KR20220100405A - 도세탁셀 및 오스톨이 봉입된 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체 마이셀 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 도세탁셀 및 오스톨이 봉입된 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체 마이셀 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 수난용성 약물인 도세탁셀 및 오스톨을 특정 고분자 중합체에 봉입하여 마이셀을 형성함으로써 물에 대한 용해도를 개선시킨 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 암 치료용 약제학적 조성물은 도세탁셀에 오스톨을 특정 몰비(molar ratio)로 조합함으로써, 도세탁셀의 함량을 두드러지게 낮출 수 있는바 도세탁셀 과량 사용에 따른 다양한 부작용을 방지하고 도세탁셀 장기사용에 따른 약물 내성의 문제점을 극복할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기의 난용성 약물을 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체 고분자를 사용하여 마이셀에 캡슐화함으로써, 도세탁셀과 오스톨을 효과적으로 가용화시킬 수 있으므로 정맥 주사제로 유용하게 사용될 수 있다. 정맥 주사는 경구 투여 제형에 비하여 간 초회통과효과를 회피할 수 있어 불필요한 약물의 손실을 줄일 수 있으며, 경구 투여 제형에 비하여 생체이용률 또한 높일 수 있어 동일한 양의 약물로 높은 효과를 기대할 수 있는 효과적인 투여 방법이므로 이러한 제형의 개발은 도세탁셀 및 오스톨의 효과적인 투여를 가능하게 한다.

Description

도세탁셀 및 오스톨이 봉입된 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체 마이셀 및 이의 용도{Polyethylene glycol-polycaprolactone copolymer micelles containing docetaxel and ostol, and uses thereof}
본 발명은 도세탁셀 및 오스톨이 봉입된 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체 마이셀 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 수난용성 약물인 도세탁셀 및 오스톨을 특정 고분자 중합체에 봉입하여 마이셀을 형성함으로써 물에 대한 용해도를 개선시킨 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
폐암은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인 중 하나이다. 항암 치료를 위해 화학 요법과 같은 여러 요법이 개발되었으나, 이러한 치료법은 전신 독성과 연관이 있으며 종양 부위의 낮은 약물 농도는 다중 약물 내성을 유발할 수 있다. 또한 종양을 죽이려면 고용량 약물이 필요하여 환자에게 심각한 부작용을 일으킬 수 있다. 따라서 폐암에 대한 효능이 개선 된 새로운 화학 요법 및 약물 전달 시스템을 모색할 필요가 있다.
도세탁셀(docetaxel)은 유방암, 두 경부암, 위암, 전립선 암 및 비소 세포 성 폐암과 같은 여러 유형의 고형 종양을 치료하는 데 사용되는 탁산 기반 약물이다. 도세탁셀은 미세소관 분해를 억제하고 미세소관 응집을 방지하여 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 또한 종양 단백질 bcl-2의 인산화를 유도하여 세포사멸을 차단하는 것으로 알려져 있다. 그러나 상기와 같은 효과를 갖는 도세탁셀은 사용에 따른 다양한 부작용(호중구 감소, 감염, 빈혈, 백혈병, 혈소판 감소, 헤모글리빈 감소, 피부 발진, 신경계 무력증, 홍조, 발진, 요통, 호흡곤란, 발열 및 오한 등)및 약물 내성으로 인해 항암 효과가 감소라는 문제점이 있다. 또한 물에 대한 용해도가 낮아 임상적 적용이 제한되고 있다.
한편, 오스톨(osthol)은 벌사상자(Cnidium monnieri) 등 여러 식물에서 발견되는 천연 성분이며 항산화제, 항염증제, 항 골다공증 및 항 알레르기 효과를 가지고 있다. 그러나 상기 약물 또한 물에 대한 용해도가 낮아 임상적 적용이 제한되는 실정이다.
폴리소르베이트 80(Tween 80®), Cremophor EL®, 에탄올 (EtOH) 및 디메틸 아세트 아미드(DMA)와 같은 용매는 정맥 내 제형에서 난용성 약물을 용해시키는데 사용된다. 그러나, Tween 80®과 13% EtOH의 혼합물을 용매로 사용하여 도세탁셀을 용해시킨 제형인 Taxotere®는 용매의 독성으로 인해 급성과민반응 및 말초신경병증과 같은 부작용이 나타난 것으로 보고된 바 있으며(ten Tije, A.J.; Verweij, J.; Loos, W.J.; Sparreboom, A. Pharmacological effects of formulation vehicles : implications for cancer chemotherapy. Clin. Pharmacokinet. 2003, 42, 665-685, doi:10.2165/00003088-200342070-00005.), Tween 80®은 또한 비알레르기성 아나필락시스 및 발진과 같은 부작용을 나타내며 신장 및 간 독성과 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Schwartzberg, L.S.; Navari, R.M. Safety of Polysorbate 80 in the Oncology Setting. Adv. Ther. 2018, 35, 754-767, doi:10.1007/s12325-018-0707-z.).
이러한 배경 하에, 본 발명자는 도세탁셀의 부작용을 낮추고 난용성 약물의 물에 대한 용해성을 개선시킬 수 있는 조성물을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였으며, 그 결과 도세탁셀에 오스톨을 특정 몰비로 조합한 복합 제제를 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체 고분자를 사용하여 마이셀에 캡슐화하는 경우, 단일 제제 대비 시너지 효과를 발생할 뿐 아니라 난용성 약물을 효과적으로 가용화시킴으로써 정맥 주사 제형으로 유용하게 사용될 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2012-0104173호 한국공개특허 제10-2017-0132152호
본 발명의 목적은, 도세탁셀의 부작용을 낮추고 난용성 약물의 물에 대한 용해도가 효과적으로 개선됨으로써 정맥 주사용 제제로 사용할 수 있는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 도세탁셀(docetaxel) 및 오스톨(osthol)이 봉입된 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체 마이셀을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 도세탁셀(docetaxel) 및 오스톨(osthol)은 1:4의 몰비(molar ratio)로 조합될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 마이셀은 25nm 내지 35nm의 입자크기를 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 정맥 주사용 제제일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 아미노산, 당, 지질, 비타민, 전해질, pH 조정제, 안정화제, 삼투압 조정제 및 용해보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 자궁암, 나팔관암, 난소암, 위암, 뇌암, 두경부암, 직장암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 폐암, 비소세포폐암, 교모세포종, 피부암, 신장암, 방광암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 폐암일 수 있다.
