KR20220135959A - 인간 유도 만능 줄기세포로부터 조골세포 펠릿을 제조하는 방법 및 상기 조골세포 펠릿을 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 유도 만능 줄기세포로부터 수득된 배상체를 부착배양하여 유도되는 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양시킴으로써 조골세포 펠릿을 제조하는 방법, 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 조골세포 펠릿을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 인간 유도 만능 줄기세포(Human induced pluripotent stem cells, hiPSC)를 배양하여 배상체를 형성 및 수득하는 단계; 상기 수득된 배상체를 돌기세포(outgrowth cell)로 유도하는 단계; 상기 유도된 돌기세포를 수확하는 단계; 상기 수확한 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양하여 조골세포 펠릿을 형성하는 단계; 및 상기 형성된 조골세포 펠릿을 수확하는 단계;를 포함하는, 조골세포 펠릿 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 조골세포 펠릿을 포함하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 면역학적 거부 및 질병 전염을 나타낼 수 있는 동종 골이식 및 환자에게 심한 통증을 유발하는 자가 골이식과 달리, 면역 문제를 유발하지 않으며, 높은 안정성을 가지면서도 뛰어난 증식 능력을 가져 골 조직을 회복 및 재생시킬 수 있으며, 이에 따라 관절염, 골다공증, 인대 및 건 손상, 골 결손, 습관성 탈구, 추간판 탈출증 등을 포함하는 근골격계 질환에 대한 치료제 및 골 세포 공급원으로서 사용될 수 있다.

Description

인간 유도 만능 줄기세포로부터 조골세포 펠릿을 제조하는 방법 및 상기 조골세포 펠릿을 포함하는 약학 조성물{METHOD OF PRODUCING OSTEOBLAST PELLETS FROM HUMAN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE OSTEOBLAST PELLETS}
본 발명은 인간 유도 만능 줄기세포로부터 조골세포 펠릿을 제조하는 방법, 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 조골세포 펠릿을 포함하는 근골격계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
골 질환 또는 골 손상은 인간의 많은 부분에 영향을 미치는 심각한 건강 및 정신 문제를 나타낸다. 뼈는 비교적 뛰어난 재생 능력을 나타내지만, 질병, 노화 또는 부상으로 인한 골 손상은 종종 상당한 골 질환을 유발하고 골 조직의 자연 치유를 방지한다. 또한, 큰 골격의 골 손상은 여전히 관련 연구자들에게 있어 큰 과제로 남아있다.
이러한 골 질환 및 골 손상을 치료하기 위한 방법으로서, 자가 골이식(Bone autografts)은 골 치환술에서 가장 좋은 임상 결과를 보여 여전히 골 치료의 표준으로 사용되고 있지만, 침습적 시술 부위에서 조직을 제거하는 것은 환자에게 심한 통증을 유발할 수 있고, 기증자 부위의 이환율, 품질 저하, 가용성 제한 등 몇 가지 중요한 단점을 가지고 있다. 때문에 이러한 자가 골이식의 사용은 점점 좁아지고 있으며, 다른 효율적인 동종 골이식으로 대체되고 있다. 그러나, 동종 골이식의 경우 기증자로부터의 면역학적 거부 및 질병 전염의 위험이 발생할 수 있다.
골 조직에 결함이 있는 경우, 다양한 재료, 예를 들어, 금속, 세라믹, 폴리머, 외인성 골 조직 등을 이용하여 골 조직을 치료하고자 하였으나, 아직까지는 골 조직 재생에 이상적인 재료로 입증된 것은 보고된 바가 없다.
이러한 골 질환을 치료하기 위한 방법으로, 세포를 대체할 수 있는 방안 또한 연구되고 있다. 상기 세포 대체 요법은, 손상되거나 죽어가는 세포를 건강한 골 세포로 대체하는 것을 목표로 하고 있으나, 성숙한 조골세포는 제한된 가용성, 탈분화 및 제한된 증식 능력과 같은 몇 가지 단점을 가진다.
최근, 줄기세포 연구는 골 재생을 위한 새로운 플랫폼을 제공한 바 있다. 그 중, 골수-유래 중간엽 줄기세포(Bone marrow-derived mesenchymal stem cell, BMSC)는 지방, 연골 및 뼈로 분화할 수 있는 다능성으로 인해, 면역 조절 효과뿐만 아니라 상당히 높은 회복 능력을 나타내어 골격 재생에 널리 사용되고 있다. 또한, 상기 골수-유래 중간엽 줄기세포는 파라크린 효과(paracrine effect)를 통한 항염증 특성을 가져 치료 및 재생에 널리 사용되었다.
그러나, 상기 중간엽 줄기세포의 사용은 다양한 기증자로부터 분리되어야 하므로 이종(heterogenous)이라는 문제를 가지며, 고령 기증자 및 체외 배양 시 증식 능력의 감소로 인해 제한된다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 자가재생능력이 부족하여 증식이 감소하고 본래의 특성을 상실하는 문제점을 가져 대량 생산이 어렵다. 이러한 이유로, 성체 줄기세포는 배아 줄기세포와 같은 다능성 줄기세포로 대체되었다. 상기 배아 줄기세포는 다능성으로 인한 뛰어난 자가재생 및 분화능을 가지고 있다. 상기 자가재생능력을 통해, 다른 자가 갱신 능력을 통해 다른 더 긴 계대로도 증식될 수 있다. 그러나, 상기 배아 줄기세포를 수확하는 방법과 관련된 윤리적 문제는 이러한 배아 줄기세포의 사용을 제한하며, 여전히 논쟁의 여지를 가지고 있다.
