획 항체는 예를 들어 키메라 항체, 단일-쇄 항체, Fab-단편, 이중-특이적 항체, 융합 항체, 표지부착된 항체 또는 이들 중 어느 하나의 유사체를 포함하는 에피토프를 인식하는 임의의 포맷일 수 있다. 이러한 변이체를 생산하는 상응하는 방법은 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor (1988) First edition; Second edition by Edward A. Greenfield, Dana-Farber Cancer Institute ⓒ 2014, ISBN 978-1-936113-81-1]에 기재되어 있다. 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편을 생성하기 위해) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생성하기 위해)과 같은 효소를 이용하여 면역글로불린 분자의 단백질분해 절단에 의해 또는 재조합적으로 생성될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다. 이러한 단편은 예를 들어 방사성 동위원소와 같은 검출 시약에 면역글로불린의 면역특이적 부분을 커플링하는 것을 포함하는 면역진단 절차에서 사용하기에 충분하다. 바람직하게는, 포획 항체는 IgG 포맷을 가지고, 즉 완전한 IgG 항체이다. 인간 또는 마우스 불변 도메인을 갖는 완전한 인간 IgG1 항체의 재조합 발현은 실질적으로 WO 2012/080518 A1의 실시예에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 방법은 검출 항체로서 제2 항체의 사용을 추가로 포함한다. 이 항체는 포획 항체 73-GGPKDEERHVGD-84 (서열번호 11)의 에피토프와 상이한 에피토프에서 mSOD1에 결합하는 임의의 항-SOD1 항체일 수 있으며, 예를 들어 다클론성 비오틴화 - 염소 항-토끼 IgG(Jackson Immuno. 111-065-144)와 조합된 토끼 단일클론성 항-인간 SOD1(Abcam ab79390), 다클론성 토끼 항-인간 SOD1(Abcam ab52950)과 같은 상업적으로 이용가능한 항체일 수 있거나(예를 들어, 상기 문헌 [Gill et al. (2019)] 참조), 또는 WO 2012/080518 A1에 개시되거나 문헌 [Tokuda et al. (2019)]의 표 3에 나열되고 개시된 항-SOD1 항체일 수 있다.
일 구현예에서 검출 항체는 상업적으로 입수가능하고(Abcam ab185125), 합성 SOD1aa 50-150 펩티드에 대해 생성된 토끼 단일클론성 항체[EPR1726]이고 BSA 및 아지드가 없다. 항체 ab185125는 ab79390의 캐리어-없는 버전이며 형광색소, 금속 동위원소, 올리고뉴클레오티드, 및 효소를 포함하는 항체 표지부착에 사용하도록 설계되었다. 예비 에피토프 분석은 항체 EPR1726이 NI-204.12G7의 에피토프와 동일한 루프의 에피토프에, NI-204.12G7 에피토프 바로 앞에, 즉 대략 인간 SOD1의 아미노산(61 위크) 65-75에서 결합함을 시사한다. 따라서, 바람직하게는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 검출 항체는 항체 EPR1726의 것과 유사한 결합 특성을 나타내는 항체, 즉 인간 SOD1의 아미노산 50-150 내에서, 특히 인간 SOD1의 아미노산 (61)65-75에 결합하는 등가 단일클론성 항체이다. 본 기술분야의 기술자는 그러한 등가 항체에 도달하는 방법 및 방법을 잘 알고 있으며; 예를 들어, 상기 문헌[Harlow and Lane (1988) and Greenfield (2014), Antibodies: A Laboratory Manual]을 참조한다.
따라서, 바람직하게는 검출 항체는 제1 항체와 상이하고 포획 항체와 상이한 에피토프에 결합한다. 따라서, 제2 항체로서 mSOD1으로의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하지 않는 항체가 사용된다. 원칙적으로, 검출 항체는 mSOD1을 인식하는 임의의 포맷일 수도 있고, 제2 항체는 단일클론성 항체이다.
이러한 맥락에서, 본 발명에 따라 수행된 실험 동안, 상이한 블라인드된 항-mSOD1 항체의 서브세트 중 하나의 후보인, 지정된 NI-204.G는 포획 항체로는 적합하지 않으나 NI-204.G가 항체 NI-204.B의 존재 하에 mSOD1에 결합할 수 있기 때문에, 적합한 제2 항체, 즉 검출 항체로서 작용할 수 있는 것으로 드러났다. 항체 프로브를 디코딩한 결과 NI-204.G가 WO 2012/080518 A1에 개시된 항체 NI-204.12G3에 해당하는 것으로 나타났으며, 이것은 WO 2012/080518 A1의 서열번호 55에 제시된 아미노산 서열 121-HEKADDLGKGGNEES-135를 포함하는 SOD1의 에피토프에 결합한다. 따라서, 일 구현예에서 검출 항체는 에피토프 121-HEKADDLGKGGNEES-135 (서열번호 14)를 인식하고 포획 항체에 대해 기재된 바와 같은 임의의 공급원 및 항체 포맷일 수 있다. 바람직하게는, 검출 항체는 인간 항체 NI-204.12G3에서 유래하고 WO 2012/080518 A1의 도 1H에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VH 및 VL 쇄의 CDR을 그의 가변 영역, 즉 결합 도메인에 포함하는 것을 특징으로 하거나, 또는 여기서 하나 이상의 CDR은 CDR2 및 CDR3의 경우에 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 아미노산이 WO 2012/080518 A1의 도 1H에 제시된 것과 그의 아미노산 서열에서 상이할 수 있고, 여기서 포획 항체는 WO 2012/080518 A1의 실시예에 예시된 항-SOD1 항체 NI-204.12G3과 실질적으로 같거나 동일한 면역학적 특성을 나타낸다. CDR의 위치는 WO 2012/080518 A1의 도 1H에 도시되어 있고 도 1에 대한 도면 범례에 설명되어 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 프레임워크 영역 또는 완전한 VH 및/또는 VL 쇄는 WO 2012/080518 A1의 도 1H에 각각 나타낸, 프레임워크 영역 및 VH 및/또는 VL 쇄와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
그러나, 상기 언급된 바와 같이, 검출 항체로서도 상이한 항-SOD1 항체가 유용할 수 있고, 특히 항체 Abcam ab185125, Abcam ab79390 및 NI-204.12G3에 의해 각각 인식되는 실질적으로 동일한 에피토프 및 아미노산 영역, 바람직하게는 SOD1aa 100-150 내의 에피토프를 인식하는 항체가 유용할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 어세이에 따라 사용하기 위한 이러한 검출 항체는 본 발명의 샌드위치 ELISA 포맷에서 SOD1에 결합하기 위해 항체 Abcam ab185125, Abcam ab79390 및/또는 NI-204.12G3과 경쟁한다.
바람직하게는, 검출 항체는 IgG 포맷을 가지며, 즉 완전한 IgG 항체이다. 인간 또는 마우스 불변 도메인을 갖는 완전한 인간 IgG1 항체의 재조합적 발현은 실질적으로 WO 2012/080518 A1의 실시예에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명의 mSOD1 어세이의 일 구현예에서, 검출 항체는 다음을 포함한다:
(i) VH 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2, 및 3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및/또는 VL CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 가변 경쇄(VL), 여기서
(a) VH-CDR1은 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(b) VH-CDR2는 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(c) VH-CDR3은 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(d) VL-CDR1은 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(e) VL-CDR2는 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(f) VL-CDR3은 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고; 및/또는
(ii) VH 쇄 및/또는 VL 쇄, 여기서
(a) VH 쇄는 서열번호 15에 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고; 및
(b) VL 쇄는 서열번호 19에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고;
바람직하게는 VH 및 VL 쇄 아미노산 서열은 각각 서열번호 15 및 19와 적어도 90% 동일하다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 제2 항체 또는 이의 단편은 검출가능한 표지(예를 들어, 형광, 화학발광, 방사성, 효소, 핵 자기, 중금속, 태그, 플래그 등)를 포함한다; 예를 들어, 일반적인 기술에 대해서는 문헌 [Antibodies A Laboratory Manual 2nd edition, 2014 by Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA]; 동적 세포 이미지화를 위한 형광 표지부착 전략의 발전에 대해서는 문헌 [Dean and Palmer, Nat. Chem. Biol. 10 (2014), 512-523]; 및 항체-약물 접합체 및 항체 모방체에 대한 효소 기반 표지부착 전략에 대해서는 문헌 [Falck and M
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ller, Antibodies 7 (2018), 4; doi:10.3390/antib7010004]을 참조한다.
표지는 직접 검출될 수 있는 표지(예를 들어 형광 표지(물리화학적 리포터))이거나 또는 직접 검출가능한 표지를 포함하는 리간드-결합 파트너에 의해 결합되는 리간드일 수 있는 표지(예를 들어 비오틴)일 수 있다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 제2 항체는 리간드-결합 파트너, 즉 비공유 단백질-리간드 상호작용을 형성하는 리간드 결합 태그에 결합할 수 있는 리간드에 접합된다.
