KR20220080539A - 광화학 반응을 이용한 달팽이관 허혈 동물모델 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 광화학 반응을 이용한 달팽이관 허혈 유도방법 및 상기 방법에 의해 제조된 동물 모델 등에 관한 것으로 본 발명의 방법에 의할 경우 종래와 달리 별도의 조직 절개가 없이 비침습적인 방법으로 허혈 모델을 유도할 수 있다는 장점이 있다.
Description
본 발명은 광화학 반응을 이용한 달팽이관 허혈 유도방법 및 상기 방법에 의해 제조된 동물 모델 등에 관한 것이다.
돌발성난청은 이비인후과에서 흔히 볼 수 있는 질병이고, 현재 치료는 전신 또는 고막내 스테로이드 처방을 시도할 수 있으나 그 효과는 명백하지 않고, 50%의 환자들이 치료되지 않는다. 이러한 돌발성난청의 원인 중 하나로 허혈성 원인이 대두되고 있으며 미로동맥폐색 (Labyrinthine artery occlusion)이 그 구체적인 원인으로 보고되고 있다.
돌발성 난청의 원인이 허혈성일 경우, 내이의 달팽이관 내의 lateral wall과 stria vascularis의 조직변화로 야기되는 혈류 감소와 모세관 수축으로 미세순환 장애가 유도되면서 광범위한 달팽이관 손상이 초래된다.
달팽이관 내 허혈로 인해 달팽이관 주변 미세혈류가 변하게 되고, 여러 염증 반응 및 산화 반응으로 유모세포가 파괴되어 난청이 일어나는 것으로 추측되며, 손상 받은 유모세포들은 다른 세포와는 달리 재생되지 않아 치료가 매우 어려운 영구적인 난청을 일으킬 수 있다. 따라서 돌발성 난청 치료연구를 위한 허혈성 모델 구축은 내이 허혈로 인한 달팽이관 장애의 병태 생리학 및 약리학적 치료를 연구하는 데 유용할 수 있다.
이에, 본 발명에서는 돌발성 난청 치료연구에 활용하고자, 난청원인 중의 하나인 내이 허혈을 유도하는 동물모델을 확립하는 것으로, 특정 광에 반응하는 광화학물질을 이용하여 달팽이관 내 허혈을 유도하는 방법을 확립하고자 하였다.
본 발명의 발명자는 난청 치료연구를 위한 허혈성 모델 구축을 연구하던 중 별도의 조직 절개가 요구되지 않는 비침습적인 달팽이관 허혈 모델 제조 방법을 완성하였다.
이에 본 발명의 목적은 달팽이관 허혈 동물모델 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 달팽이관 허혈 동물 모델을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 하기 단계를 포함하는 달팽이관 허혈 동물모델 제조방법을 제공한다.
a) 인간을 제외한 동물의 정맥에 로즈뱅갈(rose bengal)을 주입하는 단계;
b) 외이도를 통해 비침습적 방법으로 레이저 발생 장치를 상기 a)단계 동물의 고막에 접근시키는 단계; 및
c) 녹색광 레이저를 상기 b)단계 동물의 고막에 조사하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 a)단계의 인간을 제외한 동물은 설치류 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 설치류는 마우스(mouse), 렛(rat) 또는 기니픽(guinea pig) 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 a)단계의 로즈뱅갈 농도는 25 내지 40 mg/kg 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 c) 단계의 레이저는 파장이 520 내지 560 nm인 녹색광 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 c) 단계의 레이저 조사는 10 내지 20분간 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 달팽이관 허혈 동물모델을 제공한다.
본 발명은 광화학 반응을 이용한 달팽이관 허혈 유도방법 및 상기 방법에 의해 제조된 동물 모델 등에 관한 것으로 본 발명의 방법에 의할 경우 종래와 달리 별도의 조직 절개가 없이 비침습적인 방법으로 허혈 모델을 유도할 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 허혈 유도 장비 및 광조사 진행방법에 관한 사진이다.
도 2는 허혈 유도 후 청각기능 실험 일정을 나타낸 것이다.
