KR20220103182A - 핵산 타간트를 사용한 물품의 인증 - Google Patents

핵산 타간트를 사용한 물품의 인증 Download PDF

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이베이 인크.
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Abstract

본 개시내용은 식별을 위해 물품을 표시/태그화하기 위한 조성물 및 방법, 특히 핵산 타간트로 물품을 태그화하는 것 (유전자 태그-기반의 상품 인증)에 관한 것이다.

Description

핵산 타간트를 사용한 물품의 인증 {AUTHENTICATION OF OBJECTS USING NUCLEIC ACID TAGGANTS}
[우선권 주장]
본 출원은 2018년 5월 7일자 U.S. 출원 제15/972,951호를 우선권 주장하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
위조는 상표들의 주요 문제가 되고 있다. 위조된 상품은 수조 단위의 매출 손실 및 수백만 단위의 일자리 손실을 초래한다. 매출 손실 이외에도, 특정 위조 제품은 건강 및 안전 문제와 직접적으로 연관된다. 위조 상품은 직물에서 마이크로칩 및 약제까지 대부분의 산업에 침투해 있다.
약제, 완구, 오락 제품, 의류, 패션 액세서리, 화폐, 전자제품, 및 임의의 기타 고가 제품을 포함한 제품들은 소비자 시장에 모방 위조품이 존재한다. 위조품의 문제점은 그것이 원래 상표 또는 제조자의 명성 및 경제활동을 손상시킬 뿐만 아니라, 이들 제품들이 신뢰성 있는 공급원으로부터 나오는 것이 아니기 때문에 그 품질 및 효능이 훼손되었을 가능성이 있다는 것이다. 위조는 종종 위조 부품을 사용한 제품의 하자로부터 초래될 수 있는 결과에 비해, 위조 상품을 유통시키는 사람들에 대해 최소한의 대가를 치르게 한다.
[발명의 개요]
본 개시내용은 식별(identification)을 위해 물품을 표시하거나 태그화(tagging)하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 핵산 타간트(taggant)로 물품을 태그화하는 것 (예컨대 유전자 태그-기반의 상품 인증)에 관한 것이다.
일 실시양태는 a) 텔로미어를 포함하는 DNA 타간트를 함유하는 물품을 얻는 단계; b) a)의 품목을 처리하여 DNA 타간트의 적어도 일부를 꺼내는 단계; c) 임의적으로, b)의 꺼낸 DNA 타간트를 정제하는 단계; d) b)의 꺼낸 DNA 타간트 또는 c)의 정제된 DNA 타간트를 증폭 과정에 적용하여 증폭된 DNA 타간트를 생성하고, 크기 및 또는 서열 분석에 의해 증폭된 DNA 타간트를 분석하는 단계; 및 e) b)의 꺼낸 DNA 타간트, c)의 정제된 DNA 타간트 또는 d)의 증폭된 DNA 타간트를 복제에 적용하는 단계이며, 여기서 상기 DNA 타간트는 텔로미어를 갖고, 복제는 상기 DNA 타간트 텔로미어의 단축을 유발하는 것인 단계를 포함하는, 인증 또는 추적을 위해 DNA 타간트로 물품을 처리하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 추가적으로 f) 상기 단축된 DNA 타간트로 물품을 코팅하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 a)-f)를 물품에 대해 2회 이상 반복하는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, e)에서 DNA 타간트가 단축될 때마다 이는 물품의 판매를 나타내며, f)의 코팅된 DNA 타간트의 크기 및/또는 서열은 품목이 판매된 총 횟수의 결정을 가능하게 한다.
일 실시양태는 a) 검출가능한 단백질 마커를 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 DNA 타간트를 함유하는 물품을 얻는 단계; b) a)의 품목을 처리하여 DNA 타간트를 꺼내는 단계; c) 임의적으로, b)의 꺼낸 DNA 타간트를 정제하는 단계; d) b)의 꺼낸 DNA 타간트 또는 c)의 정제된 DNA 타간트를 전사 및 번역을 위한 숙주 세포에 도입하여, 검출가능한 단백질 마커를 수득하는 단계; 및 e) d)로부터의 검출가능한 단백질 마커를 검출하는 단계를 포함하는, 인증 또는 추적을 위해 DNA 타간트로 물품을 처리하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 마커는 형광을 발하고/거나, 색상을 제공하고/거나, 향기를 제공하고/거나, 발광하고/거나, 항체로 검출가능한 단백질이다.
본원에서 제공되는 방법은 추가적으로 DNA 타간트에 대해 데이터베이스를 검색하는 단계, DNA 타간트로 처리된 하나 이상의 물품을 데이터베이스에 입력하는 단계 또는 이들의 조합의 적어도 하나의 단계를 포함할 수 있다.
일 실시양태는 텔로미어를 포함하거나 발현 벡터에 제공되는 DNA 타간트; DNA 타간트 적용장치; 물품을 태그화하는 것에 대한 지침, 태그화된 품목들을 열거하는 하나 이상의 서식; 로그-온(log-on) ID; 패스워드 또는 고유 식별자 코드; 하나 이상의 용기; 웹사이트/데이터베이스를 검색하기 위한 지침; 태그화된 물품에 대해 웹사이트/데이터베이스에 정보를 제출하기 위한 지침; 또는 이들의 조합을 포함하는 키트를 제공한다.
