KR20220075441A - 항원 결합 분자의 혈장 체류성과 면역원성을 개변하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항원 결합 분자의 Fc영역을 pH 중성역의 조건하에서 2분자의 FcRn 및 활성형 Fcγ 수용체의 4자를 포함하는 헤테로 복합체를 형성하지 않는 Fc영역으로 개변함으로써, 항원 결합 분자의 약물동태가 개선되고, 항원 결합 분자의 면역응답이 저감되는 것을 발견하였다. 또한 상기 성질을 갖는 항원 결합 분자, 그의 제조방법을 발견하는 동시에, 그와 같이 항원 결합 분자 또는 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물이 투여되었을 때에, 약물동태가 개선되고, 투여된 생체에 의한 면역응답이 저감된다고 하는, 종래의 항원 결합 분자에 비해 우수한 특성을 갖는 것을 발견하는데 성공하였다.

Description

항원 결합 분자의 혈장 체류성과 면역원성을 개변하는 방법{Method for altering plasma retention and immunogenicity of antigen-binding molecule}

본 발명은 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 Fc영역을 개변함으로써, 항원 결합 분자가 투여된 생체에 의한 약물동태를 개선하는 방법 또는 항원 결합 분자의 면역 응답을 저감하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 생체에 투여되었을 때에 그 약물동태가 개선되었거나 또는 당해 생체에 의한 면역 응답이 저감된 항원 결합 분자에 관한 것이다. 또한 본 발명은 당해 항원 결합 분자의 제조방법 및 당해 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.

항체는 혈장 중에서의 안정성이 높고 부작용도 적은 것으로부터 의약품으로서 주목되고 있다. 그 중에서도 IgG형의 항체 의약은 다수 시판되어 있고 현재도 수 많은 항체 의약이 개발되고 있다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 한편, 제2세대의 항체 의약에 적용 가능한 기술로서 다양한 기술이 개발되어 있어, 이펙터 기능, 항원 결합능, 약물동태, 안정성을 향상시키거나 또는 면역원성 리스크를 저감시키는 기술 등이 보고되어 있다(비특허문헌 3). 항체 의약은 일반적으로 투여량이 매우 높기 때문에 피하 투여 제제의 제작이 곤란한 것, 제조 비용이 비싼 것 등이 과제로서 생각된다. 항체 의약의 투여량을 저감시키는 방법으로서 항체의 약물동태를 향상시키는 방법과 항체와 항원의 친화성(affinity)을 향상시키는 방법이 생각된다.

항체의 약물동태를 향상시키는 방법으로서 정상영역(constant region)의 인공적인 아미노산 치환이 보고되어 있다(비특허문헌 4, 5). 항원 결합능, 항원 중화능을 증강시키는 기술로서 친화성 성숙 기술(비특허문헌 6)이 보고되어 있어, 가변영역의 CDR영역 등의 아미노산에 변이를 도입함으로써 항원으로의 결합 활성을 증강시키는 것이 가능하다. 항원 결합능의 증강에 의해 in vitro의 생물활성을 향상시키거나 또는 투여량을 저감시키는 것이 가능하며, 또한 in vivo(생체내)에서의 약효를 향상시키는 것도 가능하다(비특허문헌 7).

한편, 항체 1분자당 중화할 수 있는 항원량은 친화성에 의존하여, 친화성을 강하게 함으로써 적은 항체량으로 항원을 중화하는 것이 가능하고, 다양한 방법으로 항체의 친화성을 강하게 하는 것이 가능하다(비특허문헌 6). 또한 항원에 공유 결합적으로 결합하여 친화성을 무한대로 할 수 있다면 1분자의 항체로 1분자의 항원(2가의 경우는 2항원)을 중화하는 것이 가능하다. 그러나, 지금까지의 방법으로는 1분자의 항체로 1분자의 항원(2가의 경우는 2항원)의 화학양론적인 중화반응이 한계로, 항원량 이하의 항체량으로 항원을 완전히 중화하는 것은 불가능하였다. 즉, 친화성을 강하게 하는 효과에는 한계가 존재하고 있었다(비특허문헌 9). 중화항체의 경우, 그 중화효과를 일정 시간 지속시키기 위해서는 그 기간에 생체내에서 생산되는 항원량 이상의 항체량이 투여될 필요가 있어, 전술한 항체의 약물동태 향상 또는 친화성 성숙 기술만으로는 필요 항체 투여량의 저감에는 한계가 존재하고 있었다. 그 때문에 항원량 이하의 항체량으로 항원의 중화효과를 목적 기간 지속하기 위해서는 하나의 항체로 복수의 항원을 중화할 필요가 있다. 이것을 달성하는 새로운 방법으로서 최근 항원에 대해 pH 의존적으로 결합하는 항체가 보고되었다(특허문헌 1). 항원에 대해 혈장 중의 중성 조건하에 있어서는 강하게 결합하고, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 항원으로부터 해리되는 pH 의존적 항원 결합 항체는 엔도솜 내에서 항원으로부터 해리하는 것이 가능하다. pH 의존적 항원 결합 항체는 항원을 해리한 후에 항체가 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클되면 재차 항원에 결합하는 것이 가능하기 때문에, 하나의 pH 의존적 항원 결합 항체로 복수의 항원에 반복해서 결합하는 것이 가능해진다.

또한 항원의 혈장 중 체류성은 FcRn에 결합하여 리사이클되는 항체와 비교하여 매우 짧다. 이러한 혈장 중 체류성이 긴 항체가 그 항원에 결합하면 항체 항원 복합체의 혈장 중 체류성은 항체와 동일하게 길어진다. 그 때문에 항원은 항체와 결합함으로써 오히려 혈장 중 체류성이 길어져 혈장 중 항원 농도는 상승한다.

IgG 항체는 FcRn에 결합함으로써 긴 혈장 중 체류성을 갖는다. IgG와 FcRn의 결합은 산성 조건하(pH 6.0)에 있어서만 확인되고, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서는 거의 그 결합이 확인되지 않는다. IgG 항체는 비특이적으로 세포에 흡수되는데, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 엔도솜 내의 FcRn에 결합함으로써 세포 표면 상으로 되돌아가고 혈장 중의 중성 조건하에 있어서 FcRn으로부터 해리된다. IgG의 Fc영역에 변이를 도입하고 산성 조건하에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 상실시키면 엔도솜 내로부터 혈장 중으로 리사이클되지 않게 되기 때문에 항체의 혈장 중 체류성은 현저히 손상된다. IgG 항체의 혈장 중 체류성을 개선하는 방법으로서 산성 조건하에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 향상시키는 방법이 보고되어 있다. IgG 항체의 Fc영역에 아미노산 치환을 도입하고 산성 조건하의 FcRn에 대한 결합을 향상시킴으로써 엔도솜 내로부터 혈장 중으로의 리사이클 효율이 상승하여, 그 결과 혈장 중 체류성이 개선된다. 아미노산 치환을 도입할 때 중요한 것은 중성 조건하에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 높이지 않는 것이다. 중성 조건하에 있어서 FcRn에 결합해버리면, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 FcRn에 결합함으로써 세포 표면 상으로 되돌아가더라도 중성 조건하의 혈장 중에 있어서 IgG 항체가 FcRn으로부터 해리되지 않으면 IgG 항체가 혈장 중으로 리사이클되지 않기 때문에 반대로 혈장 중 체류성은 손상되게 된다. 예를 들면 IgG1에 대해 아미노산 치환을 도입함으로써 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서 마우스 FcRn에 대한 결합이 확인된 항체를 마우스에 투여한 경우, 항체의 혈장 중 체류성이 악화되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 10). 또한 IgG1에 대해 아미노산 치환을 도입함으로써 산성 조건하(pH 6.0)에 있어서의 인간 FcRn의 결합이 향상되나, 동시에 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합이 확인된 항체를 게잡이원숭이에게 투여한 경우, 항체의 혈장 중 체류성은 개선되는 경우는 없어 혈장 중 체류성에 변화가 확인되지 않은 것이 보고되어 있다(비특허문헌 10, 11 및 12). 그 때문에 항체의 기능을 향상시키는 항체 공학 기술에 있어서는 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 증가시키지 않고 산성 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 증가시킴으로써 항체의 혈장 중 체류성을 개선하는 것에만 주력되고 있어, 지금까지 IgG 항체의 Fc영역에 아미노산 치환을 도입하고 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합을 증가시키는 것의 이점은 보고되어 있지 않다. 항체의 항원에 대한 친화성을 향상시키더라도 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진시키는 것은 불가능하다. 전술한 pH 의존적 항원 결합 항체는 통상의 항체와 비교하여 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진하는 방법으로서도 유효한 것이 보고되어 있다(특허문헌 1).

이와 같이 pH 의존적 항원 결합 항체는 하나의 항체로 복수의 항원에 결합하여 통상의 항체와 비교하여 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진할 수 있기 때문에 통상의 항체에서는 이룰 수 없었던 작용을 갖는다. 그러나, 지금까지 이 pH 의존적 항원 결합 항체의 항원에 반복해서 결합할 수 있는 효과 및 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진하는 효과를 더욱 향상시키는 항체 공학의 수법은 보고되어 있지 않다.

한편 항체 의약의 면역원성은 항체 의약을 인간에게 투여한 경우의 혈장 중 체류성, 유효성, 안전성의 관점에서 매우 중요하다. 인간의 체내에 있어서 투여된 항체 의약에 대한 항체가 생산되면 항체 의약의 혈장 중에서의 소실이 빨라지거나, 유효성이 저하되거나, 과민증 반응을 일으켜 안전성에 영향을 미치는 등 바람직하지 않은 사상(事象)을 일으키는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 13).

항체 의약의 면역원성을 고려하는데 있어서 처음부터 천연의 항체가 생체내에 있어서 하고 있는 기능에 대해서 이해하는 것이 필요하다. 먼저, 대부분의 항체 의약은 IgG 클래스에 속하는 항체인데 IgG 항체의 Fc영역에 결합하여 작용하는 Fc 수용체로서 Fcγ 수용체(이하, FcγR으로도 기재됨)의 존재가 알려져 있다. FcγR은 수상세포나 NK세포, 마크로파지, 호중구, 지방세포 등의 세포막 상에 발현하여, IgG의 Fc영역이 결합함으로써 면역세포에 대해 활성형 또는 억제형의 세포내 시그날을 전달하는 것이 알려져 있다. 인간 FcγR의 단백질 패밀리로서 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb의 아이소폼이 보고되어 있고 각각의 알로타입도 보고되어 있다(비특허문헌 14). 인간 FcγRIIa의 알로타입으로서 131번째가 Arg(hFcγRIIa(R))와 His(hFcγRIIa(H))의 2종류가 보고되어 있다. 또한 인간 FcγRIIIa의 알로타입으로서 158번째가 Val(hFcγRIIIa(V))과 Phe(hFcγRIIIa(F))의 2종류가 보고되어 있다. 또한 마우스 FcγR의 단백질 패밀리로서는 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII, FcγRIV가 보고되어 있다(비특허문헌 15).

인간 FcγR은 활성형 수용체인 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIIb와 억제성 수용체인 FcγRIIb로 분류된다. 마찬가지로 마우스 FcγR은 활성형 수용체인 FcγRI, FcγRIII, FcγRIV와 억제성 수용체인 FcγRIIb로 분류된다.

활성형 FcγR은 면역 복합체와 가교되면 세포내 도메인 또는 상호작용 상대인 FcR common γ-chain에 포함되는 immunoreceptor tyrosine-based activating motifs(ITAMs)의 인산화를 일으켜 시그날 전달물질인 SYK를 활성화하고, 활성화 시그날 캐스케이드를 개시함으로써 염증성 면역반응을 일으킨다(비특허문헌 15).

Fc영역과 FcγR의 결합에 대해서는 항체의 힌지영역 및 CH2 도메인 내 중 몇개의 아미노산 잔기 및 CH2 도메인에 결합해 있는 EU 넘버링 297번 위치의 Asn에 부가되는 당쇄가 중요한 것이 나타내어져 있다(비특허문헌 15, 비특허문헌 16, 비특허문헌 17). 이들 개소로 변이를 도입한 항체를 중심으로 지금까지 다양한 FcγR에 대한 결합 특성을 갖는 변이체가 연구되어, 활성형 FcγR에 대한 보다 높은 친화성을 갖는 Fc영역 변이체가 얻어지고 있다(특허문헌 2, 특허문헌 3, 특허문헌 4, 특허문헌 5).

한편 억제형 FcγR인 FcγRIIb는 B세포에 발현하고 있는 유일한 FcγR이다(비특허문헌 18). FcγRIIb에 대해 항체의 Fc영역이 상호작용함으로써 B세포의 초회 면역이 억제되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 19). 또한 B세포 상의 FcγRIIb와 B세포 수용체(B cell receptor：BCR)가 혈중의 면역 복합체를 매개로 가교되면 B세포의 활성화가 억제되고, B세포의 항체 생산이 억제되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 20). 이 BCR과 FcγRIIb를 매개로 한 면역 억제적인 시그날의 전달에는 FcγRIIb의 세포내 도메인에 포함되는 immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif(ITIM)가 필요하다(비특허문헌 21, 비특허문헌 22). 이 면역 억제적인 작용은 ITIM의 인산화를 매개로 발생한다. 인산화 결과 SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase(SHIP)가 리쿠르트되어, 다른 활성형 FcγR의 시그날 캐스캐이드의 전달을 저해하여 염증성 면역반응을 억제한다(비특허문헌 23).

이 성질에 의해 FcγRIIb는 항체 의약에 대한 면역원성을 직접적으로 저하시키는 수법으로서 기대되고 있다. 마우스에게 있어서의 이종(異種) 단백질인 Exendin-4(Ex4)에 마우스 IgG1을 융합시킨 분자(Ex4/Fc)는 마우스에 투여해도 항체가 생산되지 않지만, Ex4/Fc에 개변을 가함으로써 B세포 상의 FcγRIIb에 결합하지 않도록 한 분자(Ex4/Fc mut)의 투여에 의해 Ex4에 대한 항체가 생산된다(비특허문헌 24). 이 결과는 Ex4/Fc가 B세포 상의 FcγRIIb에 결합함으로써 B세포에 의한 Ex4에 대한 마우스 항체의 생산을 억제하고 있는 것을 시사하고 있다.

또한 FcγRIIb는 수상세포, 마크로파지, 활성화된 호중구, 마스트 세포, 호염기구에서도 발현하고 있다. 이들 세포에 있어서도 FcγRIIb는 phagocytosis나 염증성 사이토카인의 방출 등의 활성형 FcγR의 기능을 저해하여 염증성 면역반응을 억제한다(비특허문헌 25).

FcγRIIb의 면역 억제적인 기능의 중요성에 대해서는 지금까지 FcγRIIb 녹아웃 마우스를 사용한 연구에 의해 설명되어 왔다. FcγRIIb 녹아웃 마우스에서는 액성 면역이 적절히 제어되지 않고(비특허문헌 26), 콜라겐 유도 관절염(CIA)에 대한 감수성이 증가하거나(비특허문헌 27), 낭창(lupus) 유사 증상을 나타내거나, 굿파스튜어(Goodpasture) 증후군 유사 증상을 나타내는 것(비특허문헌 28)이 보고되어 있다.

또한 FcγRIIb의 조절 부전은 인간의 자기 면역 질환과의 관련도 보고되어 있다. 예를 들면 FcγRIIb의 프로모터영역이나 세포 막관통영역에 있어서의 유전자 다형과, 전신성 홍반성 낭창(SLE)의 발증 빈도와의 관련(비특허문헌 29, 비특허문헌 30, 비특허문헌 31, 비특허문헌 32, 비특허문헌 33)이나 SLE 환자의 B세포 표면에 있어서의 FcγRIIb의 발현 저하가 보고되어 있다(비특허문헌 34, 비특허문헌 35).

이와 같이 마우스 모델 및 임상상의 지견으로부터 FcγRIIb는 B세포와의 관여를 중심으로 자기 면역 질환, 염증성 질환을 제어하는 역할을 하고 있는 것으로 생각되어, 자기 면역 질환, 염증성 질환을 제어하기 위한 유망한 표적 분자이다.

시판의 항체 의약으로서 주로 사용되고 있는 IgG1은 FcγRIIb뿐 아니라 활성형 FcγR에도 강하게 결합하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 36). FcγRIIb에 대한 결합을 증강시켰거나 또는 활성형 FcγR과 비교하여 FcγRIIb로의 결합의 선택성을 향상시킨 Fc영역을 이용함으로써, IgG1과 비교하여 면역 억제적인 성질을 가진 항체 의약의 개발 가능성을 생각할 수 있다. 예를 들면 BCR에 결합하는 가변영역과 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킨 Fc를 갖는 항체를 이용함으로써 B세포의 활성화를 저해할 수 있을 가능성이 시사되어 있다(비특허문헌 37).

그러나 FcγRIIb는 활성형 FcγR의 하나인 FcγRIIa와 세포외영역의 서열이 93% 일치하여 매우 구조가 유사한 것이 알려져 있다. 또한 FcγRIIa에는 유전자 다형으로서 제2 Ig 도메인의 131번째의 아미노산이 His인 H형과 Arg인 R형이 존재하며 각각 항체와의 상호작용이 상이하다(비특허문헌 38). 그 때문에 FcγRIIb에 대해 특이적으로 결합하는 Fc영역의 창제에는 FcγRIIa의 각 유전자 다형에 대한 결합 활성을 증가시키지 않거나 또는 감소시키는 한편으로 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 증가시킨다고 하는, FcγRIIb에 대한 결합 활성을 선택적으로 향상시킨 성질을 항체의 Fc영역에 부여하는 것이 가장 곤란한 과제라고 생각된다.

지금까지 Fc영역에 아미노산 개변을 도입함으로써 FcγRIIb에 대한 결합의 특이성을 상승시킨 예가 보고되어 있다(비특허문헌 39). 이 문헌 중에서는 IgG1과 비교하여 양 유전자 다형의 FcγRIIa보다도 FcγRIIb에 대한 결합 쪽이 유지되어 있는 변이체를 제작하고 있었다. 그러나 이 문헌 중에서 보고되어 있는 FcγRIIb에 대한 특이성이 개선된 것으로 여겨지는 변이체 모두 천연형 IgG1과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합이 감소되어 있었다. 그 때문에 이들 변이체가 실제로 FcγRIIb를 매개로 한 면역 억제적인 반응을 IgG1 이상으로 일으키는 것은 곤란할 것으로 생각된다.

FcγRIIb에 대한 결합을 증강시켰다고 하는 보고도 되어 있다(비특허문헌 37). 이 문헌 중에서는 항체의 Fc영역에 S267E/L328F, G236D/S267E, S239D/S267E 등의 개변을 가함으로써 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시키고 있었다. 이 중에서 S267E/L328F의 변이를 도입한 항체가 가장 강하게 FcγRIIb에 대해 강하게 결합하였으나, 이 변이체는 FcγRIa 및 FcγRIIa의 H형에 대한 결합을 천연형 IgG1과 같은 정도로 유지하고 있었다. 가령 FcγRIIb에 대한 결합이 IgG1과 비교하여 증강되어 있었다고 하더라도, FcγRIIb를 발현하지 않고 FcγRIIa를 발현하고 있는 혈소판과 같은 세포(비특허문헌 25)에 관해서는 FcγRIIb에 대한 결합의 증강이 아니라 FcγRIIa에 대한 결합의 증강 효과만이 영향을 미치는 것으로 생각된다. 예를 들면 전신성 홍반성 낭창에 있어서는 FcγRIIa 의존적인 메커니즘에 의해 혈소판이 활성화되어 혈소판의 활성화는 중증도와 상관한다고 하는 보고가 있다(비특허문헌 40). 또한 다른 보고에 따르면 이 개변은 FcγRIIa의 R형에 대한 결합이 FcγRIIb에 대한 결합과 같은 정도로 수백 배 증강되어 있고, R형에 있어서는 FcγRIIa와 비교한 FcγRIIb에 대한 결합의 선택성이 향상되어 있지 않다(특허문헌 17). 또한 수상세포나 마크로파지 등의 FcγRIIa와 FcγRIIb 양쪽을 발현한 세포종에 대해서는 억제성 시그날의 전달을 위해서는 FcγRIIa와 비교한 FcγRIIb에 대한 결합의 선택성이 필요하나 R형에 있어서는 그것이 달성되어 있지 않다.

FcγRIIa의 H형과 R형은 Caucasian이나 African-American에서 거의 같은 정도의 빈도로 관찰된다(비특허문헌 41, 비특허문헌 42). 이들 사실로부터 FcγRIIa R형에 대한 결합이 증강되어 있는 항체를 자기 면역 질환의 치료에 사용하는 것에는 일정의 제한이 있다고 생각된다. 가령 FcγRIIb에 대한 결합이 활성형 FcγR과 비교하여 증강되어 있었다고 하더라도, FcγRIIa 중 어느 하나의 유전자 다형에 대해 결합을 증강시키고 있다고 하는 점은 자기 면역 질환의 치료약으로서 사용한다는 관점에서는 간과할 수 없다.

FcγRIIb를 이용한 자기 면역 질환 치료를 목적으로 한 항체 의약의 창제에 있어서는 천연형 IgG와 비교하여 FcγRIIa 중 어느 유전자 다형에 대해서도 Fc를 매개로 한 결합이 증가되어 있지 않거나, 바람직하게는 감소하고, 또한 FcγRIIb에 대한 결합이 증강되어 있는 것이 중요하다. 그러나 지금까지 이러한 성질을 갖는 변이체의 보고는 없어 그 개발이 요구되고 있었다.

또한 본 발명의 선행기술문헌을 아래에 나타낸다.

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투여한 항체 의약에 대해 면역 응답이 일어나는 요인으로서는 전술한 활성형 FcγR의 관여에 더하여 항원 제시라 불리는 작용이 매우 중요하다. 항원 제시란 마크로파지나 수상세포 등의 항원 제시 세포가 세균 등의 외래성 및 내인성 항원을 세포내로 흡수하여 분해를 행한 후에, 세포 표면으로 그 일부를 제시하는 면역 메커니즘이다. 제시된 항원은 T세포 등에 의해 인식되어 세포성 면역 및 액성 면역을 활성화한다.

수상세포에 있어서의 항원 제시로서 면역 복합체(다가의 항체와 항원으로 형성되는 복합체)로서 세포내에 흡수된 항원이 리소좀에서 분해되어, 항원 유래의 펩티드가 MHC 클래스 II에 제시된다고 하는 경로가 존재한다. 이 경로에 있어서 FcRn이 중요한 역할을 하고 있어 FcRn을 결손시킨 수상세포를 사용한 경우, 또는 FcRn에 결합하지 않는 면역 복합체를 사용한 경우에는 항원 제시와 그것에 의한 T세포의 활성화가 일어나지 않는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 43).

정상 동물에 대해 이물질인 항원 단백질을 투여한 경우, 투여한 항원 단백질에 대한 항체가 높은 빈도로 생산된다. 예를 들면 마우스에 대해 이종 단백질인 가용형 인간 IL-6 수용체를 투여한 경우, 가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 마우스 항체가 생산된다. 그러나 마우스에 대해 이종 단백질인 인간 IgG1 항체를 투여해도 인간 IgG1 항체에 대한 마우스 항체는 거의 생산되지 않는다. 이 차이는 투여한 이종 단백질의 혈장 중에 있어서의 소실속도가 영향을 미치고 있는 것으로 생각된다.

참고 실시예 4에 나타낸 바와 같이 인간 IgG1 항체는 마우스 FcRn에 대해 산성 조건하에서의 결합능을 갖기 때문에, 엔도솜 내에 흡수된 인간 IgG1 항체는 마우스 항체와 마찬가지로 마우스 FcRn을 매개로 한 리사이클을 받는다. 그 때문에 인간 IgG1 항체를 정상 마우스에 투여한 경우, 그 혈장 중으로부터의 소실은 매우 느리다. 한편 가용형 인간 IL-6 수용체는 마우스 FcRn을 매개로 한 리사이클을 받지 않기 때문에 투여 후 신속하게 소실된다. 한편 참고 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 가용형 인간 IL-6 수용체를 투여한 정상 마우스에 있어서는 가용형 인간 IL-6R 항체에 대한 마우스 항체의 생산이 확인되는 한편으로, 인간 IgG1 항체를 투여한 정상 마우스에 있어서는 인간 IgG1 항체에 대한 마우스 항체의 생산은 보이지 않는다. 즉, 마우스에 있어서는 소실이 느린 인간 IgG1 항체보다도 소실이 빠른 가용형 인간 IL-6 수용체 쪽이 면역원성이 높다.

이들 이종 단백질(가용형 인간 IL-6 수용체 또는 인간 IgG1 항체)의 혈장 중으로부터의 소실경로의 일부는 항원 제시 세포에 의한 흡수인 것으로 생각된다. 항원 제시 세포에 흡수된 이종 단백질은 세포내에서 프로세싱을 받은 후, MHC 클래스 II 분자와 회합하여 세포막 상으로 수송된다. 이에 항원 특이적 T세포(예를 들면 가용형 인간 IL-6 수용체 또는 인간 IgG1 항체에 대해 특이적으로 응답하는 T세포)로의 항원 제시가 일어나면 항원 특이적 T세포의 활성화가 일어난다. 그 때문에 혈장 중으로부터의 소실이 느린 이종 단백질은 항원 제시 세포에서의 프로세싱을 받기 어려워, 결과적으로 항원 특이적 T세포로의 항원 제시가 일어나기 어려워져 있는 것으로 생각되었다.

중성 조건하에 있어서 FcRn에 결합함으로써 항체의 혈장 중 체류성이 악화되는 것이 알려져 있다. 중성 조건하에 있어서 FcRn에 결합해 버리면 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 FcRn에 결합함으로써 세포 표면 상으로 되돌아가더라도, 중성 조건하의 혈장 중에 있어서 IgG 항체가 FcRn으로부터 해리되지 않으면 IgG 항체가 혈장 중으로 리사이클되지 않기 때문에 반대로 혈장 중 체류성은 손상되게 된다. 예를 들면 IgG1에 대해 아미노산 치환을 도입함으로써 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서 마우스 FcRn에 대한 결합이 확인된 항체를 마우스에 투여한 경우, 항체의 혈장 중 체류성이 악화되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 10). 그러나 한편으로 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합이 확인된 항체를 게잡이원숭이에게 투여한 경우, 항체의 혈장 중 체류성이 개선되는 경우는 없어 혈장 중 체류성에 변화가 확인되지 않은 것이 보고되어 있다(비특허문헌 10, 11 및 12). 항원 결합 분자의 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서 FcRn에 대한 결합을 증강시킴으로써 혈장 중 체류성이 악화된 경우, 항원 결합 분자의 소실이 빨라지기 때문에 면역원성이 높아질 수 있을 것으로 생각된다.

또한 FcRn은 항원 제시 세포에 발현되고 있어 항원 제시에 관여하고 있는 것이 보고되어 있다. 항원 결합 분자는 아니지만 미엘린 염기성 단백질(MBP)에 마우스 IgG1의 Fc영역을 융합시킨 단백질(이하 MBP-Fc)의 면역원성을 평가한 보고에 있어서, MBP-Fc 특이적으로 반응하는 T세포는 MBP-Fc의 존재하에서 배양함으로써 활성화, 증식이 일어난다. 여기서 MBP-Fc의 Fc영역에 FcRn으로의 결합을 증강시키는 개변을 가함으로써, in vitro에 있어서는 항원 제시 세포에 발현하는 FcRn을 매개로 한 항원 제시 세포로의 흡수가 증대됨으로써 T세포의 활성화는 증강되는 것이 알려져 있다. 그러나, FcRn으로의 결합을 증강시키는 개변을 가함으로써 혈장 중으로부터의 소실이 빨라짐에도 불구하고 in vivo에 있어서는 T세포의 활성화가 반대로 감약되는 것이 보고되어 있어(비특허문헌 44), 반드시 FcRn으로의 결합을 증강시켜서 소실이 빨라짐으로써 면역원성이 높아진다고는 한정할 수 없다.

이상의 사실로부터 FcRn 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자의 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 증강시키는 것에 의한 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성에 대한 영향 및 면역원성에 대한 영향은 지금까지 충분히 연구되어 있지 않다. 그 때문에 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성 및 면역원성을 개선시키는 방법은 지금까지 보고되어 있지 않다.

이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 사용함으로써 항원의 혈장 중으로부터 소실을 촉진시킬 수 있는 것이 발견되었으나, Fc영역의 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 증강시키는 것에 의한 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성 및 면역원성에 대한 영향은 지금까지 충분히 연구되어 있지 않았다. 본 발명자들은 연구를 진행하는 가운데 Fc영역의 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 증강시킴으로써 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성이 저하되고(약물동태가 악화되고) 항원 결합 분자의 면역원성이 높아진다(항원 결합 분자에 대한 면역응답이 점점 악화된다)는 과제가 있는 것이 발견되었다.

