KR20220083325A - Method for isolating cyclodipeptide-based compound derived from Lactobacillus sakei culture medium and composition for preventing or treating bone disease comprising the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 배양액 유래 사이클로디펩티드(cyclodipeptide)계 화합물의 분리방법 및 이를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 화합물이 파골세포로의 분화 억제 효과를 나타내므로, 이를 효과적으로 골 질환의 예방, 치료 또는 개선에 이용할 수 있다.The present invention relates to a method for isolating a cyclodipeptide-based compound derived from a Lactobacillus sakei culture medium and a composition for preventing or treating bone diseases comprising the same, wherein the compound exhibits an inhibitory effect on differentiation into osteoclasts Therefore, it can be effectively used for the prevention, treatment or improvement of bone diseases.
Description
본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 배양액 유래 사이클로디펩티드(cyclodipeptide)계 화합물의 분리방법 및 이를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 수탁번호 KCTC13816BP로 기탁된 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주의 배양액으로부터 분리한 6종의 사이클로디펩티드계 화합물 및 이의 골질환 예방, 치료 또는 개선 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a method for isolating a cyclodipeptide-based compound derived from a Lactobacillus sakei culture medium, and a composition for preventing or treating bone diseases comprising the same, and more particularly, to a composition for preventing or treating bone diseases including the lactobacillus sakei deposited under the accession number KCTC13816BP. It relates to six types of cyclodipeptide compounds isolated from the culture medium of Bacillus sacai CVL-001 strain and their use for preventing, treating or improving bone diseases.
골다공증에 의해 야기되는 골절은 주된 건강 문제를 구성하며 건강 관리 시스템 상에 막대한 경제적 부담을 준다. 골다공증으로 인한 골절의 위험은 서양에서 높으며(여성에서 약 50% 및 남성에서 약 20%), 골절은 현저한 치사율 및 이환율과 연관된다. 피질골(cortical bone)은 신체에서 뼈의 약 80%를 구성하며, 여러 연구들은 피질골이 뼈 강도의 주요 결정인자이며, 이에 따라 골절 민감성의 주요 결정인자임을 보여주었다. 65세 이후에 뼈 손실은 해면질골이 아니라 주로 피질골에서의 손실에 기인한다.Fractures caused by osteoporosis constitute a major health problem and place a huge economic burden on the health care system. The risk of fractures due to osteoporosis is high in the West (about 50% in women and about 20% in men), and fractures are associated with significant mortality and morbidity. Cortical bone constitutes about 80% of bone in the body, and several studies have shown that cortical bone is a major determinant of bone strength and, thus, a major determinant of fracture susceptibility. Bone loss after age 65 is primarily attributable to the loss of cortical bone and not cancellous bone.
골격은 뼈 형성 골아세포(OBs) 및 뼈흡수 파골 세포(OCLs)에 의해 리모델링된다. 대식세포 콜로니 자극인자(MCSF)는 OCLs 전구세포의 증식 및 생존을 증가시킬뿐만 아니라 OCL에서 핵인자-κB(RANK)의 리셉터 활성제의 발현을 상향조절한다. 이는 RANK 리간드(RANKL)가 바인딩하고 OCL 형성을 이끄는 시그널링 캐스케이드를 개시하도록 한다. RANKL의 영향은 RANKL에 대한 유인 리셉터인 오스테오프로테게린(OPG)에 의해 저해될 수 있다.The skeleton is remodeled by osteogenic osteoblasts (OBs) and bone resorbing osteoclasts (OCLs). Macrophage colony stimulating factor (MCSF) not only increases proliferation and survival of OCLs progenitor cells, but also upregulates the expression of receptor activators of nuclear factor-κB (RANK) in OCLs. This allows the RANK ligand (RANKL) to bind and initiate a signaling cascade leading to OCL formation. The effect of RANKL can be inhibited by osteoprotegerin (OPG), an attractive receptor for RANKL.
최근에, 건강 및 질병 모두를 위해 장내 미생물(gut microbiota; 이하 GM)의 중요성이 집중적으로 연구되어 왔다. GM은 총괄적으로 인간 게놈 보다 150배 더 많은 유전자를 함유하는 엄청난 양의 박테리아로 구성된다. 이는 출생시 얻어지며, 구별되는 실재(distinct entity)임에도 불구하고, 분명히 인간 게놈과 함께 공진화하고, 다양한 방식으로 이의 숙주와 소통하고 영향을 미치는 다세포 생물로 간주될 수 있다.In recent years, the importance of gut microbiota (hereinafter GM) for both health and disease has been intensively studied. GM is made up of huge numbers of bacteria that collectively contain 150 times more genes than the human genome. Although it is acquired at birth and is a distinct entity, it can be considered as a multicellular organism that apparently co-evolves with the human genome and communicates and affects its host in various ways.
GM의 구성은 음식 및 항생제 치료와 같은 다수의 환경적 요인에 의해 조절된다. 장내 미생물에 의해 생산된 분자들은 유익할 수도 있고 해로울 수도 있으며, 장 내의 내분비 세포, 장 신경계, 장 투과성 및 면역 시스템에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 동요된 미생물 구성은 크론병, 궤양성 대장염, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 당뇨, 음식 알레르기, 습진 및 천식뿐만 아니라 비만 및 대사 증후군을 포함하여 장 내외에서 다양한 염증 조건에 연루되는 것으로 상정되어 왔다.The composition of GM is regulated by a number of environmental factors, such as diet and antibiotic treatment. Molecules produced by the gut microbiota can be beneficial or harmful and are known to affect the endocrine cells in the gut, the enteric nervous system, gut permeability and the immune system. Perturbed microbial makeup has been postulated to be implicated in a variety of inflammatory conditions in and out of the gut, including Crohn's disease, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, diabetes, food allergies, eczema and asthma, as well as obesity and metabolic syndrome.
락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는 동형 또는 이형발효를 하는 유산간균으로, 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있는 미생물이다. 본 발명팀은 선행 기술에서 김치로부터 분리한 L. sakei CVL-001 균주 및 그 배양액이 파골세포 분화 억제 및 골다공증 질환 개선 효과를 확인하여 그 발명을 완성하였다. 그러나 L. sakei가 분비하는 파골세포 분화 억제 및 골다공증 질환 개선 효과를 갖는 유용성분에 대한 연구는 충분치 못한 실정이다.Lactobacillus sakei ( Lactobacillus sakei ) is a lactic acid bacillus that performs homozygous or heterozygous fermentation, and is a microorganism commonly seen in the fermentation process of dairy products and vegetables. The present invention team completed the invention by confirming the effects of L. sakei CVL-001 strain isolated from kimchi in the prior art and its culture medium to inhibit osteoclast differentiation and improve osteoporosis disease. However, there are insufficient studies on useful ingredients secreted by L. sakei to inhibit osteoclast differentiation and improve osteoporosis disease.
이에 본 발명자들은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주의 배양액으로부터 분리한 사이클로디펩티드(cyclodipeptide)계 화합물이 파골세포로의 분화 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.Accordingly, the present inventors confirmed that the cyclodipeptide-based compound isolated from the culture medium of the Lactobacillus sakei CVL-001 strain exhibits an inhibitory effect on differentiation into osteoclasts.
이에, 본 발명의 목적은 사이클로-프롤릴-글라이실(cyclo-(prolyl-glycyl)), 사이클로-프롤릴-트레오닐(cyclo-(prolyl-threonyl)), 사이클로-프롤릴-알라닐(cyclo-(prolyl-alanyl)), 사이클로-발릴-알라닐(cyclo-(valyl-alanyl)), 사이클로-프롤릴-루이실(cyclo-(prolyl-leucyl)) 및 사이클로-프롤릴-페닐알라닐(cyclo-(prolyl-phenylalanyl))로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is cyclo-prolyl-glycyl (cyclo-(prolyl-glycyl)), cyclo-prolyl-threonyl (cyclo-(prolyl-threonyl)), cyclo-prolyl-alanyl (cyclo-(prolyl-glycyl)) -(prolyl-alanyl)), cyclo-valyl-alanyl (cyclo-(valyl-alanyl)), cyclo-prolyl-leucyl (cyclo-(prolyl-leucyl)) and cyclo-prolyl-phenylalanyl ( To provide a pharmaceutical composition for preventing or treating bone disease comprising at least one selected from the group consisting of cyclo-(prolyl-phenylalanyl)).
본 발명의 다른 목적은 사이클로-프롤릴-글라이실, 사이클로-프롤릴-트레오닐, 사이클로-프롤릴-알라닐, 사이클로-발릴-알라닐, 사이클로-프롤릴-루이실 및 사이클로-프롤릴-페닐알라닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 골 질환 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is cyclo-prolyl-glycyl, cyclo-prolyl-threonyl, cyclo-prolyl-alanyl, cyclo-valyl-alanyl, cyclo-prolyl-leucyl and cyclo-prolyl- It is to provide a food composition for improving bone disease comprising at least one selected from the group consisting of phenylalanyl.
