KR20220146931A - Composition for inducing disturbance of circadian clock and model for disturbing circadian clock made using same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 생체시계(circadian clock) 조절용 조성물 및 이를 이용한 생체시계 조절 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 생체시계 관련 유전자인 Cry1, Cry2를 동시에 녹아웃 시키기 위해 직접 설계한 sgRNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템, 이를 포함하는 생체시계 교란 유도용 조성물, 이를 활용해 제조한 생체시계 교란 모델 및 상기 모델을 활용한 생체시계 교란 치료물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for regulating circadian clock and a circadian clock regulation method using the same, and more specifically, a CRISPR/Cas9 system comprising sgRNA directly designed to simultaneously knockout circadian clock-related genes Cry1 and Cry2; A composition for inducing circadian clock disturbance including the same, a circadian clock disturbance model manufactured using the same, and a screening method for a circadian clock disturbance therapeutic material using the model.
포유동물에서 빛에 의한 정보는 망막시상하부 경로(retino-hypothalamic tract, RHT)를 통하여 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus, SCN)으로 전달된다. SCN은 일련의 생체시계 유전자의 전사-번역 피드백 루프로 구성된 내재적 분자 시계 메커니즘을 갖는다. CLOCK(circadian locomotor output cycles kaput)은 E-box(CACGTG)에 결합하여 Cry1/2 유전자의 발현을 활성화 시킨다. 외부 환경의 명-암(Light-dark, LD) 주기에 의해 결정되는 외부시계에 의한 자극과 생체내부 시계의 정보를 바탕으로 SCN은 통합된 시간의 산출 신호를 생산하고, 각 신체부위에 존재하는 말초시계를 조절한다. 따라서, 생리적, 활동적 주기는 생체시계 및 외부 환경의 명-암주기(LD 사이클)에 의한 종합적인 결과물이다. In mammals, light-induced information is transmitted to the suprachiasmatic nucleus (SCN) through the retinal hypothalamus pathway (retino-hypothalamic tract, RHT). The SCN has an intrinsic molecular clock mechanism consisting of a transcription-translational feedback loop of a series of circadian clock genes. CLOCK (circadian locomotor output cycles kaput) activates the expression of the Cry1/2 gene by binding to the E-box (CACGTG). Based on the stimulus by the external clock determined by the light-dark (LD) cycle of the external environment and the information of the internal clock, the SCN produces an integrated time calculation signal, and Adjust the peripheral clock. Therefore, the physiological and active cycle is a comprehensive result of the circadian clock and the light-dark cycle (LD cycle) of the external environment.
생체 내부 시계와 환경적인 LD 사이클은 정상적인 경우 같은 주기로 나타나지만 이 주기가 흐트러지면 사람 및 쥐에서 다양한 병리학적 결과가 나타나는 것으로 보고되어 왔다. 또한 최근 연구에서는 LD 사이클의 특정 조건에서는 대사 및 비만에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 그럼에도 불구하고, 생체시계 교란 그 자체가 건강에 해가 되는지, 혹은 특정 LD 사이클이 특정 질병에 대해서 취약하게 만드는지에 대해서는 밝혀진 바가 거의 없다. 생체시계 교란의 생리학적 의미는 유전학적 변이체 연구를 통하여 유추될 수 있는데, Clock와 같은 생체시계 유전자가 결여된 변이체는 리듬을 잃는 것뿐 아니라 조기 노화, 비만 및 암에 대한 민감성이 증가된다는 것이 보고되었다. 그러나 이러한 변화가 생체시계의 조절에 따른 것인지에 대한 구체적인 연구는 미진한 실정이기에, 이러한 돌연변이 모델의 제작을 위한 기술의 개발이 필요한 실정이다.It has been reported that the biological internal clock and the environmental LD cycle appear in the same cycle in normal cases, but when this cycle is disturbed, various pathological results appear in humans and mice. In addition, recent studies have shown an important role in metabolism and obesity under certain conditions of the LD cycle. Nevertheless, little is known about whether disruption of the circadian clock itself is detrimental to health or whether certain LD cycles make them vulnerable to certain diseases. The physiological significance of circadian clock disturbance can be inferred through genetic variant studies. became However, since specific studies on whether these changes are due to the regulation of the biological clock are inexperienced, it is necessary to develop a technology for the production of such a mutation model.
상기와 같은 배경하에, 본 발명자들은 효율적으로 생체시계를 교란시킬 수 있는 조성물에 대한 연구를 수행한 결과, 직접 설계한 본 발명의 sgRNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 경우 생체시계 관련 유전자를 동시에 적중함으로써 생체시계 교란 모델을 제작할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Under the above background, the present inventors conducted a study on a composition that can efficiently disturb the circadian clock. As a result, when using the CRISPR/Cas9 system including the sgRNA of the present invention directly designed, the circadian clock-related gene The present invention was completed by confirming that a biological clock disturbance model can be produced by simultaneously hitting.
이에, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열로 이루어진, 생체시계 관련 유전자를 표적하는, 가이드 RNA(guide RNA)를 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a guide RNA, which targets a biological clock-related gene, consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
또한, 본 발명은 상기 가이드 RNA를 포함하는, 생체시계 관련 유전자를 표적하는 재조합 가이드 RNA 벡터를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.Another object of the present invention is to provide a recombinant guide RNA vector that targets a biological clock-related gene, including the guide RNA.
또한, 본 발명은 상기 가이드 RNA 벡터; 및In addition, the present invention is the guide RNA vector; and
Cas9(CRISPR associated protein 9) 핵산분해효소를 포함하는, 생체시계 교란 유도용 CRISPR/Cas9 복합체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.Another object of the present invention is to provide a CRISPR/Cas9 complex for inducing circadian clock disturbance, including a CRISPR associated protein 9 (Cas9) nuclease.
또한, 본 발명은 상기 CRISPR/Cas9 복합체를 유효성분으로 포함하는, 생체시계 교란 유도용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.Another object of the present invention is to provide a composition for inducing circadian clock disturbance, comprising the CRISPR/Cas9 complex as an active ingredient.
또한, 본 발명은 야생형의 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus)에서 생체시계 관련 유전자가 녹아웃된 생체시계 교란 유도된 동물 모델을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.Another object of the present invention is to provide an animal model in which a biological clock-related gene is knocked out in a wild-type suprachiasmatic nucleus.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 생체시계 교정 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.In addition, it is another object of the present invention to provide a screening method for a biological clock correcting material, comprising the following steps.
(a) 상기 생체시계 교란 유도된 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및(a) treating the candidate material in the circadian clock disturbance-induced animal model; and
(b) 후보물질이 처리된 생체시계 교란 유도된 동물모델을 무처리 대조군과 비교하여 주기적 특성의 회복 여부를 확인하는 단계.(b) comparing the circadian clock disturbance-induced animal model treated with the candidate substance with the untreated control group to determine whether the periodic characteristics are restored.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열로 이루어진, 생체시계 관련 유전자를 표적하는, 가이드 RNA(guide RNA)를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention consists of a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, targeting a biological clock-related gene, guide RNA (guide RNA) ) is provided.
본 발명의 일구현예로, 상기 생체시계 관련 유전자는 Cry1(Cryptochrome Circadian Regulator 1) 또는 Cry2(Cryptochrome Circadian Regulator 2)일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the biological clock-related gene may be Cry1 (Cryptochrome Circadian Regulator 1) or Cry2 (Cryptochrome Circadian Regulator 2).
본 발명의 다른 구현예로, 상기 서열번호 1로 이루어진 가이드 RNA는 Cry1 유전자를 표적하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the guide RNA consisting of SEQ ID NO: 1 may target the Cry1 gene.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 서열번호 2 또는 3으로 이루어진 가이드 RNA는 Cry2 유전자를 표적하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the guide RNA consisting of SEQ ID NO: 2 or 3 may target the Cry2 gene.
또한, 본 발명은 상기 가이드 RNA를 포함하는, 생체시계 관련 유전자를 표적하는 재조합 가이드 RNA 벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a recombinant guide RNA vector for targeting a biological clock-related gene, including the guide RNA.
본 발명의 일구현예로, 상기 생체시계 관련 유전자는 Cry1(Cryptochrome Circadian Regulator 1) 또는 Cry2(Cryptochrome Circadian Regulator 2)일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the biological clock-related gene may be Cry1 (Cryptochrome Circadian Regulator 1) or Cry2 (Cryptochrome Circadian Regulator 2).
본 발명의 다른 구현예로, 상기 벡터는 아데노연관바이러스(Adeno-associated virus; AAV) 벡터일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the vector may be an adeno-associated virus (AAV) vector.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 가이드 RNA 벡터는 Cry1 및 Cry2를 동시에 표적할 수 있다.In another embodiment of the present invention, the guide RNA vector may simultaneously target Cry1 and Cry2.
