KR20220140431A - 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 포함하는 신경퇴행성 질환용 바이오마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글리코톡신(glycotoxin), 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 포함하는 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)용 바이오마커(biomarker)에 관한 것으로서, 구체적으로 상기 바이오마커는 비침습적(noninvasive)으로 신속하게 피부 표면으로부터 특이적 형광을 측정하여 인지저하 여부를 초기에 확인하는 데 사용될 수 있고, 그 후 인지저하로 확인되었을 경우 피부, 혈액 등의 생체조직에서 상기 바이오마커의 mRNA 발현량 및 단백질양을 측정함으로써 알츠하이머 질환 등의 신경퇴행성 질환에 대한 예측, 진단 등에 유용하게 활용된다.

Description

글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 포함하는 신경퇴행성 질환용 바이오마커{A biomarker for neurodegenerative diseases containing a glycotoxin, a specific protein bound to glycotoxin, or glycotoxin-specific protein complex}
본 발명은 글리코톡신(glycotoxin), 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 포함하는 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)용 바이오마커(biomarker)에 관한 것으로서, 구체적으로 상기 바이오마커는 비침습적(noninvasive)인 방법으로 신속하게 피부 표면으로부터 특이적 형광을 측정하여 인지저하 여부를 초기에 확인하는 데 사용될 수 있고, 피부, 혈액, 뇌척수액 등의 생체조직으로부터 상기 바이오마커의 mRNA 발현량 및 단백질양을 측정함으로써 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease, AD) 등의 신경퇴행성 질환에 대한 예측, 진단 등에 유용하게 활용된다.
최근 의학의 발전으로 인간의 평균수명이 늘어나고 있으며, 노년 인구가 증가함에 따라 새로운 사회적 문제들이 부각되고 있다. 특히, 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병(Parkinson's disease) 등의 노인성 신경퇴행성 질환들은 신경계의 치명적인 기능장애로 나타나며, 현재까지는 이를 치료하기 위한 효과적인 방법이 없다.
특히, 노인성 신경퇴행성 질환 중 가장 흔히 나타나고 있는 것이 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease, AD)이다. 알츠하이머 질환(AD)은 치매를 일으키는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로 기억력, 사고력 및 행동상의 문제를 야기하며, 이는 일상생활을 방해할 정도로 심각한 기억력 및 기타 지적능력의 상실을 보인다.
알츠하이머 질환(AD)의 원인 및 발병 기전은 정확하지 않으나, 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)의 합성 감소, β-아밀로이드(β-amyloid)의 침착 및 타우 단백질(tau protein)의 과인산화로 인한 신경세포의 손상이 주요 원인으로 알려져 있다.
이러한 신경퇴행성 질환은 조기에 발견하여 치료를 하는 것이 사회적 비용을 줄일 수 있어 조기 진단의 중요성이 대두되고 있다. 그러나 지금까지 알츠하이머의 임상적 진단은 병력과 신경심리학적 검사에 주로 의존하며, 부차적인 검사로 자기공명영상(MRI, Magnetic Resonance Imaging)이나 양전자 단층촬영(PET, Positron Emission Tomography)와 같은 영상검사를 시행한다. 그러나 MRI나 PET는 뇌 영상촬영을 통해 뇌 내 아밀로이드 베타의 축적 수준을 확인함으로써 알츠하이머 질환(AD)의 진단에 이용되는 방법으로 고가의 검사비용과 범용적 적용이 어려워 대다수의 환자들은 검사를 받아보기 어렵다는데 한계점이 있다. 이에 알츠하이머 질환(AD) 등의 신경퇴행성 질환을 빠르고 편리하게 비침습적으로 진단할 수 있는 방법이 필요하게 되었다.
인체 내에서 최종 당화 산물(advanced glycation end products, AGEs)은 당(sugar)과 단백질 측쇄의 비-효소적 반응(nonenzymatic reaction)으로부터 발생한다. 이 과정은 시프 염기(Schiff base)를 형성하는 환원당과 아미노기 사이의 가역적인 반응으로 시작하고, 계속해서 공유결합 아마도리 전위 생성물(covalently-bonded Amadori rearrangement product)을 형성한다. 아마도리 생성물이 형성되면, 이 생성물은 추가의 전위를 겪어 최종당화산물(AGEs)을 생성한다.
또한, 최종당화산물(AGEs)은 다른 과정으로부터 형성될 수 있다. 예를 들어, 최종당화산물인, 카르복시메틸 라이신(Nε-(carboxylmethyl)lysine)은 지질 과산화(lipid peroxidation)와 당산화(glycoxidation) 반응 모두의 생성물이다.
현재까지 수십 가지의 최종당화산물들이 알려져 있고, 그 예로는, 펜토시딘(pentosidine), 카르복시메틸 라이신((carboxymethyl)lysine, CML), 카르복시에틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CEL)), 피랄린(pyrraline), OMA(oxalic acid monolysinylamide), 이미다졸론(imidazolones), GLAP(glyceraldehydes-derived pyridinum compound), GOLD(glyoxal-lysine dimer), MOLD(methyl-glyoxal-lysine dimmer), 크로스라인(crossline), FFI(2-(2-furoyl)-4(5)-(2-furanyl)-1H-imidazole) 등이 있다.
일반적으로 최종당화산물(AGEs)은 혈당의 평균 수준에 비례하는 속도로 인체 내에 축적된다. 최종당화산물(AGEs)은 정상적인 대사작용 및 노화에 의하여 생성 및 축적되고, 나이에 비례하여 최종당화산물(AGEs)의 축적량이 증가하여 체내에 오래 잔류한다. 특히, 당뇨병(Diabetes)에 의한 고혈당증(Hyperglycemia)이 지속되면 많은 양의 최종당화산물(AGEs)이 체내에 축적된다. 이러한 최종당화산물의 체내 축적은 막 단백질의 번역-후 변형(post-translational modification)을 촉진한다.
고혈당 상태가 지속되면 가역적인 아마도리형의 초기당화산물이 분해되지 않고 재배열(rearrangement)되고 콜라겐(collagen) 같은 수명이 긴 단백질과 교차결합(cross-link)하여 비가역적인 최종당화산물(AGEs)이 생성된다.
또한, 이렇게 생성된 최종당화산물은 콜라겐(collagen), 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin)과 같은 수명이 긴 기질 단백질과 비가역적인 교차결합을 이룰 뿐만 아니라 세포외 기질 단백질과의 교차결합, 세포 최종당화산물 수용체와의 반응 및 세포내 단백질 또는 핵산과의 최종당화산물을 형성하여 당뇨병성 합병증을 유발하는 것으로 알려졌다. 이러한 원인 중 하나는 보통 정상적인 콜라겐(collagen)의 교차결합은 N-말단과 C-말단의 특정적인 부위에서만 일어나지만, 최종당화산물에 의한 콜라겐(collagen)과의 교차결합은 모든 부위에서 무작위로 일어나기 때문이다.
이러한 비가역적이고 장기간 생존하는 최종당화산물은 여러가지 질병에서 결정적인 역할을 한다. 예를 들어 많은 당뇨병 환자가 합병증을 예방하지 못하고 결국에는 실명, 신증, 뇌졸증, 족부절단 등 극심한 고통을 당하고 있는데, 이는 합병증 예방 또는 치료가 혈당 농도 조절만으로 가능하지 않고, 이미 축적된 비가역적이고 장기간 생존하는 최종당화산물을 저감시켜야 하는 것임을 알 수 있다.
또한, 최종당화산물의 형성은 자유 라디칼 활성(free radical activity)의 증가와 단백질의 구조 및 기능의 변화를 동반하며, 이는 신경퇴행성 질환의 발병에 기여할 수 있다. 알츠하이머 질환(AD)에서 최종당화산물은 아밀로이드 플라크(amyloid plaques) 및 신경섬유 매듭(neurofibrillary tangles)과 같은 병리학적 침착물(pathological deposits)에서 검출될 수 있으며 많은 알츠하이머 질환(AD)의 신경병리학적(neuropathological) 및 생화학적(biochemical) 특징을 설명할 수 있다.
이외에도 최종당화산물(AGEs)은 염증(inflammation), 망막병증(retinopathy), 신장병(nephropathy), 죽상경화증(atherosclerosis), 뇌졸중(stroke), 내피세포 기능장애(endothelial cell dysfunction), 및 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease)을 포함하는 몇몇 병리학적 상태들과 관련 있다.
피부에서 콜라겐은 가장 흔한 단백질이며 쉽게 당화 과정을 거치며 이들은 나이가 들어감에 따라 피부에 축적되는 최종당화산물(AGEs)의 양과 함께 변화된다. 포도당은 당화로 알려진 비효소적 과정을 통하여 단백질과 결합하여 공유 부가물(adduct)을 형성하게 되며, 이런 단백질 교차결합 부분 일부는 형광을 띠게된다.
피부 콜라겐 최종당화산물은 흔히 형광 교차 결합 및 부가물의 형태를 취하며, 피부 조직에 축적된 최종당화산물은 비침습적(noninvasive) 피부 자가형광(skin autofluorescence, SAF)을 측정하여 비교적 간단한 비침습적 평가를 할 수 있다.
최근 카르복시메틸 라이신(CML), 펜토시딘 등의 피부 내 축적량이 당뇨병 환자에서 양의 상관성이 있으며, 당뇨병 환자의 최종당화산물 측정을 통하여 당뇨병으로 인한 최종당화산물의 축적도 증가치를 파악함으로써 당뇨병 합병증 발병여부를 예측할 수 있다는 보고가 있다(Meerwaldt R, Graaff R, Oomen PH, et al. Simple non-invasive assessment of advanced glycation endproduct accumulation. Diabetologia. 2004;47:1324 -1330).
그러나 지금까지 최종당화산물을 측정하여 신경퇴행성 질환 발병 여부를 진단할 수 있는지에 대하여서는 보고된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 비침습적인 방법으로 최종당화산물(AGEs)인 피부 내에 존재하는 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체의 특이적 형광을 측정하거나, 피부, 손톱, 발톱, 모발, 혈액, 뇌척수액 등의 생체조직에서 mRNA 발현량 또는 단백질양을 측정함으로서 알츠하이머 질환(AD) 등의 신경퇴행성 질환을 진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 생체조직 또는 생체액에서 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 포함하는 바이오마커 및 이를 이용하여 신경퇴행성 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 포함하는 신경퇴행성 질환 진단용 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 포함하는 바이오마커를 이용한 신경퇴행성 질환 진단 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 포함하는 바이오마커를 이용한 신경퇴행성 질환 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 비침습적으로 피부에서 형광으로 측정하거나, 피부조직, 혈액 등에서 mRNA 발현량 또는 단백질양으로 측정함으로서 알츠하이머 질환(AD) 등의 신경퇴행성 질환을 간편하게 진단할 수 있으며, 이를 통해 환자의 적절한 치료방향을 결정할 수 있다.
도 1은 알츠하이머 질환 모델 마우스에서 정상군(WT)과 질환군(5xFAD)의 피부조직 내 최종당화산물 중 (a) 펜토시딘(pentosidine), (b) 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 (c) 카르복시메틸 라이신(CML)의 양을 HPLC 분석을 통해 확인한 도이다.