한편, 인간 유도 만능 줄기세포(Human induced pluripotent stem cells, hiPSC)는 2006 년 Yamanaka에 의해 개발되었다. 상기 인간 유도 만능 줄기세포는 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 포함한 전사인자를 전달하는 방법에 의해 개발된 것으로, 상기 전사인자들의 전달은 성체 체세포에서 다능성을 유도하고, 이를 줄기세포로 분화시킨다. 상기 유도 만능 줄기세포는 윤리적 문제를 피하면서 상기 배아 줄기세포와 유사한 특성을 가지므로, 시험관 내 및 생체 내 사용을 위한 조직 재생 연구에 가장 이상적인 세포 공급원이 되었다. 또한, 상기 유도 만능 줄기세포는 이론적으로 모든 자가 체세포에서 생성될 수 있기 때문에 희귀 질환을 모델링할 수 있다. 상기 유도 만능 줄기세포에서 분화된 특정 세포 또한, 세포 치료를 위한 새로운 세포 공급원으로 제안될 수 있다. 따라서, 시험관 내 골 조직 생성을 포함하는 다양한 조직으로의 분화는 전세계 연구자들 사이에서 끊임없이 시도되고 있다.
초기 발달 중, 골격 형성의 시작은 중간엽 세포가 미래의 뼈 부위로 이동하고 응축되는 것으로 시작된다. 응축된 세포 덩어리 내에서 중간엽 세포는 1) 연골세포로 분화하여 나중에 연골 내 골화에 의해 뼈로 분화하거나, 2) 조골세포로 직접 뼈를 형성한다. 상기 연골을 광물화 된 뼈로 대체하는 것은 복잡한 과정이다. 연골 내의 연골세포는 비대 분화를 거치며, 상기 세포는 흡수되고 조골 전구세포가 조골세포로 대체되어 분화한다. 초기 발달 후, 뼈는 1) 골 형성, 2) 모델링, 3) 주로 조골세포에 의해 제어되는 리모델링의 세 가지 과정으로 구성된다. 상기 조골세포는 골세포 외 기질(ECM)을 합성하는 반면, 파골세포는 물리적 환경을 형성하기 위해 이를 조각낸다. 상기 두 세포의 협력은 골세포 외 기질을 신체 성장 및 변화하는 환경의 요구에 맞게 조정한다. 상기 조골세포는 새로 합성된 골 인터페이스에서 발견되는 입방세포이며, 평생 동안 골 내에서 발견될 수 있다. 상기 조골세포의 활성은 배아 골격 발달 중에 가장 높지만, 조골세포는 결손된 부위에서 재생이 필요하거나 골세포 외 기질이 고갈될 때만 활성화된다. 주요 골세포 외 기질 단백질에는 Ⅰ 형 콜라겐, 오스테오칼신, 및 알칼리성 포스파타제가 포함된다. 상기 조골세포는 광물화된 골세포 외 기질로 스스로를 포획하고, 골 회전율을 조절하는 골세포로 분화한다. 골 표면에 남아있는 조골세포는 비활성 골 내벽세포가 되거나 세포자살을 겪게된다. 성숙한 조골세포 수가 감소하면, 새로운 조골세포가 중간엽 전구세포로부터 분화된다. 그러나, 필요한 세포원은 종종 제한된다. 따라서, 유도 만능 줄기세포를 사용한 골 형성은 새로운 조골세포 또는 골재료의 무한한 공급원이 될 수 있다.
종래 연구에서는 상기 인간 유도 만능 줄기세포가 조골세포로 분화되고, 상기 배아 줄기세포 용으로 개발된 골 형성 계통에 대한 프로토콜이 인간 유도 만능 줄기세포에서도 유사하게 작동한다고 보고된 바 있다. 다만, 이 경우 2 차원 배양에 국한되므로 시간이 소모되고 생존율 및 골 분화성이 떨어지는 단점이 있으며, 지지체(scaffold)를 필요로 한다는 단점이 있다.
본 발명의 목적은, 인간 유도 만능 줄기세포로부터 수득된 배상체를 부착배양하여 유도되는 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양시킴으로써 근골격계 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있는 조골세포 펠릿의 제조 방법, 및 상기 조골세포 펠릿을 포함하는 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 상기 및 다른 목적과 이점은 바람직한 실시예를 설명한 하기의 설명으로부터 분명해질 것이다.
