KR20220140125A

KR20220140125A - Composition for preventing or improving ultraviolet-induced skin damages comprising baicalein

Info

Publication number: KR20220140125A
Application number: KR1020210046232A
Authority: KR
Inventors: 박상열; 윤홍화
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2022-10-18

Abstract

The present invention relates to a composition for preventing, alleviating, or treating skin damage caused by ultraviolet rays, comprising baicalein as an active ingredient. The baicalein of the present invention increases the pp2b activity level and Ca^2+ concentration decreased by ultraviolet ray irradiation to exhibit a protective effect against keratinocyte death and skin damage caused by ultraviolet ray irradiation and an inhibitory effect on the increase in thickness of skin epithelial tissue caused by ultraviolet rays. Therefore, the baicalein can be usefully used to inhibit, alleviate, or treat skin damage or skin aging caused by ultraviolet rays.

Description

Composition for preventing or improving ultraviolet-induced skin damages comprising baicalein comprising baicalein

바이칼레인(baicalein)을 유효성분으로 포함하는, 자외선에 의한 피부 손상 및 이로 인한 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. It relates to a composition for preventing, improving, or treating skin damage caused by ultraviolet rays and skin diseases resulting therefrom, comprising baicalein as an active ingredient.

단백질 탈인산화효소 2B(protein phosphatase 2B; PP2B)는 칼시뉴린(calcineurin)이라고도 불리며, 칼슘/칼모듈린 조절하에 있는 세린/트레오닌 단백질 탈인산화효소이다. 칼슘은 각질 세포(keratinocyte) 분화 및 증식에 중요한 이온으로, 각질 세포의 유전자 암호화와 단백질을 조절한다. PP2B는 칼슘(Ca²⁺) 신호 전달에서 중요한 조절 효소 역할을 하며, 염증, 아폽토시스 및 암과 같은 여러 세포 메커니즘을 포함하고, 피부 장애에서 가장 중요한 조절 역할을 한다.Protein phosphatase 2B (PP2B), also called calcineurin, is a serine/threonine protein dephosphorylation enzyme under calcium/calmodulin regulation. Calcium is an important ion for keratinocyte differentiation and proliferation, and regulates keratinocyte gene encoding and protein. PP2B plays an important regulatory enzyme role in calcium (Ca ²⁺ ) signaling, involves several cellular mechanisms such as inflammation, apoptosis and cancer, and plays the most important regulatory role in skin disorders.

피부는 신체의 가장 큰 기관이며 환경의 스트레스로부터 보호 역할을 한다. 각질 세포는 피부의 주요 세포이며 독소, 미생물 및 태양 복사와 같은 환경 스트레스에 대한 첫 번째 장벽 방어막이다. 자외선(ultraviolet; UV) 방사선은 피부 손상, 피부 노화 및 암을 유발하는 주요 환경 요인이다. 햇빛의 UV 복사 유형 중 중간파 자외선-b (mid-wave ultraviolet-b; 280-320nm)는 생물학적 활성이 매우 높다.The skin is the body's largest organ and acts as a protection against the stresses of the environment. Keratinocytes are the primary cells of the skin and are the first barrier defense against toxins, microorganisms and environmental stresses such as solar radiation. Ultraviolet (UV) radiation is a major environmental factor that causes skin damage, skin aging and cancer. Among the types of UV radiation of sunlight, mid-wave ultraviolet-b (280-320 nm) has very high biological activity.

최근 몇 년 동안 연구에 따르면 pp2b 억제제가 UVB 유발 염증을 감소시켰다고 보고한 바 있으나, UVB 조사 후 pp2b 활성의 전이와 각질 세포에서 UVB로 유도 된 세포 사멸 및 피부 손상 사이의 관계를 입증 한 연구는 없었다.Although studies in recent years have reported that pp2b inhibitors reduced UVB-induced inflammation, no studies have demonstrated a relationship between the transfer of pp2b activity after UVB irradiation and UVB-induced apoptosis and skin damage in keratinocytes. .

이에, 본 발명자들은 UVB로 인한 피부 손상에 대한 보호 메커니즘으로서 pp2b 활성의 관련성을 조사한 결과, 바이칼레인이 UVB 조사로 인한 피부 손상 및 각질 세포 사멸에 대해 보호 효과를 나타낼 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors investigated the relevance of pp2b activity as a protective mechanism against UVB-induced skin damage, and confirmed that baicalein can exhibit a protective effect against UVB-induced skin damage and keratinocyte death. completed.

대한민국공개특허 제10-2018-0062962호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2018-0062962

본 발명의 목적은 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a cosmetic composition for preventing or improving skin damage caused by ultraviolet rays.

본 발명의 다른 목적은 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving skin damage caused by ultraviolet rays.

본 발명의 또 다른 목적은 자외선에 의한 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases caused by ultraviolet rays.

상기 목적을 달성하기 위하여,In order to achieve the above object,

본 발명은 바이칼레인(baicalein) 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving skin damage caused by ultraviolet rays, comprising baicalein or a cosmetically acceptable salt thereof.

또한, 본 발명은 바이칼레인(baicalein) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a food composition for preventing or improving skin damage caused by ultraviolet rays, comprising baicalein or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

나아가, 본 발명은 바이칼레인(baicalein) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 자외선에 의한 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases caused by ultraviolet rays, including baicalein or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 바이칼레인(baicalein)은 자외선(UVB 등) 조사에 의해 감소된 pp2b 활성 수준 및 Ca²⁺ 농도를 상승(증가)시킴으로써, 자외선 조사로 인한 각질 세포 사멸 및 피부 손상에 대해 보호 효과를 나타낼 수 있으므로, 자외선에 의한 홍반 등의 피부 손상을 억제, 개선 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 나아가, 자외선에 의한 피부 상피조직의 두께 증가를 억제함으로써, 피부 노화를 억제 또는 개선하는데 유용하게 사용될 수 있다.The baicalein of the present invention increases (increases) the pp2b activity level and Ca ²⁺ concentration decreased by ultraviolet (UVB, etc.) irradiation, thereby exhibiting a protective effect against keratinocyte death and skin damage caused by ultraviolet irradiation. Therefore, it can be usefully used to suppress, improve, or treat skin damage such as erythema caused by ultraviolet rays, and furthermore, by inhibiting the increase in the thickness of the skin epithelial tissue by ultraviolet rays, it can be usefully used to inhibit or improve skin aging have.

