KR20220129242A

KR20220129242A - 쏘팔메토 오일 및 이의 불포화 지방산을 유효성분으로 함유하는 다중 병원성 미생물 바이오필름 형성 억제용 조성물

Info

Publication number: KR20220129242A
Application number: KR1020210033871A
Authority: KR
Inventors: 이진태; 이진형; 김용규
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2021-03-16
Filing date: 2021-03-16
Publication date: 2022-09-23
Also published as: KR102566917B1

Abstract

본 발명은 쏘팔메토 오일 및 이의 불포화 지방산을 유효성분으로 함유하는 바이오필름 형성 억제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 쏘팔메토 오일 및 이의 불포화 지방산인 라우르산(lauric acid) 및 미리스트산(myristic acid)은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 병원성대장균(E. coli O157:H7), 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 각각 단독, 이중 종(dual species), 삼중 종(three species)의 바이오필름 형성을 최소한의 세포 독성 효과로 억제하며, 이들 중 라우르산 또는 미리스트산을 항생제 또는 항진균제와 병용처리하여 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 병원성대장균(E. coli O157:H7)에 대해 상승적인 항균 효과가 있다.
따라서, 상기 쏘팔메토 오일 및 이의 불포화 지방산을 유효성분으로 함유하는 조성물은 다중 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제용 코팅 조성물 또는 항균 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

쏘팔메토 오일 및 이의 불포화 지방산을 유효성분으로 함유하는 다중 병원성 미생물 바이오필름 형성 억제용 조성물{Composition for inhibiting multi-pathogenic microbial biofilm formation comprising saw palmetto oil and its unsaturated fatty acids as effective ingredients}

본 발명은 쏘팔메토 오일 및 이의 불포화 지방산을 유효성분으로 함유하는 다중 병원성 바이오필름 형성 억제용 조성물에 관한 것이다.

바이오필름(biofilm) 또는 생물막은 자체 생산된 세포 외 고분자 물질에 의해 표면에 자라는 고착 된 미생물 군집으로, 이러한 필름은 자연, 의학 및 공학 환,경에 편재하여 나타난다. 병원성 바이오필름은 기존의 항생제, 숙주 방어 시스템 및 외부 스트레스에 내성을 가지고 있어 인체 건강에 심각한 문제를 일으킬 수 있으며, 만성 세균 감염을 지속시킨다.

관련하여, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 다양한 급성 및 만성 감염의 원인균이다. 종종 항생제 내성을 나타내며, 전세계적인 병원 내 감염(nosocomial infection) 발생에 책임이 있다. 바이오필름 형성이 항생제 내성에 중요한 역할을 하기 때문에 황색포도상구균에 의한 바이오필름 형성은 의료 분야에서 특히 우려되는 사항이다. 메티실린(methicillin) 내성 황색포도상구균 및 반코마이신(vancomycin) 내성 황색포도상구균과 같은 다제(multidrug) 내성 균주의 출현은 심각한 위협이 되고 있다. 황색포도상구균은 α-헤모라이신(α-hemolysin), 엔테로톡신(enterotoxins), 코아귤레이즈(coagulase) 및 프로테인 A(protein A)와 같은 여러 가지 외독성(exotoxin) 물질을 분비한다. 특히 α-헤모라이신(α-톡신으로도 알려짐)은 주요 독성 인자로서 패혈증, 폐렴 및 심한 피부 감염의 병원균과 관련되어 있고, 바이오필름 형성에 기여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 약제 내성을 갖지 않으며 황색포도상구균의 바이오필름을 억제할 수 있는 무독성 화합물을 발견하는 것이 중요하다.

한편, 대부분의 항생제는 이상적으로 숙주 또는 환경에 해를 끼치지 않고 미생물 성장을 억제하는 것을 목표로 한다. 그러나 이러한 약제의 남용으로 인해 전 세계적으로 약물 내성 병원체가 출현하였다. 박테리아 및 곰팡이 바이오필름은 항균 저항성 및 다양한 장치 관련 감염에서 중요한 역할을 하며, 다양한 병원성 미생물이 종종 여러 종의 생물막을 형성하여 항생제에 대한 내성을 더욱 증가시킨다.

다시 말해, 바이오필름이 형성되면 이는 항생제 내성 상태가 되었다고 볼 수 있으며, 이러한 경우 세균들의 항생제에 대한 감수성이 낮아져 항생제를 사용해도 거의 효과가 없으며, 특히 생물막을 형성하고 있는 세균에 의한 감염은 여러 가지 항생제에 대해 내성을 갖는 다제내성균에 의한 경우가 많아 더욱 문제가 심각하다.

따라서, 단일 및 다중 미생물 바이오필름 형성을 제어하기 위해 대체 무독성 접근법이 필요한 실정이다. 현재의 항균 전략과 달리 약물 내성의 위험을 줄이기 위해서는 플랑크톤 세포 성장(planktonic cell growth)을 억제하지 않는 바이오필름 또는 생물막 억제제를 식별하는 것이 중요하다고 인식되고 있다.

현재 다중 종(multispecies) 바이오필름의 중요성이 점차 인식되고 있으며, 단일 종 바이오필름에 대한 연구 결과는 많으나, 이중종 바이오필름(dual species biofilm) 및 삼중 종의 바이오필름(three species biofilm) 억제는 아직까지 거의 보고되지 않는 실정이다.

한편, 식물은 항생제 및 기타 의약품의 주요 공급원이며, 다양한 식물의 2차 대사 산물이 황색포도상구균에 대한 항균 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 대표적인 예로서 쏘팔메토(Seronoa repens) 열매 추출물은 전립선 비대증의 대체 치료법으로 널리 사용되어 왔는데, 쏘팔메토 제품의 주요 성분은 지방산(90% 이상)과 피토스테롤이며, 주요 지방산은 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트 산, 올레산, 리놀렌산/리놀레산 및 스테아르산 등이다.

특히 이러한 지방산은 모든 형태의 생명체에 널리 퍼져 있으며 70개 이상의 천연 지방산이 확인되었다. 대부분 100 μg/ml 용량 이상의 다양한 지방산의 항균 활성은 다양한 미생물에 대해 보고되었다. 그러나 최근 연구에 따르면 지방산은 최소 억제 농도(MICs) 보다 훨씬 낮은 농도에서 박테리아와 곰팡이에 대한 항균막 및 항바이러스 활성을 나타내며 균근균(mycorrhizal fungi)의 포자 형성을 촉진한다고 알려진 바 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 이중 종(dual species) 또는 삼중 종(three species)의 바이오필름 억제 효과를 갖는 바이오필름 억제 조성물을 개발하고자 하였다. 이에 쏘팔메토 오일 및 이의 불포화 지방산이 바이오필름 억제 조성물로 사용될 수 있는지 여부, 상세하게 황색포도상구균(S. aureus), 병원성대장균(E. coli O157:H7) 및 칸디다균(albicans)에 대해서 각각의 단일, 이중 종(dual species) 균주, 삼중 종(three species) 균주 억제 효과가 있는지 확인하였다. 추가로, 지방산과 항생제의 시너지 효과를 통해 항균 효과와 세포 독성을 확인하였다.

