JPH10509313A - Transgenic organisms and methods of using the same - Google Patents
Transgenic organisms and methods of using the sameInfo
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Abstract
(57)【要約】 陽性および/または陰性の選択可能なマーカーを保持するトランスジェニック生物(特に、トランスジェニック動物または植物)が、組織/細胞培養技術を含む種々の方法にこれらを使用すること、モノクローナル抗体を生産する方法、特定の組織/細胞型を選択的に除去し、または欠損させる方法、薬理学的活性について化合物をスクリーニングする方法、および生物中の第一の組の細胞における欠損が、第二の組の細胞の特性に及ぼす作用を測定する方法と共に、記載されている。 (57) [Summary] Use of transgenic organisms (especially transgenic animals or plants) carrying positive and / or negative selectable markers in a variety of methods, including tissue / cell culture techniques, methods of producing monoclonal antibodies A method for selectively removing or deficient for a particular tissue / cell type; a method for screening compounds for pharmacological activity; Along with a method for measuring the effect on the properties of
Description
【発明の詳細な説明】 トランスジェニック生物およびその使用方法 本発明は、一種以上の選択可能な表現型を備える細胞を持つトランスジェニッ ク生物とその使用方法に関するものである。 トランスジェニック動物のようなトランスジェニック生物は、多年にわたって 知られていた。この用語は、外来性のDNAを含むあらゆる生物に適用されるこ とがあったけれども、この用語「トランスジェニック生物」は、本明細書では、 そのもっと普通の意味で使用しており、生殖細胞系列中に異種の染色体DNAを 含む真核生物(特に動物または植物であり、とりわけ脊椎動物、例えば哺乳類) とその子孫とを示している。この異種の染色体DNAは、以降は「トランス遺伝 子」と表記する暗号配列を有している。従って、トランスジェニック生物が有す るあらゆる細胞(または少なくとも細胞のほとんど)は−体細胞も生殖細胞も− このトランス遺伝子の一種以上の複製を含んでいてよい。 トランスジェニック生物は、多くの相異なる方法で生産できる。これらの方法 は、従来技術において良く文書化されており、これらの方法を実施することは、 本分野に習熟した者の技術的なレパートリーの一部である。通常使用される方法 論的なアプローチは、例えば、米国MAのバターワース ハイネマン社の「トラ ンスジェニック動物」(1991年)の第一版およびヘーゼルタイン版に記載さ れている。 既知の方法の一つにおいては、このトランス遺伝子を胎児幹細胞中へと挿入し 、次いでこれを少数の細胞のみが存在している段階で、無菌化された接合体中へ と注入する。このように処理された胎児幹細胞は、接合体中へと組み込まれ始め 、ここに由来する細胞が、この動物体の相異なる細胞型の多くあるいはすべての 中へと分化し続ける。また、この細胞には、生殖細胞系列に寄与するものが含ま れており、従ってこの(キメラ)動物の子孫は十分にトランスジェニックになり 得る。 他の方法としては、原核中へと、または無菌化された卵子または無菌 化されていない卵子の中へとトランス遺伝子を導入する方法がある。 また、細胞を通常のように処理し、あるいは誘導することによって、細胞の上 にあらゆる多様な選択可能な表現型を付与する遺伝子を形質発現させることも、 本分野において知られている。これらの遺伝子は、選択可能なマーカーとして知 られている。これらは通常は組み換え体形質発現ベクターの一部分として細胞中 に導入される。選択可能なマーカーによって付与された選択可能な表現型は、陽 性または陰性のいずれかに分類できる。 陽性の選択可能な表現型は、この陽性の選択可能な表現型を示さない細胞を殺 しうる(または少なくとも細胞の成長を抑制または損傷させうる)特定環境下で 、生存を可能とする表現型である。 陰性の選択可能な表現型は、陰性の選択可能な表現型を示さない細胞に対して 比較的に無害な特定環境下で、この細胞の破壊(または細胞の成長の抑制あるい は損傷)をもたらす表現型である。 多様な選択可能なマーカーを入手できる。陽性の選択可能なマーカーとして広 く適用できる遺伝子としては、細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo :コルベール- ガラピン等(Colbere-Garapin et al)1981 年 150:1)、ハイグロマ イシンホスホトランスフェラーゼ(hph;サンテール等(Santerre et al)1984 年「 Gene」30:147)およびキサンチングアニン ホスホリボシル トランスフェラー ゼ(gpt; マリガンおよびベルグ(Mulligan and Berg)1981 年「P.N.A.S.」米国78 :2072)。 また、陽性の選択可能なマーカーとして使用されるのは、単純ヘルペスウイル ス1型チミジンキナーゼ(HSV-1 TK; ウイグラー等(Wigler et al)1977年、「Ce ll」11;223)、アデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ARPT:ウイグラー 等(Wigler et al)1979年、「P.N.A.S.」米国76;1373)およびハイポキサンチン ホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT;ジョリー等(Jolly et al)1983 年「P. N.A.S.」米国80;477)である。これらの後者のマーカーは、特定の変異型遺伝子 型(即ち、選択が基づいている遺伝子産物に欠損をもたらすもの)を有する細胞 中で使用 しなければならない。 また、前述した遺伝子の幾つかは、陰性と共に陽性の選択可能な表現型をもた らす。これらには、HSV-1TK、APRT、HPRTおよびgpt 遺伝子が挙げられる。これ らの遺伝子が暗号化する酵素は、特定のヌクレオシドまたはプリン相同体を細胞 毒性の中間体へと変換するのを触媒することができる。例えば、ヌクレオシド相 同体であるガンシクロヴィール(ganciclovir:GCV)は、HSV-1 チミジンキナーゼ に対しては良好な基質であるが、哺乳類細胞中に見られる天然チミジンキナーゼ に対しては貧弱な基質でしかない。この結果、GCV は、このHSV-1TK遺伝子[セ ントクレア等(St.Clair et al)1987、「Antimicrob.Agents Chemother.」31: 844]を形質発現する細胞に対して、有効な陰性の選択をするのに使用できる。 キサンチングアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼは、野性型細胞[ベ スナール等(Besnard et al)1987 年「Mol.cell.Biol.」7:4139]中で形質発現 したときには、陽性の選択と陰性の選択との双方に対して使用できる。 選択可能なマーカーは、原核および真核遺伝子処理の双方において、比較的に 稀な遺伝的変化を被った細胞を、混合された集団から回収することを可能とする ために、通常は使用されている。例えば、これらマーカーを、目的とする産物( 例えば治療用のタンパク質)を暗号化する他の遺伝子と物理的に関連して使用す ることによって、この他の遺伝子を接種した細胞を前記の選択可能なマーカーと 共に選択できる。例えば、遺伝子治療が行われた後に、患者の試料から摂取した 遺伝的に修飾された細胞を監視するために、前記neo遺伝子が使用されてきた 。 また、遺伝子治療に際して、安全装置として陰性の選択可能なマーカーを使用 することが提案されてきた。多くの遺伝子治療には、患者からの体細胞を除去し 、この中に治療遺伝子(この形質発現によって生化学的な病変を修復する)を導 入し、次いでこれらの細胞を患者内へと再び導入することが含まれる。こうして 再導入された遺伝子的に修飾された細胞は、最終的には患者の健康に対して有害 であることが明らかになる かもしれないので(例えば、これら細胞が免疫的に適合していないか、または悪 性であることが明らかになったときには)、陰性の選択可能なマーカーを、治療 遺伝子と共に導入することによって、(必要であれば)引き続いて遺伝的に修飾 された細胞を選択的に除去することを可能とする。陽性または陰性の選択可能な マーカーを保持する多数のベクターが生産されてきており、本分野に習熟した者 には容易に入手できる(総覧のためには、Miller(1992 年)「Nature」357 :455- 460を参照)。他のものは、標準的な遺伝子クローニング技術を使用して、容易 に生産できる。 トランス遺伝子として選択可能なマーカーを保持しているトランスジェニック 生物は、本分野において知られている。一般的には、選択可能なマーカーを導入 することによって、目的の遺伝子をも摂取した細胞を回収することが可能であり 、目的とする遺伝子に対して選択可能なマーカーが連結された。例えば、正常な 形質発現を中断させる遺伝子情報を有する生殖細胞系列中へと導入することを含 む研究(WO/91/13150 参照)の途中で、多くのこうしたトランスジェニック生物が 構成されてきた。 また、特定の遺伝的病変を有する動物を構成する途中で、選択可能なマーカー を保持するトランスジェニック生物が構成されてきた。ここで、この選択可能な マーカーは、(通常は相同性の組み替えによって)特定の遺伝子中へと挿入され ており、これによって特定の遺伝子が挿入状態で不活性化される。次いで、選択 可能なマーカーによって付与された選択可能な表現型を、この遺伝子の挿入状態 で不活性化されている複製を保持する細胞の同定と回収とのためのベースとして 使用する。この方法によって生産されたトランスジェニック動物の例が、〔ピエ ドラヒタ等(Piedrahita et al)1992年、「PNAS」89、4471〜4475頁]に記載され ている。 インビトロの組織/細胞培養法は、薬剤学、臨床、農業および工業研究にとっ て基本的なものである。例えば、組織/細胞培養法が、薬剤工業においては、医 薬品(例えば、治療上の活性があるタンパク質製品) の調製のために、あるいは薬剤の可能性の測定やスクリーニングのために使用さ れている。 しかし、これらのインビトロの細胞/組織培養技術は、遅く、労力を要し、高 価である。一つの重要な問題点は、培養時の感染である(通常は、細菌、酵母菌 類および/または菌類による微生物汚染によって生ずる)。これは、通常は種々 の抗生物質を使用することによって対処されており、種々の抗生物質を培地中へ と添加し、汚染物の成長を除去し、減少させる。 しかし、抗生物質を使用することでは、特に酵母菌および/または菌類による 汚染(この多くは、通常使用される抗生物質に対して耐性である)から生ずる感 染の危険を完全に取り除くことはできない。 他の重要な問題点は、単一の組織または細胞型を培養する必要性から生ずるも のである。単一の細胞からのインビトロの成長は、困難なものであり得るし(し ばしばフィーダー細胞および/または成長因子と他の補助剤との混合物を使用す ることが必要になる)、従って均一なインビトロの集団は容易に得ることができ ない。 従って、初代培養のために、あるいは他の目的のために、すべての型の細胞/ 組織の便利な源が必要である。 ここで、陽性および/または陰性の選択可能なマーカーを保持するトランスジ ェニック生物が、細胞培養技術において、以前には認識されていなかった有用性 を持っていることを見いだした。 本発明が提供するトランスジェニック生物は、特に、この生物の体のあらゆる 組織からの細胞の分離、同定、培養および分析のための材料の非常に便利な源を なしている。本発明のトランスジェニック生物から分離した組織は、インビトロ で(特定の細胞/組織型の均一な集団としてさえも)特に容易に成長させること ができ、薬剤学上の測定、組織移植片の合成、ドラッグデリバリーおよびタンパ ク質の生産を含む広範な用途に使用することができる。 本発明の一つの態様に従って、トランスジェニック真核生物を提供し、 このトランスジェニック真核生物が有する細胞が、陽性の選択可能なマーカーを 暗号化するトランス遺伝子および陰性の選択可能なマーカーを暗号化するトラン ス遺伝子を有する異種DNAを含んでいる。このトランス遺伝子から生ずる選択 可能な表現型を除けば、本生物は、実質的に正常であり得、これらのトランス遺 伝子は、例えばこれらが遺伝子を挿入状態で不活性化するように配置されてはい ない。 本明細書で使用する「実質的に正常」という用語は、この生物が、野性型に対 していかなる顕著な特性ないし形質をもたらす変異体でもなく、および/または 正常な組織分化および発生を示すものであることを示している。例えば、生物の トランス遺伝子がそのゲノムのサイレント(即ち、形質発現していない)領域内 に滞留している場合、および/または、このトランス遺伝子が染色体の複製、分 離、組織化または充填、または(ヒストンおよび調節因子を含む)DNA結合タ ンパク質のような細胞性成分との相互作用を顕著に混乱させないようなゲノムの 領域内に滞留しているという意味で、この生物は実質的に正常であり得る。陽性 および陰性の選択可能なマーカーの双方を暗号化するトランス遺伝子を規定する ことによって、インビトロでトランスジェニック生物に由来する細胞を引き続い て操作する間に、多大な柔軟性がもらたされる。更に、本発明を組織移植片を生 成させるのに使用する場合には、特定の型の細胞を、本発明のトランスジェニッ ク動物から陽性の選択によって分離することができる。次いで、このように分離 された細胞を、トランスジェニックではない動物へと移植することによって、こ の移植片が治療作用を持っているかどうかを決定できる。次いで、この移植片を 陰性の選択で除去することによって、この移植片が直接の治療作用を有している かどうかを決定するための対照物を提供できる。 本発明の他の態様においてはトランスジェニック真核生物を提供し、この生物 の細胞は、陽性の選択可能なマーカーを暗号化するトランス遺伝子および/また は陰性の選択可能なマーカーを暗号化するトランス遺伝子を有する異種DNAを 含んでおり、本生物は、このトランス遺伝子 から生ずる選択可能な表現型を除いては、実質的に正常である。陽性および陰性 の選択可能なマーカーは、単一のトランス遺伝子によってもたらすことができる 。(上記したように)幾つかのマーカーは、(採用した選択環境に応じて)陽性 および陰性の選択可能なマーカーの双方として使用できるからである。 本発明のトランスジェニック真核生物は、好ましくは動物または植物であり、 例えば脊椎動物(例えば、ラット、ウサギ、豚またはマウスのような哺乳類)で ある。 このトランスジェニック生物は、前記異種DNAが存在していることを除けば 、実質的に野生型である遺伝子型を有していることが好ましい。 更に、細胞中で形質発現する異種DNAのこの部分は、陽性の選択可能なマー カーを暗号化するトランス遺伝子および/または陰性の選択可能なマーカーを暗 号化するトランス遺伝子からなっていてよく、各トランス遺伝子は、一種のまた は複数種の形質発現因子に対して操作可能なように連結されている。他のいかな るトランスジェノシスに由来する遺伝子配列の形質発現もないことによって、こ の好適なトランスジェニック生物が、有効な野生型の遺伝子型の背景を必要とす る広範な実験研究に適したものになる。 この選択可能なマーカーのうちの少なくとも一種は、調節可能な一種または複 数種の形質発現因子(例えば、組織−または細胞特異的な一種または複数種の形 質発現因子に対して操作可能なように連結させることができる。こうした環境下 においては、各選択可能なマーカーを特異的に調節することが有利であり、例え ば各マーカーを、相異なる組織−または細胞特異的な一種または複数種の形質発 現因子に対して連結する。これによって、この選択可能なマーカーの形質発現を 、選択された組の細胞または組織に制限し、こうして、例えば、混合された初代 細胞培養物から、選択された組の細胞または組織のインビトロの選択的な培養物 をもたらすことが可能になる。 本発明は、いかなる一つの方法によって生産されたトランスジェニッ ク生物を使用することにも依存はしない:本発明の実施に際しては、あらゆるト ランスジェニック手順を採用できる。更に、ほとんどの環境下では、本発明で使 用する選択可能なマーカーの精密な性質は重要ではない。一般的には、あらゆる 選択可能なマーカー遺伝子を、それが細胞上に陽性または陰性の選択可能な表現 型を付与する限りは、使用できる。 例えば、陽性の選択可能なマーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラー ゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、キサンチングアニン ホスホ リボシル トランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ、 アデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼおよびハイポキサンチン ホスホ リボシルトランスフェラーゼから選択できる。 陰性の選択可能なマーカーは、例えば、単純ヘルペスウイルス1型チミジンキ ナーゼ、アデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン ホ スホトランスフェラーゼおよびハイポキサンチン ホスホリボシルトランスフェ ラーゼから選択できる。 これらの選択可能なマーカーは、あらゆる多数の既知のベクターに(例えば制 限エンドヌクレアーゼを使用したサブクローニングによって)由来していても都 合がよく、この例は、例えば、〔「Molecular Cloning:A laboratory Manual /s econd Edition」サムブルック J.フリッツ(Sambrook J.Fritsch)およびマニ アティス T(Maniatis T)編集、1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリ ープレス出版〕に記載されている。 本発明に使用するための形質発現因子は、これらが操作可能なように連結され ている遺伝子の形質発現を、これらの因子が(少なくともある環境下では)指示 および/または調節できるようにされている限りは、あらゆる形態をとっていて よい。本発明で使用するための形質発現因子は、転写および/または翻訳因子を 備えていてよく、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、活性化因 子およびレプレッサー(オペレーター)部位のような調節部位を有していてよい 。好適な形質発現 因子には、広範囲の使用に適したものから選択されたプロモーター類を備えてお り、この例を表1に示す。この表は、包括的なものではなく、下記の本発明の方 法において、各プロモーターを配することができる使用方法をも示している。 単なる例示として、本発明において使用するための形質発現因子を、(i)ド ーパミン作用性、セロトニン作用性、GABA作用性、コリン作用性またはペプ チド作用性ニューロンおよびその副集団;(ii)希突起膠細胞、星状膠細胞お よびその副集団、(iii)内分泌腺、肺、筋肉、性腺、胃腸、骨格組織または これらの一部分ないし複数の部分;(iv)上皮、繊維芽細胞、脂肪、マスト、 間葉組織ないし実質組織細胞、(v)特定段階の胚形成、および(vi)血液系 の成分(例えば、T−リンパ球、B−リンパ球およびマクロファージ)において 、特異的に活性であるプロモーターまたはエンハンサーから選択できる。または 、これらを、(i)神経伝達物質特異性の受容体;(ii)イオンチャンネル; (iii)イオンチャンネルのゲーティングに関与する受容体および(iv)サ イトカイン類、成長因子およびホルモン類:のための遺伝子を転写させるプロモ ーターおよび/またはエンハンサーから選択できる。 選択可能なマーカーのうちの少なくとも一種が構成成分として形質発現され得 ることが有利である。これによって、トランスジェニック生物の各トランスジェ ニック細胞中ですべての環境下で選択可能なマーカーの均一な形質発現が確保さ れ、トランスジェニック生物が、細胞/組織培養のための源生物として一般用途 に使用されている場合に、このことが特に有用である。 構成性の形質発現は、例えば、「増殖必須」遺伝子の形質発現を促進するプロ モーターを使用することによって、実現することができる。「増殖必須」遺伝子 は、すべての細胞型内で形質発現するものである。これらが翻訳された産物は、 一般的な細胞の代謝または細胞の構造の一部分として必要とされ、この結果、「 増殖必須」遺伝子は、特定の細胞または組織型内で特異的に形質発現しない。従 って、増殖必須遺伝子プロモーターは、構成性の遺伝子形質発現を確保するため には、広い範囲の(そしてときにはすべての)細胞型の中で活性であることが必 要である。 本発明において有用な構成性に形質発現するプロモーターの例は、組織適合性 に対しては、複合体H−2Kb綱1プロモーター〔ワイス (Weiss)等1983年「Nature」301、671-674;ボールドウインおよびシャープ、1987 年「Mol.Cell Biol.」7、305-313;キムラ等、1986年、「Cell」44、261-272]で あり、これは一般にトランス遺伝子中でプロモーターとして使用したときに、細 胞中で下流の暗号配列を形質発現することが示されてきた[ジャット(Jat)等、「 PNAS USA」88、5096-5100]。他の例はウイルス性SV40初期プロモーターである。 本発明において使用するプロモーターは、哺乳類細胞に由来するプロモーター には限定されず、鳥類および魚類に由来するプロモーターをも含み得る。更に、 ウイルスに由来するプロモーターも、このうちの幾つかが広範囲の哺乳類、魚類 および鳥類の細胞および他の真核細胞において生物活性を有しており、本発明を 実施する際にも使用できる。例えば、シミアンウイルス−40に由来する初期ま たは後期プロモーターや、プロモーターおよびエンハンサー因子を有しているレ トロウイルス類であって、広範囲の真核細胞中にレトロウイルスの影響下に配列 の形質発現を促進する能力を有するレトロウイルスの末端反復単位(LTR)が ある。これらのプロモーターは、エンハンサー因子のような支持配列および他の 調節因子と共に、本分野に習熟した者に良く知られている〔例えば、「Molecula r Cloning :A laboratory Manual /second Edition」サムブルック J.フリッツ およびマニアティス T編集、1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー プレス出版を参照」。 また、本発明のトランスジェニック生物には、更にレポータートランス遺伝子 、例えば3−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼを有する異種DNAを含有 していて良い。このレポータートランス遺伝子は、それ自身が、細胞ないし組織 特異的な調節に供されている一種のまたは複数種の形質発現因子に対し操作可能 なように連結されている。 こうしたレポータートランス遺伝子によって、トランスジェニック生物から培 養された細胞/組織を引き続いて分析することが容易になり、特に、一種の特定 の形質発現因子または一組の形質発現因子の応答(例えば、特定の組の細胞/組 織内に誘起された欠損に対する応答)を、イ ンビトロでまたはインビボで監視することが可能になる。 本発明の他の態様で、インビトロで細胞および/または組織を培養する方法を 提供し、本方法は、(a)細胞上に選択可能な表現型を付与する遺伝物質を含有 する細胞を有するトランスジェニック動物または植物を与える段階;(b)段階 (a)のトランスジェニック生物の細胞および/または組織から初代培養物を生 成させる段階;および(c)前記トランスジェニック生物の前記細胞中に含有さ れている前記遺伝物質によって付与された前記の選択可能な表現型に基づいて、 前記初代培養物を選択的に成長させる段階を備えている。 好ましくは、本発明の細胞/組織培養方法は、組織または細胞特異的な一種ま たは複数種の形質発現因子に操作可能なように連結されている選択可能なマーカ ーを有するトランスジェニック生物を使用することに基づいており、これによっ て、段階(c)において、特定の細胞/組織型を、前記の少なくとも一種の選択 可能なマーカーの内部の組織/細胞特異的な形質発現に基づいて選択的に成長さ せる。 本発明の好適な方法は、例えば、初代(混合細胞)培養物からの甲状腺小胞細 胞を選択するのに際して用途がある。この方法によれば、甲状腺小胞細胞の不存 在下に甲状腺の初代ストロマ細胞集団をもたらすことができ、甲状腺の生物学の 研究に対して有用であり、かつ甲状腺疾患の治療用の新しい治療薬を開発する際 に有用な独特の細胞培養系を構成しうる。 また、本発明の細胞/組織培養方法は、工程(c)で組織培養物の微生物汚染 を減少させ、除去するように実施することができ、これによって、細胞培養系に おいて共通の問題点、即ち培養物の汚染(特に菌類と酵母菌類とによる汚染)を 軽減ないし除去できる。 また、本発明のトランスジェニック生物は、モノクローナル抗体を製造する方 法において、リンパ球の源として使用することができる。 モノクローナル抗体は、バイオテクノロジーにおいて基本的な重要性を有して いるものである。この調製方法は、(a)目的とする抗原を注 入することによって動物を免疫化し、(b)この動物から脾臓を除去し、この脾 臓からリンパ球を調製し、(c)このリンパ球を、不死性の細胞(通常は骨髄腫 細胞)と融合させることによってハイブリドーマを生産し、(d)ハイブリドー マを選択的に成長させ、および(e)このハイブリドーマをクローニングして、 目的とするモノクローナル抗体を分泌するクローンを生産するという一連の段階 を有している。 ハイブリドーマを選択的に成長させる段階(上述の段階(d))は、通常、H PRT遺伝子型に基づいて、骨髄腫融合パートナー中で実現でき、骨髄腫融合パ ートナーは、融合していない骨髄腫細胞が、ハイポキサンチン、アミノペテリン およびチミジン(HAT培地)を含有する選択的培地中で成長するのを抑制する 。