본 발명에 따르면, 리간드는 본 기술분야의 기술자에게 공지된 모이어티이고 친화성 태그, 예를 들어, His-Tag, 말토스-결합 단백질(MBP)-태그, 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST)-태그, 키틴 결합 도메인 또는 티오레독신, 칼모듈린 결합 펩티드(CBP), FLAG-펩티드, Arg-태그, Hat-태그, c-myc-태그, S-태그, 또는 스트렙트아비딘 결합 태그, 예를 들어, 트윈-스트렙-태그® 등 뿐만 아니라 비오틴을 포함한다. 예를 들어 문헌 [Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 (2003), 523-533]에 개요가 제공되며 이들의 아미노산 서열을 포함하는 예시적인 태그가 본 명세서에 참조로서 포함되는 문헌 [Terpe (2003)]의 표 2에 나열되어 있다.
바람직한 구현예에서, 리간드는 비오틴 또는 비오틴 유사체 또는 이의 유도체이거나 이것을 포함하고, 즉 본 발명의 방법에 사용되는 제2 항체는 비오틴화된다. 항체의 비오틴화는 본 기술분야에 일반적으로 알려져 있으며, 본 기술분야의 기술자가 비오틴화 항체를 생성할 수 있도록 하는 상업적 키트를 이용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 상기 언급된 리간드와 상용가능한 리간드-결합 파트너를 이용한 표지부착 단계를 포함한다. 이들 리간드-결합 파트너는 또한 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Terpe, Appl Microbiol Biotechnol 60 (2003), 523-533]에 요약되어 있다.
바람직한 구현예에서, 리간드-결합 파트너는 각각의 비오틴 또는 유도체에 결합하는 스트렙트아비딘, 아비딘, 스트렙트아비딘 유사체 또는 아비딘 유사체이다. 리간드-결합 파트너는 상기 명시된 바와 같은 검출가능한 표지일 수 있는 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 접합체에 포함된다. 바람직하게는, 접합체에 포함된 검출가능한 표지는 발색성/형광성 또는 화학발광 표지, 즉 발색성/형광성/화학발광 기질의 전환을 촉매할 수 있는 효소이다. 바람직한 구현예에서, 검출가능한 표지는 서양고추냉이 퍼옥시다제 또는 β-갈락토시다제이다. 따라서, 접합체는 스트렙트아비딘-HRP 접합체 또는 스트렙트아비딘-β-갈락토시다제(SβG) 접합체이다. 이 효소는 적절한 기질 용액이 첨가될 때 신호를 생성한다. HRP의 경우 발색성 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 또는 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산](ABTS)이 사용되거나 루미놀 또는 화학발광 기질로서 루미놀을 포함하는 기질이 사용되며, β-갈락토시다제 레소루핀의 경우 β-D-갈락토피라노사이드(RGP)가 사용된다.
바람직하게는 본 발명의 방법은 하나의 표적만이 검출되는 것을 의미하는 싱글플렉스 어세이를 포함한다. 본 발명의 방법에서, mSOD1은 단일 표적으로서 검출된다. 그러나, 어세이는 멀티플렉스 어세이로 설계될 수도 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 적어도 다음 단계를 포함한다:
표면에 부착된 제1 항-SOD1 항체로 대상체의 시료 내에서 mSOD1을 포획하고, mSOD1에 결합할 수 있도록 하는 검출가능한 표지를 포함하는 제2 항-SOD1 항체를 첨가하고, 표지의 신호를 검출하고 표지의 신호를 대조군과 비교하는 단계.
일 구현예에서, 방법은 다음 단계를 포함한다; 실시예 1도 참조한다:
먼저, 전술한 바와 같은 제1 항-SOD1 항체가 스폿팅된 마이크로플레이트를 제공한다. 이러한 플레이트는 오손 바이오시스템즈에서 생산될 수 있으며 상업적으로 이용가능하다. 또한, 마이크로어레이 면역어세이의 설계는 일반적으로 문헌 [Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696]에 요약되어 있다. 바람직하게는, 이 플레이트는 96-웰 플레이트이다.
추가 단계는 체액을 포함하는 시료를 마이크로플레이트의 웰에 첨가하는 것을 포함한다. 체액은 전술한 바와 같은 임의의 체액일 수 있지만, 바람직하게는 CSF이다. 체액은 추가로 변형될 수도 있으며, 예를 들어 원하지 않는 성분 또는 면역어세이를 방해할 수 있는 성분을 제거하기 위해 정제될 수 있다. 시료는 항체-항원 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건, 즉 시료에 존재하는 경우 mSOD1에 대한 제1 항-SOD1 항체의 결합을 가능하게 하는 조건 하에 웰에서 인큐베이션된다. 적합한 조건의 확인은 실제 어세이와 동시에 또는 올바른 매개변수를 조정하기 위해 사전에 양성 대조군을 시험함으로써 수행될 수 있다. 양성 대조군은 정제된 mSOD1이거나 mSOD1이 연관된 ALS를 갖는 환자의 시료일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 인큐베이션은 바람직하게는 600rpm으로 설정된 플레이트 쉐이커에서 실온에서 2시간 동안 수행된다. 바람직한 구현예에서, 플레이트는 결합되지 않은 성분을 제거하기 위해 이후에 세척된다.
다음 단계는 시료에 제2 항-SOD1 항체를 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 제2 항체는 리간드에 접합된다. 제2 항-SOD1 항체는 전술한 바와 같은 항체 또는 결합 단편일 수 있고, 바람직하게는 각각 mSOD1의 상이한 결합 부위 및 mSOD1의 상이한 에피토프에 결합하는 항체일 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 리간드는 직접 검출될 수 있는 표지(예를 들어 형광 표지)이거나 또는 직접 검출가능한 표지를 포함하는 리간드-결합 파트너에 의해 결합되는 표지를 포함하는 리간드이다. 바람직한 구현예에서, 제2 항체는 비오틴화되고, 즉 비오틴 또는 비오틴 유사체 또는 이의 유도체에 접합된다.
혼합물은 추가 항체-항원 복합체를 형성할 수 있는 조건, 즉 시료에 존재하는 경우 mSOD1에 대한 제2 항-SOD1 항체의 결합을 가능하게 하는 조건 하에 웰에서 인큐베이션된다. 상기 조건은 두 개의 항체, 즉 제1 및 제2 항체가 mSOD1에 결합할 수 있도록 선택되어야 한다. 상기 언급한 바와 같이, 적절한 조건은 양성 대조군으로 시험될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 인큐베이션은 바람직하게는 600rpm으로 설정된 플레이트 쉐이커에서 실온에서 30분 동안 수행된다. 바람직한 구현예에서, 플레이트는 과량의 검출 항체를 제거하기 위해 이후에 세척된다.
시료 및 제2 항체는 제1 항체로 코팅된 마이크로플레이트에 동시에 첨가될 수도 있으며 인큐베이션은 mSOD1에 대한 제1 항-SOD1 항체 및 mSOD1에 대한 제2 항-SOD1 항체의 결합이 가능하도록 수행될 수 있다.
2차 항체가 검출가능한 표지(예: 형광 표지 또는 효소)로 직접 표지부착되는 경우, 적절한 기질 용액이 첨가된다.
간접 표지부착이 적용되는 경우, 리간드-결합 파트너 뿐만 아니라 검출가능한 표지를 포함하는 접합체가 첨가된다. 접합체와 함께 시료의 인큐베이션은 바람직하게는 600rpm으로 설정된 플레이트 쉐이커에서 실온에서 바람직하게는 추가로 30분 동안 수행된다. 접합체에 포함된 리간드-결합 파트너는 예를 들어 스트렙트아비딘 또는 아비딘 또는 이의 기능적 유사체 또는 유도체일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 리간드-결합 파트너는 스트렙트아비딘 또는 이의 기능적 유사체 또는 유도체이다. 접합체에 포함된 검출가능한 표지는 상기 언급된 바와 같은 임의의 검출가능한 표지일 수 있지만, 바람직하게는 발색성/형광성 또는 화학발광 기질의 전환을 촉매할 수 있는 효소이다. 더 바람직하게는, 효소는 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)이다. 따라서, 접합체는 스트렙트아비딘-HRP 시약이다. 바람직하게는 세척 단계를 수행한 후, 적절한 기질 용액, 바람직하게는 발색성 또는 화학발광 기질 용액이 첨가된다. 바람직한 구현예에서, TMB, 루미놀, 또는 루미놀을 포함하는 기질이 사용된다.
혼합물에서 파생된 신호는 이미지화된다. 원칙적으로, 특히 형광 또는 화학발광 신호를 고감도로 검출 및 측정할 수 있는 모든 상업적 이미지화 시스템을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 이미지화는 시라스캔™ 이미지화 시스템으로 수행된다.
각 웰의 신호는 검출되고 측정되며 대조군과 비교된다. 바람직하게는 대조군은 동일한 마이크로플레이트에서 별도의 웰 내에서 어세이된다.
