KR20120021941A - 겐타마이신을 이용한 한 방향 난청 동물 모델의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한 방향 난청 동물 모델의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 실험동물의 한쪽 중이에 겐타마이신을 처리하는 단계를 포함하는 한 방향 난청 동물 모델의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따르면 실험동물의 한쪽 중이에 겐타마이신을 직접 주사함으로써 중이에 있는 유모세포의 손상으로 인한 난청을 유발시킬 수 있으며 본 발명의 방법에 따라 제조된 한 방향 난청 동물은 난청과 같은 질병의 치료를 위한 임상연구, 의약품 제조 및 의료기기 제조에 적용할 수 있다.

Description

겐타마이신을 이용한 한 방향 난청 동물 모델의 제조 방법 {Methods for production of uni-lateral deafness animal model using gentamycin}

본 발명은 한 방향 난청 동물 모델의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 실험동물의 한쪽 중이에 겐타마이신을 처리하는 단계를 포함하는 한 방향 난청 동물 모델의 제조 방법에 관한 것이다.

겐타마이신(gentamycin)은 오랫동안 우수한 항생제로 널리 사용되고 있다. 미크로모노스포라 푸르프레아(micromonospora purprea) 및 미크로모노스포라 에키노스포라(micromonospora echinospora)가 생산하는 아미노글루코시드 계열의 항생물질로, 겐타마이신 C1, C2, C1a의 혼합물이다. 그람양성균 중 포도상구균과 그람음성균 중 대장균?살모넬라균 및 변형균?녹농균 등에 효과가 있다. 겐타마이신은 페니실린이나 앰피실린(ampicillin)과 함께 장내구균성 심내막염의 치료에도 사용된다. 비경구적인 방법으로 투여하거나 외용제로 많이 사용된다. 겐타마이신은 미국식품의약청(Food and Drug Administration)으로부터 허가를 받은 약물이다.

최근 연구 발표에 의하면 겐타마이신은 항생제 투여를 통하여 약효를 볼 수 있는 뒤센형 근위축증의 진전을 완전히 차단할 수 있다고 한다. 부작용으로 영구적인 청각 상실과 신장 손상 등이 대표적인 것으로 알려져 있다.

한편, 난청과 같은 질병의 치료를 위한 임상연구, 의약품 제조 및 의료기기 제조에는 양쪽 난청이 아닌 한쪽은 정상이고 다른 한쪽이 난청인 동물 모델이 필요하다. 일반적으로 청각경로(auditory path-way)를 규명하는데 있어서 양방향 난청모델을 이용하는 것보다 한 방향 난청모델을 이용할 때 좌우 주사방향에 따라 해부학적 차이점을 쉽게 파악할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 부작용으로서 청각 상실을 나타내는 겐타마이신을 이용하여 한 방향 난청 동물 모델을 제작하고자 연구하였으며, 실험동물에서 한쪽 중이에 겐타마이신을 직접 주사함으로써 한 방향 난청 동물을 제작할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 겐타마이신을 이용하여 한쪽은 정상이고 다른 한쪽이 난청인 한 방향 난청 동물 모델을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 실험동물의 한쪽 중이에 겐타마이신을 처리하는 단계를 포함하는 한 방향 난청 동물 모델의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서, 상기 ‘실험동물’은 난청(deafness) 증상을 갖지 않은 동물을 의미한다. 상기 실험동물은 특별히 한정되는 것은 아니고, 인간을 제외한 어떠한 동물도 가능하며, 바람직하게는 포유동물일 수 있으며, 일 예로 설치류 동물일 수 있고, 보다 구체적으로 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 개 등일 수 있다.

상기 ‘한 방향 난청 동물 모델’은 양쪽 난청이 아닌 한쪽은 정상이고 다른 한쪽이 난청인 동물모델로서 왼쪽 또는 오른쪽 중이 중 한쪽 중이에서 난청 증상을 나타내는 동물을 의미하여, 난청 환자의 임상 연구와 제약, 보청기 제작 연구를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 겐타마이신은 한쪽 중이에 다양한 방법으로 처리될 수 있으나, 바람직하게는 직접 주사(direct injection)에 의해 처리될 수 있다. 본 발명에 사용되는 겐타마이신은 중이에 분포하는 유모세포의 기능을 손상시키기 위해 투여되는 것으로 유모세포에 직접적으로 작용할 수 있도록 직접 주사에 의해 원하는 부위에 적정량으로 정확히 처리하는 것이 중요하다.