これは融合パートナーの選択を制限する。 従って、本発明の他の態様で提供する、抗原に特異的なモノクローナル抗体の 生産方法は、(a)選択可能な表現型をリンパ球上に付与する遺伝物質を含有す るリンパ球を有するトランスジェニック生物(例えばラット、ウサギ、豚または マウス)を準備し;(b)前記抗原によってトランスジェニック生物を免疫化し ;(c)前記トランスジェニック生物からリンパ球を除去し;(d)前記段階( c)のリンパ球を、不死性の細胞(例えば骨髄腫細胞のような腫瘍細胞)と融合 させることによってハイブリドーマを生産し;および(e)前記リンパ球に含有 されている前記遺伝物質によって付与されている選択可能な表現型に基づいて、 前記ハイブリドーマを選択的に培養する、各段階を有している。 トランスジェニック生物からのリンパ球調製物中に選択可能なマーカーが存在 することで、例えばHPRT選択プロセスに対する必要性がなくなり、ハイブリ ドーマの生成に使用できる融合パートナー細胞のレパートリーが拡大する。 また、本発明のトランスジェニック生物は、細胞の損失を含む疾患または障害 に関する用途もある。 多くの疾患および障害は、特定の細胞および/または組織の損失に関 係していることが知られている。例えば、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病 およびアルツハイマー疾患のような神経変質性疾患においては、神経伝達物質同 定細胞の一種以上の副集団が、疾患の進行の過程で失われる。 パーキンソン病においては、この損失は、主として脳のニグラ物質(Substabsi a Nigra)領域のドーパミン作用性ニューロンの損失であるけれども、他の細胞型 もまた減少する。 ハンチントン舞踏病においては、ニューロンの一層一般的な損失があるが、し かしこの場合には、この損失は大部分は溝(striatum)に限定されている。 アルツハイマー疾患においては、新皮質および旧皮質へと突出するニューロン を含有するアセチルコリン、セロトニンおよびノルアドレナリンが減少する。 他の神経性の疾患および障害も、神経細胞の変質に起因する;例えば、多発性 硬化症において生ずる脱髄鞘化は、脳内の希突起膠細胞の破壊による。 ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、CD4受容体を形質発現する細胞中に侵 入することが知られており、細胞への感染が、最終的には細胞死をもたらすよう に見える。CD4細胞の損失は、全免疫系の破滅的な阻害と、感染した人の死と をもたらす。 HIVによって引き起こされた疾患の分子/細胞的な基礎は、僅かしか理解さ れていない。これは、少なくとも部分的には、特にインビボで、この疾患の発生 を研究するためのモデル系がないことに起因している。 霊長類に感染したSIV(サル免疫不全ウイルス)を採用することが、範例と して考慮されてきたが、しかしSIVに感染したサルは、全面的に発症したAI DSにはかからない。多くの場合、サルはまったく症状を示さない。これまでに 提案されてきた他のモデルとしては、HIVに感染したチンパンジーがあった。 倫理的な考察の可能性は別として、このようなモデルにおけるAIDS様の症状 の発現には数年を必要とする ために、研究と有効な治療の開発とを著しく遅らせている。 このように、上で議論した種々の疾患と障害の動物モデルは、可能な薬剤に対 する被検体および基礎的な臨床研究における被検体として必須である。これらの 動物モデルの選択は、特定の細胞および/または組織型を選択的に破壊すること に関する困難性のために、現在のところ非常に限られている。従って、本発明の 他の態様において、生物中の特定の組織または細胞型を選択的に除去し、あるい は減少させる方法を提供し、この方法は、(a)除去あるいは減少させるべき組 織または細胞型に対して特異的な形質発現因子(例えばプロモーター)に操作可 能なように連結されている陰性の選択可能なマーカーを有するトランスジェニッ ク生物をあたえ、(b)この生物へと選択剤を投与することによって、前記の陰 性の選択可能なマーカーの組織または細胞型内における形質発現に基づいてこの 組織または細胞型を除去あるいは減少させる、各段階を有している。 この選択剤は、あらゆるルートによって投与できる。全身性の投与が必要であ る場合には、経口、腸管外または静脈内のルートを採用できる。局所的な投与が 必要である場合には(例えば、除去すべき組織または細胞型が、体の特定の器官 または特定領域に制限されている場合には)、標的注射、皮下植え込み(例えば 遅放出カプセル剤)またはカテーテル挿入を採用できる。例えば、脳の特定領域 内の組織を、脳内注射によって特異的に標的化できる。 本発明の特定の組織または細胞型を選択的に除去または減少させる方法を採用 して、疾患に関連した細胞の損失を含む疾患/障害、例えば(AIDS、パーキン ソン病およびアルツハイマー症のような)免疫不全または神経変質疾患/障害の インビボのモデルをもたらすことができる。 従って、本発明の他の態様においては、疾患/障害に関連する細胞/組織の損 失または萎縮をモデル化する方法を提供し、この方法は、(a)疾患に関連する 除去または萎縮にさらされている組織または細胞型に特異的な形質発現因子(例 えばプロモーター)に対して操作可能なように 連結されている陰性の選択可能なマーカーを有するトランスジェニック生物をあ たえ、および(b)選択剤をこの生物に投与することによって、前記陰性の選択 可能なマーカーの組織または細胞型内における形質発現に基づいて前記組織また は細胞型を除去または減少させる、各段階を有している。 また、本発明は、生物の第一の組の細胞の欠損が、第二の組の細胞の特性に対 してもたらす作用を測定する方法(例えばインビトロの方法)を提供し、この方 法は、(a)細胞の第一の組に対して特異的な形質発現因子に操作可能なように 連結されている第一の陰性の選択可能なマーカーを有するトランスジェニック生 物をあたえ、このトランスジェニック生物は、(i)第二の組の細胞に対して特 異的な形質発現因子に操作可能なように連結されている陽性の選択可能なマーカ ー、または(ii)第二の組の細胞を除く前記生物のすべての細胞中の前記陰性 の選択可能なマーカーの形質発現を導く形質発現因子に操作可能なように連結さ れている第二の陰性の選択可能なマーカーのいずれかを有しており;(b)選択 剤を前記生物に投与することによって、前記第一の組の細胞中に前記陰性の選択 可能なマーカーの細胞内での形質発現に基づいて欠損を引き起こし;(c)前記 生物から細胞を除去し:および(d)(i)前記陽性の選択可能なマーカーの細 胞内での形質発現に基づいて、または(ii)前記陰性の選択可能なマーカーの細 胞内での形質発現の欠如に基づいて、段階(c)において除去された細胞から前 記第二の組の細胞を選択的に培養する、各段階を有している。 本発明の他の態様において、細胞/組織の損失または萎縮を含む疾患または障 害に対する薬理学的活性について、化合物をスクリーニングする方法を提供し、 この方法は、(a)(i)疾患/障害に関連する除去または萎縮にさらされた組 織または細胞型に特異的な形質発現因子(例えばプロモーター)に操作可能なよ うに連結されている陰性の選択可能なマーカーを有するトランスジェニック生物 をあたえ、次いで(ii)選択剤をこの生物に投与することによって、前記陰性 の選択可能なマー カーの組織または細胞型内での形質発現に基づいて組織/または細胞型を除去ま たは減少させて試験モデルを得る、各段階によって前記疾患の試験モデルを提供 し;(b)試験すべき前記化合物を前記試験モデルに投与し;(c)試験すべき 前記化合物を、段階(a)の前記試験モデルに対する化合物の作用に基づいてス クリーニングする、各段階を有している。 本発明の方法は、細胞/組織の損失または萎縮に関連するあらゆる疾患または 障害に対して有効に適用することができる。特に、本発明の方法は、神経変質ま たは免疫不全疾患の観点で特に有用性がある:例えば、(a)パーキンソン病( ニグラ物質中のドーパミン作用ニューロンを含有する、除去または欠損されるべ き組織/または細胞型)、(b)ハンチントン舞踏病(溝の神経細胞を含有する 、除去または欠損させるべき組織または細胞型)、(c)アルツハイマー病(新 皮質または旧皮質と関連するアセチルコリン、セロトニンおよび/またはノルア ドレナリンニューロンを含有する、除去または欠損させるべき組織/または細胞 型)、(d)多発性硬化症(脳の希突起膠細胞を含有する、除去または欠損させ るべき組織/または細胞型)、(e)免疫疾患およびCD3、CD4および/ま たはCD8細胞を含有する、除去または欠損させるべき細胞型)および(f)A IDSおよびCD4細胞を含有する、除去または欠損させるべき細胞型がある。 AIDSのモデルの場合には、本発明の方法は、陰性の選択可能なマーカーを CD4細胞特異的なプロモーター(例えばCD4受容体プロモーター)に対して 連結させることによって、CD4細胞を特異的に欠損または除去させるために使 用できる。こうして、インビボでの陰性の選択によって、CD4を形質発現する 細胞の割合を調節することで、AIDSのインビボのモデルを生成させることが できるであろう。 更に、トランスジェニック動物モデルが、陽性および陰性の双方の選択可能な マーカーを保持している場合には、更なる研究のために、あらゆる残留CD4形 質発現細胞を、この動物モデルのトランスジェニック 組織からインビトロの陽性の選択によって後で分離できる。 上記した本発明の方法で使用するのに適した種々のプロモーターの例を、各プ ロモーターが用途を見いだすであろう疾患と共に表1に列記する。 また、本発明は、本発明のトランスジェニック生物に由来する(または本発明 の細胞培養方法によって生産された)細胞/組織培養物を目的とし、また本発明 の種々の治療上の用途を目的とするものである。 以下、本発明を、特定の実施例によって更に詳細に説明する。これらの実施例 は、いかなる点においても、制限的に把握されることを意図してはいない。 例えば本発明を生じさせるために、プラスミドベクターを構成するのに必要と される方法および技術は、本分野に習熟した者には良く知られている。このよう に構成された下記の配列は、本発明を実施するのに使用しうる無数の構成体の例 を示す。本発明は、これらの用途のみに限定されるように構成されてはならない 。 A.材料 i.ベクター類 「pBabeneo プラスミド ベクター」 モルゲンスターン,J.P.およびランド ,H.の「Nucl.Acids Res.」18(1990)3587-3596 頁(プラスミドは自由に入手で きる)。 「pCI プラスミドベクター」 プロメガ社、米国マジソン、2800ウッズハロウ ロード 「CD2 プラスミドベクター」 ブラエーズ(Blaese),M.R.米国、ベセスダ、国 立衛生研究所(プラスミドは自由に入手できる)。ミューレン(Mullen),C.A., キルストラップ M., ブラエーズ,R.M.,「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」89(199 2 年)33-37。オースチン,E.A.およびヒューバー,B.E.[Mol.Pharmacol.」4 3(1993 年)380-387頁。ウオーレス,P.M.、マックマスター,、J.F.スミス,V .F.カー,D.E.、センター,P.D.およびコーサンド,W.L.「Cancer Res. 」54(1994 年)2719-2723 頁。 「TG-TK αプラスミドベクター」 ウオーレス,H. 英国、エジンバラ大学、キ ングズビィルディングス(プラスミドは自由に入手できる)。ウオーレス,H.、 ルーデント(Ledent),C.、ヴァッサール(Vassart),G.、ビショップ,J.O.お よびアルショウイ(Alshawi),R.「Endocrinology」129(1991年)3217-3226 頁。 「pPBSプラスミド」 モルガン「Nucleic Acids Research」1992年、20、1293-1 299 頁。 ii.分子生物試薬 「制限エンドヌクレアーゼ」 Promege 社、米国マジソン市28000 ウッズハロウ ロード。 「DNA修飾酵素、リガーゼ、CIP、T4ポリメラーゼ等」 Promege 社、米国マ ジソン市28000 ウッズハロウロード。 「電気泳動用のアガロース」 米国セントルイス市「シグマ ケミカル コーポ レーション」 「ポリヌクレオチドキナーゼおよび緩衝液」 カナダ国、オンタリオ州、ミシソ ーガ市、ユニット12、3397アメリカン ドライブ、「ニュー イングランド バ イオラブス リミテッド」 B.遺伝子の構成 (i)チログロブリン−チミジン キナーゼ−内部リボソーム導入部位−ネオマ イシン耐性(TG-TK-α-IRES-neor) ネオマイシン耐性遺伝子(neor)を、pBabe Neoプラスミド〔モ ルゲンスターンおよびランド「Nucl.Acids Res.」18(1990年)3587-3596頁]か ら、Hind III/Cla Iによる消化と、前記neor遺伝子を含有する 1165 塩基対のフ ラグメントのゲル電気泳動法および「Promega Wizard PCR キット」による回収 によって得た。 内部リボソーム導入部位配列に由来するポリオウイルスを含有するpPBSプラス ミド[モルガン「Nucl.Acids Res.」1992年、20、1293-1299頁]を、Hind III/C la Iによって消化した。しかし、これは同時に行う ことができ、または、順次に行える。なぜなら、これらの制限部位は、互いにあ まりにも近くにあったからである。この問題点を克服するためには、このプラス ミドを最初にHind III によって消化し、5'および3'末端のHind III 制限部位 を含有するDNAの200 塩基対のフラグメントを挿入することによって、これら の部位を分離した。次いで、このpPBSプラスミドを、最初にClaIによって消化 し、次いでHind III によって消化することができた。 末端リン酸基を、ウシ腸ホスファターゼ(CIP)を使用して、Hind III/ClaI 切断pPBSベクターから除去した。このベクターを1%アガロースゲルを使用して ゲル精製し、このDNAを含有するバンドを切除し、電気泳動溶出した。 次いで、ネオマイシン遺伝子を、pPBSプラスミド中へと終夜15℃で連結し、こ の連結反応物を、新しく生産したMC1061受容細胞中へと形質転換させた。 陽性のコロニーを、Hind III/ClaIと共に調製プラスミドの消化によって同定 した。この「neor」遺伝子とプラスミドとを、陽性のコロニーから、プラスミド 調製物中で電気泳動によって検出した。次いで、陽性のコロニーからのプラスミ ドを、Hinc II およびSacIによって消化した(双方の制限酵素は、平滑末端を 有する消化されたDNAを残す)。こうして得られたIRES-neoR フラグメントを 含有するSac I/Hinc II 消化物を、1%電気泳動ゲル上に流し、適当な寸法のバ ンドを切除し、このDNAを電気泳動溶出させ、エタノールで沈殿させた。 TG-TK αプラスミド(米国国立衛生保健研究所の遺伝子バンク登録番号 JO222 4 から自由に入手できる。サンテリ等、1993 年)DNAを、「Promega Wizard 」小型装置を使用して調製し、NarIによって消化した。このプラスミドの末端 を、T4ポリメラーゼを37℃で1時間使用し、次いで、CIP を用いて末端リン酸基 を除去することによって、平滑化した。このCIP は、フェノール/ クロロホルム を用いてそのDNAを処理し、次いでエタノール中で沈殿させることによって、 不活性化した。こ うして得られたプラスミドを、1%アガロースゲル上で電気泳動させ、このDN Aを回収し、挿入体と、プラスミドの挿入体に対するモル比率1:3 で連結させた 。 この連結を、15℃で終夜培養し、次いで受容MC1061細胞を形質転換させるため に使用した。調製プラスミドをBamH I(この正確な構成は、3980、1663 、3102および1039塩基対のサイズの制限フラグメントをもたらす)で消 化することによって、陽性のコロニーを選択した。 調製プラスミドを、Sa1I制限酵素で消化することによって、このプラスミド の直線化を達成した。この構成体を図1に示す。 (ii) サイトメガロウイルス- シトシン デアミナーゼ-sv40 プロモーターネオ マイシン耐性(CMV-CD-SV40-neor、またはCD2-NEOr) pCD2プラスミド(ミューレン等「PNAS」89(1992 年)33-37頁)を、EcoRI およ びEcoR Vによって消化し、この消化物を1%アガロースゲル上で電気泳動させ、 ここでシトシン デアミナーゼ遺伝子、SV40プロモーターおよびネオマイシン耐 性遺伝子を含有する 2.5kb のフラグメントを、電気泳動溶出に引き続いてエタ ノール沈殿させることによって、回収した。 末端リン酸基が確実にこのフラグメント中に存在するようにするために、フラ グメントをポリヌクレオチド キナーゼによって処理した。 pCI ベクターをEcoRIおよびSmaI(平滑末端を有するDNAを残す制限酵素 )によって消化し、この末端リン酸基をCIP を用いて除去し、酵素をフェノール / クロロホルムによって不活性化し、次いでエタノール中で沈殿させた。次いで 、このバンドをゲル精製し、電気泳動溶出によって回収した。 挿入体のベクターに対するモル比率が3:1 である連結を準備し、15℃で終夜実 施した。この連結混合物を使用して、新しく調製した MC1061受容細胞を形質転 換させ、調製プラスミドをEcoRIおよびHind IIIで消化することによって陽性の コロニーを選択し、それぞれ1868塩基対お よび5062塩基対の長さを有する制限フラグメントを得た。このプラスミドの直線 化を、Bg1Iで消化することによって達成した。 この構成を図2に示す。 C.トランスジェニック動物の生産 確立された方法(ホーガン、B.、コンスタンチーニ、F.およびレーシー、E.(1 986 年)、マウスの胎児の取扱い- 実験室的手引き(Manipulating the Mouse Emb ro-A Laboratory Manual)、コールド スプリング ハーバー研究所、ニューヨ ーク州コールド スプリング ハーバー)に従って、トランスジェニックラット を生産した。簡単に言うと、約 2pl のプラスミドを、5 μ g/ml の濃度で、異 種交配されたスプレイグ- ドーリー胎児の前核中へとマイクロ注射した。次いで 、胎児を偽妊娠した受容細胞中に移植し、トランスジェニック動物を同定した後 に、系統を分離し、確立した。半接合されたメスをトランスジェニックではない オスと交配することによって、系統をトランスジェニックな半接合体として維持 した。 D.インビトロでのトランスジェニック動物からの細胞の陽性/陰性選択 i.繊維芽細胞 成熟した CD2/neor、TG/TK/neorおよび対照動物の肺に由来する繊維芽細胞培 養物を生産し、通常法によって広げた(フレッシュニー(1987年)、アラン,R リ ス,ニューヨーク)。平板培養の24時間後に、ジェネティシン(400 μ g/ml)を 、双方の型のトランスジェニックラットおよび対照例のラットから生じた核培養 物に対して添加し、3日ごとに新鮮な培地によって置換した。必要なときには、 細胞を継代培養(1:3)することによって、これらが融合し始めるのを防止し、こ れもまた基本的方法によった(フレッシュニー、1987年)。細胞の計数は、不作 為に選択した20の視野内でマニュアルで行い、継代培養によって変化させた後 で、各時点での値を総計した。表2からわかるように、対照例の動物や、ジェノ チシンによる処理の後10日以上生存したTG/TK/neorトランスジェニック動物に 由来する繊維芽細胞はなかった。ジェノチシンの添加がない場合には、トランス ジェニック動物のいずれからも、細胞の生存率の変化は観測されなかった。 また、5-フルオロシトシン(5-FC)の作用も測定した。100 μgの濃度の5-フル オロシトシンは、対照例の動物またはTG/TK/neor トランスジェニック動物に由 来する繊維芽細胞に対して効果がなかった。しかし、CD2/neor トランスジェニ ック動物に由来する細胞においては、5FC の存在下で10日間培養した後には、最 初に平板培養した細胞のうち94%が死ぬか、あるいは機能しなくなった(トリパ ンブルーを排除できないことで、そのように決定した)(表2)。対照的に、5FC が存在する対照例のラットからの培養物と存在しない対照例のラットからの培養 物との間や、5FC を添加していない対照例とCD2/neorラットから採取した培養物 との間には、細胞の計数に顕著な相違は見られなかった(表2)。 薬剤は、培養物中に二日目に添加した。各値は、平板培養後の種々の時点にお ける薬剤添加なしの対照例の培養物に見いだされた細胞数に対する相対値であり 、継代培養によりもたらされる希釈をさせている。表示は、三回の異なる測定値 の平均値であり、標準誤差はすべてこの平均値の15%未満であった。 ii.甲状腺細胞 成熟した CD2/neor、TG/TK/neorおよび対照例の動物の甲状腺に由来する甲状 腺培養物を、通常法(フレッシュニー、1987年)に従って生産した。平板培養の 24時間後に、ジェネティシン(400 μ g/ml)を、双方の型のトランスジェニック ラットおよび対照例のラットから生じた各培養物に対して添加し、3日ごとに新 鮮な培地によって置換した。必要なときには、細胞を継代培養(1:2)することに よって、これらが融合し始めるのを防止した。細胞の計数は、不作為に選択した 20の視野内でマニュアルで行い、継代培養によって変化させた後で、各時点で の値を総計した(表3)。最初にジェネチシンを適用してから10日後に、10μg/ml のアシクログアノシン(ACG、シグマ社)を、TG/TK/neorトランスジェニック動物 中に生じた甲状腺細胞へと添加した。10日後、再び無作為に選択した20視野の細 胞の計数を行った。結果を表3 に示す。要約すると、トランスジェニック動物の 双方の型に由来する細胞は、ジェネチシンによる処理を生き延びた一方、対照例 の細胞は生き延びなかった。TG/TK/neorトランスジェニック動物に由来する細胞 は、ACG による処理を生き延びなかったが、対照例の動物に由来する細胞は生き 延びた。これらの結果は、それぞれ、TG/TK/neorおよびCD2/neorトランスジェニ ック動物における陽性および陰性の選択可能なマーカーの特異的および非特異的 な形質発現の観点から、予測されたものであった。いかなる薬剤の添加もない状 態で培養されたTG/TK/neorトランスジェニックラットの甲状腺細胞は、対照例の 甲状腺細胞の培養物と比較して、その成長や生存率についていかなる差異も示さ なかった(表3)。 薬剤は、培養物中に二日目に添加した。各値は、平板培養後の種々の時点にお ける薬剤添加なしの対照例の培養物に見いだされた細胞数に対する相対値であり 、継代培養によりもたらされる希釈をさせている。表示は、三回の異なる測定値 の平均値であり、標準誤差はすべてこの平均値の15%未満であった。 E.CD2-neorトランスジェニック動物からの細胞を使用する組織培養物中の不妊 性の向上 トランスジェニックラットのCD2-neorに由来する脊髄細胞の培養物を、既存の 確立された方法(フォスター等、1990年、「Eur.J.Neurosci.」3、32-39)を採用し て、小型のフラスコ中で成長させた。実験期間の最初に、100の酵母菌胞子の 領域中に、未知の量の他の通常の実験室的な微生物汚染源をフラスコ中に導入し た。これと同時にジェネチシン(1mg/ml)を添加した。この後は、すべての培地 とフラスコへの添加物との取扱いを、層流キャビネットの無菌環境の外側で行っ た。最初の平板培養の60日後には、いかなる形の汚染の証拠も明確ではなかっ た。実際に、神経細胞の生存および発生は、ジェネチシンが存在しない条件下で 成長した未感染の対照例の脊髄細胞に比べて、損傷されていないように見えた( 図3参照。これらは、妊娠の14日目における、(A)対照例のラット胎児と( B)CD2/neorトランスジェニックラット胎児に由来するインビトロの脊髄培養物 の60日の位相差顕微鏡写真を示す。この後者の培養物は、意図的に酵母菌および 他の微生物に感染させ、同時にジェノチシンによって処理した。ジェノチシンを 適用した後にも、感染を発見することはできなかったが、一方ジェノチシンなし に感染した細胞は、4日または5日の間に、微生物の成長によって圧倒された。 F.インビボでの甲状腺卵胞細胞のアブレーション 成熟したメスのラット(250g)に、1日当たり50mgのACG を5日間腹腔内注射 した。この最後の注射の7日後に、T3 とT4 との各血清レベルを測定し(アメル シャム、英国)、トランスジェニック動物におい ては、0.76、0.05nMから0.06nM未満にまで低下し(T3)、58.2、3.2nMから2.5nM 未満まで低下(T4)(N=6)していることを見いだした。トランスジェニック動物へ の塩の投与は、T4 に0.68、0.07nM(n=6)への小さいがしかし顕著ではない低下を もたらした。12日間、ACG によって処理したトランスジェニックラットの甲状腺 は、最初の重量の7 %にまで萎縮した。これらの甲状腺の組織化学的分析によっ て、卵胞細胞のほとんどすべてが失われており、非卵胞細胞のみ、おそらくはカ ルシトシン生産細胞が残留していることが明らかになった。1日当たり低量のAC G を投与すると、T3 およびT4 に部分的に損失がもたらされた。トランスジェ ニック動物からのほとんどの他の組織においては、HSV-チミジンキナーゼ活性( ブリンスター等、1981年「Cell」27、223-231 頁; ジャミーソン等、1974年「J.G en.Virol.」24、481-492 頁)は、検出可能な量では形質発現しなかった。細胞 損失の組織化学的な証拠は、副甲状腺、顎下腺または副腎腺においても、心臓、 肝臓または脳内においても示されていなかった。 要約すると、双方の型のトランスジェニック動物、またはこれに由来する細胞 は、ACG または5FC を適用するまでは、適当なものとして明らかに正常であった 。この適用の後には、インビボにおいても、インビトロにおいても、感受性が付 与された細胞は急速に破壊された。更に、双方のトランスジェニック生物に由来 する細胞は、ジェネチシンの細胞毒性作用に対して耐性であり、一方、トランス ジェニックではない対照例に由来する細胞は、完全に全滅した。 