또한, 본 발명은 상기 가이드 RNA 벡터; 및In addition, the present invention is the guide RNA vector; and
Cas9(CRISPR associated protein 9) 핵산분해효소를 포함하는, 생체시계 교란 유도용 CRISPR/Cas9 복합체를 제공한다.Provided is a CRISPR/Cas9 complex for inducing circadian clock disturbance, comprising a CRISPR associated protein 9 (Cas9) nuclease.
또한, 본 발명은 상기 CRISPR/Cas9 복합체를 유효성분으로 포함하는, 생체시계 교란 유도용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for inducing circadian clock disturbance, comprising the CRISPR/Cas9 complex as an active ingredient.
또한, 본 발명은 야생형의 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus)에서 생체시계 관련 유전자가 녹아웃된 생체시계 교란 유도된 동물 모델을 제공한다.In addition, the present invention provides an animal model in which a biological clock-related gene is knocked out in a wild-type suprachiasmatic nucleus.
본 발명의 일구현예로, 상기 생체시계 관련 유전자는 Cry1(Cryptochrome Circadian Regulator 1) 또는 Cry2(Cryptochrome Circadian Regulator 2) 일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the biological clock-related gene may be Cry1 (Cryptochrome Circadian Regulator 1) or Cry2 (Cryptochrome Circadian Regulator 2).
본 발명의 다른 구현예로, 상기 생체시계 교란 유도된 동물 모델은 생체시계 관련 유전자가 발현하는 단백질의 수준이 감소하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the biological clock disturbance-induced animal model may be one in which the level of a protein expressed by a biological clock-related gene is reduced.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 생체시계 교정 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a screening method for a biological clock correction material comprising the following steps.
(a) 상기 생체시계 교란 유도된 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및(a) treating the candidate material in the circadian clock disturbance-induced animal model; and
(b) 후보물질이 처리된 생체시계 교란 유도된 동물모델을 무처리 대조군과 비교하여 주기적 특성의 회복 여부를 확인하는 단계.(b) comparing the circadian clock disturbance-induced animal model treated with the candidate substance with the untreated control group to determine whether the periodic characteristics are restored.
본 발명은 생체시계 관련 유전자를 대상으로 하는 직접 설계한 sgRNA를 활용하는 CRISPR/Cas9 기법을 활용하는 경우 생체시계의 교란을 위해 필요한 유전자를 동시에 적중함으로써 효과적으로 생체시계를 교란시킬 수 있음을 확인하였는바, 생체시계를 위한 임상적 연구 등에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. In the present invention, when using the CRISPR/Cas9 technique that utilizes a sgRNA designed directly for a biological clock-related gene, it was confirmed that the biological clock can be effectively disturbed by simultaneously hitting the genes necessary for the disruption of the biological clock. , is expected to be usefully used in clinical research for biological clocks.
단, 본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.However, the effect of the present invention is not limited to the above effect, and it should be understood to include all effects that can be inferred from the configuration of the invention described in the detailed description or claims of the present invention.
도 1은 설계한 본 발명의 sgRNA에 대한 것으로서, 도 1a는 CHOPCHOP을 활용한 sgRNA 제작 모식도를 나타낸 것이고, 도 1b는 설계한 sgRNA를 U6 프로모터 구동 벡터에 클로닝한 모식도이며, 도 1c는 도 1b에서 제작한 벡터를 투여한 다음, mutation mismatch cleavage assay를 수행한 결과이다.
도 2는 본 발명의 sgRNA를 2종 이상 클로닝한 벡터에 대한 것으로서, 도 2a는 3가지의 sgRNA가 클로닝된 벡터의 모식도를 나타낸 것이고, 도 2b는 Cry1 또는 Cry2를 표적하는 상이한 sgRNA를 탑재한 벡터를 처리했을 때, 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 sgRNA를 포함하는 AAV 벡터가 시교차상핵에 미치는 영향을 루시퍼레이즈 리포터를 이용한 생체발광량으로 확인한 결과로서, 도 3a는 생체발광량 측정을 위한 실험 계획이고, 도 3b는 AAV를 투여한 다음 DAPI 염색을 통해 sgRNA의 수준을 확인한 결과이며, 도 3c(sgLacZ 투여군, 대조군) 및 도 3d(CSAC-Crys 투여군)는 각각의 AAV를 투여한 다음, 생체발광량을 확인한 결과이고, 도 3e는 확인한 생체발광 패턴의 진폭을 나타낸 결과이며, 도 3f는 확인한 생체발광 패턴의 강인성을 나타낸 결과이고, 도 3g는 확인한 생체발광의 주기를 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명의 sgRNA를 포함하는 AAV 벡터를 시교차상핵에 투여한 결과로서, 도 4a는 시교차상핵에 AAV 벡터를 투여하는 모식도이고, 도 4b는 DAPI 염색을 통해 AAV 벡터가 잘 투여되었는지 확인한 결과이며, 도 4c(대조군) 및 도 4d(CSAC-Crys 투여군)는 AAV 투여에 따른 감염 부위를 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명의 sgRNA를 포함하는 AAV 벡터를 시교차상핵에 주입한 마우스의 일반운동활동을 확인한 결과로서, 도 5a(대조군) 및 도 5b(CSAC-Crys 투여군)는 명, 암 조건에 따른 일반운동활성을 관찰한 결과이며, 도 5c(대조군) 및 도 5d(CSAC-Crys 투여군)는 상기에서 얻은 일반운동활동 데이터에 카이-제곱 주기도 분석을 수행한 결과이다.
도 6은 본 발명의 sgRNA를 포함하는 AAV 벡터를 시교차상핵에 주입한 마우스의 온도를 확인한 결과로서, 도 6a(대조군) 및 도 6b(CSAC-Crys 투여군)는 명, 암 조건에 따른 온도를 관찰한 결과이며, 도 6c(대조군) 및 도 6d(CSAC-Crys 투여군)는 상기에서 얻은 온도 데이터에 카이-제곱 주기도 분석을 수행한 결과이다.
도 7은 상기 도 5 및 도 6에서 얻은 운동활동 및 온도 데이터의 평균값을 나타낸 결과로서, 도 7a는 명, 암 조건에서 운동활동의 평균값을 나타낸 결과이고, 도 7b는 명, 암 조건에서 온도의 평균값을 나타낸 결과이며, 도 7c는 일정한 암 조건에서 운동활동의 평균값을 나타낸 결과이고, 도 7d는 일정한 암 조건에서 온도의 평균값을 나타낸 결과이다.Figure 1 is for the designed sgRNA of the present invention, Figure 1a shows a schematic diagram of sgRNA production utilizing CHOPCHOP, Figure 1b is a schematic diagram of cloning the designed sgRNA into a U6 promoter driving vector, Figure 1c is in Figure 1b After administration of the prepared vector, it is the result of performing a mutation mismatch cleavage assay.
2 is a vector cloned of two or more types of sgRNA of the present invention, FIG. 2a is a schematic diagram of a vector into which three types of sgRNA are cloned, and FIG. 2b is a vector loaded with different sgRNAs targeting Cry1 or Cry2 It is the result of confirming the change in protein expression when treated.
Figure 3 is the result of confirming the effect of the AAV vector containing the sgRNA of the present invention on the suprachiasmatic nucleus using a luciferase reporter, Figure 3a is an experimental plan for measuring the amount of bioluminescence, Figure 3b is AAV administration Then, it is a result of confirming the level of sgRNA through DAPI staining, and FIGS. 3c (sgLacZ administration group, control group) and FIG. 3d (CSAC-Crys administration group) are the results of checking the amount of bioluminescence after administration of each AAV, FIG. 3e is It is a result showing the amplitude of the confirmed bioluminescence pattern, FIG. 3f is a result showing the robustness of the confirmed bioluminescence pattern, and FIG. 3g is a result showing the confirmed cycle of bioluminescence.
Figure 4 is the result of administering the AAV vector containing the sgRNA of the present invention to the suprachiasmatic nucleus, Figure 4a is a schematic diagram of administering the AAV vector to the suprachiasmatic nucleus, Figure 4b is the AAV vector was well administered through DAPI staining 4c (control group) and 4d (CSAC-Crys administration group) are results showing the infection site according to AAV administration.
5 is a result of confirming the general motor activity of mice injected with the AAV vector containing the sgRNA of the present invention into the suprachiasmatic nucleus. It is the result of observing general motor activity, and FIGS. 5c (control group) and FIG. 5d (CSAC-Crys administration group) are results of performing chi-square periodogram analysis on the general motor activity data obtained above.
Figure 6 is the result of confirming the temperature of mice injected with the AAV vector containing the sgRNA of the present invention into the suprachiasmatic nucleus. 6c (control group) and FIG. 6d (CSAC-Crys administration group) are results of observation, and chi-square periodogram analysis is performed on the temperature data obtained above.