한국등록특허 제10-1183484호(2012.09.11. 등록)

본 발명자들은 쏘팔메토 오일 및 이로부터 추출한 라우르산과 미리스트산이 S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans에 의한 삼중 종의 바이오필름 형성을 최소한의 세포 독성 효과로 억제한다는 것을 확인하였으며, 특히 S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans의 단일 종, 이중 종 및 삼중 종 병원성 미생물에 대한 바이오필름 형성을 억제할 수 있음을 밝혔다. 아울러, 라우르산 또는 미리스트산을 항생제와 병용처리하여 S. aureus, E.coli O157:H7에 대해 상승적인 항균 효과가 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 다중 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물, 이를 이용한 다중 병원성 미생물 바이오필름 형성 억제 방법, 및 상기 조성물을 포함하는 코팅용 조성물 또는 항균성 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 쏘팔메토 오일(saw palmetto oil), 이의 불포화 지방산인 라우르산(lauric acid), 및 미리스트산(myristic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 다중 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물; 및 항생제 또는 항진균제;를 생물체 또는 비생물체의 표면에 병용처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 병원성 미생물 바이오필름 형성 억제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오필름 형성 억제용 조성물을 포함하는 다중 병원성 미생물 바이오필름 형성을 억제하기 위한 코팅용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 불포화 지방산으로서 라우르산(lauric acid) 또는 미리스트산(myristic acid); 및 (b) 항생제 또는 항진균제;를 유효성분으로 함유하는 항균성 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 바이오필름 형성 억제용 조성물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 병원성대장균(E. coli O157:H7), 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 각각 단독, 이중 종(dual species), 삼중 종(three species)의 바이오필름 형성을 최소한의 세포 독성 효과로 억제하며, 이들 중 라우르산 또는 미리스트산을 항생제 또는 항진균제와 병용처리하여 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 병원성대장균(E. coli O157:H7)에 대해 상승적인 항균 효과가 있다.

따라서, 본 발명에 따른 조성물은 황색포도상구균(S. aureus), 병원성대장균(E. coli O157:H7) 및 칸디다균(albicans)의 바이오필름 형성을 억제할 수 있어 병원성 세균의 감염에 의한 감염성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 쏘팔메토 오일과 주요 지방산의 바이오필름 억제 활성을 확인한 결과이다. 도 1a는 96-웰 플레이트에서 24 시간 동안 미생물을 배양한 후 쏘팔메토 오일 존재 하에 각 미생물에 의한 바이오필름 형성을 정량화한 결과이고, 도 1b는 쏘팔메토 오일 내 주요 지방산의 화학 구조를 나타낸 것이고, 도 1c 내지 도 1f는 96-웰 플레이트에서 S. aureus MSSA 6538(c), E. coli O157:H7(d), C. albicans DAY185(e) 및 기타 Staphylococcus strains(f)의 라우르산(C12:0), 미리스트산(C14:0), 팔미트산(C16:0) 및 올레산(C18:1) 존재 하에서 37℃ 온도에서 24 시간 동안 배양 후 바이오필름 형성 억제 효과를 정량한 결과이고(n = 생물학적으로 독립적인 샘플 2 개, 오차 막대는 표준 편차를 나타냄*, P <0.05 vs. 미처리 대조군), 도 1g는 100 μg/ml 쏘팔메토 오일, 20 μg/ml 라우르산(C12:0) 또는 20 μg/ml 미리스트산(C14:0) 존재 하에서 폴리스티렌 플레이트 상에서 바이오필름 형성 여부를 공초점 레이저 현미경(CLSM)으로 관찰한 결과이다. 스케일 바는 100 μm 나타내며, 현미경 실험을 위해 2 개 이상의 독립적인 배양을 수행하고 10 개 이상의 무작위로 위치를 분석하였다.
도 2는 다중 미생물 모델(polymicrobial models)에서 쏘팔메토 오일, 라우르산(C12:0) 및 미리스트산(C14:0)의 바이오필름 형성 억제 효과를 확인한 결과이다. 도 2a는 LB 배지에서 S. aureus MSSA 6538 및 E. coli O157:H7의 이중 종 바이오필름 억제 효과를 나타낸 것이고, 도 2b는 PDB 및 LB 배지의 1:1 혼합물에서 S. aureus 6538 및 C. albicans DAY185의 이중 종 바이오필름 억제 효과를 확인한 결과이고, 도 2c는 PDB 및 LB 배지의 1:1 혼합물에서 E. coli O157:H7 및 C. albicans에 대한 이중 종 바이오필름 억제 효과를 나타낸 것이고, 도 2d는 PDB 및 LB 배지의 1:2 혼합물에서 S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans 인 삼중 종 병원성 미생물에 대한 바이오필름 억제 효과를 확인한 결과이고(37℃에서 24 시간 동안 배양, n = 생물학적으로 독립적인 샘플 2 개. *, P <0.05 vs. 미처리 대조군), 도 2e는 S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans의 삼중 종 병원성 미생물의 바이오필름에 대한 공초점 레이저 현미경(CLSM) 관찰한 결과이고, 도 2f는 S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans의 삼중 종 병원성 미생물의 바이오필름에 대한 주사전자현미경(SEM) 관찰한 결과이다. 삽입된 도면에서 큰 세포는 C. albicans(파란색 삼각형으로 표시)이고, 작은 원형 세포는 S. aureus(빨간색 삼각형으로 표시)이며, 막대형은 E. coli O157:H7(노란색 삼각형으로 표시)이다. 노란색 눈금 막대는 100 μm, 흰색 눈금 막대는 15 μm, 삽입된 빨간색 눈금 막대는 3 μm 나타내고, 현미경 실험을 위해 2 개 이상의 독립적인 배양을 수행하고, 10 개 이상의 무작위 위치를 분석하였다.
도 3은 전사 프로파일(transcriptional profiles), 세포 소수성(cell hydrophobicity) 및 균사 형성(hyphal formation)에 대한 지방산의 효과를 확인한 결과이다. 도 3a 내지 도 3c는 전사 프로파일 결과로서, S. aureus MSSA 6538 (a), E. coli O157:H7 (b) 또는 C. albicans DAY185 (c)는 100 μg/ml 쏘팔메토 오일, 20 μg/ml 라우르산(C12:0) 또는 20 μg/ml 미리스트산(C14:0) 존재 또는 부존재 하에서 37℃에서 6 시간, 4 시간 또는 6 시간 동안 각각 250 rpm으로 흔들어 주고 qRT-PCR을 수행하여 얻은 폴드 변화(fold changes)를 나타낸 결과이다. 폴드(fold) 결과는 처리된 대조군과 처리되지 않은 대조군의 전사 변화를 나타난 것이고, 실험을 중복으로 수행하였다(유전자 당 4 번 qRT-PCR 반응을 수행함). *, P <0.05 vs. 미처리 대조군(None). 도 3d 내지 도 3f는 세포 소수성 및 균사 형성에 대한 지방산의 효과로서, S. aureus 6538 (d), E. coli O157(e), C. albicans DAY185 (f)에서 쏘팔메토 오일, 라우르산(C12:0) 및 미리스트산(C14:0)의 유무에 관계없이 37℃에서 24 시간 동안 배양한 후 소수성을 확인한 결과이다. 도 1g는 PDB 배지에서 C. albicans DAY185를 37℃에서 24 시간 동안 배양한 후 지방산에 의한 균사 필라멘트(hyphal filamentation) 억제를 확인한 결과이다. 스케일 바는 50 μm 나타내며, 현미경 실험을 위해 2 개 이상의 독립적인 배양을 수행하고 10 개 이상의 무작위로 위치를 선택하여 분석한 것이다.
도 4는 지방산; 또는 지방산과 항생제(antimicrobial agents)를 병용 투여시의 항병원성(Anti-virulence activities) 활성을 확인한 결과이다. 도 4a 내지 도 4c는 선충(Nematode) 생존율을 나타낸 결과로서, 쏘팔메토 오일, 라우르산(C12:0) 또는 미리스트산(C14:0) 존재 하에서 S. aureus MSSA 6538(a), E. coli O157:H7(b), C. albicans DAY185(c) 세포에 노출한 후 선충의 생존율을 확인한 결과이다. 도 4d는 4 일 동안 화학적 독성이 감염되지 않은 C. elegans를 처리하여 얻은 화학적 독성(Chemical toxicities) 평가 결과로서, OP50은 E. coli OP50을 먹인 대조군(OP50-fed controls)을 의미하며, 처리되지 않은 대조군은 None로 나타냈다. *, P < 0.05 vs. 미처리 대조군(None). OP50은 E. coli OP50을 나타냈다. 도 4e 및 도 4f는 항생제 또는 항진균제와 병용처리 시의 세포 생존율을 확인한 결과로서, 항생제인 젠타마이신(gentamycin)(10μg/ml) 및 항진균제인 암포테리신 B(0.5, 2 및 5 μg/ml)의 존재 하에서 S. aureus (e) 또는 E. coli O157:H7 (f)의 생존율을 측정한 결과이다. * = P < 0.05 vs. 미처리 대조군. None; 미처리 대조군. SPO : 쏘팔메토 오일(100 μg/ml), 지방산인 라우르산(C12:0) 및 미리스트산(C14:0) (20 μg/ml), Gen : 젠타마이신, AMB : 암포테리신 B. n = 생물학적으로 독립적인 2 개 샘플.

