KR20220122692A

KR20220122692A - 항산화제 추출물 및 조성물

Info

Publication number: KR20220122692A
Application number: KR1020227025658A
Authority: KR
Inventors: 가이 벤-도르; 야엘 리프쉬츠; 아비 요세프; 차프라 코헨; 아르카디 하이킨; 마샤 프리드만; 마리나 쿠토리안; 다난 시반 모르
Original assignee: 넥스트펌 테크놀로지스 리미티드
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2022-09-02
Also published as: MX2022008034A; EP4072573A1; CA3163052A1; US20230066836A1; IL294360A; WO2021137101A1; EP3845234A1

Abstract

본 발명은 항산화제 액체 추출물 및 조성물의 제조 방법 및 이러한 항산화제 액체 추출물 및 조성물의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 아스타잔틴을 포함하는 신규한 항산화제 액체 추출물 및 조성물을 제공한다. 상기 항산화제 액체 추출물 및 조성물은 그 중에서도 높은 항산화 활성을 나타낸다.

Description

항산화제 추출물 및 조성물

아스타잔틴 (3,3'-디히드록시-β,β'-카로텐-4,4'-디온) 은 일정 해양 식물, 갑각류, 어류 및 효모에서 발견되는 천연적으로 발생되는 지용성의 붉은색 옥시카로테노이드 색소이다. 붉은색 색소 색상은 화합물의 중심에 있는 공액 이중 결합에 기인하며, 아스타잔틴의 평면 구조는 하기를 참조한다:

공액 이중 결합은 광범위한 생 유기체에서 전자를 제공하고 자유 라디칼과 반응하여 그들을 보다 안정한 산물로 전환시켜, 자유 라디칼 연쇄 반응을 종결시킴으로써 강력한 항산화제로서 작용한다. 아스타잔틴은 비타민 E 및 β-카로틴보다 강력한 항산화제이다. 아스타잔틴은 그의 강력한 항산화 활성으로 인해, (예를 들어, 면역계를 증강시키고 노화의 영향을 완화시키는) 미용학 및 건강기능식품과 같은 수많은 건강 용도를 갖는다. 암, 만성 염증성 질환, 대사 증후군, 당뇨병, 당뇨병성 신병증, 심혈관 질환, 위장 질환, 간 질환, 신경퇴행성 질환, 눈 질환, 피부 질환, 운동-유도 피로 및 남성 불임과 같은 질환의 치료에 아스타잔틴의 용도에 대한 상당한 관심도 또한 존재한다.

그러나, 아스타잔틴은 높은 공액 이중 결합 구조로 인해 산화가 비교적 용이하고, 열적 안정성 및 장기간 보관 안정성 측면에서 안정성이 제한적이다. 아스타잔틴의 산화는 그의 생물학적 활성의 손실을 야기하며, 이는 건강기능성 및 치료적 적용에서의 그의 용도를 제한할 수 있다. 아스타잔틴의 안정성과 용해도를 향상시키기 위한 시도가 이루어져 왔다. 그러나, 현재 이용가능한 아스타잔틴 추출물 및 조성물, 예컨대 조류 올레오레진 오일은 적절한 안정성이 부족하고, 이들은 강하고 불쾌한 냄새 및 맛과 같은 추가의 단점과 관련된다. 따라서, 종래 기술의 단점, 예컨대 불쾌한 냄새 및 맛과 연관이 없고, 보다 큰 안정성, 보다 높은 항산화 능력을 갖는 아스타잔틴 추출물 및 조성물의 추가적인 필요성이 존재한다.

본 발명은 본원에 제공된 신규한 공정에 의해 제조될 수 있는 신규한 항산화제 액체 추출물 및 조성물을 제공함으로써 이러한 요구를 충족시킨다. 본 발명의 항산화제 액체 추출물 및 조성물은 종래의 항산화제 액체 추출물 및 조성물에 비해 안정성이 우수하고 항산화 능력이 우수하다. 또한, 본원에 제공된 항산화제 조성물은 놀랍게도 중성 향미 및 냄새와 관련되며, 이는 건강기능식품 및 치료적 용도를 위한 다양한 범위의 제품 제형에 유리하다. 본 발명의 조성물의 관능적 (organoleptic) 우월성은 향미 및 냄새 차폐에 대한 필요 없이, 아스타잔틴을 캡슐화된 식이 보충제 이외의 다양한 제품, 예컨대 음료, 분말, 식품, 푸드 바 (food bar) 등으로의 혼입을 처음으로 가능하게 하며; 따라서 원치않는 냄새 및 맛을 극복하기 위한 추가의 성분에 대한 필요 없이 가능하게 한다. 이와 함께, 본 발명의 항산화제 액체 추출물 및 조성물의 특징은 아스타잔틴의 기능식품적 및 치료학적 적용을 개선 및 확장시킨다.

도 1
도 1 은 조류 아스타잔틴 올레오레진과 비교하여 본 발명에 따른 아스타잔틴 액체 추출물이 C. 엘레간스 (C. elegans) 선충의 산화 스트레스 저항성에 미치는 영향을 보여준다. C. 엘레간스 선충에 항산화제 액체 추출물, 조류 아스타잔틴 올레오레진 또는 표준 오일의 존재 하에 H 2O2 에 의해 급성 산화 스트레스를 적용했다. 이어서, C. 엘레간스 선충 생존율을 측정하고, 초기 수로부터 백분율로 계산하였다. **유의 P < 0.001; *유의 P < 0.01; NS: 유의하지 않음.
도 2
도 2 는 본 발명에 따른 항산화제 조성물 또는 조류 올레오레진의 섭취 전 (투여 전) 및 섭취 후 (투여 8 시간 후) 대상체 혈청 중 지질의 구리-유도 과산화의 동역학을 나타낸다. 도 2A 는 시간에 따른 지질 과산화 생성물, 디엔산 히드로퍼옥시드의 축적을 모니터링하는 245 nm 에서의 OD 값을 플롯팅하여, 지연 시간 및 t-max 의 동력학적 파라미터를 제공한다. 도 2B 는 본 발명에 따른 항산화 조성물 및 조류 올레오레진에 대한 지연상의 연장에 있어서 항산화성 보호 효과를 정량화한다 (각각의 경우, 좌측 막대는 투여 전을 나타내고, 우측 막대는 투여 후 8 시간을 나타낸다).
도 3
도 3 은 본 발명에 따른 항산화제 조성물 또는 조류 올레오레진의 존재 하에서 FRAP 분석 결과를 나타낸 것이다. 건강한 성인 대상에게 50 mg 아스타잔틴을 함유하는 캡슐화된 분말 형태의 본 발명의 항산화제 조성물 또는 50 mg 아스타잔틴을 함유하는 조류 올레오레진 오일을 투여하였다. FRAP 분석은 "감소된 철 농도의 변화 (μΜ)" 로서 기술되고 계산된 바와 같이 혈장 샘플에 대해 수행되었다.

정의

본원에서 사용되는, 용어 "BCAA" 는 "분지쇄 아미노산" 을 의미한다. 예는 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.

본원에서 사용되는, 용어 "바이오매스" 는 본 발명의 목적을 위해 파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 효모의 질량으로부터 유기 물질 (예를 들어, 세포) 의 질량을 지칭한다.

본원에서 사용되는, 아스타잔틴 함량은 유리 아스타잔틴 및 유리 아스타잔틴으로 보고된 다양한 에스테르화된 아스타잔틴 종을 포함한다.

본원에서, "디-시스 아스타잔틴" 은 아스타잔틴 분자의 이중 결합 중 2 개가 시스 구성에 있음을 의미한다. 예를 들어: "9,13 시스 아스타잔틴" 은 위치 9 및 13 에서의 이중 결합이 시스 형태 (및 트랜스 형태가 아님) 임을 의미한다.

본원에서 사용되는, 용어 "v/v" 는 부피/부피를 의미하고 용어 "w/w" 는 "중량/중량" 을 의미한다.

본원에서 사용되는, 용어 "ppm" 은 각각의 조성물의 "백만분율 (parts per million)" 을 지칭한다.

본원에서 사용되는, 값을 지칭하는 용어 "약" 은 정확한 값 뿐만 아니라 그 값의 ± 5% 를 포함한다.

용어 "N.L.T." 는 "~보다 적지 않음 (not less than)" 을 의미한다.

본원에서 사용되는, 용어 "요법" 은 치료 (예를 들어, 증상의 개선) 및 예방 (예를 들어, 증상의 미래 발생을 최소화) 둘 모두를 포함한다.

항산화제 액체 추출물의 제조 방법

본 발명은 파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 로부터 아스타잔틴을 추출하는 것을 포함하는 항산화제 액체 추출물의 신규한 제조 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 유래의 항산화제 액체 추출물의 제조 방법을 제공한다:

(a) 파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 세포 바이오매스를 유기 용매와 접촉시켜 혼합물을 형성하는 단계;

(b) 상기 혼합물로부터 세포 데브리스를 제거하도록 고액 분리를 수행하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계로부터 수득된 생성물로부터 용매를 증발시키는 단계; 및

(d) 상기 (c) 단계에서 수득된 생성물을 가열 및 냉각하여 상기 항산화제 액체 추출물을 수득하는 단계.

