KR20220097423A - 뇌수막뇌염 유발 진균의 뇌-혈관 장벽 통과 및 뇌-내부 생존 관련 유전자의 용도 - Google Patents

뇌수막뇌염 유발 진균의 뇌-혈관 장벽 통과 및 뇌-내부 생존 관련 유전자의 용도 Download PDF

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정은지
이종승
이경태
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홍주현
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Abstract

본 발명은 뇌-혈관 장벽(Brain-blood barrier) 통과에 관여하는 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 항진균제 스크리닝 방법, 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis) 진단용 바이오마커 조성물, 이의 조성물을 포함하는 진단용 키트 및 상기 단백질에 대한 저해제를 포함하는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

뇌수막뇌염 유발 진균의 뇌-혈관 장벽 통과 및 뇌-내부 생존 관련 유전자의 용도
본 발명은 뇌-혈관 장벽(Brain-blood barrier, BBB로 통칭함) 통과에 관여하는 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 것을 포함하는 항진균제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis) 진단용 바이오마커 조성물, 이의 조성물을 포함하는 진단용 키트 및 상기 단백질에 대한 저해제를 포함하는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)는 토양, 나무 및 조류 분변을 포함하는 다양한 자연환경에 분포하며, 그 감염원이 다양하고, 하등 진핵세포에서 수생 및 육생 동물에 이르는 다양한 숙주를 사용하는 진균 병원균이다. 크립토코커스 네오포만스는 진균성 뇌수막뇌염에 의한 사망의 주요 원인으로, 전 세계적으로 매년 약 백만 명의 신규 감염자 및 약 육십만 명의 사망자를 초래하는 것으로 알려져 있다. 그러나 뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증 치료에는 제한적인 치료법만 이용되고 있는 실정이다.
한편, 크립토코커스 네오포만스의 병원성 메커니즘을 이해하기 위해, 광범위한 연구가 지난 수십 년간 수행되어왔다. 개별적인 유전자/단백질의 기능을 분석하기 위한 노력뿐만 아니라, 최근에는 대규모의 유전자 결실 돌연변이 라이브러리의 체계적인 분석을 통한 많은 추가적인 병원성-관련 신호 요소들이 발견되었다. 크립토코커스 네오포만스의 병원성 메커니즘에 있어, BBB의 통과 및 증식은 크립토코커스 네오포만스가 포유류 뇌 조직에 치명적인 손상을 가하는 중요한 요소 중 하나이다.
그럼에도 불구하고, 크립토코커스 네오포만스의 BBB 통과 및 뇌 감염을 조절하는 것으로 알려진 인자 및 이를 통제하는 복잡한 신호 전달 경로는 아직 밝혀지지 않았다. 이에 따라, 크립토코커스 네오포만스의 BBB 통과 및 뇌 감염 조절과 관련하여, 크립토코커스 네오포만스의 병원성을 통제하는 신호 및 신진대사의 네트워크를 완전히 이해하고 새로운 항진균성의 타겟 및 약물 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 항진균제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 병용투여용 항진균제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis) 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 항진균제 타겟 단백질을 포함하는 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans) 세포에 분석할 시료를 접촉시키고; (b) 상기 타겟 단백질의 양 또는 활성을 측정하며; 및 (c) 상기 단계에서 항진균제 타겟 단백질의 양 또는 활성이 감소조절(down-regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항진균제임을 판별하는 단계를 포함하는 항진균제 스크리닝 방법으로서, 상기 타겟 단백질은 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질인, 항진균제 스크리닝 방법을 제공한다. 이와 관련된 일 실시예에서, 상기 항진균제는 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증 (cryptococcosis)을 치료, 예방, 또는 치료 및 예방을 위한 항진균제 일 수 있다. 이와 관련된 다른 일 실시예에서, 상기 (a) 및 (b) 단계는 바람직하게는 30℃ 내지 40℃에서 수행될 수 있다. 이와 관련된 다른 일 실시예에서, 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질은 Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2, Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1 및 Jjj1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질 일 수 있다. 이와 관련된 또 다른 일 실시예에서, 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질 중 Cex1, Alk1, Pbs2, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Vrk1, Gal83, Irk2, Hap2, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9 및 Hob1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질은 뇌-혈관 장벽(BBB) 부착과 관련된 단백질이며; 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질 중 Alk1, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Gal83, Urk1, Irk2, Vrk1, Ada2, Hap2, Sre1, Pdr802 및 Hob1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질은 뇌 내부 생존 관련 단백질이다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 본 발명은 병용투여용 항진균제를 스크리닝 하는 방법으로서, (a) 항진균제 타겟 단백질을 포함하는 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans) 세포에 항진균제를 접촉시키고, 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 제1측정 단계; (b) 항진균제 타겟 단백질을 포함하는 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans) 세포에 분석할 시료 및 상기 항진균제를 접촉시키고, 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 제2측정 단계; 및 (c) 제1 및 제2측정 단계의 측정값을 비교하여, 제2측정 단계의 측정값이 제1측정 단계의 측정값보다 감소조절(down-regulation)될 때, 상기 시료가 병용투여용 항진균제임을 판별하는 것을 포함한다. 이와 관련된 일 실시예에서, 상기 (a) 단계의 항진균제는, 예를 들어, 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸 (itraconazole), 보리코나졸(voriconazole) 및 케토코나졸(ketoconazole) 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항진균제 일 수 있다. 이와 관련된 다른 일 실시예에서, 상기 비 아졸계열 항진균제, 예를 들어, 암포테라신 B 또는 플루디옥소닐(fludioxonil)일 수 있다. 이와 관련된 다른 일 실시예에서, 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질은 Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2, Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1 및 Jjj1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질일 수 있다. 이와 관련된 또 다른 일 실시예에서, 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질 중 Cex1, Alk1, Pbs2, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Vrk1, Gal83, Irk2, Hap2, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9 및 Hob1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질은 뇌-혈관 장벽(BBB)의 부착과 관련된 것이며; 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질 중 Alk1, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Gal83, Urk1, Irk2, Vrk1, Ada2, Hap2, Sre1, Pdr802 및 Hob1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질은 뇌 내부 생존과 관련된 단백질이다. 본 실시예의 범위에 속하는 다른 일 실시예에서, 상기 병용투여용 항진균제는 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis)을 예방, 치료 또는 예방 및 치료하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 본 발명은 Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2, Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1 및 Jjj1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질을 포함하는, 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis) 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다. 이와 관련된 일 실시예에서, 본 발명은 상기 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질 양 또는 활성이 감소조절(down-regulation)되는 경우에 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis)으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis) 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다. 이와 관련된 다른 일 실시예에서, 본 발명은 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis) 진단용 바이오마커 조성물을 포함하는, 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis) 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 본 발명은 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)의 Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2, Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1 및 Jjj1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질에 대한 저해제를 포함하는, 항진균용 약학적 조성물을 제공한다. 