본 발명의 방법에서, 상기 겐타마이신의 처리양은 동물 모델의 제조에 사용되는 실험동물의 종, 성별, 체중, 식이방법, 건강상태에 따라 적절히 조절될 수 있으며, 바람직하게는 실험동물의 체중 kg 당 0.001 내지 0.1 ml로 처리될 수 있다. 또한 상기 겐타마이신의 처리양은 난청을 유발시키기 위한 충분한 양을 선택하여, 1일 또는 수일에 걸쳐 1회 내지 수회를 일정시간 간격으로 적용시킬 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 겐타마이신을 일정시간 간격으로 동일한 양을 처리함으로써 난청 정도가 조절된 동물모델을 제조할 수 있다. 일반적으로 난청은 그 정도에 따라 고도난청 및 중?저도난청으로 나뉘며, 고도난청은 80-90% 이상 청각 신호 손실, 중?저도난청은 30-60% 이상 청각 신호 손실로 정의한다. 본 발명에서는 5주령 수컷 래트를 실험동물로 할 경우 0.05 ml을 한쪽 중이에 24시간 간격으로 직접 주사함으로써 4일부터 40% 이상의 청각 손실을 갖는 저도난청 동물 모델을 얻을 수 있었으며 10일째에는 80% 이상의 청각 손실을 갖는 고도난청 동물 모델을 얻을 수 있었다.

본 발명의 방법으로 제조된 난청 동물 모델은 상기 겐타마이신의 처리에 의해 중이의 유모세포(hair cell)가 파괴(destruction) 또는 소실(disappearance)됨으로써 난청이 유발된다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 실험동물의 한쪽 중이에 겐타마이신을 직접 주사함으로써 중이에 있는 유모세포의 손상으로 인한 난청을 유발시킬 수 있으며 본 발명의 방법에 따라 제조된 한 방향 난청 동물은 난청과 같은 질병의 치료를 위한 임상연구, 의약품 제조 및 의료기기 제조에 적용할 수 있다.

도 1은 실험동물의 소리 자극에 대한 반응을 확인하는데 사용된 ABR(Audiogenic brain stem response) 시스템이다.
도 2는 도 1의 ABR 시스템에서 나타나는 프로그램을 보여준다.
도 3은 겐타마이신을 직접주사를 하지 않은 대조군의 ABR-Test에서 반응 피크(response peak)를 나타낸다.
도 4a는 겐타마이신을 왼쪽 중이에 직접주사 한 실험군의 ABR-Test에서 왼쪽 귀의 반응 피크를 나타낸다.
도 4b는 겐타마이신을 왼쪽 중이에 직접주사 한 실험군의 ABR-Test에서 오른쪽 귀의 반응 피크를 나타낸다.
도 5는 겐타마이신을 왼쪽 중이에 직접주사 한 실험군에서 공초점현미경(confocal microscope)을 이용하여 유모세포(hair cell)를 관찰한 결과이다.
도 6a 내지 6d는 겐타마이신을 24시간 주기로 10일간 왼쪽 중이에 직접 주사한 그룹에서 정상 대비 신호 손실의 정도를 나타낸 결과이다.
도 7a 내지 7d는 겐타마이신을 24시간 주기로 6일간 왼쪽 중이에 직접 주사한 그룹에서 정상 대비 신호 손실의 정도를 나타낸 결과이다.
도 8a 내지 8d는 겐타마이신을 24시간 주기로 4일간 왼쪽 중이에 직접 주사한 그룹에서 정상 대비 신호 손실의 정도를 나타낸 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 겐타마이신 주사를 통한 난청 유도

실험에 사용된 실험동물로서 5주령의 수컷 Sprague-Dawley 쥐(SD-Rat) 30마리를 이용하여 실험을 수행하였다. 겐타마이신(Gentamycin Sulfate injection, 80 mg, kyungdong)을 24시간 주기로 각각 10일, 6일, 4일간 정해진 시간에 0.05 cc를 쥐 15마리의 왼쪽 외이도를 통하여 왼쪽 중이(Lt-middle ear)에 직접주사(direct injection)하였다. 또한 직접주사를 하지 않은 15마리의 그룹을 대조군으로 하였다.