본 발명자들은 쏘팔메토 오일 및 이로부터 추출한 라우르산과 미리스트산이 S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans에 의한 삼중 종(three species)의 바이오필름 형성을 최소한의 세포 독성 효과로 억제한다는 것을 확인하였으며, 특히 S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans의 단일 종, 이중 종 및 삼중 종 병원성 미생물에 대한 바이오필름 형성을 억제할 수 있음을 밝혔다. 아울러, 라우르산 또는 미리스트산을 항생제 또는 항진균제와 병용처리하여 S. aureus, E.coli O157:H7에 대해 상승적인 항균 효과가 있음을 확인하며 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 쏘팔메토 오일(saw palmetto oil), 이의 불포화 지방산인 라우르산(lauric acid), 및 미리스트산(myristic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는, 다중 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물을 제공한다.

상기 병원성 미생물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 병원성대장균(E. coli O157:H7), 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

바람직하게는, 상기 조성물은 이중 종 바이오필름(dual species biofilm) 또는 삼중 종 바이오필름(three species biofilm) 형성을 억제하는 것이다.

상세하게, 상기 이중 종 바이오필름(dual species biofilm)은 황색포도상구균Staphylococcus aureus) 및 병원성대장균(E. coli O157:H7); 또는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans); 또는 병원성대장균(E. coli O157:H7) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans);에서 선택된 미생물의 바이오필름을 억제할 수 있다.

상기 삼중 종 바이오필름(three species biofilm)은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 병원성대장균(E. coli O157:H7) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 바이오필름을 억제할 수 있다.

본 발명에서는 쏘팔메토 오일와 이의 풍부한 라우르산과 미리스트산이 S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans의 단일 종, 이중 종 및 삼중 종 병원성 미생물에 대한 바이오필름 형성을 억제할 수 있음을 실험적으로 밝혔다.

또한, 상기 조성물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 hla 및 hld 발현 억제하고, 병원성대장균(E. coli O157:H7)에서 핌브리아(fimbriae) 유전자인 csgAB; 운동성 유전자인 fimH, flhD 및 motB; 및 쿼럼 센싱(quorum sensing) 유전자인 luxR 및 luxS를 억제하고, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에서 세포벽 유전자인 HWP1를 억제하여 바이오필름의 형성을 억제할 수 있다.

상기 불포화 지방산은 균사 형성(hypha formation) 및 바이오필름 형성을 억제할 수 있다.

상기 조성물은 항생제 또는 항진균제를 더 포함할 수 있다. 상기 항생제는 젠타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 테트라사이클린(tetracycline) 메티실린(methicillin), 반코마이신(vancomycin), 세팔로스포린(cephalosporin) 및 리팜피신 (rifampicin)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 반드시 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 항진균제는 암포테리신 B, 테르비나핀(terbinafine), 플루코나졸(fluconazole), 케토코나졸(ketoconazole), 이트라코나졸(intraconazole)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 반드시 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 바이오필름 형성 억제용 조성물; 및 항생제 또는 항진균제;를 생물체 또는 비생물체의 표면에 병용처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 병원성 미생물 바이오필름 형성 억제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 쏘팔메토 오일(saw palmetto oil), 이의 불포화 지방산인 라우르산(lauric acid), 및 미리스트산(myristic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 다중 병원성 미생물 바이오필름 형성을 억제하기 위한 코팅용 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 조성물은 의료기기, 의료용 재료 또는 의료용 이식물에 코팅되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 조성물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 또는 병원성대장균(E. coli O157:H7)에 대한 항바이오필름 및 항균 활성을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 바이오필름 형성 억제용 조성물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 병원성대장균(E. coli O157:H7), 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물로도 제공될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 바이오필름 형성 억제용 조성물은 항균용 화장료 조성물을 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물이 화장료 조성물인 경우, 상기 화장료 조성물은 상기 성분 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위해 피부 흡수 촉진제를 추가로 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 바이오필름 형성 억제용 조성물은 다중 병원성 미생물의 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 치료용 조성물, 항균용 조성물, 및 병원성 미생물 바이오필름 형성을 억제하기 위한 코팅용 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1:　균주, 화학 물질, 및 배양 재료 준비

본 연구에 사용된 11 가지 미생물, 배지, 최소 억제 농도(MIC), 및 최소 억제 농도(MIC) 측정을 위한 접종물 크기를 표 1에 나타냈다. 모든 배지[Luria-Bertani(LB), 트립신 대두 배지(tryptic soy broth, TSB), 감자 포도당 배지(potato dextrose broth, PDB), 영양 국물배지(nutrient broth) 및 한천(agar)는 Becton Dickinson(Franklin Lakes, NJ, USA)에서 구입하였다. 박테리아 및 효모에 대한 CLSI(Clinical Laboratory Standards Institute)에 따라 최소 억제 농도(MIC)를 결정했다(표 1). 표 1은 본 발명에서 사용된 균주 및 배양 배지와 쏘팔메토 오일, 라우르산 및 미리스트산의 최소 억제 농도(MIC)를 나타낸 표이다.

