KR20220122652A

KR20220122652A - TNFα 및 IL-23을 표적화하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드

Info

Publication number: KR20220122652A
Application number: KR1020227022860A
Authority: KR
Inventors: 헤이디 롬멜라에르; 크리스티안 아스브란트; 안 브리제; 시그리드 코르넬리스; 에릭 로렌트
Original assignee: 아블린쓰 엔.브이.; 사노피
Priority date: 2019-12-06
Filing date: 2020-12-03
Publication date: 2022-09-02
Also published as: CA3163877A1; US11332525B2; IL293561A; MX2022006880A; US20220064281A1; US20220372128A1; AU2020396204A1; US20210188963A1; CN114981300A; CO2022009239A2; JP2023505492A; EP4069733A1; US20220363747A1; BR112022009799A2; WO2021110816A1; TW202134269A

Abstract

본 발명의 기술은 새로운 유형의 약물을 제공하는 것을 목표로 한다. 구체적으로, 본 발명의 기술은 적어도 1개의 ISVD가 TNFα에 결합하고 적어도 2개의 ISVD가 IL-23에 결합하는 것을 특징으로 하는, 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 기술은 또한 핵산, 벡터 및 조성물을 제공한다.

Description

TNFα 및 IL-23을 표적화하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드

1. 본 발명의 기술 분야

본 발명의 기술은 TNFα 및 IL-23의 p19 서브유닛을 표적화하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 이는 또한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 및 핵산을 포함하는 벡터, 그리고 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 기술은 또한 염증성 장 질환, 건선, 건선성 관절염 또는 화농성 한선염을 앓는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 이들 산물에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 기술은 이러한 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

2. 기술 배경

자가면역 또는 염증성 질환은 신체가 자신의 조직에 대해 생성하는 면역 반응의 결과이다. 자가면역 또는 염증성 질환은 종종 만성적이며 생명을 위협할 수도 있다. 특히, 자가면역 또는 염증성 질환은 크론병 및 궤양성 결장염과 같은 염증성 장 질환, 건선, 건선성 관절염 및 화농성 한선염을 포함한다. 크론병 및 궤양성 결장염과 같은 염증성 장 질환은 장 염증 및 수반되는 상피 손상이 관여되는 만성 염증성 질환이다. 건선, 건선성 관절염 및 화농성 한선염과 같은 기타 만성 자가면역 질환은 붉고 건조하고 가렵거나 비늘 모양의 피부 패치, 관절의 통증성 염증 또는 피부의 염증이 생긴 부은 덩어리를 특징으로 한다. 건선을 앓는 환자는 당뇨병 및 크론병이나 궤양성 결장염과 같은 염증성 장 질환 및 암을 포함하는 특정 동반이환을 가질 가능성이 더 높다는 것이 확인되었다.

인터루킨 23(IL-23)은 만성 염증의 유도 동안 다양한 면역 세포의 활성화에 중요한 사이토카인이다. IL-23은 사이토카인 IL-6, IL-17, GM-CSF 및 IL-22의 상류 조절인자이며 p40 서브유닛(p40 서브유닛은 사이토카인 IL-12와 공유되며 IL-12 베타 서브유닛으로도 나타냄)에 공유 결합된 p19 서브유닛(IL-23 알파 서브유닛, 본원에서는 IL-23p19로도 나타냄)으로 구성되는 이종이량체이다. 또한, IL-23은 T 세포 염증 면역 반응뿐만 아니라 선천성 림프 세포의 염증 활성 조절에 중요한 역할을 한다. IL-23은 염증성 장 질환 및 기타 자가면역 질환을 포함하는 염증성 질환에 연루되었다.

종양 괴사 인자 알파(TNFα)는 주로 단핵구 및 대식구에 의해 생성되지만, CD4⁺및 CD8⁺ 말초혈 T 림프구에 의해 분비되는 것이 또한 알려진 동종삼량체 사이토카인이다. TNFα는 가용성 형태 또는 막통과 단백질로 존재할 수 있다. TNFα의 주요 역할은 면역 세포의 조절에 있다. TNFα는 내인성 발열원으로 작용하고 그 생산의 조절이상은 염증성 장 질환 및 건선과 같은 기타 자가면역 질환을 포함하는 다양한 인간 질환에 연루되어 있다.

현재 FDA에서 염증성 장 질환에 대해 승인된 치료제는 항-TNFα 생물학적 제제(예를 들어, Simponi®[골리무맙], Enbrel®[에타네르셉트], Remicade®[인플릭시맙] 및 Humira®[아달리무맙])를 포함한다. 그러나 염증성 장 질환에 대한 현재의 항-TNFα 치료는 큰 백분율의 환자가 현재 이용 가능한 치료에 반응하지 않는 데 직면하고 있으며, 항-TNFα 치료에 대한 반응 상실은 치료 12개월 후 높은 백분율의 환자에서 발생한다.

건선 및 건선성 관절염의 경우, 소수의 환자만이 생물학적 제제(REMICADE® [인플릭시맙] 및 HUMIRA®[아달리무맙]뿐만 아니라 사이토카인 IL-12 및 IL-23의 공유 p40 서브유닛을 표적화하는 STELARA®[우스테키누맙] 포함)로 치료된다. 구셀쿠맙(Tremfya; 건선에 대해 승인되었고 염증성 장 질환 및 건선성 관절염에 대해 임상 3상 중임) 및 리산키주맙(Skyrizi; 건선에 대해 승인되었고 건선성 관절염 및 크론병에 대해 임상 3상 중임)을 포함하는 IL-23을 표적화하는 추가 항체 치료제가 추진되고 있다. p19를 표적화하는 항-IL-23 항체 클래스는 건선에서 일부 질환 억제 유효성을 부여할 수 있지만, 상이한 및/또는 추가 자가면역 질환을 가진 환자가 반드시 이러한 치료로부터 동일한 정도로 이익을 얻는 것은 아니다. 예를 들어, 건선성 관절염에서 항-IL23으로의 치료는 염증이 있는 관절의 반응을 개선하지 않는다. 염증성 장 질환에서 환자의 절반 초과가 TNF 억제제에 반응하지 않거나 반응을 상실한다. 화농성 한선염도 마찬가지인데, 현재까지 승인된 치료제는 HUMIRA®[아달리무맙]뿐이지만 환자의 약 50%만 반응한다.

다중 질환 인자를 표적화하는 것은 예를 들어 2개의 개별 생물학적 제제, 예를 들어 상이한 치료 표적에 결합하는 항체의 공동 투여 또는 조합 사용에 의해 달성될 수 있다. 그러나 별도의 생물학적 제제의 공동 투여 또는 조합 사용은 실용적 및 상업적 관점 둘 모두에서 어려울 수 있다. 예를 들어, 별도 제품을 두 번 주사하면 환자에게 더 불편하고 고통스러운 치료 요법을 초래하며 이는 순응도에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 2개의 별도 제품의 단회 주사와 관련하여, 필요한 농도에서 허용 가능한 점도 및 2개 제품의 적절한 안정성을 허용하는 제형을 제공하는 것이 어렵거나 불가능할 수 있다. 또한, 공동 투여 및 공동 제형화는 전체 비용을 증가시킬 수 있는 2개의 개별 약물의 생산을 필요로 한다.

2개의 상이한 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 항체가 항체와 같은 별도의 생물학적 제제의 공동 투여 또는 조합 사용과 연관된 이러한 제한을 해결하기 위한 하나의 전략으로 제안되었다.

이중특이적 항체 작제물은 여러 형식으로 제안되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체 형식에는 2개의 항체 또는 이의 단편의 화학적 접합이 관여될 수 있다(Brennan, M, et al., Science, 1985. 229(4708): p. 81-83; Glennie, MJ, et al., J Immunol, 1987. 139(7): p.2367-2375). 특정 형식에서, 특정 항원에 결합하는 단일쇄 Fv(scFv) 단편은 별도의 항원에 결합하는 IgG 항체에 결합된다(예를 들어, 항-TNFα/항-IL-23 IgG-scFv 이중특이적 항체를 설명하는 WO 2016/073406). WO 2019/027780에는 한 쌍의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 TNFα를 표적화하고 다른 한 쌍의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 IL-23을 표적화하는 이종이량체 IgG 항체가 기재되어 있다.

그러나 이러한 이중특이적 항체 형식의 단점은 고농도에서 점도가 높아, 예를 들어 피하 투여를 어렵게 하고, 각 결합 단위가 특이적인 고친화도 결합을 위해 2개의 가변 도메인의 상호작용을 필요로 한다는 점에서, 폴리펩티드의 생산 안정성 및 효율에 대한 영향을 포함한다. 이러한 이중특이적 항체 형식은 또한 경쇄의 미스페어링 또는 중쇄의 미스페어링과 관련된 화학, 제조 및 관리(CMC) 문제를 잠재적으로 야기할 수 있다.

3. 본 기술의 요약

일부 구현예에서, 본 발명의 기술은 TNFα 및 IL-23을 특이적으로 표적화하는 폴리펩티드 또는 작제물에 관한 것이다. TNFα 및 IL-23의 동시 표적화는 단일특이적 항-TNFα 또는 항-IL-23 폴리펩티드와 비교하여 염증 반응을 조절하는 효율 증가를 야기한다.

상기 폴리펩티드는 TNFα 및 IL-23(예를 들어, 인간 및 cyno TNFα 및 IL-23)에 대해 매우 강력한 효능을 나타내었고, 효율적으로 제조될 수 있으며(예를 들어, 피치아(Pichia), 예를 들어 피치아 파스토리스(P. Pastoris) 같은 미생물 숙주에서) 고농도에서 낮은 점도를 나타냈으며 이는 피하 투여에 유리하고 편리하다. 또한, 이러한 폴리펩티드는 치료받을 대상체의 기존 항체(즉, 항체 작제물로의 최초 치료 전에 대상체에 존재하는 항체)에 대해 제한된 반응성을 갖는 것으로 나타날 수 있다. 다른 구현예에서, 이러한 폴리펩티드는 연속 치료가 편리하게 이격될 수 있도록 충분히 긴 반감기를 치료받을 대상체에서 나타낸다.

본 발명의 기술의 폴리펩티드는 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되며, 적어도 하나의 ISVD는 TNFα에 특이적으로 결합하고 적어도 2개의 ISVD는 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합한다. 하나의 구현예에서, TNFα에 결합하는 적어도 하나의 ISVD는 인간 TNFα에 특이적으로 결합하고, IL-23에 결합하는 적어도 2개의 ISVD는 인간 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합한다.

하나의 구현예에서, 폴리펩티드는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 결합된, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들어, 결합 단위는 인간 혈청 알부민과 같은 (인간) 혈청 단백질에 결합하는 ISVD일 수 있다.

또한, 본 발명의 기술의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 핵산 분자, 핵산을 포함하는 벡터, 그리고 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명의 기술의 폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 및 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물은 약제로서 사용될 수 있다. 약제로 사용하기 위한 폴리펩티드는 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되며, 각각의 상기 ISVD는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 결합된, 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고; 여기서

a) 제1 ISVD는 다음을 포함하고:

i. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3;

b) 제2 ISVD는 다음을 포함하고:

iv. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

v. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

vi. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3; 및

c) 제3 ISVD는 다음을 포함하고:

vii. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

viii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

ix. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3,

ISVD는 N-말단에서 시작하는 순서로 있다.

본 발명의 기술의 조성물은 약제로 사용하기 위한 것이다. 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트를 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가의 약학 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학 조성물일 수 있다.

이러한 폴리펩티드(조성물에 존재할 수 있거나 핵산에 의해 암호화될 수 있음)는 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되며, 각각의 상기 ISVD는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 결합된, 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기서

a) 제1 ISVD는 다음을 포함하고:

b) 제2 ISVD는 다음을 포함하고:

c) 제3 ISVD는 다음을 포함하고:

ISVD는 N-말단에서 시작하는 순서로 있다.

하나의 구현예에서, 폴리펩티드는 TNFα 및 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합한다. 하나의 구현예에서, 폴리펩티드는 인간 TNFα 및 인간 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합한다. 하나의 구현예에서, 폴리펩티드에 존재하는 제1 ISVD는 TNFα에 특이적으로 결합하고, 폴리펩티드에 존재하는 제2 및 제3 ISVD는 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합한다. 하나의 구현예에서, 폴리펩티드에 존재하는 제1 ISVD는 인간 TNFα에 특이적으로 결합하고, 폴리펩티드에 존재하는 제2 및 제3 ISVD는 인간 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합한다.

본 발명의 기술의 폴리펩티드는 다음을 포함할 수 있다:

a) 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는 제1 ISVD;

b) 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는 제2 ISVD; 및

c) 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는 제3 ISVD.

본 발명의 기술의 폴리펩티드는 다음을 포함할 수 있다:

a) 서열번호 2와 90% 초과(예를 들어, 95%)의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 제1 ISVD;

b) 서열번호 3과 90% 초과(예를 들어, 95%)의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 제2 ISVD; 및

c) 서열번호 5와 90% 초과(예를 들어, 95%) 동일성의 서열 동일성을 포함하는 제3 아미노산 서열.

본 발명의 기술의 폴리펩티드는 다음을 포함할 수 있다:

a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제1 ISVD;

b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 제2 ISVD; 및

c) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 제3 ISVD.

본 발명의 기술의 폴리펩티드는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 결합된, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩티드로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 결합 단위는 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예를 들어, IgG), 예를 들어 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 결합 단위로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 기술의 폴리펩티드는 다음을 포함하는 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD를 포함할 수 있다:

i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3.

하나의 구현예에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다. 하나의 구현예에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 4와 90% 초과(예를 들어, 95%)의 서열 동일성을 포함한다. 하나의 구현예에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 본 발명의 기술의 폴리펩티드에서 임의의 위치(즉, N-말단, 2개의 빌딩 블록 사이 또는 C-말단)에 위치할 수 있다. 하나의 구현예에서 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는 제2 및 제3 ISVD 사이에 위치한다.

본 발명의 기술의 폴리펩티드는 서열번호 1과 90% 초과(예를 들어, 95%)의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 기술의 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

또한, 본 발명의 기술의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 제공된다.

또한, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포가 제공된다.

또한, 본 발명의 기술의 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 적어도 다음 단계를 포함한다:

a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 기술의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 발현하는 단계; 선택적으로 이어서

b) 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계.

또한, 본 발명의 기술의 적어도 하나의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 기술의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트를 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가의 약학적 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학 조성물일 수 있다.

본 발명의 기술의 폴리펩티드는 치료에서 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 기술의 폴리펩티드는 크론병 및 궤양성 결장염과 같은 염증성 장 질환, 건선, 건선성 관절염 및 화농성 한선염으로부터 선택되는 질환과 같은 자가면역 또는 염증성 질환의 치료에서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 기술은 또한 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하는 방법을 포괄한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 기술은 크론병 및 궤양성 결장염과 같은 염증성 장 질환, 건선, 건선성 관절염 및 화농성 한선염으로부터 선택된 질환을 치료하는 방법을 포괄하며, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에 약학 활성량의 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 본 발명의 기술의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 이를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

따라서, 본 발명의 기술은 또한 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에서 본 발명의 기술의 폴리펩티드의 용도를 포괄한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 기술은 또한 크론병 및 궤양성 결장염과 같은 염증성 장 질환, 건선, 건선성 관절염 및 화농성 한선염으로부터 선택되는 질환을 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에서 본 발명의 기술의 폴리펩티드의 용도를 포괄한다.

특히, 본 발명의 기술은 다음 구현예를 제공한다:

구현예 1. 약제로서 사용하기 위한, 폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로서, 폴리펩티드는 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되며, 상기 ISVD는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 결합된, 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고; 여기서

a) 제1 ISVD는 다음을 포함하고:

x. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

xi. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

xii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3;

b) 제2 ISVD는 다음을 포함하고:

xiii. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

xiv. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

xv. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3; 및

c) 제3 ISVD는 다음을 포함하고:

xvi. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

xvii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

xviii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3,

ISVD는 N-말단에서 시작하는 순서로 있는, 폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물.

구현예 2. 구현예 1에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트를 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가의 약학 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학 조성물인, 조성물.

구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 폴리펩티드는 TNFα 및 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드는 인간 TNFα 및 인간 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 제1 ISVD는 TNFα에 특이적으로 결합하고 제2 및 제3 ISVD는 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 제1 ISVD는 인간 TNFα에 특이적으로 결합하고, 제2 및 제3 ISVD는 인간 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서,

a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서,

a) 상기 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과(예를 들어, 95%)의 서열 동일성을 포함하고;

b) 상기 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과(예를 들어, 95%)의 서열 동일성을 포함하고;

c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 5와 90% 초과(예를 들어, 95%) 동일성의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서,

a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고;

b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고;

c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 결합된, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 11. 구현예 10에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 12. 구현예 10 또는 11에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 결합 단위는 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예를 들어, IgG)에 결합할 수 있는 결합 단위로 구성되는 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 13. 구현예 12에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 결합 단위는 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 ISVD인, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 14. 구현예 13에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 다음을 포함하는. 폴리펩티드 또는 조성물:

구현예 15. 구현예 13 또는 14에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 16. 구현예 13 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과(예를 들어, 95%)의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 17. 구현예 13 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 1과 90% 초과(예를 들어, 95%)의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 자가면역 질환 또는 염증성 질환, 예컨대 크론병 및 궤양성 결장염과 같은 염증성 장 질환, 건선, 건선성 관절염 및 화농성 한선염으로부터 선택된 질환의 치료에서 사용하기 위한 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 21. 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드로서, 각각의 상기 ISVD는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 결합된, 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하며; 여기서

a) 제1 ISVD는 다음을 포함하고:

b) 제2 ISVD는 다음을 포함하고:

c) 제3 ISVD는 다음을 포함하고:

ISVD는 N-말단에서 시작하는 순서로 있는, 폴리펩티드.

구현예 22. 구현예 21에 있어서, 폴리펩티드는 TNFα 및 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.

구현예 23. 구현예 21 또는 22에 있어서, 폴리펩티드는 인간 TNFα 및 인간 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.