많은 제품 제조자들이 "트레이드 드레스(trade dress)"로 식별가능한 외관상의 품질 및 확정적인 디자인을 이용하여 그의 고품질이며 고가인 제품을 고유하게 식별함으로써, 그의 고객의 신뢰를 얻고 있다. 위조-방지 목적으로 다른 것들도 라벨에 부가된다. 통상적인 위조-방지 라벨은 일반적으로 특히 목적하는 물리적 또는 화학적 특징을 갖는 재료, 예를 들면 수표장 상의 마그네틱 스트립, 신용 카드 상의 레이저 홀로그래프, 증권 상의 형광 잉크 및 기밀 문서 상의 열-감지 잉크로부터 형성된다. 위조-방지 라벨은 식별될 필요가 있는 물품에 특이적 항원을 첨가하는 것에 의해서도 제조되었으며, 이후 항원은 그 항원에 대해 특이적인 항체로 검출될 수 있다. 그러나, 항원 및 항체는 많은 온도 및 습도 환경 조건하에서 특징적으로 저조한 안정성을 갖는 단백질이고, 변성되거나 심지어는 분해되어 결과적으로 활성을 상실하기가 쉬우며, 쉽게 파괴됨으로써 식별의 정밀도 및 신뢰성을 감소시킬 수 있다.
사용되는 또 다른 접근법은 제품이 진품임을 시각적으로 검출할 수 있도록, 제품에 형광단을 첨가하는 것이다. 형광단은 이들 제품에 염료 또는 마커로 작용할 수 있으며, 이는 제조 전반에 걸쳐 제조 초기 단계 동안 또는 마감된 제품/상품에 적용될 수 있다. 이러한 방법은 처음에는 효과적이었지만 더 이상 제품을 보호하지 못하는데, 위조자들이 제품을 형광단과 함께 모방하고 있기 때문이다. 위조자들은 제품으로부터 형광단을 추출하고, 그것을 복제하고, 그의 위조 제품에 그것을 첨가함으로써, 진품이 그러한 것처럼 제품이 형광을 발하도록 할 수 있었다.
이에 따라, 예를 들면 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)과 같은 핵산이 통상적으로 사용되는 위조-방지 라벨 및 마커의 개선된 대안으로서 주목을 받게 되었다. 비교적 단순한 뉴클레오티드 빌딩 블록으로 구성됨에도 불구하고, 핵산은 막대한 양의 정보를 코딩할 수 있는데: 예를 들면 인간 게놈은 뇌의 신경망으로부터 골격, 조직 및 기관의 복잡한 구조까지 모든 인간 신체 구성요소의 합성 및 조립에 필요한 모든 정보를 코딩한다. 핵산에는 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)이 포함된다. 핵산 서열은 고유하고 복잡할 수 있다.
마커 또는 타간트로서의 용도에 있어서의 핵산의 추가적인 장점은 적절한 보호에 의해 이들 분자가 오랜 시간 기간 동안 보존될 수 있다는 것이다. 빙하, 대빙원, 타르 갱 및 습지 및 늪지대의 보존된 시편으로부터의 증거들은 DNA가 수천년, 어떤 경우에는 수백만년에 걸쳐 분해에 대해 탄력적이라는 것을 보여준다. 보호된 타간트 DNA는 고가의 관심 품목 또는 물품의 코팅을 위한 중합체에 안정화됨으로써 오랜 시간 기간 동안 생존할 수도 있으며, 이후 식별, 인증 및 추적 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들면 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용한 증폭에 의해 적은 수의 분자를 검출하는 매우 민감한 방법과 연계된 오랜 시간 기간에 걸쳐 지속되는 이러한 능력은 핵산, 특히 DNA를 마커로서 사용하기 위한 매력적인 후보가 되게 한다. 또한, 핵산은 거의 무제한의 코딩 능력을 제공하는데, 가능한 고유 서열의 수가 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 매 추가 염기마다 4배 증가하기 때문이다.
정의
개시되는 주제를 기술하는 문맥 (특히 하기하는 청구범위의 문맥)에서 사용되는 "단수" 용어 및 유사 언급들은 본원에서 달리 나타내거나 문맥상 분명하게 부정되지 않는 한 단수 및 복수 모두를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 사용될 때, "기재에 결합" 및 "고정"이라는 용어는 DNA 결합 및 고정에 적용될 때 호환가능하다.
본원에서 사용될 때의 "타간트"라는 용어는 DNA 또는 RNA 마커를 나타내고, 임의적으로 DNA 마커는 제2 마커 물질과의 조합으로 존재할 수 있다. 마커 DNA, 및 존재할 경우의 추가적인 하나 이상의 마커는 물품에 고정되어 예를 들면 그의 제조 공급원과 같은 물품의 특성을 나타낸다.
"PCR"이라는 용어는 폴리머라제 연쇄 반응을 지칭한다. PCR은 DNA 폴리머라제 예컨대 원래 호열성 박테리아 (서무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus))로부터 단리된 열안정성 Taq 폴리머라제와 같은 열안정성 DNA 폴리머라제의 존재하에서의 주형 핵산 서열에 인접한 특정 서열에 상보성인 짧은 프라이머 올리고뉴클레오티드 쌍들을 사용한 용융, 재-어닐링, 및 중합 주기를 통한 온도 순환을 통해 주형 핵산 서열의 카피 수를 확장하는 데 유용한 증폭 기술이다. PCR에는 DNA 가닥이 카피되어 원래 DNA 가닥의 백만개 이상의 카피을 제공하는 표준 PCR 방법 (예를 들면 무작위 프라이머를 사용하는 PCR: 예를 들면 문헌 [PCR with Arbitrary Primers: Approach with Care. W. C. Black IV, Ins. Mol. Biol. 2: 1-6, December 2007] 참조); 매 주기마다 PCR 생성물의 양이 모니터링될 수 있는 실시간 PCR 기술 (문헌 [Real time quantitative PCR: C. A. Heid, J. Stevens, K. J. Livak and P. M. Williams, 1996 Genome Research 6: 986-994]); RNA가 먼저 DNA 가닥으로 카피되고 이후 DNA 가닥이 표준 PCR 반응에 의해 증폭되는 역전사-PCR (예를 들면 문헌 [Quantitative RT-PCR: Pitfalls and Potential: W. F. Freeman, S. J. Walker and K. E. Vrana; BioTechniques 26:112-125, January 1999] 참조)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용될 때의 "단량체"라는 용어는 하나 이상의 다른 이러한 물질에 공유 연결되어 올리고머 또는 중합체를 형성할 수 있는 임의의 화학 물질을 지칭한다. "단량체"의 예에는 뉴클레오티드, 아미노산, 당류, 아미노산 등이 포함된다.