본 발명은 이러한 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 Fc영역을 개변함으로써, 항원 결합 분자가 투여된 생체에 의한 약물동태를 개선하는 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 Fc영역을 개변함으로써, 항원 결합 분자의 면역응답을 저감하는 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 그것이 생체에 투여되었을 때에 그 약물동태가 개선되었거나 또는 당해 생체에 의한 면역응답이 저감된 항원 결합 분자의 제공이다. 또한 본 발명은 당해 항원 결합 분자의 제조방법의 제공을 목적으로 하는 동시에 당해 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물의 제공도 목적으로 하는 것이다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 진행시킨 결과, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 항원 결합 분자/2분자의 FcRn/활성형 Fcγ 수용체의 4자를 포함하는 헤테로 복합체(도 48)를 형성하는 것을 발견하고, 이 4자 복합체의 형성이 약물동태 및 면역응답에 악영향을 미치고 있는 것을 발견하였다. 이러한 항원 결합 분자의 Fc영역을 pH 중성역의 조건하에서 2분자의 FcRn 및 활성형 Fcγ 수용체의 4자를 포함하는 헤테로 복합체를 형성하지 않는 Fc영역으로 개변함으로써, pH 중성역의 조건하에서 2분자의 FcRn 및 활성형 Fcγ 수용체와의 4자 복합체를 형성하지 않는 Fc영역으로 개변함으로써, 항원 결합 분자의 약물동태가 개선되는 것을 발견하였다. 또한 항원 결합 분자가 투여된 생체에 의한 면역응답을 개변할 수 있는 것을 발견하였다. 또한 pH 중성역의 조건하에서 2분자의 FcRn 및 활성형 Fcγ 수용체의 4자를 포함하는 헤테로 복합체를 형성하지 않는 Fc영역으로 개변함으로써, 항원 결합 분자의 면역응답이 저감되는 것을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 상기 성질을 갖는 항원 결합 분자, 그의 제조방법을 발견하는 동시에, 그와 같이 항원 결합 분자 또는 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물이 투여되었을 때 약물동태가 개선되고, 투여된 생체에 의한 면역응답이 저감된다고 하는 종래의 항원 결합 분자에 비해 우수한 특성을 갖는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

즉 본 발명은 아래의〔1〕~〔44〕를 제공하는 것이다.

〔1〕이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 Fc영역이, pH 중성역의 조건하에서 2분자의 FcRn 및 1분자의 활성형 Fcγ 수용체를 포함하는 헤테로 복합체를 형성하지 않는 Fc영역으로 개변되는 것을 포함하는 아래의 어느 하나의 방법；

(a) 항원 결합 분자의 약물동태를 개선하는 방법, 또는

(b) 항원 결합 분자의 면역원성을 저감시키는 방법,

〔2〕상기 헤테로 복합체를 형성하지 않는 Fc영역으로 개변하는 것이, Fc영역의 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 당해 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 낮은 Fc영역으로 개변되는 것을 포함하는〔1〕에 기재된 방법,

〔3〕상기 활성형 Fcγ 수용체가 인간 FcγRIa, 인간 FcγRIIa(R), 인간 FcγRIIa(H), 인간 FcγRIIIa(V) 또는 인간 FcγRIIIa(F)인〔1〕또는〔2〕에 기재된 방법,

〔4〕상기 Fc영역의 아미노산 중 EU 넘버링으로 표시되는 235번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 270번 위치, 298번 위치, 325번 위치 및 329번 위치 중 어느 하나 이상의 아미노산을 치환하는 것을 포함하는 〔1〕내지〔3〕중 어느 하나에 기재된 방법,

〔5〕상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；

234번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr 또는 Trp 중 어느 하나,

235번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val 또는 Arg 중 어느 하나,

236번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,

237번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr 또는 Arg 중 어느 하나,

238번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp 또는 Arg 중 어느 하나,

239번 위치의 아미노산을 Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr 또는 Arg 중 어느 하나,

265번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,

266번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

267번 위치의 아미노산을 Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

269번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,

270번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,

271번 위치의 아미노산을 Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

295번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

296번 위치의 아미노산을 Arg, Gly, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

297번 위치의 아미노산을 Ala,

298번 위치의 아미노산을 Arg, Gly, Lys, Pro, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

300번 위치의 아미노산을 Arg, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

324번 위치의 아미노산을 Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

325번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,

327번 위치의 아미노산을 Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,

328번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Gly, His, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

329번 위치의 아미노산을 Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val 또는 Arg 중 어느 하나,

330번 위치의 아미노산을 Pro 또는 Ser 중 어느 하나,

331번 위치의 아미노산을 Arg, Gly 또는 Lys 중 어느 하나 또는

332번 위치의 아미노산을 Arg, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

중 어느 하나 이상으로 치환하는 것을 포함하는〔4〕에 기재된 방법,

〔6〕상기 헤테로 복합체를 형성하지 않는 Fc영역으로 개변하는 것이, Fc영역의 억제형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 Fc영역으로 개변되는 것을 포함하는〔1〕에 기재된 방법,

〔7〕상기 억제형 Fcγ 수용체가 인간 FcγRIIb인〔6〕에 기재된 방법,

〔8〕상기 활성형 Fcγ 수용체가 인간 FcγRIa, 인간 FcγRIIa(R), 인간 FcγRIIa(H), 인간 FcγRIIIa(V) 또는 인간 FcγRIIIa(F)인〔6〕또는〔7〕에 기재된 방법,

〔9〕EU 넘버링으로 표시되는 238 또는 328의 아미노산을 치환하는 것을 포함하는〔6〕내지〔8〕중 어느 하나에 기재된 방법,

〔10〕EU 넘버링으로 표시되는 238의 아미노산을 Asp 또는 328의 아미노산을 Glu로 치환하는 것을 포함하는〔9〕에 기재된 방법,

〔11〕EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；

233번 위치의 아미노산을 Asp,

234번 위치의 아미노산을 Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

237번 위치의 아미노산을 Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

239번 위치의 아미노산을 Asp,

267번 위치의 아미노산을 Ala, Gln 또는 Val 중 어느 하나,

268번 위치의 아미노산을 Asn, Asp 또는 Glu 중 어느 하나,

271번 위치의 아미노산을 Gly,

326번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser 또는 Thr 중 어느 하나,

330번 위치의 아미노산을 Arg, Lys 또는 Met 중 어느 하나,

323번 위치의 아미노산을 Ile, Leu 또는 Met 중 어느 하나,

296번 위치의 아미노산을 Asp,

중 어느 하나 이상으로 치환하는 것을 포함하는〔9〕또는〔10〕에 기재된 방법,

〔12〕상기 Fc영역의 아미노산 중 EU 넘버링으로 표시되는 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 및 436 중 어느 하나 이상의 아미노산이 천연형 Fc영역의 아미노산과 상이한 아미노산을 포함하는 Fc영역인〔1〕내지〔11〕중 어느 하나에 기재된 방법,

〔13〕상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；

237번 위치의 아미노산이 Met,

248번 위치의 아미노산이 Ile,

250번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

252번 위치의 아미노산이 Phe, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

254번 위치의 아미노산이 Thr,

255번 위치의 아미노산이 Glu,

256번 위치의 아미노산이 Asp, Asn, Glu 또는 Gln 중 어느 하나,

257번 위치의 아미노산이 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr 또는 Val 중 어느 하나,

258번 위치의 아미노산이 His,

265번 위치의 아미노산이 Ala,

286번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Glu 중 어느 하나,

289번 위치의 아미노산이 His,

297번 위치의 아미노산이 Ala,

298번 위치의 아미노산이 Gly,

303번 위치의 아미노산이 Ala,

305번 위치의 아미노산이 Ala,

307번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

308번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln 또는 Thr 중 어느 하나,

309번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Pro 또는 Arg 중 어느 하나,

311번 위치의 아미노산이 Ala, His 또는 Ile 중 어느 하나,

312번 위치의 아미노산이 Ala 또는 His 중 어느 하나,

314번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Arg 중 어느 하나,

315번 위치의 아미노산이 Ala, Asp 또는 His 중 어느 하나,

317번 위치의 아미노산이 Ala,

332번 위치의 아미노산이 Val,

334번 위치의 아미노산이 Leu,

360번 위치의 아미노산이 His,

376번 위치의 아미노산이 Ala,

380번 위치의 아미노산이 Ala,

382번 위치의 아미노산이 Ala,

384번 위치의 아미노산이 Ala,

385번 위치의 아미노산이 Asp 또는 His 중 어느 하나,

386번 위치의 아미노산이 Pro,

387번 위치의 아미노산이 Glu,

389번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Ser 중 어느 하나,

424번 위치의 아미노산이 Ala,

428번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

433번 위치의 아미노산이 Lys,

434번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, His, Ser, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나 또는

436번 위치의 아미노산이 His, Ile, Leu, Phe, Thr 또는 Val

중 어느 하나 이상의 조합인〔12〕에 기재된 방법,

〔14〕상기 항원 결합 도메인이 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인인〔1〕내지〔13〕중 어느 하나에 기재된 방법,

〔15〕상기 항원 결합 도메인이 저칼슘 이온 농도의 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮도록 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인인〔14〕에 기재된 방법,

〔16〕상기 항원 결합 도메인이 pH의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인인〔1〕내지〔13〕중 어느 하나에 기재된 방법,

〔17〕상기 항원 결합 도메인이 pH 산성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮도록 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인인〔16〕에 기재된 방법,

〔18〕상기 항원 결합 도메인이 항체의 가변영역인〔1〕내지〔16〕중 어느 하나에 기재된 방법,

〔19〕상기 항원 결합 분자가 항체인〔1〕내지〔18〕중 어느 하나에 기재된 방법,

〔20〕상기 헤테로 복합체를 형성하지 않는 Fc영역으로 개변하는 것이, Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn 결합 활성을 갖고, 다른 쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn 결합 활성을 갖지 않는 Fc영역으로 개변되는 것을 포함하는〔1〕에 기재된 방법,

〔21〕상기 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽 아미노산 서열 중, EU 넘버링으로 표시되는 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 및 436 중 어느 하나 이상의 아미노산을 치환하는 것을 포함하는〔20〕에 기재된 방법,

〔22〕상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；

237번 위치의 아미노산을 Met,

248번 위치의 아미노산을 Ile,

250번 위치의 아미노산을 Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp 또는 Tyr,

252번 위치의 아미노산을 Phe, Trp 또는 Tyr,

254번 위치의 아미노산을 Thr,

255번 위치의 아미노산을 Glu,

256번 위치의 아미노산을 Asp, Asn, Glu 또는 Gln,

257번 위치의 아미노산을 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr 또는 Val,

258번 위치의 아미노산을 His,

265번 위치의 아미노산을 Ala,

286번 위치의 아미노산을 Ala 또는 Glu,

289번 위치의 아미노산을 His,

297번 위치의 아미노산을 Ala,

298번 위치의 아미노산을 Gly,

303번 위치의 아미노산을 Ala,

305번 위치의 아미노산을 Ala,

307번 위치의 아미노산을 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr,

308번 위치의 아미노산을 Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln 또는 Thr,

309번 위치의 아미노산을 Ala, Asp, Glu, Pro 또는 Arg,

311번 위치의 아미노산을 Ala, His 또는 Ile,

312번 위치의 아미노산을 Ala 또는 His,

314번 위치의 아미노산을 Lys 또는 Arg,

315번 위치의 아미노산을 Ala, Asp 또는 His,

317번 위치의 아미노산을 Ala,

332번 위치의 아미노산을 Val,

334번 위치의 아미노산을 Leu,

360번 위치의 아미노산을 His,

376번 위치의 아미노산을 Ala,

380번 위치의 아미노산을 Ala,

382번 위치의 아미노산을 Ala,

384번 위치의 아미노산을 Ala,

385번 위치의 아미노산을 Asp 또는 His,

386번 위치의 아미노산을 Pro,

387번 위치의 아미노산을 Glu,

389번 위치의 아미노산을 Ala 또는 Ser,

424번 위치의 아미노산을 Ala,

428번 위치의 아미노산을 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr,

433번 위치의 아미노산을 Lys,

434번 위치의 아미노산을 Ala, Phe, His, Ser, Trp 또는 Tyr 또는

436번 위치의 아미노산을 His, Ile, Leu, Phe, Thr 또는 Val

중 어느 하나 이상으로 치환하는 것을 포함하는〔21〕에 기재된 방법,

〔23〕상기 항원 결합 도메인이 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인인〔20〕내지〔22〕중 어느 하나에 기재된 방법,

〔24〕상기 항원 결합 도메인이 저칼슘 이온 농도의 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮도록 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인인〔23〕에 기재된 방법,

〔25〕상기 항원 결합 도메인이 pH의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인인〔20〕내지〔22〕중 어느 하나에 기재된 방법,

〔26〕상기 항원 결합 도메인이 pH 산성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮도록 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인인〔25〕에 기재된 방법,

〔27〕상기 항원 결합 도메인이 항체의 가변영역인〔20〕내지〔26〕중 어느 하나에 기재된 방법,

〔28〕상기 항원 결합 분자가 항체인〔20〕내지〔27〕중 어느 하나에 기재된 방법,

〔29〕이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；

234번 위치의 아미노산이 Ala,

235번 위치의 아미노산이 Ala, Lys 또는 Arg 중 어느 하나,

236번 위치의 아미노산이 Arg, 238번 위치의 아미노산이 Arg,

239번 위치의 아미노산이 Lys,

270번 위치의 아미노산이 Phe,

297번 위치의 아미노산이 Ala,

298번 위치의 아미노산이 Gly,

325번 위치의 아미노산이 Gly,

328번 위치의 아미노산이 Arg 또는 329번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Arg

중에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산을 포함하는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자,

〔30〕상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；

237번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Arg 중 어느 하나,

238번 위치의 아미노산이 Lys

239번 위치의 아미노산이 Arg 또는

329번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Arg 중 어느 하나,

중에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산을 포함하는〔29〕에 기재된 항원 결합 분자,

〔31〕이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 다른 쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자,

〔32〕상기 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽 아미노산 서열 중, EU 넘버링으로 표시되는 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 및 436 중 어느 하나 이상의 아미노산이 천연형 Fc영역의 아미노산과 상이한 Fc영역인〔29〕내지〔31〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자,

〔33〕상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；

237번 위치의 아미노산이 Met,

248번 위치의 아미노산이 Ile,

250번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp 또는 Tyr,

252번 위치의 아미노산이 Phe, Trp 또는 Tyr,

254번 위치의 아미노산이 Thr,

255번 위치의 아미노산이 Glu,

256번 위치의 아미노산이 Asp, Asn, Glu 또는 Gln,

257번 위치의 아미노산이 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr 또는 Val,

258번 위치의 아미노산이 His,

265번 위치의 아미노산이 Ala,

286번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Glu,

289번 위치의 아미노산이 His,

297번 위치의 아미노산이 Ala,

303번 위치의 아미노산이 Ala,

305번 위치의 아미노산이 Ala,

307번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr,

308번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln 또는 Thr,

309번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Pro 또는 Arg,

311번 위치의 아미노산이 Ala, His 또는 Ile,

312번 위치의 아미노산이 Ala 또는 His,

314번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Arg,

315번 위치의 아미노산이 Ala, Asp 또는 His,

317번 위치의 아미노산이 Ala,

332번 위치의 아미노산이 Val,

334번 위치의 아미노산이 Leu,

360번 위치의 아미노산이 His,

376번 위치의 아미노산이 Ala,

380번 위치의 아미노산이 Ala,

382번 위치의 아미노산이 Ala,

384번 위치의 아미노산이 Ala,

385번 위치의 아미노산이 Asp 또는 His,

386번 위치의 아미노산이 Pro,

387번 위치의 아미노산이 Glu,

389번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Ser,

424번 위치의 아미노산이 Ala,

428번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr,

433번 위치의 아미노산이 Lys,

434번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, His, Ser, Trp 또는 Tyr 또는

436번 위치의 아미노산이 His, Ile, Leu, Phe, Thr 또는 Val

중 어느 하나 이상의 조합인〔30〕에 기재된 항원 결합 분자,

〔34〕상기 항원 결합 도메인이 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인인〔29〕내지〔33〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자,

〔35〕상기 항원 결합 도메인이 저칼슘 이온 농도의 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮도록 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인인〔34〕에 기재된 항원 결합 분자,

〔36〕상기 항원 결합 도메인이 pH의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인인〔29〕내지〔33〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자,

〔37〕상기 항원 결합 도메인이 pH 산성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮도록 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인인〔36〕에 기재된 항원 결합 분자,

〔38〕상기 항원 결합 도메인이 항체의 가변영역인〔29〕내지〔37〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자,

〔39〕상기 항원 결합 분자가 항체인〔29〕내지〔38〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자,

〔40〕〔29〕내지〔39〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드,

〔41〕〔40〕에 기재된 폴리뉴클레오티드가 작용 가능하게 연결된 벡터,

〔42〕〔41〕에 기재된 벡터가 도입된 세포,

〔43〕〔42〕에 기재된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정을 포함하는 〔29〕내지〔39〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법,

〔44〕〔29〕내지〔39〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자 또는〔43〕에 기재된 제조방법에 의해 얻어지는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물,

또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 포함하는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 유효성분으로서 함유하는 항원 결합 분자 약물동태 개선제 또는 항원 결합 분자의 면역원성 저감제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 대상으로 투여하는 공정을 포함하는 면역 염증성 질환의 치료방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자의, 항원 결합 분자의 약물동태 개선제 또는 항원 결합 분자의 면역원성 저감제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자에 관한 것이다.

본 발명에 의해 항원 결합 분자의 약물동태를 개선하는 방법 또는 항원 결합 분자의 면역원성을 저감시키는 방법이 제공되었다. 본 발명에 의해 통상의 항체와 비교하여 생체에 있어서의 바람직하지 않은 사상을 일으키지 않고 항체에 의한 치료를 행하는 것이 가능해진다.

도 1은 기존의 중화 항체와 중성 조건에서 FcRn으로의 결합을 증강시킨 pH 의존적 항원 결합 항체가 가용형 항원에 미치는 효과에 대해서 나타낸 도면이다.
도 2는 정상 마우스에 Fv4-IgG1 또는 Fv4-IgG1-F1이 정맥내 또는 피하에 투여되었을 때의 혈장 중 농도 추이를 나타낸 도면이다.
도 3은 인간 FcRn에 결합한 상태의 Fv4-IgG1-F157이 인간 FcγRIa에 대해 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 4는 인간 FcRn에 결합한 상태의 Fv4-IgG1-F157이 인간 FcγRIIa(R)에 대해 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 5는 인간 FcRn에 결합한 상태의 Fv4-IgG1-F157이 인간 FcγRIIa(H)에 대해 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 6은 인간 FcRn에 결합한 상태의 Fv4-IgG1-F157이 인간 FcγRIIb에 대해 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 7은 인간 FcRn에 결합한 상태의 Fv4-IgG1-F157이 인간 FcγRIIIa(F)에 대해 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 8은 인간 FcRn에 결합한 상태의 Fv4-IgG1-F157이 마우스 FcγRI에 대해 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 9는 인간 FcRn에 결합한 상태의 Fv4-IgG1-F157이 마우스 FcγRIIb에 대해 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 10은 인간 FcRn에 결합한 상태의 Fv4-IgG1-F157이 마우스 FcγRIII에 대해 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 11은 인간 FcRn에 결합한 상태의 Fv4-IgG1-F157이 마우스 FcγRIV에 대해 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 12는 마우스 FcRn에 결합한 상태의 Fv4-IgG1-F20이 마우스 FcγRI, 마우스 FcγRIIb, 마우스 FcγRIII, 마우스 FcγRIV에 대해 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 13은 마우스 FcRn에 결합한 상태의 mPM1-mIgG1-mF3이 마우스 FcγRIIb 및 마우스 FcγRIII에 대해 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 14는 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 Fv4-IgG1-F21, Fv4-IgG1-F140, Fv4-IgG1-F157, Fv4-IgG1-F424의 혈장 중 농도 추이를 나타낸 도면이다.
도 15는 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 Fv4-IgG1 및 Fv4-IgG1-F760의 혈장 중 농도 추이를 나타낸 도면이다.
도 16은 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939, Fv4-IgG1-F1009의 혈장 중 농도 추이를 나타낸 도면이다.
도 17은 정상 마우스에 있어서의 mPM1-mIgG1-mF14, mPM1-mIgG1-mF38, mPM1-mIgG1-mF39, mPM1-mIgG1-mF40의 혈장 중 농도 추이를 나타낸 도면이다.
도 18은 Fv4-IgG1-F21, Fv4-IgG1-F140을 사용한 면역원성 평가결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 hA33-IgG1-F21, hA33-IgG1-F140을 사용한 면역원성 평가결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 hA33-IgG1-F698, hA33-IgG1-F699을 사용한 면역원성 평가결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 hA33-IgG1-F698, hA33-IgG1-F763을 사용한 면역원성 평가결과를 나타낸 도면이다.
도 22는 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여된 뒤부터 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 Fv4-IgG1-F11에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 23은 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여된 뒤부터 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 Fv4-IgG1-F821에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 24는 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여된 뒤부터 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 Fv4-IgG1-F890에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내는 도면이다. B는 A의 확대도이다.
도 25는 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여된 뒤부터 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 Fv4-IgG1-F939에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 26은 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여된 뒤부터 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 Fv4-IgG1-F947에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 27은 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여된 뒤부터 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 Fv4-IgG1-F1009에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 28은 정상 마우스에 투여된 뒤부터 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 mPM1-IgG1-mF14에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 29는 정상 마우스에 투여된 뒤부터 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 mPM1-IgG1-mF39에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 30은 정상 마우스에 투여된 뒤부터 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 mPM1-IgG1-mF38에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 31은 정상 마우스에 투여된 뒤부터 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 mPM1-IgG1-mF40에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 32는 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여된 뒤부터 15분 후, 7시간 후, 1일 후, 2일 후, 3일 후, 4일 후 및 7일 후의 혈장 중의 Fv4-IgG1-F947 및 Fv4-IgG1-FA6a/FB4a의 항체농도를 나타내는 도면이다.
도 33은 각 B3 변이체의 FcγRIIb에 대한 결합과 FcγRIa에 대한 결합의 분산을 나타내는 도면이다.
도 34는 각 B3 변이체의 FcγRIIb에 대한 결합과 FcγRIIa(H)에 대한 결합의 분산을 나타내는 도면이다.
도 35는 각 B3 변이체의 FcγRIIb에 대한 결합과 FcγRIIa(R)에 대한 결합의 분산을 나타내는 도면이다.
도 36은 각 B3 변이체의 FcγRIIb에 대한 결합과 FcγRIIIa에 대한 결합의 분산을 나타내는 도면이다.
도 37은 정상 마우스에 있어서의 가용형 인간 IL-6 수용체의 혈장 중 동태와 마우스 혈장 중의 가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 마우스 항체의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 38은 항마우스 CD4 항체가 투여된 정상 마우스에 있어서의 가용형 인간 IL-6 수용체의 혈장 중 동태와 마우스 혈장 중의 가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 마우스 항체의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 39는 정상 마우스에 있어서의 항IL-6 수용체 항체의 혈장 중 동태를 나타내는 도면이다.
도 40은 인간 FcRn 형질전환 마우스에 가용형 인간 IL-6 수용체 및 항IL-6 수용체 항체가 동시에 투여되었을 때의 가용형 인간 IL-6 수용체의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 41은 X선결정구조 해석으로 결정된 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 중쇄 CDR3의 구조를 나타내는 도면이다.
도 42는 정상 마우스에 있어서의 H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1, FH4-IgG1의 혈장 중의 항체농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 43은 H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1, FH4-IgG1이 투여된 정상 마우스의 혈장 중의 가용형 인간 IL-6 수용체의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 44는 정상 마우스에 있어서의 H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W, FH4-N434W의 혈장 중의 항체농도 추이를 나타내는 도면이다.
도45는 H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W, FH4-N434W가 투여된 정상 마우스의 혈장 중의 가용형 인간 IL-6 수용체의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 46은 인간 Vk5-2 서열을 포함하는 항체와 인간 Vk5-2 서열 중의 당쇄 부가 서열이 개변된 h Vk5-2_L65 서열을 포함하는 항체의 이온 교환 크로마토그램이다. 실선은 인간 Vk5-2 서열을 포함하는 항체(중쇄：CIM_H, 서열번호：108 및 경쇄：hVk5-2, 서열번호：44)의 크로마토그램, 파선은 hVk5-2_L65 서열을 갖는 항체(중쇄：CIM_H(서열번호：108), 경쇄：hVk5-2_L65(서열번호：107))의 크로마토그램을 나타낸다.
도 47은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 정상영역 서열의 얼라이먼트와 EU 넘버링을 나타내는 도면이다.
도 48은 1분자의 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역과 2분자의 FcRn, 1분자의 FcγR으로 이루어지는 4자 복합체 형성의 모식도를 나타낸다.
도 49는 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은 Fc영역과 2분자의 FcRn, 1분자의 FcγR과의 작용을 나타내는 모식도이다.
도 50은 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 억제성 FcγR에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는 Fc영역과 2분자의 FcRn, 1분자의 FcγR과의 작용을 나타내는 모식도이다.
도 51은 FcRn 결합 도메인을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽만 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 다른 한쪽은 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 Fc영역과 2분자의 FcRn, 1분자의 FcγR과의 작용을 나타내는 모식도이다.
도 52는 Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체 유전자 라이브러리가 도입된 대장균으로부터 단리된 290 클론의 서열정보의 아미노산 분포(Library로 표시된다)와 설계된 아미노산 분포(Design으로 표시된다)의 관계를 나타내는 그래프이다. 가로축은 Kabat 넘버링으로 표시되는 아미노산의 부위가 표시된다. 세로축은 아미노산 분포의 비율이 표시된다.
도 53은 pH 의존적으로 항원에 결합하는 항체 유전자 라이브러리가 도입된 대장균으로부터 단리된 132 클론의 서열정보의 아미노산 분포(Library로 표시된다)와 설계된 아미노산 분포(Design로 표시된다)의 관계를 나타내는 그래프이다. 가로축은 Kabat 넘버링으로 표시되는 아미노산의 부위가 표시된다. 세로축은 아미노산 분포의 비율이 표시된다.
도 54는 Fv4-IgG1-F947 및 Fv4-IgG1-F1326이 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여되었을 때의 마우스 혈장 중의 Fv4-IgG1-F947 및 Fv4-IgG1-F1326의 농도 추이를 나타낸 그래프이다.
도 55의 가로축은 각 PD variant의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 세로축은 각 PD variant의 FcγRIIa R형에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 나타낸다. 각 PD variant의 각 FcγR에 대한 결합량의 값을 대조로 한 개변 도입 전의 항체인 IL6R-F652(EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro를 Asp로 치환한 개변 Fc)의 각 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값을 각 PD variant의 각 FcγR에 대한 상대적인 결합 활성의 값으로 하였다. 도면 중의 F652라는 플롯은 IL6R-F652의 값을 나타낸다.
도 56의 세로축은 각 개변을 P238D 개변을 갖지 않는 GpH7-B3에 도입한 개변체의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 가로축은 각 개변을 P238D 개변을 갖는 IL6R-F652에 도입한 개변체의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 나타낸다. 또한 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합량의 값을 개변 도입 전의 항체의 FcγRIIb에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값을 상대적인 결합 활성의 값으로 하였다. 여기서 P238D를 갖지 않는 GpH7-B3에 도입한 경우와 P238D를 갖는 IL6R-F652에 도입한 경우 모두 FcγRIIb에 대한 결합 증강 효과를 발휘한 개변은 영역 A에 포함되고, P238D를 갖지 않는 GpH7-B3에 도입한 경우에는 FcγRIIb에 대한 결합 증강 효과를 발휘하나, P238D를 갖는 IL6R-F652에 도입한 경우에는 FcγRIIb에 대한 결합 증강 효과를 발휘하지 않는 개변은 영역 B에 포함된다.
도 57은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정구조를 나타낸다.
도 58은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정구조와 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델구조를 FcγRIIb 세포외영역 및 Fc CH2 도메인 A에 대해 Cα원자간 거리를 토대로 한 최소이승법에 의해 중합한 도면을 나타낸다.
도 59는 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정구조와 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델구조에 대해서, Fc CH2 도메인 A 및 Fc CH2 도메인 B 단독끼리 Cα원자간 거리를 토대로 한 최소이승법에 의해 중합을 행하여 P238D 부근의 상세구조를 비교한 도면을 나타낸다.
도 60은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정구조에 있어서, Fc CH2 도메인 A의 EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 Gly의 주쇄와 FcγRIIb의 160번 위치의 Tyr 사이에 수소 결합이 확인되는 것을 나타내는 도면이다.
도 61은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정구조에 있어서, Fc CH2 도메인 B의 EU 넘버링으로 표시되는 270번 위치의 Asp와 FcγRIIb의 131번째의 Arg 사이에 정전적인 상호작용이 확인되는 것을 나타내는 도면이다.
도 62의 가로축은 각 2B variat의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 세로축은 각 2B variant의 FcγRIIa R형에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 각각 나타낸다. 각 2B variant의 각 FcγR에 대한 결합량의 값을 대조로 한 개변 도입 전의 항체(EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro를 Asp로 치환한 개변 Fc)의 각 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값을 각 2B variant의 각 FcγR에 대한 상대적인 결합 활성의 값으로 하였다.
도 63은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정구조에 있어서 Fc Chain A의 EU 넘버링으로 표시되는 233번 위치의 Glu와 FcγRIIb 세포외영역에 있어서의 그 주변 잔기를 나타내는 도면이다.
도 64는 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정구조에 있어서 Fc Chain A의 EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 Ala와 FcγRIIb 세포외영역에 있어서의 그 주변 잔기를 나타내는 도면이다.
도 65는 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체 및 Fc(WT)/FcγRIIIa 세포외영역 복합체의 결정구조를 Fc Chain B에 대해 Cα원자간 거리를 토대로 한 최소이승법에 의해 중합하여, Fc Chain B의 EU 넘버링으로 표시되는 271번 위치의 Pro의 구조를 나타낸 도면이다.

아래의 정의 및 상세한 설명은 본 명세서에 있어서 설명하는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 제공된다.