파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 는 아스타잔틴을 자연적으로 생산한다. 아스타잔틴을 과생산하는 (예를 들어, 효모 건조 질량 g 당 5000 ㎍ 이상) 파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 의 균주는 당업자에게 공지되어 있다. 파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 세포 바이오매스는 당업자에게 공지된 적합한 조건 하에서 파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 의 발효에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 를 배양하기 위한 특정한 적합한 조건은 탄소원 (예를 들어, 글루코스), 질소원 (예를 들어, NH4+), 염 (예를 들어, Na+, K+, Mg2+, Ca2+ 등), 미량 원소, 펩톤 (단백질의 부분 가수분해에 의해 형성된 아미노산 및 폴리펩티드의 수용성 혼합물) 과 같은 충분한 영양소와 함께, 약 17 내지 약 23℃ (예를 들어, 약 20℃) 에서의 인큐베이션, 및 적합한 pH (예를 들어, 산성 pH) 에서의 배양이다. 충분한 영양소는 당업계에 공지된 바와 같은 효모 성장 배지, 예를 들어, 효모 및 곰팡이 "YM" 배지에 의해 제공될 수 있다. 전형적으로, 효모 성장 배지는 박테리아 및 다른 산-불내성 유기체의 성장을 방해하면서, 효모의 성장을 허용하는 산성 pH 의 선택적 성장 배지이다.

단계 (a) 의 유기 용매는 아스타잔틴의 적어도 일부를 가용화할 수 있는 임의의 용매일 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 (a) 의 유기 용매는 에틸 아세테이트, 아세톤, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 메틸렌 클로라이드, 또는 이의 임의의 혼합물이다. 전형적으로, 유기 용매는 1:2 내지 1:10, 바람직하게는 1:5 의 중량 바이오매스:부피 용매 비로 적용된다. 전형적으로, 단계 (a) 는 약 20 내지 약 80℃, 바람직하게는 약 30 내지 약 50℃ 의 온도에서 수행된다. 단계 (a) 는 임의로 세포 파쇄 단계, 예를 들어, 비드 밀링 (bead milling), 세포의 고압 균질화 또는 동등한 기계적 파쇄를 추가로 포함한다.

단계 (b) 의 고액 분리는 여과 (예를 들어, 바스켓 원심분리, 필터 프레스, 누체필터 (nutsche) 등에 의해), 상 분리, 원심분리 또는 경사분리에 의해 수행될 수 있다.

단계 (c) 에서 용매를 증발시키는 것은 열 및 선택적으로 진공을 적용함으로써 수행될 수 있다. 용매를 증발시키는 것은 약 50℃ 이하의 온도에서 수행된다.

전형적으로, 단계 (c) 로부터 수득된 생성물은 오일 형태이다.

본 발명의 방법은 가열 및 냉각 단계 (d) 를 추가로 포함한다. 단계 (d) 에서 수행되는 가열은 약 40 내지 약 85℃, 바람직하게는 약 45 내지 약 80℃, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 75℃ 의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 가열은 적어도 5 시간, 바람직하게는 적어도 8 시간, 예컨대 8 내지 12 시간 동안 수행된다. 가열 후, 생성물을 냉각시킨다. 냉각은 전형적으로 약 40℃ 미만, 바람직하게는 약 35℃ 미만, 더욱 바람직하게는 약 30℃ 미만, 예를 들어 약 20℃ 내지 약 35℃ 의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 냉각은 적어도 3 시간, 바람직하게는 적어도 5 시간, 예컨대 5 내지 8 시간 동안 수행된다.

단계 (d) 로부터 수득된 항산화제 액체 추출물은 2 개의 별개의 분획: 고체 아스타잔틴을 포함하는 고체 분획 및 용해된 아스타잔틴을 포함하는 오일 분획을 포함한다. 고체 아스타잔틴은 임의의 고체 상태 형태, 예를 들어 비정질 형태, 또는 결정질 형태일 수 있다.

본원에 개시된 단계 (d) 의 가열 및 냉각은 고체 아스타잔틴을 오일로부터 침전시켜 2상 액체 추출물을 형성한다. 단계 (d) 로부터 수득된 항산화제 액체 추출물 중 고체 아스타잔틴의 높은 비율은 본원에 개시된 항산화제 액체 추출물의 개선된 특성, 예컨대 개선된 항산화제 특성의 근간을 이루는 것으로 여겨진다. 이론에 구애됨이 없이, 본원에 개시된 단계 (d) 의 가열 및 냉각은 또한 아스타잔틴의 이성질체 형태를 변화시켜, 예를 들어 고체 아스타잔틴에서 트랜스-아스타잔틴의 비율의 증가를 야기하고, 고체 아스타잔틴에서 시스-형태의 아스타잔틴의 비율의 감소하는 것으로 여겨진다. 이성질체 간의 상이한 비율은 또한 본원에 개시된 항산화제 액체 추출물의 개선된 특성에 기여할 수 있다.

본 발명의 항산화제 액체 추출물은 아스타잔틴을 약 1.5% (w/w) 이상, 바람직하게는 약 2% (w/w) 이상, 더욱 바람직하게는 약 2.5% (w/w) 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 3% (w/w) 이상, 특히 약 4% (w/w) 이상, 및 더욱 특히 약 5% (w/w) 이상 포함한다. 본 발명의 항산화제 액체 추출물에 포함된 아스타잔틴의 전체 양은 또한 아스타잔틴의 총량으로서 지칭된다.

일부 구현예에서, 본 발명의 항산화제 액체 추출물은 약 1.5% (w/w) 내지 약 10% (w/w) 아스타잔틴 (총량), 바람직하게는 약 2% (w/w) 내지 약 8% (w/w), 더욱 바람직하게는 약 2.5% (w/w) 내지 약 5% (w/w) 아스타잔틴을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 항산화제 액체 추출물에 포함된 아스타잔틴의 적어도 약 1.5% (w/w) 는 고체 아스타잔틴의 형태이다. 일부 구현예에서, 상기 항산화제 액체 추출물에 포함된 아스타잔틴의 적어도 약 3% (w/w) 는 고체 아스타잔틴의 형태이다. 일부 구현예에서, 상기 항산화제 액체 추출물에 포함된 아스타잔틴의 적어도 약 5% (w/w) 는 고체 아스타잔틴의 형태이다. 일부 구현예에서, 상기 항산화제 액체 추출물에 포함된 아스타잔틴의 적어도 약 10% (w/w) 는 고체 아스타잔틴의 형태이다. 바람직하게는 상기 항산화제 액체 추출물에 포함된 아스타잔틴의 적어도 약 20% (w/w), 더욱 바람직하게는 적어도 약 30% (w/w), 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 40% (w/w), 특히 적어도 약 50% (w/w), 더욱 특히 적어도 약 60% (w/w) 는 고체 아스타잔틴의 형태이다.

하나의 구현예에서, 상기 항산화제 액체 추출물에 포함된 아스타잔틴의 적어도 약 20% (w/w) 내지 약 90% (w/w) 는 고체 아스타잔틴의 형태이다. 바람직하게는 상기 항산화제 액체 추출물에 포함된 아스타잔틴의 적어도 약 25% (w/w) 내지 약 80% (w/w), 더욱 바람직하게는 약 30% (w/w) 내지 약 70% (w/w) 는 고체 아스타잔틴의 형태이다. 하나의 구현예에서, 상기 항산화제 액체 추출물에 포함된 아스타잔틴의 약 30% (w/w) 내지 약 60% (w/w) 는 고체 아스타잔틴의 형태이다.

전체 아스타잔틴 중 투명한 오일 중 용해된 아스타잔틴의 함량 (% (w/w)) 은 다음과 같이 결정될 수 있다:

혼합 상태로 유지되는 상기 단계 (d) 에서 얻은 항산화제 액체 추출물로부터 두 개의 샘플이 취해진다. 하나의 샘플을 칭량하고, 완전히 용해시키고, HPLC 분석에 적용하여 액체 추출물 중 총 아스타잔틴 함량을 결정한다. 다른 샘플을 6,000 rpm 에서 1분 동안 원심분리하여 고체 분획을 바닥에 침전시켰다.　원심분리 튜브의 상부로부터의 투명한 오일 액체를 주의 깊게 샘플링하고 HPLC 에 의해 아스타잔틴 함량에 대해 분석한다.

전체 아스타잔틴으로부터 용해된 아스타잔틴의 함량 (% (w/w)) 은 다음과 같이 계산될 수 있다:

% 용해된 아스타잔틴 (w/w) =

투명 오일 중 100 * % (w/w) 아스타잔틴 / 액체 추출물 중 % (w/w) 아스타잔틴

전체 아스타잔틴으로부터 고체 아스타잔틴의 함량 (% (w/w)) 은 다음과 같이 계산될 수 있다:

100 (w/w) - % 용해된 아스타잔틴 (w/w)

항산화제 액체 추출물

놀랍게도, 단계 (d) 로부터 얻어진 항산화제 액체 추출물은 우수한 항산화 활성을 나타낸다. 이론에 구애됨이 없이, 우수한 항산화 특성은 예외적으로 높은 비율의 고체 아스타잔틴을 포함하는 추출물의 특정 2상 조성물에 기인하는 것으로 생각된다.

따라서, 본 발명은 또한 파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 로부터 유래된 항산화제 액체 추출물을 제공하며, 여기서 상기 액체 추출물은 2 개의 구별되는 분획: 고체 아스타잔틴을 포함하는 고체 분획 및 용해된 아스타잔틴을 포함하는 오일 분획으로 구성된다.

본 발명의 항산화제 액체 추출물은 아스타잔틴을 약 1.5% (w/w) 이상 (총량), 바람직하게는 약 2% (w/w) 이상, 더욱 바람직하게는 약 2.5% (w/w) 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 3% (w/w) 이상, 특히 약 4% (w/w) 이상, 및 더욱 특히 약 5% (w/w) 이상 포함한다.

일부 구현예에서, 고체 아스타잔틴은 총 고체 아스타잔틴의 적어도 약 55% (w/w) 모든-트랜스 아스타잔틴, 바람직하게는 적어도 약 65% (w/w), 더욱 바람직하게는 적어도 약 70% (w/w), 가장 바람직하게는 적어도 약 80% (w/w) 모든-트랜스 아스타잔틴, 예를 들어, 약 65% (w/w) 내지 약 95% (w/w) 모든-트랜스 아스타잔틴을 포함한다.