본 발명에 따른 목적은, 인간 유도 만능 줄기세포(Human induced pluripotent stem cells, hiPSC)를 배양하여 배상체를 형성 및 수득하는 단계; 상기 수득된 배상체를 돌기세포(outgrowth cell)로 유도하는 단계; 상기 유도된 돌기세포를 수확하는 단계; 상기 수확한 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양하여 조골세포 펠릿을 형성하는 단계; 및 상기 형성된 조골세포 펠릿을 수확하는 단계;를 포함하는, 조골세포 펠릿 제조 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 목적은, 상기 조골세포 펠릿 제조 방법에 의해 제조된 조골세포 펠릿을 포함하는, 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 의해 달성될 수 있다.
구체적으로, 상기 인간 유도 만능 줄기세포를 배양하는 것은 부착배양인 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 상기 상기 인간 유도 만능 줄기세포를 배양하는 것은 비트로넥틴 코팅 플레이트에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 상기 수득된 배상체를 돌기세포로 유도하는 것은 젤라틴 코팅 플레이트에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 상기 수확한 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양하는 것은, 수확한 돌기세포를 원심분리하여 펠릿 형태로 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게, 상기 원심분리는 500 내지 1,500 rpm의 속도에서 수행될 수 있다.
바람직하게, 상기 원심분리는 약 1 분 내지 약 30 분 동안 수행될 수 있다.
바람직하게, 상기 수확한 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양하는 것은, 수확한 돌기세포를 500 내지 1,500 rpm의 속도로 약 1 분 내지 약 30 분 동안 원심분리하여 펠릿 형태로 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게, 상기 수확한 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양하는 것은, 2 일 내지 3 일 마다 배지를 교환하면서 총 3 일 내지 30 일간 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 상기 조골세포 분화 배지는 DMEM-LG, 아스코르빈산 포스페이트, 베타-글리세로포스페이트, 덱사메타손, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 근골격계 질환은 퇴행성 관절염(Osteoarthritis), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis), 골다공증(osteoporosis), 척주관협착증(spinal stenosis), 윤활막염(synovitis), 골연화증(osteomalacia), 골수염(osteomyelitis), 골괴사(osteonecrosis), 신경성 관절병증(neurogenic arthropathy), 신장성 골형성장애(renal osteodystrophy), 반월상 연골 손상(Meniscus Injury), 유착성 관절낭염(Adhesive capsulitis), 건병증(Tendinopathy), 헤바딘 결절(Heberden node), 부샤르 결절(Bouchard nodes), 추간판 변성(disk degeneration), 추간판 탈출증(Herniation of intervertebral disk), 통풍성 관절염(Gouty arthritis), 인대 손상(ligament injury), 건 손상(tendon, injury), 오십견(Frozen Shoulder), 회전근개 파열(Rotator Cuff Tear), 습관성 탈구(habitual dislocation), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 면역학적 거부 및 질병 전염을 나타낼 수 있는 동종 골이식 및 환자에게 심한 통증을 유발하는 자가 골이식과 달리, 면역 문제를 유발하지 않으며, 높은 안정성을 가지면서도 뛰어난 증식 능력을 가져 골 조직을 회복 및 재생시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 제조 방법은 인간 유도 만능줄기세포를 이용하므로 윤리적 문제를 발생시키지 않을 수 있으며, 향상된 면역 조절 효과 및 회복 능력을 나타내어 관절염, 골다공증, 인대 및 건 손상, 골 결손, 습관성 탈구, 추간판 탈출증 등을 포함하는 근골격계 질환에 대한 치료제 및 골 세포 공급원으로서 사용될 수 있다.
다만, 본 발명의 효과들은 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 조골세포 펠릿 제조 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2의 (a) 내지 (d)는, 본 발명의 일 실시예에 따른 조골세포 펠릿의 분화 7 일, 14 일, 및 21 일 째의 조골세포 펠릿의 이미지로서, 각각 생성된 펠릿의 명시야 이미지(a), H&E 염색 이미지(b), 폰 코사 염색 이미지(c), 및 알리자린 레드 염색 이미지(d)이다.
도 3의 (a) 내지 (c)는, 본 발명의 일 실시예에 따른 조골세포 펠릿의 면역 형광 염색 이미지로서, 각각 분화 7 일(a), 14 일(b), 및 21 일째(c) 펠릿에서 오스테오칼신 및 Ⅰ 형 콜라겐의 발현을 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 조골세포 펠릿의 분화 7 일 및 30 일째의 생 세포 및 죽은 세포 염색 이미지이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 조골세포 펠릿의 분화 7, 14 및 21 일째의 압축된 펠릿을 나타낸 이미지이다.
이하, 본 발명의 실시예와 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.
또한, 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 상충되는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서의 기재가 우선할 것이다.
도면에서 제안된 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다. 그리고, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에서 기술한 "부"란, 특정 기능을 수행하는 하나의 단위 또는 블록을 의미한다.
각 단계들에 있어 식별부호(제1, 제2, 등)는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.
본 발명에서, 용어 '만능 줄기세포(pluripotent stem cell, PSC)'는 만능성을 가진 줄기세포를 의미한다. 상기 만능 줄기세포는 당업계에 공지된 다양한 줄기세포가 포함될 수 있으며, 예를 들어, 배아 줄기세포 또는 역분화 만능 줄기세포가 포함될 수 있다.
