KR20220128724A - 스핑고신 인산화효소의 검출용 화합물, 형광 프로브 및 이의 용도 - Google Patents

스핑고신 인산화효소의 검출용 화합물, 형광 프로브 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물, 이의 제조 방법, 상기 화합물을 함유하는 스핑고신 인산화효소(sphingosine kinase) 검출용 형광 프로브, 상기 형광 프로브를 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 스핑고신 인산화효소의 검출 방법, 및 상기 형광 프로브를 스핑고신 인산화효소의 저해제 후보물질 및 스핑고신 인산화효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, 스핑고신 인산화효소 저해제의 스크리닝 방법이 제공된다:
[화학식 1]
Figure pat00069

화학식 1에 있어서, L1 은 단일 결합, 또는 탄소수 1 내지 5의 알킬기를 나타내고,R1 및 R2 는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 5의 알킬기를 나타내고, x는 1 내지 10의 정수이다.

Description

스핑고신 인산화효소의 검출용 화합물, 형광 프로브 및 이의 용도 {Compounds for the detection of sphingosine kinase, Fluorescent Probes, and Uses thereof}
본 발명은 스핑고신 인산화효소(sphingosine kinase)의 검출에 사용될 수 있는 화합물, 이의 제조 방법, 이를 함유하는 형광 프로브, 상기 형광 프로브를 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 스핑고신 인산화효소의 검출 방법, 및 상기 형광 프로브를 스핑고신 인산화효소의 저해제 후보물질 및 스핑고신 인산화효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, 스핑고신 인산화효소 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
스핑고지질(sphingolipids)은 인지질과 함께 세포막을 구성하는 주요 물질로서, 세포의 성장, 분화, 사멸 등의 생명 현상을 조절하는 물질이다. 이러한 과정은 세포가 외부 자극을 받아 생체막의 스핑고미엘린(SM)이 분해되어 진행되는데, 스핑고미엘린의 분해물인 세라마이드, 스핑고신(sphingosine), 스핑고신-1-포스페이스(sphingosine-1-phosphate, S1P)는 세포 내 2차 신호 전달자로서 작용한다. 또한, 스핑고신 인산화효소 (sphingosine kinase, SphK)는 스핑고신을 인산화시켜 스핑고신-1-포스페이트로 전환시키는 효소로서, 세포의 생존과 분열 등에 중요한 역할을 한다. 스핑고신 인산화효소의 저해제는 항암제로 개발 중에 있다.
기존의 스핑고신 인산화효소의 활성 측정 방법은 주로 방사성 동위원소 표지법, 크로마토그라피 등에 의존하였다. 그러나, 이러한 측정법은 인산화된 산물인 S1P 또는 그 유도체를 크로마토그라피로 분리한 후 방사성 동위원소 또는 형광을 이용하여 정량하는 것으로서, S1P 등을 분리하기 위한 크로마토그라피 과정에 시간이 많이 소요되고 방사성 동위원소 실험은 비용이 비쌀 뿐만 아니라 실험 조건이 복잡하고 효율도 낮다는 단점이 있었다. 이에 따라 항암제 후보물질로서 스핑고신 인산화효소 저해제 후보물질을 빠르게 테스트하기 위한 고속 스크리닝에 적용할 수 없었다.
본 발명의 일 목적은 스핑고신 인산화효소(sphingosine kinase)의 검출에 사용될 수 있는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상기 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 일 목적은 스핑고신 인산화효소를 검출하기 위한 형광 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 일 목적은 스핑고신 인산화효소를 검출하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 일 목적은 스핑고신 인산화효소 저해제를 스크리닝하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물이 제공된다:
[화학식 1]
Figure pat00001
화학식 1에 있어서, L1 은 단일 결합, 또는 탄소수 1 내지 5의 알킬기를 나타내고, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 5의 알킬기를 나타내고, x는 1 내지 10의 정수이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서 L1 은 단일 결합이고, x 는 3 내지 9의 정수일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 7로 표시될 수 있다:
[화학식 7]
Figure pat00002
화학식 7에서, x는 상기 화학식 1 에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 전술한 화학식 1의 화합물을 함유하는 스핑고신 인산화효소(sphingosine kinase) 검출용 형광 프로브가 제공된다.
본 발명의 또다른 일 양태에 따르면, 전술한 형광 프로브를 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 스핑고신 인산화효소의 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 스핑고신 인산화효소의 검출 방법은 시료와 형광 프로브의 혼합물에 Mg2+을 포함하는 염을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 스핑고신 인산화효소의 검출 방법은 시료에서의 형광 켜짐 또는 형광 변화를 관찰 또는 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 일 양태에 따르면, 전술한 형광 프로브를 스핑고신 인산화효소의 저해제 후보물질 및 스핑고신 인산화효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, 스핑고신 인산화효소 저해제의 스크리닝 방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 일 양태에 따르면, (a) 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 올레핀 교차 복분해 반응(olefin cross metathesis)을 통해 반응시켜 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;
(b) 화학식 4로 표시되는 화합물과 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 알킬화 반응을 통해 반응시켜 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및
(c) 화학식 6으로 표시되는 화합물에서 보호기를 탈보호하여 제1항에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법이 제공된다:
[화학식 2]
Figure pat00003
[화학식 3]
Figure pat00004
[화학식 4]
Figure pat00005
[화학식 5]
Figure pat00006
[화학식 6]
Figure pat00007
상기 화학식 2 내지 6에서, x, L1, R1, 및 R2 는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같고, PT1 및 PT2는 보호기이다.