본 발명에 따른 암 치료용 약제학적 조성물은 도세탁셀에 오스톨을 특정 몰비(molar ratio)로 조합함으로써, 도세탁셀의 함량을 두드러지게 낮출 수 있는바 도세탁셀 과량 사용에 따른 다양한 부작용을 방지하고 도세탁셀 장기사용에 따른 약물 내성의 문제점을 극복할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기의 난용성 약물을 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체 고분자를 사용하여 마이셀에 캡슐화함으로써, 도세탁셀과 오스톨을 효과적으로 가용화시킬 수 있으므로 정맥 주사제로 유용하게 사용될 수 있다. 정맥 주사는 경구 투여 제형에 비하여 간 초회통과효과를 회피할 수 있어 불필요한 약물의 손실을 줄일 수 있으며, 경구 투여 제형에 비하여 생체이용률 또한 높일 수 있어 동일한 양의 약물로 높은 효과를 기대할 수 있는 효과적인 투여 방법이므로, 이러한 제형의 개발은 도세탁셀 및 오스톨의 효과적인 투여를 가능하게 한다.
특히, 본 발명 조성물의 유효성분인 도세탁셀 및 오스톨이 봉입된 고분자 마이셀의 경우 폐에 집중적으로 축적되고 약물이 지속적으로 방출될 수 있음을 확인하였는바, 폐암 치료에 더욱 효과적일 수 있다.
도 1은 도세탁셀(docetaxel) 및 오스톨(osthol)이 봉입된 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체 마이셀의 제조 방법과 제조 후의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2a는 도세탁셀(docetaxel) 및 오스톨(osthol)이 봉입된 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체 마이셀의 투과전자현미경(TEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 2b는 도세탁셀(docetaxel) 및 오스톨(osthol)이 봉입된 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체 마이셀의 입자 분포를 나타낸 것이다.
도 3은 도세탁셀 및 오스톨의 단일 및 병용 제제에 따른 실험관 내(In vitro) 약물 방출 프로파일을 나타낸 것이다(A: 도세탁셀-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 및 도세탁셀 용액에서 도세탁셀 약물 방출 프로파일, B: 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 및 도세탁셀/오스톨 용액에서 도세탁셀 약물 방출 프로파일, C: 오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 및 오스톨 용액에서 오스톨 약물 방출 프로파일, D: 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 및 도세탁셀/오스톨 용액에서 오스톨 약물 방출 프로파일).
도 4는 도세탁셀 및 오스톨의 단일 및 병용 제제를 인체 폐암세포(A549)에 단기간(48시간) 처리에 따른 세포 독성을 분석한 결과이다(A: 도세탁셀 유리 약물, B: 도세탁셀-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀, C: 오스톨 유리 약물, D: 오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀, E: 도세탁셀/오스톨 유리 약물, F: 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀).
도 5는 도세탁셀 및 오스톨의 단일 및 병용 제제를 인체 폐암세포(A549)에 장기간(14일) 처리에 따른 암세포의 클론 형성정도를 분석한 결과이다(A: 도세탁셀 유리 약물, B: 도세탁셀-로딩된 PEG-b-PCL 마이셀, C: 오스톨 유리 약물, D: 오스톨-로딩된 PEG-b-PCL 마이셀, E: 도세탁셀/오스톨 유리 약물, F: 도세탁셀/오스톨-로딩된 PEG-b-PCL 마이셀).
도 6은 도세탁셀 및 오스톨의 단일 및 병용 제제를 랫트 정맥 내 투여한 후 약물의 혈장 농도 시간 프로파일을 나타낸 것이다(A: 도세탁셀-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 및 도세탁셀 용액에서 도세탁셀 약물의 프로파일, B: 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 및 도세탁셀/오스톨 용액에서 도세탁셀 약물의 프로파일, C: 오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 및 오스톨 용액에서 오스톨 약물의 프로파일, D: 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 및 도세탁셀/오스톨 용액에서 오스톨 약물의 프로파일).
도 7은 도세탁셀 및 오스톨의 단일 및 병용 제제를 랫트에 정맥 내 투여한 후 8시간 이내에 각 조직(간, 폐, 신장, 심장, 비장)에서 도세탁셀의 농도를 측정하여 나타낸 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 도세탁셀(docetaxel) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및 하기 화학식 2로 표시되는 오스톨(osthol) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 봉입된 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체 마이셀을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
<화학식 1>
Figure pat00001
<화학식 2>
Figure pat00002
상기 도세탁셀(docetaxel) 화합물은 유방암, 두 경부암, 위암, 전립선 암 및 비소 세포 성 폐암과 같은 여러 유형의 고형 종양을 치료하는 데 사용되는 탁산 기반 약물로서, 도세탁셀은 미세소관 분해를 억제하고 미세소관 응집을 방지하여 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 또한 종양 단백질 bcl-2의 인산화를 유도하여 세포사멸을 차단하는 것으로 알려져 있다.
상기 오스톨(osthol) 화합물은 벌사상자(Cnidium monnieri) 등 여러 식물에서 발견되는 천연 정유 성분으로서, 분자식 C15H16O3, 분자량 244를 가지며, 무색의 바늘 모양의 결정을 가지며 녹는점은 85℃이다. 물에 대한 용해도가 낮으며 클로로포름, 아세톤, 아세트산에틸, 메탄올 및 에탄올과 같은 용매에 잘 녹는다. 상기 오스톨 화합물은 항산화제, 항염증제, 항 골다공증 및 항 알레르기 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
상기 화학식 1 및 2로 표시되는 도세탁셀 및 오스톨 화합물은 시중에서 판매되는 것을 사용할 수 있으며, 또는, 종래 알려진 합성방법을 통해 직접 합성하여 사용할 수도 있다.
상기 화학식 1 및 2로 표시되는 도세탁셀 및 오스톨 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가 염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 상기 화학식 1 및 2의 구조를 갖는 도세탁셀 및 오스톨 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식의 구조를 갖는 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체 마이셀은 친수성 물질인 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 소수성 성분인 폴리카프로락톤 (polycaprolactone, PCL)의 중합 고분자인 PEG-b-PCL의 회합으로 이루어지며, 약물을 담지할 수 있는 담체 또는 약물을 전달할 수 있는 운반체(carrier)로서 역할을 한다.
상기, PEG-b-PCL은 단일 분자이지만 이 물질이 물에 용해되어 특정 농도 (critical micelle concentration, CMC)를 넘어서게 되면 구형의 마이셀을 형성한다. 마이셀이 형성되면, 친수성 부분인 껍질 (shall)과 소수성 부분인 핵(core)이 형성된다. 친수성 부분인 껍질은 고분자의 친수성 부분인 PEG로 이루어져 있으며 소수성 부분인 핵은 고분자의 소수성 부분인 PCL로 구성된다.