7 is a result showing the average value of the exercise activity and temperature data obtained in FIGS. 5 and 6, FIG. 7a is a result showing the average value of the exercise activity in light and dark conditions, and FIG. 7b is the result of temperature in light and dark conditions. Results showing the average value, FIG. 7c is a result showing the average value of exercise activity under a constant dark condition, and FIG. 7d is a result showing the average value of the temperature under a constant dark condition.
본 발명자들은 생체시계 관련 유전자를 대상으로 하는 직접 설계한 sgRNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템을 활용하여 유전자를 조작하는 경우 생체시계의 교란을 위해 필요한 유전자를 동시에 적중함으로써 효과적으로 생체시계를 교란시킬 수 있음을 확인 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하게 되었다.When the present inventors manipulate genes using the CRISPR/Cas9 system including a sgRNA designed directly for a biological clock-related gene, it is possible to effectively disturb the biological clock by simultaneously hitting the genes necessary for the disruption of the biological clock. was confirmed, thereby completing the present invention.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
이에, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열로 이루어진, 생체시계 관련 유전자를 표적하는, 가이드 RNA(guide RNA)를 제공한다.Accordingly, the present invention provides a guide RNA, which targets a biological clock-related gene, consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
본 발명에서 사용되는 용어, "가이드 RNA(guide RNA; gRNA)"란 편집하고자 하는 표적하는 특정 DNA의 위치를 찾아내어 Cas 단백질을 표적 DNA로 인도하는 역할을 하는 단일 가닥의 RNA로서, 상기 가이드 RNA는 PAM(protospacer adjacent motif) 자리와 인접하며, 편집하려는 DNA의 10~25bp의 염기 서열과 상보적인 서열을 포함하는 것일 수 있다.As used herein, the term “guide RNA (gRNA)” refers to a single-stranded RNA that serves to guide a Cas protein to a target DNA by locating a specific target DNA to be edited, and the guide RNA is adjacent to the PAM (protospacer adjacent motif) site, and may include a sequence complementary to a nucleotide sequence of 10 to 25 bp of the DNA to be edited.
상기 생체시계 관련 유전자는 Cry1(Cryptochrome Circadian Regulator 1) 또는 Cry2(Cryptochrome Circadian Regulator 2)일 수 있다.The biological clock-related gene may be Cry1 (Cryptochrome Circadian Regulator 1) or Cry2 (Cryptochrome Circadian Regulator 2).
본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 상기 생체시계 관련 유전자를 표적하는 것으로 보다 구체적으로, 서열번호 1로 이루어진 가이드 RNA는 Cry1 유전자를 표적하는 것일 수 있으며, 상기 서열번호 2 또는 3으로 이루어진 가이드 RNA는 Cry2 유전자를 표적하는 것일 수 있다.In the present invention, the guide RNA targets the biological clock-related gene. More specifically, the guide RNA consisting of SEQ ID NO: 1 may target the Cry1 gene, and the guide RNA consisting of SEQ ID NO: 2 or 3 is Cry2 It may be targeting a gene.
본 발명에 있어서, 상기 Cry1 유전자를 표적하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 이 때 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.In the present invention, the polynucleotide targeting the Cry1 gene may consist of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, in which case, 70% or more, preferably 80% or more, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 , more preferably 90% or more, most preferably 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more of a nucleotide sequence having sequence homology.
본 발명에 있어서, 상기 Cry2 유전자를 표적하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 이 때 상기 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.In the present invention, the polynucleotide targeting the Cry2 gene may consist of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, wherein 70% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3, Preferably, it may include a nucleotide sequence having sequence homology of 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 가이드 RNA를 포함하는, 생체시계 관련 유전자를 표적하는 재조합 가이드 RNA 벡터를 제공한다.In addition, as another aspect of the present invention, the present invention provides a recombinant guide RNA vector for targeting a biological clock-related gene, including the guide RNA.
본 발명에서 사용되는 용어, "벡터(vector)"란 목적하는 DNA 단편을 숙주 세포에 도입시켜 증식할 수 있는 DNA로써 클로닝 운반체(cloning vehicle)라고도 한다. "발현 벡터"는 목적하는 코딩서열과, 특정 숙주생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 본 발명에서 상기 벡터는 발현벡터와 동일한 의미로 사용될 수 있다.As used herein, the term "vector" refers to DNA that can be propagated by introducing a desired DNA fragment into a host cell, and is also referred to as a cloning vehicle. "Expression vector" means a recombinant DNA molecule comprising a desired coding sequence and an appropriate nucleic acid sequence essential for expressing a coding sequence operably linked in a particular host organism. In the present invention, the vector may be used in the same sense as the expression vector.
본 발명에 있어서, 상기 벡터는 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터 등의 다른 형태의 발현 벡터를 이용할 수 있고, 바람직하게는 아데노-연관 바이러스 벡터를 이용할 수 있다.In the present invention, the vector is a viral vector providing equivalent functions, such as an adeno-associated virus (AAV) vector, an adenoviral vector, a herpes virus vector, a retroviral vector, a lentiviral vector, a vacciniavirus vector, a poxvirus vector. , it is possible to use other types of expression vectors, such as herpes simplex virus vector, preferably an adeno-associated viral vector.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 가이드 RNA 벡터; 및 Cas9(CRISPR associated protein 9) 핵산분해효소를 포함하는, 생체시계 교란 유도용 CRISPR/Cas9 복합체를 제공한다.In addition, as another aspect of the present invention, the present invention is the guide RNA vector; and Cas9 (CRISPR associated protein 9) nuclease, it provides a CRISPR/Cas9 complex for inducing circadian clock disturbance.
본 발명에 있어서 사용되는 용어, "생체시계(Circadian clock)"란 식물, 동물, 균루, 박테리아 등을 포함하는 지구상의 생명체들에서 생화학적, 생리학적 또는 행동학적 흐름이 거의 24시간의 주기에 따라 나타나는 현상을 의미한다.As used in the present invention, the term "circadian clock" means that biochemical, physiological or behavioral flows in living things on earth, including plants, animals, fungi, bacteria, etc., follow a cycle of almost 24 hours. phenomenon that appears.
본 발명에서 사용되는 용어, "생체시계 교란"이란 교대근무 수면 손실 등의 이유로 인해 생체시계에 따른 주기적인 특성(주기에 따른 활동 및 온도의 변화)이 망가진 상태를 의미한다.As used herein, the term “biological clock disturbance” refers to a state in which periodic characteristics (change in activity and temperature according to cycle) according to the biological clock are damaged due to reasons such as shift work sleep loss.
본 발명에서, 상기 "Cas9"이란 "CRISPR-Cas9"을 지칭하며, CRISPR-Cas9는 3세대 유전자가위로써 이용하고자 하는 특정 염기서열을 인식하여 절단하고 편집하며, 게놈의 목적 장소에 특정 유전자를 삽입하거나 특정 유전자의 활동을 정지시키는 조작을 간단하고 신속하고 효율성 있게 실시하는데 유용하다.In the present invention, the term "Cas9" refers to "CRISPR-Cas9", and CRISPR-Cas9 recognizes, cuts, and edits a specific nucleotide sequence to be used as a third-generation gene scissors, and inserts a specific gene into the target site of the genome It is useful for simple, quick and efficient operation of stopping the activity of a specific gene.
Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, Cas9 단백질은 그 목적에 따라 당업자가 추가적인 도메인을 적절하게 연결할 수 있다. Cas9 protein or gene information may be obtained from a known database such as GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI), but is not limited thereto. In addition, according to the purpose of the Cas9 protein, a person skilled in the art can appropriately link additional domains.
본 발명에 있어서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9 뿐만아니라, 유전자 편집을 위한 핵산분해효소의 기능을 갖는 것이라면 Cas9의 변이체를 모두 포함할 수 있다.In the present invention, the Cas9 protein may include all variants of Cas9 as long as it has the function of a nuclease for gene editing as well as wild-type Cas9.
또한, 본 발명에서 Cas9 단백질은 그 유래가 제한되지 않으며, 비제한적인 예시로써 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 리스테리아 이노큐아(Listeria innocua), 또는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 유래일 수 있고, 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있다.In addition, the Cas9 protein in the present invention is not limited in its origin, and as non-limiting examples, Streptococcus pyogenes, Francisella novicida, Streptococcus thermophilus, Legionella It may be derived from Legionella pneumophila, Listeria innocua, or Streptococcus mutans, and those skilled in the art may appropriately select and use it.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 CRISPR/Cas9 복합체를 유효성분으로 포함하는, 생체시계 교란 유도용 조성물을 제공한다.In addition, as another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for inducing circadian clock disturbance, comprising the CRISPR/Cas9 complex as an active ingredient.