아미노산

본 명세서에 있어서 예를 들면, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I, Val/V로 표시되는 바와 같이, 아미노산은 1문자 코드 또는 3문자 코드 또는 그 양쪽으로 표기되어 있다.

항원

본 명세서에 있어서 「항원」은 항원 결합 도메인이 결합하는 에피토프를 포함하는 한 그 구조는 특정 구조에 한정되지 않는다. 다른 의미로는 항원은 무기물일 수도 있고 유기물일 수도 있다. 항원으로서는 하기와 같은 분자；17-IA, 4-1 BB, 4Dc, 6-케토-PGF1a, 8-이소-PGF2a, 8-옥소-dG, A1 아데노신 수용체, A33, ACE, ACE-2, 액티빈, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, 아드레신(Addressins), aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, 알파-1-안티트립신, 알파-V/베타-1 안타고니스트, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, 아르테민, 항Id, ASPARTIC, 심방성 나트륨 이뇨인자, av/b3 인테그린, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-림프구 자극인자(BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 오스테오게닌(Osteogenin), BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7(OP-1), BMP-8(BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA(ALK-3), BMPR-IB(ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II(BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, 봄베신, 골 유래 신경 영양인자(Bone-derived neurotrophic factor), BPDE, BPDE-DNA, BTC, 보체인자 3(C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, 칼시토닌, cAMP, 암 태아성 항원(CEA), 암 관련 항원, 카텝신 A, 카텝신 B, 카텝신 C/DPPI, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 H, 카텝신 L, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 V, 카텝신 X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33(p67 단백질), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80(B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin), 웰치균 독소(Clostridium perfringens toxin), CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 사이토케라틴 종양 관련 항원, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, 보체 제어인자(Decay accelerating factor), des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-1), Dhh, 디곡신, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR(ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, 엔도텔린 수용체, 엔케팔리나제, eNOS, Eot, 에오탁신 1, EpCAM, 에프린 B2/EphB4, EPO, ERCC, E-셀렉틴, ET-1, 팩터 IIa, 팩터 VII, 팩터 VIIIc, 팩터 IX, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), Fas, FcR1, FEN-1, 페리틴, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, 피브린, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, 난포 자극 호르몬, 프랙탈카인, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3(Vgr-2), GDF-5(BMP-14, CDMP-1), GDF-6(BMP-13, CDMP-2), GDF-7(BMP-12, CDMP-3), GDF-8(미오스타틴), GDF-9, GDF-15(MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-알파1, GFR-알파2, GFR-알파3, GITR, 글루카곤, Glut4, 당단백질IIb/IIIa(GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, 성장 호르몬 방출인자, 합텐(NP-cap 또는 NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCMV gB 엔벨로프 당단백질, HCMV gH 엔벨로프 당단백질, HCMV UL, 조혈 성장 인자(HGF), Hep B gp120, 헤파라나제, Her2, Her2/neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4(ErbB-4), 단순 헤르페스 바이러스(HSV) gB 당단백질, HSV gD 당단백질, HGFA, 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 루프, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, 인간 심장 미오신, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV), 인간 성장 호르몬(HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA 수용체, IgE, IGF, IGF 결합 단백질, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, 인터페론(INF)-알파, INF-베타, INF-감마, 인히빈, iNOS, 인슐린 A쇄, 인슐린 B쇄, 인슐린 유사 증식 인자 1, 인테그린 알파 2, 인테그린 알파 3, 인테그린 알파 4, 인테그린 알파 4/베타 1, 인테그린 알파 4/베타 7, 인테그린 알파 5(알파 V), 인테그린 알파 5/베타 1, 인테그린 알파 5/베타 3, 인테그린 알파 6, 인테그린 베타 1, 인테그린 베타 2, 인터페론 감마, IP-10, I-TAC, JE, 칼리크레인 2, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 11, 칼리크레인 12, 칼리크레인 14, 칼리크레인 15, 칼리크레인 L1, 칼리크레인 L2, 칼리크레인 L3, 칼리크레인 L4, KC, KDR, 케라티노사이트 증식 인자(KGF), 라미닌 5, LAMP, LAP, LAP(TGF-1), 잠재적 TGF-1, 잠재적 TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, 레프티, 루이스-Y 항원, 루이스-Y 관련 항원, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, 리포단백질, LIX, LKN, Lptn, L-셀렉틴, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, 폐 표면, 황체 형성 호르몬, 림포톡신 베타 수용체, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALLOPROTEASES, MGDF 수용체, MGMT, MHC(HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-알파, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, 뮤신(Muc1), MUC18, 뮬러리안 억제 물질, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C 아드헤린, NCA 90, NCAM, NCAM, 네프릴리신, 뉴로트로핀-3, -4, 또는 -6, 뉴르투린, 신경 성장 인자(NGF), NGFR, NGF-베타, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, 부갑상선 호르몬, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-카드헤린, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, 태반성 알칼리포스파타아제(PLAP), PlGF, PLP, PP14, 프로인슐린, 프로릴랙신(prorelaxin), 프로테인 C, PS, PSA, PSCA, 전립선 특이적 막항원(PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, 릴랙신 A쇄, 릴랙신 B쇄, 레닌, 호흡기 다핵체 바이러스(RSV)F, RSV Fgp, Ret, 류머티즘 인자, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, 혈청 알부민, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72(종양 관련 당단백질-72), TARC, TCA-3, T세포 수용체(예를 들면 T세포 수용체 알파/베타), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, 고환 PLAP 유사 알칼리포스파타아제, TfR, TGF, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 Pan Specific, TGF-베타RI(ALK-5), TGF-베타RII, TGF-베타RIIb, TGF-베타RIII, TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타4, TGF-베타5, 트롬빈, 흉선 Ck-1, 갑상선 자극 호르몬, Tie, TIMP, TIQ, 조직인자, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-알파, TNF-알파베타, TNF-베타2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A(RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B(OPG OCIF, TR1), TNFRSF12(TWEAK R FN14), TNFRSF13B(TACI), TNFRSF13C(BAFF R), TNFRSF14(HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF17(BCMA), TNFRSF18(GITR AITR), TNFRSF19(TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L(RELT), TNFRSF1A(TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B(TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26(TNFRH3), TNFRSF3(LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4(OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5(CD40 p50), TNFRSF6(Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B(DcR3 M68, TR6), TNFRSF7(CD27), TNFRSF8(CD30), TNFRSF9(4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21(DR6), TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25(DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10(TRAIL Apo-2 리간드, TL2), TNFSF11(TRANCE/RANK 리간드 ODF, OPG 리간드), TNFSF12(TWEAK Apo-3 리간드, DR3 리간드), TNFSF13(APRIL TALL2), TNFSF13B(BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14(LIGHT HVEM 리간드, LTg), TNFSF15(TL1A/VEGI), TNFSF18(GITR 리간드 AITR 리간드, TL6), TNFSF1A(TNF-a 코넥틴(Conectin), DIF, TNFSF2), TNFSF1B(TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3(LTb TNFC, p33), TNFSF4(OX40 리간드 gp34, TXGP1), TNFSF5(CD40 리간드 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6(Fas 리간드 Apo-1 리간드, APT1 리간드), TNFSF7(CD27 리간드 CD70), TNFSF8(CD30 리간드 CD153), TNFSF9(4-1BB 리간드 CD137 리간드), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, 트랜스페린 수용체, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, 종양 관련 항원 CA125, 종양 관련 항원 발현 루이스 Y 관련 탄수화물, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, 우로키나아제, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherin, VE-cadherin-2, VEFGR-1(flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3(flt-4), VEGI, VIM, 바이러스 항원, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR 인테그린, 폰빌레브란트 인자, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, 산화 LDL, PCSK9, prekallikrein, RON, TMEM16F, SOD1, Chromogranin A, Chromogranin B, tau, VAP1, 고분자 키니노겐, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdin, sclerostin, fibrinogen, fibrin, prothrombin, thrombin, 조직인자, factor V, factor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XII, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antithrombin III, EPCR, 트롬보모듈린, TAPI, tPA, plasminogen, plasmin, PAI-1, PAI-2, GPC3, Syndecan-1, Syndecan-2, Syndecan-3, Syndecan-4, LPA, S1P 및 호르몬 및 성장인자를 위한 수용체가 예시될 수 있다.

항원 중에 존재하는 항원 결정기를 의미하는 에피토프는 본 명세서에 있어서 개시되는 항원 결합 분자 중의 항원 결합 도메인이 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 따라서, 예를 들면, 에피토프는 그 구조에 의해 정의될 수 있다. 또한 당해 에피토프를 인식하는 항원 결합 분자 중의 항원에 대한 결합 활성에 따라서도 당해 에피토프가 정의될 수 있다. 항원이 펩티드 또는 폴리펩티드인 경우에는 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다. 또한 에피토프가 당쇄인 경우에는 특정 당쇄 구조에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다.

직선상 에피토프는 아미노산 1차 서열이 인식된 에피토프를 포함하는 에피토프이다. 직선상 에피토프는 전형적으로는 3개 이상 및 가장 보통으로는 5개 이상, 예를 들면 약 8 내지 약 10개, 6 내지 20개의 아미노산이 고유의 서열에 있어서 포함된다.

입체구조 에피토프는 직선상 에피토프와는 대조적으로 에피토프를 포함하는 아미노산의 1차 서열이 인식된 에피토프의 단일 규정 성분이 아닌 에피토프(예를 들면, 아미노산의 1차 서열이 반드시 에피토프를 규정하는 항체에 의해 인식되는 것은 아닌 에피토프)이다. 입체구조 에피토프는 직선상 에피토프에 대해 증대된 수의 아미노산을 포함할 지도 모른다. 입체구조 에피토프의 인식에 관하여, 항체는 펩티드 또는 단백질의 3차원 구조를 인식한다. 예를 들면, 단백질 분자가 폴딩되어 3차원 구조를 형성하는 경우에는 입체구조 에피토프를 형성하는 어떤 아미노산 및/ 또는 폴리펩티드 주쇄는 병렬로 되어 항체가 에피토프를 인식하는 것을 가능하게 한다. 에피토프의 입체구조를 결정하는 방법에는 예를 들면 X선 결정학, 2차원 핵자기공명 분광학 및 부위 특이적인 스핀 표지 및 전자 상자성 공명 분광학이 포함되는데, 이들에는 한정되지 않는다. 예를 들면, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996), 제66권, Morris(편)를 참조.

결합 활성

하기에 IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자에 의한 에피토프로의 결합의 확인방법이 예시되는데, IL-6R 이외의 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자에 의한 에피토프로의 결합의 확인방법도 하기의 예시에 준하여 적당히 실시될 수 있다.

예를 들면, IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 IL-6R 분자 중에 존재하는 선상 에피토프를 인식하는 것은, 예를 들면 다음과 같이 하여 확인할 수 있다. 상기 목적을 위해 IL-6R의 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상의 펩티드가 합성된다. 당해 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 또는 IL-6R의 cDNA 중의 세포외 도메인에 상당하는 아미노산 서열을 코드하는 영역을 이용하여 유전자 공학적 수법에 의해 얻어진다. 다음으로 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드와 IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 평가된다. 예를 들면, 고정화된 선상 펩티드를 항원으로 하는 ELISA에 의해 당해 펩티드에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합 활성이 평가될 수 있다. 또는 IL-6R 발현 세포에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합에 있어서의 선상 펩티드에 의한 저해 레벨을 토대로 선상 펩티드에 대한 결합 활성이 명확해질 수 있다. 이들 시험에 의해 선상 펩티드에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합 활성이 명확해질 수 있다.

또한 IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 입체구조 에피토프를 인식하는 것은, 다음과 같이 하여 확인될 수 있다. 상기 목적을 위해 IL-6R을 발현하는 세포가 조제된다. IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 IL-6R 발현 세포에 접촉했을 때에 당해 세포에 강하게 결합하는 한편, 당해 항원 결합 분자가 고정화된 IL-6R의 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드에 대해 실질적으로 결합하지 않을 때 등을 들 수 있다. 여기서 실질적으로 결합하지 않는다는 것은, 인간 IL-6R 발현 세포에 대한 결합 활성의 80% 이하, 통상 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하의 결합 활성을 말한다.

IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 발현 세포에 대한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는 예를 들면, Antibodies A Laboratory Manual 기재의 방법(Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988) 359-420)을 들 수 있다. 즉 IL-6R 발현 세포를 항원으로 하는 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting)의 원리에 의해 평가될 수 있다.

ELISA 포맷에 있어서 IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 발현 세포에 대한 결합 활성은 효소반응에 의해 생성되는 시그날 레벨을 비교함으로써 정량적으로 평가된다. 즉, IL-6R 발현 세포를 고정화한 ELISA 플레이트에 피험 폴리펩티드 회합체를 첨가하여, 세포에 결합한 피험 항원 결합 분자가 피험 항원 결합 분자를 인식하는 효소 표지 항체를 이용하여 검출된다. 또는 FACS에 있어서는 피험 항원 결합 분자의 희석 계열을 제작하여 IL-6R 발현 세포에 대한 항체 결합 역가(titer)를 결정함으로써, IL-6R 발현 세포에 대한 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 비교될 수 있다.

완충액 등에 현탁한 세포 표면 상에 발현되고 있는 항원에 대한 피험 항원 결합 분자의 결합은 플로우 사이토미터에 의해 검출할 수 있다. 플로우 사이토미터로서는 예를 들면, 다음과 같은 장치가 알려져 있다.

FACSCanto^TM II

FACSAria^TM

FACSArray^TM

FACSVantage^TM SE

FACSCalibur^TM(모두 BD Biosciences사의 상품명)

EPICS ALTRA HyPerSort

Cytomics FC 500

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(모두 Beckman Coulter사의 상품명)

예를 들면, IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성의 적합한 측정방법의 일례로서, 다음의 방법을 들 수 있다. 먼저, IL-6R을 발현하는 세포와 반응시킨 피험 항원 결합 분자를 인식하는 FITC 표지한 2차 항체로 염색한다. 피험 항원 결합 분자를 적당히 적합한 완충액으로 희석함으로써, 당해 항원 결합 분자가 목적하는 농도로 조제하여 사용된다. 예를 들면, 10 ㎍/㎖부터 10 ng/㎖까지 사이 중 어느 하나의 농도로 사용될 수 있다. 다음으로 FACSCalibur(BD사)에 의해 형광강도와 세포수가 측정된다. 당해 세포에 대한 항체의 결합량은 CELL QUEST Software(BD사)를 사용하여 해석함으로써 얻어진 형광강도, 즉 Geometric Mean의 값에 반영된다. 즉, 당해 Geometric Mean의 값을 얻음으로써 피험 항원 결합 분자의 결합량으로 표시되는 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 측정될 수 있다.

IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 어떤 항원 결합 분자와 에피토프를 공유하는 것은 양자의 동일한 에피토프에 대한 경합에 의해 확인될 수 있다. 항원 결합 분자 간의 경합은 교차 블로킹 어세이 등에 의해 검출된다. 예를 들면 경합 ELISA 어세이는 바람직한 교차 블로킹 어세이다.

구체적으로는 교차 블로킹 어세이에 있어서는 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 코트한 IL-6R 단백질이, 후보가 되는 경합 항원 결합 분자의 존재하 또는 비존재하에서 프리인큐베이트된 후에 피험 항원 결합 분자가 첨가된다. 웰 중의 IL-6R 단백질에 결합한 피험 항원 결합 분자의 양은 동일한 에피토프로의 결합에 대해 경합하는 후보가 되는 경합 항원 결합 분자의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉 동일 에피토프에 대한 경합 항원 결합 분자의 친화성이 커지면 커질수록, 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 단백질을 코트한 웰로의 결합 활성은 저하된다.

IL-6R 단백질을 매개로 웰에 결합한 피험 항원 결합 분자의 양은 사전에 항원 결합 분자를 표지해 둠으로써 용이하게 측정될 수 있다. 예를 들면, 비오틴 표지된 항원 결합 분자는 아비딘페록시다아제 콘쥬게이트와 적절한 기질을 사용함으로써 측정된다. 페록시다아제 등의 효소 표지를 이용한 교차 블로킹 어세이는 특히 경합 ELISA 어세이라 불린다. 항원 결합 분자는 검출 또는 측정이 가능한 다른 표지 물질로 표지될 수 있다. 구체적으로는 방사 표지 또는 형광 표지 등이 공지이다.

후보의 경합 항원 결합 분자 회합체의 비존재하에서 실시되는 대조 시험에 있어서 얻어지는 결합 활성과 비교하여, 경합 항원 결합 분자가 IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 결합을 20% 이상, 바람직하게는 20-50% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상 블록할 수 있다면, 당해 피험 항원 결합 분자는 경합 항원 결합 분자와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 동일한 에피토프로의 결합에 대해 경합하는 항원 결합 분자이다.

IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 결합하는 에피토프의 구조가 동정되어 있는 경우에는 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 에피토프를 공유하는 것은, 당해 에피토프를 구성하는 펩티드에 아미노산 변이를 도입한 펩티드에 대한 양자의 항원 결합 분자의 결합 활성을 비교함으로써 평가될 수 있다.

이러한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는 예를 들면, 상기의 ELISA 포맷에 있어서 변이를 도입한 선상의 펩티드에 대한 피험 항원 결합 분자 및 대조 항원 결합 분자의 결합 활성을 비교함으로써 측정될 수 있다. ELISA 이외의 방법으로서는 칼럼에 결합한 당해 변이 펩티드로의 결합 활성을, 당해 칼럼에 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자를 유하(流下)시킨 후에 용출액 중에 용출되는 항원 결합 분자를 정량함으로써도 측정될 수 있다. 변이 펩티드를 예를 들면 GST와의 융합 펩티드로서 칼럼에 흡착시키는 방법은 공지이다.

또한 동정된 에피토프가 입체 에피토프인 경우에는 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 에피토프를 공유하는 것은, 다음의 방법으로 평가될 수 있다. 먼저, IL-6R을 발현하는 세포와 에피토프에 변이가 도입된 IL-6R을 발현하는 세포가 조제된다. 이들 세포가 PBS 등의 적절한 완충액에 현탁된 세포 현탁액에 대해 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 첨가된다. 이어서, 적당히 완충액으로 세정된 세포 현탁액에 대해 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자를 인식할 수 있는 FITC 표지된 항체가 첨가된다. 표지 항체에 의해 염색된 세포의 형광강도와 세포수가 FACSCalibur(BD사)에 의해 측정된다. 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 농도는 적합한 완충액에 의해 적당히 희석함으로써 목적하는 농도로 조제하여 사용된다. 예를 들면, 10 ㎍/㎖부터 10 ng/㎖까지의 사이 중 어느 하나의 농도로 사용된다. 당해 세포에 대한 표지 항체의 결합량은 CELL QUEST Software(BD사)를 사용하여 해석함으로써 얻어진 형광강도, 즉 Geometric Mean의 값에 반영된다. 즉, 당해 Geometric Mean의 값을 얻음으로써, 표지 항체의 결합량으로 표시되는 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 결합 활성을 측정할 수 있다.

본 방법에 있어서, 예를 들면 「변이 IL-6R 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않는」다는 것은, 아래의 방법에 의해 판단할 수 있다. 먼저, 변이 IL-6R을 발현하는 세포에 대해 결합한 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 표지 항체로 염색된다. 이어서 세포의 형광강도가 검출된다. 형광 검출에 플로우 사이토메트리로서 FACSCalibur를 사용한 경우, 얻어진 형광강도는 CELL QUEST Software를 사용하여 해석될 수 있다. 폴리펩티드 회합체 존재하 및 비존재하에서의 Geometric Mean의 값으로부터 이 비교값(△Geo-Mean)을 하기의 계산식을 토대로 산출함으로써, 항원 결합 분자의 결합에 의한 형광강도의 증가비율을 구할 수 있다.

△Geo-Mean = Geo-Mean(폴리펩티드 회합체 존재하)/Geo-Mean(폴리펩티드 회합체 비존재하)

해석에 의해 얻어지는 피험 항원 결합 분자의 변이 IL-6R 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 Geometric Mean 비교값(변이 IL-6R 분자 △Geo-Mean값)을 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 △Geo-Mean 비교값과 비교한다. 이 경우에 있어서 변이 IL-6R 발현 세포 및 IL-6R 발현 세포에 대한 △Geo-Mean 비교값을 구할 때 사용하는 피험 항원 결합 분자의 농도는 서로 동일 또는 실질적으로 동일 농도로 조제되는 것이 특히 바람직하다. 사전에 IL-6R 중의 에피토프를 인식하고 있는 것이 확인된 항원 결합 분자가 대조 항원 결합 분자로서 이용된다.

피험 항원 결합 분자의 변이 IL-6R 발현 세포에 대한 △Geo-Mean 비교값이, 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 발현 세포에 대한 △Geo-Mean 비교값의 80% 이상, 바람직하게는 50%, 더욱 바람직하게는 30%, 특히 바람직하게는 15%보다 작으면, 「변이 IL-6R 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않는」 것으로 한다. Geo-Mean값(Geometric Mean)을 구하는 계산식은 CELL QUEST Software User's Guide(BD biosciences사)에 기재되어 있다. 비교값을 비교함으로써 그것이 실질적으로 동일하다고 볼 수 있는 정도라면, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 에피토프는 동일하다고 평가될 수 있다.

항원 결합 도메인

본 명세서에 있어서 「항원 결합 도메인」은 목적으로 하는 항원에 결합하는 한 어떠한 구조의 도메인도 사용될 수 있다. 그러한 도메인의 예로서 예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역, 생체내에 존재하는 세포막 단백인 Avimer에 포함되는 35 아미노산 정도의 A 도메인으로 불리는 모듈(WO2004/044011, WO2005/040229), 세포막에 발현하는 당단백질인 fibronectin 중의 단백질에 결합하는 도메인인 10Fn3 도메인을 포함하는 Adnectin(WO2002/032925), ProteinA의 58 아미노산으로 이루어지는 3개의 헬릭스의 다발(bundle)을 구성하는 IgG 결합 도메인을 scaffold로 하는 Affibody(WO1995/001937), 33 아미노산 잔기를 포함하는 턴과 2개의 역병행 헬릭스 및 루프의 서브유닛이 반복해서 겹쳐진 구조를 갖는 안키린 반복(ankyrin repeat：AR)의 분자 표면에 노출되는 영역인 DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(WO2002/020565), 호중구 겔라티나아제 결합 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)) 등의 리포칼린 분자에 있어서 고도로 보존된 8개의 역병행 스트랜드가 중앙방향으로 비틀어진 배럴 구조의 편측을 지지하는 4개의 루프영역인 Anticalin 등(WO2003/029462), 칠성장어, 먹장어 등 무악류의 획득 면역 시스템으로서 이뮤노 글로불린의 구조를 갖지 않는 가변성 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor(VLR))의 류신 잔기가 풍부한 리피트(leucine-rich-repeat(LRR)) 모듈이 반복해서 겹쳐진 편자모양의 구조 내부의 병행형 시트 구조의 움푹 들어간 영역(WO2008/016854)을 바람직하게 들 수 있다. 본 발명의 항원 결합 도메인의 적합한 예로서, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 포함하는 항원 결합 도메인을 들 수 있다. 이러한 항원 결합 도메인의 예로서는 「scFv(single chain Fv)」, 「단일 사슬 항체(single chain antibody)」, 「Fv」, 「scFv2(single chain Fv2)」, 「Fab」 또는 「F(ab')2」 등을 바람직하게 들 수 있다.

본 발명의 항원 결합 분자에 있어서의 항원 결합 도메인은 동일 에피토프에 결합할 수 있다. 여기서 동일 에피토프는 예를 들면, 서열번호：1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재할 수 있다. 또한 서열번호：1에 기재된 아미노산 서열의 20번째부터 365번째의 아미노산으로 이루어지는 단백질 중에 존재할 수 있다. 또는 본 발명의 항원 결합 분자에 있어서의 항원 결합 도메인은 서로 다른 에피토프에 결합할 수 있다. 여기서 상이한 에피토프는 예를 들면, 서열번호：1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재할 수 있다. 또한 서열번호：1에 기재된 아미노산 서열의 20번째부터 365번째의 아미노산으로 이루어지는 단백질 중에 존재할 수 있다.

특이적

특이적이란 특이적으로 결합하는 분자의 한쪽 분자가 그 하나 또는 복수의 결합하는 상대방 분자 이외의 분자에 대해서는 전혀 유의한 결합을 나타내지 않는 상태를 말한다. 또한 항원 결합 도메인이 어떤 항원 중에 포함되는 복수의 에피토프 중 특정 에피토프에 대해 특이적인 경우에도 사용된다. 또한 항원 결합 도메인이 결합하는 에피토프가 복수의 상이한 항원에 포함되는 경우에는, 당해 항원 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자는 당해 에피토프를 포함하는 다양한 항원과 결합할 수 있다.

항체

본 명세서에 있어서 항체란 천연의 것이거나 또는 부분적 또는 완전 합성에 의해 제조된 면역 글로불린을 말한다. 항체는 그것이 천연으로 존재하는 혈장이나 혈청 등의 천연 자원이나 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 배양상청으로부터 단리될 수 있고, 또는 유전자 재조합 등의 수법을 사용함으로써 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다. 항체의 예로서는 면역 글로불린의 아이소타입 및 그들 아이소타입의 서브클래스를 바람직하게 들 수 있다. 인간의 면역 글로불린으로서 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM의 9종류의 클래스(아이소타입)가 알려져 있다. 본 발명의 항체에는 이들 아이소타입 중 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 포함될 수 있다.

목적하는 결합 활성을 갖는 항체를 제작하는 방법은 당업자에 있어서 공지이다. 아래에 IL-6R에 결합하는 항체(항IL-6R 항체)를 제작하는 방법이 예시된다. IL-6R 이외의 항원에 결합하는 항체도 하기의 예시에 준하여 적당히 제작될 수 있다.

항IL-6R 항체는 공지의 수단을 사용하여 다중클론 또는 단일클론 항체로서 취득될 수 있다. 항IL-6R 항체로서는 포유동물 유래의 단일클론 항체가 바람직하게 제작될 수 있다. 포유동물 유래의 단일클론 항체에는 하이브리도마에 의해 생산되는 것 및 유전자 공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환한 숙주세포에 의해 생산되는 것 등이 포함된다. 본 출원 발명의 단일클론 항체에는 「인간화 항체」나 「키메라 항체」가 포함된다.

단일클론 항체 생산 하이브리도마는 공지기술을 사용함으로써, 예를 들면 아래와 같이 제작될 수 있다. 즉, IL-6R 단백질을 감작 항원으로서 사용하여 통상의 면역방법에 따라 포유동물이 면역된다. 얻어지는 면역세포가 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합된다. 다음으로 통상의 스크리닝법에 의해 단일클론 항체 생산 세포를 스크리닝함으로써 항IL-6R 항체를 생산하는 하이브리도마가 선택될 수 있다.

구체적으로는 단일클론 항체의 제작은 예를 들면 이하에 나타내는 바와 같이 행해진다. 먼저, 서열번호：2에 그의 뉴클레오티드 서열이 개시된 IL-6R 유전자를 발현함으로써, 항체 취득의 감작 항원으로서 사용되는 서열번호：1로 표시되는 IL-6R 단백질이 취득될 수 있다. 즉, IL-6R을 코드하는 유전자 서열을 공지의 발현 벡터에 삽입함으로써 적당한 숙주세포가 형질전환된다. 당해 숙주세포 중 또는 배양상청 중으로부터 목적하는 인간 IL-6R 단백질이 공지의 방법으로 정제된다. 배양상청 중으로부터 가용형의 IL-6R을 취득하기 위해서는 예를 들면, Mullberg등(J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968)에 의해 기재되어 있는 바와 같은 가용형 IL-6R인 서열번호：1로 표시되는 IL-6R 폴리펩티드 서열 중, 1부터 357번째의 아미노산으로 이루어지는 단백질이 서열번호：1로 표시되는 IL-6R 단백질 대신에 발현된다. 또한 정제한 천연의 IL-6R 단백질도 또한 동일하게 감작 항원으로서 사용될 수 있다.

포유동물에 대한 면역에 사용하는 감작 항원으로서 당해 정제 IL-6R 단백질을 사용할 수 있다. IL-6R의 부분 펩티드도 또한 감작 항원으로서 사용할 수 있다. 이때, 당해 부분 펩티드는 인간 IL-6R의 아미노산 서열로부터 화학합성으로도 취득될 수 있다. 또한 IL-6R 유전자의 일부를 발현 벡터에 삽입하여 발현시킴으로써도 취득될 수 있다. 더 나아가서는 단백질 분해효소를 사용하여 IL-6R 단백질을 분해함으로써도 취득될 수 있으나, 부분 펩티드로서 사용하는 IL-6R 펩티드의 영역 및 크기는 특별한 태양에 한정되지 않는다. 바람직한 영역은 서열번호：1의 아미노산 서열에 있어서 20-357번째의 아미노산에 상당하는 아미노산 서열로부터 임의의 서열이 선택될 수 있다. 감작 항원으로 하는 펩티드를 구성하는 아미노산의 수는 적어도 5 이상, 예를 들면 6 이상 또는 7 이상인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는 8~50, 바람직하게는 10~30 잔기의 펩티드가 감작 항원으로서 사용될 수 있다.

