KR20220147628A - 세포간 및 세포내 근접-기반 표지 조성물 및 시스템 - Google Patents

세포간 및 세포내 근접-기반 표지 조성물 및 시스템 Download PDF

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KR20220147628A
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protein
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애런 트로브릿지
시아란 시이트
데이빗 더블류.씨. 맥밀런
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더 트러스티스 오브 프린세톤 유니버시티
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Abstract

일측면에서, 전이 금속 착물은, 세포내 및 세포간 환경에서 단백질을 포함하는 다양한 생체분자 종의 근접-기반 표지에 유리한 수명 및 확산 반경을 갖는 반응성 표지 중간체를 생성하기 위한 조성 및 전자 구조를 갖는 것으로 본원에 기재되어 있다.

Description

세포간 및 세포내 근접-기반 표지 조성물 및 시스템
관련 출원 데이터
본 출원은 2020년 2월 27일자로 출원된 미국 가특허원 62/982,366 및 2020년 9월 10일자로 출원된 미국 가특허원 63/076,658에 대한 특허 협력 조약 제8조에 따라 우선권을 주장하며 이들 전체는 참조로 본원에 포함된다.
정부 권리 진술
본 발명은 국립 보건원 및 국립 일반 의학 연구소에서 수여한 보조금 제5R01GM103558-08호에 따라 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
기술분야
본 발명은 근접-기반 표지(proximity-based labeling)를 위한 조성물, 시스템 및 방법에 관한 것이며, 특히, 세포간 및 세포내 근접-기반 표지를 위한 전이 금속 촉매에 관한 것이다.
단백질 근접 표지(proximity labeling)는 단백질 상호작용 네트워크를 프로파일링(profiling)하기 위한 강력한 접근 방식으로 등장하였다. 근접 표지를 통해 관련 또는 방관자 단백질을 라벨링하는 능력은, 관심 있는 단백질의 세포 환경 및 생물학적 역할을 추가로 이해하는 데에 중요한 의미를 가질 수 있다. 현재의 근접 표지방법은, 모두, 확산 또는 물리적 접촉을 통해 소수의 선택된 아미노산 잔기에 인접 단백질을 표지하는 효소-생성 반응성 중간체의 사용을 포함한다. 이러한 기술의 변형적인 영향에도 불구하고, 퍼옥시다제 활성화를 통한 페녹시 라디칼 (t1/2 > 100㎲) 또는 비오틴 리가아제를 통한 비오틴-AMP (t1/2 > 60s)와 같은 반응성 중간체의 고유한 안정성은 이의 원점으로부터의 확산을 촉진할 수 있다. 결과적으로, 이러한 효소-생성 반응성 중간체는 긴밀한 미세 환경 내에서 프로파일링하는 데에 문제가 된다. 또한, 큰 효소 크기, 표지를 위한 특정 아미노산에 대한 의존성, 이러한 표지 시스템을 일시적으로 제어할 수 없는 능력은, 제한된 공간 영역 내에서 프로파일링에 대한 추가 문제를 제시한다. 이러한 한계를 감안할 때 근접-기반 표지 에 대한 새로운 접근 방식이 요구된다.
일측면에서, 단백질을 포함하는 다양한 생체분자 종의 근접-기반 표지에 유리한 수명 및 확산 반경을 갖는 반응성 표지 중간체를 생성하기 위한 조성 및 전자 구조를 갖는 전이 금속 착물이 본원에 기재되어 있다. 몇몇 양태에서, 전이 금속 촉매는 화학식 I의 것이다:
Figure pct00001
여기서, M은 전이 금속이고;
A, D, E, G, Y 및 Z는 독립적으로 C 및 N로부터 선택되고;
R3 내지 R7은 각각 1 내지 4개의 임의의 환 치환체를 나타내고, 상기 각각의 1 내지 4개의 임의의 환 치환체는 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로알킬, 할로알케닐, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아민, 아미드, 에테르, -C(O)O-, -C(O)OR8, 및 -R9OH로 이루어진 군으로부터 선택되며, R8은 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R9는 알킬이고;
R1은 직접 결합, 알킬렌, 알케닐렌, 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐렌, 아릴렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 헤테로사이클렌, 및 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L은 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포네이트, 카바메이트, 및 우레아로 이루어진 군으로부터 선택된 연결 모이어티(linking moiety)이고;
R2는 알킨, 아민, 보호된 아민, 아지드, 하이드라지드, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 하이드록시, 카복실, 할로, 알콕시, 말레이미드, -C(O)H, -C(O)OR8, -OS(O2)R9, 티올, 비오틴, 옥시아민, 및 할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8 내지 R9는 알킬, 할로알킬, 아릴, 할로아릴, N-석신이미딜, 및 N-석신이미딜 에스테르로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
X-은 반대 이온이고, n은 0 내지 20의 정수이다.
본원에 추가로 설명된 바와 같이, 전이 금속 착물의 극성은 R3 내지 R7의 선택을 통해 특정 세포 환경에 맞춰질 수 있다. 몇몇 양태에서, 예를 들면, R3 내지 R7 중 하나 이상은 하전된/되거나 극성인 화학 모이어티를 통해 친수성 특성을 나타내도록 선택된다. 이러한 양태에서, 전이 금속 착물은 세포간 또는 세포외 수성 환경에 배치하기에 적합한 친수성 특성을 나타낼 수 있다. 대안적으로, R3 내지 R7 중 하나 이상은 소수성, 친유성, 또는 비극성 특성을 나타내도록 선택된다. 몇몇 양태에서, 예를 들면, R3 내지 R7 중 하나 이상은 알킬, 플루오로, 또는 플루오로알킬일 수 있다. 소수성, 친유성, 또는 비극성 성을 나타내는 본원에 기재된 전이 금속 착물은 세포내 환경으로 배치되거나 상기 환경을 통과하는 데에 적합할 수 있다. 전이 금속 착물은 본원에 기재된 원리에 따라 국소 세포내 환경을 매핑하기 위해 세포막을 통과할 수 있다. 따라서, 이러한 전이 금속 착물은 세포 투과성이다.
게다가, 몇몇 양태에서, 전이 금속 착물은 60kcal/mol 이상의 삼중항 에너지 상태를 갖는다. 몇몇 양태에서, 금속 중심은 백금족의 전이 금속으로부터 선택될 수 있다. 금속 중심은, 예를 들면, 이리듐일 수 있다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 n은 1 내지 20이다.
다른 측면에서, 세포막 상에서의 단백질-단백질 상호작용 및 세포 내에서의 단백질, 핵산 및/또는 기타 생체분자 상호작용을 포함하는 다양한 특징을 선택적으로 식별하도록 작동될 수 있는 미세환경 맵핑 플랫폼(microenvironment mapping platform)을 제공하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 기재되어 있다. 몇몇 양태에서, 조성물은 화학식 I의 전이 금속 촉매, 및 단백질 표지제를 포함하며, 여기서 전이 금속 촉매는 단백질 표지제를 반응성 중간체로 활성화시킨다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 전이 금속 촉매는, 단백질 표지제로 에너지 전달을 허용하여 반응성 중간체를 형성하기 위한 전자 구조를 가질 수 있다. 반응성 중간체는 반응성 중간체의 확산 반경 내에서 단백질 또는 기타 생체분자와 반응하거나 가교결합한다. 단백질이나 다른 생체분자가 확산 반경 내에 있지 않으면 반응성 중간체는 주변 환경에 의해 소멸된다(quenching). 본원에 추가로 설명된 바와 같이, 반응성 중간체의 확산 반경은 특정 미세환경 매핑 고려사항에 맞춰질 수 있으며, 나노미터 규모로 제한될 수 있다. 몇몇 양태에서, 예를 들면, 확산 반경은 10nm 미만 또는 5nm 미만일 수 있다. 게다가, 몇몇 양태에서, 반응성 중간체는 5㎱ 미만의 반감기를 가질 수 있다. 몇몇 양태에서, 단백질 표지제는 분석을 돕기 위한 비오틴과 같은 마커 또는 발광성 마커로 기능화될 수 있다. 촉매로부터 단백질 표지제로의 에너지 전달은, 덱스터(Dexter) 에너지 전달을 포함하여 본원에 추가로 기재된 다양한 메커니즘을 통해 발생할 수 있다.
다른 측면에서, 근접-기반 표지 시스템에서 사용하기 위한 접합체가 본원에 기재되어 있다. 접합체는 생체분자 결합제에 커플링(coupling)된 전이 금속 착물을 포함하며, 생체분자 결합제에 커플링되기 전에, 화학식 I의 전이 금속 착물은 전술된 화학식 I의 것이다. 본원에 추가로 상세히 설명된 바와 같이, 생체분자 결합제는 근접 표지 및 관련 분석을 위해 원하는 세포내 또는 세포간/세포외 환경에서 전이 금속 착물의 위치를 지정하는 데 사용될 수 있다. 생체분자 결합제는, 근접-기반 표지 및 세포막을 포함하는 세포간/세포외 환경의 관련 마이크로매핑을 위해 원하는 위치로 상기 접합체를 안내하는 선택적 결합을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 생체분자 결합제는, 다양한 세포소기관 환경 뿐만 아니라 핵에 국부적인 환경을 포함하는 세포내 환경의 근접-기반 표지 및 관련 마이크로매핑을 위해 원하는 위치로 상기 접합체를 안내하는 선택적 결합을 나타낼 수 있다. 생체분자 결합제는, 예를 들면, 펩티드, 단백질, 당, 소분자, 핵산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본원에 추가로 설명된 바와 같이, 전이 금속 착물은 클릭 화학(click chemistry)을 포함하는 생체분자 결합제를 커플링하기 위한 반응성 작용기를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 전이 금속 착물은 구리 부재하에 생체분자 결합제에 커플링될 수 있다. 본원에 기재된 접합체는 위에서 상세히 설명된 세포 근접-기반 표지를 위한 시스템용 단백질 표지제와 함께 사용될 수 있다.
추가의 측면에서, 근접-기반 표지 방법이 본원에 설명되어 있다. 근접-기반 표지 방법은 화학식 (I)의 전이 금속 촉매를 제공하는 단계, 및 단백질 표지제를 촉매와 반응성 중간체로 활성화하는 단계를 포함한다. 반응성 중간체는 단백질에 커플링하거나 결합한다. 몇몇 양태에서, 전이 금속 촉매는, 단백질 표지제와 함께 단백질 맵핑을 위한 특정 환경에 촉매를 선택적으로 위치시키거나 표적화하기 위해, 생체분자 결합제에 커플링된다. 전이 금속 촉매, 접합체 및 단백질 표지제는 상기 및 하기 상세한 설명에 기재된 조성물 및/또는 특성을 가질 수 있다.
이들 및 다른 양태는 다음의 상세한 설명에서 추가로 설명된다.
도 1은 몇몇 양태에 따라 본원에 기재된 전이 금속 촉매를 예시한다.
도 2는 몇몇 양태에 따라 본원에 기재된 전이 금속 촉매 및 접합체를 예시한다.
도 3은 몇몇 양태에 따른 전이 금속 촉매 및 JQ1 생체분자 결합제를 포함하는 세포 투과성 접합체를 예시한다.
도 4는 몇몇 양태에 따른 도 3의 세포 투과성 접합체를 제조하기 위한 합성 반응식을 예시한다.
도 5a는 몇몇 양태에 따른 본원에 기재된 접합체를 사용한 세포간 표지의 웨스턴 블롯(Western Blot)이다.
도 5b는 도 5a의 웨스턴 블롯의 농도측정 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 HeLa 세포에서 BRD4의 시간 의존적 표지 결과를 제공한다.
도 7은 비-세포 투과성 접합체를 예시한다.
도 8은 도 3의 세포 투과성 접합체와 도 7의 비-세포 투과성 접합체 사이의 BRD4 표지 결과를 예시한다.
도 9는 몇몇 양태에 따른 (-)-JQ1 접합체의 구조 및 (+)-JQ1 접합체에 대한 BRD4 표지를 예시한다.
도 10a 내지 도 10c는 몇몇 양태에 따라 본원에 기재된 접합체를 갖는 표적화된 브로모도메인 단백질에 대한 유의성 대 배수 농축(fold enrichment)의 화산 플롯을 예시한다.
도 11은 몇몇 양태에 따른 본원에 기재된 접합체에 대한 합성 경로를 예시한다.
도 12는 몇몇 양태에 따른 도 11의 세포 투과성 접합체를 사용하여 MCF-7 세포에서 표적화된 튜불린 단백질에 대한 배수 농축 대 유의성의 화산 플롯을 제공한다.
도 13은 몇몇 양태에 따른 도 3의 접합체에 의한 세포내 표지의 공초점 현미경 이미지를 상이한 시점에서 나타낸다.
