KR20220115324A - 미산성 차아염소산수를 포함하는 친환경 나노에멀션 손소독제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미산성 차아염소산수, 타임 레드 오일, 모노라우린을 포함하는 나노에멀션 손소독제 조성물을 제공한다.

Description

미산성 차아염소산수를 포함하는 친환경 나노에멀션 손소독제 조성물{Eco-friendly nano-emulsion hand sanitizer composition containing slight acidic hypochlorous acid water}

본 발명은 미산성 차아염소산수(slight acidic hypochlorous acid water)를 포함하는 친환경 나노에멀션 손소독제 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는 피부 감염 및 병원성 유해균에 대한 미산성 차아염소산수, 식물성 정유 및 모노라우린의 항균 활성 측정 및 혼합물의 최적 항균 활성 분석을 통해 최적의 소독제 제제를 확립하고, 보관 중 최적 혼합비로 제조된 소독제의 물성 안정성 및 항균 효능 평가를 통해 미산성 차아염소산수를 포함하는 손소독제 제조 기술에 관한 것이다.

최근 코로나19 바이러스의 대유행으로 인해 개인 위생과 청결에 대한 관심이 높아지고 있다. 코로나19 바이러스는 전염병 중 하나로 에어로졸과 포마이트 형태로 전염이 가능하다고 보고되어있다. 기침 및 재채기에서 발생하는 감염자의 비말과 직접 접촉하거나 마스크 표면을 통한 간접 접촉으로 손이 오염될 수 있으므로 적절한 손 위생이 가장 중요하다. 미국 질병예방통제센터(CDC)에서는 올바른 방법으로 손 씻기를 할 경우 코로나19 등 각종 감염병을 예방할 수 있는 가장 손쉽고 효과적인 예방 방법 중 하나라고 하였다. 이로 인해 현재 손소독제 및 손 세정제 등과 같은 위생용품의 수요가 증가하고 있다. 세계 보건기구(WHO)에서는 박테리아 및 바이러스에 대한 광범위한 살균 작용이 입증된 알코올 기반 손소독제(ABHS)를 권장하고 있다. 현재까지 가장 효과적인 손소독제 제품은 미생물의 단백질을 변성시키고 바이러스를 불활성화시킬 수 있는 알코올 함량이 62 내지 95%인 알코올 기반 제제이다.

식품의약품안전처의 허가를 받은 손소독제의 주성분으로는 에탄올, 이소프로판올, 염화벤잘코늄, 크레졸 및 과산화수소 등이 있다. 하지만 에탄올은 1급 발암물질로 지정된 물질로 소비자들의 불안감을 형성할 수 있다. 따라서 에탄올을 대체할 살균소독제로 미산성 차아염소산수를 이용하여 미산성 차아염소산수를 기반으로 한 친환경 손소독제의 개발이 필요하다. 미산성 차아염소산수는 식품의약품안전처가 식품첨가물공전에 살균소독제로 지정한 성분으로 도 1과 같이 에탄올, 이소프로판올, 염화벤잘코늄 및 차아염소산 나트륨 등의 소독제 성분보다 소독 대상물 및 대상 미생물의 범위가 넓으며, 살균력과 안전성 면에서도 매우 우수하다. 하지만 미산성 차아염소산수의 물성과 살균효능을 안정적으로 유지 가능한 전해용액을 개발하여 적용한 제품 및 연구결과는 현재 없다.

본 발명의 목표는 보관 기간 동안 소독제의 항균 활성을 평가하고 기존 알코올계의 소독제와 항균성을 비교하여 미산성 차아염소산수를 기반으로 한 친환경 손소독제를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 미산성 차아염소산수, 타임 레드 오일(thyme red, 학명: Thymus vulgaris), 모노라우린을 포함하는 나노에멀션 손소독제 조성물을 제공한다.

상기 타임 레드 오일의 농도는 0.001 내지 0.5mg/ml, 바람직하게는 0.005 내지 0.335mg/ml일 수 있다. 상기 범위 미만이면 살균 또는 항바이러스 효과를 기대하기 어려우며, 상기 범위를 초과하면 약간의 독성을 가질 수 있다.

상기 모노라우린의 농도는 0.001 내지 0.5mg/ml, 바람직하게는 0.005 내지 0.19mg/ml일 수 있다. 상기 범위 미만이면 살균 또는 항바이러스 효과를 기대하기 어려우며, 상기 범위를 초과하면 함량 대비 살균/항균 효과가 미흡할 수 있다.

상기 나노에멀션의 입자 크기는 10 내지 1000nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 입자의 크기가 상기 범위를 초과하면 제형안정성이 낮아질 수 있다.

상기 조성물은 추가적으로 초음파로 처리한 것일 수 있다.

상기 초음파의 범위는 10 내지 50kHz, 바람직하게는 20kHz일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 초음파는 상기 범위 미만이면 제형의 결합 안정성의 효과가 미흡할 수 있으며, 상기 범위를 초과하면 유화안전성이 감소될 수 있다.