구현예 24. 구현예 21 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 제 1 ISVD는 TNFα에 특이적으로 결합하고 제2 및 제3 ISVD는 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는, 폴리펩티드.

구현예 25. 구현예 21 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 제1 ISVD는 인간 TNFα에 특이적으로 결합하고 제2 및 제3 ISVD는 인간 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는, 폴리펩티드.

구현예 26. 구현예 21 내지 25 중 어느 하나에 있어서,

c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드.

구현예 27. 구현예 21 내지 26 중 어느 하나에 있어서,

c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 5와 90% 초과(예를 들어, 95%) 동일성의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩티드.

구현예 28. 구현예 21 내지 27 중 어느 하나에 있어서,

a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고;

b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고;

c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.

구현예 29. 구현예 21 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 결합된, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는, 폴리펩티드.

구현예 30. 구현예 29에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.

구현예 31. 구현예 29 또는 30에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예를 들어, IgG)에 결합할 수 있는 결합 단위로 구성되는 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.

구현예 32. 구현예 31에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 결합 단위는 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 ISVD인, 폴리펩티드.

구현예 33. 구현예 32에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 다음을 포함하는 폴리펩티드:

구현예 34. 구현예 32 또는 33에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드.

구현예 35. 구현예 32 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과(예를 들어, 95%)의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩티드.

구현예 36. 구현예 32 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩티드.

구현예 37. 구현예 21 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 1과 90% 초과(예를 들어, 95%)의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩티드.

구현예 38. 구현예 21 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드.

구현예 39. 구현예 21 내지 38 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.

구현예 40. 구현예 39에 따른 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포.

구현예 41. 구현예 21 내지 38 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 적어도 다음 단계를 포함하는 방법:

a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서 구현예 39에 따른 핵산을 발현하는 단계; 선택적으로 이어서:

b) 구현예 21 내지 38 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계.

구현예 42. 구현예 21 내지 38 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드, 또는 구현예 39에 따른 핵산을 포함하는 조성물.

구현예 43. 구현예 42에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트를 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가의 약학 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학 조성물인 조성물.

구현예 44. 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 약학 활성량의 구현예 21 내지 38 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 구현예 42 또는 43에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.

구현예 45. 구현예 44에 있어서, 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 크론병 및 궤양성 결장염과 같은 염증성 장 질환, 건선, 건선성 관절염 및 화농성 한선염으로부터 선택되는, 방법.

구현예 45. 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에서 구현예 21 내지 38 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 구현예 42 또는 43에 따른 조성물의 용도.

구현예 46. 구현예 45에 있어서, 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 크론병 및 궤양성 결장염과 같은 염증성 장 질환, 건선, 건선성 관절염 및 화농성 한선염으로부터 선택되는, 폴리펩티드 또는 조성물의 용도.

4. 도면의 간단한 설명
도 1: 인간 혈청 알부민(HSA)을 통해 포획된 F027500069에 대한 TNFα 및 IL-23의 동시 결합을 보여주는 센서그램.
도 2: F027500069 및 항-hTNFα 참조 mAb에 의한 Glo response™ HEK293_NFκB-NLucP 리포터 검정에서 가용성 인간(a) 및 cyno(b) TNFα의 억제. IRR00096은 음성 대조군 V_HH이다. 데이터포인트는 전역 평균 값(n=2)이고 오차 막대는 +/- SD를 나타낸다.
도 3: F027500069, 항-hIL-23 참조 mAb1, 항-hIL-23 참조 mAb2에 의한 Glo response™ HEK293_인간 IL-23R/IL-12Rb1-Luc2P 리포터 검정을 사용한 인간(a) 및 cyno(b) IL-23의 억제. IRR00096은 음성 대조군 V_HH이다. 데이터포인트는 전역 평균 값(n=2)이고 오차 막대는 +/- SD를 나타낸다.
도 4: 대조군 F027301099와 비교하여 F027500069에 대한 96개의 인간 혈청 샘플에 존재하는 기존 항체의 결합을 보여주는 상자 그래프.
도 5: 대조군 폴리펩티드 F027301099 및 F027301186과 비교하여 F027500069, F027500093, F027500095 및 F027500096에 대한 96개의 인간 혈청 샘플에 존재하는 기존 항체의 결합을 보여주는 상자 그래프.
도 6: Tg197 인간 TNF 트랜스제닉 마우스 모델에서 다발관절염의 억제. 상이한 처리군(n=8마리 마우스/군)에서 경시적인 관절염 스코어를 표시한다. 동물은 6주령에 시작하여 주 2회 표시된 화합물의 복강내 주사를 수여받았다. 평균 주간 관절염 스코어 ± SEM을 나타낸다. 통계는 2-웨이 ANOVA 및 본페로니(Bonferroni) 다중 비교 시험이다.
도 7: 경시적인 Tg197 마우스 모델에서 관절염 스코어에 대한 곡선 하 면적의 막대 그래프. 개별 값(기호) 및 평균 ± SEM(막대)을 나타낸다. 통계는 1-웨이 ANOVA 및 본페로니 다중 비교 시험이다.
도 8: Tg197 마우스 모델의 발의 조직학 스코어의 막대 그래프. 개별 값(기호) 및 평균 ± SEM(막대)을 나타낸다. 통계는 1-웨이 ANOVA 및 본페로니 다중 비교 시험이다.
도 9: 인간 IL-23 모델에서 피부 염증의 억제. 막대 그래프는 상이한 처리 군(n=10마리 마우스/군)의 귀 피부 부종을 예시한다. 동물은 제1일부터 제4일까지 재조합 인간 IL-23 또는 PBS의 매일 피내 주사를 수여받았다. 동물은 제1일 및 제3일에 표시된 화합물의 복강내 주사를 수여받았다. 제5일에 기준선으로부터의 귀 피부 두께 평균 변화 ± SEM을 나타낸다. 통계는 ANOVA 및 본페로니 다중 비교 시험이다.
도 10: 인간 IL-23-유도 피부 염증 모델의 제5일에 피부 생검으로부터의 조직 IL-22 농도의 막대 그래프. 개별 값(기호) 및 평균 ± SEM(막대)을 나타낸다. 통계는 ANOVA 및 본페로니 다중 비교 시험이다.
도 11: 복강내 및 피하 경로 둘 모두에 의해 투여된 F027500069에 의한 피부 염증의 억제. 막대 그래프는 상이한 처리군(n=8마리 마우스/군)의 귀 피부 부종을 예시한다. 동물은 제1일부터 제4일까지 재조합 인간 IL-23 또는 PBS의 피내 주사를 매일 수여받았다. 표시된 용량의 복강내(IP) 또는 피하(SC) 주사는 제1일 및 제3일에 투여되었다. 제5일에 기준선으로부터의 귀 피부 두께 평균 변화 ± SEM을 나타낸다. 통계는 ANOVA 및 본페로니 다중 비교 시험이다.
도 12: 복강 내 및 피하 경로 둘 모두에 의해 전달된 F027500069를 사용하는 제5일 피부 생검으로부터의 조직 IL-22 농도 막대 그래프. 개별 값(기호) 및 평균 ± SEM(막대)을 나타낸다. 통계는 ANOVA 및 본페로니 다중 비교 시험이다.
도 13: 인간 TNFα/TNFR1 녹 인(knock in) 마우스에서의 콜라겐-항체 유도 관절염(CAIA) 모델의 관절염 스코어의 억제. 상이한 처리군(n=8마리 마우스/군)에서의 경시적인 관절염 스코어를 나타낸다. 동물은 LPS 주사 6시간 후, 제1일에 표시된 화합물의 단회 복강내 주사를 수여받았다. 평균 일일 관절염 스코어 ± SEM을 나타낸다. 통계는 2-웨이 ANOVA 및 본페로니 다중 비교 시험이다.
도 14: 인간 TNFα 녹 인 마우스(n=4마리 내지 10마리 마우스/군)에서 수행된 인간 IL-23 피부 주사 모델에서 IL-23 및 TNFα 유도 염증의 이중 억제. 동물은 제1일부터 제4일까지 재조합 인간 IL-23 또는 PBS의 피내 주사를 매일 수여받았다. 제1일 및 제3일에 표시된 화합물의 복강내 주사. 제5일에 기준선으로부터의 귀 피부 두께 평균 변화 ± SEM을 나타낸다. 통계는 ANOVA 및 본페로니 다중 비교 시험이다.
도 15: 사이토카인의 단일- 또는 이중-특이적 억제 후 염증이 있는 피부 조직에서의 차별적 피부 조직 유전자 발현. 차별적으로 발현된 유전자(DEG, p<0.001에서 변화 배율 >2)의 벤 다이어그램. F027500069의 총 769개 DEG 중 199개가 이러한 처리에 대해 특이적이었다.
도 16: 9GS 링커를 통해 결합된 1가 빌딩 블록/ISVD 6C11, 119A03/1, ALB23002 및 81A12를 N-말단에서 C-말단으로 나타내는 ISVD 작제물 F027500069의 도식적 표시.

5. 본 발명의 기술의 상세한 설명

본 발명의 기술은 크론병 및 궤양성 결장염과 같은 염증성 장 질환, 건선, 건선성 관절염 또는 화농성 한선염을 치료하기 위한 새로운 유형의 약물을 제공하는 것을 목표로 한다.

본 발명자들은 놀랍게도 적어도 하나의 ISVD가 TNFα에 특이적으로 결합하고 적어도 2개의 ISVD가 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는, 적어도 3개의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드가 단일특이적 항-TNFα 또는 항-IL-23p19 폴리펩티드와 비교하여 자가면역 또는 염증성 질환의 보다 효율적인 치료를 위해 사용될 수 있음을 확인하였다.

일부 구현예에서, 본 발명의 기술의 폴리펩티드는 TNFα 및 IL-23(예를 들어, 인간 또는 cyno TNFα 및 IL-23)에 대해 높은 효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 기술의 폴리펩티드는 (예를 들어, 피치아, 예를 들어 피치아 파스토리스와 같은 미생물 숙주에서) 효율적으로 생산된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 기술의 폴리펩티드는 고농도에서 낮은 점도를 가지며, 이는 피하 투여에 유리하고 편리하다. 또한, 일부 구현예에서, 본 발명의 기술의 폴리펩티드는 치료받을 대상체에서의 기존 항체(즉, 항체 작제물로의 최초 치료 전에 대상체에 존재하는 항체)에 대해 제한된 반응성을 갖는다. 다른 구현예에서, 이러한 폴리펩티드는 치료 대상체에서 연속 치료가 편리하게 이격될 수 있도록 충분히 긴 반감기를 나타낸다.

폴리펩티드는 적어도 이중특이적이지만, 또한 예를 들어 삼중특이적, 사중특이적 또는 오중특이적일 수 있다. 더욱이, 폴리펩티드는 적어도 3가이지만, 또한 예를 들어 4가 또는 5가일 수 있다.

용어 "이중특이적", "삼중 특이적", "사중 특이적" 또는 "오중특이적"은 모두 용어 "다중특이적"에 속하며 각각 2개, 3개, 4개 또는 5개의 상이한 표적 분자에 대한 결합을 나타낸다. 용어 "2가", "3가", "4가" 또는 "5가"는 모두 용어 "다가"에 속하며 각각 2개, 3개, 4개 또는 5개의 결합 단위(예를 들어, ISVD)의 존재를 시사한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 하나의 ISVD는 인간 TNFα에 결합하고, 2개의 ISVD는 인간 IL-23에 결합하고, 하나의 ISVD는 인간 혈청 알부민에 결합하는, 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드와 같은 삼중특이적-4가일 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 예를 들어 2개의 ISVD가 IL-23의 p19 서브유닛 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 경우에 동시에 이중파라토프일 수 있다. 용어 "이중파라토프"는 동일한 표적 분자의 2개의 상이한 부분(즉, 에피토프)에 대한 결합을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "제1 ISVD", "제2 ISVD", "제3 ISVD" 등은 ISVD의 서로에 대한 상대적인 위치만을 표시하며, 넘버링은 본 발명의 기술의 폴리펩티드의 N-말단으로부터 시작된다. 따라서 "제1 ISVD"는 "제2 ISVD"보다 N-말단에 더 가깝고, "제2 ISVD"는 "제3 ISVD"보다 N-말단에 더 가까움, 등이다. 따라서 ISVD 배열은 C-말단으로부터 고려되는 경우 반대이다. 넘버링은 절대적이지 않고 적어도 3개의 ISVD의 상대적인 위치만을 표시하기 때문에 TNFα 또는 IL-23의 p19 서브유닛에 결합하는 추가 ISVD와 같은 다른 결합 단위/빌딩 블록은 배제되지 않거나 또 다른 표적에 결합하는 ISVD가 폴리펩티드에 존재할 수 있다. 또한, ISVD와 같은 다른 결합 단위/빌딩 블록이 그 사이에 배치될 수 있는 가능성을 배제하지 않는다. 예를 들어, 아래에 추가로 설명된 바와 같이(특히 섹션 5.3 "(생체내) 반감기 연장" 참고), 폴리펩티드는 예를 들어 심지어 "제2 ISVD" 및 "제3 ISVD" 사이에 위치할 수도 있는 인간 혈청 알부민에 결합하는 또 다른 ISVD를 추가로 포함할 수 있다.

상기의 관점에서, 본 발명의 기술은 적어도 3개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드를 제공하며, 적어도 하나의 ISVD는 TNFα에 특이적으로 결합하고 적어도 2개의 ISVD는 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합한다.

IL-23에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD는 IL-23의 p19 서브유닛에 결합한다. IL-23에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD는 IL-23의 p19 서브유닛 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. IL-23에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 ISVD는 IL-23과 IL-23R 사이의 상호작용 차단 및/또는 IL-23 유도된 IL-22의 방출 억제와 같은 IL-23의 기능을 차단할 수 있다.

폴리펩티드의 구성분, 예를 들어 ISVD는 펩티드 링커와 같은 하나 이상의 적합한 링커에 의해 서로 결합될 수 있다.

2개 이상의 (폴리)펩티드를 연결하기 위한 링커의 사용은 당분야에 잘 알려져 있다. 예시적인 펩티드 링커를 표 A-5에 나타낸다. 종종 사용되는 펩티드 링커의 한 클래스는 "Gly-Ser"또는 "GS" 링커로 알려져 있다. 이들은 본질적으로 글리신(G) 및 세린(S) 잔기로 구성되는 링커이며, 보통 GGGGS(서열번호 47) 모티프와 같은 펩티드 모티프의 하나 이상의 반복부를 포함한다(예를 들어, 식 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n을 가짐(n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 이상일 수 있음)). 이러한 GS 링커의 일부 종종 사용되는 예는 9GS 링커(GGGGSGGGS, 서열번호 50), 15GS 링커(n=3; 서열번호 52) 및 35GS 링커(n=7; 서열번호 57)이다. 예를 들어 문헌[Chen et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369; 및 Klein et al., Protein Eng. Des. Sel. (2014) 27(10): 325-330]을 참조한다. 본 발명의 기술의 폴리펩티드의 하나의 구현예에서, 폴리펩티드의 구성분을 서로 결합시키기 위해 9GS 링커가 사용된다.

하나의 구현예에서, TNFα에 특이적으로 결합하는 ISVD는 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다. 본 발명자들은 놀랍게도 이러한 구성이 폴리펩티드의 생산 수율을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

또한 하나의 구현예에서, IL-23에 특이적으로 결합하는 ISVD 중 하나는 폴리펩티드의 C-말단에 위치한다.

따라서, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 시작하여 순서대로 다음: TNFα에 특이적으로 결합하는 ISVD, IL-23의 기능을 차단할 수 있는 IL-23에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD, 본원에 정의된 바와 같이 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 선택적 결합 단위, 및 IL-23에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD를 포함하거나 이로 구성된다. 하나의 구현예에서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 결합 단위는 ISVD이다.

하나의 구현예에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 시작하여 순서대로 다음: TNFα에 특이적으로 결합하는 ISVD, 링커, IL-23의 기능을 차단할 수 있는 IL-23에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD, 링커, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD, 링커, 및 IL-23에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD를 포함하거나 이로 구성된다. 하나의 양태에서, 각각의 링커는 9GS 링커이다.

