KR20220115496A - The development of vitrification container for cryopreservation and vitrification method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 냉동보존에 이용되는 유리화 용기에 관한 것으로, 구체적으로는 인간 또는 동물의 생식세포 냉동보존에 적용되는 유리화 동결을 위한 보존 용기 및 유리화 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a vitrification container used for cryopreservation, and more particularly, to a preservation container and a vitrification method for vitrification freezing applied to the cryopreservation of human or animal germ cells.
일반적으로, 보조생식술 (Assisted Reproductive Technology, ART) 에서 난자 또는 배아와 같은 생식세포의 냉동보관은 난임 환자에게 더 많은 임신의 기회를 제공해주는 기술로 알려져 있다.In general, the cryopreservation of reproductive cells such as eggs or embryos in Assisted Reproductive Technology (ART) is known as a technology that provides more chances of conception to infertile patients.
이러한 생식세포의 냉동보관 기술은 크게 완만 동결법과 유리화 동결법으로 나눌 수 있다.The cryopreservation technology of these germ cells can be largely divided into a gentle freezing method and a vitrification freezing method.
먼저, 완만 동결법은 세포질 내 수분의 일부분과 동결 억제제를 삼투압 원리를 이용하여 세포질 내의 수분 일부와 투과동결억제제(permeable cryoprotectant)를 치환하여 평형시킨 후 세포동결기에 의해 세포 외부의 수분을 천천히 동결시키는 과정을 통해 세포 외부의 동결억제제의 농도를 올려 삼투압을 발생시키고, 이 힘을 이용하여 세포 내에 남아있는 물을 천천히 제거시켜 최소한의 수분만을 남겨 세포 내에 남아 있는 수분의 얼음 결정을 최소화하는 기술로 알려져 있다.First, the gentle freezing method uses the osmotic principle to equilibrate a part of the moisture in the cytoplasm and a cryoprotectant by substituting a part of moisture in the cytoplasm with a permeable cryoprotectant, and then slowly freezing the moisture outside the cell by a cell freezer. It is known as a technology that generates osmotic pressure by increasing the concentration of the cryo inhibitor outside the cell, and uses this power to slowly remove the remaining water in the cell, leaving only the minimum amount of water and minimizing the ice crystals of the remaining water in the cell. .
하지만 이 방법은 비교적 고가의 장비와 많은 시간의 소요 및 많은 양의 액체질소가 필요하며, 특히 얼음 결정(ice crystal) 현상으로 인해 해동 후 생식세포의 생존율 및 회수율에 치명적 단점을 가지고 있다.However, this method requires relatively expensive equipment, a lot of time, and a large amount of liquid nitrogen. In particular, due to the ice crystal phenomenon, it has fatal disadvantages in the survival rate and recovery rate of germ cells after thawing.
이에 반해 유리화 동결법(vitrification method)은 생식세포의 동결 시 투과율이 높고 독성이 적은 동결 억제제 또는 투과성과 비투과성 동결억제제 조합을 이용하여 상대적 농도 변화 없이 절대적인 농도를 낮추고, 세포에 독성을 감소시키며, 해동 후 동결된 생식세포 효율성을 증진시켜 주는 기술로 알려져 있다.In contrast, the vitrification method uses a cryo inhibitor with high permeability and low toxicity or a combination of permeability and impermeability cryo inhibitor when freezing germ cells to lower the absolute concentration without changing the relative concentration, reduce toxicity to cells, and thaw It is known as a technique to enhance the efficiency of post-frozen germ cells.
또한, 공정이 간편하고 신속하기 때문에 동결 보존을 위한 조작 시간이 단축되고, 온도 제어 장치가 필요하지 않다는 이점을 가지고 있다.In addition, since the process is simple and quick, the operation time for cryopreservation is shortened and a temperature control device is not required.
이러한 유리화 동결법은 다양한 세포 또는 조직의 동결 보존에 적용되고 있으며, 많은 난임 시험관 시술 센터와 동물 생식세포 연구소에서도 폭 넓게 이용하고 있는 실정이다.This vitrification freezing method is applied to cryopreservation of various cells or tissues, and is widely used in many infertility in vitro treatment centers and animal germ cell laboratories.
그러나 현재 사용하고 있는 크라이오 탑(cryo-top), 크라이오 루프(cryo-loop), 크라이오파이펫(cryo-pipet), 크라이오팁(cryo-tip), 이엠그리드(EM-grid) 등과 같은 유리화 운반체(vitrification carrier) 또는 유리화 용기(vitrification container)는 시중에서 고가로 제공되어 난임 시술비용과 동물 연구의 비용을 증가시킬 뿐만 아니라, 생식세포 냉동 후 해동 시 검체 튜브 또는 스트로우 캐니스터의 폭발 또는 생식세포 부착으로 인한 생식세포의 손실률이 높은 단점을 가지고 있다.However, vitrification such as cryo-top, cryo-loop, cryo-pipet, cryo-tip, EM-grid, etc. Vitrification carriers or vitrification containers are available in the market at a high price, which increases the cost of fertility procedures and animal studies, as well as explosion of test tubes or straw canisters or attachment of germ cells during thawing after freezing of germ cells. It has a disadvantage in that the loss rate of germ cells due to this is high.
이러한 문제점을 보완하기 위한 배경기술을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-1962052호(이하 ‘문헌 1’)의 “세포 또는 조직의 동결 보존용 지그 및 동결 보존 방법”에서, 세포 또는 조직을 올려놓는 재치부의 최표면에 수용성 고분자 화합물을 함유하는 표면층의 전체 또는 일부가 융해액 중에 용해되어 세포 또는 조직이 동결 보존용 지그의 재치부에 고착되지 않아, 용이하게 박리, 회수될 수 있는 장점이 있다.Looking at the background technology to supplement this problem, in the "jig and cryopreservation method for cryopreservation of cells or tissues" of Korean Patent Publication No. 10-1962052 (hereinafter referred to as 'Document 1'), All or part of the surface layer containing the water-soluble high molecular compound on the outermost surface of the mounting unit is dissolved in the lysing solution, so that cells or tissues do not adhere to the mounting unit of the cryopreservation jig, and there is an advantage that can be easily peeled off and recovered.
그러나 문헌 1의 세포로서 배아 또는 난자를 포함하는 생식세포가 적용될 경우, 생식세포는 일반세포 또는 암세포보다 크기가 크기 때문에 얼음결정이 형성되어 쉽게 손상될 수 있는 단점이 있다.However, when germ cells including embryos or eggs are applied as cells of Document 1, since germ cells are larger than normal cells or cancer cells, ice crystals are formed and they can be easily damaged.
다른 배경기술을 살펴보면, 대한민국 공개특허공보 제10-2020-0005582호(이하 ‘문헌 2’)의 “세포 또는 조직의 동결 보존용 지그”에서, 재치부 표면이 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와 보존액을 저류시키는 오목부를 갖는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 대해 개시하고 있다.Looking at the other background art, in the "jig for cryopreservation of cells or tissues" of Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2020-0005582 (hereinafter referred to as 'Document 2'), the surface of the mounting part is a convex part for maintaining cells or tissues and Disclosed is a jig for cryopreservation of cells or tissues having a recess for storing a preservative solution.
문헌 2의 발명을 이용할 경우, 볼록부와 오목부에 의해 세포 또는 조직 주변에 남아있는 보존액을 제거하는데 용이한 장점이 있으나, 오목부와 볼록부의 형상에 의해 세포가 손상될 수 있는 단점이 있다.When the invention of Document 2 is used, there is an advantage in that it is easy to remove the preservative solution remaining around cells or tissues by the convex portions and concave portions, but there is a disadvantage that cells may be damaged due to the concave portions and the shapes of the convex portions.
다른 배경기술을 살펴보면, 일본 공개특허공보 특개 2020-103224호(이하 ‘문헌 3’)의 “동결보존용 지그”에서, 광투과성 지지체 상에 접착층과 접착층에 저장액 흡수층이 적층된 보존액 흡수체를 갖는 동결보존용 지그에 대해 개시하고 있다.Looking at the other background art, in the "jig for cryopreservation" of Japanese Patent Application Laid-Open No. 2020-103224 (hereinafter referred to as 'Document 3'), an adhesive layer on a light-transmitting support and a storage solution absorber in which a storage solution absorbing layer is laminated on an adhesive layer having a preservative absorber Disclosed is a jig for cryopreservation.