상기 초음파 처리 시간은 10분 내지 1시간, 바람직하게는 30분일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 초음파 처리 시간 범위 미만이면 제형의 결합 안정성의 효과가 미흡할 수 있으며, 상기 범위를 초과하면 유화안전성이 감소될 수 있다.

상기 미산성 차아염소산수는 양극과 음극 사이에 막이 없는 무격막 전해조에서 생성되며 pH가 5.0 내지 6.5, 유효염소농도가 10 내지 30pmm인 나노에멀션 손소독제 조성물을 제공한다. 상기 유효 염소 농도가 상기 범위 미만이면 살균효과가 감소할 수 있고, 상기 범위를 초과하면 알레르기와 같이 피부에 영향을 미칠 수 있다.

상기 조성물에 부형제가 추가로 포함될 수 있다.

상기 부형제는 콜로이드성 실리카, 합성 점토 물질, EDTA, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리소르베이트, 글리세롤, 아크릴레이트 공중합체, 에센셜 오일, 완충제, 셀룰로스 유도체 및 크산탄 검으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 손소독제 조성물은 에스캐리키아 콜리(Escherichia coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 균에 대해 항균 활성이 인정된다.

본 발명을 통해 제조된 미산성 차아염소산수를 포함하는 손소독제 조성물은 무알코올성 및 친환경적이므로 피부에 대해 독성이 없고, 알레르기 반응도 일으키지 않는 장점이 있다.

도 1은 소독제제의 특성을 나타낸다.
도 2는 개발한 손소독제의 전반적인 흐름도를 보여준다.
도 3은 ACC 농도에 따른 살균 효과를 나타낸다.
도 4는 디스크 확산 방식에 의한 식물성 정유의 항균 활성을 나타낸다.
도 5는 병원성 미생물에 대한 나노에멀션 기반 소독제의 항균 효과를 나타낸다.
도 6은 타임 레드 오일의 화학 성분에 대한 가스 크로마토그래피 질량 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 박테리아 지질 단백질(LpxC, 지질 2 - 세포벽 단백질) 및 핵산 기반 국소이성질화효소 단백질에 대한 타임 레드 오일의 분자 상호 작용을 나타낸다.
도 8은 Phase Inversion Composition (PIC) 방법에 의한 나노 유화액 생산의 개략도를 나타낸다.
도 9는 제형의 결합 안정성을 높이기 위해 초음파처리를 기반으로 제조한 나노 유화액의 변화를 나타낸다.
도 10은 (A) 가열 전 및 (B) 72℃에서 2시간 동안 열처리 후 병원성 미생물에 대한 항균 효과 및 개발된 손소독제의 안정성을 나타낸다. SAEW10: 미산성 차아염소산수(10ppm); SAEW30: 미산성 차아염소산수(30ppm); TR: 타임 레드 오일(0.125mg/ml); ML: 모노라우린(0.05mg/ml).
도 11은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 투과 전자 현미경 사진을 나타낸다. DW: 증류수; SAEW10: 미산성 차아염소산수(10ppm); SAEW20: 미산성 차아염소산수(20ppm); TR: 타임 레드 오일(0.125mg/ml); ML: 모노라우린(0.05mg/ml).
도 12는 공초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 황색포도상구균을 30초 동안 소독제에 처리한 결과를 나타낸다. DW: 증류수, SAEW10: 미산성 차아염소산수(10ppm), SAEW20: 미산성 차아염소산수(20ppm); TR: 타임 레드 오일(0.125mg/ml); ML: 모노라우린(0.05mg/ml).
도 13은 MTT 분석에 의한 CCD-1135sk 세포에 대한 손소독제 용액의 세포 독성을 나타낸다. DW: 증류수, SAEW10: 미산성 차아염소산수(10ppm), TR: 타임 레드 오일(0.125mg/ml), ML: 모노라우린(0.05mg/ml).
도 14는 손소독제로 72시간 배양한 후 AO/EB로 염색된 세포의 형태를 나타낸다. DW: 증류수; SAEW10: 미산성 차아염소산수(10ppm); SAEW20: 미산성 차아염소산수(20ppm); TR: 타임 레드 오일(0.125mg/ml); ML: 모노라우린(0.05mg/ml)
도 15는 HET-CAM 분석결과를 광학현미경사진법(photomicrography)으로 나타낸 것이다. DW에 300초 노출 후 대표적인 CAM 효과. (A) 음성 대조군: 증류수, (B) 양성 대조군: NaOH(0.1N), (C) SAEW 10, (D) DW + TR + ML, (E) SAEW 10 + TR + ML.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예의 상세한 설명은 첨부된 도면들을 참조하여 설명한다. 본 발명의 설명에 앞서, 이하의 내용들은 단지 본 발명의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위한 목적으로 예시된 것으로, 본 발명의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

도 2는 개발한 손소독제의 전반적인 흐름도를 보여준다. 이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