본 발명에 따른 화합물은 BSA나 Triton X-100 과 같은 첨가제가 없어도 그 자체로 물에 대한 용해도가 양호하여 용액 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에서는 방사성 동위원소를 사용하거나 인산화된 산물인 S1P를 분리하여 정량하는 것이 아니라, chelation-enhanced fluorescence (CHEF) 효과를 이용하여, 용액 상에서 형광 측정만으로 인산화반응의 정도를 간단하고 쉽게 측정할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 형광의 세기는 스핑고신 인산화효소와의 반응에 의해 인산화된 화합물의 양에 비례한다. 따라서, 본 발명의 화합물을 용액 중에서 시료와 접촉시킴으로써 스핑고신 인산화효소를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 다량의 샘플을 동시에 측정할 수 있으므로 고속 스크리닝에도 적용이 가능하다.
도 1에서 A는 본 발명에 따라 제조된 화합물(Sox-Sph) 및 이의 인산화된 화합물(Sox-S1P)의, 파장에 따른 형광 강도 그래프를 나타내고, B 는 Mg2+ 의 농도 20 mM 및 50 mM 에서 Sox-Sph (오른쪽)와 Sox-S1P (왼쪽) 용액의 발광을 나타내는 사진이다.
도 2에서 A는 화학식 1에서 x = 3, 5, 또는 7 인 경우의 화합물 및 이의 인산화된 화합물을 제조하고, 각 화합물의 형광 강도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, B 는 x = 5 인 화합물 Sox-Sph 및 이의 인산화된 화합물 Sox-S1P 을 사용하여 Mg2+ 농도에 따른 형광 강도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험예 3의 스핑고신 인산화효소 1 (SphK1)을 사용한 in vitro 인산화 검정에서 인산화 반응을 모니터링하기 위하여 측정한 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 SphK1의 첨가 전/후의 형광 강도를 알킬 링커 그룹의 길이 (x = 3, 5, 7, 9)에 따라 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 화합물을 사용한 인산화 검정에서 SphK1의 농도 및 시간에 따른 형광 강도의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6에서 A는 96웰 플레이트에서 각 웰의 샘플에 본 발명에 따른 화합물을 사용하여 스핑고신 인산화효소의 저해제(inhibitor) 후보물질을 스크리닝하는 예를 개략적으로 나타낸 것이며, B 는 본 발명에 따른 화합물을 사용하여 세포 이미징(imaging)하는 예를 시뮬레이션 결과로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다, “함유”한다, “가지다”라고 할 때, 이는 특별히 달리 정의되지 않는 한, 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물이 제공된다:
[화학식 1]
Figure pat00008
화학식 1에서, L1 은 단일 결합, 또는 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 구체적으로는 단일 결합, 또는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, 더 구체적으로는 단일 결합을 나타내고, 여기서 알킬기는 직쇄형 또는 분지형 알킬기를 포함한다.
화학식 1에서, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 구체적으로는 탄소수 1 내지 3의 알킬기를 나타내고, 여기서 알킬기는 직쇄형 또는 분지형 알킬기를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, R1 및 R2 는 서로 동일할 수 있다.
화학식 1에서, x는 1 내지 10의 정수, 구체적으로는 3 내지 9의 정수이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 7로 표시될 수 있다:
[화학식 7]
Figure pat00009
화학식 7에서, x는 상기 화학식 1 에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 전술한 본 발명의 화학식 1의 화합물을 함유하는 스핑고신 인산화효소(sphingosine kinase) 검출용 형광 프로브가 제공된다. 구체적으로 상기 형광 프로브는 본 발명의 화합물을 용매 또는 적절한 완충액 중에 함유하는 것일 수 있다. 또한, 구체적으로, 상기 화학식 1의 화합물은 상기 화학식 7로 표시되는 것일 수 있다. 상기 형광 프로브에서 상기 화합물은 스핑고신 인산화효소와 반응하여 인산화됨으로서 형광 켜짐 현상을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 일 양태에 따르면, 전술한 형광 프로브를 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 스핑고신 인산화효소의 검출 방법이 제공된다. 상기 검출 방법은 상기 형광 프로브와 시료를 접촉시켜 혼합물을 제조한 후, 상기 에 Mg2+을 포함하는 염을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서 상기 시료는 목적하는 스핑고신 인산화효소 여부의 검출이 필요한 물질을 함유하는 것이다. 또한, 상기 Mg2+을 포함하는 염은 형광 프로브와 시료의 혼합물 중에서 Mg2+을 내어줄 수 있는 물질이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 MgCl2 또는 ATP-Mg2+일 수 있다. 또한, 상기 스핑고신 인산화효소의 검출 방법은 시료에서의 형광 켜짐 또는 형광 변화를 관찰 또는 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서 형광 변화는 형광 세기의 증가 또는 감소를 의미한다. 형광 켜짐 또는 형광 강도의 증가가 관찰되거나 측정된 경우, 이는 스핑고신 인산화효소가 검출된다는 의미일 수 있다. 또한, 형광 강도는 스핑고신 인산화효소의 양에 비례하므로, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 스핑고신 인산화효소의 검출은 정량적 검출일 수 있다.