문헌 3의 발명을 이용할 경우, 세포 또는 조직의 동결작업 시 보존액의 국소적인 포화를 방지하고 불필요한 보존액을 신속하게 제거할 수 있는 장점이 있으나, 지지체 상측에 흡수층이 형성되어 해동 시 얼음결정 형성으로 인해 세포의 손상을 유발할 수 있는 단점이 있다.When the invention of
다른 배경기술을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-1988140호(이하 ‘문헌 4’)의 “세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그”에서, 지지체 상에 접착층과 유리화액 흡수층이 형성된 유리화액 흡수체를 갖고, 유리화액 흡수층의 세포 또는 조직을 올려놓는 부분과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그에 대해 개시하고 있다.Looking at the other background art, in the "jig for cryopreservation of cells or tissues for vitrification of cells or tissues" of Korean Patent Publication No. 10-1988140 (hereinafter referred to as 'Document 4'), a vitrification solution absorber having an adhesive layer and a vitrification solution absorption layer formed on a support was prepared. It discloses a jig for vitrification cryopreservation of cells or tissues, characterized in that it has a portion in which an adhesive layer does not exist between the support and the portion on which the cells or tissues of the vitrification solution absorption layer are placed.
문헌 4의 발명을 이용할 경우, 여분의 유리화액을 유리화액 흡수체가 흡수시킴으로써, 여분의 유리화액을 제거시키기 위한 별도의 공정이 수행되지 않아 간편한 장점이 있지만, 유리화액 흡수층과 지지체 상측에 형성된 접착층 등이 좁은 용기 내에 위치되어 구조적으로 복잡하고 제작비용 상승에 원인이 되는 단점이 있다.In the case of using the invention of Document 4, the vitrification absorber absorbs the excess vitrification liquid, so a separate process for removing the excess vitrification liquid is not performed, which has a simple advantage. It is located in this narrow container and has a disadvantage in that it is structurally complicated and causes an increase in manufacturing cost.
<배경기술문헌><Background art literature>
대한민국 등록특허공보 제10-1962052호Republic of Korea Patent Publication No. 10-1962052
대한민국 공개특허공보 제10-2020-0005582호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2020-0005582
일본 공개특허공보 특개 2020-103224호Japanese Patent Laid-Open No. 2020-103224
대한민국 등록특허공보 제10-1988140호Republic of Korea Patent Publication No. 10-1988140
본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 종래에 세포 냉동보존을 위해 적용되는 크라이오 탑(cryo-top), 크라이오 루프(cryo-loop), 크라이오파이펫(cryo-pipet), 크라이오팁(cryo-tip), 이엠그리드(EM-grid) 등과 같은 유리화 운반체(vitrification carrier) 또는 유리화 용기(vitrification container)는 시중에서 고가로 제공되어 난임 시술비용과 동물 연구의 비용을 증가시킬 뿐만 아니라, 세포 냉동 후 해동 시 검체 튜브 또는 스트로우 캡슐의 폭발로 인해 세포의 손실율이 높은 단점을 보완 할 수 있는 유리화 동결을 위한 보존 용기 및 이를 이용한 유리화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention is to solve the problems of the prior art, and a cryo-top, a cryo-loop, a cryo-pipet, which are conventionally applied for cryopreservation of cells, Vitrification carriers or vitrification containers, such as cryo-tips, EM-grid, etc., are provided in the market at a high price, which increases the cost of infertility procedures and animal studies, as well as increases the cost of animal studies. , An object of the present invention is to provide a storage container for vitrification freezing and a vitrification method using the same, which can compensate for the disadvantage of a high cell loss rate due to the explosion of a specimen tube or straw capsule when thawing cells after freezing.
더욱이, EM-grid는 금속으로 형성되어 전자현미경에서 시료를 현미경으로 관찰하기 위해 고정시키기 위한 용도로 개발된 것으로, 냉동보존에 적용될 경우, 세포의 유기 고분자와 금속 간의 친화성으로 인해 세포의 냉동 또는 해동 시 금속에 세포가 달라붙게 되어 해동 후 세포가 폐사하는 단점을 최소화시킬 수 있는 유리화 동결을 위한 보존 용기 및 이를 이용한 유리화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Moreover, EM-grid is formed of metal and developed for the purpose of fixing a sample in an electron microscope to observe it under a microscope. When applied to cryopreservation, the cell is frozen or An object of the present invention is to provide a storage container for vitrification freezing that can minimize the disadvantage that cells are attached to metal during thawing and the cells die after thawing, and a vitrification method using the same.
또한, 냉동된 세포의 폐사와 손실 가능성을 줄일 뿐만 아니라, 제1용기에 절곡 형성된 핸들링부에 별도의 표시가 적용되어 냉동된 세포 위치와 혼돈을 최소화하고, 세포의 이동 또는 보관 과정에서 유실될 가능성을 낮출 수 있는 유리화 동결을 위한 보존 용기 및 이를 이용한 유리화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, the possibility of death and loss of frozen cells is reduced, and a separate mark is applied to the bent handling part of the first container to minimize confusion with the location of frozen cells, and the possibility of cell loss in the process of movement or storage An object of the present invention is to provide a storage container for freezing and vitrification that can lower the temperature and a method for vitrification using the same.
나아가, 수용부, 제1흡수부 또는 제2흡수부를 선택적으로 더 포함시켜 보다 적은 양의 유리화 냉동액으로 세포를 냉동 보존하여 얼음결정을 최소화하고 생존율을 증진시킬 수 있는 유리화 동결을 위한 보존 용기 및 이를 이용한 유리화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Furthermore, a storage container for vitrification freezing that can minimize ice crystals and improve viability by cryopreserving cells with a smaller amount of vitrified freezing solution by optionally further including a receiving part, a first absorption part, or a second absorption part; and An object of the present invention is to provide a vitrification method using the same.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 상측에 세포(10)를 수용할 수 있도록 판 형태로 형성된 제1용기(100)를 포함하는 것을 특징으로 한다.In order to achieve the above object, the present invention is characterized in that it includes a
또한, 제1용기(100)는 집게를 포함하는 기구에 의해 파지되는 것을 특징으로 한다.In addition, the
더욱이, 세포(10)는 시험관아기 시술에 적용되는 정자, 난자 또는 배아를 포함하는 생식세포인 것을 특징으로 한다.Moreover, the
또한, 제1용기(100)는 합성수지로 형성된 것을 특징으로 한다,In addition, the
더욱이, 제1용기(100)는 PET(polyethyleneterephthalate), PCTFE(Poly-Chloro-Tri-Fluoro Ethylene), PTFE(Polytetrafluoroethylene) 또는 PFA(perfluoroalkoxy) 중 선택되는 어느 하나 이상으로 형성된 것을 특징으로 한다.Furthermore, the
또한, 제1용기(100)는 단부가 상측방향으로 절곡 형성된 핸들링부(110)를 포함하는 것을 특징으로 한다.In addition, the
더욱이, 제1용기(100) 단부에 이동 또는 사용의 편의성을 위해 세포(10)가 수용되는 부분의 마주보는 측에 제1표시부(111)가 형성된 것을 특징으로 한다.Furthermore, it is characterized in that the
또한, 제1용기(100)는 세포(10)와 인접한 위치에 길이 방향으로 연장 형성되며, 내측에 홈이 형성된 수용부(200)를 포함하는 것을 특징으로 한다.In addition, the
더욱이, 제1용기(100)의 세포(10)와 인접한 위치에 형성된 제1흡수부(300)를 포함하는 것을 특징으로 한다.Furthermore, it is characterized in that it includes a
또한, 제1용기(100)의 단부 하측에 외측방향으로 돌출 형성된 제2흡수부(400)를 포함하는 것을 특징으로 한다.In addition, it is characterized in that it includes a
본 발명은 종래에 세포 냉동보존을 위해 적용되는 EM grid와 같은 냉동보존을 위한 기구 또는 용기들은 금속으로 형성되어 전자현미경에서 시료를 현미경으로 관찰하기 위해 고정시키기 위한 용도로 개발된 것으로, 냉동보존에 적용될 경우, 세포의 유기 고분자와 금속 간의 친화성으로 인해 세포의 냉동 또는 해동 시 금속에 세포가 달라붙게 됨에 따라, 해동 후 세포가 폐사하는 단점을 최소화시키고 사용 용도에 맞지 않는 기구를 사용하지 않는 장점이 있다.The present invention is a device or containers for cryopreservation, such as an EM grid, which is conventionally applied for cryopreservation of cells, is formed of metal and is developed for the purpose of fixing a sample in an electron microscope to observe it under a microscope. When applied, due to the affinity between the organic polymer of the cell and the metal, the cell adheres to the metal when the cell is frozen or thawed. There is this.
또한, 제1용기에 절곡 형성된 핸들링부가 형성되어 세포를 냉동 또는 해동 시 손쉽게 바이알(vial)에 넣어 보관하고 이동 할 수 있도록 형성되어, 세포를 냉동하고 해동하는 작업 시 핸들링부와 세포를 부착(loading)하는 부위를 구분지어 표시함으로써 바이알에 넣고 보관 시 세포가 유실 될 가능성이 현저히 저하 될 뿐만 아니라, 이동 시 편리한 장점이 있다.In addition, a bent handling part is formed in the first container so that the cells can be stored and moved easily in a vial when freezing or thawing. ), the possibility of cell loss when placed in a vial and stored in a vial is markedly reduced, and has the advantage of being convenient when moving.