<실시예 1> 살균 효과 스크리닝

(1) 미산성 차아염소산수의 항균 효과

① 박테리아 균주 및 배양 준비

에스캐리키아 콜리(Escherichia coli O157:H7 43894), 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis ATCC 13076), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes Scott ATCC 43251), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus ATCC 13565), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus ATCC 10987)를 강원대학교 식품생명공학과에서 분양받아 사용하였다. 각 균주들은 tryptic soy broth 또는 brain heart infusion broth를 사용하여 37℃에서 24시간 배양한 후 3,000g × g에서 10분간 원심분리 하고 상등액을 제거한 후 멸균된 0.1% 완충 펩톤수로 2회 세척한 후 0.1% BPW에 재부유하여 사용하였다. 실험에 이용하는 균의 최종농도는 8.0~9.0 log CFU/mL으로 조정하여 사용하였으며 미산성 차아염소산수의 살균효능 분석은 상기에 배양한 균주 1.0mL를 9.0mL의 차아염소산수에 1분간 침지시킨 뒤 중화용액(0.85% NaCl + 0.5% Na₂S₂O₃)에 옮겨 1분간 중화시키고 중화된 용액을 0.1% 완충 펩톤수 9mL를 이용하여 연속 희석한 후 TSA 혹은 BHI agar에 0.1mL 접종하였다. plate는 37℃에서 24시간 배양한 후 콜로니를 계수하였다.

② 미산성차아염소산수(SAEW)의 준비

양극(IrO₂ + SnO₂)과 음극(Ti) 사이에 막이 없는 무격막 전해조를 사용하여 미산성차아염소산수를 생성하였다. 전해질로서의 HCl 용액(2%)은 전해조 내부의 수돗물과 혼합하였고 암페어와 전압은 하기 표 1에 나타나있다. pH 및 ORP 전극을 측정하는 pH 미터(Accumet 모델 15, Fisher Scientific Co., Fair Lawn, NJ, USA)와 ACC(available chlorine concentration)는 디지털 염소 테스트 키트(RC-3F, Kasahara Chemical Instruments Corp., Saitama, Japan)를 사용하여 비색 방법으로 분석하였다.

	Sample	Voltage(V)	Ampere (A)	pH	ACC (ppm)
SAEW 10	3.1	4.5	4.5	6.15	10
SAEW 20	3.1	6.0	6.0	5.88	20

③ 미산성차아염소산수의 생산 최적화

SAEW에 대한 생산 공정을 최적화하기 위해 다른 농도와 유속에서 HCl과 NaCl을 포함하여 생산하였다. 이러한 조합은 강산성, 산성 및 약산성 EW를 포함한 다양한 EW 생산을 유도하였다. 전해질 유속이 증가하면서 HCl 농도를 증가 시키면 ACC 값이 높아지고 모든 조합에서 pH가 감소하였다. 1.0 M NaCl(전해질 농도)을 제외하고 적절한 pH 5.0 내지 6.5의 SAEW는 수돗물에 대해 1~2 mL/min의 EFR에서 생성하였다. 수돗물을 사용하여 SAEW를 생성하는 최적의 조건은 2% HCl + 1M NaCl(EFR 2mL/min) 조합이었다.

④ 병원성 식중독균 및 피부 감염 유해균에 대한 SAEW의 염소 농도에 따른 영향

침지 시간 1분 동안 23±0.2℃에서 처리된 병원균에 대한 SAEW 살균 효능에 대한 ACC의 효과는 도 3에 표시하였다. 동일한 조건을 유지하기 위해 모든 처리 용액에 대해 pH를 6.0으로 설정하였다. 그 결과 박테리아 집단이 ACC 20, 30에서 1분 동안 SAEW 처리 후 완전히 불활성화되었다는 것을 알 수 있다. 이 결과는 pH 6.0과 유리 염소 농도 20ppm에서 1분 동안 SAEW 처리가 병원성 미생물을 약 8 내지 9 Log CFU/mL를 살균하는 데 효율적인 것을 나타내나 본 발명에서는 모노라우린 및 식물성 정유의 결합으로 인해 생길 수 있는 상승효과를 확인하기 위해 ACC 10을 사용하였다.

⑤ Viable bacterial cell count

제조한 손소독제의 항균성과 저장 중의 항균 기능을 평가하기 위하여 9mL의 소독제를 tube에 넣어 10분간 배양 후 각 균현탁액 1mL을 첨가하였다. 23±0.2℃에서 30초와 60초 동안 voltexing 후 항균 작용을 중지하기 위하여 각각의 샘플 1mL을 취하여 중화용액(0.5% 티오황산나트륨+0.85% 염화나트륨) 9mL과 1분간 잘 혼합하였다. 대조군으로 동일 농도의 미산성 차아염소산수를 사용하였다. 중화 후 각각의 샘플은 0.1% 완충 펩톤수에 10배씩 연속 희석하여 배지에 도말하였고 37±2℃에서 24~48시간 배양 후 콜로니 수를 계측하였다.