본 발명의 약물 전달용 조성물은 난용성 물질인 도세탁셀과 오스톨 화합물이 마이셀의 수층이나 친수성 부분에 거의 존재하지 않고, 소수성 부분인 핵에 분포함으로써 마이셀 내에 봉입되게 되는 방식으로 가용화가 이루어지게 된다.
본 발명은 마이셀의 제조 방법으로 박막수화법(thin-film hydration method)을 사용하였다. 간략하게는, 각 비율에 따른 도세탁셀과 오스톨을 50, 100, 150 mg의 PEG-b-PCL 고분자와 함께 1ml의 아세토니트릴 (acetonitrile)에 녹였다. 이를 둥근바닥 플라스크에 옮긴 후 EYELA® 회전증발기 (Bohemia, NY, USA)를 사용하여 섭씨 60℃에서 10분간 증발시켜 얇은 필름막을 만들었다. 박막 형성 후 증류수 1.4 mL를 사용하여 30분 동안 수화 (hydration)시켜 맑은 마이셀 용액을 만들었다. 이 용액을 13000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액만을 취하여 200 nm의 포어 사이즈를 가지는 셀룰로오스 필터(cellulose filter)에 여과하여 무균화함과 동시에 침전되는 물질을 제거하여 수화되지 않은 불순물을 제거하였다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 도세탁셀 및 오스톨은 1:4의 몰비(molar ratio)로 조합될 수 있다. 하기 실시예에서는 도세탁셀 및 오스톨을 다양한 몰비(1:2, 2:1, 1:4, 1:11)로 조합한 결과, 캡슐화 효율 (EE, %), 약물 로딩(DL, %), 입자 직경, 다분산지수 (PDI) 및 제타 전위와 같은 다양한 요인을 고려하였을 때 1:4의 몰비가 가장 최적의 비율임을 확인하였다.
상기와 같은 방법으로 제조된 본 발명의 마이셀은 평균 입자 직경이 25nm 내지 35nm일 수 있다. 참고로, 마이셀의 입자 크기가 100nm 미만인 경우 망상내피계(reticuloendothelial system, RES)에 의한 식균 작용 및 흡수를 피할 수 있기 때문에, 이에 따라 체순환이 연장될 수 있다. 따라서 본 발명의 마이셀은 입자크기가 충분히 작아 망상내피계에 의한 식균 작용 및 흡수를 피할 수 있는바, 체내에 오래 머무를 수 있어, 전달하고자 하는 약물(도세탁셀 및 오스톨)의 생체이용률을 높일 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 정맥 주사용 액제가 좋다.
본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분인 도세탁셀 및 오스톨 화합물은 수층에 녹아들 수 있게 하여 물을 이용한 정맥 주사제로 개발될 수 있다. 정맥 주사는 경구 투여 제형에 비하여 간 초회통과효과를 회피할 수 있어 불필요한 약물의 손실을 줄일 수 있으며, 경구 투여 제형에 비하여 생체이용률 또한 높일 수 있어 동일한 양의 약물로 높은 효과를 기대할 수 있는 효과적인 투여 방법이므로 이러한 제형의 개발은 도세탁셀 및 오스톨 화합물의 효과적인 투여를 가능하게 한다.
본 발명의 약제학적 조성물이 정맥 주사용 제제인 경우 일반적으로 정맥주사 제제 조성물에 포함되는 약제학적 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 정맥주사 제제 조성물은 아미노산, 당, 지질, 비타민, 전해질, pH 조정제, 안정화제, 삼투압 조정제 및 용해보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 아미노산 주사용 수액제, 당 주사용 수액제, 또는 지질 주사용 수액제의 구체적인 조성은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료효과를 나타낼 수 있는 암의 종류로는, 유방암, 대장암, 자궁암, 나팔관암, 난소암, 위암, 뇌암, 두경부암, 직장암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 폐암, 비소세포폐암, 교모세포종, 피부암, 신장암, 방광암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암 및 혈액암 등을 예시할 수 있으며, 바람직하게는 폐암이 좋다.
본 발명의 하기 실시예에서는 도세탁셀 및 오스톨의 단일 및 병용 제제의 정맥 주사 후 8시간이 경과한 시점에 주요 기관에서의 약물 분포를 살펴본 결과, 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀의 경우 다른 단일 제제 및 도세탁셀/오스톨 용액 대비 상대적으로 폐에 집중적으로 축적되고 약물이 지속적으로 방출될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 약제학적 조성물은 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류에 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 재료 및 방법
재료 및 시약
mPEG-b-PCL (Mw ~ 2,000 : 2,000Da)은 Polyscitech(West Lafayette, IN, USA)에서 구입하였다. 도세탁셀(docetaxel, DTX)과 제니스테인(genistein)은 LC Laboratories(Woburn, MA, USA)에서 구입하였다. 오스톨(osthol, OTH)은 대한민국 청주 충북대학교에서 수득했으며 천연물을 전문으로하는 이미경 교수가 확인하였다. 에탄올(EtOH) 및 아세토니트릴(ACN)은 Fisher Scientific Ltd. (Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. 증류수(DW)는 Tedia(Fairfield, OH, USA)에서 구입하였다. 메탄올(MeOH)은 Honeywell Burdick과 Jackson(한국, 울산)에서 구입하였다. 폴리소르베이트 80(Tween 80174;)은 Sigma-Aldrich Corp.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다 다른 모든 화학 물질은 분석 시약 등급 이상을 사용하였다.
세포주 및 세포 배양
A549 세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. Roswell Park Memorial Institute 배지(RPMI 1640), Dulbecco의 변형된 Eagle 배지, Dulbecco의 DPBS(phosphate-buffered saline) 및 트립신은 Corning Inc.(Corning, NY, USA)에서 구입하였다. Thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT)는 Sigma-Aldrich Corp.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 세포를 가습된 5% CO2 분위기에서 37℃에서 1%(w/v) 스트렙토마이신/페니실린 및 10%(v/v) 소태아혈청(FBS)이 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다.
고성능액체크로마토그래피(HPLC) 분석
2695 분리 모듈 및 2996 포토 다이오드 어레이가 장착된 Waters 고성능액체크로마토그래피 (HPLC) 시스템 (Milford, Massachusetts, USA)을 사용하여 측정하였다. The Fortis C18 크로마토그래피 컬럼 (5μm, 4.6 × 250 mm)을 사용하였으며, 분석 동안 30℃에서 유지하였다. 도세탁셀, 오스톨 및 제니스테인(내부 표준물질, IS)은 아세토니크릴/물(70:30, v/v)로 구성된 이동상을 갖는 등용매 모드를 사용하여 용출하였다. 샘플 주입 볼륨은 10uL이었으며, 유동 속도는 이동상에서 1.0mL/min이었다. 도세탁셀, 오스톨 및 제니스테인(내부 표준물질, IS)는 각각 230nm, 320nm, 259nm 파장에서 검출되었다. 도세탁셀, 오스톨 및 제니스테인(내부 표준물질, IS)의 정체시간은 각각 4.7, 8.6 및 3.5 분이었다. 각 약물의 농도는 피크 면적을 검량선과 비교하여 계산되었다.