폴리펩티드의 이러한 구성은 발현 수율, 점도 및 기타 생물물리학적 특성을 포함하여 증가된 생산 수율 및 우수한 CMC 특징을 제공할 수 있다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 기술의 폴리펩티드는 인간 혈청에 존재하는 기존 항체에 의해 감소된 결합을 나타낸다. 이를 위해, 하나의 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 하나의 ISVD에서 아미노산 위치 11에 발린(V) 및 아미노산 위치 89에 류신(L)을 포함한다(Kabat 넘버링에 따름). 하나의 구현예에서, 폴리펩티드는 각각의 ISVD에서 아미노산 위치 11에 발린(V) 및 아미노산 위치 89에 류신(L)을 포함한다(Kabat 넘버링에 따름). 또 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 C-말단 ISVD의 C-말단에서 단일 알라닌(A) 연장과 같은 1개 내지 5개(자연 발생)의 아미노산의 연장을 포함한다. ISVD의 C-말단은 보통 VTVSS(서열번호 112)이다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 하나의 ISVD에서 위치 110에 라이신(K) 또는 글루타민(Q)을 포함한다(Kabat 넘버링에 따름). 또 다른 구현예에서, ISVD는 적어도 하나의 ISVD에서 위치 112에 라이신(K) 또는 글루타민(Q)을 포함한다(Kabat 넘버링에 따름). 이들 구현예에서, ISVD의 C-말단은 단일 알라닌의 부가 후에 폴리펩티드의 C-말단이 예를 들어 서열 VTVSSA(서열번호 115), VKVSSA(서열번호 116), VQVSSA(서열번호 117), VTVKSA(서열번호 152), VTVQSA(서열번호 153), VKVKSA(서열번호 154), VKVQSA(서열번호 155), VQVKSA(서열번호 156), 또는 VQVQSA(서열번호 157)를 포함하도록 VKVSS(서열번호 113), VQVSS(서열번호 114), VTVKS(서열번호 146), VTVQS(서열번호 147), VKVKS(서열번호 148), VKVQS(서열번호 149), VQVKS(서열번호 150), 또는 VQVQS(서열번호 151)이다. 하나의 구현예에서, C-말단은 VKVSSA(서열번호 116)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 각각의 ISVD에서 아미노산 위치 11에 발린(V) 및 아미노산 위치 89에 류신(L)을 포함하며(Kabat 넘버링에 따름), 선택적으로 적어도 하나의 ISVD에서 위치 110에 라이신(K) 또는 글루타민(Q)을 포함하고(Kabat 넘버링에 따름), 폴리펩티드의 C-말단이 예를 들어 서열 VKVSSA(서열번호 115), VKVSSA(서열번호 116) 또는 VQVSSA(서열번호 117), 예컨대 VKVSSA(서열번호 116)를 포함하도록 C-말단 ISVD의 C-말단에서 단일 알라닌(A) 연장과 같은 1개 내지 5개(자연 발생)의 아미노산의 연장을 포함한다. 이와 관련된 추가 정보는 예를 들어 WO2012/175741 및 WO2015/173325를 참고한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 기술의 폴리펩티드는 서열번호 1과 90% 초과, 예를 들어, 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 4개의 ISVD의 CDR은 아래에서 각각 섹션 "5.1 면역글로불린 단일 가변 도메인"및 "5.3 (생체내) 반감기 연장"에서 제시된 항목 A 내지 D(또는 Kabat 정의를 사용하는 경우 A' 내지 D')에 정의된 바와 같고, 여기서 특히:

· TNFα에 특이적으로 결합하는 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

· IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

· IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

· 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

또는 대안적으로 Kabat 정의를 사용하는 경우:

· TNFα에 특이적으로 결합하는 ISVD는 서열번호 122의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 130의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 138의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

· IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 123의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 131의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 139의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

· IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 125의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 133의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 141의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

· 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 124의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 132의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 140의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 기술의 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드와 비교하여 인간 TNFα 및 인간 IL-23에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 또는 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 SPR(표면 플라즈몬 공명)과 같은, 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

5.1 면역글로불린 단일 가변 도메인

"단일 가변 도메인"과 상호 교환적으로 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"(ISVD)은 항원 결합 부위가 단일 면역글로불린 도메인 상에 존재하고 단일 면역글로불린 도메인에 의해 형성되는 면역글로불린 분자를 정의한다. 이것은 ISVD를 "통상적인" 면역글로불린(예를 들어, 모노클로날 항체) 또는 이의 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')_2, scFv, 디-scFv)과 구별하며, 2개의 면역글로불린 도메인, 특히 2개의 가변 도메인은 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 전형적으로, 통상적인 면역글로불린에서, 중쇄 가변 도메인(V_H) 및 경쇄 가변 도메인(V_L)은 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 이 경우, V_H및 V_L 둘 모두의 상보성 결정 영역(CDR)이 항원 결합 부위에 기여할 것이며, 즉 총 6개의 CDR이 항원 결합 부위 형성에 관여될 것이다.

상기 정의에 비추어 볼 때, 통상적인 4-사슬 항체(예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자; 당분야에 알려져 있음) 또는 Fab 단편, F(ab')₂단편, 이황화 결합된 Fv 또는 scFv 단편과 같은 Fv 단편, 또는 이러한 통상적인 4-사슬 항체로부터 유래된 디아바디(당분야에 모두 알려져 있음)의 항원 결합 도메인은 보통 ISVD로 간주되지 않을 것이고, 이러한 경우, 항원의 각 에피토프에 대한 결합은 보통 하나의 단일 면역글로불린 도메인에 의해 발생하지 않지만 경쇄 및 중쇄 가변 도메인과 같은 연합하는 면역글로불린 도메인 쌍에 의해, 즉 면역글로불린 도메인의 V_H-V_L 쌍에 의해 발생할 것이며, 이는 각 항원의 에피토프에 함께 결합한다.

대조적으로, ISVD는 추가적인 면역글로불린 가변 도메인과 쌍을 이루지 않고 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. ISVD의 결합 부위는 단일 V_H, 단일 V_HH또는 단일 V_L 도메인에 의해 형성된다.

이와 같이, ISVD는 단일 항원 결합 단위, 즉, 단일 항원 결합 도메인이 기능적 항원 결합 단위를 형성하기 위해 또 다른 가변 도메인과 상호작용할 필요가 없도록, 본질적으로 ISVD로 구성되는 기능적 항원 결합 단위를 형성할 수 있는 한, 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, V_L-서열)또는 이의 적합한 단편; 또는 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, V_H-서열 또는 V_HH서열) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다.

ISVD는예를 들어 낙타화 V_H 또는 인간화 V_HH를 포함하는 V_H, V_HH와 같은 중쇄 ISVD일 수 있다. 하나의 구현예에서, 이는 낙타화 V_H또는 인간화 V_HH를 포함하는 V_HH이다. 중쇄 ISVD는 통상적인 4-사슬 항체 또는 중쇄 항체로부터 유래될 수 있다.

예를 들어, ISVD는 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로 사용하기에 적합한 아미노산 서열), "dAb"또는 dAb(또는 dAb로 사용하기에 적합한 아미노산 서열) 또는 Nanobody®(본원에 정의된 바와 같은, V_HH를 포함하지만 이에 제한되지 않음); 다른 단일 가변 도메인, 또는 이들 중 어느 하나의 임의의 적합한 단편일 수 있다.

특히, ISVD는 Nanobody®(예를 들어 인간화 V_HH또는 낙타화 V_H를 포함하는 V_HH) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. Nanobody®, Nanobodies® 및 Nanoclone®은 등록 상표이다.

V_HH, V_HH항체 단편 및 V_HH 항체로도 알려진 "V_HH 도메인"은 원래 "중쇄 항체"의 항원 결합 면역글로불린 가변 도메인; 즉, "경쇄가 없는 항체"로 기재되었으며, 문헌[Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993]을 참고한다. 용어 "V_HH도메인"은 본원에서 "V_H 도메인"으로 나타내는 통상적인 4-사슬 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인 및 본원에서 "V_L 도메인"으로 나타내는 통상적인 4-사슬 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인과 이들 가변 도메인을 구별하기 위해 선택되었다. V_HH에 대한 추가 설명은 Muyldermans의 리뷰 논문(Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001)을 참조한다.

전형적으로, 면역글로불린의 생성에는 실험 동물의 면역화, 하이브리도마를 생성하기 위한 면역글로불린 생산 세포의 융합 및 요망되는 특이성에 대한 스크리닝이 관여된다. 대안적으로, 면역글로불린은 예를 들어 파지 디스플레이에 의한 나이브, 면역 또는 합성 라이브러리의 스크리닝에 의해 생성될 수 있다.

Nanobodies®와 같은 면역글로불린 서열의 생성은 다양한 문헌에 널리 기재되었으며, 특히 문헌[WO 94/04678, Hamers-Casterman et al. 1993 (Nature 363: 446-448, 1993) 및 Muyldermans et al. 2001 (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001)]을 들 수 있다. 이들 방법에서, 낙타과는 상기 표적 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 표적 항원으로 면역화된다. 상기 면역화로부터 수득된 Nanobodies®의 레퍼토리는 표적 항원에 결합하는 Nanobodies®에 대해 추가로 스크리닝된다.

이러한 경우에, 항체의 생성은 면역화 및/또는 스크리닝을 위해 정제된 항원을 필요로 한다. 항원은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 생산 과정에서 정제될 수 있다.

면역글로불린 서열에 대한 면역화 및/또는 스크리닝은 이러한 항원의 펩티드 단편을 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 기술은 마우스, 래트, 토끼, 당나귀, 인간 및 낙타과 면역글로불린 서열을 포함하는 상이한 기원의 면역글로불린 서열을 사용할 수 있다. 본 발명의 기술은 또한 완전 인간, 인간화 또는 키메라 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 기술은 낙타과의 면역글로불린 서열 및 인간화 낙타과의 면역글로불린 서열, 또는 낙타화 도메인 항체, 예를 들어 문헌[Ward et al. (Nature 341: 544, 1989)(예를 들어 WO 94/04678 및 Davies and Riechmann, Febs Lett., 339:285-290, 1994 및 Prot. Eng., 9:531-537, 1996 참고)]에 기재된 바와 같은 낙타화 dAb를 포함한다. 더욱이, 본 발명의 기술은 또한 융합된 면역글로불린 서열을 사용하여, 예를 들어 다가 및/또는 다중특이적 작제물(하나 이상의 V_HH도메인을 함유하는 다가 및 다중특이적 폴리펩티드 및 이의 제조에 대해서는 문헌[Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001, 뿐만 아니라 예를 들어 WO 96/34103 및 WO 99/23221]을 참조한다), 및 태그 또는 기타 기능적 모이어티, 예를 들어 독소, 표지, 방사성화학물질 등을 포함하는 면역글로불린 서열을 형성하며, 이는 본 발명의 기술의 면역글로불린 서열로부터 유도 가능하다.

"인간화 V_HH"는 자연 발생 V_HH 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만 "인간화"된, 즉 상기 자연 발생 V_HH 서열의 아미노산 서열에서(및 특히 프레임워크 서열에서) 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간으로부터의 통상적인 4-사슬 항체로부터의 V_H 도메인(예를 들어, 위에 표시됨)의 상응하는 위치(들)에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체함으로써 인간화된 아미노산 서열을 포함한다. 이것은 자체가 알려진 방식으로 수행될 수 있으며, 이는 예를 들어 본원의 추가 설명 및 선행 기술(예를 들어, WO 2008/020079)에 기초하여 당업자에게 명확할 것이다. 다시 말하지만, 이러한 인간화 V_HH는 자체가 알려진 임의의 적합한 방식으로 수득될 수 있고, 이에 따라 출발 물질로서 자연 발생 V_HH도메인을 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 수득된 폴리펩티드로 엄격하게 제한되지 않음이 주지되어야 한다.

"낙타화 V_H"는 자연 발생 V _H 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만 "낙타화", 즉, 통상적인 4-사슬 항체로부터의 자연 발생 V_H 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 V_HH도메인의 상응하는 위치(들)에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 대체함으로써 낙타화된 아미노산 서열을 포함한다.이는 자체가 알려진 방식으로 수행될 수 있으며, 이는 예를 들어 본원의 추가 설명 및 선행 기술(예를 들어, WO 2008/020079)에 기초하여 당업자에게 명확할 것이다. 이러한 "낙타화" 치환은 보통 V_H-VL계면 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 소위 낙타과 특징 잔기를 형성하고/하거나 여기에 존재하는 아미노산 위치에 삽입된다(예를 들어 WO 94/04678 및 Davies and Riechmann, 1994 and 1996, 상기 문헌 참고). 하나의 구현예에서, 낙타화 V_H를생성 또는 설계하기 위한 출발 물질 또는 출발점으로 사용되는 V_H서열은 포유동물로부터의 V_H 서열, 또는 V_H3 서열과 같은 인간의 V_H 서열이다. 그러나, 이러한 낙타화 V_H는 자체가 알려진 임의의 적합한 방식으로 수득될 수 있고, 따라서 출발 물질로 자연 발생 V_H도메인을 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 수득된 폴리펩티드로 엄격하게 제한되지 않음이 주지되어야 한다.

ISVD 서열의 구조는 당분야 및 본원에서 각각 "프레임워크 영역 1"("FR1"); "프레임워크 영역 2"("FR2"); "프레임워크 영역 3"("FR3"); 및 "프레임워크 영역 4"("FR4")로 나타내는 4개의 프레임워크 영역("FR")으로 구성되는 것으로 간주될 수 있으며; 이 프레임워크 영역은 당분야 및 본원에서 각각 "상보성 결정 영역 1"("CDR1"); "상보성 결정 영역 2"("CDR2"); 및 "상보성 결정 영역 3"("CDR3")으로 나타내는, 3개의 상보적 결정 영역("CDR")에 의해 단속된다.

WO 08/020079의 58 및 59페이지의 단락 q)에 추가로 기재된 바와 같이, ISVD의 아미노산 잔기는 문헌[Riechmann and Muyldermans, 2000 (J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195; 예를 들어 이 문헌의 도 2 참고)]에서 낙타과의 V_HH 도메인에 적용된 바와 같은, 문헌[Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)]에 의해 주어지는 V_H도메인에 대한 일반 넘버링에 따라 넘버링될 수 있다. V_H도메인 및 V_HH 도메인에 대해 당분야에 잘 알려진 바와 같이 각 CDR의 아미노산 잔기의 총 수는 다양할 수 있으며 Kabat 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총 수에 상응하지 않을 수 있음이 주지되어야 한다. 즉, Kabat 넘버링에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열에서 점유되지 않을 수 있거나, 실제 서열은 Kabat 넘버링에 의해 허용되는 수보다 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 이것은 일반적으로 Kabat에 따른 넘버링이 실제 서열에서 아미노산 잔기의 실제 넘버링에 상응할 수도 상응하지 않을 수도 있음을 의미한다. V_H도메인 및 V_HH 도메인에서 아미노산 잔기의 총 수는 보통 110 내지 120, 종종 112 내지 115의 범위에 있을 것이다. 그러나 더 짧거나 더 긴 서열 또한 본원에 기재된 목적을 위해 적합할 수 있음이 주지되어야 한다.

본 출원에서, 달리 표시되지 않는 한, CDR 서열은 문헌[Kontermann and D

bel (Eds. 2010, Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51)]에 기재된 AbM 넘버링에 따라 결정되었다. 이 방법에 따르면, FR1은 위치 1 내지 25에 아미노산 잔기를 포함하고, CDR1은 위치 26 내지 35에 아미노산 잔기를 포함하고, FR2는 위치 36 내지 49에 아미노산을 포함하고, CDR2는 위치 50 내지 58에 아미노산 잔기를 포함하고, FR3은 위치 59 내지 94에 아미노산 잔기를 포함하고, CDR3은 위치 95 내지 102에 아미노산 잔기를 포함하고, FR4는 위치 103 내지 113에 아미노산 잔기를 포함한다.

CDR 영역의 결정은 또한 상이한 방법에 따라 수행될 수 있다. Kabat에 따른 CDR 결정에서, ISVD의 FR1은 위치 1 내지 30에 아미노산 잔기를 포함하고, ISVD의 CDR1은 위치 31 내지 35에 아미노산 잔기를 포함하고, ISVD의 FR2는 위치 36 내지 49의 아미노산을 포함하고, ISVD의 CDR2는 위치 50 내지 65에 아미노산 잔기를 포함하고, ISVD의 FR3은 위치 66 내지 94에 아미노산 잔기를 포함하고, ISVD의 CDR3은 위치 95 내지 102에 아미노산 잔기를 포함하고, ISVD의 FR4는 위치 103 내지 113에 아미노산 잔기를 포함한다.

이러한 면역글로불린 서열에서, 프레임워크 서열은 임의의 적합한 프레임워크 서열일 수 있고, 적합한 프레임워크 서열의 예는 예를 들어 표준 핸드북 및 추가 개시 및 본원에 언급된 선행 기술에 기초하여 당업자에게 명확할 것이다.

프레임워크 서열은 예를 들어 인간화 또는 낙타화에 의해 면역글로불린 프레임워크 서열로부터 유래된 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 프레임워크 서열의 적합한 조합이다. 예를 들어, 프레임워크 서열은 경쇄 가변 도메인(예를 들어, V_L-서열) 및/또는 중쇄 가변 도메인(예를 들어, V_H-서열또는 V_HH서열)으로부터 유래된 프레임워크 서열일 수 있다. 하나의 양태에서, 프레임워크 서열은 상기 프레임워크 서열이 선택적으로 부분적으로 또는 완전히 인간화되었을 수 있는 V_HH-서열로부터 유래된 프레임워크 서열이거나 (본원에 정의된 바와 같이) 낙타화된 통상적인 V_H 서열이다.

특히, 본 발명의 기술에서 사용되는 ISVD 서열에 존재하는 프레임워크 서열은 ISVD 서열이 인간화 V_HH 또는 낙타화 V_H를 포함하는 V_HH와 같은 Nanobody®이도록, 하나 이상의 특징 잔기(본원에 정의된 바와 같음)를 함유할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열의 적합한 조합의 일부 비제한적 예는 본원의 추가 개시로부터 명확해질 것이다.

다시, 면역글로불린 서열에 대해 본원에 일반적으로 기재된 바와 같이, 하나 이상의 프레임워크 서열이 적합하게 측면에 있고/있거나 이를 통해 결합된, 예를 들어, 이들 CDR과 동일한 순서로, 적합한 단편 또는 하나 이상의 CDR 서열을 함유하는 단편과 같은 전술한 것 중 임의의 것의 단편의 조합을 사용하는 것도 가능하며; 프레임워크 서열은 단편이 유래된 전체 크기의 면역글로불린 서열에서 발생할 수 있다.

그러나, 본 발명의 기술은 ISVD 서열의 기원 또는 이를 발현하는 데 사용되는 뉴클레오티드 서열의 기원, 또는 ISVD 서열 또는 뉴클레오티드 서열이 생성되거나 수득되는, 또는 생성되었거나 수득된 방식에 대해 제한되지 않음이 주지되어야 한다. 따라서, ISVD 서열은 자연 발생 서열(임의의 적합한 종으로부터의) 또는 합성 또는 반-합성 서열일 수 있다. 구체적인, 그러나 비제한적인 양태에서, ISVD 서열은 "인간화"(본원에 정의된 바와 같음) 면역글로불린 서열(예를 들어, 부분적으로 또는 완전 인간화 마우스 또는 토끼 면역글로불린 서열, 특히 부분적으로 또는 완전 인간화 V_HH서열), "낙타화"(본원에 정의된 바와 같음) 면역글로불린 서열뿐만 아니라 친화도 성숙(예를 들어, 합성, 무작위 또는 자연 발생 면역글로불린 서열로부터 시작된), CDR 이식, 베니어링, 상이한 면역글로불린 서열로부터 유래된 단편의 조합, 중첩 프라이머를 사용한 PCR 조립, 및 당업자에게 잘 알려진 면역글로불린 서열을 조작하기 위한 유사한 기법; 또는 전술한 것 중 임의의 것의 임의의 적절한 조합과 같은 기법에 의해 수득된 면역글로불린 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 자연 발생 서열(임의의 적합한 종으로부터의) 또는 합성 또는 반합성 서열이다.