일부 구현예에서, 항산화제 액체 추출물의 오일 분획에 포함된 용해된 아스타잔틴은 총 용해된 아스타잔틴의 약 70% (w/w) 미만 모든-트랜스 아스타잔틴, 바람직하게는 65% (w/w) 미만, 더욱 바람직하게는 약 60% (w/w) 미만 모든-트랜스 아스타잔틴, 예를 들어, 약 30% (w/w) 내지 약 55% (w/w) 모든-트랜스 아스타잔틴을 포함한다.

일부 구현예에서, 둘 모두에서, 고체 아스타잔틴을 포함하는 고체 분획과 용해된 아스타잔틴을 포함하는 오일 분획에서, 모든-트랜스가 아닌 (not-all-trans) 아스타잔틴은 15시스-아스타잔틴, 13시스-아스타잔틴 및 9시스-아스타잔틴을 포함한다.　바람직하게는, 15시스-아스타잔틴은 9시스-아스타잔틴보다 많은 양으로 존재하는 13시스-아스타잔틴보다 많은 양으로 존재한다.

일부 구현예에서, 고체 아스타잔틴 (% (w/w)) 의 모든-트랜스 아스타잔틴의 비율 (% w/w) 대 용해된 아스타잔틴 (% (w/w)) 의 모든-트랜스 아스타잔틴의 비율 (% w/w) 의 비는 1:1 내지 10:1, 바람직하게는 1.5:1 내지 5:1 이다.

일부 구현예에서, 항산화제 액체 추출물은 디-시스 아스타잔틴을 총 아스타잔틴의 적어도 약 0.2% (w/w), 바람직하게는 적어도 약 0.5% (w/w), 및 더욱 바람직하게는 적어도 약 2% (w/w) 의 양으로 포함한다.

일부 구현예에서, 고체 아스타잔틴은 디-시스 아스타잔틴을 총 고체 아스타잔틴의 적어도 약 0.1% (w/w), 바람직하게는 적어도 약 0.2% (w/w), 및 더욱 바람직하게는 적어도 약 0.5% (w/w) 의 양으로 포함한다.

일부 구현예에서, 고체 아스타잔틴 중 디-시스 아스타잔틴의 비율 (% (w/w)) 대 용해된 아스타잔틴 중 디-시스 아스타잔틴의 비율 (% (w/w)) 의 비는 1:1 내지 1:50, 바람직하게는 1:1 내지 1:20, 더욱 바람직하게는 1:1 내지 1:10, 가장 바람직하게는 1:1.5 내지 1:7 이다.

본 발명은 또한 파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 로부터 유래된 항산화제 액체 추출물을 제조하는 방법에 의해 수득되는 항산화제 액체 추출물을 제공하며, 상기 방법은 모든 이들의 구현예와 함께 본원에 정의된 단계 (a) 내지 (d) 를 포함한다.

항산화제 액체 추출물은 투약 형태 (dosage form), 예를 들어 캡슐 또는 연질 캡슐과 같은 경구 투약 형태 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 적합한 투약 형태로 추가로 제형화될 수 있다.

항산화제 조성물의 제조 방법

본 발명은 항산화제 중합체의 제조 방법을 추가로 제공하고, 그 방법은 하기 단계를 포함한다:

(e) 고액 분리를 수행하여 파피아 로도자이마 유래의 항산화제 추출물의 액체로부터 고체를 분리하는 단계;

(f) 상기 (e) 단계에서 얻어진 고체를 물과 혼합하는 단계; 및

(g) 고액 분리를 수행하여 고체 항산화제 조성물을 수득하는 단계.

단계 (e) 에서 사용되는 파피아 로도자이마 유래의 항산화제 추출물은 파피아 로도자이마 유래의 임의의 추출물일 수 있다. 예를 들어, 상기 항산화제 추출물은 본원에 기재된 바와 같은 공정에 의해 제조된 항산화제 액체 추출물일 수 있다.

따라서, 일부 구현예에서, 단계 (e) 에서 사용된 파피아 로도자이마 유래의 항산화제 추출물은 본원에 기재된 단계 (a) 내지 (d) 에 따른 공정에 의해 제조된 항산화제 액체 추출물일 수 있다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 항산화제 조성물의 제조 방법은 단계 (e) 내지 (g) 이전에 수행되는 본원에 기재된 단계 (a) 내지 (d) 를 포함한다.

하나의 구현예에서, 항산화제 조성물의 제조 방법은 하기의 단계를 포함한다:

(c) 상기 (b) 단계로부터 수득된 생성물로부터 용매를 증발시키는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 수득된 생성물을 가열 및 냉각하여 항산화제 액체 추출물을 수득하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계에서 수득된 항산화제 액체 추출물의 액체로부터 고체를 분리하는 단계;

(f) 상기 (e) 단계에서 얻어진 고체를 물과 혼합하는 단계; 및

단계 (e) 의 액체로부터의 고체의 분리는 여과 (예를 들어, 바스켓 원심분리, 필터 프레스, 누체필터 (nutsche) 등에 의해), 상 분리, 원심분리 또는 경사분리에 의해 수행될 수 있다.

단계 (f) 에서, 물은 1:2 내지 1:50, 바람직하게는 1:10 내지 1:30 의 고체 중량:물 중량 비로 단계 (e) 로부터 수득된 고체와 혼합된다. 혼합은 약 5 내지 약 95℃ 의 온도에서, 바람직하게는 약 40 내지 약 90℃ 의 온도에서, 더욱 바람직하게는 약 60 내지 약 80℃ 의 온도에서 수행된다.

본원에 개시된 단계 (f) 에 따르면, 고체 형태는 오일을 제거하기 위해 용매를 사용하지 않고 얻어지지만, 대신 물로 얻어진다. 놀랍게도, (항산화제 액체 추출물의 오일 분획에서 용해된 아스타잔틴으로부터 고체 아스타잔틴을 분리하고, 이어서 물을 사용하여 고체 아스타잔틴으로부터 오일을 제거하는 것을 포함하는) 2 개의 독특한 공정 단계의 조합은 종래 기술의 항산화제 조성물보다 더 큰 안정성 및 더 높은 항산화제 용량과 같은 개선된 특성을 갖는 본원에 개시된 바와 같은 항산화제 조성물을 야기한다. 본원에 개시된 항산화제 조성물은 아스타잔틴 이외에, 적어도 하나의 아미노산, 구리, 망간 및 아연으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 금속, 및/또는 인지질을 포함할 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, 이들 추가의 성분은 또한 본원에 개시된 항산화제 조성물의 개선된 특성에 기여할 수 있다.

단계 (g) 의 고액 분리는 여과 (예를 들어, 바스켓 원심분리, 필터 프레스, 누체필터 (nutsche) 등에 의해), 상 분리, 원심분리 또는 경사분리에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 단계 (g) 에서 액체의 제거 후, 고체 항산화제 조성물은 고체 형태이다.

단계 (g) 의 고액 분리로부터 얻어진 고체는 열 및 진공을 가하여 추가로 건조시킬 수 있다 (예: 진공 트레이 건조기).

단계 (g) 로부터 얻어진 고체 항산화제 조성물은 매우 높은 양의 아스타잔틴을 함유한다. 예를 들어, 상기 고체 항산화제 조성물은 약 20% (w/w) 이상의 아스타잔틴, 바람직하게는 약 30% (w/w) 이상, 더욱 바람직하게는 약 40% (w/w) 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 50% (w/w) 이상, 가장 바람직하게는 약 60% (w/w) 이상의 아스타잔틴을 포함한다.

하나의 구현예에서, 항산화제 조성물은 약 20% (w/w) 내지 약 60% (w/w), 또는 약 30% (w/w) 내지 약 50% (w/w), 또는 약 40% (w/w) 내지 약 50% (w/w) 아스타잔틴을 포함한다.

단계 (g) 로부터 얻어진 상기 고체 항산화제 조성물은 매우 우수한 항산화 특성 및/또는 후각 특성, 및/또는 매우 우수한 안정성을 나타낸다.

항산화제 조성물

따라서, 본 발명은 또한 항산화제 조성물을 제공하며, 상기 항산화제 조성물은 하기를 포함한다:

- 아스타잔틴; 및

- 적어도 하나의 아미노산; 또는

- 구리, 망간 및 아연으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 금속; 또는

- 인지질.

현저하게, 본 발명의 항산화제 조성물은 종래 기술의 항산화제 조성물, 예를 들어 조류 올레오레진 아스타잔틴 조성물보다 더 큰 안정성 및 더 높은 항산화 능력을 갖는다. 또한, 이러한 항산화제 조성물은 놀랍게도 중성 풍미 및 냄새와 연관되며, 즉 이들은 개선된 관능적 특성을 갖는다. 이는 종래 기술의 아스타잔틴-함유 조성물과 관련된 불쾌한 냄새 및 맛을 극복하기 위해 추가의 성분의 필요 없이 다양한 제품에 통합될 수 있는 이점을 갖는다. 또한, 본 발명의 조성물은 우수한 약동학적 특성 및 생체 이용률을 나타낸다. 본 발명의 조성물은 조류 아스타잔틴에 비해 더 빠르고 더 우수한 흡수를 나타낸다. 우수한 흡수는 더 높은 C-max (최대 혈장 농도), 혈장 농도 대 시간 곡선 하의 더 높은 면적 (AUC), 및 더 빠른 T-max (C_max 가 발생하는 시간) 와 같은 약동학 파라미터에 의해 입증된다.