대조군은 참조 표준, 즉 mSOD1일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로 제2 대조군으로서 신경퇴행성 질환이 없는 대조군 대상체의 시료가 사용되며, 여기서 시료 내의 mSOD1 수준과 대조군 사이의 차이는 진단될 대상체가 신경퇴행성 질환을 가짐을 나타낸다. 특히, 상기 대조군 시료에 비해 시료 내 mSOD1의 상승된 수준은 질환, 특히 ALS에 대한 지표이다. 바람직하게는, 진단될 대상체 및 대조군 대상체(들)는 연령이 일치한다.
일 구현예에서, 표준은 200 ng/㎖ 내지 3 pg/㎖의 미스폴드 SOD1의 연속 희석액을 포함한다.
일 구현예에서, 마이크로플레이트는 인큐베이션 단계 동안 시료 증발을 방지하기 위해 뚜껑, 바람직하게는 유체로 채워진 유체-흡수 매트릭스를 갖는 뚜껑으로 덮인다. 전술한 세척 단계는 표면에 대한 제1 항체의 결합, mSOD1에 대한 제1 및 제2 항체의 결합 및 제2 항체에 대한 접합체의 결합을 방해하지 않는 임의의 적합한 완충액으로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 세척은 실시예에 기재된 바와 같이 키트에 제공된 오손 바이오시스템즈의 세척 완충액으로 수행된다. 상기 언급한 바와 같이, mSOD1에 대한 항체의 결합 및 제2 항체의 리간드에 접합된 결합을 가능하게 하기 위해 어세이의 상이한 단계들 사이에 인큐베이션이 수행된다. 물론, 항체와 접합체의 결합이 보장되는 한 상이한 인큐베이션 시간이 선택될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 디지털 ELISA로도 알려진 단일 분자 어레이(시모어™)를 이용한다. 이 접근법에서, 표적 단백질은 항체가 코팅된, 상자성 비드 상에 포획되고, 포획된 단백질은 효소 표지로 표지부착되며, 단일 비드가 단리되고 효소 기질의 존재 하에 펨토리터 웰의 어레이에서 밀봉된다. 밀봉 단계는 효소-기질 반응의 형광 생성물을 ~40fL 부피로 제한하고, 단일 효소에 의해 생성된 형광은 냉각되지 않은 CCD 카메라에서 백색광 여기 공급원을 이용하여 30초 이내에 검출될 수 있다; 문헌 [Quanterix Whitepaper 6.0 (2015)] 및 그 안에 인용된 참고 문헌, 예를 들어 문헌 [Rissin et al., Measurement of single protein molecules using digital ELISA. In: Wild, D. (Ed.), The Immunoassay Handbook: Theory and Applications of Ligand Binding, ELISA and Related Techniques, 4th ed. Elsevier, Oxford, UK and Rivnak et al., A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood, J. Immunol. Methods, 2015; 424:20]을 참조한다. 예를 들어, 포획 비드, 바람직하게는 약 2.7μM의 직경을 가지고, 그의 표면에 상기 정의된 바와 같은 제1 항체 또는 이의 결합 단편이 부착된 상자성 비드가 본 발명의 방법에 사용될 수 있고; 실시예 3을 참조한다. 이러한 비드를 사용하면 단일 분자 수준에서 mSOD1을 검출할 수 있다. 상기 정의된 바와 같은 체액을 포함하는 시료를 포획 비드에 첨가하고 인큐베이션을 수행하여 체액에 존재하는 경우 mSOD1이 제1 항-SOD1 항체에 의해 매개되는 비드에 의해 포획될 수 있도록 한다. 위에서 언급한 바와 같이, 인큐베이션 조건은 달라질 수 있으며 최적의 조건은 양성 대조군을 이용해 시험될 수 있다. 바람직하게는, 인큐베이션 시간은 30분이다. 그 후, 상기 정의된 바와 같은 리간드에 접합된 제2 항-SOD1 항체를 첨가하고 인큐베이션을 수행하여 제2 항-SOD1 항체가 비드 상에 포획된 미스폴드 SOD1에 결합할 수 있도록 한다. 바람직하게는, 인큐베이션은 5분 동안 수행된다. 대안적으로, 시료 및 제2 항체를 포획 비드에 첨가하고 인큐베이션을 수행하여 체액에 존재하는 미스폴드 SOD1가 제1 항-SOD1 항체에 의해 매개되는 비드에 의해 포획되고 제2 항-SOD1 항체가 상기 비드 상에 포획된 미스폴드 SOD1에 결합되도록 한다는 점에서 전술한 2개의 단계를 조합할 수 있다. 인큐베이션 시간은 바람직하게는 2개의 단계를 조합할 때, 바람직하게는 35분으로 증가된다. 제2 항체가 검출가능한 표지로 직접 표지부착되지 않고 리간드로 표지부착되는 경우, 리간드-결합 파트너 및 검출가능한 표지를 포함하는 상기 정의된 바와 같은 접합체가 첨가되며, 바람직하게는 리간드-결합 파트너는 스트렙트아비딘 또는 이의 기능적 유사체 또는 유도체이고 검출가능한 표지는 발색성 또는 형광 기질을 발색할 수 있는 효소이며, 바람직하게는 효소는 β-갈락토시다제이다. 인큐베이션은 바람직하게는 5분 동안 수행된다. 또한 상기 언급된 바와 같이, 비드가 재현탁된 상기 정의된 바와 같은 형광성 기질 용액이 첨가된다. 바람직하게는, 기질은 레소루핀 β-D-갈락토피라노사이드(RGP)이다. 다음 단계에서, 웰 당 1개 이하의 비드를 보유하도록 구성된 마이크로플레이트의 펨토리터 크기의 웰에 비드를 로딩한다. 바람직하게는, 웰의 너비는 약 4.25㎛이고 깊이는 약 3.25㎛이다. 바람직하게는 오일로 웰을 밀봉하고 형광 신호의 이미지화를 수행한다. 원칙적으로 고감도로 신호를 검출하는 상업적으로 이용가능한 모든 이미지화 시스템을 사용할 수 있다. 이 어세이는 퀀터릭스(Quanterix)로부터 상업적으로 이용가능한 시모어® 어세이를 기반으로 하므로, 시약 및 시모어TM 광학 시스템이 상기 면역어세이에서 사용된다. 이미 위에서 언급한 바와 같이, 어세이의 상이한 단계들 사이에 세척 단계가 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법의 일 구현예에서 제2 항-SOD1 항체는 리간드에 접합되고 상기 방법은 리간드-결합 태그를 이용한 표지부착 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 방법은 단일 분자 어레이(시모어™) 어세이를 이용하고, 선택적으로 다음 단계 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 포함한다:
(i) 포획 비드의 표면에 제1 항-SOD1 항체를 부착하는 단계로서, 바람직하게는 비드는 상자성 비드이고 및/또는 약 2.7μM의 직경을 가짐; 및
(ii)(a) 체액, 바람직하게는 CSF를 포함하는 시료를 첨가하고, 및 시료와 함께 비드를 인큐베이션하고, 이로써 체액에 존재하는 미스폴드 SOD1이 제1 항-SOD1 항체에 의해 매개되는 비드에 의해 포획되도록 하는 단계로서, 바람직하게는 여기서 인큐베이션 시간은 30분임; 및
(ii)(b) 리간드, 바람직하게는 비오틴 또는 비오틴 유사체 또는 이의 유도체에 접합된 제2 항-SOD1 항체를 첨가하고 인큐베이션함으로써 제2 항-SOD1 항체가 비드 상에 포획된 미스폴드 SOD1에 결합되도록 하는 단계로서, 바람직하게는 여기서 인큐베이션 시간은 5분임; 및
(ii)(c) 리간드-결합 태그, 바람직하게는 스트렙트아비딘 또는 이의 기능적 유사체 또는 유도체, 및 검출가능한 표지, 바람직하게는 발색성 기질 또는 형광 분자를 발색할 수 있는 효소를 포함하는 접합체를 첨가하고 인큐베이션하는 단계로서, 바람직하게는 상기 효소는 β-갈락토시다제(스트렙트아비딘-β-갈락토시다제(SβG) 접합체이고, 바람직하게는 여기서 인큐베이션 시간은 5분임; 또는
(II)(A) 체액, 바람직하게는 CSF를 포함하는 시료를 첨가하고, 리간드, 바람직하게는 비오틴 또는 비오틴 유사체 또는 이의 유도체에 접합된 제2 항-SOD1 항체를 첨가하고, 및 시료 및 제2 항체와 함께 비드를 인큐베이션하고, 이로써 체액에 존재하는 미스폴드 SOD1이 제1 항-SOD1 항체에 의해 매개되는 비드에 의해 포획되고 비드 상에 포획된 미스폴드 SOD1에 제2 항-SOD1 항체가 결합되도록 하는 단계로서, 바람직하게는 여기서 인큐베이션 시간은 35분임; 및
(II)(B) 리간드-결합 태그, 바람직하게는 스트렙트아비딘 또는 이의 기능적 유사체 또는 유도체, 및 검출가능한 표지, 바람직하게는 발색성 기질 또는 형광 분자를 발색할 수 있는 효소를 포함하는 접합체를 첨가하고 인큐베이션하는 단계로서, 바람직하게는 여기서 효소는 β-갈락토시다제(스트렙트아비딘-β-갈락토시다제(SβG) 접합체)이고, 바람직하게는 인큐베이션 시간은 5분임; 및
(iii) 형광성 기질 용액에서 비드를 재현탁하는 단계로서, 바람직하게는 여기서 형광성 기질은 레소루핀 β-D-갈락토피라노사이드(RGP)임; 및
(iv) 단계 (iii)의 비드를 웰 당 1개 이하의 비드를 보유하도록 구성된 펨토리터 크기 웰의 어레이에 로딩하는 단계; 및
(v) 펨토리터 크기 웰 내에서 개별 비드를 밀봉하는 단계로서, 바람직하게는 밀봉은 오일로 수행됨; 및
(vi) 형광 신호를 이미지화하는 단계로서, 바람직하게 이미지화는 시모어™ 광학 시스템에 의해 수행됨; 선택적으로
(vii) 미스폴드 SOD1의 어세이된 수준을 참조 표준 및/또는 대조군과 비교하는 단계.