"핵산"이라는 용어는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드일 수 있는 뉴클레오티드로 구성된 중합체를 의미한다. 이들 화합물은 천연 또는 합성적으로 생성된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드일 수 있다. 합성적으로 생성된 핵산은 자연 발생 서열 또는 비-자연 고유 서열의 것일 수 있다.
"리보핵산" 및 "RNA"라는 용어는 리보뉴클레오티드로 구성되는 중합체를 나타낸다. "데옥시리보핵산" 및 "DNA"라는 용어는 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 중합체를 나타낸다.
"뉴클레오티드"라는 용어는 데옥시리보뉴클레오티드의 경우 보통 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 또는 티민 (T)이며 리보뉴클레오티드의 경우 보통 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 또는 우라실 (U)인 질소-함유 염기에 공유 결합된 보통 리보스-5'-포스페이트 또는 2'-데옥시리보스-5'-포스페이트인 당 포스페이트를 포함하는 단량체 단위를 의미한다.
본 명세서에 사용될 때의 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 2 내지 약 20개 뉴클레오티드 길이의 사슬을 형성하는 공유 뉴클레오티드 단량체들로 구성된 단일 또는 이중 가닥 중합체를 지칭한다.
본 명세서에 사용될 때의 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 일반적으로 약 20개 뉴클레오티드 초과 길이의 사슬을 형성하는 공유 뉴클레오티드 단량체들로 구성된 단일 또는 이중 가닥 중합체를 지칭한다.
자연 발생 서열을 갖는 핵산은 서열 특이적인 방식으로 핵산과 혼성화될 수 있다. 즉, 그것은 상보성인 염기 쌍 A:T (아데닌:티민) 및 G:C (구아닌:시토신)가, 함께 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성 상호작용으로 알려진, 분자간 (또는 분자-내) 수소 결합, 및 파이 전자를 통한 각 가닥에서의 평면 상의 이웃 염기들 사이의 협력적 스태킹 상호작용을 형성하는 혼성화 반응에 참여할 수 있다. 핵산 가닥의 염기들은 혼성화되어, G (구아닌)가 U (우라실)와 쌍을 이루거나 대안적으로 I (이노신)가 C (시토신), U (우라실) 또는 A (아데닌)와 쌍을 이루지만 정상적인 왓슨-크릭 염기 쌍형성 상호작용에 비해 더 낮은 결합 에너지를 갖는 소위 "워블(wobble)" 상호작용에 의해 비-왓슨-크릭 염기 쌍들을 형성할 수도 있다.
예시적인 실시양태는 물품을 태그화하고 물품의 외관을 해치지 않으면서 물품으로부터 타간트를 회수하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 예시적인 실시양태는 또한 물품 상에, 또는 활성화된 DNA 타간트의 결합을 위한 액체에 혼입된 타간트를 사용한 물품의 인증 방법을 제공한다.
타간트
타간트가 처리될 때마다 단축될 텔로미어를 갖는 단백질 또는 서열을 코딩하는 특정 유전자 서열을 갖는 맞춤식 유전자 벡터와 같은 변조 DNA 사슬이 상품/제품/물품에 매립될 수 있다. 이러한 벡터는 물품으로부터 꺼낸 후, 업계 기술자에게 이용가능한 분자 생물학적 기술에 따라 처리되어 벡터에 의해 코딩된 특정 단백질을 생성할 수 있다. 이후, 이러한 단백질이 검출될 수 있다. 이러한 유전자 서열은 무작위화되어 각 제품 SKU에 대해 맞춤화된 후, 추가적으로 특정 제조 일자에 맞추어질 수 있다. 인증 동안, 생성되는 특정 단백질은 검출가능한 방식으로 또 다른 단백질과 반응하거나, 특정 냄새, 발광, 형광을 생성하거나, 또는 일시적인 색상을 제공할 수 있는, 예를 들면 하이-엔드 상표로 관리될 수 있는 시약으로 처리될 수 있다. 또한, 그러한 맞춤식 DNA 타간트는 특정 시간량에 걸쳐 분해되도록 조작될 수 있다. 누군가 벡터를 서열분석할 수 있다 할지라도, 여전히 특정 시약 부위 및 생성되는 검출/타간트 분자를 알아야 할 것이다. 또한, 이러한 역조작을 수행하는 비용은 그러한 고가 사슬의 일시적인 특성으로 인해 엄두도 못 낼 정도로 높을 것이다.
본 개시내용의 타간트에는 예를 들면 핵산 타간트가 포함된다. 핵산은 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)의 일반적인 용어이며, 합성이거나, 동물, 식물, 박테리아, 바이러스, 진균 유래이거나, 또는 상기-열거된 핵산들 중 어느 것의 합성 벡터 또는 단편 등일 수 있다. 합성 핵산은 동물, 식물, 박테리아, 진균, 바이러스 또는 임의의 다른 유기체 또는 합성 벡터의 자연 발생 핵산 서열을 가질 수 있다는 것을 알아야 한다. 대안적으로, 합성 핵산은 자연에서는 발견되지 않는 고유 서열을 가질 수 있다. 이러한 고유한 비-자연 서열은 자연에서 발견되는 서열의 스트레치를 가질 수 있으나, 전체 비-자연 서열은 고유하며, 어떠한 식물, 동물 또는 바이러스 또는 임의의 다른 자연 유기체에서도 발견되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 특히, 본 개시내용의 타간트에서 암호화되거나 코딩되는 데이터 또는 표식 요소를 코딩하는 핵산 서열은 고유한 비-자연 서열이어서, 관심 물품의 인증에서 사용하기에 적합하다.