더욱이, 제1용기에 수용부, 제1흡수부 또는 제2흡수부가 선택적으로 더 포함되어 보존액인 유리화 냉동액의 양을 적게 적용시키면서 얼음결정으로 인한 세포의 얼음 결빙을 최소화하여 폐사 또는 손실을 저하시켜줌으로써, 세포의 생존율을 증진시킬 수 있는 장점이 있다.Moreover, the first container optionally further includes a receiving part, a first absorption part, or a second absorption part, so that the amount of vitrified freezing liquid, which is a preservative, is applied to a small amount, and ice freezing of cells due to ice crystals is minimized, thereby reducing mortality or loss. By doing so, there is an advantage in that the viability of cells can be improved.
나아가, 제1용기에 세포를 수용할 수 있는 부분이 종래에 적용되는 EM-grid 보다 크게 형성되어 사용자 또는 외부 자극에 따른 세포의 손실이 현저히 저하될 수 있는 장점이 있다.Furthermore, since the portion that can accommodate the cells in the first container is formed larger than the conventionally applied EM-grid, there is an advantage that the loss of cells due to the user or external stimuli can be significantly reduced.
도 1은 본 발명에 따른 냉동보존에 이용되는 유리화 용기의 사시도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 사시도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 단면도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 사시도이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 단면도이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 단면도이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 사시도이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 사시도이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 사시도이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 사시도이다.
도 11은 실험예 1의 결과 값이다.
도 12는 실험예 1의 결과 값이다.
도 13은 실험예 1의 결과 값이다.
도 14는 실험예 1의 결과 값이다.
도 15는 실험예 2의 결과 값이다.
도 16은 본 발명의 실시예에 따른 단면도이다.
도 17은 본 발명의 실시예에 따른 단면도이다.
<부호의 설명>
10: 세포, 20: 바닥면
100: 제1용기, 110: 핸들링부, 111: 제1표시부
200: 수용부, 210: 수용로
300: 제1흡수부
400: 제2흡수부1 is a perspective view of a vitrification container used for cryopreservation according to the present invention.
2 is a perspective view according to an embodiment of the present invention.
3 is a cross-sectional view according to an embodiment of the present invention.
4 is a perspective view according to an embodiment of the present invention.
5 is a cross-sectional view according to an embodiment of the present invention.
6 is a cross-sectional view according to an embodiment of the present invention.
7 is a perspective view according to an embodiment of the present invention.
8 is a perspective view according to an embodiment of the present invention.
9 is a perspective view according to an embodiment of the present invention.
10 is a perspective view according to an embodiment of the present invention.
11 is a result value of Experimental Example 1.
12 is a result value of Experimental Example 1.
13 is a result value of Experimental Example 1.
14 is a result value of Experimental Example 1.
15 is a result value of Experimental Example 2.
16 is a cross-sectional view according to an embodiment of the present invention.
17 is a cross-sectional view according to an embodiment of the present invention.
<Explanation of code>
10: cell, 20: bottom surface
100: first container, 110: handling unit, 111: first display unit
200: receiving unit, 210: receiving path
300: first absorption unit
400: second absorption unit
이하, 실시예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples.
본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예들을 통해 쉽게 이해될 것이다.Objects, features, and advantages of the present invention will be readily understood through the following examples.
본 발명은 여기에서 개시되는 실시예들에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수 있다. 여기에서 개시되는 실시예들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위하여 제공되는 것이고, 본 발명의 기술적 사상 및 기술적 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 또는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.The present invention is not limited to the embodiments disclosed herein, and may be embodied in other forms. The embodiments disclosed herein are provided so that the spirit of the present invention can be sufficiently conveyed to those of ordinary skill in the technical field to which the present invention belongs, and all transformations included in the technical spirit and scope of the present invention , should be understood to include equivalents or substitutes.
따라서 이하의 실시예들에 의하여 본 발명이 제한되어서는 안 되며, 본 발명의 기술적 사상 및 기술적 범위에 포함되는 모든 변환이 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 즉, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 사람이라면 청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 또는 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.Therefore, the present invention should not be limited by the following embodiments, and it should be understood that all transformations included in the technical spirit and scope of the present invention are included. That is, a person of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can variously modify or modify the present invention by adding, changing, deleting or adding components within the scope that does not depart from the spirit of the present invention described in the claims. It will be possible to change, it will also be said to be included within the scope of the present invention.
본 발명은 다양한 변환이 가해질 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세하게 설명한다. 도면들에서 요소의 크기 또는 요소들 사이의 상대적인 크기는 본 발명에 대한 명확한 이해를 위해서 다소 과장되게 도시될 수 있다. 또한, 도면들에 도시된 요소의 형상이 제조 공정상의 변이 등에 의해서 다소 변경될 수 있다.Since the present invention is capable of various modifications and various embodiments, specific embodiments are illustrated in the drawings and described in detail. In the drawings, the size of the elements or the relative sizes between the elements may be exaggerated for a clear understanding of the present invention. In addition, the shape of the elements shown in the drawings may be slightly changed due to variations in the manufacturing process or the like.
따라서 본 명세서에서 개시된 실시예들은 특별한 언급이 없는 한 도면에 도시된 형상으로 한정되어서는 안 되며, 어느 정도의 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.Therefore, the embodiments disclosed herein should not be limited to the shapes shown in the drawings unless otherwise noted, and should be understood to include some degree of deformation.
한편, 본 발명의 여러 가지 실시예들은 명확한 반대의 지적이 없는 한 그 외의 어떤 다른 실시예들과 결합될 수 있다. 특히 바람직하거나 유리하다고 지시하는 어떤 특징도 바람직하거나 유리하다고 지시한 그 외의 어떤 특징 및 특징들과 결합될 수 있다. 즉, 본 발명의 다양한 양상들, 특징들, 실시예들 또는 구현예들은 단독으로 또는 다양한 조합들로 사용될 수 있다.On the other hand, various embodiments of the present invention may be combined with any other embodiments unless clearly indicated to the contrary. Any feature indicated as particularly preferred or advantageous may be combined with any other feature and features indicated as preferred or advantageous. That is, the various aspects, features, embodiments or implementations of the present invention may be used alone or in various combinations.
본 명세서에 사용된 용어는 특정의 실시예를 기술하기 위한 것일 뿐 청구범위에 의해서 한정하려는 것은 아님을 이해하여야 하고, 본 명세서에 사용되는 모든 기술용어 및 과학용어는 다른 언급이 없는 한 통상의 기술을 가진 사람에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.It should be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing specific embodiments and is not intended to be limited by the claims, and all technical and scientific terms used in this specification are those of ordinary skill unless otherwise noted. has the same meaning as is commonly understood by a person with The singular expression includes the plural expression unless the context clearly dictates otherwise.
본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.In describing the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known technology may obscure the gist of the present invention, the detailed description thereof will be omitted.
<실시예 1><Example 1>
본 발명에 따른 냉동보존에 이용되는 유리화 용기(이하, 설명의 편의를 위해 ‘용기’라 함)는 도 1에 도시된 바와 같이, 세포(10) 및 제1용기(100)를 포함하여 형성될 수 있다.The vitrification container (hereinafter, referred to as 'container' for convenience of explanation) used for cryopreservation according to the present invention is to be formed including the
더욱 자세히 설명하면, 본 발명에 따른 용기는 상측에 세포(10)를 수용할 수 있도록 판 형태로 형성된 제1용기(100)를 포함하여 형성될 수 있다.More specifically, the container according to the present invention may be formed including the
이때, 세포(10)는 보존액 내에 보존되고 있는 세포(10)로서, 시험관아기 시술에 적용되는 정자, 난자, 배아 또는 착상되기 전 상태의 배아인 배반포 등과 같은 생식세포가 적용될 수 있다.In this case, the
바람직하게 세포(10)는 정자, 난자 또는 배아 등과 같은 생식세포가 적용될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.Preferably, the
이와 같이, 세포(10)가 보존액에 보존되어 제1용기(100)에 이동 시 세포가 손상되거나 유실되지 않도록 형성될 수 있다.In this way, the
다음으로, 제1용기(100)는 상측에 세포(10)를 수용할 수 있도록 판 형태로 형성될 수 있다.Next, the
이때, 도 1에 도시된 바와 같이, 제1용기(100)의 일측 단부 상측에 세포(10)가 안정적으로 위치(loading)됨으로써, 세포(10)가 안정적으로 위치될 뿐만 아니라, 세포(10)가 제1용기(100)에 달라붙지 않는 장점이 있다.At this time, as shown in FIG. 1 , by stably loading the
이를 위해, 제1용기(100)는 세포(10)를 안정적으로 지지하기 위해 합성수지로 형성될 수 있으며, 바람직하게는 PET(polyethyleneterephthalate), PCTFE(Poly-Chloro-Tri-Fluoro Ethylene), PTFE(Polytetrafluoroethylene) 또는 PFA(perfluoroalkoxy) 중 선택되는 어느 하나 이상으로 형성될 수 있다.To this end, the
가장 바람직하게, 강성, 전기적 성질, 내유성, 내약품성, 항장력, 내열성, 투명성이 뛰어나다고 알려져 있는 PET 또는 PCTFE 중 선택되는 어느 하나 이상의 소재로 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.Most preferably, it may be formed of at least one material selected from PET or PCTFE, which is known to have excellent rigidity, electrical properties, oil resistance, chemical resistance, tensile strength, heat resistance, and transparency, but is not limited thereto.