도 1은 UVB 조사가 NHEKs에서 단백질 탈인산화효소 2B(protein phosphatase 2B; pp2b) 활성에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 이때, NHEKs에 100 mJ/cm² UVB로 조사한 후 표시된 시점(1, 2, 4, 8 및 12시간)에서의 측정결과를 나타내었으며, UVB에 노출되지 않은 NHEKs를 대조군(0시간)으로 하였다: (A) NHEKs를 Fluo-4-AM (5μM)으로 염색하여 유세포 분석을 통해 세포 내 Ca²⁺ 농도의 변화를 확인한 결과 그래프; (B) Fluo-4-AM으로 염색된 NHEKs의 형광 강도를 측정하여 대조군 세포의 Ca²⁺ 농도를 1.0으로 설정하여 UVB 처리군의 상대적 형광 강도를 정량화한 그래프; (C) 칼시뉴린(pp2b) 활성 분석 키트로 pp2b의 활성을 측정한 결과 그래프; (D) UVB의 조사 시간에 따른 p-bcl-10의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 측정한 결과 이미지; 및 (E) 밴드 밀도를 측정하여 p-bcl-10의 단백질 발현 수준을 정량화한 그래프(평균±SD, n=3, * P <0.05 및 ** P <0.01은 대조군과 각 처리군 간의 유의한 차이를 의미함).
도 2는 UVB 조사가 NHEKs에서 세포 사멸에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 이때, NHEKs에 100 mJ/cm² UVB로 조사한 후 표시된 시점(1, 2, 4, 8 및 12시간)에서의 측정결과를 나타내었으며, UVB에 노출되지 않은 NHEKs를 대조군(0시간)으로 하였다: (A) NHEKs의 세포 형태를 광학현미경(×100)으로 촬영한 이미지(scale bar 50μm); (B) NHEKs를 크리스탈 바이올렛 염색으로 세포 형태를 분석한 결과 이미지; (C) 대조군 세포의 생존율을 100%로 설정하여 UVB 처리군의 상대적 세포 생존율을 정량화한 그래프; (D) 젖산탈수소효소(LDH) 분석을 사용하여 배지로 방출된 LDH의 수준을 대조군의 LDH 방출량 1.0 대비 정량화한 그래프(평균±SD, n=3, * P<0.001은 대조군과 각 처리군 간의 유의한 차이를 의미함); 및 (E) UVB 조사 시간에 따른 cas-3의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 측정한 결과 이미지.
도 3은 NHEKs에서 UVB로 유도된 칼시뉴린 활성 감소에 대하여, 바이칼레인 처리에 따른 pp2b 활성 감소 억제 효과를 분석한 결과이다. 이때, NHEKs를 바이칼레인(100μM)으로 처리한 후 100mJ/cm² UVB에 노출시켰고, 바이칼레인 비처리한 NHEKs를 대조군(UVB 비처리) 및 UVB 조사군으로 하였다: (A) NHEKs를 Fluo-4-AM (5μM)으로 염색하여 유세포 분석을 통해 세포 내 Ca²⁺ 농도의 변화를 확인한 결과 그래프; (B) Fluo-4-AM으로 염색된 NHEKs의 형광 강도를 측정하여 대조군 세포의 Ca²⁺ 농도를 1.0으로 설정하여 UVB 처리군의 상대적 형광 강도를 정량화한 그래프; (C) 칼시뉴린(pp2b) 활성 분석 키트로 pp2b의 활성을 측정한 결과 그래프; (D) UVB의 조사 시간에 따른 p-bcl-10의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 측정한 결과 이미지; 및 (E) 밴드 밀도를 측정하여 p-bcl-10의 단백질 발현 수준을 정량화한 그래프(평균±SD, n=3, * P<0.001는 대조군과 각 처리군 사간의 유의한 차이, # P<0.001은 UVB 조사군과 각 바이칼레인 처리군 간의 유의 한 차이를 의미함).
도 4는 NHEKs에서 UVB로 유도된 세포 사멸에 대하여, 바이칼레인 처리에 따른 pp2b 활성 감소 억제에 의한 보호 효과를 분석한 결과이다. 이때, NHEKs를 바이칼레인(0, 25, 50 및 100μM)으로 처리한 후 100 mJ/cm² UVB로 조사하였고, UVB 및 바이칼레인을 모두 비처리한 NHEKs를 대조군으로 하였다: (A) NHEKs의 세포 형태를 광학현미경(×100)으로 촬영한 이미지(scale bar 50μm); (B) NHEKs를 크리스탈 바이올렛 염색으로 세포 형태를 분석한 결과 이미지; (C) 대조군 세포의 생존율을 100%로 설정하여 각 처리군의 상대적 세포 생존율을 정량화한 그래프; (D) 젖산탈수소효소(LDH) 분석을 사용하여 배지로 방출된 LDH의 수준을 대조군의 LDH 방출량 1.0 대비 정량화한 그래프(평균±SD, n=3, * P<0.001은 대조군과 각 처리군 간의 유의한 차이, # P<0.001은 UVB 조사군과 각 바이칼레인 처리군 간의 유의 한 차이를 의미함); 및 (E) UVB 조사 시간에 따른 cas-3의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 측정한 결과 이미지.
도 5는 pp2b 억제제 처리가 UVB로 유도된 세포 사멸에 대한 바이칼레인의 보호 효과에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 이때, NHEK를 바이칼레인(100μM) 및/또는 pp2b 억제제(1μM FK506 또는 1μM Cys A)를 처리한 후, 100mJ/cm² UVB를 조사하였고, UVB, 바이칼레인 및 pp2b 억제제를 모두 비처리한 NHEKs를 대조군으로 하였다: (A) NHEKs의 세포 형태를 광학현미경(×100)으로 촬영한 이미지(scale bar 50μm); (B) NHEKs를 크리스탈 바이올렛 염색으로 세포 형태를 분석한 결과 이미지; (C) 대조군 세포의 생존율을 100%로 설정하여 각 처리군의 상대적 세포 생존율을 정량화한 그래프; (D) 젖산탈수소효소(LDH) 분석을 사용하여 배지로 방출된 LDH의 수준을 대조군의 LDH 방출량 1.0 대비 정량화한 그래프(평균±SD, n=3, * P<0.001은 대조군과 각 처리군 간의 유의한 차이, # P<0.001은 UVB 조사군과 각 바이칼레인 처리군 간의 유의 한 차이, ‡ P<0.001은 pp2b 억제제 비처리한 UVB 및 바이칼레인 처리군 대비 pp2b 억제제를 처리한 UVB 및 바이칼레인 처리군 간의 유의 한 차이를 의미함); 및 (E) UVB 조사 시간에 따른 cas-3의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 측정한 결과 이미지.
도 6은 바이칼레인 처리에 따른 UVB로 인한 피부 손상에 대한 보호 효과를 분석한 결과이다: (A) 피부 조직 샘플 수집 전 마우스 등 피부의 형태를 촬영한 이미지; (B) Draize 점수 시스템을 사용하여 피부 손상 정도를 정량화한 그래프(평균±SD, n=5, * P<0.001은 대조군과 각 처리군 간의 유의한 차이를 의미함); (C) 수집된 피부 조직 샘플을 H&E로 염색한 결과 이미지(scale bar 100 μm); (D) ImageJ로 상피의 두께를 측정한 결과 그래프(평균±SD, n=3, * P<0.001은 대조군과 각 처리군 간의 유의한 차이, # P<0.001은 UVB 조사군과 각 바이칼레인 처리군 간의 유의한 차이를 의미함); (E) 피부 샘플을 TUNEL 염색 및 PI 염색을 이용하여 면역조직화학 분석한 결과 이미지(scale bar 100 μm); (F) TUNEL-양성 세포를 계수하고 대조군 대비 정량화한 막대 그래프(평균±SD, n=5, * P <0.001은 대조군과 각 처리군 간의 유의한 차이를 의미함, # P <0.001은 UVB 조사군과 각 바이칼레인 처리군 간의 유의한 차이를 의미함); 및 (G) 피부에서 cas-3 활성을 웨스턴 블롯팅으로 평가한 결과 이미지.1 is a result of analyzing the effect of UVB irradiation on protein phosphatase 2B (pp2b) activity in NHEKs. At this time, the measurement results at the indicated time points (1, 2, 4, 8 and 12 hours) after irradiating NHEKs with 100 mJ/cm ² UVB were shown, and NHEKs not exposed to UVB were used as a control (0 hours): (A) NHEKs stained with Fluo-4-AM (5 μM) and confirmed the change in intracellular Ca ²⁺ concentration through flow cytometry; (B) A graph quantifying the relative fluorescence intensity of the UVB-treated group by measuring the fluorescence intensity of NHEKs stained with Fluo-4-AM and setting the Ca ²⁺ concentration of the control cells to 1.0; (C) a graph of the result of measuring the activity of pp2b with a calcineurin (pp2b) activity assay kit; (D) an image of the result of measuring the protein expression level of p-bcl-10 according to the UVB irradiation time by Western blotting; and (E) a graph quantifying the protein expression level of p-bcl-10 by measuring the band density (mean±SD, n=3, *P <0.05 and **P <0.01 are significant between the control group and each treatment group. means difference).
2 is a result of analyzing the effect of UVB irradiation on apoptosis in NHEKs. At this time, the measurement results at the indicated time points (1, 2, 4, 8 and 12 hours) after irradiating NHEKs with 100 mJ/cm ² UVB were shown, and NHEKs not exposed to UVB were used as a control (0 hours): (A) An image of the cellular morphology of NHEKs taken with an optical microscope (×100) (scale bar 50 μm); (B) Images of NHEKs analyzed for cell morphology by crystal violet staining; (C) A graph quantifying the relative cell viability of the UVB-treated group by setting the viability of the control cells to 100%; (D) A graph quantifying the level of LDH released into the medium using lactate dehydrogenase (LDH) analysis compared to the LDH release amount of the control group of 1.0 (mean±SD, n=3, * P<0.001 is between the control group and each treatment group. means a significant difference); and (E) an image as a result of measuring the protein expression level of cas-3 according to UVB irradiation time by Western blotting.
3 is a result of analyzing the inhibitory effect of baicalin treatment on the decrease in pp2b activity on the UVB-induced decrease in calcineurin activity in NHEKs. At this time, NHEKs were treated with baikalein (100 μM) and then exposed to 100 mJ/cm ² UVB, and NHEKs untreated with baicalin were used as control (untreated UVB) and UVB irradiation groups: (A) Fluo-4 NHEKs Staining with -AM (5μM) and confirming the change in intracellular Ca ²⁺ concentration through flow cytometry graph; (B) A graph quantifying the relative fluorescence intensity of the UVB-treated group by measuring the fluorescence intensity of NHEKs stained with Fluo-4-AM and setting the Ca ²⁺ concentration of the control cells to 1.0; (C) a graph of the result of measuring the activity of pp2b with a calcineurin (pp2b) activity assay kit; (D) an image of the result of measuring the protein expression level of p-bcl-10 according to the UVB irradiation time by Western blotting; and (E) a graph quantifying the protein expression level of p-bcl-10 by measuring the band density (mean±SD, n=3, * P<0.001 is a significant difference between the control group and each treatment group, # P< 0.001 means a significant difference between the UVB-irradiated group and each baicalin-treated group).
FIG. 4 is a result of analyzing the protective effect of inhibiting the decrease in pp2b activity according to baicalein treatment against UVB-induced cell death in NHEKs. At this time, NHEKs were treated with baikalein (0, 25, 50 and 100 μM) and then irradiated with 100 mJ/cm ² UVB, and NHEKs untreated with both UVB and baikalein were used as controls: (A) NHEKs cells Images taken with an optical microscope (×100) of the morphology (scale bar 50 μm); (B) Images of NHEKs analyzed for cell morphology by crystal violet staining; (C) A graph quantifying the relative cell viability of each treatment group by setting the viability of the control cells to 100%; (D) A graph quantifying the level of LDH released into the medium using lactate dehydrogenase (LDH) analysis compared to the LDH release amount of the control group of 1.0 (mean±SD, n=3, * P<0.001 is between the control group and each treatment group. Significant difference, # P<0.001 means a significant difference between the UVB irradiation group and each baicalin treatment group); and (E) an image as a result of measuring the protein expression level of cas-3 according to UVB irradiation time by Western blotting.
5 is a result of analyzing the effect of pp2b inhibitor treatment on the protective effect of baikalein against UVB-induced cell death. At this time, NHEK was treated with baikalein (100 μM) and/or pp2b inhibitor (1 μM FK506 or 1 μM Cys A), then 100 mJ/cm ² UVB was irradiated, and NHEKs untreated with UVB, baikalein and pp2b inhibitor were all untreated. As a control group: (A) an image of the cellular morphology of NHEKs taken with an optical microscope (×100) (scale bar 50 μm); (B) Images of NHEKs analyzed for cell morphology by crystal violet staining; (C) A graph quantifying the relative cell viability of each treatment group by setting the viability of the control cells to 100%; (D) A graph quantifying the level of LDH released into the medium using lactate dehydrogenase (LDH) analysis compared to the LDH release amount of the control group of 1.0 (mean±SD, n=3, * P<0.001 is between the control group and each treatment group. Significant difference, # P<0.001 is a significant difference between the UVB-irradiated group and each baikalein-treated group, ‡ P<0.001 is the UVB and baicalin-treated groups treated with pp2b inhibitor and UVB and baicalin treated without the pp2b inhibitor. mean significant difference between groups); and (E) an image as a result of measuring the protein expression level of cas-3 according to UVB irradiation time by Western blotting.
6 is a result of analyzing the protective effect on the skin damage caused by UVB according to the baicalein treatment: (A) an image of the skin, such as a mouse, before collecting a skin tissue sample; (B) A graph quantifying the degree of skin damage using the Draize scoring system (mean±SD, n=5, *P<0.001 means a significant difference between the control group and each treatment group); (C) Image of the collected skin tissue samples stained with H&E (scale bar 100 μm); (D) Graph of the result of measuring the thickness of the epithelium with ImageJ (mean±SD, n=3, * P<0.001 is a significant difference between the control group and each treatment group, # P<0.001 is the UVB irradiation group and each baicalein treatment group) means a significant difference between groups); (E) Immunohistochemical analysis of skin samples using TUNEL staining and PI staining (scale bar 100 μm); (F) Histograms of TUNEL-positive cells counted and quantified compared to the control group (mean±SD, n=5, *P <0.001 means a significant difference between the control group and each treatment group, # P <0.001 is UVB irradiation) means a significant difference between the group and each baikalein treatment group); and (G) an image as a result of evaluating cas-3 activity in skin by Western blotting.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일 측면에서, 바이칼레인(baicalein) 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, there is provided a cosmetic composition for preventing or improving skin damage caused by ultraviolet rays, comprising baicalein or a cosmetically acceptable salt thereof.

본 발명의 상기 바이칼레인의 수득방법은 특별히 한정되지 않으며, 상기 바이칼레인을 함유하고 있는 식물로부터 추출 및 분리하거나, 공지된 제법을 사용하여 화학적으로 합성하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 시판되는 바이칼레인을 구입하여 사용하였다.The method for obtaining the baicalin of the present invention is not particularly limited, and may be extracted and separated from a plant containing the baicalin, chemically synthesized using a known method, or commercially available. In the present invention, commercially available baicalein was purchased and used.