따라서, 본 개시내용의 타간트는 재조합적으로 또는 합성적으로 생성될 수 있다. 상기 DNA 타간트는 자연 공급원으로부터 단리된 것인지 또는 합성인지에 관계없이 자연 DNA일 수 있거나; 또는 상기 DNA 타간트는 합성적으로 생성된 비-자연 서열일 수 있다. DNA 전체 또는 그의 일부는 식별가능한 서열을 포함할 수 있다.
a) 텔로미어 - 텔로미어는 염색체의 말단을 열화 또는 이웃 염색체와의 융합으로부터 보호하는 각 염색체 말단의 반복적인 뉴클레오티드 서열 영역이다. 척추동물의 경우, 텔로미어의 뉴클레오티드 서열은 TTAGGG이고, 상보성 DNA 가닥은 AATCCC이고, 단일 가닥 TTAGGG 오버행을 갖는다. 인간에서는 이러한 서열 TTAGGG가 대략 2,500회 반복된다. 인간에서, 평균 텔로미어 길이는 출생시 약 11 킬로베이스에서 고령시 4 킬로베이스 미만으로 줄어든다.
염색체 복제 동안, DNA를 복제하는 효소는 그의 복제를 염색체의 말단까지 전체적으로 계속할 수는 없어서, 매 복제마다 염색체의 말단이 단축된다 (이는 오카자키 단편의 합성이 후행 가닥(lagging strand)의 앞에 부착하는 RNA 프라이머를 필요로 하기 때문임). 텔로미어는 세포 분열 동안 말단절단되는 염색체 말단에서 이용가능한 완충물질이며; 그의 존재는 염색체 상에서 그들 이전의 유전자들이 대신 말단절단되는 것으로부터 보호한다. 텔로미어 자체는 셸터인(shelterin) 단백질 복합체에 의해서 뿐만 아니라 텔로미어 DNA가 코딩하는 RNA (TERRA)에 의해서도 보호된다.
시간이 지나면서, 매 세포 분열로 인해, 텔로미어 말단은 더 짧아진다.
일부 실시양태에서, DNA 타간트는 그의 5' 및 3' 말단에 텔로미어 서열을 포함한다. 인간에서, 말단 (TTAGGG)n 텔로미어 DNA의 양은 시험관내 및 생체내에서 다양한 체세포 유형의 노화 동안 감소한다. 일부 실시양태에서, DNA 타간트는 특정 서열을 갖는 이중 가닥 DNA를 포함하며, 상기 특정 서열의 각 말단에는 텔로미어 서열을 포함한다. 상기 특정 서열은 본원에서 기술되는 인증 정보를 코딩할 수 있다. 본 개시내용에서 유용한 DNA 타간트는 임의의 적합한 길이의 DNA 타간트를 포함할 수 있으며, 예컨대 예를 들면 일 예에서, DNA 타간트는 약 40 염기 쌍 내지 약 1000 염기 쌍의 길이를 갖는 이중 가닥 DNA 올리고머이다. 다른 실시양태에서, DNA 타간트는 약 80 내지 500 염기 쌍의 길이를 갖는 이중 가닥 DNA 올리고머이다. 또 다른 실시양태에서, DNA 타간트는 약 100 내지 약 250 염기 쌍의 길이를 갖는 이중 가닥 DNA 올리고머이다. 각 염기 쌍의 5' 및 3' 말단에는 텔로미어 서열 (TTAGGG)n (여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 등을 포함하여 1 내지 약 50 또는 그 초과임)이 존재한다.
이러한 타간트가 물품으로부터 꺼내어질 때, 타간트의 크기가 결정된다. 이후, 타간트는 섬유모세포와 같은 진핵 체세포에 위치되어 (업계 기술자에게 이용가능한 방법에 의함), 복제가 가능하게 된다. 복제는 텔로미어 단축으로 인해 단축된 단편을 생성시킬 것이다. 더 짧은 단편이 길이 및 서열 분석된 다음, 원래의 타간트가 수득되었던 물품 상에 다시 적용된다.
이는 또 다른 수준의 복잡성 및 고유 식별자를 물품에 부가한다. 이러한 방법은 물품을 인증하는 데 뿐만 아니라, 예를 들면 얼마나 많은 횟수로 물품이 판매되었는지를 추적하고/거나 물품이 판매될 수 있는 횟수를 제한하는 데에도 사용될 수 있다 (그것이 판매될 때마다, 타간트가 복제되고, 이에 따라 이는 텔로미어의 특성으로 인해 단축되고, 고유한 더 짧은 DNA 타간트가 원래의 타간트가 수득되었던 물품에 적용됨). 예를 들어, 물품의 양도시, 구매자가 (그것이 진품인지를 확인하기 위하여) DNA 타간트 인증 과정을 적용하면, 인증 동안 DNA 가닥은 단축/분해된다. 이는 첫 번째 타이틀 양도를 구성한다. 이후의 품목의 재판매시, 동일한 인증 과정이 적용되며 (이번에는 이전의 인증 후 더 짧아진 가닥이 품목에 적용됨), DNA 가닥은 다시 단축된다. 예정된 시점에, 가닥은 추가적인 인증이 더 이상 이루어질 수 없을 정도로 단축/분해된다.
다른 실시양태에서, 타간트의 의도적인 무효화가 제공된다. 예를 들면, 이는 소유권이 당국에 의해 압류당한 경우에 사용될 수 있다 (경찰 관리하에 있은 후 도난 및 재판매를 방지하기 위함). 이는 또한 품목이 굉장히 고가에 판매되는 상황에서 새로운 소유자가 마지막 최종 소유자가 되도록 이전 소유자가 타간트를 파괴하고자 할 때 사용될 수 있다. 이는 산화 또는 임의의 수의 이용가능한 절차에 의해 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, DNA 타간트가 꺼내어지고, 예컨대 예정된 엑소뉴클레아제 부위를 통해 텔로미어가 절단된 다음, DNA가 재적용되며, 이에 의해 나머지 코딩된 가닥은 진품임을 확인하는 데 무손상으로 남게 된다. 다른 말로 하면, 임의의 잔류 텔로미어의 부재가 타이틀 양도를 종료시킬 것이나, 그가 진품임을 확인하기 위해서는 여전히 나머지 사슬을 필요로 할 것이다.