분광 광도계 및 콜로니 계수에 의해 평가된 바와 같이, 최소 억제 농도(MIC)를 세포 성장을 80% 까지 억제한 최저 농도로 정의하였다. 최소한 3 개의 독립적인 배양을 통해 실험을 수행하였다. 4 가지 지방산, 즉 도데칸산(라우르산), 테트라데칸산(미리스트산), 헥사데칸산(팔미트산), 9-옥타데센산(올레산)과, 항생제, 즉 젠타마이신 및 암포테리신 B를 Sigma-Aldrich(St. Louis, USA) 또는 TCI Co. (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. DMSO (Dimethyl sulfoxide)를 사용하여 모든 지방산을 용해시키고 0.1 % (v/v) DMSO를 음성 대조군으로 사용하여 실험하였다. 참고로, 이 농도에서는 박테리아 성장이나 바이오필름 형성에 영향을 미치지 않았다.

실시예 2:　96-웰 플레이트에서 바이오필름 형성 분석(Biofilm assay)

다양한 미생물의 바이오필름 형성은 이전에 설명한 바와 같이 96-웰 폴리스티렌 플레이트에서 생성되었다. 간단히 말해서, 박테리아(bacteria)의 경우 OD 0.05 (~ 108 또는 107 CFU/ml)의 초기 탁도에서 밤새 배양하고, 칸디다균(Candida)의 경우 600 nm OD 0.1(~ 105 CFU/ml)의 초기 탁토에서 지방산을 포함하거나 포함하지 않은 상태의 최종 부피 300 μL의 적절한 배양배지에 접종하고, 37℃에서 흔들지 않고 24 시간 동안 배양하였다(표 1). 96-웰 플레이트(SPL Life Sciences, Pocheon, Korea)에 부착된 바이오필름 세포를 0.1% crystal violet Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)로 20 분간 염색하고, 멸균 증류수로 반복적으로 세척하고 95% 에탄올에 재현탁 시켰다. 570 nm에서 플레이트를 판독하였으며, 그 결과는 두 개의 독립적인 배양에서 최소 6 회 반복하여 수행되었다. 억제 비율의 백분율은 상대적인 바이오필름 값(화합물을 처리한 바이오필름/화합물을 처리하지 않은 대조군 x 100)으로 나타냈다.

실시예 3:　가스크로마토그래피/질량 분광법(GC-MS)

쏘팔메토 오일의 성분을 분리하고 실리카 모세관 컬럼(100mx 0.25 mm id., 필름 두께 0.25 mm)이 있는 Agilent 6890N GC 및 SP-2560(Supelco, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)을 사용하여 가스크로마토그래피/질량분광법(GC-MS)으로 분석하였다. 컬럼 온도 조건 및 지방산의 유도체화(메틸화)는 종래에 알려진 Front. Microbiol. 9, 1241 (2018)에 개시된 방법으로 진행하였다. 트리운데카노인 (C11: 0)을 내부 표준으로 사용하고 영역을 통합하고 지방산 메틸화를 보정하여 정량화를 수행했다. Supelco 37 성분 FAME Mix (Supelco)를 참조 표준으로 사용하였다.

실시예 4:　공초점 주사 레이저 현미경(CSLM) 및 주사전자현미경(SEM)을 이용한 바이오필름 형성 관찰

단일 종, 이중 종 또는 삼중 종 바이오필름은 37℃에서 24 시간 동안 교반없이 지방산이 있거나 없는 조건에서 96-웰 폴리스티렌 플레이트에 형성되었다. 플랑크톤 세포를 증류수로 세 번 세척하여 제거하고 단일 종 또는 이중 종 바이오필름을 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(Invitrogen, Molecular Probes, Inc, Eugene, USA)로 염색했다. 공초점 레이저 현미경(Nikon Eclipse Ti, Tokyo, Japan) 하에서 488 nm 아르곤(Ar) 레이저(방출 500 내지 550 nm)를 사용하여 플레이트베이스를 시각화 하였다. 2 개의 독립적인 배양이 각 실험 조건 하에서 수행되었고 적어도 10 개의 위치를 무작위로 분석하였다. 주사전자현미경(SEM) 검사법을 이용하여 나일론 막에서 여러 종의 바이오필름 형성 여부를 관찰하였다. 간단히 말하면, 나일론 막(Merck Millipore, Burlington, USA)을 0.5 x 0.5 cm 조각으로 자르고 지방산 유무에 관계없이 성장한 단일 종 또는 혼합 종을 포함하는 96-웰 플레이트에 놓고 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. C. albicans 바이오필름의 경우 PDB 배지가 사용되었으며, C. albicans 및 S. aureus의 이중 바이오필름의 경우 배지로 PDB 및 LB 배지가 1:1 혼합물이 사용되었다. C. albicans 및 E. coli O157:H7의 이중 바이오필름의 경우 배지로 PDB 및 LB 배지의 1:1 혼합물을 사용하거나 S. aureus, C. albicans 및 E. coli O157:H7의 삼중 바이오필름의 경우에는 PDB와 LB 배지의 1:2 혼합물을 사용하였다. 나일론막에 부착된 세포를 글루타르 알데히드(2.5%)와 포름알데히드(2%)로 24 시간 동안 고정한 다음 오스뮴을 사용하여 후고정하고 에탄올 시리즈(50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%) 및 이소 아밀 아세테이트를 사용하여 탈수시켰다. 임계점 건조 후, 15 kV의 전압에서 S-4100 주사전자현미경(SEM, Hitachi, Tokyo, Japan)을 사용하여 세포를 검사하고 이미지화 시켰다.