본 발명에서, 용어 '인간 유래 만능 줄기세포'는 생체를 구성하는 3 가지 배엽(germ layer), 즉 내배엽(endoderm), 중배엽(mesoderm), 외배엽(ectoderm) 모두로 분화될 수 있어 인체의 모든 세포나 장기 조직으로 분화할 수 있는 다기능성을 지닌 줄기세포를 의미하며, 인간 배아 줄기세포가 가지고 있는 많은 윤리적인 문제점을 해결하기 위해 제조되었다. 인간 유도 만능 줄기세포는 미분화성과 정상핵형을 유지한 상태로 자기재생 능력을 갖고 있기 때문에 세포치료제의 대량생산을 위한 세포 근원지로서 적합하다고 판단된다.
본 발명에서, 용어 '배지'는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 배양 또는 분화를 위한 혼합물을 말한다. 당업계에는 다양한 배지가 시판되고 있으며, 인위적으로 제조하여 사용할 수도 있다. 시판 중인 배지로는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMPM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), AmnioMax, AminoMaxⅡcomplete Medium(Gibco, Newyork, USA), Chang's Medium MesemCult-XF Medium(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) 등이 있으며, 인위적으로 제조할 수 있는 배지와 더불어 본 발명에서 사용되는 배지에 포함되는 구성성분들을 포함하는 배지를 기본 배지로 사용할 수 있다.
본 발명에서, 용어 '배아 줄기세포'는 수정 후 발생 초기인 배반포기(blastocyst)의 내부세포덩어리(inner cell mass)에서 분리하여 배양한 세포로 만능성(pluripotency)을 지니는 세포를 의미한다.
본 발명에서, 용어 '분화'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능 이 특수화되는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 의미한다. 일반적으로, 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들어, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이, 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부분 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.
본 발명에서, 용어 '배상체(embryonic body, EB)'는 상기 만능 줄기세포의 분화를 유발시켜 생성된 응집체이다. 상기배아체는 내배엽, 중간엽, 외배엽의 개체 형성시 필요한 모든 세포로의 분화가 가능함이 보고된 것으로, 상기 만능 줄기세포의 전능성을 나타내는 체외에서의 증명 방법 중의 하나이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 이러한 구현예 및 실시예와 도면은 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시 형태는, 인간 유도 만능 줄기세포(Human induced pluripotent stem cells, hiPSC)를 배양하여 배상체를 형성 및 수득하는 단계; 상기 수득된 배상체를 돌기세포(outgrowth cell)로 유도하는 단계; 상기 유도된 돌기세포를 수확하는 단계; 상기 수확한 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양하여 조골세포 펠릿을 형성하는 단계; 및 상기 형성된 조골세포 펠릿을 수확하는 단계;를 포함하는, 조골세포 펠릿 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 조골세포 펠릿 제조 방법에 의해 제조된 조골세포 펠릿을 포함하는, 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 면역학적 거부 및 질병 전염을 나타낼 수 있는 동종 골이식 및 환자에게 심한 통증을 유발하는 자가 골이식과 달리, 면역 문제를 유발하지 않으며, 높은 안정성을 가지면서도 뛰어난 증식 능력을 가져 골 조직을 회복 및 재생시킬 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 제조되는 조골세포 펠릿 및 상기 조골세포 펠릿을 포함하는 약학 조성물은 인간 유도 만능줄기세포를 이용하므로 윤리적 문제를 발생시키지 않을 수 있으며, 향상된 면역 조절 효과 및 회복 능력을 나타내어 관절염, 골다공증, 인대 및 건 손상, 골 결손, 습관성 탈구, 추간판 탈출증 등을 포함하는 근골격계 질환에 대해 뛰어난 골 재생 능력을 발휘하여 골 손상에 대한 치료 및 개선 효과를 나타낼 수 있으며, 다른 약리성분과 함께 투여되어 보조제로서 적용될 수 있다.
이하, 도 1을 참조하여 본 발명에 따른 조골세포 펠릿 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의한 조골세포 펠릿을 포함하는 약학 조성물에 대해 상세히 설명한다.
먼저, 인간 유도 만능 줄기세포(Human induced pluripotent stem cells, hiPSC)를 배양하여 배상체를 형성 및 수득한다.
일 실시예에 있어서, 상기 인간 유도 만능 줄기세포의 배양은 부착배양일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 인간 유도 만능 줄기세포의 배양은 비트로넥틴 코팅 플레이트에서 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 인간 유도 만능 줄기세포의 배양은 비트로넥틴 코팅 플레이트에서 부착배양 방법으로 배양되어 배상체가 형성 및 수득되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 인간 유도 만능 줄기세포의 배양 시, 배지는 1 일 간격으로 매일 교체되는 것일 수 있다.
다음으로, 상기 수득된 배상체를 젤라틴 코팅 플레이트에서 돌기세포로 유도하고, 유도된 돌기세포를 수확한다.