実施例2:陽性および陰性の選択可能なマーカーを保持するトランスジェニック マウスの生産についてのプロトコルの提案 単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ遺伝子(tk)(tkプロモーターに 操作可能なように連結されている)および細菌ネオマイシンホスホトランスフェ ラーゼ(neo)遺伝子(SV40 初期プロモーターに操作可能なように連結されている) を、プラスミドベクターの適切なクローニ ング部位中へとクローニングする。 このプラスミドベクターを、制限エンドヌクレアーゼによって消化し、tk お よび neo 選択可能なマーカーの双方を(これに対して操作可能なように連結さ れている形質発現因子と共に)含有するフラグメントを、アガロースゲル上で分 離する。 次いで、このゲル上に分離されたフラグメントを精製し、無菌化された単細胞 マウス卵のオス原核中へと、TE 緩衝液(10mM トリス、pH7.5、0.2mM EDTA)中に 1-2 μg/ml のDNAを含有する濃度で注入する。これらの卵は、CBA ×C57BL/1 0交配に由来するものである。 次いで、マイクロ注射を生き延びた卵を、例えばワーグナー等 1981年「PNAS 」78、5016頁に記載されているようにして、偽妊娠したメスへと移し、発生、出 産させた。 7-14 日の歳で、各児を分析し、トランス遺伝子が存在しているかどうかを測 定した。DNAを、尾の一部から、[サムブルック等1989年、「Molecular clon ing」コールド スプリング ハーバー]に記載されている方法によって調製し た。neo 遺伝子およびtk遺伝子の存在は、標識された tk および neo 特異的な プローブによって測定することで決定する。 このように同定されたこれらのトランスジェニックマウス児を交配させ、これ らの子も分析し、トランス遺伝子のメンデル遺伝について検査する。 実施例3:マウス甲状腺卵胞細胞の選択培養のためのプロトコルの提案 トランスジェニックマウスを実施例1に記載したようにして調製するが、ただ しneo遺伝子をチオグロブリンプロモーター(例えば、クリストフ等(1989 年 )「Molecular and Cellular endocrinology)64(1)5-18頁; クリストフ等(1987 年)19、「Suppl.」17、70-73 頁; およびルーデント等(1990 年)「PNAS」87(16)61 76-6180 頁に記載されている)の制御の下に配置する。 トランスジェニックマウスを犠牲にし、その甲状腺組織を除去し、初代培養物 を抗生物質G418の存在下に調製した。この抗生物質は、neo 遺伝子を形質発現し ない細胞を殺し、甲状腺卵胞細胞の初代培養物(混合細胞)内に選択的な培養を もたらす。 実施例4:モノクローナル抗体の調製プロトコルの提案 細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子(sv40初期 プロモーターに対して操作可能なように連結されている)を、プラスミドベクタ ーの適切なクローニング部位中へとクローニングさせた。次いで、このプラスミ ドを制限エンドヌクレアーゼで消化し、neo選択可能なマーカーを含有するフ ラグメントをアガロースゲル上で分離し、次いでneoトランス遺伝子を保持す るトランスジェニックマウスを、実質的に実施例に記載したようにして調製する 。 モノクローナル抗体が必要とされている対照の抗原を精製し、フロイントの補 助液と共に、上記したようにして調製したトランスジェニックマウス中に注射す る。次いで、このマウスを犠牲にし、マウスの脾臓を除去し、組織培養液中に配 置する。この脾臓を細かく裂いてリンパ球を放出させ、これらのリンパ球を遠心 分離によって分離させる。次いで、これらのリンパ球を、ポリエチレングリコー ルの存在下に骨髄腫融合パートナーと混合し、融合を引き起こし、ハイブリドー マを生成させる。 マウスリンパ球中でneo選択可能なマーカーの存在に基づいて抗生物質G1 48を培養物の培地に補充することによって、ハイブリドーマを選択する。次い で、これらのハイブリドーマを、希釈を制限することによってクローニングし、 この関連クローンを、適切な結合アッセイによってスクリーニングすることによ って同定する。 この骨髄腫細胞系は、陰性の選択可能なマーカー(例えばHPRT-)を有し ている必要がない。更に、この培養物中のG418の存在によって、培養物の感染の 危険が減少し、取り除かれる。 実施例5:パーキンソン病のラットモデルの調製のためのプロトコルの提案 単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ遺伝子(tk)を、ニグラ物質中の ドーパミン作用ニューロン内でのみ活性であるプロモーターへと操作可能なよう に連結させ、プラスミドベクターの適切なクローニング部位中へとクローニング する。 このプラスミドを制限エンドヌクレアーゼによって消化し、前記のtk選択可能 なマーカーを含有するフラグメントをアガロースゲル上で分離し、次いでこのtk 遺伝子を保持するトランスジェニックラットを、実質的に実施例1に記載したよ うにして調製する。 次いで、ガンシクロビールを、トランスジェニックラットの脳のニグラ部質領 域中へと注射によって投与することによって、陰性の選択可能な tk マーカーを 形質発現するドーパミン作用ニューロンを特異的に除去または欠損させ、これに よってパーキンソン病のモデルラットを得た。 実施例6:アルツハイマー病のラットモデルを調製するためのプロトコルの提案 単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ遺伝子(tk)を、旧皮質および新 皮質に関連するアセチルコリン、セロトニンおよび/ またはノルアドレナリン作 用ニューロン中でのみ活性であるプロモーターへと操作可能なように連結させ、 プラスミドベクターの適切なクローニング部位中へとクローニングする。 このプラスミドを制限エンドヌクレアーゼによって消化し、前記の選択可能な tk マーカーを含有するフラグメントをアガロースゲル上で分離し、次いでこの tk トランス遺伝子を保持するトランスジェニックラットを、実質的に実施例1 に記載したようにして調製する。 次いで、ガンシクロビールを、トランスジェニックラットの脳の適切な領域中へ と注射によって投与することによって、陰性の選択可能な tkマーカーを形質発 現する、新皮質および旧皮質に関連するアセチルコリ ン、セロトニンおよび/ またはノルアドレナリンニューロンを特異的に除去また は欠損させ、これによってアルツハイマー症のモデルラットを得た。The present invention relates to transgenic organisms having cells with one or more selectable phenotypes and methods of using the same. Transgenic organisms, such as transgenic animals, have been known for many years. Although the term was sometimes applied to any organism containing exogenous DNA, the term "transgenic organism" is used herein in its more ordinary sense and refers to germline Eukaryotes (especially animals or plants, especially vertebrates such as mammals) containing heterologous chromosomal DNA therein and their progeny are indicated. This heterologous chromosomal DNA has a coding sequence hereinafter referred to as "transgene". Thus, any cell (or at least most of the cells) that a transgenic organism has-both somatic cells and germ cells-may contain one or more copies of this transgene. Transgenic organisms can be produced in many different ways. These methods are well documented in the prior art, and implementing these methods is part of the technical repertoire of those skilled in the art. Commonly used methodological approaches are described, for example, in Butterworth Heinemann, MA, USA, First Edition and "Hazeltine Edition" of "Transgenic Animals" (1991). In one known method, the transgene is inserted into fetal stem cells, which are then injected into a sterilized zygote, while only a few cells are present. The fetal stem cells thus treated begin to integrate into the zygote, and cells derived therefrom continue to differentiate into many or all of the different cell types of the animal. The cells also include those that contribute to the germ line, so that the progeny of this (chimeric) animal can be fully transgenic. Other methods include introducing the transgene into prokaryotes or into sterile or non-sterile eggs. It is also known in the art to treat cells or otherwise induce cells to express genes that impart any of a variety of selectable phenotypes on the cells. These genes are known as selectable markers. These are usually introduced into cells as part of a recombinant expression vector. The selectable phenotype conferred by the selectable marker can be classified as either positive or negative. A positive selectable phenotype is a phenotype that allows survival under certain circumstances that can kill (or at least inhibit or damage cell growth) cells that do not exhibit this positive selectable phenotype. is there. A negative selectable phenotype is an expression that results in the destruction (or inhibition or damage of cell growth) of this cell under specific circumstances that are relatively harmless to cells that do not display the negative selectable phenotype Type. A variety of selectable markers are available. Genes that can be widely applied as positive selectable markers include bacterial neomycin phosphotransferase (neo: Colbere-Garapin et al, 1981, 150: 1), hygromycin phosphotransferase (hph; Santerre et al. (Santerre et al.) et al) 1984 "Gene" 30: 147) and xanthine guanine phosphoribosyltransferase (gpt; Mulligan and Berg 1981 "PNAS" USA 78: 2072). Also used as positive selectable markers are herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (HSV-1 TK; Wigler et al. (Wigler et al) 1977, Cell 11: 223), adenine phosphoribosyl Transferase (ARPT: Wigler et al. (Wigler et al) 1979, `` PNAS '' U.S.A. 76; 1373) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT; Jolly et al. (1983) `` PNAS '' U.S.A. 80; 477) . These latter markers must be used in cells with a particular mutant genotype (ie, one that results in a deficiency in the gene product on which selection is based). Also, some of the aforementioned genes result in a positive as well as a positive selectable phenotype. These include the HSV-1TK, APRT, HPRT and gpt genes. The enzymes encoded by these genes can catalyze the conversion of certain nucleoside or purine homologs to cytotoxic intermediates. For example, the nucleoside homolog ganciclovir (ganciclovir: GCV) is a good substrate for HSV-1 thymidine kinase, but a poor substrate for native thymidine kinase found in mammalian cells. There is only. As a result, GCV was able to select effective negative selections for cells expressing this HSV-1TK gene [St. Clair et al. 1987, “Antimicrob. Agents Chemother.” 31: 844]. Can be used to Xanthine guanine phosphoribosyltransferase, when expressed in wild-type cells [Besnard et al., 1987, "Mol. Cell. Biol." 7: 4139], has both positive and negative selection. Can be used. Selectable markers are commonly used in both prokaryotic and eukaryotic gene processing to allow cells that have undergone relatively rare genetic changes to be recovered from a mixed population. I have. For example, by using these markers in physical association with another gene that encodes a product of interest (eg, a therapeutic protein), cells inoculated with this other gene can be selected as described above. Can be selected with markers. For example, the neo gene has been used to monitor genetically modified cells taken from patient samples after gene therapy has been performed. It has also been proposed to use negative selectable markers as safety devices in gene therapy. Many gene therapies involve removing somatic cells from the patient, introducing a therapeutic gene into it, which repairs a biochemical lesion, and then reintroducing the cells back into the patient. For example. Genetically modified cells thus re-introduced may eventually prove to be detrimental to the patient's health (for example, if they are not immunocompatible). , Or when it turns out to be malignant), the subsequent selective removal of genetically modified cells (if necessary) by introducing a negative selectable marker with the therapeutic gene It is possible to do. Numerous vectors carrying positive or negative selectable markers have been produced and are readily available to those skilled in the art (for a review, see Miller (1992) Nature 357: 455-460). Others can be readily produced using standard gene cloning techniques. Transgenic organisms carrying selectable markers as transgenes are known in the art. In general, by introducing a selectable marker, cells that have also taken in the target gene can be collected, and the selectable marker is linked to the target gene. For example, many such transgenic organisms have been constructed in the course of research involving the introduction into germline cells with genetic information that disrupts normal phenotype (see WO / 91/13150). Also, transgenic organisms carrying selectable markers have been constructed in the course of constructing animals with specific genetic lesions. Here, the selectable marker has been inserted (usually by recombination of homology) into a particular gene, thereby inactivating the particular gene in the inserted state. The selectable phenotype conferred by the selectable marker is then used as a basis for the identification and recovery of cells that retain replication-inactivated replication of the gene. Examples of transgenic animals produced by this method are described in [Piedrahita et al., 1992, "PNAS" 89, pp. 4471-4475]. In vitro tissue / cell culture methods are fundamental to pharmaceutical, clinical, agricultural and industrial research. For example, tissue / cell culture methods have been used in the pharmaceutical industry for the preparation of pharmaceuticals (eg, therapeutically active protein products) or for measuring or screening drug potential. However, these in vitro cell / tissue culture techniques are slow, labor intensive, and expensive. One important problem is infection during culture (usually caused by microbial contamination by bacteria, yeasts and / or fungi). This is usually addressed by using various antibiotics, which are added into the medium to eliminate and reduce the growth of contaminants. However, the use of antibiotics does not completely eliminate the risk of infection, especially from contamination by yeasts and / or fungi, many of which are resistant to commonly used antibiotics. Another important problem arises from the need to culture a single tissue or cell type. In vitro growth from a single cell can be difficult (often requiring the use of a mixture of feeder cells and / or growth factors and other adjuncts), and thus a homogeneous in vitro Populations are not readily available. Therefore, there is a need for a convenient source of all types of cells / tissues, for primary culture or for other purposes. It has now been found that transgenic organisms carrying positive and / or negative selectable markers have previously unrecognized utility in cell culture technology. The transgenic organisms provided by the present invention constitute a very convenient source of material, particularly for the isolation, identification, culture and analysis of cells from any tissue of the organism's body. Tissues isolated from the transgenic organisms of the present invention can be particularly easily grown in vitro (even as a homogeneous population of a particular cell / tissue type), allowing for pharmacological measurements, synthesis