실시예 5: 정량적 실시간 PCR 분석(qRT-PCR)

S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans 세포를 사용하여 세 세트의 전 사체 분석을 수행하였다. S. aureus의 경우, 쏘팔메토 오일(100 μg/ml), 라우르산(20 μg/ml) 및 미리스트산(20 μg/ml)의 존재 또는 부재 하에서, S. aureus MSSA 6538 세포를 37℃, 250 ml 플라스크에 25 ml의 LB 배지에 접종하고, 0.05의 OD₆₀₀ 시작하여 6 시간 동안 진탕하면서 250 rpm으로 배양하였다. E. coli O157:H7의 경우, E. coli O157:H7 세포를 37℃, 250 ml 플라스크에 25 ml의 LB 배지에 접종한 다음, 쏘팔메토 오일(100 μg/ml), 라우르산(20 μg/ml) 및 미리스트산(20 μg/ml)의 존재 또는 부재 하에 250 rpm으로 진탕하면서 4 시간 동안 배양하였다. 그런 다음 RNase 억제제(RNAlater, Ambion, TX, USA)를 첨가하고 RNA 분해를 방지하기 위해 세포를 95% 에탄올이 있는 드라이아이스 배스(dry ice bath)에서 30 초 동안 즉시 냉각시켰다.

C. albicans의 경우, OD₆₀₀에서 0.1의 초기 탁도(~ 10⁵ CFU/ml)에서 25 ml의 C. albicans DAY185를 250ml의 PDB 배지에 접종하고, 쏘팔메토 오일(100 μg/ml), 라우르산(20 μg/ml) 및 미리스트산(20 μg/ml)의 존재 또는 부재 하에 교반(250 rpm)과 함께 37℃에서 6 시간 동안 배양하였다.

RNA 분해를 방지하기 위해 RNase 억제제(RNAlater, Ambion, TX, USA)를 세포에 첨가하고 세포를 즉시 억제제(RNAlater, Ambion, TX, USA)를 세포에 첨가하고 세포를 즉시 뜨거운 산성 페놀 방법을 사용하여 분리했다. RNA는 Qiagen RNeasy mini Kit (Valencia, USA)를 사용하여 정제되었다.

qRT-PCR을 이용하여 다양한 바이오필름 관련 유전자의 발현을 확인하였다: S. aureus의 경우 agrA, aur, hla, hld, icaA, sarA 및 sigB; E. coli O157:H7의 경우 csgA, csgB, fimH, flhD, luxR, luxS 및 motB; C. albicans의 경우 ALS1, ALS3, CDR1, CDR2, CHT4, CYR1, ECE1, ERG9, ERG10, HWP1, MTS1, RAS1, RBT5 및 UME6

표 2는 상기 qRT-PCR에 사용된 특정 프라이머를 나타낸 것이다. 3 개의 하우스 키핑 유전자, 16s rRNA, rrsG 또는 RDN18이 각각 사용되었으며 하우스 키핑 유전자의 발현은 지방산에 영향을 받지 않았다.

qRT-PCR 방법은 SYBR Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, USA)와 ABI StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems)을 사용하였으며, 적어도 두 개의 독립적인 배양을 하였다.

실시예 6: 세포 표면 친수성 분석(Cell-Surface Hydrophilicity Assay)

세포 표면 소수성을 분석하였다. 상세하게, 세포 배양물은 LB 배지에서 20 시간 배양한 후 7,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 37℃에서 250 rpm으로 흔들어 수확하였다. 수확한 세포를 헥사데칸(TCI chemicals, Tokyo, Japan)과 6:1의 비율로 90 초 동안 볼텍싱하여 혼합하였다. 상 분리를 가능하게하기 위해 혼합물을 실온에서 30 분 동안 두었다. 수성상 흡광도(Aqueous phase absorbance)를 OD₆₀₀에서 측정하였다. 각 재료 당 4 개의 독립적인 배양물이 사용되었다.

실시예 7: 칸디다균( C. albicans )의 균사(hyphae) 형성관찰

균사 형성을 관찰하기 위해, 현미경 이미징 시스템(microscopic imaging system)을 사용하였다. 간단히 말해서, 지방산(0, 10, 20 또는 100 μg/ml)이 있거나 없는 2 ml PDB 배지에 C. albicans DAY185 세포를 1:50 희석으로 재접종하고 흔들림 없이 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다.

배양 후 iRiS^TM Digital Cell Imaging System (Logos Bio Systems, Anyang, Korea)을 사용하여 세포를 혼합하고 시각화하였다. 최소한 4 개의 독립적인 배양물을 사용하였다.

실시예 8: 선충 모델(nematode model)에서 지방산의 항바이러스 및 세포 독성 분석

S. aureus, E. coli O157:H7 또는 C. albicans의 지방산에 대한 독성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 C. elegans 균주 fer-15 (b26); fem-1 (hc17)을 사용하였다. 간단히 말해서, S. aures 및 E. coli O157:H7 감염을 위해 M9를 포함하는 96-웰 플레이트, C. albicans 감염을 위해 PDB : M9 (20:80) 혼합물을 포함하는 96-웰 플레이트의 각 웰에 약 30 개의 선충을 넣었다. 또한, 처리되지 않은 대조군과 쏘팔메토 오일(20 또는 100 μg/ml), 라우르산(10 또는 20 μg/ml) 또는 미리스트산(10 또는 20 μg/ml) 처리된 S. aures, E. coli O157:H7 (각각 ~ 10⁸, 10⁷ CFUml^-1) 또는 C. albicans (~ 10⁵ CFU/ml)를 선충류를 포함하는 상기 웰에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 흔들지 않고 25℃에서 10 일 동안 배양하였다. 세포 독성 분석의 경우, 병원균(pathogens) 없이 최종 농도가 0, 10, 50, 100 또는 200 μg/ml인 M9 완충액 및 지방산(쏘팔메토 오일, 라우르산 또는 미리스트산)을 함유하는 96-웰 플레이트의 단일 웰에 30 개의 비감염 선충을 피펫팅 하였다.

이어서 플레이트를 흔들지 않고 25℃에서 4 일 동안 인큐베이션 하였다. 세 번의 독립적인 실험을 세 번 수행하였다. 결과는 백금 와이어 접촉에 대한 반응으로 결정된 살아있는 선충의 생존율을 백분율로 표시하였다. iRiS ™ 디지털 세포 이미징 시스템(Logos Bio Systems, Anyang, Korea)을 사용하여 관찰하였다.

실시예 9: 지방산(fatty acid)과 항생제(antimicrobial agents)의 병용 처리

S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans에 대해 지방산 및 항생제의 병요처리 효과를 분석하였다. 간단히, 600 nm에서 박테리아(bacteria)의 경우 OD 0.05 및 Candida의 경우 OD 0.1의 초기 탁도에서 밤새 배양을 적절한 배양 배지(최종 부피 1000 μl)에 항생제, 젠타마이신(10 μg/ml) 또는 암포테리신 B(0.5, 2, 5μg/ml) 및/또는 지방산 (소팔메토 오일 100 μg/ml, 라우르산(C12:0) 또는 미리스트산(C14:0)(20 μg/ml)과 함께 접종하였다.

세포를 37℃에서 진탕하면서 1 시간 동안 배양하였다. 세포 혼합물을 PBS에서 연속적으로 희석하고 적절한 배양 배지에 플레이팅했다. CFU는 37℃에서 24 시간 배양한 후 콜로니 계수에 의해 결정되었다. 두 개의 독립적인 배양을 적어도 세 번 반복 수행하였다.