도 2는 알츠하이머 질환 모델 마우스에서 정상군(WT)과 질환군(5xFAD)의 혈장(plasma) 내 최종당화산물 중 (a) 펜토시딘, (b) 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 (c) 카르복시메틸 라이신(CML)의 양을 ELISA 분석을 통해 확인한 도이다.
도 3은 알츠하이머 질환 모델 마우스에서 정상군(WT)과 질환군(5xFAD)의 피부조직 내 (a) Collagen 1 mRNA 발현량, (b) Collagen 2 mRNA 발현량 , (c) Collagen 3 mRNA 발현량, (d) Collagen 4 mRNA 발현량, (e) Collagen 5 mRNA 발현량, 및 (f) Collagen 6 mRNA 발현량을 확인한 도이다.
도 4는 알츠하이머 질환 모델 마우스에서 정상군(WT)과 질환군(5xFAD)의 피부조직 내 Collagen 7 mRNA 발현량을 확인한 도이다.
도 5a 및 도 5b는 알츠하이머 질환 모델 마우스에서 정상군(WT)과 질환군(5xFAD)의 피부조직 내 콜라겐 XVII의 단백질 발현량을 확인한 것으로,도이다.
도 6은 노화 모델 마우스에서 정상군(young)과 노화군(old)의 피부조직 내 콜라겐 XVII의 mRNA 발현량을 확인한 도이다.
도 7은 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈장(plasma) 내 (a) 펜토시딘, (b) 카르복시에틸 라이신(CEL), (c) 카르복시메틸 라이신(CML), 및 (d) MG-H1의 양을 나타낸 도이다.
도 8은 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈장(plasma) 내 콜라겐 XVII의 양을 나타낸 도이다.
도 9는 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈장(plasma) 내 (a) 메틸글리옥살(Methylglyoxal, MGO)의 양 및 (b) 글리옥살라아제 1 (glyoxalase-1, GLO-1) 효소 활성도(enzyme activity)를 나타낸 도이다.
도 10은 알츠하이머 질환 모델(5xFAD) 마우스에서의 새로운 사물에 대한 인지 테스트(Novel Object Recognition Test, NORT) 결과와 피부조직 내 (a) 펜토시딘(pentosidine), (b) 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 (c) 카르복시메틸 라이신(CML) 함량과의 상관관계를 나타낸 도이다.
도 11은 알츠하이머 질환 모델(5xFAD) 마우스에서의 새로운 사물에 대한 인지 테스트(Novel Object Recognition Test, NORT) 결과와 콜라겐 XVII의 mRNA 발현량의 상관관계를 나타낸 도이다.
도 12는 콜라겐 XVII의 mRNA 발현량과 피부조직 내 (a) 펜토시딘(pentosidine), (b) 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 (c) 카르복시메틸 라이신(CML) 함량과의 상관관계를 나타낸 도이다.
도 13은 정상군(HC), 당뇨환자군(HCD), 인지저하군(CI) 및 당뇨·인지저하군(CID)의 피부 자가형광(Skin autofluorescence, SAF)을 나타낸 도이다.
도 14는 정상군(HC + HCD) 그리고 인지저하군(CI + CID) 간의 피부 자가형광을 통한 진단 성능을 나타낸 도이다.
도 15는 당뇨병이 없는 그룹에서 피부 자가형광(Skin autofluorescence, SAF)과 임상 지표간의 상관관계를 나타낸 것으로, 도 15a는 MMSE , 도 15b는 creatinine 및 도 15c는 CKD-EPI 지표를 나타낸 것이다.
도 16는 당뇨병이 있는 그룹에서 피부 자가형광(Skin autofluorescence, SAF)과 임상 지표간의 상관관계를 나타낸 것으로, 도 16a는 MMSE , 도 16b는 creatinine, 도 16c는 CKD-EPI, 도 16d는 HbA1c, 및 도 16e는 HDL 지표를 나타낸 것이다.
도 17은 피부 자가형광(SAF)과 FDG-PET간의 상관관계를 보이는 뇌 영역을 시각화하여 나타낸 도이다.
도 18은 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈장(plasma) 내 콜라겐 XVII과 결합된 최종당화산물들의 양을 나타낸 것으로, 도 18a는 펜토시딘(pentosidine), 도 18b는 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 도 18c는 카르복시메틸 라이신(CML)이다.
도 19는 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈장(plasma) 내 콜라겐 XVII과 결합된 최종당화산물들의 양과 간이 정신 상태 검사(Mini-Mental State Examination, MMSE) 결과와의 상관관계를 나타낸 것으로, 도 18a는 펜토시딘(pentosidine), 도 18b는 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 도 18c는 카르복시메틸 라이신(CML)이다.
도 20은 인지저하군(CI) 혈장(plasma) 내 콜라겐 XVII, CEL 및 CML의 발현양상을 나타낸 도이다.
도 21은 정상군(HC), 당뇨환자군(HCD), 인지저하군(CI) 및 당뇨·인지저하군(CID)의 혈액 내 카르복시에틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CEL)과 메틸글리옥살 하이드로이미다졸론(methylglyoxal hydroimidazolones, MG-H1)의 비율 변화를 나타낸 도이다.
도 21b는 정상군(HC), 당뇨환자군(HCD), 인지저하군(CI) 및 당뇨·인지저하군(CID)의 혈액 내 카르복시에틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CEL)과 메틸글리옥살 하이드로이미다졸론-1(methylglyoxal hydroimidazolones, MG-H1)의 비율 변화와 임상 치매 척도(Clinical Dementia Rating, CDR)를 나타낸 도이다.
도 21c는 정상군(HC), 당뇨환자군(HCD), 인지저하군(CI) 및 당뇨·인지저하군(CID)의 혈액 내 카르복시에틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CEL)과 메틸글리옥살 하이드로이미다졸론-1(methylglyoxal hydroimidazolones, MG-H1)의 비율 변화와 간이 정신 상태 검사(Mini-Mental State Examination, MMSE) 결과와의 상관관계를 나타낸 도이다.
도 22는 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈액 내 (a) CEL, (b) MG-H1, (c) CML (d)펜토시딘(pentosidine), (e) CEL/MG-H1, (f) CML/MG-H1 및 (g) pentosidine/MG-H1의 바이오마커로서의 성능을 ROC curve 분석법(analysis)을 통해 분석한 도이다.
도 23은 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈액 내 (a) 콜라겐 XVII, (b) 콜라겐 XVII-CEL, 및 (c) 콜라겐 XVII와 콜라겐 XVII-CEL의 성능을 ROC curve 분석법(analysis)를 통해 분석한 것이고, 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈액 내 (d) 콜라겐 XVII/MG-H1, (e) 콜라겐 XVII_CEL/MG-H1, 및 (f) 콜라겐 XVII/MG-H1 및 콜라겐 XVII_CEL/MG-H1의 성능을 ROC curve 분석법(analysis)을 통해 분석한 것이다.
도 24는 글리코톡신(펜토시딘, CEL, CML, 및 MG-H1),글리코톡신-단백질 복합체(단백질-펜토시딘, 단백질-CEL, 단백질-CML, 및 단백질-MG-H1), 및 콜라겐 XVII-CEL의 화학식 및 화학식과 단백질의 결합 상태를 나타낸 것이다.
본 발명은 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환 진단용 바이오마커를 제공한다.
상기 글리코톡신은 펜토시딘(pentosidine), 카르복시메틸 라이신((carboxymethyl)lysine, CML), 카르복시에틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CEL), 피랄린(pyrraline), OMA(oxalic acid monolysinylamide), 이미다졸론(imidazolones),
GLAP(glyceraldehydes-derived pyridinum compound), GOLD(glyoxal-lysine dimer), MOLD(methyl-glyoxal-lysine dimmer), 크로스라인(crossline), FFI(2-(2-furoyl)-4(5)-(2-furanyl)-1H-imidazole)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다.
이미다졸론에는 메틸글리옥살 하이드로이미다졸론(methylglyoxal hydroimidazolones, MG-H1)가 있다.
본 발명에 있어서 글리코톡신과 최종당화산물(advanced glycation end products)는 동일한 의미이다.
본 발명에 있어서 측정된 CEL은 Total CEL 값으로서, 이는 단일 CEL(free CEL). 단백질 결합 CEL의 모두를 포함하는 결과이다.
상기 특정 단백질은 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 케라틴(keratin), β-아밀로이드 베타 종(amyloid β species), 타우(tau), 알파-시누클레인(alpha-synuclein) 및 TDP-43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다.
상기 콜라겐(collagen)은 콜라겐 XVIIA(collagen XVIIA)이다.
본 발명의 하나의 실험예에서, 알츠하이머 질환 모델(5xFAD) 마우스의 혈장 및 피부조직 내 최종당화산물(AGEs)의 측정 결과, 24주 질환군(5xFAD)의 피부조직 내 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL), 카르복시메틸 라이신(CML)의 양이 유의미하게 증가함을 확인하였다(도 1a 내지 도 1c).
반면, 정상군(WT) 및 질환군(5xFAD)의 혈장 내 펜토시딘 및 카르복시메틸 라이신(CML)의 양에 유의적인 차이가 없었고, 카르복시에틸 라이신(CEL)의 양은 12주, 24주 질환군(5xFAD)에서 모두 감소하는 경향을 보였지만 두 그룹간의 차이는 없었다 (도 2a 내지 도 2c).
이는 대표적인 신경퇴행성 질환 중 하나인 알츠하이머 질환(AD)에서 상기 최종당화산물(AGEs)들이 피부에 축적됨을 의미하고, 이들을 바이오마커로 하여 상기 알츠하이머 질환(AD)의 진단, 치료 등에 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 하나의 실험예에서, 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈장 내 최종당화산물(AGEs)의 측정 결과, 인지저하군(CI)의 혈장(plasma) 내 펜토시딘 및 카르복시에틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CEL의 함량이 정상군(HC)에 비해 증가하였다(도 7a 내지 도 7d). 이들의 증가와는 달리 그러나 CML은 CI군에서 유의적으로 증가하지 않았다.
이는 인지저하 질환이 있으면 혈장(plasma) 내 글리코톡신인 펜토시딘 및 카르복시에틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CEL의 함량이 증가함을 보여준다. 따라서 이를 표적으로 하여 상기 질환의 진단, 치료 등에 이용할 수 있다.
한편, 본 발명의 하나의 실험예에서, 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈액 내 Glyoxalase 1 효소 활성 측정 결과, 인지저하군(CI)의 혈장 내 Glyoxalase 1 활성도는 정상군(HC)의 활성도 보다 작았다(도 9).
메틸글리옥살(Methylglyoxal)의 분해 효소인 상기 Glyoxalase 1의 활성이 인지저하 환자에서 더 작다는 것은 카르복시에틸 라이신(CEL)의 전구물질인 메틸글리옥살 (Methylglyoxal)이 덜 분해된다는 것을 나타내고, 이는 인지저하 환자에서 덜 분해된 메틸글리옥살이 카르복시에틸 라이신(CEL)으로 더 많이 전환될 수 있어, 결과적으로 인지저하 환자에서 카르복시에틸 라이신의 양이 증가할 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 혈장 내 카르복시에틸 라이신(CEL)이 인지저하군(CI)에서 증가한 것과 상응한다.