일 실시예에 있어서, 상기 수확한 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양하여 조골세포 펠릿을 형성하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 수확한 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양하는 것은, 수확한 돌기세포를 원심분리하여 펠릿 형태로 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 원심분리는 약 500 내지 약 1,500 rpm의 속도에서 수행될 수 있다. 만약, 상기 원심분리가 약 500 rpm 미만의 속도에서 수행될 경우 펠렛이 충분히 형성되지 않을 수 있고, 약 1,500 rpm을 초과하는 속도에서 수행될 경우 손상이 발생할 수 있으므로, 상기 원심분리는 약 500 내지 약 1,500 rpm의 속도 범위에서 수행되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게, 상기 원심분리는 약 500 내지 약 1,000 rpm의 속도 범위에서 수행되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 원심분리는 약 1 분 내지 약 30 분 동안 수행될 수 있다. 만약, 상기 원심분리가 약 1 분 미만으로 수행될 경우 펠렛이 형성되지 않을 수 있고, 약 30 분을 초과하여 수행될 경우 열이 발생하여 세포 손상이 발생할 수 있다. 바람직하게, 상기 원심분리는 약 1 분 내지 약 15 분 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 상기 수확한 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양하는 것은, 수확한 돌기세포를 약 500 내지 약 1,500 rpm의 속도로 약 1 분 내지 약 30 분 동안 원심분리하여 펠릿 형태로 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 수확한 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양하는 것은, 약 2 일 내지 약 3 일 마다 배지를 교환하면서 총 3 일 내지 30 일간 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 수확한 돌기세포를 약 2 일 내지 약 3 일 마다 배지를 교환하면서 총 3 일 내지 30 일간 배양함으로써, 상기 인간 유도 만능 줄기세포로부터 유도된 돌기세포가 조골세포로 분화되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 수확한 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양 시, 약 7 일까지는 세포의 응축이 일어날 수 있으며, 약 7 일 이후로 골 형성이 나타나는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 조골세포 펠릿은 오스테오칼신 및 콜라겐이 발현된 것일 수 있다. 상기 오스테오칼신 및 콜라겐은 골 형성의 중요한 지표로서, 본 발명에 따른 방법에 의해 조골세포 펠릿을 제조할 경우 오스테오칼신 및 콜라겐이 발현되어 골 형성이 성공적으로 수행된 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 콜라겐은 Ⅰ 형 콜라겐, Ⅱ 형 콜라겐, Ⅲ형 콜라겐, Ⅳ형 콜라겐, Ⅴ형 콜라겐, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 구체적으로는 Ⅰ 형 콜라겐을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 상기 조골세포 분화 배지는 DMEM-LG, 아스코르빈산 포스페이트, 베타-글리세로포스페이트, 덱사메타손, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 수확한 돌기세포는 상기 DMEM-LG, 아스코르빈산 포스페이트, 베타-글리세로포스페이트, 덱사메타손, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양됨에 따라, 성공적으로 골 분화되어 조골세포 펠릿을 형성할 수 있다. 구체적으로, 상기 조골세포 분화 배지는 DMEM-LG, 아스코르빈산 포스페이트, 베타-글리세로포스페이트, 및 덱사메타손을 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
마지막으로, 상기 조골세포 분화 배지에서 배양되어 형성된 조골세포 펠릿을 수확한다.
일 실시예에 있어서, 상기 수득된 조골세포 펠릿은 근골격계 질환을 예방 또는 치료할 수 있으며, 이에 따라 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 근골격계 질환은 퇴행성 관절염(Osteoarthritis), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis), 골다공증(osteoporosis), 척주관협착증(spinal stenosis), 윤활막염(synovitis), 골연화증(osteomalacia), 골수염(osteomyelitis), 골괴사(osteonecrosis), 신경성 관절병증(neurogenic arthropathy), 신장성 골형성장애(renal osteodystrophy), 반월상 연골 손상(Meniscus Injury), 유착성 관절낭염(Adhesive capsulitis), 건병증(Tendinopathy), 헤바딘 결절(Heberden node), 부샤르 결절(Bouchard nodes), 추간판 변성(disk degeneration), 추간판 탈출증(Herniation of intervertebral disk), 통풍성 관절염(Gouty arthritis), 인대 손상(ligament injury), 건 손상(tendon, injury), 오십견(Frozen Shoulder), 회전근개 파열(Rotator Cuff Tear), 습관성 탈구(habitual dislocation), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 약학 조성물을 제제화할 경우, 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 예를 들어, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 비경구 투여를 위한 제제로는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 비수성용제 또는 현탁제로는, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 좌제로는, 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 상기 약학 조성물을 투여하는 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여량은 개체의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 약학 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 예를 들어, 피하, 눈, 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내, 뇌 내, 두개 내(intracranial), 골수 내, 관절강 내, 척추 내, 뇌실 내, 수강막 내, 비 내, 정맥 내로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여는 1회 이상, 예를 들어 1회 내지 4회 투여될 수 있으며, 투여량이 많은 경우에는 하루에 수 회에 걸쳐 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 상기 약학 조성물은 주사가능 형태인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 주사가능 형태란, 상기 조골세포 펠렛을 외과적인 수술이 필요 없이 주사기를 이용하여 골 재생이 필요한 부위에 투여할 수 있는 형태를 의미하며, 보다 구체적으로 그 크기가 주사 바늘을 통과할 수 있을 정도로 충분히 작은 것을 의미한다.