본 발명의 또다른 일 양태에 따르면, 전술한 형광 프로브를 스핑고신 인산화효소의 저해제 후보물질 및 스핑고신 인산화효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, 스핑고신 인산화효소 저해제의 스크리닝 방법이 제공된다. 여기서 상기 스크리닝 방법은 실시간 스크리닝 방법일 수 있다. 본 발명의 상기 스크리닝 방법은 상기 스핑고신 인산화효소의 저해제 후보물질과 상기 스핑고신 인산화효소를 먼저 접촉시킨 후, 상기 형광 프로브를 접촉시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 스크리닝 방법은 상기 접촉후 형광 켜짐 또는 형광 변화를 관찰 또는 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이 형광 강도는 스핑고신 인산화효소의 양에 비례하므로, 만약 후보물질이 스핑고신 인산화효소를 저해했다면 형광 켜짐이 발생하지 않거나 형광 강도가 감소하였을 수 있다. 이와 반대로 만약에 형광 강도가 증가하였을 경우에는 상기 후보물질은 스핑고신 인산화효소의 저해제이기 보다는 활성화제(activator)일 수 있다.
본 발명의 또다른 일 양태에 따르면, (a) 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 올레핀 교차 복분해 반응(olefin cross metathesis)을 통해 반응시켜 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; (b) 화학식 4로 표시되는 화합물과 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 알킬화 반응을 통해 반응시켜 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및 (c) 화학식 6으로 표시되는 화합물에서 보호기를 탈보호하여 제1항에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법이 제공된다:
[화학식 2]
Figure pat00010
[화학식 3]
Figure pat00011
[화학식 4]
Figure pat00012
[화학식 5]
Figure pat00013
[화학식 6]
Figure pat00014
상기 화학식 2 내지 6에서, x, L1, R1, 및 R2 는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같고, PT1 및 PT2는 보호기이다. 여기서 상기 PT1 및 PT2는 목적하는 작용 기를 충분히 보호할 수 있다면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 화합물의 제조 방법에 대한 일 구현예를, 하기 반응식 1을 참조하여 좀 더 구체적으로 설명한다.
[반응식 1]
Figure pat00015
본 발명에 따른 화합물의 제조 방법은 화학식 2로 표시되는 화합물 (이하, "알킬 링커 그룹"이라고도 함) 및 화학식 3으로 표시되는 화합물 (이하, "헤드 그룹"이라고도 함)을 각각 제조한 후, (a) 화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 올레핀 교차 복분해 반응(olefin cross metathesis)을 통해 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; (b) 화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 5로 표시되는 화합물을 알킬화 반응응ㄹ 통해 반응시켜 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및 (c) 화학식 6으로 표시되는 화합물에서 보호기를 탈보호하여 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함한다.
여기서 상기 단계 (a)는 2nd generation Grubbs catalyst을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 단계 (b)는 염기(basic) 조건 하에 수행될 수 있다. 또한, 상기 (c) 단계는 강산 하에 수행될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 참고하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[제조예 1] 화학식 3의 화합물의 제조
제조예 1-(1): tert-부틸 (S)-(3-히드록시-1-(메톡시(메틸)아미노)-1-옥소프로판-2-일)카바메이트 (화합물 S1-2)의 제조
Figure pat00016
디옥산(60 mL)과 물(60 mL) 중의 L-세린(serine)(10 g, 95.16 mmol) 용액에 트리에틸아민 (66.50 mL, 475.80 mmol) 및 디-tert-부틸디카보네이트 (24.92 g, 114.19 mol)을 0℃에서 첨가하였다. 이렇게 생성된 혼합물을 3 시간 동안 실온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 헥산으로 세척하였다. 그 후, 수층에 12N HCl을 첨가하여 pH 1.15로 조정하고, 이렇게 생성된 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 합하고 염수로 세척한 후, MgSO4 로 건조하고, 여과 및 진공 농축하여 무색 오일로서 조(crude) Boc-L-세린을 얻었다. CH2Cl2 (10 mL) 중 Boc-L-세린 (1 g, 4.87 mmol) 용액에 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (522.90 mg, 5.36 mmol) 및 N-메틸모르포린 (542.16 mg, 5.36 mmol)을 -15℃에서 첨가하였다. 그 후, 혼합물에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 히드로클로라이드 (36.48 g, 209.3 mmol)을 동일 온도에서 30분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 동일 온도에서 1 시간 동안 교반한 후, 얼음과 1N-HCl을 첨가하고, 혼합물을 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 합하고, 염수로 세척한 후, MgSO4 로 건조하고, 여과 및 진공 농축하여 무색 고체로서 조(crude) Weinreb 아미드 (화합물 S1-1)을 얻었다. DMF (10 mL) 중의 Weinreb 아미드 (0.94 g, 3.79 mmol)의 용액에 이미다졸 (303 mg, 4.54 mmol) 및 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (599 mg, 3.98 mmol)를 0°C에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 동일 온도에서 10분 동안 교반한 후, 얼음을 첨가하고, 생성된 혼합물을 디에틸 에테르로 추출하였다. 유기층을 합하고, 염수로 세척한 후, MgSO4 로 건조하고, 여과 및 진공 농축하여 무색 오일로서 조 화합물 S1-2 (29.221 g, 93% for 3 steps)을 얻었다.