of tissue grafts, It can be used for a wide range of applications, including drug delivery and protein production. According to one embodiment of the present invention there is provided a transgenic eukaryote, wherein the cells of the transgenic eukaryote encode a transgene encoding a positive selectable marker and a negative selectable marker. Heterologous DNA having a transgene that Except for a selectable phenotype resulting from this transgene, the organism may be substantially normal, and these transgenes may be arranged such that they inactivate the gene in an inserted state. Not in. As used herein, the term "substantially normal" means that the organism is not a mutant that produces any significant property or trait for the wild type and / or exhibits normal tissue differentiation and development. Is shown. For example, if the transgene of the organism resides in a silent (ie, non-expressed) region of its genome, and / or the transgene replicates, segregates, organizes or fills chromosomes, or ( The organism may be substantially normal in the sense that it resides in a region of the genome that does not significantly disrupt its interaction with cellular components such as DNA binding proteins (including histones and regulators). . Defining a transgene that encodes both a positive and a negative selectable marker provides great flexibility during subsequent manipulation of cells derived from the transgenic organism in vitro. Furthermore, when the present invention is used to generate tissue grafts, certain types of cells can be isolated from the transgenic animals of the present invention by positive selection. The cells thus isolated can then be transplanted into a non-transgenic animal to determine whether the graft has a therapeutic effect. The graft can then be removed with a negative selection to provide a control to determine whether the graft has a direct therapeutic effect. In another aspect of the invention, there is provided a transgenic eukaryote, wherein the cells of the organism encode a transgene encoding a positive selectable marker and / or a transgene encoding a negative selectable marker. And the organism is substantially normal except for a selectable phenotype resulting from this transgene. Positive and negative selectable markers can be provided by a single transgene. This is because some markers (as described above) can be used as both positive and negative selectable markers (depending on the selection environment employed). The transgenic eukaryote of the invention is preferably an animal or a plant, for example a vertebrate (eg a mammal such as a rat, rabbit, pig or mouse). Preferably, the transgenic organism has a genotype that is substantially wild-type except for the presence of the heterologous DNA. Further, this portion of the heterologous DNA that is expressed in the cell may be comprised of a transgene encoding a positive selectable marker and / or a transgene encoding a negative selectable marker, and The gene is operably linked to one or more expression factors. The absence of expression of the gene sequence from any other transgenesis makes this suitable transgenic organism suitable for extensive experimental studies that require a valid wild-type genotype background. . At least one of the selectable markers is operably linked to one or more regulatable expression factor (eg, one or more tissue- or cell-specific expression factors). In such circumstances, it may be advantageous to specifically modulate each selectable marker, for example, to make each marker a different tissue- or cell-specific one or more trait-expressing factors. To limit the expression of the selectable marker to a selected set of cells or tissues, thus, for example, from a mixed primary cell culture, to a selected set of cells. Alternatively, the present invention can provide for the in vitro selective culture of tissue. Neither does it rely on the use of organisms: any transgenic procedure may be employed in practicing the present invention, and in most circumstances, the precise nature of the selectable marker used in the present invention is not critical. In general, any selectable marker gene can be used as long as it confer a positive or negative selectable phenotype on the cell, eg, a positive selectable marker is neomycin phospho Selectable from transferase, hygromycin phosphotransferase, xanthine guanine phosphoribosyltransferase, herpes simplex virus type 1 thymidine kinase, adenine phosphoribosyltransferase, and hypoxanthine phosphoribosyltransferase. Can be selected from, for example, herpes simplex virus type 1 thymidine kinase, adenine phosphoribosyltransferase, hygromycin phosphotransferase, and hypoxanthine phosphoribosyltransferase.These selectable markers can be included in any of a number of known vectors (eg, restriction endonucleases). Conveniently, such as by subcloning using nucleases, examples of which are described in, for example, [Molecular Cloning: A laboratory Manual / s econd Edition] Sambrook J. Fritsch and Maniatis T. (Maniatis T) edited by Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]. Trait expression factors for use in the present invention are those which are capable of directing and / or regulating (at least under certain circumstances) the trait expression of a gene to which they are operably linked. It can take any form as long as it is present. The expression factor for use in the present invention may comprise transcription and / or translation factors and have regulatory sites such as promoters, ribosome binding sites, enhancers, activators and repressor (operator) sites. May be. Suitable expression factors include promoters selected from those suitable for a wide range of uses, examples of which are shown in Table 1. This table is not exhaustive, but also shows how the promoters can be placed in the methods of the invention described below. By way of example only, a trait-expressing factor for use in the present invention may comprise: (i) dopaminergic, serotonergic, GABA-, cholinergic or peptidergic neurons and subpopulations thereof; (ii) oligodendrocytes Cells, astrocytes and subpopulations thereof, (iii) endocrine glands, lung, muscle, gonads, gastrointestinal, skeletal tissue or a part or parts thereof; (iv) epithelium, fibroblasts, fat, mast, A promoter or enhancer that is specifically active in leaf or parenchymal cells, (v) a particular stage of embryogenesis, and (vi) components of the blood system (eg, T-lymphocytes, B-lymphocytes and macrophages). You can choose from. Alternatively, they may include: (i) neurotransmitter-specific receptors; (ii) ion channels; (iii) receptors involved in ion channel gating; and (iv) cytokines, growth factors and hormones: And / or an enhancer that transcribes the gene for transcription. Advantageously, at least one of the selectable markers can be expressed as a component. This ensures uniform expression of the selectable marker under all circumstances in each transgenic cell of the transgenic organism, and allows the transgenic organism to be used as a source organism for cell / tissue culture for general use. This is particularly useful where it has been done. Constitutive expression can be achieved, for example, by using a promoter that promotes expression of a "growth essential" gene. A "growth essential" gene is one that is expressed in all cell types. The products from which they are translated are required as part of the general cellular metabolism or cellular structure, so that "growth essential" genes are not specifically expressed in certain cells or tissue types. Therefore, a growth-essential gene promoter needs to be active in a wide range (and sometimes all) of cell types to ensure constitutive gene expression. Examples of constitutively expressed promoters useful in the present invention include, for histocompatibility, the complex H-2K b Class 1 promoter [Weiss et al., 1983, Nature 301, 671-674; Baldwin and Sharp, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 305-313; Kimura et al., 1986, Cell 44. 261-272], which have generally been shown to express downstream coding sequences in cells when used as promoters in transgenes [Jat et al., "PNAS USA" 88, 5096-5100]. Another example is the viral SV40 early promoter. The promoter used in the present invention is not limited to a promoter derived from a mammalian cell, and may also include a promoter derived from birds and fish. In addition, promoters derived from viruses, some of which have biological activity in a wide range of mammalian, fish and bird cells, and other eukaryotic cells, can also be used in practicing the present invention. For example, retroviruses having an early or late promoter derived from Simian virus-40, or promoter and enhancer elements, which promote expression of the sequence under the influence of the retrovirus in a wide range of eukaryotic cells There are retroviral terminal repeat units (LTRs) that have the ability to These promoters, as well as supporting sequences such as enhancer elements and other regulatory elements, are well known to those skilled in the art [see, eg, "Molecular Cloning: A laboratory Manual / second Edition" Sambrook J. et al. Edited by Fritz and Maniatis T, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. " Further, the transgenic organism of the present invention may further contain a heterologous DNA having a reporter transgene, for example, 3-galactosidase or luciferase. The reporter transgene is itself operably linked to one or more expression factors that are subject to cell or tissue specific regulation. Such a reporter transgene facilitates subsequent analysis of cells / tissues cultured from the transgenic organism, and in particular, the response of one particular trait expresser or set of trait expressors (eg, Response to defects induced in a set of cells / tissues) can be monitored in vitro or in vivo. In another aspect of the present invention, there is provided a method of culturing cells and / or tissues in vitro, comprising the steps of (a) transfecting a cell containing genetic material that confers a selectable phenotype on the cell. Providing a transgenic animal or plant; (b) generating a primary culture from cells and / or tissues of the transgenic organism of step (a); and (c) being contained in the cells of the transgenic organism. Selectively growing said primary culture based on said selectable phenotype conferred by said genetic material. Preferably, the cell / tissue culture method of the present invention employs a transgenic organism having a selectable marker operably linked to one or more tissue or cell-specific trait-expressing factors. Whereby, in step (c), specific cells / tissue types are selectively grown based on tissue / cell-specific expression within said at least one selectable marker. . The preferred method of the invention finds use, for example, in selecting thyroid vesicle cells from primary (mixed cell) cultures. According to this method, a primary stromal cell population of the thyroid gland can be brought about in the absence of thyroid vesicle cells, useful for the study of thyroid biology, and a new therapeutic agent for the treatment of thyroid disease Can constitute a unique cell culture system useful in the development of Also, the cell / tissue culture method of the present invention can be carried out in step (c) to reduce and eliminate microbial contamination of the tissue culture, thereby having a common problem in cell culture systems, namely, Contamination of the culture (particularly contamination by fungi and yeast) can be reduced or eliminated. In addition, the transgenic organism of the present invention can be used as a source of lymphocytes in a method for producing a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies are of fundamental importance in biotechnology. This