본 발명에서 사용되는 용어, "유전자의 발현 억제"는 유전자의 발현을 감소시키는 모든 행위를 의미하며, 구체적으로 유전자 넉아웃(knock-out), 넉다운(knock-down), 유전자 DNA 서열에 결실, 중복, 역위, 또는 교체 등의 변이를 도입함으로써 이루어질 수 있다.As used herein, the term "suppression of gene expression" refers to any action that reduces gene expression, specifically gene knock-out, knock-down, deletion in gene DNA sequence, This can be done by introducing mutations such as duplication, inversion, or substitution.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에서 직접설계한 sgRNA를 활용한 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 경우 생체시계 관련 유전자를 동시에 녹아웃 함으로써 효율적으로 생체시계를 교란할 수 있다는 사실을 확인하였다.The present inventors confirmed the fact that the biological clock can be efficiently disturbed by simultaneously knocking out biological clock-related genes when using the CRISPR/Cas9 system using the sgRNA designed in the present invention through specific examples.
본 발명의 일실시예에서는, 직접 설계하여 제작한 본 발명의 sgRNA가 생체시계 관련 유전자인 Cry1, Cry2의 발현을 효과적으로 억제한다는 사실을 확인하였다(실시예 2 참조).In one embodiment of the present invention, it was confirmed that the sgRNA of the present invention directly designed and manufactured effectively inhibits the expression of Cry1 and Cry2, which are biological clock-related genes (see Example 2).
본 발명의 다른 실시예에서는, 시교차상핵 부위에 본 발명의 sgRNA를 포함하는 바이러스 벡터를 투여한 다음, 주기적인 특성인 활동 및 온도 변화를 관찰한 결과, 대조군에 비해 본 발명의 sgRNA를 포함하는 바이러스를 투여한 마우스에서 생체시계의 교란이 일어남을 확인하였다(실시예 4 참조).In another embodiment of the present invention, after administration of the viral vector containing the sgRNA of the present invention to the suprachiasmatic nucleus region, periodic characteristics such as activity and temperature change were observed. As a result, compared to the control group, It was confirmed that disturbance of the biological clock occurred in mice administered with the virus (see Example 4).
상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 sgRNA를 포함하는 바이러스 벡터가 효과적으로 생체시계 관련 유전자를 녹아웃하여 생체시계를 교란시킬 수 있다는 사실을 확인하였다.Through the above results, the present inventors confirmed the fact that the viral vector containing the sgRNA of the present invention can disrupt the biological clock by effectively knocking out biological clock-related genes.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 야생형의 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus)에서 생체시계 관련 유전자가 녹아웃된 생체시계 교란 유도된 동물 모델을 제공한다. In addition, as another aspect of the present invention, the present invention provides an animal model induced by circadian clock disturbance in which a circadian clock-related gene is knocked out in a wild-type suprachiasmatic nucleus.
본 발명에 있어서, 상기 생체시계 교란 유도된 동물 모델은 상기 생체시계 관련 유전자가 발현하는 단백질의 수준이 감소된 것일 수 있다.In the present invention, the biological clock disturbance-induced animal model may have a reduced level of protein expressed by the biological clock-related gene.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 생체시계 교정 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, as another aspect of the present invention, the present invention provides a method for screening a biological clock correcting material, comprising the following steps.
(a) 상기 생체시계 교란 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및(a) processing the candidate material in the biological clock disturbance animal model; and
(b) 후보물질이 처리된 생체시계 교란 동물모델을 무처리 대조군과 비교하여 생체 주기적 특성의 회복 여부를 확인하는 단계.(b) Comparing the biological clock disturbance animal model treated with the candidate substance with the untreated control group, and confirming whether the biological cycle characteristics are restored.
본 발명에서 사용되는 용어 "생체 주기적 특성"은 약 24시간이 경과하면서 발생하는 명 및 암조건의 변화에 의한 활동 수준 및 체내 온도의 주기적 변화를 의미한다.As used herein, the term "biological characteristics" refers to periodic changes in activity level and body temperature due to changes in light and dark conditions that occur over about 24 hours.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to help the understanding of the present invention. However, the following examples are only provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
[실시예][Example]
실시예 1. 실험준비 및 방법Example 1. Experimental preparation and method
1-1. 동물모델 및 시약의 준비1-1. Preparation of animal models and reagents
본 발명에 사용된 모든 마우스들은 표준 마우스 케이지(16 x 36 x 12.5 cm)에서 태어났으며, 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 환경에서 사육하였다. 마우스들은 3-4 주에 젖을 뗀 다음, 22 ± 1℃의 온도에서 12시간의 암/명 주기로 케이지 당 최대 4마리의 동성 마우스와 함께 사육하였고, 모든 절차는 대구경북과학기술원(Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology, DGIST)의 동물 관리 및 이용위원회의 승인을 받아 수행되었다. 상기 마우스 중, PER2::LUC knock-in 마우스는 Joseph Takahashi(Proc. Natl. Acad.Sci. USA 101, 5339-5346 (2004))에게 제공받았으며, Cas9-expressing 마우스는 Feng Zhang(Cell 159, 440-455 (2014))에게 제공받아 사용하였다.All mice used in the present invention were born in standard mouse cages (16 x 36 x 12.5 cm) and were bred in an environment with free access to food and water. Mice were weaned at 3-4 weeks and then bred with up to 4 same-sex mice per cage at a temperature of 22 ± 1 °C with a dark/light cycle of 12 hours, and all procedures were performed at the Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology (Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology). It was performed with the approval of the Animal Care and Use Committee of Science and Technology, DGIST). Among the mice, PER2::LUC knock-in mice were provided by Joseph Takahashi (Proc. Natl. Acad.Sci. USA 101, 5339-5346 (2004)), and Cas9-expressing mice were Feng Zhang (Cell 159, 440). -455 (2014)) was provided and used.
1-2. 세포의 준비1-2. Preparation of cells
본 발명에 사용된 세포들은 기존에 알려진 방법에서 약간의 변형(Mol. Cells 42, 418-425 (2019))된 방식으로 배양하였다. Neuro2a 및 Neuro2a Cas9-GFP-Hygorres (CSC-RO0033, Genecopeoia, Rockville, MD, USA) 세포는 1Х 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)(Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany), 10mg/mL의 하이그로마이신(hygromycin)(H-34274, Merck Millipore, Burlington, MA, USA) 및 10 %의 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) (Hyclone)을 포함하고 있는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium (Hyclone, Chicago, IL, USA)) 배지에서 37℃의 온도와 5%의 CO2 조건에서 배양하였다.The cells used in the present invention were cultured in a manner slightly modified from previously known methods (Mol. Cells 42, 418-425 (2019)). Neuro2a and Neuro2a Cas9-GFP-Hygor res (CSC-RO0033, Genecopeoia, Rockville, MD, USA) cells were treated with 1Х penicillin/streptomycin (Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany) at 10 mg/mL hygro. DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium (Hyclone, Chicago, IL, USA)) cultured in the medium at 37° C. and 5% CO 2 conditions.
Cas9:EGFP를 안정적으로 발현하는 Neuro2a 세포(이하, Neuro2a-Cas9)는 형질주입(transfection) 시약인 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000) (#11668019, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)을 제조사의 지침(Cosmo Genetech, Seoul, South Korea)에 맞게 활용하여 pAAV-U6-sgCRY-hSyn-mCherry, 또는 pAAV-U6-sgLacZ-hSyn-mCherry로 형질주입 하였고, 돌연변이 여부는 제조사(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA)의 지침에 따른 Surveyor 돌연변이 분석을 수행하여 확인하였다.Neuro2a cells stably expressing Cas9:EGFP (hereinafter, Neuro2a-Cas9) were prepared using the transfection reagent Lipofectamine 2000 (#11668019, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) according to the manufacturer's instructions. (Cosmo Genetech, Seoul, South Korea) was used and transfected with pAAV-U6-sgCRY-hSyn-mCherry, or pAAV-U6-sgLacZ-hSyn-mCherry, and the mutation was checked by the manufacturer (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). , USA) was confirmed by performing Surveyor mutation analysis according to the guidelines.
1-3. 플라스미드 및 AAV 바이러스의 준비1-3. Preparation of Plasmids and AAV Viruses
sgRNA의 DNA 올리고머는 CRISPR-Cas9의 위치 선택 알고리즘인 CHOPCHOP(Nucleic Acids Res. 42,W401-407; 10.1093/nar/gku410 (2014))과 클로닝용 어댑터를 함께 사용하여 Bionics(Seoul, South Korea)에서 상업적으로 제작한 것을 사용하였고, 어닐링을 수행한 다음, sgRNA를 포함하는 DNA 단편을 sgRNA 발현 벡터인 pAAV-hU6-gRNA-hSyn-mCherry-KASH에 클로닝 하였다. 플라스미드의 서열은 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)(Macrogen, Seoul, South Korea)을 수행하였다.The DNA oligomer of sgRNA was prepared in Bionics (Seoul, South Korea) using the CRISPR-Cas9 position selection algorithm CHOPCHOP (Nucleic Acids Res. 42,W401-407; 10.1093/nar/gku410 (2014)) and an adapter for cloning. A commercially produced one was used, and after performing annealing, the DNA fragment containing the sgRNA was cloned into an sgRNA expression vector, pAAV-hU6-gRNA-hSyn-mCherry-KASH. The sequence of the plasmid was performed by Sanger sequencing (Macrogen, Seoul, South Korea).