이와 관련된 일 실시예에서, 상기 저해제는 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질에 대한 항체(antibody), 우성음성돌연변이(Dominant-negative mutation) 및 리보자임(ribozyme) 중 어느 하나 이상일 수 있다. 이와 관련된 다른 일실시예에서, 상기 저해제는 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 안티센스올리고뉴클레오타이드(antisenseoligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터일 수 있다. 이와 관련된 일 실시예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 포함하여, 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis)의 치료, 예방, 또는 치료 및 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실실시예에서, 본 발명은 진균의 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 저해제를 스크리닝 하는 방법으로서, (a) Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2, Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1 및 Jjj1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질 포함하는 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans) 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 단백질 및/또는 상기 단백질을 인코딩하는 유전자의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 단백질 및/또는 유전자의 양 또는 활성이 감소조절(down-regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 진균의 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 저해제인 것으로 판별하는 단계를 포함하는, 진균의 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 저해제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다. 이와 관련된 일 실시예에서, 상기 (a) 및 (b) 단계를 30℃ 내지 40℃에서 수행될 수 있다. 이와 관련된 본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 본 발명은 상기 방법에 따라 스크리닝된 저해제를 포함하는, 항진균용 조성물을 제공하며, 상기 저해제는 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질에 대한 항체(antibody), 우성음성돌연변이(Dominant-negative mutation) 및 리보자임(ribozyme) 중 어느 하나 이상일 수 있다. 또한, 상기 저해제는 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 안티센스올리고뉴클레오타이드(antisenseoligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터일 수 있다. 이와 관련된 또 다른 일 실시예에서, 본 발명은 상기 항진균용 조성물을 약리학적 유효 성분으로 포함하는, 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis)의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한, 항진균용 약학적 조성물. 이와 관련된 또 다른 일 실시예에서, 본 발명은 상기 항진균용 조성물을 포함하는 화장용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 있어서, 본 발명은 Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2, Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1 및 Jjj1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질 또는 이들 단백질을 인코딩하는 유전자에 분석하고자 하는 시료를 처리하고; 및 상기 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질 양 또는 활성을 분석하거나 상기 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 양 또는 활성을 분석 것을 포함하여, 세균 또는 진균의 뇌-혈관 장벽 통과 저해제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다. 이와 관련된 다른 일 실시예에서, 본 발명은 상기 방법에 따라 스크리닝된 저해제를 포함하는 항진균용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 저해제는 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질에 대한 항체(antibody), 우성음성돌연변이(Dominant-negative mutation) 및 리보자임(ribozyme) 중 어느 하나 이상일 수 있다. 또한, 상기 저해제는 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 안티센스올리고뉴클레오타이드(anti-sense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터일 수 있다. 이와 관련된 또 다른 일 실시예에서, 본 발명은 상기 항진균용 조성물을 약리학적 유효 성분으로 포함하는, 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis)의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한, 약학적 조성물을 제공한다. 이와 관련된 또 다른 일 실시예에서, 본 발명은 상기 항진균용 조성물을 포함하는 화장용 조성물을 제공한다.
본 발명의 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질은 크립토코커스 네오포만스 감염에 의한 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis) 완화 및 치료에 대한 새로운 타겟으로 활용될 수 있으며, 상기 단백질을 억제할 수 있는 항진균제 또는 약물 스크리닝에 효과적으로 활용될 수 있다. 본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 폐 및 뇌-STM 분석 비교를 위한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 비강 흡입 쥐를 통한 폐-STM 점수 및 정맥 내 주사된 쥐를 통한 쥐-STM 점수를 나타낸 것이다.
도 3은 나노스트링(NanoString) 분석을 위한 모식도를 나타낸 것이다.
도 4a 및 4b는 독성 관련 유전자, 폐-독성 유전자, 뇌-독성 유전자 및 핵심 독성 유전자의 유전자 발현의 폴드 변화 히트맵을 나타낸 것이다.
도 5는 트렌스웰(transwell)을 이용한 시험관 내 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 분석결과를 나타낸 것이다.
도 6은 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질의 내피 세포 부착 및 뇌-혈관 장벽 통과 여부를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질의 나노스트링 군집화를 나타낸 것이다.
도 8은 ICV(intracerebroventricular) 투여와 관련하여 모식도로 나타낸 것이다.
도 9는 ICV-STM 점수를 통해 뇌에서의 생존과 관련된 단백질을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 뇌 감염 관련 신호 네트워크를 모식도로 나타낸 것이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 (a) 항진균제 타겟 단백질을 포함하는 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans) 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 타겟 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계에서 항진균제 타겟 단백질의 양 또는 활성이 감소조절(down-regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항진균제임을 판별하는 단계를 포함하는 항진균제 스크리닝 방법으로서, 상기 타겟 단백질은 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질인, 항진균제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, “항진균제”는 진균류(곰팡이, 효모 및 버섯)의 번식을 억제하는 것으로, 무기계 항진균제, 유기계 천연물 추출계 항진균제, 유기계 지방족 화합물 항진균제 및 유기계 방향족 화합물 항진균제를 포함한다. 무기계 항진균제로서는, 차아염소나트륨으로 대표되는 염소화합물, 과산화수소로 대표되는 과산화물 붕산, 붕산나트륨으로 대표되는 붕산화합물, 황산구리로 대표되는 구리화합물, 황산아연, 염화아연으로 대표되는 아연화합물, 유황, 다황산 석회, 수화유황으로 대표되는 유황계물, 산화칼슘으로 대표되는 칼슘화합물, 티오황산나트륨, 은착염, 질산은으로 대표되는 은화합물, 그 밖에, 옥소, 실리코플루오리드 나트륨 등이 있고, 유기계 천연물 추출계 항진균제로서는, 히노키티올, 맹종죽 추출액, 크레오소트유 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항진균제는 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis)을 치료 또는 예방하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 “뇌수막뇌염(meningoencephalitis)”은 조직을 둘러싸고 있는 얇은 막과 뇌 사이 혹은 뇌 조직 안에 발생하는 뇌수막염 및/또는 뇌 실질의 염증성 질환을 일컫는 뇌염을 포함하는 질환을 말한다.
상기 뇌수막염은 진균성 뇌수막뇌염, 바이러스성 뇌수막뇌염, 결핵성 뇌수막뇌염 등이 있다. 진균성 뇌막뇌염의 경우 호흡기를 통해 감염되어 중추신경계에 침범하며, 진균류 및 포유류는 세포구조가 진화적으로 유사하여 진균류만의 타겟 발굴이 어려워 효과적인 항진균제 개발이 어려운 질병 중 하나이다.
상기 뇌염은 원인에 따라 감염성, 혈관염성, 종양성, 화학성, 특발성 등으로 분류되며, 병인에 대하여 감염성 뇌염, 결핵성 뇌염 등으로 분류될 수 있다. 뇌염은 조기 진단에 따른 치료를 하지 않는 경우 치사율이 70 - 80% 정도로 높은 질병 중 하나이다.
본 발명의 “크립토코커스증(cryptococcosis)”은 크립토코커스 네오포만스라는 효모형 진균에 의한 감염 질환이다. 주로 면역력이 저하되어 있는 사람에서 많이 나타나며, 호흡기 증상을 동반한 폐 감염이 발생하거나 중추 신경계로 감염이 확산되어 수막염이나 크립토코커스증과 같은 중추 신경계 감염이 발생할 수 있다.