preparation method comprises the steps of (a) immunizing an animal by injecting an antigen of interest, (b) removing a spleen from the animal, preparing lymphocytes from the spleen, and (c) Producing hybridomas by fusing with immortal cells (usually myeloma cells), (d) selectively growing the hybridomas, and (e) cloning the hybridomas to secrete the desired monoclonal antibody A series of steps to produce a clone. The step of selectively growing hybridomas (step (d) above) can usually be achieved in a myeloma fusion partner, based on the HPRT genotype, wherein the myeloma fusion partner comprises unfused myeloma cells. Inhibit growth in selective media containing hypoxanthine, aminopeterin and thymidine (HAT media). This limits the choice of fusion partner. Accordingly, the method for producing a monoclonal antibody specific for an antigen provided in another aspect of the present invention comprises the steps of: (a) transgenic having a lymphocyte containing genetic material that confers a selectable phenotype on the lymphocyte; Providing an organism (eg, rat, rabbit, pig or mouse); (b) immunizing a transgenic organism with said antigen; (c) removing lymphocytes from said transgenic organism; (d) said step (c). Producing hybridomas by fusing the lymphocytes with immortal cells (eg, tumor cells such as myeloma cells); and (e) conferred by the genetic material contained in the lymphocytes. And selectively culturing the hybridoma based on a selectable phenotype. The presence of a selectable marker in the lymphocyte preparation from the transgenic organism eliminates the need for, for example, the HPRT selection process and expands the repertoire of fusion partner cells available for hybridoma generation. The transgenic organisms of the present invention also find use in diseases or disorders involving cell loss. Many diseases and disorders are known to be associated with the loss of certain cells and / or tissues. For example, in neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Huntington's disease and Alzheimer's disease, one or more subpopulations of neurotransmitter identifying cells are lost during the course of the disease. In Parkinson's disease, although this loss is primarily a loss of dopaminergic neurons in the substabsia a nigra region of the brain, other cell types are also reduced. In Huntington's disease, there is a more general loss of neurons, but in this case this loss is largely limited to the striatum. In Alzheimer's disease, acetylcholine, serotonin and noradrenaline, which contain neurons that protrude into the neocortex and the old cortex, are reduced. Other neurological diseases and disorders also result from degeneration of nerve cells; for example, demyelination that occurs in multiple sclerosis is due to destruction of oligodendrocytes in the brain. Human immunodeficiency virus (HIV) is known to invade cells that express the CD4 receptor, and infection of the cells appears to ultimately result in cell death. Loss of CD4 cells results in catastrophic inhibition of the entire immune system and death of infected individuals. The molecular / cellular basis of the disease caused by HIV is poorly understood. This is due, at least in part, to the lack of a model system to study the development of this disease, especially in vivo. The adoption of primate-infected SIV (simian immunodeficiency virus) has been considered as a paradigm, but SIV-infected monkeys do not have a fully developed AIDS. In many cases, monkeys show no symptoms. Another model that has been proposed to date has been HIV-infected chimpanzees. Apart from the possibility of ethical considerations, the development of AIDS-like symptoms in such models takes several years, significantly delaying research and developing effective treatments. Thus, the animal models of the various diseases and disorders discussed above are essential as subjects for potential drugs and as subjects in basic clinical research. The choice of these animal models is currently very limited due to the difficulties associated with selectively destroying specific cells and / or tissue types. Accordingly, in another aspect of the present invention, there is provided a method for selectively removing or reducing a particular tissue or cell type in an organism, the method comprising: (a) providing a tissue or cell type to be removed or reduced. Providing a transgenic organism having a negative selectable marker operably linked to an expression factor (eg, a promoter) specific for (b) administering a selection agent to the organism. Removing or reducing said tissue or cell type based on the expression of said negative selectable marker within said tissue or cell type. The selective agent can be administered by any route. If systemic administration is required, oral, parenteral or intravenous routes can be employed. If local administration is required (eg, if the tissue or cell type to be removed is restricted to a particular organ or area of the body), targeted injection, subcutaneous implantation (eg, slow release) Capsules) or catheter insertion. For example, tissue within a particular region of the brain can be specifically targeted by intracerebral injection. Diseases / disorders involving loss of cells associated with the disease, such as immunity (such as AIDS, Parkinson's disease and Alzheimer's disease), employing the methods of the present invention for selectively removing or reducing specific tissues or cell types. An in vivo model of a deficiency or neurodegenerative disease / disorder can be provided. Accordingly, in another aspect of the invention, there is provided a method of modeling cell / tissue loss or atrophy associated with a disease / disorder, the method comprising: (a) subjecting the disease / disorder to removal or atrophy associated with the disease. Providing a transgenic organism having a negative selectable marker operably linked to a trait-expressing factor (eg, a promoter) specific for the tissue or cell type being treated, and (b) providing a selection agent. Administering to the organism, removing or reducing the tissue or cell type based on the expression of the negative selectable marker in the tissue or cell type. The present invention also provides a method (eg, an in vitro method) for determining the effect of deficiency of a first set of cells of an organism on the properties of a second set of cells, the method comprising: a) providing a transgenic organism having a first negative selectable marker operably linked to a trait expressor specific for a first set of cells, wherein the transgenic organism comprises: (I) a positive selectable marker operably linked to a trait-expressing factor specific for the second set of cells, or (ii) the presence of the organism excluding the second set of cells. (B) having any of the second negative selectable marker operably linked to a transcript that directs the expression of said negative selectable marker in all cells; ) Administering a selective agent to said organism Thereby causing a defect in said first set of cells based on intracellular expression of said negative selectable marker; (c) removing cells from said organism: and (d) (i A) removing in step (c) based on intracellular expression of said positive selectable marker, or (ii) based on lack of intracellular expression of said negative selectable marker. And selectively culturing the second set of cells from the collected cells. In another aspect of the present invention, there is provided a method of screening a compound for pharmacological activity against a disease or disorder involving cell / tissue loss or atrophy, comprising: (a) (i) treating a disease / disorder Providing a transgenic organism having a negative selectable marker operably linked to a trait-expressing factor (eg, a promoter) specific to the tissue or cell type that has been subjected to the associated ablation or atrophy, and then ( ii) administering a selection agent to the organism to remove or reduce the tissue / or cell type based on the expression of the negative selectable marker in the tissue or cell type to obtain a test model; Providing a test model of said disease by steps; (b) administering said compound to be tested to said test model; Screening each compound based on the effect of the compound on the test model of step (a). The method of the present invention can be effectively applied to any disease or disorder associated with cell / tissue loss or atrophy. In particular, the method of the present invention has particular utility in terms of neurodegenerative or immunodeficient diseases: for example, (a) Parkinson's disease (tissues containing dopaminergic neurons in nigra substances / to be removed or deleted / Or cell types), (b) Huntington's disease (tissue or cell type containing sulcus nerve cells to be removed or deleted), (c) Alzheimer's disease (acetylcholine, serotonin and / or associated with neocortex or old cortex) Or a tissue / or cell type containing noradrenaline neurons to be removed or deleted), (d) multiple sclerosis (a tissue / or cell type containing oligodendrocytes of the brain to be removed or deleted), ( e) cell types containing immune diseases and CD3, CD4 and / or CD8 cells to be removed or deleted) and Containing beauty (f) A IDS and CD4 cells, there is a cell type to be eliminated or defective. In the case of the AIDS model, the method of the present invention provides that a negative selectable marker is linked to a CD4 cell-specific promoter (eg, the CD4 receptor promoter), thereby specifically deficient or deficient in CD4 cells. Can be used to remove. Thus, in vivo negative selection could generate an in vivo model of AIDS by modulating the proportion of cells that express CD4. In addition, if the transgenic animal model carries both positive and negative selectable markers, any residual CD4 expressing cells may be removed from the transgenic tissue of this animal model for further study. Later isolation can be achieved by positive selection in vitro. Examples of various promoters suitable for use in the methods of the invention described above are listed in Table 1, along with the diseases for which each promoter will find use. The invention is also directed to cell / tissue cultures derived from the transgenic organisms of the invention (or produced by the cell culture method of the invention), and to various therapeutic uses of the invention. Is what you do. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples. These examples are not intended to be considered limiting in any way. For example, the methods and techniques required to construct a plasmid vector, to produce the present invention, are well known to those skilled in the art. The following arrangements thus constructed represent examples of the myriad constructions that can be used to practice the invention. The present invention should not be configured to be limited to only these applications. A. Material i. Vectors "pBabeneo plasmid vector" Morgenstern, J. et al. P. And Rand, H., "Nucl. Acids Res." 18 (1990) 3587-3596 (plasmids are freely available). "PCI plasmid vector" Promega, Madison, USA, 2800 Woods Halo Road "CD2 plasmid vector" Blaese, M.S. R. Bethesda, USA, National Institutes of Health (plasmids are freely available). Mullen, CA, Killstrap M., Blaez, RM, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 89 (1992) 33-37. Austin, E. A. And Huber, BE [Mol. Pharmacol. 