인 비트로( In Vitro ) 세포독성 에세이
A549 세포에서 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀의 세포독성은 MTT 분석에 의해 평가되었다. 자세하게는, A549 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 5,000개 세포의 밀도로 분주하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, 배지를 제거하고 세포를 도세탁셀 유리 약물, 오스톨 유리 약물, 도세탁셀/오스톨 유리 약물, 도세탁셀-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀, 오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 또는 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀을 각 농도에 따라 처리하였다(n = 6). 약물이 포함되지 않은 신선한 배지를 대조군으로 사용하였다. 세포를 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 48 시간 후, 배지를 제거하고 100 μL의 MTT 용액 (0.5 mg/mL)을 첨가한 다음 4 시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 100 μL의 디메틸 설폭사이드를 첨가하고, 플레이트를 200 rpm에서 10 분 동안 흔들었다. 흡광도는 마이크로 플레이트 리더 (Spectra Max ID3, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 540nm에서 측정되었다. 모든 데이터 처리는 GraphPad Prism 5 소프트웨어 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 분석되었다.
조합 지수(combination index, CI) 분석
CI 분석은 약물 간의 약물 상호작용을 평가하기 위해 Chou의 방법에 따라 수행되었다(Chou, T.C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Res. 2010, 70, 440-446, doi:10.1158/0008-5472.can-09-1947.).
간략하게는, 도세탁셀 및 오스톨의 CI 값은 다음 방정식을 사용하여 계산되었다.
Combination index (CI) = (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2
여기서 (Dx)1 및 (Dx)2는 각각 약물 1과 약물 2의 억제 농도이며, (D)1 및 (D)2는 두 약물의 조합에서 각 약물의 억제 농도이다. CI>1은 길항 작용을, CI<1은 상승 작용을, CI=1은 부가 효과를 나타낸다.
집락형성 분석법(clonogenic assay)
A549 세포를 6 웰 플레이트에 웰당 200 개 세포의 밀도로 분주하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 부착을 확인한 후, 세포를 도세탁셀 유리 약물, 오스톨 유리 약물, 도세탁셀/오스톨 유리 약물, 도세탁셀-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀, 오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 또는 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀로 처리했다. 2주 후 배지를 제거하고 크리스탈 바이올렛 (0.5 % w/v)을 포함하는 에탄올 수용액 1mL를 각 웰에 처리하여 30분간 방치한 다음, 깨끗한 물로 씻어내고 염색된 콜로니의 수를 카운팅하였다. 집락 형성 비율은 아래 방정식을 사용하여 계산되었다.
집락 형성 (% of control) = 약물 처리 후 콜로니 수/대조군(PBS) 콜로니 수×100
도세탁셀 용액, 오스톨 용액, 도세탁셀/오스톨 용액 제조
용액 제조를 위하여 Tween 80®, EtOH 및 DW 각각을 25 %, 10 % 및 65 %의 비율로 조합하여 용매를 준비하였다. 도세탁셀 용액은 상기 용매에 도세탁셀 약물을 혼합하여 4 mg/mL 농도로 제조하였으며, 오스톨 용액은 상기 용매에 오스톨 약물을 혼합하여 5 mg/mL 농도로 제조하였고, 도세탁셀/오스톨 용액은 상기 용매에 도세탁셀/오스톨 약물을 혼합하여 4 mg/mL 농도로 제조하였다.
도세탁셀 유리 약물, 오스톨 유리 약물, 도세탁셀/오스톨 유리 약물 제조
도세탁셀 및 오스톨 각각의 유리 약물을 제조하기 위하여, 도세탁셀 및 오스톨 각각의 약물을 5 mg씩 100 μL의 DMSO에 녹이고 1000배 희석을 하여 50 μg/mL를 시작농도로 제조하였다.
도세탁셀/오스톨 유래 약물을 제조하기 위하여, 도세탁셀/오스톨 약물 6.6 mg을 100 μL의 DMSO에 녹이고 1000배 희석을 하여 66 μg/mL를 시작농도로 제조하였다.
도세탁셀/오스톨-로딩된 고분자 마이셀의 제조
친수성 물질인 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG)과 소수성 성분인 폴리카프로락톤 (polycaprolactone, PCL)의 중합 고분자인 PEG-b-PCL의 회합으로 이루어진 고분자 마이셀을 사용하여 두 약물을 가용화했다. PEG-b-PCL은 단일 분자이지만 이 물질이 물에 용해되어 특정 농도 (critical micelle concentration, CMC)를 넘어서게 되면 구형의 마이셀을 형성한다. 마이셀이 형성되면, 친수성 부분인 껍질 (shall)과 소수성 부분인 핵(core)이 형성된다. 친수성 부분인 껍질은 고분자의 친수성 부분인 PEG로 이루어져 있으며 소수성 부분인 핵은 고분자의 소수성 부분인 PCL로 구성된다. 난용성 물질인 도세탁셀과 오스톨은 수층이나 친수성 부분에 거의 존재하지 않고, 소수성 부분인 핵에 분포함으로써 마이셀 내에 봉입되게 되는 방식으로 가용화가 이루어지게 된다.
나노 가용화 마이셀 제제의 제조 방법으로 박막수화법(thin-film hydration method)을 사용하였다. 간략하게는, 각 비율에 따른 도세탁셀과 오스톨을 50, 100, 150 mg의 PEG-b-PCL 고분자와 함께 1ml의 아세토니트릴 (acetonitrile)에 녹였다. 이를 둥근바닥 플라스크에 옮긴 후 EYELA® 회전증발기 (Bohemia, NY, USA)를 사용하여 섭씨 60℃에서 10분간 증발시켜 얇은 필름막을 만들었다. 박막 형성 후 증류수 1.4 mL를 사용하여 30분 동안 수화 (hydration)시켜 맑은 마이셀 용액을 만들었다. 이 용액을 13000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액만을 취하여 200 nm의 포어 사이즈를 가지는 셀룰로오스 필터(cellulose filter)에 여과하여 무균화함과 동시에 침전되는 물질을 제거하여 수화되지 않은 불순물을 제거하였다.