실시예 2. 겐타마이신에 의한 한방향 난청 유발 확인

1) 겐타마이신을 10일간 주사한 후, 청성뇌간유발전위 반응검사(ABR-TEST, Auditori brainstem respons test)를 양쪽 귀에 소리자극을 이용하여 실시하였다. ABR-Test에는 Click-ABR-Test를 이용하였고, 소리자극은 아주 가느다란 튜브선을 이용하여 외이도와 중이도 사이에 삽입하여 소리자극을 주었다. 또한 소리자극의 db는 90 db에서 각각 3 db씩 낮추어 가며 60db 까지 ABR-Test를 실시하였다.

그 결과, 도 3과 같이 직접주사를 하지 않은 대조군에서는 ABR-Test에 대하여 정상의 반응 피크(response peak)가 나타났으나, 도 4a와 같이 왼쪽 중이에 직접주사 한 실험군에서는 60~90 db에서 모두 100% 난청(deafness)으로 결과가 나타났다. 또한 도 4b와 같이 실험군에서 오른쪽 귀는 정상의 반응 피크가 나왔다. 이때 반응 피크는 고난청일수록 선형(linear)의 측정치를 나타낸다.

2) 또한 직접주사 후, 공초점현미경(confocal microscope)을 이용하여 유모세포(hair cell)를 관찰하였다.

그 결과, 도 5에서와 같이, 실험군의 왼쪽 중이의 유모세포가 겐타마이신의 주사에 의해 파괴(destruction) 또는 소실(disappearance)된 것을 확인할 수 있었다. 도 5는 대조군(Normal)과 실험군(Deaf)에 대하여 공초점현미경(confocal microscope)으로 유모세포를 촬영한 이미지로서, 각각 핵(DAPI) 염색, F-actin 단백질 염색, 및 이를 합친(merged) 이미지이다. 실험군은 10일간 주사한 그룹의 신호 손실된 유모세포를 나타낸 것으로 대조군과 비교하여 유모세포의 현저한 손상을 확인할 수 있다.

실시예 3. 겐타마이신에 투여량에 의한 난청 정도 조절

실시예 1에서와 같이, 겐타마이신을 24시간 주기로 각각 10일, 6일, 4일간 정해진 시간에 0.05 cc를 쥐 15마리의 왼쪽 외이도를 통하여 왼쪽 중이에 직접 주사한 결과, 주사 횟수를 조절하여 고난청과 저난청을 조절할 수 있었다.

일반적으로 고도난청은 80-90% 이상 신호 손실, 중?저도난청은 30-60% 이상 신호 손실로 정의한다. 방법론적으로는 90 db에서 60 db까지 각각 3 db씩 차이나는 측정치의 합을 비교하였다.

10일간 주사간 그룹에서는 정상대비 80% 이상 신호 손실이 있고 (도 6a 내지 6d), 6일간 주사한 그룹에서는 50% 이상 신호 손실이 있고 (도 7a 내지 7d), 4일간 주사한 그룹에서는 40% 이상 신호 손실이 있음 (도 8a 내지 8d)을 확인하였다.

따라서 겐타마이신의 주사 횟수(투여량)를 조절함으로써 비교적 간편한 방법으로 고난청과 중?저난청이 조절된 동물모델을 제조할 수 있음을 확인하였다.

Claims (6)

1. 실험동물의 한쪽 중이에 겐타마이신을 처리하는 단계를 포함하는 한 방향 난청 동물 모델의 제조 방법.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 겐타마이신은 직접 주사(direct injection)에 의해 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 겐타마이신의 처리양은 동물 체중 kg 당 0.01 내지 10.0 ml로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 3항에 있어서, 상기 겐타마이신을 일정시간 간격으로 동일한 양을 처리함으로써 난청 정도가 조절된 동물모델을 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 겐타마이신을 24시간 주기로 4일, 6일 또는 10일간 처리하여 정상 대비 40%, 50% 또는 80% 이상 신호 손실된 난청 동물 모델을 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제 1항에 있어서, 상기 겐타마이신의 처리에 의해 중이의 유모세포(hair cell)가 파괴(destruction) 또는 소실(disappearance)됨으로써 난청이 유발되는 것을 특징으로 하는 방법.
   

Images