도 3은 말초청각기관의 절편조직 도식에 관한 것이다.
도 4는 허혈 유도 후 말초청각조직의 청각 기능 및 조직학적 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 반대측 귀, 로즈뱅갈 단독군, 레이저 단독군의 10일째 청각 기능 및 조직학적 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 조직학적 분석을 통해 SV소실에 따른 혈관내피세포항체 발현 감소를 확인한 것이다.
도 7은 레이저 도플러를 이용하여 허혈 유도시 혈류 수치 감소를 확인한 것이다.
도 2는 허혈 유도 후 청각기능 실험 일정을 나타낸 것이다.
도 3은 말초청각기관의 절편조직 도식에 관한 것이다.
도 4는 허혈 유도 후 말초청각조직의 청각 기능 및 조직학적 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 반대측 귀, 로즈뱅갈 단독군, 레이저 단독군의 10일째 청각 기능 및 조직학적 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 조직학적 분석을 통해 SV소실에 따른 혈관내피세포항체 발현 감소를 확인한 것이다.
도 7은 레이저 도플러를 이용하여 허혈 유도시 혈류 수치 감소를 확인한 것이다.
본 발명의 발명자는 돌발성 난청 치료연구를 위한 허혈성 모델 구축을 연구하던 중 별도의 조직 절개가 없이 비침습적으로 달팽이관 허혈 모델 제조 방법을 완성하였다.
이에 본 발명은 하기 단계를 포함하는 달팽이관 허혈 동물모델 제조방법을 제공한다.
a) 인간을 제외한 동물의 정맥에 로즈뱅갈(rose bengal)을 주입하는 단계;
b) 외이도를 통해 비침습적 방법으로 레이저 발생 장치를 상기 a)단계 동물의 고막에 접근시키는 단계; 및
c) 녹색광 레이저를 상기 b)단계 동물의 고막에 조사하는 단계.
본 명세서에서 사용된 "동물" 또는 "실험동물"은 인간 이외의 임의의 포유류 동물을 의미한다. 상기 동물은 모든 연령의 동물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물들은, 예를 들어, 상업용 소스로부터 이용할 수 있다.
본 발명에서 허혈이란 조직, 장기의 산소수요에 대해 그 공급원인 혈류가 절대적 또는 상대적으로 부족한 상태를 의미한다. 본 발명의 로즈 뱅갈을 주사한 후 녹색파장 빛을 조사하는 경우 혈전이 유도되어 동맥을 막게 되므로 허혈이 유도될 수 있다.
본 발명에서 달팽이관은 귀의 가장 안쪽인 내이에 위치하며 듣기를 담당하는 청각기관이다. 그 안은 림프액으로 채워져 있고 소리를 받아들이는 데 중심적 역할을 하는 유모세포들이 존재한다.
본 발명에서 로즈뱅갈은 단백질의 산화를 광증감시키는 작용을 하는 염료의 하나로, 본 발명에서는 상술한 바와 같이 혈전 유도에 이용되며, 아래와 같은 구조를 가진다.
[화학식 1]
본 발명에서 비침습적 방법이란 대상 동물의 피부를 관통하지 않는 방법을 의미하며, 예시로서 본 발명은 동물의 귀 조직 부분을 절개하지 않고 레이저 파이버를 외이도를 통해 삽입하여 고막에 근접시킨 후 광조사 하는 방법을 통해 달팽이관 허혈을 유도하였다.
본 발명에서 레이저 발생 장치는 520 내지 560 nm 파장의 녹색광 레이저를 발생시킬 수 있는 것이면 제한없이 이용할 수 있다.
본 발명에서 상기 a)단계의 인간을 제외한 동물은 설치류 일 수 있으며 구체적으로, 마우스(mouse), 렛(rat) 또는 기니픽(guinea pig) 일 수 있다.
본 발명에서 상기 a)단계의 로즈뱅갈 농도는 25 내지 40mg/kg 일 수 있으며, 바람직하게는 30mg/kg 일 수 있다.