본 발명의 하나의 실험예에서, 알츠하이머 질환 모델(5xFAD) 마우스의 피부조직 내 collagen 1 내지 6 및 17의 mRNA 발현량 측정 결과, 질환군(5xFAD) 피부 내에서 Collagen 1, 3, 4 및 5의 mRNA 발현이 감소하였고, Collagen 2 및 6의 mRNA 발현은 유의한 증가를 나타내지 못했다(도 3a 내지 도 3f). 반면, 질환군(5xFAD) 피부 내의 콜라겐 XVII의 mRNA 발현이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 4).
본 발명의 하나의 실험예에서, 알츠하이머 질환 모델(5xFAD) 마우스의 피부조직 내 콜라겐 XVII의 단백질 발현량 측정 결과, 질환군(5xFAD) 피부 내의 콜라겐 XVII의 단백질 발현이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 5).
또한, 본 발명의 하나의 실험예에서, 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈장 내 콜라겐 XVII 함유량 측정 결과, 정상군(HC) 대비 인지저하군(CI)에서 혈액 내 콜라겐 XVII이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 8).
이는 인지저하 질환이 있으면 혈액 내에 콜라겐 XVII 함량이 증가함을 보여준다. 따라서 이를 표적으로 하여 인지저하 질환의 진단, 치료 등에 이용할 수 있다.
한편, 본 발명의 하나의 실험예에서, 노화 마우스 모델(old)의 피부 내 콜라겐 XVII의 mRNA 발현량 측정 결과, 대조군(young) 대비 노화군(old)에서 피부 내 콜라겐 XVII의 mRNA 발현량이 감소하였다(도 6).
이는 콜라겐 XVII이 단순히 노화로 인하여 증가하는 것이 아니고, 알츠하이머 질환(AD)이 있을 경우 증가하는 것임을 나타낸다.
따라서, 콜라겐 XVII을 바이오마커로 사용하여 노화로 인한 것과는 구분하여 알츠하이머 질환(AD)의 진단, 치료 등에 이용할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 생체조직 또는 생체액에서, 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 측정하는 신경퇴행성 질환의 진단 방법을 제공한다.
상기 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체는 형광, 유전자 발현량 및 단백질량을 측정하는 방법 중 어느 하나 이상에 의해 측정되는 것이다.
상기 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체는 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 카르복시메틸 라이신(CML) 메틸글리옥살 하이드로이미다졸론(methylglyoxal hydroimidazolones, MG-H1) 상기 글리코톡신에 결합된 특정 단백질은 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 케라틴(keratin), β-아밀로이드 베타 종(amyloid β species), 타우(tau), 알파-시누클레인(alpha-synuclein) 및 TDP-43으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 콜라젠이다.
상기 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체는 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL) 또는 카르복시메틸 라이신(CML)과 콜라젠XVII의 복합체를 측정하는 것이다.
상기 글리코톡신(펜토시딘, CEL, CML, 및 MG-H1),글리코톡신-단백질 복합체(단백질-펜토시딘, 단백질-CEL, 단백질-CML, 및 단백질-MG-H1), 및 콜라겐 XVII-CEL의 화학식 및 화학식과 단백질의 결합 상태를 도 24에 나타내었다.
또한, 본 발명은 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체와 메틸글리옥살 하이드로이미다졸론(MG-H1)의 축적 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단 방법을 제공한다.
상기 축적 비율은 CEL/MGH1, CML/MGH1, 펜토시딘/MGH1, 콜라젠 XVII/MGH1,
콜라젠 XVII-CEL/ MGH1, 콜라젠 XVII-CML/MGH1 및 콜라젠 XVII-펜토시딘/MGH1 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 측정하는 것이다.
상기 축적 비율은 [CEL/MGH1, CML/MGH1, 펜토시딘/MGH1 또는 콜라젠 XVII/MGH1 중 어느 하나]와 [펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 카르복시메틸 라이신(CML)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상과 콜라젠XVII의 복합체]를 측정하는 것이다.
상기 축적 비율은 상기 바이오마커는 CEL/MGH1 또는 콜라겐 XVII-CEL인 것이다. 본 발명에서 복합 바이오마커는 글리코톡신 축적 비율인 CEL/MGH1 분석을 하고, 단일 바이오마커는 콜라겐 XVII-CEL 복합체를 분석하는 것이다.
상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 헌팅턴무도병, 척수소뇌변성, 프리온질병, 크로이츠펠트야콥병, 전두측두엽치매, 혈관치매, 루이소체치매 및 파킨슨병에 동반된 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다.
본 발명의 하나의 실시예에서, 알츠하이머 질환 모델(5xFAD) 마우스에 대한 새로운 사물 인식 시험(Novel Object Recognition Test, NORT)을 통한 인지저하 평가 결과를 본 발명의 상기 바이오마커와의 상관관계를 비교하였다.
그 결과, 상기 질환 모델 마우스의 인지능력이 감소할수록 피부 내 펜토시딘, CEL, CML의 함량이 증가하는 경향을 보이며, 그 중 펜토시딘 및 CEL은 인지능력과 높은 상관관계를 보였다(도 10a 내지 도 10c). 또한, 인지기능이 감소할수록 피부 내 콜라겐 XVII의 mRNA 발현량이 증가하는 경향을 보였다(도 11).
이를 통해, 인지저하와 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 콜라겐 XVII 사이에 상관관계가 있음을 확인하였다.
본 발명의 하나의 실험예에서, 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈장(plasma) 내 Collagen XVII과 결합된 최종당화산물들의 양을 측정한 결과, 정상군(HC) 대비 인지저하군(CI)에서 혈액 내 Collagen XVII과 결합된 CEL이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 12a 내지 도 12c).
또한, 본 발명의 하나의 실험예에서, 인지저하군(CI)의 혈장(plasma) 내 Collagen XVII과 CEL의 발현양상을 확인한 결과, 콜라겐 XVII과 CEL이 여러 단백질 사이즈 위치 중 같은 단백질 사이즈 위치 (~70kDa)에서 검출되었으며, 이는 CEL이 혈액 내 존재할 때, 콜라겐 XVII에 결합하여 최종당화산물을 형성하고 있는 것을 나타낸다(도 20).
이는 상기 치매 등의 인지저하 질환이 있으면 혈액 내에 증가된 콜라겐 XVII 함량이 다른 최종당화산물보다 CEL과만 선택적으로 결합되어있는 것을 보여준다. 따라서 이를 표적으로 하여 상기 질환의 예측, 진단 등에 이용할 수 있다.
상기 생체조직의 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 측정하는 것은 피부 자가형광(skin autofluorescence, SAF)을 측정하는 것이다.
상기 피부 자가형광(skin autofluorescence, SAF)은 정상군과 인지저하군(CI)을 구분할 수 있다.
본 발명의 하나의 실험예에서, 비침습적인(noninvasive) 방법을 통해 정상군(HC), 당뇨환자군(HCD), 인지저하군(CI) 및 당뇨인지저하군(CID)에서 본 발명의 바이오마커에 특이적인 피부 자가형광(Skin autofluorescence, SAF)을 측정하였다.
그 결과, 피부 자가형광(SAF)은 정상군(HC)에 비해 당뇨인지저하군(CID), 인지저하군(CI) 및 당뇨환자군(HCD)에서 증가했으며, 인지저하군(CI) 및 당뇨환자군(HCD) 각각에 비해 당뇨병과 동반된 인지저하군(CID)에서 더욱 증가했다(도 13).
피부 자가형광(SAF) 측정 값의 증가는 당뇨의 주요 지표가 될 수 있는데, 본 발명에서는 당뇨가 없는 인지저하군(CI)에서도 피부 자가형광(SAF) 측정 값이 증가함을 확인하였다. 이는 피부 자가형광(SAF) 측정 값이 당뇨와는 독립적으로 인지저하와 연관성이 있음을 의미한다. 특히 당뇨와 인지저하가 모두 있는 군(CID)에서는 당뇨와 인지저하의 상호작용으로 인해 피부 자가형광(SAF) 측정 값이 가장 높은 것으로 해석이 가능하다.
고혈당증상이 없는 인지저하군 즉 CI군에서도 높은 수준으로 SAF 값이 증가하는 것을 볼 때, 피부 내의 글리코톡신의 증가는 알츠하이머 질환을 포함하는 퇴행성뇌질환 자체의 획기적인 마커가 될 수 있음을 나타냈다. 또한 당뇨가 동반된 인지저하환자에서 가장 높은 SAF값을 보였기 때문에, 당뇨병이 있는 환자들 중에서도 피부 내의 글리코톡신을 통해 퇴행성 뇌질환의 진단 가능성을 보였다.
또한, MMSE, creatinine 및 CKD-EPI 지표와 높은 상관관계가 있고, HbA1c 지표와는 상관관계가 보이지 않는다는 데이터로부터, 당뇨병이 없는 대상자(HC 및 CI)에서의 피부 자가형광(SAF)의 결과는 인지저하군에만 특이적으로 증가하였기때문에 당뇨병과는 독립적인 것임을 확인할 수 있었다.(표 3). 즉 피부에서 측정되는 SAF값의 증가는 알츠하이머환자와 같은 인지저하에서 독랍적으로 영향을 미치는 바이오마커이고 당뇨병이 있는 경우 더욱 가속화되는 것으로 판단된다. 그러므로 본 SAF는 당뇨병과는 달리 초기 인지저하 정도를 예측하는데 사용할 수 있는 독립적인 진단마커일 수 있다.
본 발명의 하나의 실험예에서, 인지저하에 영향을 미치는 변수 분석한 결과, 단변량(Univariate)에서는 피부 자가형광, 당뇨, glucose가 각각 인지저하에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 그 중에서 피부 자가형광이 교차비(odds ration)가 가장 높았다(표 4). 이 결과를 통해 피부 자가형광의 정도가 인지저하를 판단하는 매우 중요한 역할을 하는 핵심인자임을 한번 더 검증할 수 있었다.
본 발명의 하나의 실험예에서, 피부 자가형광과 MRI(magnetic resonance imaging) 결과를 수치화한 분석값의 상관관계를 분석하였다. All은 모든 그룹(HC, HCD, CI, CID)을 포함한 분석 결과를 나타내며, DM(diabetes mellitus) 여부에 따라서 non-DM (HC+CI)와 DM (HCD+CID)로 나누어서 분석하였다.
그 결과 모든 그룹에서 분석하였을 경우 뇌실주위 백질과집중(periventricular white matter hyperintensities, (PVWMH)를 제외한 모든 결과에서 유의미한 통계값을 보였다(표 5).
본 결과를 통해서, 피부 자가형광이 뇌의 실질적인 변화를 충분히 반영하고 있음을 알 수 있다. 모든 실험그룹에서 피부 자가형광이 뇌위축(brain atrophy)과 백질과집중(white matter hyperintensity)과 높은 상관관계를 보였다. 또한 당뇨 유무의 따라 피부 자가형광이 뇌의 변화를 반영하는 것이 달랐다.
본 발명의 하나의 실험예에서, Non-DM(HC+CI) 그룹에서 뇌의 glucose 대사를 확인할 수 있는 FDG(18F-fludeoxyglucose)-PET(Positron emission tomography)과 피부 자가형광과의 상관관계를 시각화하였다.