나아가, 본 발명은 상기 바이칼레인 및 이의 화장품학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 입체이성질체, 유도체, 용매화물 등을 모두 포함하는 것일 수 있다.Furthermore, the present invention may include all possible stereoisomers, derivatives, solvates, etc. that can be prepared therefrom, as well as the baicalin and its cosmetically acceptable salts.

상기 용어 "화장품학적으로 허용가능한 염"은 화장품학적으로 허용 가능하고 모화합물(parent compound)의 바람직한 약리 활성을 갖는 본 발명의 일 양상에 따른 염을 의미한다. 상기 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 시클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-히드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [2,2,2]-옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로파이온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다.The term “cosmetically acceptable salt” refers to a salt according to an aspect of the present invention that is cosmetically acceptable and has the desired pharmacological activity of the parent compound. The salt is formed with an inorganic acid such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and the like; or acetic acid, propionic acid, hexanoic acid, cyclopentanepropionic acid, glycolic acid, pyruvic acid, lactic acid, malonic acid, succinic acid, malic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, 3-(4-hydroxybenzoyl) Benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, 1,2-ethane-disulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, 4-chlorobenzenesulfonic acid, 2-naphthalenesulfonic acid, 4-Toluenesulfonic acid, camphorsulfonic acid, 4-methylbicyclo[2,2,2]-oct-2-ene-1-carboxylic acid, glucoheptonic acid, 3-phenylpropionic acid, trimethylacetic acid, tert -acid addition salts formed with organic acids such as butylacetic acid, lauryl sulfate, gluconic acid, glutamic acid, hydroxynaphthoic acid, salicylic acid, stearic acid, and muconic acid; or salts formed when an acidic proton present in the parent compound is substituted.

상기 용어 "입체이성질체(stereoisomer)"는 분자식 및 구성원자의 연결 방법도 같으나 원자 사이의 공간적 배치가 다른 것을 말한다. 상기 입체이성질체는 부분입체 이성질체(diasteromer) 또는 거울상이성질체(enantiomer)일 수 있다. 거울상이성질체는 왼손과 오른손의 관계처럼 그 거울상과 겹쳐지지 않는 이성질체를 말하고, 광학이성질체(optical isomer)라고도 한다. 거울상 이성질체는 키랄 중심 탄소에 4개 이상의 치환기가 서로 다른 경우 R(Rectus: 시계방향) 및 S(sinister: 반시계 방향)로 구분한다. 부분입체이성질체는 거울상 관계가 아닌 입체 이성질체를 말하고, 원자의 공간 배열이 달라 생기 시스(cis)-트랜스(trans) 이성질체로 나뉠 수 있다.The term "stereoisomer" refers to a thing in which the molecular formula and the method of connecting members are the same, but the spatial arrangement between atoms is different. The stereoisomer may be a diasteromer or an enantiomer. An enantiomer refers to an isomer that does not overlap its mirror image as in the relationship between the left hand and the right hand, and is also called an optical isomer. Enantiomers are divided into R (Rectus: clockwise) and S (sinister: counterclockwise) when 4 or more substituents differ from each other at the chiral central carbon. Diastereomers refer to stereoisomers that are not in a mirror image relationship, and can be divided into cis-trans isomers due to the spatial arrangement of atoms.

상기 용어 "유도체(derivative)"는 상기 화합물의 구조 일부를 다른 원자나 원자단으로 치환하여 얻어지는 화합물을 말한다.The term "derivative" refers to a compound obtained by substituting a part of the structure of the compound with another atom or group of atoms.

상기 용어 "용매화물(solvate)"는 유기 또는 무기 용매에 용매화된 화합물을 말한다. 상기 용매화물은 예를 들어, 수화물이다.The term “solvate” refers to a compound solvated in an organic or inorganic solvent. The solvate is, for example, a hydrate.

본 발명에 있어서, 상기 자외선은 UVB인 것일 수 있다.In the present invention, the ultraviolet rays may be UVB.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 자외선에 의한 단백질 탈인산화효소 2B(protein phosphatase 2B; pp2b) 활성의 감소를 증가시키는 것일 수 있다. 본 발명의 바이칼레인은 pp2b를 활성화시킴으로써, 자외선으로부터 피부를 보호하고, 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선시키는 효과를 발휘하는 것일 수 있다. 이때, 상기 활성화란, pp2b의 효소 활성, 단백질, 유전자 또는 관련 인자의 수준 또는 발현을 증가시키는 것을 의미하는 것일 수 있다.In the present invention, the cosmetic composition may increase the decrease in protein phosphatase 2B (pp2b) activity by ultraviolet rays. By activating pp2b, the baicalin of the present invention may protect the skin from UV rays and exhibit the effect of preventing or improving skin damage caused by UV rays. In this case, the activation may mean increasing the level or expression of pp2b enzymatic activity, protein, gene, or related factors.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 자외선에 의한 조직 또는 세포 내 칼슘 이온 농도의 감소를 증가시키는 것일 수 있다. 본 발명의 바이칼레인은 자외선에 의해 피부 조직 또는 세포내 Ca²⁺농도가 감소되는 현상을 억제함으로써, pp2b 활성 증가를 통해, 자외선으로부터 피부를 보호하고, 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선시키는 효과를 발휘하는 것일 수 있다.In the present invention, the cosmetic composition may increase the decrease in the concentration of calcium ions in tissues or cells by ultraviolet rays. The baicalin of the present invention inhibits a phenomenon in which the concentration of Ca ²⁺ in skin tissue or cells is decreased by ultraviolet rays, thereby protecting the skin from ultraviolet rays and preventing or improving the skin damage caused by ultraviolet rays by increasing pp2b activity may be exerting

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 상피조직의 두께 증가를 억제하는 것일 수 있다. 본 발명의 바이칼레인은 자외선으로 인해 유발되는 피부 상피조직의 두께 증가를 억제함으로써, 자외선으로부터 피부를 보호하고, 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선시키는 효과를 발휘하는 것일 수 있다.In the present invention, the cosmetic composition may suppress an increase in the thickness of the skin epithelial tissue. The baicalein of the present invention may exhibit the effect of protecting the skin from UV rays and preventing or improving skin damage caused by UV rays by suppressing an increase in the thickness of the skin epithelial tissue caused by UV rays.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 각질세포의 사멸을 억제하는 것일 수 있다. 본 발명의 바이칼레인은 자외선으로 인해 유발되는 피부 각질세포의 사멸을 억제함으로써, 자외선으로부터 피부를 보호하고, 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선시키는 효과를 발휘하는 것일 수 있다.In the present invention, the cosmetic composition may inhibit the death of skin keratinocytes. The baicalin of the present invention may exhibit the effect of protecting the skin from UV rays and preventing or improving skin damage caused by UV rays by inhibiting the apoptosis of skin keratinocytes induced by UV rays.

본 발명의 일실시예에서는 바이칼레인이 자외선(UVB 등) 조사에 의해 감소된 칼슘 이온(Ca2+) 농도를 증가시키고, 억제된 pp2b 활성을 증가시킴으로써, 자외선 조사로 인한 각질 세포 사멸 및 피부 손상에 대해 보호 효과를 나타낼 수 있으므로, 자외선에 의한 홍반 등의 피부 손상을 억제 또는 개선하는데 유용하게 사용될 수 있음을 입증하였고, 자외선에 의한 피부 상피조직의 두께 증가를 억제함으로써, 피부 노화를 억제 또는 개선하는데에도 유용하게 사용될 수 있음을 입증하였다(실시예 1 내지 6 참조).In one embodiment of the present invention, baicalein increases the calcium ion (Ca2+) concentration reduced by ultraviolet (UVB, etc.) irradiation and increases the inhibited pp2b activity, thereby preventing keratinocyte death and skin damage caused by ultraviolet irradiation. Since it can exhibit a protective effect, it has been proven that it can be usefully used to inhibit or improve skin damage such as erythema caused by ultraviolet rays, and by suppressing the increase in the thickness of the skin epithelial tissue by ultraviolet rays, it is also used to inhibit or improve skin aging It has been proven that it can be usefully used (see Examples 1 to 6).

일 구현예에서, 상기 화장료 조성물은 자외선 조사에 의해 피부 두께가 증가하는 것을 억제함으로써, 피부 노화(광노화)를 억제 또는 개선시키는 효과를 나타내는 것일 수 있다.In one embodiment, the cosmetic composition may exhibit an effect of inhibiting or improving skin aging (photoaging) by suppressing an increase in skin thickness by UV irradiation.

일 구현예에서, 상기 화장료 조성물은 자외선 조사로 인한 피부 손상 및 세포 사멸을 억제함으로써, 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 조성물로 이용될 수 있다.In one embodiment, the cosmetic composition may be used as a composition for protecting the skin from UV rays by inhibiting skin damage and cell death due to UV irradiation.

본 발명에 있어서, 상기 자외선에 의한 피부 손상은 자외선에 의해 표피 또는 진피에 발생하는 일광화상, 홍반, 부종, 색소침착, 피부 염증, 피부 각화, 광알레르기, 광독성, 광감작현상 및 광노화로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.In the present invention, the skin damage caused by ultraviolet rays is a group consisting of sunburn, erythema, edema, pigmentation, skin inflammation, skin keratinization, photoallergy, phototoxicity, photosensitization, and photoaging occurring in the epidermis or dermis by ultraviolet rays. It may be any one or more selected from.

본 발명에서 ‘홍반(erythema)’이란 자외선 노출 등의 자극에 의해 피부 내 혈관이 확장되거나 혈류량이 증가하여 피부가 붉게 변하는 피부질환을 의미한다. 일반적으로 30일 내외로 자연스럽게 소실되지만, 지속적인 자극에 의해 색소 침착이 남으면 치료가 쉽지 아니하고, 정상피부와 달리 각질층이 발달하게 되어 가렵고 따끔거리는 증세를 나타낼 수 있어 홍반의 예방과 초기 치료가 중요하다.In the present invention, 'erythema' refers to a skin disease in which the skin turns red due to the expansion of blood vessels in the skin or increased blood flow by stimulation such as UV exposure. In general, it disappears naturally within 30 days, but if pigmentation remains due to continuous stimulation, it is difficult to treat, and unlike normal skin, the stratum corneum develops, which can cause itchy and stinging symptoms, so prevention and early treatment of erythema are important.

본 발명에서 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 자외선에 의하여 유발되는 피부 손상, 피부 노화, 피부 세포 사멸 등의 증상 또는 피부 질환의 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 자외선에 의하여 유발되는 증상 또는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, "prevention" means any action that delays the onset of symptoms or skin diseases such as skin damage, skin aging, and skin cell death caused by ultraviolet rays by administration of the composition according to the present invention, and "improvement" By administration of the composition according to the present invention, it means any action that reduces the symptoms or disease-related parameters, for example, the severity of symptoms induced by ultraviolet rays.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양크림, 수분크림, 마사지크림, 에센스, 페이스트, 마스크팩, 패치, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌저, 오일, 파운데이션, 메이크업 베이스, 왁스 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 제형인 것일 수 있다. 상기한 성분 이외의 다른 성분들은 기타 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.The cosmetic composition according to the present invention is a lotion, nourishing lotion, nourishing cream, moisture cream, massage cream, essence, paste, mask pack, patch, gel, cream, lotion, powder, soap, cleanser, oil, foundation, makeup base, wax And it may be one or more formulations selected from the group consisting of sprays. Components other than the above components can be appropriately selected and formulated by those skilled in the art without difficulty depending on other formulations or purposes of use.