또한 IL-6R 단백질의 목적하는 부분 폴리펩티드나 펩티드를 상이한 폴리펩티드와 융합한 융합 단백질이 감작 항원으로서 이용될 수 있다. 감작 항원으로서 사용되는 융합 단백질을 제조하기 위해, 예를 들면, 항체의 Fc 단편이나 펩티드 태그 등이 바람직하게 이용될 수 있다. 융합 단백질을 발현하는 벡터는 목적하는 2종류 또는 그 이상의 폴리펩티드 단편을 코드하는 유전자가 인프레임으로 융합되고, 당해 융합 유전자가 상기와 같이 발현 벡터에 삽입됨으로써 제작될 수 있다. 융합 단백질의 제작방법은 Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab. press)에 기재되어 있다. 감작 항원으로서 사용되는 IL-6R의 취득방법 및 그것을 이용한 면역방법은 WO2003/000883, WO2004/022754, WO2006/006693 등에도 구체적으로 기재되어 있다.

상기 감작 항원으로 면역되는 포유동물로서는 특정 동물에 한정되는 것은 아니나, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로는 설치류의 동물, 예를 들면, 마우스, 랫트, 햄스터 또는 토끼, 원숭이 등이 바람직하게 사용된다.

공지의 방법에 따라 상기 동물이 감작 항원에 의해 면역된다. 예를 들면, 일반적인 방법으로서 감작 항원이 포유동물의 복강내 또는 피하에 주사에 의해 투여됨으로써 면역이 실시된다. 구체적으로는 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당한 희석배율로 희석된 감작 항원이 목적하는 바에 따라 통상의 애쥬번트, 예를 들면 프로인트 완전 애쥬번트와 혼합되어 유화된 후에, 그 감작 항원이 포유동물에 4~21일마다 수회 투여된다. 또한 감작 항원의 면역시에는 적당한 담체가 사용될 수 있다. 특히 분자량이 작은 부분 펩티드가 감작 항원으로서 사용되는 경우에는 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 등의 담체 단백질과 결합한 그 감작 항원 펩티드를 면역하는 것이 바람직한 경우도 있다.

또한 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마는 DNA 면역을 사용하여 아래와 같이 해서도 제작될 수 있다. DNA 면역이란 면역동물 중에서 항원 단백질을 코드하는 유전자가 발현될 수 있는 태양으로 구축된 벡터 DNA가 투여된 당해 면역동물 중에서, 감작 항원이 당해 면역동물의 생체내에서 발현됨으로써 면역자극이 부여되는 면역방법이다. 단백질 항원이 면역동물에 투여되는 일반적인 면역방법과 비교하여 DNA 면역에는 다음과 같은 우위성이 기대된다.

-IL-6R과 같은 막단백질의 구조를 유지하여 면역자극이 부여될 수 있다

-면역항원을 정제할 필요가 없다

DNA 면역에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 얻기 위해, 먼저, IL-6R 단백질을 발현하는 DNA가 면역동물에 투여된다. IL-6R을 코드하는 DNA는 PCR 등의 공지의 방법에 의해 합성될 수 있다. 얻어진 DNA가 적당한 발현 벡터에 삽입되어 면역동물에 투여된다. 발현 벡터로서는 예를 들면 pcDNA3.1 등의 시판의 발현 벡터가 바람직하게 이용될 수 있다. 벡터를 생체에 투여하는 방법으로서 일반적으로 사용되고 있는 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터가 흡착된 금 입자가 gene gun으로 면역동물 개체의 세포내에 도입됨으로써 DNA 면역이 행해진다. 또한 IL-6R을 인식하는 항체의 제작은 국제공개 WO 2003/104453에 기재된 방법을 사용해도 제작될 수 있다.

이와 같이 포유동물이 면역되어 혈청 중에 있어서의 IL-6R에 결합하는 항체 역가의 상승이 확인된 후에, 포유동물로부터 면역세포가 채취되어 세포융합에 제공된다. 바람직한 면역세포로서는 특히 비장세포가 사용될 수 있다.

상기 면역세포와 융합되는 세포로서 포유동물의 골수종 세포가 사용된다. 골수종 세포는 스크리닝을 위한 적당한 선택 마커를 구비하고 있는 것이 바람직하다. 선택 마커란 특정 배양 조건하에서 생존할 수 있는(또는 할 수 없는) 형질을 가리킨다. 선택 마커로는 히포크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스페라아제 결손(이하 HGPRT 결손으로 생략한다) 또는 티미딘키나아제 결손(이하 TK 결손으로 생략한다) 등이 공지이다. HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는 히포크산틴-아미노프테린-티미딘 감수성(이하 HAT 감수성으로 생략한다)을 갖는다. HAT 감수성의 세포는 HAT 선택 배지 중에서 DNA 합성을 행할 수 없어 사멸되지만, 정상의 세포와 융합하면 정상 세포의 샐비지 회로를 이용하여 DNA의 합성을 계속할 수 있기 때문에 HAT 선택 배지 중에서도 증식되게 된다.

HGPRT 결손이나 TK 결손의 세포는 각각 6 티오구아닌, 8 아자구아닌(이하 8AG로 생략한다) 또는 5'브로모데옥시우리딘을 포함하는 배지에서 선택될 수 있다. 이들 피리미딘 아날로그를 DNA 중에 흡수하는 정상의 세포는 사멸된다. 한편, 이들 피리미딘 아날로그를 흡수할 수 없는 이들 효소를 결손한 세포는 선택 배지 중에서 생존할 수 있다. 이 밖에 G418 내성으로 불리는 선택 마커는 네오마이신 내성 유전자에 의해 2-데옥시스트렙타민계 항생물질(겐타마이신 유사체)에 대한 내성을 부여한다. 세포융합에 적합한 각종의 골수종 세포가 공지이다.

이러한 골수종 세포로서 예를 들면, P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol.(1979)123 (4), 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7), NS-1(C. Eur. J. Immunol.(1976)6 (7), 511-519), MPC-11(Cell(1976)8 (3), 405-415), SP2/0(Nature(1978)276 (5685), 269-270), FO(J. Immunol. Methods(1980)35 (1-2), 1-21), S194/5.XX0.BU.1(J. Exp. Med.(1978)148 (1), 313-323), R210(Nature(1979)277 (5692), 131-133) 등이 바람직하게 사용될 수 있다.

기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면, 쾰러와 밀스테인등의 방법(Methods Enzymol.(1981)73, 3-46) 등에 준하여 상기 면역세포와 골수종 세포의 세포융합이 행해진다.

보다 구체적으로는 예를 들면 세포융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양배양액 중에서, 상기 세포융합이 실시될 수 있다. 융합 촉진제로서는 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 추가로 융합효율을 높이기 위해 목적하는 바에 따라 디메틸설폭시드 등의 보조제가 첨가되어 사용된다.

면역세포와 골수종 세포의 사용비율은 임의로 설정될 수 있다. 예를 들면, 골수종 세포에 대해 면역세포를 1~10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 사용하는 배양액으로서는 예를 들면, 상기 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타, 이 종의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용되고, 추가로 소태아혈청(FCS) 등의 혈청 보액이 적합하게 첨가될 수 있다.

세포융합은 상기 면역세포와 골수종 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 사전에 37℃ 정도로 가온된 PEG 용액(예를 들면 평균 분자량 1000~6000 정도)이 통상 30~60%(w/v)의 농도로 첨가된다. 혼합액이 완만하게 혼합됨으로써 목적하는 융합세포(하이브리도마)가 형성된다. 이어서, 상기에 예로 든 적당한 배양액이 축차 첨가되고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등이 제거될 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸되기에 충분한 시간(통상, 이러한 충분한 시간은 수일 내지 수 주간이다) 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속될 수 있다. 이어서, 통상의 한계희석법에 의해 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시된다.

이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는 세포융합에 사용된 골수종이 갖는 선택 마커에 따른 선택 배양액을 이용함으로써 선택될 수 있다. 예를 들면 HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 즉, HAT 감수성의 골수종 세포를 세포융합에 사용한 경우, HAT 배양액 중에서 정상 세포와의 세포융합에 성공한 세포가 선택적으로 증식될 수 있다. 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸되기에 충분한 시간, 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속된다. 구체적으로는 일반적으로 수일 내지 수 주간의 배양에 의해 목적하는 하이브리도마가 선택될 수 있다. 이어서, 통상의 한계희석법에 의해 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시될 수 있다.

목적하는 항체의 스크리닝 및 단일 클로닝이 공지의 항원 항체 반응에 기초하는 스크리닝방법에 의해 바람직하게 실시될 수 있다. 예를 들면, IL-6R에 결합하는 단일클론 항체는 세포 표면에 발현된 IL-6R에 결합할 수 있다. 이러한 단일클론 항체는 예를 들면, FACS(fluorescence activated cell sorting)에 의해 스크리닝될 수 있다. FACS는 형광 항체와 접촉시킨 세포를 레이저광으로 해석하여, 개개의 세포가 발하는 형광을 측정함으로써 세포 표면으로의 항체의 결합을 측정하는 것을 가능하게 하는 시스템이다.

FACS에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해서는 먼저 IL-6R을 발현하는 세포를 조제한다. 스크리닝하기 위한 바람직한 세포는 IL-6R을 강제 발현시킨 포유동물세포이다. 숙주세포로서 사용한 형질전환되어 있지 않은 포유동물세포를 대조로서 사용함으로써, 세포 표면의 IL-6R에 대한 항체의 결합 활성이 선택적으로 검출될 수 있다. 즉, 숙주세포에 결합하지 않고 IL-6R 강제 발현 세포에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택함으로써, IL-6R 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마가 취득될 수 있다.

또는 고정화한 IL-6R 발현 세포에 대한 항체의 결합 활성이 ELISA의 원리를 토대로 평가될 수 있다. 예를 들면, ELISA 플레이트의 웰에 IL-6R 발현 세포가 고정화된다. 하이브리도마의 배양상청을 웰 내의 고정화 세포에 접촉시켜 고정화 세포에 결합하는 항체가 검출된다. 단일클론 항체가 마우스 유래인 경우, 세포에 결합한 항체는 항마우스 이뮤노 글로불린 항체에 의해 검출될 수 있다. 이들 스크리닝에 의해 선택된 항원에 대한 결합능을 갖는 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마는 한계희석법 등에 의해 클로닝될 수 있다.

이와 같이 하여 제작되는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양될 수 있다. 또한 그 하이브리도마는 액체질소 중에서 장기에 걸쳐 보존될 수 있다.

당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그 배양상청으로부터 목적하는 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시키고, 그의 복수로부터 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻기에 적합한 것이다.

당해 하이브리도마 등의 항체 생산 세포로부터 클로닝되는 항체 유전자에 의해 코드되는 항체도 바람직하게 이용될 수 있다. 클로닝한 항체 유전자를 적당한 벡터에 삽입하여 숙주에 도입함으로써 당해 유전자에 의해 코드되는 항체가 발현된다. 항체 유전자의 단리와 벡터로의 도입, 그리고 숙주세포의 형질전환을 위한 방법은 예를 들면, Vandamme등에 의해 이미 확립되어 있다(Eur.J. Biochem.(1990)192 (3), 767-775). 하기에 기술하는 바와 같이 재조합 항체의 제조방법도 또한 공지이다.

예를 들면, 항IL-6R 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 항IL-6R 항체의 가변영역(V영역)을 코드하는 cDNA가 취득된다. 그 때문에 통상 먼저 하이브리도마로부터 전체 RNA가 추출된다. 세포로부터 mRNA를 추출하기 위한 방법으로서, 예를 들면 다음과 같은 방법을 이용할 수 있다.

-구아니딘 초원심법(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)

-AGPC법(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)

추출된 mRNA는 mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스 제조) 등을 사용하여 정제될 수 있다. 또는 QuickPrep mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스 제조) 등과 같이 세포로부터 직접 전체 mRNA를 추출하기 위한 키트도 시판되고 있다. 이러한 키트를 사용하여 하이브리도마로부터 mRNA가 취득될 수 있다. 얻어진 mRNA로부터 역전사효소를 사용하여 항체 V영역을 코드하는 cDNA가 합성될 수 있다. cDNA는 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(생화학 공업사 제조) 등에 의해 합성될 수 있다. 또한 cDNA의 합성 및 증폭을 위해 SMART RACE cDNA 증폭 키트(Clontech 제조) 및 PCR을 사용한 5'-RACE법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002, Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932)이 적당히 이용될 수 있다. 또한 이러한 cDNA의 합성과정에 있어서 cDNA의 양말단에 후술하는 적절한 제한효소 사이트가 도입될 수 있다.

얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 cDNA 단편이 정제되고 이어서 벡터 DNA와 연결된다. 이와 같이 재조합 벡터가 제작되고 대장균 등에 도입되어 콜로니가 선택된 후에, 그 콜로니를 형성한 대장균으로부터 목적하는 재조합 벡터가 조제될 수 있다. 그리고, 그 재조합 벡터가 목적으로 하는 cDNA의 염기서열을 가지고 있는지 여부에 대해서 공지의 방법, 예를 들면, 디데옥시뉴클레오티드 체인 터미네이션법 등에 의해 확인된다.

가변영역을 코드하는 유전자를 취득하기 위해서는 가변영역 유전자 증폭용 프라이머를 사용한 5'-RACE법을 이용하는 것이 간편하다. 먼저 하이브리도마 세포로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 cDNA가 합성되고 5'-RACE cDNA 라이브러리가 얻어진다. 5'-RACE cDNA 라이브러리의 합성에는 SMART RACE cDNA 증폭 키트 등 시판의 키트가 적당히 사용된다.

얻어진 5'-RACE cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR법에 의해 항체 유전자가 증폭된다. 공지의 항체 유전자 서열을 토대로 마우스 항체 유전자 증폭용 프라이머가 디자인될 수 있다. 이들 프라이머는 이뮤노 글로불린의 서브클래스별로 상이한 염기서열이다. 따라서, 서브클래스는 사전에 Iso Strip 마우스 단일클론 항체 아이소타이핑 키트(로슈 다이어그노스틱스) 등의 시판 키트를 사용하여 결정해 두는 것이 바람직하다.

구체적으로는 예를 들면 마우스 IgG를 코드하는 유전자의 취득을 목적으로 할 때는 중쇄로서 γ1, γ2a, γ2b, γ3, 경쇄로서 κ쇄와 λ쇄를 코드하는 유전자의 증폭이 가능한 프라이머가 이용될 수 있다. IgG의 가변영역 유전자를 증폭하기 위해서는 일반적으로 3'측의 프라이머에는 가변영역에 가까운 정상영역에 상당하는 부분에 어닐링하는 프라이머가 이용된다. 한편 5'측의 프라이머에는 5'RACE cDNA 라이브러리 제작 키트에 부속되는 프라이머가 이용된다.

이렇게 하여 증폭된 PCR 산물을 이용하여 중쇄와 경쇄의 조합으로 이루어지는 이뮤노 글로불린이 재구성될 수 있다. 재구성된 이뮤노 글로불린의 IL-6R에 대한 결합 활성을 지표로 하여 목적하는 항체가 스크리닝될 수 있다. 예를 들면 IL-6R에 대한 항체의 취득을 목적으로 할 때, 항체의 IL-6R으로의 결합은 특이적인 것이 더욱 바람직하다. IL-6R에 결합하는 항체는 예를 들면 다음과 같이 하여 스크리닝될 수 있다；

(1) 하이브리도마로부터 얻어진 cDNA에 의해 코드되는 V영역을 포함하는 항체를 IL-6R 발현 세포에 접촉시키는 공정,

(2) IL-6R 발현 세포와 항체의 결합을 검출하는 공정 및

(3) IL-6R 발현 세포에 결합하는 항체를 선택하는 공정.

항체와 IL-6R 발현 세포의 결합을 검출하는 방법은 공지이다. 구체적으로는 앞서 기술한 FACS 등의 수법에 의해 항체와 IL-6R 발현 세포의 결합이 검출될 수 있다. 항체의 결합 활성을 평가하기 위해 IL-6R 발현 세포의 고정 표본이 적당히 이용될 수 있다.

결합 활성을 지표로 하는 항체의 스크리닝방법으로서 파지 벡터를 이용한 패닝법도 바람직하게 사용된다. 다중클론 항체 발현 세포군으로부터 항체 유전자를 중쇄와 경쇄의 서브클래스의 라이브러리로서 취득한 경우에는 파지 벡터를 이용한 스크리닝방법이 유리하다. 중쇄와 경쇄의 가변영역을 코드하는 유전자는 적당한 링커 서열로 연결함으로써 싱글 체인 Fv(scFv)를 형성할 수 있다. scFv를 코드하는 유전자를 파지 벡터에 삽입함으로써 scFv를 표면에 발현하는 파지가 취득될 수 있다. 이 파지와 목적하는 항원의 접촉 후에 항원에 결합한 파지를 회수함으로써 목적의 결합 활성을 갖는 scFv를 코드하는 DNA가 회수될 수 있다. 이 조작을 필요에 따라 반복함으로써 목적하는 결합 활성을 갖는 scFv가 농축될 수 있다.

목적으로 하는 항IL-6R 항체의 V영역을 코드하는 cDNA가 얻어진 후에, 당해 cDNA의 양말단에 삽입한 제한효소 사이트를 인식하는 제한효소에 의해 그 cDNA가 소화된다. 바람직한 제한효소는 항체 유전자를 구성하는 염기서열에 출현하는 빈도가 낮은 염기서열을 인식하여 소화한다. 또한 1 카피의 소화 단편을 벡터에 바른 방향으로 삽입하기 위해서는 부착 말단을 부여하는 제한효소의 삽입이 바람직하다. 상기와 같이 소화된 항IL-6R 항체의 V영역을 코드하는 cDNA를 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 항체 발현 벡터가 취득될 수 있다. 이때, 항체 정상영역(C영역)을 코드하는 유전자와 상기 V영역을 코드하는 유전자가 인프레임으로 융합되면 키메라 항체가 취득된다. 여기서 키메라 항체란 정상영역과 가변영역의 유래가 상이한 것을 말한다. 따라서, 마우스-인간 등의 이종(異種) 키메라 항체에 더하여 인간-인간 동종(同種) 키메라 항체도 본 발명에 있어서의 키메라 항체에 포함된다. 사전에 정상영역을 갖는 발현 벡터에 상기 V영역 유전자를 삽입함으로써 키메라 항체 발현 벡터가 구축될 수 있다. 구체적으로는 예를 들면, 목적하는 항체 정상영역(C영역)을 코드하는 DNA를 보유한 발현 벡터의 5'측에 상기 V영역 유전자를 소화하는 제한효소의 제한효소 인식서열이 적당히 배치될 수 있다. 동일한 조합의 제한효소로 소화된 양자가 인프레임으로 융합됨으로써 키메라 항체 발현 벡터가 구축된다.

항IL-6R 단일클론 항체를 제조하기 위해 항체 유전자가 발현 제어영역에 의한 제어하에서 발현되도록 발현 벡터에 삽입된다. 항체를 발현하기 위한 발현 제어영역이란 예를 들면, 인핸서나 프로모터를 포함한다. 또한 발현된 항체가 세포외로 분비되도록 적절한 시그날 서열이 아미노 말단에 부가될 수 있다. 뒤에 기재되는 실시예에서는 시그날 서열로서 아미노산 서열 MGWSCIILFLVATATGVHS(서열번호：3)를 갖는 펩티드가 사용될 수 있는데, 이것 이외에도 적합한 시그날 서열이 부가된다. 발현된 폴리펩티드는 상기 서열의 카르복실 말단 부분에서 절단되고, 절단된 폴리펩티드가 성숙 폴리펩티드로서 세포외로 분비될 수 있다. 이어서, 이 발현 벡터에 의해 적당한 숙주세포가 형질전환됨으로써 항IL-6R 항체를 코드하는 DNA를 발현하는 재조합 세포가 취득될 수 있다.

항체 유전자 발현을 위해 항체 중쇄(H쇄) 및 경쇄(L쇄)를 코드하는 DNA는 각각 다른 발현 벡터에 삽입된다. H쇄와 L쇄가 삽입된 벡터에 의해 동일 숙주세포에 동시에 형질전환(co-transfect)됨으로써 H쇄와 L쇄를 구비한 항체 분자가 발현될 수 있다. 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA가 단일 발현 벡터에 삽입됨으로써 숙주세포가 형질전환될 수 있다(국제공개 WO 1994/011523을 참조할 것).

단리된 항체 유전자를 적당한 숙주에 도입함으로써 항체를 제작하기 위한 숙주세포와 발현 벡터의 많은 조합이 공지이다. 이들 발현계는 모두 본 발명의 항원 결합 도메인을 단리하는데 응용될 수 있다. 진핵세포가 숙주세포로서 사용되는 경우, 동물세포, 식물세포 또는 진균세포가 적당히 사용될 수 있다. 구체적으로는 동물세포로서는 다음과 같은 세포가 예시될 수 있다.

(1) 포유류세포,：CHO, COS, 골수종, BHK(baby hamster kidney), Hela, Vero, HEK(human embryonic kidney) 293 등

(2) 양서류세포：아프리카 발톱개구리 난모세포 등

(3) 곤충세포：sf9, sf21, Tn5 등

또는 식물세포로서는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 등의 니코티아나(Nicotiana)속 유래의 세포에 의한 항체 유전자의 발현계가 공지이다. 식물세포의 형질전환에는 캘러스 배양한 세포가 적당히 이용될 수 있다.

또한 진균세포로서는 다음과 같은 세포를 이용할 수 있다.

-효모：사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces serevisiae) 등의 사카로미세스(Saccharomyces)속, 메탄올 자화 효모(Pichia pastoris) 등의 Pichia속

-사상균：아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 등의 아스퍼질러스(Aspergillus)속

또한 원핵세포를 이용한 항체 유전자의 발현계도 공지이다. 예를 들면, 세균세포를 사용하는 경우, 대장균(E. coli), 고초균 등의 세균세포가 적당히 이용될 수 있다. 이들 세포 중에 목적으로 하는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터가 형질전환에 의해 도입된다. 형질전환된 세포를 in vitro에서 배양함으로써 당해 형질전환 세포의 배양물로부터 목적하는 항체가 취득될 수 있다.

재조합 항체의 생산에는 상기 숙주세포에 더하여 형질전환 동물도 이용될 수 있다. 즉 목적하는 항체를 코드하는 유전자가 도입된 동물로부터 당해 항체를 얻을 수 있다. 예를 들면, 항체 유전자는 유즙 중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자의 내부에 인프레임으로 삽입함으로써 융합 유전자로서 구축될 수 있다. 유즙 중에 분비되는 단백질로서 예를 들면, 염소 β카제인 등을 이용할 수 있다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편은 염소의 배(胚)로 주입되고, 당해 주입된 배가 암컷의 염소로 도입된다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 형질전환 염소(또는 그의 자손)가 생산하는 유즙으로부터는 목적하는 항체가 유즙 단백질과의 융합 단백질로서 취득될 수 있다. 또한 형질전환 염소로부터 생산되는 목적하는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해 호르몬이 형질전환 염소에 대해 투여될 수 있다(Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702).

본 명세서에 있어서 기재되는 폴리펩티드 회합체가 인간에게 투여되는 경우, 당해 회합체에 있어서의 항원 결합 도메인으로서, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체 유래의 항원 결합 도메인이 적당히 채용될 수 있다. 유전자 재조합형 항체에는 예를 들면, 인간화(Humanized) 항체 등이 포함된다. 이들 개변 항체는 공지의 방법을 사용하여 적당히 제조된다.

본 명세서에 있어서 기재되는 폴리펩티드 회합체에 있어서의 항원 결합 도메인을 제작하기 위해 사용되는 항체의 가변영역은 통상 4개의 프레임워크 영역(FR) 사이에 끼인 3개의 상보성 결정영역(complementarity-determining region;CDR)으로 구성되어 있다. CDR은 실질적으로 항체의 결합 특이성을 결정하고 있는 영역이다. CDR의 아미노산 서열은 다양성이 풍부하다. 한편 FR을 구성하는 아미노산 서열은 상이한 결합 특이성을 갖는 항체 사이에서도 높은 동일성을 나타내는 것이 많다. 그 때문에 일반적으로 CDR의 이식에 의해 어떤 항체의 결합 특이성을 다른 항체에 이식할 수 있는 것으로 되어 있다.

인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해진다. 구체적으로는 인간 이외의 동물, 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 인간 항체에 이식한 인간화 항체 등이 공지이다. 인간화 항체를 얻기 위한 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는 마우스의 항체의 CDR을 인간의 FR에 이식하기 위한 방법으로서, 예를 들면 Overlap Extension PCR이 공지이다. Overlap Extension PCR에 있어서는 인간 항체의 FR을 합성하기 위한 프라이머에 이식 대상 마우스 항체의 CDR을 코드하는 염기서열이 부가된다. 프라이머는 4개의 FR의 각각에 대해서 준비된다. 일반적으로 마우스 CDR의 인간 FR으로의 이식에 있어서는 마우스의 FR과 동일성이 높은 인간 FR을 선택하는 것이 CDR의 기능 유지에 있어서 유리하다고 되어 있다. 즉, 일반적으로 이식 대상 마우스 CDR에 인접해 있는 FR의 아미노산 서열과 동일성이 높은 아미노산 서열로 이루어지는 인간 FR을 이용하는 것이 바람직하다.

또한 연결되는 염기서열은 서로 인프레임으로 접속되도록 디자인된다. 각각의 프라이머에 의해 인간 FR이 개별적으로 합성된다. 그 결과 각 FR에 마우스 CDR을 코드하는 DNA가 부가된 산물이 얻어진다. 각 산물의 마우스 CDR을 코드하는 염기서열은 서로 오버랩되도록 디자인되어 있다. 계속해서 인간 항체 유전자를 주형으로 하여 합성된 산물의 오버랩된 CDR 부분을 서로 어닐링시켜서 상보가닥 합성반응이 행해진다. 이 반응에 의해 인간 FR이 마우스 CDR의 서열을 매개로 연결된다.

최종적으로 3개의 CDR과 4개의 FR이 연결된 V영역 유전자는 그의 5'말단과 3'말단에 어닐링하여 적당한 제한효소 인식서열이 부가된 프라이머에 의해 그의 전장이 증폭된다. 상기와 같이 얻어진 DNA와 인간 항체 C영역을 코드하는 DNA를 인프레임으로 융합하도록 발현 벡터 중에 삽입함으로써 인간형 항체 발현용 벡터를 제작할 수 있다. 당해 삽입 벡터를 숙주에 도입하여 재조합 세포를 수립한 후에, 당해 재조합 세포를 배양하고, 당해 인간화 항체를 코드하는 DNA를 발현시킴으로써 당해 인간화 항체가 당해 배양세포의 배양물 중에 생산된다(유럽 특허공개 EP239400, 국제공개 WO1996/002576 참조).

상기와 같이 제작된 인간화 항체의 항원으로의 결합 활성을 정성적 또는 정량적으로 측정하고 평가함으로써, CDR을 매개로 연결되었을 때 그 CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 인간 항체의 FR을 적합하게 선택할 수 있다. 필요에 따라 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기를 치환하는 것도 가능하다. 예를 들면, 마우스 CDR의 인간 FR으로의 이식에 사용한 PCR법을 응용하여 FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다. 구체적으로는 FR에 어닐링하는 프라이머에 부분적인 염기서열의 변이를 도입할 수 있다. 이러한 프라이머에 의해 합성된 FR에는 염기서열의 변이가 도입된다. 아미노산을 치환한 변이형 항체의 항원으로의 결합 활성을 상기 방법으로 측정하여 평가함으로써 목적하는 성질을 갖는 변이 FR 서열이 선택될 수 있다(Cancer Res., (1993) 53, 851-856).

또한 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물(국제공개 WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735 참조)을 면역동물로 하여 DNA 면역에 의해 목적하는 인간 항체가 취득될 수 있다.

또한 인간 항체 라이브러리를 사용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 V영역이 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현된다. 항원에 결합하는 scFv를 발현하는 파지가 선택될 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써 항원에 결합하는 인간 항체의 V영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열을 결정한 후, 당해 V영역 서열을 목적하는 인간 항체 C영역의 서열과 인프레임으로 융합시킨 후에 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 발현 벡터가 제작될 수 있다. 당해 발현 벡터를 상기에 예로 든 바와 같은 적합한 발현 세포 중에 도입하고, 그 인간 항체를 코드하는 유전자를 발현시킴으로써 당해 인간 항체가 취득된다. 이들 방법은 이미 공지이다(국제공개 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388 참조).

또한 항체 유전자를 취득하는 방법으로서 Bernasconi등(Science (2002) 298, 2199-2202) 또는 WO2008/081008에 기재된 바와 같은 B세포 클로닝(각각의 항체의 코드 서열의 동정 및 클로닝, 그의 단리 및 각각의 항체(특히, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 제작을 위한 발현 벡터 구축을 위한 사용 등)의 수법이 상기 외에 적당히 사용될 수 있다.

EU 넘버링 및 Kabat 넘버링

본 발명에서 사용되고 있는 방법에 의하면 항체의 CDR과 FR에 할당되는 아미노산 위치는 Kabat에 따라 규정된다(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987년 및 1991년). 본 명세서에 있어서 항원 결합 분자가 항체 또는 항원 결합 단편인 경우, 가변영역의 아미노산은 Kabat 넘버링에 따라 정상영역의 아미노산은 Kabat의 아미노산 위치에 준한 EU 넘버링에 따라 표시된다.

이온 농도의 조건

금속 이온 농도의 조건

본 발명의 하나의 태양에서는 이온 농도란 금속 이온 농도를 말한다. 「금속 이온」이란 수소를 제외한 알칼리금속 및 구리족 등의 제I족, 알칼리토류금속 및 아연족 등의 제II족, 붕소를 제외한 제III족, 탄소와 규소를 제외한 제IV족, 철족 및 백금족 등의 제VIII족, V, VI 및 VII족의 각 A아족에 대한 원소와 안티몬, 비스무트, 폴로늄 등의 금속원소의 이온을 말한다. 금속원자는 원자가 전자를 방출하여 양이온이 되는 성질을 가지고 있어 이를 이온화 경향이라 한다. 이온화 경향이 큰 금속은 화학적으로 활성이 풍부하다고 한다.