43 (1993) pp. 380-387. Wallace, PM, Macmaster, J. F. Smith, V. F. Carr, D. E. , Center, PD. And Caesando, WL. "Cancer Res." 54 (1994) 2719-2723. "TG-TK α plasmid vector" Wallace, H .; King's Wildings, University of Edinburgh, UK (plasmids are freely available). Wallace, H. , Ledent, C.E. , Vassart, G., Bishop, J. O. And Alshawi, R .; "Endocrinology" 129 (1991) 3217-3226. "PPBS plasmid" Morgan "Nucleic Acids Research", 1992, 20, 1293-1 299. ii. Molecular Reagent Restriction Endonuclease Promege, 28,000 Woods Hollow Road, Madison, USA. "DNA modifying enzyme, ligase, CIP, T4 polymerase, etc." Promege, 28,000 Woods Hallow Road, Madison, USA. Agarose for electrophoresis Sigma Chemical Corporation, St. Louis, U.S.A. Polynucleotide kinase and buffer, Unit 12, 3397 American Drive, Mississauga, Ontario, Canada, "New England Biolabs Limited." Gene Construction (i) Thyroglobulin-Thymidine Kinase-Internal Ribosome Introduction Site-Neomycin Resistance (TG-TK-α-IRES-neo r ) Neomycin resistance gene (neo r ) Was digested with HindIII / ClaI from the pBabe Neo plasmid [Morgenstern and Land "Nucl. Acids Res." 18 (1990) 3587-3596] r Obtained by gel electrophoresis of the 1165 bp fragment containing the gene and recovery with the "Promega Wizard PCR Kit". A pPBS plasmid containing a poliovirus derived from an internal ribosome entry site sequence [Morgan "Nucl. Acids Res." 1992, 20, 1293-1299] was digested with HindIII / ClaI. However, this can be done simultaneously or sequentially. Because these restriction sites were too close to each other. To overcome this problem, the plasmid is first digested with HindIII and these plasmids are inserted by inserting a 200 base pair fragment of DNA containing HindIII restriction sites at the 5 'and 3' ends. Sites were separated. The pPBS plasmid could then be digested first with ClaI and then with HindIII. Terminal phosphate groups were removed from the HindIII / ClaI-cut pPBS vector using bovine intestinal phosphatase (CIP). The vector was gel purified using a 1% agarose gel, the band containing the DNA was excised and electrophoretically eluted. The neomycin gene was then ligated into the pPBS plasmid overnight at 15 ° C., and the ligation reaction was transformed into freshly produced MC1061 recipient cells. Positive colonies were identified by digestion of the prepared plasmid with HindIII / ClaI. This "neo r Gene and plasmid were detected by electrophoresis in plasmid preparations from positive colonies. Plasmids from positive colonies were then digested with HincII and SacI (both restriction enzymes leave digested DNA with blunt ends). The Sac I / Hinc II digest containing the IRES-neoR fragment thus obtained was run on a 1% electrophoresis gel, the appropriate sized band was excised, the DNA was electrophoretically eluted and precipitated with ethanol. Was. TG-TKα plasmid (available freely from the National Institutes of Health, Gene Bank Accession No. JO2224; Santelli et al., 1993) DNA was prepared using a small device "Promega Wizard" and digested with NarI. did. The ends of this plasmid were blunt-ended by using T4 polymerase at 37 ° C. for 1 hour and then removing the terminal phosphate groups using CIP. The CIP was inactivated by treating the DNA with phenol / chloroform and then precipitating in ethanol. The thus obtained plasmid was electrophoresed on a 1% agarose gel, and the DNA was recovered and ligated to the insert at a molar ratio of the plasmid to the insert of 1: 3. This ligation was cultured overnight at 15 ° C. and then used to transform recipient MC1061 cells. Positive colonies were selected by digesting the prepared plasmid with BamHI (this correct construction results in restriction fragments of size 3980, 1663, 3102 and 1039 base pairs). Linearization of this plasmid was achieved by digesting the prepared plasmid with the SalI restriction enzyme. This structure is shown in FIG. (ii) Cytomegalovirus-cytosine deaminase-sv40 promoter neomycin resistance (CMV-CD-SV40-neo r , Or CD2-NEO r p) The pCD2 plasmid (Muren et al., PNAS 89 (1992) pp. 33-37) is digested with EcoRI and EcoRV, and the digest is electrophoresed on a 1% agarose gel, where the cytosine deaminase gene, SV40 A 2.5 kb fragment containing the promoter and the neomycin resistance gene was recovered by electrophoretic elution followed by ethanol precipitation. The fragment was treated with polynucleotide kinase to ensure that a terminal phosphate group was present in the fragment. The pCI vector is digested with EcoRI and SmaI (restriction enzyme leaving DNA with blunt ends), the terminal phosphate groups are removed using CIP, the enzyme is inactivated with phenol / chloroform and then precipitated in ethanol. Was. This band was then gel purified and collected by electrophoretic elution. A ligation with a 3: 1 molar ratio of insert to vector was prepared and performed overnight at 15 ° C. This ligation mixture is used to transform freshly prepared MC1061 recipient cells and positive colonies are selected by digesting the prepared plasmid with EcoRI and HindIII, increasing the length of 1868 and 5062 base pairs, respectively. A restriction fragment was obtained. Linearization of this plasmid was achieved by digestion with BglII. This configuration is shown in FIG. C. Production of transgenic animals Established methods (Hogan, B., Constantine, F. and Lacey, E., 1986), Handling of mouse embryos-Manipulating the Mouse Embro-A Laboratory Transgenic rats were produced according to (Cold Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Briefly, approximately 2 pl of plasmid was microinjected into the pronucleus of a crossbred Sprague-Dawley embryo at a concentration of 5 μg / ml. The fetuses were then transplanted into pseudopregnant recipient cells and the strains were isolated and established after identifying transgenic animals. The lines were maintained as transgenic hemizygotes by crossing the hemizygous females with non-transgenic males. D. Positive / negative selection of cells from transgenic animals in vitro i. Fibroblasts mature CD2 / neo r , TG / TK / neo r And fibroblast cultures from the lungs of control animals were produced and expanded by conventional methods (Freshney (1987), Alan, R. Ris, New York). Twenty-four hours after plating, Geneticin (400 μg / ml) was added to nuclear cultures generated from both types of transgenic and control rats and replaced with fresh medium every three days did. When necessary, the cells were subcultured (1: 3) to prevent them from beginning to fuse, again by the basic method (Freshney, 1987). Cell counts were performed manually in 20 randomly selected fields of view, and the values at each time point were summed after changing by subculture. As can be seen from Table 2, the control animals and the TG / TK / neo survived for 10 days or more r There were no fibroblasts from the transgenic animals. In the absence of genoticin addition, no change in cell viability was observed in any of the transgenic animals. The effect of 5-fluorocytosine (5-FC) was also measured. A concentration of 100 μg of 5-fluorocytosine had no effect on fibroblasts from control animals or TG / TK / neor transgenic animals. However, in cells derived from CD2 / neor transgenic animals, 94% of the initially plated cells died or failed after 10 days of culture in the presence of 5FC (trypan blue). It was so determined that it could not be excluded) (Table 2). In contrast, cultures from control rat cultures with and without 5FC, and cultures from control and CD2 / neor rats without 5FC. There was no significant difference in cell counts between (Table 2). Drug was added to the cultures on day two. Each value is relative to the number of cells found in the control culture without drug addition at various time points after plating, allowing the dilution resulting from the subculture. Indication is the average of three different measurements and all standard errors were less than 15% of this average. ii. Thyroid cells mature CD2 / neo r , TG / TK / neo r Thyroid cultures derived from the thyroid gland of control and control animals were produced according to conventional methods (Freshney, 1987). Twenty-four hours after plating, Geneticin (400 μg / ml) was added to each culture generated from both types of transgenic and control rats and replaced with fresh medium every three days. did. When necessary, cells were subcultured (1: 2) to prevent them from beginning to fuse. Cell counts were performed manually in 20 randomly selected fields of view and, after changing by subculture, the values at each time point were summed (Table 3). Ten days after the first Geneticin application, 10 μg / ml acycloguanosine (ACG, Sigma) was added to TG / TK / neo. r Added to thyroid cells generated in transgenic animals. Ten days later, cells in 20 randomly selected fields were counted again. Table 3 shows the results. In summary, cells from both types of transgenic animals survived treatment with geneticin, whereas control cells did not. TG / TK / neo r Cells from transgenic animals did not survive treatment with ACG, whereas cells from control animals did. These results are, respectively, TG / TK / neo r And CD2 / neo r This was expected in terms of specific and non-specific phenotypic expression of positive and negative selectable markers in transgenic animals. TG / TK / neo cultured without any drug added r Transgenic rat thyroid cells did not show any differences in their growth or viability when compared to control thyroid cell cultures (Table 3). Drug was added to the cultures on day two. Each value is relative to the number of cells found in the control culture without drug addition at various time points after plating, allowing the dilution resulting from the subculture. Indication is the average of three different measurements and all standard errors were less than 15% of this average. E. FIG. CD2-neo r Improving fertility in tissue culture using cells from transgenic animals CD2-neo in transgenic rats r Cultures of spinal cord cells derived from E. coli were grown in small flasks using existing established methods (Foster et al., 1990, "Eur. J. Neurosci." 3, 32-39). . At the beginning of the experimental period, unknown amounts of other conventional laboratory microbial sources were introduced into the flask in the area of 100 yeast spores. At the same time, Geneticin (1 mg / ml) was added. After this, handling of all media and additives to the flask was performed outside the sterile environment of the laminar flow cabinet. After 60 days of the first plating, no evidence of any form of contamination was apparent. Indeed, neuronal survival and development appeared to be undamaged compared to uninfected control spinal cord cells grown in the absence of geneticin (see Figure 3. On day 14, (A) control rat fetus and (B) CD2 / neo r 1 shows a 60 day phase contrast micrograph of an in vitro spinal cord culture from a transgenic rat fetus. This latter culture was intentionally infected with yeast and other microorganisms and simultaneously treated with genotisin. No infection could be detected after applying genoticin, while cells infected without genoticin were overwhelmed by microbial growth in 4 or 5 days. F. Ablation of Thyroid Follicle Cells In Vivo Mature female rats (250 g) were injected intraperitoneally with 50 mg of ACG per day for 5 days. Seven days after this last injection, the respective serum levels of T3 and T4 were measured (Amersham, UK) and in transgenic animals decreased from 0.76, 0.05 nM to less than 0.06 nM (T3), 58.2, A decrease (T4) from 3.2 nM to less than 2.5 nM (N = 6) was found. Administration of salt to the transgenic animals resulted in a small but not significant decrease in T4 to 0.68, 0.07 nM (n = 6). The thyroid gland of the transgenic rats treated with ACG for 12 days atrophy to 7% of its original weight. Histochemical analysis of these thyroid glands revealed that almost all follicular cells had been lost, leaving only non-follicular cells, possibly calcitocin-producing cells. Administration of low doses of ACG per day resulted in partial loss of T3 and T4. In most other tissues from transgenic animals, HSV-thymidine kinase activity (Brinster et al., 1981, Cell 27, pp. 223-231; Jamison et al., 1974, J. Gen. Virol. 