일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 하기를 포함한다:

- 아스타잔틴; 및

- 적어도 하나의 아미노산.

일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 하기를 포함한다:

- 아스타잔틴; 및

- 구리, 망간 및 아연으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 금속.

일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 하기를 포함한다:

- 아스타잔틴; 및

- 인지질.

일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 하기를 포함한다:

- 아스타잔틴; 및

- 적어도 하나의 아미노산; 및

일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 하기를 포함한다:

- 아스타잔틴; 및

- 적어도 하나의 아미노산; 및

- 인지질.

일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 하기를 포함한다:

- 아스타잔틴; 및

- 적어도 하나의 아미노산;

- 구리, 망간 및 아연으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 금속; 및

- 인지질.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산은 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 글리신 및 페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 적어도 하나의 아미노산은 발린, 류신, 및 이소류신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 글리신 및 페닐알라닌 중 적어도 2 개를 포함한다. 일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 발린, 류신, 이소류신, 글리신, 프롤린 및 페닐알라닌 중 적어도 3 개를 포함한다. 일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 글리신 및 페닐알라닌 중 적어도 4 개를 포함한다. 바람직하게는, 항산화제 조성물은 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.

전형적으로, 적어도 하나의 아미노산은 조성물에 약 25 ppm 내지 약 10000 ppm 의 양으로 포함된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산은 조성물에 약 30 ppm 내지 약 5000 ppm 의 양으로 포함된다. 바람직하게는, 적어도 하나의 아미노산은 조성물에 약 40 ppm 내지 약 2000 ppm 의 양으로 포함된다. 더욱 바람직하게는, 적어도 하나의 아미노산은 조성물에 약 50 ppm 내지 약 700 ppm 의 양으로 포함된다.

일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 구리, 망간 및 아연 중 적어도 2 개를 포함한다. 바람직하게는, 항산화제 조성물은 구리, 망간 및 아연을 포함한다.

일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 구리를 적어도 약 1 ppm, 또는 적어도 약 5 ppm, 또는 적어도 약 10 ppm, 또는 적어도 약 15 ppm 의 양으로 포함한다. 바람직하게는, 항산화제 조성물은 구리를 약 1 ppm 내지 약 500 ppm 의 양으로 포함한다. 더욱 바람직하게는, 항산화제 조성물은 구리를 약 1 ppm 내지 약 100 ppm, 또는 약 5 ppm 내지 약 100 ppm, 또는 약 10 ppm 내지 약 100 ppm, 또는 약 15 ppm 내지 약 100 ppm 의 양으로 포함한다.

일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 망간을 적어도 약 0.5 ppm, 또는 적어도 약 1 ppm, 또는 적어도 약 2 ppm, 또는 적어도 약 3 ppm, 또는 적어도 약 4 ppm, 또는 적어도 약 5 ppm 의 양으로 포함한다. 바람직하게는, 항산화제 조성물은 망간을 약 0.5 ppm 내지 약 250 ppm 의 양으로 포함한다. 더욱 바람직하게는, 항산화제 조성물은 망간을 약 0.5 ppm 내지 약 50 ppm, 또는 약 1 ppm 내지 약 50 ppm, 또는 약 2 ppm 내지 약 50 ppm, 또는 약 3 ppm 내지 약 50 ppm, 또는 약 4 ppm 내지 약 50 ppm, 또는 약 5 ppm 내지 약 50 ppm 의 양으로 포함한다.

일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 아연을 적어도 약 10 ppm, 또는 적어도 약 20 ppm, 또는 적어도 약 30 ppm, 또는 적어도 약 40 ppm, 또는 적어도 약 50 ppm, 또는 적어도 약 60 ppm, 또는 적어도 약 70 ppm, 또는 적어도 약 80 ppm, 또는 적어도 약 90 ppm, 또는 적어도 약 100 ppm 의 양으로 포함한다. 바람직하게는, 항산화제 조성물은 아연을 약 10 ppm 내지 약 1000 ppm 의 양으로 포함한다. 더욱 바람직하게는, 항산화제 조성물은 아연을 약 10 ppm 내지 약 250 ppm, 또는 약 20 ppm 내지 약 250 ppm, 또는 약 30 ppm 내지 약 250 ppm, 또는 약 40 ppm 내지 약 250 ppm, 또는 약 50 ppm 내지 약 250 ppm, 또는 약 60 ppm 내지 약 250 ppm, 또는 약 70 ppm 내지 약 250 ppm, 또는 약 80 ppm 내지 약 250 ppm, 또는 약 90 ppm 내지 약 250 ppm, 또는 약 100 ppm 내지 약 250 ppm 의 양으로 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 항산화제 조성물은 아스타잔틴, 아미노산 발린, 류신, 및 이소류신, 및 금속 구리, 망간 및 아연을 포함하고; 상기 아미노산 및 상기 금속은 본원에 개시된 임의의 농도 범위로 조성물에 포함된다.

일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 인지질을 적어도 약 0.005% (w/w), 바람직하게는 적어도 약 0.1% (w/w), 및 더욱 바람직하게는 적어도 약 0.5% (w/w) 의 양으로 포함한다. 전형적으로, 인지질의 약 10% (w/w) 내지 약 90% (w/w) 는 포스파티딜콜린이다.

본 발명의 항산화제 조성물은 약 20% (w/w) 이상의 아스타잔틴, 더욱 바람직하게는 약 30% (w/w) 이상, 더 더욱 바람직하게는 약 40% (w/w) 이상, 특히 바람직하게는 약 50% (w/w) 이상, 더 더욱 특히 바람직하게는 약 60% (w/w) 이상의 아스타잔틴을 포함한다.

일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 약 20% (w/w) 내지 약 60% (w/w), 더욱 바람직하게는 약 30% (w/w) 내지 약 50% (w/w), 더 더욱 바람직하게는 약 40% (w/w) 내지 약 50% (w/w) 아스타잔틴을 포함한다.

일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 디-시스 아스타잔틴을 총 아스타잔틴의 적어도 약 0.05% (w/w), 적어도 약 0.2% (w/w), 적어도 약 0.5% (w/w), 적어도 약 1% (w/w), 적어도 약 2% (w/w), 및 바람직하게는 적어도 약 3% (w/w) 의 양으로 포함한다.

본 발명의 항산화제 조성물은 전형적으로 고체 형태이다. 일부 구현예에서, 고체는 분말의 형태이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 로부터 유래된 항산화제 조성물을 제공하며, 항산화제 조성물은 아스타잔틴; 및 적어도 하나의 아미노산, 또는 구리, 망간 및 아연으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 금속, 또는 인지질을 포함하고; 항산화제 조성물은 고체이다.

본 발명의 항산화제 조성물은 매우 높은 항산화 활성을 나타낸다. 항산화 활성은 예를 들면, 당업계에 공지된 여러 분석법에 의해 측정될 수 있다.

아스타잔틴의 항산화 능력은, 예를 들어 아스타잔틴의 존재에서 C. 엘레간스 (C. elegans) 선충을 성장시키고, 임의의 급성 산화 스트레스 유도인자, 예컨대 과산화수소 (H₂O₂) 또는 파라쿼트, 예를 들어 약 5 시간 동안 mM H₂O₂ 의 존재하에서 급성 산화 스트레스에 적용된 상기 C. 엘레간스의 생존의 증가를 측정함으로써 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 2 mM H2O2 의 존재 하에 급성 산화 스트레스 하에 C. 엘레간스 (C. elegans) 선충의 생존을 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 약 20%, 예컨대 약 20% 내지 약 30% 증가시킨다.

ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) 는 아스타잔틴의 항산화 능력을 평가하는 방법의 또 다른 예이다. 본 검정은 일중항 산소로부터 아스타잔틴 보호능을 측정하는 시험관내 검정이다 (Ou et. al. 2006). 이 검정은 아스타잔틴의 존재 또는 부재하에서, 리튬 몰리브데이트와 과산화수소 사이의 반응에 의한 퍼옥시-라디칼-유도 산화의 억제 정도를 측정한다. 반응에서, 단일항 산소는 37℃ 에서 몰리브데이트에 의해 촉매되는 과산화수소의 불균등화에 의해 에탄올에서 생성된다. 비-형광 프로브인 히드로에티딘 (HE) 은 일중항 산소에 의해 산화되어 590 nm 에서 강한 형광 신호를 나타내는 옥시에티듐을 형성한다. 따라서, 항산화제의 존재 하에서의 HE 형광 억제는 항산화 능력의 지표를 제공한다. 일중항 산소 결과에 대한 ORAC 는 그램 당 마이크로몰 알파-토코페롤 당량으로 표현된다.

생체외 지연 시간 검정은 인간 혈청에서 지질의 빠른 과산화를 지연시키는 항산화제로서의 능력에 기초하여 아스타잔틴의 항산화 능력을 평가하는 방법의 또다른 예이다 (Pinchuk et al 2015). 검정은 구리-유도된 지질 과산화를 연속적 분광광도계로 모니터링한 후, 245 nm 에서 검출된, 지질 산화 생성물, 디엔계 과산화물을 방출하여 동역학을 측정하는 생체외 방법이다. 지연 상의 지속기간 또는 연장을 의미하는 지연-시간 값은, 지질이 과산화로부터 보호되는 동안의 지속기간이다. 이러한 검정은 혈청 내의 아스타잔틴 활성의 생체 외 추정을 가능하게 하며, 따라서 항산화제 평가를 위한 방법은 생리학적으로 관련된 것으로 고려될 수 있다. 항산화제가 지질의 빠른 과산화를 지연시키는 능력은 항산화 효율의 척도로 여겨진다.