마이셀의 물리화학적 특성
도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀의 입자 크기와 제타 전위는 동적광산란(DLS) 장치 (Litesizer 500, Anton Paar, Graz, Austria)를 사용하여 측정하였다. 제조된 마이셀 용액을 측정 전에 10배 희석하였다. mPEG-b-PCL 마이셀의 약물 함량은 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였으며, 20 μL의 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 용액을 180 μL의 ACN에 용해시켰다. 도세탁셀 및 오스톨의 캡슐화 효율 (EE, %) 및 약물 로딩(DL, %)은 다음 방정식을 이용하여 계산하였다.
DL% = (마이셀 단위의 약물 중량/공급 중합체 및 약물의 중량)×100
EE% = (마이셀 내 약물의 중량/공급 약물의 중량)×100
도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀의 형태는 JEM-2100 투과전자현미경(TEM, JEOL Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였다. TEM 측정을 위한 샘플 준비 절차에서 희석된 마이셀 용액을 200-mesh formvar 코팅 구리 그리드에 떨어뜨리고 60℃의 건조 오븐에서 12 시간 동안 건조시켰다. 각 샘플 분석의 결과는 3 개의 개별 실험의 평균±표준편차로 나타내었다.
인 비트로( In Vitro ) 약물 방출 에세이
마이셀에서 약물의 시험관내(In Vitro) 방출 거동을 336시간에 걸쳐 평가하였다. 이때, 방출 매질(release medium)로서 포스페이트 완충식염수(PBS, pH 7.4)를 이용한 투석법을 사용하여 평가하였다.
간략하게는, 도세탁셀 용액, 오스톨 용액, 도세탁셀/오스톨 용액, 도세탁셀-로딩된 mPEG-b-PCL, 오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 및 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 샘플 각각을, pre-wetted dialysis membrane bag (MWCO 20 kD)에 삽입하였다. 상기 pre-wetted dialysis membrane bag은 묶은 후, 37℃의 핫 플레이트 교반기 상에서 2.0L 방출 미디엄에 넣었다. 용액은 대조군과 동일한 용매 (Taxotere®)를 사용하여 각각 Tween 80®, EtOH 및 DW의 25%, 10% 및 65% 비율로 준비되었다. 인 비트로(In Vitro) 방출 실험과 약동학 실험 모두에서 도세탁셀 용액과 마이셀을 4mg/mL 농도로 사용하였으며, 오스톨을 5mg/mL 농도로 사용하였다. 각 샘플링 시점(0, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 168, 240 및 336 h)에서, 각각의 샘플 20L를 수집하고, 아세토니크릴로 10배 희석한 다음, 도세탁셀 및 오스톨 농도를 HPLC로 측정하였다. PBS 방출 배지는 8, 72, 144, 216 및 288 시간에 새로운 배지로 교체되었다. 모든 실험은 세 번 반복하여 수행하였다.
약물동태 연구
모든 동물 실험은 충북대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았다(CBNUR-1405-20, 2020 년 7 월 23 일). 수컷 Sprague-Dawley 랫트(7 주령)는 Orient Bio Inc.(Seongnam, Korea)에서 구입하여 모든 동물 실험에 사용하였다. 랫트는 물과 음식에 자유롭게 접근할 수 있는 통풍 케이지에 보관하였다. 랫트는 도세탁셀 용액, 오스톨 용액, 도세탁셀/오스톨 용액, 도세탁셀-로딩된 mPEG-b-PCL, 오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 및 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀의 6 개 그룹으로 나누었다. 마이셀은 30nm 크기로 주입되었고 용액은 상기 인 비트로(In Vitro) 약물 방출 에세이에서 언급한 것과 동일한 용매를 사용하였다. 각 샘플을 정맥 주사하였으며, 도세탁셀 및 오스톨은 각각 10 mg/kg, 12 mg/kg의 용량으로 투여하였다. 약물 투여 후 5, 15, 30, 60, 120, 240, 480 분에 500 μL의 혈액을 채취하고(안와 뒤 신경총에서 채취) 헤파린 튜브에 넣었다. 그 후, 시료를 즉시 16,600 ×g에서 5 분 동안 원심분리하여 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 약동학적 분석을 위해 비구획적 모델을 사용하여 마이셀에서 약물의 초기 혈액 농도(initial blood concentration, C0), 혈중농도-시간곡선하면적(concentration-time curve, AUC), 겉보기 분포 용적(apparent volume of distribution, Vd) 및 총 청소율(total clearance, CLt)과 같은 상대적인 파라미터를 계산하였다. 약동학적 매개 변수 계산을 위한 곡선 피팅(curve fitting)은 Sigma Plot V 10.0(Systat Software, San Jose, CA, USA)을 사용하여 수행되었다. 모든 실험은 세 번 반복하여 수행하였다.
생체 내 분포
생체 분포 연구는 각각의 용액 및 마이셀 샘플을 랫트에 정맥 주사한 후 수행되었다. 정맥 주사 후 8시간이 경과하였을 때, 랫트는 이산화탄소(CO2)를 사용하여 안락사시키고 간, 비장, 심장, 폐, 신장 및 근육 조직을 해부하였다. 조직 샘플을 식염수로 세척하고, 종이 타월로 닦아 과량의 유체를 제거하고, 무게를 측정한 다음, 분석할 때까지 약 -70℃에서 보관하였다.
HPLC 분석을 위한 생물 시료 전처리
동결된 생물학적 샘플을 실온에서 해동시켰다. 200 μL의 혈장 샘플에 400 μL의 메탄올(MeOH)과 50 μL의 제니스테인(내부표준)을 첨가한 후 16,600 × g에서 5 분간 원심분리하였다. 상층액을 0.2 μm 셀룰로오스 필터를 통해 여과하고 HPLC 시스템에 주입하였다. 균질화 방법을 사용하여 생체 분포 샘플을 평가하였다. 간략하게는, 각 조직 샘플(간, 비장, 심장, 폐, 신장 및 근육)을 Teflon pestle를 갖는 glass Potter-Elvehjem-type homogenizer(Ultra Turrax T-25; IKAWorks Inc., Staufen, Germany)로 균질화하였다. 수집된 200 μL의 샘플에 메탄올(MeOH) 및 제니스테인(내부표준)을 첨가하고 상기에서 설명한 것과 동일한 방식으로 전처리하여 도세탁셀 및 오스톨의 농도를 HPLC로 분석하였다.
통계분석
모든 실험은 3반복 수행되었으며 모든 데이터 값은 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. GraphPad Prism v 5.0의 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행하였으며, P <0.05의 값은 통계학적 유의성이 있는 것으로 평가되었다.