(2) 식물성 정유 및 모노라우린의 항균 효과

① 식물성 정유

식물성 정유는(타임 레드 오일(thyme red oil), 펜넬 오일(fennel oil), 바질 오일 (basil oil), 오레가노 오일(oregano oil), 시나몬 오일(cinnamon oil), 유칼립투스 오일(eucalyptus oil), 클로브 오일(clove oil), 월계수잎 오일(Bay leaf oil))은 한국 웹사이트 https://www.doterra.com/KR/ko_에서 구매하여 항균 활성을 측정하였다.

② 한천 디스크 확산(Disk diffusion method) 분석

상기 식물성 정유 8가지를 사용하여 항균 효능 스크리닝을 디스크 확산법으로 수행하였다. 10⁸CFU/mL 수준의 균 배양액을 Mueller Hinton agar 배지에 도말하고, 식물성 정유와 모노라우린을 각각 20μL로 적신 지름 8mm의 멸균 여과지 디스크를 배지 표면에 접종한 뒤 37℃에서 24시간 배양하고, 생육 저지환을 측정하여 항균 활성을 측정하였다. 대조군으로는 DMSO 1%(v/v)를 사용하였다. 억제 영역은 디스크를 포함하여 밀리미터 단위로 측정하였으며, 모든 결과는 3회씩 독립적으로 수행하였다.

③ 디스크 확산 방식에 의한 식물성 정유의 항균 활성

병원성 미생물에 대한 식물성 정유의 감수성은 디스크 확산법으로 확인하였다. 도 4에서 알 수 있듯이 8가지 식물성 오일 중 타임 레드 오일, 오레가노 오일 및 시나몬 오일은 모든 균주에 대한 성장 억제 효과를 나타냈다. 특히 타임 레드 오일과 시나몬 오일은 세 가지 박테리아 균주에 대해 가장 높은 활성을 보였고 오레가노 오일이 그 뒤를 이었다. 한편 펜넬 오일, 바질 오일, 월계수잎 오일, 클로브 오일, 오레가노 오일 및 유칼립투스 오일에 대해서는 가장 낮은 항균력을 보였으며 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 에스캐리키아 콜리(Escherichia coli)에 대해서는 활성이 없었다. 이 결과에 따라 타임 레드 오일을 선택하였다.

④ 최소 억제 농도(MIC) 및 최소 살균 농도(MBC) 결정

MIC(최소 억제 농도, minimum inhibitory concentration) 측정을 위해 The Clinical and Laboratory Standards Institute(NCCLS, 2003)에서 권장한 대로 박테리아에 대한 액체배지 미량희석법 분석을 하였다. MBC(최소 살균 농도, minimum bactericidal concentration)는 NCCLS(1999) 지침에 따라 결정하였다. 테스트 균주를 0.1%(w/v) 완충 펩톤수에 현탁하여 10⁸CFU/mL의 세포 밀도를 얻었고 각 웰에 첨가된 100μL의 박테리아 현탁액을 얻은 후 0.31 내지 10.0mg/mL의 식물성 정유 범위의 희석액을 96-웰 마이크로플레이트에서 준비하였다. MIC는 가시적인 성장을 방해하는 최저 농도의 오일로 정의하였고, MBC는 초기 세균 감소율이 99.9% 이상인 최저 농도의 오일로 사용되었으며, 한천 플레이트에서 육안으로 보이는 성장이 정지된 각 웰에서 100μL의 계대 배양으로 진행하였다. 모든 결과는 각 테스트 농도에서 3회 반복되었으며 MIC 및 MBC 값은 미산성차아염소산수, 식물성 정유, 모노라우린의 유화액 제조를 위해 결정하였다.

⑤ 병원성 미생물에 대한 타임 레드 오일의 최소 억제 농도(MIC) 및 최소 살균 농도(MBC) 설정

손소독제 제조를 위해 미산성 차아염소산수와 결합한 타임 레드 오일와 모노라우린의 농도를 선택하기 위해 MIC 및 MBC 분석을 수행하였다. 선택된 각 타임 레드 오일과 모노라우린의 MIC 및 MBC 결과는 표 3에 표시하였다. 타임 레드 오일는 0.025mg/mL에서 MIC를 나타내는 모든 병원성 미생물에 대해 강력한 항균 효능을 보였다. 모노라우린의 MIC 및 MBC는 타임 레드 오일과 유사한 패턴을 보였다. 모노라우린은 병원성 균주에 대한 정균 또는 살균 효과를 얻기 위해 더 높은 농도를 가졌다. 따라서 우리는 미산성 차아염소산수(SAEW)와 결합하기 위해 0.125mg/mL의 타임 레드 오일과 0.05mg/mL의 모노라우린을 사용하였다.

(3) 손소독제 제제의 항균 효과

손 세정제 최적 제형 확립: MIC와 MBC를 통해 얻은 식물성 정유와 모노라우린의 농도를 미산성 차아염소산수와 혼합하여 viable bacteria cell count을 이용하여 복합 제제의 항균 효율성을 확인하였다.