본 발명에서, “시료”는 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 양 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에 이용되는 미지의 후보 물질을 의미하는 것으로, 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 화학물질 및 천연물 추출물을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 단백질의 양 또는 활성의 변화는 2차원 전기영동, 바이오칩 또는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정될 수 있으며, 상기 바이오칩은 단백질칩 또는 핵산 어레이 등이 있다. 또한 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정하는 방법에는 웨스턴 블롯(western blot), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법 (scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법 등이 있을 수 있나, 이에 제한되지 않고 공지된 다양한 분석방법을 통해 수행될 수 있다.
본 발명에서 “뇌-혈관 장벽(BBB)”은 뇌척수액과 혈액을 분리시키는 장벽으로 뇌 모세혈관의 내피세포가 밀착연접(tight junction)을 형성하여 세포 간 용질의 이동을 방해하여 고분자와 친수성 물질의 통과를 막는 것을 의미한다.
본 발명에서 “뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질”은 이러한 뇌-혈관 장벽에 세균 및/또는 진균류 등의 균이 통과하는데 직간접적으로 관여하는 키나아제, 전사인자 등의 단백질을 모두 일컫는다.
본 발명에서는 뇌수막뇌염을 일으키는 크립토코커스 네오포만스에 의한 일련의 감염 과정 중에서 여태까지 밝혀진 바 없는 뇌-혈관 장벽 통과 및 증식에 관여하는 단백질에 관하여 규명하였다. 이에 본 발명자들은 뇌-혈관 장벽 부착 및 통과에 관여하는 14개의 키나아제 Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2 및 9개의 전사인자 Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1, Jjj1의 총 23개의 단백질을 밝혀냈으며, 이러한 뇌수막 통과 관련 단백질을 이용한 항진균제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
구체적으로 상기 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질은 Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2, Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1, 및 Jjj1으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 시험관 내 BBB 시스템을 통해 뇌 감염 관련 돌연변이 전사인자 및 키나아제의 뇌-혈관 장벽 이동 여부를 확인한 결과, 14개의 키나아제 Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2 및 9개의 전사인자 Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1, Jjj1가 뇌-혈관 장벽 통과에 있어 필요한 단백질임을 확인하였다 (도 5).
구체적으로, 상기 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질 중에서 Cex1, Alk1, Pbs2, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Vrk1, Gal83, Irk2, Hap2, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9 및 Hob1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질은 뇌-혈관 장벽의 부착에 관여할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 크립토코커스 네오포만스는 뇌-혈관 장벽을 통과하는데 있어 첫번째로 내피 세포의 표면 부착 단계를 포함하는 바, 상기 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질이 내피 세포의 단분자 부착 능력에도 관여하는지 여부를 확인하였으며, 대부분의 단백질이 내피 세포의 부착에도 관여함을 확인하였다. 이는 내피 세포에 대한 부착이 크립토코커스 네오포만스의 효율적인 뇌-혈관 장벽 통과를 위해 중요한 전제조건 중 하나임을 시사한다(도 6).
또한 구체적으로 상기 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질인 Alk1, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Gal83, Urk1, Irk2, Vrk1, Ada2, Hap2, Sre1, Pdr802 및 Hob1으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질은 뇌 내부 생존과도 관련된 단백질일 수 있다.
상기 “뇌 내부 생존 관련 단백질”은 뇌 내부에서 크립토코커스 네오포만스를 증식시키거나 증식에 필요한 것과 기능상 연관된 단백질 등을 모두 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서는 뇌 내부 생존에 관여하는 단백질을 확인하기 위해 크립토코커스 네오포만스 균주로 쥐를 감염시킨 후 감염된 뇌를 회수하여 확인한 결과, Alk1, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Gal83, Vrk1, Urk1, Irk2, Ada2, Hap2, Sre1, Pdr802 및 Hob1의 14개의 단백질이 뇌-혈관 장벽 통과 및 뇌 내부에서의 생존 둘 다에 관여하는 단백질임을 확인하였다. 또한 20개의 키나아제(Tlk1, Trm7, Crk1, Mak3201, Yck2, Arg5/6, Kin1, Mpk1, Mps1, Kic1, Yak1, Bud32, Bck1, Utr1, Fpb26, Pos5, Mec1, Ipk1, Hog1, Swe102)와 4개의 전사인자(Bzp2, Zfc3, Gat201, Nrg1)를 포함 총 24개의 단백질이 뇌-혈관 장벽 통과에는 관여하지 않지만 뇌 내부에서 크립토코커스 네오포만스 균주가 증식하는데 관여하는 단백질임을 확인하였다(도 9).
상기 결과를 통해 크립토코커스 네오포만스 균주가 뇌-혈관 장벽을 통과하고 뇌 내부에서 증식하기 위해 중복적이면서 별개의 신호 전달 경로를 이용함을 알 수 있다.
상기 뇌-혈관 장벽 통과 및/또는 뇌 내부 생존에 관여하는 단백질은 세포 주기 조절, tRNA 이동, 세포 벽 및 막 보전, 스트레스 반응 및 적응, 지질과 스테롤 물질대사 관여, 액포 수송, 헴- 매개 호흡 조절, 리보솜 생체 내 합성, 탄소 이용 및 포도당 신생합성, 캡슐 생합성, 인산염 감지 및 물질대사에 관여, Tor 신호전달 등의 생물학적 과정 및 신호전달 경로에 관여할 수 있다.
예컨대, 상기 뇌-혈관 장벽 통과에 관여하는 단백질의 생물학적 기능 및 신호전달 경로에는 Alk1의 세포 주기 조절 관여; Cex1의 tRNA 이동에 관여; Yfh701의 세포 벽 및 막 보존 관여; Pbs2의 스트레스 반응 및 적응에 관여; Pkh201, Sre1 및 Hob1의 지질과 스테롤 물질 대사에 관여; Hap2의 헴-매개 호흡 조절에 관여; Vrk1, Sch9 및 Jjj1의 리보솜 생체내 합성에 관여; Pho4의 인산염 감지 및 물질대사에 관여; Sch9의 Tor 신호전달에 관여 등이 있다.
또한 예컨대, 상기 뇌 내부 생존 관련 단백질의 생물학적 기능 및 신호전달 경로에는 Snf1, Gal83, Yck1, Fpb26의 포도당 감지 및 물질대사 관여; Kin1의 분극성 세포외 배출 관여; Urk1의 피리미딘 리보뉴클레오티드 회수 경로에 관여; Pos5의 미토콘드리아 기능 관여; Trm7의 tRNA 변형에 관여; Mak3201의 이중가닥 RNA-함유 입자의 복제 또는 유지에 관여; Crk1(효모 Ime2 이종상동성 단백질)의 감수분열 활성화; Alk1, Swe102, Hsl101, 및 Ssn3의 세포 주기 및 형태 조절; Pkh201(효모 Pkh2 이종상동성 단백질); Ada2의 히스톤 아세틸기전이효소 활성화에 관여; Hap2의 헴-매개 호흡 조절 관여; 및 Vrk1의 리보솜 생체내 합성에 관여 등이 있다.
이 중에서 Pkh201 및 Alk1를 포함하는 2개의 키나아제 및 Hap2, Sre1, Hob1 및 Pdr802를 포함하는 4개의 전사인자는 뇌-혈관 장벽 통과와 부착 및 뇌 내부에서의 생존 모두에 필요했으며, 이는 지질 물질대사, 세포 주기 조절, 및 헴-매개 호흡 조절이 뇌-혈관 장벽 통과와 부착 및 뇌 내부에서의 생존 등의 모든 과정에 중요하다는 것을 시사한다.