아스타잔틴의 항산화능을 평가하는 방법의 또다른 예는 FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma) 검정이다. 이 검정은 단일 전자 전달 반응을 측정함으로써 혈장 중 아스타잔틴의 항산화 능력을 시험하는데 사용될 수 있다. 이는 pH 3.6 에서 2,4,6 트리피리딜-s-트리아진 (Fe3 + TPTZ) 의 철 착물을 착색된 철 착물 FE2 + TPTZ 로 감소시키는 항산화제의 능력에 기초한다. 결과의 해석은 철 이온을 감소시키는 항산화제의 능력이 반응성 산소 종 (ROS) 을 감소시키는 그들의 능력을 반영한다는 가설에 기초한다. FRAP 값은 593 nm 에서의 흡광도 변화를 공지된 농도의 철 이온의 표준 곡선 (Benzie and Strain 1996) 과 비교함으로써 수득된다.

일부 구현예에서, 항산화제 액체 추출물 및/또는 항산화제 조성물은 조성물 그램 당 적어도 800 마이크로몰 (μmole) 알파-토코페롤 당량의 항산화 활성을 갖는다. 바람직하게는, 항산화제 액체 추출물 및/또는 항산화제 조성물은 조성물 그램 당 적어도 1000 마이크로몰 (μmole) 알파-토코페롤 당량의 항산화 활성을 갖는다.

본 발명의 항산화제 조성물은 또한 높은 안정성, 특히 열적 안정성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 100℃, 바람직하게는 10 mmHg 절대 이하의 진공 하에 12 시간 동안 인큐베이션한 후 아스타잔틴 수준에서 5% (w/w) 미만의 분해를 나타낸다. 바람직하게는, 항산화제 조성물은 100℃, 바람직하게는 10 mmHg 절대 이하의 진공 하에 12 시간 동안 인큐베이션한 후 아스타잔틴 수준에서 2% (w/w) 미만의 분해를 나타낸다. 더욱 바람직하게는, 항산화제 조성물은 100℃, 바람직하게는 10 mmHg 절대 이하의 진공 하에 12 시간 동안 인큐베이션한 후 아스타잔틴 수준에서 분해를 나타내지 않는다. 아스타잔틴 수준의 분해는 기준선 아스타잔틴 수준 (%w/w) 과 비교하여 아스타잔틴 수준 (%w/w) 의 감소로서 정의된다. 이는 예를 들어 HPLC 정상 상에 의해 측정될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 항산화제 조성물은 무취 및 무미이며, 이는 종래 기술의 항산화제 조성물에 비해 추가의 이점을 제공한다.

놀랍게도, 본 발명의 특정 방법에 의해 수득되는 조성물이 우수한 항산화제 및/또는 열안정 및/또는 후각 특성을 갖는 독특한 조성물을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 이론에 구애됨이 없이, 본 발명자들은 이것이 성분의 특정 조성 때문이라고 믿는다. 예를 들어, 본 발명자들은 아미노산, 및 특히 류신 (Leu), 이소류신 (Ile) 및 발린 (Val) 을 포함하는 분지쇄 아미노산 (BCAA) 이 아스타잔틴의 항산화 활성, 안정성 및/또는 후각 특성을 향상시킬 수 있다고 생각한다. 유사하게, 본 발명자들은 망간, 구리 및 아연이 아스타잔틴의 항산화 활성, 안정성 및/또는 후각 특성을 향상시킬 수 있다고 믿는다. 그리고 본 발명자들은 인지질이 아스타잔틴의 항산화 활성, 안정성 및/또는 후각 특성을 향상시킬 수 있다고 믿는다.

놀랍게도, 본 발명의 고체 항산화제 조성물은 건조, 분말 형태에서 안정할 뿐만 아니라 오일에 분산될 때에도 안정하다.

이에, 본 발명은 고체 항산화제 조성물을 오일 내에 포함하는 유성 분산액을 추가로 제공한다. 고체 항산화제 조성물은 상기 오일에 약 10% (w/w), 또는 약 20% (w/w), 또는 약 30% (w/w), 또는 약 40% (w/w), 또는 약 50% (w/w), 또는 약 60% (w/w), 또는 약 70% (w/w), 또는 그 사이의 임의의 값의 양으로 포함될 수 있다.

오일은 의도된 목적에 적합한 임의의 오일일 수 있다. 예를 들어, 오일은 식용유, 또는 약학적으로 허용가능한 오일, 또는 식물성 오일과 같은 화장용으로 허용가능한 오일일 수 있다. 적합한 식물성 오일의 예는 해바라기유, 올리브유, 코코넛유, 대두유, 평지씨유, 칸나비디올 (CBD) 오일 및 팜유를 포함한다. 적합한 화장용으로 허용가능한 오일은, 예를 들어, 보라지 종자 오일, 석류 종자 오일, 달맞이꽃 오일 등이다. 이러한 분산 오일은 본 발명의 고체 항산화제 조성물의 교반, 균질화, 또는 압력-균질화, 및 당업자에게 공지된 다른 산업적 블렌딩 방법에 의해 제조될 수 있다. 전형적으로, 분산은 실온 내지 약 80℃ 의 온도에서 수행되어, 안정화된 오일계 항산화제 조성물을 제공한다.

본 발명은 항산화제 조성물을 제조하는 방법에 의해 수득되는 항산화제 조성물을 제공하며, 상기 방법은 모든 이들의 구현예와 함께 본원에 정의된 단계 (a) 내지 (g) 를 포함한다.

항산화제 조성물은 투약 형태, 예를 들어 캡슐 또는 연질 캡슐, 경질 캡슐, 정제와 같은 경구 투약 형태 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 적합한 투약 형태로 추가로 제형화될 수 있다.

하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 항산화제 액체 추출물, 또는 본 발명의 고체 항산화제 조성물을 포함하는 유성 분산액을 포함하는 경구 투약 형태를 제공한다. 경구 투약 형태는 바람직하게는 캡슐 또는 연질 캡슐이다.

항산화제 추출물 및 조성물의 용도

자유 라디칼 및 일중항 산소를 포함하는 수많은 반응성 산소 종 (ROS) 은 체내에서 그리고 외부 환경 요인에 의해 생성된다. 이들이 인체의 세포에 도달하면, 이러한 고반응성 종은 DNA, 지질 및 단백질을 직접적으로 손상시킬 수 있다. 이러한 산화적 스트레스는 심혈관 질환, 당뇨병, 및 신경퇴행성 질환을 포함하는 많은 질환의 발병에 중추적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 이들 병리 중 다수는 체액 및 조직 중의 산화가능한 지질의 과산화와 관련된다. 예를 들어, 지질 과산화는 막 기능을 손상시키고 단백질 및 효소를 불활성화시킨다. 따라서, 지질 과산화의 억제는 산화 스트레스의 유해한 효과를 억제할 수 있는 것으로 여겨지며, 이는 산화 스트레스-관련 질환의 예방 및/또는 치료를 도울 수 있다. 이들의 높은 항산화 활성을 고려하여, 본 발명의 항산화제 액체 추출물 및 조성물은 산화적 스트레스를 감소시킬 수 있으며, 예를 들어 체액 및 조직 내의 산화성 지질의 과산화를 감소시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 식이 보충제, 영양 보충제, 식품 보충제, 음료 보충제, 사료 착색제 또는 식품 첨가제와 같은 사료 첨가물로서 본원에 제공된 항산화제 조성물 및/또는 항산화제 액체 추출물의 용도를 제공한다. 보충제는 임의의 식용 형태, 예를 들어 식용 캔디, 식용 구미, 초콜릿, 바 또는 식용 음료의 형태일 수 있다. 항산화제 조성물 및/또는 항산화제 액체 추출물은 이러한 보충제 또는 첨가제에 분산 오일로서 첨가될 수 있다. 항산화제 조성물은 이러한 보충제 또는 첨가제에 분말로서 첨가될 수 있다.

또한, 본원에는 스포츠, 예를 들어 운동 후 근육 손상 예방 및 관절 및 근육 통증 감소, 및 근육 성능 및 강도-지구력에 사용하기 위한 본원에 제공된 고체 항산화제 조성물을 포함하는 항산화제 액체 추출물 및/또는 항산화제 조성물 및/또는 오일 분산액이 제공된다.

피부에 직접 붙이는 아스타잔틴이 자외선 손상, 대기 오염의 영향 및 기타 피부 스트레스와 모욕을 최소화할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명은 또한 화장학에서 사용하기 위한 본원에 기재된 항산화제 조성물 및/또는 항산화제 액체 추출물을 제공한다. 일부 구현예에서, 항산화제 조성물 및/또는 항산화제 액체 추출물은 하나 이상의 화장용으로 허용가능한 부형제와 함께 화장 조성물로 제형화된다.

또한, 본원에는 요법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 고체 항산화제 조성물을 포함하는 항산화제 액체 추출물 및/또는 항산화제 조성물 및/또는 유성 분산액이 제공된다.

또한, 본원에는 만성 염증성 질환, 심혈관 질환, 신경퇴행성 질환, 암, 자가면역 질환, 면역계 및 간 질환으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 본원에 제공된 고체 항산화제 조성물을 포함하는 항산화제 액체 추출물 및/또는 항산화제 조성물 및/또는 유성 분산액이 제공된다.

바람직하게는, 간 질환은 알코올성 지방간 질환 (AFLD), 비알코올성 지방간염 (NASH) 및 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD) 으로부터 선택된다.

바람직하게는, 만성 염증성 질환은 류마티스 관절염 (RA) 또는 아토피 피부염이다.

바람직하게는, 심혈관 질환은 심장 마비 후 죽상동맥경화증 및 재활이다.

신경퇴행성 질환은 다발성 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 또는 프리온병일 수 있다. 바람직하게는, 신경퇴행성 질환은 파킨슨병이다.