24 481-492) did not express in detectable amounts. No histochemical evidence of cell loss was shown in the parathyroid, submandibular or adrenal glands, nor in the heart, liver or brain. In summary, both types of transgenic animals, or cells derived therefrom, were clearly normal as appropriate until ACG or 5FC was applied. Following this application, the sensitized cells were rapidly destroyed, both in vivo and in vitro. Furthermore, cells from both transgenic organisms were resistant to the cytotoxic effects of geneticin, while cells from non-transgenic controls were completely annihilated. Example 2: Proposal of a Protocol for the Production of Transgenic Mice Carrying Positive and Negative Selectable Markers Herpes Simplex Virus (HSV) Thymidine Kinase Gene (tk) (Operably Linked to a tk Promoter ) And the bacterial neomycin phosphotransferase (neo) gene (operably linked to the SV40 early promoter) are cloned into appropriate cloning sites of a plasmid vector. This plasmid vector is digested with restriction endonucleases and a fragment containing both the tk and neo selectable markers (along with the expression factor operably linked thereto) is placed on an agarose gel. To separate. The fragments separated on this gel were then purified and placed in sterile unicellular mouse egg male prokaryotes in TE buffer (10 mM Tris, pH 7.5, 0.2 mM EDTA) at 1-2 μg / Inject at a concentration containing ml of DNA. These eggs are from the CBA x C57BL / 10 cross. The eggs that survived the microinjection were then transferred to pseudopregnant females for development and delivery, as described, for example, in Wagner et al., 1981, "PNAS", 78, p. 5016. At 7-14 days of age, each child was analyzed to determine if the transgene was present. DNA was prepared from a portion of the tail by the method described in [Sambrook et al., 1989, "Molecular cloning" Cold Spring Harbor]. The presence of the neo and tk genes is determined by measuring with labeled tk and neo specific probes. These transgenic offspring thus identified are bred and the offspring are also analyzed and tested for Mendelian inheritance of the transgene. Example 3 Proposal of a Protocol for the Selective Culture of Mouse Thyroid Follicle Cells Transgenic mice are prepared as described in Example 1, except that the neo gene has a thioglobulin promoter (eg Christoph et al. (1989)). `` Molecular and Cellular endocrinology '' 64 (1) pages 5-18; Christoph et al. (1987) 19, `` Suppl. '' 17, pages 70-73; and Ludent et al. (1990) `` PNAS '' 87 (16) 61 76 (Described on page -6180). Transgenic mice were sacrificed, their thyroid tissue was removed, and primary cultures were prepared in the presence of antibiotic G418. This antibiotic kills cells that do not express the neo gene and results in selective culture in primary cultures of thyroid follicle cells (mixed cells). Example 4: Proposal of a Preparation Protocol for Monoclonal Antibodies The bacterial neomycin phosphotransferase (neo) gene (operably linked to the sv40 early promoter) was cloned into a suitable cloning site of a plasmid vector. Was. The plasmid is then digested with restriction endonucleases, the fragment containing the neo selectable marker is separated on an agarose gel, and the transgenic mouse carrying the neo transgene is then substantially as described in the Examples. And prepared. The control antigen, in which the monoclonal antibody is required, is purified and injected with the aid of Freund's into the transgenic mice prepared as described above. The mouse is then sacrificed, the mouse spleen is removed and placed in tissue culture. The spleen is minced to release lymphocytes, and the lymphocytes are separated by centrifugation. These lymphocytes are then mixed with a myeloma fusion partner in the presence of polyethylene glycol to cause fusion and generate hybridomas. Hybridomas are selected by supplementing the culture medium with the antibiotic G148 based on the presence of the neo selectable marker in mouse lymphocytes. These hybridomas are then cloned by limiting dilution and the relevant clones are identified by screening by a suitable binding assay. This myeloma cell line need not have a negative selectable marker (eg, HPRT-). In addition, the presence of G418 in this culture reduces and eliminates the risk of infection of the culture. Example 5: Proposal of a protocol for the preparation of a rat model of Parkinson's disease Herpes simplex virus (HSV) thymidine kinase gene (tk) can be engineered into a promoter that is active only in dopaminergic neurons in nigra material And cloning into the appropriate cloning site of the plasmid vector. This plasmid was digested with restriction endonuclease, the fragment containing the tk selectable marker was separated on an agarose gel, and the transgenic rat carrying the tk gene was substantially described in Example 1. Prepared as described above. The ganciclovir is then injected by injection into the nigra extracellular region of the brain of the transgenic rat to specifically eliminate or abolish dopaminergic neurons expressing the negative selectable tk marker, Thus, a model rat of Parkinson's disease was obtained. Example 6: Proposal of a protocol for preparing a rat model of Alzheimer's disease The herpes simplex virus (HSV) thymidine kinase gene (tk) was expressed in acetylcholine, serotonin and / or noradrenergic neurons associated with the old and neocortex. It is operably linked to a promoter that is only active and cloned into an appropriate cloning site of a plasmid vector. The plasmid is digested by restriction endonuclease, the fragment containing the selectable tk marker is separated on an agarose gel, and the transgenic rat carrying the tk transgene is substantially described in Example 1. Prepare as described. The ganciclovir is then administered by injection into the appropriate area of the brain of the transgenic rat, whereby acetylcholine, serotonin and serotonin and neocortical-associated cortical, which express the negative selectable tk marker. // Noradrenaline neurons were specifically removed or deleted, whereby an Alzheimer's disease model rat was obtained.
【手続補正書】特許法第184条の8第1項 【提出日】1996年11月8日 【補正内容】 請求の範囲 1.トランスジェニック生物に由来する組織であって、トランスジェニック生物 が、陰性の選択可能なマーカーを暗号化するトランス遺伝子を有する異種DNA を含有する細胞を有しており、前記組織が、前記トランス遺伝子から生ずる選択 可能な表現型を除いて実質的に正常であり、移植治療(例えば、神経変性疾患/ 障害の治療)に使用される組織。 2.トランスジェニック生物に由来する組織であって、トランスジェニック生物 が、陽性の選択可能なマーカーを暗号化するトランス遺伝子を有する異種DNA を含有する細胞を有しており、前記組織が、前記トランス遺伝子から生ずる選択 可能な表現型を除いて実質的に正常であり、治療に使用される組織。 3.トランスジェニック生物に由来する組織であって、トランスジェニック生物 が、陰性の選択可能なマーカーを暗号化するトランス遺伝子および陽性の選択可 能なマーカーを暗号化するトランス遺伝子を有する異種DNAを含有する細胞を 有しており、治療に使用される組織。 4.トランスジェニック動物または植物、例えば脊椎動物(例えば、ラット、ウ サギ、豚またはマウスのような哺乳類)に由来する、請求項1〜3のいずれか一 つの請求項に記載の組織。 5.前記組織が、前記異種DNAが存在していることを除けば実質的に野生型で ある遺伝子型を有しており、および/または、前記異種DNAの前記組織中で形 質発現する部分が、陽性の選択可能なマーカーを暗号化するトランス遺伝子(お よび必要に応じて陰性の選択可能なマーカーを暗号化するトランス遺伝子)から なっており、各トランス遺伝子は、一種のまたは複数種の形質発現因子に対して 操作可能なように連結され ている、請求項1〜4のいずれか一つの請求項に記載の組織。 6.前記選択可能なマーカーのうちの少なくとも一種が、調節可能な一種または 複数種の形質発現因子、例えば、組織または細胞特異的な一種または複数種の形 質発現因子に対して操作可能なように連結されている、請求項1〜5のいずれか 一つの請求項に記載の組織。 7.各選択可能なマーカーが特異的に調節されており、各マーカーが、例えば異 なる組織または細胞特異的な一種または複数種の形質発現因子に対して連結され ている、請求項6記載の組織。 8.少なくとも一種の選択可能なマーカーが構成的に形質発現されている、請求 項1〜7のいずれか一つの請求項に記載の組織。 9.前記異種DNAが更にレポータートランス遺伝子、例えばβ−ガラクトシダ ーゼまたはルシフェラーゼを含有している、請求項1〜8のいずれか一つの請求 項に記載の組織。 10.前記レポータートランス遺伝子が、組織または細胞特異性の調節に供され る一種または複数種の形質発現因子へと操作可能なように連結されている、請求 項9記載の組織。 11.(a)前記陽性の選択可能なマーカーが、ネオマイシンホスホトランスフ ェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、キサンチングアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナ ーゼ、アデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼおよびハイポキサンチン ホスホリボシルトランスフェラーゼから選択されており、および/または、前記 陰性の選択可能なマーカーが、単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ、ア デニン ホスホリ ボシルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン ホスホトランスフェラーゼおよ びハイポキサンチン ホスホリボシルトランスフェラーゼから選択されており、 および/または (b)前記形質発現因子が、 (I)(i)ドーパミン作用性、セロトニン作用性、GABA作用性、コリン 作用性またはペプチド作用性のニューロンおよびその副集団;(ii)希突起膠 細胞、星状膠細胞およびその副集団、(iii)内分泌腺、肺、筋肉、性腺、胃 腸、骨格組織またはこれらの一部分ないし複数の部分;(iv)上皮、繊維芽細 胞、脂肪、マスト、間葉組織または実質組織細胞;(v)特定段階の胚形成、お よび(vi)血液系の成分(例えば、T−リンパ球、B−リンパ球およびマクロ ファージ)において特異的に活性であるプロモーターおよび/またはエンハンサ ー:または (II)(i)神経伝達物質特異性の受容体;(ii)イオンチャンネル;(i ii)イオンチャンネルのゲーティングに関与する受容体および(iv)サイト カイン類、成長因子およびホルモン類のための遺伝子を転写させるプロモーター および/またはエンハンサー から選択されている、請求項1〜10のいずれか一つの請求項に記載の組織。 12.インビトロで細胞および/または組織を培養する方法であって、 (a)細胞上に選択可能な表現型を付与する選択可能なマーカーを有する遺伝 物質を含有する細胞を有するトランスジェニック動物または植物、例えば請求項 1〜11のいずれか一つの請求項に記載の組織を有するトランスジェニック動物 または植物を与え; (b)段階(a)のトランスジェニック動物または植物の細胞および/または 組織から初代培養物を生成させ;および (c)前記トランスジェニック動物または植物の前記細胞中に含有されている 前記遺伝物質によって付与された前記の選択可能な表現型に基づいて、前記初代 培養物を選択的に成長させる、各段階を備えており、 少なくとも一種の選択可能なマーカーが、組織または細胞特異的な一種または 複数種の形質発現因子に操作可能なように連結されており、これによって段階( c)において、特定の細胞/組織型を、前記の少なくとも一種の選択可能なマー カーの内部の組織/細胞特異的な形質発現に基づいて選択的に成長させる方法。 13.段階(c)によって初代培養物中の特定の組の細胞の均一な集団を生産す る、請求項12記載の方法。 14.インビトロで細胞および/または組織を培養する方法であって、 (a)細胞上に陽性の選択可能な表現型を付与する陽性の選択可能なマーカー を有する遺伝物質を含有する細胞を有するトランスジェニック動物または植物、 例えば請求項1〜11のいずれか一つの請求項に記載の組織を有するトランスジ ェニック動物または植物を与え; (b)段階(a)のトランスジェニック動物または植物の細胞および/または 組織から初代培養物を生成させ;および (c)前記トランスジェニック動物または植物の前記細胞中に含有されている 前記遺伝物質によって付与された前記の選択可能な表現型に基づいて、前記初代 培養物を選択的に成長させる、各段階を備えており、 これによって段階(c)において、前記組織培養物の微生物(例えば酵母菌お よび菌類)による汚染を減少させ、または除去する方法。 15.請求項12〜14のいずれか一つの請求項に記載の方法によって培養され た組織または細胞であって、前記組織または細胞が、例えば組織移植片として、 生化学的測定における被検体としてまたは目的とするタンパク質の源として使用 されるものである、組織または細胞。 16.治療に使用される請求項15記載の組織または細胞。 17.抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を生産する方法であって、 (a)リンパ球に選択可能な表現型を付与する遺伝物質を含有するリンパ球を 有するトランスジェニック動物(例えば、請求項1〜11のいずれか一つの請求 項に記載の組織を有するトランスジェニック動物)を与え; (b)この抗原によって前記トランスジェニック生物を免疫化し; (c)前記トランスジェニック動物から前記リンパ球を除去し; (d)前記段階(c)の前記リンパ球を不死性の細胞(例えば腫瘍細胞、例え ば骨髄腫細胞)と融合させることによってハイブリドーマを生産し;および (e)前記リンパ球中に含有されている前記遺伝物質によって付与された前記 選択可能な表現型に基づいて前記ハイブリドーマを選択的に培養する、各段階を 有している方法。 18.請求項17の方法によって生産可能な、例えば治療に使用するためのモノ クローナル抗体。 19.生物中の特定の組織または細胞型を選択的に除去し、あるいは欠損させる 方法であって、 (a)除去あるいは欠損させるべき組織または細胞型に対して特異的な形質発 現因子(例えばプロモーター)に操作可能なように連結されている陰性の選択可 能なマーカーを有する、請求項1〜11のいずれか一つの請求項に記載の組織を 含有するトランスジェニック生物を与え; (b)この生物へと選択剤を投与することによって、前記の陰性の選択可能な マーカーの組織または細胞型内における形質発現に基づいてこの組織または細胞 型を除去あるいは欠損させる、各段階を有している方法。 20.細胞/組織の損失または萎縮(例えば、免疫変性または神経変性疾患/障 害)をモデル化するための請求項19記載の方法であって、 除去または欠損させるべき前記組織または細胞型が、疾患/障害に関連する除 去または萎縮にさらされている組織または細胞型である方法。 21.請求項19または20記載の方法に使用するための、請求項1〜11のい ずれか一つの請求項に記載の組織を有するトランスジェニック生物。 22.請求項19または20記載の方法によって生産された、特定の細胞/組織 が特異的に除去または欠損されている生物(例えば哺乳類のような脊椎動物)。 23.疾患/障害に関連する細胞/組織の損失または萎縮のモデル、例えば免疫 変性疾患/障害のモデルである、請求項22記載の生物。 24.細胞/組織の損失または萎縮(例えば、ニューロンの損失および/または 萎縮)を含む疾患または障害に対する薬理学的活性について、化合物をスクリー ニングする方法であって、 (a)請求項20記載の方法による前記疾患/障害の試験モデルをあたえ; (b)段階(a)の試験モデルに対して、試験すべき化合物を投与し; (c)試験すべき前記化合物を、前記試験モデルに対する化合物の作用に基づ いてスクリーニングする、各段階を有する方法。 25.前記疾患/障害が: (a)パーキンソン病、およびニグラ物質中のドーパミン作用ニューロンを含 有する、除去または欠損させるべき組織/または細胞型; (b)ハンチントン舞踏病、およびしわの神経細胞を含有する、除去 または欠損させるべき組織または細胞型; (c)アルツハイマー病、および新皮質または旧皮質と関連するアセチルコリ ン、セロトニンおよび/またはノルアドレナリンニューロンを含有する、除去ま たは欠損させるべき組織/または細胞型 (d)多発性硬化症、および脳の希突起膠細胞を含有する、除去または欠損さ せるべき組織/または細胞型; (e)免疫疾患、およびCD3、CD4および/またはCD8細胞を含有する 、除去または欠損させるべき細胞型;および (f)AIDS、およびCD4細胞を含有する、除去または欠損させるべき細 胞型である、請求項20または24記載の方法。 26.生物の第一の組の細胞の欠損が、第二の組の細胞の特性に対してもたらす 作用を測定する方法(例えばインビトロの方法)であって、 (a)細胞の第一の組に対して特異的な形質発現因子に操作可能なように連結 されている第一の陰性の選択可能なマーカーを有する、請求項1〜11のいずれ か一つの請求項に記載の組織を有するトランスジェニック生物を与え、この組織 が、(i)第二の組の細胞に対して特異的な形質発現因子に操作可能なように連 結されている陽性の選択可能なマーカーと、(ii)第二の組の細胞を除く前記 生物のすべての細胞中の前記陰性の選択可能なマーカーの形質発現を導く形質発 現因子に連結されている第二の陰性の選択可能なマーカーとのいずれかを有して おり; (b)選択剤を前記生物に投与することによって、前記第一の組の細胞中に前 記陰性の選択可能なマーカーの細胞内での形質発現に基づいて欠損を引き起こし ; (c)前記生物から細胞を除去し:および (d)(i)前記陽性の選択可能なマーカーの細胞内での形質発現に基づいて 、または(ii)前記陰性の選択可能なマーカーの細胞内での形質発現の欠如に 基づいて、段階(c)において除去された細胞から前記第二の組の細胞を選択的 に培養する、各段階を有する方法。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Submission date] November 8, 1996 [Correction contents] The scope of the claims 1. A tissue derived from a transgenic organism, wherein the tissue is a transgenic organism. Heterologous DNA having a transgene that encodes a negative selectable marker And wherein the tissue is selected from the transgene. Substantially normal except for possible phenotypes, and transplant therapy (eg, neurodegenerative disease / Tissue used to treat disorders). 