또한 구체적으로 상기 항진균제 스크리닝 방법에서 (a) 및 (b) 단계는 30℃-40℃사이에서 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 (a) 항진균제 타겟 단백질을 포함하는 크립토코커스 네오포만스 세포에 항진균제를 접촉시키고, 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 제1측정 단계; (b) 항진균제 타겟 단백질을 포함하는 크립토코커스 네오포만스 세포에 분석할 시료 및 상기 항진균제를 접촉시키고, 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 제2측정 단계; 및 (c) 제1 및 제2측정 단계의 측정값을 비교하여, 제2측정 단계의 측정값이 제1측정 단계의 측정값보다 감소조절(down-regulation)될 때, 상기 시료가 병용투여용 항진균제임을 판별하는 병용투여용 항진균제 스크리닝 방법으로서, 상기 타겟 단백질은 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질인 병용투여용 항진균제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 “병용투여”란 여러 약 등을 함께 투여할 경우 그 효과가 단독 투여할 때보다 상승하는 경우를 일컬으며, 본 발명에서 기존의 알려진 항진균제를 단독으로 투여할 때보다 스크리닝한 항진균제를 함께 투여할 때 항진균 효과가 상승되는 경우를 의미한다.
상기 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질은 Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2, Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1, 및 Jjj1으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
구체적으로, 상기 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질 중에서 Cex1, Alk1, Pbs2, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Vrk1, Gal83, Irk2, Hap2, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9 Hob1 및 Hob1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질은 뇌-혈관 장벽의 부착에 관여할 수 있다.
또한, 구체적으로 상기 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질 중 Alk1, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Gal83, Urk1, Irk2, Vrk1, Ada2, Hap2, Sre1, Pdr802 및 Hob1의 14개로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질은 뇌 내부 생존과도 관련된 단백질일 수 있다.
또한, 구체적으로 상기 (a) 단계의 항진균제는 아졸계열 또는 비 아졸계열 항진균제일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 아졸계열 항진균제는 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 보리코나졸(voriconazole) 및 케토코나졸(ketoconazole) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
또한 상기 비 아졸계열 항진균제는 암포테라신 B 또는 플루디옥소닐 (fludioxonil) 일 수 있다.
상기 병용투여용 항진균제는 뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증을 치료하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2, Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1, 및 Jjj1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질을 포함하는, 뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
상기 “뇌수막뇌염” 또는 “크립토코커스증”에 관한 설명은 전술한 바와 동일하다.
본 발명에서, “뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증 진단용 바이오마커”는 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질의 양 또는 활성 수준 차이를 이용하여 뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증인지 여부를 진단할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, “진단”은 뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증인지 여부를 결정하는 것을 의미하며, 구체적으로 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질의 양 또는 활성의 수준이 높거나 낮음을 비교함으로써 판단할 수 있다.
구체적으로, 상기 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질 양 또는 활성이 감소조절되는 경우에, 뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증으로 진단할 수 있다.
예컨대, 뇌-혈관 장벽 통과 단백질인 Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2, Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1, 및 Jjj1으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질의 양 또는 활성 수준을 측정하여 감소조절되는 경우 뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증으로 진단할 수 있다.
상기 바이오마커 조성물은 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함할 수 있으며, 상기 제제는 상기 23개의 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질 각각의 단백질 양 또는 활성을 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증 진단용 바이오마커 조성물을 포함하는, 뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증 진단용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질의 양 또는 활성을 측정할 수 있는 제제, 측정을 위해 사용되는 다른 구성 성분, 용액 또는 장치 등을 제한없이 포함할 수 있으며, 키트의 사용을 위한 설명서를 추가할 수 있다.
상기 키트는 시료를 담지할 수 있는 통상의 웰 형태의 마이크로타이터 플레이트를 포함할 수 있다. 상기 웰 내에는 시료 및 하나 이상의 바이오마커를 흡수할 수 있는 다공성 지지체를 포함할 수 있으며, 이러한 지지체는 종래 기술분야에서 공지되어 있으며, 또한 상업적으로 구입 가능하다.
본 발명의 또 다른 측면은 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)의 Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2, Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1, 및 Jjj1으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질에 대한 저해제를 포함하는, 항진균용 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기 “뇌수막뇌염” 또는 “크립토코커스증”은 이미 전술한 바와 동일하다.
본 발명에서 “저해제”는 뇌-혈관 장벽을 통과하거나, 뇌-혈관 장벽 통과 전에 내피 세포 부착에 직간접적으로 관여하는 키나아제 또는 전사인자의 발현 또는 활성을 저하시키거나 억제하는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 화학물질 또는 천연물질 등을 일컫는다.
구체적으로 상기 저해제는 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질에 대한 항체(antibody), 우성음성돌연변이(Dominant-negative mutation) 및 리보자임(ribozyme) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
또한 구체적으로 상기 저해제는 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 안티센스올리고뉴클레오타이드(antisenseoligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 상기 유전자의 발현을 억제할 수 있는 저해제를 모두 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 항진균용 약학적 조성물을 포함하는, 뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.
“항진균용 약학적 조성물”, “뇌수막뇌염” 및 “크렙토코커스증”에 관한 설명은 전술한 바와 동일하다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명 화합물의 활성을 저해하지 않는 범위 내에서 추가적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제, 기타 약제학적으로 허용 가능한 첨가제롤 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여는 약제학적으로 유효한 양을 투여할 수 있다. “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 유효 용량 수준은 제제화 방법, 환자의 상태 및 체중, 환자의 성별, 연령, 질환의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간, 배설 속도, 반응 감응성 등과 같은 요인들에 따라 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 kg당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여할 수 있으나, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 도포 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 주사)할 수 있으나 경구 투여가 바람직하다. 질염의 예방 및 치료를 위해서는 질 내로 투여할 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제 등이 포함될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 점안제, 안연고제, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 안연고제, 점안제, 파스타제 또는 카타플 라스마제의 약제학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 국소 투여를 위한 제제는 임상적 처방에 따라 무수형 또는 수성형일 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌수막뇌염 또는 크립토코커스증 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 “뇌수막뇌염” “크립토코커스증” 등의 용어는 상기 설명한 바와 동일하다.
상기 대상체는 동물을 말하며, 전형적으로 본 발명의 화합물을 이용한 치료로 유익한 효과를 나타낼 수 있는 포유동물일 수 있다. 이러한 대상체의 바람직한 예로 인간과 같은 영장류가 포함될 수 있다. 또한 이와 같은 대상체들에는 당뇨 질환의 증상을 갖거나 이와 같은 증상을 가질 위험이 있는 대상체들이 모두 포함될 수 있다.