본 발명의 또 다른 목적은 다음의 단계를 포함하는 사이클로디펩티드계 화합물의 분리방법을 제공하는 것이다:Another object of the present invention is to provide a method for isolating a cyclodipeptide compound comprising the following steps:
락토바실러스 사케이를 배양하는 배양액 제조 단계; 및A culture solution preparation step of culturing Lactobacillus saccharis; and
배양액을 클로로포름으로 분획하는 용매분획 단계.A solvent fractionation step of fractionating the culture solution with chloroform.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 사케이 배양액으로부터 분리된 사이크롤디펩티드계 화합물의 골 질환 예방, 치료 또는 개선 용도에 관한 것이다.Another object of the present invention relates to the use of a cyclodipeptide-based compound isolated from a Lactobacillus saccharin culture medium for preventing, treating or improving bone disease.
본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 배양액 유래 사이클로디펩티드(cyclodipeptide)계 화합물의 분리방법 및 이를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 파골세포로의 분화 억제 효과를 나타낸다.The present invention relates to a method for isolating a cyclodipeptide-based compound derived from a Lactobacillus sakei culture medium, and a composition for preventing or treating bone disease comprising the same, wherein the composition according to the present invention differentiates into osteoclasts exhibits an inhibitory effect.
본 발명자들은 수탁번호 KCTC13816BP로 기탁된 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주의 배양액으로부터 분리한 6종의 사이클로디펩티드계 화합물이 파골세포로의 분화를 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다.The present inventors confirmed that 6 types of cyclodipeptide-based compounds isolated from the culture medium of the Lactobacillus sacai CVL-001 strain deposited with accession number KCTC13816BP exhibited the effect of inhibiting differentiation into osteoclasts.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 양태는 사이클로-프롤릴-글라이실(cyclo-(prolyl-glycyl)), 사이클로-프롤릴-트레오닐(cyclo-(prolyl-threonyl)), 사이클로-프롤릴-알라닐(cyclo-(prolyl-alanyl)), 사이클로-발릴-알라닐(cyclo-(valyl-alanyl)), 사이클로-프롤릴-루이실(cyclo-(prolyl-leucyl)) 및 사이클로-프롤릴-페닐알라닐(cyclo-(prolyl-phenylalanyl))로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 사이클로디펩티드계 화합물을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물이다.One aspect of the present invention is cyclo-prolyl-glycyl (cyclo-(prolyl-glycyl)), cyclo-prolyl-threonyl (cyclo-(prolyl-threonyl)), cyclo-prolyl-alanyl (cyclo- (prolyl-alanyl)), cyclo-(valyl-alanyl)), cyclo-prolyl-leucyl (cyclo-(prolyl-leucyl)) and cyclo-prolyl-phenylalanyl (cyclo -(prolyl-phenylalanyl))) is a pharmaceutical composition for preventing or treating bone disease comprising one or more cyclodipeptide-based compounds selected from the group consisting of.
상기 약학 조성물은 바람직하게는 사이클로-프롤릴-알라닐 또는 사이클로-프롤릴-루이실인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 사이클로-프롤릴-글라이실, 사이클로-프롤릴-트레오닐, 사이클로-프롤릴-알라닐, 사이클로-발릴-알라닐, 사이클로-프롤릴-루이실 및 사이클로-프롤릴-페닐알라닐 6종을 모두 포함하는 혼합물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition may be preferably cyclo-prolyl-alanyl or cyclo-prolyl-leucyl, more preferably cyclo-prolyl-glycyl, cyclo-prolyl-threonyl, cyclo-prolyl -alanyl, cyclo-valyl-alanyl, cyclo-prolyl-leucyl, and cyclo-prolyl- phenylalanyl may be a mixture containing all six types, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 뼈전이암(bone metastatic cancer), 골연화증(osteomalacia), 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성 골질환 및 치주질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.In the present invention, the bone disease is one selected from the group consisting of osteoporosis, bone metastatic cancer, osteomalacia, rickets, fibrous osteotitis, aplastic bone disease, metabolic bone disease, and periodontal disease. It may be more than
본 발명의 약학 조성물은 사이클로-프롤릴-글라이실, 사이클로-프롤릴-트레오닐, 사이클로-프롤릴-알라닐, 사이클로-발릴-알라닐, 사이클로-프롤릴-루이실 및 사이클로-프롤릴-페닐알라닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 사이클로디펩티드계 화합물의 약학적 유효량 및/또는 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물로 이용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is cyclo-prolyl-glycyl, cyclo-prolyl-threonyl, cyclo-prolyl-alanyl, cyclo-valyl-alanyl, cyclo-prolyl-leucyl and cyclo-prolyl- It can be used as a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically effective amount of one or more cyclodipeptide compounds selected from the group consisting of phenylalanyl and/or a pharmaceutically acceptable carrier.
본 명세서에서 용어 "약학적 유효량"은 상술한 사이클로디펩티드계 화합물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.As used herein, the term “pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the above-described cyclodipeptide compound.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, silicic acid. calcium, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like. it is not The pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components.
본 발명에 따른 약학 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may be administered to mammals including humans by various routes. The administration method may be any method commonly used, for example, may be administered by routes such as oral, skin, intravenous, intramuscular, subcutaneous, etc., and preferably orally.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.A suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and response sensitivity of the patient, usually Thus, a skilled physician can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment or prevention.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. Alternatively, it may be prepared by introducing it into a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in oil or an aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet, capsule, or gel (eg, hydrogel), and may additionally include a dispersant or stabilizer. .
본 발명의 다른 양태는 사이클로-프롤릴-글라이실, 사이클로-프롤릴-트레오닐, 사이클로-프롤릴-알라닐, 사이클로-발릴-알라닐, 사이클로-프롤릴-루이실 및 사이클로-프롤릴-페닐알라닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 사이클로디펩티드계 화합물을 포함하는 골 질환 개선용 식품 조성물이다.Another aspect of the invention is cyclo-prolyl-glycyl, cyclo-prolyl-threonyl, cyclo-prolyl-alanyl, cyclo-valyl-alanyl, cyclo-prolyl-leucyl and cyclo-prolyl- It is a food composition for improving bone disease comprising at least one cyclodipeptide compound selected from the group consisting of phenylalanyl.
상기 식품 조성물은 바람직하게는 사이클로-프롤릴-알라닐 또는 사이클로-프롤릴-루이실인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 사이클로-프롤릴-글라이실, 사이클로-프롤릴-트레오닐, 사이클로-프롤릴-알라닐, 사이클로-발릴-알라닐, 사이클로-프롤릴-루이실 및 사이클로-프롤릴-페닐알라닐 6종을 모두 포함하는 혼합물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The food composition may be preferably cyclo-prolyl-alanyl or cyclo-prolyl-leucyl, more preferably cyclo-prolyl-glycyl, cyclo-prolyl-threonyl, cyclo-prolyl -alanyl, cyclo-valyl-alanyl, cyclo-prolyl-leucyl, and cyclo-prolyl- phenylalanyl may be a mixture containing all six types, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 골 질환은 골다공증, 뼈전이암, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성 골질환 및 치주질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.In the present invention, the bone disease may be one or more selected from the group consisting of osteoporosis, bone metastases, osteomalacia, rickets, fibrous osteotitis, aplastic bone disease, metabolic bone disease, and periodontal disease.
본 발명의 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다.When the food composition of the present invention is used as a food additive, the food composition may be added as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method. In general, in the production of food or beverage, the food composition of the present invention may be added in an amount of 15% by weight or less, preferably 10% by weight or less, based on the raw material.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.There is no particular limitation on the type of the food. Examples of foods to which the above substances can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, There are alcoholic beverages, vitamin complexes, and the like, and includes all foods in a conventional sense.
상기 음료는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.The beverage may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients. As the above-mentioned natural carbohydrates, monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and natural sweeteners such as dextrin and cyclodextrin, synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame may be used. . The ratio of the natural carbohydrate may be appropriately determined by the selection of those skilled in the art.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.In addition to the above, the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol , a carbonation agent used in carbonated beverages, and the like. In addition, the food composition of the present invention may contain fruit for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, and vegetable beverage. These components may be used independently or in combination. The proportion of these additives may also be appropriately selected by those skilled in the art.
본 발명의 또 다른 양태는 다음의 단계를 포함하는 사이클로디펩티드계 화합물의 분리방법이다:Another aspect of the present invention is a method for isolating a cyclodipeptide compound comprising the steps of:
락토바실러스 사케이를 배양하는 배양액 제조 단계; 및A culture solution preparation step of culturing Lactobacillus saccharis; and
배양액을 클로로포름으로 분획하는 용매분획 단계.A solvent fractionation step of fractionating the culture solution with chloroform.