일 구현예에서, 상기 화장료 조성물은, 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 오일, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.In one embodiment, the cosmetic composition may be provided in any formulation suitable for topical application. For example, solutions, gels, solid or kneaded dry products, emulsions obtained by dispersing an oily phase in an aqueous phase, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules or ionic (liposomes), nonionic vesicular dispersions, creams, It may be provided in the form of a skin, lotion, oil, powder, ointment, spray or cone stick. In addition, it may be prepared in the form of a foam or an aerosol composition further containing a compressed propellant.

또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 상기 바이칼레인에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 이들 보조제는 화장품학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.In addition, the cosmetic composition comprises a fatty substance, an organic solvent, a solubilizer, a thickening agent and a gelling agent, an emollient, an antioxidant, a suspending agent, a stabilizer, a foaming agent, a fragrance, and a surfactant in addition to the baicalin of the present invention. , water, ionic or non-ionic emulsifiers, fillers, sequestering and chelating agents, preservatives, vitamins, blocking agents, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic actives, lipid vesicles or conventionally in cosmetics. It may contain adjuvants commonly used in the cosmetic field, such as any other ingredients used. These adjuvants are introduced in amounts generally used in the field of cosmetology.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 상기 바이칼레인이 0.001 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.In the cosmetic composition of the present invention, the baicalin of the present invention may be added in an amount of 0.001 to 50% by weight, preferably 0.01 to 10% by weight, in the cosmetic composition usually contained therein.

본 발명에 따른 바이칼레인을 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.When the baicalein according to the present invention is used as an external preparation for skin, additionally a fatty substance, an organic solvent, a solubilizer, a thickening agent and a gelling agent, an emollient, an antioxidant, a suspending agent, a stabilizer, a foaming agent, a fragrance, an interface Active agents, water, ionic or nonionic emulsifiers, fillers, sequestering and chelating agents, preservatives, vitamins, blocking agents, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic active agents, lipid vesicles or external preparations for skin It may contain adjuvants commonly used in the field of dermatology, such as any other ingredients commonly used. In addition, the above ingredients may be introduced in an amount generally used in the field of dermatology.

본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.The cosmetic composition of the present invention may be used alone or in combination, or may be used in combination with other cosmetic compositions other than the present invention. In addition, the cosmetic composition according to the present invention can be used according to a conventional method of use, and the number of times of use can be changed according to the skin condition or taste of the user.

일 구현예에서, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 유효한 양으로 개체에게 국소 도포하는 단계를 포함하는, 자외선에 의한 피부 손상를 예방 또는 개선하는 방법을 제공한다.In one embodiment, the present invention provides a method for preventing or improving skin damage caused by ultraviolet rays, comprising the step of topically applying the cosmetic composition to an individual in an effective amount.

상기, "개체"란, 상기 증상이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하는 것일 수 있고, 본 발명의 화장료 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 증상들을 효과적으로 예방 또는 개선시킬 수 있다.As used herein, the term "individual" refers to all animals, including humans, monkeys, cows, horses, sheep, pigs, chickens, turkeys, quails, cats, dogs, mice, rats, rabbits or guinea pigs who have or may develop the above symptoms. It may mean an animal, and by administering the cosmetic composition of the present invention to an individual, the symptoms can be effectively prevented or improved.

본 발명에서 용어 "유효한 양"은 화장품에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 자외선에 의해 유발되는 피부의 손상, 노화 등의 증상을 개선시키기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 손상정도, 자극정도, 노화정도, 연령, 성별, 유효성분의 활성, 유효성분에 대한 민감도, 도포 시간, 도포 기간, 동시 사용되는 다른 유효성분을 포함한 요소 및 기타 화장품 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.In the present invention, the term "effective amount" means an amount sufficient to improve symptoms such as skin damage and aging caused by UV rays at a reasonable benefit/risk ratio applicable to cosmetics, and the effective dose level depends on the type of individual and the damage. It may be determined according to the degree, the degree of irritation, the degree of aging, age, sex, the activity of the active ingredient, the sensitivity to the active ingredient, the application time, the application period, factors including other active ingredients used at the same time, and other factors well known in the cosmetic field. have.

또한, 본 발명의 일 측면에서, 바이칼레인(baicalein) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.In addition, in one aspect of the present invention, it provides a food composition for preventing or improving skin damage caused by ultraviolet rays, including baicalein or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 자외선에 의한 프로틴 탈인산화효소 2B(protein phosphatase 2B; pp2b) 활성의 감소를 증가시키는 것일 수 있다. 본 발명의 바이칼레인은 pp2b를 활성화시킴으로써, 자외선으로부터 피부를 보호하고, 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선시키는 효과를 발휘하는 것일 수 있다.In the present invention, the food composition may increase the decrease in protein dephosphorylation enzyme 2B (protein phosphatase 2B; pp2b) activity by ultraviolet rays. By activating pp2b, the baicalin of the present invention may protect the skin from UV rays and exhibit the effect of preventing or improving skin damage caused by UV rays.

본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 자외선에 의한 조직 또는 세포 내 칼슘 이온 농도의 감소를 증가시키는 것일 수 있다. 본 발명의 바이칼레인은 자외선에 의해 피부 조직 또는 세포내 Ca²⁺농도가 감소되는 현상을 억제함으로써, pp2b 활성 증가를 통해, 자외선으로부터 피부를 보호하고, 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선시키는 효과를 발휘하는 것일 수 있다.In the present invention, the food composition may increase the decrease in the concentration of calcium ions in tissues or cells by ultraviolet rays. The baicalin of the present invention inhibits a phenomenon in which the concentration of Ca ²⁺ in skin tissue or cells is decreased by ultraviolet rays, thereby protecting the skin from ultraviolet rays and preventing or improving the skin damage caused by ultraviolet rays by increasing pp2b activity may be exerting

본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 피부 상피조직의 두께 증가를 억제하는 것일 수 있다. 본 발명의 바이칼레인은 자외선으로 인해 유발되는 피부 상피조직의 두께 증가를 억제함으로써, 자외선으로부터 피부를 보호하고, 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선시키는 효과를 발휘하는 것일 수 있다.In the present invention, the food composition may be to inhibit the increase in the thickness of the skin epithelial tissue. The baicalein of the present invention may exhibit the effect of protecting the skin from UV rays and preventing or improving skin damage caused by UV rays by suppressing an increase in the thickness of the skin epithelial tissue caused by UV rays.

본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 피부 각질세포의 사멸을 억제하는 것일 수 있다. 본 발명의 바이칼레인은 자외선으로 인해 유발되는 피부 각질세포의 사멸을 억제함으로써, 자외선으로부터 피부를 보호하고, 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선시키는 효과를 발휘하는 것일 수 있다.In the present invention, the food composition may inhibit the death of keratinocytes of the skin. The baicalin of the present invention may exhibit the effect of protecting the skin from UV rays and preventing or improving skin damage caused by UV rays by inhibiting the apoptosis of skin keratinocytes induced by UV rays.

일 구현예에서, 상기 식품 조성물은 자외선 조사에 의해 피부 두께가 증가하는 것을 억제함으로써 피부 노화(광노화)를 억제 또는 개선시키는 효과를 나타내는 것일 수 있다.In one embodiment, the food composition may exhibit an effect of inhibiting or improving skin aging (photoaging) by inhibiting an increase in skin thickness by UV irradiation.

본 발명의 조성물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 상기 바이칼레인을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다.When the composition of the present invention is used as a food composition, the baicalin may be added as it is or used with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.

상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합량은 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.In addition to the active ingredient, the composition may include a food additive that is pharmaceutically acceptable, and the mixing amount of the active ingredient may be suitably determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).

본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.As used in the present invention, the term "food supplement additive" refers to a component that can be supplementally added to food, and is added to manufacture health functional food of each formulation, and those skilled in the art can appropriately select and use it. Examples of food supplement additives include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavoring agents and flavoring agents such as natural flavoring agents, coloring agents and fillers, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners , pH adjuster, stabilizer, preservative, glycerin, alcohol, carbonation agent used in carbonated beverages, etc., but the above examples are not limited to the type of food supplement additive of the present invention.

본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품을 포함하는 의미인 것일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. The food composition of the present invention may be meant to include health functional food. The term "health functional food" used in the present invention refers to food manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc. using raw materials or ingredients useful for the human body. Here, the term 'functionality' refers to obtaining useful effects for health purposes such as regulating nutrients or physiological effects on the structure and function of the human body.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 통상의 기술분야에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. The health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the conventional technical field, and in the production, it can be prepared by adding raw materials and components commonly added in the conventional technical field. In addition, the dosage form of the health functional food may also be manufactured without limitation as long as it is a dosage form recognized as a health functional food.

본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 관련 질환의 치료제의 효과를 증진 시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.The composition for food of the present invention can be prepared in various forms, and unlike general drugs, it has the advantage that there are no side effects that may occur when taking the drug for a long period of time using food as a raw material, and it is excellent in portability, and the present invention Health functional foods can be taken as supplements to enhance the effect of treatment for related diseases.

또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 바이칼레인을 유효성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. In addition, there is no limitation on the type of health food in which the composition of the present invention can be used. In addition, the composition comprising baicalein of the present invention as an active ingredient can be prepared by mixing well-known additives with other suitable auxiliary ingredients that may be contained in health functional foods according to the selection of those skilled in the art.

첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 바이칼레인을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.Examples of foods that can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages and There are vitamin complexes, and the like, and it can be prepared by adding to juice, tea, jelly, juice, etc. prepared with baicalin according to the present invention as a main component.