본 발명의 용도의 일부 구현예에서, 항산화제 액체 추출물 및/또는 항산화제 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 분산 오일로서 투여된다. 일부 구현예에서, 항산화제 액체 추출물 및/또는 항산화제 조성물은 투약 형태, 예를 들어 캡슐 또는 연질 캡슐, 경질 캡슐, 정제와 같은 경구 투약 형태 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 적합한 투약 형태로 제형화될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 치료 용도를 위한 항산화제 액체 추출물 및/또는 항산화제 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 약학 조성물로 제형화된다.

실시예

실시예 1: 파피아 로도자이마 유래의 항산화제 액체 추출물

10% (w/w) 아스타잔틴을 함유하는 시판되는 조류 올레오레진 오일 생성물의 조성물을 단계 (a) 내지 (d) 에 따른 본 발명의 방법에 의해 제조된 파피아 로도자이마로부터 유래된 항산화제 액체 추출물과 비교하였다.

조류 올레오레진 오일 생성물에 함유된 아스타잔틴은 100% 용해되었다. 대조적으로, 본 발명의 액체 추출물은 약 25% 의 아스타잔틴을 침전물 (고체) 로서 함유하였고, 나머지 아스타잔틴 (즉, 약 75%) 은 액체 추출물 오일 분획에 용해되었다.

실시예 2: 항산화제 조성물의 미량 원소

표 1 은 10% (w/w) 아스타잔틴을 함유하는 시판되는 조류 올레오레진 오일 생성물과 단계 (a) 내지 (g) 에 따른 본 발명의 방법에 의해 제조된 항산화제 조성물 및 이어서 진공 하에 건조의 원소 분석의 비교를 나타낸다.

아미노산 수준을 Schuster et al 1988 에 따라 HPLC 에 의해 분석하였다.

금속 수준을 ICP MS 에 의해 분석하였다.

인지질을 정량적 ³¹P-NMR 에 의해 분석하였다.

표 1

단계 (a) 내지 (g) 에 따른 본 발명의 방법에 의해 제조된 본 발명에 따른 항산화제 조성물은 시판되는 조류 올레오레진 오일 생성물에 비해 아스타잔틴이 6 배 더 함유되었고, 발린, 이소류신 및 류신이 65 배 더 함유되었다. 또한, 항산화제 조성물은 훨씬 많은 양의 구리, 망간 및 아연 금속, 및 더 많은 양의 인지질을 함유하였다.

실시예 3: 열 안정성

항산화제 조성물은 본 발명의 방법의 단계 (a) 내지 (g) 에 따라 제조되고, 이어서 진공 건조기에서 건조되었다.

또한, 항산화제 조성물을 해바라기 오일에 분산시켜 10% (w/w) 아스타잔틴을 함유하는 항산화제 조성물 분산 오일을 제조하였다 (본원에서 "항산화제 조성물-10" 이라 함). 간단히, 본 발명의 방법의 단계 (a) 내지 (g) 에 따라 제조된 항산화제 조성물을 실온에서 해바라기 오일에서 격렬하게 교반하고 균질화하였다.

항산화제 조성물, 항산화제 조성물-10 및 조류 올레오레진을 열 안정성에 대해 시험하였다. 열 안정성은 기준선 아스타잔틴 수준과 비교하여 HPLC 정상 상에서 시험된 아스타잔틴 수준의 감소에 의해 결정되었다. 각 조성물 1 g 을 칭량하고, 유리 바이알에서 100℃ 에서 10 mmHg 절대 진공 하에 12 시간 동안 인큐베이션하였다. 표 2 에 제시된 열 안정성 데이터는 열 인큐베이션 전후의 아스타잔틴 조성물 수준 (% w/w) 또는 조류 올레오레진 수준 (% w/w) 이다. 이러한 결과는 항산화제 조성물 및 항산화제 조성물-10 이 조류 올레오레진에 비해 더 높은 열 안정성을 가짐을 나타낸다.

표 2 - 열 안정성 결과

실시예 4 내지 8 은 본 발명에 따른 항산화제 액체 추출물 및 항산화제 조성물이 시판되는 조류 아스타잔틴 올레오레진에 비해 산화적 스트레스에 대한 강한 항산화능을 가짐을 보여주는 시험관 내 및 생체 외 연구 결과를 나타낸다.

실시예 4 및 5 는 실시예 1 에 제시된 항산화제 액체 추출물을 사용하여 수행된 시험관 내 연구 결과를 나타낸다.

실시예 6 및 7 은 실시예 2 에 제시된 항산화제 조성물의 보충 후 임상 연구의 인간 혈청 샘플에서 수행된 생체 외 연구를 나타낸다.

실시예 8 은 실시예 2 에 제시된 항산화제 조성물의 보충 후 임상 연구의 혈장 샘플로 수행된 생체 외 분석의 결과를 보여준다.

실시예 9 는 실시예 2 에 제시된 항산화제 조성물로 보충된 임상에 참여한 대상체에게 제공된 미각 및 후각 설문지 (Taste and Smear Questionnaire) 의 결과를 나타낸다.

실시예 10 은 액체 추출물의 제조를 나타낸다.

실시예 4: C. 엘레간스 선충 모델에서 항산화제 액체 추출물의 시험관 내 - 항산화제 활성

본 발명에 따른 항산화제 액체 추출물의 항산화제 활성을 예쁜 꼬마 선충 (카에노르합디티스 엘레간스 (Caenorhabditis elegans), C. elegans) 의 생체 내 모델을 이용하여 시판중인 조류 아스타잔틴 올레오레진과 비교하였다.

본 실험을 위해, 선충 성장 배지 (NGM) 를 제조하였다. 전형적으로, NGM 배지 플레이트 (1 리터의 플레이트) 는 다음과 같이 제조된다:

1. 하기를 조합한다:

NaCl 3 g

아가 17 g

펩톤 2.5 g

콜레스테롤 (에탄올 중 5 mg/ml)

물 975 ml

2. 오토클레이브한다

3. 멸균 기술을 유지하고 각 첨가 후에 혼합하면서, 다음을 추가한다:

1 M CaCl2 1 ml

1 M MgSO4 1 ml

1M PH 6 K2HPO4 25 ml.

생체 내 모델 실험을 위해, 아스타잔틴이 없는 표준 식물성 오일이 배경 대조군으로서 역할을 하였다. 3 개의 샘플을 DMSO 에 용해시킨 다음, NGM 중 0.01 ㎎/㎖ 아스타잔틴의 최종 농도로 희석하였다. 연구 대조군은 임의의 항산화제 없이 NGM + DMSO 였다.

C. 엘레간스 선충의 동기화된 부화된 알은 식품 공급원으로서 표준 E. 콜라이 OP50 균주를 갖는 NGM 아가 플레이트 상에서 일상적으로 증식되었다. NGM 플레이트는 상이한 아스타잔틴 조성물의 존재 또는 부재 하에 제조하였다. 20℃ 에서 5 일 동안 성장시킨 후, 벌레를 2 mM H₂O₂ 를 함유하는 NGM 플레이트에 옮기고 5 시간 동안 방치하였다. 2 mM H₂O₂ 로의 인큐베이션은 급성 산화 스트레스를 유발하였다. 이어서, 선충을 세척하고, 그들의 생존력을 측정하였다. 벌레가 더 이상 프로딩 (prodding) 에 반응하지 않을 때 죽은 것으로 간주되었다. 각 섭식 조건에서 그들의 생존 점수를 결정하였다.

결과가 표 3 및 도 1 에 제시되어 있다:

항산화제 액체 추출물 함유 플레이트 상의 C. 엘레강스 벌레의 생존율은 대조군과 비교하여 14% 더 높았으며 (p-값 ≤ 0.001), 조류 아스타잔틴보다 9% 더 높았다 (이는 대조군과 비교하여 11% 였음) (하기 도 1 및 표 3 참조). 대조군과 표준 오일 사이의 생존율은 유의한 차이가 없었으며, 이는 항산화 활성이 아스타잔틴에 의해서만 기여됨을 입증한다. 본 연구는 항산화제 액체 추출물이 조류 아스타잔틴 올레오레진에 비해 급성 산화 스트레스에 대해 유의하게 높은 저항성을 제공함을 보여준다.

표 3

실시예 5: ORAC 분석에서 시험된 항산화제 액체 추출물

ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) 일중항 산소 분석을 수행하여, 본 발명에 따른 항산화제 액체 추출물이 아스타잔틴을 함유하는 시판되는 조류 아스타잔틴 올레오레진의 동등한 농도에 비해 일중항 산소에 대해 보호하는 능력이 2 배 더 높음을 입증하였다 - 표 4 의 결과를 참조한다.

표 4 는 조성물의 그램 당 "알파-토코페롤 당량" (알파-토코페롤 ep/그램) 을 지칭하며, 이는 아스타잔틴 조성물과 같은 복합 혼합물의 총 항산화 능력에 사용되는 측정치이다.　

표 4

ORAC 분석은 Ou, Boxin, Dejian Huang, and Maureen H. Woodill. U.S. Patent No. 7,132,296. 7 Nov. 2006 에 기재된 바와 같이 수행하였다.

실시예 6: 임상 파일럿 연구에서 항산화제 조성물을 대상체에게 투여한 후 인간 혈청 샘플에 대한 생체 외 지연 시간 분석

본 발명에 따른 항산화제 조성물을 생체 외 지연 시간 분석에 의해 혈청 샘플에서 혈액 지질 과산화를 보호하는 항산화 능력에 대해 시험하였다. 건강한 성인 대상체를 파일럿 임상 연구에 모집하였다. 밤샘 금식 및 고지방 아침 후, 대상체에게 50 mg 아스타잔틴을 함유하는 캡슐화된 분말 형태의 본 발명의 항산화제 조성물 또는 50 mg 아스타잔틴을 함유하는 조류 올레오레진 오일을 투여하였다. 투약전 혈액 샘플과 치료후 혈액 샘플은 각각 투약 전과 투약 8 시간 후에 채취하였다. 혈청 샘플을 혈장으로부터 분리하여 지연 시간 분석에 사용하였다.