선택적으로, 세포(10)의 시인성을 높이기 위해, 제1용기(100)는 투명한 재질로 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.Optionally, in order to increase the visibility of the
더욱이, 제1용기(100)는 판상으로 형성되어 상측에 위치되는 세포(10)를 안정적으로 지지할 수 있도록 형성될 수 있다.Moreover, the
이를 위해, 제1용기(100)의 길이는 50mm이하로 형성될 수 있으나, 바람직하게 20~30mm로 형성되어 작업자가 제1용기(100)를 용이하게 이동시킬 수 있을 뿐만 아니라, 세포(10)를 수용할 수 있는 충분한 길이를 제공할 수 있는 장점이 있다.To this end, the length of the
더욱 바람직하게는 25mm으로 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.More preferably, it may be formed to be 25 mm, but is not limited thereto.
나아가, 제1용기(100)의 폭은 0.5~5mm의 폭으로 형성될 수 있으며, 바람직하게는 1~3mm의 폭으로 형성될 수 있고, 가장 바람직하게는 2mm로 형성될 수 있다.Furthermore, the width of the
만약, 제1용기(100)의 폭이 0.5mm이하로 형성될 경우, 제1용기(100)의 폭에 의해 세포(10) 뿐만 아니라, 보존액이 제1용기(100) 외측으로 이탈되어 세포(10)에 손상이 가해질 가능성이 높은 단점이 있고, 5mm 이상으로 형성될 경우, 넓은 폭에 의해 제조단가가 높아지는 단점이 있다.If the width of the
또한, 제1용기(100)는 집게를 포함하는 기구에 의해 파지되도록 형성될 수 있다.In addition, the
더욱 자세히 설명하면, 제1용기(100)를 파지하기 위한 기구에 의해 제1용기(100)에서 세포(10)의 위치와 마주보는 측의 단부가 파지되어 사용자가 원하는 위치에 이동될 수 있는 것이다.In more detail, the end of the side opposite to the position of the
이를 위해, 제1용기(100)를 파지하기 위한 기구는 집게가 적용될 수 있으며, 바람직하게는 핀셋이 적용될 수 있고, 가장 바람직하게는 의료용 포셉(forcep)이 적용될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.To this end, as the mechanism for holding the
<실험예 1><Experimental Example 1>
1) 생쥐 배아 배양1) Mouse embryo culture
1-1) 6주령의 B6D2 F1 생쥐에 PMSG(pregnant mare serum gonadotropin) 7.5IU을 주사하고, 48시간 후에 hCG 7.5IU을 주사하여 과배란을 유도 하였다.1-1) 7.5 IU of PMSG (pregnant mare serum gonadotropin) was injected into 6-week-old B6D2 F1 mice, and after 48 hours, 7.5 IU of hCG was injected to induce superovulation.
1-2) 체내 수정을 유도하기 위하여 동일 계통의 수컷 생쥐와 교미 시켰다.1-2) In order to induce in vivo fertilization, male mice of the same strain were mated.
1-3) hCG 주사 20시간 후에 암컷 생쥐의 plug을 검사하여 교미 여부를 확인하고 생쥐의 경추를 탈골하여 도살하였다.1-3) After 20 hours of hCG injection, the female mice's plugs were inspected to determine whether mating occurred, and the cervical vertebrae of the mice were dislocated and slaughtered.
1-4) 도살한 생쥐로 부터 난소만을 떼어 낸 다음, MTF(mouse tubal fluid)배양액이 들어있는 접시로 옮겼다.1-4) Only the ovaries were removed from the slaughtered mice, and then transferred to a dish containing MTF (mouse tubal fluid) culture solution.
1-5) 해부 현미경 하에서 37℃ 로 유지된 MTF 배양액이 담긴 주사기를 난관 한쪽 끝에 넣어서, 조심스럽게 배양액을 난관에 넣어주면서 배아가 반대편 끝으로 나오도록 유도하였다.1-5) Under a dissecting microscope, a syringe containing the MTF culture medium maintained at 37° C. was placed at one end of the fallopian tube, and the embryo was induced to emerge from the other end while carefully inserting the culture solution into the fallopian tube.
1-6) 난구세포괴를 Hyaluronidase를 포함한 배양액에 넣고 난구 세포를 제거하였다.1-6) The cumulus cell mass was placed in a culture medium containing hyaluronidase and the cumulus cells were removed.
1-7) 생쥐 배아를 회수하여 2차례 신선한 배양액으로 세척한 후에 배양기에서 배양하였다.1-7) The mouse embryos were recovered, washed twice with fresh culture medium, and then cultured in an incubator.
1-8) 체외에서 48시간 배양하여 얻은 6~8세포기의 배아를 3종류의 냉동 보관 용기(EM grid, cryotop, TPS)에 나누어 각각 100여 개 가량의 배아를 유리화 동결하였다.1-8) Approximately 100 embryos each were vitrified and frozen by dividing 6-8 cell stage embryos obtained by in vitro culture for 48 hours into 3 types of cryopreservation containers (EM grid, cryotop, TPS).
이때, TPS는 본 발명에 따른 유리화 동결을 위한 보존 용기가 적용되었다.At this time, the storage container for vitrification freezing according to the present invention was applied to the TPS.
1-9) 체외에서 96시간 배양하여 얻은 배반포 배아를 3종류의 냉동 보관 용기(EM grid, Cryotop, TPS)에 나누어 각각 100여 개 가량의 배아를 유리화 동결하였다.1-9) The blastocyst embryos obtained by culturing in vitro for 96 hours were divided into 3 types of cryopreservation containers (EM grid, Cryotop, TPS), and about 100 embryos each were vitrified and frozen.
1-10) 120시간 이상 배양한 탈각 중 이거나 탈각한 배반포 배아를 2종류의 냉동 보관 용기(EM grid, TPS)에 나누어 각각 80여 개 가량을 유리화 동결하였다.1-10) Shelling or shelling blastocyst embryos cultured for more than 120 hours were divided into two types of cryopreservation containers (EM grid, TPS), and about 80 each were vitrified and frozen.
2) 생쥐배아 냉동2) Freezing mouse embryos
2-1) 7.5% ethylene glycol, 7.5% DMSO(Dimethyl sulfoxide), 20% SSS(serum substitute supplement) in D-PBS로 형성된 유리화용액 1(Vitrification solution 1)을 제조하였다.2-1) Vitrification solution 1 formed of 7.5% ethylene glycol, 7.5% DMSO (dimethyl sulfoxide), and 20% SSS (serum substitute supplement) in D-PBS was prepared.
2-2) 15% ethylene glycol, 15% DMSO(Dimethyl sulfoxide), 10μg/ml의 Ficoll, 0.65M의 sucrose, 20% SSS(serum substitute supplement) in D-PBS로 형성된 유리화용액 2(Vitrification solution 2)를 제조하였다.2-2) Vitrification solution 2 formed with 15% ethylene glycol, 15% DMSO (Dimethyl sulfoxide), 10μg/ml Ficoll, 0.65M sucrose, 20% SSS (serum substitute supplement) in D-PBS was prepared.
2-3) 배아를 유리화용액 1에 2분간 정치시킨 다음, 유리화용액 2에 45초간 정치시킨 후, 유리화 용액 2에 노출된 배아는 EM grid, cryotop, TPS에 빠르게 옮겼다.2-3) After allowing the embryo to stand in vitrification solution 1 for 2 minutes and then in vitrification solution 2 for 45 seconds, the embryos exposed to vitrification solution 2 were quickly transferred to an EM grid, cryotop, and TPS.