발명의 실시를 위한 형태
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주 및 배양 조건
본 발명에서는 뇌수막뇌염 유발과 관련된 전사인자 및 키나아제를 분석하기 위해 사용한 균주는 하기 표 1에 나타난 바와 같다. 크립토코커스 네오포만스는 별도의 표시가 없으면 효모 추출물-펩톤 덱스트로즈(Yeast Extract Peptone Dextrose, YPD) 배지에서 배양하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
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실험예 1. 크립토코커스 네오포만스( Cryptococcus neoformans ) 키나아제 및 전사인자 돌연변이 라이브러리를 이용한 STM-기반 쥐의 폐 및 뇌 감염 분석
폐 및 뇌 감염에 필요한 키나아제 및 전사인자를 확인하기 위해 크립토코커스 네오포만스 키나아제 및 전사인자 돌연변이 라이브러리를 이용하여 각 돌연변이에 대한 폐-STM 점수와 뇌-STM 점수를 비교하였다. 크립토코커스 네오포만스 키나아제 및 전사인자 돌연변이 라이브러리 제작 방법은 한국공개특허 제 10-2017-0054190 호를 참조할 수 있다.
46개의 고유한 시그니처-태그를 포함하는 NAT 선택 마커를 가진 키나아제 및 전사인자의 돌연변이 라이브러리(4개 그룹의 전사인자, 5개 그룹의 키나아제 돌연변이 라이브러리)를 사용하여 고속대용량(high-throughput)의 쥐의 뇌-감염성 분석을 수행하였다. ste50 돌연변이를 독성 대조 균주로 사용하였다.
라이브러리의 각 그룹은 YPD 배지에 30°C에서 16시간 동안 각각 배양하고 PBS로 3차례 세척하였으며, 각 돌연변이의 농도를 107 cells ml-1 로 조절하고 각 시료 50 μl를 하나의 튜브에 모았다.
각 돌연변이 라이브러리의 입력(input) 게놈 DNA의 준비를 위해, 돌연변이 풀 200 ml를 YPD 플레이트에 펼치고, 30°C에서 3일간 배양한 후 긁어냈다. 출력(output) 게놈 DNA 샘플을 위해 돌연변이 풀 50 μl (쥐 당 5x105)를 7주 된 암컷 A/J 쥐(일본 SLC, Inc.)에 정맥 내 주사(꼬리 정맥 내) 또는 뇌실 내(ICV) 주입을 통해 감염시켰다. 정맥 주사는 꼬리 정맥의 팽창을 자극하기 위해 따뜻한(40℃) 물 안에서 수행하였으며, 쥐는 억제 장치로 고정하였다. ICV 주사의 경우 쥐를 2% 트리브로모에탄올(20 ml/kg, 복강 내 주사, Sigma Aldrich)로 마취시키고 정위 장치(David Kopf Instruments) 위에 두었다. 대조 또는 돌연변이 풀에 해밀턴 주사기 및 펌프(WPI)와 함께 NanoFil 바늘(WIP)을 사용하여 심실(전후방향, -0.2 mm; 측면, -0.1 mm; 복부, -2.0 mm)에 주입하였다. 감염된 쥐는 감염 7일 후에 희생시키고, 뇌를 회수하여 4 ml PBS에서 균질화 시킨 후 200 μl의 샘플을 100 mg ml-1 의 클로람페니콜을 함유하는 YPD 플레이트에 펼쳐놓고, 30°C에서 2일 동안 배양한 다음 긁어내었다. 총 게놈 DNA는 CTAB 방법으로 긁어낸 입출력 샘플에서 추출하였다.
CFX96TM 실시간(Real-Time) PCR 검출 시스템(Bio-Rad)를 사용하여 태그 특이적 프라이머로 정량적 PCR (Quantitative PCR)를 수행한 후 STM 점수를 계산하였다. STM 점수를 결정하기 위해 2-ΔΔCT 방법으로 게놈 DNA 양의 상대적 변화를 계산하였다. 입력 대 출력 샘플의 평균 배수 변화는 Log 점수(Log2 2-(Ct,타겟 - Ct,액틴)출력 - (Ct,타겟 - Ct,액틴)입력))로 계산하였으며, 각각의 키나아제 및 전사인자에 대해 두개의 독립적인 돌연변이를 확인하였다.
동일한 방법을 이용하여 비강 내로 감염된 쥐(감염 후 14일)로부터 회수한 폐를 이용한 키나아제 및 전사인자에 대해 두개의 독립적인 돌연변이를 확인하였으며, 그 후, 뇌-STM 점수와 폐-STM 점수를 비교하였다.
그 결과, 키나아제의 경우 총 34개의 키나아제가 폐 및 뇌 감염에 모두 필요한 것을 확인하여, 핵심 독성 키나아제임을 확인하였다. 핵심 독성 키나아제는 cAMP 신호 전달 경로의 Pka1, 높은 삼투압 글리세롤 반응(HOG) 경로의 Ssk2 및 Hog1, 세포 벽 보전 MAPK 경로의 Bck1 및 Mpk1, 비접힘 단백질 반응 (UPR) 경로의 Ire1, 액포-수송 경로의 Vps15, 탄소 활용 경로의 Snf1 및 Gal83, KEOPS/EKC 복합체의 Bud32 및 TOR (라파마이신의 타겟) 경로의 Ypk1, Gsk3 및 Ipk1가 있으며, 이러한 알려진 단백질을 제외하고 핵심 독성 키나아제는 생체 내에서의 기능이 분명하지 않은 Irk2 및 Irk5를 확인하였다. Irk2 및 Irk5는 각각 APH 인산전이효소, 디아실글리세롤 인산화 효소-유사 키나아제 및 AGC/YANK 단백질 키나아제 계열에 속하였으며, IRK5의 결실은 멜라닌 생성을 현저히 감소 시키지만, 캡슐 생성을 극적으로 향상 시키므로, 멜라닌 형성의 결함은 독성에 대한 Irk5의 역할이 원인이 될 수 있음을 나타낸다(도 2).
또한, 전사인자의 경우 총 9개의 전사인자가 폐 및 뇌 감염에 모두 필요한 것을 확인하여, 핵심 독성 전사인자임을 확인하였다. 핵심 독성 전사인자는 스테롤 생합성 경로의 Sre1 및 Hob1, 캡슐 생합성 경로의 Gat201 및 Nrg1을 포함하는 것을 확인하였다. 또한 곰팡이 특이적 Zn2Cys6 DNA 결합 도메인을 모두 포함하는 Pdr802, Fzc1, Fzc9 및 Fzc31도 핵심 독성 인자임을 확인하였다. 구체적으로, FZC1의 결실은 39°C에서 (37°C는 아님) 성장 및 교미 능력을 감소 시키지만, 캡슐 및 멜라닌 생성은 증가시켰으며, FZC9의 결실은 교미 및 과산화수소에 대한 내성을 감소시켰다. FZC31의 결실은 고온 및 산화 스트레스 하에서의 성장 그리고 교미 능력을 감소시키지만 멜라닌 생성은 증가시킴을 확인하였다.
상기 결과에서는 키나아제 유전자의 결실이 전사인자의 유전자 결실보다 폐 및 뇌-STM 점수에 더 극적인 변화를 가져왔으며, 이는 키나아제가 일반적으로 신호 전달 경로에서 전사인자의 상류에서 기능하기 때문이며, 이러한 결과는 중복적이고 별개의 신호 성분의 다른 크립토코카칼 감염 단계에 관여함을 시사한다.