상기 락토바실러스 사케이는 수탁번호 KCTC13816BP로 기탁된 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주인 것일 수 있다.The Lactobacillus saccharin may be a Lactobacillus sacchari CVL-001 strain deposited with accession number KCTC13816BP.
상기 사이클로디펩티드계 화합물은 사이클로-프롤릴-글라이실, 사이클로-프롤릴-트레오닐, 사이클로-프롤릴-알라닐, 사이클로-발릴-알라닐, 사이클로-프롤릴-루이실 및 사이클로-프롤릴-페닐알라닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.The cyclodipeptide-based compound is cyclo-prolyl-glycyl, cyclo-prolyl-threonyl, cyclo-prolyl-alanyl, cyclo-valyl-alanyl, cyclo-prolyl-leucyl and cyclo-prolyl. -It may be at least one selected from the group consisting of phenylalanyl.
본 발명에 있어서 배양액 제조 단계는 락토바실러스 사케이를 배양하고, 균주를 제거한 후 배양 상층액, 이의 농축물, 이의 분획물 또는 이의 동결건조물을 수득하는 것일 수 있다.In the present invention, the step of preparing a culture solution may be to obtain a culture supernatant, a concentrate thereof, a fraction thereof or a freeze-dried product thereof after culturing Lactobacillus saccharis and removing the strain.
상기 배양액은 균주를 12시간 내지 30시간, 12시간 내지 24시간, 18시간 내지 30시간 또는 18시간 내지 24시간, 예를 들어, 22시간 내지 26시간 동안 배양하여 수득한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 시간은 24시간을 기점으로 하여 그 이상 배양하는 것이 배양 시간 의존적으로 파골세포 분화 억제 활성에 대하여 현저한 상승효과를 나타내는 것은 아니다.The culture solution may be obtained by culturing the strain for 12 hours to 30 hours, 12 hours to 24 hours, 18 hours to 30 hours or 18 hours to 24 hours, for example, 22 hours to 26 hours, but is not limited thereto. it is not As for the culture time, culturing longer than 24 hours does not show a significant synergistic effect on the osteoclast differentiation inhibitory activity in a culture time-dependent manner.
상기 배양액은 pH 6.5 내지 8.5, 6.5 내지 8.0, 6.5 내지 7.5, 7.0 내지 8.5 또는 7.0 내지 8.0, 예를 들어, pH 7.0 내지 7.5인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The culture medium may have a pH of 6.5 to 8.5, 6.5 to 8.0, 6.5 to 7.5, 7.0 to 8.5, or 7.0 to 8.0, for example, a pH of 7.0 to 7.5, but is not limited thereto.
배양액에서는 유산균이 자라면서 젖산 등의 대사체를 생산하게 되어 산성화될 수 있고, 이는 세포 배양에 적절하지 않은 pH 범위에 해당한다. 이러한 점에 근거하여, 세포 배양에 있어서 가장 적절한 pH 값은 7.4이다.In the culture medium, as lactic acid bacteria grow, they produce metabolites such as lactic acid and may be acidified, which corresponds to a pH range that is not suitable for cell culture. Based on this point, the most appropriate pH value for cell culture is 7.4.
본 발명에 있어서 용매분획 단계는 배양액을 헥산(n-hexane)으로 분획한 여액을 클로로포름으로 분획하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 여액은 헥산 층을 제외한 나머지를 의미한다.In the present invention, the solvent fractionation step may be performed by fractionating the filtrate obtained by fractionating the culture solution with hexane (n-hexane) with chloroform. The filtrate means the remainder except for the hexane layer.
본 발명에 있어서 분리방법은 다음 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다:In the present invention, the separation method may further include the following steps:
클로로포름으로 분획한 용매층을 헥산, 에틸아세테이트(EtOAc) 및 메탄올(MeOH)의 단계적 시스템으로 컬럼 분획하는 제1 분획 단계; 및a first fractionation step of column-fractionating the solvent layer fractionated with chloroform using a stepwise system of hexane, ethyl acetate (EtOAc) and methanol (MeOH); and
제1 분획 단계의 용출액을 물(H2O) 및 메탄올의 구배 시스템으로 컬럼 분획하는 제2 분획 단계.A second fractionation step of column fractionation of the eluate of the first fractionation step with a gradient system of water (H 2 O) and methanol.
상기 제1 분획 단계는 헥산, 에틸아세테이트 및 메탄올을 9:1:0, 7:3:0, 5:5:0, 그리고 0:0:10(v/v)의 용매로 하여 수행되는 것일 수 있다.The first fractionation step may be performed using hexane, ethyl acetate and methanol as solvents of 9:1:0, 7:3:0, 5:5:0, and 0:0:10 (v/v). have.
상기 제2 분획 단계는 제1 분획 단계에서 헥산, 에틸아세테이트 및 메탄올을 0:0:10(v/v)의 용매로 하여 용출된 용출액을 선택하여 수행되는 것일 수 있다.The second fractionation step may be performed by selecting the eluate eluted using hexane, ethyl acetate and methanol as solvents of 0:0:10 (v/v) in the first fractionation step.
상기 분리방법은 제2 분획 단계의 용출액을 물 및 메탄올, 또는 물 및 시안화메틸(methyl cyanide; MeCN)의 구배 시스템으로 컬럼 분획하는 정제 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.The separation method may further include a purification step of column fractionation of the eluate of the second fractionation step with a gradient system of water and methanol, or water and methyl cyanide (MeCN).
상기 정제 단계는 물 및 메탄올의 구배 시스템으로 컬럼 분획하여 수행되는 것일 수 있고, 물 및 메탄올의 구배 시스템으로 컬럼 분획한 후 추가적으로 물 및 시안화메틸의 구배 시스템으로 컬럼 분획하여 수행되는 것일 수 있다.The purification step may be performed by column fractionation with a gradient system of water and methanol, or column fractionation with a gradient system of water and methanol, followed by column fractionation with a gradient system of water and methyl cyanide.
본 발명에 있어서 골 질환은 골다공증, 뼈전이암, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성 골질환 및 치주질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.In the present invention, the bone disease may be one or more selected from the group consisting of osteoporosis, bone metastases, osteomalacia, rickets, fibrous osteotitis, aplastic bone disease, metabolic bone disease, and periodontal disease.
본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 배양액 유래 사이클로디펩티드(cyclodipeptide)계 화합물의 분리방법 및 이를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 화합물이 파골세포로의 분화 억제 효과를 나타내므로, 이를 효과적으로 골 질환의 예방, 치료 또는 개선에 이용할 수 있다.The present invention relates to a method for isolating a cyclodipeptide-based compound derived from a Lactobacillus sakei culture medium and a composition for preventing or treating bone diseases comprising the same, wherein the compound exhibits an inhibitory effect on differentiation into osteoclasts Therefore, it can be effectively used for the prevention, treatment or improvement of bone diseases.
도 1은 본 발명의 실시예에 따라 L. sakei 배양액으로부터 얻어지는 화합물 1 내지 6의 분리 및 정제 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 1인 사이클로-프롤릴-글라이실(cyclo-(prolyl-glycyl))의 HMBC 상관관계(화살표) 및 구조식을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 2인 사이클로-프롤릴-트레오닐(cyclo-(prolyl-threonyl))의 HMBC 상관관계 및 구조식을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 3인 사이클로-프롤릴-알라닐(cyclo-(prolyl-alanyl))의 HMBC 상관관계 및 구조식을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 4인 사이클로-발릴-알라닐(cyclo-(valyl-alanyl))의 HMBC 상관관계 및 구조식을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 5인 사이클로-프롤릴-루이실(cyclo-(prolyl-leucyl))의 HMBC 상관관계 및 구조식을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 6인 사이클로-프롤릴-페닐알라닐(cyclo-(prolyl-phenylalanyl))의 1H-1H-COSY 상관관계(굵은선), HMBC 상관관계 및 구조식을 나타낸 것이다.
도 8a는 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 1 내지 6의 10 μM 농도에서의 파골세포 분화 억제 효과를 나타낸 결과 사진이다.
도 8b는 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 1 내지 6의 10 μM 농도에서의 파골세포 분화 억제 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 9a는 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 1 내지 6의 40 μM 농도에서의 파골세포 분화 억제 효과를 나타낸 결과 사진이다.
도 9b는 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 1 내지 6의 40 μM 농도에서의 파골세포 분화 억제 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 10a는 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 1 내지 6의 혼합물 10 μM의 파골세포 분화 억제 효과를 나타낸 결과 사진이다.