이하, 구체적인 실시예와 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
조골세포 펠릿 생성 및 배양
본 발명에 따른 조골세포 펠릿의 제조 방법은 도 1에 나타낸 바와 같다. 요약하면, 인간 유도 만능 줄기세포를 배양하여 수확하고 배상체(Embryoid Body, EB)를 형성하였다. 부착된 배상체를 유도하여 중간엽 줄기세포와 유사한 특성을 나타내는 돌기세포를 수득하고, 원심분리에 의해 펠릿을 생성하였다.
구체적으로, 인간 유도 만능 줄기세포는 Essential 8 배지(Thermo Fisher, Scientific, Waltham, MA, USA) 및 비트로 넥틴 코팅 플레이트에서 배양되었다. 배양 시 배지는 매일 교체되었다. 배양된 인간 유도 만능 줄기세포를 수확하고, 조골세포 분화 배지(osteoblast differentiation media, ODM) 중 1×105 세포/mL으로 재현탁하였다. 다음으로, 100 μl의 분취량을 96-웰 U-자형 마이크로 플레이트의 웰에 분배하고, 펠릿 형성을 위해 800×g에서 10 분 동안 원심분리하였다. 생성된 골 형성 펠릿(osteogenic pellets)을 37℃에서 3 일 동안 배양하여 조골세포 펠릿(osteopellet)을 형성하였다. 조골세포 펠릿은 DMEM-LG(Thermo Fisher, Scientific, Waltham, MA, USA), 50 μg/ml 아스코르브산 포스페이트(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), 10 mM b-글리세로 포스페이트(Sigma Aldrich), 및 100 nM 덱사메타손(Sigma Aldrich)으로 구성된 조골세포 분화 배지(ODM)에서 유지되었다. 배양에 사용된 조골세포 분화 배지는 2 일마다 교체되었으며, 조골세포 펠릿의 수확 시점까지 37℃5% CO2를 유지하였다.
실험예 1. 염색을 통한 조골세포 펠릿의 분석
상기 실시예에서 제조된 조골세포 펠릿에 대해, 폰 코사(Von Kossa) 염색 및 알리자린 레드 에스(Alizarin Red S) 염색을 수행하여 조골세포로의 분화를 확인하였다. 상기 폰 코사 염색은 Sigma Aldrich에서 구입한 키트를 사용하여 수행되었다. PBS로 세척한 후, 세포를 4% PFA로 20 분간 고정하고 수돗물을 이용하여 세척하였다. 폰 코사 염색을 위해, 고정된 세포를 5% 질산은 용액에서 40 분 동안 UV에 노출시켰다. 수돗물을 이용하여 세척한 후, 상기 세포를 5% 티오황산나트륨 용액에서 5 분 동안 배양하였다. 염색 후, 상기 세포를 수돗물을 이용하여 3 회 세척하고 이미지를 분석하였다. 칼슘의 침착 정도를 확인하기 위해, 알리자린 레드 에스 염색을 수행하였다. 분화된 조골세포를 멸균 1×PBS로 세척하였다. 알리자린 레드 에스 용액을 첨가하고, 상기 샘플을 실온(RT)에서 30 분 동안 염색하였다. 그 후, 비특이적으로 염색된 부분을 멸균수를 이용하여 여러 번 세척하였다. 상기 염색된 샘플은 광학 현미경으로 관찰되었다. 염색된 알리자린 레드 수준을 정량화하기 위해, 상기 샘플을 10%(w/v) 세틸 피리디늄 클로라이드 용액과 함께 RT에서 30 분 동안 반응시켰고, 상층액의 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 595 nm에서 측정하였다.
실험예 2. 조직학적 분석
생성된 조골세포 펠릿의 내부 형태를 확인하기 위해, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 수행하였다. 염색은 먼저 섹션을 연속 5 μm 두께로 절단한 다음, 파라핀을 제거하고 재수하였다. 그 후, 절편을 Harris 's hematoxylin 용액에서 10 분 동안 배양하였다. 과량의 헤마톡실린은 70%(v/v) 에틸 알코올에 1% HCl을 5 초 동안 첨가한 다음, 0.5% 수산화 암모늄 용액 세척으로 제거하였다. 다음으로, 슬라이드를 약 1 분 동안 에오신 Y(1%, w/v)으로 염색하고 흐르는 수돗물을 이용하여 1 분 동안 세척하였다. 상기 섹션은 투명한 유리 슬라이드에 장착하고 얇은 유리 커버 슬립으로 덮어주었다.
제조된 조골세포 펠릿에서의 Ⅰ 형 콜라겐 및 오스테오칼신의 발현을 확인하기 위해, 면역 형광 염색을 수행하였다. 상기 실시예에서 제조된 조골세포 펠릿 절편을 3% H2O2에서 배양하여 내인성 과산화 효소 활성을 제거한 다음, 1% BSA(1% PBA)와 함께 1×PBS를 포함하는 10% 정상 염소 혈청과 함께 배양하여 비특이적 배경 염색을 제거하였다. 항-콜라겐 Ⅰ 항체 및 항-OCN 항체(모두 영국 캠브리지의 Abcam에서 구입)를 1% PBA를 함유하는 5% 정상 염소 혈청에 희석하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 몇 번의 세척 후, 섹션을 PBS에서 Alexa Fluor 594 염소 항-토끼 IgG(H+L) 항체(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)와 함께 RT에서 40 분 동안 배양하였다. 핵 염색은 DAPI를 사용하여 수행되었다.