나아가, 본 발명의 일 측면에서, 바이칼레인(baicalein) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 자외선에 의한 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.Furthermore, in one aspect of the present invention, it provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases caused by ultraviolet rays, including baicalein or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 자외선에 의한 프로틴 탈인산화효소 2B(protein phosphatase 2B; pp2b) 활성의 감소를 증가시키는 것일 수 있다. 본 발명의 바이칼레인은 pp2b를 활성화시킴으로써, 자외선으로부터 피부를 보호하고, 자외선에 의한 피부 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 발휘하는 것일 수 있다.In the present invention, the pharmaceutical composition may increase the decrease in protein dephosphorylation enzyme 2B (protein phosphatase 2B; pp2b) activity by ultraviolet rays. By activating pp2b, the baicalin of the present invention may protect the skin from UV rays and exhibit the effect of preventing or treating skin diseases caused by UV rays.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 자외선에 의한 조직 또는 세포 내 칼슘 이온 농도의 감소를 증가시키는 것일 수 있다. 본 발명의 바이칼레인은 자외선에 의해 피부 조직 또는 세포내 Ca²⁺농도가 감소되는 현상을 억제함으로써, pp2b 활성 증가를 통해, 자외선으로부터 피부를 보호하고, 자외선에 의한 피부 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 발휘하는 것일 수 있다.In the present invention, the pharmaceutical composition may increase the decrease in the concentration of calcium ions in tissues or cells by ultraviolet rays. Baikalein of the present invention inhibits a phenomenon in which the concentration of Ca ²⁺ in skin tissue or cells is decreased by ultraviolet rays, thereby protecting the skin from ultraviolet rays and preventing or treating skin diseases caused by ultraviolet rays by increasing pp2b activity may be exerting

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 피부 상피조직의 두께 증가를 억제하는 것일 수 있다. 본 발명의 바이칼레인은 자외선으로 인해 유발되는 피부 상피조직의 두께 증가를 억제함으로써, 자외선으로부터 피부를 보호하고, 자외선에 의한 피부 질환을 예방 또는 치료하는 효과 및 피부 노화와 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 발휘하는 것일 수 있다.In the present invention, the pharmaceutical composition may be to inhibit the increase in the thickness of the skin epithelial tissue. By inhibiting the increase in the thickness of the skin epithelial tissue caused by ultraviolet rays, the baicalin of the present invention protects the skin from ultraviolet rays, prevents or treats skin diseases caused by ultraviolet rays, and prevents or treats diseases related to skin aging. it may be effective.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 피부 각질세포의 사멸을 억제하는 것일 수 있다. 본 발명의 바이칼레인은 자외선으로 인해 유발되는 피부 각질세포의 사멸을 억제함으로써, 자외선으로부터 피부를 보호하고, 자외선에 의한 피부 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 발휘하는 것일 수 있다.In the present invention, the pharmaceutical composition may inhibit apoptosis of skin keratinocytes. The baicalein of the present invention may exhibit the effect of protecting the skin from UV rays and preventing or treating skin diseases caused by UV rays by inhibiting the apoptosis of skin keratinocytes induced by UV rays.

본 발명의 일실시예에서는 바이칼레인이 자외선(UVB 등) 조사에 의해 감소된 칼슘 이온(Ca2+) 농도를 증가시키고, 억제된 pp2b 활성을 증가시킴으로써, 자외선 조사로 인한 각질 세포 사멸 및 피부 손상에 대해 보호 효과를 나타낼 수 있으므로, 자외선에 의해 유발되는 홍반 등의 피부 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있음을 입증하였고, 자외선에 의한 피부 상피조직의 두께 증가를 억제함으로써, 피부 노화 관련 질환을 예방 또는 치료하는데에도 유용하게 사용될 수 있음을 입증하였다(실시예 1 내지 6 참조).In one embodiment of the present invention, baicalein increases the calcium ion (Ca2+) concentration reduced by ultraviolet (UVB, etc.) irradiation and increases the inhibited pp2b activity, thereby preventing keratinocyte death and skin damage caused by ultraviolet irradiation. Since it can exhibit a protective effect, it has been proven that it can be usefully used to prevent or treat skin diseases such as erythema induced by ultraviolet rays, and by inhibiting the increase in the thickness of the skin epithelial tissue by ultraviolet rays, it prevents skin aging-related diseases Or it has been demonstrated that it can be usefully used for treatment (see Examples 1 to 6).

일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 자외선 조사에 의해 피부 두께가 증가하는 것을 억제함으로써 피부 노화(광노화) 관련 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 나타내는 것일 수 있다.In one embodiment, the pharmaceutical composition may exhibit an effect of preventing or treating skin aging (photoaging) related diseases by inhibiting the increase in skin thickness by UV irradiation.

본 발명에 있어서, 상기 자외선에 의한 피부 질환은 일광화상, 홍반, 부종, 색소침착, 피부 염증, 피부 각화, 광알레르기, 광독성, 광감작현상 및 광노화로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.In the present invention, the skin disease caused by ultraviolet rays may be any one or more selected from the group consisting of sunburn, erythema, edema, pigmentation, skin inflammation, skin keratosis, photoallergy, phototoxicity, photosensitization, and photoaging.

상기 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 화합물의 무기산염, 유기산염, 또는 금속염의 부가염을 말한다. 상기염은 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 염일 수 있다. 상기 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염, 또는 이황산염일 수 있다. 상기 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 또는 아스파르트산염일 수 있다. 상기 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염, 또는 칼륨염일 수 있다.The term "pharmaceutically acceptable salt" refers to an addition salt of an inorganic, organic, or metal salt of a compound. The salt may be a pharmaceutically acceptable salt. The pharmaceutically acceptable salt may be a salt that does not cause serious irritation to the organism to which the compound is administered and does not impair the biological activity and properties of the compound. The inorganic acid salt may be hydrochloride, bromate, phosphate, sulfate, or disulfate. The organic acid salts include formate, acetate, acetate, propionate, lactate, oxalate, tartrate, malate, maleate, citrate, fumarate, besylate, camsylate, edicyl salt, trichloroacetic acid, trifluoro Acetate, benzoate, gluconate, methanesulfonate, glycolate, succinate, 4-toluenesulfonate, galacturonate, embonate, glutamate, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, or aspartate. The metal salt may be a calcium salt, a sodium salt, a magnesium salt, a strontium salt, or a potassium salt.

상기 “치료”는 치료하고자 하는 대상(또는 개체) 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위하여 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하며, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위하여 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과는 질병의 발생 또는 재발을 예방하거나, 증상을 완화시키거나, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키거나, 전이를 예방하거나, 질병 진행 속도를 감소시키거나, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키거나, 예후를 개선시키는 것을 포함할 수 있다.The "treatment" refers to any action that clinically intervenes to change the natural process of a subject (or individual) or cell to be treated, and may be performed while a clinical pathology is in progress or to prevent it. The desired therapeutic effect is to prevent the occurrence or recurrence of a disease, alleviate symptoms, reduce any direct or indirect pathological consequences of the disease, prevent metastasis, reduce the rate of disease progression, or reduce the rate of disease progression. alleviating or temporarily ameliorating the condition, or improving the prognosis.

상기, "개체"란, 상기 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하는 것일 수 있고, 본 발명의 약학 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환들을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.As used herein, the term "individual" refers to all animals, including monkeys, cows, horses, sheep, pigs, chickens, turkeys, quails, cats, dogs, mice, rats, rabbits or guinea pigs, including humans, who have or may develop the disease. It may mean an animal, and by administering the pharmaceutical composition of the present invention to an individual, the above diseases can be effectively prevented or treated.

상기 조성물은 경구적 전달, 비경구적 전달의 형태로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 전신 또는 국소 투여될 수 있으며, 상기 투여는 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다.The composition may be administered in the form of oral delivery or parenteral delivery. The composition may be administered systemically or locally, and the administration may include oral administration and parenteral administration. The compositions may be formulated with a suitable amount of a pharmaceutically acceptable vehicle or carrier to provide an appropriate dosage form.

상기 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition may further include a carrier, excipient and diluent used in the preparation of the pharmaceutical composition. The carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil.

또한, 상기 약학 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injection solutions.

경구 투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 사용될 수 있고, 상기 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 또한, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수 있다.A solid preparation for oral administration may include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and the solid preparation includes at least one excipient in the extract, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, or gelatin. It can be prepared by mixing. In addition to the above excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may be used.

경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있고, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.Liquid formulations for oral administration may include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc., and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. may be used in addition to simple diluents such as water and liquid paraffin.

비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 사용될 수 있다.Formulations for parenteral administration may be sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, and suppositories.

상기 비수성용제, 현탁제는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.The non-aqueous solvent and suspension may be propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, or injectable ester such as ethyl oleate. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin fat, and glycerogelatin may be used.

일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양이 대상체에 투여될 수 있다. 상기 “약제학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.In one embodiment, the pharmaceutical composition may be administered to a subject in a pharmaceutically effective amount. The “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is dependent on the patient's type, severity, drug activity, and drug. Sensitivity, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including concomitant drugs, and other factors well known in the medical field.

일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.In one embodiment, the pharmaceutical composition may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple. Taking all of the above factors into consideration, it is preferable to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

일 구현예에서, 본 발명은 바이칼레인을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 자외선에 의한 피부 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.In one embodiment, the present invention provides a method for preventing or treating a skin disease caused by ultraviolet rays, comprising administering to a subject in need thereof.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail through the following examples. However, the following examples are only intended to embody the contents of the present invention, and the present invention is not limited thereto.

준비예 1. 세포 및 실험 동물의 준비Preparation Example 1. Preparation of cells and experimental animals

1-1. 세포 배양1-1. cell culture

정상 인간 상피 각질 세포(Normal human epithermal keratinocytes; NHEKs; neonatal; Lonza, Basel, Switzerland)는 인간 각질 세포 성장 보충제(HKGS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) 및 100 unite/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 보충된 각질 세포 성장 배지(Epilife; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)에서 5% CO₂ 분위기 및 37℃의 온도 조건으로 배양하였다. NHEKs는 콜라겐이 코팅된 플레이트에 3.5×10³ 내지 1×10⁴ 세포/cm² 사이의 세포 밀도로 분주(plating)하고, 70~90% 컨플루언트 배양(confluent cultures)이 될 때까지 배양하였다.Normal human epithermal keratinocytes (NHEKs; neonatal; Lonza, Basel, Switzerland) were mixed with human keratinocyte growth supplement (HKGS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) and 100 unite/ml 5% CO ₂ atmosphere in keratinocyte growth medium (Epilife; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) supplemented with penicillin and 100 μg/ml streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). and incubated at a temperature condition of 37°C. NHEKs were plated at a cell density between 3.5×10 ³ and 1×10 ⁴ cells/cm ² on a collagen-coated plate, and cultured until 70-90% confluent. .