본 발명에서 적합한 금속 이온의 예로서 칼슘 이온을 들 수 있다. 칼슘 이온은 많은 생명 현상의 조절에 관여하고 있어 골격근, 평활근 및 심근 등의 근육의 수축, 백혈구의 운동 및 탐식 등의 활성화, 혈소판의 변형 및 분비 등의 활성화, 림프구의 활성화, 히스타민의 분비 등의 비만세포의 활성화, 카테콜아민 α수용체나 아세틸콜린 수용체를 매개로 하는 세포의 응답, 엑소시토시스, 뉴런 종말로부터의 전달물질의 방출, 뉴런의 축삭류(axoplasmic flow) 등에 칼슘 이온이 관여하고 있다. 세포내의 칼슘 이온 수용체로서 복수 개의 칼슘 이온 결합 부위를 가지며, 분자 진화상 공통의 기원으로부터 유래된 것으로 생각되는 트로포닌 C, 칼모듈린, 파브알부민, 미오신 경쇄 등이 알려져 있고, 그의 결합 모티브도 많이 알려져 있다. 예를 들면, 카드헤린 도메인, 칼모듈린에 포함되는 EF 핸드, Protein kinase C에 포함되는 C2 도메인, 혈액응고 단백질 Factor IX에 포함되는 Gla 도메인, 아시알로글리코프로테인 수용체나 만노오스 결합 수용체에 포함되는 C형 렉틴, LDL 수용체에 포함되는 A 도메인, 아넥신, 트롬보스폰딘 3형 도메인 및 EGF 유사 도메인이 잘 알려져 있다.

본 발명에 있어서는 금속 이온이 칼슘 이온인 경우에는 칼슘 이온 농도의 조건으로서 저칼슘 이온 농도의 조건과 고칼슘 이온 농도의 조건을 들 수 있다. 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 결합 활성이 변화된다는 것은, 저칼슘 이온 농도와 고칼슘 이온 농도의 조건의 차이에 의해 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 것을 말한다. 예를 들면 저칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 고칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높은 경우를 들 수 있다. 또한 고칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 저칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높은 경우도 또한 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 고칼슘 이온 농도란 특별히 일의적인 수치에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 100 μM~10 mM로부터 선택되는 농도일 수 있다. 또한 다른 태양에서는 200 μM~5 mM로부터 선택되는 농도일 수도 있다. 또한 상이한 태양에서는 400 μM~3 mM로부터 선택되는 농도일 수도 있고, 다른 태양에서는 200 μM~2 mM로부터 선택되는 농도일 수도 있다. 또한 400 μM~1 mM로부터 선택되는 농도일 수도 있다. 특히 생체내의 혈장 중(혈중)에서의 칼슘 이온 농도에 가까운 500 μM~2.5 mM로부터 선택되는 농도를 바람직하게 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 저칼슘 이온 농도란 특별히 일의적인 수치에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 0.1 μM~30 μM로부터 선택되는 농도일 수 있다. 또한 다른 태양에서는 0.2 μM~20 μM로부터 선택되는 농도일 수도 있다. 또한 상이한 태양에서는 0.5 μM~10 μM로부터 선택되는 농도일 수도 있고, 다른 태양에서는 1 μM~5 μM로부터 선택되는 농도일 수도 있다. 또한 2 μM~4 μM로부터 선택되는 농도일 수도 있다. 특히 생체내의 조기 엔도솜 내에서의 칼슘 이온 농도에 가까운 1 μM~5 μM로부터 선택되는 농도를 바람직하게 들 수 있다.

본 발명에 있어서 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다는 것은, 항원 결합 분자의 0.1 μM~30 μM로부터 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성이 100 μM~10 mM로부터 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다. 바람직하게는 항원 결합 분자의 0.5 μM~10 μM로부터 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성이 200 μM~5 mM로부터 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미하고, 특히 바람직하게는 생체내의 조기 엔도솜 내의 칼슘 이온 농도에 있어서의 항원 결합 활성이 생체내의 혈장 중의 칼슘 이온 농도에 있어서의 항원 결합 활성보다 약한 것을 의미하고, 구체적으로는 항원 결합 분자의 1 μM~5 μM로부터 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성이 500 μM~2.5 mM로부터 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다.

금속 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되고 있는지 여부는, 예를 들면 상기 결합 활성의 항목에서 기재된 바와 같은 공지의 측정방법을 사용함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면 저칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 고칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높게 변화되는 것을 확인하기 위해서는 저칼슘 이온 농도 및 고칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 비교된다.

또한 본 발명에 있어서 「저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다」는 표현은, 항원 결합 분자의 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 높다고 표현하는 것도 가능하다. 또한 본 발명에 있어서는 「저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다」를 「저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원 결합능이 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합능보다 약하다」라고 기재하는 경우도 있고, 또한 「저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 활성을 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 저하시킨다」를 「저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원 결합능을 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합능보다도 약하게 한다」고 기재하는 경우도 있다.

항원으로의 결합 활성을 측정할 때의 이온화 칼슘 농도 이외의 조건은 당업자가 적당히 선택하는 것이 가능하고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, HEPES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면, Biacore(GE Healthcare) 등을 사용하여 측정하는 것이 가능하다. 항원 결합 분자와 항원의 결합 활성의 측정은, 항원이 가용형 항원인 경우는 항원 결합 분자를 고정화한 칩으로 항원을 애널라이트로서 흘림으로써 가용형 항원으로의 결합 활성을 평가하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는 항원을 고정화한 칩으로 항원 결합 분자를 애널라이트로서 흘림으로써 막형 항원에 대한 결합 활성을 평가하는 것이 가능하다.

본 발명의 항원 결합 분자에 있어서 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 약한 한, 저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 항원에 대한 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 KD(Dissociation constant：해리상수)와 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 KD의 비인 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값이 10 이상이며, 더욱 바람직하게는 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값이 40 이상이다. KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한 400, 1000, 10000 등 어떠한 값이어도 된다.

항원에 대한 결합 활성의 값으로서 항원이 가용형 항원인 경우는 KD(해리상수)를 사용하는 것이 가능하나, 항원이 막형 항원인 경우는 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수)를 사용하는 것이 가능하다. KD(해리상수) 및 겉보기 KD(겉보기 해리상수)는 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 스캐차드 플롯, 플로우 사이토미터 등을 사용하는 것이 가능하다.

또한 본 발명의 항원 결합 분자의 저칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비를 나타내는 다른 지표로서, 예를 들면, 해리속도상수인 kd(Dissociation rate constant：해리속도상수)도 또한 바람직하게 사용될 수 있다. 결합 활성의 비를 나타내는 지표로서 KD(해리상수) 대신에 kd(해리속도상수)를 사용하는 경우, 항원에 대한 저칼슘 농도의 조건에 있어서의 kd(해리속도상수)와 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 kd(해리속도상수)의 비인 kd(저칼슘 농도의 조건)/kd(고칼슘 농도의 조건)의 값은 바람직하게는 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 5 이상이며, 더욱 바람직하게는 10 이상이고, 보다 바람직하게는 30 이상이다. kd(저칼슘 농도의 조건)/kd(고칼슘 농도의 조건)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술상식에 있어서 제작 가능한 한 50, 100, 200 등 어떠한 값이어도 된다.

항원 결합 활성의 값으로서 항원이 가용형 항원인 경우는 kd(해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는 겉보기 kd(Apparent dissociation rate constant：겉보기 해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하다. kd(해리속도상수) 및 겉보기 kd(겉보기 해리속도상수)는 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 플로우 사이토미터 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한 본 발명에 있어서 상이한 칼슘 이온 농도에 있어서의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성을 측정할 때는 칼슘 농도 이외의 조건은 동일하게 하는 것이 바람직하다.

예를 들면 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항체의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.

(a) 저칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성을 얻는 공정,

(b) 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성을 얻는 공정,

(c) 저칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항체 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.

(a) 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체 또는 그들의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 저칼슘 농도 조건하에 두는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항체를 단리하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(d)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항체 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.

(a) 저칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 선택된 항원 결합 도메인 또는 항체를 고칼슘 농도 조건하에서 항원에 결합시키는 공정,

(d) 상기 공정(c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 단리하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.

(a) 항원을 고정한 칼럼에 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 저칼슘 농도 조건하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 용출된 항원 결합 도메인 또는 항체를 단리하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(d)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.

(a) 항원을 고정한 칼럼에 저칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 통과시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 칼럼에 결합하지 않고 용출된 항원 결합 도메인 또는 항체를 회수하는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 회수된 항원 결합 도메인 또는 항체를 고칼슘 농도 조건하에서 항원에 결합시키는 공정,

(d) 상기 공정(c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 단리하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(d)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.

(a) 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 취득하는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 취득한 항원 결합 도메인 또는 항체를 저칼슘 농도 조건하에 두는 공정,

(d) 상기 공정(c)에서 항원 결합 활성이 상기 공정(b)에서 선택한 기준보다 약한 항원 결합 도메인 또는 항체를 단리하는 공정.

또한 상기 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서 본 발명에 의해, 전술한 스크리닝방법에 있어서 (a)~(c) 또는 (a)~(d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가로 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득된 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다. (a)~(c) 또는 (a)~(d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않으나, 통상 10회 이내이다.

본 발명의 스크리닝방법에 있어서, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 이온화 칼슘 농도가 0.1 μM~30 μM의 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 0.5 μM~10 μM의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 생체내의 조기 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도를 들 수 있고, 구체적으로는 1 μM~5 μM에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 또한 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 이온화 칼슘 농도가 100 μM~10 mM의 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 200 μM~5 mM의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 생체내의 혈장 중에서의 이온화 칼슘 농도를 들 수 있고, 구체적으로는 0.5 mM~2.5 mM에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다.

항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 당업자에게 공지의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하고, 이온화 칼슘 농도 이외의 조건에 대해서는 당업자가 적당히 결정하는 것이 가능하다. 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 KD(Dissociation constant：해리상수), 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수), 해리속도인 kd(Dissociation rate：해리속도상수) 또는 겉보기 kd(Apparent dissociation：겉보기 해리속도상수) 등으로서 평가하는 것이 가능하다. 이들은 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 스캐차드 플롯, FACS 등을 사용하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정은, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정과 동일한 의미이다.

고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 한, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성과 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성의 차는 특별히 한정되지 않으나, 바람하게는 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성의 2배 이상이고, 더욱 바람직하게는 10배 이상이며, 보다 바람직하게는 40배 이상이다.

상기 스크리닝방법에 의해 스크리닝되는 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체는 어떠한 항원 결합 도메인 또는 항체여도 되고, 예를 들면 전술한 항원 결합 도메인 또는 항체를 스크리닝하는 것이 가능하다. 예를 들면 천연의 서열을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항체를 스크리닝해도 되고, 아미노산 서열이 치환된 항원 결합 도메인 또는 항체를 스크리닝해도 된다.

라이브러리

어떤 일태양에 따르면, 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체는 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 항원 결합 도메인에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 이온 농도의 예로서는 금속 이온 농도나 수소 이온 농도를 바람직하게 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 「라이브러리」란 복수의 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자를 포함하는 복수의 융합 폴리펩티드, 또는 이들의 서열을 코드하는 핵산, 폴리뉴클레오티드를 말한다. 라이브러리 중에 포함되는 복수의 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자를 포함하는 복수의 융합 폴리펩티드의 서열은 단일 서열이 아니라, 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자를 포함하는 융합 폴리펩티드이다.

본 명세서에 있어서는 서로 서열이 상이한 복수의 항원 결합 분자라는 기재에 있어서의 「서로 서열이 상이하다」는 용어는 라이브러리 중의 개개의 항원 결합 분자의 서열이 상호 상이한 것을 의미한다. 즉 라이브러리 중에 있어서의 서로 다른 서열의 수는 라이브러리 중의 서열이 상이한 독립 클론의 수가 반영되어 「라이브러리 사이즈」로 지칭되는 경우도 있다. 통상의 파지 디스플레이 라이브러리에서는 10⁶~10¹²이고, 리보솜 디스플레이법 등의 공지의 기술을 적용함으로써 라이브러리 사이즈를 10¹⁴까지 확대하는 것이 가능하다. 그러나 파지 라이브러리의 패닝 선택시에 사용되는 파지 입자의 실제 수는 통상 라이브러리 사이즈보다도 10~10,000배 크다. 이 과잉 배수는 「라이브러리 당량수」라고도 불리는데 동일한 아미노산 서열을 갖는 개개의 클론이 10~10,000 존재할 수 있는 것을 나타낸다. 따라서 본 발명에 있어서의 「서로 서열이 상이하다」는 용어는 라이브러리 당량수가 제외된 라이브러리 중의 개개의 항원 결합 분자의 서열이 상호 상이한 것, 보다 구체적으로는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자가 10⁶~10¹⁴ 분자, 바람직하게는 10⁷~10¹² 분자, 더욱 바람직하게는 10⁸~10¹¹, 특히 바람직하게는 10⁸~10¹⁰ 존재하는 것을 의미한다.

또한 본 발명의 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리라는 기재에 있어서의 「복수의」라는 용어는, 예를 들면 본 발명의 항원 결합 분자, 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터 또는 바이러스는 통상 그 물질의 2개 이상의 종류의 집합을 가리킨다. 예를 들면 어떤 2개 이상의 물질이 특정 형질에 관하여 서로 상이하다면 그 물질에는 2종류 이상이 존재하는 것을 나타낸다. 예로서는 아미노산 서열 중의 특정 아미노산 위치에서 관찰되는 변이체 아미노산을 들 수 있다. 예를 들면 플렉시블 잔기 이외, 또는 표면에 노출된 매우 다양한 아미노산 위치의 특정 변이체 아미노산 이외는 실질적으로 동일한, 바람직하게는 동일 서열인 본 발명의 2개 이상의 항원 결합 분자가 있는 경우, 본 발명의 항원 결합 분자는 복수 개 존재한다. 다른 실시예에서는 플렉시블 잔기를 코드하는 염기 이외, 또는 표면에 노출된 매우 다양한 아미노산 위치의 특정 변이체 아미노산을 코드하는 염기 이외는 실질적으로 동일한, 바람직하게는 동일 서열인 본 발명의 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 분자가 있다면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는 복수 개 존재한다.

또한 본 발명의 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리라는 기재에 있어서의 「로 주로 이루어지는」이라는 용어는 라이브러리 중의 서열이 상이한 독립 클론의 수 중, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 상이한 항원 결합 분자의 수가 반영된다. 구체적으로는 그러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중에 적어도 10⁴ 분자 존재하는 것이 바람직하다. 또한 보다 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 그러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 10⁵ 분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 그러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 10⁶ 분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 특히 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 그러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 10⁷ 분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 또한 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 그러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 10⁸ 분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 다른 표현으로는 라이브러리 중의 서열이 상이한 독립 클론의 수 중, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 상이한 항원 결합 분자의 비율로서도 적합하게 표현될 수 있다. 구체적으로는 본 발명의 항원 결합 도메인은 그러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중의 서열이 상이한 독립 클론 수의 0.1%~80%, 바람직하게는 0.5%~60%, 보다 바람직하게는 1%~40%, 더욱 바람직하게는 2%~20%, 특히 바람직하게는 4%~10% 포함되는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터의 경우도 상기와 마찬가지로 분자의 수나 분자 전체에 있어서의 비율로 표현될 수 있다. 또한 바이러스의 경우도 상기와 마찬가지로 바이러스 개체의 수나 개체 전체에 있어서의 비율로 표현될 수 있다.

칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성을 변화시키는 아미노산

상기 스크리닝방법에 의해 스크리닝되는 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체는 어떻게 조제되어도 되고, 예를 들면 금속 이온이 칼슘 이온 농도인 경우에는 사전에 존재하고 있는 항체, 사전에 존재하고 있는 라이브러리(파지 라이브러리 등), 동물에 대한 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항체 또는 라이브러리, 이들 항체나 라이브러리에 칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산 변이를 도입한 항체 또는 라이브러리(칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산의 함유율을 높게 한 라이브러리나 특정 개소에 칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산 변이를 도입한 라이브러리 등) 등을 사용하는 것이 가능하다.

상기와 같이 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산의 예로서, 예를 들면 금속 이온이 칼슘 이온인 경우에는 칼슘 결합 모티브를 형성하는 아미노산이라면 그 종류는 불문한다. 칼슘 결합 모티브는 당업자에게 주지로 상세하게 기재되어 있다(예를 들면 Springer등(Cell (2000) 102, 275-277), Kawasaki 및 Kretsinger(Protein Prof. (1995) 2, 305-490), Moncrief등(J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562), Chauvaux등(Biochem. J. (1990) 265, 261-265), Bairoch 및 Cox(FEBS Lett. (1990) 269, 454-456), Davis(New Biol. (1990) 2, 410-419), Schaefer등(Genomics (1995) 25, 638~643), Economou등(EMBO J. (1990) 9, 349-354), Wurzburg등(Structure. (2006) 14, 6, 1049-1058)). 즉, ASGPR, CD23, MBR, DC-SIGN 등의 C형 렉틴 등의 임의의 공지의 칼슘 결합 모티브가 본 발명의 항원 결합 분자에 포함될 수 있다. 이러한 칼슘 결합 모티브의 적합한 예로서, 상기 외에는 서열번호：4에 기재되는 항원 결합 도메인에 포함되는 칼슘 결합 모티브도 들 수 있다.

또한 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산의 예로서, 금속 킬레이트 작용을 갖는 아미노산도 적합하게 사용될 수 있다. 금속 킬레이트 작용을 갖는 아미노산의 예로서, 예를 들면 세린(Ser(S)), 트레오닌(Thr(T)), 아스파라긴(Asn(N)), 글루타민(Gln(Q)), 아스파라긴산(Asp(D)) 및 글루타민산(Glu(E)) 등을 바람직하게 들 수 있다.

상기의 아미노산이 포함되는 항원 결합 도메인의 위치는 특정 위치에 한정되지 않고, 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 한, 항원 결합 도메인을 형성하는 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역 중 어느 위치일 수도 있다. 즉 본 발명의 항원 결합 도메인은 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 중쇄의 항원 결합 도메인에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 또한 다른 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산이 중쇄의 CDR3에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 그 밖의 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산이 중쇄의 CDR3의 Kabat 넘버링으로 표시되는 95번 위치, 96번 위치, 100a번 위치 및/또는 101번 위치에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.

또한 본 발명의 일태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 경쇄의 항원 결합 도메인에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 또한 다른 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산이 경쇄의 CDR1에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 그 밖의 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산이 경쇄의 CDR1의 Kabat 넘버링으로 표시되는 30번 위치, 31번 위치 및/또는 32번 위치에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.

또한 다른 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR2에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 그 밖의 태양에서는 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR2의 Kabat 넘버링으로 표시되는 50번 위치에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리가 제공된다.

또 다른 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR3에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 그 밖의 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR3의 Kabat 넘버링으로 표시되는 92번 위치에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.

또한 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 상기에 기재된 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3로부터 선택되는 2개 또는 3개의 CDR에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 본 발명의 상이한 태양으로서 취득될 수 있다. 또한 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 Kabat 넘버링으로 표시되는 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및/또는 92번 위치 중 어느 하나 이상에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.

특히 적합한 실시태양에서는 항원 결합 분자의 경쇄 및/또는 중쇄 가변영역의 프레임워크 서열은 인간의 생식세포계 프레임워크 서열을 가지고 있는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 일태양에 있어서 프레임워크 서열이 완전히 인간의 서열이라면, 인간에게 투여(예를 들면 질병의 치료)된 경우, 본 발명의 항원 결합 분자는 면역원성 반응을 거의 또는 전혀 일으키지 않을 것으로 생각된다. 상기 의미로부터 본 발명의 「생식세포 계열의 서열을 포함한다」는 것은, 본 발명의 프레임워크 서열의 일부가 어느 하나의 인간의 생식세포계 프레임워크 서열의 일부와 동일한 것을 의미한다. 예를 들면 본 발명의 항원 결합 분자의 중쇄 FR2의 서열이 복수의 상이한 인간의 생식세포계 프레임워크 서열의 중쇄 FR2 서열이 조합된 서열인 경우도, 본 발명의 「생식세포 계열의 서열을 포함하는」 항원 결합 분자이다.

프레임워크의 예로서는 예를 들면 V-Base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 등의 웹사이트에 포함되어 있는, 현재 알려져 있는 완전히 인간형의 프레임워크 영역의 서열을 바람직하게 들 수 있다. 이들 프레임워크 영역의 서열이 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 생식세포 계열의 서열로서 적당히 사용될 수 있다. 생식세포 계열의 서열은 그 유사성을 토대로 분류될 수 있다(Tomlinson등(J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798) Williams 및 Winter(Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461) 및 Cox등(Nat. Genetics (1994) 7, 162-168)). 7개의 서브 그룹으로 분류되는 κ, 10의 서브 그룹으로 분류되는 Vλ, 7개의 서브 그룹으로 분류되는 VH로부터 적합한 생식세포 계열의 서열이 적당히 선택될 수 있다.

완전히 인간형의 VH 서열은 하기에만 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 VH1 서브 그룹(예를 들면 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69), VH2 서브 그룹(예를 들면 VH2-5, VH2-26, VH2-70), VH3 서브 그룹(VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74), VH4 서브 그룹(VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61), VH5 서브 그룹(VH5-51), VH6 서브 그룹(VH6-1), VH7 서브 그룹(VH7-4, VH7-81)의 VH 서열 등을 바람직하게 들 수 있다. 이들은 공지 문헌(Matsuda등(J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975)) 등에도 기재되어 있어, 당업자는 이들 서열정보를 토대로 본 발명의 항원 결합 분자를 적당히 설계하는 것이 가능하다. 이들 이외의 완전히 인간형의 프레임워크 또는 프레임워크의 준영역도 적합하게 사용될 수 있다. 　

완전히 인간형의 Vk 서열은 하기에만 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 Vk1 서브 그룹으로 분류되는 A20, A30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14, O18, Vk2 서브 그룹으로 분류되는 A1, A2, A3, A5, A7, A17, A18, A19, A23, O1, O11, Vk3 서브 그룹으로 분류되는 A11, A27, L2, L6, L10, L16, L20, L25, Vk4 서브 그룹으로 분류되는 B3, Vk5 서브 그룹으로 분류되는 B2(본 명세서에 있어서는 Vk5-2라고도 지칭된다)), Vk6 서브 그룹으로 분류되는 A10, A14, A26 등(Kawasaki등(Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028), Schable 및 Zachau(Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022) 및 Brensing-Kuppers등(Gene (1997) 191, 173-181))을 바람직하게 들 수 있다.

완전히 인간형의 VL 서열은 하기에만 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 VL1 서브 그룹으로 분류되는 V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20, V1-22, VL1 서브 그룹으로 분류되는 V2-1, V2-6, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, VL3 서브 그룹으로 분류되는 V3-2, V3-3, V3-4, VL4 서브 그룹으로 분류되는 V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, VL5 서브 그룹으로 분류되는 V5-1, V5-2, V5-4, V5-6 등(Kawasaki등(Genome Res. (1997) 7, 250-261))을 바람직하게 들 수 있다.

통상 이들의 프레임워크 서열은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 상위함으로 인해 서로 상이하다. 이들 프레임워크 서열은 본 발명의 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」와 함께 사용되는 완전히 인간형의 프레임워크의 예로서는 이것에만 한정되는 것이 아니라, 이 밖에도 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY, POM 등을 들 수 있다(예를 들면 상기의 Kabat등 (1991) 및 Wu등(J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250)).

본 발명은 특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 생식세포계의 서열의 사용이 대부분인 개인에 있어서 유해한 면역반응을 배제할 것으로 기대되고 있는 하나의 이유는 아래와 같다고 생각되고 있다. 통상의 면역반응 중에 생기는 친화성 성숙 스텝의 결과, 면역블로불린의 가변영역에 체세포의 돌연변이가 빈번하게 생긴다. 이들 돌연변이는 주로 그 서열이 초가변적인 CDR의 주변에 생기는데 프레임워크 영역의 잔기에도 영향을 미친다. 이들 프레임워크의 돌연변이는 생식세포계의 유전자에는 존재하지 않고 또한 환자의 면역원성이 될 가능성은 적다. 한편 통상의 인간의 집단은 생식세포계의 유전자에 의해 발현되는 프레임워크 서열의 대다수에 노출되어 있어, 면역관용의 결과, 이들 생식세포계의 프레임워크는 환자에 있어서 면역원성이 낮거나 또는 비면역원성일 것으로 예상된다. 면역관용의 가능성을 최대로 하기 위해, 가변영역을 코드화하는 유전자가 보통으로 존재하는 기능적인 생식세포계 유전자의 집합으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 상기 프레임워크 서열에 포함되는 항원 결합 분자를 제작하기 위해 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지의 방법이 적당히 채용될 수 있다.

예를 들면 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 사전에 포함되어 있는 프레임워크 서열로서 선택된 경쇄 가변영역과, 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킴으로써 본 발명의 복수의 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다. 이러한 비한정적인 예로서 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 예를 들면 서열번호：4(Vk5-2)에 기재된 경쇄 가변영역 서열과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킨 라이브러리를 바람직하게 들 수 있다.

또한 상기 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 사전에 포함되어 있는 프레임워크 서열로서 선택된 경쇄 가변영역의 서열에, 당해 아미노산 잔기 이외의 잔기로서 다양한 아미노산이 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명에 있어서 그러한 잔기는 플렉시블 잔기라 지칭된다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양에 한정되는 경우는 없다. 즉 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 서열 및/또는 FR 서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 예를 들면 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 서열번호：4(Vk5-2)에 기재된 경쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서 표 1 또는 표 2에 기재된 아미노산 잔기를 들 수 있다.

본 명세서에 있어서는 플렉시블 잔기란 공지 및/또는 천연 항체 또는 항원 결합 도메인의 아미노산 서열을 비교한 경우에, 그 위치에서 제시되고 있는 몇 개의 상이한 아미노산을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변영역 상의 아미노산이 매우 다양한 위치에 존재하는 아미노산 잔기의 변형을 말한다. 매우 다양한 위치는 일반적으로 CDR영역에 존재한다. 일태양에서는 공지 및/또는 천연 항체의 매우 다양한 위치를 결정할 때는 Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.) (1987년 및 1991년)가 제공하는 데이터가 유효하다. 또한 인터넷 상의 복수의 데이터베이스(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/, http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)에서는 수집된 다수의 인간 경쇄 및 중쇄의 서열과 그의 배치가 제공되고 있어, 이들 서열과 그의 배치의 정보는 본 발명에 있어서의 매우 다양한 위치의 결정에 유용하다. 본 발명에 의하면 아미노산이 어떤 위치에서 바람직하게는 약 2~약 20, 바람직하게는 약 3~약 19, 바람직하게는 약 4~약 18, 바람직하게는 5~17, 바람직하게는 6~16, 바람직하게는 7~15, 바람직하게는 8~14, 바람직하게는 9~13, 바람직하게는 10~12개의 가능한 상이한 아미노산 잔기의 다양성을 갖는 경우는 그 위치는 매우 다양하다고 할 수 있다. 몇개의 실시형태에서는 어떤 아미노산 위치는 바람직하게는 약 2 이상, 바람직하게는 약 4 이상, 바람직하게는 약 6 이상, 바람직하게는 약 8 이상, 바람직하게는 약 10, 바람직하게는 약 12의 가능한 상이한 아미노산 잔기의 다양성을 가질 수 있다.

또한 상기 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된 경쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킴으로써도, 본 발명의 복수의 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다. 이러한 비한정적인 예로서 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 예를 들면 서열번호：5(Vk1), 서열번호：6(Vk2), 서열번호：7(Vk3), 서열번호：8(Vk4) 등의 생식세포 계열의 특정 잔기가, 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환된 경쇄 가변영역 서열과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킨 라이브러리를 바람직하게 들 수 있다. 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 경쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 그 밖에도 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 경쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 또한 당해 아미노산 잔기의 비한정의 다른 예로서 경쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기도 또한 예시된다.

상기와 같이 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR1 중의 EU 넘버링으로 표시되는 30번 위치, 31번 위치 및/또는 32번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR2 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 50번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR3 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 92번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 이들의 아미노산 잔기가 칼슘 결합 모티브를 형성 및/또는 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 한, 이들 아미노산 잔기가 단독으로 포함될 수 있고, 이들 아미노산이 2개 이상 조합되어 포함될 수 있다. 또한 복수 개의 칼슘 이온 결합 부위를 가지며, 분자 진화상 공통의 기원으로부터 유래된 것으로 생각되는 트로포닌 C, 칼모듈린, 파브알부민, 미오신 경쇄 등이 알려져 있어, 그의 결합 모티브가 포함되도록 경쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3를 설계하는 것도 가능하다. 예를 들면 상기의 목적으로 카드헤린 도메인, 칼모듈린에 포함되는 EF 핸드, Protein kinase C에 포함되는 C2 도메인, 혈액 응고 단백질 FactorIX에 포함되는 Gla 도메인, 아시알로글리코프로테인 수용체나 만노오스 결합 수용체에 포함되는 C형 렉틴, LDL 수용체에 포함되는 A 도메인, 아넥신, 트롬보스폰딘 3형 도메인 및 EGF 유사 도메인이 적당히 사용될 수 있다.

상기 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된 경쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시키는 경우라도, 상기와 마찬가지로 플렉시블 잔기가 당해 경쇄 가변영역의 서열에 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양에 한정되는 경우는 없다. 즉 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 서열 및/또는 FR 서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 예를 들면 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는 경쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서 표 1 또는 표 2에 기재된 아미노산 잔기를 들 수 있다.