그 결과 뇌의 glucose 대사 감소와 피부 자가형광 증가의 상관관계가 두정엽(parietal cortex)과 후 대상회(posterior cingulate gyrus)에서 강하게 나타났다.
두정엽(parietal cortex)의 대사 감소는 MRI(magnetic resonance imaging)에서의 위축(atrophy)결과와 일치하여 피부 자가형광이 뇌의 변화를 나타냄을 한번 더 확인할 수 있었다. 특히, 후 대상회(posterior cingulate gyrus)의 경우 FDG-PET에서 알츠하이머 질환을 진단하는데 가장 중요한 부위로 알려져 있다. 이에 따라, 피부 자가형광과 후 대상회(posterior cingulate gyrus)의 glucose 대사 감소의 상관관계는 피부 자가형광이 뇌의 변화 중에서도 알츠하이머 질환에 의한 변화를 반영함을 의미한다.
상기 생체조직은 피부, 손톱, 발톱 또는 모발로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다.
상기 생체액은 눈물, 타액, 소변, 혈액 또는 뇌척수액이다.
상기 생체액의 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체 측정은 혈액으로부터 유전자 발현량 및 단백질량을 측정하는 것이다.
또한, 본 발명은 생체조직 또는 생체액에서, 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 측정하는 신경퇴행성 질환 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트에 사용될 수 있는 글리코톡신은 펜토시딘(pentosidine), 카르복시메틸 라이신((carboxymethyl)lysine, CML), 카르복시에틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CEL), 피랄린(pyrraline), OMA(oxalic acid monolysinylamide), 이미다졸론(imidazolones),GLAP(glyceraldehydes-derived pyridinum compound), GOLD(glyoxal-lysine dimer), MOLD(methyl-glyoxal-lysine dimmer), 크로스라인(crossline), FFI(2-(2-furoyl)-4(5)-(2-furanyl)-1H-imidazole)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다.
이미다졸론에는 메틸글리옥살 하이드로이미다졸론(methylglyoxal hydroimidazolones, MG-H1)가 포함된다.
상기 글리코톡신에 결합된 특정 단백질은 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 케라틴(keratin), β-아밀로이드 베타 종(amyloid β species), 타우(tau), 알파-시누클레인(alpha-synuclein) 및 TDP-43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다. 콜라젠은 콜라젠17A를 포함한다.
글리코톡신 또는 글리코톡신과 결합된 단백질은 단독으로 사용될 수도 있고 조합하여 사용될 수도 있다
구체적으로 상기 키트는 비침습적(noninvasive)인 방법으로 신속하게 피부 표면으로부터 특이적 피부 자가형광(skin autofluorescence, SAF)을 측정하거나, 또는 피부, 혈액, 뇌척수액 등의 생체조직으로부터 상기 바이오마커의 mRNA 발현량 또는 단백질양을 측정함으로써 신경퇴행성 질환을 예측 또는 진단할 수 있다.
상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 헌팅턴무도병, 척수소뇌변성, 프리온질병, 크로이츠펠트야콥병, 전두측두엽치매, 혈관치매, 루이소체치매 및 파킨슨병에 동반된 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다.
키트는 글리코톡신 중에서도 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL), 카르복시메틸 라이신(CML)을 이용하여 진단할 수 있다.
글리코톡신과 결합된 단백질 중에서는 특히 콜라젠을 이용하여 진단할 수 있다.
펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL), 카르복시메틸 라이신(CML), 콜라젠은 단독으로 사용될 수도 있고 조합하여 사용될 수도 있다
콜라젠은 단독으로도 사용될 수 있고, 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL) 또는 카르복시메틸 라이신(CML)과 결합된 복합물로서 사용될 수 있다.
특히 콜라겐 XVII과 결합된 CEL이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 18 및 도 19).
또한 CEL/MG-H1+ CEL-COL17A는 90% 이상의 정확도를 나타내었다.
피부에서 측정되는 SAF값은 알츠하이머환자와 같은 인지저하에서 당뇨병이 있는 경우 더욱 증가한다. 그러므로 본 SAF는 초기 인지저하 정도를 예측하는데 사용할 수 있다.
좀더 선택성과 예민도가 높은 바이오마커의 핵심인자를 도출하기 위하여, 인지저하군 환자의 혈액 내 메틸글리옥살 유래 최종당화산물인 카르복시에틸 라이신(CEL)과 메틸글리옥살 하이드로이미다졸론(MG-H1)를 측정하고 그 축적 비율을 분석하였다.
그 결과, CEL/MG-H1의 비율은 정상군(HC)에 비해 인지저하군(CI), 당뇨환자군(HCD) 및 당뇨·인지저하군(CID)에서 증가했으며, 당뇨환자군(HCD)에 비해 인지저하군(CI) 및 당뇨·인지저하군(CID)에서 특히 증가했다(도 21a).
또한, 임상 치매 척도(Clinical Dementia Rating, CDR) 및 간이 정신 상태 검사(Mini-Mental State Examination, MMSE)을 통해 알츠하이머 중증도 따라 군을 분류하였을 시, CDR값이 증가할수록 혹은 MMSE값이 감소할수록 CEL/MG-H1의 비율이 비례적으로 증가하였다(도 21b 및 도 21c). 이는 치매 등의 인지저하 질환이 있으면 혈액 내에 CEL함량이 증가하고 MG-H1의 함량이 감소함을 보여준다.
따라서 본 발병인은 CEL, MG-H1각각의 의 수치로 분석하기보다는 CEL/MG-H1 비율로 계산하는 값이 차별적으로 큰 차이가 났기 때문에 본 발명자는 CEL/MG-H1 비율이 상기 질환의 진단, 치료 등의 성능 우수성이 매우 높다는 사실을 발견하였다.
본 발명의 하나의 실험 예에서, 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈액 내 CEL, MG-H1, pentosidine 및 MG-H1의 진단 성능과 각 바이오마커를 조합을 통한 진단 성능 향상을 분석하였다. 그 결과, CEL, MG-H1 및 pentosidine 단독 보다는 두가지 바이오마커를 조합할 경우 AUC 값이 크게 높아졌으며, 이 과정에서 CEL/MG-H1이 가장 뛰어난 진단 성능의 우수성을 보였다. MG-H1/CEL도 유사한 진단 성능을 보였다(도 22a 내지 도 22g).
또한, 단일 바이오마커 키트 중에서는 콜라겐 XVII-CEL이 유일하게 AUC 값이 0.8을 넘었으며, 이를 통해 인지저하가 있다고 판단할 수 있다. MGH1을 분모로 다른 바이오마커와 조합하였을 경우에 CEL/MGH1과 콜라겐 XVII-CEL/MGH1이 AUC 값이 0.8을 넘었으며, 이를 통해 인지저하가 있다고 판단할 수 있다(도 23a 내지 도 23f).
따라서, 콜라겐 XVII-CEL과 MG-H1을 모두 포함하는 복합 바이오마커 키트(composite biomarker kit)을 적용하였을 경우 인지저하의 진단 성능이 우수함을 확인하였다.
특히 복합 바이오마커 키트(composite biomarker kit)은 높은 정확도를 보여 인지장애환자에서 알츠하이머병 유무와 기타 인지장애를 일으킬 만한 전신 신체장애(우울증, 만성질환 합병증, 약물 부작용) 등을 감별하는 목적으로 활용이 가능하다.
이하 본 발명의 실험예를 통해 더 상세히 설명한다.
<실험예 1> 알츠하이머 질환 모델(5xFAD) 마우스의 혈장 및 피부조직 내 최종당화산물(AGEs)의 측정
혈장 및 피부조직 내 최종당화산물(AGEs)의 측정은 하기와 같이 수행하였다. 5xFAD는 Human APP(Swedish mutation: K670N/M671L, Florida mutation: I716V, London mutation: V717I) 및 PS1(M146L, L286V) 유전자를 발현하는 5xFAD 형질전환 마우스의 알츠하이머 질환 모델이다. B6SJL 마우스(암컷)와 5xFAD 마우스(수컷)를 번식(breeding)하여 낳은 산자(wild type, 5xFAD)를 사용하였다. 마우스의 사육은 12시간 간격으로 명/암을 조절하고, 실내온도 22±2℃ 및 습도 50±10% 수준으로 유지하였으며, 물과 사료는 자유롭게 먹게 하였다(ad libitum).
12주 및 24주가 지난 후, 정상군(WT) 및 질환군(5xFAD) 마우스 피부 조직을 분쇄하여 클로로포름(Sigma):메탄올(Sigma)=2:1로 섞은 용액을 상온(25℃)에서 12시간 동안 처리하였다. collagenase(Sigma C0773)를 280U 농도로 처리한 후 37℃에서 교반하며 24시간 반응시켰다. 2ul의 클로로포름과 2ul의 톨루엔을 넣어 미생물 오염을 방지하였다. 상층액 및 펠렛(pellet) 또는 혈액에 6N HCl 1ml를 넣은 후 히트블록(heat block)에서 110℃에서 24시간 가수분해시켰다. 가수 분해 후 Savant Concentrator로 용액을 증발시킨 후 1ml의 증류수를 넣어주었다. 용액 내 콜라겐(collagen) 농도는 Hydroxyproline Assay 및 ELISA KIT(STA-675)을 통해 측정하였다.
Monnier 등의 방법(Monnier. V. et al. Diabetes. 48(4): 870-880. 1999)에 의해 HPLC 분석(표 1)하여 혈장 및 피부조직 내 펜토시딘을 측정한 후, Hydroxyproline Assay를 통해 콜라겐 양 정량 후 pentosidine/collagen 양으로 정량하였다. 또한, 피부 가수 분해물 내 카르복시에틸 라이신(CEL), 카르복시메틸 라이신(CML)을 ELISA kit을 통하여 측정하였다.
최종당화산물(AGEs) 검출을 위한 HPLC 분석조건
HPLC 분석조건
Column Vydac 218TP104
Buffer A 0.01 mol/L heptafluorobutyric acid
Buffer B 60% acetonitrile (v/v) and 0.01 mol/L heptafluorobutyric acid
Detection 335/385 nm excitation/emission
~ 10min 2% buffer B isocratic
10 ~ 40 min 2% to 30% buffer B gradient
40 ~ 55 min 30% buffer B isocratic
그 결과, 24주 질환군(5xFAD)의 피부조직 내 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL), 카르복시메틸 라이신(CML)의 양이 유의미하게 증가함을 확인하였다(도 1a 내지 도 1c).
반면, 정상군(WT) 및 질환군(5xFAD)의 혈장 내 펜토시딘 및 카르복시메틸 라이신(CML)의 양에 유의적인 차이가 없었고, 카르복시에틸 라이신(CEL)의 양은 12주, 24주 질환군(5xFAD)에서 모두 감소하였다(도 2a 내지 도 2c).
이는 대표적인 신경퇴행성 질환 중 하나인 알츠하이머 질환(AD)에서 상기 최종당화산물(AGEs)들이 피부에 축적됨을 의미한다.
따라서, 상기 피부에 축적된 최종당화산물들을 바이오마커로 하여 상기 알츠하이머 질환(AD)의 진단, 치료 등에 이용할 수 있다.