유사하게, 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 뉴클레오티드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있고, 예를 들어 적합한 자연 발생 주형, 예를 들어 세포로부터 단리된 DNA 또는 RNA로부터의 PCR에 의해 단리된 서열, 라이브러리(특히, 발현 라이브러리)로부터 단리된 뉴클레오티드 서열, 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입함으로써 제조된 뉴클레오티드 서열(미스매치 PCR과 같이, 자체가 알려진 임의의 적합한 기법 사용), 중첩 프라이머를 사용한 PCR에 의해 제조된 뉴클레오티드 서열, 또는 자체가 알려진 DNA 합성 기법을 사용하여 제조된 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

위에서 설명된 바와 같이, ISVD는 Nanobody® 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. Nanobodies®의 일반적인 설명을 위해, 아래의 추가 설명뿐만 아니라 본원에 인용된 선행 기술을 참조한다. 그러나 이와 관련하여, 이 설명 및 선행 기술은 소위 "V_H3클래스"의 Nanobodies®, 즉 DP-47, DP-51 또는 DP-29와 같은 V_H3클래스의 인간 생식계열 서열에 대해 고도의 서열 상동성을 갖는 Nanobodies®를 주로 기재함이 주지되어야 한다. 그러나 가장 넓은 의미에서 본 발명의 기술은 일반적으로 임의의 유형의 Nanobody®를 사용할 수 있으며, 예를 들어 소위 "V_H4 클래스"에 속하는 Nanobodies®, 즉 예를 들어 WO 2007/118670에 기재된 바와 같은 DP-78과 같이 V_H4 클래스의 인간 생식계열 서열에 대해 고도의 서열 상동성을 갖는 Nanobodies®를 사용할 수도 있음이 주지되어야 한다.

일반적으로, Nanobodies®(특히 (부분적으로) 인간화 V_HH 서열 및 낙타화 V_H 서열을 포함하는 V_HH 서열)는 하나 이상의 프레임워크 서열(본원에 추가로 기재됨)에서 하나 이상의 "특징 잔기"(본원에 기재됨)의 존재를 특징으로 할 수 있다. 따라서 일반적으로 Nanobody®는 다음 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열로 정의될 수 있다:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

여기서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 나타내고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 나타내고, 하나 이상의 특징 잔기는 본원에 추가로 정의된 바와 같다.

특히, Nanobody®는 다음 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열일 수 있다:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

여기서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 나타내고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 나타내며, 프레임워크 서열은 본원에 추가로 정의된 바와 같다.

보다 구체적으로, Nanobody®는 다음 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열일 수 있다:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

여기서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 나타내고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 나타내며,

Kabat 넘버링에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 아래에서 표 A-6에 언급된 특징 잔기로부터 선택된다.

[표 A-6]

Nanobodies에서의 특징 잔기

본 발명의 기술은 특히 TNFα 또는 IL-23의 p19 서브유닛에 결합할 수 있는 ISVD를 사용한다. 본 발명의 기술의 맥락에서, 특정 표적 분자에 "결합하는"은 항체 및 이의 각각의 항원의 맥락에서 이해되는 바와 같은 당분야에서 일반적인 의미를 갖는다.

본 발명의 기술의 폴리펩티드는 TNFα에 결합하는 1개 이상의 ISVD 및 IL-23에 결합하는 2개 이상의 ISVD를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 TNFα에 결합하는 1개의 ISVD 및 IL-23의 p19 서브유닛에 결합하는 2개의 ISVD를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 ISVD는 그의 표적 분자를 기능적으로 차단할 수 있다. 예를 들어, ISVD는 TNFα와 TNFR(TNF 수용체) 간 상호작용을 차단할 수 있거나 IL-23과 IL-23R(IL-23 수용체) 간 상호작용을 차단할 수 있다. 본 발명의 기술의 폴리펩티드에서 적어도 하나의 ISVD는 예를 들어 IL-23과 IL-23R 간 상호작용을 차단하고/하거나 IL-22의 IL-23 유도 방출을 억제함으로써 IL-23을 기능적으로 차단할 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명의 기술의 폴리펩티드는 TNFα에 결합하고 TNFα를 기능적으로 차단하는 1개의 ISVD 및 IL-23에 결합하고, 그 중 하나는 IL-23을 기능적으로 차단할 수 있는 2개의 ISVD를 포함한다.

본 발명의 기술에서 사용된 ISVD는 본 발명의 기술의 폴리펩티드의 일부를 형성하며, 이는 폴리펩티드가 TNFα 및 IL-23에 특이적으로 결합할 수 있도록, 적어도 3개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성된다.

따라서, 본 발명의 기술의 폴리펩티드에서 사용되는 적어도 3개의 ISVD에 대한 표적 분자는 TNFα 및 IL-23이다. 예는 포유동물 TNFα 및 IL-23이다. 인간 TNFα(Uniprot 접근 P01375) 및 인간 IL-23(p19 서브유닛, IL-23A에 대한 Uniprot 접근: Q9NPF7) 외에, 다른 종의 버전, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 양, 말, 돼지, 비인간 영장류, 예를 들어 게잡이 원숭이(또한 본원에서 "cyno"로 나타냄), 또는 낙타과, 예를 들어 라마 또는 알파카로부터의 TNFα 및 IL-23도 본 발명의 기술을 적용할 수 있다.

본 발명의 기술에서 사용될 수 있는 TNFα 또는 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는 ISVD의 구체적인 예는 하기 항목 A 내지 C에 기재된 바와 같다:

A. 인간 TNFα에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR3.

하나의 구현예에서, ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

인간 TNFα에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 예는 표 A-2의 작제물 6C11에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 또는 모든 프레임워크 영역을 갖는다(이전 항목 A에서 정의된 바와 같은 CDR에 더하여). 하나의 구현예에서, 이는 작제물 6C11(서열번호 2, 표 A-1 및 A-2 참고)의 전체 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 ISVD이다.

또 다른 구현예에서, 인간 TNFα에 특이적으로 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있으며, CDR은 이전 항목 A에서 정의된 바와 같다. 하나의 구현예에서, TNFα에 특이적으로 결합하는 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

TNFα에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD가 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 A)에 비해 적어도 하나의 CDR에 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 경우, ISVD는 작제물 6C11(서열번호 2)과 비교하여 인간 TNFα에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 또는 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

B. 인간 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR3.

하나의 구현예에서, ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

인간 IL-23에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 예는 표 A-2의 작제물 119A03/1에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 또는 모든 프레임워크 영역을 갖는다(이전 항목 B에서 정의된 바와 같은 CDR에 더하여). 하나의 구현예에서, 이는 작제물 119A03/1(서열번호 3, 표 A-1 및 A-2 참고)의 전체 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 ISVD이다.

또한, 또 다른 구현예에서, 인간 IL-23에 특이적으로 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있고, CDR은 이전 항목 B에서 정의된 바와 같다. 하나의 구현예에서, IL-23에 결합하는 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

IL-23에 결합하는 이러한 ISVD가 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 B)에 비해 적어도 하나의 CDR에 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 경우, ISVD는 작제물 119A03/1(서열번호 3)과 비교하여 인간 IL-23에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 또는 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

하나의 구현예에서, 서열번호 11(TIESGSRTN)과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2를 포함하는 ISVD는 CDR2 서열의 아미노산 위치 3에서 E에서 N으로의 치환을 갖지 않고/않거나 CDR2 서열의 아미노산 위치 9에서 N에서 Y로의 치환을 갖지 않는다. 또 다른 구현예에서, 이러한 ISVD는 CDR2 서열의 아미노산 위치 3에서 E에서 N으로의 치환을 갖지 않고 CDR2 서열의 아미노산 위치 9에서 N에서 Y로의 치환을 갖지 않는다. 서열번호 11(TIESGSRTN)과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2를 포함하는 ISVD의 이러한 구현예에서, E는 상기 CDR2 서열의 위치 3에서 아미노산으로 유지되고/되거나 N은 위치 9에서 아미노산으로 유지된다. 또 다른 구현예에서, 상기 CDR2 서열의 아미노산 위치 3의 E 및 아미노산 위치 9의 N 둘 모두가 유지된다. 상기 CDR2 서열의 아미노산 위치 3에 N을 포함하는 ISVD를 사용하면 상기 아미노산 위치에 N을 포함하지 않는 동일한 폴리펩티드와 비교하여, 특히 상기 아미노산 위치에 E를 포함하는 동일한 폴리펩티드와 비교하여, 예를 들어 탈아민화로 인해 폴리펩티드의 생산 동안 아미노산 서열 안정성을 감소시킬 수 있다. 상기 CDR2 서열의 아미노산 위치 9에 Y를 포함하는 ISVD를 사용하면 상기 아미노산 위치에 Y를 포함하지 않는 동일한 폴리펩티드와 비교하여, 특히 상기 아미노산 위치에 N을 포함하는 동일한 폴리펩티드와 비교하여 폴리펩티드의 단백질 응집을 증가시킬 수 있다.

C. 인간 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR3.

하나의 구현예에서, ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

인간 IL-23에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 예는 표 A-2에서 작제물 81A12에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 또는 모든 프레임워크 영역을 갖는다(이전 항목 C에 정의된 바와 같은 CDR에 더하여). 하나의 구현예에서 이는 작제물 81A12(서열번호 5, 표 A-1 및 A-2 참고)의 전체 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 ISVD이다.

또한, 또 다른 구현예에서, 인간 IL-23에 특이적으로 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 5와 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있고, CDR은 이전 항목 C에 정의된 바와 같다. 하나의 구현예에서, IL-23에 결합하는 ISVD는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

IL-23에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD가 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 C)에 비해 적어도 하나의 CDR에 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 경우, ISVD는 작제물 81A12(서열번호 5)와 비교하여 인간 IL-23에 대해 적어도 절반의 결합 친화도를 갖거나 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

하나의 구현예에서, 상기 항목 A 내지 C에 정의된 바와 같은 각각의 ISVD는 본 발명의 기술의 폴리펩티드에 포함된다. 상기 항목 A 내지 C에 정의된 바와 같은 각각의 ISVD를 포함하는 본 발명의 기술의 이러한 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드와 비교하여 인간 TNFα에 대해 및 인간 IL-23에 대해 적어도 절반의 결합 친화도 또는 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

상기 항목 A 내지 C에서 나타낸 서열번호는 AbM 정의에 따른 CDR 정의에 기초한다(표 A-2 참고). Kabat 정의(표 A-2.1 참고)에 따라 동일한 CDR을 정의하는 서열번호가 마찬가지로 상기 항목 A 내지 C에서 사용될 수 있음이 주지된다.

따라서, AbM 정의를 사용하여 상술된 바와 같이 본 발명의 기술에서 사용될 수 있는 TNFα 또는 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는 특정 ISVD 또한 아래의 항목 A' 내지 C'에 제시된 바와 같이 Kabat 정의를 사용하여 기재될 수 있다:

A'. 인간 TNFα에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. 서열번호 122의 아미노산 서열 또는 서열번호 122와 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 130의 아미노산 서열 또는 서열번호 130과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 138의 아미노산 서열 또는 서열번호 138과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR3.

하나의 구현예에서, ISVD는 서열번호 122의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 130의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 138의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

인간 TNFα에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 예는 표 A-2.1에서 작제물 6C11에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 또는 모든 프레임워크 영역을 갖는다(이전 항목 A'에 정의된 바와 같은 CDR에 더하여). 하나의 구현예에서, 이는 작제물 6C11(서열번호 2, 표 A-1 및 A-2.1 참고)의 전체 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 ISVD이다.

또한, 또 다른 구현예에서, 인간 TNFα에 특이적으로 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있으며, CDR은 이전 항목 A'에서 정의된 바와 같다. 하나의 구현예에서, TNFα에 특이적으로 결합하는 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

TNFα에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD가 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 A')에 비해 적어도 하나의 CDR에 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 경우, ISVD는 작제물 6C11(서열번호 2)과 비교하여 인간 TNFα에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 또는 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

B'. 인간 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. 서열번호 123의 아미노산 서열 또는 서열번호 123과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 131의 아미노산 서열 또는 서열번호 131과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 139의 아미노산 서열 또는 서열번호 139와 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR3.

하나의 구현예에서, ISVD는 서열번호 123의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 131의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 139의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

인간 IL-23에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 예는 표 A-2.1에서 작제물 119A03/1에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상 또는 모든 프레임워크 영역을 갖는다(이전 항목 B'에서 정의된 바와 같은 CDR에 더하여). 하나의 구현예에서, 이는 작제물 119A03/1의 전체 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 ISVD이다(서열번호 3, 표 A-1 및 A-2.1 참고).

또한, 또 다른 구현예에서, 인간 IL-23에 특이적으로 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있고, CDR은 이전 항목 B'에서 정의된 바와 같다. 하나의 구현예에서, IL-23에 결합하는 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

IL-23에 결합하는 이러한 ISVD가 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 B')에 비해 적어도 하나의 CDR에 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 경우, ISVD는 작제물 119A03/1(서열번호 3)과 비교하여 인간 IL-23에 대해 적어도 절반의 결합 친화도 또는 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

하나의 구현예에서, 서열번호 131(TIESGSRTNYADSVKG)과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR2를 포함하는 ISVD는 상기 CDR2 서열의 아미노산 위치 3에서 E에서 N으로의 치환을 갖지 않고/않거나 아미노산 위치 9에서 N에서 Y로의 치환을 갖지 않는다. 또 다른 구현예에서, 이러한 ISVD는 CDR2 서열의 아미노산 위치 3에 E에서 N으로의 치환을 갖지 않고 CDR2 서열의 아미노산 위치 9에 N에서 Y로의 치환을 갖지 않는다. 서열번호 131(TIESGSRTNYADSVKG)과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR2를 포함하는 ISVD의 이러한 구현예에서, E는 상기 CDR2 서열의 위치 3에서 아미노산으로 유지되고/되거나 N은 위치 9에서 아미노산으로 유지된다. 또 다른 구현예에서, 상기 CDR2 서열의 아미노산 위치 3의 E 및 아미노산 위치 9의 N 둘 모두가 유지된다. 상기 CDR2 서열의 아미노산 위치 3에 N을 포함하는 ISVD를 사용하면 상기 아미노산 위치에 N을 포함하지 않는 동일한 폴리펩티드와 비교하여, 특히 상기 아미노산 위치에 E를 포함하는 동일한 폴리펩티드와 비교하여, 예를 들어 탈아민화로 인해 폴리펩티드의 생산 동안 아미노산 서열 안정성을 감소시킬 수 있다. 상기 CDR2 서열의 아미노산 위치 9에 Y를 포함하는 ISVD를 사용하면 상기 아미노산 위치에 Y를 포함하지 않는 동일한 폴리펩티드와 비교하여, 특히 상기 아미노산 위치에 N을 포함하는 동일한 폴리펩티드와 비교하여 폴리펩티드의 단백질 응집을 증가시킬 수 있다.

C'. 인간 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. 서열번호 125의 아미노산 서열 또는 서열번호 125와 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 133의 아미노산 서열 또는 서열번호 133과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 141의 아미노산 서열 또는 서열번호 141과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR3.

하나의 구현예에서, ISVD는 서열번호 125의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 133의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 141의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

인간 IL-23에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 예는 표 A-2.1에서 작제물 81A12에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 또는 모든 프레임워크 영역을 갖는다(이전 항목 C'에서 정의된 바와 같은 CDR에 더하여). 하나의 구현예에서, 이는 작제물 81A12의 전체 아미노산 서열(서열번호 5, 표 A-1 및 A-2.1 참고)을 포함하거나 이로 구성되는 ISVD이다.

또한, 또 다른 구현예에서, 인간 IL-23에 특이적으로 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 5와 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있고, CDR은 이전 항목 C'에 정의된 바와 같다. 하나의 구현예에서, IL-23에 결합하는 ISVD는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

IL-23에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD가 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 C')에 비해 적어도 하나의 CDR에 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 경우, ISVD는 작제물 81A12(서열번호 5)와 비교하여 인간 IL-23에 대해 적어도 절반의 결합 친화도를 갖거나 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

하나의 구현예에서, 상기 항목 A' 내지 C'에 정의된 바와 같은 각각의 ISVD는 본 발명의 기술의 폴리펩티드에 포함된다. 상기 항목 A' 내지 C'에 정의된 바와 같은 각각의 ISVD를 포함하는 본 발명의 기술의 이러한 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드와 비교하여 인간 TNFα 및 인간 IL-23에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 또는 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 간 "서열 동일성"의 백분율은 [제2 아미노산 서열에서 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기와 동일한 제1 아미노산 서열에서의 아미노산 잔기의 수]를 [제1 아미노산 서열에서의 총 아미노산 잔기 수]로 나누고 [100%]를 곱하여 계산될 수 있고, 제1 아미노산 서열과 비교하여 제2 아미노산 서열에서의 아미노산 잔기의 각각의 결실, 삽입, 치환 또는 부가는 단일 아미노산 잔기(즉, 단일 위치)에서 차이로 간주된다.

보통, 위에서 개략된 계산 방법에 따라 2개의 아미노산 서열 간 "서열 동일성"의 백분율을 결정하기 위해, 가장 많은 수의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이 "제1" 아미노산 서열로 간주될 것이고, 다른 아미노산 서열은 "제2" 아미노산 서열로 간주될 것이다.

본원에 사용된 "아미노산 차이"는 참조 서열에 대한 단일 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 나타낸다. 하나의 구현예에서, "아미노산 차이"는 치환이다.