1-2. 세포 UVB 조사 및 바이칼레인 처리1-2. Cell UVB irradiation and baicalin treatment

NHEKs는 상기 준비예 1-1의 방법으로 24-웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰로 분주하고, 70~90% 컨플루언트로 배양되었다. 자외선 B(UVB) 조사(irradiation)를 위해 배양 배지를 제거하고 150μl/웰의 PBS를 첨가한 다음, UVB 소스로 CL-1000 UV Crosslinker(UVP, Upland, CA, USA)를 사용하여 100mJ/cm²의 선량으로 배양 배지를 UVB에 노출시켰다. UVB 조사가 완료된 후 PBS를 제거하고, 지시된 농도의 바이칼레인(bai; cat. No. 465119; Sigma-Aldrich; Merck. KGaA, Danvers, MA, USA)를 포함하거나 바이칼레인을 포함하지 않는 500μl/웰의 새 배양 배지를 첨가하였다.NHEKs were aliquoted at 1×10 ⁵ cells/well in a 24-well plate by the method of Preparation Example 1-1, and cultured to 70-90% confluency. For ultraviolet B (UVB) irradiation, the culture medium was removed and 150 μl/well of PBS was added, followed by 100 mJ/cm ² using a CL-1000 UV Crosslinker (UVP, Upland, CA, USA) as a UVB source. The culture medium was exposed to UVB at a dose of After UVB irradiation was completed, PBS was removed, and 500 μl/with or without baicalin (bai; cat. No. 465119; Sigma-Aldrich; Merck. KGaA, Danvers, MA, USA) at the indicated concentrations. A fresh culture medium was added to the wells.

pp2b 억제를 위해, UVB 조사 유무에 관계없이 바이칼레인 처리 전후 1시간에 세포를 1μM의 FK506(cat. No. 10007965; Cayman chemical; Ann Arbor, Michigan, USA) 또는 cyclosporine A(Cys A; cat. No. 12088; Cayman chemical; Ann Arbor, Michigan, USA)로 전처리하였다.For pp2b inhibition, 1 μM of FK506 (cat. No. 10007965; Cayman chemical; Ann Arbor, Michigan, USA) or cyclosporine A (Cys A; cat. No. 12088; Cayman chemical; Ann Arbor, Michigan, USA).

1-3. 실험 동물1-3. laboratory animal

7주령 수컷 BALB/c 마우스(체중 21~25g)를 동물 시설에서 12시간 명암 주기로 표준 조건에서 사육하였다. 모든 실험은 IACUC 동물 실험 윤리위원회(승인 번호: CBNU-2020-0151)에서 설정한 지침에 따라 수행되었다. 사육 시설 적응 일주일 후, 마우스를 4개의 그룹(그룹당 5마리)으로 나누었다: 그룹 1- UVB 조사 및 바이칼레인을 모두 처리하지 않은 군(정상 대조군); 그룹 2- UVB 조사만 처리하고 바이칼레인은 비처리한 군(UVB 조사군); 그룹 3- UVB 조사 및 0.5mM 바이칼레인 처리군; 그룹 4- UVB 조사 및 1mM 바이칼레인 처리군.7-week-old male BALB/c mice (weight 21 to 25 g) were bred in an animal facility under standard conditions with a 12-hour light-dark cycle. All experiments were performed according to guidelines set by the IACUC Animal Experimental Ethics Committee (approval number: CBNU-2020-0151). After one week of acclimatization to the breeding facility, the mice were divided into 4 groups (5 mice per group): Group 1- Untreated with UVB irradiation and baikalein (normal control group); Group 2- UVB irradiation only and no baicalein (UVB irradiation group); Group 3- UVB irradiation and 0.5 mM baicalin treatment group; Group 4- UVB irradiation and 1 mM baicalin treatment group.

UVB 조사 처리를 위하여, 3일에 한 번씩 각 마우스의 등쪽 피부에 1×1.5cm²의 정사각형 모양으로 400mJ/cm² UVB에 노출시켰다. 등쪽 피부는 마지막 UVB 조사 24시간 후에 수집하였다. 바이칼레인의 경우 0.5mM 또는 1mM의 농도로 10일 동안 매일 등쪽 피부의 UVB 처리한 곳과 동일한 부분에 1×1.5cm²의 정사각형 모양으로 국소 도포 처리하였다.For UVB irradiation treatment, once every 3 days, the dorsal skin of each mouse was exposed to 400mJ/cm ² UVB in a square shape of 1×1.5 cm ² . Dorsal skin was collected 24 hours after the last UVB irradiation. In the case of baikalein, it was applied topically in a square shape of 1×1.5 cm ² to the same area as the UVB-treated area of the dorsal skin every day for 10 days at a concentration of 0.5 mM or 1 mM.

1-4. 통계 분석1-4. statistical analysis

통계 분석은 GraphPad Prism (버전 5.03; GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 모든 실험은 세번 수행하였으며, 데이터는 평균±표준 편차로 표시하였다. 대조군과 처리군(UVB 및/또는 바이칼레인 처리군) 간의 유의한 차이는 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Tukey’s post-hoc test를 사용하여 분석되었다.Statistical analysis was performed using GraphPad Prism (version 5.03; GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). All experiments were performed in triplicate, and data were expressed as mean±standard deviation. Significant differences between control and treated groups (UVB and/or baicalin treated groups) were analyzed using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey's post-hoc test.

실시예 1.Example 1. NHEKs에서 UVB 조사로 인한 칼시뉴린 활성 감소 확인Confirmation of reduction in calcineurin activity due to UVB irradiation in NHEKs

PP2B는 Ca²⁺/칼모듈린-의존성 단백질 탈인산화효소(Ca²⁺/calmodulin-dependent protein phosphatase)이며 세포 내 Ca²⁺ 농도에 의해 조절된다. NHEKs에서 UVB 조사가 pp2b에 미치는 영향을 알아보기 위해, 유세포 분석을 통한 세포 내 [Ca ²⁺ ]i 농도의 변화 및 칼시뉴린 활성(PP2B 활성)을 분석하였다.PP2B is a Ca ² +/calmodulin-dependent protein phosphatase and is regulated by intracellular ^{Ca 2+} ^{concentrations} . To investigate the effect of UVB irradiation on pp2b in NHEKs, changes in intracellular [Ca ²⁺ ]i concentration and calcineurin activity (PP2B activity) were analyzed through flow cytometry.

세포 내 Ca²⁺ 농도의 변화는 유세포 분석을 사용하여 평가하였다. NHEKs(1x10⁵ 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 플레이팅하고 100mJ/cm² UVB에 노출시키고 표시된 시간(0, 1, 2, 4, 8 및 12시간)까지 배양하였다. 세포 내 Ca²⁺ 농도를 측정하기 위해 NHEKs를 37℃ 배지에서 5μM Fluo-4 AM(cat. No. F14201; Thermo Fisher Scientific, Inc.)과 함께 40분동안 배양하여 염색한 다음, HBSS(Hank 's Balanced Salt Solution)로 세 번 세척하였다. 염색 후, [Ca ²⁺ ]i의 변화는 Guava EasyCyte HT 시스템(Millipore, Bedford, MA, USA)을 사용하여 488nm 여기/530nm 방출에서 활성 강도를 측정하였다.Changes in intracellular Ca ²⁺ concentrations were assessed using flow cytometry. NHEKs (1× ^{10 5} cells/well) were plated in 24-well plates, exposed to 100 mJ/cm ² UVB and incubated for the indicated times (0, 1, 2, 4, 8 and 12 hours). To measure the intracellular Ca ²⁺ concentration, NHEKs were stained by incubating for 40 min with 5 μM Fluo-4 AM (cat. No. F14201; Thermo Fisher Scientific, Inc.) in 37 °C medium, and then stained with HBSS (Hank' s Balanced Salt Solution) was washed three times. After staining, the change in [Ca ²⁺ ]i was measured for activity intensity at 488 nm excitation/530 nm emission using a Guava EasyCyte HT system (Millipore, Bedford, MA, USA).

또한, 칼시뉴린(PP2B) 세포 활성 분석 키트(cat. No. BML-AK816-001, Enzo Life Science, USA)를 사용하여, 제조업체의 지시에 따라 대식세포에서 칼시뉴린의 탈인산화효소 활성(phosphatase activity)을 측정하였다. NHEKs(1x10⁶ 세포/웰)를 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 100mJ/cm² UVB를 조사한 다음 세포를 지정된 시간(0, 1, 2, 4, 8 및 12시간)까지 배양했다. 세포를 단백질분해효소 억제제(protease inhibitors)를 함유하는 용해 완충액에 넣어 얼음에서 용해시켰다. 탈인산화효소 활성은 분광계 판독기를 사용하여 620 nm에서 말라카이트 그린의 흡광도를 측정함으로써, 반응에서 방출된 유리 인산염을 검출하여 정량화하였다.In addition, using a calcineurin (PP2B) cell activity assay kit (cat. No. BML-AK816-001, Enzo Life Science, USA), the phosphatase activity of calcineurin in macrophages according to the manufacturer's instructions (phosphatase activity) ) was measured. NHEKs (1x10 ⁶ cells/well) were plated in 6-well plates, irradiated with 100 mJ/cm ² UVB, and then cells were incubated until the indicated times (0, 1, 2, 4, 8 and 12 hours). Cells were lysed on ice by placing them in lysis buffer containing protease inhibitors. Dephosphorylation enzyme activity was quantified by detecting the free phosphate released from the reaction by measuring the absorbance of malachite green at 620 nm using a spectrometer reader.

NHEKs를 100mJ/cm²의 UVB로 조사한 후 표시된 시점에 칼슘 지시약으로 염색한 결과, UVB 조사는 NHEKs에서 8시간 및 12시간 후에 세포 내 Ca²⁺ 농도를 감소시켰다(도 1A 및 B). NHEKs were irradiated with UVB of 100 mJ/cm ² and stained with a calcium indicator at the indicated time points. As a result, UVB irradiation decreased intracellular Ca ²⁺ concentration in NHEKs after 8 and 12 hours ( FIGS. 1A and B).

상기 결과와 마찬가지로 UVB 조사 NHEKs 펠렛에서 pp2b 활성의 시간 의존적 감소가 나타났으며, 이는 8시간 및 12시간에서 현저하게 감소하는 것으로 나타났다 (도 1C). Similar to the above results, a time-dependent decrease in pp2b activity was observed in the UVB-irradiated NHEKs pellet, which was significantly decreased at 8 and 12 hours ( FIG. 1C ).

실시예 2.Example 2. NHEKs에서 UVB 조사로 인한 칼시뉴린 활성 관련 인자의 발현 변화 확인Confirmation of expression change of factors related to calcineurin activity due to UVB irradiation in NHEKs

NHEKs에서의 PP2B 활성의 감소를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 pp2b에 의한 ser-138에서 특이적으로 탈인산화된 p-Bcl-10의 수준을 평가하였다.To confirm the decrease in PP2B activity in NHEKs, Western blot analysis was performed to evaluate the level of p-Bcl-10 specifically dephosphorylated at ser-138 by pp2b.