Figure pat00017
제조예 1-(2): 1-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-(2S)-(N-tert-부틸옥시카보닐)아미노-3-옥소-4-펜텐 (화합물 S1-3)의 제조
Figure pat00018
THF (5 mL) 중 화합물 S1-2 (120 mg, 0.66 mmol)의 용액에 THF (2.64 mL) 중 1M 비닐 마그네슘 브로마이드 (약 2.64 mmol)의 용액을 -15°C에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 동일 온도에서 3 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물에 2N HCl을 부었다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 합하고, 염수로 세척한 후, MgSO4 로 건조하고, 여과 및 진공 농축하여 조 생성물을 얻었다. 실리카겔 상에서 칼럼 크로마토그래피 (헥산 중 5%에서 10% 에틸 아세테이트)를 하여 연노란색 오일로서 화합물 S1-3 (217.48 mg, 81%)을 얻었다.
Figure pat00019
제조예 1-(3): 1-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-(2S)-(N-tert- 부틸옥시카보닐)아미노 -4-펜텐-(3R)-올 (화합물 S1-4)의 제조
Figure pat00020
에탄올 (2 mL) 중 화합물 S1-3 (30 mg, 0.091 mmol)의 용액에 리튬 트리-tert-부톡시알루미노히드리드 (LiAl(O-tBu)3H) (46 mg, 0.18 mmol)을 -78°C에서 첨가하였다. 혼합물을 동일 온도에서 15분 동안 교반한 후, 1N HCl을 첨가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 합하고, 염수로 세척한 후, MgSO4 로 건조하고, 여과 및 진공 농축하여 조 생성물을 얻었다. 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피 (헥산 중 10%에서 33%의 에틸 아세테이트)를 하여 무색 오일로서 화합물 S1-4 (29 mg, 96%)을 얻었다.
Figure pat00021
제조예 1-(4): (2S)-(N-tert-부틸옥시카보닐)아미노-4-펜텐- 1,(3R)-디올 (화합물 S1-5)의 제조
Figure pat00022
메탄올 (1mL) 중 화합물 S1-4 (29.0 g, 0.088 mmol)의 용액에 1N HCl을 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 동일 온도에서 15 분 동안 교반한 후, 염수를 첨가하고, 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 합하고, 염수로 세척한 후, MgSO4 로 건조하고, 여과 및 진공 농축하여 조 생성물을 얻었다. 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피 (헥산 중 33%에서 67%의 에틸 아세테이트)를 하여 무색 고체로서 화합물 S1-5 (17.2 mg, 90%)을 얻었다.
Figure pat00023
제조예 1-(5): 디메틸 (2S)-N-(tert-부틸옥시카보닐아미노)-(3R)- 히드록시-4-펜테닐포스페이트 (화합물 S1-6)의 제조
Figure pat00024
피리딘 (0.9 mL) 중 분자체 4Å (20 mg), CBr4 (183 mg, 0.55 mmol)의 혼합물에 트리메틸포스파이트 (0.075 mL, 0.55 mmol) 및 화합물 S1-5 (0.100 g, 0.46 mmol)을 -15℃에서 첨가하였다. 그 후, 반응 혼합물을 실온으로 천천히 가온한 후, 2N HCl을 첨가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 합하고, 염수로 세척한 후, MgSO4 로 건조하고, 여과 및 진공 농축하여 조 생성물을 얻었다. 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피 (클로로포름 중 5% 메탄올)를 하여 무색 오일로서 화합물 S1-6 (0.149 g, 75%)을 얻었다.
Figure pat00025
[제조예 2] 화학식 2의 화합물의 제조
Figure pat00026
제조예 2-(1): S-(데크-9-엔-1-일)에탄티오에이트 (화합물 S3-1)의 제조
건조 DMF (20 ml) 중 3 Å 분자체 (40 mg/mmol)와 10-브로모데센 (3.36 g, 15.34 mmol)의 용액에 디이소프로필에틸아민 (3.17 ml, 18.41 mmol) 및 티오아세트산 (1.21 ml, 16.88 mmol)을 실온에서 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 1 시간 동안 교반한 후, 혼합물을 디에틸 에테르로 추출하였다. 유기층을 합하고, 포화 수성 NH4Cl 및 염수로 세척하고, MgSO4 로 건조하고, 여과 및 진공 농축하여 조 생성물을 얻었다. 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피 (100% 헥산 내지 헥산 중 10% 에틸 아세테이트)를 하여 노란색 오일로서 화합물 S3-1 (x=7, 2.75 g, 82%)을 얻었다.
Figure pat00027
제조예 2-(2): S-(도데크-11-엔-1-일)에탄티오에이트 (화합물 S2-1) (x=9)의 제조
칼럼 크로마토그래피의 필요가 없었다는 점을 제외하고는 제조예 2-(1)과 유사하게 화합물 S2-1을 제조하였다(x=9, 63 mg, 붉은빛 오일로서 80%).
Figure pat00028
제조예 2-(3): S-(옥트-7-엔-1-일)에탄티오에이트 (화합물 S4-1) (x=5)의 제조
칼럼 크로마토그래피의 필요가 없었다는 점을 제외하고는 제조예 2-(1)과 유사하게 화합물 S2-1을 제조하였다(x=5, 960 mg, 노란색 오일로서 96%).