2. A tissue derived from a transgenic organism, wherein the tissue is a transgenic organism. Heterologous DNA having a transgene encoding a positive selectable marker And wherein the tissue is selected from the transgene. Tissue that is substantially normal except for possible phenotypes and is used for treatment. 3. A tissue derived from a transgenic organism, wherein the tissue is a transgenic organism. Has a transgene encoding a negative selectable marker and a positive selectable marker Cells containing heterologous DNA having a transgene encoding a functional marker Tissue that has and is used for treatment. 4. Transgenic animals or plants, such as vertebrates (eg, rat, cormorant) A mammal such as a heron, a pig or a mouse). The organization according to one claim. 5. The tissue is substantially wild-type except for the presence of the heterologous DNA; Have a genotype and / or form in the tissue the heterologous DNA A transgene encoding a positive selectable marker (such as a transgene) And, optionally, a transgene encoding a negative selectable marker) Each transgene is associated with one or more Operably linked The tissue according to any one of claims 1 to 4, wherein 6. At least one of said selectable markers is adjustable one or Multiple expression factors, for example, one or more tissue- or cell-specific forms The method according to any one of claims 1 to 5, which is operably linked to the expression factor. An organization according to one claim. 7. Each selectable marker is specifically regulated and each marker is Linked to one or more tissue or cell-specific expression factors 7. The tissue of claim 6, wherein 8. Claims wherein at least one selectable marker is constitutively expressed. An organization according to any one of claims 1 to 7. 9. The heterologous DNA may further comprise a reporter transgene, for example, β-galactosida. 9. A method according to any one of claims 1 to 8, wherein said method comprises luciferase or luciferase. The organization described in the section. 10. The reporter transgene is provided for regulation of tissue or cell specificity. Operably linked to one or more expression factors. Item 10. The tissue according to Item 9. 11. (A) the positive selectable marker is neomycin phosphotransf Enzyme, hygromycin phosphotransferase, xanthine guanine Phosphoribosyltransferase, herpes simplex virus type 1 thymidine quina , Adenine phosphoribosyltransferase and hypoxanthine Selected from phosphoribosyltransferases and / or Negative selectable markers are herpes simplex virus type 1 thymidine kinase, a Denin phosphoryl Bosyltransferase, hygromycin phosphotransferase and And hypoxanthine phosphoribosyltransferase, And / or (B) the trait expression factor is (I) (i) dopaminergic, serotoninergic, GABAergic, choline -Active or peptide-active neurons and subpopulations thereof; (ii) oligodendrocytes Cells, astrocytes and subpopulations thereof, (iii) endocrine glands, lung, muscle, gonads, stomach Intestine, skeletal tissue or a part or parts thereof; (iv) epithelium, fibroblast Vesicles, fat, mast, mesenchymal or parenchymal cells; (v) specific stages of embryogenesis, And (vi) components of the blood system (eg, T-lymphocytes, B-lymphocytes, and macro- Promoters and / or enhancers that are specifically active in ー: Or (II) (i) neurotransmitter specific receptor; (ii) ion channel; ii) Receptors and (iv) sites involved in ion channel gating Promoters that transcribe genes for Caines, growth factors and hormones And / or enhancers The tissue according to any one of claims 1 to 10, wherein the tissue is selected from: 12. A method of culturing cells and / or tissue in vitro, comprising: (A) Genetics with selectable markers that confer a selectable phenotype on cells Transgenic animal or plant having cells containing the substance, e.g. claims A transgenic animal having the tissue according to any one of claims 1 to 11. Or give plants; (B) cells of the transgenic animal or plant of step (a) and / or Producing a primary culture from the tissue; and (C) contained in the cells of the transgenic animal or plant Based on the selectable phenotype conferred by the genetic material, Each stage of selectively growing a culture, The at least one selectable marker is a tissue or cell specific one or It is operably linked to a plurality of phenotypes, thereby providing a step ( In c), the specific cell / tissue type is converted to the at least one selectable marker. A method for selective growth based on tissue / cell-specific trait expression inside the car. 13. Producing a uniform population of a particular set of cells in the primary culture by step (c) 13. The method of claim 12, wherein 14. A method of culturing cells and / or tissue in vitro, comprising: (A) Positive selectable marker that confers a positive selectable phenotype on cells A transgenic animal or plant having cells containing genetic material having For example, a transgene having a tissue according to any one of claims 1 to 11 Feeding the animal or plant; (B) cells of the transgenic animal or plant of step (a) and / or Producing a primary culture from the tissue; and (C) contained in the cells of the transgenic animal or plant Based on the selectable phenotype conferred by the genetic material, Each stage of selectively growing a culture, Thereby, in step (c), the microorganisms of the tissue culture (for example, yeast and And fungi) to reduce or eliminate contamination. 15. Cultivated by the method according to any one of claims 12 to 14. Tissue or cells, wherein the tissue or cells are, for example, as tissue grafts, Use as analyte or source of desired protein in biochemical assays Tissue or cell that is to be treated. 16. The tissue or cell according to claim 15, which is used for treatment. 17. A method for producing a monoclonal antibody specific to an antigen, (A) lymphocytes containing genetic material that confers a selectable phenotype on the lymphocytes A transgenic animal (e.g., any one of claims 1 to 11) A transgenic animal having the tissue described in the above section); (B) immunizing said transgenic organism with said antigen; (C) removing the lymphocytes from the transgenic animal; (D) replacing the lymphocytes of step (c) with immortal cells (eg, tumor cells, eg, Producing a hybridoma by fusing with a myeloma cell; and (E) the said gene provided by said genetic material contained in said lymphocytes Selectively culturing the hybridoma based on a selectable phenotype, The way you have. 18. An article for producing, for example for use in therapy, which can be produced by the method of claim 17. Clonal antibodies. 19. Selectively remove or delete specific tissues or cell types in an organism The method (A) specific transduction for the tissue or cell type to be removed or deleted Negative selectable operably linked to current factor (eg, promoter) Having a functional marker, the tissue according to any one of claims 1 to 11, Providing a transgenic organism containing; (B) administering said selective agent to said organism to produce said negative selectable This tissue or cell based on the expression of the marker within the tissue or cell type A method having each step of removing or deleting a mold. 20. Cell / tissue loss or atrophy (eg, immunodegenerative or neurodegenerative disease / disorder) 20. The method according to claim 19 for modeling harm). If the tissue or cell type to be removed or deleted is a disease / disorder related removal A method that is a tissue or cell type that has been exposed or atrophyed. 21. Claims 1 to 11 for use in a method according to claim 19 or 20. A transgenic organism having a tissue according to any one of the preceding claims. 22. A specific cell / tissue produced by the method of claim 19 or 20. Organisms in which is specifically removed or deleted (eg, vertebrates such as mammals). 23. Models of cell / tissue loss or atrophy associated with disease / disorder, eg, immunity 23. The organism of claim 22, which is a model for a degenerative disease / disorder. 24. Cell / tissue loss or atrophy (eg, neuronal loss and / or Compounds for pharmacological activity against diseases or disorders including atrophy) Is a method of (A) providing a test model of the disease / disorder according to the method of claim 20; (B) administering to the test model of step (a) the compound to be tested; (C) determining the compound to be tested based on the effect of the compound on the test model; And screening. 25. The disease / disorder is: (A) Including Parkinson's disease and dopaminergic neurons in nigra substances A tissue / or cell type to be removed, deleted or deleted; (B) Elimination containing Huntington's chorea and wrinkle neurons Or a tissue or cell type to be deleted; (C) Alzheimer's disease and acetylcholine associated with neocortex or old cortex Ablation containing serotonin and / or noradrenaline neurons Tissue or cell type to be deleted (D) Multiple sclerosis and removal or deficiency containing oligodendrocytes of the brain Tissue / or cell type to be treated; (E) containing immune disorders and CD3, CD4 and / or CD8 cells The cell type to be removed or deleted; and (F) a cell containing AIDS and CD4 cells to be removed or deleted; 25. The method of claim 20 or 24, wherein the method is of the vesicular type. 26. Deletion of a first set of cells of an organism results in a property of a second set of cells A method of measuring the effect (eg an in vitro method), (A) operably linked to a trait-expressing factor specific to a first set of cells; 12. The method of any of claims 1 to 11, wherein the first negative selectable marker is Providing a transgenic organism having a tissue according to any one of the preceding claims. (I) operably linked to a trait-expressing factor specific for the second set of cells. A positive selectable marker that has been ligated; and (ii) the exception of a second set of cells, Transduction leading to expression of said negative selectable marker in all cells of the organism With either a second negative selectable marker linked to the current factor Yes; (B) administering a selective agent to the organism, thereby predisposing the first set of cells into the organism; Caused a defect based on the intracellular expression of a negative selectable marker ; (C) removing cells from the organism: and (D) (i) based on the intracellular expression of the positive selectable marker Or (ii) lack of intracellular expression of said negative selectable marker. Selectively selecting said second set of cells from the cells removed in step (c) A method comprising the steps of:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI A61K 39/395 ABB A61K 39/395 ABBN 48/00 48/00 ABA ABA C07K 16/00 C07K 16/00 C12N 5/10 C12P 21/08 C12P 21/08 C12Q 1/02 C12Q 1/02 G01N 33/15 Z G01N 33/15 33/48 N 33/48 33/531 A 33/531 C12N 5/00 B C (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG ,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN, TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,SZ,U G),AM,AT,AU,BB,BG,BR,BY,C A,CH,CN,CZ,DE,DK,EE,ES,FI ,GB,GE,HU,IS,JP,KE,KG,KP, KR,KZ,LK,LR,LT,LU,LV,MD,M G,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO ,RU,SD,SE,SG,SI,SK,TJ,TM, TT,UA,UG,US,UZ,VN──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI A61K 39/395 ABB A61K 39/395 ABBN 48/00 48/00 ABA ABA C07K 16/00 C07K 16/00 C12N 5/10 C12P 21 / 08 C12P 21/08 C12Q 1/02 C12Q 1/02 G01N 33/15 Z G01N 33/15 33/48 N 33/48 33/531 A 33/531 C12N 5/00 BC (81) Designated country EP ( AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LU, LV, MD, MG, MN , MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TT, UA, UG, US, UZ, VN
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