실험예 2. 크립토코커스 네오포만스( Cryptococcus neoformans ) 감염 관련 독성 유전자, 키나아제 및 전사인자에 대한 생체 내 유전자 발현 프로파일링
감염 단계 의존적 신호 전달 경로에 대한 분석을 하기 위하여, 58개의 독성 관련인자, 180개의 전사인자 및 183개의 키나아제에 대하여 나노스트링 엔카운터 기반 생체 내 전사 분석(NanoString nCounter-based in vivo transcription analysis)을 수행하였다.
먼저, 쥐에 크립토코커스 네오포만스 H99 균주를 비강 내로 감염시키고 감염된 폐, 뇌, 신장 및 비장 조직을 감염 후 3, 7, 14 및 21일에 회수하였다. 전체 숙주와 병원체 RNA를 각 감염된 조직으로부터 분리하여 나노스트링 분석에 사용하였다. 병원균 특이적인 mRNA 전사체를 8개의 하우스키핑 유전자의 평균 발현 레벨로 정규화시키고, 설계된 프로브를 사용한 병원균-특이적 mRNA 전사체 정량화에 사용하였다. 다양한 조직 및 감염일에서의 각 타겟 유전자의 생체 내 발현 수준을 기저 성장 조건 (30°C에서 YPD 배지) 하에서 시험관 내 발현 수준과 비교하였다.
구체적으로, 6주령의 암컷 A/J 쥐에게 비강 흡입을 통해 5 × 105 세포를 감염시켰으며, 감염 3, 7, 14 또는 21일 후에 각 그룹의 3마리의 마우스의 폐, 뇌, 비장 그리고 신장을 꺼내어 동결건조시켰다. 건조된 기관을 균질화시키고, 총 RNA 추출 키트(easy-BLUE, Intron Biotechnology)를 사용하여 총 RNA(YPD 배지에서 성장한 기저 샘플로부터)를 추출하였다. C.neoformans 총 RNA(YPD 배지에서 성장한 기저 샘플로부터) 10 ng 또는 C.neoformans 감염 쥐의 조직 RNA 10 μg를 함유하는 샘플을 제조회사의 표준 프로토콜에 따라 설계된 프로브 코드 세트와 반응시켰다.
총 8개의 하우스키핑 유전자 미토콘드리아 단백질, CNAG_00279; 미세소관 결합 단백질, CNAG_00816; 알도스 환원효소, CNAG_02722; 코피린, CNAG_02991; 액틴, CNAG_00483; 튜불린 베타 체인, CNAG_01840, 튜불린 알파-1A 체인, CNAG_03787; 히스톤 H3, CNAG_04828를 정규화에 사용하였다. 정규화된 데이터를 log2 점수로 변환하여 배수 변화를 표현하고 Morpheus (http://software.broadinstitute.org/morpheus)의 평균 결합과 1 마이너스 피어슨(Pearson) 상관관계를 이용하여 군집화를 수행하였다.
그 결과, 58개의 세포 독성 관련 유전자가 어떻게 다르게 조절되는지 확인하였으며, ClG1과 CFO1과 같은 금속 이온의 감지와 흡수에 관여하는 유전자는 전체 감염 단계의 다른 조직에서 매우 높게 상향 조절되었고, Cig1과 Cfo1이 크립토코커스 네오포만스의 독성에 대해 필수적임을 확인하였다. 또한, CnMT1/2 (메탈로치오넨) 및 CTR4 (구리 운반체)와 같은 구리 레귤론 유전자는 초기 감염 단계부터 후기 감염 단계까지 모든 감염 조직에서 고도로 상향 조절됨을 확인하였다. 또한, 두 가지 주요 독성 인자인 멜라닌(LAC1) 및 캡슐(CAP10, CAP59, CAP60, CAP64)의 생성과 관련된 유전자는 감염동안 별도로 조절되었으며 특히, LAC1의 생체 내 발현 수준이 3~14일 동안엔 증가하고, 21일 째에는 감소하는 것을 확인하였다. 이는 LAC1의 유도 조건이 조혈성 확산에 더 유리하다는 것을 시사한다. CAP10, CAP59, CAP60과 CAP64는 전반적으로 낮은 발현수준을 보였지만, 폐에서 7~21일 동안에만 약하게 발현이 증가하였다.
또한 키나아제 및 전사인자의 생체 내 전사 프로파일링 분석 결과, 전체 감염 과정에서 183개의 키나아제 및 180개의 전사인자의 발현 양상을 확인하였다. 폐가 C.neoformans 초기 감염 부위임을 반영하여 특히 14일 후에 많은 키나아제 및 전사인자 유전자의 발현이 폐에서 유도됨을 확인하였다. 폐 이외의 다른 조직에서 특이적으로 발현된 유전자는 없었으며, 일부 유전자는 감염 단계 전반에 걸쳐 높은 발현 수준 또는 낮은 발현 수준을 나타내는 것을 확인하였다. 즉, 병원성에 관여하는 대부분의 유전자들은 일반적으로 생체 내에서 고도로 발현됨을 알 수 있다.
실험예 3. 뇌-혈관 장벽(BBB) 부착 및 통과에 필요한 전사인자 및 키나아제의 동정
뇌가 크립토코커스 네오포만스 감염의 치명적인 표적 조직인 바, 뇌 감염에 특이적으로 결함이 있는 전사인자 및 키나아제 STM 돌연변이에 집중하여 하기 실험을 수행하였다. 뇌-STM 점수가 폐-STM 점수와 달리 특히 낮은 경향을 보이는 키나아제 및 전사인지는 각각 12개 및 10개이며, 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
*ND: 인체 온도에서 결실 돌연변이체의 성장 결함의 미결정 원인 이 중에 뇌-STM 점수 변화가 조혈성 확산 동안 발생하는지 여부를 확인하였으며, pho4Δ 돌연변이만이 혈청-특이적 성장 결함을 나타내었다. 나머지 돌연변이 중 일부는 뇌를 커버하는 뇌-혈관 장벽 통과 관련되어 있을 수 있다고 가정하였으며, 상기 12개의 키나아제 및 10개의 전사인자가 뇌-혈관 장벽 부착 및 통과에 필수적인지 여부를 확인하기 위해 시험관 내 BBB 시스템을 이용하여 실험을 수행하였다.
또한 뇌-STM 점수 및 폐-STM 점수 둘다 낮은 경향을 보이는 키나아제 및 전사인자는 각각 34개 및 9개이며, 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
*ND: 인체 온도에서 결실 돌연변이체의 성장 결함의 미결정 원인
3-1. 시험관 내 BBB 시스템( in vitro BBB system) 검증
먼저, 시험관 내 BBB 시스템을 검증하기 위해, 먼저 크립토코커스 네오포만스 (Cryptococcus neoformans H99 균주), 비병원성의 사카로미세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae S288C) 및 본 발명에서 독자적으로 구축한 mpr1Δ 변이주의 뇌-혈관 장벽 통과 능력을 비교하기 위하여, 24시간 동안 상기 균주를 배양시킨 후, 뇌-혈관 장벽을 통과할 수 있는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 야생형 크립토코커스 네오포만스의 약 10%가 뇌-혈관 장벽을 통과한 반면 S. cerevisiae (S288C)는 전혀 뇌-혈관 장벽을 통과하지 못하였으며, mpr1Δ 돌연변이체도 거의 뇌-혈관 장벽을 통과하지 못함을 확인하였다(도 5a). 또한, TEER (trans-endothelial electrical resistance) 측정 결과 유의미한 변화를 발견하지 못하였으며, 더욱이 크립토코커스 네오포만스 세포의 뇌-혈관 장벽을 통과하는 동안 이웃하는 HBMECs와 결합하는 밀착 연접이 영향을 받지 않았음을 추가로 확인하였다.