실시예 10: 통계 분석

분석에 대한 복제 번호(Replication numbers)는 위에 제공되며 결과는 평균±표준편차(means ± SDs)로 나타냈다. 통계 분석을 단방향 ANOVA를 사용한 후 SPSS 버전 23 (SPSS Inc., Chicago, USA)을 사용한 Dunnett의 테스트를 사용하여 수행하였다. 0.05 미만의 P 값은 유의미한 것으로 간주되었으며, 별표는 처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플 간의 유의한 차이를 나타낸다.

실험예 1: 미생물의 바이오필름 형성을 억제 효과 확인

도 1에 나타낸 바와 같이, 11 개의 미생물에 대해 쏘팔메토 오일의 바이오필름 억제 효과를 먼저 조사하였다. 50 μg/ml 농도의 쏘팔메토 오일은 2 개의 메티실린 내성 균주를 포함하는 4 개의 S. aureus 균주, Staphylococcus epidermidis 균주, 2 개의 병원성 E. coli 균주, C. albicans 균주에 의한 바이오필름 형성을 크게 억제하였다. 반면에 A. baumannii 균주와 P. aeruginosa 균주에 의한 바이오필름 형성을 억제하지 못하였다(도 1a).

특히, 쏘팔메토 오일은 20 μg/ml에서도 85 % 이상의 C. albicans 균주에 의한 바이오필름 형성을 억제하였다. 아울러, GC-MS 분석 결과, 쏘팔메토 오일에서 25 개의 지방산을 확인했다(표 3). 쏘팔메토 오일의 주성분은 라우르산 (34.3 %), 미리스트산 (14.3%), 팔미트산 (9.6%), 올레산 (29.1%)이었다(도 1b). GC-MS 분석으로 확인된 쏘팔메토 오일의 성분은 종래의 연구 결과(Nutrients 5, 3617-3633 (2013) 및 J. Pharm. Pharmacol. 66, 811-822 (2014))와 일치한다.

4 가지 주요 지방산인 라우르산(C12:0), 미리스트산(C14:0), 팔미트산(C16:0) 및 올레산(C18:1)의 항균막 효능을 세 가지 균주(S. aureus, E. coli, 및 C. albicans.)에 대해 추가로 조사하였다. 라우르산과 미리스트산은 세 가지 미생물에 대해 가장 활동적인 것으로 보인다. 예를 들어, 20 μg/ml의 라우르산과 미리스트산은 5 개의 Staphylococcus, E. coli O157:H7 및 C. albicans 균주에 의한 생물막 형성을 50% 이상 억제하였다(도 1c 내지 도 1f). S. aureus 균주의 경우, 20 μg/ml 이상의 올레산도 바이오필름 형성을 현저하게 감소시켰지만, 팔미트산은 그렇지 않았다(도 1c). 그러나 팔미트산과 올레산은 E. coli O157:H7 및 C. albicans에 의한 바이오필름 형성을 변화시키지 않았다(도 1d 및 도 1e). 쏘팔메토 오일, 라우르산 및 미리스트산으로 관찰된 결과와 유사하게 5 μg/ml에서 대부분 C. albicans 바이오필름 생성을 억제하였다(도 1e). 라우르산과 미리스트산이 E. coli O157:H7에 대한 바이오필름 억제 활성을 나타냄을 확인하였다. 따라서 S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans에 대한 쏘팔메토 오일의 바이오필름 억제 활성은 주로 라우르산과 미리스트산에 기인한 것으로 확인할 수 있었다.

한편, 쏘팔메토 오일과 11 개의 미생물에 대한 2 개의 활성 지방산의 최소 억제 농도(MIC)는 > 500 μg/ml인 것으로 확인되는데(표 1), 이러한 결과는 쏘팔메토 오일, 라우르산 및 미리스트산이 플랑크톤 세포 성장에 영향을 미치지 않으면서 미생물 바이오필름 형성을 억제했으며, 기존의 항생제와 달리 이러한 지방산이 약물 내성 발생에 덜 취약할 수 있음을 시사한다.

96-웰 플레이트 바닥의 바이오필름 억제 여부는 공초점 레이저 현미경(CSLM)으로 분석하였다. 삼종의 미생물이 처리되지 않은 대조군에서 삼종의 미생물이 조밀한 바이오필름(두께 > 40 μm, 및 거의 100% 표면 덮음)을 형성하는 동안 100μg/ml의 쏘팔메토 오일 처리군에서는 바이오필름의 밀도와 두께를 유의적으로 감소시켰다(도 1g). 또한 라우르산과 미리스트산 모두 20 μg/ml 농도에서 S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans의 바이오필름 형성을 유의하게 억제시켰다.

실험예 2: 쏘팔메토 오일 및 주요 지방산의 다중 미생물( S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans )의 바이오필름 억제 활성 확인

S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans의 이중 종(dual species), 삼중 종(three species) 균주의 바이오필름 형성과 관련하여 쏘팔메토 오일과 지방산의 바이오필름 억제 효능을 확인하였다. 상세하게, 본 발명자들은 이중 종(dual species) 균주에 대해 총 3 세트와 삼종 균주에 대해 1 세트에 대해 바이오필름 형성하기 위한 적절한 배지와 접종물을 먼저 찾았다. 예를 들면, S. aureus 및 E. coli O157:H7의 경우 LB 배지를, S. aureus 및 C. albicans; E. coli O157:H7 및 C. albicans;의 경우 PDB 및 LB의 1:1 혼합물을, S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans인 삼종의 경우 PDB와 LB의 1:2 혼합물을 배지로 사용하였다.

이중 종(dual species) 균주(S. aureus 및 E. coli O157:H7, S. aureus 및 C. albicans, E. coli O157:H7 및 C. albicans) 또는 삼종 균주(S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans)의 처리군에서는 4 가지 경우 모두에서 적절한 바이오필름이 형성(OD₅₇₀에서 1 ~ 2) 됨을 확인할 수 있었다(도 2a 내지 도 2d). 라우르산과 미리스트산은 이중 종(dual species) 또는 삼중 종(three species)에 대해 바이오필름 형성을 농도 의존적으로 억제하였다(도 2a 내지 도 2d). 특히 라우르산과 미리스트산은 10 μg/ml 농도에서 24 시간 동안 배양한 후 상기 삼종 균주에 대해 바이오필름 형성을 90% 정도 억제하였다.

한편, 단일 균주에 대한 바이오필름과 유사하게 쏘팔메토 오일과 두개의 지방산인 라우르산과 미리스트산은 C. albicans를 포함한 다종 생물막을 가장 현저하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 2b 내지 도 2d).