조합되는 중쇄 가변영역의 예로서 랜덤화 가변영역 라이브러리를 바람직하게 들 수 있다. 랜덤화 가변영역 라이브러리의 제작방법은 공지의 방법이 적절히 조합된다. 본 발명의 비한정의 일태양에서는 특정 항원으로 면역된 동물, 감염증 환자나 백신 접종하여 혈중 항체가가 상승한 인간, 암 환자, 자기 면역 질환의 림프구 유래의 항체 유전자를 토대로 구축된 면역 라이브러리가 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 적합하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 게놈 DNA에 있어서의 V 유전자나 재구축되어 기능적인 V 유전자의 CDR 서열이 적당한 길이의 코돈 세트를 코드하는 서열을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드 세트로 치환된 합성 라이브러리도 또한 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 적합하게 사용될 수 있다. 이 경우, 중쇄의 CDR3의 유전자 서열의 다양성이 관찰되는 것으로부터, CDR3의 서열만을 치환하는 것도 또한 가능하다. 항원 결합 분자의 가변영역에 있어서 아미노산의 다양성을 만들어내는 기준은, 항원 결합 분자의 표면에 노출된 위치의 아미노산 잔기에 다양성을 부여하는 것이다. 표면에 노출된 위치란 항원 결합 분자의 구조, 구조 어셈블 및/또는 모델화된 구조에 기초하여 표면 노출이 가능 및/또는 항원과의 접촉이 가능하다고 판단되는 위치를 말하는데, 일반적으로는 그의 CDR이다. 바람직하게는 표면에 노출된 위치는 InsightII 프로그램(Accelrys)과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 항원 결합 분자의 3차원 모델로부터의 좌표를 사용하여 결정된다. 표면에 노출된 위치는 당 기술분야에서 공지인 알고리즘(예를 들면 Lee 및 Richards(J.Mol.Biol. (1971) 55, 379-400), Connolly(J.Appl.Cryst. (1983) 16, 548-558))을 사용하여 결정될 수 있다. 표면에 노출된 위치의 결정은 단백질 모델링에 적합한 소프트웨어 및 항체로부터 얻어지는 3차원 구조 정보를 사용하여 행해질 수 있다. 이러한 목적을 위해 이용할 수 있는 소프트웨어로서 SYBYL 생체 고분자 모듈 소프트웨어(Tripos Associates)를 바람직하게 들 수 있다. 일반적으로 또한 바람직하게는 알고리즘이 유저의 입력 사이즈 파라미터를 필요로 하는 경우는 계산에 있어서 사용되는 프로브의 「사이즈」는 반경 약 1.4 옹스트롬 이하로 설정된다. 또한 퍼스널 컴퓨터용 소프트웨어를 사용한 표면에 노출된 영역 및 구역의 결정법이Pacios(Comput.Chem. (1994) 18 (4), 377-386 및 J.Mol.Model. (1995) 1, 46-53)에 기재되어 있다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 건강한 정상인의 림프구 유래의 항체 유전자로부터 구축되어, 그 레퍼토리에 바이어스를 포함하지 않는 항체 서열인 나이브 서열로 이루어지는 나이브 라이브러리도 또한 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 특히 적합하게 사용될 수 있다(Gejima등(Human Antibodies (2002) 11,121-129) 및 Cardoso등(Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)). 본 발명에서 기재되는 나이브 서열을 포함하는 아미노산 서열이란 이러한 나이브 라이브러리로부터 취득되는 아미노산 서열을 말한다.

본 발명의 하나의 태양에서는 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 사전에 포함되어 있는 프레임워크 서열로서 선택된 중쇄 가변영역과, 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역을 조합시킴으로써 본 발명의 복수의 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리로부터 본 발명의 항원 결합 도메인이 취득될 수 있다. 이러한 비한정적인 예로서 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 예를 들면 서열번호：9(6RL#9-IgG1) 또는 서열번호：10(6KC4-1#85-IgG1)에 기재된 중쇄 가변영역 서열과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역을 조합한 라이브러리를 바람직하게 들 수 있다. 또한 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역 대신에, 생식세포 계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 중에서 적당히 선택함으로써 제작될 수 있다. 예를 들면 서열번호：9(6RL#9-IgG1) 또는 서열번호：10(6KC4-1#85-IgG1)에 기재된 중쇄 가변영역 서열과 생식세포 계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 조합시킨 라이브러리를 바람직하게 들 수 있다.

또한 상기 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 사전에 포함되어 있는 프레임워크 서열로서 선택된 중쇄 가변영역의 서열에 플렉시블 잔기가 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양으로 한정되는 경우는 없다. 즉 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 서열 및/또는 FR 서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 예를 들면 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는 서열번호：9(6RL#9-IgG1)에 기재된 중쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서, 중쇄 CDR1 및 CDR2의 모든 아미노산 잔기 외에 중쇄 CDR3의 95번 위치, 96번 위치 및/또는 100a번 위치 이외의 CDR3의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또는 서열번호：10(6KC4-1#85-IgG1)에 기재된 중쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서, 중쇄 CDR1 및 CDR2의 모든 아미노산 잔기 외에 중쇄 CDR3의 95번 위치 및/또는 101번 위치 이외의 CDR3의 아미노산 잔기도 또한 들 수 있다.

또한 상기 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 도입된 중쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역 또는 생식세포 계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 조합시킴으로써도 복수의 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다. 이러한 비한정적인 예로서, 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 예를 들면 중쇄 가변영역의 특정 잔기가 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환된 중쇄 가변영역 서열과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역 또는 생식세포 계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 조합시킨 라이브러리를 바람직하게 들 수 있다. 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 중쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 그 밖에도, 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 중쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 또한 당해 아미노산 잔기의 비한정의 다른 예로서 중쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기도 또한 예시된다. 당해 아미노산 잔기가 중쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 중쇄 가변영역의 CDR3 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 95번 위치, 96번 위치, 100a번 위치 및/또는 101번 위치의 아미노산을 들 수 있다. 또한 이들 아미노산 잔기가 칼슘 결합 모티브를 형성 및/또는 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 한, 이들 아미노산 잔기가 단독으로 포함될 수 있고, 이들 아미노산이 2개 이상 조합되어 포함될 수 있다.

상기의 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된 중쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역 또는 생식세포 계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 조합시키는 경우라도, 상기와 마찬가지로 플렉시블 잔기가 당해 중쇄 가변영역의 서열에 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양으로 한정되는 경우는 없다. 즉 중쇄의 CDR 서열 및/또는 FR 서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 또한 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산 잔기 이외의 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3의 아미노산 서열로서 램덤화 가변영역 라이브러리도 적합하게 사용될 수 있다. 경쇄 가변영역으로서 생식세포 계열의 서열이 사용되는 경우에는, 예를 들면 서열번호：5(Vk1), 서열번호：6(Vk2), 서열번호：7(Vk3), 서열번호：8(Vk4) 등의 생식세포 계열의 서열을 비한정의 예로서 들 수 있다.

상기의 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산으로서는 칼슘 결합 모티브를 형성하는 한 어느 아미노산도 적합하게 사용될 수 있으나, 그러한 아미노산으로서는 구체적으로 전자 공여성을 갖는 아미노산을 들 수 있다. 이러한 전자 공여성을 갖는 아미노산으로서는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파라긴산 또는 글루타민산이 바람직하게 예시된다.

수소 이온 농도의 조건

또한 본 발명의 하나의 태양에서는 이온 농도의 조건이란 수소 이온 농도의 조건 또는 pH의 조건을 말한다. 본 발명에서 프로톤 즉 수소원자의 원자핵의 농도의 조건은 수소 지수(pH)의 조건과도 같은 정의로 취급된다. 수용액 중의 수소 이온의 활동량을 aH+로 나타낼 때, pH는 -log10aH+로 정의된다. 수용액 중의 이온 강도가 (예를 들면 10^-3보다) 낮으면 aH+는 수소 이온 강도와 거의 동등하다. 예를 들면 25℃, 1기압에 있어서의 물의 이온곱은 Kw=aH+aOH=10^-14이기 때문에, 순수(純水)의 경우는 aH+=aOH=10^-7이다. 이 경우의 pH=7이 중성이고, pH가 7보다 작은 수용액은 산성, pH가 7보다 큰 수용액은 알칼리성이다.

본 발명에 있어서는 이온 농도의 조건으로서 pH의 조건이 사용되는 경우에는 pH의 조건으로서 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건과 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역의 조건을 들 수 있다. pH의 조건에 따라 결합 활성이 변화된다는 것은, 고수소 이온 농도 또는 저pH(pH 산성역)와 저수소 이온 농도 또는 고pH(pH 중성역)의 조건의 차이에 의해 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 것을 말한다. 예를 들면 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높은 경우를 들 수 있다. 또한 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높은 경우도 또한 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 pH 중성역이란 특별히 일의적인 수치에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 pH 6.7~pH 10.0으로부터 선택될 수 있다. 또한 다른 태양에서는 pH 6.7~pH 9.5로부터 선택될 수 있다. 또한 상이한 태양에서는 pH 7.0~pH 9.0으로부터 선택될 수 있고, 다른 태양에서는 pH 7.0~pH 8.0으로부터 선택될 수 있다. 특히 생체내의 혈장 중(혈중)에서의 pH에 가까운 pH 7.4를 바람직하게 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 pH 산성역이란 특별히 일의적인 수치에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 pH 4.0~pH 6.5로부터 선택될 수 있다. 또한 다른 태양에서는 pH 4.5~pH 6.5로부터 선택될 수 있다. 또한 상이한 태양에서는 pH 5.0~pH 6.5로부터 선택될 수 있고, 다른 태양에서는 pH 5.5~pH 6.5로부터 선택될 수 있다. 특히 생체내의 조기 엔도솜 내에서의 pH에 가까운 pH 5.8을 바람직하게 들 수 있다.

본 발명에 있어서 항원 결합 분자의 고수소 이온 농도 또는 저pH(pH 산성역)의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH(pH 중성역)의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다는 것은, 항원 결합 분자의 pH 4.0~pH 6.5로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 6.7~pH 10.0으로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다. 바람직하게는 항원 결합 분자의 pH 4.5~pH 6.5로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 6.7~pH 9.5로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미하고, 보다 바람직하게는 항원 결합 분자의 pH 5.0~pH 6.5로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 7.0~pH 9.0으로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다. 또한 바람직하게는 항원 결합 분자의 pH 5.5~pH 6.5로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 7.0~pH 8.0으로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다. 특히 바람직하게는 생체내의 조기 엔도솜 내의 pH에 있어서의 항원 결합 활성이 생체내의 혈장 중의 pH에 있어서의 항원 결합 활성보다 약한 것을 의미하고, 구체적으로는 항원 결합 분자의 pH 5.8에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 7.4에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다.

pH의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되어 있는지 여부는, 예를 들면 상기 결합 활성의 항목에서 기재된 바와 같은 공지의 측정방법을 사용함으로써 결정될 수 있다. 즉 당해 측정방법으로 상이한 pH의 조건하에서의 결합 활성이 측정된다. 예를 들면 pH 산성역의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 pH 중성역의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높게 변화되는 것을 확인하기 위해서는, pH 산성역 및 pH 중성역의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 비교된다.

또한 본 발명에 있어서 「고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다」고 하는 표현은, 항원 결합 분자의 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 높다고 표현하는 것도 가능하다. 또한 본 발명에 있어서는 「고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다」를 「고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합능보다도 약하다」라고 기재하는 경우도 있고, 또한 「고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 저하시킨다」를 「고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합능보다도 약하게 한다」라고 기재하는 경우도 있다.

항원으로의 결합 활성을 측정할 때의 수소 이온 농도 또는 pH 이외의 조건은 당업자가 적당히 선택하는 것이 가능하고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 HEPES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면 Biacore(GE Healthcare) 등을 사용하여 측정하는 것이 가능하다. 항원 결합 분자와 항원의 결합 활성의 측정은, 항원이 가용형 항원인 경우는 항원 결합 분자를 고정화한 칩으로 항원을 애널라이트로서 흘림으로써 가용형 항원으로의 결합 활성을 평가하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는 항원을 고정화한 칩으로 항원 결합 분자를 애널라이트로서 흘림으로써 막형 항원으로의 결합 활성을 평가하는 것이 가능하다.

본 발명의 항원 결합 분자에 있어서, 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 약한 한, 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역의 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 항원에 대한 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 KD(Dissociation constant：해리상수)와 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 KD의 비인 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 10 이상이며, 더욱 바람직하게는 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 40 이상이다. KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한 400, 1000, 10000 등 어떠한 값이어도 된다.

항원에 대한 결합 활성의 값으로서 항원이 가용형 항원인 경우는 KD(해리상수)를 사용하는 것이 가능하나, 항원이 막형 항원인 경우는 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수)를 사용하는 것이 가능하다. KD(해리상수) 및 겉보기 KD(겉보기 해리상수)는 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 스캐차드 플롯, 플로우 사이토미터 등을 사용하는 것이 가능하다.

또한 본 발명의 항원 결합 분자의 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비를 나타내는 다른 지표로서, 예를 들면 해리속도상수인 kd(Dissociation rate constant：해리속도상수)도 또한 적합하게 사용될 수 있다. 결합 활성의 비를 나타내는 지표로서 KD(해리상수) 대신에 kd(해리속도상수)를 사용하는 경우, 항원에 대한 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 kd(해리속도상수)와 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 kd(해리속도상수)의 비인 kd(pH 산성역의 조건에 있어서의)/kd(pH 중성역 조건에 있어서의)의 값은 바람직하게는 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 5 이상이며, 더욱 바람직하게는 10 이상이고, 보다 바람직하게는 30 이상이다. Kd(pH 산성역의 조건에 있어서의)/kd(pH 중성역 조건에 있어서의)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술 상식에 있어서 제작 가능한 한 50, 100, 200 등 어떠한 값이어도 된다

항원 결합 활성의 값으로서 항원이 가용형 항원인 경우는 kd(해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는 겉보기 kd(Apparent dissociation rate constant：겉보기 해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하다. kd(해리속도상수) 및 겉보기 kd(겉보기 해리속도상수)는 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 플로우 사이토미터 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한 본 발명에 있어서 상이한 수소 이온 농도즉 pH에 있어서의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성을 측정할 때는 수소 이온 농도 즉 pH 이외의 조건은 동일하게 하는 것이 바람직하다.

예를 들면 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항체의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.

(a) pH 산성역의 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성을 얻는 공정,

(b) pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성을 얻는 공정,

(c) pH 산성역의 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항체 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.

(a) pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체 또는 그들의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 pH 산성역의 조건에 두는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항체를 단리하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(d)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항체 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.

(a) pH 산성역의 조건에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 선택된 항원 결합 도메인 또는 항체를 pH 중성역의 조건에서 항원에 결합시키는 공정,

(d) 상기 공정(c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 단리하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.

(a) 항원을 고정한 칼럼에 pH 중성역의 조건에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 pH 산성역의 조건에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 용출된 항원 결합 도메인 또는 항체를 단리하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(d)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.

(a) 항원을 고정한 칼럼에 pH 산성역의 조건에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 통과시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 칼럼에 결합하지 않고 용출된 항원 결합 도메인 또는 항체를 회수하는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 회수된 항원 결합 도메인 또는 항체를 pH 중성역의 조건에서 항원에 결합시키는 공정,

(d) 상기 공정(c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 단리하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(d)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.

(a) pH 중성역의 조건에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 취득하는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 취득한 항원 결합 도메인 또는 항체를 pH 산성역의 조건에 두는 공정,

(d) 상기 공정(c)에서 항원 결합 활성이 상기 공정(b)에서 선택한 기준보다 약한 항원 결합 도메인 또는 항체를 단리하는 공정.

또한 상기 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서 본 발명에 의해, 전술한 스크리닝방법에 있어서 (a)~(c) 또는 (a)~(d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가로 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득된 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다. (a)~(c) 또는 (a)~(d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않으나, 통상 10회 이내이다.

본 발명의 스크리닝방법에 있어서, 고수소 이온 농도 조건 또는 저pH 즉 pH 산성역에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 pH가 4.0~6.5 사이인 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 pH로서 pH가 4.5~6.6 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 다른 바람직한 pH로서 pH가 5.0~6.5 사이인 항원 결합 활성, 더욱이 pH가 5.5~6.5 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 pH로서 생체내의 조기 엔도솜 내의 pH를 들 수 있고, 구체적으로는 pH 5.8에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 또한 저수소 이온 농도 조건 또는 고pH 즉 pH 중성역에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 pH가 6.7~10 사이인 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 pH로서 pH가 6.7~9.5 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 다른 바람직한 pH로서 pH가 7.0~9.5 사이인 항원 결합 활성, 더욱이 pH가 7.0~8.0 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 pH로서 생체내의 혈장 중에서의 pH를 들 수 있고, 구체적으로는 pH가 7.4에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다.

항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 당업자에게 공지의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하고, 이온화 칼슘 농도 이외의 조건에 대해서는 당업자가 적당히 결정하는 것이 가능하다. 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 KD(Dissociation constant：해리상수), 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수), 해리속도인 kd(Dissociation rate：해리속도상수) 또는 겉보기 kd(Apparent dissociation：겉보기 해리속도상수) 등으로서 평가하는 것이 가능하다. 이들은 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore (GE healthcare), 스캐차드 플롯, FACS 등을 사용하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정은, 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정과 동일한 의미이다.

저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 한, 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성과 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원 결합 활성의 차는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원 결합 활성의 2배 이상이고, 더욱 바람직하게는 10배 이상이며, 보다 바람직하게는 40배 이상이다.

상기 스크리닝방법에 의해 스크리닝되는 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체는 어떠한 항원 결합 도메인 또는 항체여도 되고, 예를 들면 전술한 항원 결합 도메인 또는 항체를 스크리닝하는 것이 가능하다. 예를 들면 천연의 서열을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항체를 스크리닝해도 되고, 아미노산 서열이 치환된 항원 결합 도메인 또는 항체를 스크리닝해도 된다.

상기 스크리닝방법에 의해 스크리닝되는 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체는 어떻게 조제되어도 되고, 예를 들면 사전에 존재하고 있는 항체, 사전에 존재하고 있는 라이브러리(파지 라이브러리 등), 동물에 대한 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항체 또는 라이브러리, 이들 항체나 라이브러리에 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산 변이를 도입한 항체 또는 라이브러리(측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산의 함유율을 높게 한 라이브러리나 특정 개소에 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산 변이를 도입한 라이브러리 등) 등을 사용하는 것이 가능하다.

동물에 대한 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항원 결합 도메인 또는 항체로부터, 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 도메인 또는 항체를 취득하는 방법으로서, 예를 들면 WO2009/125825에서 기재되는 바와 같은 항원 결합 도메인 또는 항체 중의 아미노산의 적어도 하나가 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산 변이로 치환되어 있거나 또는 항원 결합 도메인 또는 항체 중에 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산이 삽입되어 있는 항원 결합 분자 또는 항체를 바람직하게 들 수 있다.

측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이가 도입되는 위치는 특별히 한정되지 않고, 치환 또는 삽입 전과 비교하여 pH 산성역에 있어서의 항원 결합 활성이 pH 중성역에 있어서의 항원 결합 활성보다 약해지는(KD(pH 산성역)/KD(pH 중성역)의 값이 커지거나 또는 kd(pH 산성역)/kd(pH 중성역)의 값이 커지는) 한 어떠한 부위여도 된다. 예를 들면 항원 결합 분자가 항체인 경우에는 항체의 가변영역이나 CDR 등을 바람직하게 들 수 있다. 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로 치환되는 아미노산의 수 또는 삽입되는 아미노산의 수는 당업자가 적당히 결정할 수 있고, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 하나의 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산에 의해 치환될 수 있으며, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 하나의 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산이 삽입될 수 있고, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 2개 이상의 복수의 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산에 의해 치환될 수 있으며, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 2개 이상의 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산이 삽입될 수 있다. 또한 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 치환 또는 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 삽입 이외에, 다른 아미노산의 결실, 부가, 삽입 및/또는 치환 등이 동시에 행해질 수 있다. 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 치환 또는 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 삽입은 당업자 공지의 알라닌 scanning의 알라닌을 히스티딘 등으로 치환한 히스티딘 등 scanning 등의 방법에 의해 랜덤으로 행해질 수 있고, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 치환 또는 삽입의 변이가 랜덤으로 도입된 항원 결합 도메인 또는 항체 중으로부터, 변이 전과 비교하여 KD(pH 산성역)/KD(pH 중성역) 또는 kd(pH 산성역)/kd(pH 중성역)의 값이 커진 항원 결합 분자가 선택될 수 있다.

상기와 같이 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 변이가 행해지고, 또한 pH 산성역에서의 항원 결합 활성이 pH 중성역에서의 항원 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 바람직한 예로서, 예를 들면 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 변이 후의 pH 중성역에서의 항원 결합 활성이, 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 변이 전의 pH 중성역에서의 항원 결합 활성과 동등한 항원 결합 분자를 바람직하게 들 수 있다. 본 발명에 있어서 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 후의 항원 결합 분자가, 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 전의 항원 결합 분자와 동등한 항원 결합 활성을 갖는다는 것은, 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 전의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 100%로 한 경우에, 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 후의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성이 적어도 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상인 것을 말한다. 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 후의 pH 7.4에서의 항원 결합 활성이 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 전의 pH 7.4에서의 항원 결합 활성보다 높아져도 된다. 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 치환 또는 삽입에 의해 항원 결합 분자의 항원 결합 활성이 낮아진 경우에는 항원 결합 분자 중의 1 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등에 의해, 항원 결합 활성이 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 치환 또는 삽입 전의 항원 결합 활성과 동등하게 될 수 있다. 본 발명에 있어서는 그러한 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 치환 또는 삽입 후에 1 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 행함으로써 결합 활성이 동등해진 항원 결합 분자도 포함된다.

또한 항원 결합 분자가 항체 정상영역을 포함하는 물질인 경우, pH 산성역에서의 항원 결합 활성이 pH 중성역에서의 항원 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 바람직한 다른 태양으로서, 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역이 개변된 방법을 들 수 있다. 개변 후의 항체 정상영역의 구체예로서는 예를 들면 서열번호：11, 12, 13, 또는 14에 기재된 정상영역을 바람직하게 들 수 있다.

수소 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성을 변화시키는 아미노산

상기 스크리닝방법에 의해 스크리닝되는 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체는 어떻게 조제되어도 되고, 예를 들면 이온 농도의 조건이 수소 이온 농도의 조건 또는 pH의 조건인 경우에는 사전에 존재하고 있는 항체, 사전에 존재하고 있는 라이브러리(파지 라이브러리 등), 동물에 대한 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항체 또는 라이브러리, 이들 항체나 라이브러리에 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이를 도입한 항체 또는 라이브러리(측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 함유율을 높게 한 라이브러리나 특정 개소에 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이를 도입한 라이브러리 등) 등을 사용하는 것이 가능하다.

본 발명의 하나의 태양으로서 「수소 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 도입된 경쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킴으로써도, 본 발명의 복수의 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다.

당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 경쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 그 외에도 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 경쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 또한 당해 아미노산 잔기의 비한정의 다른 예로서 경쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기도 또한 예시된다.

상기와 같이 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR1 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 24번 위치, 27번 위치, 28번 위치, 31번 위치, 32번 위치 및/또는 34번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR2 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 50번 위치, 51번 위치, 52번 위치, 53번 위치, 54번 위치, 55번 위치 및/또는 56번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR3 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 89번 위치, 90번 위치, 91번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치 및/또는 95A번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 이들 아미노산 잔기가 수소 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 한 이들 아미노산 잔기가 단독으로 포함될 수 있고, 이들 아미노산이 둘 이상 조합되어 포함될 수 있다.

상기 「수소 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 도입된 경쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시키는 경우라도, 상기와 마찬가지로 플렉시블 잔기가 당해 경쇄 가변영역의 서열에 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 수소 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양에 한정되는 경우는 없다. 즉 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 서열 및/또는 FR 서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 예를 들면 경쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서, 표 3 또는 표 4에 기재된 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 수소 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산 잔기나 플렉시블 잔기 이외의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열로서는, 비한정의 예로서 Vk1(서열번호：5), Vk2(서열번호：6), Vk3(서열번호：7), Vk4(서열번호：8) 등의 생식세포 계열의 서열이 적합하게 사용될 수 있다.

(위치는 Kabat 넘버링을 나타낸다)

(위치는 Kabat 넘버링을 나타낸다)

상기의 수소 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산 잔기로서는 어느 아미노산 잔기도 적합하게 사용될 수 있으나, 그러한 아미노산 잔기로서는 구체적으로 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산을 들 수 있다. 이러한 전자 공여성을 갖는 아미노산으로서는 히스티딘 또는 글루타민산 등의 천연의 아미노산 외에, 히스티딘 아날로그(US2009/0035836) 또는 m-NO2-Tyr(pKa 7.45), 3,5-Br2-Tyr(pKa 7.21) 또는 3,5-I2-Tyr(pKa 7.38) 등의 비천연의 아미노산(Bioorg. Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-2768이 적합하게 예시된다. 또한 당해 아미노산 잔기의 특히 적합한 예로서는 측쇄의 pKa가 6.0-7.0인 아미노산을 들 수 있다. 이러한 전자 공여성을 갖는 아미노산으로서는 히스티딘이 적합하게 예시된다.

항원 결합 도메인의 아미노산 개변을 위해서는 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지의 방법이 적당히 채용될 수 있다. 또한 천연의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환하는 아미노산 개변의방법으로서, 복수의 공지의 방법도 또한 채용될 수 있다(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). 예를 들면 종지 코돈의 하나인 UAG 코돈(앰버 코돈)의 상보적 앰버 서프레서 tRNA에 비천연 아미노산이 결합된 tRNA가 포함되는 무세포 번역계 시스템(Clover Direct(Protein Express)) 등도 적합하게 사용될 수 있다.

조합되는 중쇄 가변영역의 예로서 랜덤화 가변영역 라이브러리를 바람직하게 들 수 있다. 랜덤화 가변영역 라이브러리의 제작방법은 공지의 방법이 적당히 조합된다. 본 발명의 비한정의 일태양에서는 특정 항원으로 면역된 동물, 감염증 환자나 백신 접종하여 혈중 항체가가 상승한 인간, 암 환자, 자기 면역 질환의 림프구 유래의 항체 유전자를 토대로 구축된 면역 라이브러리가 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 적합하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 상기와 마찬가지로 게놈 DNA에 있어서의 V 유전자나 재구축되어 기능적인 V 유전자의 CDR 서열이 적당한 길이의 코돈 세트를 코드하는 서열을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드 세트로 치환된 합성 라이브러리도 또한 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 적합하게 사용될 수 있다. 이 경우, 중쇄의 CDR3의 유전자 서열의 다양성이 관찰되는 것으로부터 CDR3의 서열만을 치환하는 것도 또한 가능하다. 항원 결합 분자의 가변영역에 있어서 아미노산의 다양성을 만들어 내는 기준은, 항원 결합 분자의 표면에 노출된 위치의 아미노산 잔기에 다양성을 부여하는 것이다. 표면에 노출된 위치란 항원 결합 분자의 구조, 구조 어셈블 및/또는 모델화된 구조를 토대로 표면에 노출이 가능 및/또는 항원과의 접촉이 가능하다고 판단되는 위치를 말하나, 일반적으로는 그의 CDR이다. 바람직하게는 표면에 노출된 위치는 InsightII 프로그램(Accelrys)과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 항원 결합 분자의 3차원 모델로부터의 좌표를 사용하여 결정된다. 표면에 노출된 위치는 당 기술분야에서 공지인 알고리즘(예를 들면 Lee 및 Richards(J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400), Connolly(J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558))을 사용하여 결정될 수 있다. 표면에 노출된 위치의 결정은 단백질 모델링에 적합한 소프트웨어 및 항체로부터 얻어지는 3차원 구조 정보를 사용하여 행해질 수 있다. 이러한 목적을 위해 이용할 수 있는 소프트웨어로서 SYBYL 생체 고분자 모듈 소프트웨어(Tripos Associates)를 바람직하게 들 수 있다. 일반적으로 또한 바람직하게는 알고리즘이 유저의 입력 사이즈 파라미터를 필요로 하는 경우, 계산에 있어서 사용되는 프로브의 「사이즈」는 반경 약 1.4 옹스트롬 이하로 설정된다. 또한 퍼스널 컴퓨터용 소프트웨어를 사용한 표면에 노출된 영역 및 구역의 결정법이 Pacios(Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386 및 J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53)에 기재되어 있다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 건강한 정상인의 림프구 유래의 항체 유전자로부터 구축되어 그 레퍼토리에 바이어스를 포함하지 않는 항체 서열인 나이브 서열로 이루어지는 나이브 라이브러리도 또한 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 특히 적합하게 사용될 수 있다(Gejima등(Human Antibodies (2002) 11,121-129) 및 Cardoso등(Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)).

FcRn

면역 글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 Fcγ 수용체와 달리, 인간 FcRn은 구조적으로는 주요 조직 부적합성 복합체(MHC) 클래스Ｉ의 폴리펩티드와 구조적으로 유사하여 클래스Ｉ의 MHC 분자와 22~29%의 서열 동일성을 갖는다(Ghetie등，Immunol. Today (1997) 18 (12), 592-598). FcRn은 가용성 β 또는 경쇄(β2 마이크로글로불린)와 복합체화된 막관통 α 또는 중쇄로 이루어지는 헤테로다이머로서 발현된다. MHC와 같이 FcRn의 α쇄는 3개의 세포외 도메인(α1, α2, α3)으로 이루어지고, 짧은 세포질 도메인은 단백질을 세포 표면에 계류한다. α1 및 α2 도메인이 항체의 Fc영역 중의 FcRn 결합 도메인과 상호작용한다(Raghavan등(Immunity (1994) 1, 303-315).