도 2의 (a) 내지 (d)는, 상기 실시예에서 제조된 조골세포 펠릿의 분화 7 일, 14 일, 및 21 일 째의 조골세포 펠릿의 이미지로서, 각각 생성된 펠릿의 명시야 이미지(a), H&E 염색 이미지(b), 폰 코사 염색 이미지(c), 및 알리자린 레드 염색 이미지(d)이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 인간 유도 만능 줄기세포로부터 생성된 조골세포 펠릿은 일반적인 구형 형태를 나타냈다[도 2 (a)]. H&E 염색은 조골세포 펠릿의 상세 구조를 나타내었다. 분화 7 일째에는 대부분의 염색된 영역이 세포질 또는 콜라겐일 수 있는 연한 분홍색으로 염색되어 생존 세포가 관찰되었다[도 2 (b)]. 세포 비대는 골 형성에서 중요한 단계이며, 이는 과정을 연골 형성과 구별하는 단계이다. 14 일째 펠릿에서 대부분의 세포는 7 일 펠릿에 비해 더 큰 핵 크기를 나타냈다. 또한, 14 일째에 조골세포 펠릿의 크기도 증가하였다. 그러나, 분화 21 일째에는 펠릿 크기가 줄어들고 대부분의 세포를 찾기가 어려워졌다. 또한, 조직 절편을 수행하는 동안 21 일째 조골세포 펠릿은 석회화되지 않은 골 조직처럼 부서지는 경향을 나타내었다. 성공적인 골 형성 분화를 확인하기 위해, 폰 코사 염색으로 광물화를 확인하였다[도 2 (c)]. 7 일째 조골세포 펠릿에서는 광물화가 거의 나타나지 않았다. 그러나, 14 일 펠릿에서는 급격히 증가하였다. 분화 21 일째에는 대부분의 영역이 광물화된 것을 확인할 수 있었다. 상기 인간 유도 만능 줄기세포-유래 조골세포 펠릿의 칼슘 배치는 알리자린 레드 염색에 의해 확인되었다[도 2 (d)]. 다른 염색 방법의 결과와 유사하게, 침착된 칼슘은 14 일째 조골세포 펠릿에서 유의하게 나타났으며 분화 21 일째에 가장 강한 강도를 나타냈다. 종합하면, 이러한 염색 결과는 7 일까지 세포 응축이 일어나고 분화 7 일 후에 적절한 골 형성이 나타나기 시작한다는 것을 시사한다.
도 3의 (a) 내지 (c)는, 상기 실시예에서 제조된 조골세포 펠릿의 면역 형광 염색 이미지로서, 각각 분화 7 일(a), 14 일(b), 및 21 일째(c) 펠릿에서 오스테오칼신 및 I 형 콜라겐의 발현을 나타낸 것이다.
오스테오칼신(Osteocalcin) 및 I 형 콜라겐은 골 형성의 중요한 지표이다. 상기 오스테오칼신은 골 조직에서 가장 풍부한 비콜라겐성 기질 단백질이며, I 형 콜라겐은 무기질화된 뼈에서 찾을 수 있는 유일한 콜라겐이다. 상기 오스테오칼신 및 I 형 콜라겐의 발현은 7, 14, 21 일에 조골세포 펠릿에서 확인되었다. 7 일째의 조골세포 펠릿에서 오스테오칼신 및 Ⅰ 형 콜라겐이 모두 발현되었다. 그러나, 상기 Ⅰ 형 콜라겐은 주로 펠릿의 윤곽선으로 표현되었다[도 3 (a)]. 상기 오스테오칼신 발현이 분화 14 일째에 안정된 수준의 발현을 유지하는 반면, 상기 I 형 콜라겐 발현은 펠릿의 중앙에 나타나기 시작하였다[도 3 (b)]. 분화 21 일째, 두 마커 모두 높은 발현을 나타내었다. 그러나, 상기 Ⅰ 형 콜라겐의 발현은 약간 감소하였다[도 3 (c)]. 흥미롭게도, 14 일째에 상기 오스테오칼신과 Ⅰ 형 콜라겐의 발현이 세포핵에서 발견되었다. 그러나, 21 일째에는 발현 성향이 세포를 둘러싸고 있는 기질로 이동하였다. 이 결과를 통해, 상기 펠릿 내의 세포가 성숙한 조골-유사세포로 성공적으로 분화되었음을 확인할 수 있었다.
조골세포의 세포자살(apoptosis)은 뼈의 발달과 유지에 중요한 역할을 한다. 일부 조골세포는 광물화된 기질에 갇혀 완전히 성숙되어 골 세포로 변화하는 반면, 재흡수를 위한 구멍(resorption pit)에 모인 조골세포의 약 60 내지 80%는 세포자살에 의해 죽는 것으로 보고된다. 세포자살은 또한 연골 내 골화 중에서도 관찰된다. 상기 과정에서, 비대성 연골세포는 대부분 세포 사멸을 겪으며, 적은 비율의 세포만이 골 형성 계통으로 완전히 분화한다. 따라서, 본 실시예에서는 조골세포 내에서 살아있는 세포와 죽은 세포를 확인하였다. 분화 7 일째에는 대부분의 세포가 GFP 발현에 의해 살아있는 것으로 나타났다(도 4). 그러나, 이러한 세포들은 분화 30 일째에는 대부분 죽은 것으로 확인되었다.