Figure pat00029
제조예 2-(4): S-(헥스-5-엔-1-일)에탄티오에이트 (화합물 S5-1) (x=3)의 제조
제조예 2-(1)과 유사하게 화합물 S5-1을 제조하였다(x=3, 568 mg, 연한 노란색 오일로서 56%).
Figure pat00030
[제조예 3] 화학식 4의 화합물의 제조
Figure pat00031
제조예 3-(1): (E)-S-(12-((tert-부톡시카보닐)아미노)-11,13- 디히드록시트리데크 -9-엔-1-일) 에탄티오에이트 (화합물 S10-1)의 제조
CH2Cl2 (1 ml) 중 화합물 S1-5 (90 mg, 0.41 mmol)의 용액에 화합물 S3-2 (354.62 mg, 1.66 mmol) 및 2세대 Grubbs 촉매 (17.57 mg, 0.05 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 2 시간 동안 교반한 후, 용매를 진공 하에 제거하여 조 생성물을 얻었다. 실리카 겔 상의 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 33%에서 40% 에틸 아세테이트)를 하여 무색 무정형 고체로서 화합물 S10-1 (95.6 mg, 58%)을 얻었다.
Figure pat00032
제조예 3-(2): (E)-S-(8-((tert-부톡시카보닐)아미노)-7,9-디히드록시논 -5-엔-1-일) 에탄티오에이트 (화합물 S6-1)의 제조
제조예 3-(1)과 유사한 방식으로 화합물 S6-1을 무색 무정형 고체로서 제조하였다 (66.2 mg, 56%).
Figure pat00033
제조예 3-(3): (E)-S-(8-((tert-부톡시카보닐)아미노)-9-((디메톡시 포스포릴)옥시)-7- 히드록시논-5-엔-1-일) 에탄티오에이트 (화합물 pS6-1)의 제조
실리카겔 상에서 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 50% 에서 67% 에틸 아세테이트)를 하여 제조예 3-(1)과 유사한 방식으로 화합물 pS6-1을 무색 무정형 고체로서 제조하였다 (43.1 mg, 55%).
Figure pat00034
제조예 3-(4): (E)-S-(10-((tert-부톡시카보닐)아미노)-9,11- 디히드록시운데크-7-엔-1-일) 에탄티오에이트 (화합물 S8-1)의 제조
실리카겔 상에서 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 33% 에서 40% 에틸 아세테이트)를 하여 3-(1)과 유사한 방식으로 화합물 S8-1을 무색 무정형 고체로서 제조하였다 (23.7 mg, 72%).
Figure pat00035
제조예 3-(5): (E)-S-(10-((tert-부톡시카보닐)아미노) -11-((디메톡시포스포릴) 옥시)-9-히드록시운데크-7-엔-1-일) 에탄티오에이트 (화합물 pS8-1)의 제조
실리카겔 상에서 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 50% 에서 67% 에틸 아세테이트)를 하여 제조예 3-(1)과 유사한 방식으로 화합물 pS8-1을 무색 무정형 고체로서 제조하였다 (29.4 mg, 66%).
Figure pat00036
제조예 3-(6): (E)-S-(12-((tert-부톡시카보닐)아미노)-13-((디메톡시 포스포릴) 옥시)-11-히드록시트리데크-9-엔-1-일) 에탄티오에이트 (화합물 pS10-1)의 제조
실리카겔 상에서 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 33% 에서 50% 에틸 아세테이트)를 하여 제조예 3-(1)과 유사한 방식으로 화합물 pS10-1을 무색 무정형 고체로서 제조하였다 (49.5 mg, 55%).
Figure pat00037
제조예 3-(7): (E)-S-(14-((tert-부톡시카보닐)아미노)-13,15 -디히드록시펜타데크 -11-엔-1-일) 에탄티오에이트 (화합물 S12-1)의 제조
실리카겔 상에서 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 33% 에서 40% 에틸 아세테이트)를 하여 제조예 3-(1)과 유사한 방식으로 화합물 S12-1을 무색 무정형 고체로서 제조하였다 (22.6 mg, 63%).
Figure pat00038
[제조예 4] 화학식 5의 화합물의 제조
Figure pat00039
건조 CH2Cl2 (1 mL) 중 8-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)-2- (히드록시메틸)-N,N- 디메틸퀴놀린-5-술폰아미드 (200 mg, 0.38 mmol)의 용액에 N-브로모숙신이미드 (140 mg, 0.77 mmol)을 0°C에서 Ar 하에 첨가하였다. 트리페닐포스핀 (191 mg, 0.73 mmol)을 건조 CH2Cl2 (1 mL) 중에 용해시켜 상기 혼합물에 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 동일 온도에서 20 분 동안 교반한 후, 디에틸 에테르로 희석하였다. 유기층을 포화 수성 NH4Cl 및 염수로 세척하고, MgSO4 로 건조하고, 여과 및 진공 농축하여 조 생성물을 얻었다. Florisil (100-200 mesh, 헥산 중 10% 에틸 아세테이트) 상의 칼럼 크로마토그래피를 하여 무색 오일로서 2-(브로모메틸)-8-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)-N,N-디메틸퀴놀린-5-술폰아미드 (화합물 Sox-Br) (135 mg, 60%)을 얻었다.