본 발명에서 상기 c) 단계의 레이저는 파장이 520 내지 560 nm인 녹색광 일 수 있으며, 바람직하게는 532nm 일 수 있다.
본 발명에서 상기 c) 단계의 레이저 조사는 10 내지 20분간 수행될 수 있으며, 바람직하게는 15분간 수행될 수 있다.
다른 양태로서 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 달팽이관 허혈 동물모델을 제공한다. 상기 모델은 종래의 허혈 모델과 달리 비 침습적 방법에 의해 제조되었으므로 관련 질환의 시험에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
<실시예 1: 시약 및 재료>
로즈뱅갈은 sigma aldrich에서 구매하고, 녹생광 조사를 위해 Diode-Pumped Solid-State (DPSS, LRS-0532) 레이저를 Laserglow Technologies로부터 구매하여 사용하였으며, 조직염색에 필요한 Eosin과 Hematoxlin은 BBC biochemical에서, 면역염색에 사용된 anti-Endothelial cell antibody(RECA-1)는 Abcam에서 구매하여 사용하였으며, 혈류측정을 위해서는 750 nm Laser Doppler (PeriScan PIM3 system, Perimed AB)를 사용하여 측정하였다. 또한 동물은 SPF급으로 동물전문회사에서 구매하여 실험을 진행하였다.
<실시예 2: 실험동물의 제조 및 실험방법>
7주령 수컷 SD(Sprague-Dawley) 렛(rat)을 흡입마취 시킨 뒤, 30mg/kg의 로즈뱅갈 용액을 대퇴부정맥에 주입하고 5분 뒤에 532 nm 레이저에 장착된 레이저 파이버를 외이도를 통하여 고막까지 근접시킨 다음 175 mW에서 15분 동안 광조사를 시행하였다(도 1 참조).
광조사 후 1일, 3일, 7일, 10일째 되는 날에 청성뇌간유발반응검사(auditory brain response, ABR)로 청력 역치를 확인하고 분석하였다(도 2 참조). ABR측정은 동물을 마취시킨 다음 3개의 electrods (active, reference, ground) 바늘을 동물의 양쪽 귀와 정수리(ground)에 꽂고, 8, 16, 32 kHz의 주파수를 이용해 80 dB SPL부터 10 dB SPL까지 5 dB 간격으로 전기자극 신호에 따른 청각기능의 변화를 청성뇌간유발반응검사(RZ6; Tucker Davis Technologies, Alachua, FL) 장비를 사용하여 청력을 측정하였다.
실험을 마친 10일째 동물을 희생시켜 와우(cochlea)를 분리해 낸 후 4% PFA에 2시간 동안 후 고정 후 0.5M EDTA로 4-7일 탈회(decalcification) 시켰다. 그 다음 Cryomold로 이동시켜 OCT로 포매(embedding) 시킨 후 얼음 결정이 생기지 않게 드라이아이스를 이용해서 얼린 후 5 μM의 두께로 동결 절편을 만들어 조직염색과 면역 염색을 통해 청각 조직의 조직학적 변화를 관찰하였다.
조직염색은 냉동절편의 OCT만 슬라이드에서 제거하고 헤마톡실린(Hematoxylin)으로 1분간 핵을 염색하고 3분정도 세척한 다음 1% 에시드 알코올(acid alchol)에 1회 dip 하고 2분정도 세척하고 에오진(Eosin)에 5회 디핑(dipping)한 후 백그라운드만 없앨 정도로 씻어낸 후 디핑으로 탈수(dehydration)시킨 다음 마운팅(mounting)하여 샘플을 제작한 후 올림푸스 광학현미경 (BX53)으로 관찰하였다.