단계 (ii)(a), (ii)(b) 및 (ii)(c)는 "3단계 접근법"을 나타내고 단계 (II)(a) 및 (II)(b)는 "2단계 접근법"을 나타낸다.
위에서 언급한 바와 같이, 대조군은 참조 표준, 즉 mSOD1일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로 제2 대조군으로서 신경퇴행성 질환이 없는 대조군 대상체의 시료가 사용되며, 여기서 시료 및 대조군 내 mSOD1 수준 사이의 차이는 진단될 대상체가 신경퇴행성 질환을 가짐을 나타낸다. 특히, 상기 대조군 시료와 비교하여 시료 내 mSOD1의 상승된 수준은 질환, 특히 ALS에 대한 지표이다. 바람직하게는, 진단될 대상체 및 대조군 대상체(들)는 연령이 일치한다.
일 구현예에서, 표준은 미스폴드 SOD1의 연속 희석액을 약 1000 ng/㎖에서 8점 검량선으로 4배 연속 희석에 의해 0.244 ng/㎖까지, 10 ng/㎖에서 8점 검량선으로 2배 연속 희석에 의해 0.020 ng/㎖까지, 50 ng/㎖에서 12점 검량선으로 2배 연속 희석에 의해 0.012 ng/㎖까지 및/또는 약 66.66667 ng/㎖에서 12점 검량선으로 3배 연속 희석에 의해 0.00339 ng/㎖까지 포함한다.
본 발명에 따른 방법은 대상체의 CSF에서 최소량의 mSOD1을 검출할 수 있는 고감도이다. 고감도는 특히 본 발명의 방법에서 제1 포획 항체로서 사용된 항체에 기인할 수 있다. 어세이에 따라, mSOD1은 허용가능한 정밀도로 6 내지 7 pg/㎖까지 검출될 수 있다. 오손 바이오시스템즈의 시약 및 기기를 이용한 어세이와 관련하여, 1:2 MRD(최소 요구 희석) 후 보고가능한 범위 20.32 내지 14814.82 pg/mL로 이어지는 10.16 pg/㎖ 내지 7404.41 pg/㎖의 mSOD1 범위 내에서 보다 정밀한 결과가 수득되었다. 퀀터릭스의 시약 및 기기를 이용한 어세이와 관련하여, 어세이는 실시예 3에 기재된 바와 같이 사용된 포획 항체에 따라, 각각, 2x 어세이 백그라운드 방법을 기반으로 6 pg/㎖ 내지 32 pg/㎖ 범위의 LLOD 및 58 pg/㎖ 내지 132 pg/㎖ 범위의 LLOQ 및 10.8 내지 13.6 pg/㎖ 범위의 LLOD를 갖는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 방법은 바람직하게는 약 ≤20.32 pg/㎖의 mSOD1에 대한 정량 하한(LLOQ) 및 약 7 pg/㎖의 검출 하한(LLOD), 또는 약 58 pg/㎖의 LLOQ 및 약 6 또는 10 pg/㎖의 LLOD를 갖는다.
본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 추가의 단일 분자 감지 플랫폼은 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있으며 플라즈몬 및 전기 나노변환기 뿐만 아니라 저-배경-노이즈 형광 현미경과 같이 발전하고 있다; 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Macchia et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry 412 (2020), 5005-5014]을 참조한다.
접근가능한 유체를 어세이할 수 있는 능력, 및 여러 연구에서 확인된 바이오마커를 갖고자 하는 욕구를 고려할 때, 임의의 주어진 환자의 질환 진행에 대한 전체 그림을 얻고, 본 발명의 면역어세이를 ALS에 대한 다른 바이오마커 후보 분자의 평가와 조합하는 것은 물론 유용한 접근법이 될 것이다. 예를 들어, 상기 문헌 [Vijayakumar et al. (2019)]은 표 2에 나열된 것들로부터 바이오마커 후보 분자를 조합하는 것을 제안하며, 여기에는 모두 뉴런 생존을 반영하는 시스타틴 C, pNFH 및 NFL의 패널, 전-염증 마커로서 MCP1, 각각 근육 발단 및 신경근 접합부를 반영하는 MiRs 206 및 133b, 및 호모시스테인, 글루타메이트, 또는 콜레스테롤과 같은 조절되지 않은 대사의 일부 지표가 있다. 바람직하게는, 본 발명의 면역어세이는 상기 문헌 [Vu and Bowser (2017)]에 개시된 표 1 내지 5에 나열된 ALS에 대한 하나 이상의 바이오마커 유체-기반 바이오마커의 평가와 조합된다. 따라서, 본 발명의 면역어세이는 진단 목적 및 예후 또는 예측 적용을 위한 이종 다중-바이오마커 패널의 개발을 도울 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 ALS를 앓거나 발병할 위험이 있는 것으로 진단된 환자의 증상을 치료하거나 완화하는 데 사용하기 위한 치료제를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 환자는 검출가능한 양의 mSOD1을 갖는 것으로 어세이되었다. 바람직하게는, 환자는 대조군과 비교할 때 증가된 수준의 mSOD1을 나타낸다. 바람직하게는 대조군은 진단된 환자와 연령이 일치하는 건강한 대상체일 수 있다.
환자는 바람직한 구현예에서 적어도 5 pg/㎖ 초과, 바람직하게는 6 또는 7 pg/㎖ 초과, 더 바람직하게는 10 pg/㎖ 초과, 더 바람직하게는 20 pg/㎖ 초과 및 가장 바람직하게는 20.32 pg/㎖ 또는 58 pg/㎖ 초과의 mSOD1 수준을 갖는다.
일 구현예에서, 치료제는 항-SOD1 항체, 바람직하게는 WO 2012/080518 A1에 개시된 항체, 바람직하게는 항체 NI-204.12G7 또는 WO 2016/120810에 개시된 항체이다. 또 다른 구현예에서, 치료제는 SOD1의 수준을 낮추는 제제, 예를 들어 피리메타민(문헌 [Lange et al. Ann. Neurol. 81 (2017), 837-848]), 유전자 침묵(silencing)에 사용되는 제제, 예를 들어 모르폴리노 올리고뉴클레오티드(MOs) 또는 라파마이신과 같은 비특이적 치료제이다. 치료제는 유전자 치료 접근법에 사용되는 제제일 수도 있다. 바람직한 구현예에서, 치료제는 둘 다 ALS의 치료를 위해 미국 식품의약국에 의해 승인된 것인, 릴루텍(릴루졸) 또는 라디카바(에다바로네)이다. 또한, 치료제는 ALS의 특정 증상 중 일부를 목표로 하는 제제, 예를 들어, 진통제 또는 근육 이완제일 수 있다. 따라서, 바람직하게는 치료제는 경련 완화에 도움이 될 수 있는 바클로펜(Gablofen, Kemstro, Lioresal) 또는 디아제팜(Diastat, Valium)이다. 삼키기 어려워 입 안에 침이 고이는 것도 ALS의 증상이며 본 발명에 따른 치료제인 다른 약물로 치료될 수 있다. 바람직하게는, 치료제는 엘라빌(아미트립틸린), 트리헥시페니딜, 스코포덤(스코폴라민 패치), 또는 로비눌(글리코피롤레이트)이다.
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하도록 구성된 키트도 포함한다. 따라서, 키트는 본 발명의 방법을 수행하는 데 필요한 성분, 바람직하게는 본 발명의 방법의 바람직한 구현예의 성분을 포함한다.