웨스턴 블롯 분석을 위하여, 면역 침전 분석 완충액(immunoprecipitation assay buffer)를 사용하여 NHEKs에서 총 단백질을 추출하였고, 원심 분리(13,282×g; 4℃; 10분)를 통해 상층액을 수득하였다. 총 단백질 농도는 Pierce BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 측정하였다. 단백질(30μg)은 SDS-PAGE 겔 및 니트로셀룰로오스 막으로 분리하였으며, 분리된 막을 실온에서 1시간 동안 5% 무지방 탈지유로 블로킹(blocking)한 다음 4℃에서 밤새 1차 항체와 함께 배양하였다. 항-β-액틴(anti-β-actin; cat. No. A5441; Sigma-Aldrich; Merck. KGaA, Danvers, MA, USA) 및 항-포스포-bcl-10 (anti-phospho-bcl-10; cat. No. sc-81484; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)을 면역 블롯팅을 위한 항체로 사용하였다. 막을 서양 고추냉이 퍼옥시다제-접합된 2차 항체(cat. No. ADI-SAB-100 and ADI-SAB-300; Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY)와 함께 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 면역 반응성 단백질 밴드는 강화된 화학 발광 검출 시스템(GE Healthcare Life Sciences, Chalfont, UK)을 사용하여 시각화하였다. 이때, 항-β-액틴이 로딩 컨트롤로 사용되었다.For Western blot analysis, total protein was extracted from NHEKs using an immunoprecipitation assay buffer, and the supernatant was obtained through centrifugation (13,282×g; 4°C; 10 min). Total protein concentration was determined using a Pierce BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Protein (30 μg) was separated by SDS-PAGE gel and nitrocellulose membrane, and the separated membrane was blocked with 5% nonfat skim milk at room temperature for 1 hour, and then incubated with primary antibody at 4° C. overnight. anti-β-actin (anti-β-actin; cat. No. A5441; Sigma-Aldrich; Merck. KGaA, Danvers, MA, USA) and anti-phospho-bcl-10 (anti-phospho-bcl-10; cat. No. sc-81484; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) was used as an antibody for immunoblotting. Membranes were incubated with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (cat. No. ADI-SAB-100 and ADI-SAB-300; Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY) at 25° C. for 1 hour. did. Immunoreactive protein bands were visualized using an enhanced chemiluminescence detection system (GE Healthcare Life Sciences, Chalfont, UK). At this time, anti-β-actin was used as a loading control.

그 결과, pp2b 활성의 감소에 이어 p-Bcl-10의 수준이 UVB를 조사한 시간 증가에 따라 의존적으로 증가하였다(도 1D 및 F).As a result, following the decrease in pp2b activity, the level of p-Bcl-10 increased dependently with the increase in UVB irradiation time ( FIGS. 1D and F).

실시예 3. NHEKs에서 UVB 조사로 인한 세포 사멸 확인Example 3. Confirmation of cell death due to UVB irradiation in NHEKs

크리스탈 바이올렛 염색(crystal violet staining) 방법 및 젖산탈수소효소(Lactate dehydrogenase; LDH) 분석을 사용하여 UVB에 노출되어 세포 사멸이 유도된 NHEKs에서 세포 생존력(cell viability) 및 세포 독성을 평가하였다.Cell viability and cytotoxicity were evaluated in NHEKs exposed to UVB to induce apoptosis using a crystal violet staining method and a lactate dehydrogenase (LDH) assay.

크리스탈 바이올렛 염색 분석을 수행하기 위하여, 먼저, NHEKs(1×10⁵ 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 플레이팅하고 40mJ/cm² UVB로 조사한 다음, 24시간 후, 세포를 1% 크리스탈 바이올렛(cat. C0775; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 염색하였다. 24시간 건조 후, 크리스탈 바이올렛 염색된 세포를 1% SDS 용액에 용해시키고 96-웰 플레이트로 분할한 다음 분광계 판독기를 사용하여 550nm에서 흡광도를 평가하였다.To perform the crystal violet staining assay, first, NHEKs (1×10 ⁵ cells/well) were plated in a 24-well plate and irradiated with 40 mJ/cm ² UVB, and 24 hours later, the cells were plated with 1% crystal violet ( cat. C0775; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). After drying for 24 hours, crystal violet-stained cells were lysed in 1% SDS solution, aliquoted into 96-well plates, and absorbance was evaluated at 550 nm using a spectrometer reader.

또한, 젖산탈수소효소(LDH) 분석을 수행하기 위하여, NHEKs(1×10⁵ 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 플레이팅하고 40mJ/cm² UVB로 조사한 다음, 표시된 시간(0, 1, 2, 4, 8 및 12시간)까지 배양하였다. 세포 형태는 현미경(Nikon, Japan)으로 평가하였고, LDH 세포 독성 검출 키트(Takara Bio, Japan)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 상층액에서 배지 내 방출된 LDH를 측정하여, 세포 독성을 평가하였다. 대조군의 LDH 방출량을 1로 하여 UVB 처리군의 LDH 수준을 정량화하였다.In addition, to perform lactate dehydrogenase (LDH) assay, NHEKs (1×10 ⁵ cells/well) were plated in a 24-well plate and irradiated with 40 mJ/cm ² UVB, followed by the indicated time (0, 1, 2). , 4, 8 and 12 hours). Cell morphology was evaluated by microscopy (Nikon, Japan), and LDH released from the supernatant into the medium was measured using an LDH cytotoxicity detection kit (Takara Bio, Japan) according to the manufacturer's protocol to evaluate cytotoxicity. The LDH level of the UVB-treated group was quantified by setting the LDH release amount of the control group to 1.

UVB 조사에 따른 NHEKs의 세포 생존력을 평가하기 위해 크리스탈 바이올렛 염색을 이용하여 세포를 분석한 결과, UVB 비조사된 세포와 비교하여 UVB에 노출 된 세포는 시간에 따른 세포 생존력의 감소를 나타냈다(도 2A, B 및 C). As a result of analyzing the cells using crystal violet staining to evaluate the cell viability of NHEKs following UVB irradiation, cells exposed to UVB showed a decrease in cell viability over time compared to cells not irradiated with UVB (Fig. 2A). , B and C).

또한, 배지 내 LDH 방출량을 측정한 결과, LDH 방출의 시간 의존적 증가가 확인되었고, 특히 UVB 조사 후 4시간부터 유의하게 증가하였다(도 2D).In addition, as a result of measuring the amount of LDH release in the medium, a time-dependent increase in LDH release was confirmed, and in particular, it increased significantly from 4 hours after UVB irradiation ( FIG. 2D ).

또한, UVB 조사가 표피에서 세포 사멸을 유도하는지 여부를 알아보기 위해, 항-카스파제-3(anti-caspase-3; cat. No. 9662; Cell Signaling Technology, Inc.)을 면역 블롯팅을 위한 항체로 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하여, caspase-3(cas-3)의 수준을 평가하였다.In addition, to determine whether UVB irradiation induces apoptosis in the epidermis, anti-caspase-3 (anti-caspase-3; cat. No. 9662; Cell Signaling Technology, Inc.) was used for immunoblotting. Western blot analysis was performed using the antibody to evaluate the level of caspase-3 (cas-3).

그 결과, UVB 조사 후 4시간부터 cas-3의 전체 형태(35kDa)가 감소하면서 절단된 cas-3(17 및 19kDa)가 나타났다(도 2E).As a result, cleaved cas-3 (17 and 19 kDa) appeared while the overall form (35 kDa) of cas-3 decreased from 4 hours after UVB irradiation (FIG. 2E).

따라서, UVB 조사에 의해 NHEKs의 세포 사멸이 유도됨을 확인하였다.Therefore, it was confirmed that apoptosis of NHEKs was induced by UVB irradiation.

실시예 4. NHEKs에서 바이칼레인의 PP2B 감소 억제를 통한 UVB 유도 세포 사멸로부터의 보호 효과 확인Example 4. Confirmation of protective effect from UVB-induced apoptosis through inhibition of PP2B reduction of baikalein in NHEKs

UVB 조사된 NHEKs에서 pp2b 활성에 대한 바이칼레인(baicalein)의 효과를 평가하였다. NHEKs에 100mJ/cm² UVB 조사 후 8시간 동안 바이칼레인(100μM)을 처리하거나 처리하지 않았고, 상기 실시예 1 내지 3과 동일한 방법으로 Ca²⁺ 농도, pp2b 활성, p-Bcl-10 수준, 세포 형태, 세포 생존율, LDH 방출량 및 cas-3 수준을 분석하였다.The effect of baicalein on pp2b activity in UVB-irradiated NHEKs was evaluated. NHEKs were treated with or not treated with baikalein (100 μM) for 8 hours after 100mJ/cm ² UVB irradiation, and in the same manner as in Examples 1 to 3, Ca ²⁺ concentration, pp2b activity, p-Bcl-10 level, cells Morphology, cell viability, LDH release and cas-3 levels were analyzed.

그 결과, 바이칼레인 처리시 세포 내 Ca²⁺ 농도의 감소를 방지할 수 있음을 확인하였다(도 3A 및 B). 또한, 바이칼레인(100 μM)의 투여가 UVB로 인한 pp2b 활성 감소를 효과적으로 억제하여, pp2b 활성을 증가시켰고(도 3C), 바이칼레인 처리가 UVB 조사된 NHEKs에서 p-Bcl-10의 상승을 차단함을 확인하였다(도 3D 및 E).As a result, it was confirmed that the decrease in intracellular Ca ²⁺ concentration during baicalein treatment can be prevented ( FIGS. 3A and 3B ). In addition, administration of baikalein (100 μM) effectively inhibited the decrease in pp2b activity due to UVB, increasing pp2b activity (Fig. 3C), and baicalin treatment blocked the rise of p-Bcl-10 in UVB-irradiated NHEKs It was confirmed that (Figs. 3D and E).

바이칼레인이 UVB로 유도된 세포 사멸에 미치는 영향을 조사하기 위해 100mJ/cm² UVB 조사 후 NHEKs를 바이칼레인(0, 25, 50 및 100 μM)으로 처리하고 UVB 조사 후 12시간에 세포 생존력을 측정하였다. To investigate the effect of baikalein on UVB-induced cell death, NHEKs were treated with baikalein (0, 25, 50 and 100 μM) after 100 mJ/cm ² UVB irradiation, and cell viability was measured 12 hours after UVB irradiation. did.

도 4에 나타난 바와 같이, 바이칼레인의 처리는 효과적으로 세포 생존력을 높이고 LDH 방출을 차단하였다(도 4A-D). 또한, 바이칼레인은 cas-3의 분열을 감소시키고 cas-3의 전체 형태의 감소를 억제하였다(도 4E).As shown in FIG. 4 , treatment with baikalein effectively increased cell viability and blocked LDH release ( FIGS. 4A-D ). In addition, baicalin reduced the cleavage of cas-3 and inhibited the reduction of the overall form of cas-3 (Fig. 4E).

결과적으로, 바이칼레인이 PP2B 활성 감소 억제, 즉, PP2B 활성화를 통해 UVB로 유도된 세포 사멸로부터 세포를 보호할 수 있음을 확인하였다.As a result, it was confirmed that baicalin can protect cells from UVB-induced cell death through inhibition of PP2B activity reduction, that is, PP2B activation.