2. 결과
도세탁셀과 오스톨의 상승적 상호작용 평가
도세탁셀 및 오스톨의 조합에 따른 잠재적인 상승 효과는 도세탁셀 및 오스톨의 50% 억제 농도(IC50) 값을 서로 다른 비율로 측정하고 조합 지수(CI) 값을 분석하였다. IC50 값은 약물 반응을 수치화하는 방법 중 하나로, 약물을 투여하였을 때 세포의 활성도가 절반으로 떨어지는 순간의 최대 농도를 가리킨다.
하기 표 1은 도세탁셀과 오스톨의 IC50 값을 각 비율로 나타낸 것으로 조합 비율에 따라 세포 증식 억제 효과가 다양함을 알 수 있었다. 또한, 도세탁셀 및 오스톨의 최적 비율을 결정하기 위해, 상기 두 약물의 몰비(molar ratio)를 11:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:11 비율로 하여 조합 지수(CI) 값을 계산하였다. 조합 지수(CI) 분석 결과, 상기 두 약물이 11:1과 4:1의 몰비(molar ratio)에서 각각 1.85와 2.97의 값을 얻었으며, 이 값은 CI가 1보다 크므로 길항적 상호작용을 나타내었다. 반면에, 상기 두 약물이 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:11의 몰비(molar ratio)에서 조합 지수(CI)가 1 미만으로 나타나, 상승적 상호작용을 나타내었다. 따라서 상승적 상호작용를 나타내는 몰비를 선택하여, 후속 약물 탑재 mPEG-b-PCL 마이셀의 제조에 사용하였다.
도세탁셀 및 오스톨의 다양한 몰비(molar ratio)에 따른 조합 지수(CI) 값
도세탁셀:오스톨
(molar ratio)		 IC50(nM) CI 값
도세탁셀 오스톨
11:1 1214 ± 705 110 ± 64.1 1.85
4:1 1947 ± 550 487 ± 137 2.97
2:1 131 ± 60.9 65.5 ± 30.5 0.20
1:1 404 ± 206 404 ± 206 0.62
1:2 343 ± 278 686 ± 557 0.53
1:4 244 ± 101 975 ± 402 0.38
1:11 68.8 ± 23.1 757 ± 232 0.11
도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀의 제조 및 특징
하기 표 2는 도세탁셀 및 오스톨이 로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀의 캡슐화 효율 (EE, %), 약물 로딩(DL, %), 입자 직경, 다 분산 지수(PDI) 및 제타 전위와 관련된 결과를 나타낸 것이다. 도세탁셀 및 오스톨이 2:1의 몰비(molar ratio)에서 오스톨의 EE(%) 값은 82.2 ~ 109%로 측정되어, 다른 몰비 보다 높은 수치를 보여주었지만, 도세탁셀의 EE(%) 값은 54.0 ~ 67.4%로 측정되어 다른 몰지 대비 훨씬 낮은 수치를 보여주었다. 나머지 몰비(1:2, 1:4, 1:11)의 경우 도세탁셀은 EE(%) 값이 69.1 ~ 76.2% 범위로 나타났으며, 오스톨은 EE(%) 값이 74.5 ~ 82.3% 범위로 나타나, 유사한 전체 패턴을 보였다. 또한 폴리머의 양이 증가함에 따라 전체 약물 로딩 값이 감소하는 것으로 나타났다.
따라서 다양한 요인을 고려할 때, 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 제조에 있어서, 최적의 비율로 폴리머 50mg을 사용한 1:4 몰비(molar ratio)를 선택하고, 약물의 양을 두 배로 늘린 제형을 최종 제형으로 선택하여 추가 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo) 연구에 사용하였다.
또한, 투과전자현미경 (TEM) 이미지에서 도세탁셀/오스톨의 몰비가 1:4 인 mPEG-b-PCL 마이셀의 경우 균일한 구형을 나타내는 것을 확인하였으며(도 2a 참조), 마이셀 입자 크기 분포 그래프에서는 각각의 마이셀의 크기가 100nm 미만인 것으로 나타났다(도 2b 참조). 이러한 결과는 입자 크기가 100nm 미만인 마이셀이 망상내피계에 의한 흡수가 매우 낮고 EPR(Permeability and Retention) 효과를 높여 종양으로 축적될 수 있음을 나타낸다.
참고로, 종양에서 마이셀과 같은 나노 약물 전달 시스템은 주로 향상된 투과성 및 보유 효과를 통해 종양에 축적된다. 입자 크기가 50-60 nm인 마이셀은 일반적으로 종양 조직에 침투하는 능력이 뛰어나며 또한, 마이셀의 입자 크기가 100nm 미만인 경우 망상내피계(reticuloendothelial system, RES)에 의한 식균 작용 및 흡수를 피할 수 있기 때문에, 이에 따라 체순환이 연장될 수 있다. 따라서 마이셀의 입자 크기가 충분히 작아 망상내피계에 의한 식균 작용 및 흡수를 피할 수 있는 경우, 체내에 오래 머무를 수 있어, 전달하고자 하는 약물의 생체이용률을 높일 수 있다.