하나의 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 이러한 보존적 치환은 하기 군 (a) 내지 (e) 내의 하나의 아미노산이 동일한 군 내의 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 치환이다: (a) 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성인 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (b) 극성이고 음으로 하전된 잔기 및 이의 (비하전) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (c) 극성이고 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (d) 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (e) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp.

하나의 구현예에서, 보존적 치환은 하기와 같다: Ala에서 Gly로 또는 Ser로; Arg에서 Lys로; Asn에서 Gln으로 또는 His로; Asp에서 Glu로; Cys에서 Ser로; Gln에서 Asn으로; Glu에서 Asp로; Gly에서 Ala로 또는 Pro로; His에서 Asn으로 또는 Gln으로; Ile에서 Leu로 또는 Val로; Leu에서 Ile로 또는 Val로; Lys에서 Arg로, Gln으로 또는 Glu로; Met에서 Leu로, Tyr로 또는 Ile로; Phe에서 Met로, Leu로 또는 Tyr로; Ser에서 Thr로; Thr에서 Ser로; Trp에서 Tyr로; Tyr에서 Trp로; 및/또는 Phe에서 Val로, Ile로 또는 Leu로.

5.2 특이성

" 특이성", "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적 결합"이라는 용어는 ISVD와 같은 특정 결합 단위가 충분히 높은 친화도로 결합할 수 있는 동일한 유기체로부터 항원과 같은 상이한 표적 분자의 수를 나타낸다(아래 참고). "특이성", "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적 결합"은 본원에서 "선택성", "선택적으로 결합하는" 또는 "선택적 결합"과 상호 교환적으로 사용된다. ISVD와 같은 결합 단위는 이의 지정된 표적에 특이적으로 결합한다.

결합 단위의 특이성/선택성은 친화도에 기초하여 결정될 수 있다. 친화도는 분자 상호작용의 강도 또는 안정성을 표시한다. 친화도는 일반적으로 몰/리터(또는 M) 단위를 갖는 KD 또는 해리 상수로 제공된다. 친화도는 1/KD와 동일하고 (몰/리터)^-1(또는 M^-1) 단위를 갖는 결합 상수, KA로도 표현될 수도 있다.

친화도는 모이어티와 표적 분자 상의 결합 부위 간 결합 강도에 대한 척도이다: KD 값이 낮을수록 표적 분자와 표적화 모이어티 간 결합 강도가 강해진다.

전형적으로, ISVD와 같은 본 발명의 기술에서 사용되는 결합 단위는 10^-5내지 10^-12 몰/리터 이하, 10^-7내지 10^-12 몰/리터 이하, 또는 10^-8내지 10^-12몰/리터의 해리 상수(KD)(즉, 10⁵내지 10¹²리터/몰 이상, 10⁷내지 10¹²리터/몰 이상, 또는 10⁸내지 10¹²리터/몰의 결합 상수(KA))로 표적에 결합할 것이다.

10^-4 몰/리터 초과의 임의의 KD 값(또는 10⁴ 몰/리터보다 작은 임의의 KA 값)은 일반적으로 비특이적 결합을 표시하는 것으로 간주된다.

특이적인 것으로 간주되는, 항원에 대한 면역글로불린 서열의 결합과 같은 생물학적 상호작용에 대한 KD는 전형적으로 10^-5몰/리터(10000 nM 또는 10 μM) 내지 10^-12몰/리터(0.001 nM 또는 1 pM) 이하의 범위이다.

따라서, 특이적/선택적 결합은 - 동일한 측정 방법, 예를 들어 SPR을 사용하여 - 결합 단위(또는 이를 포함하는 폴리펩티드)가 10^-5내지 10^-12 몰/리터 이하의 KD 값으로 TNFα 및/또는 IL-23에 결합하고 10^-4 몰/리터 초과의 KD 값으로 관련 사이토카인에 결합함을 의미할 수 있다. IL-23에 대한 관련 사이토카인의 예는 IL-23과 p40 서브유닛을 공유하므로 IL-12이다. TNFα에 대한 관련 사이토카인의 예는 TNF 수퍼패밀리 구성원 FASL, TNFβ, LIGHT, TL-1A, RANKL이다. 따라서, 본 발명의 기술의 하나의 구현예에서, 폴리펩티드에 포함된 적어도 하나의 ISVD는 10^-5내지 10^-12 몰/리터 이하의 KD 값으로 (인간) TNFα에 결합하고, 10^-4 몰/리터 초과의 KD 값으로 동일한 종의 FASL, TNFβ, LIGHT, TL-1A, RANKL에 결합하고, 폴리펩티드에 포함된 적어도 2개의 ISVD는 10^-5내지 10^-12 몰/리터 이하의 KD 값으로 IL-23에 결합하고 10^-4 몰/리터 초과의 KD 값으로 동일한 종의 IL-12에 결합한다.

따라서, 본 발명의 기술의 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드와 비교하여 인간 TNFα에 대해 및 인간 IL-23에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 또는 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

특정 종으로부터의 특정 표적에 대한 특이적 결합은 결합 단위가 또한 상이한 종으로부터의 유사한 표적에 특이적으로 결합할 수 있음을 배제하지 않는다. 예를 들어, 인간 TNFα에 대한 특이적 결합은 결합 단위 또는 이를 포함하는 폴리펩티드가 또한 게잡이 원숭이로부터의 TNFα에 특이적으로 결합할 수 있음을 배제하지 않는다. 마찬가지로, 예를 들어, 인간 IL-23에 대한 특이적 결합은 결합 단위 또는 이를 포함하는 폴리펩티드가 또한 게잡이 원숭이("cyno")로부터의 IL-23에 특이적으로 결합할 수 있음을 배제하지 않는다.

그 지정된 표적에 대한 결합 단위의 특이적 결합은 예를 들어 스캐챠드(Scatchard) 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정, 예를 들어 방사성면역검정(RIA), 효소 면역검정(EIA) 및 샌드위치 경쟁 검정, 및 당분야에 자체가 알려진 이의 상이한 변형뿐만 아니라 본원에 언급된 다른 기법을 포함하는, 자체가 알려진 임의의 적합한 방식으로 결정될 수 있다.

해리 상수는 당업자에게 명확할 바와 같이 실제 또는 겉보기 해리 상수일 수 있다. 해리 상수를 결정하는 방법은 당업자에게 명확할 것이며, 예를 들어 아래에 언급된 기법을 포함한다. 이와 관련하여, 10^-4 몰/리터 또는 10^-3몰/리터(예를 들어, 10^-2몰/리터) 초과의 해리 상수를 측정하는 것이 불가능할 수 있음도 명확할 것이다. 선택적으로, 당업자에게 또한 명확할 바와 같이, (실제 또는 겉보기) 해리 상수는 (실제 또는 겉보기) 결합 상수(KA)에 기초하여, 관계 [KD = 1/KA]에 의해 계산될 수 있다.

두 분자 사이의 분자 상호작용의 친화도는 잘 알려진 표면 플라즈몬 공명(SPR) 바이오센서 기법(예를 들어 Ober et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559)과 같은 자체가 알려진 상이한 기법을 통해 측정될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "표면 플라즈몬 공명"은 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도의 변경 검출에 의해 실시간 생물특이적 상호작용의 분석을 허용하는 광학 현상을 나타내며, 하나의 분자는 바이오센서 칩에 고정화되고 다른 분자는 유동 조건 하에서 고정된 분자 상으로 통과되어 k_on, k_off측정 및 이에 따라 K_D(또는 K_A) 값을 산출한다. 이것은 예를 들어 잘 알려진 BIAcore® 시스템(BIAcore International AB, GE Healthcare company, Uppsala, Sweden 및 Piscataway, NJ)을 사용하여 수행될 수 있다. 자세한 설명은 문헌[Jonsson et al. (1993, Ann. Biol. Clin. 51: 19-26), Jonsson et al. (1991 Biotechniques 11: 620-627), Johnsson et al. (1995, J. Mol. Recognit. 8: 125-131), 및 Johnnson et al. (1991, Anal. Biochem. 198: 268-277)]을 참고한다.

생체분자 상호작용의 친화도를 결정하기 위한 또 다른 잘 알려진 바이오센서 기법은 생물층 간섭측정(BLI)이다(예를 들어 문헌[Abdiche et al. 2008, Anal. Biochem. 377: 209-217] 참고). 본원에 사용된 용어 "바이오층 간섭측정" 또는 "BLI"는 내부 참조 층(참조 빔) 및 바이오센서 팁 상의 고정화된 단백질층(신호 빔)의 두 표면으로부터 반사된 빛의 간섭 패턴을 분석하는 무표지 광학 기법을 나타낸다. 바이오센서 팁에 결합된 분자 수의 변화는 파장 이동(nm)으로 보고되는, 간섭 패턴의 이동을 유도하며, 그 크기는 바이오센서 팁 표면에 결합된 분자 수의 직접적인 측정이다. 상호작용이 실시간으로 측정될 수 있으므로, 결합 및 해리 속도와 친화도가 결정될 수 있다. BLI는 예를 들어 잘 알려진 Octet® Systems(ForteBio, Pall Life Sciences의 한 부문, Menlo Park, USA)를 사용하여 수행될 수 있다.

대안적으로, 친화도는 KinExA 플랫폼(Sapidyne Instruments Inc, Boise, USA)을 사용하여 동력학 배제 검정(KinExA)(예를 들어 문헌[Drake et al. 2004, Anal. Biochem., 328: 35-43] 참고)에서 측정될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "KinExA"는 변형되지 않은 분자의 진정한 평형 결합 친화도 및 동력학을 측정하기 위한 용액 기반 방법을 나타낸다. 항체/항원 복합체의 평형 용액은 항원(또는 항체)으로 미리 코팅된 비드가 있는 칼럼 위로 통과되어 유리 항체(또는 항원)가 코팅된 분자에 결합하는 것을 허용한다. 이렇게 포획된 항체(또는 항원)의 검출은 항체(또는 항원)에 결합하는 형광 표지된 단백질을 이용하여 달성된다.

GYROLAB® 면역검정 시스템은 자동화된 생물분석 및 신속한 샘플 변환을 위한 플랫폼을 제공한다(Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74).

5.3 (생체내) 반감기 연장

폴리펩티드는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 결합된, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 증가된 (생체내) 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 생체내 반감기 연장은, 예를 들어 폴리펩티드가 투여 후 인간 대상체와 같은 포유동물에서 증가된 반감기를 가짐을 의미한다. 반감기는 예를 들어 t1/2베타로 표현될 수 있다.

기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위의 유형은 일반적으로 제한되지 않으며, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩티드로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

보다 구체적으로, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 또는 IgG와 같은 혈청 면역글로불린에 결합할 수 있는 결합 단위로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 구현예에서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 결합 단위이다. 하나의 구현예에서, 결합 단위는 ISVD이다.

예를 들어, WO 2004/041865는 상기 단백질의 반감기를 증가시키기 위해 다른 단백질(예를 들어, 요망되는 표적에 결합하는 하나 이상의 다른 ISVD)에 결합될 수 있는 혈청 알부민(특히 인간 혈청 알부민에 대한)에 결합하는 ISVD를 기재한다.

국제 출원 WO 2006/122787은 (인간) 혈청 알부민에 대한 다수의 ISVD를 기재한다. 이러한 ISVD는 Alb-1(WO 2006/122787의 서열번호 52)로 불리는 ISVD 및 Alb-8(WO 2006/122787의 서열번호 62)과 같은 이의 인간화 변이체를 포함한다. 다시 말하지만, 이들은 치료 단백질 및 폴리펩티드 그리고 기타 치료 엔티티 또는 모이어티의 반감기를 연장하는 데 사용될 수 있다.

더욱이, WO 2012/175400은 Alb-23으로 불리는 Alb-1의 추가 개선된 버전을 기재한다.

하나의 구현예에서, 폴리펩티드는 Alb-1, Alb-3, Alb-4, Alb-5, Alb-6, Alb-7, Alb-8, Alb-9, Alb-10(WO 2006/122787) 및 Alb-23으로부터 선택되는 혈청 알부민 결합 모이어티를 포함한다. 하나의 구현예에서, 혈청 알부민 결합 모이어티는 WO 2012/175400의 7페이지 내지 9페이지에 나타낸 바와 같은 Alb-8 또는 Alb-23 또는 그 변이체이다. 하나의 구현예에서, 혈청 알부민 결합 모이어티는 WO 2012/175741, WO2015/173325, WO2017/080850, WO2017/085172, WO2018/104444, WO2018/134235, 및 WO2018/134234에 기재된 알부민 결합제로부터 선택된다. 일부 혈청 알부민 결합제를 또한 표 A-4에 나타낸다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 기술의 폴리펩티드의 추가 구성분은 하기 항목 D에 기재된 바와 같다:

D. 인간 혈청 알부민에 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR3.

하나의 구현예에서, ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

인간 혈청 알부민에 결합하는 이러한 ISVD의 예는 표 A-2에서 작제물 ALB23002에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 또는 모든 프레임워크 영역을 갖는다(이전 항목 D에 정의된 바와 같은 CDR에 더하여). 하나의 구현예에서, 이는 작제물 ALB23002의 전체 아미노산 서열(서열번호 4, 표 A-1 및 A-2 참고)을 포함하거나 이로 구성되는 ISVD이다.

항목 D는 Kabat 정의를 사용하여 다음과 같이 설명될 수도 있다:

D'. 인간 혈청 알부민에 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. 서열번호 124의 아미노산 서열 또는 서열번호 124와 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 132의 아미노산 서열 또는 서열번호 132와 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 140의 아미노산 서열 또는 서열번호 140과 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열인 CDR3.

하나의 구현예에서, ISVD는 서열번호 124의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 132의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 140의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

인간 혈청 알부민에 결합하는 이러한 ISVD의 예는 표 A-2.1에서 작제물 ALB23002에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 또는 모든 프레임워크 영역을 갖는다(이전 항목 D'에 정의된 바와 같은 CDR에 더하여). 하나의 구현예에서, 이는 작제물 ALB23002의 전체 아미노산 서열(서열번호 4, 표 A-1 및 A-2.1 참고)을 포함하거나 이로 구성되는 ISVD이다.

또한 또 다른 구현예에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있으며, CDR은 이전 항목 D 또는 D'에 정의된 바와 같다. 하나의 구현예에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

인간 혈청 알부민에 결합하는 이러한 ISVD 결합이 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 D 또는 D')에 비해 적어도 하나의 CDR에 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 경우, ISVD는 작제물 ALB23002(서열번호 4)와 비교하여 인간 혈청 알부민에 대해 적어도 절반의 결합 친화도 또는 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

하나의 구현예에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 이러한 ISVD가 C-말단 위치를 갖는 경우, 이는 C-말단 알라닌(A) 또는 글리신(G) 연장과 같은 C-말단 연장을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 이러한 ISVD는 서열번호 33, 34, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43 및 45로부터 선택된다(아래 표 A-4 참고). 또 다른 구현예에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 C-말단 위치와 다른 위치를 갖는다(즉, 본 발명의 기술의 폴리펩티드의 C-말단 ISVD가 아님). 하나의 구현예에서, 이러한 ISVD는 서열번호 4, 31, 32, 35 및 37로부터 선택된다(아래 표 A-4 참고).

5.4 핵산 분자

또한, 본 발명의 기술의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 제공된다.

"핵산 분자"("핵산"과 상호 교환적으로 사용됨)는 뉴클레오티드 서열을 형성하기 위해 포스페이트 골격을 통해 서로 결합된 뉴클레오티드 단량체의 사슬이다. 핵산은 예를 들어 폴리펩티드의 발현 및/또는 생산을 위해 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 형질전환/형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 생산 목적에 적합한 숙주 또는 숙주 세포는 당업자에게 명확할 것이며, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 유기체일 수 있다. 본 발명의 기술의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포도 본 발명의 기술에 포괄된다.

핵산은 예를 들어 DNA, RNA, 또는 이의 하이브리드일 수 있고, 또한 PNA와 같은 (예를 들어, 화학적으로) 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이는 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 하나의 구현예에서, 이는 이중 가닥 DNA의 형태이다. 예를 들어, 본 발명의 기술의 뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA, cDNA일 수 있다.

본 발명의 기술의 핵산은 자체가 알려진 방식으로 제조 또는 수득될 수 있고/있거나 적합한 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 자연 발생 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 변이를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 제공하기 위해 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발을 거칠 수 있다. 또한, 당업자에게 명확할 바와 같이, 핵산을 제조하기 위해 표적화 모이어티를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열 및 예를 들어 하나 이상의 링커를 암호화하는 핵산과 같은 여러 뉴클레오티드 서열도 적합한 방식으로 함께 결합될 수 있다.

핵산을 생성하는 기법은 당업자에게 명확할 것이며 예를 들어 자동화 DNA 합성; 부위 지정 돌연변이유발; 2개 이상의 자연 발생 및/또는 합성 서열(또는 이의 2개 이상의 부분)의 조합, 절단된 발현 산물의 발현을 야기하는 돌연변이의 도입; 하나 이상의 제한 부위의 도입(예를 들어, 적합한 제한 효소를 사용하여 쉽게 소화 및/또는 결찰될 수 있는 카세트 및/또는 영역을 생성하기 위해), 및/또는 하나 이상의 "미스매치된" 프라이머를 사용하는 PCR 반응에 의한 돌연변이의 도입을 포함하지만 이에 제한되지 않을 수 있다.

5.5 벡터

또한, 본 발명의 기술의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 본원에서 사용되는 벡터는 유전 물질을 세포 내로 운반하기에 적합한 비히클이다. 벡터는 플라스미드 또는 mRNA와 같은 네이키드 핵산 또는 리포좀 또는 바이러스 벡터와 같은 더 큰 구조에 내장된 핵산을 포함한다.