이러한 결과는 우리의 시험관 내 BBB 시스템이 예상대로 작동함을 시사한다.
3-2. 시험관 내 BBB 시스템( in vitro BBB system)을 이용한 뇌-혈관 장벽의 부착 및 통과에 필요한 전사인자 및 키나아제 동정
상기와 같이 BBB 시스템을 검증하고 확립한 후, 뇌-혈관 장벽 통과에 있어 선택된 뇌 감염 관련 10개의 전사인자, 12개의 키나아제 돌연변이 및 뇌와 폐 감염 모두에 중요하다고 밝힌 9개 전사인자와 34개 키나아제 중 37°C에서 성장의 결함이 있는 신호 전달 경로를 제외한 CEX1, ALK1, PBS2, YFH701, PKH201, ABC1, TRM7, TLK1, MAK3201, CRK1, HAP2, ADA2, JJJ1, PHO4, ATF1, HOB5, STB4, CRZ1, ZFC3, MET3, HSL101, SNF1, SCH9, IRK5, VRK1, GAL83, URK1, IRK2, YAK1, HOG1, SSK2, DAK101, KIN1, PKA1, SRE1, FZC9, PDR802, FZC1, HOB1, FZC31 및 GAT201 유전자 변이균주의 신호 전달 경로에서의 핵심 독성 키나아제 및 전사인자를 트렌스웰(transwell) 기반 시험관 내 BBB 시스템을 통해 확인하고자 하기 실험을 수행하였다. 혈액 부위의 상부 구획과 뇌 부위의 하부 구획을 분리하는 트랜스 웰 상에 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMECs)를 BBB 스크리닝에 사용하였다.
먼저, 내피 세포주 배양은 hCMECM/D3 세포를 콜라겐 코팅된 8 μm 다공성 막(BD Falcon) 또는 12-웰 플레이트(BD Falcon)에 5x104 cells/mL 밀도로 뿌리고 EGM™-2 (Longa)에서 유지시켰다. 이후 그 다음날 배지를 2.5% 인간 혈청으로 바꾸고 4일 동안 배양하였다. 접종 24시간 전에 배지를 절반 강도의 배지로 바꾸고 세포를 37°C 및 5% CO2 에서 유지시켰다(transendothelial electrical resistance (TEER) around 200 Ω/cm2).
시험관 내 BBB 스크리닝을 위해, 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans) WT 및 결실 돌연변이체, 또는 S. cerevisiae 균주의 5 x 105 세포는 500 μl의 PBS에 넣고 다공성 막의 상부에 접종시켰다. 37°C CO2 인큐베이터에서 24 인큐베이팅한 후, 막을 통과한 세포의 수를 CFU로 측정하였다. 부착 분석을 위해, 접종된 24 시간 배양 접시를 PBS로 3차례 세척하고 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 멸균 증류수와 반응시켜 hCMEC/D3 세포를 파괴하고 수집하였다. 뇌-혈관 장벽 이동 또는 내피 세포 부착의 정도는 WT 산출 수에 대한 CFU의 비율로 계산하였다. TEER은 효모 세포의 접종 전 및 접종 후 EVOM2 장치(World Precision Instruments) 를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 총 5개의 키나아제 Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, 및 Pkh201, 및 4개의 전사인자 Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, 및 Jjj1 이 뇌-혈관 장벽 통과에 요구되는 것을 확인하였다(도 5b). 나아가, 뇌-혈관 장벽 통과 결함의 5개의 키나아제와 4개의 TF 돌연변이의 HBMECs의 단분자막에 대한 부착 능력을 확인하였으며, jjj1Δ, yfh701Δ, ada2Δ, 및 pho4Δ 돌연변이를 제외한 대부분의 돌연변이들은 HBMECs에 대하여 감소된 부착력이 있음을 확인하였다(도 6a).
또한, 스테롤 생합성 경로의 Sre1 및 Hob1, TOR 경로의 Sch9, 황 동화 경로의 Met3, 탄소 이용 경로의 Snf1과 Gal83, 리보솜 생합성 경로의 Vrk1은 크립토코커스 네오포만스의 뇌-혈관 장벽 통과를 촉진시킨다는 것을 확인하였으며(도 5c), Hsl101, Irk2, Irk5, Urk1, Fzc1, Fzc9, 및 Pdr802 또한 뇌-혈관 장벽 통과에 중요하다는 것을 확인하였다. 나아가, met3Δ, snf1Δ, vrk1Δ, gal83Δ, hsl101Δ, irk2Δ, sre1Δ, fzc9Δ, hob1Δ, pdr802Δ, 및 fzc1Δ 돌연변이는 HBMECs의 단분자막에 대한 감소된 부착력을 보여주었다(도 6b).
상기 결과에서 크립토코커스 네오포만스의 효율적인 뇌-혈관 장벽 통과에서 숙주 세포의 부착이 중요하다는 것을 알 수 있으며, 크립토코커스 네오포만스가 뇌-혈관 장벽 통과를 위해 다양한 생물학적 과정에 관여하는 복잡한 신호 네트워크를 이용한다는 것을 시사한다.
3-3. 뇌-혈관 장벽 부착 및 통과에 필요한 전사인자 및 키나아제의 생체 내 전사 프로파일링 분석 확인
상기 실험예 3-2에서 동정한 전사인자 및 키나아제가 뇌에서만 특이적으로 조절되는지 여부를 상기 실험예 2의 나노스트링 엔카운터 기반 생체 내 전사 분석을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 유전자 대부분이 감염 후기 단계에서 폐에서 상향조절됨을 확인하였으며, 특히 PDR802, SRE1, VRK1, PKH201 및 YFH701의 생체 내 발현은 거의 모든 감염 단계 동안 모든 감염 조직에서 강력하게 유도됨을 확인하였다. 반면, BBB 통과 및 HBMECs에 대한 부착에 있어서의 Cex1와 Met3의 중요한 역할과 상관없이, 전체 감염 단계 및 모든 조직에서 강력하게 유도되지 않음을 확인하였다.
실험예 4. 뇌 내부에서 크립토코커스 네오포만스( Cryptococcus neoformans )의 생존에 필요한 키나아제 및 전사인자 동정
일부 키나아제 및 전사인자들이 조혈성의 확산 및 뇌-혈관 장벽 통과에서는 정상이나 뇌-STM 점수 변화가 여전이 나타나는 이유를 밝히기 위해, 뇌 내부에서 증식하기 위한 낮은 뇌-STM 점수의 전사인자 및 키나아제 돌연변이의 능력을 모니터링하는 실험을 수행하였다.