병원성 미생물에 대한 SAEW의 항균 효과를 평가하기 위해 세균 현탁 방법을 사용하였다. 도 5에서 볼 수 있듯이 SAEW(ACC는 10ppm)를 기반으로 한 손소독제는 병원성균에 대한 살균 효과가 뛰어났다.

<실시예 2> 식물성 정유에 존재하는 주요 항균 화합물에 대한 분자 결합 작용 및 항균 효율 결정

(1) 가스 크로마토그래피 - 질량 분석법 (GC-MS) 분석

GM, YM, RB 및 CC의 미정제 헥산 추출물에서 추출한 휘발성 화합물은 GC-MS, Agilent 7890A/5975C 질량 선택 검출기(Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 결정하고 DB-5MS 모세관 컬럼(30m 길이×0.25 mm id, 0.25 mm 필름 두께)을 사용하였다. 헬륨은 1 mL/min의 일정한 유속으로 운반 가스로 사용되었으며, 주입 부피는 1mL로 하였다(분할 비율 5:1). 오븐 온도는 5분 동안 50℃로 설정하고 분당 4℃에서 230℃로 올린 다음 20분 동안 유지하였고, 검출기 및 주입기 온도는 280℃로 설정하였다. 질량 선택 검출기의 이온화 에너지는 70eV로 설정되었으며 스캔 질량 범위는 50 내지 500m/z이다. 휘발성 성분은 ChemStation integrator를 사용하여 식별 및 정량화하였다. 피크 평균을 기반으로 한 질량 스펙트럼의 머무름 시간을 WWiley, W8N05ST.L database library(Liu et al., 2017)의 스펙트럼과 비교하였다.

① 타임 레드 오일 기반 가스 크로마토그래피(GCMS) 분석

총 39개의 휘발성 화합물이 타임 레드 오일에서 확인되었다. 탄화수소는 모든 샘플에서 확인된 가장 큰 휘발성 성분 그룹으로, 검출된 총 휘발성 화합물의 36.7 내지 66.49%를 차지하였다(도 6). 타임 레드 오일의 주요 휘발성 성분은 티몰 36 내지 55%와 p-사이멘 15 내지 28%로 확인되었다. 이 화합물은 인간과 동물에 대한 독성이 비교적 낮지만 강력한 살균성을 가진다. 다른 화합물의 비율은 γ-테르피넨 5 내지 10%, 리날로올 4 내지 6.5%, 카바크롤 1 내지 4%, β-미르센 1 내지 3%, 테르핀-4-올 0.2 내지 4.0%이 검출되었다. 또한 α-tujen, α-alpg-pinene, α-테르피넨, 캄퍼 미르센(camphor myrcen)과 같은 모노테르펜 탄화수소뿐만 아니라 모노테르펜, 1.8-시네올, 리날로올, 테르핀-4-올 및 γ의 산소 유도체도 검출되었다.

(2) 분자 도킹(Molecular docking) 분석

GM, YM, CC 및 RB 샘플의 헥산 추출물의 항균 활성을 담당하는 주요 화합물을 확인하기 위해 컴퓨터 기반 분자 도킹 방법을 이용하여 박테리아 국소이성질화효소 2(topoisomerase II)의 4개 사슬 구조 결합 단백질에 대한 가능한 결합 방식을 확인하였다. 국소이성질화효소 2(4PLB) 및 지단백질X복합체(LpxC) UDP-3-O-(R-3-히드록시미리스토일)-N-아세틸글루코사민 디아세틸레이스(deacetylase) 추출물 화합물(리간드)과 표적 단백질(수용체) 및 분자 도킹 점수(Kcal/mol) 간의 분자 상호 작용은 Argus Lab 4.0.1(Mark Thompson 및 Planaria Software LLC) 및 BIOVIA Discovery studio 2016(Accelrys Software)를 사용하여 분석하였다.