물품으로부터 회수된 DNA 타간트는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭되고, 젤 전기영동에 의해 분해될 수 있다. 본 개시내용의 핵산 타간트의 서열은 고유하고 태그화된 물품에 대해 특이적이기 때문에, 고유 타간트 서열의 일부에 대해 상보성인 특이적 서열을 갖는 프라이머를 사용하는 경우에만 원래 핵산이 증폭될 수 있다. 이러한 절차를 통해, 조사되는 물품이 원래의 핵산을 보유하는 경우, PCR 절차가 추출된 핵산을 증폭시켜, 예정된 크기를 가지며 원래 타간트 핵산 서열의 일부와 동일한 서열을 갖는 앰플리콘을 생성할 것이다. 반대로, 조사되는 물품으로부터 회수된 샘플이 진품에 상응하는 고유 핵산을 포함하지 않는 경우, 증폭된 핵산 생성물이 존재하지 않을 가능성이 있거나, 또는 프라이머가 회수된 핵산을 증폭시켜 하나 이상의 무작위 앰플리콘들을 생성하는 경우, 이러한 하나 이상의 앰플리콘들은 진품으로부터의 고유한 타간트 핵산 서열을 가질 수 없다. 게다가, 위조 물품으로부터 유래된 무작위 앰플리콘들은 또한 무작위의 길이를 가지며, 타간트-특이적 프라이머에 의해 특정되는 정확한 길이의 앰플리콘을 생성시킬 가능성이 점점 더 작아진다. 따라서, PCR 생성물의 크기를 비교하는 것에 의해, 표지된 물품이 진품임이 확인될 수 있으며, 진품이 아닌 물품은 스크리닝되어 퇴출될 수 있고, 그렇게 되면, 위조-방지 스크리닝 목적이 달성된다.
b) 벡터 - 본 개시내용의 일부 실시양태는 특정 핵산 서열을 포함하고/거나 비제한적으로 녹색 형광 단백질 (GFP), 루시퍼라제 - 루시페린, β-글루쿠로니다제 - β-D-글루쿠론산 (GUS 검정), β-갈락토시다제 - 갈락토시드 유사 X-gal (청색-백색 스크린)을 포함한 특정 검출가능한 마커 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 제공한다. 달리 발현 구축물로도 알려진 발현 벡터는 보통 세포에서의 유전자 발현을 위해 설계된 플라스미드 또는 바이러스이다. 상기 벡터는 표적 세포에 특정 유전자를 도입하는 데 사용되며, 유전자에 의해 코딩된 단백질을 생성시키기 위한 단백질 합성에 세포의 메커니즘을 동원할 수 있다. 발현 벡터는 단백질의 생성을 위한 생물공학의 기본적 도구이다.
상기 벡터는 인핸서 및 프로모터 영역으로 작용하여 발현 벡터 상에 보유된 유전자의 효율적인 전사로 인도하는 조절 서열들을 함유하도록 조작된다. 잘 설계된 발현 벡터의 목표는 효율적인 단백질 생성이며, 이는 나중에 단백질로 번역될 수 있는 상당량의 안정한 메신저 RNA 생성에 의해 달성될 수 있다. 보통 에셰리키아 콜리(Escherichia coli)가 단백질 생성을 위한 숙주로 사용되지만, 다른 세포 유형도 사용될 수 있다.
발현 벡터는 다수의 유전자 발현 요소들을 갖고 있다. 여기에는 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 개시 코돈과 같은 올바른 번역 개시 서열, 종료 코돈 및 전사 종료 서열이 포함될 수 있다. 원핵생물과 진핵생물 사이에는 단백질 합성 기구에 차이가 존재하므로, 발현 벡터는 선택된 숙주에 적절한 발현 요소들을 가져야 한다. 예를 들어, 원핵생물 발현 벡터는 리보솜의 결합을 위해 그의 번역 개시 부위에 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열을 갖게 되는 반면, 진핵생물 발현 벡터는 코자크(Kozak) 컨센서스 서열을 함유하게 된다.
프로모터는 전사를 개시하며, 그에 따라 클로닝된 유전자의 발현을 위한 조절점이 된다. 발현 벡터에 사용되는 프로모터는 보통 유도성이며, 이는 단백질 합성이 오직 요구되는 경우에 IPTG와 같은 유도인자의 도입에 의해 개시된다는 것을 의미한다. 그러나, 일부 발현 벡터에서는 유전자 발현이 구성적 (즉 단백질이 지속적으로 발현됨)일 수도 있다.
유전자 생성물의 발현 후에는, 발현된 단백질을 정제할 필요가 있을 수 있다. 정제 태그가 클로닝된 유전자에 부가될 수 있다. 이러한 태그는 히스티딘 (His) 태그 또는 융합 상대물 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제 또는 말토스-결합 단백질일 수 있다. 이러한 융합 상대물들 중 일부는 일부 발현된 단백질의 용해도를 증가시키는 것을 도울 수도 있다.
일 실시양태에서, 텔로미어 타간트 및/또는 벡터 타간트는 단독으로, 서로와의 조합으로, 또는 임의의 다른 적합한 검출가능하거나 추적가능한 마커, 예를 들면 화학적 마커 또는 생물학적 마커와의 조합으로 유용하다. 본 개시내용의 방법의 실시양태에서, 마커는 UV 형광단, 세라믹 IR 마커, 상향 전환 포스포르(Up Converting Phosphor) (UCP) 적외선 (IR) 마커, UV 마커, 다른 DNA, 아미노산, 펩티드, 단백질, 지질, 당, 다당류, 페로몬, 향기, 추적 요소, 희토류 원소, 또는 이들 임의의 2종 이상의 조합에서 선택된다.