면역 염색을 위해, 5% normal goat serum과 0.3% Triton X-100을 첨가한 1X PBS에 샘플을 넣고 실온에서 1 시간 동안 블로킹(blocking) 한 후, 1:200배로 희석된 mouse anti-Endothelial cell antibody(RECA-1, ab9774, Abcam) 1차를 사용하여 4 ℃에서 16-18시간 (overnight) 반응시켰다. 이후, 샘플을 1X PBS로 10분씩 3번 세척한 다음, Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit (IgG) (1:1000 희석, # A11034, Life Technologies) 2차 항체로 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로, 샘플을 1X PBS로 10분씩 3번 PBS 세척 후 Vectashield (Vector Labs)를 사용하여 샘플슬라이드를 제작하였다. 염색된 세포를 공초점 현미경 (LSM 510 META, Zeiss, Germany)으로 관찰하였다.
미세혈류측정을 위해서 먼저 동물을 마취시킨 후, 귀 뒤쪽을 절개하고 bula의 한쪽 면을 모두 제거하여 달팽이관을 노출시킨 다음, 광선이 잘 흡수되는 까만색 패드 위에 놓고, 레이저 도플러(PeriScan PIM3 system)의 NR 헤드를 목표물에 위치시킨 뒤 Perfusion scale과 intensity scale, color 해상도를 소프트웨어 상에서 조정한 뒤 혈류를 측정 분석하였다.
<실시예 3: 허혈 유도 후 말초청각조직의 청력변화 조직학적 변화>
허혈유도 10일째의 8, 16, 32 kHz의 주파수 영역에서 ABR 측정으로 청력역치를 확인한 결과, 광조사 1일째부터 청력의 역치가 70 dB 이상 떨어진 것을 확인하였으며, 10일 째까지도 평균 60-70 dB청력로 청력손실이 유지되고 있음을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
또한 조직학적 분석을 통해 로즈뱅갈과 532 nm laser 광조사 후 10 일째 말초청각조직을 확인한 결과 듣는 영역을 담당하는 유모세포도 손실되고 광화학반응으로 SV 부분도 소실되었음을 확인할 수 있으며(도 4 참조), 또한 SV소실에 따른 혈관내피세포항체 발현도 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있다(도 6 참조).
반면, 도 5에서 보는 바와 같이 반대측 귀, 로즈뱅갈 단독군, 레이저 단독군의 10일째 청각은 8, 16, 32 kHz의 주파수 영역 모두에서 정상청력을 유지하고 있음을 알 수 있었고, 조직학적 분석에서도 조직의 손상은 없었다.
허혈 유도 후 레이저 도플러를 이용하여 달팽이관내 미세혈류변화를 위해 허혈 유도 3일째 샘플의 혈류를 측정한 결과 대조군에 비교하여 통계적으로 유의하게 혈류 수치가 낮은 것이 확인되었다(도 7참조).
Claims (7)
- 하기 단계를 포함하는 달팽이관 허혈 동물모델 제조방법:
a) 인간을 제외한 동물의 정맥에 로즈뱅갈(rose bengal)을 주입하는 단계;
b) 외이도를 통해 비침습적 방법으로 레이저 발생 장치를 상기 a)단계 동물의 고막에 접근시키는 단계; 및
c) 녹색광 레이저를 상기 b)단계 동물의 고막에 조사하는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 a)단계의 인간을 제외한 동물은 설치류인 것인, 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 설치류는 마우스(mouse), 렛(rat) 또는 기니픽(guinea pig)인 것인, 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 a)단계의 로즈뱅갈 농도는 25 내지 40 mg/kg인 것인, 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 c) 단계의 레이저는 파장이 520 내지 560 nm인 녹색광인 것인, 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 c) 단계의 레이저 조사는 10 내지 20분간 수행되는 것인, 제조방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 달팽이관 허혈 동물모델.
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Citations (2)
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| KR102142434B1 (ko) * | 2018-09-18 | 2020-08-07 | 아주대학교산학협력단 | 스트레스를 이용한 난청 동물 모델의 제조방법 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Acta Otolaryngol. vol.118 no.5 pp.666-672(1998)* * |
| Eur Arch Otorhinolaryngol vol.250 no.5 pp.292-296,1993. * |
| Eur Arch Otorhinolaryngol. vol.248 no.2 pp.105-108, 1990. * |
Also Published As
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| KR102557213B1 (ko) | 2023-07-19 |
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