3) 생쥐배아 해동3) Thaw mouse embryos
3-1) 0.25M sucrose, 20% SSS in D-PBS로 형성된 해동 용액 1(warming solution 1)을 제조하였다.3-1) A thawing solution 1 (warming solution 1) formed of 0.25M sucrose and 20% SSS in D-PBS was prepared.
3-2) 0.125M sucrose, 20% SSS in D-PBS로 형성된 해동용액 2(warming solution 2)를 제조하였다.3-2) A thawing solution 2 (warming solution 2) formed of 0.125M sucrose and 20% SSS in D-PBS was prepared.
3-3) EM grid, Cryotop, TPS를 해동 용액 1에 2분간 정치시킨다.3-3) Place the EM grid, Cryotop, and TPS in thawing solution 1 for 2 minutes.
3-4) 해동 용액 2에 3분간 정치시켰다.3-4) It was allowed to stand in thawing solution 2 for 3 minutes.
3-5) 3회 세척한 후 배양하였다.3-5) After washing 3 times, cultured.
4) 생쥐배아 냉동 및 해동 후 세포 사멸 검사4) Cell death test after freezing and thawing of mouse embryos
4-1) 생쥐배아를 4% paraformaldehyde에 30분간 실온에 정치시켰다.4-1) Mouse embryos were placed in 4% paraformaldehyde at room temperature for 30 minutes.
4-2) 0.3% polyvinylalcohol에 3차례 세척하였다.4-2) Washed 3 times with 0.3% polyvinylalcohol.
4-3) 4℃에서 10분간 0.1% Triton X-100을 투과시킨 후 0.3% polyvinylalcohol로 3차례 세척하였다.4-3) After permeating 0.1% Triton X-100 at 4°C for 10 minutes, it was washed three times with 0.3% polyvinylalcohol.
4-4) 암소(暗所)에서 1시간 동안 37℃에서 TUNEL 반응액으로 배양하였다.4-4) Incubated with TUNEL reaction solution at 37°C for 1 hour in a dark place.
4-5) 슬라이드에 4,6-diamidino-2-phenyldole로 고정하였다.4-5) The slide was fixed with 4,6-diamidino-2-phenyldole.
4-6) 슬라이드 커버를 씌우고 형광현미경으로 관찰하였으며, 전체 세포 수는 파란색으로 나타나고 사멸한 세포는 녹색으로 관찰되었다.4-6) A slide cover was put on and observed with a fluorescence microscope. The total number of cells was observed in blue, and dead cells were observed in green.
도 11에 도시된 바와 같이, EM grid, Cryotop, TPS를 이용하여 분열기 배아를 냉동 후 해동하였을 때 배아의 생존율(Survived embryos), 배반포 발생률(produced blastocysts) 및 세포 사멸률(Apoptotic cells)을 살펴보았을 때 세 그룹간의 차이는 유의한 차이는 관찰되지 않았다.As shown in FIG. 11, when metaphase embryos were frozen and then thawed using EM grid, cryotop, and TPS, survival rates of embryos (Survived embryos), blastocysts (produced blastocysts), and apoptotic cells (Apoptotic cells) were examined. No significant difference was observed between the three groups.
이때, 도 11에 도시된 값은 숫자(%) 또는 평균±SD로 표시되었으며, 열 내에서 다른 위첨자가 있는 값은 ρ>0.05에서 유의미한 차이는 없는 것으로 판단되었다.At this time, the values shown in FIG. 11 were expressed as numbers (%) or mean±SD, and it was determined that there was no significant difference between values with other superscripts in the column at ρ>0.05.
더욱이, Survived embryos, produced blastocysts and hatching-stage blastocysts는 각각 카이제곱테스트(chi-square test)에 의한 값이고, No. of total cells, No. of apoptotic cells는 분산분석(Tukey’s test)에 의한 값이다.Moreover, Survived embryos, produced blastocysts and hatching-stage blastocysts are values by chi-square test, respectively, and No. of total cells, No. of apoptotic cells is a value by analysis of variance (Tukey's test).
또한, produced blastocysts는 가온 후 배아를 48시간 동안 시험관 내에서 배양하고, 배반포 단계에 도달하는 속도를 평가하였다.In addition, the produced blastocysts were cultured in vitro for 48 hours after warming, and the rate at which they reached the blastocyst stage was evaluated.
더욱이, hatching-stage blastocysts는 가온 후 배아를 72시간 동안 시험관 내에서 배양하고 배아의 부화율을 평가하였다.Moreover, hatching-stage blastocysts were cultured in vitro for 72 hours after warming and the hatchability of embryos was evaluated.
또한, 도 12에 도시된 바와 같이, 부화 중인 생쥐 배반포를 사용하여 냉동 후 해동하였을 때 TPS 와 EM grid 간에 재확장율(Re-expanded blastocysts)과 부화율(Hatched blastocysts)은 크게 차이가 나타나지 않았다.In addition, as shown in FIG. 12, when thawed after freezing using hatching mouse blastocysts, there was no significant difference in re-expanded blastocysts and hatched blastocysts between TPS and EM grids.
그러나 배아의 생존율은 TPS을 사용했을 때 EM grid 보다 배아의 생존율(Survived embryos)이 유의하게 높게 관찰되었다(ρ<0.05).However, when using TPS, the survival rate of embryos (survived embryos) was significantly higher than that of the EM grid (ρ<0.05).
이때, 도 12에 도시된 값은 숫자(%)로 표시되었으며, Re-expanded blastocysts는 가온 후 배아를 체외에서 3시간 동안 배양하고 배아의 재 팽창률을 평가한 것이고, Hatched blastocysts는 가온 후 배아를 24시간 동안 시험관 내에서 배양하고 부화 단계에 도달하는 속도를 평가한 것이다.At this time, the value shown in FIG. 12 is expressed as a number (%), the re-expanded blastocysts are the evaluation of the re-expanding rate of embryos after culturing the embryos in vitro for 3 hours after warming, and the hatched blastocysts are 24 embryos after warming. The rate of incubation in vitro over time and reaching the hatching stage was evaluated.
더욱이, 도 13에 도시된 바와 같이, 완전히 부화된 배반포를 냉동 후 해동하였을 때 TPS와 EM grid 간의 생존율(Surviving embryos) 차이는 관찰되지 않았으나, 재확장율(Re-expanded blastocysts)은 TPS를 사용한 경우에 EM grid를 사용한 경우보다 유의하게 높게 관찰되었다(ρ<0.05).Moreover, as shown in FIG. 13, when the fully hatched blastocysts were frozen and then thawed, no difference in survival rates between TPS and EM grids was observed, but the re-expanded blastocysts were the same when using TPS. It was observed to be significantly higher than the case where the EM grid was used (ρ<0.05).
이때, 도 13에 도시된 값은 숫자(%)로 표시되었으며, Re-expanded blastocysts는 가온 후 배아를 3시간 동안 in vitro 배양하여 배아의 재 팽창률을 평가한 것이다.At this time, the value shown in FIG. 13 is expressed as a number (%), and the re-expanded blastocysts were evaluated for re-expanding rate of embryos by culturing the embryos in vitro for 3 hours after warming.
다음으로, 도 14에 도시된 바와 같이, 생쥐 배반포 배아를 냉동 후 해동하였을 때 EM grid, Cryotop, TPS간에 생존율(surviving embryos)을 살펴보았을 때 Cryotop 과 TPS의 생존율이 EM grid를 사용한 경우보다 유의하게 높게 나타났다.Next, as shown in FIG. 14 , when thawing mouse blastocyst embryos after freezing, the survival rate of cryotop and TPS was significantly higher than that of using EM grid when examining the survival rates between EM grid, Cryotop, and TPS. appeared high.
이때, 생존한 생쥐 배반포의 재확장율(re-expanded blastocysts)의 차이는 세 그룹 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.At this time, the difference in the re-expanded blastocysts of the surviving mouse blastocysts was not significantly different between the three groups.
그러나 재확장 후 부화 단계까지 도달한 배아의 수(hatching-stage blastocysts), 배반포 세포수(Total No. of cells), 사멸된 세포수(No. of apoptotic cells) 간의 차이는 EM grid를 사용하였을 때 유의하게 낮은 것을 관찰 할 수 있었다(ρ<0.05).However, the difference between the number of hatching-stage blastocysts, Total No. of cells, and No. of apoptotic cells that reached the hatching stage after re-expansion was observed using the EM grid. A significantly lower value could be observed (ρ<0.05).
그러므로 TPS는 기존에 사용되고 있는 EM grid 보다 냉동 및 해동 과정에서 보다 높은 배아의 생존율을 보이고 해동 후 배아가 사멸하지 않고 지속적으로 발생하는 경향도 높으며 해동 후 사멸되는 세포 수도 적은 것을 알 수 있었다.Therefore, it was found that TPS showed a higher survival rate of embryos during freezing and thawing than the previously used EM grid, and the tendency for embryos to continue to develop after thawing was high, and the number of cells killed after thawing was also low.