본원에 기재된 양태는 하기 상세한 설명과 예 및 이들의 전술 및 후술된 설명을 참조하여 보다 쉽게 이해될 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 요소, 기기 및 방법은 상세한 설명 및 예에 제시된 특정 양태들로 제한되지 않는다. 이들 양태는 본 발명의 원리를 예시하는 것일 뿐임을 인식해야 한다. 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않으면서도 다수의 수정 및 개조가 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
정의
단독으로 또는 조합하여 본원에 사용된 용어 "알킬"은 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소 기를 지칭한다. 예를 들면, 알킬은 C1 - C30 또는 C1 - C18일 수 있다.
단독으로 또는 조합하여 본원에 사용된 용어 "알케닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 기를 지칭한다.
단독으로 또는 조합하여 본원에 사용된 용어 "알키닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖고 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 기를 지칭한다.
단독으로 또는 조합하여 본원에 사용된 용어 "아릴"은 하나 이상의 환 치환기로 임의로 치환된 방향족 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 환 시스템을 지칭한다.
단독으로 또는 조합하여 본원에 사용된 용어 "헤테로아릴"은 환 원자 중 하나 이상이 탄소 이외의 원소, 예를 들어 질소, 붕소, 산소 및/또는 황인 방향족 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 환 시스템을 지칭한다.
단독으로 또는 조합하여 본원에 사용된 용어 "헤테로사이클"은 환 시스템의 하나 이상의 원자가 탄소 이외의 원소, 예를 들어 붕소, 질소, 산소 및/ 또는 황 또는 인인 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 환 시스템을 지칭하며, 상기 환 시스템은 하나 이상의 환 치환기로 임의로 치환된다. 헤테로사이클릭 환 시스템은 하나 이상의 불포화 지점을 갖는 환을 포함하는 방향족 및/또는 비방향족 환을 포함할 수 있다.
단독으로 또는 조합하여 본원에 사용된 용어 "사이클로알킬"은 하나 이상의 환 치환기로 임의로 치환된 비방향족, 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 환 시스템을 지칭한다.
단독으로 또는 조합하여 본원에 사용된 용어 "헤테로사이클로알킬"은 환 시스템의 원자 중 하나 이상이 탄소 이외의 원소, 예를 들어 단독으로 또는 조합되어 있는 붕소, 질소, 산소, 황 또는 인인 비방향족, 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 환 시스템을 지칭하며, 상기 환 시스템은 하나 이상의 환 치환기로 임의로 치환된다.
단독으로 또는 조합하여 본원에 사용된 용어 "알콕시"는 R이 상기 정의된 알킬, 알케닐 또는 아릴인 모이어티 RO-를 지칭한다.
단독으로 또는 조합하여 본 명세서에 사용된 용어 "할로"는 주기율표의 VIIA족 원소(할로겐)를 지칭한다. 화학적 환경에 따라 할로는 중성 또는 음이온 상태일 수 있다.
본 명세서에서 구체적으로 정의되지 않은 용어는 당업계에서 통상적인 의미를 갖는다.
I. 전이 금속 착물
일측면에서, 단백질을 포함하는 다양한 생체분자 종의 근접-기반 표지에 유리한 수명 및 확산 반경을 갖는 반응성 표지 중간체를 생성하기 위한 조성 및 전자 구조를 갖는 전이 금속 착물이 본원에 기재되어 있다. 몇몇 양태에서, 전이 금속 촉매는 화학식 I의 것이다:
Figure pct00002
여기서, M은 전이 금속이고;
A, D, E, G, Y 및 Z는 독립적으로 C 및 N로부터 선택되고;
R3 내지 R7은 각각 1 내지 4개의 임의의 환 치환체를 나타내고, 상기 각각의 1 내지 4개의 임의의 환 치환체는 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로알킬, 할로알케닐, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아민, 아미드, 에테르, -C(O)O-, -C(O)OR8, 및 -R9OH로 이루어진 군으로부터 선택되며, R8은 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R9는 알킬이고;
R1은 직접 결합, 알킬렌, 알케닐렌, 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐렌, 아릴렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 헤테로사이클렌, 및 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L은 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포네이트, 카바메이트, 및 우레아로 이루어진 군으로부터 선택된 연결 모이어티이고;
R2는 알킨, 아민, 보호된 아민, 아지드, 하이드라지드, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 하이드록시, 카복실, 할로, 알콕시, 말레이미드, -C(O)H, -C(O)OR8, -OS(O2)R9, 티올, 비오틴, 옥시아민, 및 할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8 내지 R9는 알킬, 할로알킬, 아릴, 할로아릴, N-석신이미딜, 및 N-석신이미딜 에스테르로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
X-은 반대 이온이고, n은 0 내지 20의 정수이다.
임의의 치환체 R3 내지 R7의 부재하에 수소는 화학식 I의 아릴 환 상의 위치를 점유하는 것으로 이해된다. 또한, 몇몇 양태에서, 반대 이온 (X-)은 테트라알킬보레이트, 테트라플루오로보레이트, 테트라페닐보레이트, PF6 -, 및 클로라이드로부터 선택될 수 있다.
전이 금속 착물의 극성은 R3 내지 R7을 선택하여 특정 세포 환경에 맞출 수 있다. 몇몇 양태에서, 예를 들면, R3 내지 R7 중 하나 이상은 하전된/되거나 극성 화학 모이어티를 통해 친수성 특성을 나타내도록 선택된다. 이러한 양태에서, 전이 금속 착물은 세포간/세포외 환경에 배치하기에 적합한 친수성 특성을 나타낼 수 있다. 도 2에 예시된 전이 금속 착물은, 예를 들면, 수성 세포간 환경에 대한 하전된 극성 화학 모이어티를 포함한다. 대안적으로, R3 내지 R7 중 하나 이상은 소수성, 친유성, 또는 비극성 특성을 나타내도록 선택된다. 몇몇 양태에서, 예를 들면, R3 내지 R7 중 하나 이상은 알킬, 플루오로, 또는 플루오로알킬일 수 있다. 도 1은 알킬, 플루오로, 또는 플루오로알킬 치환체를 포함하는 전이 금속 착물의 하나의 비제한적인 양태를 예시한다. 소수성, 친유성 또는 비극성 특성을 나타내는 본원에 기재된 전이 금속 착물은 세포내 환경에 배치하기에 적합할 수 있다. 본원의 실시예에서 입증된 바와 같이, 전이 금속 착물은 본원에 기재된 원리에 따라 국소 세포내 환경을 매핑하기 위해 세포막을 통과할 수 있다. 몇몇 양태에서, 예를 들면, 세포 투과성 화학식 I의 전이 금속 착물은 순수한 물 중 0.2% DMSO에서 150μM 미만의 수용해도를 갖는다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 전이 금속 착물은 100μM 미만의 수용해도를 갖는다. 소수성, 친유성, 또는 비극성 특성을 나타내는 화학식 I의 전이 금속 착물은 순수한 물 중 0.2% DMSO에서 1μM 내지 150μM 또는 1μM 내지 100μM의 수용해도를 가질 수 있다. 수용해도는 C18 컬럼 (HPLC)에서의 전이 금속 착물의 체류 시간에 따라 결정될 수 있다. 전술한 수용해도 값은 또한 생체분자 결합제에 커플링된 전이 금속 착물을 포함하는 본원에 기재된 접합체에 적용될 수 있다.
본원에 기재된 전이 금속 촉매는 세포막 상의 단백질-단백질 상호작용을 포함한 다양한 특징을 선택적으로 식별하도록 작동될 수 있는 미세환경 맵핑 플랫폼을 제공하기 위한 조성물에 사용된다. 몇몇 양태에서, 조성물은 화학식 I의 전이 금속 촉매, 및 단백질 표지 제제를 포함하며, 여기서 전이 금속 촉매는 단백질 표지제를 반응성 중간체로 활성화시킨다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 전이 금속 촉매는 단백질 표지제로 에너지 전달을 허용하여 반응성 중간체를 형성하기 위한 전자 구조를 가질 수 있다. 반응성 중간체는 반응성 중간체의 확산 반경 내에서 단백질 또는 기타 생체 분자와 반응하거나 가교결합한다. 단백질이나 다른 생체 분자가 확산 반경 내에 있지 않으면 반응성 중간체는 주변 환경에 의해 소멸된다.
몇몇 양태에서, 단백질 표지제로의 에너지 전달은 전이 금속 촉매 전자 구조의 여기 상태로부터 유래할 수 있다. 촉매의 여기 상태는, 예를 들면, 일중항 여기 상태 또는 삼중항 여기 상태일 수 있다. 촉매의 여기 상태는 촉매에 의한 에너지 흡수를 포함하는 하나 이상의 메커니즘에 의해 생성될 수 있다. 몇몇 양태에서, 촉매는, 여기 상태가 하나 이상의 광자의 흡수에 의해 유도되는 광촉매이다. 다른 양태에서, 촉매는 주변 환경에서 하나 이상의 화학종과의 상호작용에 의해 여기 상태에 놓일 수 있다. 대안적으로, 전자 전달을 포함하는 단백질 표지제로의 에너지 전달은, 촉매 전자 구조의 기저 상태에서 유래할 수 있다.
단백질 표지제로의 전자 전달을 포함한 에너지 전달은, 단백질 표지제의 반응성 중간체를 형성한다. 반응성 중간체는 반응성 중간체의 확산 반경 내에서 단백질 또는 기타 생체 분자와 반응하거나 가교결합한다. 단백질이나 다른 생체 분자가 확산 반경 내에 있지 않으면 반응성 중간체는 주변 환경에 의해 소멸된다. 반응성 중간체의 확산 반경은 특정 미세환경 매핑 (근접-기반 표지)을 고려하여 조정할 수 있으며 나노미터 규모로 제한될 수 있다. 몇몇 양태에서, 예를 들면, 반응성 중간체의 확산 반경은 주변 환경에서 소멸되기 전에 10nm 미만, 5nm 미만, 4nm 미만, 3nm 미만, 또는 2nm 미만일 수 있다. 따라서, 반응성 중간체는, 확산 반경 내에서 단백질 또는 다른 생체분자와 반응하거나 가교결합하거나 단백질 또는 생체분자가 존재하지 않는 경우 주변 환경에 의해 소멸된다. 이러한 방식으로, 촉매 및 단백질 표지 에이전트 간의 공동 노력을 통해 고분해능의 국소 환경을 매핑할 수 있다. 또한, 몇몇 양태에서, 반응성 중간체는 소멸되기 전에 5㎱ 미만, 4㎱ 미만, 또는 2㎱ 미만의 t1/2를 나타낼 수 있다. 추가의 양태에서, 확산 반경은 반응성 중간체 반감기의 연장을 통해 5 내지 500nm로 연장될 수 있다.
에너지 전달 및 반응성 중간 생성 및 관련 단백질 또는 생체분자 결합을 위한 전술된 전자 구조 특성을 나타내는 임의의 전이 금속 촉매-단백질 표지제 조합이 미세환경 매핑에 사용될 수 있다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 전이 금속 착물은 단백질 표지제로의 에너지 전달을 촉진하는 수명이 긴 삼중항 여기 상태 (T1)를 나타낼 수 있다. T1 상태는 예를 들면 0.2 내지 2㎲의 t1/2를 가질 수 있다. 본원에 기재된 전이 금속 착물은 광촉매일 수 있고, 몇몇 양태에서, 전자기 스펙트럼의 가시 영역의 광을 흡수한다. 전자기 복사의 흡수는 전이 금속 착물을 S1 상태로 여기시킨 다음 T1 상태로 정량적 시스템간 교차(crossing)시킬 수 있다. 이어서 전이 금속 촉매는 단거리 덱스터 에너지를 단백질 표지제로 전달하여 바닥 상태 S0로 되돌아갈 수 있다. 표지제로의 에너지 전달은 단백질 또는 다른 생체분자와의 반응을 위해 상기 표지제를 활성화시킨다. 몇몇 양태에서, 전이 금속 착물의 T1 상태는 60kcal/mol 이상일 수 있다. 금속 중심은 예를 들면 백금족의 전이 금속으로부터 선택될 수 있다. 몇몇 양태에서, 금속 중심은 이리듐일 수 있다.
도 1 및 도 2는 본원에 기재된 다양한 전이 금속 착물을 예시한다. 도 1에 예시된 바와 같이, R2는 생체분자 결합제를 결합하기 위한 반응성 작용기로서 선택될 수 있다. 몇몇 양태에서, 예를 들면, R2는 BCN, DBCO, TCO, 테트라진, 알킨, 및 아지드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 클릭 화학 모이어티를 포함한다. 도 1에 예시된 바와 같이, R2의 이러한 클릭 화학은 링커 (L)에 직접 커플링되거나 헤테로원자, 아릴 또는 카보닐을 통해 커플링될 수 있다.
단백질 표지제는 전이 금속 촉매로부터 에너지 전달을 받아 반응성 중간체를 형성한다. 반응성 중간체는 반응성 중간체의 확산 반경 내에서 단백질 또는 기타 생체 분자와 반응하거나 가교결합한다. 반응성 중간체의 확산 반경은 전술되어 있다. 단백질 표지제의 특이적 동일성은 촉매의 동일성, 형성된 반응성 중간체의 성질, 반응성 중간체의 수명 및 확산 반경을 포함하는 여러 고려사항에 따라 선택될 수 있다.