<실험예 2> 알츠하이머 질환 모델(5xFAD) 마우스의 피부조직 내 collagen 1 내지 6 및 17의 mRNA 발현량 측정
피부조직 내 유전자 발현을 관찰하기 위하여 실시간 정량적 RT-PCR 방법을 수행하였다. 정상군(WT) 마우스와 알츠하이머 질환 모델(5xFAD) 마우스의 피부조직을 파쇄하여 Trizol 용액 (Invitrogen, UK) 을 이용하여 RNA를 추출하였고, 전체 RNA는 NanoDrop ND-1000(NanoDrop, USA)으로 정량하였다. 역전사효소(TaKaRa, Japan)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 프라이머(표 2)를 첨가하고, 실시간 PCR 반응기(ABI Prism 7900HT Sequence Detection SyJPem, Applied BiosyJPems, USA)를 이용하여 실시간 PCR 반응(real-time PCR reaction)을 수행하여, Collagen 1 내지 6(도 2a) 및 17(도 2b)의 유전자 발현 수준을 측정하였다.
그 결과, 질환군(5xFAD) 피부 내에서 Collagen 1, 3, 4 및 5의 mRNA 발현이 감소하였고, Collagen 2 및 6의 mRNA 발현은 유의한 증가를 나타내지 못했다(도 3a 내지 도 3f). 반면, 질환군(5xFAD) 피부 내의 콜라겐 XVII의 mRNA 발현이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 4).
이는 콜라겐 XVII을 바이오마커로 사용하여 알츠하이머 질환(AD) 등의 신경퇴행성 질환 진단, 치료 등에 이용할 수 있음을 나타낸다.
RT-qPCR에 사용된 프라이머
구분 서열번호 정방향 염기서열(5' -> 3') 서열번호 역방향 염기서열(5' -> 3')
Col1a1 1 CCTCAGGGTATTGCTGGACAAC 2 CAGAAGGACCTTGTTTGCCAGG
Col2a1 3 GCTGGTGAAGAAGGCAAACGAG 4 CCATCTTGACCTGGGAATCCAC
Col3a1 5 GACCAAAAGGTGATGCTGGACAG 6 CAAGACCTCGTGCTCCAGTTAG
Col4a1 7 ATGGCTTGCCTGGAGAGATAGG 8 TGGTTGCCCTTTGAGTCCTGGA
Col5a1 9 GGACTCGGCGGAACATT 10 GGAGTTGAGGGAACCAAAGAT
Col6a1 11 GACACCTCTCAGTGTGCTCTGT 12 GCGATAAGCCTTGGCAGGAAATG
Col17a1 13 GAAAGGAGACAAAGGTGACCA 14 CGGCTTGATGGCAATACTTC
Gapdh 15 CCATGGAGAAGGCTGGGG 16 CAAAGTTGTCATGGATGACC
<실험예 3> 알츠하이머 질환 모델(5xFAD) 마우스의 피부조직 내 콜라겐 XVII의 단백질 발현량 측정
단백질 발현량을 확인하기 위하여, 피부조직을 파쇄하여 lysis buffer로 용해하고, 12,000 rpm 으로 10분간 원심분리 후 상등액을 취하였다. Bradford법으로 단백질 농도를 측정한 이후, 30㎍의 단백질을 취하여 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)를 실시한 후, 나이트로셀룰로스 멤브레인으로 전이시켰다. 상기 멤브레인을 TBS-T (0.05% Tween 20)에 용해된 5% [w/v] 탈지유로 블록킹하고, 항체(콜라겐 XVII, α-Tubulin) 반응하여 측정하였다.
그 결과, 질환군(5xFAD) 피부 내의 콜라겐 XVII의 단백질 발현이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 5a 및 도 5b).
이는 콜라겐 XVII을 바이오마커로 사용하여 알츠하이머 질환(AD) 등의 신경퇴행성 질환 진단, 치료 등에 이용할 수 있음을 나타낸다.
<실험예 4> 노화 마우스 모델(old)의 피부 내 콜라겐 XVII의 mRNA 발현량 측정
노화 마우스 모델(old)에서 피부 내 콜라겐 XVII의 mRNA 발현량을 측정하였다.
그 결과, 대조군(young) 대비 노화군(old)에서 피부 내 콜라겐 XVII의 mRNA 발현량이 감소하였다(도 6).
이는 콜라겐 XVII이 노화로 인하여 증가하는 것이 아니고, 알츠하이머 질환(AD)이 있을 경우 증가하는 것임을 나타낸다.
따라서, 콜라겐 XVII을 바이오마커로 사용하여 노화로 인한 것과는 구분하여 알츠하이머 질환(AD)의 진단, 치료 등에 이용할 수 있음을 확인하였다.
<실험예 5> 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈장 내 최종당화산물(AGEs)의 측정
정상인 및 인지저하 환자의 혈액을 취하고, 원심분리하여 상층액인 혈장(plasma)을 얻은 후, HPLC 분석을 이용하여 혈장(plasma) 내 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CEL) 및 카르복시메틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CML)의 양을 측정하였다. HPLC 분석조건은 상기 표 1과 동일하게 하였다.
그 결과, 인지저하군(CI)의 혈장(plasma) 내 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CEL) 및 카르복시메틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CML)의 함량이 정상군(HC)에 비해 증가하였다(도 7a 내지 도 7d).
이는 인지저하 질환이 있으면 혈장(plasma) 내 글리코톡신인 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CEL) 및 카르복시메틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CML)의 함량이 증가함을 보여준다. 따라서 이를 표적으로 하여 상기 질환의 진단, 치료 등에 이용할 수 있다.
<실험예 6> 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈장 내 콜라겐 XVII 함유량 측정
정상인 및 인지저하 환자의 혈액을 취하고, 원심분리하여 상층액인 혈장(plasma)를 얻은 후, 이를 human 콜라겐 XVII ELISA kit(CSB-EL005724HU)을 이용하여 혈장 내 콜라겐 XVII의 함유량을 측정하였다. 본 실험방법은 제조사의 프로토콜에 따라 진행하였다.
그 결과, 정상군(HC) 대비 인지저하군(CI)에서 혈액 내 콜라겐 XVII이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 8).
이는 인지저하 질환이 있으면 혈액 내에 콜라겐 XVII 함량이 증가함을 보여준다. 따라서 이를 표적으로 하여 인지저하 질환의 진단, 치료 등에 이용할 수 있다.
<실험예 7> 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈액 내 Glyoxalase 1 효소 활성 측정
글리옥살레이즈 (Glyoxalase; GLO)는 메틸글리옥살 (Methylglyoxal; MG)의 대사에 직접적으로 관여하는 단백질이다. 메틸글리옥살은 CEL의 전구체이고, 최종적으로 GLO 효소에 의해 D-lactate로 바뀐다 .
정상인 및 인지저하 환자의 혈액을 취하고, 원심분리하여 상층액인 혈장(plasma)을 얻은 후, ELISA assay (QuantiChrom™, DGLO-100)을 통해 혈액 내 Glyoxalase 1 활성을 측정하였다.
그 결과, 인지저하군(CI)의 혈장 내 Glyoxalase 1 활성도는 정상군(HC)의 활성도 보다 작았다(도 9a 및 도 9b).
메틸글리옥살(Methylglyoxal)의 분해 효소인 Glyoxalase 1의 활성이 인지저하 환자에서 더 작다는 것은 카르복시에틸 라이신(CEL)의 전구물질인 메틸글리옥살 (Methylglyoxal)이 덜 분해된다는 것을 나타낸다.
이는 인지저하 환자에서 덜 분해된 메틸글리옥살이 카르복시에틸 라이신(CEL)으로 더 많이 전환될 수 있어, 결과적으로 인지저하 환자에서 카르복시에틸 라이신의 양이 증가할 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 상기 실험예 5의 결과인 혈장 내 카르복시에틸 라이신(CEL)이 인지저하군(CI)에서 증가한 것과 상응한다.
<실험예 8> 알츠하이머 질환 모델(5xFAD) 마우스에 대한 새로운 사물 인식 시험(Novel Object Recognition Test, NORT)을 통한 인지저하와 본 발명의 바이오마커와의 상관관계 비교
알츠하이머 질환 모델(5xFAD) 마우스에 대하여 새로운 사물 인식 시험(Novel Object Recognition Test, NORT)를 실시하였다. 상기 시험을 위해 마우스(5xFAD)를 행동 관찰실로 옮겨 5분간 적응시킨 뒤 3분의 노출시행에서는 상자에 동일한 물체 2개(1set)를 30cm 간격으로 놓은 후 동물이 3분 동안 물체를 탐색하는 시간을 측정하였다. 하루 후 인출시행에서는 동일한 상자에 노출 시 계시했던 물체 1개와 새롭게 대치된 물체 1개를 준비해 놓고, 동물이 탐색하는 시간을 측정하였다.
상기 탐색 시간은(새로운 사물에 관심을 보이는 시간-익숙한 사물에 관심을 보이는 시간)/(새로운 사물에 관심을 보이는 시간+익숙한 사물에 관심을 보이는 시간)으로 산출하여 나타내었다. 산출된 값은 인식 지표(recognition index)로 나타내었고, 이 값이 낮을수록 인지능력이 감소함을 나타낸다.
그 결과, 상기 마우스의 인지능력이 감소할수록 피부 내 펜토시딘, CEL, CML의 함량이 증가하는 경향을 보이며, 그 중 펜토시딘(p = 0.0133) 및 CEL(p = 0.008)는 인지능력과 높은 상관관계를 보였다. 반면, CML(p = 0.1166) 은 인지능력과 낮은 상관관계를 보였다(도 10a 내지 도 10c).
또한, 인지기능이 감소할수록 피부 내 콜라겐 XVII의 mRNA 발현량이 증가하는 경향을 보였다(도 11).
이에 인지저하와 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 콜라겐 XVII 사이에 상관관계가 있음을 확인하였다.
<실험예 9> 인지저하 환자의 혈중 내 콜라겐 XVII과 결합된 최종당화산물 측정
<실험예 9-1> 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈장(plasma) 내 콜라겐 XVII과 결합된 최종당화산물들의 양
정상인 및 인지저하 환자의 혈액을 취하고, 원심분리하여 상층액인 혈장(plasma)를 얻은 후, 이를 human 콜라겐 XVII ELISA kit(CSB-EL005724HU) 및 pentosidine, CEL 및 CML antibody를 이용하여 혈액 내 콜라겐 XVII에 결합된 최종당화산물의 양을 측정하였다. 본 실험방법은 콜라겐 XVII 포획항체가 코팅된 plate과 혈액을 배양시켜 혈액 속 콜라겐 XVII를 포획 항체와 결합시켰다. 그 후 고정된 콜라겐 XVII에 검출항체인 pentosidine, CEL 및 CML antibody를 결합시켜 기질효소 반응을 일으켜 색 변화를 생성시켜 이를 광학 밀도 값으로 측정하였다.
그 결과, 정상군(HC) 대비 인지저하군(CI)에서 혈액 내 콜라겐 XVII과 결합된 CEL이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 18a 내지 도 18c 및 도 19a 내지 도 19c).
<실험예 9-2> 인지저하군(CI) 혈장(plasma) 내 콜라겐 XVII과 CEL의 발현양상
또한, 혈액 내 존재하는 콜라겐 XVII 단백질과 CEL을 웨스턴 블롯 실험방법으로 확인하였다.