지연 시간 분석 반응 혼합물: 13 ul 의 혈청 샘플을 720 μΜ 시트르산나트륨 완충액 및 100 μΜ 염화구리 (II) 와 함께 최종 부피 250 ul 로 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 96 Well UV-Star® Microplate 플레이트에 첨가하고 반응 전에 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 245 nm 에서의 UV 광의 흡광도를 플레이트 리더 (Infinite M200 PRO) 를 사용하여 37℃ 에서 3 분 간격으로 5 시간 동안 연속적으로 모니터링하였다.

도 2 는 항산화제 조성물 또는 조류 올레오레진의 투여 전 (투약전) 및 투여 후 8 시간에 대상체의 혈청에서 지질 과산화의 동역학을 나타낸다. 항산화제 조성물의 투여는 조류 올레오레진에 비해 혈청 지질의 급속한 산화를 더욱 강하게 지연시켰다 (도 2A 참조). 두 아스타잔틴 공급원은 지연 상에 대한 효과에서 정량적으로 유의하게 차이가 있다 (도 2B 참조). 항산화제 조성물의 연장 지연 시간은 투약전 혈청 샘플보다 상당히 더 커서 항산화 활성을 보여, 더 강한 항산화 효율을 나타낸다.

실시예 7: 통제된 임상 연구에서 항산화제 조성물을 대상체에게 투여한 후 인간 혈청 샘플에 대한 생체 외 지연 시간 분석

본 발명에 따른 항산화제 조성물을 생체 외 지연 시간 분석에 의해 혈청 샘플에서 혈액 지질 과산화를 보호하는 항산화 능력에 대해 시험하였다. 건강한 성인 대상체를 단일-센터, 개방-표지, 비-무작위, 단일-용량 연구에 모집하였다. 밤샘 금식 및 고지방 아침 후, 대상체에게 50 mg 아스타잔틴을 함유하는 캡슐화된 분말 형태의 항산화제 조성물을 투여하였다. 투약전 혈액 샘플과 치료후 혈액 샘플은 각각 투약 전과 투약 후 24 시간 동안 채취하였다. 혈청 샘플을 혈액으로부터 분리하여 지연 시간 분석에 사용하였다. 생체 외 지연 시간 분석을 실시예 6 에 기재된 바와 같이 수행하였다.

결과: 표 5 는 항산화제 조성물의 투여 전 (투약전) 및 투여 후 10-12 시간에 혈청 샘플에서 지질 과산화의 지연 시간 결과를 나타낸다. 항산화제 조성물은 투약전 시간에서 과산화에 비해 혈청 지질의 빠른 과산화를 유의하게 지연시켰다. 연구에 포함된 대상체의 연장 지연 시간 평균은 투약전 혈청 샘플에 비해 상당히 더 크고, 즉 상당히 지연되며, 이는 항산화제 조성물이 지질 과산화에 대해 상당한 보호를 제공하고, 따라서 강한 항산화제 활성을 제공한다는 것을 나타낸다. 가장 높은 지연은 투약전 수준보다 38.9% 증가한 대상체 6 에 의해 입증되었다.

표 5: 상이한 건강한 남성 성인 대상체의 지연 시간 백분율 및 투약전 지연 시간에 대한, 항산화제 조성물의 보충 후 10-12 시간에서의 지연 시간 백분율 평균.

실시예 8: 항산화제 조성물의 투여 후 대상체 혈장에서 생체 외 FRAP 분석

본 발명에 따른 항산화제 조성물을 생체 외 FRAP 분석에 의해 혈장 샘플에서 산화에 대해 보호하는 항산화 능력에 대해 시험하였다. 건강한 성인 대상체를 파일럿 임상 연구에 모집하였다. 밤샘 금식 및 고지방 아침 후, 대상체에게 50 mg 아스타잔틴을 함유하는 캡슐화된 분말 형태의 항산화제 조성물 또는 50 mg 아스타잔틴을 함유하는 조류 올레오레진 오일을 보충하였다. 투약전 혈액 샘플과 치료후 혈액 샘플은 각각 투약 전과 투약 24 시간 후에 채취하였다. 혈장 샘플을 FRAP 분석에 사용하였다. FRAP 분석은 Benzie and Strain, Analytical Biochemistry 239, 70-76 (1996) 에 기재된 바와 같이 수행하였다.

도 3 은 항산화제 조성물이 조류 조성물에 비해 항산화 능력이 더 커, 철 이온으로 환원되는 철 이온의 양을 증가시키는 효과가 2 배 이상 있음을 보여준다. 이는 인간 혈장에서 산화적 손상에 대해 더 큰 보호 능력을 입증한다.

실시예 9: 임상 연구 미각 및 후각 설문지

12 명의 대상체가 본 발명에 따른 항산화제 조성물인 조사 제품의 맛과 냄새를 평가하기 위해, 50 mg 아스타잔틴을 함유하는 캡슐화된 분말 형태의 항산화제 조성물을 투여하고 5 분 이내에 설문지에 기입하도록 하는 임상 연구에 참여하였다. 설문지에는 표 6 에 자세히 나와 있는 바와 같이 3 개의 질문과 여러 개의 답변이 포함되어 있었다.

답변 옵션의 평균 값은 항산화제 조성물을 보충한 대상체가 남아있는 맛 없이 그것의 냄새와 맛을 눈치채지 못한 것으로 기술했음을 보여준다.

표 6: 임상 연구 미각 및 후각 설문지 답변 및 결과

실시예 10: 액체 추출물의 제조

파피아 로도자이마 (0.7% w/w 의 아스타잔틴 함유) 로부터의 바이오매스 250 g 을 에틸 아세테이트 1250 ml 와 혼합하였다. 혼합물을 약 4 리터/시간의 유속으로, 비드 밀 (WAB, Dyno-Mill/Multi Lab, 0.5 mm 유리 비드로 충전함) 에 연속적으로 공급하였다. 비드 밀 출구의 온도는 30 내지 45℃ 를 유지하였다. 비드 밀링 후 물질을 유리 미세섬유 필터 시트를 통해 진공을 사용하여 부흐너 필터 (Buchner filter) 상에서 여과하였다. 케이크를 추가의 1 리터의 에틸 아세테이트로 세척하였다. 얻어진 여과액을 감압 하에서 회전 증발기에서 증발시켰으며, 수조 온도는 45℃, 재료 온도는 25 내지 35℃ 였다.

대부분의 용매를 제거한 후 (겉보기 증류액이 나오지 않을 때), 압력을 60 mmHg 절대압으로 감소시키고, 물질을 약 40℃ 에서 추가의 용매 제거를 위해 방치하였다. 상기 조건 하에서 4 시간 후, 온도를 75℃ 까지 상승시키고 물질을 이 온도에서 4 시간 더 유지시켰다.

상기 가열 단계에 이어서, 물질을 30℃ 로 냉각시키고, 5 시간 더 상기 조건에서 유지하였다. 45 g 의 액체 추출물을 수득하였다. 액체 추출물을 샘플링하고 시험하였으며, 결과는 아스타잔틴 농도가 2.9% (w/w) 이고 용해된 형태의 아스타잔틴의 함량이 총 아스타잔틴의 31% (w/w) 였음을 나타냈다.

실시예 11: 종래 기술의 전형적인 공정에 따른 항산화제 액체 추출물의 제조와 비교된 본 발명에 따른 항산화제 액체 추출물의 제조

본 실시예는 단계 (a) 내지 (c) ("파트 1" 라고 함) 를 포함하는 종래 기술의 전형적인 공정과 비교하여 본원에 개시된 단계 (a) 내지 (d) ("파트 2" 라고 함) 를 포함하는 본 발명의 공정의 비교 절차를 기재한다.

320 g 의 파피아 로도자이마 세포 바이오매스와 1500 ml 의 에틸 아세테이트를 혼합하고, 슬러리를 0.5 mm 유리 비드로 충전된 비드 밀 (WAB, Dyno-Mill/Multi Lab) 에 통과시켜 추출을 수행하였다. 온도는 섭씨 35-45 도로 유지하였다.

혼합물로부터 세포 데브리스를 제거하기 위해 진공 여과에 의해 고액 분리를 수행하였다. 수득된 액체 상을 2 개의 동일한 파트로 분리하였다:　파트 1 및 파트 2. 용매를 45℃ 의 수조 및 100 mmHg 절대압의 감압 하에 회전 증발기에 의해 각 파트로부터 제거하였다. 증발은 용매가 더 이상 증발하지 않을 때까지 계속되어, 플라스크 내에 유성으로 보이는 액체 추출물을 남겼다. 양 파트의 액체 추출물 중 총 아스타잔틴 농도는 1.5% 였다.

따라서, 파트 1 처리를 완료하였다. 고체 상은 관찰되지 않았다. 물질을 실온 (약 25℃) 으로 냉각하고 이것을 분석하기 전에 약 8 시간 동안 이 온도에서 유지시켰다.

파트 2 는 하기와 같이 가열/냉각 사이클에 적용되었다: 첫째, 이것을 100 mmHg 절대 진공하에 15 분 동안 75℃ 로 가열하였다. 물질을 섭씨 50 도에서 약 8 시간 동안 유지하여 가열을 계속하였다. 물질을 실온 (약 25℃) 으로 냉각하고 이것을 분석하기 전에 8 이상의 시간 동안 이 온도에서 유지시켰다.