일 구현예에서, 키트는 바람직하게는 실시예 1 및 2에 예시된 오손 바이오시스템즈의 시라플렉스™ 초감도 면역어세이와 같은 싱글플렉스 샌드위치 ELISA를 이용하는 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하고, 상기 정의된 바와 같은 제1 항-SOD1 항체로 웰이 미리 스폿팅된 마이크로플레이트를 적어도 포함하고, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 뚜껑을 포함한다. 키트는 상기 정의된 바와 같은 제2 항-SOD1 항체를 포함하는 검출 시약을 추가로 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 키트는 상기 정의된 바와 같은 리간드-결합 파트너 및 검출가능한 표지, 바람직하게는 발색성 또는 화학발광 기질의 전환을 촉매할 수 있는 효소를 포함하는 접합체, 적절한 기질 용액, mSOD1의 보정된 면역어세이 표준 또는 대조군, 완충액, 희석액, 기질 및/또는 용액에 대한 권장사항 뿐만 아니라 본 발명의 어세이를 수행하는 방법에 대한 지침, 및/또는 본 발명의 방법을 방해하지 않고 항체가 그의 활성 형태를 유지할 수 있도록 하는 면역-기반 진단 어세이에 적합한 세척 및 어세이/시료 희석 완충액을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 키트는 바람직하게는 실시예 3에 예시된 바와 같은 시모어™ 어세이를 이용하는 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하고, 상기 정의된 바와 같은 제1 항-SOD1 항체를 포함하는 포획 시약 및 상기 정의된 바와 같은 제2 항-SOD1 항체를 포함하는 검출 시약을 포함한다. 선택적인 구현예에서, 키트는 비드 및 적절한 펨토리터 크기의 마이크로플레이트를 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 키트는 상기 정의된 바와 같은 리간드-결합 파트너 및 검출가능한 표지, 바람직하게는 형광성 기질의 전환을 촉매할 수 있는 효소를 포함하는 접합체, 적절한 기질 용액, mSOD1의 보정된 면역어세이 표준 또는 대조군, 마이크로플레이트, 완충액, 희석액, 기질 및/또는 용액에 대한 권장사항 뿐만 아니라 본 발명의 어세이를 수행하는 방법에 대한 지침, 및/또는 본 발명의 방법을 방해하지 않고 항체가 그의 활성 형태를 유지할 수 있도록 하는 면역-기반 진단 어세이에 적합한 세척 및 어세이/시료 희석 완충액을 포함한다.
이 명세서 전체에 걸쳐 여러 문헌이 인용된다. 인용된 모든 참고문헌(배경 섹션 및 제조업체의 사양, 지침 등을 포함하여 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 인쇄물 참고문헌, 발행된 특허, 공개 특허 출원을 포함함)의 내용은 본 명세서에 참조로서 명시적으로 포함된다; 그러나, 인용된 임의의 문헌이 실제로 본 발명에 관한 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.
보다 완전한 이해는 단지 예시의 목적으로 본 명세서에 제공되고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않은 다음의 특정 실시예를 참조하여 얻을 수 있다.
실시예
실시예 1: mSOD1에 특이적인 면역어세이의 확립 및 검증
CSF에서 mSOD1의 정량적 측정을 위해, 오손 바이오시스템즈에서 제조한 시라플렉스TM 휴먼 울트라센서티브 mSOD1 1-플렉스 면역어세이 키트(싱글플렉스 샌드위치 ELISA)를 사용하였다.
시험의 원리:
96-웰 마이크로플레이트의 각 웰은 인간 SOD1의 아미노산 서열 73-GGPKDEERHVGD-84(서열번호 11) 내 에피토프에서, 특히 아미노산 서열 73-GGPKDEERHVG-83(서열번호 12)을 포함하는 에피토프에서 mSOD1을 특이적으로 인식하고 관심 시료로부터 mSOD1을 포획하는 단일클론성 항체인 포획 항체 NI-204.B로 오손 바이오시스템즈에 의해 사전-스폿팅되었다. 결합되지 않은 단백질을 세척해버린 후, mSOD1의 2차 부위에 결합하는 ab185125 또는 ab79390으로서 Abcam에서 입수가능한 비오틴화 SOD1 토끼 단일클론성 검출 항체 EPR1726을 첨가했다 (이 경우 ab185125를 사용했다). 과잉 검출 항체를 제거한 후, 스트렙트아비딘-서양고추냉이 퍼옥시다제(SA-HRP)를 첨가하였다. HRP는 기질과 반응하여 시라스캔™ 이미지화 시스템에 의해 감지되는 발광 신호를 생성하는 효소이다. 생성된 신호의 강도는 표준 또는 관심 시료의 각 단백질 양에 정비례한다. 강도는 통합 밀도 값(Integrated Density Values, IDV)으로 표시되고 SoftMax Pro로 내보내지며 여기서 해당 표준 곡선에서 보간된 결과를 이용하여 미지의 시료를 역 계산하는 데에 가중 5-매개변수 알고리즘이 사용된다.
특히, 어세이는 다음과 같이 수행되었다:
-70℃에 보관된 20 ㎍/㎖ mSOD1의 스톡 용액(스태빌자임/프로테아제 억제제 칵테일로 희석된 mSOD1 용액)을 해동했다. 또한, 모든 어세이 성분을 냉장고/냉동고에서 꺼내 사용하기 전에 실온에서 30-60분 동안 보관했다. 전체 병(50㎖)을 1200㎖ 탈이온수에 첨가하여 1x 세척 완충액을 제조하였다.
인큐베이션 단계 동안, 마이크로클라임® 뚜껑을 96-웰 마이크로플레이트 위에 놓았다. 사용하기 전에, 탈이온(DI) 수로 채웠다. 이를 위해, 포장재에서 뚜껑을 제거하고 충전 홈통(뚜껑 가장자리 주변의 홈)과 모서리가 위를 향하도록 배치했다. 주사기 또는 다중 채널 피펫을 이용하여, 4㎖의 탈이온수를 뚜껑의 긴 가장자리 상부에 있는 충전 홈통에 서서히 분배했다. 이것을 긴 가장자리의 하부에 있는 충전 홈통으로 반복하여, 뚜껑에 총 8㎖의 탈이온수가 포함되었다. 홈통에서 임의의 과량의 물을 제거하기 위해 킴 와이프를 사용했다. 인큐베이션 단계가 준비되면, 뚜껑을 뒤집어 96-웰 마이크로플레이트 위에 놓았다.
스톡을 해동하고 시료 희석액으로 1:100으로 희석하여 표준을 제조했다. 1:100 표준을 시료 희석액으로 1:3으로 추가로 희석하여 최고 표준(top standard)을 받았다. 최고 표준은 총 11개의 0이 아닌 표준을 갖도록 1:3으로 추가로 희석하였다. 제로 표준은 오직 표준 희석액이었다. 시료 및 대조군을 시료 희석액으로 3배 희석하였다.
mSOD1-마이크로플레이트를 파우치에서 제거하고 이뮤노 워시(Immuno Wash) 12 수동 세척기를 이용하여 ≥300㎕의 1x 세척 완충액으로 6회 세척했다. 그 후, 플레이트를 흡수지 위에서 단단히 두드려 건조시켰다. 50㎕의 표준, 희석된 대조군 및 희석된 시료를 적절한 웰에 이중으로 첨가하고, 플레이트를 마이크로클라임® 뚜껑으로 덮고 실온에서 2시간 동안 600rpm으로 설정된 플레이트 쉐이커에서 인큐베이션했다. 플레이트를 이뮤노 워시 12 수동 세척기를 이용하여 ≥300㎕의 1x 세척 완충액으로 4회 세척했다. 그 후, 플레이트를 흡수지 위에서 단단히 두드려 건조시켰다. 50㎕의 IgG 스파이크된 비오틴화 항체 시약을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 마이크로클라임® 뚜껑으로 덮고 600rpm으로 설정된 플레이트 쉐이커에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 그 후, 플레이트를 이뮤노 워시 12 수동 세척기를 이용하여 ≥300㎕의 1x 세척 완충액으로 4회 세척하고 흡수지 위에서 두드려 건조시켰다. 50㎕의 스트렙트아비딘-HRP 시약을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 마이크로클라임® 뚜껑으로 덮고 600rpm으로 설정된 플레이트 쉐이커에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 그 후, 플레이트를 이뮤노 워시 12 수동 세척기를 이용하여 ≥300㎕의 1x 세척 완충액으로 4회 세척하고 흡수지 위에서 두드려 건조시켰다.
슈퍼시그널® 기질 용액은 사용 전 15분 이내, 바람직하게는 마지막 세척 단계 직전에 준비했다. 50㎕의 혼합된 슈퍼시그널® 기질 용액을 각 웰에 첨가하고 오손 시라스캔 이미지화 시스템즈에서 2-4분 이내에 플레이트를 판독하여 각 플레이트에 대해 짧은 노출 시간과 긴 노출 시간을 기록했다. 시라소프트(Cirasoft)의 통합 밀도 값(IDV)은 SoftMax Pro 프로토콜을 통해 전송 및 처리되었으며 결과는 가중 5-매개변수 로지스틱 곡선 적합을 이용하여 정량화되었다.