도 10b는 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 1 내지 6의 혼합물 10 μM의 파골세포 분화 억제 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 11a는 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 1 내지 6의 혼합물 10 μM 파골세포 분화 관련 유전자 TRAP 발현에 대한 억제 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 11b는 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 1 내지 6의 혼합물 10 μM 파골세포 분화 관련 유전자 Cathepsin K 발현에 대한 억제 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 11c는 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 1 내지 6의 혼합물 10 μM 파골세포 분화 관련 유전자 DC-STAMP 발현에 대한 억제 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 11d는 본 발명의 실시예에 따라 얻어지는 화합물 1 내지 6의 혼합물 10 μM 파골세포 분화 관련 유전자 NFATc1 발현에 대한 억제 효과를 나타낸 결과 그래프이다.1 is a schematic diagram showing the separation and purification process of
Figure 2 shows the HMBC correlation (arrow) and structural formula of cyclo-prolyl-glycyl (cyclo-(prolyl-glycyl)), which is
3 shows the HMBC correlation and structural formula of cyclo-prolyl-threonyl (cyclo-(prolyl-threonyl)), which is
Figure 4 shows the HMBC correlation and structural formula of cyclo-prolyl-alanyl (cyclo-(prolyl-alanyl)), which is
5 shows the HMBC correlation and structural formula of cyclo-valyl-alanyl (cyclo-(valyl-alanyl)), which is
6 shows the HMBC correlation and structural formula of cyclo-prolyl-leucyl (cyclo-(prolyl-leucyl)), which is
Figure 7 is a 1H-1H-COSY correlation (bold line), HMBC correlation and structural formula of cyclo-prolyl-phenylalanyl (cyclo-(prolyl-phenylalanyl)), which is
8A is a photograph showing the effect of inhibiting osteoclast differentiation at a concentration of 10 μM of
Figure 8b is a graph showing the osteoclast differentiation inhibitory effect of the
9a is a photograph showing the effect of inhibiting osteoclast differentiation at a concentration of 40 μM of
9b is a graph showing the osteoclast differentiation inhibitory effect of
10A is a photograph showing the osteoclast differentiation inhibitory effect of 10 μM of a mixture of
10B is a graph showing the osteoclast differentiation inhibitory effect of 10 μM of a mixture of
11a is a graph showing the inhibitory effect on the expression of 10 μM osteoclast differentiation-related gene TRAP in a mixture of
11b is a graph showing the inhibitory effect on the expression of 10 μM osteoclast differentiation-related gene Cathepsin K of a mixture of
11c is a graph showing the inhibitory effect on the expression of 10 μM osteoclast differentiation-related gene DC-STAMP of a mixture of
11D is a graph showing the inhibitory effect on the expression of 10 μM osteoclast differentiation-related gene NFATc1 of a mixture of
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.Throughout this specification, "%" used to indicate the concentration of a specific substance is (weight/weight)% solid/solid, (weight/volume)%, and (weight/volume)% for solid/solid, and Liquid/liquid is (vol/vol) %.
실시예 1: 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주Example 1: Lactobacillus Sakei CVL-001 strain 배양액 및 용매분획물의 제조Preparation of culture medium and solvent fraction
락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei; L. sakei) CVL-001 균주의 배양액을 제조하기 위하여 MRS 배지에 균을 접종해 37℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 이를 원심분리(3000 rpm, 15분)한 후, 상층액을 분리하여 pH 7.4로 맞추고 0.22 μm 멤브레인 필터(membrane filter)로 여과하여 배양액을 얻었다.To prepare a culture solution of the Lactobacillus sakei ( L. sakei ) strain CVL-001, the bacteria were inoculated into MRS medium and incubated at 37°C for 24 hours. After centrifugation (3000 rpm, 15 minutes), the supernatant was separated, adjusted to pH 7.4, and filtered through a 0.22 μm membrane filter to obtain a culture solution.
얻어진 L. sakei 배양액 5.0 L에 헥산(n-hexane, 5.0 L × 3회), 클로로포름(CHCl3, 5.0 L × 3회), 에틸아세테이트(EtOAc, 5.0 L × 3회), 그리고 수포화 부탄올(BuOH, 2.5 L × 3회)을 이용하여 순차적으로 용매분획하였다. 각 용매분획액을 냉각 아스피레이터(cooling aspirator, CA-111, Eyela, Tokyo, Japan)가 장착된 진공 농축기(vacuum evaporator, N-2N, Eyela, Tokyo, Japan)를 이용하여 40℃ 이하에서 각각 감압 농축하여 도 1과 같이 용매분획물을 얻었다.The obtained L. sakei culture solution In 5.0 L, hexane ( n -hexane, 5.0 L × 3 times), chloroform (CHCl 3 , 5.0 L × 3 times), ethyl acetate (EtOAc, 5.0 L × 3 times), and saturated butanol (BuOH, 2.5 L × 3 times) 3 times) for sequential solvent fractionation. Using a vacuum evaporator (N-2N, Eyela, Tokyo, Japan) equipped with a cooling aspirator (cooling aspirator, CA-111, Eyela, Tokyo, Japan) for each solvent fraction, each at 40 ℃ or less Concentrated under reduced pressure to obtain a solvent fraction as shown in FIG.
실시예 2: 클로로포름 분획물로부터의 화합물 분리 및 정제Example 2: Isolation and purification of compounds from chloroform fractions
실시예 1의 용매분획물 중 클로로포름 층에 대하여 실리카 겔 컬럼(silica gel column, 120 g, Biotage)이 장착된 MPLC(medium performance liquid chromatography; Isolera one, Biotage)를 실시하여 화합물을 분리 및 정제하였다. 구체적으로, 클로로포름 분획물(1.9678 g)을 흡착시킨 실리카 겔(silica gel)을 실리카 겔 컬럼(120 g)에 연결한 다음 헥산(n-hexane)/에틸아세테이트(EtOAc)/메탄올(MeOH) = 9:1:0, 7:3:0, 5:5:0, 그리고 0:0:10(v/v)의 용매로 각각 1000 mL씩 단계적 시스템(step-wise system)으로 용출하였다.In the solvent fraction of Example 1 The chloroform layer was subjected to MPLC (medium performance liquid chromatography; Isolera one, Biotage) equipped with a silica gel column (120 g, Biotage) to separate and purify the compound. Specifically, the silica gel to which the chloroform fraction (1.9678 g) was adsorbed was connected to a silica gel column (120 g), and then hexane ( n -hexane)/ethyl acetate (EtOAc)/methanol (MeOH) = 9: It was eluted in a step-wise system by 1000 mL each with a solvent of 1:0, 7:3:0, 5:5:0, and 0:0:10 (v/v).
상기에서 얻어진 획분 B(642.8 mg, CHCl3/MeOH = 0:0:10, v/v)를 컬럼(SNAP Ultra C18 120 g, Biotage)에 주입하여 ODS-MPLC를 수행하였다. 이동상 용매의 용출은 초기 36분 동안 H2O/MeOH = 8:2(v/v)로 유지하다가 170분까지 H2O/MeOH = 0:10(v/v)가 되도록 구배 시스템(gradient system)으로, 유속은 17 mL/min로, 그리고 검출파장은 254 nm로 하여 수행하였다. 이를 통해 도 1과 같이 획분 B로부터 4종의 획분(B1 내지 B4)로 분획하였다.Fraction B (642.8 mg, CHCl 3 /MeOH = 0:0:10, v/v) obtained above was injected into a column (SNAP Ultra C18 120 g, Biotage) to perform ODS-MPLC. Elution of the mobile phase solvent was maintained at H 2 O/MeOH = 8:2 (v/v) for the initial 36 minutes, and then H 2 O/MeOH = 0:10 (v/v) until 170 minutes using a gradient system. ), a flow rate of 17 mL/min, and a detection wavelength of 254 nm. Through this, as shown in FIG. 1, fraction B was fractionated into four fractions (B1 to B4).