아스타잔틴의 두 형태 (고체 대 액체) 의 백분율을 양 파트에서 측정하였다.

결과는 파트 1 에서 검출가능한 수준의 아스타잔틴 고체를 나타내지 않았다.

파트 2 에서, 고체 상이 검출되었고; 아스타잔틴은 용해된 형태 (아스타잔틴 용해된 형태) 및 고체 형태 (아스타잔틴 고체 형태) 둘 다로서 존재하였다. 분포는 다음과 같았다: 총 아스타잔틴의 64% 는 아스타잔틴 용해된 형태였고, 총 아스타잔틴의 36% 는 아스타잔틴 고체 형태였다.

실시예 12: 항산화제 조성물의 비교

본 실시예는 본원에 기재된 아스타잔틴 액체 추출물을 항산화제 조성물로 처리하기 위한 비교 절차를 기재한다. 에탄올 세척을 사용하는 공정 ("파트 3" 으로 함) 은 본원에 기재된 공정 단계 (f) 에 따른 물 세척을 사용하는 공정 ("파트 4" 로 함) 과 비교된다.

400 g 의 파피아 로도자이마 세포 바이오매스와 4000 ml 의 에탄올 (99% 순도) 을 혼합하고, 슬러리를 0.5 mm 유리 비드로 충전된 비드 밀 (WAB, Dyno-Mill/Multi Lab) 에 통과시켜 추출을 수행하였다.

혼합물로부터 세포 데브리스를 제거하기 위해 진공 여과에 의해 고액 분리를 수행하였다. 수득된 액체 상을 2 개의 동일한 파트로 분리하였다: 파트 3 및 파트 4. 용매를 55℃ 의 수조 및 100 mmHg 절대압의 감압 하에 회전 증발기에 의해 각 파트로부터 제거하였다. 증발은 더 이상의 용매가 증발되지 않을 때까지 계속되었다. 대략 40 g 의 유성 액체 추출물이 각각의 파트에 대해 남아있다.

두 파트는 하기와 같이 가열/냉각 사이클에 적용되었다: 첫째, 이것을 100 mmHg 절대 진공하에 15 분 동안 75℃ 로 가열하였다. 물질을 섭씨 50 도에서 8 시간 동안 유지하여 가열을 계속하였다. 두 물질을 실온 (약 25℃) 으로 냉각하고 이들을 분석하기 전에 8 이상의 시간 동안 이 온도에서 유지시켰다. 두 부분 모두에서, 고체 상이 관찰되었고 분리되었다 (본원에 기재된 공정 단계 (e)).

파트 3 - 분리된 고체를 50 ml 의 에탄올로 세척한 후, 고액 분리하였다 (본원에 기재된 공정 단계 (g)).

파트 4 - 분리된 고체를 50 ml 의 탈이온수로 세척한 후 (본원에 기재된 공정 단계 (f)), 고액 분리하였다 (본원에 기재된 공정 단계 (g)).

두 정제된 고체를 80℃ 및 2 mbar 의 감압 하에 12 시간 동안 건조시켰다.

샘플을 양성자 NMR (pNMR) 에 의해 인지질 함량을 분석하였고, 그 결과를 하기 표 7 에 나타내었다.

표 7

실시예 13: 액체 추출물의 제조 및 아스타잔틴의 이성질체 형태의 분석, 및 항산화제 조성물의 제조

파피아 로도자이마 (0.85% w/w 의 아스타잔틴 함유) 로부터의 바이오매스 75 g 을 에틸 아세테이트 750 ml 와 혼합하였다. 혼합물을 약 4 리터/시간의 유속으로, 비드 밀 (WAB, Dyno-Mill/Multi Lab, 0.5 mm 유리 비드로 충전함) 에 연속적으로 공급하였다. 비드 밀의 출구의 온도는 30 내지 45℃ 로 유지하였다. 비드 밀링 후 물질을 유리 미세섬유 필터 시트를 통해 진공을 사용하여 부흐너 필터 (Buchner filter) 상에서 여과하였다. 케이크를 추가의 1 리터의 에틸 아세테이트로 세척하였다. 얻어진 여과액을 감압 하에서 회전 증발기에서 증발시켰으며, 수조 온도는 더이상 용매가 증발하지 않을 때까지 40-45℃ 였다. 이어서, 물질을 이들 조건 하에 4 시간 더 방치하였다. 그 후, 배스 온도를 75℃ 까지 증가시키고 물질을 이 온도에서 4 시간 더 유지시켰다.　

상기 가열 단계에 이어서, 물질을 섭씨 30 도로 냉각시키고, 5 시간 더 상기 조건에서 유지하였다. 6.2% (w/w) 의 아스타잔틴을 함유하는 10 g 의 액체 추출물의 양을 얻었다.

추출물을 원심분리 (1 분, 4500 rcf, 주위 온도) 에 적용하였다. 원심분리 튜브에서 2 개의 상이 관찰되었고, 액체를 경사분리하였다. 6 그램의 액상이 얻어지고, 나머지는 튜브의 바닥에 고체였다. 분석은 용해된 형태의 아스타잔틴이 액체 추출물 중 총 아스타잔틴의 15% (w/w) 임을 나타냈다 (따라서 85% 는 고체 아스타잔틴이었다).

아스타잔틴 이성질체 분포는 액상 및 고상 모두에 대해 결정되었다. 결과를 하기 표 8 에 나타낸다:

표 8

분리된 고체를 탈이온수 (80℃, 15 분) 와 1:4 (고체:탈이온수) 의 비율로 잘 혼합하여 정제하였다. 고액 분리를 진공 여과로 수행하고, 분리된 고체를 항산화제 조성물을 제조하기 위해, 80℃ 에서 추가 25 ml 의 탈이온수로 세척하였다.

세척된 고체를 8 시간 동안, 100℃ 및 10 mBar 의 감압 동안 진공 건조기에서 추가로 건조시켰다. 45% (w/w) 아스타잔틴을 함유하는 물질 1.3 g 의 양을 건조 후에 수득하였다.

Claims

항산화제 중합체의 제조 방법으로서, 하기 단계:
(a) 파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 세포 바이오매스를 유기 용매와 접촉시켜 혼합물을 형성하는 단계;
(b) 상기 혼합물로부터 세포 데브리스를 제거하도록 고액 분리를 수행하는 단계;
(c) 단계 (b) 로부터 수득된 생성물로부터 용매를 증발시키는 단계;
(d) 단계 (c) 로부터 수득된 생성물을 가열 및 냉각하여 항산화제 액체 추출물을 수득하는 단계;
(e) 고액 분리를 수행하여 항산화제 액체 추출물의 액체로부터 고체를 분리하는 단계;
(f) 단계 (e) 로부터 수득된 고체를 물과 혼합하는 단계; 및
(g) 고액 분리를 수행하여 고체 항산화제 조성물을 수득하는 단계
를 포함하는 항산화제 중합체의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (c) 로부터 수득된 생성물은 약 40 내지 약 85℃ 의 온도로 가열되는 항산화제 액체 추출물의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 냉각은 약 40℃ 미만의 온도에서 수행되는 항산화제 액체 추출물의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f) 에서 물은 1:2 내지 1:50 의 고체의 중량:물의 중량 비로 단계 (e) 로부터 수득된 고체와 혼합되는 항산화제 조성물의 제조 방법.
파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 로부터 유래된 항산화제 액체 추출물로서, 상기 액체 추출물은 2 개의 구별되는 분획: 고체 아스타잔틴을 포함하는 고체 분획 및 용해된 아스타잔틴을 포함하는 오일 분획으로 구성되는 항산화제 액체 추출물.
제 5 항에 있어서, 상기 항산화제 액체 추출물에 포함된 아스타잔틴의 적어도 약 10% (w/w) 는 고체 아스타잔틴의 형태인 항산화제 액체 추출물.
파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) 로부터 유래된 항산화제 조성물로서, 하기 성분을 포함하는 항산화제 조성물:
- 아스타잔틴; 및
- 적어도 하나의 아미노산, 또는
- 구리, 망간 및 아연으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 금속, 또는
- 인지질;
이때 항산화제 조성물은 고체임.
제 7 항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산은 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 글리신 및 페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항산화제 조성물.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 항산화제 조성물이 적어도 약 1 ppm 의 양의 구리; 적어도 약 0.5 ppm 의 양의 망간; 및/또는 적어도 약 10 ppm 의 양의 아연을 포함하는 항산화제 조성물.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 항산화제 조성물이 오일, 바람직하게는 식용유에 분산되어 있는, 또는 항산화제 조성물이 분말 형태인 항산화제 조성물.
제 5 항 또는 제 6 항에 따른 항산화제 액체 추출물, 또는 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 항산화제 조성물을 포함하는 경구 투약 형태.
(i) 식이 보충제, 영양 보충제, 식품 보충제, 음료 보충제, 또는 식품 첨가제로서의, 또는 (ii) 스포츠에서, 바람직하게는 운동 후 근육 손상을 방지하고 관절 및 근육 통증을 감소시키며 근육 성능 및 강도-지구력을 위한 것인, 제 5 항 또는 제 6 항에 따른 항산화제 액체 추출물, 및/또는 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 항산화제 조성물, 또는 제 11 항에 따른 경구 투약 형태의 용도.
요법에 사용하기 위한, 제 5 항 또는 제 6 항에 따른 항산화제 액체 추출물, 및/또는 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 항산화제 조성물, 또는 제 11 항의 경구 투약 형태.
만성 염증성 질환, 심혈관 질환, 신경퇴행성 질환, 암, 자가면역 질환, 및 간 질환으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 제 5 항 또는 제 6 항에 따른 항산화제 액체 추출물, 및/또는 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 항산화제 조성물, 또는 제 11 항의 경구 투약 형태.