분화 중 펠릿의 강도는 외부 힘으로 펠릿을 눌러 테스트하였다. 7 일째 펠릿이 외부 압력에 의해 완전히 평평하게 압축되는 동안, 생성된 조골세포 펠릿은 추가 분화를 거치면서 형태를 유지할 수 있었다(도 5). 분화 21 일째에서, 상기 조골세포 펠릿은 그 모습을 유지하기에 충분히 단단해졌으며 전혀 평평해지지 않았다.
본원에서, 골 형성 분화 7, 14, 21 일에 Ⅰ 형 콜라겐 및 오스테오칼신의 발현이 확인되었다. 분화 7 일째에 Ⅰ 형 콜라겐의 발현 패턴은 독특하고 윤곽선에서 세포에서 높게 발현되어 가장 높은 세포 밀도로 활성 증식을 보이는 것으로 나타났다. 그러나, Ⅰ 형 콜라겐의 발현은 발현 14 일 이후에 중심에서 발현되었으며 21 일째에는 발현이 다소 감소하였다. 골 형성의 주요 단계는 1) 증식, 2) 알칼리성 포스파타제의 발현 증가 및 골세포 외 기질의 침착, 및 3) 광물화이다. Ⅰ 형 콜라겐의 발현은 매트릭스 침착이 발생하는 증식 단계 말기에 높았다. 상기 단계가 끝나면이 유전자를 조골세포에 가장 특이적인 마커로 만드는 오스테오칼신이 광물화 단계에서 발현된다. 결과적으로, 상기 오스테오칼신은 전체 골 형성 과정 동안 세포에서 상대적으로 안정된 발현을 나타냈다. 그러나, 상기 오스테오칼신은 분화 21 일에 가장 높게 발현되었다. 이러한 결과는 상기 유도 만능 줄기세포가 시험관 내에서 성공적으로 조골세포로 분화되었음을 시사한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 인간 유도 만능 줄기세포(Human induced pluripotent stem cells, hiPSC)를 배양하여 배상체를 형성 및 수득하는 단계;
    상기 수득된 배상체를 돌기세포(outgrowth cell)로 유도하는 단계;
    상기 유도된 돌기세포를 수확하는 단계;
    상기 수확한 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양하여 조골세포 펠릿을 형성하는 단계; 및
    상기 형성된 조골세포 펠릿을 수확하는 단계;
    를 포함하는, 조골세포 펠릿 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 인간 유도 만능 줄기세포를 배양하는 것은 부착배양인 것을 특징으로 하는, 조골세포 펠릿 제조 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 인간 유도 만능 줄기세포를 배양하는 것은 비트로넥틴 코팅 플레이트에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 조골세포 펠릿 제조 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 수득된 배상체를 돌기세포로 유도하는 것은 젤라틴 코팅 플레이트에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 조골세포 펠릿 제조 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 수확한 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양하는 것은, 수확한 돌기세포를 원심분리하여 펠릿 형태로 배양하는 것을 특징으로 하는, 조골세포 펠릿 제조 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 원심분리는 500 내지 1,500 rpm의 속도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 조골세포 펠릿 제조 방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 원심분리는 약 1 분 내지 약 30 분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 조골세포 펠릿 제조 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 조골세포 분화 배지는 DMEM-LG, 아스코르빈산 포스페이트, 베타-글리세로포스페이트, 덱사메타손, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 조골세포 펠릿 제조 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 수확한 돌기세포를 조골세포 분화 배지에서 펠릿 형태로 배양하는 것은, 2 일 내지 3 일 마다 배지를 교환하면서 총 3 일 내지 30 일간 배양하는 것을 특징으로 하는, 조골세포 펠릿 제조 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 조골세포 펠릿을 포함하는, 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 근골격계 질환은 퇴행성 관절염(Osteoarthritis), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis), 골다공증(osteoporosis), 척주관협착증(spinal stenosis), 윤활막염(synovitis), 골연화증(osteomalacia), 골수염(osteomyelitis), 골괴사(osteonecrosis), 신경성 관절병증(neurogenic arthropathy), 신장성 골형성장애(renal osteodystrophy), 반월상 연골 손상(Meniscus Injury), 유착성 관절낭염(Adhesive capsulitis), 건병증(Tendinopathy), 헤바딘 결절(Heberden node), 부샤르 결절(Bouchard nodes), 추간판 변성(disk degeneration), 추간판 탈출증(Herniation of intervertebral disk), 통풍성 관절염(Gouty arthritis), 인대 손상(ligament injury), 건 손상(tendon, injury), 오십견(Frozen Shoulder), 회전근개 파열(Rotator Cuff Tear), 습관성 탈구(habitual dislocation), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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