2-1. 화합물 1 내지 4의 정제2-1. Purification of
얻어진 획분 B1(H2O/MeOH = 8:2, v/v, 137.4 mg)에 대하여 ODS-MPLC(SNAP Ultra C18 120g; 유속 17 mL/min; 검출파장 254 nm)를 수행하였다. 이동상 용매의 용출은 초기 11분 동안 10% MeOH로 유지하다가 64분까지 20% MeOH가 되도록 구배 시스템으로 하여 4종의 화합물을 분리하였다.obtained fraction ODS-MPLC (SNAP Ultra C18 120 g; flow rate 17 mL/min; detection wavelength 254 nm) was performed on B1 (H 2 O/MeOH = 8:2, v/v, 137.4 mg). The elution of the mobile phase solvent was maintained at 10% MeOH for the initial 11 minutes and then the gradient system was used to achieve 20% MeOH until 64 minutes to separate four compounds.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 1(6.1 mg, t R 22 min)은 사이클로-프롤릴-글라이실(cyclo-(prolyl-glycyl))로,
[화학식 1][Formula 1]
하기 화학식 2로 표시되는 화합물 2(3.2 mg, t R 26 min)는 사이클로-프롤릴-트레오닐(cyclo-(prolyl-threonyl))로,Compound 2 (3.2 mg, t R 26 min) represented by the following
[화학식 2][Formula 2]
하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 3(16.5 mg, t R 35 min)은 사이클로-프롤릴-알라닐(cyclo-(prolyl-alanyl))로,
[화학식 3][Formula 3]
그리고 하기 화학식 4로 표시되는 화합물 4(3.9 mg, t R 45 min)는 사이클로-발릴-알라닐(cyclo-(valyl-alanyl))로 명명하였다.And compound 4 (3.9 mg, t R 45 min) represented by the following
[화학식 4][Formula 4]
2-2. 화합물 5의 정제2-2. Purification of
얻어진 획분 B3(121.4 mg)에 대하여, 상기 2-1의 획분 B1에 대한 ODS-MPLC 수행 조건과 동일하게 수행하되, 이동상 용매의 용출 조건에 있어서 초기 11분 동안 20% MeOH로 유지하다가 70분까지 40% MeOH가 되는 구배 시스템으로 적용하여 획분 B3-a1(15.6 mg)을 얻었다. 획분 B3-a1에 대하여 ODS 컬럼(Spherisorb S5 ODS2, 10×250 mm)이 장착된 HPLC(유속 4 mL/min, 검출파장 220 nm)를 수행하였으며, 이때 초기 5분 동안 13% MeCN으로 유지하다가 50분까지 16% MeCN이 되도록 구배 시스템으로 용출하여 화합물 5(2.7 mg, t R 19 min)를 얻었다.With respect to the obtained fraction B3 (121.4 mg), the same ODS-MPLC conditions were performed for the fraction B1 of 2-1, but 20% MeOH was maintained for the first 11 minutes in the elution condition of the mobile phase solvent, and then maintained until 70 minutes Fraction B3-a1 (15.6 mg) was obtained by application with a gradient system to 40% MeOH. For fraction B3-a1, HPLC (flow
하기 화학식 5로 표시되는 화합물 5는 사이클로-프롤릴-루이실(cyclo-(prolyl-leucyl))로 명명하였다.
[화학식 5][Formula 5]
2-3. 화합물 6의 정제2-3. Purification of
얻어진 획분 B4(18 mg)에 대하여, 상기 2-1의 획분 B1에 대한 ODS-MPLC 수행 조건과 동일하게 수행하되, 이동상 용매의 용출 조건에 있어서 초기 13분 동안 30% MeOH로 유지하다가 44분까지 50% MeOH가 되는 구배 시스템으로 적용하여 획분 B4-b(6.2 mg)를 얻었다. 획분 B4-b에 대하여 ODS 컬럼(Spherisorb S5 ODS2, 10×250 mm)이 장착된 HPLC(유속 4 mL/min, 검출파장 220 nm)를 수행하였으며, 이때 30% MeCN으로 하나의 등용매(isocratic)로 용출하여 화합물 6(2.9 mg)을 분리하였다.With respect to the obtained fraction B4 (18 mg), the same ODS-MPLC operation conditions were performed for the fraction B1 of 2-1, but 30% MeOH was maintained for the initial 13 minutes under the elution condition of the mobile phase solvent, and then maintained until 44 minutes Fraction B4-b (6.2 mg) was obtained by application with a gradient system to 50% MeOH. For fraction B4-b, HPLC (flow
하기 화학식 6으로 표시되는 화합물 6은 사이클로-프롤릴-페닐알라닐(cyclo-(prolyl-phenylalanyl))로 명명하였다.
[화학식 6][Formula 6]
실시예 3: 화합물 1 내지 6의 구조해석Example 3: Structural analysis of
3-1. 화합물 1의 구조해석3-1. Structural analysis of
화합물 1의 HR-ESI-MS 분석결과에서 양성자화된 분자 이온 피크(protonated molecular ion peak)인 m/z 155.0822 [M+H]+가 관찰되어 이 화합물의 분자식은 C7H10N2O2(MW 154)임을 알 수 있었다.In the HR-ESI-MS analysis result of
화합물 1의 13C-NMR 스펙트럼(spectrum)(125 MHz, CD3OD)에서는 2종의 아미드 카보닐 카본 시그널(amide carbonyl carbon signal)들[δ 170.6 (C-1)과 165.0 (C-1')]을 포함한 총 7종 카본 시그널들이 관찰되어 MS 분석 결과와 일치하였다.In the 13 C-NMR spectrum of compound 1 (125 MHz, CD 3 OD), two types of amide carbonyl carbon signals [δ 170.6 (C-1) and 165.0 (C-1') )], a total of 7 types of carbon signals were observed, which was consistent with the MS analysis results.
화합물 1의 1H-NMR 스펙트럼(500 MHz, CD3OD)에서 관찰된 1종의 메틴 양성자 시그널(methine proton signal)[δ 4.24 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-2)]와 3종의 메틸렌 양성자 시그널(methylene proton signal)들[δ 2.30-2.33 (2H, m, H-3a), 2.00-2.03 (2H, m, H-3b), 1.97-2.01 (2H, m, H-4), 3.50-3.58 (2H, m, H-5)]로부터 이 화합물에는 프롤린(proline)의 존재가 시사되었다.One methine proton signal [δ 4.24 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-2)] and 3 observed in 1 H-NMR spectrum (500 MHz, CD 3 OD) of
게다가 1H-NMR 스펙트럼에서 1종의 메틸렌 양성자 시그널[δ 4.11 (1H, d, J =17.0 Hz, H-2'a)과 3.74 (1H, d, J = 17.0 Hz, H-2'b)]와 13C-NMR 스펙트럼에서 1종의 아미드 카보닐 카본 시그널[δ 165.0 (C-1')]가 관찰되어 다른 1종의 아미노산(amino acid)은 글리신(glycine)으로 시사되었다. 이상의 MS와 NMR 결과로부터 이 화합물은 프롤린과 글리신으로 구성된 디펩티드(dipeptide)로 시사되었다.In addition, one methylene proton signal in the 1 H-NMR spectrum [δ 4.11 (1H, d, J = 17.0 Hz, H-2'a) and 3.74 (1H, d, J = 17.0 Hz, H-2'b) ] and 13 C-NMR spectrum, one type of amide carbonyl carbon signal [δ 165.0 (C-1')] was observed, suggesting that the other type of amino acid was glycine. The above MS and NMR results suggest that this compound is a dipeptide composed of proline and glycine.