혈액 내 단백질을 8% 아크릴 아마이드(Acryl amide)로 만든 젤에 주입하여 100 볼트의 전압으로 1시간 동안 전기영동 시켰다. 전기영동 되어 샘플이 주입된 젤 위에 멤브레인을 올려서 4℃ 상태에서 전기영동 80 볼트의 전압으로 1 시간 동안 전기영동 시켰다. 샘플이 옮겨진 멤브레인을 PBS로 워싱 후 5% 스킴밀크(Skim milk)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 방치한 후 10분씩 3번 PBS로 워싱하였으며 그 후에 프라이머리 안티바디(Primary antibody), 즉 anti-콜라겐 XVII antibody 과 anti-CEL antibody를 5% 스킴밀크에 섞은 액체에 멤브레인을 담근 후 4℃ 상태에서 12시간 동안 방치하였다. 12시간 후 멤브레인을 PBS로 10분씩 3번 워싱 후 세컨드리 안티바디 (Secondary antibody), 즉 항토끼(anti-rabbit), 항마우스(anti-mouse) 안티바디를 5% 스킴밀크에 섞은 액체에 넣어서 1시간동안 상온에 방치하였다. 다시 멤브레인을 10분씩 3번 워싱 후 겨자무과산화효소와 반응시킨 후 필름에 나타내었다.
그 결과, 콜라겐 XVII과 CEL이 여러 단백질 사이즈 위치 중 같은 단백질 사이즈 위치 (~70kDa)에서 검출되었으며, 이는 CEL이 혈액 내 존재할 때, 콜라겐 XVII에 결합하여 최종당화산물을 형성하고 있는 것을 나타낸다(도 20).
이는 상기 치매 등의 인지저하 질환이 있으면 혈액 내에 증가된 콜라겐 XVII 함량이 다른 최종당화산물보다 CEL과 선택적으로 결합되어있는 것을 보여준다. 따라서 이를 표적으로 하여 상기 질환의 예측, 진단 등에 이용할 수 있다.
<실험예 10> 비침습적인(noninvasive) 방법을 통한 본 발명의 바이오마커에 특이적인 피부 자가형광(SAF) 측정
<실험예 10-1> 정상군(HC), 당뇨환자군(HCD), 인지저하군(CI) 및 당뇨인지저하군(CID)의 피부 자가형광(Skin autofluorescence, SAF)
피부 자가형광(SAF)은 특정 최종당화산물(AGEs)의 형광 신호를 감지할 수 있는 AGE Reader(DiagnoOptics Technologies BV)에 의해 측정되었으며, 모든 측정은 팔꿈치 아래 10~15cm 사이의 팔뚝의 볼라(volar) 측에서 수행되었다. 피부 표면의 1cm2에서 축적된 최종당화산물(AGEs) 수준을 측정할 수 있다.
측정 대상은 정상군(HC), 당뇨환자군(HCD), 인지저하군(CI) 및 당뇨인지저하군(CID)을 대상으로 하였고, 측정 값은 420~600nm 사이의 nm 당 방출 광 강도(emitted light intensity)의 평균값을 300~420nm 사이의 nm 당 여기 광 강도(excitation light intensity)의 평균값으로 나누어 계산했으며, 임의 단위(AU)로 표시하였다.
그 결과, 피부 자가형광(SAF)은 정상군(HC)에 비해 당뇨인지저하군(CID), 인지저하군(CI) 및 당뇨환자군(HCD)에서 증가했으며, 인지저하군(CI) 및 당뇨환자군(HCD)에 비해 당뇨인지저하군(CID)에서 더 증가했다(CID 대 CI, P = 0.019; CID 대 HCD, P = 0.000)(도 13).
피부 자가형광(SAF) 측정 값의 증가는 당뇨의 주요 지표가 될 수 있는데, 본 발명에서는 당뇨가 없는 인지저하군(CI)에서도 피부 자가형광(SAF) 측정 값이 증가함을 확인하였다. 이는 피부 자가형광(SAF) 측정 값이 당뇨와는 독립적으로 인지저하와 연관성이 있음을 의미한다. 특히 당뇨와 인지저하가 모두 있는 군(CID)에서는 당뇨와 인지저하의 상호작용으로 인해 피부 자가형광(SAF) 측정 값이 가장 높은 것으로 해석이 가능하다.
당뇨가 없는 CI에서 높은 수준으로 SAF 값이 증가하여 피부 내의 글리코톡신이 알츠하이머 질환을 포함하는 퇴행성뇌질환의 획기적인 마커가 될 수 있음을 나타냈다. 더욱이 당뇨 그룹 중에서도 인지저하가 함께 있을 경우에는 가장 높은 SAF값을 보였기 때문에, 당뇨가 있는 환자들 중에서도 피부 내의 글리코톡신을 통해 퇴행성 뇌질환의 진단 가능성을 보였다.
<실험예 10-2> 정상군(HC + HCD) 그리고 인지저하군(CI + CID) 간의 피부 자가형광을 통한 진단 성능 측정
피부 자가형광 수치로 정상군(HC + HCD)과 인지저하군(CI + CID)을 어느 정도 구분할 수 있는지를 확인하기 위하여 ROC(Receiver Operating Characteristic)curve 분석을 수행하였다. 상기 ROC curve 분석법은 검사의 유용성 판단, 검사의 정확도 평가 또는 진단의 컷오프 포인트(cut-off point) 설정에 사용된다.
그 결과 AUC(Area Under the ROC curve) 값이 0.763(값이 1에 가까울수록 진단 성능이 높음)으로 준수한 수준의 진단 성능을 보였으며, 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 각각 68.1%와 76.7%로 나왔다(도 14).
단 12초 이내로 인지저하 여부를 확인할 수 있어, 인지저하 환자를 비침습적으로 신속하게 구분할 수 있는 지표로 활용될 수 있다. 특히 당뇨와는 독립적으로 치매를 진단하는데 충분히 활용 가능하다.
<실험예 10-3> 당뇨병이 없는 그룹에서 피부 자가형광(Skin autofluorescence, SAF)과 임상 지표간의 상관관계
SAF와 다른 임상 변수의 연관성은 당뇨병의 유무에 따라 나누어진 두 그룹에서 수행되었다.
당뇨가 없는 대상자(HC 및 CI)에게서 임상 치매 척도(Clinical Dementia Rating, CDR), 간이 정신 상태 검사(Mini-Mental State Examination, MMSE) 및 혈액 검사(glucose, HbA1c, total cholesterol, triacylglycerol, HDL, LDL, Creatinine 및 CKD_EPI 수치 측정) 결과와 피부 자가형광(SAF)의 상관관계를 분석하였다.
그 결과, 피부 자가형광(SAF)은 당뇨가 없는 대상자(HC 및 CI)의 인지저하(MMSE, ρ = -0.241, P = 0.009) 및 신장기능지표(creatinine: ρ = 0.322, P = 0.000 및 CKD-EPI: ρ = -0.310, P = 0.000)와 높은 상관관계가 있었다. 반면, 혈액검사 중 당뇨의 대표적인 지표인 HbA1c(β = -0.120, P = 0.281)와의 상관관계는 보이지 않았다(도 15 및 도 16).
Non-DM DM
HC (n=71) CI (n=55) P value HCD (n=45) CID (n=64) P value
나이 [만] 75 [73-77] 76 [73-77] 0.159a 75 [72-76] 75 [72-77] 0.385a
성별 (남성/여성), n 56/15 46/9 0.499b 37/8 57/7 0.307b
MMSE 26 [25-28] 23 [19-26] 0.000a 27 [26-28] 22 [17-25] 0.000a
CDR, 0/0.5/1/2/3 52/19/0/0/0 0/30/16/7/2 0.000c 35/10/0/0/0 0/29/26/8/1 0.000c
APOE4 (-/+), n 29/11 26/11 0.829b 13/3 27/13 0.304b
교육(Education), 연도 9 [6-12] 10 [6-12] 0.851a 9 [7-12] 10 [7-12] 0.484a
현재 흡연자(Current smoker), 0/1/2 54/10/7 33/14/8 0.147b 33/7/5 37/24/3 0.030c
고혈압(Hypertension), n 45 (64.3 %) 34 (63.0%) 0.879b 37 (82.2 %) 53 (82.8 %) 0.936b
관상동맥심장병(Coronary heart Disease), n 10 (14.3 %) 7 (14.0 %) 0.965b 9 (20.0%) 12 (18.8 %) 0.871b
심방세동(Atrial fibrillation), n 3 (4.3 %) 3 (6.1 %) 0.689c 3 (6.7 %) 6 (9.4 %) 0.734c
협심증(Angina pectoris), n 14 (20.3 %) 11 (21.6%) 0.865b 11 (24.4 %) 12 (18.8 %) 0.473b
만성 콩팥병 (Chronic kidney disease), n 16 (22.5 %) 14 (29.4%) 0.389b 17 (37.8 %) 24 (39.3 %) 0.870b
글루코스(Glucose), mg/dL 102 [94-112] 103 [93-119] 0.715a 131 [111-161] 129 [115-174] 0.811a
HbA1c, % 5.7 [5.5-6.1] 5.8 [5.5-6.1] 0.526a 7.1 [6.3-8.0] 7.1 [6.5-8.0] 0.871a
총 콜레스테롤, mg/dL 162 ± 33 161 ± 36 0.861d 145 ± 24 149 ± 43 0.610d
트리아실글리세롤(Triacylglycerol), mg/dL 99 [76-134] 109 [85-145] 0.451a 139 [88-192] 137 [89-192] 0.839a
HDL cholesterol, mg/dL 55 [44-65] 51 [43-67] 0.950a 43 [37-61] 41 [34-54] 0.361a
LDL 콜레스테롤, mg/dL 94 [75-113] 92 [68-110] 0.816a 81 [71-91] 80 [63-97] 0.934a
크레아티닌(Creatinine), mg/dL 0.9 [0.8-1.1] 1.0 [0.9-1.2] 0.012a 1.0 [0.9-1.3] 1.0 [0.9-1.2] 0.883a
CKD-EPI, mL/min per 1.73 m2 81 [64-88] 70 [56-84] 0.036a 72 [54-82] 73 [58-83] 0.883a
SAF 2.4 [2.2-2.7] 3.0 [2.6-3.3] 0.000a 2.8 [2.5-3.1] 3.1 [2.9-3.5] 0.000a
상기 MMSE, creatinine 및 CKD-EPI 지표와 높은 상관관계가 있고, HbA1c 지표와는 상관관계가 보이지 않는다는 데이터로부터, 당뇨가 없는 대상자(HC 및 CI)에서 피부 자가형광(SAF)의 결과는 인지저하에 특이적이고 당뇨와는 독립적인 것임을 확인하였다(표 3).
<실험예 10-4> 당뇨병이 있는 그룹에서 피부 자가형광(Skin autofluorescence, SAF)과 임상 지표간의 상관관계
당뇨가 있는 대상자(HCD 및 CID)에게서 간이 정신 상태 검사(Mini-Mental State Examination, MMSE) 및 혈액 검사(glucose, HbA1c, total cholesterol, triacylglycerol, HDL, LDL, Creatinine 및 CKD_EPI 수치 측정)와 피부 자가형광(SAF)의 상관관계를 분석하였다.