Figure pat00040
[제조예 5] 화학식 6의 화합물의 제조
Figure pat00041
Ar 버블링한 THF (1 mL) 및 메탄올 (1 mL) 중 티오에스테르, 화합물 S10-1 (3.2 mg, 0.009 mmol)의 용액에 20% 수산화나트륨 용액 (200 μL, 최종 2% NaOH)을 0˚C에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 교반하고 진공 농축한 후, 혼합물을 클로로포름으로 희석하였다. 포화 수성 NH4Cl로 중화한 후, 유기층을 합하고, 염수로 세척하고, Na2SO4 로 건조하고, 여과 및 진공 농축하여 가수분해된 티올을 얻었다. 건조 CH2Cl2 (1 mL) 중에 티올, S10-2의 용액에 디이소프로필에틸아민 (6 당량) 및 Sox-Br (1 당량)을 암실에서 Ar 하에 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 동안 (12시간) 교반한 후, 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 합하고, 염수로 세척하고, 포화 수성 NH4Cl 및 염수로 세척하고, Na2SO4 로 건조하고, 여과 및 진공 농축하여 조 생성물을 얻었다. 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 33% 에틸 아세테이트에서 100% 에틸아세테이트에서 CH2Cl2 중 5% 메탄올까지)를 하여 노란색 무정형 고체로서 화합물 S10-3을 얻었다. 염기성 조건 하에 알코올 보호기 TBDPS 중 일부가 그 자리에서 분해되어 화합물 S10-4을 생성하였다.
화합물 S6-3 (16 mg, 59%, 무색 무정형 고체) (실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피 - CH2Cl2 중 33% 에서 66% 에틸 아세테이트)
Figure pat00042
화합물 pS6-3 (무색 무정형 고체)(실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피 - CH2Cl2 중 33% 에서 66% 에틸 아세테이트)
Figure pat00043
화합물 S8-4 (12 mg, 63%, 무색 무정형 고체)(실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피 - CH2Cl2 중 33% 에틸 아세테이트에서 100% 에틸아세테이트에서 CH2Cl2 중 5% 메탄올까지)
Figure pat00044
화합물 pS8-4 (5 mg, 32%, 무색 무정형 고체)(실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피 - CH2Cl2 중 33% 에틸 아세테이트에서 100% 에틸아세테이트에서 CH2Cl2 중 5% 메탄올까지)
Figure pat00045
화합물 S10-3 (5.5 mg, 62.5%, 무색 무정형 고체)(실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피 - CH2Cl2 중 33% 에서 66% 에틸 아세테이트)
Figure pat00046
화합물 pS10-4 (13 mg, 27%, 무색 무정형 고체)(실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피 - CH2Cl2 중 33% 에틸 아세테이트에서 100% 에틸아세테이트에서 CH2Cl2 중 5% 메탄올까지)
Figure pat00047
화합물 S12-4 (무색 무정형 고체)(실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피 - CH2Cl2 중 33% 에틸 아세테이트에서 100% 에틸아세테이트에서 CH2Cl2 중 5% 메탄올까지)
Figure pat00048
화합물 pS12-3 (무색 무정형 고체)(실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피 - CH2Cl2 중 33% 에서 66% 에틸 아세테이트)
Figure pat00049
[제조예 6] 화학식 1의 화합물의 제조
Figure pat00050
CH2Cl2 (1 ml) 중의 화합물 S10-4 (11 mg, 0.018 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 (1 ml)를 0℃에서 첨가하였다. 반응을 HPLC (InertSustain C18, 40-70B, 8 min run)로 모니터링하였다. 반응 혼합물을 동일 온도에서 3 시간 동안 교반한 후, 혼합물을 N2 하에서 농축하였다. 조 생성물을 메탄올 및 물 (0.1% TFA 와 함께)로 희석하고 역상 HPLC (InertSustain semi-prep C18, 40-70B, 20 min)로 정제하였다.
Figure pat00051
Figure pat00052
Figure pat00053
Figure pat00054
[제조예 7] 인산화된 화합물의 제조
Figure pat00055
건조 MeCN (1 ml) 중 화합물 pS10-4 (3.6 mg, 0.005 mmol) 용액에 브로모트리메틸실란 (10.7 mg, 0.070 mmol)을 -15℃에서 첨가하였다. 반응을 HPLC (InertSustain C18, 40-70B, 8 min run)로 모니터링하였다. 반응 혼합물을 동일 온도에서 8시간 내지 13시간 동안 교반한 후 혼합물을 N2 하에 농축하였다. 생성된 조 실릴에스테르를 메탄올 (1 mL)에 용해하고 용액을 추가로 10분 동안 교반한 후, 용매를 진공 제거하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물은 메탄올 및 물 (0.1% TFA 와 함께)로 희석하고 HPLC (Inertsil semi-prep C18, 40-70B, 20 min)로 정제하였다.