정확한 구조해석을 위하여 HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) 분석한 결과, 이 화합물은 프롤린과 글리신이 결합된 화합물임을 재차 확인할 수 있었다. 특히 HMBC 스펙트럼에서 δ 4.11 (H-2')과 170.6 (C-1) 및 δ 3.50-3.58 (H-5)과 165.0 (C-1') 간의 상관관계들이 관찰되었다. 그러므로 화합물 1은 사이클로-프롤릴-글라이실(cyclo-(prolyl-glycyl))로 구조해석되었다.As a result of HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) analysis for accurate structural analysis, it was confirmed again that this compound is a compound in which proline and glycine are combined. In particular, correlations between δ 4.11 (H-2') and 170.6 (C-1) and δ 3.50-3.58 (H-5) and 165.0 (C-1') were observed in the HMBC spectrum. Therefore,
하기 표 1은 화합물 1(CD3OD)의 1H- (500 MHz) 및 13C- (125 MHz) NMR 자료이다. 화합물 1의 HMBC 상관관계(화살표) 및 구조는 도 2에 나타내었다.Table 1 below is 1 H- (500 MHz) and 13 C- (125 MHz) NMR data of Compound 1 (CD 3 OD). The HMBC correlation (arrow) and structure of
3-2. 화합물 2의 구조해석3-2. Structural analysis of
화합물 2의 ESI-MS 분석결과에서 양성자화된 분자 이온 피크인 m/z 199.1 [M+H]+이 관찰되어 이 화합물의 분자량은 198임을 알 수 있었다. 화합물 1의 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼과 비교한 결과, 화합물 2 또한 프롤린의 존재가 시사되었다.As a result of ESI-MS analysis of
그에 더하여 1H-NMR 스펙트럼(500 MHz, CD3OD)에서 2종의 메틴 양성자 시그널들[δ 3.98 (1H, s, H-2'a)과 4.28-4.30 (1H, m, H-3')]과 1종의 메틸 양성자 시그널[δ 1.33 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-4')]이, 그리고 13C-NMR 스펙트럼(125 MHz, CD3OD)에서 δ170.5 (C-1'), 59.9 (C-2'), 65.5 (C-3') 및 18.8 (C-3')을 포함한 총 4종의 카본 시그널들이 관찰되어, 화합물 2는 프롤린 외 다른 1종의 아미노산으로 트레오닌(threonine)의 존재가 시사되었다.In addition, two methine proton signals [δ 3.98 (1H, s, H-2'a) and 4.28-4.30 (1H, m, H-3') in 1 H-NMR spectrum (500 MHz, CD 3 OD) )] and one methyl proton signal [δ 1.33 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-4’)], and δ170.5 (C in 13 C-NMR spectrum (125 MHz, CD 3 OD)). A total of 4 carbon signals including -1'), 59.9 (C-2'), 65.5 (C-3') and 18.8 (C-3') were observed, and
정확한 구조해석을 위하여 HMBC 분석한 결과, 이 화합물은 프롤린과 트레오닌이 결합된 화합물임을 확인할 수 있었다. 특히, HMBC 스펙트럼에서 δ 3.44-3.61 (H-5)과 170.5 (C-1') 간에 그리고 δ 3.98 (H-2')과 165.5 (C-1) 간에 상관관계들이 관찰되었다. 그러므로, 화합물 2는 사이클로-프롤릴-트레오닐(cyclo-(prolyl-threonyl))로 구조해석되었다.As a result of HMBC analysis for accurate structural analysis, it was confirmed that this compound is a compound in which proline and threonine are combined. In particular, correlations were observed between δ 3.44-3.61 (H-5) and 170.5 (C-1') and between δ 3.98 (H-2') and 165.5 (C-1) in the HMBC spectrum. Therefore,
하기 표 2는 화합물 2 (CD3OD)의 1H- (500 MHz) 및 13C- (125 MHz) NMR 자료이다. 화합물 2의 HMBC 상관관계(화살표) 및 구조는 도 3에 나타내었다.Table 2 below is 1 H- (500 MHz) and 13 C- (125 MHz) NMR data of compound 2 (CD 3 OD). The HMBC correlation (arrow) and structure of
3-3. 화합물 3의 구조해석3-3. Structural analysis of
화합물 3의 ESI-MS 분석결과에서 양성자화된 분자 이온 피크인 m/z 169.2 [M+H]+가 관찰되어 이 화합물의 분자량은 168임을 알 수 있었다. 화합물 3의 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼에서도 화합물 1과 2에 존재하고 있는 프롤린과 관련된 양성자와 카본 시그널들이 관찰되었다.As a result of ESI-MS analysis of
그에 더하여 1H-NMR 스펙트럼에서 1종의 메틴 양성자[δ4.19 (1H, q, J = 7.0 Hz, H-2')]과 1종의 메틸 양성자[δ 1.38 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-3')]이, 그리고 13C-NMR 스펙트럼에서 δ167.65 (C-1'), 50.7 (C-2') 및 14.3 (C-3')을 포함한 총 3종의 카본 시그널들이 관찰되어, 이 화합물의 다른 1종의 아미노산 그룹(group)은 알라닌(alanine)으로 시사되었다. 이는 δ 1.38 (H-3')과 167.65 (C-1') 간의 3 J HC HMBC 상관관계, 및 δ 4.19 (H-2')과 167.65 (C-1') 간의 2 J HC HMBC 상관관계의 관찰로부터 확인되었다.In addition, 1 H-NMR spectrum showed one methine proton [δ4.19 (1H, q, J = 7.0 Hz, H-2')] and one methyl proton [δ 1.38 (3H, d, J = 7.0). Hz, H-3')], and a total of three carbon signals including δ167.65 (C-1'), 50.7 (C-2') and 14.3 (C-3') in the 13 C-NMR spectrum. were observed, suggesting that one other amino acid group of this compound is alanine. This is of the 3 J HC HMBC correlation between δ 1.38 (H-3′) and 167.65 (C-1′), and the 2 J HC HMBC correlation between δ 4.19 (H-2′) and 167.65 (C-1′). confirmed from observation.
HMBC 분석 결과로부터 이 화합물은 프롤린과 알라닌이 결합된 화합물임을 확인할 수 있었다. 특히, HMBC 스펙트럼에서 관찰된 δ 3.51-3.54 (H-5)과 167.6 (C-1') 및 δ 4.19 (H-2')과 171.2 (C-1) 간의 상관관계들로부터 화합물 3은 사이클로-프롤릴-알라닐(cyclo-(prolyl-alanyl))로 구조해석되었다.From the HMBC analysis result, it was confirmed that this compound was a compound in which proline and alanine were combined. In particular, from the correlations between δ 3.51-3.54 (H-5) and 167.6 (C-1') and δ 4.19 (H-2') and 171.2 (C-1) observed in the HMBC spectrum,
하기 표 3은 화합물 3 (CD3OD)의 1H- (500 MHz) 및 13C- (125 MHz) NMR 자료이다. 화합물 3의 HMBC 상관관계(화살표) 및 구조는 도 4에 나타내었다.Table 3 below is 1 H- (500 MHz) and 13 C- (125 MHz) NMR data of compound 3 (CD 3 OD). The HMBC correlation (arrow) and structure of
3-4. 화합물 4의 구조해석3-4. Structural analysis of
화합물 4의 ESI-MS 분석 결과에서 양성자화된 분자 이온 피크로 m/z 171 [M+H]+이 관찰되어 이 화합물의 분자량은 170임을 알 수 있었다.As a result of ESI-MS analysis of
화합물 4의 1H-NMR 스펙트럼(500 MHz, CD3OD)에서 관찰된 1종의 메틴 양성자 시그널[δ 3.85 (1H, q, J = 7.5 Hz, H-2)], 1종의 메틸 양성자 시그널[δ 1.45 (3H, d, J = 7.5 Hz, H-3)]과 13C-NMR 스펙트럼(125 MHz, CD3OD)에서 1종의 아미드 카보닐 카본 시그널[δ 170.0 (C-1)]을 포함한 총 3종 카본 시그널들이 관찰되어 이 화합물 또한 화합물 3과 같이 알라닌의 존재가 시사되었다.One methine proton signal [δ 3.85 (1H, q, J = 7.5 Hz, H-2)] and one methyl proton signal observed in 1 H-NMR spectrum (500 MHz, CD 3 OD) of compound 4 [δ 1.45 (3H, d, J = 7.5 Hz, H-3)] and one amide carbonyl carbon signal in 13 C-NMR spectrum (125 MHz, CD 3 OD) [δ 170.0 (C-1)] A total of three carbon signals including
게다가 1H-NMR 스펙트럼에서 2종의 메틴 양성자 시그널들[δ 4.01-4.06 (1H, d, J =7.5 Hz, H-2')과 2.26-2.29 (1H, m, H-3')], 2종의 이중선(doublet) 메틸 양성자 시그널들 [δ 1.05 (3H, d, J =7.5 Hz, H-4'), 0.95 (3H, m, J =7.0 Hz, H-5')]과 13C-NMR 스펙트럼에서 1종의 아미드 카보닐 카본 시그널[δ 167.9 (C-1')]을 포함한 총 5종의 카본 시그널들이 관찰되어 다른 1종의 아미노산은 발린(valine)으로 시사되었다. 이상의 MS와 NMR 결과로부터 이 화합물은 알라닌과 발린으로 구성된 디펩티드로 시사되었다. 이는 알라닌과 발린이 결합된 화합물임을 HMBC 스펙트럼으로부터 확인할 수 있었다.In addition, two methine proton signals in 1 H-NMR spectrum [δ 4.01-4.06 (1H, d, J =7.5 Hz, H-2') and 2.26-2.29 (1H, m, H-3')], Two doublet methyl proton signals [δ 1.05 (3H, d, J =7.5 Hz, H-4'), 0.95 (3H, m, J =7.0 Hz, H-5')] and 13 C In the -NMR spectrum, a total of 5 carbon signals including one amide carbonyl carbon signal [δ 167.9 (C-1')] were observed, suggesting that the other amino acid was valine. The above MS and NMR results suggest that this compound is a dipeptide composed of alanine and valine. It could be confirmed from the HMBC spectrum that it was a compound in which alanine and valine were combined.