본 발명에서 사용된 AAV는 삼중 형질감염(triple transfection) 방법을 사용하여 제작하였고, 이렇게 제작된 AAV를 요오딕사놀(iodixanol) 구배 방법(Nat. Protoc. 1, 1412-1428 (2006))을 활용하여 수득하였다. 모든 AAV 벡터들을 종이에 처리한 다음, qPCR로 정량화한 결과, 1012 내지 1013 viral genome copies/milliliter(GC/mL) 수준(AAV-DJ-hU6-sgLacZ-hSyn-mCherry-KASH 1.8 Х 1013 GC/mL; AAV-DJ-CSAC-Crys-hSyn-mCherry-KASH 1.1 Х 1013 GC/mL)으로 정제된 것을 확인할 수 있었다.The AAV used in the present invention was prepared using a triple transfection method, and the thus-produced AAV was used in an iodixanol gradient method (Nat. Protoc. 1, 1412-1428 (2006)). was obtained. All AAV vectors were processed on paper and quantified by qPCR. As a result, 10 12 to 10 13 viral genome copies/milliliter (GC/mL) level (AAV-DJ-hU6-sgLacZ-hSyn-mCherry-KASH 1.8 Х 10 13 GC/mL; AAV-DJ-CSAC-Crys-hSyn-mCherry-KASH 1.1 Х 10 13 GC/mL) was confirmed to be purified.
1-4. 통계 분석1-4. statistical analysis
카이-제곱 주기도(Chi-square periodogram) 분석은 기존에 알려진 R(R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.)의 xsp 패키지를 활용하여 수행하였고, Real time bioluminescence는 cosinor 절차(Chronobiologia 6, 305-323 (1979) 및 Biol. Rhythm Res. 38, 275-325; 10.1080/09291010600903692 (2007))로 수행하였다.Chi-square periodogram analysis was performed using the previously known xsp package of R (R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.). , Real time bioluminescence was performed by cosinor procedures (
실시예 2. 생체시계(circadian clock)의 조절을 위한 조성물의 제작Example 2. Preparation of a composition for regulation of the circadian clock
2-1. 생체시계 관련 유전자 조절을 위한 sgRNA의 설계2-1. Design of sgRNA for regulation of circadian clock-related genes
생체시계의 필수적인 분자 구성을 knock-out할 수 있는 sgRNA를 설계하기 위해 CHOPCHOP을 활용하여 생체시계관련 핵심인자로 알려진 유전자(Cry1, Cry2)를 타겟팅할 수 있는 sgRNA를 예측해본 다음, 격자이동 넌센스(Frame shift-mediated nonsense) 돌연변이를 극대화 할 수 있도록 도 1a에 나타낸 바와 같이, 초기 엑손을 표적으로 하는 3가지의 sgRNA를 선택하여 설계하였다.To design an sgRNA that can knock-out the essential molecular composition of the circadian clock, we used CHOPCHOP to predict sgRNA that can target genes (Cry1, Cry2) known as key factors related to circadian clock, and then use the lattice shift nonsense ( Frame shift-mediated nonsense) to maximize mutation, as shown in FIG. 1a, three sgRNAs targeting the initial exon were selected and designed.
상기 3가지 sgRNA를 U6 프로모터 구동 sgRNA 발현 벡터에 클로닝 한 다음(도 1b), 돌연변이 유도 효율을 평가하였으며 각각의 sgRNA를 SpCas9 발현 플라스미드를 활용하여 Neuro2a 신경모세포종 세포주를 형질감염 시켰다. 세포주에서 DNA를 추출해낸 다음, Surveyor nuclease mismatch cleavage assay를 활용하여 DNA의 돌연변이율을 확인하였다. 그 결과, 도 1c에 화살표로 표시한 바와 같이, Cry1(sgCry1)을 표적으로 하는 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 Neuro2a 세포의 게놈 DNA는 상기 분석에서 모두 절단된 DNA 밴드를 생성하는 것을 확인할 수 있었다. Cry2(sgCry2)를 표적으로 하는 그룹에서도 절단이 일어나는 것을 확인할 수 있었으나, Cry1을 표적으로 하는 sgRNA를 사용한 그룹만큼 많은 절단은 관찰할 수 없었다.The three sgRNAs were cloned into a U6 promoter-driven sgRNA expression vector (FIG. 1b), mutagenesis efficiency was evaluated, and the Neuro2a neuroblastoma cell line was transfected with each sgRNA using an SpCas9 expression plasmid. After DNA was extracted from the cell line, the DNA mutation rate was confirmed using Surveyor nuclease mismatch cleavage assay. As a result, as indicated by the arrow in FIG. 1C , it was confirmed that the genomic DNA of Neuro2a cells transfected with a plasmid expressing sgRNA targeting Cry1 (sgCry1) produced a cleaved DNA band in the above analysis. . It was confirmed that cleavage occurred in the group targeting Cry2 (sgCry2), but as many cleavage as the group using sgRNA targeting Cry1 could not be observed.
단일 AAV는 최대 3개의 sgRNA 발현 카세트를 수용할 수 있기에 Cry1과 Cry2를 동시에 녹아웃 할 수 있도록 강한 돌연변이 유도 효율을 가지는 Cry1 타겟팅 sgRNA(sgCry1-2)와 중간 수준의 돌연변이 유도 효율을 가지는 Cry2(sgCry2-1 및 sgCry2-2)를 타겟으로 하는 sgRNA를 활용하여 AAV를 제작하였다. 본 발명에서 활용된 sgRNA의 구조는 하기 표 1에 나타내었다.Since a single AAV can accommodate up to three sgRNA expression cassettes, the Cry1-targeting sgRNA (sgCry1-2) with strong mutagenesis efficiency to simultaneously knockout both Cry1 and Cry2 (sgCry1-2) and Cry2 (sgCry2-) with an
2-2. 제작한 sgRNA의 단백질 발현 조절 효과 확인2-2. Confirmation of the effect of regulating protein expression of the produced sgRNA
상기 실시예 2-1에서 제작한 sgRNA 및 이를 탑재한 AAV의 단백질 발현 조절 효과를 확인하기 위해 Neuro2a-Cas9에 도 2a에 표시된 카세트를 포함하는 플라스미드로 형질감염 시킨 다음, 세포에서 단백질 추출물을 분리하였고, 이렇게 분리해낸 단백질 수준을 측정하기 위해, 세포들을 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline)로 2회 세척한 다음, 방사선 면역침전 분석(radioimmunoprecipitation assay(RIPA) 버퍼(#9806, Cell Signaling, Danvers, MA, USA))에 초음파 처리(sonication)를 수행하여 용해시키고, 얼음에서 30분동안 배양하였다. 이렇게 수득한 용해물은 Laemmli 샘플 버퍼(#NP0007, Invitrogen, Waltham, MA, USA)에서 5분 끓인 다음 원심분리하여 상청액을 수득하였다.In order to confirm the effect of regulating the protein expression of the sgRNA prepared in Example 2-1 and the AAV loaded therewith, Neuro2a-Cas9 was transfected with a plasmid containing the cassette shown in FIG. 2a, and then the protein extract was isolated from the cells. , To measure the level of the isolated protein, the cells were washed twice with phosphate-buffered saline, followed by a radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (#9806, Cell Signaling, Danvers, MA). , USA)) was dissolved by sonication, and incubated on ice for 30 min. The lysate thus obtained was boiled in Laemmli sample buffer (#NP0007, Invitrogen, Waltham, MA, USA) for 5 minutes and then centrifuged to obtain a supernatant.