그 결과, 피부 자가형광(SAF)은 당뇨가 없는 대상자(HC 및 CI)의 인지저하(MMSE, ρ = -0.241, P = 0.009)와는 높은 상관관계를 가졌다. 혈액검사 중 신장기능지표인 creatinine(ρ = 0.322, P = 0.000 및 CKD-EPI: ρ = -0.310, P = 0.000)와 높은 상관관계를 보였고, 당뇨의 대표적인 지표인 HbA1c 및 HDL와는 상관관계를 보이지 않았다.
그 결과, 피부 자가형광(SAF)은 당뇨가 있는 대상자(HCD 및 CID)의 인지저하(MMSE, ρ = -0.200, P = 0.046)와는 상관관계가 당뇨가 없는 대상자(HC 및 CI)에 비해 상대적으로 낮았다. 반면, 혈액검사 중 신장기능지표인 creatinine(ρ = 0.288, P = 0.003 및 CKD-EPI: ρ = -0.310, P = 0.000)와 높은 상관관계를 보였고, 당뇨의 대표적인 지표인 HbA1c(ρ = 0.198, P = 0.045) 및 HDL(ρ = -0.231, P = 0.029)와 낮은 상관관계를 보였다(도 16a 내지 도 16e).
이는 당뇨가 없는 대상자(HC 및 CI)에서는 HbA1c와 HDL보다는 인지저하가 피부 자가형광(SAF)과 상관관계를 보였기 때문에, 이 그룹은 당뇨와는 별개의 기전을 통해 피부 자가형광(SAF)이 증가함을 알 수 있다.
이는 당뇨가 있는 대상자(HCD 및 CID)에서는 인지저하보다는 당뇨가 피부 자가형광(SAF)과 상관관계를 보였기 때문에, 이 그룹은 당뇨와 관련된 기전을 통해 피부 자가형광(SAF)이 증가함을 알 수 있다. 또한, 당뇨·인지저하 모두 있는 대상자(CID)에서는 피부 자가형광(SAF)이 당뇨·인지저하 양 측면으로부터 함께 영향을 받고, 그 중 당뇨의 영향이 더 크다는 것을 확인하였다.
<실험예 11> 인지저하에 영향을 미치는 변수 분석
인지저하에 영향을 미치는 변수를 분석하기 위해 피부 자가형광 수치, 여러 임상지표 및 혈액검사 결과의 상관관계를 분석하였다. 단변량(Univariate)은 인지저하에 영향을 미치는 변수를 하나씩 따로 분석하였으며, 다변량(multivariate)은 모든 지표를 모두 넣어서 각 변수의 영향력을 고려한 뒤 인지저하에 영향을 미치는 변수를 추려내었다.
그 결과 단변량(Univariate)에서는 피부 자가형광, 당뇨, glucose가 각각 인지저하에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 그 중에서 피부 자가형광이 교차비(odds ration)이 6.711로 가장 높았다. 임상지표와의 다변량(multivariate) 분석에서는 피부 자가형광과 흡연 여부가 인지저하에 영향을 미치는 것으로 나왔다. 혈액검사를 추가하여 분석하였을 때는 SAF와 흡연 여부, 그리고 total cholesterol이 인지저하에 영향을 미쳤다(표 4).
모든 분석 결과에서 피부 자가형광 값이 인지저하에 가장 큰 영향력을 미치는 것으로 확인되었다. 이 결과를 통해 피부 자가형광이 인지저하에 중요한 역할을 하는 인자임을 한번 더 검증하였다.
분석 교차비(Odds ratio)
(95% CI) 		P value
단변량(Univariate) 모델
나이 1.027 (0.964-1.095) 0.406
남성 1.592 (0.793-3.196) 0.191
교육 1.000 (0.935-1.069) 0.994
현재 흡연자 2.657 (0.867-8.145) 0.084
SAF 6.711 (3.580-12.580) 0.000
DM 1.836 (1.093-3.085) 0.022
고혈압 1.129 (0.635-2.008) 0.679
관상동맥심장병 1.011 (0.504-2.027) 0.976
만성 콩팥병 1.344 (0.767-2.353) 0.301
협심증 0.890 (0.471-1.683) 0.720
심방세동 1.572 (0.541-4.571) 0.406
글루코스 1.008 (1.001-1.015) 0.031
HbA1c 1.269 (0.990-1.625) 0.060
크레아티닌 2.208 (0.925-5.272) 0.074
CKD-EPI 0.986 (0.970-1.002) 0.083
총 콜레스테롤 0.999 (0.991-1.007) 0.816
HDL 0.987 (0.968-1.006) 0.164
LDL 1.002 (0.996-1.009) 0.527
트리아실글리세롤 1.003 (0.999-1.007) 0.165
다변량(Multivariate) 모델 1a
SAF 6.238 (3.256-11.949) 0.000
현재 흡연자 2.755 (0.925-8.204) 0.069
다변량(Multivariate) 모델 2b
SAF 8.420 (3.415-20.763) 0.000
현재 흡연자 3.750 (0.959-14.663) 0.057
총 콜레스테롤 1.014 (1.002-1.025) 0.017
나이, 교육, SAF, 글루코스, HbA1c, 크레아티닌, CKD-EPI, 총 콜레스테롤, 트리아실글리세롤, HDL 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테놀은 연속 변수(continuous variable)로 정의되었다. 남성 성별, 현재 흡연자, DM, 고혈압, 관상동맥심장병, 만성 콩팥병, 협심증, 및 심방세동은 범주형 변수(categorical variable)로 정의되었다.
a나이, 남성, 교육, 현재 흡연자, SAF, DM, 협심증, 관상동맥심장병, 만성 콩팥병, 협심증 및 심방세동은 변량(variate)으로서 포함되었다.
b나이, 남성, 교육, 현재 흡연자, SAF, 글루콧,, HbA1c, 크레아티닌, CKD-EPI, 총 콜레스테롤, HDL, LDL, 트리아실글리세롤은 변량(variate)으로서 포함되었다.
<실험예 12> 피부 자가형광과 MRI 분석결과의 교차비(odds ration) 분석
피부 자가형광과 MRI(magnetic resonance imaging) 결과를 수치화한 분석값의 상관관계를 분석하였다. All은 모든 그룹(HC, HCD, CI, CID)을 포함한 분석 결과를 나타내며, DM(diabetes mellitus) 여부에 따라서 non-DM (HC+CI)와 DM (HCD+CID)로 나누어서 분석하였다.
그 결과 모든 그룹에서 분석하였을 경우 뇌실주위 백질과집중(periventricular white matter hyperintensities, (PVWMH)를 제외한 모든 결과에서 유의미한 통계값을 보였다. 흥미로운 점은 non-DM과 DM으로 나누어서 분석하였을 때 서로 다른 양상을 가진다. Non-DM의 경우 해마 위축(hippocampal atrophy, HA)과 두정 위축(parietal atrophy, (PA)에서 모두 강한 통계적인 의미를 보였다. DM 그룹의 경우 PA에서는 통계적인 HA에서는 피부 자가형광과의 상관관계가 약해졌음을 확인하였다. Fazekas (파제카) scale의 경우 non-DM보다 DM에서 더 강한 상관관계를 가졌다(표 5).
본 결과는 피부 자가형광이 뇌의 변화를 충분히 반영하고 있음을 의미한다. 모든 그룹에서 피부 자가형광이 뇌위축(brain atrophy)과 백질과집중(white matter hyperintensity)과의 상관관계를 보였다. 또한 당뇨 유무의 따라 피부 자가형광이 뇌의 변화를 반영하는 것이 달랐다. Non-DM에서는 주로 atrophy를 크게 반영하였으며, DM에서는 atrophy의 반영이 약해진 반면 WMH의 상관관계가 높아졌다.
All a non-DM b DM b
교차비(95% CI) P 교차비(95% CI) P 교차비(95% CI) P
왼쪽 해마위축(HA) 1.772 (1.176-2.672) 0.006 2.004 (1.130-3.695) 0.018 1.536 (0.866-2.724) 0.142
오른쪽 해마위축(HA) 1.738 (1.138-2.656) 0.011 1.824 (0.987-3.370) 0.055 1.680 (0.930-3.037) 0.086
왼쪽 두정위축(PA) 2.212 (1.390-3.522) 0.001 2.641 (1.344-5.181) 0.005 2.012 (1.046-3.869) 0.036
오른쪽 두정위축(PA) 2.175 (1.366-3.459) 0.001 2.641 (1.344-5.181) 0.005 1.935 (1.009-3.706) 0.047
PVWMH 1.455 (0.917-2.309) 0.111 1.567 (0.811-3.019) 0.179 1.445 (0.740-2.821) 0.281
DWMH 1.809 (1.055-3.102) 0.031 1.815 (0.850-3.877) 0.124 1.970 (0.911-4.259) 0.085
파제카 스케일(Fazekas scale) 1.632 (1.044-2.552) 0.032 1.255 (0.705-2.469) 0.386 2.168 (1.131-4.154) 0.020
a나이, 성별, SAF, DM은 변량(variate)으로 포함되었다.
b나이, 성별, SAF은 변량(variate)으로 포함되었다.
<실험예 13> 피부 자가형광과 FDG-PET간의 상관관계 분석
Non-DM(HC+CI) 그룹에서 뇌의 glucose 대사를 확인할 수 있는 FDG(18F-fludeoxyglucose)-PET(Positron emission tomography)과 피부 자가형광과의 상관관계를 시각화하였다. DM 그룹의 경우 FDG-PET에 비정상적인 영향을 미치기 때문에 이번 분석에서 제외하였다.
그 결과, 자가형광의 증가와 glucose 대사의 감소에 상관관계가 있는 부분을 명암의 차이로 표시하였으며, 진한 검은색 일수록 높은 상관관계를 가지고 있음을 의미한다. 도 17과 같이 뇌의 glucose 대사 감소와 피부 자가형광 증가의 상관관계가 두정엽(parietal cortex)과 후 대상회(posterior cingulate gyrus)에서 강하게 나타났다.
두정엽(parietal cortex)의 대사 감소는 MRI(magnetic resonance imaging)에서의 위축(atrophy)결과와 일치하여 피부 자가형광이 뇌의 변화를 나타냄을 한번 더 확인할 수 있었다. 특히, 후 대상회(posterior cingulate gyrus)의 경우 FDG-PET에서 알츠하이머 질환을 진단하는데 가장 중요한 부위로 알려져 있다. 해당 결과들은 피부 자가형광의 증가에 따라 두정엽(parietal cortex)과 대상회(posterior cingulate gyrus)에 뇌 병변 발생에 영향을 미쳐 glucose 대사가 감소함을 알 수 있다. 또한, 자가형광과 대상회(posterior cingulate gyrus)의 glucose 대사 감소의 상관관계는 피부 자가형광이 뇌의 변화 중에서도 알츠하이머 질환에 의한 변화를 반영함을 의미한다(도 17).
<실험예 14> 인지저하군 환자의 혈액 내 메틸글리옥살 유래 최종당화산물인 카르복시에틸 라이신(CEL)과 메틸글리옥살 하이드로이미다졸론(MG-H1)의 축적 비율 분석
정상인 및 인지저하 환자의 혈액을 취하고, 원심분리하여 상층액인 혈장(plasma)를 얻은 후, ELISA assay를 이용하여 혈액 내 CEL 및 MG-H1의 양을 측정하였다. 본 실험방법은 제조사의 프로토콜에 따라 진행하였다. 그 후, 혈액에 축적된 각 최종당화산물의 비율을 비교하여 나타내었다.