FcRn은 포유동물의 모성 태반 또는 난황낭에서 발현되고 그것은 모친으로부터 태아로의 IgG의 이동에 관여한다. 이에 더하여 FcRn이 발현하는 설치류 신생아의 소장에서는 FcRn이 섭취된 초유 또는 젖으로부터 모성 IgG의 쇄자연(brush border) 상피를 가로지르는 이동에 관여한다. FcRn은 다수의 종에 걸쳐 다수의 다른 조직 및 각종 내피세포계에 있어서 발현되고 있다. 그것은 인간 성인 혈관내피, 근육혈관계 및 간장 동양 모세혈관(hepatic sinusoidal capillaries)에서도 발현된다. FcRn은 IgG에 결합하여 그것을 혈청에 리사이클함으로써 IgG의 혈장 중 농도를 유지하는 역할을 하고 있는 것으로 생각되고 있다. FcRn의 IgG 분자로의 결합은 통상 엄격하게 pH에 의존적이며, 최적 결합은 7.0 미만의 pH 산성역에 있어서 확인된다.

서열번호：15로 표시된 시그날 서열을 포함하는 폴리펩티드를 전구체로 하는 인간 FcRn은 생체내에서(서열번호：16에 시그날 서열을 포함하는 그의 폴리펩티드가 기재되어 있는) 인간 β2-마이크로글로불린과의 복합체를 형성한다. 뒤에 참고 실시예에서 나타내어지는 바와 같이 β2-마이크로글로불린과 복합체를 형성하고 있는 가용형 인간 FcRn이 통상의 재조합 발현수법을 사용함으로써 제조된다. 이러한 β2-마이크로글로불린과 복합체를 형성하고 있는 가용형 인간 FcRn에 대한 본 발명의 Fc영역의 결합 활성이 평가될 수 있다. 본 발명에 있어서 특별히 기재가 없는 경우는 인간 FcRn은 본 발명의 Fc영역에 결합 가능한 형태인 것을 가리키고, 예로서 인간 FcRn과 인간 β2-마이크로글로불린의 복합체를 들 수 있다.

Fc영역

Fc영역은 항체 중쇄의 정상영역에 유래하는 아미노산 서열을 포함한다. Fc영역은 EU 넘버링으로 표시되는 대략 216의 아미노산에 있어서의 파파인 절단부위의 힌지영역의 N말단으로부터 당해 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 항체의 중쇄 정상영역의 부분이다.

본 발명에 의해 제공되는 Fc영역의 FcRn, 특히 인간 FcRn에 대한 결합 활성은 상기 결합 활성의 항목에서 기술되어 있는 바와 같이 당업자에게 공지의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하고, pH 이외의 조건에 대해서는 당업자가 적당히 결정하는 것이 가능하다. 항원 결합 분자의 항원 결합 활성과 인간 FcRn 결합 활성은 KD(Dissociation constant：해리상수), 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수), 해리속도인 kd(Dissociation rate：해리속도) 또는 겉보기 kd(Apparent dissociation：겉보기 해리속도) 등으로서 평가될 수 있다. 이들은 당업자 공지의 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들면 Biacore (GE healthcare), 스캐차드 플롯, 플로우 사이토미터 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 Fc영역의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 측정할 때의 pH 이외의 조건은 당업자가 적당히 선택하는 것이 가능하고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 WO2009125825에 기재되어 있는 바와 같이 MES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정될 수 있다. 또한 본 발명의 Fc영역의 인간 FcRn에 대한 결합 활성의 측정은 당업자 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE Healthcare) 등을 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명의 Fc영역과 인간 FcRn의 결합 활성의 측정은 Fc영역 또는 Fc영역을 포함하는 본 발명의 항원 결합 분자 또는 인간 FcRn을 고정화한 칩으로 각각 인간 FcRn 또는 Fc영역 또는 Fc영역을 포함하는 본 발명의 항원 결합 분자를 애널라이트로서 흘림으로써 평가될 수 있다.

본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역과 FcRn의 결합 활성을 갖는 조건으로서의 pH 중성역이란 통상 pH 6.7~pH 10.0을 의미한다. pH 중성역이란 바람직하게는 pH 7.0~pH 8.0의 임의의 pH값으로 나타내어지는 범위이고, 바람직하게는 pH 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 및 8.0으로부터 선택되며, 특히 바람직하게는 생체내의 혈장 중(혈중)의 pH에 가까운 pH 7.4이다. pH 7.4에서의 인간 FcRn 결합 도메인과 인간 FcRn의 결합 친화성이 낮기 때문에 그의 결합 친화성을 평가하는 것이 곤란한 경우에는 pH 7.4 대신에 pH 7.0을 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역과 FcRn의 결합 활성을 갖는 조건으로서의 pH 산성역이란 통상 pH 4.0~pH 6.5를 의미한다. 바람직하게는 pH 5.5~pH 6.5를 의미하고, 특히 바람직하게는 생체내의 조기 엔도솜 내의 pH에 가까운 pH 5.8~pH 6.0을 의미한다. 측정 조건에 사용되는 온도로서, 인간 FcRn 결합 도메인과 인간 FcRn의 결합 친화성은 10℃~50℃의 임의의 온도에서 평가해도 된다. 바람직하게는 인간 FcRn 결합 도메인과 인간 FcRn의 결합 친화성을 결정하기 위해 15℃~40℃의 온도가 사용된다. 보다 바람직하게는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35℃ 중 어느 하나와 같은 20℃~35℃에서의 임의의 온도도 마찬가지로, 인간 FcRn 결합 도메인과 인간 FcRn의 결합 친화성을 결정하기 위해 사용된다. 25℃라는 온도는 본 발명의 태양의 비한정의 일례이다.

The Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671에 의하면, 천연형 인간 IgG1의 인간 FcRn 결합 활성은 pH 산성역(pH 6.0)에서 KD 1.7 μM이나, pH 중성역에서는 활성을 거의 검출하지 못하고 있다. 따라서 바람직한 태양에 있어서는 pH 산성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 KD 20 μM 또는 그것보다 강하고, pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 천연형 인간 IgG와 동등하거나 그것보다 강한 항원 결합 분자를 포함하는 pH 산성역 및 pH 중성역에 있어서 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 본 발명의 항원 결합 분자가 스크리닝될 수 있다. 보다 바람직한 태양에 있어서는 pH 산성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 KD 2.0 μM 또는 그것보다 강하고, pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 KD 40 μM 또는 그것보다 강한 항원 결합 분자를 포함하는 본 발명의 항원 결합 분자가 스크리닝될 수 있다. 더욱이 보다 바람직한 태양에 있어서는 pH 산성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 KD 0.5 μM 또는 그것보다 강하고, pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 KD 15 μM 또는 그것보다 강한 항원 결합 분자를 포함하는 본 발명의 항원 결합 분자가 스크리닝될 수 있다. 상기 KD값은 The Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671에 기재된 방법(항원 결합 분자를 칩에 고정하고 애널라이트로서 인간 FcRn을 흘림)으로 결정된다.

본 발명에 있어서는 pH 산성역 및 pH 중성역에 있어서 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 Fc영역이 바람직하다. 당해 도메인은 사전에 pH 산성역 및 pH 중성역에 있어서 인간 FcRn 결합 활성을 가지고 있는 Fc영역이라면 그대로 사용될 수 있다. 당해 도메인이 pH 산성역 및/또는 pH 중성역에 있어서 인간 FcRn 결합 활성이 없거나 또는 약한 경우에는 항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변함으로써 목적하는 안간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역이 취득될 수 있으나, 인간 Fc영역 중의 아미노산을 개변함으로써 pH 산성역 및/또는 pH 중성역에 있어서의 목적하는 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역도 적합하게 취득될 수 있다. 또한 사전에 pH 산성역 및/또는 pH 중성역에 있어서 인간 FcRn 결합 활성을 가지고 있는 Fc영역 중의 아미노산의 개변에 의해 목적하는 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역도 취득될 수 있다. 그러한 목적하는 결합 활성을 초래하는 인간 Fc영역의 아미노산 개변은 아미노산 개변 전과 개변 후의 pH 산성역 및/또는 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 비교함으로써 발견될 수 있다. 공지의 수법을 사용하여 당업자는 적당히 아미노산의 개변을 실시할 수 있다.

본 발명에 있어서 Fc영역의 「아미노산의 개변」 또는 「아미노산 개변」이란 출발 Fc영역의 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열로 개변하는 것을 포함한다. 출발 Fc영역의 수식 개변체가 pH 산성역에 있어서 인간 FcRn에 결합할 수 있는 한(따라서 출발 Fc영역은 pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 반드시 필요로 하는 것은 아니다) 어느 Fc영역도 출발 도메인으로서 사용될 수 있다. 출발 Fc영역의 예로서는 IgG 항체의 Fc영역, 즉 천연형의 Fc영역을 바람직하게 들 수 있다. 또한 이미 개변이 가해진 Fc영역을 출발 Fc영역으로서 추가적인 개변이 가해진 개변 Fc영역도 본 발명의 개변 Fc영역으로서 적합하게 사용될 수 있다. 출발 Fc영역이란 폴리펩티드 그 자체, 출발 Fc영역을 포함하는 조성물, 또는 출발 Fc영역을 코드하는 아미노산 서열을 의미할 수 있다. 출발 Fc영역에는 항체의 항목에서 개략 설명된 재조합에 의해 생산된 공지의 IgG 항체의 Fc영역이 포함될 수 있다. 출발 Fc영역의 기원은 한정되지 않지만 비인간 동물의 임의의 생물 또는 인간으로부터 취득될 수 있다. 바람직하게는 임의의 생물로서는 마우스, 랫트, 기니피그, 햄스터, 황무지쥐, 고양이, 토끼, 개, 염소, 양, 소, 말, 낙타 및 비인간 영장류로부터 선택되는 생물을 바람직하게 들 수 있다. 다른 태양에 있어서 출발 Fc영역은 또한 게잡이원숭이, 마모셋, 빨간털원숭이, 침팬지 또는 인간으로부터 취득될 수 있다. 바람직하게는 출발 Fc영역은 인간 IgG1으로부터 취득될 수 있지만, IgG의 특정 서브클래스에 한정되는 것도 아니다. 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc영역을 출발 Fc영역으로서 적당히 사용할 수 있는 것을 의미한다. 마찬가지로, 본 명세서에 있어서 상기 임의의 생물로부터의 IgG의 임의의 클래스 또는 서브클래스의 Fc영역을, 바람직하게는 출발 Fc영역으로서 사용할 수 있는 것을 의미한다. 천연에 존재하는 IgG의 변이체 또는 조작된 유형의 예는 공지의 문헌(Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91, Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470, Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202, WO2009/086320, WO2008/092117, WO2007/041635 및 WO2006/105338)에 기재되지만 그들에 한정되지 않는다.

개변의 예로서는 하나 이상의 변이, 예를 들면, 출발 Fc영역의 아미노산과는 상이한 아미노산 잔기로 치환된 변이, 또는 출발 Fc영역의 아미노산에 대해 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 출발 Fc영역의 아미노산으로부터 하나 이상의 아미노산의 결실 등이 포함된다. 바람직하게는 개변 후의 Fc영역의 아미노산 서열에는 천연으로 생기지 않는 Fc영역의 적어도 부분을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 그러한 변종은 필연적으로 출발 Fc영역과 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 바람직한 실시형태에 있어서, 변종은 출발 Fc영역의 아미노산 서열과 약 75%~100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성, 보다 바람직하게는 약 80%~100% 미만, 보다 바람직하게는 약 85%~100% 미만의, 보다 바람직하게는 약 90%~100% 미만, 가장 바람직하게는 약 95%~100% 미만의 동일성 또는 유사성의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 비한정의 일태양에 있어서 출발 Fc영역 및 본 발명의 개변된 Fc영역 사이에는 하나 이상의 아미노산의 차가 있다. 출발 Fc영역과 개변 Fc영역의 아미노산의 차이는 특히 전술한 EU 넘버링으로 대표되는 아미노산 잔기의 위치의 특정된 아미노산의 차이에 따라서도 적합하게 특정 가능하다.

Fc영역의 아미노산의 개변을 위해서는 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지의 방법이 적당히 채용될 수 있다. 또한 천연의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환하는 아미노산의 개변방법으로서 복수의 공지의 방법도 채용될 수 있다(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). 예를 들면 종지 코돈의 하나인 UAG 코돈(앰버 코돈)의 상보적 앰버 서프레서 tRNA에 비천연 아미노산이 결합된 tRNA가 포함되는 무세포 번역계 시스템(Clover Direct(Protein Express)) 등도 적합하게 사용된다.

본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역은 어떠한 방법으로도 취득될 수 있으나, 구체적으로는 출발 Fc영역으로서 사용되는 인간 IgG형 면역 글로불린의 아미노산의 개변에 의해 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역이 취득될 수 있다. 개변을 위한 바람직한 IgG형 면역 글로불린의 Fc영역으로서는 예를 들면 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 및 그들의 개변체)의 Fc영역을 들 수 있다. 다른 아미노산으로의 개변은 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖거나 또는 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 높일 수 있는 한, 어떠한 위치의 아미노산도 개변될 수 있다. 항원 결합 분자가 인간 Fc영역으로서 인간 IgG1의 Fc영역을 포함하고 있는 경우, pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합이 인간 IgG1의 출발 Fc영역의 결합 활성보다 증강되는 효과를 초래하는 개변이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 그러한 개변이 가능한 아미노산으로서, 예를 들면 EU 넘버링 221번 위치~225번 위치, 227번 위치, 228번 위치, 230번 위치, 232번 위치, 233번 위치~241번 위치, 243번 위치~252번 위치, 254번 위치~260번 위치, 262번 위치~272번 위치, 274번 위치, 276번 위치, 278번 위치~289번 위치, 291번 위치~312번 위치, 315번 위치~320번 위치, 324번 위치, 325번 위치, 327번 위치~339번 위치, 341번 위치, 343번 위치, 345번 위치, 360번 위치, 362번 위치, 370번 위치, 375번 위치~378번 위치, 380번 위치, 382번 위치, 385번 위치~387번 위치, 389번 위치, 396번 위치, 414번 위치, 416번 위치, 423번 위치, 424번 위치, 426번 위치~438번 위치, 440번 위치 및 442번 위치의 아미노산을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 예를 들면 표 5에 기재된 바와 같은 아미노산의 개변을 들 수 있다. 이들 아미노산의 개변에 의해 IgG형 면역 글로불린의 Fc영역의 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합이 증강된다.

본 발명에 사용하기 위해 이들 개변 중 pH 중성역에 있어서도 인간 FcRn에 대한 결합을 증강시키는 개변이 적당히 선택된다. 특히 바람직한 Fc영역 개변체의 아미노산으로서, 예를 들면 EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치, 248번 위치, 250번 위치, 252번 위치, 254번 위치, 255번 위치, 256번 위치, 257번 위치, 258번 위치, 265번 위치, 286번 위치, 289번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 303번 위치, 305번 위치, 307번 위치, 308번 위치, 309번 위치, 311번 위치, 312번 위치, 314번 위치, 315번 위치, 317번 위치, 332번 위치, 334번 위치, 360번 위치, 376번 위치, 380번 위치, 382번 위치, 384번 위치, 385번 위치, 386번 위치, 387번 위치, 389번 위치, 424번 위치, 428번 위치, 433번 위치, 434번 위치 및 436번 위치의 아미노산을 들 수 있다. 이들 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써, 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역의 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 증강시킬 수 있다.

특히 바람직한 특히 바람직한 개변으로서는 예를 들면 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는

237번 위치의 아미노산이 Met,

248번 위치의 아미노산이 Ile,

250번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

252번 위치의 아미노산이 Phe, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

254번 위치의 아미노산이 Thr,

255번 위치의 아미노산이 Glu,

256번 위치의 아미노산이 Asp, Asn, Glu 또는 Gln 중 어느 하나,

257번 위치의 아미노산이 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr 또는 Val 중 어느 하나,

258번 위치의 아미노산이 His,

265번 위치의 아미노산이 Ala,

286번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Glu 중 어느 하나,

289번 위치의 아미노산이 His,

297번 위치의 아미노산이 Ala,

303번 위치의 아미노산이 Ala,

305번 위치의 아미노산이 Ala,

307번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

308번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln 또는 Thr 중 어느 하나,

309번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Pro 또는 Arg 중 어느 하나,

311번 위치의 아미노산이 Ala, His 또는 Ile 중 어느 하나,

312번 위치의 아미노산이 Ala 또는 His 중 어느 하나,

314번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Arg 중 어느 하나,

315번 위치의 아미노산이 Ala, Asp 또는 His 중 어느 하나,

317번 위치의 아미노산이 Ala,

332번 위치의 아미노산이 Val,

334번 위치의 아미노산이 Leu,

360번 위치의 아미노산이 His,

376번 위치의 아미노산이 Ala,

380번 위치의 아미노산이 Ala,

382번 위치의 아미노산이 Ala,

384번 위치의 아미노산이 Ala,

385번 위치의 아미노산이 Asp 또는 His 중 어느 하나,

386번 위치의 아미노산이 Pro,

387번 위치의 아미노산이 Glu,

389번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Ser 중 어느 하나,

424번 위치의 아미노산이 Ala,

428번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

433번 위치의 아미노산이 Lys,

434번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, His, Ser, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나 및

436번 위치의 아미노산이 His, Ile, Leu, Phe, Thr 또는 Val

을 들 수 있다. 또한 개변되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않고, 1개소만의 아미노산이 개변될 수 있고, 2개소 이상의 아미노산이 개변될 수 있다. 2개소 이상의 아미노산 개변의 조합으로서는 예를 들면 표 6에 기재되는 바와 같은 조합을 들 수 있다.

항원 결합 분자

본 발명에 있어서 항원 결합 분자는 항원 결합 도메인 및 Fc영역을 포함하는 분자를 나타내는 가장 광의의 의미로서 사용되고 있고, 구체적으로는 그들이 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 한, 다양한 분자형이 포함된다. 예를 들면 항원 결합 도메인이 Fc영역과 결합한 분자의 예로서 항체를 들 수 있다. 항체에는 단일클론항체(아고니스트 및 안타고니스트 항체를 포함), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 등이 포함될 수 있다. 또한 항체의 단편으로서 사용되는 경우로서는 항원 결합 도메인 및 항원 결합 단편(예를 들면 Fab, F(ab')2, scFv 및 Fv)를 바람직하게 들 수 있다. 기존의 안정한 α/β 배럴 단백질 구조 등의 입체구조가 scaffold(토대)로서 사용되고, 그 일부분의 구조만이 항원 결합 도메인의 구축을 위해 라이브러리화된 스캐폴드 분자도 본 발명의 항원 결합 분자에 포함될 수 있다.

본 발명의 항원 결합 분자는 FcRn에 대한 결합 및 Fcγ 수용체에 대한 결합을 매개하는 Fc영역의 적어도 부분을 포함할 수 있다. 예를 들면 비한정의 일태양에 있어서 항원 결합 분자는 항체 또는 Fc 융합 단백질일 수 있다. 융합 단백질이란 천연으로는 그것이 자연히 연결되지 않는 제2 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 연결된 제1 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면 융합 단백질은 Fc영역의 적어도 부분(예를 들면 FcRn에 대한 결합을 부여하는 Fc영역의 부분이나 Fcγ 수용체에 대한 결합을 부여하는 Fc영역의 부분)을 코드하는 아미노산 서열 및 예를 들면 수용체의 리간드 결합 도메인 또는 리간드의 수용체 결합 도메인을 코드하는 아미노산 서열을 포함하는 비면역 글로불린 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 함께 융합 단백질에 운반되는 각각의 단백질에 존재할 수 있거나 또는 그들은 통상은 동일 단백질에 존재할 수 있으나, 융합 폴리펩티드 중의 새로운 재편성에 넣어진다. 융합 단백질은 예를 들면 화학 합성에 의해 또는 펩티드영역이 목적하는 관계로 코드된 폴리뉴클레오티드를 제작하고, 그것을 발현하는 유전자 재조합의 수법에 의해 제작될 수 있다.

본 발명의 각 도메인은 폴리펩티드 결합에 의해 직접 연결될 수 있고 링커를 매개로 연결될 수 있다. 링커로서는 유전자 공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커 또는 합성 화합물 링커(예를 들면 Protein Engineering (1996) 9 (3), 299-305)에 개시되는 링커 등이 사용될 수 있으나 본 발명에 있어서는 펩티드 링커가 바람직하다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고 목적에 따라 당업자가 적당히 선택하는 것이 가능하나, 바람직한 길이는 5 아미노산 이상(상한은 특별히 한정되지 않으나 통상 30 아미노산 이하, 바람직하게는 20 아미노산 이하)이고, 특히 바람직하게는 15 아미노산이다.

예를 들면 펩티드 링커의 경우：

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：17)

Ser·Gly·Gly·Gly(서열번호：18)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：19)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：20)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：21)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：22)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：23)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：24)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：19))n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：20))n

［n은 1 이상의 정수이다］등을 바람직하게 들 수 있다. 단, 펩티드 링커의 길이나 서열은 목적에 따라 당업자가 적당히 선택할 수 있다.

합성 화합물 링커(화학 가교제)는 펩티드의 가교에 통상 사용되고 있는 가교제, 예를 들면 N-히드록시숙신이미드(NHS), 디숙신이미딜수베레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)수베레이트(BS3), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(DSP), 디티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 에틸렌글리콜비스(설포숙신이미딜숙시네이트)(설포-EGS), 디숙신이미딜 타르타르산염(DST), 디설포숙신이미딜 타르타르산염(설포-DST), 비스［2-(숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸］설폰(BSOCOES), 비스［2-(설포숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸］설폰(설포-BSOCOES) 등이고, 이들 가교제는 시판되고 있다.

각 도메인을 연결하는 링커가 복수 사용되는 경우에는 모두 동종의 링커가 사용될 수 있고, 이종의 링커도 사용될 수 있다.

또한 상기 기재에서 예시되는 링커 외에, 예를 들면 His 태그, HA 태그, myc 태그, FLAG 태그 등의 펩티드 태그를 갖는 링커도 적당히 사용될 수 있다. 또한 수소 결합, 디설피드 결합, 공유 결합, 이온성 상호작용 또는 이들 결합의 조합에 의해 서로 결합하는 성질도 또한 적합하게 이용될 수 있다. 예를 들면 항체의 CH1과 CL 간의 친화성이 이용되거나, 헤테로 Fc영역의 회합시에 전술한 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc영역이 사용되거나 한다. 또한 도메인 간에 형성되는 디설피드 결합도 또한 적합하게 이용될 수 있다.

각 도메인을 펩티드 결합으로 연결하기 위해 당해 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 인프레임으로 연결된다. 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 연결하는 방법으로서는 제한 단편의 라이게이션이나 퓨젼 PCR, 오버랩 PCR 등의 수법이 공지이며, 본 발명의 항원 결합 분자의 제작에도 적당히 이들 방법이 단독 또는 조합으로 사용될 수 있다. 본 발명에서는 용어 「연결되고」, 「융합되고」, 「연결」 또는 「융합」은 상호 교환적으로 사용된다. 이들 용어는 상기 화학 결합 수단 또는 재조합 수법을 포함한 모든 수단에 의해 둘 이상의 폴리펩티드 등의 엘리먼트 또는 성분을 하나의 구조를 형성하도록 연결하는 것을 말한다. 인프레임으로 융합한다는 것은, 둘 이상의 엘리먼트 또는 성분이 폴리펩티드인 경우에, 당해 폴리펩티드의 바른 리딩 프레임을 유지하도록 연속한 보다 긴 리딩 프레임을 형성하기 위한 둘 이상의 리딩 프레임의 단위의 연결을 말한다. 2분자의 Fab가 항원 결합 도메인로서 사용된 경우, 당해 항원 결합 도메인과 Fc영역이 링커를 매개로 하지 않고 펩티드 결합에 의해 인프레임으로 연결된 본 발명의 항원 결합 분자인 항체는 본 출원의 적합한 항원 결합 분자로서 사용될 수 있다.

Fcγ 수용체

Fcγ 수용체(FcγR으로도 기재된다)란 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론항체의 Fc영역에 결합 가능한 수용체를 말하고, 실질적으로 Fcγ 수용체 유전자에 코드되는 단백질의 패밀리의 모든 멤버를 의미한다. 인간의 경우는 이 패밀리에는 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64)；아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32)；및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함)를 포함하는 FcγRIII(CD16) 및 어떠한 미발견의 인간 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되나, 이들에 한정되는 것은 아니다. FcγR은 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이를 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 어떠한 생물 유래여도 된다. 마우스 FcγR류에는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(FcγRIV, CD16-2) 및 어떠한 미발견의 마우스 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 Fcγ 수용체의 적합한 예로서는 인간 FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), FcγRIIb(CD32), FcγRIIIa(CD16) 및/또는 FcγRIIIb(CD16)를 들 수 있다. 인간 FcγRI의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：25(NM_000566.3) 및 26(NP_000557.1)에 인간 FcγRIIa(알로타입 H131)의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：27(BC020823.1) 및 28(AAH20823.1)에 (알로타입 R131은 서열번호：28의 166번째의 아미노산이 Arg로 치환되어 있는 서열이다), FcγRIIb의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：29(BC146678.1) 및 30(AAI46679.1)에 FcγRIIIa의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：31(BC033678.1) 및 32(AAH33678.1)에 및 FcγRIIIb의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：33(BC128562.1) 및 34(AAI28563.1)에 기재되어 있다(괄호 안은 RefSeq 등록번호를 나타낸다). 예를 들면 참고 실시예 27 등에서 알로타입 V158이 사용되고 있는 경우에 FcγRIIIaV로 표기되어 있는 것과 같이, 특기되지 않는 한 알로타입 F158이 사용되고 있는데, 본 출원에서 기재되는 아이소폼 FcγRIIIa의 알로타입이 특별히 한정하여 해석되는 것은 아니다. Fcγ 수용체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론항체의 Fc영역에 결합 활성을 갖는지 여부는 상기에 기재되는 FACS나 ELISA 포맷 외에, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR)현상을 이용한 BIACORE법 등에 의해 확인될 수 있다(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010).

또한 「Fc 리간드」 또는 「이펙터 리간드」는 항체의 Fc영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는, 임의의 생물에 유래하는 분자, 바람직하게는 폴리펩티드를 의미한다. Fc 리간드의 Fc로의 결합은 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 이펙터 기능을 야기한다. Fc 리간드에는 Fc 수용체, FcγR, FcαR, FcεR, FcRn, C1q, C3, 만난 결합 렉틴, 만노오스 수용체, 스타필로코커스의 프로테인 A, 스타필로코커스의 단백질 G 및 바이러스의 FcγR이 포함되나, 이들에 한정되지 않는다. Fc 리간드에는 FcγR에 상동인 Fc 수용체의 패밀리인 Fc 수용체 상동체(FcRH)(Davis et al.,(2002)Immunological Reviews 190, 123-136)도 포함된다. Fc 리간드에는 Fc에 결합하는 미발견의 분자도 포함될 수 있다.

FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64) 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함)를 포함하는 FcγRIII(CD16)는 IgG의 Fc 부분과 결합하는 α쇄와 세포내에 활성화 시그날을 전달하는 ITAM을 갖는 공통 γ쇄가 회합한다. 한편 아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32) 자신의 세포질 도메인에는 ITAM이 포함되어 있다. 이들 수용체는 마크로파지나 마스트 세포, 항원 제시 세포 등의 많은 면역세포에 발현하고 있다. 이들 수용체가 IgG의 Fc 부분에 결합함으로써 전달되는 활성화 시그날에 의해, 마크로파지의 탐식능이나 염증성 사이토카인의 생산, 마스트 세포의 탈과립, 항원 제시 세포의 기능 항진이 촉진된다. 상기와 같이 활성화 시그날을 전달하는 능력을 갖는 Fcγ 수용체는 본 발명에 있어서도 활성형 Fcγ 수용체라 불린다.

한편 FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함) 자신의 세포질내 도메인에는 억제형 시그날을 전달하는 ITIM이 포함되어 있다. B세포에서는 FcγRIIb와 B세포 수용체(BCR)의 가교에 의해 BCR으로부터의 활성화 시그날이 억제되는 결과 BCR의 항체 생산이 억제된다. 마크로파지에서는 FcγRIII와 FcγRIIb의 가교에 의해 탐식능이나 염증성 사이토카인의 생산능이 억제된다. 상기와 같이 억제화 시그날을 전달하는 능력을 갖는 Fcγ 수용체는 본 발명에 있어서도 억제형 Fcγ 수용체라 불린다.

ALPHA 스크린은 도너와 액셉터의 2개의 비드를 사용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해 하기의 원리를 토대로 실시된다. 도너 비드에 결합한 분자가 액셉터 비드에 결합한 분자와 생물학적으로 상호작용하여 2개의 비드가 근접한 상태일 때만 발광 시그날이 검출된다. 레이저에 의해 여기된 도너 비드 내의 감광제는 주변의 산소를 여기상태의 일중항산소로 변환한다. 일중항산소는 도너 비드 주변에 확산되어 근접해 있는 액셉터 비드에 도달하면 비드 내의 화학 발광반응을 일으켜 최종적으로 빛이 방출된다. 도너 비드에 결합한 분자와 액셉터 비드에 결합한 분자가 상호작용하지 않을 때는 도너 비드가 생산하는 일중항산소가 액셉터 비드에 도달하지 않기 때문에 화학 발광반응은 일어나지 않는다.