4-1. 낮은 뇌-STM 점수의 전사인자 및 키나아제 돌연변이 확인
먼저, 뇌-혈관 장벽을 우회하여 크립토코커스 네오포만스로 쥐를 감염시키기 위한 새로운 뇌실 내(ICV) 주입 방법을 확립하였다(도 8). ICV 주입으로 높고/낮은 뇌-STM 전사인자 및 키나아제 돌연변이를 가진 한 그룹의 쥐를 감염 시킨 후, 6 dpi 후에 감염된 뇌로부터 돌연변이를 회수하고 qPCR에 의한 STM 점수를 평가하였다(이하 ICV-STM 점수로 약칭함).
그 결과, 6개의 키나아제 TLK1, TRM7, CRK1, MAK3201, PKH201 또는 ALK1와
4개의 전사인자 ADA2,PIP2, ZFC3 또는 HAP2 유전자가 변이된 균주가 ICV-STM 점수를 현저하게 감소시킴을 확인하였다(도 9).
이를 통해, 2개의 키나아제 Pkh201, Alk1 및 2개의 전사인자 Ada2, Hap2가 뇌-혈관 장벽 통과 및 뇌 내부에서의 생존 둘 다에 필요한 반면, 뇌-혈관 장벽 통과에 필요한 키나아제와 전사인자 Cex1, Pbs2, Yfh701, Pho4, 및 Jjj1 는 뇌 내부에서의 증식을 위해 필요가 없음을 알 수 있다.
또한, 4개의 키나아제 Tlk1, Trm7, Crk1, 및 Mak3201와 1개의 전사인자 Zfc3는 독특하게 뇌-혈관 장벽 통과가 아닌 뇌 내부에서의 증식에 관여함을 확인하였다.
4-2. 뇌 내부 크립토코커스 네오포만스( Cryptococcus neoformans ) 증식에 필요한 추가 키나아제 및 전사인자 확인
뇌 내부에서 크립토코커스 네오포만스의 증식에 필요한 것과 기능상 연관된 다른 키나아제 및 전사인자를 확인하기 위해, 핵심 독성 키나아제 및 전사인자 돌연변이에 대한 ICV-STM 점수를 확인하였다.
그 결과, 37°C에서 성장에 결함이 있는 대부분의 키나아제 및 전사인자 돌연변이 yck2Δ, arg5/6Δ, mpk1Δ, mps1Δ, kic1Δ, bud32Δ, bck1Δ, utr1Δ, fbp26Δ, pos5Δ, mec1Δ, ipk1Δ, swe102Δ, 및 nrg1Δ는 또한 ICV-STM 점수의 감소를 나타냈으며, 뇌-혈관 장벽 통과를 위해 필요한 핵심 키나아제와 전사인자 중 Irk2, Vrk1, Pdr802, Sre1, 및 Hob1는 뇌 내부에서의 증식을 위해서도 필요함을 확인하였다(도 9).
*hog1Δ 돌연변이의 경우 낮은 ICV-STM 점수를 보이는 바, Hog1이 뇌-혈관 장벽 통과에는 필요하지 않으나 뇌 내부 증식에 있어서는 필요하며, 반대로 Sch9, Irk5, Fzc1, 및 Fzc9는 뇌 내부에서의 증식을 위해 불필요함을 확인하였다. 또한, Snf1, Gal83, Kin1, Urk1, Hsl101, Yak1, Fbp26, Pos5, 및 Swe102 이 뇌 내부에서 크립토코커스 네오포만스의 증식에 관여한다는 것을 확인하였다.
상기 결과는 크립토코커스 네오포만스가 뇌-혈관 장벽를 통과하고 뇌 내부에서 증식하기 위해 중복적이고 별개 세트의 신호 전달 경로를 이용한다는 것을 시사한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> AMTIXBIO CO., LTD. <120> USE OF THE GENES ASSOCIATED WITH BLOOD-BRAIN BARRIER PASSAGE AND SURVIVAL IN BRAIN TISSUES OF MENINGOENCEPHALITIS-CAUSING FUNGI <130> AMTIX20P02WO <150> KR 10-2019-0114797 <151> 2019-09-18 <160> 78 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR primer 1 of URE1 <400> 1 ttgctttccc tttcttcctc 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR primer 2 of URE1 <400> 2 ggtggtgagg atgagtttg 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR primer 1 of CPS1 <400> 3 actcacggat gactgtttg 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR primer 2 of CPS1 <400> 4 ataccaccgt caatgtgtg 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR primer 1 of ITR1a <400> 5 cttcaaccga ggtcatactc 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR primer 2 of ITR1a <400> 6 agattccgat accaagggc 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> 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Claims (16)

  1. 진균의 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 저해제를 스크리닝 하는 방법으로서,
    (a) Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2, Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1 및 Jjj1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질 포함하는 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans) 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 단백질의 양 또는 활성이 감소조절(down-regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 진균의 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 저해제인 것으로 판별하는 단계를 포함하는,
    진균의 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 저해제를 스크리닝 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 및 (b) 단계를 30℃ 내지 40℃에서 수행하는 것인, 방법.
  3. 제1항의 방법에 따라 스크리닝된 저해제를 포함하는, 항진균용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 저해제는 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질에 대한 항체(antibody), 우성음성돌연변이(Dominant-negative mutation) 및 리보자임(ribozyme) 중 어느 하나 이상인 것인, 항진균용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 저해제는 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 안티센스올리고뉴클레오타이드(anti-sense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터인 것인, 항진균용 조성물.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항진균용 조성물을 약리학적 유효 성분으로 포함하는, 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis)의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한, 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 아졸계 또는 비-아졸계 항진균제를 더 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 아졸계열 항진균제는 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸 (itraconazole), 보리코나졸(voriconazole) 및 케토코나졸(ketoconazole) 중 어느 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 비-아졸계열 항진균제는 암포테라신 B 또는 플루디옥소닐(fludioxonil)인 것인, 약학적 조성물.
  10. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 화장용 조성물인 것을 특징으로 하는 항진균용 조성물.
  11. Cex1, Alk1, Pbs2, Yfh701, Pkh201, Met3, Hsl101, Snf1, Sch9, Irk5, Vrk1, Gal83, Urk1, Irk2, Ada2, Hap2, Pho4/Hlh3, Sre1, Fzc1, Pdr802, Fzc9, Hob1 및 Jjj1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 뇌-혈관 장벽 통과 관련 단백질에 분석하고자 하는 시료를 처리하고; 및
    상기 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질 양 또는 활성을 분석하는 것을 포함하여,
    세균 또는 진균의 뇌-혈관 장벽 통과 저해제를 스크리닝 하는 방법.
  12. 제11항의 방법에 따라 스크리닝된 저해제를 포함하는, 항진균용 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 저해제는 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질에 대한 항체(antibody), 우성음성돌연변이(Dominant-negative mutation) 및 리보자임(ribozyme) 중 어느 하나 이상인 것인, 항진균용 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 저해제는 상기 뇌-혈관 장벽(BBB) 통과 관련 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 안티센스올리고뉴클레오타이드(anti-sense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터인 것인, 항진균용 조성물.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항진균용 조성물을 약리학적 유효 성분으로 포함하는, 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코커스증(cryptococcosis)의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한, 약학적 조성물.
  16. 제12항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 화장용 조성물인 것을 특징으로 하는 항진균용 조성물.
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