도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀의 특성(n=3, 평균±표준편차)
몰비 중합체 양(mg) DTX 양 (mg) OTH 양 (mg) DTX 캡슐화 효율 (EE %) OTH 캡슐화 효율(EE %) DTX 약물 로딩 (DL %) OTH 약물 로딩(DL %) 입자 크기 (nm) 다분산지수 (PDI) 제타전위(mV)
DTX:OTH
1:2		 50 4 2.4 73.4 ± 9.81 80.8 ± 12.6 5.43 ± 0.73 3.70 ± 0.58 30.9 ± 0.85 0.13 ± 0.65 0.97 ± 0.21
100 4 2.4 76.2 ± 7.27 82.3 ± 10.4 2.93 ± 0.28 1.93 ± 0.24 30.9 ± 0.99 0.16 ± 4.00 2.17 ± 1.05
150 4 2.4 69.6 ± 5.72 77.3 ± 11.8 1.81 ± 0.15 1.22 ± 0.19 30.1 ± 1.06 0.08 ± 2.31 2.40 ± 1.21
DTX:OTH
2:1		 50 6.62 1.0 54.0 ± 18.1 109 ± 4.16 6.31 ± 2.12 2.14 ± 0.08 31.3 ± 1.52 0.12 ± 7.75 -1.03 ± 2.12
100 6.62 1.0 65.4 ± 5.31 82.2 ± 11.7 4.06 ± 0.33 0.81 ± 0.12 31.4 ± 2.22 0.12 ± 7.54 1.73 ± 0.76
150 6.62 1.0 67.4 ± 0.79 95.8 ± 32.6 2.85 ± 0.03 0.63 ± 0.22 31.1 ± 0.97 0.12 ± 4.04 6.07 ± 2.37
DTX:OTH
1:4		 50 3 3.6 72.2 ± 10.8 77.2 ± 11.8 4.09 ± 0.61 5.19 ± 0.80 31.4 ± 0.20 0.08 ± 0.38 0.53 ± 1.46
100 3 3.6 70.5 ± 5.01 78.1 ± 5.93 2.05 ± 0.15 2.72 ± 0.21 31.6 ± 0.97 0.10 ± 1.14 1.37 ± 2.80
150 3 3.6 74.2 ± 8.55 80.6 ± 1.95 1.45 ± 0.17 1.89 ± 0.05 31.5 ± 1.29 0.13 ± 0.82 4.03 ± 2.32
50 6 7.2 72.2 ± 4.53 78.6 ± 2.38 7.74 ± 0.49 9.90 ± 0.30 33.3 ± 0.28 0.09 ± 0.67 -0.60 ± 0.78
150 6 7.2 69.1 ± 4.27 77.7 ± 3.47 2.66 ± 0.16 3.56 ± 0.16 33.5 ± 2.25 0.17 ± 5.55 2.67 ± 0.40
DTX:OTH
1:11		 50 2 6.6 74.1 ± 5.25 78.9 ± 1.68 2.85 ± 0.20 9.20 ± 0.20 32.6 ± 0.53 0.11 ± 2.35 -0.47 ± 0.70
100 2 6.6 70.5 ± 3.11 76.8 ± 5.03 1.38 ± 0.06 4.75 ± 0.31 32.4 ± 0.36 0.10 ± 2.81 3.47 ± 0.96
150 2 6.6 70.8 ± 5.44 74.5 ± 5.86 0.93 ± 0.07 3.14 ± 0.25 32.2 ± 1.00 0.16 ± 3.59 4.17 ± 1.03
인 비트로( In Vitro ) 약물 방출 에세이
본 발명의 나노 가용화 마이셀의 용출 시험을 시험관 수준 (in vitro)에서 진행하였다. 용출 시험은 pH 7.4 , 섭씨 37℃ 조건의 PBS 용액 내에서 336시간까지 시행하였다. 도세탁셀 및 오스톨의 단일 및 병용 제제에 따른 약물 방출 프로파일 결과는 도 3에서 자세히 나타내었다.
도 3A는 도세탁셀-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 및 도세탁셀 용액에서 도세탁셀 약물 방출 프로파일을 나타낸 것이다. 6시간이 경과했을 때 도세탁셀-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀에서 약물 방출 속도는 4.4%였으며, 도세탁셀 용액에서 약물의 방출 속도는 50.5%였다 (P <0.05). 336 시간이 경과했을 때 도세탁셀 용액에서 약물 방출은 96.9%인 반면, 도세탁셀-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀에서는 약물 방출이 70.3%인 것으로 나타나, 도세탁셀 용액 대비 도세탁셀-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀에서 약물 방출이 느리게 방출되는 것을 확인할 수 있었다(P <0.05).
도 3B는 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 및 도세탁셀/오스톨 용액에서 도세탁셀 약물 방출 프로파일을 나타낸 것이다. 72 시간이 경과했을 때 도세탁셀/오스톨 용액의 경우 도세탁셀 방출 속도가 82.3%였고, 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀의 방출 속도는 47.4%인 것으로 나타났다. 마이셀에서의 약물 방출이 용액보다 매우 느린 것을 확인할 수 있었다.
도 3C는 오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 및 오스톨 용액에서 오스톨 약물 방출 프로파일을 나타낸 것이다. 자세하게는, 72 시간이 경과했을 때 오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀에서 오스톨의 방출률은 73.5% 였고, 오스톨 용액에서 오스톨의 방출률은 81.5%였다. 마이셀에서의 약물 방출이 용액보다 매우 느린 것을 확인할 수 있었다.
도 3D는 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀 및 도세탁셀/오스톨 용액에서 오스톨 약물 방출 프로파일을 나타낸 것이다. 72 시간이 경과했을 때 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀에서 오스톨의 방출률이 63.2%였고, 도세탁셀/오스톨 용액에서 오스톨의 방출률이 80.6%(P <0.05)인 것으로 나타나, 마이셀에서의 약물 방출이 용액보다 느린 것을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과를 통해, 마이셀의 약물 방출 속도가 용액의 방출 속도보다 느리다는 것을 보여주었다. 이러한 결과는 약물이 마이셀에 갇혀있어 약물의 빠른 방출을 제한함을 시사한다. 또한 난용성 약물이 캡슐화된 마이셀 운반체는 약물의 용해도를 증가시키고 약물 방출을 느리게 하는 것으로 나타났다.
A549 세포에서 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀의 세포 독성
본 발명의 나노 가용화 마이셀의 세포 독성 연구 실험으로 단기간 (48시간)동안 MTT assay를 시험관 수준 (in vitro)에서 진행하여 암세포의 동태를 확인하였으며, 그 결과는 도 4에서 자세히 나타내었다.
도세탁셀 유리 약물의 IC50 값은 657.3 nM이며(도 4A 참조); 도세탁셀-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀의 IC50 값은 1664 nM이고(도 4B 참조); 오스톨 유리 약물의 IC50 값은 121741 nM이며(도 4C 참조); 오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL의 IC50 값은 863565 nM이고(도 4D 참조); 도세탁셀/오스톨 유리 약물의 IC50 값은 1219 nM이며(도 4E 참조), 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀의 IC50 값은 2852 nM인 것으로 나타났다(도 4F 참조).
전체적인 IC50 값의 결과로 도세탁셀과 오스톨 두 약물 모두 유리 약물의 IC50 값이 마이셀보다 낮음을 확인하였다. 이러한 결과는 방출 프로파일과 관련하여 설명할 수 있는데, 도세탁셀과 오스톨을 병용한 용액에서 도세탁셀의 48시간 방출률은 77.2%인 반면 도세탁셀/오스톨-로딩된 PEG-b-PCL 마이셀에서 도세탁셀의 방출률은 36%에 불과했다. 유사하게, 도세탁셀과 오스톨을 병용한 용액에서 오스톨의 48시간 방출 속도는 74.4%였고, 도세탁셀/오스톨-로딩된 PEG-b-PCL 마이셀에스 오스톨 방출률은 44.8%에 불과했다. 이러한 이유로 48시간 동안 마이셀에서 약물의 느린 방출 때문에 마이셀의 세포독성 효과는 유리 약물보다 더 낮았음을 알 수 있었다. 또한, 유리 약물은 수동 확산에 의해 세포막으로 들어갈 수 있지만 마이셀은 세포 내 이입 과정이 더 느리기 때문에 이로 인한 약물 방출 조절이 암세포 사멸 과정을 지연시키는 것으로 판단되었다.