① 타임 레드 오일의 항균 메커니즘 기반 In-silico 분자 도킹 상호 작용

손소독제의 항균 분석의 시험관 내 결과를 검증하기 위해 분자 메커니즘 연구를 진행하였다. 하기 표 4 및 도 7에서 알 수 있듯이, 타임 레드 오일의 테스트 화합물 중 1,5-cycloctadien이 세균의 Lipid 2 - 세포벽 단백질에 대해 가장 높은 도킹 점수 -6.349Kcal/mol를 나타냈다. 또한, Pro329, Ser339, Tyr391, 전기적으로 하전된 측쇄 Glu348, Glu393, Lys23 및 Lys328과 Val392, Ala330, Ile309, Pro329, Pro331, Ser339, Tyr391 같은 아미노산 소수성 측쇄에서의 강한 상호 작용을 가졌으나 피리딘, 리날로올, 1,6-옥타디엔-3-올 및 비사이클로(3.1.1)헵탄과 같은 다른 주요 화합물은 상호 작용이 없었다. 마찬가지로 1,5-cycloctadien 및 피리딘은 각각 국소이성질화효소 2(4PLB)에 대해 가장 높은 도킹 점수를 나타냈다. Val1071, Val1742, Ala1739, Ala1068, Met1075, Met 1121 및 Met1792와 같은 아미노산 소수성 측쇄에서 전기적으로 하전된 측쇄 Asp 1754가 있는 강력한 상호 작용이 타임 레드 오일 유래 1,5-cycloctadie과 4PLB 단백질 사이에서 관찰되었다. 모노라우린은 소수성 측쇄 Ala1068, Ala1739, Val1742, Val1071, Met1121 및 Met1792에서 강한 상호 작용을 나타냈다. Val1071, Ala1739, Met1075, Met1121 및 Met1792; Ala1068, Ala1739, Val1742, Ile1757, Met1121 및 Met1746은 각각 -1.9의 가장 높은 도킹 점수를 나타냈다. GM, YM, CC 및 RB의 헥산 추출물에 다양한 화합물이 존재하면 박테리아 세포의 단백질 발현 억제에 시너지 효과를 발휘하여 세포 사멸을 초래할 수 있다. 최근 DNA 자이라제 억제제, 새로운 세균 국소이성질화효소 억제제(NBTI)가 박테리아 단백질과 함께 잠재적인 표적으로 발견되었다.

<실시예 3> 나노에멀션 준비

(1) 손소독제의 최적 nano-formulation 구축

혼합액은 두 개로 나누어 각각 1,100×g에서 5분간 원심분리 후 샘플은 85℃에서 15분간 열처리하였다. 유화액층과 액체층을 측정하여 하기 수학식 1과 같은 유화도와 유화안전성을 측정하였다. 또한 나노 크기 에멀젼의 물리적 특성은 입도 분석기와 제타 전위를 기반으로 설정하였다. 5초 펄스(5초 켜짐 및 5초 꺼짐) 및 50% 진폭에서 6분 유효 시간 동안 아래에 초음파(ultra sonication)를 이용하여 나노에멀션을 형성하였다.

① 손소독제의 나노 유화(Nano-Emulsification) 특성

개발된 손소독제의 유화 특성은 도 8에 나타나있다. 이는 손소독제의 유화 활성과 유화 안정성이 완전히 안정될 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 측면 상호 작용을 증가시켜 타임 레드 오일과 SAEW 사이의 유화제로서 중요한 역할을 하는 모노라우린에 의존한다(Kunieda, Yano & Solans, 1989).

(2) 나노에멀션의 입자 크기 분석

에멀션(emulsion, 유화액) 내의 입자 크기는 Malvern ZetaSizer(Nano-ZS, Malvern Instruments, Malvern, UK)를 사용하여 측정하였다. 유화액 샘플(2방울)을 큐벳에 넣고 입자 크기 측정을 위해 물(2ml)에 희석하였다. 측정은 25℃에서 3회 진행하였다. PDI는 0에서 1까지의 크기 분포 폭에 대한 무차원 측정값이며, 더 높은 값은 입자 크기의 더 넓은 분포를 나타낸다. 입도 측정은 3회 실시하였다.

타임 레드 오일 기반 초음파 처리한 나노 유화액의 입자 크기 분포는 도 9의 b의 결과를 가졌다. 크기 10nm에서 1000nm 사이의 입자 크기 분포를 확인하여 나노에멀션을 생성하였다. 초음파 처리한 나노 유화액은 초음파 처리 하지 않은 유화액 보다 안정적인 것을 확인하였다.

(3) 나노에멀션의 z-Potential 분석

z-Potential 측정용 샘플(25μl)을 모세관 cell에 넣고 물(2ml)에 하였다. 입자 크기는 해당 다분산 지수(PDI)와 Stokes-Einstein 관계를 적용하여 z-평균으로 설정하였다. 각 샘플의 제타 전위(ζ 전위) 측정은 3회 실시하였다.

제타 전위는 고체와 액체 사이의 상 경계의 전위차이다. 저농도에서 타임 레드 오일 혼합물의 제타 전위는 나노 유화액 -62.4 mV에서 가장 높은 제타 전위값을 나타냈다. 본 실험에서 비이온성 계면 활성제인 모노라우린을 사용하였고, 샘플에서 음의 제타 전위값을 나타냈다(제타 전위 앞의 (-)는 산란 물체의 순 전하가 음이고 콜로이드 분산의 안정성을 나타내는 핵심 지표이다).

샘플은 상대적으로 낮은 제타 전위 절대 값(최대 -37.4mV)을 가졌다(도 9의 a). 일반적으로 30mV보다 낮은 제타 전위의 절대 값은 분자 사이의 정전기 인력으로 인해 응집에 대한 안정성이 낮음을 의미한다.