이 어세이를 사용하여, mSOD1은 허용가능한 정밀도로 7.01 pg/㎖ 및 6 pg/㎖로 정량화될 수 있다. CSF 시료의 1:2 MRD(최소 요구 희석) 후 20.32 내지 14814.82 pg/㎖의 보고가능한 범위로 이어지는 10.16 pg/㎖ 내지 7404.41 pg/㎖의 mSOD1 범위 내에서 훨씬 더 정밀한 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 어세이는 mSOD1에 대해 약 ≤20.32 pg/㎖의 정량 하한(LLOQ) 및 약 7 pg/㎖의 검출 하한(LLOD)을 갖는다.
실시예 2: fALS 및 sALS 환자의 CSF 시료로부터 mSOD1의 검출
전술한 어세이 매개변수를 사용하여 CSF 시료를 분석했다. 특히, 상이한 SOD1 돌연변이를 가진 10명의 fALS 환자, 6명의 sALS 환자 및 10명의 비신경계 대조군(NNC) 참가자의 CSF 시료를 mSOD1에 대해 스크리닝했다; 도 1a, b 및 c를 참조한다. 이들 대조군 참가자는 신경계 장애가 없지만 다른 질환이 있을 수 있다. 도 1d 및 e에 나타낸 바와 같이, mSOD1은 대부분의 fALS 및 sALS 환자의 CSF에서 검출되었고, 즉 fALS 및 sALS 환자의 CSF에서 검출된 mSOD1의 양은 대조군 환자의 CSF에서의 mSDO1 양보다 높았다.
실시예 3: mSOD1에 특이적인 단일 분자 어레이(시모어™) 어세이의 확립 및 검증
본 실험에서는, 시모어TM 어세이 및 포획 항체로서 항체 NI-204.B를 사용하여 대상체의 체액에서 mSOD1을 결정하는 것을 수행하였다. 3단계 접근법(30분 포획, 5분 검출, 5분 효소 접합) 및 위에서 설명한 대로 퀀터릭스 홈브루 키트를 적용하여 시모어TM 어세이를 수행하였다. 시료 부피는 100㎕였다. 포획 및 검출 항체뿐만 아니라 미스폴드 SOD의 항원 스톡(667 g/㎖)을 시약 준비 전에 4℃에서 보관했다. 검출 항체는 상업적으로 이용가능하다(Abcam ab185125). CSF 시료는 분석할 때까지 -80℃에서 유지되었다.
먼저, 상자성 비드(2.7㎛ 직경)의 표면을 제1 항-mSOD1 항체(포획 항체)로 코팅하였다. 비드는 일반적으로 대략 250,000개의 부착 부위를 함유한다. 특히, 포획 항체는 표준 퀀터릭스 홈브루 어세이 프로토콜에 따라 처리되었다. 포획 항체는 0.7 ㎎/㎖ 항체 농도 및 0.5 ㎎/㎖의 EDC에서 표준 2단계 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDAC) 커플링 화학을 사용하여 자성 비드에 접합되었다.
제2 항-mSOD1 항체(검출 항체)는 표준 퀀터릭스 홈브루 비오틴화 프로토콜을 이용하여 60x의 몰 과량으로 비오틴화하였다.
포획 비드를 홈브루 키트의 표준 비트 희석액으로 희석하고 4x106 비드/㎖를 시료 용액에 첨가하여 표적 분자보다 더 많은 비드가 있도록 하였다. 인큐베이션은 30분 동안 수행하였다. 이로써 시료에 존재하는 미스폴드 SOD1은 포획 비드에 의해 포획된다. 제네릭 홈브루 시료 희석액으로 CSF 시료를 2배 희석하였다. 이후 비드를 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 제거한 후, 0.1 ㎍/㎖의 비오틴화 검출 항체를 포획 비드와 혼합했다. 검출기 항체의 희석을 위해, 제네릭 홈브루 검출기 희석액을 사용했다. 이 혼합물을 5분 동안 인큐베이션하여 비드 상의 포획된 mSOD1에 검출 항체가 결합되도록 하였다.
두 번째 세척 단계 후, 300pM의 스트렙트아비딘-β-갈락토시다제(SβG) 접합체(홈브루 키트의 SβG 희석액으로 희석됨)를 포획 비드와 혼합하고 5분 동안 인큐베이션했다. SβG는 비오틴화 검출 항체에 결합하여, 포획된 미스폴드 SOD1의 효소 표지부착을 초래한다. 이러한 방식으로, 단일 단백질 분자를 포획한 각각의 비드는 효소로 표지부착된다. 분자를 포획하지 않은 비드는 표지가 없는 상태로 유지된다.
세 번째 세척 후, 포획 비드를 레소루핀 ß-D-갈락토피라노사이드(RGP) 기질 용액에 재현탁하고 시모어 디스크로 옮겼다. 이것은 216,000 펨토리터 크기 웰의 어레이로, 웰 당 1개 이하의 비드를 보유하도록 크기가 조정되었다(너비 4.25㎛, 깊이 3.25㎛). 이후에 웰은 오일로 밀봉되고 이미지화된다.
미스폴드 SOD1이 포획되고 표지부착되면, ß-갈락토시다제는 RGP 기질을 측정을 위한 신호를 제공하는 형광 생성물로 가수분해한다. 단일 표지부착된 미스폴드 SOD1 분자는 시모어 광학 시스템(시모어 HD-1 분석기(기기 ID: 2710000020 및 2710000004 STD RUO; 소프트웨어 버전 1.5)에 의해 검출 및 계수되는 충분한 형광 신호를 30초 이내에 생성한다.
시험 시료의 단백질 농도는 비드를 함유하는 웰의 총 수 대비 비드 및 형광 생성물을 둘 다 함유하는 웰의 수를 계수함으로써 결정된다. 시모어™ 어세이를 사용하면 전체 아날로그 신호를 사용하지 않고 디지털 방식으로 농도를 결정할 수 있으므로, 단일 면역복합체를 검출하는 이러한 접근법을 디지털 ELISA라고 한다. 미스폴드 SOD1 농도가 낮을 때, 어레이에서 양성 신호를 갖는 비드 함유 웰의 백분율은 시료에 존재하는 미스폴드 SOD1의 양에 비례한다. 더 높은 표적 농도에서, 대부분의 비드 함유 웰이 하나 이상의 표지부착된 표적 분자를 가질 때, 총 형광 신호는 시료에 존재하는 미스폴드 SOD1의 양에 비례한다. 미지의 시료에서 미스폴드 SOD1의 농도는 표준 곡선에서 보간된다.
중간 mSOD1 스톡으로 만든(667 ㎍/㎖ 스톡에서 6.7 ㎍/㎖로 100x 희석), 1 ㎍/㎖부터의 연속 희석에 의한 보정 곡선을 생성하여 mSOD1으로 보정을 수행했다. 희석은 제네릭 홈브루 캘리브레이터 희석액 A로 수행했으며 4 매개변수 로지스틱 곡선 적합 데이터 감소 방법(4PLC, 1/y2 가중)을 사용하였다. 이 어세이는 2x 어세이 배경 방법을 기반으로 6 pg/㎖ 내지 32 pg/㎖의 LLOD 범위(평균 LLOD: 15.7 pg/㎖) 및 58 pg/㎖ 내지 132 pg/㎖의 LLOQ 범위를 갖는다.
추가 실험에서, 시모어™ 어세이를 이용한 대상체의 체액에서의 mSOD1의 결정은 인간 SOD1의 아미노산 서열 73-GGPKDEERHVGD-84(서열번호 11) 내 에피토프에서 mSOD1을 특이적으로 인식하는 포획 항체로서의 또 다른 단일클론성 항체, 즉 아미노산 서열 76-KDEERHVGD-84(서열번호 13)를 포함하는 에피토프를 인식하는 항체 NI-204.O를 이용하여 수행하였다. 시모어™ 어세이는 원칙적으로 전술한 대로 수행되었지만 시약 농도는 상이했다. 특히, 상자성 비드에 대한 포획 항체의 접합은 0.5 ㎎/㎖의 항체 농도에서 수행되었다; 1,500,000 포획 비드/㎖를 시료 용액에 첨가했다; 검출 항체는 60x의 몰 과량에서 비오틴화되었다; 어세이를 위해 0.75 ㎍/㎖의 비오틴화 검출 항체를 사용했다; 75pM SβG가 표지부착에 사용되었다; 그리고 CSF 시료는 제네릭 홈브루 시료 희석액으로 4x 희석되었다. 이 어세이는 10.8 내지 13.6 pg/㎖의 LLOD 범위를 갖는다.