단백질은 4-15%의 트리스-글라이신(tris-glycine, TG) 젤(#45101080003-2, SMOBIO, Hsinchu, Taiwan)에서 분리한 다음, 트리스-글라이신 버퍼에서 폴리비닐리덴플루오라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF)막으로 전기전달(electro-transferred) 하였다. 막은 트윈-20(Tween-20, TTBS) 및 1%의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) 처리된 상기 버퍼에서 차단하였고, 밤새 트윈-20(Tween-20, TTBS) 및 1%의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)에서 4℃의 온도로 1차 항체인 Cry1(#AF3764-SP, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), Cry2(#HPA037577, Atlas Antibodies, Bromma, Sweden) 및 β-actin-HRP(#SC-47778, Santa Cruz, Dallas, TX, USA)와 함께 배양하였다. 2차 항체로는 Anti-Rabbit(SKU # 31460, Thermo Scientific) 또는 antigoat(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)를 사용하였고, 강화된 화학발광(Enhanced Chemiluminescence, ECL) 선택 용액(GE Healthcare)과 ECL Pico System(ECL-PS100, Dongin, Seoul, Korea)을 활용하여 단백질을 검출하였다.Proteins were separated on a 4-15% tris-glycine (TG) gel (#45101080003-2, SMOBIO, Hsinchu, Taiwan), followed by polyvinylidene fluoride (PVDF) in tris-glycine buffer. ) was electro-transferred to the membrane. Membranes were blocked in the buffer treated with Tween-20 (TTBS) and 1% bovine serum albumin (BSA), overnight with Tween-20 (TTBS) and 1% bovine serum albumin (BSA). Cry1 (#AF3764-SP, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), Cry2 (#HPA037577, Atlas Antibodies, Bromma, Sweden) and β- Incubated with actin-HRP (#SC-47778, Santa Cruz, Dallas, TX, USA). Anti-Rabbit (SKU # 31460, Thermo Scientific) or antigoat (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) was used as the secondary antibody, and enhanced chemiluminescence (ECL) selection solution (GE Healthcare) and Proteins were detected using the ECL Pico System (ECL-PS100, Dongin, Seoul, Korea).
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, sgCrys를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 Neuro2a-Cas9 세포의 Cry1 및 Cry2 단백질 수준은 대조군에 비해 현저하게 낮게 나타남을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 2b , it was confirmed that the Cry1 and Cry2 protein levels of Neuro2a-Cas9 cells transfected with a plasmid expressing sgCrys were significantly lower than those of the control group.
실시예 3. 본 발명 AAV 벡터 시스템의 생체시계 관련 인자 조절 효과 확인Example 3. Confirmation of the effect of regulating biological clock-related factors of the AAV vector system of the present invention
상기 실시예 2에서 제작한 다중 sgRNA를 탑재한 AAV 벡터 시스템(이하, CSAC)의 효과를 확인하기 위해, 상기 실시예 1-2에서 준비한 PER2 및 LUCIFERASE 융합 단백질 및 Cas9(PER2::LUC;Cas9)을 지속적으로 발현하는 시교차상핵 절편의 바이오형광 진동(oscillation of bioluminescence)을 확인하기 위해 도 3a에 나타낸 대로 실험을 설계하였다. 바이오형광 진동은 시교차상핵(Suprachiasmatic nucleus, SCN) 절편을 활용하여 수행하였고, 이때 시교차상핵 절편의 배양은 기존에 알려진 방식에서 약간 수정(Exp. Mol. Med. 52, 473-484 (2020))된 방법을 활용하여 준비하였다. 시교차상핵의 준비를 위해 1 주령된 mPer2::LUC; Cas9 마우스를 희생시킨 다음, 뇌를 신속하게 제거하여 얼음 위에서 식혔다. 0.01M HEPES와 36mM D-glucose가 보충된 Gey 's Balanced Salt Solution(GBSS)에 뇌를 적신 다음, 5 % CO2 및 95 % O2로 구성된 공기를 처리하였다. 뇌는 Leica VT1000 S vibratome(Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 400μm 두께의 조각으로 관상 절단하였으며, 절단된 슬라이스를 배양 삽입막(Millicell-CM; Millipore, Bedford, MA, USA)에 유지하였다가, 37℃의 배양 배지(50 % minimum essential medium, 25 % GBSS, 25 % horse serum, 36 mM glucose 및 1Х antibiotic-antimycotic)에 살짝 잠기게 하였다. In order to confirm the effect of the AAV vector system (hereinafter, CSAC) loaded with the multiple sgRNA prepared in Example 2, PER2 and LUCIFERASE fusion proteins and Cas9 (PER2::LUC;Cas9) prepared in Example 1-2 An experiment was designed as shown in FIG. 3a to confirm the oscillation of bioluminescence of the suprachiasmatic nucleus fragment continuously expressing . Biofluorescence vibration was performed using a suprachiasmatic nucleus (SCN) section, and the culture of the suprachiasmatic nucleus section was slightly modified from a previously known method (Exp. Mol. Med. 52, 473-484 (2020)). ) was prepared using the method. 1-week-old mPer2::LUC; Cas9 mice were sacrificed, then brains were quickly removed and cooled on ice. Brains were soaked in Gey's Balanced Salt Solution (GBSS) supplemented with 0.01M HEPES and 36mM D-glucose, and then treated with air composed of 5% CO 2 and 95% O 2 . The brain was coronal cut into 400 μm-thick pieces using a Leica VT1000 S vibratome (Leica, Wetzlar, Germany), and the cut slices were maintained in a culture insert (Millicell-CM; Millipore, Bedford, MA, USA). It was lightly immersed in a culture medium (50% minimum essential medium, 25% GBSS, 25% horse serum, 36 mM glucose and 1Х antibiotic-antimycotic) at 37°C.
상기와 같은 방식으로 준비된 시교차상핵 절편은 실험에 사용되기 전에 2주 이상 배양하였고, 생물발광을 정략적으로 측정하기 위해, 시교차상핵 절편을 36℃의 온도조건에서 0.3mM D-luciferin(Promega, Madison, WI, USA)을 포함하는 1mL 배양 배지를 넣은 35mm 페트리 접시에서 보관하였다. 빛 방출(Light emission)은 접시-타입 바퀴달린 발광계(luminometer)(AB-2550 Kronos-Dio; ATTO, Tokyo, Japan)를 사용하여 10분 간격으로 1분 동안 측정하였다. The suprachiasmatic nucleus sections prepared in the above manner were cultured for at least 2 weeks before being used in the experiment. Madison, WI, USA) was stored in a 35 mm Petri dish containing 1 mL culture medium. Light emission was measured at 10-minute intervals for 1 minute using a dish-type wheeled luminometer (AB-2550 Kronos-Dio; ATTO, Tokyo, Japan).
달리 언급이 없는 한, 절편 배양을 위해 사용된 모든 배양 배지 및 보충제는 Thermo-Fisher Scientific에서 구입한 것을 사용하였고, 시교차상핵 절편은 기존에 알려진 바(Neuroendocrinology, 10.1159/000505922 (2020))와 같이, 안정화한지 7일 후, 바이러스를 활용하여 형질 도입하였다. AAV 바이러스들을 상기 35mm 페트리접시에 있는 시교차상핵 절편의 표면에 직접 떨어뜨린 다음, 15일 배양하고, 세포의 생물 발광을 확인하였다.Unless otherwise noted, all culture media and supplements used for section culture were purchased from Thermo-Fisher Scientific, and supracruciate sections were previously known (Neuroendocrinology, 10.1159/000505922 (2020)). , 7 days after stabilization, the virus was used for transduction. AAV viruses were directly dropped on the surface of the suprachiasmatic nucleus section in the 35 mm Petri dish, and then cultured for 15 days, and cell bioluminescence was confirmed.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 시교차상핵 절편에서 sgRNA의 발현이 잘되고 있음을 알려주는 광범위한 형광을 확인할 수 있었다. 대조군인 sgLacZ를 발현하는 시교차상핵 외식편(explants)은 도 3c에 나타낸 바와 같이, PER2에 대해서 강력한 일주기 진동을 보여줌을 확인할 수 있었으나, 본 발명의 CSAC-Crys를 형질감염 시킨 그룹에서는 도 3d에 나타낸 바와 같이, PER2의 바이오형광 진동이 심하게 저해된 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in Figure 3b, it was possible to confirm a wide range of fluorescence indicating that the expression of sgRNA in the suprachiasmatic nucleus section is good. As shown in FIG. 3c , it was confirmed that the suprachiasmatic nucleus explants expressing sgLacZ as a control showed strong circadian oscillations for PER2, but in the group transfected with the CSAC-Crys of the present invention, FIG. 3d As shown in , it was confirmed that the biofluorescence vibration of PER2 was severely inhibited.