본 개시내용의 실시양태에서, 타간트는 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, 타간트는 DNA로 본질적으로 이루어지고 (예컨대 텔로미어 타간트 및/또는 벡터 타간트), 식별 또는 인증에 유용한 다른 유의한 성분은 없다.
태그화되는 물품 및 코딩되는 정보
실질적으로 고체인 표면을 포함하는 임의의 물품이 핵산 타간트 (태그)에 의해 표시될 수 있다. 예를 들면, 본 개시내용의 예시적인 실시양태에 따른 DNA 태그 및 임의적인 추가 타간트는 물품의 소유권을 표시하는 데 사용될 수 있다. 이러한 물품의 예에는 세라믹 표면, 플라스틱 필름, 비닐 시트, 마그네틱 스트립 카드, 기념품, 종이 상품, 화폐, 은행권, 채권, 수표, 보안 문서 또는 임의의 기타 인쇄물, 비제한적으로 보석, 반지, 귀걸이, 목걸이, 시계 등을 포함한 장신구, 비제한적으로 조각품, 그림 등을 포함한 예술 작품; 전자 상품 예컨대 비제한적으로 컴퓨터, 컴퓨터 주변 장치, 프린터, 마이크로칩, 디스크 드라이브, 텔레비전, 라디오, DVD 플레이어, CD 플레이어, 음향 시스템 등; 가구, 가전, 골동품, 섬유 또는 직물, 의류 또는 액세서리, 예를 들면 비제한적으로 지갑 (예를 들면 호화 핸드백), 신발, 벨트, 선글라스 및 기타 개인 소유물, 예를 들면 비제한적으로 카메라, 자동차, 자전거, 오토바이, 가방 등, 및 스포츠 수집품 및 기타 수집품 (예를 들면 수집용 스니커즈) 또는 임의의 고가 품목이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
핵산 태그가 개인 식별 문서, 예를 들면 비제한적으로 여권, 운전 면허증, 건강 카드, 신원확인 카드, 의료보험 카드, 은행 카드, 신용 카드, 출생 증명서 등 상에 또는 그에 사용될 수 있다는 것도 고려된다.
핵산 타간트가 액체 조성물에 첨가될 수도 있다. 상기 액체 조성물은 예를 들면 인쇄 잉크, 염료 또는 스프레이러한 임의의 적합한 액체 조성물일 수 있다. 상기 액체는 또한 향료 또는 향수일 수 있다.
이후, 예를 들면 하기에서 더욱 상세하게 기술되는 방법을 통해 거기에 결합 또는 공유 결합된 타간트를 식별하는 것에 의해 이들 물품이 진품임이 확인될 수 있다.
일 실시양태에서, 타간트는 그것이 적용/매립되는 물품에 대해 내재적이 아니다. 다른 말로 하면, 태그화된 물품에 타간트의 DNA 서열이 존재하지 않는다.
물품상에 적용된 타간트는 추적가능한 핵산 타간트를 제공한다. 추적가능한 핵산 타간트는 식별, 확인, 인증될 물품 전체 또는 일부 상에 적용될 수 있거나, 또는 물품이 통상 품목인 경우, 통상의 흐름을 통해 임의의 시점에 품목이 추적될 수 있다.
타간트는 예를 들면 회사 또는 품목의 유형에 대해 특이적이거나 (예를 들면 모델 번호), 구체적인 품목 로트(lot) 또는 배치(batch)에 대해 특이적이거나 (로트 번호), 또는 예를 들면 품목에 고유한 일련 번호에서와 같이 실제 품목에 대해 특이적일 수 있다. 또한, 타간트는 다양한 다른 유용한 데이터 항목들 중 임의의 하나 이상을 나타낼 수 있고; 예를 들면 타간트는 태그화된 제품 또는 품목을 제조한 회사의 명칭 및 접촉 정보, 제조 일자, 유통자, 및/또는 제품 또는 품목의 예정된 소매상을 나타내는 데이터를 코딩할 수 있다. 타간트는 또한 예를 들면 비제한적으로 구성요소 데이터, 예컨대 품목에 혼입된 구성요소의 공급원, 또는 제품 또는 품목의 제조에 사용된 제조 플랜트 또는 기구의 정체; 제품 또는 품목이 통상 흐름에 위치된 일자, 유통자에 의해 승인된 일자, 및/또는 소매상에의 인도 일자, 구매자에의 판매 일자, 및 임의의 다른 유용한 상업용 또는 기타 데이터 예컨대 예를 들면 소유자의 개인 정보를 나타낼 수 있다. 각 데이터 또는 표식 요소는 타간트에 암호화 또는 코딩될 수 있으며, 물품으로부터 회수된 타간트로부터 판독되고, 본원에서 기술되는 방법에 따라 해독 또는 암호해제될 수 있다. 해독 또는 암호해제된 데이터는 이후 물품의 특성을 확인하거나, 물품을 인증하거나, 또는 위조 품목을 배제하는 데 사용될 수 있다.
핵산 태그는 하기의 특성들을 나타낼 수 있다: 조성물이 물품, 자산, 품목 등에 적용된 후, DNA는 분해로부터 안정하며/보호된다. 예를 들면, DNA는 약 1년, 예컨대 약 2년, 또는 약 5년, 또는 약 10년, 심지어는 약 20년 또는 그 초과를 포함한 적어도 약 6개월의 기간 동안 분해되는 것으로부터 보호된다. "분해된" 또는 "분해"라는 용어는 DNA가 조성물에 함유된 원래 DNA의 약 10 % 미만의 절단 및 약 1 % 미만의 절단을 포함한 약 30 % 미만의 절단, 예컨대 약 20 % 미만의 절단을 포함한, DNA의 50 % 미만의 절단을 포함한다는 것을 의미한다. "절단"이라는 용어는 엑소뉴클레아제 절단, 엔도뉴클레아제 절단 또는 이들의 조합 중 어느 하나를 의미한다.