<110> AL-S Pharma AG Neurimmune AG <120> Misfolded SOD1 Assay <130> 2022-FPA-1658 <150> EP 20163909.3 <151> 2020-03-18 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Arg Glu Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Ser Thr Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Gln Asn Phe 50 55 60 Pro Asp Arg Val Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Phe 65 70 75 80 Met Glu Leu His Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Ser Glu His Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Pro Tyr Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Arg Glu Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Ser Thr Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Gln Asn Phe 50 55 60 Pro Asp Arg Val Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Phe 65 70 75 80 Met Glu Leu His Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Ser Glu His Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Pro Tyr Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Tyr Tyr Ile His 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Val Ile Asn Pro Ser Thr Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Gln Asn Phe Pro 1 5 10 15 Asp <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Ile Ser Glu His Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Pro Tyr Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Gly 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro Val Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Arg Asp Val Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Met Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Trp 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Gly 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro Val Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Arg Asp Val Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Met Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Trp 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Gly Glu Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Arg Asp Val Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Trp Val 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide comprising epitope of NI-204.B and NI-204.O <400> 11 Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His Val Gly Asp 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide comprising the epitope of NI-204.B <400> 12 Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His Val Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide comprising the epitope of NI-204.O <400> 13 Lys Asp Glu Glu Arg His Val Gly Asp 1 5 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide comprising the epitope of NI-204.G <400> 14 His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Arg Gln Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Tyr Asp Asp Lys Arg Gly Gly Phe Asp Thr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ser Phe Gly Met His 1 5 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Arg Gln Ser Tyr Ala Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Thr Gly Tyr Asp Asp Lys Arg Gly Gly Phe Asp Thr 1 5 10 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Ala Lys Gln Tyr Ser 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Met Val Met Tyr 35 40 45 Lys Asp Arg Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Ala Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Gly Thr Asp Ser Pro Tyr 85 90 95 Ile Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ser Gly Asp Ala Leu Ala Lys Gln Tyr Ser Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Lys Asp Arg Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gln Ser Thr Gly Thr Asp Ser Pro Tyr Ile 1 5 10

Claims (25)

  1. 체액을 포획 항체로서 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열 73-GGPKDEERHVGD-84 내의 SOD1의 에피토프에 결합하는 제1 항-SOD1 항체 및 검출 항체로서 인간 SOD1aa 50-150의 에피토프에 결합하는 제2 항-SOD1 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체의 체액을 포함하는 시료에서 미스폴드 SOD1을 어세이하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 체액은 뇌척수액(CSF)인 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 미스폴드 SOD1의 존재는 대상체에서 근위축성 측삭 경화증(ALS)에 대한 지표인 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 따른 방법의 단계를 포함하는 대상체에서 ALS를 진단하는 방법으로서,
    대조군에 비해 시료에서 미스폴드 SOD1의 증가된 수준 또는 존재는 상기 대상체에서 ALS에 대한 지표인 방법.
  5. 청구항 3 또는 청구항 4에 있어서,
    ALS는 가족성 ALS(fALS)인 방법.
  6. 청구항 3 또는 청구항 4에 있어서,
    ALS는 산발성 ALS(sALS)인 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 항체는 단일클론성 항체인 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 항체는 단일클론성 항체인 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 항체는 가변 영역, 즉 결합 도메인에 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)의 6개의 CDR, 여기서:
    (a) VH-CDR1은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (b) VH-CDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (c) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (d) VL-CDR1은 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (e) VL-CDR2는 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (f) VL-CDR3은 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고; 및/또는
    (ii) VH 쇄 및 VL 쇄, 여기서
    (a) VH 쇄는 서열번호 1 또는 2에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
    (b) VL 쇄는 서열번호 6 또는 7에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 항체는 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열 121-HEKADDLGKGGNEES-135 내의 SOD1의 에피토프에 결합하고 그의 가변 영역, 즉 결합 도메인에 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) VH 쇄 및 VL 쇄의 6개의 CDR, 여기서
    (a) VH-CDR1은 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (b) VH-CDR2는 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (c) VH-CDR3은 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (d) VL-CDR1은 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (e) VL-CDR2는 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (f) VL-CDR3은 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고; 및/또는
    (ii) VH 쇄 및 VL 쇄, 여기서
    (a) VH 쇄는 서열번호 15에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
    (b) VL 쇄는 서열번호 19에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 항-SOD1 항체는 검출가능한 표지에 접합되는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 검출가능한 표지는 효소, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 생물발광 화합물, 태그, 플래그, 리간드 및 중금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    상기 제2 항-SOD1 항체는 리간드에 접합되고 상기 방법은 리간드-결합 태그를 이용한 표지부착 단계를 포함하고, 상기 방법은:
    (i) 웰에 제1 항-SOD1 항체가 스폿팅된 마이크로플레이트를 제공하는 단계; 및
    (ii) 체액을 포함하는 시료를 웰에 첨가한 후 인큐베이션하여, 체액에 존재하는 미스폴드 SOD1이 제1 항-SOD1 항체에 의해 포획되도록 하는 단계로서, 바람직하게는 여기서 인큐베이션은 600rpm으로 설정된 플레이트 쉐이커에서 실온에서 2시간 동안 수행되는 단계; 및
    (iii) 리간드에 접합된 제2 항-SOD1 항체를 첨가하고 인큐베이션하여, 제2 항-SOD1 항체가 상기 포획된 미스폴드 SOD1에 결합되도록 하는 단계로서, 바람직하게는 여기서 인큐베이션은 600rpm으로 설정된 플레이트 쉐이커에서 실온에서 30분 동안 수행되는 단계; 및
    (iv) 리간드-결합 태그 및 검출가능한 표지를 포함하는 접합체를 첨가하고 인큐베이션하는 단계로서, 바람직하게는 여기서 인큐베이션은 600rpm으로 설정된 플레이트 쉐이커에서 실온에서 30분 동안 수행되는 단계; 및
    (v) 발색성 또는 화학발광 기질 용액을 첨가하는 단계; 및
    (vi) 신호를 이미지화하는 단계; 선택적으로
    (vii) 미스폴드 SOD1의 어세이된 수준을 참조 표준 및/또는 대조군과 비교하는 단계로서, 바람직하게는 여기서 상기 참조 표준 및/또는 대조군은 시료와 동일한 마이크로플레이트에 첨가되는 단계;를 포함하고,
    선택적으로 상기 방법은 싱글플렉스(singleplex) 면역어세이인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    (i) 상기 마이크로플레이트는 96-웰 플레이트이고
    (ii) 상기 체액은 뇌척수액(CSF)이고;
    (iii) 상기 리간드는 비오틴 또는 비오틴 유사체 또는 이의 유도체이고;
    (iv) 상기 리간드-결합 태그는 스트렙트아비딘 또는 기능적 유사체 또는 이의 유도체이고 상기 검출가능한 표지는 발색성 또는 화학발광 기질의 전환을 촉매할 수 있는 효소이고, 바람직하게는 상기 효소는 서양고추냉이 퍼옥시다제이고;
    (v) 상기 기질은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 또는 루미놀 기질이고;
    (vi) 이미지화는 시라스캔(Cirascan)™ 이미징 시스템에 의해 수행되고;
    (vii) 세척 단계는 적어도 단계 (ii), (iii) 및/또는 (iv) 후에 수행되고; 및/또는
    (viii) 상기 마이크로플레이트는 뚜껑, 바람직하게는 인큐베이션 단계 동안 유체로 채워진 유체-흡수 매트릭스를 갖는 뚜껑으로 덮여 있는 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 ≤20.32 pg/㎖의 미스폴드 SOD1에 대한 정량의 하한(LLOQ)을 갖는 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    바람직하게는,
    (i) 포획 비드의 표면에 제1 항-SOD1 항체를 부착하는 단계; 및
    (ii)(a) 체액을 포함하는 시료를 첨가하고 시료와 함께 비드를 인큐베이션하여, 제1 항-SOD1 항체에 의해 매개되는 비드에 의해 체액에 존재하는 미스폴드 SOD1이 포획되도록 하는 단계; 및
    (ii)(b) 리간드에 접합된 제2 항-SOD1 항체를 첨가하고 인큐베이션하여, 비드 상의 상기 포획된 미스폴드 SOD1에 제2 항-SOD1 항체가 결합되도록 하는 단계; 및
    (ii)(c) 리간드-결합 태그 및 검출가능한 표지를 포함하는 접합체를 첨가하고 인큐베이션하는 단계; 또는
    (II)(A) 체액을 포함하는 시료를 첨가하고, 리간드에 접합된 제2 항-SOD1 항체를 첨가하고, 및 시료 및 제2 항체와 함께 비드를 인큐베이션하여, 제1 항-SOD1 항체에 의해 매개되는 비드에 의해 체액에 존재하는 미스폴드 SOD1이 포획되고 비드 상의 상기 포획된 미스폴드 SOD1에 제2 항-SOD1 항체가 결합되도록 하는 단계; 및
    (II)(B) 상기 리간드-결합 태그 및 검출가능한 표지를 포함하는 접합체를 첨가하고, 인큐베이션하는 단계; 및
    (iii) 발색성/형광성 기질 용액에서 비드를 재현탁시키는 단계; 및
    (iv) 단계 (iii)의 비드를 웰 당 1개 이하의 비드를 보유하도록 구성된 펨토리터-크기 웰의 어레이에 로딩하는 단계; 및
    (v) 펨토리터-크기 웰 내에 개별 비드를 밀봉하는 단계; 및
    (vi) 신호를 이미지화하는 단계; 선택적으로
    (vii) 미스폴드 SOD1의 어세이된 수준을 참조 표준 및/또는 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는, 단일 분자 어레이(시모어™)를 사용하는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    (i) 상기 비드는 상자성 비드이고 및/또는 약 2.7μM의 직경을 가지고;
    (ii)(a) 상기 체액은 CSF이고 및/또는 상기 인큐베이션 시간은 30분이고;
    (ii)(b) 상기 리간드는 비오틴 또는 비오틴 유사체 또는 이의 유도체이고 및/또는 상기 인큐베이션 시간은 5분이고;
    (ii)(c) 상기 리간드-결합 태그는 스트렙트아비딘 또는 기능적 유사체 또는 이의 유도체이고, 상기 검출가능한 표지는 발색성/형광성 기질을 전환할 수 있는 효소이고, 바람직하게는 상기 효소는 β-갈락토시다제이고, 및/또는 상기 인큐베이션 시간은 5분이고;
    (II)(A) 상기 체액은 CSF이고, 상기 리간드는 비오틴 또는 비오틴 유사체 또는 이의 유도체이고, 및/또는 인큐베이션 시간은 35분 내이고;
    (II)(B) 상기 리간드-결합 태그는 스트렙트아비딘 또는 기능적 유사체 또는 이의 유도체이고, 상기 검출가능한 표지는 발색성/형광성 기질을 전환할 수 있는 효소이고, 바람직하게는 상기 효소는 β-갈락토시다제이고, 및/또는 상기 인큐베이션 시간은 5분이고;
    (iii) 상기 형광성 기질은 레소루핀 β-D-갈락토피라노사이드(RGP)이고;
    (v) 상기 밀봉은 오일로 수행되고;
    (vi) 상기 이미지화는 시모어TM 광학 시스템에 의해 수행되는 방법.