예를 들면, 전이 금속 촉매는 광촉매인 양태에서, 단백질 표지제는 디아지린일 수 있다. 여기 상태 광촉매로부터의 삼중항 에너지 전달은 디아지린을 이의 삼중항 (T1) 상태로 촉진할 수 있다. 디아지린 삼중항은 N2를 제거하여 자유 삼중항 카르벤을 방출하고, 이는 이의 반응성 일중항 상태로 피코초 시간 규모의 스핀 평형 (t1/2 < 1㎱)을 거쳐, 인근 단백질과 가교되거나 수성 환경에서 소멸된다. 몇몇 양태에서, 전이 금속 착물의 흡광 계수는 디아지린의 흡광 계수보다 3 내지 5배 더 크다.
모든 디아지린은 본원에 논의된 기술적 원칙과 일치한다. 예를 들면, 디아지린 감작(sensitization)은, 자유 카복실산, 페놀, 아민, 알킨, 카보하이드레이트, 및 비오틴 기를 포함하여 현미경 및 단백질체학(proteomics) 분야에 유용한 페이로드를 지닌 p- 및 m-치환된 다양한 아릴트리플루오로메틸 디아지린으로 확장될 수 있다. 디아지린은 비오틴과 같은 마커로 기능화될 수 있다. 몇몇 양태에서, 마커는 데스티오비오틴이다. 마커는 단백질 표지제로 표지된 단백질을 식별하는 데 도움이 될 수 있다. 마커는, 예를 들면, 웨스턴 블롯 및/또는 기타 분석 기술을 통한 분석 결과에 유용할 수 있다. 마커는 비오틴 및 데스티오비오틴 이외에도 알킨, 아지드, FLAG 태그, 형광단 및 클로로알칸 기능을 포함할 수 있다.
전이 금속 촉매가 광촉매인 몇몇 양태에서, 단백질 표지제는 아지드일 수 있다. 여기 상태 광촉매로부터의 삼중항 에너지 전달은 아지드로부터의 니트렌 형성을 촉진할 수 있다. 반응성 니트렌은 근처의 단백질과 가교결합하거나 수성 환경에서 소멸된다. 니트렌 형성을 위해 전이 금속 광촉매로 인해 에너지 전달되도록 작동될 수 있는 임의의 아지드가 사용될 수 있다. 몇몇 양태에서, 아지드는 아릴 아지드이다.
II. 접합체
다른 측면에서, 근접-기반 표지 시스템에서 사용하기 위한 접합체가 본원에 기재되어 있다. 접합체는 생체분자 결합제에 커플링된 전이 금속 착물을 포함하며, 여기서, 생체분자 결합제에 커플링되기 전에, 전이 금속 착물은 전술된 화학식 I의 것이다. 본원에 추가로 상세히 설명된 바와 같이, 생체분자 결합제는 근접 표지 및 관련 분석 및 매핑을 위해 원하는 세포 환경에서 전이 금속 촉매의 위치를 지정하는 데 사용될 수 있다. 몇몇 양태에서, 원하는 세포 환경은 세포간이다. 다른 양태에서, 원하는 환경은 세포내이다. 생체분자 결합제는 근접-기반 표지 및 세포간 환경의 관련 마이크로매핑을 위해 접합체를 원하는 위치로 안내하는 선택적 결합을 나타낼 수 있다.
접합체의 전이 금속 착물은 상기 섹션 I에 기재된 구조 및/또는 특성을 갖는 임의의 전이 금속 착물을 포함할 수 있다. 게다가, 생체분자 결합제는 단백질, 다당류, 또는 핵산을 포함하는 다가 디스플레이 시스템을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 생체분자 결합제는 표적 단백질에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 소분자 리간드 또는 비오틴이다. 예를 들면, 생체분자 결합제는 항체일 수 있다. 몇몇 양태에서, 생체분자 결합제는 원하는 항원에 결합된 1차 항체와 상호작용하기 위한 2차 항체이다. 또한, 생체분자 결합제는 광촉매 전이 금속 착물에 공유 결합될 수 있다.
생체분자 결합제는 전이 금속 촉매에 결합될 수 있다. 몇몇 양태에서, 촉매는 생체분자 결합제를 커플링하기 위한 반응성 핸들 또는 작용기를 포함한다. 몇몇 양태에서, 예를 들면, 촉매는 BCN, DBCO, TCO, 테트라진, 알킨, 및 아지드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 클릭 화학 모이어티를 포함할 수 있다. 생체분자 결합제를 커플링하기 위한 반응성 작용기를 갖는 화학식 (I)의 다양한 전이 금속 광촉매를 예시한다. 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 다양한 길이의 연결기(linker)가 반응성 작용기와 배위 리간드 사이에 사용될 수 있다. 아미드 또는 폴리아미드 링커와 같은 링커의 길이는 표적 부위의 입체 조건을 비롯한 여러 고려 사항에 따라 선택될 수 있다. 게다가, 몇몇 양태에서, 전이 금속 착물은 구리의 부재하에 생체분자 결합제에 커플링될 수 있다.
몇몇 양태에서, 접합체는 세포간 환경에서 표지 적용에 적합한 극성을 나타낸다. 대안적으로, 접합체는 세포 투과성일 수 있으며, 여기서, 접합체는 세포내 표지 적용을 위해 세포막을 통과할 수 있다. 몇몇 양태에서, 예를 들면, 접합체는 세포 투과성 전이 금속 착물에 대해 상기 섹션 I에 언급된 수용해도 값을 나타낼 수 있다.
III. 세포내 근접-기반 표지를 위한 시스템
다른 측면에서, 근접-기반 표지를 위한 시스템이 본원에 기재된다. 시스템은, 예를 들면, 단백질 표지제, 및 전이 금속 촉매를 포함하고, 여기서, 전이 금속 촉매는, 반응성 중간체를 제공하기 위해 단백질 표지제로의 전자 전달을 허용하는 전자 구조를 갖는다. 이어서 반응성 중간체는 국부적 또는 즉각적인 세포 환경에서 단백질 또는 다른 생체분자에 커플링될 수 있다. 몇몇 양태에서, 전이 금속 착물은 본원에 기재된 화학식 I의 것이다.
몇몇 양태에서, 전자 전달은 일중항 여기 상태 또는 삼중항 여기 상태를 포함하는 촉매 전자 구조의 여기 상태로부터 발생한다. 예를 들면, 촉매의 여기 상태는 몇몇 양태에서 광유도될 수 있다. 대안적으로, 전자 전달은 촉매 전자 구조의 기저 상태로부터 유래할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 단백질 표지제로의 전자 전달은 반응성 중간체를 제공한다. 반응성 중간체는 본원에 상세히 기술된 근접 표지 양태와 일치하는 확산 반경을 나타낼 수 있다. 확산 반경은 주변 수성 환경에 의한 반응성 중간체의 급속 냉각에 의해 제한되거나 한정될 수 있다. 예를 들면, 반응성 중간체는 수성 환경에서 소멸되기 전에 5nm 미만, 3nm 미만 또는 2nm 미만의 확산 반경을 가질 수 있다. 따라서, 반응성 중간체는 확산 반경 내에서 단백질 또는 다른 생체분자와 반응하거나 가교결합하거나, 단백질 또는 생체분자가 존재하지 않는 경우 수성 환경에 의해 소멸될 것이다. 이러한 방식으로, 촉매와 단백질 표지제 간의 공동 노력을 통해 고분해능의 국지 환경을 매핑할 수 있다. 또한, 반응성 중간체는 몇몇 양태에서 소멸되기 전에 2㎱ 미만의 t1/2를 나타낼 수 있다. 추가의 양태에서, 확산 반경은 반응성 중간체 반감기의 연장을 통해 5 내지 500nm로 연장될 수 있다.
전자 전달 및 반응성 중간 생성을 위한 전술된 전자 구조 특성을 나타내는 임의의 촉매-단백질 표지제 조합이 미세환경 매핑에 사용될 수 있다. 몇몇 양태에서, 촉매-단백질 표지제 조합은 화학식 I의 전이 금속 촉매 및 디아지린 표지제를 포함한다. 화학식 I의 전이 금속 촉매는 상기 섹션 I에 기재된 임의의 구조 및/또는 특성을 가질 수 있다. 몇몇 양태에서, 단백질 표지제는 분석을 돕기 위한 비오틴과 같은 마커 또는 발광성 마커로 기능화될 수 있다. 디아지린 감작은, 자유 카복실산, 페놀, 아민, 알킨, 카보하이드레이트, 및 비오틴 기를 포함하여 현미경 및 단백질체학 분야에 유용한 페이로드를 지닌 p- 및 m-치환된 다양한 아릴트리플루오로메틸디아지린으로 확장될 수 있다. 전이 금속 촉매의 소광 계수는 감작에 사용되는 청색 LED (450nm)에서 방출되는 파장에서 디아지린의 소광 계수보다 5배 더 클 수 있으며, 이는 백그라운드 비-촉매 반응의 부재를 설명한다.
몇몇 양태에서, 다중 단백질 표지제가 전이 금속 촉매와 함께 사용될 수 있다. 이러한 양태에서, 전이 금속 촉매는 반응성 중간체를 제공하기 위해 단백질 표지제 중 하나 또는 모두에 전자 전달을 허용하는 전자 구조를 나타낸다. 몇몇 양태에서, 반응성 중간체는 상이한 확산 반경을 나타낼 수 있고, 이에 따라 상이한 위치에서 상이한 단백질 또는 생체분자에 결합할 수 있다. 이러한 양태는 본원에 기재된 세포내 근접-기반 표지 시스템의 분해능을 향상시킬 수 있다.
추가로, 본원에서 고려되는 시스템의 전이 금속 착물은 상기 섹션 II에 기재된 바와 같이 생체분자 결합제에 커플링되어 접합체를 제공할 수 있다. 생체분자 결합제를 포함하면, 하나 이상의 단백질 결합제와 관련된 분석 및 매핑을 위해 전이 금속 촉매를 원하는 세포 환경으로 안내할 수 있다. 몇몇 양태에서, 본원에 기재된 시스템은 다중 접합체 및 단백질 표지제를 사용할 수 있으며, 여기서, 각각의 접합체 및 연관된 단백질 표지제는 상이한 세포내 환경에 특이적이다.
IV. 세포내 근접-기반 표지 방법
추가 측면에서, 세포 근접-기반 표지 방법이 본원에 기재되어 있다. 몇몇 양태에서, 방법은, 단백질 표지제, 및 생체분자 결합제에 커플링된 전이 금속 촉매를 포함하는 접합체를 제공하는 것을 포함한다. 단백질 표지제는 전이 금속 촉매에 의해 반응성 중간체로 활성화되고, 반응성 중간체는 세포 환경에서 단백질 또는 기타 생체분자와 커플링된다. 본원에 기재된 방법은, 반응성 중간체에 대한 단백질 커플링을 검출하거나 분석하여 국부 세포 환경의 매핑을 생성하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
단백질 표지제 및 접합체는 상기 섹션 I 내지 III 중 임의의 것에 기재된 임의의 구조, 조성 및/또는 특성을 가질 수 있다.
이들 및 다른 양태는 하기 실시예에서 추가로 예시된다.
실시예 1 - 전이 금속 촉매
단계 1
3-(4'-메틸-[2,2'-비피리딘]-4-일)프로판산
Figure pct00003
화염건조된 플라스크에서에서 3-(4'-메틸-[2,2']비피리디닐-4-일)-프로피온산 에틸 에스테르 4,4'-디메틸-2,2'-비피리딜 (2.5g, 13.5mmol)을 질소 분위기하에 무수 THF (20mL)에 용해시켰다. 용액을 -78℃로 냉각시키고, LDA (14.8mmol, 1.1당량)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온 1.5시간 동안 실온으로 가온하였다. 상기 용액을 -78℃에서 N2하에 무수 THF (15mL) 중의 에틸 2-브로모아세테이트 (2.3mL, 20mmol)의 용액으로 캐뉼러 삽입하였다. 반응 혼합물을 밤새 천천히 실온에 도달하게 하고 탄산수소나트륨 포화 용액을 첨가하여 급랭하였다(quenching). 용액. 에틸 아세테이트를 사용하여 후처리한 다음 Na2SO4로 건조시키고 감압하에 농축하여 조 생성물을 제공하였다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔; DCM:MeOH:NH4OH 95:5:0.5)로 정제하여 목적하는 생성물을 69% 수율로 제공하였다.
단계 2: 5-(4'-메틸-[2,2]비피리디닐-4-일)-펜트-4-엔산.