<실험예 1> 나노에멀션의 열 안정성 및 항균 활성

(1) 나노에멀션 손소독제의 유효성 평가

① Viable bacterial cell count

제조한 손소독제의 항균성과 저장 중의 항균 기능을 평가하기 위하여 9mL의 소독제를 tube에 넣어 10분간 배양 후 각 균현탁액 1mL을 첨가하였다. 23±0.2℃에서 30초와 60초 동안 voltexing 후 항균 작용을 중지하기 위하여 각각의 샘플 1mL을 취하여 중화용액(0.5% 티오황산나트륨 + 0.85% 염화나트륨) 9mL와 1분간 잘 혼합하였다. 대조군으로 동일 농도의 미산성 차아염소산수를 사용하였다. 중화 후 각각의 샘플은 0.1% 완충 펩톤수에 10배씩 연속 희석하여 배지에 도말하였고 37±2℃에서 24~48시간 배양 후 콜로니 수를 계측하였다.

② 개발된 손소독제의 안정성 평가

나노에멀션 형태의 손소독제의 열처리 테스트는 소독제 저장시 불안정성 기작에 대한 설명을 제공한다. 가열하는 동안 지방 용해, 계면 상 전이, 계면 층 구조, 불안정을 유발할 수 있는 화학적 또는 정전 기적 상호 작용을 포함한 일부 물리 화학적 변화가 발생하게 된다.

75℃ 열 안정성에서 처리된 나노에멀션 샘플은 고농도의 오일을 포함하는 샘플이 분리되는 경향이 있음을 확인할 수 있었다. 오일 비율이 높고 균일하지 않은 샘플을 사용하는 나노 유화액에서 상 분리가 관찰되었다. 초음파 처리를 한 샘플(0.05mg/ml의 모노라우린 및 0.125mg/ml 타임 레드 오일을 포함함)만이 분리에 대해 안정함을 나타냈다.

도 10은 75℃에서 1시간 동안 열처리 후 병원성 미생물에 대한 항균 효과 및 개발된 손소독제의 안정을 나타낸다.

75℃에서 4시간 보관 후 SAEW의 개발된 손소독제의 항균 효능 안정성을 평가 하였다. SAEW(ACC는 10 및 20ppm)는 0일에 황색포도상구균과 살모넬라티피에 대해 뛰어난 소독 효과를 나타냈다. 그러나 21일 보관 후 상당한 변화를 보였다. 이러한 결과는 살균 효능을 결정하는 SAEW의 사용 가능한 염소 화합물이 공기에 노출됨에 따라 느슨해지기 때문이다(Cui et al., 2009). 이러한 결과는 타임 레드 오일를 함유한 SAEW의 나노에멀션이 병원성 미생물에 대한 항균 활성을 가지며 항균 활성의 안정성이 일반 SAEW 및 비-나노 유화액보다 우수하다는 것을 나타낸다. 따라서 개발된 나노에멀션 기반 손소독제는 병원성 미생물 관리를 위한 대체 소독 물질이 될 수 있음을 알 수 있었다.

③ 투과전자현미경(Transmission electron microscopy, TEM) 분석

병원성 미생물 중 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 세포 구조에 대한 소독제의 효과를 알아보기 위해 투과 전자 현미경으로 세균 세포를 관찰하였다. 도 11은 1분간 개방 상태에서 30℃ 보관한 개발된 소독제로 처리된 황색포도상구균의 TEM에서 관찰된 부분을 나타낸다. 대조군은 정상적인 세포벽과 막을 가진 둥근 모양의 세포이다. 황색포도상구균을 개발된 소독제로 처리하면 세포질 밀도가 감소하고 세포질이 세포벽을 형성하고 세포에 공간이 형성되고, 또한 세포가 부분적으로 파괴되고 세포질의 유출로 인해 전자 밀도가 감소한다.

TEM은 세포 파괴 이미지를 관찰하는 데 사용되었다. 처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플을 원심 분리하고(4℃에서 15분 동안 4000 x g) 0.1% 완충 펩톤수에 재현탁하였다. 박테리아 세포를 4시간 동안 0.1M 카코딜산 완충액(pH7.4)에 4% 글루타르알데히드 및 파라포름알데히드 용액에 고정시켰다. 글루타르알데히드 용액을 제거하고 샘플을 0.1M 카코딜산 완충액(pH 7.4)에서 10분 동안 3회 세척하였다. 샘플을 에탄올, 프로필렌옥사이드 및 Eponate 812 수지로 처리 한 후 65℃에서 24시간 동안 처리하였다. 그 후 울트라마이크로톰(ultra-microtome)을 사용하여 세포 단면의 변화를 확인하였고, 형태학적 변화는 Transmission Electronic Microscopy(EF-TEM, LEO912AB, Carl Zeiss)에 의해 분석되었다.

④ 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM) 분석

처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플을 원심 분리 (4℃에서 15분 동안 4000 x g)하고 0.1% 완충 펩톤수에 재현탁시켰다. 박테리아 세포를 SYTO-9 및 프로피디움 요오드화물로 염색한 후 공초첨 레이저 주사 현미경(SR-CLSM; LSM880 with Airyscan, ZEISS, Oberkochen, Germany)으로 확인하였다.