또한, 공초점 레이저 현미경(CLSM) 관찰을 통해, 쏘팔메토 오일 또는 20 μg/ml 농도의 라우르산과 미리스트산이 96-웰 플레이트 바닥에서 삼중 종(three species)의 생물막 형성을 크게 감소시켰음을 확인할 수 있었다(도 2e). 또한, 주사전자현미경(SEM) 관찰을 통해, 삼중 종(three species)의 바이오필름 형성에 대한 쏘팔메토 오일, 라우르산 또는 미리스트산의 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 2f).

본 발명자들은 처리되지 않은 대조군에서 S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans의 다중 미생물과의 연관성을 관찰하였다. C. albicans는 둥근 형태의 S. aureus 세포와 막대 형태의 E. coli O157:H7 세포보다 훨씬 큰 균사와 몇 개의 효모 세포를 형성한 것으로 보인다. 특히, 쏘팔메토 오일, 라우르산 또는 미리스트산은 C. albicans와 S. aureus 및 E. coli O157:H7 세포의 균사 형성을 분명히 감소시켰음을 알 수 있었다.

실험예 3: 쏘팔메토 오일, 라우르산 및 미리스트산에 의해 유도된 차등 유전자 발현(Differential gene expressions)

쏘팔메토 오일, 라우르산 및 미리스트산에 의한 바이오필름 형성 억제를 담당하는 분자를을 조사하기 위해, 다양한 바이오필름 관련 유전자를 가진 상기 세가지 미생물에 대해 qRT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, S. aureus 균주에서 미리스트산이 아닌 쏘팔메토 오일과 라우르산은 alpha-hemolysin hla 유전자의 발현을 각각 20 배 및 32 배 감소시켰으며, delta-hemolysin (hld, 또한 RNAIII로 알려짐) agrA, aur, icaA 및 sigB와 같은 다른 유전자에는 영향을 받지 않았다(도 3a). 한편, hld (RNAIII)가 hla 번역을 자극한다고 알려져 있다. hla는 주요 세포 독성 물질이며 S. aureus의 바이오필름 형성과 연관되어 있고, 이는 지방산에 의한 hla 및 hld의 억제 결과에 의해 뒷받침 된다(도 3a). 따라서 hla 억제는 부분적으로 쏘팔메토 오일과 라우르산에 의한 hld의 하향 조절 때문인 것으로, 흥미롭게도 쏘팔메토 오일과 라우르산은 S. aureus의 바이오필름의 양성 조절제(positive regulator)인 sarA를 상향 조절하였다. 또한 두 개의 오메가 지방산이 hla 및 hld20의 발현을 억제한다고 알려져 있는데, 라우르산 및 기타 오메가 지방산은 hla 및 hld 유전자 발현을 하향 조절하기 때문에 바이오필름 형성을 억제하는 것으로 판단된다.

또한, E. coli O157:H7 균주에서 쏘팔메토 오일 보다 라우르산과 미리스트산이 바이오필름 관련 유전자 발현에 미치는 영향이 더 유의적임을 확인할 수 있었다. 특히 라우르산과 미리스트산은 두 개의 핌브리아(fimbriae) 유전자(csgAB), 세 개의 운동성 유전자(fimH, flhD 및 motB), 두 개의 쿼럼 센싱 유전자(luxR 및 luxS)의 발현을 억제하였다(도 3b).

C. albicans 균주에서 쏘팔메토 오일과 라우르산 모두 균사 발달에 필수적인 HWP1 유전자 의 발현을 억제했으며 이들의 발현은 세포 신장 및 생물막 형성과 상관 관계가 있는 것으로 나타났다(도 3c).

또한, 특히 쏘팔메토 오일과 두 가지 지방산은 키티나아제(chitinase)를 암호화하는 CHT4의 발현이 유도하였다. CHT4 전사는 효모에서 균사로 전환할 때 감소했다고 알려져 있으며, 이는 쏘팔메토 오일과 두 개의 지방산이 균사 형성을 억제할 수 있음을 시사한다. 또한 최근에는 중쇄 지방산이 쿼럼 센싱 분자인 파르네솔(farnesol)을 모방하여 HWP1 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있는바, 본 결과는 바이오필름 형성(도 1e)과 균사 형성(도 2f)의 감소에 대한 가설을 부분적으로 뒷받침한다.

실험예 4: S. aureus의 소수성 변화 및 지방산에 의한 C. albicans의 균사 억제 효과 확인

소수성 세포가 소수성 표면에 더 많이 부착되기 때문에 세포 표면의 소수성과 바이오필름 형성은 여러 박테리아에서 밀접하게 연결되어 있다. 따라서 세포 표면의 소수성을 세 균주의 지방산 존재 하에서 측정하였다(도 3d-f). 흥미롭게도 쏘팔메토 오일, 라우르산, 미리스트산은 친수성을 증가시켰는데, 이는 S. aureus에서 세포가 덜 소수성이면서 E. coli O157:H7 또는 C. albicans 에서 친수성을 변경하지 않았음을 의미한다(도 3e 및 도 3f). 이러한 결과는 소수성인 폴리스티렌 표면이 지방산에 의한 S. aureus에 의한 바이오필름 형성의 억제를 부분적으로 설명할 수 있다. 효모에서 균사로의 전이는 C. albicans에 의한 바이오필름 개발의 전제 조건으로 알려져 있기 때문에 균사 형성에 대한 지방산의 효과가 관찰되었다. 쏘팔메토 오일, 라우르산, 미리스트산은 균사 전이를 실질적으로 억제한 반면, 처리되지 않은 대조군 세포는 주로 균사 세포였다(도 3g).

이러한 결과는 라우르산과 미리스트산이 균사 형성(hypha formation)을 강력하게 억제하고 C. albicans에 의한 바이오필름 형성을 감소시키고 심지어 C. albicans를 포함하는 다종 생물막 형성을 감소시킨다는 것을 뒷받침한다.

실험예 5: 선충 모델에서 항병원성(Anti-virulence activities) 활성 확인

바이오필름 또는 생물막 형성과 세포 접착은 동물 숙주의 주요 독성 인자이다. Caenorhabditis elegans 모델은 생물학, 특히 세균 감염 분야의 다양한 연구에서 동물 모델(animal hosts)의 사용에 대한 대안으로 이용된다. S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans와 같은 병원성 미생물은 선충류를 죽일 수 있다. C. elegans는 충의 일반적인 먹이 공급원인 E. coli OP50와 함께 잘 살아남았다. 반면에, C. elegans의 수명은 각 병원균의 존재 하에 크게 감소한다. 도 4의 결과를 통해, 쏘팔메토 오일, 라우르산, 미리스트산은 S. aureus(도 4a), E. coli O157:H7(도 4b) 또는 C. albicans(도 4c)의 존재 하에서 C. elegans 생존을 현저하게 연장하는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 선충류 생존율은 10 일 동안 병원균 없이 거의 100% 였지만, 100 μg/ml의 쏘팔메토 오일 또는 20 μg/ml의 미리스트산이 있는 경우 선충류의 55% 이상이 생존하였다. 이러한 결과는 관찰된 바이오필름 형성의 하향 조절(도 1) 및 헤모리신 유전자의 억제(도 3a) 결과와 일치한다.