즉, TPS가 냉동 운반체로써 기존에 사용되고 있는 EM grid 보다 월등하게 양호한 결과를 보이고, 해외에서 수입해 사용하고 있는 Cryotop 과는 대등한 결과를 보인다는 점에서 새로운 냉동 운반체로써의 가치를 충분히 지니고 있다는 것을 유추할 수 있었다.In other words, TPS shows a much better result than the EM grid that is used as a refrigeration carrier, and it has enough value as a new refrigeration carrier in that it shows the same results as Cryotop imported and used overseas. could infer.
이때, 도 14에 도시된 값은 숫자(%) 또는 평균±SD로 표시되었으며, Survived embryos, produced blastocysts and hatching-stage blastocysts는 각각 카이제곱테스트(chi-square test)에 의한 값이고, No. of total cells, No. of apoptotic cells는 분산분석(Tukey’s test)에 의한 값이다.At this time, the values shown in FIG. 14 are expressed as numbers (%) or mean±SD, and Survived embryos, produced blastocysts and hatching-stage blastocysts are values by chi-square test, respectively, and No. of total cells, No. of apoptotic cells is a value by analysis of variance (Tukey's test).
더욱이, No. (%) of re-expanded blastocysts는 가온 후 배아를 체외에서 3시간 동안 배양하고 배아의 재 팽창률을 평가한 것이고, No. (%) of hatching-stage blastocysts는 가온 후 배아를 체외에서 24시간 동안 배양하고 배아의 부화율을 평한 것이다.Moreover, No. (%) of re-expanded blastocysts after warming embryos were cultured in vitro for 3 hours and the rate of re-expanded embryos was evaluated. (%) of hatching-stage blastocysts is an evaluation of the hatching rate of embryos after warming and culturing them in vitro for 24 hours.
<실험예 2><Experimental Example 2>
1) 인간 분열기 혹은 포배기 배아 동결 및 해동1) Freezing and thawing human metaphase or blastocyst embryos
1-1) vitrification basic media는 PBS, 20% SSS로 형성되며, vitrification solution 1은 20% Ethylene glycol, vitrification basic media로 형성되고, vitrification solution 2는 40% Ethylene glycol, 18% Ficoll, 0.3M sucrose, vitrification basic media로 형성된 냉동용 배양액을 준비하였다.1-1) vitrification basic media is formed of PBS, 20% SSS, vitrification solution 1 is formed of 20% ethylene glycol, vitrification basic media, vitrification solution 2 is formed of 40% ethylene glycol, 18% Ficoll, 0.3M sucrose, A culture medium for freezing formed of vitrification basic media was prepared.
1-2) Thawing solution 1은 vitrification basic media로 형성되고, Thawing solution 2는 0.5M sucrose, vitrification basic media로 형성된 해동용 배양액을 준비하였다.1-2) Thawing solution 1 was prepared with vitrification basic media, and thawing solution 2 was prepared with 0.5M sucrose and vitrification basic media for thawing.
2) 인간 분열기 혹은 포배기 배아 유리화 동결 과정2) Human metaphase or blastocyst embryo vitrification freezing process
2-1) 동결하고자 하는 배아를 배양기에서 내어 현미경하에서 관찰하여 냉동배아 개수와 배아의 질, 동결 횟수 등을 판단하고 기록하였다.2-1) The embryos to be frozen were taken out of the incubator and observed under a microscope to determine and record the number of frozen embryos, embryo quality, and number of freezing.
2-2) 동결할 배반포를 배양기에서 내어 29-G insulin syringe를 이용하여 shrink시켰으며, 분열기 배아는 이 과정을 생략하였다.2-2) The blastocysts to be frozen were removed from the incubator and shrunk using a 29-G insulin syringe, and this process was omitted for metaphase embryos.
2-3) Shrink가 완벽히 되었는지를 확인 후 냉동할 배아가 들어있는 배양접시를 배아 냉동실로 이동시켰다.2-3) After checking whether the shrink is complete, the culture dish containing the embryo to be frozen was moved to the embryo freezer.
2-4) 배아를 vitrification basic media로 옮기고 30초 동안 실온에 정치시켰다.2-4) The embryos were transferred to vitrification basic media and left at room temperature for 30 seconds.
2-5) Vitrification solution 1에 배아를 옮기고 50초 동안 실온에서 정치시켰다.2-5) Transfer the embryo to Vitrification solution 1 and let it stand at room temperature for 50 seconds.
2-6) EM-grid 혹은 TPS를 준비하고 cane, cryovial을 액체 질소에 담가 준비하였다.2-6) Prepare EM-grid or TPS and immerse cane and cryovial in liquid nitrogen.
2-7) 배아를 vitrification solution 2로 옮긴 후 20초 동안 실온에 정치시켰다.2-7) After transferring the embryo to vitrification solution 2, it was allowed to stand at room temperature for 20 seconds.
2-8) Vitrification solution 2 처리가 완료되면 배아를 현미경 하에서 TPS 혹은 EM grid에 올렸다.2-8) After the treatment with Vitrification solution 2 was completed, the embryos were placed on a TPS or EM grid under a microscope.
2-9) TPS 혹은 EM grid를 액체질소에 미리 냉각된 cryovial에 넣고 동결보존 tank(LN2 tank)에 넣어 보관하였다.2-9) The TPS or EM grid was placed in a cryovial pre-cooled in liquid nitrogen and stored in a cryopreservation tank (LN2 tank).
3) 인간 분열기 혹은 포배기 배아 해동3) Thaw human metaphase or blastocyst embryos
3-1) 해동용 dish에 해동 배양액을 각 0.5ml씩 넣어 준비하였다.3-1) Each 0.5ml of the thawing culture solution was put into a thawing dish.
3-2) 해동할 배아가 보관된 액체질소 통에서 cane, cryovial을 꺼내어 이동용 질소탱크에 넣어두었다.3-2) The cane and cryovial were taken out from the liquid nitrogen container in which the embryos to be thawed were stored and placed in a nitrogen tank for transport.
3-3) Cryovial 내 TPS 혹은 EM grid를 건져 내어 thawing solution 2에 담근 후 5분 동안 실온에 정치시켰다.3-3) Take out the TPS or EM grid from the cryovial, immerse it in thawing solution 2, and let it stand at room temperature for 5 minutes.
3-4) 배아를 thawing solution 1로 옮긴 후 5분 동안 실온에 정치시켰다.3-4) The embryos were transferred to thawing solution 1 and left at room temperature for 5 minutes.
3-5) 해동과정이 끝난 배아를 배양접시로 옮겨 여러 번 세척 후 배양용 dish에 옮겨 배양하였다.3-5) After thawing, the embryos were transferred to a culture dish, washed several times, and then transferred to a culture dish for incubation.
3-6) 해동한 배아의 생존 가능성 여부 및 배아의 질을 관찰하였다.3-6) Viability of thawed embryos and embryo quality were observed.
이때, 배아의 배양은 배아의 배양은 CO2:O2:N2의 비가 6:5:89의 환경 하에서 수행될 수 있다.In this case, the culturing of the embryos, the culturing of the embryos, CO 2 :O 2 :N 2 A ratio of 6:5:89 may be performed in an environment.
또한, 분열기 배아는 채취 후 3일째에 냉동을 실시하였고 8세포기를 기준으로 할구 분열이 빠르거나 느린 정도 그리고 할구의 균일 정도에 따라 배아의 질을 평가하였다.In addition, the metaphase embryos were frozen on the 3rd day after collection, and the quality of the embryos was evaluated according to the degree of fast or slow blastocyst division and the uniformity of the blastomeres based on the 8-cell stage.
더욱이, 배반포는 팽창 정도, 내세포괴의 질, 영양 상피세포 외관의 품질에 따라 A, B, C 등급으로 배반포를 등급화 시켰다.Furthermore, blastocysts were graded into A, B, and C grades according to the degree of expansion, the quality of the inner cell mass, and the quality of the vegetative epithelial cell appearance.
정상적인 배란환자를 기준으로, 월경 2주 후 10mg의 에스트로겐을 투여하고, 자궁내막 두께가 8mm 이상일 때 프로게스테론을 투여한 다음, 배아 이식을 수행하였다.Based on normal ovulation patients, 10 mg of estrogen was administered 2 weeks after menstruation, and progesterone was administered when the endometrium was 8 mm or more thick, and then embryo transplantation was performed.
배아 이식 14일 후에 혈청 hCG농도를 측정하여 임신여부를 확인하였다.Pregnancy was confirmed by measuring serum hCG concentration 14 days after embryo transfer.