단계 1로부터의 비피리디닐 에틸 에스테르를 1:1 THF:물에서 취하고 이어서 LiOH (2당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고 (TLC에 의해 완결) NH4Cl를 (pH 5 내지 6까지) 첨가하여 급랭하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고, Na2SO4로 건조시키고 감압하에 농축하여 목적하는 생성물을 오프화이트색 분말로 제공하였다 (63% 수율).
tert-부틸 (2-(3-(4'-메틸-[2,2'-비피리딘]-4-일)프로판아미도)에틸)카바메이트
Figure pct00004
bipy x (228mg, 1mmol, 1당량), PyBOP (612mg, 1.2mmol, 1.2당량), 및 tert-부틸 (2-아미노에틸)카바메이트 (192mg, 1.2mmol, 1.2당량)가 충전된 20mL 바이알에 DMF (2mL)를 첨가하고 이어서 디이소프로필에틸아민 (347㎕, 0.15mmol, 3당량)을 첨가하였다. 반응물을 16시간 동안 교반하였다. 물과 EtOAc를 첨가하여, 생성된 혼합물을 급랭하였다. 층들을 분리하고, 유기물을 포화 NaHCO3, 및 H2O, 및 염수로 세척하였다. 이어서 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고 감압하에 농축하여 황색 오일을 제공하였으며 이를 섬광 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 0-15% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 목적하는 화합물을 황색 고체로 제공하였다 (380mg, 99%).
Ir-촉매 X
Figure pct00005
bipy y (161mg, 0.42mmol, 1.05당량) 및 Ir[dF(CO2H-CF3)ppy]MeCN2 (351mg, 0.4mmol, 1당량)로 충전된 환저 플라스크에 DCM/EtOH (4mL, 4:1)를 첨가하고 반응 혼합물을 30℃에서 16시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 실리카 겔 상에서 직접 감압하에 농축하였다. 조악한 생성물을 섬광 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 0-25% MeOH/DCM)로 정제하여 목적하는 Ir-촉매를 제공하였다 (200mg, 42% 수율).
DBCO Ir 촉매
Figure pct00006
CH2Cl2 (500㎕) mg 중의 Ir-cat X (9.4mg, 0.008mmol, 1당량)로 충전된 5mL 바이알 (차광을 위해 흑색 테이프로 포장되어 있음)을 0℃로 냉각시킨 다음 트리플루오로아세트산 (100㎕)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 완료될 때까지 교반하였다 (TLC 및 HRMS로 모니터링하였다). 완료된 반응물을 감압하에 농축하고 고형물을 MeOH로 슬러리화시키고 감압하에 농축하였다 (3회 이상 수행하여 과량의 산을 제거하였다).
이어서 Ir 촉매-트리플루오로아세트산 염을 DMF (500㎕)에 용해시키고 디이소프로필에틸아민 (10㎕)을 첨가하였다. 상기 용액에 DBCO-NHS (6mg, 0.016mmol, 2당량)를 첨가하고 용액을 암조건에서 3시간 동안 교반하였다. 완결되면, (HRMS/TLC에 의해) 반응 혼합물을 섬광 컬럼 크로마토그래피 (C18, 5-95% MeCN/H2O)로 직접 정제하여 목적하는 화합물을 황색 고체로 제공하였다 (10mg, 91%).
실시예 2 - 전이 금속 촉매
단계 1: 3-(4'-메틸-[2,2'-비피리딘]-4-일)프로판산과 Ir[dF(CF3)ppy]MeCN2 PF6으로 충전된 환저 플라스크에 MeCN/H2O (4:1)를 첨가하고 반응 혼합물을 70℃에서 16시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 감압하에 농축하여 황색 고체를 제공하였다. 조악한 생성물을 섬광 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 0-10% MeOH/DCM)로 정제하여 Ir-촉매를 갖는 목적하는 산을 제공하였다 (55% 수율).
단계 2 (차등적으로 활성화된 촉매의 경우): Ir-촉매, PyBOP, 및 아민으로 충전된 20mL 바이알에 DMF를 첨가하였다. 10분 동안 암조건에서 반응 혼합물을 N2로 살포하고 이어서 디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 반응물을 암조건에서 N2 분위기하에 16시간 동안 교반하였다. 물과 EtOAc를 첨가하여, 생성된 혼합물을 급랭하였다. 층들을 분리하고, 유기물을 5% 시트르산, 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 이어서 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고 감압하에 농축하여 목적하는 화합물을 제공하였다.
실시예 3 - 세포 투과성 접합체, (+)-JQ1-PEG3-Ir
도 3의 전이 금속 착물 및 JQ1 생체분자 결합제를 포함하는 세포 투과성 접합체를 하기 프로토콜에 따라 합성하였다. 전이 금속 착물 및 JQ1 생체분자 결합제의 합성 계획은 도 4에도 예시되어 있다. 무수 DMF (4.5mL) 중의 (+)-JQ1-CO2H (177mg, 0.44mmol)의 교반된 용액에 HATU (176mg, 0.46mmol)를 첨가하고 이어서 DIPEA (230㎕, 1.32mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 10분 동안 N2하에 교반하고 무수 DMF (0.5mL) 중의 t-Boc-N-아미도-PEG3-아민 (143mg, 0.49mmol)의 용액을 적가하였다. 생성된 혼합물을 밤새 교반하고, EtOAc로 희석하고, 이를, 포화 수성 NaHCO3를 첨가하여 급랭하였다. 수성 상을 제거하고 유기 층을 추가의 포화 수성 NaHCO3, 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 진공하에 제거하고, 조악한 재료를 실리카 컬럼 크로마토그래피 (구배 용리: 0 내지 10% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 (+)-JQ1-PEG3-NHBoc를 황갈색 고체로 제공하였다 (171mg, 57%). 1H NMR (500MHz, CDCl3) δ: 7.39 (d, J = 8.5Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.7Hz, 2H), 7.20 (br. s, 1H), 5.35 (br. s, 1 H), 4.65 (t, J = 7.1Hz, 1H), 3.69 - 3.46 (m, 15H), 3.36 (dd, J = 15.0, 6.8Hz, 1H), 3.30 (m, 2H), 2.65 (s, 3H), 2.39 (s, 3H), 1.66 (s, 3H), 1.41 (s, 9H). 13C NMR (125MHz, CDCl3) δ: 170.7, 164.0, 156.3, 155.7, 150.0, 136.9, 136.7, 132.2, 131.0, 131.0, 130.6, 130.0, 128.8, 79.2, 70.6, 70.6, 70.4, 70.2, 70.0, 54.5, 40.4, 39.5, 39.0, 28.5, 14.5, 13.2, 11.9. m/z HRMS 측정치 [M]+ = 675.29120, [C32H44ClF10N6O6S]+ 요구치 675.27226.
CH2Cl2 (2mL) 중의 (+)-JQ1-PEG3-NHBoc (146mg, 0.22mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 TFA (3mL)를 적가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온으로 가온하고 용매를 진공하에 제거하였다. 조악한 혼합물을 포화 수성 NaHCO3를 사용하여 염기성화시키고, CH2Cl2로 추출하고, 용매를 진공하에 제거하여 (+)-JQ1-PEG3-NH2를 황갈색 고체로 제공하였으며 (125mg, 99%), 이를 추가로 정제하지 않고 즉시 사용하였다.
무수 DMF (2mL) 중의 (+)-JQ1-PEG3-NH2 (32mg, 56μmol), Ir-CO2H (61mg, 56μmol), 및 PyBOP (45mg, 86μmol)의 교반된 용액에 N2하에 암조건에서 DIPEA (30㎕, 172μmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 밤새 교반하고, EtOAc로 희석하고, 이를, 포화 수성 NaHCO3를 첨가하여 급랭하였다. 수성 상을 제거하고 유기 층을 추가의 포화 수성 NaHCO3, 5% 수성 시트르산, 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 진공하에 제거하고, 조악한 재료를 실리카 컬럼 크로마토그래피 (구배 용리: 0 내지 3% MeOH/CH2Cl2) 및 C8 역상 제조용 HPLC (구배 용리: 30 내지 100% MeCN/H2O (0.1% 포름산))로 정제하여 (+)-JQ1-PEG3-이리듐을 황색 고체로 제공하였다 (25mg, 27%). 1H NMR (500MHz, CDCl3) δ: 9.24 - 8.92 (m, 2H), 8.58 - 8.27 (m, 2H), 8.24 (s, 1H), 8.04 (dd, J = 12.2, 8.9Hz, 2H), 7.79 - 7.66 (m, 2H), 7.62 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.49 (t, J = 5.1Hz, 1H), 7.41 (d, J = 8.2Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.2Hz, 2H), 6.63 (dd, J = 12.2 8.8Hz, 2H), 5.62 (dd, J = 8.0, 2.3Hz, 2H), 4.80 (br. s, 2H), 4.66 (t, J = 6.9Hz, 1H), 3.70 - 3.30 (m, 18H), 3.24 - 3.15 (m, 2H), 2.93 - 2.77 (m, 2H), 2.66 (s, 3H), 2.63 (s, 3H), 2.39 (s, 3H), 1.66 (s, 3H). 13C NMR (125MHz, CDCl3) δ: 171.9, 170.8, 167.0 (dd, J = 258.2, 16.8Hz), 163.9, 162.7 (dd, J = 262.6, 14.2Hz), 157.6, 155.6 (d, J = 9.9Hz), 155.1 (dd, J = 6.9, 28.6Hz), 154.5, 149.6, 149.1, 145.2 (d, J = 3.2Hz), 136.8 (d, J = 2.8Hz), 136.6, 131.1, 130.9, 130.7, 130.0, 129.9, 129.6, 128.8, 127.9, 126.6, 126.4, 126.2, 123.7 (d, J = 22.5Hz), 121.7 (dd, J = 273.3, 8.9Hz), 114.2 (ddd, J = 17.1, 10.1, 2.6Hz), 100.1 (dt, J = 27.0, 9.7Hz), 70.7, 70.4, 70.3, 69.9, 69.8, 54.5, 39.6, 39.2, 38.9, 35.2, 32.1, 29.8, 29.5, 22.8, 21.8, 14.6, 14.3, 14.3, 13.2, 12.0. 19F NMR (376MHz, CDCl3) δ: -62.7 (d, J = 3.1Hz), -62.7 (s), -72.1 (d, J = 714.3Hz), -101.6 (dtt, J = 59.3, 12.5, 8.8Hz), -105.9 - -106.1 (m). m/z HRMS 측정치 [M]+ = 1507.34161 (100), 1508.33996 (84), 1505.33212 (63), 1506.3 3296 (52), 1509.33644 (72), 1510.33378 (47) [C65H57ClF10IrN10O5S]+ 요구치 1507.33876 (100), 1508.34202 (70), 1505.33634 (60), 1506.33969 (42), 1509.33572 (32), 1509.34538 (24), 1510.33907 (23). HPLC (Vydac 218TP C18 HPLC, 구배: 0 - 90% MeCN/H2O (0.1% TFA) 10분, 5분 90% MeCN (0.1% TFA), 1mL/min, 254nm): τr = 12.5분.
거울상이성체는 (-)-JQ1-CO2H로부터 유사하게 제조되었다.
실시예 4 - 세포내 미세환경 맵핑
세포내 표지:
페놀 레드가 없는 DMEM (Gibco) (4mL)에서 80% 융합도(confluency)의 12×10cm 플레이트 중의 HeLa 세포에 JQ1-PEG3-Ir (실시예 3) (5μM) (4 플레이트, A); Ir-PEG3-NHBoc (5μM) (4 플레이트, B); 및 DMSO (4 플레이트, C)를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 항온배양하고 배지를 제거하고 교체하였다. 디아지린-PEG3-비오틴 (250μM)을 첨가하고 플레이트를 37℃에서 추가의 20분 동안 항온배양하였다. 이어서, 플레이트를 생물반응기에서 450nM에서 15분 동안 (뚜껑 없이) 조사하였다. 배지를 제거하고 세포를 차가운 DPBS (4℃)로 2회 세척하였다. 세포를 차가운 DPBS (4℃)에 재현탁하고, 긁어내고, 별도의 50mL 팔콘 튜브로 옮겼다. 세포를 펠릿화하고 (1000g, 5분 동안 4℃에서), PMSF (1mM) 및 cOmplete EDTA 자유 프로테아제 저해제 (1x) (Roche)를 함유하는 차가운 RIPA 완충액 1mL에 현탁시켰다. 용해된 세포를 얼음 위에서 5 내지 10분 동안 항온배양하고 초음파처리하였다 (35%, 5×5초, 30초 휴식). 이어서 용해물(lysate)을 15×1000g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 세포 용해물의 농도를 BCA 검정으로 측정하고 이에 따라 1mg/mL의 동일 농도로 조정하였다. 대조군 샘플을 각각의 플렉스(plex) (15㎕)로부터 제거하고 이후의 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다.