Figure pat00056
Figure pat00057
Figure pat00058
Figure pat00059
[실험예 1] 본 발명에 따른 화합물의 형광 특성 확인
Sox-Sph (상기 제조예에서 제조된 본 발명에 따른 화합물) 및 Sox-S1P (상기 제조예에서 제조된 인산화된 화합물)의 형광 특성을 알아보기 위하여 10 μM Sox-Sph 또는 Sox-S1P와 50 mM MgCl2 를 함유하는 용액을 사용하여 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5 완충제 중에서 37°C 에서 흡광 및 형광 특성을 측정하였다. 파장에 따른 형광 강도의 그래프를 도 1의 A 에 나타내었다.
도 1의 A 에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 화합물 (Sox-Sph)과 이의 인산화된 형태 (Sox-S1P)는 360 nm 파장을 흡수하여 480-500 nm 파장의 형광을 방출하였다. 또한, Sox-S1P는 인산화되지 않은 Sox-Sph에 비하여 형광의 증가를 나타낸다는 것을 알 수 있다.
도 1의 B 는 Mg2+ 의 농도 20 mM 및 50 mM 에서 Sox-Sph (오른쪽)와 Sox-S1P (왼쪽) 용액의 발광을 나타내는 사진이다. 도 1의 B 로부터 인산화에 의해 형광 증가가 나타난다는 사실을 육안으로 확인할 수 있다.
상기 도 1의 A와 B 로부터 본 발명에 따른 화합물 (비인산화된 Sox-Sph)이 스핑고신 인산화효소를 검출하기 위한 형광 프로브용 화합물로서 효과적으로 사용될 수 있다는 점을 알 수 있다.
[실험예 2] 본 발명에 따른 화합물의 최적화
Sox 와 포스포릴 그룹 사이의 Mg2+ 킬레이션을 최적화하기 위해, 헤드 그룹과 Sox 형광 발색단 사이의 알킬 링커 길이에 따른 각 형광 프로브용 화합물의 형광 특성을 알아보기로 하였다. 이를 위해 화학식 1에서 x = 3, 5, 또는 7 인 경우의 화합물 및 이의 인산화된 화합물을 제조하고, 각 화합물의 형광 강도를 측정하였으며, 그 결과를 도 2의 A 에 나타내었다. 도 2의 A 에서 알 수 있는 바와 같이, 알킬 링커 길이가 짧을수록 형광 강도의 세기는 커졌으나, 가장 짧은 길이의 x = 3에서 본 발명의 화합물 Sox-Sph 와 인산화된 화합물 Sox-S1P 사이의 형광 강도 증가가 대략 1.8 배로서 비교적 작게 나타났다. 중간 길이인 x = 5 에서 가장 높은 형광 증가 효과를 나타내었다.
가장 높은 형광 증가 효과를 나타낸 x = 5 인 화합물 및 이의 인산화된 화합물을 사용하여 Mg2+ 농도에 따른 형광 증가 여부에 대해 확인해 보았으며, 그 결과를 도 2의 B에서 나타내었다. 도 2의 B에서 알 수 있는 바와 같이, Mg2+ 의 농도가 높아질수록 각 화합물의 형광 강도 자체는 커졌으나, 인산화에 따른 형광 증가의 정도는 생리적 조건에 해당하는 대략 10 mM 농도의 Mg2+ 에서 가장 우수하였고, 그 이후로는 농도가 증가할수록 형광 증가의 정도가 작아졌다.
다음으로, 알킬 링커의 길이에 따른 금속 친화도 및 광학 특성을 다음의 표 1에 나타낸다.
Figure pat00060
[실험예 3] 스핑고신 인산화효소 1 (SphK1)을 사용한 In vitro 인산화 검정
SphK를 사용한 in vitro 인산화 검정을 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5 완충액 중에서 실시하였다. SphK1 (Sino biological, Beijing, China)은 20 mM Tris, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 8.0에서 멸균 스톡으로 제공되었다. SphK1 활성을 37℃ 하에서 형광 (λex/λem =360/485 nm)으로 모니터링하였다. Sox-Sphs 및 SphK1은 완전히 사전에 혼합되어야 한다. ATP-Mg2+ 용액을 첨가하여 반응을 개시하였다.
Figure pat00061
HPLC를 사용하여 인산화 반응을 모니터링하였으며, HPLC 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3으로부터 시간의 경과에 따라 Sox-Sph 가 인산화되어 Sox-S1P 가 생성됨을 확인할 수 있었다.
한편, 알킬 링커 그룹의 길이를 x = 3, 5, 7, 9 로 다양하게 하여 제작한 형광 프로브용 화합물로 전술한 in vitro 인산화 반응을 실시하여, SphK1 첨가 전의 형광 강도와 SphK1 첨가 후 형광 강도를 측정함으로써 인산화에 따른 형광 증가를 알아보았다. 링커의 길이가 가장 긴 프로브 (x=9)는 인산화된 기질이 분해되어 버려서 인산화되지 않은 상태와 인산화된 상태 사이의 형광 강도를 비교할 수가 없으나, 스핑고신 인산화효소를 사용한 in vitro 인산화의 경우에는 인산화된 기질을 별도로 제조할 필요가 없기 때문에 x = 3, 5, 7, 9의 4종 프로브를 SphK1의 기질로 활용 가능하였다.