실시예 5. NHEKs에서 PP2B 억제제 처리에 따른 바이칼레인의 UVB로 유도된 세포 사멸 보호 효과에 대한 억제 효과 확인Example 5. Confirmation of inhibitory effect on UVB-induced apoptosis protective effect of baikalein according to PP2B inhibitor treatment in NHEKs

pp2b 억제제(FK506 및 Cys A)가 바이칼레인의 UVB에 의한 세포 사멸에 대한 효과에 미치는 영향을 평가하였다. 상기 실시예 1 내지 3과 동일한 방법으로 세포 형태, 세포 생존율, LDH 방출량, p-Bcl-10 수준 및 cas-3 수준을 분석하였다.The effect of pp2b inhibitors (FK506 and Cys A) on the effect of baicalin on UVB-induced cell death was evaluated. Cell morphology, cell viability, LDH release, p-Bcl-10 level and cas-3 level were analyzed in the same manner as in Examples 1 to 3.

pp2b 억제제 처리 없이 바이칼레인만 처리된 NHEKs와 비교하여 FK506 또는 Cys A의 전처리는 세포 생존력을 감소 시켰으며(도 5A-C), UVB 조사된 NHEKs에서 바이칼레인만 처리한 군보다 pp2b 억제제 전처리한 군에서 LDH 방출이 증가되었다(도 5D). 또한, FK506 또는 Cys A의 투여가 바이칼레인 처리에 의해 감소되는 cas-3의 절단을 다시 증가시킴을 확인하였다(도 5E).In comparison with NHEKs treated with only baicalin without pp2b inhibitor treatment, FK506 or Cys A pretreatment reduced cell viability (Fig. 5A-C), and the pp2b inhibitor pretreatment group compared to the group treated with only baicalin in UVB-irradiated NHEKs. LDH release was increased (Fig. 5D). In addition, it was confirmed that the administration of FK506 or Cys A again increased the cleavage of cas-3 reduced by baicalin treatment (FIG. 5E).

결과적으로, pp2b 억제제(FK506 및 Cys A)로 PP2B 활성화를 억제할 경우 UVB로 유도된 세포 사멸에 대한 바이칼레인의 보호 효과의 억제를 유발했음을 확인하였다.As a result, it was confirmed that inhibition of PP2B activation with pp2b inhibitors (FK506 and Cys A) induced inhibition of the protective effect of baicalin against UVB-induced cell death.

실시예 6.Example 6. 마우스 모델에서 바이칼레인의 UVB로 인한 피부 손상 예방 및 개선 효과 확인Confirmation of UVB-induced skin damage prevention and improvement effect of baikalein in mouse model

UVB로 인한 피부 손상에 대한 바이칼레인의 보호 효과를 평가하기 위하여, 면도된 마우스 등쪽 피부를 바이칼레인 처리 유무에 관계없이 400mJ/cm² UVB에 노출 시켰다(도 6).In order to evaluate the protective effect of baikalein against UVB-induced skin damage, the shaved mouse dorsal skin was exposed to 400 mJ/cm ² UVB with or without baicalein treatment (FIG. 6).

먼저, UVB로 조사한 피부에 대해 피부 손상 수준을 분석하기 위해 5명의 연구원이 점수가 0에서 8까지 범위인 수정된 Draize 점수 시스템을 사용하여 홍반과 부종(붓기)의 정도를 평가하였다. 홍반과 부종의 정도는 홍반과 부종에 대한 개별 지수 값(index values)을 합산하여 계산된 단일 숫자로 표현하였다. 상기 지수 값은 다음과 같다: 홍반; 0=홍반 없음, 1=매우 경미한 홍반, 2=뚜렷한 홍반, 3=중등도에서 중증 홍반, 4=중증 홍반; 부종; 0=부종 없음, 1=매우 경미한 부종, 2=경미한 부종, 3=중등도 부종, 4=중증 부종.First, to analyze the level of skin damage on UVB-irradiated skin, five researchers assessed the degree of erythema and edema (swelling) using a modified Draize scoring system, with scores ranging from 0 to 8. The degree of erythema and edema was expressed as a single number calculated by summing the individual index values for erythema and edema. The index values were as follows: erythema; 0 = no erythema, 1 = very mild erythema, 2 = distinct erythema, 3 = moderate to severe erythema, 4 = severe erythema; edema; 0 = no edema, 1 = very mild edema, 2 = mild edema, 3 = moderate edema, 4 = severe edema.

또한, UVB 조사후 피부의 형태학적 변화를 확인하기 위하여, UVB에 노출된 피부 병변을 수집하고, 실온(25℃)에서 밤새 4% 파라포름알데히드에 고정하였다. 고정 된 조직은 조직 기계에서 자동으로 12시간 동안 정제된 알코올과 자일렌으로 처리되었다. 조직 처리 후, 샘플을 파라핀에 포매하고 5μm 섹션으로 절단했다. 파라핀 섹션은 60℃에서 30분동안 탈랍시키고, 자일렌에서 5분 동안 3회 세척하고 감소된 에탄올 비율만큼 재수화하였다. 조직 형태를 결정하기 위해 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin; H&E)으로 각 샘플 섹션을 염색하고, 단면을 광학 현미경(배율, ×100)으로 촬영하여 시각화 하였으며, 상피 두께는 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 측정하였다. In addition, in order to confirm the morphological change of the skin after UVB irradiation, skin lesions exposed to UVB were collected and fixed in 4% paraformaldehyde overnight at room temperature (25° C.). The fixed tissue was automatically treated with purified alcohol and xylene for 12 hours in a tissue machine. After tissue processing, samples were embedded in paraffin and cut into 5 μm sections. Paraffin sections were dewaxed at 60° C. for 30 min, washed three times in xylene for 5 min and rehydrated with reduced ethanol ratio. To determine the tissue morphology, each sample section was stained with hematoxylin and eosin (H&E), and the cross-sections were visualized by photographing with an optical microscope (magnification, ×100), and the epithelial thickness was measured using ImageJ software (NIH). was used for measurement.

UVB 조사는 피부 홍반 및 부종을 유발하였으나, 이러한 피부 증상은 바이칼레인 처리에 의해 억제되었다(도 6A 및 B). 조직학적 분석을 위해 등쪽 피부 샘플을 헤마톡실린-에오신(H&E)으로 염색한 결과, UVB 조사 피부의 표피는 조사되지 않은 피부보다 더 두껍게 나타난 반면, 이러한 변화는 바이칼레인 처리에 의해 개선(억제)되었다(그림 6C 및 D). UVB irradiation induced skin erythema and edema, but these skin symptoms were suppressed by baicalein treatment (FIGS. 6A and B). As a result of staining dorsal skin samples with hematoxylin-eosin (H&E) for histological analysis, the epidermis of UVB-irradiated skin appeared thicker than that of un-irradiated skin, whereas these changes were improved (inhibited) by baicalein treatment. (Figure 6C and D).

세포 사멸을 평가하기 위해 UVB 조사 피부를 TUNEL 염색 및 cas-3에 대한 웨스턴 블롯팅을 이용하여 분석하였다. To assess cell death, UVB-irradiated skin was analyzed using TUNEL staining and Western blotting for cas-3.

세포 사멸 세포 분석을 위해, Fluorometric Tunel 시스템 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)을 사용하여 피부 조직을 분석하였다. 파라핀이 내장된 조직을 5μm 섹션으로 절단한 다음, 표준 원고에 따라 TUNEL 반응성 화합물로 염색하였다. 섹션은 모든 핵을 시각화하기 위해 100μg/ml RNase가 포함된 50μg/ml 요오드화 프로피듐(propidium iodide; PI; cat. No: SC-3541, Santa Cruz Biotech, CA, USA) 용액으로 대조 염색되었다. Guava EasyCyte HT 시스템(Millipore, Bedford, MA, USA)을 사용하여 형광 강도를 검출하였다. 형광 강도의 정량화는 Image J를 사용하여 TUNEL-양성 세포를 계수하였다. 또한 피부 조직내 cas-3의 발현 변화를 웨스턴 블롯 분석을 통해 평가하였으며, 이때, GAPDH를 로딩 대조군으로 사용하였다.For apoptotic cell analysis, skin tissues were analyzed using a Fluorometric Tunel system (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Paraffin-embedded tissues were cut into 5 μm sections and stained with TUNEL-reactive compounds according to standard manuscripts. Sections were counterstained with a 50 μg/ml propidium iodide (PI; cat. No: SC-3541, Santa Cruz Biotech, CA, USA) solution containing 100 μg/ml RNase to visualize all nuclei. Fluorescence intensity was detected using a Guava EasyCyte HT system (Millipore, Bedford, MA, USA). For quantification of fluorescence intensity, TUNEL-positive cells were counted using Image J. In addition, the expression change of cas-3 in the skin tissue was evaluated through Western blot analysis, and at this time, GAPDH was used as a loading control.

그 결과, UVB 조사로 TUNEL 양성 세포의 수가 증가한 반면, 바이칼레인 투여시 세포 사멸되는 세포의 수가 감소되었다(도 6E 및 F). 절단된 cas-3는 UVB 조사 피부 샘플에서 유의하게 상승했지만 바이칼레인 처리에 의해 감소하였다(도 6G).As a result, the number of TUNEL-positive cells increased by UVB irradiation, while the number of cells that died upon administration of baikalein decreased ( FIGS. 6E and F ). Cleaved cas-3 was significantly elevated in UVB-irradiated skin samples but decreased by baicalin treatment (Fig. 6G).

결과적으로, 바이칼레인 투여는 마우스 모델에서 UVB로 인한 피부 손상에 대하여 보호 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the administration of baikalein can exhibit a protective effect against UVB-induced skin damage in a mouse model.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, with respect to the present invention, the preferred embodiments have been looked at. Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention may be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments are to be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is indicated in the claims rather than in the foregoing description, and all differences within the scope equivalent thereto should be construed as being included in the present invention.

Claims

A cosmetic composition for preventing or improving skin damage caused by ultraviolet rays, comprising baicalein or a cosmetically acceptable salt thereof.

According to claim 1,
The UV light is characterized in that the UVB, cosmetic composition.

According to claim 1,
The cosmetic composition is characterized in that it increases the decrease in protein phosphatase 2B (protein phosphatase 2B) activity by ultraviolet rays, the cosmetic composition.

According to claim 1,
The cosmetic composition is characterized in that it increases the decrease in the concentration of calcium ions in tissues or cells by ultraviolet rays, the cosmetic composition.

According to claim 1,
The cosmetic composition is characterized in that it suppresses the increase in the thickness of the skin epithelial tissue due to ultraviolet rays, the cosmetic composition.

According to claim 1,
The cosmetic composition is characterized in that it inhibits the apoptosis of skin keratinocytes by ultraviolet rays, the cosmetic composition.

According to claim 1,
The skin damage caused by ultraviolet rays is at least one selected from the group consisting of sunburn, erythema, edema, pigmentation, skin inflammation, skin keratinization, photoallergy, phototoxicity, photosensitization, and photoaging occurring in the epidermis or dermis by ultraviolet rays. A cosmetic composition, characterized in that.

A food composition for preventing or improving skin damage caused by UV rays, comprising baicalein or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

A pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases caused by ultraviolet light, comprising baicalein or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

10. The method of claim 9,
The skin disease caused by ultraviolet rays is at least one selected from the group consisting of sunburn, erythema, edema, pigmentation, skin inflammation, keratinization, photoallergy, phototoxicity, photosensitization, and photoaging, a pharmaceutical composition.