또한 쏘팔메토 오일, 라우르산, 미리스트산의 세포 독성을 알아보기 위해 E. coli OP50만 먹이고 병원균 없이 C. elegans 생존율을 조사하였다.

감염되지 않은 선충류를 최대 200 μg/ml 농도의 쏘팔메토 오일에 노출시켰을 때 독성 효과가 관찰되지 않았고, 100 μg/ml 또는 200 μg/ml의 라우르산과 미리스트산은 선충류에 대한 마일드한 역가(titer)를 나타냈다(도 4d). 그러나 라우르산과 미리스트산은 세포 독성 수준보다 훨씬 낮은 10 μg/ml 또는 20 μg/ml의 농도에서 항바이오필름 활성(antibiofilm activity)을 나타냈다.

따라서, 본 발명에 따른 바이오필름 형성 억제 조성물은 최소한의 세포 독성으로 항병원성(Anti-virulence activities) 활성 효과를 갖음을 확인할 수 있었다.

실험예 6: 지방산과 항생제(antimicrobial agents)의 병용처리 시의 효과

종래에는 항균 효능을 향상시키기 위한 병용처리법이 제안되었기 때문에, 미생물 성장에 대한 지방산과 항생제(antimicrobial agents)의 병용(combinatory efficacies)이 개별 미생물에 대해 조사하였다. 먼저 항생제(antibiotic agent)인 젠타마이신(gentamicin) 10 μg/ml를 단독으로 사용하여 S. aureus 또는 E. coli O157:H7에 대해 테스트하였고, 항진균제(antifungal agent)인 암포테리신 B 0.5, 2 또는 5μg/ml를 단독으로 사용하여 C. albicans에 대해 테스트 하였다.

예상한 대로 아미노글리코사이드 젠타마이신(aminoglycoside gentamicin)은 1 시간 내에 두 박테리아의 90% 이상을 부분적으로 죽였음을 확인할 수 있었다(도 4e 및 도 4f). 또한 2 μg/ml 이상의 암포테리신 B는 C. albicans 성장을 거의 억제하였다(도 4g).

다음으로, 지방산과 항생제(antimicrobial agents)의 병용이 세 가지 개별 미생물에 미치는 영향을 확인하였다. 20 μg/ml 라우르산(C12:0) 또는 20 μg/ml 미리스트산(C14:0)을 첨가하면, S. aureus(도 4e)와 E. coli O157:H7(도 4f)의 생존율이 훨씬 낮아졌다. 20 μg/ml 라우르산 또는 20 μg/ml 미리스트산의 경우 단독 처리 시 세포 성장에 전혀 영향을 미치지는 않았다(MICs > 500 μg/ml). 젠타마이신의 항균 효능은 라우르산 또는 미리스트산의 존재 하에서 현저하게 향상되었다. 반면에 쏘팔메토 오일은 100 μg/ml 농도에서 항생제 효능에 미미한 효과(marginal effect)를 나타냈다. 한편, C. albicans의 경우, 쏘팔메토 오일, 라우르산, 또는 미리스트산의 첨가는 C. albicans의 생존율을 크게 증가시켜 예상치 못한 결과를 얻었다(도 4g). 이러한 결과를 통해, 라우르산 또는 미리스트산을 항생제인 젠타마이신(gentamicin)와 병용처리 시 S. aureus 과 E.coli O157:H7에 대해 상승적인 항균 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

종합하여 보건데, 본 발명에서는 쏘팔메토 오일와 이의 풍부한 라우르산과 미리스트산이 S. aureus, E. coli O157:H7 및 C. albicans의 단일 종, 이중 종 및 삼종 종 병원성 미생물에 대한 바이오필름 형성을 억제할 수 있음을 밝혔으며, 이는 플랑크톤 세포 성장(planktonic cell growth)에 영향을 주지 않았다. 아울러, 라우르산 또는 미리스트산을 항생제인 젠타마이신와 병용처리하여 S. aureus, E.coli O157:H7에 대해 상승적인 항균 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 바이오필름 형성 억제용 조성물은 다중 병원성 미생물의 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 치료용 조성물, 항균용 조성물 및 병원성 미생물 바이오필름 형성을 억제하기 위한 코팅용 조성물로 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

쏘팔메토 오일(saw palmetto oil), 이의 불포화 지방산인 라우르산(lauric acid), 및 미리스트산(myristic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 다중 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 병원성 미생물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 병원성대장균(E. coli O157:H7), 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 다중 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 이중 종 바이오필름(dual species biofilm) 또는 삼중 종 바이오필름(three species biofilm) 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 다중 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 이중 종 바이오필름(dual species biofilm)은 황색포도상구균Staphylococcus aureus) 및 병원성대장균(E. coli O157:H7); 또는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans); 또는 병원성대장균(E. coli O157:H7) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans);에서 선택된 미생물의 바이오필름을 억제하는 것을 특징으로 하는 다중 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 삼중 종 바이오필름(three species biofilm)은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 병원성대장균(E. coli O157:H7) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 바이오필름을 억제하는 것을 특징으로 하는 다중 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 hla 및 hld 발현 억제하고, 병원성대장균(E. coli O157:H7)에서 핌브리아(fimbriae) 유전자인 csgAB; 운동성 유전자인 fimH, flhD 및 motB; 및 쿼럼 센싱(quorum sensing) 유전자인 luxR 및 luxS를 억제하고, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에서 세포벽 유전자인 HWP1를 억제하여 바이오필름의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 다중 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 불포화 지방산은 균사 형성(hypha formation) 및 바이오필름 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 다중 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 항생제 또는 항진균제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 항생제는 젠타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 테트라사이클린(tetracycline) 메티실린(methicillin), 반코마이신(vancomycin), 세팔로스포린(cephalosporin) 및 리팜피신 (rifampicin)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 다중 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 항진균제는 암포테리신 B, 테르비나핀(terbinafine), 플루코나졸(fluconazole), 케토코나졸(ketoconazole), 이트라코나졸(intraconazole)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 다중 병원성 미생물 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제 1 항 내지 제 10 항 중에서 선택한 어느 한 항의 조성물; 및 항생제 또는 항진균제;를 생물체 또는 비생물체의 표면에 병용처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 병원성 미생물 바이오필름 형성 억제 방법.
쏘팔메토 오일(saw palmetto oil), 이의 불포화 지방산인 라우르산(lauric acid), 및 미리스트산(myristic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 다중 병원성 미생물 바이오필름 형성을 억제하기 위한 코팅용 조성물.
(a) 불포화 지방산으로서 라우르산(lauric acid) 또는 미리스트산(myristic acid); 및 (b) 항생제 또는 항진균제;를 유효성분으로 함유하는 항균성 조성물.
제 13 항에 있어서,
상기 조성물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 또는 병원성대장균(E. coli O157:H7)에 대한 항균 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.