알킬 링커 그룹의 길이에 따른 인산화 전/후의 형광 강도를 도 4에 그래프로 나타내었다 (분홍색 그래프가 SphK1을 첨가하지 않은 상태를 나타내고 하늘색 그래프가 SphK1을 첨가한 상태를 나타냄). 도 4 로부터 SphK 에 의해 다양한 길이의 Sox-Sph가 인산화에 의해 형광의 세기가 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 Sox-Sph가 실제로 SphK이 기질로 작용한다는 것을 의미한다. 또한, Sox 와 헤드 그룹 사이의 거리 (즉, 알킬 링커 그룹의 길이)와 형광 증가에 대한 관계에 있어서, 거리가 멀수록 형광의 증가는 커지고 (즉, 유연성(flexibility)가 Sox-포스페이트 배위에 중요한 요소), 다만, 형광 강도의 절대값은 작아졌다.
추가로, SphK 의 활성을 형광에 의해 실시간으로 측정하였으며, 그 결과를 도 5 에 그래프로 나타내었다 (x = 7 인 화합물을 사용함). 도 5 로부터 본 발명의 화합물을 사용하여 SphK의 활성을 실시간으로 측정할 수 있다는 점을 확인할 수 있다. 또한, 도 5에서는 스핑고신 인산화효소 (SphK1)의 농도를 다양하게 하여, 효소의 농도에 따른 형광 강도의 변화도 그래프로 함께 표시하였다. SphK1의 농도가 20 nM 인 경우와 SphK1의 농도가 100 nM 인 경우를 비교하였을 때 대략 1.8 배의 형광 강도 차이가 나타났다. 도 5로부터 형광 증가의 정도는 효소 (SphK)의 농도에 비례한다는 점을 알 수 있다.
본 발명에 따른 형광 프로브용 화합물은 BSA나 Triton X-100 과 같은 첨가제가 없어도 그 자체로 물에 대한 용해도가 양호하여 용액 형태로 사용될 수 있다. 또한, 스핑고신 인산화효소에 의한 인산화에 의해 형광을 발광하고 해당 형광의 세기는 스핑고신 인산화효소와의 반응에 의한 인산화된 화합물의 양에 비례한다. 따라서, 본 발명의 화합물을 사용하여 용액 중에서 시료와 접촉시킴으로써 스핑고신 인산화효소를 검출할 수 있다. 또한, 도 6의 A 에서 보는 바와 같이 96웰 플레이트로 다량의 샘플을 동시에 측정할 수 있으므로 고속 스크리닝에도 적용이 가능하다. 예를 들어, 스핑고신 인산화효소의 활성화제(activator) 또는 저해제(inhibitor) 후보물질을 스핑고신 인산화효소와 함께 본 발명의 화합물과 접촉시키면 도 6의 A 에서 보는 바와 같이 강한 형광(strong fluorescence)를 나타내는 웰은 해당 후보물질이 활성화제 후보라는 것을 의미할 수 있고, 약한 형광(weak fluorescence)를 나타내는 웰은 해당 후보물질이 저해제 후보라는 것을 의미할 수 있다. 스핑고신 인산화효소의 해제는 새로운 항암제 개발의 유망한 타겟 시스템이므로 본 발명을 통해 항암제 후보물질을 고속으로 탐색이 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 형광 프로브용 화합물은 세포에서의 이미징을 통해 실시간으로 스핑고신 인산화효소의 활성을 측정하는데에도 적용이 가능하다. 이러한 세포 이미징에 대한 시뮬레이션 결과를 도 6의 B 에 나타내었다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00062

    화학식 1에서,
    L1 은 단일 결합, 또는 탄소수 1 내지 5의 알킬기를 나타내고,
    R1 및 R2 는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 5의 알킬기를 나타내고,
    x는 1 내지 10의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, L1 은 단일 결합이고, x 는 3 내지 9의 정수인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 하기 화학식 7로 표시되는 화합물:
    [화학식 7]
    Figure pat00063

    화학식 7에서, x는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 화합물을 함유하는 스핑고신 인산화효소(sphingosine kinase) 검출용 형광 프로브.
  5. 제4항에 기재된 형광 프로브를 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 스핑고신 인산화효소의 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서, 시료와 형광 프로브의 혼합물에 Mg2+을 포함하는 염을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 스핑고신 인산화효소의 검출 방법.
  7. 제5항에 있어서, 시료에서의 형광 켜짐 또는 형광 변화를 관찰 또는 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 스핑고신 인산화효소의 검출 방법.
  8. 제4항에 기재된 형광 프로브를 스핑고신 인산화효소의 저해제 후보물질 및 스핑고신 인산화효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, 스핑고신 인산화효소 저해제의 스크리닝 방법.
  9. (a) 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 올레핀 교차 복분해 반응(olefin cross metathesis)을 통해 반응시켜 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;
    (b) 화학식 4로 표시되는 화합물과 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 알킬화 반응을 통해 반응시켜 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및
    (c) 화학식 6으로 표시되는 화합물에서 보호기를 탈보호하여 제1항에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는,
    제1항에 기재된 화합물의 제조 방법:
    [화학식 2]
    Figure pat00064

    [화학식 3]
    Figure pat00065

    [화학식 4]
    Figure pat00066

    [화학식 5]
    Figure pat00067

    [화학식 6]
    Figure pat00068

    상기 화학식 2 내지 6에서, x, L1, R1, 및 R2 는 제1항에서 정의한 바와 같고, PT1 및 PT2는 보호기이다.
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