스트렙타비딘 풀-다운:
마그네틱 스트렙타비딘(Streptavidin) 비드 (NEB)를 제거하고 (플렉스당 250㎕) RIPA (0.5mL)로 2회 세척하였다 (로티쇠르 상에서 5분 항온배양). 상기 비드를 마그네틱 랙 상에서 펠릿화하고, 샘플 (1mL)로 희석하고 로티쇠르 상에서 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 상기 비드를 마그네틱 랙 상에서 펠릿화하고, 상청액을 제거하고, 각각의 플렉스로부터의 대조군 샘플 (15㎕)을 이후의 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다. 이어서, 상기 비드를 1×RIPA (0.5mL), DPBS 중의 3×1% SDS (0.5mL), DPBS 중의 3×1M NaCl (0.5mL), DPBS 중의 3×10% EtOH 및 1×RIPA (0.5mL)로 세척하였다. 샘플을 펠렛화하기 전에 5분 동안 각 세척과 함께 항온배양하였다. 상기 비드를 RIPA 완충액 (300㎕)에 재현탁하고 새로운 1.5mL Lo-바인드 튜브로 옮겼다.
웨스턴 블롯 분석:
풀-다운을 위한 최종 세척 및 이동 절차 후, 상기 비드를 마그네틱 랙 상에서 펠릿화하고 상청액을 제거하였다. 상기 비드를 부드럽게 원심분리하여 튜브 바닥에 모으고 신규 제조된 용리 완충액 (30mM 비오틴, 6M 우레아, 2M 티오우레아, DPBS 중의 2% SDS, pH = 11.5) (24㎕) 및 4× Laemlli 완충액을 BME (6㎕)를 부드럽게 혼합하면서 첨가하였다. 상기 비드를 95℃로 15분 동안 가열하고, 마그네틱 랙 상에서 펠릿화하고, 뜨거울 때 상층액을 제거하고 비드를 제가하였다. 샘플을 실온으로 냉각시키고 원심분리하였다. 이어서 샘플 (17㎕)을 모든 적절한 대조군과 함께 BioRad Criterion 4-20% 트리스-글리신 겔에 로딩하고, 신규 제조된 Tris 실행 완충액 (160V, 60분)에서 실행하였다. 겔을 세척하고 (3×MiliQ 워터) iBlot 2를 통해 NC 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 다시 세척하고 (3×MiliQ 워터) Li-COR TBS 차단 완충액 1시간 동안 실온에서 Li-COR TBS 차단 완충액으로 차단한 다음, 항-BRD4 (A-7, Santa Cruz) (1:500) 및 항-히스톤 H3 (다클론성 Invitrogen PA5-16183) (1:2000)으로, Pierce 단백질이 없는 차단 (1:2000)에서 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 멤브레인을 3×TBST (세척당 5분) 및 5×MiliQ 워터로 세척하고, Li-COR 2차 항체 (Goat-anti-Mouse 800) 및 (Goat-anti-Rabbit 700)를 갖는 Pierce 단백질이 없는 차단 완충액에 재현탁하고 1시간 동안 실온에서 진탕하였다 (1:12,500). 멤브레인을 3×TBST (세척당 5분) 및 5×MiliQ 워터로 세척하고 이미지화하였다.
도 5a는 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도시하고, 도 5b는 전이 금속 착물과 BRD4 단백질의 연관성을 정량화하는 웨스턴 블롯의 농도측정 결과를 제공한다. 도 2b에 예시된 바와 같이, 본원의 실시예 3의 세포 투과성 접합체 (+)-JQ1-PEG3-Ir은 생체분자 결합제가 결여된 BRD4 상대적 전이 금속 착물의 표지에서 2.5배가 넘는 증가를 나타내었다.
실시예 5 - (+)-JQ1-PEG3-Ir를 사용한 BRD4의 시간 의존적 표지
실시예 4에 기재된 바와 같은 세포내 표지 프로토콜에 따른다. 조사(irradiation) 시간은, 시간 경과에 따른 비오틴화 정도를 나타내기 위해 변화되었다 (2분, 5분, 및 15분). UV 광을 사용한 제어 반응은 UV-포토박스를 사용하여 수행하였으며, 4℃에서 20분 동안 254nm 광을 사용하여 플레이트를 조사하였다. 도 6은 HeLa 세포에서 BRD4의 시간 의존적 표지의 결과를 제공한다. 도 6에 예시된 바와 같이, 본 발명의 실시예 3에서 합성된 세포 투과성 접합체는 2분, 5분 및 15분의 시간 주기에서 BRD4의 표지를 가능하게 하였다. 반면, JQ1 생체분자 결합제로 기능화되지 않은 전이 금속 촉매는 BRD4 표지를 생성하지 않았다.
실시예 6 - 세포 투과성 및 비-세포 투과성 접합체간의 표지 비교
도 7의 비-세포 투과성 접합체를 다음과 같이 제조하였다. 비-세포 투과성 접합체는 당해 예의 목적을 위해 JQ1-(Gen1)-Ir을 표지한다. (+)-JQ1-CO2H (100mg, 0.25mmol), 아지도-PEG3-아민 (60mg, 0.27mmol), 1-프로판포스폰산 무수물 (300mL, 0.5mmol, 에틸 아세테이트 중의 50% 용액, 1.07g/mL) 및 디소프로필에틸아민 (130mL, 0.75mmol)을 디클로로메탄 (0.6mL)과 합하고 실온에서 3.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (15mL)와 물 (15mL) 사이에 분할시켰다. 수성 층을 추가의 에틸 아세테이트로 추출하고 유기 층을 합하고, 염수로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과한 다음 감압하에 농축하였다. 생성된 재료를 헥산 중에서 순상(normal phase) 컬럼 크로마토그래피 (ISCO RediSep Gold 12 컬럼, 0-100% (3:1 에틸 아세테이트:에탄올)로 정제하였다. 생성 분획을 농축하여 JQ1-PEG3-아지드를 무색 오일로 제공하였다 (68mg, 45% 수율). 1H NMR (500MHz, CDCl3) δ: 7.44 (d, 2H, J = 8.3Hz), 7.36 (d, 2H, J = 8.4Hz), 6.90 (bs, 1H), 4.68 (t, 1H, J = 7.0Hz), 3.75 - 3.69 (m, 8H), 3.63 (m 2H), 3.55 (m, 2H), 3.45 - 3.37 (m, 2H), 2.69 (s, 3H), 2.43 (s, 3H), 1.70 (s, 3H). 13C NMR (125MHz, CDCl3) δ: 170.6, 163.9, 155.7, 149.9, 136.8, 136.7, 132.2, 130.9, 130.8, 130.5, 129.9, 128.7, 70.7, 70.7, 70.7, 70.4, 70.0, 69.8, 54.4, 50.7, 39.4, 39.2, 14.4, 13.1, 11.8. m/z HRMS 측정치 [M]+ = 601.2125, [C27H33ClN8O4S]+ 요구치 601.2125.
JQ1-PEG3-아지드 (11mg, 0.02mmol) 및 Ir-알킨 [1세대] (21mg, 0.02mmol) 및 DIPEA (16mL, 0.1mmol)를 아세토니트릴 (0.2mL)에 합하여 탁한 현탁액을 제공하였다. 상기 현탁액에 물 (0.3mL) 중의 황산구리 (1.4mg, 0.005mmol)와 아스코르브산나트륨 (3.3mg, 0.02mmol)의 신규 제조된 현탁액을 첨가하여 즉시 황색 용액을 생성하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하고 이때 이를 1.5mL DMSO로 희석하고 제조용 HPLC (50-100% MeCN/물, 10분에 걸쳐 0.05% TFA, 20mL/min, LUNA 5마이크론 C18(2) 100옹스트롬, 250×21.2mm)로 정제하였다. 생성물 분획을 동결건조시켰다. 제조용 HPLC (동일 조건)를 반복하고 생성물 분획을 동결건조시켜 JQ-1-PEG3-Ir (6mg, 20% 수율)을 황색 고체로 제공하였다. 1H NMR (500MHz, MeOH-d 4) δ: 9.07 (s, 1H), 8.92 (s, 1H), 8.70 (s, 2H), 8.14 - 8.08 (m, 2H), 8.06 (s, 1H), 7.86 - 7.80 (m, 2H), 7.66 (d, J = 10.4Hz, 2H), 7.50 - 7.43 (m, 2H), 7.40 (dd, J = 8.7, 3.9Hz, 2H), 6.92 - 6.79 (m, 2H), 5.94 - 5.85 (m, 2H), 4.69 - 4.61 (m, 1H), 4.57 (q, J = 4.5Hz, 2H), 4.53 - 4.43 (m, 2H), 3.89 (t, J = 4.8Hz, 2H), 3.68 - 3.56 (m, 10H), 3.50 - 3.39 (m, 3H), 3.28 (dd, J = 14.9, 5.2Hz, 1H), 3.24 (d, J = 2.5Hz, 3H), 2.69 (d, J = 3.2Hz, 3H), 2.46 (s, 3H), 1.69 (dd, J = 17.2, 3.9Hz, 15H). 13C NMR (125MHz, MeOH-d 4) δ: 171.32, 168.40, 166.33, 164.93, 164.59, 164.17, 162.20, 161.83, 161.67, 159.62, 159.51, 159.32, 156.29, 156.16, 155.51, 155.25, 151.03, 150.77, 149.66, 146.48, 144.21, 142.69, 136.67, 136.51, 132.09, 130.71, 130.57, 130.03, 128.41, 126.38, 126.13, 124.42, 123.22, 123.05, 122.80, 122.61, 122.54, 120.37, 113.94, 99.64, 99.42, 99.21, 77.45, 76.60, 70.12, 70.10, 69.94, 69.17, 68.99, 56.80, 53.63, 49.97, 49.92, 39.15, 37.18, 26.78, 26.74, 26.42, 26.38, 25.81, 13.00, 11.53, 10.17. 19F NMR (471MHz, MeOH-d 4) δ: -61.73, -77.07, -103.74, -107.98.
C73H66ClF10IrN12O10S에 대해 계산된 m/z (1719.3958 측정치 1719.3947 (M+H) 및 860.2029 (M+2H)/2. LC 체류 시간: 1.23분. 2개 체널 (20V 및 25V)이 장착된 Acquity Single pole LCMS를 사용함. 1.8분 동안 구배 5 내지 100% MeCN을 갖는 2.1×50mm BEH 1.7mM 입자 크기 컬럼 상에서 유속은 0.6ml/min이며, 0.2분 동안 유지한다.
실시예 3의 세포 투과성 접합체는 이 실시예에서 BRD4 표지 비교를 위해 제공되었으며, JQ1-(Gen2)-Ir로 지칭된다. 실시예 4에 설명된 세포내 표지 프로토콜에 따른다. 페놀 레드가 없는 DMEM (Gibco) (4mL)에서 80% 융합도의 12×10cm 플레이트 중의 HeLa 세포에 JQ1-PEG3-Ir (Gen-2) (5μM) (4 플레이트, A); JQ1-PEG3-Ir (Gen-1) (5μM) (4 플레이트, B); 및 DMSO (4 플레이트, C)를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 항온배양하고 배지를 제거하고 교체하였다. 디아지린-PEG3-비오틴을 첨가하고 (250μM) 플레이트를 37℃에서 추가의 20분 동안 항온배양하였다. 이어서, 플레이트를 (뚜껑 없이) 생물반응기에서 450nM에서 20분 동안 조사하였다 조사하였다. 스트렙타비딘 농축 및 웨스턴 블롯을 전술된 바와 같이 수행하였다. 표지의 결과가 도 8에 제공된다. 결과에 나타난 바와 같이, JQ1-(Gen1)-Ir은 세포에 유입되는 능력이 부족하며 BRD4 표지를 유효하게 한다. 반면, JQ1-(Gen2)-Ir은 BRD4 표지를 위한 세포내 환경에 유입되었다.
실시예 8 - (+)-JQ1 및 (-)-JQ1 접합체간의 표지 비교
(-)-JQ1은 BRD-단백질에 대한 친화력이 없으므로 음성 대조군으로 사용된다.
실시예 4에 기재된 바와 같은 세포내 표지 프로토콜에 따른다. 페놀 레드가 없는 DMEM (Gibco) (4mL)에서 80% 융합도의 12×10cm 플레이트 중의 HeLa 세포에 (+)-JQ1-PEG3-Ir (Gen-2) (5μM) (4 플레이트, A); (-)-JQ1-PEG3-Ir (Gen-2) (5μM) (4 플레이트, B); 및 DMSO (4 플레이트, C)를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 항온배양하고 배지를 제거하고 교체하였다. 디아지린-PEG3-비오틴 (250μM)을 첨가하고 플레이트를 37℃에서 추가의 20분 동안 항온배양하였다. 이어서, 플레이트를 (뚜껑 없이) 생물반응기에서 450nM에서 20분 동안 조사하였다. 스트렙타비딘 농축 및 웨스턴 블롯을 전술된 바와 같이 수행하였다. 결과가 도 9에 제공된다.