일부 구현예에서, 벡터는 예를 들어 하나 이상의 적합한 프로모터(들), 인핸서(들), 터미네이터(들) 등과 같은 하나 이상의 조절 요소에 선택적으로 결합된 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 벡터는 발현 벡터, 즉, 적합한 조건 하에, 예를 들어 벡터가 (예를 들어, 인간) 세포 내로 도입되는 경우 암호화된 폴리펩티드 또는 작제물을 발현하기에 적합한 벡터이다. DNA 기반 벡터는 전사(예를 들어, 프로모터 및 폴리A 신호) 및 번역(예를 들어, 코작 서열)을 위한 요소의 존재를 포함한다.

하나의 구현예에서, 벡터에서, 상기 적어도 하나의 핵산 및 상기 조절 요소는 서로 "작동 가능하게 결합"되어 있으며, 이는 일반적으로 이들이 서로 기능적 관계에 있음을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 상기 프로모터가 코딩 서열의 전사 및/또는 발현을 개시하거나 달리 제어/조절할 수 있는 경우 코딩 서열에 "작동 가능하게 결합된" 것으로 간주된다(여기서 상기 코딩 서열은 상기 프로모터"의 제어 하인" 것으로 이해되어야 함). 일반적으로, 2개의 뉴클레오티드 서열이 작동 가능하게 결합되어 있는 경우, 이들은 동일한 배향에 있을 것이고 보통 동일한 해독틀에 있을 것이다. 이들은 보통 본질적으로 연속적일 것이지만, 이것이 또한 요구되지 않을 수 있다.

하나의 구현예에서, 벡터의 임의의 조절 요소는 이들이 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 이의 의도된 생물학적 기능을 제공할 수 있도록 한다.

예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 터미네이터는 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 "작동 가능"해야 하며, 이는 예를 들어 상기 프로모터가 작동 가능하게 결합된 뉴클레오티드 서열 - 예를 들어 코딩 서열 - 의 전사 및/또는 발현을 개시하거나 달리 제어/조절할 수 있어야 함을 의미한다.

5.6 조성물

본 발명의 기술은 또한 본 발명의 기술의 적어도 하나의 폴리펩티드, 본 발명의 기술의 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자 또는 이러한 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트를 추가로 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 추가의 약학 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함할 수 있다.

5.7 숙주 유기체

본 발명의 기술은 또한 본 기술의 폴리펩티드, 본 발명의 기술의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 및/또는 본 발명의 기술의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에 관한 것이다.

적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 당업자에게 명확하고, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 유기체이다. 구체예는 HEK293 세포, CHO 세포, 대장균 또는 피치아 파스토리스를 포함한다. 하나의 구현예에서, 숙주는 피치아 파스토리스이다.

5.8 방법 및 폴리펩티드의 용도

본 발명의 기술은 또한 본 발명의 기술의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 형질전환/형질감염하는 단계, 숙주에서 폴리펩티드를 발현하는 단계, 이어서 선택적으로 하나 이상의 단리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 방법은 다음을 포함할 수 있다:

a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 발현하는 단계; 선택적으로 이어서

b) 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계.

생산 목적에 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 당업자에게 명확할 것이며, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 유기체일 수 있다. 구체예는 HEK293 세포, CHO 세포, 대장균 또는 피치아 파스토리스를 포함한다. 하나의 구현예에서, 숙주는 피치아 파스토리스이다.

기재된 바와 같은 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물은 약제로 유용하다.

따라서, 본 발명의 기술은 약제로서 사용하기 위한 기재된 바와 같은 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

또한, (예방적 및/또는 치료적) 처치에서 사용하기 위한 기재된 바와 같은 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.

또한, 자가 면역 또는 염증성 질환의 (예방적 및/또는 치료적) 처치에서 사용하기 위한 기재된 바와 같은 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.

또한 크론병 및 궤양성 결장염과 같은 염증성 장 질환, 건선, 건선성 관절염 및 화농성 한선염의 (예방적 및/또는 치료적) 처치에서 사용하기 위한 기재된 바와 같은 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.

자가면역 또는 염증성 질환의 (예방적 및/또는 치료적) 처치 방법이 추가로 제공되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 약학 활성량의 기재된 바와 같은 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

크론병 및 궤양성 결장염과 같은 염증성 장 질환, 건선, 건선성 관절염 및 화농성 한선염의 (예방적 및/또는 치료적) 처치 방법이 추가로 제공되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 약학 활성량의 기재된 바와 같은 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

자가면역 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에서 기재된 바와 같은 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터, 또는 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물의 용도가 추가로 제공된다.

크론병 및 궤양성 결장염과 같은 염증성 장 질환, 건선, 건선성 관절염 또는 화농성 한선염을 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에서 기재된 바와 같은 본 발명의 기술의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터, 또는 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물의 용도가 추가로 제공된다.

염증성 장 질환은 예를 들어 크론병 또는 궤양성 결장염일 수 있다.

본 발명의 기술의 맥락에서 나타내는 "대상체"는 임의의 동물일 수 있다. 하나의 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 포유동물 중에서 인간과 인간이 아닌 포유동물이 구별될 수 있다. 비인간 동물은 예를 들어 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이), 가축(예를 들어, 소, 말, 양, 염소 또는 돼지 동물), 또는 연구 목적 및/또는 항체 생산을 위해 일반적으로 사용되는 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 양, 말, 돼지, 게잡이 원숭이와 같은 비인간 영장류, 또는 라마 또는 알파카와 같은 낙타과)일 수 있다.

예방 및/또는 치료 목적의 맥락에서, 대상체는 임의의 동물, 보다 구체적으로 임의의 포유동물일 수 있다. 하나의 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다.

폴리펩티드, 핵산 분자 및 벡터를 포함하는 물질, 또는 조성물은 임의의 적합한 투여 경로, 예를 들어 장(예를 들어, 경구 또는 직장) 또는 비경구(예를 들어, 경피부, 설하, 협측, 비강, 관절내, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경피 또는 경점막) 투여에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 물질은 근육내, 피하 또는 피내 투여와 같은 비경구 투여에 의해 투여된다. 하나의 구현예에서, 피하 투여가 사용된다.

기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터, 또는 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량이 의도되는 치료 결과를 제공하기 위해 대상체에 투여될 수 있다.

하나 이상의 용량이 투여될 수 있다. 하나를 초과하는 용량이 투여되는 경우, 용량은 폴리펩티드, 조성물, 핵산 분자 또는 벡터의 효과를 최대화하기 위해 적합한 간격으로 투여될 수 있다.

[표 A-1]

4가 폴리펩티드 F027500069 내에서 확인된 상이한 1가 V _HH 빌딩 블록의 아미노산 서열("ID"는 본원에 사용된 서열번호를 나타냄)

[표 A-2]

AbM 넘버링에 따른 CDR 및 프레임워크에 대한 서열("ID"는 주어진 서열번호를 나타냄)

[표 A-2.1]

Kabat 넘버링에 따른 CDR 및 프레임워크에 대한 서열("ID"는 주어진 서열번호를 나타냄)

[표 A-3]

선택된 다가 폴리펩티드의 아미노산 서열("ID"는 주어진 서열번호를 나타냄)

[표 A-4]

혈청 알부민 결합 ISVD 서열("ID"는 본원에 사용된 서열번호를 나타냄)

[표 A-5]

링커 서열("ID"는 본원에 사용된 서열번호를 나타냄)

6 실시예

6.1 실시예 1: 다중특이적 ISVD 작제물 생성

TNFα 및 IL-23에 결합하는 ISVD-함유 폴리펩티드 F027500069(서열번호 1)의 확인은 항-TNFα V_HH빌딩 블록(TNF06C11(WO/081320), TNF01C02(WO 2015/173325, 서열번호 327) 및 VHH#3E(WO 2004/041862, 서열번호 4)), 항-IL-23p19 V_HH빌딩 블록(23IL37D05, 23IL119A03 및 23IL81A12)(WO 2009/068627) 및 항-HSA V_HH빌딩 블록 ALB23002(WO2017085172, 서열번호 10)을 기반으로 하는 빌딩 블록이 포함된 데이터 기반 다중특이적 엔지니어링 및 형식화 캠페인으로부터 생성하였다. 상이한 위치/배향 및 상이한 링커 길이(9GS 대 35GS)의 빌딩 블록을 적용하였고 상이한 파라미터(효능, 교차 반응성, 발현 등)에 대해 중요한 것으로 증명되었다. 이 맥락에서 효능은 실시예 6에서 검정된 바와 같은 시험관내 TNFα-유도 NFκB 활성화의 억제 및 생체외 IL-23-유도 mIL-22 생성의 억제뿐만 아니라 실시예 7 및 8에서 검정된 바와 같은 시험관내 IL-23 유도 SIE 프로모터 활성화의 억제를 나타낸다.

38개의 작제물을 포함하는 패널(표 1)을 소규모 생산을 위해 피치아 파스토리스에서 형질전환시켰다. ISVD 작제물 발현의 유도는 메탄올의 단계적 첨가에 의해 발생하였다. 분비된 ISVD 작제물을 포함하는 청정화된 배지를 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 이어 탈염을 통해 정제를 위한 출발 물질로 사용하였다. 정제된 샘플을 기능적 특징규명 및 발현 평가에 사용하였다.

일부 작제물은 ISVD 빌딩 블록의 링커 길이 및 상대적 위치에 따라 손상된 효능을 나타내었다. 예를 들어, cyno TNFα에 대한 2가 VHH#3E의 효능은 짧은 9GS 링커와 결합되는 경우 강하게 손상되었다. 또 다른 예는 다중특이적 작제물에서 항-IL-23 ISVD 빌딩 블록, 37D05의 위치가 최대 효능을 수득하는 데 중요하다는 것이다.

[표 1]

평가된 38개의 상이한 다중특이적 ISVD 형식의 목록. BB = 빌딩 블록, ALB = ALB23002.

그 후, 큰 패널을 두 표적(인간 및 cyno) 모두에 대해 강력한 것으로 증명되었고 예비 수율 추정치에 기초하여 높은 발현 수준의 가능성을 포함하는, ISVD 작제물 F027500069, F027500093, F027500095 및 F027500096으로 구성되는 4개의 다중특이적 작제물 패널로 축소하였다.

발현 수율의 결정 그리고 생물물리학적 특성 및 기존 항체 반응성의 평가를 위해 피치아 파스토리스에서 대규모 2 L 생산을 수행했다. 표 2는 피치아 파스토리스에서 높은 발현 수준을 수득하기 위해 빌딩 블록의 특정 배향이 필요하였음을 나타낸다. 동일한 빌딩 블록을 갖지만 상이한 배향 및 상이한 링커 길이를 가진 4개의 형식화된 ISVD 작제물에 대해 5 ml 배양으로부터 수득한 발현 수율은 ISVD 6C11이 우수한 발현을 위해 N-말단 위치를 필요로 함을 명확히 시사한다. 이는 F027500069 및 F027500070의 2 L 발효에서 확인되었으며, N-말단 6C11을 갖는 ISVD 작제물(F027500069)은 C-말단 6C11을 갖는 F027500070보다 3.2배 더 높은 6.4 g/L의 역가에 도달했다.

[표 2]

상이한 배향 및 상이한 링커 길이를 갖는 빌딩 블록 6C11, 119A03/1 및 81A12를 갖는 4개의 ISVD 작제물의 발현 수준.

표 3 및 실시예 9는 기존 항체 반응성이 각각의 ISVD 작제물의 조성 및 결합가에 의해 유도됨을 나타낸다.

[표 3]

대조군 ISVD 작제물 F027301099 및 F027301186과 비교하여 F027500069, F027500093, F027500095 및 F027500096에 대한 96개의 인간 혈청 샘플에 존재하는 기존 항체의 결합

마지막으로, ISVD 작제물 F027500069를 효능, 기존 항체에 대한 감소된 결합, 더 우수한 발현 수준 및 정의된 완충액 중 100 mg/mL 농도에서 3.3 cP 및 146 mg/mL에서 6.4 cP의 낮은 점도를 갖는, CMC 특징에 기초하여 선택하였다.

6.2 실시예 2: TNFα, IL-23 및 혈청 알부민에 대한 다중특이적 ISVD 작제물 결합 친화도

인간 및 cyno TNFα, 인간 및 cyno IL-23, 인간 및 cyno 혈청 알부민에 대한 F027500069의 평형 해리 상수(K_D)로 표현되는 친화도를 Gyrolab xP 워크스테이션(Gyros)에서 용액 내 친화도 측정을 통해 정량하였다.

K_D제어 측정에서 TNFα 또는 IL-23(1 μM 내지 0.1 pM 범위) 또는 혈청 알부민(10 μM 내지 1 pM 범위)의 연속 희석 및 고정량의 F027500069(TNFα의 경우 50 pM, IL-23의 경우 20 pM 또는 12.5 pM, 그리고 혈청 알부민의 경우 1 nM)를 혼합하여 상호작용을 허용하고 24시간 또는 48시간(IL-23 및 TNFα의 경우) 또는 2시간(혈청 알부민의 경우) 동안 인큐베이션하여 평형에 도달하였다.

수용체 제어 측정에서 TNFα 또는 IL-23(1 μM 내지 0.1 pM 범위) 또는 혈청 알부민(10 μM 내지 1 pM 범위)의 연속 희석 및 고정량의 F027500069(TNFα의 경우 5 nM, IL-23의 경우 1.25 nM 그리고 혈청 알부민의 경우 50 nM)를 혼합하여 상호작용을 허용하고 24시간 또는 48시간(IL-23 및 TNFα의 경우) 또는 2시간(혈청 알부민의 경우) 동안 인큐베이션하여 평형에 도달하였다.

비오틴화된 인간 TNFα/IL-23/혈청 알부민을 비드 칼럼을 포함하고 평형 용액으로부터 유리 F027500069를 포획하기 위한 분자 탐침으로 사용되는 Gyrolab Bioaffy 1000 CD의 미세구조에 포획하였다. TNFα/IL-23/혈청 알부민 및 F027500069(유리 TNFα/IL-23/혈청 알부민, 유리 F027500069 및 TNFα/IL-23/혈청 알부민-F027500069 복합체 함유)의 혼합물을 비드를 통해 흐르게 허용하였으며 작은 비율의 유리 F027500069가 포획되었고, 이는 유리 ISVD 농도에 비례한다. 그런 다음 형광 표지된 항-V_HH항체를 주입하여 임의의 포획된 F027500069를 표지하고 과량의 형광 탐침을 씻어낸 후 형광 변화를 결정했다. 희석 시리즈의 피팅은 Gyrolab 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며, K_D- 및 수용체-제어 곡선을 분석하여 K_D값을 결정했다.

결과(표 4)는 다중특이적 ISVD 작제물이 인간/cyno IL-23 및 인간/cyno TNFα에 높은 친화도로 결합함을 실증한다.

[표 4]

인간 및 cyno IL-23, TNFα 및 혈청 알부민에 대한 F027500069의 결합 친화도

6.3 실시예 3: 막 결합된 TNFα에 결합하는 다중특이적 ISVD 작제물

막 결합된 TNFα에 대한 F027500069의 결합을 인간 막 TNFα 발현 HEK293H 세포에 대한 및 PBMC로부터 단리되고 PMA 및 이오노마이신으로 자극된 활성화된 CD4+ 세포에 대한 유세포측정을 사용하여 실증하였다(TNFα 발현 HEK293H 세포에 대한 데이터를 나타냄). 간단히 말해서, 세포를 1 x 10⁴세포/웰의 밀도로 접종하고 4℃에서 1시간 동안 100 nM에서 시작하여 최대 0.5 pM까지 F027500069의 희석 시리즈와 함께 인큐베이션했다. 병행하여 (막 결합된 TNFα의 검출을 증가시키기 위해) 접종 전에 세포를 PBS 중 4% 파라포름알데히드 및 0.1% 글루타르알데히드로 고정하고 4℃에서 1시간 또는 실온에서 24시간 동안 ISVD 희석 시리즈와 함께 인큐베이션했다. 세포를 3회 세척한 다음, 4℃에서 30분 동안 항-V_HH mAb와 함께 인큐베이션하고, 다시 세척하고, 염소 항-마우스 PE 표지된 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 샘플을 세척하고 FACS 완충액(5 nM TOPRO3이 보충된 10% FBS 및 0.05% 아지드화나트륨을 포함하는 D-PBS) 중에 재현탁했다. 그런 다음 세포 현탁액을 iQuescreener에서 분석했다. EC50 값을 GraphPad Prism을 사용하여 계산하였다. F027500069에 대한 EC50 값은 1시간 인큐베이션 후 생존 및 고정 세포에 대해 동일한 범위에 있었지만, 세포의 고정은 막 상 TNFα의 더 높은 발현 수준을 초래했다(표 5). 24시간 인큐베이션 후, EC50의 동시 6.6배 향상과 함께 결합 평형에 도달했다.

[표 5]

1시간 또는 24시간의 인큐베이션 시간 후 막 발현된 TNFα에 대한 F027500069의 결합 친화도

6.4 실시예 4: 다중특이적 ISVD 작제물이 TNFα 및 IL-23에 선택적으로 결합함

TNFα 및 IL-23 관련 인간 사이토카인에 대한 결합의 부재를 SPR을 통해 평가하였다. hIL-12는 IL-23과 p40 서브유닛을 공유하므로 시험하였다. TNF 수퍼패밀리 구성원 인간 FASL, TNFβ, LIGHT, TL-1A, RANKL을 TNFα에 대한 관련 사이토카인으로 시험하였다.

표적은 활성화를 위해 EDC/NHS를 420초 주입하고 탈활성화를 위해 1 M 에탄올아민 HCl을 420초 주입하는 아민 커플링을 사용하여 600초 동안 10 μg/mL로 고정화하였다(Sierra 센서 아민 커플링 키트 II Cat No ACK-001-025). 활성화, 탈활성화 및 리간드 주입 동안의 유속은 10 μl/분으로 설정하였다. 10 mM 아세테이트 고정화 완충액의 pH는 각 리간드의 pI에서 약 1.5를 빼서 선택했다.