도 15에 도시된 바와 같이, 분열기 배아와 배반포를 각각 TPS 와 EM grid를 이용하여 냉동 및 해동을 수행했을 때 배아의 생존율과 이식 배아의 평균수는 크게 차이나지 않았다.As shown in FIG. 15 , when freezing and thawing of metaphase embryos and blastocysts were performed using TPS and EM grids, respectively, the survival rate of embryos and the average number of transplanted embryos did not differ significantly.
그러나 TPS 와 EM grid를 이용하여 냉동 및 해동을 수행했을 때 임상 임신율은 분열기 배아와 배반포에서 TPS를 사용했을 때 EM grid를 사용했을 때 보다 높게 나타났다.However, when freezing and thawing were performed using TPS and EM grid, the clinical pregnancy rate was higher when using TPS in metaphase embryos and blastocysts than when using EM grid.
이와 같이, 본 발명은 종래에 세포 냉동보존을 위해 적용되는 EM grid와 같은 냉동보존을 위한 기구 또는 용기들은 금속으로 형성되어 세포(10)의 냉동 또는 해동 시 금속에 세포(10)가 달라붙게 됨에 따라, 해동 후 세포(10)가 폐사하는 단점을 최소화시키고 사용 용도에 맞지 않는 기구를 사용하지 않는 장점이 있다.As such, in the present invention, devices or containers for cryopreservation, such as an EM grid, which are conventionally applied for cryopreservation of cells, are formed of metal, so that the
나아가, 제1용기(100)에 세포(10)를 수용할 수 있는 부분이 종래에 적용되는 EM-grid 보다 크게 형성되어 사용자 또는 외부 자극에 따른 세포의 손실이 현저히 저하될 수 있는 장점이 있다.Furthermore, since the portion that can accommodate the
<실시예 2><Example 2>
도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이, 제1용기(100)는 단부가 상측방향으로 절곡 형성된 핸들링부(110)가 더 포함될 수 있다.2 and 3 , the
바람직하게, 핸들링부(110)는 세포(10)가 수용되는 위치와 마주보는 측의 단부에 상측방향으로 절곡 형성될 수 있다.Preferably, the
핸들링부(110)가 형성됨으로써, 작업자는 세포(10)가 수용될 수 있는 위치를 용이하게 파악할 수 있다.Since the
나아가, 핸들링부(110)가 바닥면(20)을 기준으로 상측방향으로 절곡 형성됨으로써, 제1용기(100)를 파지하기 위한 집게에 의해 제1용기(100)가 오염되지 않고 청결을 유지함과 동시에, 파지가 용이한 장점이 있다.Furthermore, since the
이를 위해, 핸들링부(110)는 바닥면(20)을 기준으로 θ만큼 절곡 형성될 수 있다.To this end, the
이때, θ는 바닥면(20)을 기준으로 1~90° 각도로 형성될 수 있으며, 바람직하게는 10~45° 각도로 형성될 수 있다.At this time, θ may be formed at an angle of 1 to 90° with respect to the
만약, θ가 바닥면(20)을 기준으로 1° 이하로 형성될 경우, 낮은 각도에 의해 집게로 핸들링부(110)를 용이하게 파지하지 못하고, 세포(10)가 수용되는 위치와 혼동되어 작업자가 핸들링부(110)에 세포를 위치시키는 오류를 범할 수 있는 단점이 있고, 90° 이상으로 형성될 경우, 작업자가 제1용기(100) 상측에 세포(10)를 위치시킨 다음, 집게에 의해 핸들링부(110) 파지 시 세포(10) 손상을 유도할 수 있는 단점이 있다.If θ is formed to be 1° or less with respect to the
선택적으로, 제1용기(100) 단부에 이동 또는 사용의 편의성을 위해 세포(10)가 수용되는 부분의 마주보는 측에 제1표시부(111)가 형성될 수 있다.Optionally, a
더욱 자세히 설명하면, 제1표시부(111)는 세포(10)가 수용되는 부분의 마주보는 단부에 형성됨으로써, 사용자가 집게 등에 의해 파지할 수 있는 부분과 세포(10)를 위치시킬 수 있는 부분을 한 눈에 식별할 수 있는 장점이 있다.In more detail, the
이를 위해, 제1표시부(111)는 제1용기(100)로부터 대비되는 색으로 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.To this end, the
예를 들어, 제1용기(100)가 투명하게 형성될 경우, 제1표시부(111)는 유색으로 형성될 수 있는 것이다.For example, when the
이로 인해, 제1용기(100)가 작업자의 부주의로 인해 유실될 경우, 제1표시부(111)에 의해 쉽게 발견할 수 있는 장점이 있다.For this reason, when the
또한, 제1용기(100)에 절곡 형성된 핸들링부(110)가 형성되어 세포(10)를 냉동 또는 해동 시 손쉽게 바이알(vial)에 넣어 보관하고 이동 할 수 있도록 형성되어, 세포(10)를 냉동하고 해동하는 작업 시 핸들링부(110)와 세포를 부착(loading)하는 부위를 구분지어 표시함으로써 바이알에 넣고 보관 시 세포(10)가 유실 될 가능성이 현저히 저하 될 뿐만 아니라, 이동 시 편리한 장점이 있다.In addition, the
<실시예 3><Example 3>
도 4, 도 5 및 도 16에 도시된 바와 같이, 제1용기(100)는 세포(10)와 인접한 위치에 길이 방향으로 연장 형성되며, 내측에 홈이 형성된 수용부(200)를 포함하여 형성될 수 있다.4, 5 and 16, the
더욱 자세히 설명하면, 수용부(200)는 세포(10)와 인접한 위치에 파여 있거나, 함몰 또는 관통 형성되어 제1용기(100) 상측에 세포(10)와 함께 수용되는 보존액을 수용할 수 있도록 형성될 수 있다.More specifically, the
바람직하게, 도 16에 도시된 바와 같이, 수용부(200)는 세포(10)와 인접한 위치에 관통 형성되어 수용액이 용이하게 외부로 배출되거나 수용될 수 있도록 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.Preferably, as shown in FIG. 16 , the receiving
이때, 수용부(200)에 보존액이 모세관 현상에 의해 수용될 수 있는 것이다.At this time, the preservative solution may be accommodated in the
이로 인해, 제1용기(100) 상측에 세포(10)와 적정량의 보존액이 존재됨으로써, 세포(10)의 냉동보존 시 보존액에 의한 얼음결정이 형성되는 것을 최소화 시킬 수 있는 장점이 있다.For this reason, since the
즉, 제1용기(100) 상측에는 세포(10)와 수용부(200)에 의해 수용되거나 외부로 배출되어 제거된 잉여분의 보존액이 존재될 수 있는 것이다.That is, the surplus preservative solution removed by being accommodated by the
이를 위해, 수용부(200)는 세포(10)가 수용되는 위치와 일정간격 이격 형성됨으로써, 제1용기(100)와 세포(10)가 함께 동결될 경우, 수용부(200) 내에 유입된 보존액의 동결에 의해 세포(10)가 손상되는 것을 예방할 수 있도록 형성될 수 있다.To this end, the receiving
선택적으로, 도 6 및 도 17에 도시된 바와 같이, 수용부(200) 단부에 길이방향으로 연장 형성된 수용로(210)가 더 포함될 수 있다.Optionally, as shown in FIGS. 6 and 17 , an
자세하게 수용로(210)는 수용부(200) 단부로부터 세포(10)가 위치되는 방향으로 연장 형성될 수 있다.In detail, the receiving
이때, 수용로(210)는 수용부(200) 단부로부터 상측 방향으로 경사지도록 형성됨으로써, 세포(10)가 제1용기(100)에 위치됨과 동시에 보존액이 수용로(210)의 경사에 의해 수용부(200) 내측으로 안정적으로 흘러 들어갈 수 있도록 형성될 수 있다.At this time, the receiving
이를 위해, 세포(10)와 인접한 위치의 수용로(210) 단부 지름은 5mm 이하로 형성되며, 세포(10)와 마주보는 측의 단부는 수용부(200)와 같거나 작게 형성될 수 있다.To this end, the end diameter of the
이로 인해, 수용로(210)의 지름에 의해 세포(10)가 수용부(200)에 수용되지 않고 보존액을 선택적으로 수용부(200)에 유입시킬 수 있도록 형성될 수 있다.For this reason, the
이때, 수용로(210)의 길이는 길이방향으로 충분히 연장 형성되어, 수용부(200)에 보존액을 선택적으로 충분히 수용시켜, 제1용기(100)와 세포(10)가 함께 동결될 경우, 수용부(200) 내에 유입된 보존액의 동결에 의해 세포(10)가 손상되는 것을 예방할 수 있도록 형성될 수 있다.At this time, the length of the receiving
<실시예 4><Example 4>
도 7에 도시된 바와 같이, 제1용기(100)의 세포(10)와 인접한 위치에 형성된 제1흡수부(300)를 포함하여 형성될 수 있다.As shown in FIG. 7 , it may be formed to include the
더욱 자세히 설명하면, 도 7에 도시된 바와 같이, 제1용기(100) 상측에 위치되는 세포(10)와 일정거리 이격되어 제1용기(100) 상측에 제1흡수부(300)가 형성될 수 있다.More specifically, as shown in FIG. 7 , the
제1흡수부(300)가 형성됨으로써, 세포(10)와 함께 제1용기(100) 상측에 위치되는 보존액이 제1흡수부(300)에 흡수되어, 세포(10)와 적정량의 보존액이 제1용기(100) 상측에 위치됨과 동시에 냉동보존이 수행될 수 있는 것이다.When the
이를 위해, 제1흡수부(300)는 제1용기(100)로부터 착탈 가능하도록 형성될 수 있다.To this end, the
자세하게는, 제1흡수부(300) 하측면은 점착층으로 형성되어, 일정양의 보존액을 흡수하고 난 다음, 작업자가 집게에 의해 간단하게 제1흡수부(300)를 박리하여 제거할 수 있도록 형성될 수 있다.In detail, the lower surface of the first
바람직하게, 제1흡수부(300)는 제1용기(100)의 폭과 작거나 크게 형성되어, 제1용기(100)로부터 집게에 의해 용이하게 박리될 수 있도록 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.Preferably, the
이로 인해, 제1용기(100) 상측에 세포(10)와 적정량의 보존액이 존재됨과 동시에, 냉동보존 시 보존액의 얼음결정 형성에 의해 세포(10)가 손상되는 것을 최소화 할 수 있는 장점이 있다.For this reason, there is an advantage in that the