실시예 9 - (+)-JQ1 접합체를 사용한 BRD4 단백질의 선택적 표지
단백질체 제조 및 등압 표지(isobaric labelling):
수행된 절차는 실시예 4의 웨스턴 블롯 분석을 위한 세포내 표지의 절차와 동일하다. 페놀 레드가 없는 DMEM (Gibco) (4mL)에서 80% 융합도의 12×10cm 플레이트 중의 HeLa 세포에 JQ1-PEG3-Ir (5μM) (6 플레이트, A) 및 Ir-PEG3-NHBoc [분석 동안 자유-Ir으로 지칭됨] (5μM) (6 플레이트, B)를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 항온배양하고 배지를 제거하고 교체하였다. 디아지린-PEG3-비오틴 (250μM)을 첨가하고 플레이트를 37℃에서 추가의 20분 동안 항온배양하였다. 이어서, 플레이트를 생물반응기에서 450nM에서 15분 동안 (뚜껑 없이) 조사하였다. 배지를 제거하고 세포를 차가운 DPBS (4℃)로 2회 세척하였다. 세포를 차가운 DPBS (4℃)에 재현탁하고, 긁어내고, 별도의 15mL 팔콘 튜브로 옮겼다 (튜브당 2 플레이트; 총 6개 튜브). 세포를 펠릿화하고 (1000g, 5분 동안 4℃에서), PMSF (1mM) 및 cOmplete EDTA 자유 프로테아제 저해제 (1x) (Roche)를 함유하는 차가운 RIPA 완충액 2mL에 현탁시켰다. 용해된 세포를 얼음 위에서 5 내지 10분 동안 항온배양하고 초음파처리하였다 (35%, 5×5초, 30초 휴식). 이어서 용해물을 15×1000g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 세포 용해물의 농도를 BCA 검정으로 측정하고 이에 따라 농도 1.5mg/mL로 조정되었다. 마그네틱 스트렙타비딘 비드 (NEB)를 제거하고 (플렉스당 350㎕) RIPA (0.5mL)로 2회 세척하였다 (로티쇠르 상에서 5분 항온배양). 상기 비드를 마그네틱 랙 상에서 펠릿화하고, 샘플 (1mL)로 희석하고 로티쇠르 상에서 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 상기 비드를 마그네틱 랙 상에서 펠릿화하고, 상청액을 제거하고, 각각의 플렉스로부터의 대조군 샘플 (15㎕)을 이후의 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다. 이어서, 상기 비드를 1×RIPA (0.5mL), DPBS 중의 3×1% SDS (0.5mL), DPBS 중의 3×1M NaCl (0.5mL), DPBS 중의 3×10% EtOH 및 1×RIPA (0.5mL)로 세척하였다. 샘플을 펠렛화하기 전에 5분 동안 각 세척과 함께 항온배양하였다. 상기 비드를 RIPA 완충액 (300㎕)에 재현탁하고 새로운 1.5mL Lo-바인드 튜브로 옮겼다.
상청액을 제거하고 비드를 3×DPBS (0.5mL) 및 3×NH4HCO3 (100mM) (0.5mL)으로 세척하였다. 상기 비드를 DPBS 중의 500㎕의 6M 우레아에 재현탁하고 25mM NH4HCO3 중의 25㎕의 200mM DTT를 첨가하였다. 상기 비드를 55℃에서 30분 동안 항온배양하였다. 이어서, 25mM NH4HCO3 중의 30㎕의 500mM IAA를 첨가하고 암조건에서 실온에서 30분 동안 항온배양하였다. 상청액을 제거하고 비드를 3×0.5mL의 DPBS 및 3×0.5mL의 TEAB (50mM)로 세척하였다. 상기 비드를 0.5mL의 TEAB (50mM)에 재현탁하고 신규한 단백질 LoBind 튜브로 옮기고, 펠릿화하고, 상청액을 제거하였다. 상기 비드를 40㎕ TEAB (50 mM)에 재현탁하고 1.2㎕ 트립신 (50mM 아세트산 중의 1mg/mL)을 첨가하고 비드를 로티쇠르 상에서 37℃에서 밤새 항온배양하였다. 16시간 후, 추가의 0.8㎕ 트립신을 첨가하고 비드를 추가의 1시간 동안 로티쇠르 상에서 37℃에서 항온배양하였다. 한편, TMT10 플렉스 표지 시약 (0.8mg) (Thermo)을 실온으로 평형화하고, 41㎕의 무수 아세토니트릴 (Optima 등급; 와동하에 5분)로 희석하고 원심분리하였다. 이어서, 상기 비드를 펠릿화하고 상청액을 해당 TMT-표지로 옮겼다.
A1: 127N B1: 128C C1: 130N
A2: 127C B2: 129N C2: 130C
A3: 128N B3: 129C C3: 131
반응물을 실온에서 2시간 동안 항온배양하였다. 샘플을 8㎕의 5% 하이드록실아민으로 급랭하고 15분 동안 항온배양하였다. 모든 샘플을 신규한 단백질 LoBind 수준으로 폴링(pooling)하고 TFA (16㎕, Optima)로 급랭하였다. 단백질체가 수행될 때까지 샘플을 -80℃에서 보관하였다. 실행 전에 샘플을 탈염하고 분획화하였다.
LC-MS/MS/MS-기반 단백질체 분석
Princeton Proteomics Facility에서 Orbitrap Fusion을 사용하여 질량 스펙트럼을 얻었으며 MaxQuant를 사용하여 분석하였다. TMT 표지된 펩티드를 SpeedVac에서 건조시키고, 물 중의 0.1% TFA 300㎕에 재용해시키고, Pierce™ High pH 역상 펩티드 분획 키트 (#84868)를 사용하여 8개의 분획으로 분별하였다. 분획 1, 4, 및 7을 샘플 1로 합하였다. 분획 2와 6을 샘플 2로 합하였다. 분획 3, 5, 및 8을 샘플 3으로 합하였다. 3개의 합한 샘플을 SpeedVac에서 완전히 건조시키고 20㎕의 5% 아세토니트릴/물 (0.1% 포름산 (pH = 3))에 재현탁하였다. Easy-nLC 1200 UPLC 시스템을 사용하여 실행당 2㎕ (~360ng)를 주입하였다. 샘플은, Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific, USA)와 인라인으로 금속 발광체와 짝을 이루는 1.9um C18-AQ 수지 (Dr. Maisch, Germany)로 채워진 길이 45cm 내경 75um의 나노 모세관 컬럼에 직접 로드되었다. 컬럼 온도는 45℃로 설정되었으며 분당 300nl의 유량으로 2시간 구배 방법으로 설정되었다. 질량 분석기는 동기 전구체 선택 (동기(synchronous)) (SPS) - MS3 방법을 사용한 데이터 의존적 방식으로 작동하였으며 [Anal Chem. 2014, 86 (14), 7150-7158] Orbitrap에서 MS1 스캔의 120,000 분해능 (포지티브 모드, 프로필 데이터 유형, 강도 임계값 5.0e3 및 질량 범위 375 내지 1600m/z)을 사용한 후 이온 트랩에서 CID 단편화(fragmentation), MS2의 경우 35% 충돌 에너지 및 Orbitrap (50,000 분해능)의 HCD 단편화, MS3의 경우 55% 충돌 에너지를 사용하였다. MS3 스캔 범위는 120ms의 주입 시간으로 100 내지 500으로 설정되었다. 동적 제외 목록을 호출하여 60초 동안 이전에 시퀀싱된 펩티드를 제외하고 2.5초의 최대 주기 시간을 사용하였다. 사중극자 (0.7m/z 단리 윈도우)를 사용하여 단편화를 위해 펩티드를 단리하였다. 이온 트랩은 급속 모드에서 작동하였다.
MS/MS/MS 데이터는 일반적인 오염물을 함유하는 2018 Uniprot 사람 단백질 데이터베이스에 대해 검색되었다 (정방향 및 역방향). 샘플을 3개 분획으로 설정하고 데이터베이스 검색 기준을 다음과 같이 적용하였다: 메티오닌 산화 및 N-말단 아세틸화 및 탈아미드화 (NQ)로 설정된 가변 변형태, 및 펩티드당 최대 5개의 변형태로 시스테인 카바미도메틸화로 설정된 고정 변형태. 최대 2개의 누락된 절단(cleavage)이 있는 특정 트립신 소화 (트립신/P). 실행들 간에 펩티드 샘플을 일치시켰다. 최대 펩티드 질량은 6000Da로 설정하였다. 표지 최소 배급 횟수를 2로 설정하고 unique and razor 펩티드를 모두 사용하여 정량화하였다. FTMS MS/MS 일치 허용 오차는 0.05Da로 설정하였고 ITMS MS/MS 일치 허용 오차는 0.6Da로 설정하였다. 다른 모든 설정은 기본값으로 유지되었다.
이어서, proteinGroups.txt 파일은 Persues로 수입되었다 [Main: 수정된 보고 강도; 나머지 항목은 기본값으로 남음]. 이어서, 행은 '사이트로만 식별', '역방향' 및 '잠재적 오염물' 기준에 따라 축소된 행렬을 통해 제거된 일치하는 행과 함께 '+' 값이 있는 범주형 열로 필터링되었다. 이어서, 생성된 행렬을 log2(x)로 변환하였으며 열 상관 관계가 >0.9인 것으로 확인되었다. 이전 행렬로부터, 행에 해당 실험 (3×A, 3×B)에 주석이 추가되었다(행의 범주형 주석). 행렬은 후속적으로 정규화되고 (열을 소거함) 해당 데이터는 산점도 그래프 (화산 플롯)로 표시된다. FDR은 2-샘플 T-검정 (Benjamini-Hochberg)에 의해 결정되었다. 결과는 도 10a 내지 도 10c의 화산 플롯에 제공된다. 도 10a 내지 도 10c에 예시된 바와 같이, (+)-JQ1 접합체는, 비교 접합체 종에 비해 브로모도메인 패밀리에서 표지된 단백질의 상당한 농축을 초래하였다.
실시예 10 - 세포 투과성 접합체, Taxol-Ir
본원에 기재된 구조를 갖는 세포 투과성 Taxol-Ir 접합체를 도 11의 합성 반응식에 따라 제조하였으며 하기 설명하였다.
무수 DMF (1mL) 중의 Ir-CO2H (75mg, 69μmol), 및 PyBOP (55mg, 105μmol)의 교반된 용액에 N2하에 암조건에서 DIPEA (30㎕, 172μmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하고 무수 DMF (1mL) 중의 Taxol-NH2 (66mg, 70μmol)의 용액을 적가하였다. 반응물을 밤새 교반하고, EtOAc로 희석하고, 이를, 포화 수성 NaHCO3를 첨가하여 급랭하였다. 수성 상을 제거하고 유기 층을 추가의 포화 수성 NaHCO3, 5% 수성 시트르산, 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 진공하에 제거하고, 조악한 재료를 실리카 컬럼 크로마토그래피 (구배 용리: 0 내지 3% MeOH/CH2Cl2) 및 C8 역상 제조용 HPLC (구배 용리: 30 내지 100% MeCN/H2O (0.1% 포름산))로 정제하여 Taxol-이리듐을 황색 고체로 제공하였다 (47mg, 33%).