다음으로, 1 μM의 F027500069를 2분 동안 주입하고 45 μL/분의 유속으로 900초 동안 해리되는 것을 허용하였다. 수행 완충액으로 1 x HBS-EP+ pH 7.4를 사용하였다. 양성 대조군으로서 0.2 μM α-huIL-12 Ab 및 0.5 μM α- huFASL Ab, 0.5 μM α-huTNFβ Ab, 0.5 μM α-huLIGHT Ab, 0.5 μM α-huTL-1A Ab 및 0.5 μM α- huRANKL V_HH를주입하였다. F027500069 및 고정화된 표적을 갖는 양성 대조군 간 상호작용은 결합 시 칩 상의 질량 변화 결과로 발생하는 굴절율 증가의 검출에 의해 측정했다.

모든 양성 대조군은 이의 각각의 표적에 결합했다. 인간 IL-12, FASL, TNFβ, LIGHT, TL-1A, RANKL에 대한 F027500069의 결합은 검출되지 않았다.

6.5 실시예 5: hIL-23 및 hTNFα에 대한 다중특이적 ISVD 작제물의 동시 결합

F027500069가 hTNFα 및 hIL-23에 동시에 결합할 수 있는지를 결정하기 위해 ProteOn XPR36 기구를 사용하였다. 이를 위해 HSA를 아민 커플링을 통해 GLC ProteOn 센서 칩 상에 고정화하였다. ALB23002 빌딩 블록을 통해 ISVD를 포획하기 위해 100 nM의 F027500069를 HSA 표면에 걸쳐 10 μl/분으로 2분 동안 주입하였다. 후속적으로 100 nM의 hIL-23, hTNFα 또는 hOX40L을 주입하거나 100 nM IL-23 + 100 nM TNFα, 100 nM IL-23 + 100 nM OX40L 또는 100 nM TNFα + IL- 100 nM IL-13의 혼합물을 2분 동안 10 μl/분의 유속으로 주입한 후 600초 해리 단계를 수행하였다. HSA 표면을 45 μL/분으로 HCl(100 mM)을 2분 주입하여 재생시켰다. 센서그램(도 1)은 반응 단위의 증가: TNFα만으로는 약 500 RU 증가, IL-23만으로는 약 880 RU 증가 그리고 IL-23 및 TNFα 혼합물로는 약 1300 RU 증가에 의해 나타난 바와 같이 F027500069가 인간 IL-23과 인간 TNFα에 동시에 결합할 수 있음을 실증한다.

6.6 실시예 6: 시험관내 TNFα-유도 NFkB 활성화의 다중특이적 ISVD 작제물 억제

HEK293_NFkB-NLucP 세포는 NFkB 의존적 프로모터의 제어 하에 Nano 루시퍼라제를 암호화하는 리포터 작제물로 안정적으로 형질감염된 TNF 수용체 발현 세포이다. 가용성 인간 및 cyno TNFα와 세포를 이용한 인큐베이션은 NFκB 매개 Nano 루시퍼라제 유전자 발현을 초래하였다. Nano-Glo 루시퍼라제 기질과 혼합된 용해 완충액을 1:50의 비로 세포 상으로 첨가하여 Nano 루시퍼라제 발광성을 측정하였다. 샘플을 진탕기에서 5분 동안 혼합하여 완전한 용해를 얻었다.

Glo response™ HEK293_NFkB-NLucP 세포를 바닥이 투명한 백색 조직 배양(TC) 처리된 96웰 플레이트에서 일반 성장 배지 중 20000개 세포/웰로 접종했다. F027500069 또는 참조 화합물(항-TNFα 참조 mAb)의 희석 시리즈를 25 pM 인간 또는 70 pM cyno TNFα에 첨가하고 30 μM HSA의 존재 하에 37℃에서 5시간 동안 세포와 인큐베이션했다.

F027500069는 인간 및 cyno TNFα-유도 NFκB 활성화를 항-TNFα 참조 mAb에 필적하는 38.8 pM(인간 TNFα에 대해) 및 128 pM(cyno TNFα에 대해)의 IC50으로 농도 의존적 방식으로 억제하였다(표 6, 도 2).

[표 6]

참조 화합물 항-hTNFα 참조 mAb 대비 Glo response™ HEK293_NFκB-NLucP 리포터 검정에서 인간 및 cyno TNFα의 F027500069 매개 중화의 IC50 값

6.7 실시예 7: 생체외 IL-23-유도 mIL-22 생산의 다중특이적 ISVD 작제물의 억제

인간(및 cyno) IL-23은 마우스 비장 세포로부터 mIL-17 및 mIL-22 분비를 자극했다(Aggarwal et al. 2003, J. Biol. Chem. 278(3): 1910-4). F027500069가 생체외 mIL-22의 IL-23 유도 발현을 차단함이 실증되었다. 5마리의 C57BL/6 마우스의 비장을 제거하고 비장세포를 수확하여 단세포 현탁액을 제조했다. 세포를 20 ng/ml 재조합 mIL-2의 존재 하에 배양하고 96-웰 편평한 바닥 플레이트에 400,000개 세포/웰로 접종하였다. F027500069 또는 참조 화합물(항-hIL-23 참조 mAb1 및 항-hIL-23 참조 mAb2)의 연속 희석액을 재조합 hIL-23(36 pM) 또는 게잡이 원숭이로부터의 재조합 IL-23(36 pM)과 함께 실온에서 30분 동안 배양 배지 중에 사전 인큐베이션한 다음 37℃에서 30 μM HSA의 존재하에 비장세포와 함께 3일 더 인큐베이션했다. 상청액을 수집하고 mIL-22의 수준을 ELISA를 사용하여 측정했다.

표 7에 나타낸 결과는 F027500069가 43 pM(인간 IL-23에 대해) 및 31 pM(cyno IL-23에 대해)의 IC50으로 농도 의존적 방식으로 hIL-23 및 cyno IL-23 유도 mIL-22 생산을 억제하였음을 실증한다. 억제는 참조 화합물 항-hIL-23 참조 mAb1 및 항-hIL-23 참조 mAb2에 의한 억제보다 더 강력했다.

6.8 실시예 8: 시험관내 IL-23 유도 SIE 프로모터 활성화의 다중특이적 ISVD 작제물의 억제

Glo response™ HEK293_인간 IL-23R/IL-12Rb1-Luc2P 세포를 SIE 반응성 프로모터의 제어 하에 루시퍼라제 유전자를 함유하는 리포터 작제물로 안정적으로 형질감염시켰다. 또한, 이들 세포는 인간 IL-23 수용체의 두 서브유닛, 즉 IL-12Rb1 및 IL-23R 모두를 구성적으로 과발현하였다. IL-23에 의한 이들 세포의 촉발 시 루시퍼라제 리포터 단백질이 발현되었으며, 이는 기질인 5'-플루오로루시페린(Bio-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템)의 첨가에 의한 그 효소 활성에 기초하여 정량된다.

세포를 일반 성장 배지 중 배양하고 바닥이 투명한 96-웰 백색 조직 배양 처리 플레이트에 15000개 세포/웰로 접종하였다. F027500069 또는 참조 화합물(항-hIL-23 참조 mAb1 및 항-hIL-23 참조 mAb2)의 연속 희석액을 세포에 첨가한 다음, 재조합 hIL-23(10 pM) 또는 cyno IL-23(40 pM)을 첨가하였다. 세포를 30 μM HSA의 존재 하에 37℃에서 4시간 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 Bio-Glo를 세포 상으로 각 웰에 첨가하고 루시페라제 발광을 측정하였다. F027500069는 각각 250 pM 및 323 pM의 IC50으로 인간 및 cyno IL-23 의존적 신호전달을 억제하였다(표 7 및 도 3).

[표 7]

참조 화합물 항-hIL-23 참조 mAb1 및 항-hIL-23 참조 mAb2 대비 마우스 비장세포 검정 및 Glo response™ HEK293_인간 IL-23R/IL-12Rb1-Luc2P 리포터 검정에서 인간 및 cyno IL-23의 F027500069 매개 중화의 IC50 값.

6.9 실시예 9: 기존 항체에 결합하는 다중특이적 ISVD 작제물

ISVD 작제물 F027500069의 기존 항체 반응성을 ProteOn XPR36(Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 사용하여 일반 인간 혈청(n=96)에서 평가하였다. PBS/Tween(인산염 완충 식염수, pH 7.4, 0.005% Tween20)을 수행 완충액으로 사용하였고 실험은 25℃에서 진행하였다.

ISVD는 칩 상에 고정화된 HSA에 대한 ALB23002 빌딩 블록의 결합을 통해 칩 상에 포획하였다. HSA를 고정화하기 위해 ProteOn GLC 센서 칩의 리간드 레인을 EDC/NHS(유속 30 μl/분)로 활성화하고 HSA를 ProteOn 아세테이트 완충액 pH 4.5 중 100 μl/ml로 주입하여 대략 3200 RU의 고정화 수준을 제공했다. 고정화 후, 표면을 에탄올아민 HCl(유속 30 μl/분)로 탈활성화하였다.

후속적으로, ISVD 작제물을 HSA 표면에 걸쳐 45 μl/분으로 2분 동안 주입하여 대략 800 RU의 ISVD 포획 수준을 제공하였다. 기존 항체를 함유하는 샘플을 14,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고 상청액을 PBS-Tween20(0.005%) 중 1:10으로 희석한 후 45 μl/분으로 2분 동안 주입하고 이어서 후속 400초 해리 단계를 수행하였다. 각 주기 후(즉, 새로운 ISVD 포획 및 혈액 샘플 주입 단계 전) HSA 표면을 45 μl/분으로 HCl(100 mM)의 2분 주입을 이용해서 재생시켰다. 1) ISVD-HSA 해리 및 2) 참조 리간드 레인에 대한 비특이적 결합을 빼서 이중 참조 후 기존 항체 결합을 나타내는 센서그램을 수득하였다. 보고 지점을 125초(결합 종료 5초 후)로 설정하여 기존 항체의 결합 수준을 결정했다. 기존 항체 결합의 감소 백분율을 참조 ISVD의 125초에서의 결합 수준에 대해 계산하였다.

각각의 빌딩 블록에서 돌연변이 L11V 및 V89L 및 C-말단 알라닌의 도입에 의해 감소된 기존 항체 결합에 대해 최적화된 4가 ISVD 작제물 F027500069는 대조군인 비최적화 4가 ISVD 작제물 F027301099와 비교하여 기존 항체에 대해 실질적으로 더 적은 결합을 나타내었다(표 8 및 도 4).

[표 8]

대조군 ISVD 작제물 F027301099와 비교하여 F027500069에 대한 96개의 인간 혈청 샘플에 존재하는 기존 항체의 결합

기존 항체 결합은 다중특이적 작제물의 결합가 및 조성에 의존하였다. 표 3 및 도 5는 작제물 F027500069가 작제물 F027500095 및 F027500096보다 낮은 기존 항체 반응성을 나타내었음을 실증한다.

6.10 실시예 10: 인간 TNFα 트랜스제닉 Tg197 다발관절염 모델에서 F027500069의 평가.

F027500069를 TNF-유도 진행성 다발관절염의 Tg197 마우스 모델에서 프로파일링하였다(Keffer at al., 1991, EMBO J., 10:4025-4031). 이들 마우스에서 변형된 인간 TNFα 유전자를 이식유전자로 마우스 내에 삽입하였다. 인간 유전자는 전사된 mRNA를 보다 안정적으로 만드는 방식으로 변형되었고, 이에 따라 100% 침투율에서 네 발 모두에 TNFα의 과발현과 자발적 진행성 관절염을 야기했다. 징후 및 증상은 약 6주령에 가시적이 되며 치료하지 않으면 약 10주령부터 심각한 빈사상태와 사망에 이를 때까지 지속적으로 증가한다. 관절염 중증도를 아래에 자세히 설명된 바와 같이 스코어링 시스템에 의해 임상적으로 평가하였다.

¹ 도 6에서 y-축에 표시된 관절염 스코어.

관절염은 인간 TNFα를 억제하려는 치료제를 사용한 치료에 민감했다(Shealy et al., 2002, Arthritis Res. 4(5): R7).

용량 의존적 유효성을 확립하기 위해, 상이한 용량의 F027500069를 관절염의 가시적 징후 및 증상을 갖는 6주령 동물(n=8마리 동물/군)에 치료적 방식으로 매주 2회 복강내 주사로 투여하였다. 인간 골수종 혈청(BioXcell #BE0297)으로부터 정제된 인간 IgG1을 음성 대조군으로 사용하고 항-hTNFα 참조 mAb를 양성 대조군으로 사용하여 관절염을 억제했다. F027500069를 각각 1.3 mg/체중kg, 4 mg/체중kg 및 13.5 mg/체중kg의 3개의 상이한 용량 강도로 투여하였다. 치료를 11주령까지 계속하였다. 임상 관절염 스코어를 일주일에 한 번 결정하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, F027500069를 이용한 치료는 경시적인 임상 관절염 스코어의 용량 의존적 억제를 초래하였다.

인간 IgG1 음성 대조군 항체로 치료받은 동물은 11주까지의 평균 관절염 스코어가 1.099 ± 0.1071로 나타났다. 항-hTNFα 참조 mAb는 관절염 진행을 완전히 억제했으며 11주까지의 평균 스코어는 0.4844 ± 0.0594였다. F027500069는 0.8047 ± 0.0929(1.3 mg/kg), 0.7969 ± 0.0585(4 mg/kg) 및 0.6016 ± 0.0349(13.5 mg/kg)의 평균 스코어로 관절염 진행을 제11주까지 감소시켰다. 관절염의 전반적 억제를 곡선 하 면적(AUC, 도 7)에 의해 분석하였다. F027500069의 모든 용량은 Tg197 관절염 모델에서 항-hTNFα 참조 mAb에 필적하게 관절염 진행을 유의미하게 억제했다.

치료가 완료되면 뒷다리 발목 관절을 조직학적으로 처리하고 절편에서 다음 스코어링 체계로 관절염의 구조적 징후를 평가했다:

¹도 8에서 y-축에 표시된 관절염 스코어^.

조직학 스코어링 결과를 도 8에 도시한다. 구조적 관절염과 관절 파괴는 더 높은 용량에서 F027500069에 의해 유의미하게 억제되었다.

결론적으로, 결과는 항-TNFα 참조 mAb와 필적하는 정도로 F027500069에 의한 관절염 징후 및 증상의 용량 의존적 억제뿐만 아니라 구조적 진행의 억제를 실증한다.

6.11 실시예 11: 인간 IL-23 유도 피부 염증 모델에서 F027500069의 평가.

마우스에서 재조합 IL-23의 피내 주사는 주사 부위 주변의 홍반 및 부종을 갖는 급성 피부 염증을 야기했다. 조직학적으로, 각질세포 과증식에 의한 표피 비후화, 각화증 그리고 T 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포 침윤과 같은 건선성 피부 염증의 특징은 가시적이었다. 분자 수준 상에서, 모델에서의 전사체 변화는 인간의 정상 피부 대비 건선성 병변 피부에서 관찰된 변화와 크게 중복되었다(Gauld et al., 2018, Journal of Dermatological Science 92:45-53). 따라서 IL-23 피부 염증 모델은 건선의 기계론적 모델과 유사하다.

IL-23 매개 염증의 억제를 조사하기 위해, F027500069를 문헌[Rizzo et al., 2011, J Immunol; 186:1495-1502]로부터 채택된 피부 염증 모델에서 시험하였다. 제1일, 제2일, 제3일, 제4일에 총 부피 20 μl의 재조합 인간 IL-23 1 ㎍을 암컷 C57BL/6 마우스의 오른쪽 귀 내로 피내 주사하였다. 한 군의 마우스의 귀 내로 PBS를 대조군으로 주사하였다. 귀 피부 비후화를 캘리퍼로 매일 측정했다. F027500069 및 대조군 화합물을 제1일 및 제3일에 복강내 주사로 투여하였다. 제5일에 마우스를 희생시키고 피부 펀치 생검을 취했다. 생검을 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 PBS 중에 균질화하고 하류 효과기 사이토카인 IL-22 수준을 결정했다.

용량 의존적 유효성을 확립하기 위해, 상이한 용량의 ISVD 작제물을 관절염의 가시적 징후 및 증상을 갖는 6주령 동물(n=10마리 동물/군)에 치료적 방식으로 매주 2회 복강내 주사로 투여하였다. 인간 골수종 혈청(BioXcell #BE0297)으로부터 정제된 인간 IgG1을 음성 대조군으로 사용하고 항-hIL-23 참조 mAb1을 양성 대조군으로 사용하여 피부 염증을 억제했다. F027500069는 각각 0.13 mg/체중kg, 0.4 mg/체중kg, 1 mg/체중kg 및 4 mg/체중kg의 4개의 상이한 용량 강도로 투여하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, F027500069로의 치료는 제5일에 기준선으로부터의 귀 두께의 변화로 도시되는 피부 부종의 용량 의존적 억제를 초래하였다.

제5일에 피부 생검을 취하고 조직 균질액을 제조했다. 뮤린 IL-22 수준을 Mesoscale Discovery V-plex 마우스 IL-22 검정 키트(#K152WVD, 도 10)를 사용하여 측정하였다. IL-23의 투여는 PBS-주사 피부로부터의 모든 샘플이 이용된 검정의 정량 하한(LLOQ) 미만이었기 때문에 측정 가능한 수준의 IL-22를 야기했다. 모든 용량의 F027500069뿐만 아니라 항-hIL-23 참조 mAb1은 IL-22 조직 수준을 유의미하게 억제했다(1 mg/kg 용량 군의 경우 IL-22 수준이 결정되지 않았음).

또한, IL-23 유도 피부 염증 모델의 또 다른 실험에서 피하 투여의 타당성을 평가했다. F027500069의 2개의 용량(0.1 mg/kg 및 1 mg/kg)을 제1일 및 제3일에 복강내 또는 피하 주사로 투여하고 귀 두께 변화를 수득하였다(도 11). 이 실험에서, 관련되지 않은 V_HH의 1 mg/kg 용량을 음성 대조군(Nab 대조군)으로 사용하였고, 3 mg/kg 용량의 항-hIL-23 참조 mAb1(IP)을 양성 대조군으로 사용하였다.