  18. 포획 항체로서 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열 73-GGPKDEERHVGD-84 내의 SOD1의 에피토프에 결합하는 항-SOD1 항체 및/또는 검출 항체로서 인간 SOD1aa 50-150의 에피토프에 결합하는 항-SOD1 항체를 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 방법에서 미스폴드 SOD1을 어세이하기 위해 사용하는 용도.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 포획 항체는 청구항 9에 정의된 바와 같이 특성화되고 및/또는 상기 검출 항체는 청구항 10에 정의된 바와 같이 특성화되는 용도.
  20. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 ALS를 앓거나 발병할 위험이 있는 것으로 진단된 환자의 증상을 치료 또는 완화하는 데 사용하기 위한 치료제로서,
    바람직하게는 상기 환자는 sALS를 앓거나 발병할 위험이 있는 것으로 진단되었으며, 바람직하게는 상기 환자는 검출가능한 양의 미스폴드 SOD1 및/또는 대조군에 비해 증가된 수준의 미스폴드 SOD1을 갖는 것으로 어세이된 치료제.
  21. 적어도 다음을 포함하는, 대상체의 체액을 포함하는 시료에서 미스폴드 SOD1을 어세이하기 위한 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하도록 구성된 키트:
    (i) 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열 73-GGPKDEERHVGD-84 내의 SOD1의 에피토프에 결합하는 제1 단일클론성 항-SOD1 항체; 및
    (ii) 검출 항체로서 인간 SOD1aa 50-150의 에피토프에 결합하는 제2 단일클론성 항-SOD1 항체를 포함하는 검출 시약으로서, 여기서 상기 제2 항-SOD 항체는 검출가능한 표지에 접합되고, 바람직하게는 상기 검출가능한 표지는 효소, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 생물발광 화합물, 태그, 플래그, 리간드 및 중금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출 시약; 및 선택적으로
    (iii) 검출가능한-표지-결합 태그 및 검출가능한 표지를 포함하는 접합체로서, 바람직하게는 상기 검출가능한-표지-결합 태그는 리간드-결합 태그이고 상기 검출가능한 표지는 발색성, 화학발광, 또는 형광성 기질의 전환을 촉매할 수 있는 효소인 접합체;
    (iv) 발색성, 화학발광, 또는 형광성 기질 용액;
    (v) 미스폴드 SOD1의 보정된 면역어세이 표준 또는 대조군;
    (vi) 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 어세이를 수행하는 방법 뿐만 아니라 마이크로플레이트, 완충액, 희석액, 기질 및/또는 용액에 대한 권장사항; 및/또는
    (vii) 세척 및 어세이/시료 희석 완충액.
  22. 청구항 21에 있어서,
    (i) 상기 제1 항체는 마이크로플레이트, 바람직하게는 뚜껑을 포함하는 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 미리 스폿팅되고, 바람직하게는 상기 제1 항체는 청구항 9에 정의된 바와 같이 특성화되고;
    (ii) 상기 검출가능한 표지는 리간드, 바람직하게는 비오틴 또는 비오틴 유사체 또는 이의 유도체이고;
    (iii) 상기 리간드-결합 태그는 스트렙트아비딘 또는 기능적 유사체 또는 이의 유도체이고, 상기 검출가능한 표지는 발색성 또는 화학발광 기질의 전환을 촉매할 수 있는 효소이고, 바람직하게는 상기 검출가능한 표지는 서양고추냉이 퍼옥시다제이고;
    (v) 상기 기질 용액은 발색성 또는 화학발광 기질 용액이고, 바람직하게는 상기 기질은 TMB 또는 루미놀 기질이고; 및/또는
    (vi) 상기 표준은 200 ng/㎖ 내지 3 pg/㎖로 미스폴드 SOD1의 연속 희석액을 포함하는 키트.
  23. 청구항 21 또는 청구항 22에 있어서,
    (i) 마이크로플레이트, 바람직하게는 뚜껑을 포함하는 96-웰 마이크로플레이트로서, 상기 웰은 청구항 9에 정의된 바와 같이 특성화된 포획 항체로서 제1 단일클론성 항-SOD1 항체로 미리 스폿팅된 것인 마이크로플레이트;
    (ii) 검출 항체로서 제2 비오틴화 항-SOD1 항체;
    (iii) 스트렙트아비딘-HRP 시약;
    (v) TMB 또는 루미놀을 포함하는 기질 용액;
    (vi) 미스폴드 SOD1의 보정된 면역어세이 표준 또는 대조군; 및
    (vii) 세척 및 어세이/시료 희석 완충액.
  24. 청구항 21에 있어서,
    (i) 상기 제1 단일클론성 항-SOD1 항체는 포획 시약에 포함되고, 바람직하게는 상기 제1 항체는 청구항 9에 정의된 바와 같이 특성화되고;
    (ii) 상기 검출가능한 표지는 리간드, 바람직하게는 비오틴 또는 비오틴 유사체 또는 이의 유도체이고;
    (iii) 상기 리간드-결합 태그는 스트렙트아비딘 또는 기능적 유사체 또는 이의 유도체이고, 상기 검출가능한 표지는 발색성/형광성 기질을 전환할 수 있는 효소이고, 바람직하게는 상기 검출가능한 표지는 β-갈락토시다제이고;
    (iv) 상기 기질 용액은 발색성 또는 형광성 기질 용액이고, 바람직하게는 상기 기질은 레소루핀 β-D-갈락토피라노사이드(RGP)이고; 및/또는
    (v) 상기 표준은 미스폴드 SOD1의 연속 희석액을 약 1000 ng/㎖에서 8점 검량선으로 4배 연속 희석에 의해 0.244 ng/㎖까지, 10 ng/㎖에서 8점 검량선으로 2배 연속 희석에 의해 0.020 ng/㎖까지, 50 ng/㎖에서 12점 검량선으로 2배 연속 희석에 의해 0.012 ng/㎖까지 및/또는 약 66.66667 ng/㎖에서 12점 검량선으로 3배 연속 희석에 의해 0.00339 ng/㎖까지 포함하고, 및 선택적으로
    상기 키트는 포획 비드, 바람직하게는 약 2.7μM의 직경을 갖는 상자성 비드를 추가로 포함하는 키트.
  25. 청구항 21 또는 청구항 24에 있어서,
    (i) 청구항 9에 정의된 바와 같이 특성화된 포획 항체로서 제1 단일클론성 항-SOD1 항체를 포함하는 포획 시약;
    (ii) 검출 항체로서 제2 비오틴화 항-SOD1 항체;
    (iii) 스트렙트아비딘-β-갈락토시다제(SβG) 시약;
    (iv) RGP를 포함하는 기질 용액;
    (v) 미스폴드 SOD1의 보정된 면역어세이 표준 또는 대조군;
    (vi) 세척 및 어세이/시료 희석 완충액; 및
    (vii) 약 2.7μM의 직경을 갖는 상자성 포획 비드;를 포함하는 키트.
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