1H NMR (500MHz, CDCl3) δ: 8.77 (d, J = 7.3Hz, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.77 - 8.65 (m, 1H), 8.48 (t, J = 10.5Hz, 2H), 8.14 - 7.99 (m, 4H), 7.92 - 7.77 (m, 2H), 7.82 (d, J = 7.3Hz, 2H), 7.74 (t, J = 7.3Hz, 2H), 7.66 - 7.28 (m, 13H), 7.04 - 6.94 (m, 1H), 6.64 (t, J = 9.4Hz, 2H), 6.16 (s, 1H), 6.10 (t, J = 8.4Hz, 1H), 5.79 - 5.68 (m, 1H), 5.67 - 5.57 (m, 3H). 5.55 - 5.45 (m, 1H), 5.29 (s, 1H), 4.90 (d, J = 9.6Hz, 1H), 4.84 (d, J = 3.6Hz, 1H), 4.27 (d, J = 8.9Hz, 1H), 4.15 (d, J = 7.9Hz, 1H), 3.87 (d, J = 7.9Hz, 1H), 3.16 (app. s, 4H), 2.95 - 2.58 (m, 7H), 2.58 - 2.50 (m, 1H), 2.35 (app. s, 3H), 2.26 - 2.09 (m, 5H), 1.86 - 1.63 (m, 7H), 1.25 (app. s, 3H), 1.16 (s, 3H), 1.13 (s, 3H). 13C NMR (125MHz, CDCl3) δ: 202.03, 172.7, 172.5, 171.5 (d, J = 3.2Hz), 170.5, 169.6, 169.5, 168.2 - 168.0 (m), 167.3, 167.0, 165.0 (dd, J = 262.5, 13.0Hz), 262.7 (dd, J = 263.7, 13.0Hz), 157.7, 153.4 - 155.2 (m), 155.1 - 155.0 (m), 154.8 - 154.6 (m), 149.7, 149.3, 145.1 - 144.8 (m), 140.8 (d, J = 2.6Hz), 138.7 (d, J = 2.0Hz), 136.8 - 136.6 (m), 134.1 (d, J = 2.1Hz), 133.9, 132.8, 131.8, 130.3, 130.1 (d, J = 6.1Hz), 129.8, 129.3, 128.9, 128.8, 128.7, 128.1, 127.4, 126.4, 126.2, 123.9 (t, J = 21.3Hz), 122.7 (d, J = 9.1Hz), 120.6 (d, J = 9.1Hz), 114.2 (dd, J = 16.5, 6.7Hz), 100.1 (td, J = 27.0, 9.8Hz), 84.1, 81.0, 78.6, 76.5, 75.4, 74.5, 73.5, 71.6, 71.5, 71.5, 56.2, 55.9, 55.8, 53.6, 47.1, 43.3, 38.8, 35.5, 35.4, 35.3, 33.4, 31.2, 29.8, 26.5, 26.4, 23.8, 23.8, 22.7, 21.6, 21.0, 20.9, 14.6, 11.0. 19F NMR (376MHz, CDCl3) δ: -62.7 (d, J = 5.6Hz), -62.8 (d, J = 5.0Hz), -71.0, -72.9, -101.3 - -101.5 (m), -105.7 - -105.9 (m). m/z HRMS 측정치 [M]+ = 1871. 51783 (100), 1872.51899 (89), 1869.51134 (55), 1870.51373 (55), 1873.51932 (52), 1874.52130 (22), [C89H80F10IrN6O16]+ 요구치 1871.50949 (100), 1872.51284 (96), 1869.50715 (60), 1870.51051 (57), 1873.51620 (46), 1874.51955 (14). HPLC (Vydac 218TP C18 HPLC, 구배: 0-90% MeCN/H2O (0.1% TFA) 10분, 5분 90% MeCN (0.1% TFA), 1mL/min, 254nm): tr = 13.3분.
실시예 11 - 세포내 미세환경 맵핑
세포내 표지:
페놀 레드가 없는 RPMI 1640 (Gibco) (4mL)에서 80% 융합도의 10개의 투명한 10cm 플레이트의 10개의 투명한 10cm 플레이트의 MCF-7 세포에 Taxol-Ir (실시예 10) (20μM) (5 플레이트, A) 및 Ir-dF(CF3)(dMebpy)PF6 [분석 동안 자유-Ir으로 지칭됨] (2μM) (5 플레이트, B)을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 항온배양하고 배지를 제거하고 교체하였다. N-(4-(3-(트리플루오로메틸)-3H-디아지린-3-일)벤질)헥스-5-인아미드 (250μM)를 첨가하고 플레이트를 37℃에서 추가의 20분 동안 항온배양하였다. 이어서, 플레이트를 (뚜껑 없이) 생물반응기에서 450nM에서 20분 동안 조사하였다. 이어서 플레이트를 (뚜껑 없이) Merck 생물반응기 450nM에서 15분 동안 조사하였다. 플레이트를 차가운 DPBS (2×5mL)로 부드럽게 세척하고, 세포를 긁어내고 (5mL 차가운 DPBS 중에서), 합하고, 펠렛화하였다 (1000g, 4℃에서 5분 동안). 상청액을 제거하고, 세포를, PMSF (1mM) 및 cOmplete EDTA 자유 프로테아제 저해제 (Roche)를 함유하는 저온 용해 완충액 (10mM HEPES 중의 1% SDS, 150mM NaCl, 1.3mM MgCl2) 1mL에 현탁하였다. 용해된 세포를 얼음 위에서 항온배양하고 초음파처리하였다 (35%, 4×5초, 30초 휴식). 이어서 용해물을 15×1000g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 세포 용해물의 농도를 BCA 검정으로 측정하였다 (통상 3mg/mL).
CuAAC 반응:
3개 플렉스용 클릭-칵테일(Click-cocktail): 0.5mL Lo-bind 튜브에서, 6.2㎕ 500mM CuSO4를 62㎕의 100mM THPTA에 첨가하고 와류시켰다. 이어서, 15.5㎕의 5mM 비오틴-PEG7-아지드 (broadpharm)를 첨가한 다음 15.5㎕의 신규 제조된 1M 아스코르브산나트륨을 첨가하였다 (중요: 시약을 순서대로 첨가함).
1.5mL Lo-bind 튜브의 세포-용해물 (1mL)에 32㎕의 클릭-칵테일을 첨가하였다. 생성된 용액을 와류시키고 로티쇠르 상에서 실온에서 1시간 동안 항온배양하고, 5㎕ 250mM Na4EDTA를 첨가하여 급랭하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 15mL 튜브로 옮기고, 4.2mL 얼음처럼 차가운 아세톤으로 희석하였다. 샘플을 -20℃에서 밤새 침전시키고 (3시간도 만족스러운 것으로 확인됨), 4.5×1000g에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 펠렛을 초음파처리(20%에서 2초)에 의해 얼음처럼 차가운 메탄올(1mL)에 완전히 재현탁하고 -20℃에서 30분 동안 항온배양하였다. 이후에, 혼합물을 4.5×1000g에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 절차를 반복하였다. 펠릿을 20분 동안 실온에서 공기 건조시키고 300㎕ 1% SDS (실온에서 1시간)에 재용해시키고 5분 동안 95℃에서 가열하였다. 샘플을 냉각시키고 900㎕ RIPA 완충액으로 희석하였다. 250㎕의 스트렙타비딘 마그네틱 비드 (Thermo Fisher, cat. 88817)를 단백질 LoBind 미세원심분리 튜브 (Eppendorf, cat. 022431081)에 첨가하고 1mL RIPA 완충액 (Thermo Fisher, cat. 89900)으로 2회 세척하였다. 대략 1.0mg의 세포 용해물을 미리 세척된 스트렙타비딘 마그네틱 비드에 첨가하고 3시간 동안 실온에서 항온배양하였다. 마그네틱 랙을 사용하여 비드를 펠렛화하고 용해물 상청액을 제거하였다. 상기 비드를 각각 1mL의 1% SDS, 1mL의 1M NaCl, 및 1mL의 10% EtOH로 순차적으로 3회 세척하였으며, 이들은 모두 1x DPBS에서 제조되었고 세척 사이에 5분 동안 항온배양되었다. 1mL RIPA 완충액으로 최종 세척을 수행하였다. 이어서 상기 비드를 20mM DTT와 25mM 비오틴을 함유하는 4× Laemmli 샘플 완충액 (Boston BioProducts, cat. BP-110R) 30㎕에 재현탁하였다. 비드를 95℃에서 10분 동안 가열한 다음 마그네틱 랙 위에 놓았다. 상청액을 신규한 단백질 LoBind 미세원심분리 튜브로 옮기고 -80℃에서 보관하였다. 정량적 단백질체 샘플 제조 및 분석을 샘플 IQ Proteomics (Cambridge, MA)에 의해 수행하였다.
IQ Proteomics에서 LC-MS 분석을 위해, EASY nanoLC-1000 (또는 nanoLC-1200) (Thermo Fisher) 액체 크로마토그래피 시스템에 연결된 Orbitrap Fusion Lumos에서 질량 스펙트럼을 획득하였다. Sepax GP-C18 수지 (1.8㎛, 150Å, Sepax)로 내부 포장된 75㎛ 모세관 컬럼 상에 대략 2㎍의 펩티드를 최종 길이가 35cm가 되도록 로딩하였다. 0.1% 포름산 중에서 8%에서부터 28%까지의 아세토니트릴로의 110분 선형 구배를 사용하여 펩티드를 분리하였다. 질량 분석기는 데이터 종속 모드에서 작동되었다. 스캔 시퀀스는 FTMS1 스펙트럼으로 시작하였다 (해상도 120,000; 질량 범위 350 내지 1400m/z; 최대 주입 시간 50ms; AGC 표적 1ㆍ106; +/- 10ppm 윈도우에서 60초 동안 동적 제외). 10개의 가장 강력한 전구체 이온은, 이온 트랩에서 (정규화된 충돌 에너지 (NCE) = 35; 최대 주입 시간 100ms; 격리 윈도우 0.7Da; AGC 표적 1.5ㆍ104) 충돌 유도 해리 (CID)를 통해 MS2 분석을 위해 선택되었다. MS2 수집 후, 동기 전구체 선택 (SPS) MS3 방법을 사용하여, Orbitrap에서 (NCE = 55; 해상도 50,000; 최대 주입 시간 86ms; AGC 표적 1.4ㆍ105; 1.2Da에서 +2m/z 동안, 1.0Da에서 +3m/z 동안 또는 0.8Da에서 +4 내지 +6m/z 동안 격리 윈도우) 고에너지 충돌 유도 해리(HCD)를 위한 8개의 MS2 생성 이온을 선택할 수 있다. 모든 질량 스펙트럼은 수정된 버전의 ReAdW.exe를 사용하여 mzXML로 변환되었다. MS/MS 스펙트럼은 SEQUEST 알고리즘을 사용하여 일반적인 오염물을 포함하는 연결된 2018 사람 Uniprot 단백질 데이터베이스에 대해 검색되었다 (정방향 + 역방향 서열). 데이터베이스 검색 기준은 다음과 같다: 50ppm의 전구체 질량 내성 및 1Da의 단편 이온 내성; 메티오닌의 산화 (15.9949Da)는 차등 변형으로 설정되었다. 정적 변형은 시스테인의 카복시아미도메틸화 (57.0214) 및 펩티드의 N-말단 및 라이신에 대한 TMT (229.1629)였다. 선형 판별 분석을 사용하여 펩티드-스펙트럼 일치를 필터링하고 1% 펩티드 거짓 발견율 (FDR)로 조정하였다.
LC-MS/MS 데이터의 모든 생물정보학적 분석은 R 통계 컴퓨팅 환경에서 수행되었다. 펩티드 수준 풍부 데이터를 사용하여, 실험에서 단백질에 해당하는 펩티드의 수를 확인하였다. 특이치가 다운스트림 근위 호출에 영향을 미칠 가능성을 줄이기 위해 단일 펩타이드 정량화가 있는 모든 단백질을 제거하였다. 이어서 펩티드 수준 풍부 데이터를 각 샘플에 대해 개별적으로 합산된 전체 풍부로 정규화하였다 이어서 이러한 총계를 평균화하고, 각 정규화된 단백질 풍부 값에 이러한 평균을 곱하여 풍부 데이터의 규모를 재조정하였다. 이어서 단백질에 해당하는 모든 펩티드의 중앙값을 취하여 펩티드 수준 데이터를 단백질 수준 데이터에 병합하였다. 이어서 단백질을 여과하여, 데이터베이스 검색으로부터 확인된 알려진 오염물과 알려진 항체 오염물인 단백질 (예를 들면, 유전자 기호에 IGK, IGK 또는 IGH가 있고 Uniprot 설명에 면역글로불린이 있음)을 제거하였다. 이어서 데이터를 여과하여, 거의 모든 실험에서 일관되게 검출된 위양성으로 알려진 단백질인 PRNP를 제거하였다. 단백질 풍부를 log2로 변환하고 Limma로 선형 모델링 분석을 수행하였다. Limma는 그룹당 작은 샘플 크기로 생물학적 분산의 현실적인 분포를 허용하는 경험적 Bayes 접근 방식을 사용한다. 이러한 프로그램은 전체 데이터 세트를 활용하여, 관찰된 표본 분산을 합동 추정치로 축소한다. 단백질 전반에 걸친 분산 정보의 이러한 차용은 실제 분산에 대한 보다 정확한 추정을 가능하게 하며, 그룹 간의 실제 차이를 감지하는 향상된 검정력을 허용한다. 각 단백질에 대해, 풍부 데이터는 lmFit 함수를 사용하여 입력 변수로 실험 그룹을 사용하여 선형 모델에 적합하였다. log2FC 값을 추정하고 유의성을 위해 p-값을 계산하였다. 이어서, Benjamini와 Hochberg의 거짓 발견율 (FDR) 방법을 사용하여 다중 비교를 위해 P-값을 수정하였다. 화산 플롯은 ggplot2 라이브러리를 사용하여 R에서 생성되었다. Limma로부터의 Log2FC 및 p-값 추정치는 지정된 log2FC 컷오프에 도달한 것들의 부분집합이었다. 단백질은 log2-배수 컷오프 임계값 위 또는 아래로 떨어졌는지 여부에 따라 색상이 지정되었으며 통계적으로 유의하였다 (FDR 보정 p-값 < 0.05).
도 12는 표지를 위해 실시예 10의 세포 투과성 접합체를 사용하여 MCF-7 세포에서 표적화된 튜불린 단백질에 대한 배수 농축 대 유의성의 화산 플롯을 제공한다.