특히 HMBC 스펙트럼에서 δ 3.85 (H-2)과 167.9 (C-1') 및 δ 4.01-4.06 (H-2')과 170.0 (C-1) 간의 상관관계들이 관찰되었다. 그러므로 화합물 4는 사이클로-발릴-알라닐(cyclo-(valyl-alanyl))로 구조해석되었다.In particular, correlations between δ 3.85 (H-2) and 167.9 (C-1') and δ 4.01-4.06 (H-2') and 170.0 (C-1) were observed in the HMBC spectrum. Therefore,
하기 표 4는 화합물 4 (CD3OD)의 1H- (500 MHz) 및 13C- (125 MHz) NMR 자료이다. 화합물 4의 HMBC 상관관계(화살표) 및 구조는 도 5에 나타내었다.Table 4 below shows 1 H- (500 MHz) and 13 C- (125 MHz) NMR data of compound 4 (CD 3 OD). The HMBC correlation (arrow) and structure of
3-5. 화합물 5의 구조해석3-5. Structural analysis of
화합물 5의 ESI-MS 분석결과에서 양성자화된 분자 이온 피크인 m/z 211 [M+H]+가 관찰되어 이 화합물의 분자량은 210임을 알 수 있었다.As a result of ESI-MS analysis of
화합물 5의 13C-NMR 스펙트럼(150 MHz, CD3OD)에서는 2종의 아미드 카보닐 카본 시그널들[δ 171.7 (C-1)과 168.0 (C-1')]을 포함한 총 11종 카본 시그널들이 관찰되어 MS 분석 결과와 일치하였다.In the 13 C-NMR spectrum (150 MHz, CD 3 OD) of
화합물 5의 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼에서는 화합물 1 내지 3의 경우에서 관찰된 프롤린에 해당하는 양성자 및 카본 시그널들이 관찰되어, 이 화합물 또한 프롤린을 포함한 디펩티드로 시사되었다.In 1 H- and 13 C-NMR spectra of
이에 더하여 1H-NMR 스펙트럼(600 MHz, CD3OD)에서 2종의 메틴 양성자 시그널들[δ 3.67 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-2'), 1.58-1.62 (1H, m, H-4'a), 1.20-1.25 (1H, m, H-4'b)], 1종의 메틸렌 양성자 시그널[δ 1.85-1.90 (1H, m, H-3')] 및 2종의 이중선 메틸 양성자 시그널들[δ 0.95 (3H, t, J = 7.2 Hz, H-5'), 1.00 (3H, d, J = 7.2 Hz, H-6')]이, 그리고 13C-NMR 스펙트럼(150 MHz, CD3OD)에서 1종의 아미드 카보닐 카본 시그널[δ 168.0 (C-1')]을 포함한 총 6종의 카본 시그널들이 관찰되었다. 이상의 결과로부터 화합물 5는 프롤린 외 다른 1종의 아미노산은 류신(leucine)으로 시사되었다.In addition, in 1 H-NMR spectrum (600 MHz, CD 3 OD), two methine proton signals [δ 3.67 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-2'), 1.58-1.62 (1H, m, H-4'a), 1.20-1.25 (1H, m, H-4'b)], one methylene proton signal [δ 1.85-1.90 (1H, m, H-3')] and two doublets Methyl proton signals [δ 0.95 (3H, t, J = 7.2 Hz, H-5'), 1.00 (3H, d, J = 7.2 Hz, H-6')], and 13 C-NMR spectrum (150 MHz, CD 3 OD), a total of 6 carbon signals including one amide carbonyl carbon signal [δ 168.0 (C-1')] were observed. From the above results, it was suggested that in
이 화합물은 프롤린과 류신이 결합된 화합물임을 HMBC 분석으로부터 확인할 수 있었다. 특히, HMBC 스펙트럼에서 δ 3.48-3.65 (H-5)과 168.0 (C-1') 간에 그리고 δ 3.67 (H-2')과 171.7 (C-1) 간에 상관관계들이 관찰되었다. 그러므로 화합물 5는 사이클로-프롤릴-루이실(cyclo-(prolyl-leucyl))로 구조해석되었다.It was confirmed from HMBC analysis that this compound was a compound in which proline and leucine were combined. In particular, correlations were observed between δ 3.48-3.65 (H-5) and 168.0 (C-1') and between δ 3.67 (H-2') and 171.7 (C-1) in the HMBC spectrum. Therefore,
하기 표 5는 화합물 5의 1H- (600 MHz) 및 13C- (150 MHz) NMR 자료(CD3OD)이다. 화합물 5의 HMBC 상관관계(화살표) 및 구조는 도 6에 나타내었다.Table 5 below shows 1 H- (600 MHz) and 13 C- (150 MHz) NMR data (CD 3 OD) of
3-6. 화합물 6의 구조해석3-6. Structural analysis of
화합물 6의 ESI-MS 분석결과에서 양성자화된 분자 이온 피크인 m/z 245 [M+H]+이 관찰되어 이 화합물의 분자량은 244임을 알 수 있었다.As a result of ESI-MS analysis of
화합물 6의 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼에서는 화합물 1 내지 3 및 5의 경우에서 관찰된 프롤린에 해당하는 양성자 및 카본 시그널들이 관찰되어, 이 화합물 또한 프롤린을 포함한 디펩티드로 시사되었다.In the 1 H- and 13 C-NMR spectrum of
게다가 1H-NMR 스펙트럼 (600 MHz)에서 1종의 메틴 양성자 시그널[δ 4.46 (1H, t, J = 5.0 Hz, H-8')], 1종의 메틸렌 양성자 시그널[δ 3.11-3.21 (2H, m, H-7')] 및 벤젠 고리(benzene ring)에 해당하는 5종의 양성자 시그널들[δ 7.22-7.31 (5H, m, H-2'~6')]이, 그리고 13C-NMR 스펙트럼 (150 MHz, CD3OD)에서 1종의 아미드 카보닐 카본 시그널 [δ 167.0 (C-9')]을 포함한 총 9종의 카본 시그널들이 관찰되어, 화합물 6의 다른 아미노산으로는 페닐알라닌(phenylalanine)의 존재가 시사되었다.In addition, one methine proton signal [δ 4.46 (1H, t, J = 5.0 Hz, H-8')] and one methylene proton signal [δ 3.11-3.21 (2H) in 1 H-NMR spectrum (600 MHz) , m, H-7')] and five proton signals corresponding to the benzene ring [δ 7.22-7.31 (5H, m, H-2'~6')], and 13 C- In the NMR spectrum (150 MHz, CD 3 OD), a total of nine carbon signals including one amide carbonyl carbon signal [δ 167.0 (C-9')] were observed, and as other amino acids of
화합물 6은 프롤린과 페닐알라닌으로 구성된 화합물임을 1H-1H-COSY 및 HMBC 분석으로부터 확인할 수 있었다. 특히, HMBC 스펙트럼에서 δ 4.07 (H-2)과 167.0 (C-9'), δ 4.46 (H-8')과 171.0 (C-1) 간의 상관관계들이 추가로 관찰되었다. 그러므로 화합물 6은 사이클로-프롤릴-페닐알라닐(cyclo-(prolyl-phenylalanyl))로 구조해석되었다.It was confirmed from 1 H- 1 H-COSY and HMBC analysis that
하기 표 6는 화합물 6의 1H- (600 MHz) 및 13C-(150 MHz) NMR 자료(CD3OD)이다. 또한, 화합물 6의 1H-1H-COSY 상관관계(굵은선), HMBC 상관관계(화살표) 및 구조는 도 7에 나타내었다.Table 6 below is 1 H- (600 MHz) and 13 C- (150 MHz) NMR data (CD 3 OD) of
실시예 4: 화합물 1 내지 6을 이용한 골 질환 예방 또는 치료 효과 확인Example 4: Confirmation of the effect of preventing or treating bone
4-1. 골수 유래 대식세포 분리 및 배양4-1. Bone marrow-derived macrophages isolation and culture
8 내지 12 주령 사이의 C57BL/6 마우스의 대퇴골(femur)에서 골수를 분리하고, 대식세포(macrophage)로 분화시키기 위하여 10% FBS(Fetal bovine serum) 및 1% 페니실린과 M-CSF(Macrophage-colony stimulating factor) 25 ng/ml가 첨가된 MEM alpha 배지에 도말하였다. 3일 동안 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하여 골수 유래 대식세포(bone marrow-derived macrophages; BMDMs)를 얻었다. 상기 골수 유래 대식세포를 2x105 cells/well의 밀도로 12 웰-플레이트(well-plate)에서 24시간 동안 배양하였다.Bone marrow was isolated from the femur of C57BL/6 mice between 8 and 12 weeks of age, and 10% Fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin and M-CSF (Macrophage-colony) for differentiation into macrophages stimulating factor) was plated on MEM alpha medium to which 25 ng/ml was added. Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) were obtained by culturing in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 conditions for 3 days. The bone marrow-derived macrophages were cultured for 24 hours in a 12 well-plate at a density of 2x10 5 cells/well.
4-2. 화합물 1 내지 6의 파골세포 분화에 대한 억제4-2. Inhibition of Osteoclast Differentiation of
대식세포에 RANKL을 처리하면 RANK에 결합하며 TRAP(Tartrate resistance acid phosphatase) 양성 세포로 분화하게 되는데, 이 TRAP 양성 세포에 RANKL, TNF-α와 같은 염증인자로 자극하면 세포끼리 융합되어 다핵형 TRAP 양성 세포로 분화된다.When macrophages are treated with RANKL, they bind to RANK and differentiate into TRAP (tartrate resistance acid phosphatase)-positive cells. differentiate into cells.