도 12에서는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 세포의 SYT-PI 단일 및 이중 염색을 사용하여 공초점 레이저 주사 현미경으로 박테리아 생존 조건에 대한 살균 효과를 확인하였다. 살아있는 세포는 녹색 형광으로 표시되고 죽은 세포는 적색 형광으로 표시하였다. 특히 SAEW10 + TR + ML 및 SAEW20 + TR + ML 처리는 SAEW10, 20 및 DW + TR + ML에 비해 더 많은 죽은 세포가 나타났다.

<실험예 2> 손소독제로 개발된 나노에멀션의 안정성 평가

(1) 손소독제의 피부 적용 평가

① 세포 독성

CCD-1135sk 세포 (6×103 cell/well)는 5% CO₂로 37℃에서 24시간 동안 96 웰 플레이트에서 배양하였다. 이후 세포를 개발된 손소독제 용액으로로 72시간 동안 처리하였다. MTT(5mg/mL 최종 농도)를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 상층액을 제거하고 생성된 포르마잔 결정을 DMSO에 용해시켰다. 살아있는 세포는 570nm에서 측정하였다.

도 13에서 알 수 있듯이, SAEW10은 100%의 세포 생존율을 보였고, DW + TR + ML 및 SAEW 10 + TR + ML이 각각 91% 및 88.69% 순으로 나타났다. 즉, 정상 세포에서 손소독제의 안전성을 확인할 수 있었다.

② 아크리딘 오렌지/브로민화 에티듐(AO/EB) 염색

이중 아크리딘 오렌지/브로민화 에티듐(AO/EB) 형광 염색을 수행하여 소독제로 처리된 CCD-1135sk의 세포 자멸사 변화를 확인하였다. CCD-1135sk 세포(6 x 103 cell/well)는 5% CO₂로 37℃에서 24시간 동안 96 웰-플레이트에서 배양하였다. 이후 세포를 개발한 소독제로 48시간 동안 처리하였다. 배양 후, 20μL의 트립신을 각 웰에 첨가한 후 현탁액을 슬라이드로 옮겼다. 이중 형광 염색 용액(AO/EB, Sigma, St. Louis, MO)을 각 현탁액에 첨가하였다. 세포 사멸 세포의 형태는 형광 현미경으로 관찰하였다.

도 14에서 알 수 있듯이, SAEW 10에서는 유의한 세포 사멸이 검출되지 않았다. DW + TR + ML 및 SAEW 10 + TR + ML 처리된 샘플에서 조기에 세포 사멸 세포가 녹황색 핵으로 보이는 단편화된 DNA가 발견되었다. SAEW 20 및 SAEW 20 + TR + ML 처리된 샘플에 표시되는 AO/EB로 주황색으로 염색된 후기 세포 자멸사 세포이다. SAEW 20을 사용한 샘플은 생존 세포의 수를 줄일 수 있었다.

③ HET-CAM 분석(알레르기성 결정)

도 15 및 표 5에서 알 수 있듯이, HET-CAM 분석결과는 모든 손소독제 용액에서 실질적으로 자극적이지 않은 것으로 나타났다(score 0). 하지만 0.1N NaOH 용액은 응고를 나타내어 용액이 자극 효과를 생성하였음을 암시한다(score 12). 이러한 결과로부터 SAEW 10 + TR + ML은 자극이 없다는 것을 알 수 있었다.

④ 통계 분석

모든 실험은 두 번의 반복실험으로 진행하였다. 콜로니를 열거하고 미생물 계수를 샘플의 log CFU/mL로 표시하였다. 또한, 박테리아 집단에 대한 log CFU/mL 감소를 계산하였다. 비활성화를 포함한 각 처리의 평균은 SPSS 통계 소프트웨어 버전 21(SPSS Inc., IBM Company)을 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA)을 하였다. 이러한 평균 간의 차이는 p<0.05로 설정된 유의성을 사용한 Tukey의 다중 비교에 의해 결정하였다.

Claims (7)

1. 미산성 차아염소산수, 타임 레드 오일, 모노라우린을 포함하는 나노에멀션 손소독제 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 타임 레드 오일의 농도는 0.001 내지 0.5mg/ml인 나노에멀션 손소독제 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 모노라우린의 농도는 0.001 내지 0.5mg/ml인 나노에멀션 손소독제 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 나노에멀션의 입자 크기는 10 내지 1000nm인 나노에멀션 손소독제 조성물.
5. 제1항에 있어서, 초음파 처리를 추가적으로 할 수 있는 나노에멀션 손소독제 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 미산성 차아염소산수는 양극과 음극 사이에 막이 없는 무격막 전해조에서 생성되며 pH가 5.0 내지 6.5, 유효염소농도가 10 내지 30pmm인 나노에멀션 손소독제 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 손소독제는 에스캐리키아 콜리(Escherichia coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 균에 대해 항균 활성이 있는 나노에멀션 손소독제 조성물.

Images