실시예 12 - 공초점 현미경
HeLa 세포를 DMEM (페놀 레드 없음)이 있는 35mm 유리 바닥 현미경 접시에 플레이팅하고 (+)-JQ1-PEG3-Ir (실시예 3) (5μM), Ir-PEG3-NHBoc [자유-Ir로 지칭됨] (5μM), 및 DMSO로 처리하였다. 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 항온배양하고 배지를 제거하고 교체하였다. 디아지린-PEG3-비오틴 (250μM)을 첨가하고 플레이트를 37℃에서 추가의 20분 동안 항온배양하였다. 이어서, 플레이트를 (뚜껑 없이) 생물반응기에서 450nM에서 상이한 시간 동안 조사하였다. 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척하였다. 이어서 세포를 PBS 중 4% 파라포름알데히드 400㎕로 37℃에서 20분 동안 고정하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 실온에서 20분 동안 PBS 중의 0.1% 트리톤 X-100 400㎕로 투과화하였다. 세포를 PBS로 세척하고 실온에서 20분 동안 PBS 중의 2% BSA 400㎕로 차단하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 PBS 중에서 1:500으로 희석된 스트렙타비딘-Alexa Fluor 488 및 1:10,000으로 희석된 Hoechst 400㎕와 함께 배양하였다. 공초점 현미경은 Nikon A1/HD25 현미경 (Nikon Instruments, Inc., Melville, NY)을 사용하여 40배 배율에서 수행되었다. 도 13의 이미지는 각 세션 동안 촬영한 다중 단면 이미지를 나타낸다.
본 발명의 다양한 목적을 달성하기 위해 본 발명의 다양한 양태가 설명되어 있다. 이들 양태는 단지 본 발명의 원리를 예시하는 것임을 인식해야 한다. 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서도 이의 다수의 변경 및 개조가 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.

Claims (45)

  1. 화학식 I의 전이 금속 착물.
    Figure pct00007

    여기서, M은 전이 금속이고;
    A, D, E, G, Y 및 Z는 독립적으로 C 및 N로부터 선택되고;
    R3 내지 R7은 각각 1 내지 4개의 임의의 환 치환체를 나타내고, 상기 각각의 1 내지 4개의 임의의 환 치환체는 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로알킬, 할로알케닐, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아민, 아미드, 에테르, -C(O)O-, -C(O)OR8, 및 -R9OH로 이루어진 군으로부터 선택되며, R8은 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R9는 알킬이고;
    R1은 직접 결합, 알킬렌, 알케닐렌, 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐렌, 아릴렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 헤테로사이클렌, 및 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L은 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포네이트, 카바메이트, 및 우레아로 이루어진 군으로부터 선택된 연결 모이어티이고;
    R2는 알킨, 아민, 보호된 아민, 아지드, 하이드라지드, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 하이드록시, 카복실, 할로, 알콕시, 말레이미드, -C(O)H, -C(O)OR8, -OS(O2)R9, 티올, 비오틴, 옥시아민, 및 할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8 내지 R9는 알킬, 할로알킬, 아릴, 할로아릴, N-석신이미딜, 및 N-석신이미딜 에스테르로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    X-은 반대 이온이고, n은 0 내지 20의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, M은 백금족 금속인, 전이 금속 착물.
  3. 제2항에 있어서, M은 이리듐인, 전이 금속 착물.
  4. 제1항에 있어서, 전자기 스펙트럼의 가시 영역에서 흡수 스펙트럼을 갖는, 전이 금속 착물.
  5. 제1항에 있어서, R2는 생체분자를 커플링하기 위한 모이어티를 포함하도록 선택되는, 전이 금속 착물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 R2는 클릭 화학 모이어티인, 전이 금속 착물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 클릭 화학 모이어티는 BCN, DBCO, TCO, 테트라진, 알킨, 및 아지드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전이 금속 착물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 생체분자는 항체인, 전이 금속 착물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 전이 금속 착물은 세포 투과성인, 전이 금속 착물.
  10. 제1항에 있어서, 순수한 물에서 0.2% DMSO에서 1μM 내지 150㎛의 수 가용성을 갖는, 전이 금속 착물.
  11. 생체분자 결합제에 커플링된 전이 금속 착물을 포함하는 접합체로서, 상기 생체분자 결합제에 커플링되기 전에, 상기 전이 금속 착물은 화학식 I의 것인, 접합체.
    Figure pct00008

    여기서, M은 전이 금속이고;
    A, D, E, G, Y 및 Z는 독립적으로 C 및 N로부터 선택되고;
    R3 내지 R7은 각각 1 내지 4개의 임의의 환 치환체를 나타내고, 상기 각각의 1 내지 4개의 임의의 환 치환체는 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로알킬, 할로알케닐, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아민, 아미드, 에테르, -C(O)O-, -C(O)OR8, 및 -R9OH로 이루어진 군으로부터 선택되며, R8은 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R9는 알킬이고;
    R1은 직접 결합, 알킬렌, 알케닐렌, 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐렌, 아릴렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 헤테로사이클렌, 및 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L은 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포네이트, 카바메이트, 및 우레아로 이루어진 군으로부터 선택된 연결 모이어티이고;
    R2는 알킨, 아민, 보호된 아민, 아지드, 하이드라지드, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 하이드록시, 카복실, 할로, 알콕시, 말레이미드, -C(O)H, -C(O)OR8, -OS(O2)R9, 티올, 비오틴, 옥시아민, 및 할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8 내지 R9는 알킬, 할로알킬, 아릴, 할로아릴, N-석신이미딜, 및 N-석신이미딜 에스테르로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    X-은 반대 이온이고, n은 0 내지 20의 정수이다.
  12. 제11항에 있어서, 상기 전이 금속 착물 및 생체분자 결합제는 클릭 화학을 통해 커플링되는, 접합체.
  13. 제11항에 있어서, M은 백금족 금속인, 접합체.
  14. 제11항에 있어서, 상기 전이 금속 착물은 전자기 스펙트럼의 가시 영역에서 흡수 스펙트럼을 갖는, 접합체.
  15. 제11항에 있어서, 상기 접합체는 세포 투과성인, 접합체.
  16. 제11항에 있어서, 순수한 물에서 0.2% DMSO에서 1μM 내지 150㎛의 수 가용성을 갖는, 접합체.
  17. 근접 표지를 위한 시스템으로서, 상기 시스템은 단백질 표지제; 및 전이 금속 촉매를 포함하며, 상기 전이 금속 촉매는, 반응성 중간체를 제공하기 위해 상기 단백질 표지제로의 전자 전달을 허용하는 전자 구조를 갖고, 상기 전이 금속 촉매는 화학식 I의 것인, 시스템.
    Figure pct00009

    여기서, M은 전이 금속이고;
    A, D, E, G, Y 및 Z는 독립적으로 C 및 N로부터 선택되고;
    R3 내지 R7은 각각 1 내지 4개의 임의의 환 치환체를 나타내고, 상기 각각의 1 내지 4개의 임의의 환 치환체는 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로알킬, 할로알케닐, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아민, 아미드, 에테르, -C(O)O-, -C(O)OR8, 및 -R9OH로 이루어진 군으로부터 선택되며, R8은 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R9는 알킬이고;
    R1은 직접 결합, 알킬렌, 알케닐렌, 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐렌, 아릴렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 헤테로사이클렌, 및 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L은 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포네이트, 카바메이트, 및 우레아로 이루어진 군으로부터 선택된 연결 모이어티이고;
    R2는 알킨, 아민, 보호된 아민, 아지드, 하이드라지드, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 하이드록시, 카복실, 할로, 알콕시, 말레이미드, -C(O)H, -C(O)OR8, -OS(O2)R9, 티올, 비오틴, 옥시아민, 및 할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8 내지 R9는 알킬, 할로알킬, 아릴, 할로아릴, N-석신이미딜, 및 N-석신이미딜 에스테르로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    X-은 반대 이온이고, n은 0 내지 20의 정수이다.
  18. 제17항에 있어서, 상기 전자 전달은 상기 촉매 전자 구조의 여기 상태로부터 발생하는, 시스템.
  19. 제18항에 있어서, 상기 전자 전달은 상기 촉매 전자 구조의 삼중항 상태로부터 발생하는, 시스템.
  20. 제17항에 있어서, 상기 반응성 중간체는 1 내지 500nm의 확산 반경을 갖는, 시스템.
  21. 제20항에 있어서, 상기 확산 반경은 1 내지 10nm인, 시스템.
  22. 제17항에 있어서, 상기 전이 금속 촉매는 생체분자 결합제에 커플링되는, 시스템.
  23. 제22항에 있어서, 상기 생체분자 결합제는 펩티드, 단백질, 당, 소분자 또는 핵산을 포함하는, 시스템.
  24. 제22항에 있어서, 상기 전이 금속 착물 및 생체분자 결합제는 클릭 화학을 통해 커플링되는, 시스템.
  25. 제17항에 있어서, 상기 단백질 표지제는 디아지린인, 시스템.
  26. 제25항에 있어서, 상기 디아지린은 분자 마커를 포함하는, 시스템.
  27. 제25항에 있어서, 상기 반응성 중간체는 카르벤인, 시스템.
  28. 제22항에 있어서, 상기 전이 금속 촉매는 세포 투과성인, 시스템.
  29. 근접 표지 방법으로서,
    단백질 표지제, 및 생체분자 결합제에 커플링된 전이 금속 촉매를 포함하는 접합체를 제공하는 단계;
    상기 전이 금속 촉매에 의해 상기 단백질 표지제를 반응성 중간체로 활성화시키는 단계; 및
    세포 환경에서 상기 반응성 중간체를 단백질에 커플링하는 단계
    를 포함하고, 상기 전이 금속 착물은 화학식 I의 것인, 방법.
    Figure pct00010

    여기서, M은 전이 금속이고;
    A, D, E, G, Y 및 Z는 독립적으로 C 및 N로부터 선택되고;
    R3 내지 R7은 각각 1 내지 4개의 임의의 환 치환체를 나타내고, 상기 각각의 1 내지 4개의 임의의 환 치환체는 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로알킬, 할로알케닐, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아민, 아미드, 에테르, -C(O)O-, -C(O)OR8, 및 -R9OH로 이루어진 군으로부터 선택되며, R8은 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R9는 알킬이고;
    R1은 직접 결합, 알킬렌, 알케닐렌, 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐렌, 아릴렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 헤테로사이클렌, 및 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L은 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포네이트, 카바메이트, 및 우레아로 이루어진 군으로부터 선택된 연결 모이어티이고;
    R2는 알킨, 아민, 보호된 아민, 아지드, 하이드라지드, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 하이드록시, 카복실, 할로, 알콕시, 말레이미드, -C(O)H, -C(O)OR8, -OS(O2)R9, 티올, 비오틴, 옥시아민, 및 할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8 내지 R9는 알킬, 할로알킬, 아릴, 할로아릴, N-석신이미딜, 및 N-석신이미딜 에스테르로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    X-은 반대 이온이고, n은 0 내지 20의 정수이다.
  30. 제29항에 있어서, 상기 단백질 표지제를 활성화시키는 단계는 상기 전이 금속 촉매로부터 상기 단백질 표지제로의 전자 전달을 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 전자 전달은 상기 촉매 전자 구조의 여기 상태로부터 발생하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 여기 상태는 삼중항 상태인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 삼중항 상태는 적어도 60kcal/mol의 에너지 상태를 갖는, 방법.
  34. 제29항에 있어서, 상기 단백질 표지제는 디아지린인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 디아지린은 마커로 기능화되는, 방법.
  36. 제29항에 있어서, 상기 반응성 중간체는 1 내지 10nm의 확산 반경을 갖는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 반응성 중간체는 상기 확산 반경 외부에서 소멸되며, 상기 확산 반경 외부에서 생체분자로의 결합을 방지하는, 방법.
  38. 제29항에 있어서, 상기 생체분자 결합제는 단백질, 단당류, 또는 핵산을 포함하는, 방법.
  39. 제29항에 있어서, 상기 생체분자 결합제는 상기 전이 금속 착물을 상기 세포 핵 내에 또는 상기 세포 핵에 인접하게 위치시키는, 방법.
  40. 제28항에 있어서, 상기 반응성 중간체에 커플링된 상기 단백질을 검출 또는 분석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  41. 제31항에 있어서, 상기 여기 상태는 상기 전이 금속 촉매에 의한 광 흡수에 의해 생성되는, 방법.
  42. 제29항에 있어서, 상기 전이 금속 착물 및 생체분자 결합제는 클릭 화학을 통해 커플링되는, 방법.
  43. 제29항에 있어서, 상기 세포 환경은 세포내 환경인, 방법.
  44. 제29항에 있어서, 상기 세포 환경은 세포간 환경인, 방법.
  45. 제29항에 있어서, 상기 생체분자 결합제는 구리의 부재하에 상기 전이 금속 촉매에 커플링되는, 방법.
KR1020227033134A 2020-02-27 2021-02-26 세포간 및 세포내 근접-기반 표지 조성물 및 시스템 KR20220147628A (ko)

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