기재/물품에 타간트를 결합시키는 방법
핵산 타간트는 혼입된 중합체 또는 중합체 코팅이 있거나 없이 브러싱, 분무 또는 침지될 수 있다 (본원에 그 전체가 참조로 포함되는 US 특허 출원 공개 20090253127호 참조). 물품 및 DNA 타간트가 손상되지 않는 한, 임의의 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, DNA 태그는 타간트를 기재/물품과 접촉시키기 전에 알칼리성 조건에 노출된다. 알칼리 금속은 원소 리튬 (Li), 소듐 (Na), 칼륨 (K), 루비듐 (Rb), 세슘 (Cs) 및 프란슘 (Fr)으로 이루어진 주기율표 I족의 구성원들이다. 주기율표의 이러한 알칼리 금속들은 동종의 화학적 특징을 나타내는 원소들이다.
일 실시양태에서, DNA 타간트가 알칼리성 조건에 노출된 후, 이어서 데옥시리보핵산을 기재에 접촉시킨다. 기재에 결합된 DNA는 혼성화 프로브에 의한 결합, PCR 증폭 및 DNA 서열분석 방법에 이용가능하다.
일 실시양태에서, 알칼리성 조건은 데옥시리보핵산을 높은 pH를 갖는 알칼리성 용액과 혼합하는 단계이며, 예를 들면 알칼리성 용액의 pH는 약 9.0 이상의 pH; 약 10.0 이상의 pH; 약 11.0 이상의 pH; 또는 심지어는 약 12.0 이상의 pH일 수 있는 단계, 및 알칼리성 조건에 노출된 데옥시리보핵산을 기재와 접촉시키는 단계에 의해 생성된다. 일 실시양태에서, 알칼리성 용액은 알칼리 금속의 히드록시드 용액이다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태는 기재에 데옥시리보핵산을 결합시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 데옥시리보핵산을 알칼리성 조건에 노출시키는 단계이며, 여기서 알칼리성 조건은 데옥시리보핵산을 알칼리성 용액과 혼합하는 것에 의해 생성되는 것인 단계, 및 알칼리성 조건에 노출된 데옥시리보핵산을 기재와 접촉시키는 단계를 포함하며; 여기서 알칼리성 용액은 알칼리 금속의 히드록시드 용액이고, 알칼리 금속은 리튬 (Li), 소듐 (Na), 루비듐 (Rb) 및 세슘 (Cs)으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태는 기재에 데옥시리보핵산을 결합시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 데옥시리보핵산을 알칼리성 조건에 노출시키는 단계이며, 여기서 알칼리성 조건은 데옥시리보핵산을 알칼리성 용액과 혼합하는 것에 의해 생성되는 것인 단계, 및 알칼리성 조건에 노출된 데옥시리보핵산을 기재와 접촉시키는 단계를 포함하며; 여기서 알칼리성 용액은 알칼리 금속 히드록시드의 용액이고, 여기서 알칼리 금속 히드록시드는 리튬 히드록시드 (LiOH), 소듐 히드록시드 (NaOH) 및 세슘 히드록시드 (CsOH)로 이루어진 군에서 선택된다. 일 실시양태에서, 알칼리 금속 히드록시드는 소듐 히드록시드 (NaOH)이다.
이들 및 기타 알칼리 결합 방법/조성물에 대해서는 US 특허 제9,790,538호가 참조로 포함된다.
물품상 타간트의 분리 및/또는 분석
DNA는 관련 기술분야에 알려진 바와 같은 다양한 방법들에 의해 본원에서 제공된 타간트로 태그화된 물품으로부터 회수될 수 있다. 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것은 아니나, 예를 들면 물품은 핵산 타간트 (예를 들면 DNA)를 분리하며 그와 회합된 임의의 중합체를 용해시켜 거기에 함유된 타간트 (예를 들면 DNA)에의 접근을 제공하는 용매, 용액 또는 이들의 조합으로 닦을 수 있다.
타간트가 예를 들면 비제한적으로 적절한 도구로의 온건한 마찰 또는 약한 스크래핑에 의해 물품으로부터 분리될 수 있다는 것도 고려된다. 이러한 도구에는 줄(file), 사포 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 경우에서, 타간트는 예컨대 물품의 조각을 절단하거나 파손/인열 제거하는 것에 의해 분리를 위해 설계된 물품의 부분 (예컨대 추가적인 직물 플랩(flap) 또는 벨트 조각)에 적용될 수 있다.
물품으로부터 회수된 DNA는 관련 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 추출, 세척, 정제, 농축, 증폭되거나, 또는 이들의 조합에 적용될 수 있다. 예를 들면, DNA는 1회 이상의 침전, 추출, 원심분리, 여과, 미세여과, 크로마토그래피 분리, 전기영동 분리 또는 이들의 조합에 적용될 수 있다. 또한, 단리되는 DNA는 비제한적으로 관련 기술분야에 알려진 임의의 클로닝 단계, 비제한적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)과 같은 증폭 단계 등을 포함한 하나 이상의 효소 반응에 적용될 수 있다.
어떠한 방식으로도 본 개시내용을 제한하고자 하는 것은 아닌 본 개시내용의 일 실시양태에서, 텔로머라제 및 단백질 제조에 더하여, 처리된 물품으로부터 단리된 DNA가 정제되고, PCR, 또는 관련 기술분야에 알려진 바와 같은 유사한 절차에 의해 증폭된다. 일단 증폭되면, DNA는 서열분석되고, 물품의 소유자에 대한 정보를 제공할 수단으로서의 제한 길이 단편 다형성, 미세위성, 짧은 일렬 반복부 (STR) 분석 등에 적용될 수 있다. 상기 정보는 물품 및/또는 그의 세부사항을 식별하기 위해 데이터베이스 또는 데이터-조직을 검색하는 데 사용될 수 있다.