그 결과, CEL/MG-H1의 비율은 정상군(HC)에 비해 인지저하군(CI), 당뇨환자군(HCD) 및 당뇨·인지저하군(CID)에서 증가했으며, 당뇨환자군(HCD)에 비해 인지저하군(CI) 및 당뇨·인지저하군(CID)에서 더 증가했다(도 21a).
또한, 임상 치매 척도(Clinical Dementia Rating, CDR) 및 간이 정신 상태 검사(Mini-Mental State Examination, MMSE)을 통해 알츠하이머 중증도 따라 군을 분류하였을 시, CDR값이 증가할수록 혹은 MMSE값이 감소할수록 CEL/MG-H1의 비율이 증가하였다(도 21b 및 도 21c).
이는 상기 실험예 7의 결과(도 9a 및 도 9b)와도 유사한 경향을 나타내는 것으로서, 치매 등의 인지저하 질환이 있으면 혈액 내에 CEL함량이 증가하고 MG-H1의 함량이 감소함을 보여준다. 따라서 CEL, MG-H1, CEL/MG-H1을 표적으로 하여 상기 질환의 진단, 치료 등에 이용할 수 있다.
<실험예 15> 인지저하군 환자의 혈액 내 콜라겐 XVII-CEL, CEL/MG-H1 및 MG-H1/CEL의 축적 비율 분석
<실험예 15-1> 정상군(HC) 및 인지저하군(CI)의 혈액 내 콜라겐 XVII-CEL, CEL/MG-H1 및 MG-H1/CEL의 축적 비율 분석
바이오마커의 진단값의 정확도를 평가하기 위해 ROC(Receiver Operator Characteristic) 곡선에서 AUC(Area under the Curve)를 분석하였다. Cutoff 값은 Youden 지수가 최대가 되는 지점의 민감도와 특이도에 따라 구하였다. 각 바이오마커별로 측정된 샘플 수가 다르기 때문에 독립적으로 분석하였다.
그 결과, CEL, MG-H1, CML 및 pentosidine 단독 바이오 마커의 AUC값은 각각 0.690, 0.755, 0.516, 0.683으로 나왔으나, CEL/MG-H1을 적용한 복합 바이오마커 키트(composite biomarker kit)은 가장 높은 정확도로 AUC 값이 0.806으로 나왔으며, 컷오프 11.53에서 민감도와 정확도가 각각 84.3%, 65.7%로 나왔다. CML/MG-H1와 pentosidine/MG-H1도 다소 진단 성능이 CEL/MG-H1에 비해 떨어진 AUC 값이 0.695, 0.765이며, 컷오프 1.81, 11.73의 경우 민감도 60.8, 64.7% 그리고 정확도 73.1, 83.6%로 나왔다(도 22a 내지 도 22f).
상기의 결과는 ROC curve anlysis에 근거한 것으로, cutoff는 민감도와 특이도가 가장 좋은 포인트로 선정하였다. CEL/MG-H1을 적용한 복합 바이오마커 키트의 컷오프를 11.53으로 잡고, 이보다 높은 수치를 인지저하, 낮은 수치를 정상인지로 판단하였을 때, 민감도와 정확도가 각각 84.3%, 65.7%로 나왔다. 다른 컷오프보다 11.53이 가장 높은 민감도와 정확도를 가지기 때문에, 이를 근거하여 11.53보다 높은 수치일 경우 인지저하라고 판단할 수 있다.
또한, 단일 바이오마커 중에서는 콜라겐 XVII-CEL이 유일하게 AUC 값이 0.8을 넘었다. 컷오프 수치를 0.86로 잡고, 이보다 높은 수치를 인지저하, 반대로 낮을 경우 정상인지로 판단하였을 때 민감도와 정확도가 각각 84.3%, 65.7%로 나왔다. 다른 컷오프보다 0.86이 가장 높은 민감도와 정확도를 가지기 때문에, 이를 근거하여 0.86 이상일 경우 인지저하가 있다고 판단할 수 있다.
MGH1을 분모로 다른 바이오마커와 조합하였을 경우에 CEL/MGH1과 콜라겐 XVII-CEL/MGH1이 AUC 값이 0.8을 넘었다. 이에, 컷오프를 0.7839로 잡고 이보다 높은 수치를 인지저하, 낮은 경우 정상인지로 판단하였을 때, 민감도와 정확도가 각각 70.6%, 93.7%로 나왔다. 다른 컷오프보다 0.7839가 가장 높은 민감도와 정확도를 가지기 때문에 이를 근거하여 0.7839보다 높은 수치일 경우 인지저하라고 판단할 수 있다(도 23a 내지 도 23f).
따라서, 콜라겐 XVII-CEL과 MG-H1을 모두 포함하는 복합 바이오마커 키트(composite biomarker kit)을 적용하였을 경우 인지저하의 진단 성능이 우수함을 확인하였다.
<110> Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation Veterans Health Service Medical Center <120> A biomarker for neurodegenerative diseases containing a glycotoxin, a specific protein bound to glycotoxin, or glycotoxin-specific protein complex <130> 2022P-01-021 <150> KR 10-2021-0046500 <151> 2021-04-09 <150> KR 10-2021-0144355 <151> 2021-10-27 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col1a1_forward <400> 1 cctcagggta ttgctggaca ac 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col1a1_reverse <400> 2 cagaaggacc ttgtttgcca gg 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col2a1_forward <400> 3 gctggtgaag aaggcaaacg ag 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col2a1_reverse <400> 4 ccatcttgac ctgggaatcc ac 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col3a1_forward <400> 5 gaccaaaagg tgatgctgga cag 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col3a1_reverse <400> 6 caagacctcg tgctccagtt ag 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col4a1_forward <400> 7 atggcttgcc tggagagata gg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col4a1_reverse <400> 8 tggttgccct ttgagtcctg ga 22 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col5a1_forward <400> 9 ggactcggcg gaacatt 17 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col5a1_reverse <400> 10 ggagttgagg gaaccaaaga t 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col6a1_forward <400> 11 gacacctctc agtgtgctct gt 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col6a1_reverse <400> 12 gcgataagcc ttggcaggaa atg 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col17a1_forward <400> 13 gaaaggagac aaaggtgacc a 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col17a1_reverse <400> 14 cggcttgatg gcaatacttc 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh_forward <400> 15 ccatggagaa ggctgggg 18 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh_reverse <400> 16 caaagttgtc atggatgacc 20

Claims (26)

  1. 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단용 바이오마커.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 글리코톡신은 펜토시딘(pentosidine), 카르복시메틸 라이신((carboxymethyl)lysine, CML), 카르복시에틸 라이신((carboxyethyl) lysine, CEL), 피랄린(pyrraline), OMA(oxalic acid monolysinylamide), 이미다졸론(imidazolones), GLAP(glyceraldehydes-derived pyridinum compound), GOLD(glyoxal-lysine dimer), MOLD(methyl-glyoxal-lysine dimmer), 크로스라인(crossline), 및 FFI(2-(2-furoyl)-4(5)-(2-furanyl)-1H-imidazole)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단용 바이오마커.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 글리코톡신는 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 카르복시메틸 라이신(CML) 메틸글리옥살 하이드로이미다졸론(methylglyoxal hydroimidazolones, MG-H1)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 측정하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단용 바이오마커.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 특정 단백질은 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 케라틴(keratin), β-아밀로이드 베타 종(amyloid β species), 타우(tau), 알파-시누클레인(alpha-synuclein) 및 TDP-43으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단용 바이오마커.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 콜라겐은 콜라겐 XVII(collagen XVII)인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단용 바이오마커.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 헌팅턴무도병, 척수소뇌변성, 프리온질병, 크로이츠펠트야콥병, 전두측두엽치매, 혈관치매, 루이소체치매 및 파킨슨병에 동반된 치매로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단용 바이오마커.
  7. 생체조직 또는 생체액으로부터 측정용 샘플을 준비하는 단계;
    상기 측정용 샘플로부터 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체는 형광, 유전자 발현량 및 단백질량을 측정하는 방법 중 어느 하나 이상에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체는 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 카르복시메틸 라이신(CML) 메틸글리옥살 하이드로이미다졸론(methylglyoxal hydroimidazolones, MG-H1)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 측정하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 글리코톡신에 결합된 특정 단백질은 콜라젠인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체는 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL) 또는 카르복시메틸 라이신(CML)과 콜라젠XVII의 복합체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단방법.
  12. 제1항의 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체와 메틸글리옥살 하이드로이미다졸론(MG-H1)의 축적 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 축적 비율은 CEL/MGH1, CML/MGH1, 펜토시딘/MGH1, 콜라젠 XVII/MGH1, 콜라젠 XVII-CEL/ MGH1, 콜라젠 XVII-CML/MGH1 및 콜라젠 XVII-펜토시딘/MGH1 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 측정하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 축적 비율은 [CEL/MGH1, CML/MGH1, 또는 펜토시딘/MGH1 중 어느 하나]와 [펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 카르복시메틸 라이신(CML)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상과 콜라젠XVII의 복합체]를 측정하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 축적 비율은 CEL/MGH1 또는 콜라겐 XVII-CEL인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단방법.
  16. 제7항에 있어서,
    상기 생체조직은 피부, 손톱, 발톱 또는 모발인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단 방법.
  17. 제7항에 있어서,
    상기 생체액은 눈물, 타액, 소변, 혈액 또는 뇌척수액인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단 방법.
  18. 제7항에 있어서,
    상기 생체조직은 상기 측정용 샘플의 준비가 필요없는 비침습적인 피부 자가형광(skin autofluorescence, SAF)을 측정하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단 방법.
  19. 제1항의 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단용 키트.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 키트는 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 카르복시메틸 라이신(CML)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 측정하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단용 키트.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 글리코톡신에 결합된 특정 단백질은 콜라젠인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단용 키트.
  22. 제19항에 있어서,
    상기 키트는 펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL) 또는 카르복시메틸 라이신(CML)과 콜라젠XVII의 복합체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단용 키트.
  23. 제1항의 글리코톡신, 글리코톡신에 결합된 특정 단백질 또는 글리코톡신-특정 단백질 복합체와 메틸글리옥살 하이드로이미다졸론(MG-H1)의 축적 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단용 키트.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 키트는 CEL/MGH1, CML/MGH1, 펜토시딘/MGH1, 콜라젠 XVII/MGH1, 콜라젠 XVII-CEL/ MGH1, 콜라젠 XVII-CML/MGH1 및 콜라젠 XVII-펜토시딘/MGH1 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 측정하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단용 키트.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 키트는 [CEL/MGH1, CML/MGH1, 또는 펜토시딘/MGH1 중 어느 하나]와 [펜토시딘, 카르복시에틸 라이신(CEL) 및 카르복시메틸 라이신(CML)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상과 콜라젠XVII의 복합체]를 측정하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단용 키트.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 키트는 CEL/MGH1 또는 콜라겐 XVII-CEL 인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예측 또는 진단용 키트.
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