상기와 같은 결과가 본 발명의 CSAC의 시교차상핵 세포의 손상 또는 PER2 발현 조절 유전자의 억제에 기인한 것이 아닌, 생체시계를 조절한다는 사실을 명확히 하기 위해서 아데닐일 사이클레이스 활성화제(adenylyl cyclase activator)인 포스콜린(forskolin)을 처리하였다. 그 결과, 모든 그룹에서 포스콜린의 처리는 CSAC와 관계없이 PER2::LUC 발현을 강력하게 유도하는 것을 확인할 수 있었으며, PER2 :: LUC 진동을 통계적으로 분석해 보았을 때, 도 3e에 나타낸 바와 같이, CSAC-Crys가 PER2 :: LUC 진동의 진폭을 현저하게 억제하고, 도 3f에 나타낸 바와 같이, 강인성(robustness)도 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 다만, 진동 기간의 경우 도 3g에 나타낸 바와 같이, 유의한 변화가 발생하지 않음을 확인할 수 있었다.In order to clarify the fact that the above results are not due to damage to the suprachiasmatic cells of the CSAC of the present invention or inhibition of the PER2 expression regulatory gene, but to regulate the biological clock, an adenylyl cyclase activator Phosphorus forskolin was treated. As a result, it was confirmed that forskolin treatment in all groups strongly induced PER2::LUC expression regardless of CSAC, and when statistically analyzing PER2::LUC oscillations, as shown in FIG. 3e, CSAC -Crys remarkably suppressed the amplitude of PER2::LUC oscillation, and as shown in FIG. 3f, it was confirmed that it also suppressed robustness. However, in the case of the vibration period, as shown in FIG. 3G, it was confirmed that no significant change occurred.
본 발명자들은 상기와 같은 발견을 통해 본 발명의 CSAC가 생체 외(ex vivo) 분자 시계를 효과적으로 감쇠시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.The present inventors were able to confirm the fact that the CSAC of the present invention effectively attenuates the ex vivo molecular clock through the above findings.
실시예 4. 본 발명 AAV 벡터 시스템의 생체내 생체시계 조절 효과Example 4. In vivo biological clock regulation effect of the AAV vector system of the present invention
4-1. 본 발명 AAV 벡터 시스템의 생체 내 주입4-1. In vivo injection of the AAV vector system of the present invention
생체내의 CSAC의 효과를 확인하기 위해 마우스에 정위주입법(Stereotaxic injection)으로 CSAC를 주입하는 실험을 진행하였다. 수술은 무균기술을 활용하여 수행되었고, 구체적으로 케타민(ketamine, 100mg/kg)과 자일라이진(xylazine, 10mg/kg)을 사용하여 마취시킨 마우스를 정위 장치(stereotaxic apparatus, (RWD Life Science, Shenzhen, China))에 넣은 다음, Nanoliter 주입기 시스템(WPI, Sarasota, FL, USA)을 사용하여 0.1 μL/min의 속도로 AAV 시교차상핵 절편(AP(Anteroposterior) = -0.8 mm, ML(Mediolateral) = ±0.22 mm(bregma 기준), DV(Dorsoventral) = -5.85 mm(brain surface 기준))에 주입하였다(도 4a). In order to confirm the effect of CSAC in vivo, an experiment was conducted to inject CSAC into mice by stereotaxic injection. The surgery was performed using aseptic technique, and specifically, a stereotaxic apparatus, (RWD Life Science, Shenzhen), anesthetized mice using ketamine (100mg/kg) and xylazine (10mg/kg). , China)), and then section the AAV suprascapular nucleus (AP (Anteroposterior) = -0.8 mm, ML (Mediolateral) = ±0.22 mm (based on bregma), DV (Dorsoventral) = -5.85 mm (based on brain surface)) (Fig. 4a).
4-2. 시교차상핵 부분이 감염된 마우스의 선별4-2. Selection of mice infected with the suprachiasmatic nucleus
상기 실시예 4-1에서 주입한 본 발명 CSAC의 주입여부 확인을 위해, 바이러스의 충분한 발현을 위해 3주 이상 사육한 마우스를 대상으로 하여 4%의 파라 포름알데히드(paraformaldehyde)를 심장내 관류한 다음, 4℃의 온도에서 밤새 고정시켰다. Leica VT1000 S vibratome(Leica, Wetzlar, Germany)를 활용하여 조직을 관상(coronal)의 50-μm 두께 절편으로 잘라내었다. 핵은 4'6'-diamidino-2-phnylindole(DAPI)를 활용하여 염색하였고, 이미지는 Nikon C2+ 공초점 현미경 시스템을 활용하여 촬영한 다음, Fiji(Nat.Methods 9, 676-682 (2012))를 활용하여 선형조정하였다. 그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 성공적으로 마우스 내에 주입된 사실을 확인할 수 있었다. 마우스의 운동 활성 및 온도 확인을 위해 도 4c(대조군) 및 4d(Crys)에 나타낸 바와 같이, CSAC에 의해 시교차상핵 부분이 형질감염된 마우스만 선별하여 다음 실험에 사용하였다.In order to check whether the CSAC of the present invention injected in Example 4-1 was injected or not, 4% paraformaldehyde was intracardiac perfused to mice bred for 3 weeks or more for sufficient expression of the virus. , and fixed overnight at a temperature of 4 °C. Using a Leica VT1000 S vibratome (Leica, Wetzlar, Germany), the tissue was cut into coronal 50-μm thick sections. Nuclei were stained using 4'6'-diamidino-2-phnylindole (DAPI), and images were taken using a Nikon C2+ confocal microscope system, followed by Fiji (Nat.
4-3. 마우스의 일반운동 활성(locomotor activity) 및 온도 확인4-3. Confirmation of locomotor activity and temperature of mice
상기 4-2에서 선별해낸 마우스를 대상으로 하여 운동 활성 및 체온을 측정하기 위해, 무선송신기 기반 원격 측정 시스템인 E-mitter(Starr Life Science, Oakmont, PA, USA)를 활용하였으며, E-mitter는 복강내 케타민(ketamine, 100mg/kg)과 자일라이진(xylazine, 10mg/kg)의 투여로 인해 전신 마취된 마우스의 피부 아래에 무균 기술을 활용하여 이식하였다. E-mitter가 이식된 마우스는 12시간의 규칙적인 명암주기 조건으로 1주일의 회복기간을 주었으며, E-mitter가 감지한 마우스의 활동 및 온도 데이터는 수신기(ER-4000 engergizer receiver, Starr Life Science)로 송신되었고, 데이터 수집 및 디지털 변환은 VitalView 소프트웨어(Starr Life Science)를 사용하여 6분 마다 수행하였다.E-mitter (Starr Life Science, Oakmont, PA, USA), a wireless transmitter-based telemetry system, was used to measure motor activity and body temperature of the mice selected in 4-2 above. It was implanted under the skin of mice under general anesthesia due to intraperitoneal administration of ketamine (100mg/kg) and xylazine (10mg/kg) using aseptic technique. E-mitter-implanted mice were given a recovery period of 1 week under the condition of a regular light-dark cycle of 12 hours. data collection and digital conversion were performed every 6 minutes using VitalView software (Starr Life Science).
① 상기와 같은 방법을 통해 운동 활동을 측정한 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 일주기 운동 활동 형광 단백질(mCherry)을 발현하는 AAV가 주입된 대조군 동물에서는 명 조건 및 암 조건에서 모두 잘 정렬된 운동활동이 관찰되었으며, 일정한 암 조건(constant darkness, DD)에서 대조군 동물은 24시간 보다 약간 짧은 생체시계에 따른 각성(wake) 및 휴식(resting) 주기를 보여주었다. 그러나, 도 5b에 나타낸 바와 같이, CSAC-Crys를 주사한 마우스는 일정한 암 조건에서 일주기 리듬 이상(arrhythmicity)을 보여주는 것을 확인할 수 있었다.① As a result of measuring locomotor activity through the above method, as shown in FIG. 5a , in control animals injected with AAV expressing circadian locomotor activity fluorescent protein (mCherry), well-aligned in both light and dark conditions. Motor activity was observed, and in constant darkness (DD), the control animals showed a wake and rest cycle according to the circadian clock, which was slightly shorter than 24 hours. However, as shown in FIG. 5B , it was confirmed that mice injected with CSAC-Crys showed arrhythmicity under certain cancer conditions.
본 발명자들은 상기 데이터를 토대로 하여 상기 실시예 1-4의 카이-제곱 주기도 분석을 수행해 보았을 때, 본 발명의 CSAC가 일주기 운동활동을 방해한다는 사실을 명확히 할 수 있었는데, 구체적으로 대조군 동물에서 평균 Qp 값은 도 5c에 나타낸 바와 같이 정상적인 일주기 운동활동의 전형적인 형태인 24시간 즈음에 피크를 보여줌을 확인할 수 있었으나, 도 5d(CSAC-Crys 투여 그룹)은 어느 시점에서도 유의한 수치를 보여주지 않았다.The present inventors were able to clarify the fact that the CSAC of the present invention interferes with circadian motor activity when performing the chi-square periodogram analysis of Examples 1-4 based on the above data. Specifically, the average in control animals It was confirmed that the Qp value showed a peak around 24 hours, which is a typical form of normal circadian motor activity, as shown in Fig. 5c, but Fig. 5d (CSAC-Crys administration group) did not show a significant value at any time point. .