이와 같이 형성된 제1흡수부(300)는 보존액을 용이하게 흡수시키기 위해 와트만지(whatman paper) 또는 한지 등을 포함하는 보존액을 흡수시킬 수 있는 섬유로 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The first
선택적으로, 도 8 내지 도 10에 도시된 바와 같이, 제1용기(100)의 단부 하측에 외측방향으로 돌출 형성된 제2흡수부(400)가 포함될 수 있다.Optionally, as shown in FIGS. 8 to 10 , a
제2흡수부(400)는 제1용기(100) 단부 하측에 외측방향으로 돌출 형성되어, 세포(10) 수용 후 형성되는 잉여보존액 제거를 위해 세포(10)를 길게 펼치고 제2흡수부(400) 말단과 접촉하게 하여 잉여보존액이 용이하게 흡수 제거될 수 있는 장점이 있다.The
이를 위해, 제2흡수부(400)는 세포(10)가 수용되는 측의 제1용기(100) 단부 하측으로부터 길이 또는 폭 방향 중 선택되는 어느 하나 이상으로 연장 형성될 수 있다.To this end, the
이때, 제2흡수부(400) 일측 또는 타측 중 선택되는 어느 하나 이상의 단부 상측 또는 제1용기(100) 단부 하측 일측 또는 타측 중 선택되는 어느 하나 이상에 점착층이 형성될 수 있다.In this case, an adhesive layer may be formed on any one or more selected from the upper side of one or more ends of the
이에 따라, 집게 등에 의해 간단히 제2흡수부(400)를 박리시킴으로써, 간단한 조작에 의해 제2흡수부(400)를 제거시킬 수 있는 장점이 있다.Accordingly, there is an advantage in that the
더욱이, 제2흡수부(400)는 제1용기(100) 하측에 견고하게 점착됨과 동시에 용이하게 제거될 수 있도록, 제1용기(100)의 폭보다 같거나 크게 형성될 수 있다.Moreover, the
만약, 도 9에 도시된 바와 같이, 제2흡수부(400)가 제1용기(100)의 단부로부터 좌측 또는 우측 방향으로 연장 형성될 경우, 제2흡수부(400)의 제1용기(100)와 점착되는 측의 단부는 제1용기(100) 단부와 일직선상에 위치될 수 있도록 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.If, as shown in FIG. 9 , when the second absorbing
더욱이, 도 10에 도시된 바와 같이, 제2흡수부(400)는 제1용기(100)의 단부를 중심으로 길이, 좌측 및 우측방향으로 연장 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.Moreover, as shown in FIG. 10 , the
이때, 제2흡수부(400)는 제1흡수부(300)와 동일한 소재로 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.In this case, the
이와 같이, 제2흡수부(400)가 형성됨으로써, 세포(10)의 이동 과정 중에 발생될 수 있는 보존액 이탈 시 제2흡수부(400)에 의해 신속한 처리가 용이할 뿐만 아니라, 적정량의 보존액과 세포(10)가 제1용기(100) 상측에 위치되어 보존액에 의한 얼음결정 형성을 최소화시키고, 간단한 조작으로 제2흡수부(400)를 박리시켜 제거할 수 있는 장점이 있다.As described above, since the
더욱이, 상기와 같이, 제1용기(100)에 수용부(200), 제1흡수부(300) 또는 제2흡수부(400)가 선택적으로 더 포함되어 보존액인 유리화 냉동액의 양을 적게 적용시키면서 얼음결정으로 인한 세포(10)의 얼음 결빙을 최소화하여 폐사 또는 손실을 저하시켜줌으로써, 세포(10)의 생존율을 증진시킬 수 있는 장점이 있다.Moreover, as described above, the
본 발명은 세포와 함께 병(vial)에 넣어 보관시킴으로써, 세포의 이동 또는 보관 과정에서 세포가 유실될 가능성이 현저히 저하되어 세포의 냉동보존 등의 산업상 이용가능한 발명이다.The present invention is an industrially applicable invention such as cryopreservation of cells because the possibility of cell loss in the course of movement or storage of cells is significantly reduced by storing them in a vial together with the cells.
Claims (10)
A vitrified container used for cryopreservation, characterized in that it comprises a first container (100) formed in a plate shape to accommodate the cells (10) on the upper side.
제1용기(100)는 집게를 포함하는 기구에 의해 파지되는 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
The method according to claim 1,
The first container 100 is a vitrified container used for cryopreservation, characterized in that it is gripped by a mechanism including tongs.
세포(10)는 시험관아기 시술에 적용되는 정자, 난자 또는 배아를 포함하는 생식세포인 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
The method according to claim 1,
The cell 10 is a vitrified container used for cryopreservation, characterized in that the germ cells including sperm, egg or embryo applied to the in vitro fertilization procedure.
제1용기(100)는 합성수지로 형성된 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
The method according to claim 1,
The first container 100 is a vitrified container used for cryopreservation, characterized in that formed of a synthetic resin.
제1용기(100)는 PET(polyethyleneterephthalate), PCTFE(Poly-Chloro-Tri-Fluoro Ethylene), PTFE(Polytetrafluoroethylene) 또는 PFA(perfluoroalkoxy) 중 선택되는 어느 하나 이상으로 형성된 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
The method according to claim 1,
The first container 100 is used for cryopreservation, characterized in that it is formed of any one or more selected from PET (polyethyleneterephthalate), PCTFE (Poly-Chloro-Tri-Fluoro Ethylene), PTFE (Polytetrafluoroethylene), and PFA (perfluoroalkoxy). vitrified container.
제1용기(100)는 단부가 상측방향으로 절곡 형성된 핸들링부(110)를 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
The method according to claim 1,
The first container 100 is a vitrified container used for cryopreservation, characterized in that it comprises a handling part 110 formed by bending the end in the upward direction.
제1용기(100) 단부에 이동 또는 사용의 편의성을 위해 세포(10)가 수용되는 부분의 마주보는 측에 제1표시부(111)가 형성된 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
The method according to claim 1,
A vitrified container used for cryopreservation, characterized in that the first display part 111 is formed at the end of the first container 100 opposite to the part where the cells 10 are accommodated for the convenience of movement or use.
제1용기(100)는 세포(10)와 인접한 위치에 길이 방향으로 연장 형성되며, 내측에 홈이 형성된 수용부(200)를 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
The method according to claim 1,
The first container 100 is a vitrified container used for cryopreservation, characterized in that it is formed to extend in the longitudinal direction at a position adjacent to the cell 10, and includes a receiving part 200 having a groove formed therein.
제1용기(100)의 세포(10)와 인접한 위치에 형성된 제1흡수부(300)를 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
The method according to claim 1,
A vitrified container used for cryopreservation, characterized in that it comprises a first absorption unit (300) formed at a position adjacent to the cells (10) of the first container (100).
제1용기(100)의 단부 하측에 외측방향으로 돌출 형성된 제2흡수부(400)를 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
The method according to claim 1,
A vitrified container used for cryopreservation, characterized in that it comprises a second absorption part (400) formed to protrude outwardly below the end of the first container (100).
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