또한, 조직 IL-22 수준을 제5일 피부 생검 균질물로부터 측정하였다(도 12).

결론적으로, 결과는 피부 비후화뿐만 아니라 조직 효과인자 사이토카인 수준 둘 모두에서 IL-23 유도 피부 염증의 억제를 실증한다. 복강내뿐만 아니라 피하 투여 경로 둘 모두 타당하다.

6.12 실시예 12: 인간 TNFα/TNFR1 녹 인 마우스에서의 콜라겐 항체 유도 관절염 모델에서 F027500069의 평가.

F027500069를 TNFα뿐만 아니라 TNF 수용체 1(TNFR1) 둘 모두의 유전자좌가 각각의 인간 유전자좌로 대체된 독점 마우스에서의 콜라겐 항체 유도 관절염(CAIA) 모델에서 프로파일링하였다.

군당 8마리의 동물에 연골의 콜라겐 2에 대한 모노클로날 항체 칵테일(ArthritoMab, MDbioscience, CIA-MAB-2C) 8 mg을 제0일에 주사했다. 제1일에 25 μg의 세균성 지질다당류(LPS)를 주사하여 관절염 발생을 유발했다. 시험 화합물은 LPS 주사 6시간 후 1회 단회 주사로 투여하였다. 관절염의 징후 및 증상의 발생을 아래에 상세히 기재된 관절염 스코어에 기초하여 제7일까지 매일 평가하였다:

¹ 도 13에서 y-축에 표시된 관절염 스코어.

F027500069는 1.3 mg/체중kg으로 투여하였고, 항 hTNFα 참조 mAb 양성 대조군은 0.5 mg/체중kg으로 투여하였다. 도 13은 경시적인 관절염 징후 및 증상의 발생을 나타낸다. F027500069 또는 항 hTNFα 참조 mAb 둘 모두의 단회 예방 투여는 관절염 발생의 완전한 억제를 초래했다.

6.13 실시예 13: 인간 TNFα 녹-인 마우스에서의 인간 IL-23 유도 피부 염증 모델에서 F027500069의 평가.

F027500069는 인간 또는 영장류 표적(IL-23뿐만 아니라 TNFα 둘 모두)에만 결합하고 억제하기 때문에 인간 IL-23 유도 피부 염증이 TNFα 인간화 마우스에서 반복되었다. 이 독점 균주에서 마우스의 전체 게놈 TNFα 유전자좌를 인간 유전자좌로 대체하였다. 엑손-인트론 구조 및 조절 요소는 마우스 및 인간 간에 보존된다. 마우스에서 반응을 이끌어내는 인간 TNFα의 충실한 발현뿐만 아니라 기능적 능력을 사전에 평가하였다.

hIL-23의 피내 주사는 TNFα 발현의 중등도 증가를 야기하였다(자체 데이터 및 문헌[Gauld et al. 2018, Journal of Dermatological Science 92:45-53]). 등몰 용량의 F027500069 및 상응하는 단일특이적 ISVD 빌딩 블록 F027500101(항-TNFα) 및 F027500017(항-IL-23)을 이중 표적화의 잠재적인 부가 효과를 다루기 위해 이 모델에서 투여하였다. 투여된 용량 강도는 약 0.1 mg/kg에 상응하는 3.6 nmol/kg이었다. 이 낮은 용량은 일부 남아있는 유리 IL-23 및 이에 따른 하류 TNFα 분비를 허용하기 위해 선택하였다. 또한, 고용량의 F027500069뿐만 아니라 항-hIL-23 참조 mAb1을 양성 대조군으로 투여하였다. 귀 두께의 변화를 고(Nab 음성 대조군) 및 저(IL-23 주사 없음) 대조군((샘플 - 저 대조군) / (고 대조군 - 저 대조군))에 대해 표준화하였다. 도 14는 결과를 예시한다. 3.6 nmol/kg F027500101로의 단일특이적 TNFα 억제는 피부 부종을 억제하지 않은 반면, 3.6 nmol/kg F027500017로의 단일특이적 IL-23 억제는 중등도지만 유의미한 효과를 가졌다. 3.6 nmol/kg F027500069로의 TNFα 및 IL-23 둘 모두의 이중 표적화는 수치적으로 더 우수한 피부 부종의 억제를 야기했다.

제5일 피부 생검을 취하고 표준 방법을 사용하여 mRNA를 제조했다. mRNA로 Ilumina NovaSeq™6000 플랫폼에서 페어드-엔드(paired-end), 벌크 기반 전체 전사체 서열분석을 거쳤다. NAb 대조군 대비 차별적으로 발현된 유전자(DEG, p < 0.001에서 변화 배율 > 2)를 처리군 간 중첩에 대해 분석하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 단일특이적 처리군과 다중특이적 처리군의 큰 중첩에도 불구하고, 여전히 769개 중 199개의 DEG가 F027500069 처리에 특이적이었다. 이것은 이 모델에서 TNFα와 IL-23 둘 모두의 이중 표적화가 인간 질환의 독특한 분자 반응 그리고 아마도 상승적 완화를 야기하였음을 시사한다.

결론적으로, 결과는 IL-23 유도 피부 염증에서 IL-23 및 TNFα 둘 모두의 다중특이적 억제가 피부 비후화에 대한 수치적 부가 효과를 야기했고 독특한 전사체 프로파일을 유발했음을 실증한다.

7 산업적 이용가능성

본원에 기재된 폴리펩티드, 이를 암호화하는 핵산 분자, 핵산을 포함하는 벡터 및 조성물은 예를 들어 염증성 장 질환, 건선, 건선성 관절염 또는 화농성 한선염을 앓는 대상체의 치료와 같은 치료에서 사용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Ablynx NV <110> Sanofi <120> POLYPEPTIDES COMPRISING IMMUNOGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAINS TARGETING TNFa AND IL-23 <130> 228664 <150> US 62/944,619 <151> 2019-12-06 <150> EP 20 305 056.2 <151> 2020-01-23 <150> EP 20 000 090.9 <151> 2020-02-28 <150> EP 20 305 216.2 <151> 2020-03-02 <160> 157 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 517 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F027500069 <400> 1 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala 20 25 30 Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro 130 135 140 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser 145 150 155 160 Leu Pro Ala Ser Gly Asn Ile Phe Asn Leu Leu Thr Ile Ala Trp Tyr 165 170 175 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Glu Ser 180 185 190 Gly Ser Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 195 200 205 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 210 215 220 Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Thr Ser Gly Ser Gly 225 230 235 240 Ser Pro Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 245 250 255 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 260 265 270 Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 275 280 285 Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala 290 295 300 Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser 305 310 315 320 Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 325 330 335 Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg 355 360 365 Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val 385 390 395 400 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr 405 410 415 Leu Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu 420 425 430 Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Ser Gln Gly Gly Thr Ala Ile Tyr Tyr 435 440 445 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 450 455 460 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala 465 470 475 480 Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Pro Ser Pro Tyr Tyr Arg Gly Ser Ala 485 490 495 Tyr Leu Leu Ser Gly Ser Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 500 505 510 Lys Val Ser Ser Ala 515 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6C11 <400> 2 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala 20 25 30 Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 119A03/1 <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Leu Pro 20 25 30 Ala Ser Gly Asn Ile Phe Asn Leu Leu Thr Ile Ala Trp Tyr Arg Gln 35 40 45 Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Glu Ser Gly Ser 50 55 60 Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70 75 80 Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro 85 90 95 Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Thr Ser Gly Ser Gly Ser Pro 100 105 110 Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB23002 <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 81A12 <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Gln Gly Gly Thr Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Pro Ser Pro Tyr Tyr Arg Gly Ser Ala Tyr Leu Leu Ser 100 105 110 Gly Ser Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ser 115 120 125 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 6 Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala Asp Met Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 7 Gly Arg Ile Phe Ser Leu Pro Ala Ser Gly Asn Ile Phe Asn Leu Leu 1 5 10 15 Thr Ile Ala <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 8 Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 9 Gly Arg Thr Leu Ser Ser Tyr Ala Met Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 10 Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 11 Thr Ile Glu Ser Gly Ser Arg Thr Asn 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 12 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 13 Arg Ile Ser Gln Gly Gly Thr Ala Ile Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 14 Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 15 Ser Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 16 Gly Gly Ser Leu Ser Arg 1 5 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 17 Asp Pro Ser Pro Tyr Tyr Arg Gly Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Gly Ser 1 5 10 15 Tyr Asp Ser <210> 18 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 18 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 20 25 <210> 19 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 20 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 21 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 22 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 23 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 24 Tyr Asp Glu Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 1 5 10 15 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 20 25 30 Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg Ser 35 <210> 25 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 25 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 1 5 10 15 Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 20 25 30 Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Thr 35 <210> 26 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 26 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 1 5 10 15 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 20 25 30 Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Ile 35 <210> 27 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 27 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 1 5 10 15 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 20 25 30 Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys 35 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 <400> 28 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 <400> 29 Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 <400> 30 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ser 1 5 10 <210> 31 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb8 <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb23 <400> 32 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb129 <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 <210> 34 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb132 <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 <210> 35 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb11 <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb11 (S112K)-A <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 <210> 37 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb82 <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb82-A <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 <210> 39 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb82-AA <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ala 115 <210> 40 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb82-AAA <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ala Ala 115 <210> 41 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb82-G <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly 115 <210> 42 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb82-GG <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly 115 <210> 43 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb82-GGG <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 <210> 44 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb23002 <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb223 <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 <210> 46 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A <400> 46 Ala Ala Ala 1 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5GS <400> 47 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7GS <400> 48 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8GS <400> 49 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9GS <400> 50 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10GS <400> 51 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 15GS <400> 52 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 18GS <400> 53 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 54 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 20GS <400> 54 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 55 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 25GS <400> 55 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 56 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 30GS <400> 56 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 57 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 35GS <400> 57 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 58 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 40GS <400> 58 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G1 hinge <400> 59 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 60 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9GS-G1 hinge <400> 60 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 1 5 10 15 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 20 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Llama upper long hinge region <400> 61 Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 62 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G3 hinge <400> 62 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 50 55 60 <210> 63 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 63 Lys Glu Arg Glu 1 <210> 64 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 64 Lys Gln Arg Glu 1 <210> 65 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 65 Gly Leu Glu Trp 1 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 66 Lys Glu Arg Glu Leu 1 5 <210> 67 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 67 Lys Glu Arg Glu Phe 1 5 <210> 68 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 68 Lys Gln Arg Glu Leu 1 5 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 69 Lys Gln Arg Glu Phe 1 5 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 70 Lys Glu Arg Glu Gly 1 5 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 71 Lys Gln Arg Glu Trp 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 72 Lys Gln Arg Glu Gly 1 5 <210> 73 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 73 Thr Glu Arg Glu 1 <210> 74 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 74 Thr Glu Arg Glu Leu 1 5 <210> 75 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 75 Thr Gln Arg Glu 1 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 76 Thr Gln Arg Glu Leu 1 5 <210> 77 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 77 Lys Glu Cys Glu 1 <210> 78 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 78 Lys Glu Cys Glu Leu 1 5 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 79 Lys Glu Cys Glu Arg 1 5 <210> 80 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 80 Lys Gln Cys Glu 1 <210> 81 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 81 Lys Gln Cys Glu Leu 1 5 <210> 82 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 82 Arg Glu Arg Glu 1 <210> 83 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 83 Arg Glu Arg Glu Gly 1 5 <210> 84 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 84 Arg Gln Arg Glu 1 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 85 Arg Gln Arg Glu Leu 1 5 <210> 86 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 86 Arg Gln Arg Glu Phe 1 5 <210> 87 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 87 Arg Gln Arg Glu Trp 1 5 <210> 88 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 88 Gln Glu Arg Glu 1 <210> 89 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 89 Gln Glu Arg Glu Gly 1 5 <210> 90 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 90 Gln Gln Arg Glu 1 <210> 91 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 91 Gln Gln Arg Glu Trp 1 5 <210> 92 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 92 Gln Gln Arg Glu Leu 1 5 <210> 93 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 93 Gln Gln Arg Glu Phe 1 5 <210> 94 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 94 Lys Gly Arg Glu 1 <210> 95 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 95 Lys Gly Arg Glu Gly 1 5 <210> 96 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 96 Lys Asp Arg Glu 1 <210> 97 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 97 Lys Asp Arg Glu Val 1 5 <210> 98 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 98 Asp Glu Cys Lys Leu 1 5 <210> 99 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 99 Asn Val Cys Glu Leu 1 5 <210> 100 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 100 Gly Val Glu Trp 1 <210> 101 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 101 Glu Pro Glu Trp 1 <210> 102 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 102 Gly Leu Glu Arg 1 <210> 103 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 103 Asp Gln Glu Trp 1 <210> 104 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 104 Asp Leu Glu Trp 1 <210> 105 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 105 Gly Ile Glu Trp 1 <210> 106 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 106 Glu Leu Glu Trp 1 <210> 107 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 107 Gly Pro Glu Trp 1 <210> 108 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 108 Glu Trp Leu Pro 1 <210> 109 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 109 Gly Pro Glu Arg 1 <210> 110 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 110 Gly Leu Glu Arg 1 <210> 111 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif <400> 111 Glu Leu Glu Trp 1 <210> 112 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 112 Val Thr Val Ser Ser 1 5 <210> 113 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 113 Val Lys Val Ser Ser 1 5 <210> 114 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 114 Val Gln Val Ser Ser 1 5 <210> 115 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 115 Val Thr Val Ser Ser Ala 1 5 <210> 116 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 116 Val Lys Val Ser Ser Ala 1 5 <210> 117 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 117 Val Gln Val Ser Ser Ala 1 5 <210> 118 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 118 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 119 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 119 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser 20 25 30 <210> 120 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 120 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg 20 25 30 <210> 121 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 121 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Leu Ser 20 25 30 <210> 122 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 122 Thr Ala Asp Met Gly 1 5 <210> 123 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 123 Leu Pro Ala Ser Gly Asn Ile Phe Asn Leu Leu Thr Ile Ala 1 5 10 <210> 124 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 124 Ser Phe Gly Met Ser 1 5 <210> 125 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 125 Ser Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 126 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 126 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 127 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 127 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 128 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 128 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 129 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 129 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 130 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 130 Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 131 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 131 Thr Ile Glu Ser Gly Ser Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 132 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 132 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 133 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 133 Arg Ile Ser Gln Gly Gly Thr Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 134 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 134 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg Ser 20 25 30 <210> 135 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 135 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Thr 20 25 30 <210> 136 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 136 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Ile 20 25 30 <210> 137 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 137 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 <210> 138 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 138 Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 139 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 139 Ser Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe 1 5 <210> 140 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 140 Gly Gly Ser Leu Ser Arg 1 5 <210> 141 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 141 Asp Pro Ser Pro Tyr Tyr Arg Gly Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Gly Ser 1 5 10 15 Tyr Asp Ser <210> 142 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 <400> 142 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 143 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 <400> 143 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 144 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 <400> 144 Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 145 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 <400> 145 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ser 1 5 10 <210> 146 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 146 Val Thr Val Lys Ser 1 5 <210> 147 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 147 Val Thr Val Gln Ser 1 5 <210> 148 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 148 Val Lys Val Lys Ser 1 5 <210> 149 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 149 Val Lys Val Gln Ser 1 5 <210> 150 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 150 Val Gln Val Lys Ser 1 5 <210> 151 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 151 Val Gln Val Gln Ser 1 5 <210> 152 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 152 Val Thr Val Lys Ser Ala 1 5 <210> 153 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 153 Val Thr Val Gln Ser Ala 1 5 <210> 154 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 154 Val Lys Val Lys Ser Ala 1 5 <210> 155 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 155 Val Lys Val Gln Ser Ala 1 5 <210> 156 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 156 Val Gln Val Lys Ser Ala 1 5 <210> 157 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 157 Val Gln Val Gln Ser Ala 1 5

Claims

약제로서 사용하기 위한, 폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로서, 폴리펩티드는 TNFα 및 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하고, 폴리펩티드는 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되며, 각각의 상기 ISVD는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 결합된, 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고; 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:
a) 제1 ISVD는 다음을 포함하고,
i. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3;
b) 제2 ISVD는 다음을 포함하고:
iv. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3; 및
c) 제3 ISVD는 다음을 포함함:
vii. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;
viii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및
ix. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3.
제1항에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:
a) 상기 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고;
b) 상기 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고;
c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 5와 90% 초과의 동일성의 서열 동일성을 포함함.
제1항 또는 제2항에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:
a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되고;
b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되고;
c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성됨.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 다음을 포함하는 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD를 추가로 포함하는, 폴리펩티드 또는 조성물:
i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3.
제4항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩티드 또는 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩티드 또는 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역 또는 염증성 질환의 치료에서 사용하기 위한 폴리펩티드 또는 조성물.
제7항에 있어서, 자가면역 또는 염증성 질환은 염증성 장 질환(예를 들어, 크론병 또는 궤양성 결장염), 건선, 건선성 관절염 및 화농성 한선염으로부터 선택되는, 폴리펩티드 또는 조성물.
적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드로서, 각각의 상기 ISVD는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 결합된, 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고; 다음과 같은, 폴리펩티드:
a) 제1 ISVD는 다음을 포함하고,
i. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3;
b) 제2 ISVD는 다음을 포함하고:
iv. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3; 및
c) 제3 ISVD는 다음을 포함함:
vii. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;
viii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및
ix. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3.
제9항에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드:
a) 상기 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고;
b) 상기 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고;
c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 5와 90% 초과의 동일성의 서열 동일성을 포함함.
제9항 또는 제10항에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드:
a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되고;
b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되고;
c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성됨.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 다음을 포함하는 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD를 추가로 포함하는 폴리펩티드:
i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열인 CDR3.
제12항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩티드.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드.
제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
제15항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포.
제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 적어도 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서 제15항에 따른 핵산을 발현하는 단계; 선택적으로 이어서,
b) 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계.
제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드, 또는 제15항에 따른 핵산을 포함하는 조성물.