한편, 본 실험에서 유리 약물의 용매로 사용한 DMSO(Dimethyl sulfoxide)는 세포 실험에 있어서 난용성 물질을 녹이는데 많이 사용되는 유기용매로서, 독성이 강하여 실질적으로 인체 적용되는 약물에 적용하기에는 어려운 문제점이 있다. 이와는 대조적으로 본 발명의 마이셀은 수난용성 약물인 도세탁셀 및 오스톨을 생분해성 소재인 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체에 봉입하여 물에 잘 녹을 수 있도록 함으로써, 인체 안전한 특성을 갖는다.
집락형성 분석법
본 발명의 나노 가용화 마이셀의 세포 독성 연구 실험으로 장기간 (14일)에 걸쳐 세포 독성을 평가하기 위해 다양한 농도에서 IC50 값을 계산하여 클론 생성 분석을 수행하였다. 참고로, 집락형성 분석법은 항암제의 인 비트로(in vitro) 약효 검색 방법으로서 약물의 처치 후 대상 세포의 클론 형성정도를 측정하여 약효를 측정하는 방법이다.
그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 도세탁셀과 오스톨의 단일 제제에서 마이셀의 콜로니 억제율은 유리 약물과 비교할 때 콜로니 억제 효과가 거의 없는 것으로 나타난 반면, 상기 두 약물을 병용하는 경우 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀이 도세탁셀/오스톨 유리 약물 대비 약 3.7 배 더 높은 콜로니 형성 억제 효과를 보여주었다.
상기와 같은 결과를 통해, 이는 복합 요법이 단일 약물 요법보다 암세포 억제에 더 효과적임을 확인할 수 있었다.
생체 내( in vivo ) 약물동태
본 발명의 생체 내 약동학 연구에서 도세탁셀 및 오스톨의 단일 및 병용 제제는 혈장 시간 농도 그래프 및 약동학 매개 변수를 사용하여 분석되었으며, 그 결과는 도 6 및 표 3에 자세히 나타내었다.
단일 제제 도세탁셀 용액 및 마이셀은 각각 222 및 205의 AUC 값을 가졌고, 단일 제형 오스톨 용액 및 마이셀은 각각 274 및 177의 AUC 값을 나타내어 용액이 마이셀보다 높은 AUC 값을 가지는 것으로 나타났다. 이 현상은 마이셀의 도세탁셀과 오스톨이 약물의 정맥 투여 후 혈장에서 조직으로 빠르게 분포하기 때문에 AUC를 낮춘 것으로 생각된다. 또한, 용액이 마이셀보다 높은 AUC를 갖는 이유는 용액 군에서 약물과 지방산 사슬의 소수성 그룹 사이의 상당한 상호 작용으로 인해 약물의 높은 혈장 축적 때문일 수 있다. 반면에 소수성 상호 작용이 약한 마이셀의 내부 코어는 약물을 포획하기가 어려워 혈장에서 약물의 AUC를 낮추는 것으로 생각된다.
그러나 단일 마이셀과 병용 마이셀을 비교한 결과, 도세탁셀과 오스톨을 함께 사용하면 AUC 값이 증가하고 CLt 값이 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 단일 제제를 사용할 때보다 도세탁셀과 오스톨을 병용하여 사용할 때 생체 이용률이 향상되었음을 나타낸다.
도세탁셀 및 오스톨의 정맥 주사 후 약동학적 매개 변수
Parameters DTX 용액 DTX 마이셀 OTH 용액 OTH 마이셀 DTX/OTH 용액에서 DTX DTX/OTH-로딩된 마이셀에서 DTX DTX/OTH 용액에서 OTH DTX/OTH-로딩된 마이셀에서 OTH
Dose (μg·kg-1) 10,000 10,000 12,000 12,000 10,000 10,000 12,000 12,000
AUC (min·μg·mL-1) 222 ± 16.6 205 ± 43.3 274 ± 41.6 177 ± 23.5 183 ± 11.7 244 ± 42.4 246 ± 7.3 212 ± 24.2
CLt (mL·kg-1·min) 45.2 ± 3.44 50.1 ± 9.47 44.6 ± 7.37 68.5 ± 9.3 54.8 ± 3.65 41.8 ± 7.4 48.7 ± 1.45 57.1 ± 6.21
생체 내 분포
본 발명의 생체 내 분포 연구에서 도세탁셀 및 오스톨의 단일 및 병용 제제의 정맥 주사 후 8시간이 경과한 시점에 주요 기관에서의 약물 분포를 살펴보었다.
그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 도세탁셀은 일부 기관에서 검출되었지만 오스톨은 모든 기관에서 검출되지 않았다. 도세탁셀은 용액과 마이셀 모두에서 폐와 비장에 분포하는 것으로 밝혀졌다. 두 기관 중 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀의 도세탁셀 농도는 폐에서 가장 높았고, 비장에서는 폐에서 보다 1.3 배 낮은 것으로 나타났다. 또한 단일 제제의 마이셀에 비해, 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀을 정맥 주사한 랫트의 비장과 폐 모두에서 더 많은 양의 도세탁셀이 검출되었다.
상기와 같은 결과를 통해, 도세탁셀/오스톨-로딩된 mPEG-b-PCL 마이셀의 경우 다른 단일 제제 및 도세탁셀/오스톨 용액 대비 상대적으로 폐에 집중적으로 축적되고 약물이 지속적으로 방출될 수 있음을 확인하였는바, 폐암 치료에 효과적일 것으로 판단되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
DTX: Docetaxel
OTH: Osthol
mPEG-b-PCL: Methoxy poly(ethylene glycol)-b-poly(caprolactone)
EE: Encapsulation efficiency
DL: Drug loading
CI: Combination index
LOD: Limit of detection
PDI: Poly-dispersity index
RES: Reticuloendothelial system

Claims (7)

  1. 도세탁셀(docetaxel) 및 오스톨(osthol)이 봉입된 폴리에틸렌 글리콜-폴리카프로락톤 공중합체 마이셀을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 도세탁셀(docetaxel) 및 오스톨(osthol)은 1:4의 몰비(molar ratio)로 조합되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 마이셀은 25nm 내지 35nm의 입자크기를 갖는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 정맥 주사용 제제인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 아미노산, 당, 지질, 비타민, 전해질, pH 조정제, 안정화제, 삼투압 조정제 및 용해보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 대장암, 자궁암, 나팔관암, 난소암, 위암, 뇌암, 두경부암, 직장암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 폐암, 비소세포폐암, 교모세포종, 피부암, 신장암, 방광암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 암은 폐암인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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