② 상기와 같은 방법으로 온도를 측정하였을 때에도, 상기 운동활동과 거의 유사한 결과를 관찰할 수 있었는데, 구체적으로 도 6a에 나타낸 바와 같이, 대조군 동물은 일정한 암 조건 및 명/암 조건에서 모두 전형적인 온도 변화를 보여줬으나, CSAC-Crys를 투여한 그룹에서는 도 6b에 나타낸 바와 같이, 체온의 일정한 일주기 변화를 보여주지 않았다.② Even when the temperature was measured in the same way as above, a result almost similar to the exercise activity could be observed. Specifically, as shown in FIG. 6a , the control animal had a typical temperature change under both constant dark conditions and light/dark conditions. , but the group administered with CSAC-Crys did not show a constant circadian change in body temperature, as shown in FIG. 6b .
상기와 같은 온도 데이터는 카이-제곱 주기도 분석을 수행하였을 때, 운동활동 데이터와 유사하게 대조군의 경우 평균 Qp 값이 24시간 즈음에 피크를 보여줌으로써 일주기의 전형적인 형태를 가지고 있음을 확인할 수 있었으나, 도 6c(CSAC-Crys 투여 그룹)는 어느 시점에서도 유의한 수치를 보여주지 않았기에, 본 발명의 CSAC를 처리한 그룹은 일정한 일주기 변화를 보여주지 않음을 확인할 수 있었다.When the chi-square periodogram analysis was performed on the temperature data as described above, similar to the exercise activity data, the average Qp value of the control group showed a peak around 24 hours, so it was confirmed that it had a typical form of the circadian cycle. 6c (CSAC-Crys administration group) did not show a significant value at any time point, so it was confirmed that the group treated with the CSAC of the present invention did not show a constant circadian change.
4-4. 마우스의 일반운동 활성(locomotor activity) 및 온도의 평균 확인4-4. Mean determination of locomotor activity and temperature of mice
상기 4-3의 실험예에서 얻어진 데이터를 토대로 하여, 명/암 조건(LD)에서 마우스의 평균 활동(도 7a) 및 평균 온도(도 7b)를 측정하고, 일정한 암 조건(DD)에서 마우스의 평균 활동(도 7c) 및 평균 온도(도 7d)를 측정하였다. 그 결과, 대조군에 비해서, 본 발명의 CSAC를 투여한 그룹에서도 평균 활동 및 평균 온도의 유의한 차이가 나지 않음을 확인할 수 있었다.Based on the data obtained in the experimental example of 4-3, the average activity (Fig. 7a) and the average temperature (Fig. 7b) of the mouse in the light/dark condition (LD) were measured, and the mouse under the constant dark condition (DD) was measured. Mean activity (FIG. 7C) and mean temperature (FIG. 7D) were measured. As a result, compared to the control group, it was confirmed that there was no significant difference in average activity and average temperature in the group administered with the CSAC of the present invention.
본 발명자들은 상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 CSAC는 평균적인 운동활동이나 온도에 영향을 주지 않으면서도 효과적으로 생체시계를 조절하여 생체 주기적인 특징(활동 및 온도의 변화)을 저해한다는 사실을 확인하였다.The present inventors confirmed the fact that the CSAC of the present invention effectively regulates the circadian clock without affecting the average exercise activity or temperature through the above results, thereby inhibiting circadian characteristics (changes in activity and temperature). .
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The description of the present invention stated above is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. There will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.
<110> Institute for Basic Science Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology <120> Composition for inducing disturbance of circadian clock and model for disturbing circadian clock made using same <130> PD21-017 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> sgCry 1-2 <400> 1 ggtcgaggat atagacgcag cgg 23 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> sgCry 2-1 <400> 2 ctgtgggcat caaccgatgg agg 23 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> sgCry 2-2 <400> 3 tcggttgatg cccacagacg agg 23 <110> Institute for Basic Science Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology <120> Composition for inducing disturbance of circadian clock and model for disturbing circadian clock made using same <130> PD21-017 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> sgCry 1-2 <400> 1 ggtcgaggat atagacgcag cgg 23 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> sgCry 2-1 <400> 2 ctgtgggcat caaccgatgg agg 23 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> sgCry 2-2 <400> 3 tcggttgatg cccacagacg agg 23
Claims (14)
상기 생체시계 관련 유전자는 Cry1(Cryptochrome Circadian Regulator 1) 또는 Cry2(Cryptochrome Circadian Regulator 2)인 것을 특징으로 하는, 가이드 RNA.According to claim 1,
The biological clock-related gene is Cry1 (Cryptochrome Circadian Regulator 1) or Cry2 (Cryptochrome Circadian Regulator 2), characterized in that the guide RNA.
상기 서열번호 1로 이루어진 가이드 RNA는 Cry1를 표적하는 것을 특징으로 하는, 가이드 RNAAccording to claim 1,
The guide RNA consisting of SEQ ID NO: 1 is characterized in that it targets Cry1, guide RNA
상기 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 가이드 RNA는 Cry2를 표적하는 것을 특징으로 하는, 가이드 RNA.According to claim 1,
The guide RNA consisting of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 is characterized in that it targets Cry2, guide RNA.
상기 생체시계 관련 유전자는 Cry1(Cryptochrome Circadian Regulator 1) 또는 Cry2(Cryptochrome Circadian Regulator 2)인 것을 특징으로 하는, 가이드 RNA 벡터.6. The method of claim 5,
The biological clock-related gene is Cry1 (Cryptochrome Circadian Regulator 1) or Cry2 (Cryptochrome Circadian Regulator 2), characterized in that the guide RNA vector.
상기 벡터는 아데노연관바이러스(Adeno-associated virus; AAV) 벡터인 것을 특징으로 하는, 가이드 RNA 벡터.6. The method of claim 5,
The vector is an adeno-associated virus (AAV) vector, characterized in that the guide RNA vector.
상기 가이드 RNA 벡터는 Cry1 및 Cry2를 동시에 표적하는 것을 특징으로 하는, 가이드 RNA 벡터.7. The method of claim 6,
The guide RNA vector is characterized in that it simultaneously targets Cry1 and Cry2, the guide RNA vector.
Cas9(CRISPR associated protein 9) 핵산분해효소;를 포함하는, 생체시계 교란 유도용 CRISPR/Cas9 복합체.The guide RNA vector of claim 5; and
Cas9 (CRISPR associated protein 9) nuclease; CRISPR/Cas9 complex for inducing circadian clock disturbance.
상기 생체시계 관련 유전자는 Cry1(Cryptochrome Circadian Regulator 1) 또는 Cry2(Cryptochrome Circadian Regulator 2)인 것을 특징으로 하는, 생체시계 교란 유도된 동물 모델.12. The method of claim 11,
The biological clock-related gene is Cry1 (Cryptochrome Circadian Regulator 1) or Cry2 (Cryptochrome Circadian Regulator 2), characterized in that the biological clock disturbance induced animal model.
상기 생체시계 교란 유도된 동물 모델은 생체시계 관련 유전자가 발현하는 단백질의 수준이 감소하는 것을 특징으로 하는, 생체시계 교란 유도된 동물 모델. 12. The method of claim 11,
The biological clock disturbance-induced animal model is characterized in that the level of the protein expressed by the biological clock-related gene is reduced, the biological clock disturbance-induced animal model.
(a) 제 11항의 생체시계 교란 유도된 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 후보물질이 처리된 생체시계 교란 유도된 동물모델을 무처리 대조군과 비교하여 주기적 특성의 회복 여부를 확인하는 단계.A method for screening a biological clock correcting material, comprising the steps of:
(a) treating the candidate material in the biological clock disturbance-induced animal model of claim 11; and
(b) comparing the circadian clock disturbance-induced animal model treated with the candidate substance with the untreated control group to determine whether the periodic characteristics are restored.
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| KR1020210053833A KR102586501B1 (en) | 2021-04-26 | 2021-04-26 | Composition for inducing disturbance of circadian clock and model for disturbing circadian clock made using same |
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| KR1020210053833A KR102586501B1 (en) | 2021-04-26 | 2021-04-26 | Composition for inducing disturbance of circadian clock and model for disturbing circadian clock made using same |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Citations (2)
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| JP2006087384A (en) * | 2004-09-27 | 2006-04-06 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Animal exhibiting short or long period circadian rhythm |
| JP2011036143A (en) * | 2009-08-06 | 2011-02-24 | Hitoshi Okamura | Medicine for body dysrhythmia and method for screening the same |
-
2021
- 2021-04-26 KR KR1020210053833A patent/KR102586501B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006087384A (en) * | 2004-09-27 | 2006-04-06 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Animal exhibiting short or long period circadian rhythm |
| JP2011036143A (en) * | 2009-08-06 | 2011-02-24 | Hitoshi Okamura | Medicine for body dysrhythmia and method for screening the same |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Frontiers in Physiology,제10권,577호,1-9면(2019.05.) 1부.* * |
| Scientific Reports,제11권,2575호(2021.01.28.) 1부.* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102586501B1 (en) | 2023-10-10 |
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