마우스 대식세포를 12 웰-플레이트에 2x105 cells/well의 밀도로 10% FBS, 1% PS 및 M-CSF(25 ng/ml)가 첨가된 배지에 24h 배양 후, 같은 조성의 배지로 교체해준 후 화합물 1 내지 6(10 또는 40 μM)을 2h 동안 처리하였다. 이후 RANKL을 100 ng/ml 처리하여 24h 동안 반응시켰다. 위와 같은 방법으로 4일간 분화시켰다.Mouse macrophages were cultured for 24 h in a medium supplemented with 10% FBS, 1% PS and M-CSF (25 ng/ml) at a density of 2x10 5 cells/well in a 12 well-plate, and then replaced with a medium of the same composition. Then, compounds 1 to 6 (10 or 40 μM) were treated for 2 h. Then, RANKL was treated with 100 ng/ml and reacted for 24 h. It was differentiated for 4 days in the same way as above.
이후 파골세포의 세포 화학적 표지효소인 TRAP에 발색성 기질을 첨가하여 분화시킨 대식세포의 핵을 염색하였고, 핵이 3개 이상으로 다핵화된 세포를 관찰하여 이미지화 및 정량화하여 표 7로 나타내었다.Thereafter, the nuclei of macrophages differentiated by adding a chromogenic substrate to TRAP, a cytochemical labeling enzyme of osteoclasts, were stained, and cells with three or more nuclei were observed, imaged and quantified, as shown in Table 7.
(uM)Throughput
(uM)
도 8a 및 8b에서 확인할 수 있듯이, 대식세포에 RANKL을 처리했을 때 파골세포의 분화가 증가하였고, 화합물 1 내지 6을 10 μM씩 처리했을 때 파골세포 분화가 유의적으로 억제된 것을 확인하였다.As can be seen in Figures 8a and 8b, when macrophages were treated with RANKL, osteoclast differentiation was increased, and it was confirmed that osteoclast differentiation was significantly inhibited when
도 9a 및 9b에서 확인할 수 있듯이, 특히 화합물 1 내지 6을 40 μM씩 처리했을 때 파골세포 분화가 10 μM로 처리했을 때와 비교하여 현저하게 억제된 것을 확인하였다.As can be seen in FIGS. 9a and 9b , it was confirmed that osteoclast differentiation was significantly inhibited when, in particular, compounds 1 to 6 were treated at 40 μM compared to when treated with 10 μM.
10 및 40 μM로 처리한 경우 모두에서, 특히 화합물 3 및 5가 파골세포 분화 억제에 가장 효과적임을 확인하였다.In both cases treated with 10 and 40 μM, it was confirmed that
추가적으로, 화합물 1 내지 6을 동량으로 혼합하여 준비한 혼합물(Mixture)을 10 μM씩 처리한 결과도 동일한 방법으로 확인하여 표 8로 나타내었다.Additionally, the results obtained by treating the mixture prepared by mixing
(uM)Throughput
(uM)
도 10a 및 10b에서 확인할 수 있듯이, 화합물 1 내지 6을 혼합하여 10 μM씩 처리한 결과, 같은 농도의 단일 화합물을 처리했을 경우 대비 파골세포로의 분화가 현저하게 억제된 것을 확인하였다.As can be seen in FIGS. 10a and 10b , as a result of mixing 10 μM of
4-3. 화합물 1 내지 6의 파골세포 분화 관련 유전자 발현에 대한 억제4-3. Inhibition of Osteoclast Differentiation-Related Gene Expression of
상기 4-2와 동일한 방법으로 화합물 1 내지 6을 동량으로 혼합하여 마우스 대식세포에 처리하고 TRAP, Cathepsin K, DC-STAMP, NFATc1에 대한 유전자 발현(gene expression)을 Real-time PCR을 통해 확인하였다.In the same manner as in 4-2,
대식세포 BMDMs을 12 웰-플레이트에 2x105 cells/well의 밀도로 24h 동안 배양하였다. 상기 4-2에서 파골세포 분화 억제에 가장 효과적이었던 화합물 1 내지 6의 혼합물을 10 μM의 농도로 2h 동안 대식세포에 처리하였다. 이후 RANKL을 100 ng/ml 처리하여 24h 동안 반응시켰다. 위와 같은 방법으로 3일간 분화시킨 후 TRIzol 용액을 이용하여 세포내 RNA를 분리하고 RNA 정량값을 토대로 RT premix를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 프라이머(primer)를 이용하여 Real time PCR을 통해 증폭시켰다.Macrophage BMDMs were cultured for 24 h at a density of 2x10 5 cells/well in 12 well-plates. The mixture of
사용된 프라이머는 Mouse TRAP, Cathepsin K, DC-STAMP, NFATc1이고 하기 표 9와 같으며, Control 유전자인 β-actin과 비교하여 상대적 양을 비교함으로써 표 10에 나타내었다.The primers used were Mouse TRAP, Cathepsin K, DC-STAMP, and NFATc1 and are shown in Table 9 below, and are shown in Table 10 by comparing the relative amounts compared to the Control gene β-actin.
도 11a 내지 11d에서 확인할 수 있듯이, RANKL 처리에 의하여 증가된 TRAP, Cathepsin K, DC-STAMP, NFATc1의 발현은 L. sakei에서 분리된 화합물 1 내지 6의 혼합물의 처리에 의해서 감소하였다.11a to 11d, the expression of TRAP, Cathepsin K, DC-STAMP, and NFATc1 increased by RANKL treatment was decreased by treatment with a mixture of
이로부터 화합물 1 내지 6 및 이의 혼합물이 전사인자인 NFATc1의 활성을 감소시키고, 파골세포 분화기전 관련 유전자인 TRAP, Cathepsin K, DC-STAMP의 발현을 감소시킴으로써, 파골세포로의 분화를 억제시킴을 확인할 수 있었다.From this, compounds 1 to 6 and a mixture thereof reduce the activity of NFATc1, a transcription factor, and reduce the expression of TRAP, Cathepsin K, DC-STAMP, which are genes related to the osteoclast differentiation mechanism, thereby inhibiting differentiation into osteoclasts. could check
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for isolating cyclodipeptide-based compound derived from Lactobacillus sakei culture medium and composition for preventing or treating bone disease comprising the same <130> PN200344 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse TRAP Forward primer <400> 1 ctggagtgca cgatgccagc gaca 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse TRAP Reverse primer <400> 2 tccgtgctcg gcgatggacc aga 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin K Forward primer <400> 3 ggccaactca agaagaaaac 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin K Reverse primer <400> 4 gtgcttgctt cccttctgg 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DC-STAMP Forward primer <400> 5 ccaaggagtc gtccatgatt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DC-STAMP Reverse primer <400> 6 ggctgctttg atcgtttctc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1 Forward primer <400> 7 ctcgaaagac agtggagcat 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1 Reverse primer <400> 8 cggctgcctt ccgtctcata g 21 <110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for isolating cyclodipeptide-based compound derived from Lactobacillus sakei culture medium and composition for preventing or treating bone disease comprising the same <130> PN200344 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse TRAP Forward primer <400> 1 ctggagtgca cgatgccagc gaca 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse TRAP Reverse primer <400> 2 tccgtgctcg gcgatggacc aga 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin K Forward primer <400> 3 ggccaactca agaagaaaac 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin K Reverse primer <400> 4 gtgcttgctt cccttctgg 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DC-STAMP Forward primer <400> 5 ccaaggagtc gtccatgatt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DC-STAMP Reverse primer <400> 6 ggctgctttg atcgtttctc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1 Forward primer <400> 7 ctcgaaagac agtggagcat 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1 Reverse primer <400> 8 cggctgcctt ccgtctcata g 21
Claims (11)
락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)를 배양하는 배양액 제조 단계; 및
배양액을 클로로포름으로 분획하는 용매분획 단계.A method for isolating a cyclodipeptide-based compound comprising the steps of:
Lactobacillus sake K ( Lactobacillus sakei ) A culture medium preparation step of culturing; and
A solvent fractionation step of fractionating the culture solution with chloroform.
클로로포름으로 분획한 용매층을 헥산, 에틸아세테이트(EtOAc) 및 메탄올(MeOH)의 단계적 시스템으로 컬럼 분획하는 제1 분획 단계; 및
제1 분획 단계의 용출액을 물(H2O) 및 메탄올의 구배 시스템으로 컬럼 분획하는 제2 분획 단계.The separation method according to claim 5, further comprising the following steps:
a first fractionation step of column-fractionating the solvent layer fractionated with chloroform using a stepwise system of hexane, ethyl acetate (EtOAc) and methanol (MeOH); and
A second fractionation step of column fractionation of the eluate of the first fractionation step with a gradient system of water (H 2 O) and methanol.
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2020
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