데이터베이스
본 개시내용의 방법은 비제한적으로 전자 데이터베이스일 수 있는 데이터베이스, 데이터 조직 등에 태그화된 물품을 기록하거나 등록하는 단계를 포함할 수도 있다. 상기 전자 데이터베이스는 온라인 또는 오프-라인일 수 있다. 일 실시양태에서, 전자 데이터베이스는 온라인이며, 정보는 인터넷을 통해 데이터베이스로 전송될 수 있다. 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것은 아니나, 이러한 실시양태에서, 대상체는 태그화된 물품을 열거하고 임의적으로는 기술할 수 있다. 기록 또는 등록될 수 있는 정보에는 소유자 또는 제조자의 성명, 주소, 전화 번호, 팩스 번호, 이메일 주소, 태그화된 물품의 설명, 물품이 태그화된 위치, 물품이 구매되거나 입수된 일자, 물품이 구매되거나 입수된 장소, 일련 번호 또는 기타 식별 번호 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 기술되는 방법은 임의적으로 물품의 진품임을 확인하거나 부정하기 위해 데이터베이스 또는 데이터-조직을 검색하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 개시내용의 일 실시양태는 타간트가 결합 또는 공유 결합된 물품을 제공하는 단계, 식별을 위해 물품을 샘플링하는 단계, 고유의 추적가능한 데옥시리보핵산 (DNA) 타간트를 식별함으로써 물품이 진품임을 추적하거나 확인하는 단계를 포함하는 물품의 인증 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 고유 타간트는 고유 DNA 서열을 갖거나 갖지 않을 수 있으나 고유한 텔로머라제 기준 길이 및 타간트 복제 횟수를 갖는 DNA 타간트이다. 고유한 DNA 서열 및/또는 길이는 고유 타간트에 결합 또는 공유 결합된 물품에 해당하는 데이터 요소에 고유 DNA 서열 및/또는 길이를 매치시키는 데이터베이스에 저장된다. 데이터베이스는 다시 타간트가 검출된 태그화된 물품의 정체를 탐색, 추적, 인증 및 확인하기 위해 접근할 수 있는 컴퓨터 상에 배치될 수 있다.
키트
본 개시내용은 또한 핵산 타간트로 물품을 표시하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 DNA 타간트, 타간트 적용장치, 예를 들면 브러시 등, 타간트로 물품을 표시하는 것에 대한 지침, 본 개시내용의 타간트로 표시된 품목들을 열거하는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 서식; 로그온 ID 및 패스워드 또는 고유 식별자 코드 또는 시스템용 번호, 대상체가 타간트로 표시된 품목을 데이터베이스에 기록하는 것을 가능하게 하는 데이터베이스 또는 데이터 조직, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 간주되고자 하는 것은 아닌 본 개시내용의 실시양태에서, 고유 등록 코드/번호는 소유자에게 안전한 웹-기반 적용에 대한 개인적인 접근권을 제공할 수 있고, 여기서 개인은 타간트로 처리된 그의 물리적 물품 및 자산과 관련한 정보를 기록하거나 등록함으로써, 소유자를 그의 자산 또는 물리적 재산과 연결시킨다. 상기 안전한 웹-기반의 적용은 개인에 대한 정보, 예를 들면 비제한적으로 개인의 성명 또는 코드명 및 주소 뿐만 아니라, 개인에 대한 하나 이상의 일반적인 질문에 대한 답변을 기록할 수 있다.
타간트는 하나 이상의 용기, 예를 들면 비제한적으로 하나 이상의 바이알, 스크류 캡 튜브, 에펜도르프(Eppendorf) 튜브 등 내로 제공될 수 있다. 타간트가 하나 이상의 물품을 표시하는 데 사용될 수 있는 단일 사용 용기로서 제공될 수 있다는 것도 고려된다.
본원에서는 특정 실시양태들을 기술하고 있다. 물론, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 전기한 상세한 설명의 판독시, 이와 같이 기술되는 실시양태들의 변경이 떠오를 것이다. 숙련된 기술자라면, 해당될 경우 이러한 변경들을 어떻게 사용하는지, 그리고 본원에서 개시되는 실시양태들이 구체적으로 기술된 것과 다르게 실시될 수도 있다는 것을 알고 있을 것이다. 이에 따라, 본원에 첨부된 청구범위에서 언급되는 대상의 모든 변형 및 등가물이 본 개시내용의 영역 내에 포함된다. 또한, 본원에서 달리 나타내거나 아니면 문맥상 분명하게 부정되지 않는 한, 해당하는 모든 가능한 변경에서의 상기한 요소들의 모든 조합이 본 개시내용에 의해 포괄된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 공개, 특허 및/또는 특허 출원 (합하여 "참고문헌")을 참조한다. 언급된 참고문헌 각각은 구체적으로 언급된 그의 교시는 물론 그것이 개시하고 있는 모두가 개별적으로 본원에 참조로 포함된다.

Claims (1)

  1. a) 텔로미어를 포함하는 DNA 타간트를 함유하는 물품을 얻는 단계;
    b) a)의 품목을 처리하여 DNA 타간트의 적어도 일부를 꺼내는 단계;
    c) b)의 꺼낸 DNA 타간트를 증폭 과정에 적용하여 증폭된 DNA 타간트를 생성하고, 크기 및 또는 서열 분석에 의해 증폭된 DNA 타간트를 분석하는 단계; 및
    d) b)의 꺼낸 DNA 타간트 또는 c)의 증폭된 DNA 타간트를 복제에 적용하는 단계이며, 여기서 상기 DNA 타간트는 텔로미어를 갖고, 복제는 상기 DNA 타간트 텔로미어의 단축을 유발하는 것인 단계
    를 포함하는, 물품을 인증하거나 추적하기 위해 DNA 타간트로 물품을 처리하는 용도.
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