예를 들면 도너 비드에 비오틴 표지된 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 결합되고, 액셉터 비드에는 글루타티온 S 트랜스페라아제(GST)로 태그화된 Fcγ 수용체가 결합된다. 경합하는 Fc영역 개변체를 포함하는 항원 결합 분자의 비존재하에서는 야생형 Fc영역을 갖는 폴리펩티드 회합체와 Fcγ 수용체는 상호작용하여 520-620 nm의 시그날을 발생시킨다. 태그화되어 있지 않은 Fc영역 개변체를 포함하는 항원 결합 분자는 천연형 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체 간의 상호작용과 경합한다. 경합 결과 나타나는 형광의 감소를 정량함으로써 상대적인 결합 친화성이 결정될 수 있다. 항체 등의 항원 결합 분자를 Sulfo-NHS-비오틴 등을 사용하여 비오틴화하는 것은 공지이다. Fcγ 수용체를 GST로 태그화하는 방법으로서는 Fcγ 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 융합한 융합 유전자가 작용 가능하게 연결된 벡터에 보유된 세포 등에 있어서 발현하고, 글루타티온 칼럼을 사용하여 정제하는 방법 등이 적당히 채용될 수 있다. 얻어진 시그날은 예를 들면 GRAPHPAD PRISM(GraphPad사, San Diego) 등의 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀해석을 이용하는 일부위 경합(one-site competition) 모델에 적합시킴으로써 적합하게 해석된다.

상호작용을 관찰하는 물질의 한쪽(리간드)을 센서칩의 금박막 상에 고정하고, 센서칩의 안쪽으로부터 금박막과 유리의 경계면에서 전반사되도록 빛을 조사하면, 반사광의 일부에 반사강도가 저하된 부분(SPR 시그날)이 형성된다. 상호작용을 관찰하는 물질의 다른 쪽(애널라이트)을 센서칩의 표면에 흘려 리간드와 애널라이트가 결합하면, 고정화되어 있는 리간드 분자의 질량이 증가하여 센서칩 표면의 용매의 굴절률이 변화된다. 이 굴절률의 변화에 의해 SPR 시그날의 위치가 시프트된다(반대로 결합이 해리되면 시그날의 위치는 되돌아간다). Biacore 시스템은 상기 시프트되는 양, 즉 센서칩 표면에서의 질량 변화를 세로축에 취하고, 질량의 시간 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램의 커브로부터 키네틱스：결합속도상수(ka)와 해리속도상수(kd)가, 당해 상수의 비로부터 친화성(KD)이 구해진다. BIACORE법에서는 저해 측정법도 적합하게 사용된다. 저해 측정법의 예는 Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010에 있어서 기재되어 있다.

2분자의 FcRn 및 1분자의 활성형 Fcγ 수용체의 4자를 포함하는 헤테로 복합체

FcRn과 IgG 항체의 결정학적 연구에 의해 FcRn-IgG 복합체는 2분자의 FcRn에 대해 1분자의 IgG로부터 구성되고, IgG의 Fc영역의 양쪽에 위치하는 CH2 및 CH3 도메인의 접촉면 부근에 있어서 2분자의 결합이 일어날 것으로 생각되고 있다(Burmeister등(Nature (1994) 372, 336-343). 한편 후술하는 실시예 3에 있어서 확인된 바와 같이, 항체의 Fc영역이 2분자의 FcRn 및 1분자의 활성형 Fcγ 수용체의 4자를 포함하는 복합체를 형성할 수 있는 것이 명확해졌다(도 48). 이 헤테로 복합체의 형성은 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 성질에 대해서 해석을 진행한 결과 명확해진 현상이다.

본 발명은 특정 원리에 구속되는 것은 아니나, 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역과 2분자의 FcRn 및 1분자의 활성형 Fcγ 수용체의 4자를 포함하는 헤테로 복합체의 형성에 의해, 항원 결합 분자가 생체내에 투여되었을 때의 항원 결합 분자의 당해 생체내에 있어서의 약물동태(혈장 중 체류성) 및 투여된 항원 결합 분자에 대한 면역응답(면역원성)에 대해 아래와 같은 영향이 초래되는 것도 생각된다. 전술한 바와 같이, 면역세포 상에는 각종 활성형 Fcγ 수용체에 더하여 FcRn이 발현되고 있어, 항원 결합 분자가 면역세포 상에서 이러한 4자 복합체를 형성하는 것은 면역세포에 대한 친화성을 향상시키고, 또한 세포내 도메인을 회합화시킴으로써 내재화 시그날을 증강시켜, 면역세포로의 흡수가 촉진되는 것이 시사된다. 항원 제시 세포에 있어서도 마찬가지로 항원 제시 세포의 세포막 상에서 4자 복합체를 형성함으로써, 항원 결합 분자가 항원 제시 세포로 흡수되기 쉬워질 가능성이 시사된다. 일반적으로 항원 제시 세포에 흡수된 항원 결합 분자는 항원 제시 세포내의 리소좀에 있어서 분해되어 T세포로 제시된다. 결과로서 항원 제시 세포의 세포막 상에서 상기 4자 복합체를 형성함으로써, 항원 결합 분자에 대한 항원 제시 세포로의 흡수가 촉진됨으로써 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성이 악화될 가능성도 있다. 또한 마찬가지로 면역응답이 야기될(점차 악화될) 가능성이 있다.

그 때문에 이러한 4자 복합체를 형성하는 능력이 저하된 항원 결합 분자가 생체에 투여된 경우, 당해 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성이 향상되고, 당해 생체에 의한 면역응답의 야기가 억제될 것으로 생각될 수 있다. 이러한 항원 제시 세포를 포함하는 면역세포 상에 있어서의 당해 복합체의 형성을 저해하는 항원 결합 분자의 바람직한 태양으로서, 아래의 3종류를 들 수 있다.

(양태 1) pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자

양태 1의 항원 결합 분자는 2분자의 FcRn에 결합함으로써 3자 복합체를 형성하는데, 활성형 FcγR을 포함한 복합체는 형성하지 않는(도 49) 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은 Fc영역은 상기와 같이 천연형 Fc영역의 아미노산을 개변함으로써 제작될 수 있다. 개변 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은지 여부는 상기 결합 활성의 항목에서 기재된 방법을 사용하여 적당히 실시될 수 있다.

활성형 Fcγ 수용체로서는 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64), FcγRIIa(알로타입 R131 및 H131을 포함) 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함)를 포함하는 FcγRIII(CD16)를 바람직하게 들 수 있다.

본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역과 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 pH의 조건은 pH 산성역 또는 pH 중성역의 조건이 적당히 사용될 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역과 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 조건으로서의 pH 중성역이란 통상 pH 6.7~pH 10.0을 의미한다. 바람직하게는 pH 7.0~pH 8.0의 임의의 pH값에 의해 나타내어지는 범위이고, 바람직하게는 pH 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 및 8.0으로부터 선택되며, 특히 바람직하게는 생체내의 혈장 중(혈중)의 pH에 가까운 pH 7.4이다. 본 발명에 있어서 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역과 Fcγ 수용체의 결합 활성을 갖는 조건으로서의 pH 산성역이란 통상 pH 4.0~pH 6.5를 의미한다. 바람직하게는 pH 5.5~pH 6.5를 의미하고, 특히 바람직하게는 생체내의 조기 엔도솜 내의 pH에 가까운 pH 5.8~pH 6.0을 의미한다. 측정조건에 사용되는 온도로서 Fc영역과 인간 Fcγ 수용체의 결합 친화성은 10℃~50℃의 임의의 온도에서 평가될 수 있다. 바람직하게는 인간 Fc영역과 Fcγ 수용체의 결합 친화성을 결정하기 위해 15℃~40℃의 온도가 사용된다. 보다 바람직하게는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35℃ 중 어느 하나와 같은 20℃~35℃의 임의의 온도도 마찬가지로, Fc영역과 Fcγ 수용체의 결합 친화성을 결정하기 위해 사용된다. 25℃라는 온도는 본 발명의 태양의 비한정의 일례이다.

본 명세서에 있어서 Fc영역 개변체의 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 낮다는 것은, Fc영역 개변체의 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 이들 인간 Fcγ 수용체에 대한 천연형 Fc영역의 결합 활성보다도 낮은 것을 말한다. 예를 들면 상기 해석방법을 토대로 대조로 하는 천연형 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 결합 활성에 비교하여 Fc영역 개변체를 포함하는 항원 결합 분자의 결합 활성이 95% 이하, 바람직하게는 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 특히 바람직하게는 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다. 천연형 Fc영역으로서는 출발 Fc영역도 사용될 수 있고, 야생형 항체의 상이한 아이소타입의 Fc영역도 사용될 수 있다.

또한 천연형의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이란 인간 IgG1의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성인 것이 바람직하고, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 저감시키는 데는 상기 개변 이외에도 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4에 아이소타입을 변경함으로써도 달성할 수 있다. 또한 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 저하시키는 것은 상기 개변 이외에도 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 대장균 등의 당쇄를 부가하지 않는 숙주에서 발현시킴으로써도 얻을 수 있다.

대조로 하는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자로서는 IgG 단일클론항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자가 적당히 사용될 수 있다. 당해 Fc영역의 구조는 서열번호：1(RefSeq 등록번호 AAC82527.1의 N끝에 A 부가), 2(RefSeq 등록번호 AAB59393.1의 N끝에 A 부가), 3(RefSeq 등록번호 CAA27268.1), 4(RefSeq 등록번호 AAB59394.1의 N끝에 A 부가)에 기재되어 있다. 또한 어떤 특정 아이소타입의 항체의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 피검물질로서 사용한 경우에는, 당해 특정 아이소타입의 IgG 단일클론항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 대조로서 사용함으로써, 당해 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자에 의한 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성의 효과가 검증된다. 상기와 같이 하여 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 높은 것이 검증된 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 적당히 선택된다.

본 발명의 비한정의 일태양에서는 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은 Fc영역의 예로서,

상기 Fc영역의 아미노산 중 EU 넘버링으로 표시되는 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325, 328 및 329 중 어느 하나 이상의 아미노산이 천연형 Fc영역과 상이한 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역을 바람직하게 들 수 있으나, Fc영역의 개변은 상기 개변에 한정되지 않고, 예를 들면 Current Opinion in Biotechnology (2009) 20(6), 685-691에 기재되어 있는 탈당쇄(N297A, N297Q), IgG1-L234A/L235A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A, IgG4-L236E 등의 개변 및 WO 2008/092117에 기재되어 있는 G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R, N325LL328R 등의 개변 및 EU 넘버링 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 237번 위치에 있어서의 아미노산의 삽입, WO 2000/042072에 기재되어 있는 개소의 개변이어도 된다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；

234번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr 또는 Trp 중 어느 하나,

235번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val 또는 Arg 중 어느 하나,

236번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,

237번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr 또는 Arg 중 어느 하나,

238번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp 또는 Arg 중 어느 하나,

239번 위치의 아미노산을 Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr 또는 Arg 중 어느 하나,

265번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,

266번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

267번 위치의 아미노산을 Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

269번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,

270번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,

271번 위치의 아미노산을 Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

295번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

296번 위치의 아미노산을 Arg, Gly, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

297번 위치의 아미노산을 Ala,

298번 위치의 아미노산을 Arg, Gly, Lys, Pro, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

300번 위치의 아미노산을 Arg, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

324번 위치의 아미노산을 Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

325번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,

327번 위치의 아미노산을 Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,

328번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Gly, His, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

329번 위치의 아미노산을 Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val 또는 Arg 중 어느 하나,

330번 위치의 아미노산을 Pro 또는 Ser 중 어느 하나,

331번 위치의 아미노산을 Arg, Gly 또는 Lys 중 어느 하나 또는

332번 위치의 아미노산을 Arg, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

중 어느 하나 이상으로 개변되어 있는 Fc영역을 바람직하게 들 수 있다.

(양태 2) pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 억제형 FcγR에 대한 결합 활성이 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자

양태 2의 항원 결합 분자는 2분자의 FcRn과 1분자의 억제형 FcγR에 결합함으로써 이들 4자를 포함하는 복합체를 형성할 수 있다. 그러나 1분자의 항원 결합 분자는 1분자의 FcγR과만 결합할 수 있기 때문에 1분자의 항원 결합 분자는 억제형 FcγR에 결합한 상태로 다른 활성형 FcγR에 결합하는 것은 불가능하다(도 50). 또한 억제형 FcγR에 결합한 상태로 세포내로 흡수된 항원 결합 분자는 세포막 상으로 리사이클되어 세포내에서의 분해를 회피하는 것이 보고되어 있다(Immunity (2005) 23, 503-514). 즉 억제형 FcγR에 대한 선택적 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자는 면역응답의 원인이 되는 활성형 FcγR 및 2분자의 FcRn을 포함한 헤테로 복합체를 형성할 수 없을 것으로 생각된다.

활성형 Fcγ 수용체로서는 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64), FcγRIIa(알로타입 R131 및 H131을 포함) 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함)를 포함하는 FcγRIII(CD16)를 바람직하게 들 수 있다. 또한 FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함)를 억제형 Fcγ 수용체의 적합한 예로서 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 억제형 FcγR에 대한 결합 활성이 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높다는 것은, Fc영역 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 것을 말한다. 예를 들면 상기 해석방법을 토대로 Fc영역 개변체를 포함하는 항원 결합 분자의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성의 105% 이상, 바람직하게는 110% 이상, 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 특히 바람직하게는 150% 이상, 160% 이상, 170% 이상, 180% 이상, 190% 이상, 200%% 이상, 250% 이상, 300% 이상, 350% 이상, 400% 이상, 450% 이상, 500% 이상, 750% 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다.

FcγRIIb에 대한 결합 활성이 FcγRIa, FcγRIIa(알로타입 R131 및 H131을 포함) 및 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함)보다도 모두 높은 것이 가장 바람직하다. FcγRIa는 천연형 IgG1에 대한 친화성이 매우 높은 것으로부터 생체내에 있어서는 대량의 내인성 IgG1에 의해 결합이 포화되어 있을 것으로 생각되기 때문에, FcγRIIb에 대한 결합 활성은 FcγRIIa 및 FcγRIIIa보다도 높고 FcγRIa보다는 낮아도 당해 복합체의 형성 저해는 가능할 것으로 생각된다.

대조로 하는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자로서는 IgG 단일클론항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자가 적당히 사용될 수 있다. 당해 Fc영역의 구조는 서열번호：11(RefSeq 등록번호 AAC82527.1의 N끝에 A 부가), 12(RefSeq 등록번호 AAB59393.1의 N끝에 A 부가), 13(RefSeq 등록번호 CAA27268.1), 14(RefSeq 등록번호 AAB59394.1의 N끝에 A 부가)에 기재되어 있다. 또한 어떤 특정 아이소타입의 항체의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 피검물질로서 사용하는 경우에는, 당해 특정 아이소타입의 IgG 단일클론항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 대조로서 사용함으로써, 당해 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자에 의한 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성의 효과가 검증된다. 상기와 같이 하여 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 높은 것이 검증된 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 적당히 선택된다.

본 발명의 비한정의 일태양에서는 억제형 FcγR에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는 Fc영역의 예로서, 상기 Fc영역의 아미노산 중 EU 넘버링으로 표시되는 238 또는 328의 아미노산이 천연형 Fc영역과 상이한 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역을 바람직하게 들 수 있다. 또한 억제형 Fcγ 수용체에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는 Fc영역으로서 US 2009/0136485에 기재되어 있는 Fc영역 또는 개변도 적당히 선택할 수 있다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서 EU 넘버링으로 표시되는 238의 아미노산이 Asp, 또는 328의 아미노산이 Glu 중 어느 하나 이상으로 개변되어 있는 Fc영역을 바람직하게 들 수 있다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro의 Asp로의 치환 및 EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Trp, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Phe, EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 아미노산이 Val, EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 아미노산이 Gln, EU 넘버링으로 표시되는 268번 위치의 아미노산이 Asn, EU 넘버링으로 표시되는 271번 위치의 아미노산이 Gly, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Leu, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Gln, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Glu, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Met, EU 넘버링으로 표시되는 239번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 아미노산이 Ala, EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치의 아미노산이 Trp, EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치의 아미노산이 Tyr, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Ala, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Glu, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Leu, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Met, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Tyr, EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 아미노산이 Lys, EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 아미노산이 Arg, EU 넘버링으로 표시되는 233번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 268번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 268번 위치의 아미노산이 Glu, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Ser, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Thr, EU 넘버링으로 표시되는 323번 위치의 아미노산이 Ile, EU 넘버링으로 표시되는 323번 위치의 아미노산이 Leu, EU 넘버링으로 표시되는 323번 위치의 아미노산이 Met, EU 넘버링으로 표시되는 296번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Ala, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Asn, EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 아미노산이 Met 중 어느 하나 이상으로 개변되어 있는 Fc영역을 바람직하게 들 수 있다.

(양태 3) Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 다른 쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합능 활성을 갖지 않는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자

양태 3의 항원 결합 분자는 1분자의 FcRn과 1분자의 FcγR에 결합함으로써 3자 복합체를 형성할 수 있으나, 2분자의 FcRn과 1분자의 FcγR의 4자를 포함하는 헤테로 복합체는 형성하지 않는다(도 51). 본 양태 3의 항원 결합 분자에 포함되는, Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 다른 쪽의 폴리펩티드가 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합능 활성을 갖지 않는 Fc영역으로서, 이중 특이성 항체(bispecific 항체)를 기원으로 하는 Fc영역도 적당히 사용될 수 있다. 이중 특이성 항체란 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 2종류의 항체이다. IgG형의 이중 특이성 항체는 IgG 항체를 생산하는 하이브리도마 2종을 융합함으로써 생성되는 hybrid hybridoma(quadroma)에 의해 분비시키는 것이 가능하다(Milstein등(Nature (1983) 305, 537-540).

상기 양태 3의 항원 결합 분자를 상기 항체의 항목에서 기재된 바와 같은 재조합 수법을 사용하여 제조하는 경우, 목적의 2종의 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 세포에 도입하고 그들을 공발현시키는 방법이 채용될 수 있다. 그러나 제조되는 Fc영역은 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 다른 쪽의 폴리펩티드가 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합능 활성을 갖지 않는 Fc영역과, Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 양쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역과, Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 양쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 Fc영역이, 2：1：1의 분자 수의 비율로 존재하는 혼합물이 된다. 3종류의 IgG로부터 목적의 조합의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 정제하는 것은 곤란하다.

이러한 재조합 수법을 사용하여 양태 3의 항원 결합 분자를 제조할 때, Fc영역을 구성하는 CH3 도메인에 적당한 아미노산 치환의 개변을 가함으로써 헤테로 조합의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 우선적으로 분비될 수 있다. 구체적으로는 한쪽 중쇄의 CH3 도메인에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob(「돌기」의 의미))로 치환하고, 다른 한쪽 중쇄의 CH3 도메인에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole(「공극」의 의미))로 치환함으로써, 돌기가 공극 내에 배치될 수 있도록 하여 이종 H쇄 형성의 촉진 및 동종 H쇄 형성의 저해를 일으키는 방법이다(WO1996027011, Ridgway등(Protein Engineering (1996) 9, 617-621), Merchant등(Nat. Biotech. (1998) 16, 677-681)).

또한 폴리펩티드의 회합 또는 폴리펩티드에 의해 구성되는 이종 다량체 회합의 제어방법을 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 회합에 이용함으로써 이중 특이성 항체를 제작하는 기술도 알려져 있다. 즉 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드 내의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 개변함으로써 동일 서열을 갖는 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드의 회합이 저해되어, 서열이 상이한 2개의 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드 회합체가 형성되도록 제어하는 방법이 이중 특이성 항체의 제작에 채용될 수 있다(WO2006/106905). 이러한 방법도 본 발명의 양태 3의 항원 결합 분자를 제조할 때 채용될 수 있다.

본 발명의 비한정의 일태양에 있어서의 Fc영역으로서는 상기 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드가 적당히 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 349번 위치의 아미노산이 Cys, 366번 위치의 아미노산이 Trp이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 356번 위치의 아미노산이 Cys, 366번 위치의 아미노산이 Ser, 368번 위치의 아미노산이 Ala, 407번 위치의 아미노산이 Val인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다.

그 밖의 본 발명의 비한정의 일태양에 있어서의 Fc영역으로서는 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 409번 위치의 아미노산이 Asp이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 399번 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다. 상기 태양에서는 409번 위치의 아미노산은 Asp 대신에 Glu, 399번 위치의 아미노산은 Lys 대신에 Arg일 수도 있다. 또한 399번 위치의 아미노산인 Lys에 더하여 360번 위치의 아미노산으로서 Asp 또는 392번 위치의 아미노산으로서 Asp도 적합하게 추가될 수 있다.

본 발명의 다른 비한정의 일태양에 있어서의 Fc영역으로서는 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 370번 위치의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 357번 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다.

본 발명의 또 다른 비한정의 일태양에 있어서의 Fc영역으로서는 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 439번 위치의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 356번 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다.

본 발명의 다른 비한정의 일태양에 있어서의 Fc영역으로서는 이들이 조합된 아래의 태양 중 어느 하나；

Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 409번 위치의 아미노산이 Asp, 370번 위치의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 399번 위치의 아미노산이 Lys, 357번 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드(본 태양에서는 EU 넘버링으로 표시되는 370번 위치의 아미노산인 Glu 대신에 Asp여도 되고, EU 넘버링으로 표시되는 370번 위치의 아미노산인 Glu 대신에 392번 위치의 아미노산인 Asp여도 된다.),

Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 409번 위치의 아미노산이 Asp, 439번 위치의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 399번 위치의 아미노산이 Lys, 356번 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드(본 태양에서는 EU 넘버링으로 표시되는 439번 위치의 아미노산인 Glu 대신에 360번 위치의 아미노산인 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 392번 위치의 아미노산인 Asp 또는 439번 위치의 아미노산인 Asp여도 된다),

Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 370번 위치의 아미노산이 Glu, 439번 위치의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 357번 위치의 아미노산이 Lys, 356번 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드, 또는

Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 409번 위치의 아미노산이 Asp, 370번 위치의 아미노산이 Glu, 439번 위치의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 399번 위치의 아미노산이 Lys, 357번 위치의 아미노산이 Lys, 356번 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드(본 태양에서는 EU 넘버링으로 표시되는 370번 위치의 아미노산을 Glu로 치환하지 않아도 되고, 또한 370번 위치의 아미노산을 Glu로 치환하지 않고 439번 위치의 아미노산인 Glu 대신에 Asp 또는 439번 위치의 아미노산인 Glu 대신에 392번 위치의 아미노산인 Asp여도 된다),

가 적합하게 사용된다.

또한 본 발명의 다른 비한정의 일태양에 있어서 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 356의 아미노산이 Lys이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 435의 아미노산이 Arg, 439의 아미노산이 Glu인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드도 적합하게 사용된다.

또한 본 발명의 다른 비한정의 일태양에 있어서 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 356의 아미노산이 Lys, 357의 아미노산이 Lys이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 370의 아미노산이 Glu, 435의 아미노산이 Arg, 439의 아미노산이 Glu인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드도 적합하게 사용된다.

이들 양태 1~3의 항원 결합 분자는 4자 복합체를 형성할 수 있는 항원 결합 분자와 비교하여 모두 면역원성을 저하시키고 또한 혈장 중 체류성을 향상시키는 것이 가능할 것으로 기대된다.

면역응답의 저감(면역원성의 개선)

본 발명의 항원 결합 분자에 대한 면역응답이 개변되었는지 여부는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물이 투여된 생체의 응답반응을 측정함으로써 평가될 수 있다. 생체의 응답반응으로서는 주로 세포성 면역(MHC 클래스 I에 결합한 항원 결합 분자의 펩티드 단편을 인식하는 세포장애성 T세포의 유도)과 액성 면역(항원 결합 분자에 결합하는 항체 생산의 유도)의 2개의 면역응답을 들 수 있으나, 특히 단백질 의약품의 경우는 투여된 항원 결합 분자에 대한 항체 생산이 면역원성으로 불린다. 면역원성을 평가하는 방법으로서는 in vivo에서 항체 생산을 평가하는 방법과 in vitro에서 면역 세포의 반응을 평가하는 방법의 2종류가 있다.

항원 결합 분자를 생체에 투여했을 때의 항체가를 측정함으로써 in vivo에 있어서의 면역응답(면역원성)을 평가하는 것이 가능하다. 예를 들면 마우스에 A와 B의 항원 결합 분자를 투여했을 때의 항체가를 측정하여, A의 항원 결합 분자 쪽이 B보다도 항체가가 높았던 경우, 또는 복수의 마우스에 투여했을 ‹š A의 항원 결합 분자를 투여한 쪽이 항체가 상승하는 개체의 출현율이 높았던 경우, A쪽이 B보다 면역원성이 높다고 판단된다. 항체가의 측정법은 당업자 공지의 ELISA, ECL, SPR을 사용한 투여 분자에 대해 특이적으로 결합하는 분자의 측정방법을 사용함으로써 실시 가능하다(J. Pharm. Biomed. Anal. (2011) 55 (5), 878-888).

항원 결합 분자에 대한 생체의 면역응답(면역원성)을 in vitro에서 평가하는 방법으로서는 도너로부터 단리한 인간 말초혈 단핵구 세포(또는 그의 분획세포)와 항원 결합 분자를 in vitro에서 반응시켜, 반응 또는 증식하는 헬퍼 T세포 등의 세포 수나 비율 또는 생산되는 사이토카인의 양을 측정하는 방법이 있다(Clin. Immunol. (2010) 137 (1), 5-14, Drugs R D. (2008) 9 (6), 385-396). 예를 들면 이러한 in vitro 면역원성의 시험에 의해 A와 B의 항원 결합 분자를 평가했을 때, A의 항원 결합 분자 쪽이 B보다도 반응이 높았던 경우, 또는 복수의 도너로 평가했을 때 A의 항원 결합 분자 쪽이 반응의 양성률이 높았던 경우, A 쪽이 B보다도 면역원성이 높다고 판단된다.

본 발명은 특정 이론에 구속되는 것은 아니나, pH 중성역에 있어서의 FcRn의 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자는 항원 제시 세포의 세포막 상에서 2분자의 FcRn 및 1분자의 FcγR의 4자를 포함하는 헤테로 복합체를 형성하는 것이 가능하기 때문에 항원 제시 세포로의 흡수가 촉진되고 있어, 면역응답이 유도되기 쉬워져 있는 것으로 생각된다. FcγR과 FcRn의 세포내 도메인에는 인산화 부위가 존재한다. 일반적으로 세포 표면에 발현하고 있는 수용체의 세포내 도메인의 인산화는 수용체가 회합화함으로써 일어나고, 그 인산화에 의해 수용체의 내재화가 일어난다. 천연형 IgG1이 항원 제시 세포 상에 있어서 FcγR/IgG1의 2자 복합체를 형성해도 FcγR의 세포내 도메인의 회합화는 일어나지 않으나, pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 IgG 분자가 가령 FcγR/2분자의 FcRn/IgG의 4자를 포함하는 복합체를 형성한 경우, FcγR과 FcRn의 3개의 세포내 도메인의 회합화가 일어나기 때문에, 그것에 의해 FcγR/2분자의 FcRn/IgG의 4자를 포함하는 헤테로 복합체의 내재화가 유도될 수 있을 것으로 생각된다. FcγR/2분자의 FcRn/IgG의 4자를 포함하는 헤테로 복합체의 형성은 FcγR과 FcRn을 모두 발현하는 항원 제시 세포 상에서 일어나는 것으로 생각되고, 그것에 의해 항체 분자가 항원 제시 세포에 흡수되는 양이 증대되며, 결과로서 면역원성이 악화될 수 있을 것으로 생각된다. 본 발명에서 발견된 양태 1, 2, 3 중 어느 하나의 방법에 의해 항원 제시 세포 상에 있어서의 상기 복합체의 형성을 저해함으로써 항원 제시 세포로의 흡수를 저감시키고, 결과로서 면역원성이 개선될 수 있을 것으로 생각된다.

약물동태의 개선

본 발명은 특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 예를 들면 pH 산성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮도록, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 생체에 투여되었을 때에 생체 중의 세포로의 흡수가 촉진됨으로써, 1분자의 항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 수가 증가하는 이유 및 혈장 중 항원 농도의 소실이 촉진되는 이유는 예를 들면 아래와 같이 설명하는 것이 가능하다.

예를 들면 항원 결합 분자가 막항원에 결합하는 항체가 생체내에 투여된 경우, 당해 항체는 항원에 결합한 후, 항원에 결합한 채로 항원과 함께 내재화에 의해 세포내의 엔도솜에 흡수된다. 그 후, 항원에 결합한 채로 리소좀으로 이행된 항체는 항원과 함께 리소좀에 의해 분해된다. 내재화를 매개로 한 혈장 중으로부터의 소실은 항원 의존적인 소실이라 불리고 있고, 대부분의 항체 분자에서 보고되어 있다(Drug Discov Today (2006) 11(1-2):81-88). 1분자의 IgG 항체가 2가로 항원에 결합한 경우, 1분자의 항체가 2분자의 항원에 결합한 상태로 내재화되어 그대로 리소좀에서 분해된다. 따라서, 통상의 항체의 경우, 1분자의 IgG 항체가 3분자 이상의 항원에 결합하는 것은 불가능하다. 예를 들면, 중화 활성을 갖는 1분자의 IgG 항체의 경우, 3분자 이상의 항원을 중화하는 것은 불가능하다.

IgG 분자의 혈장 중 체류성이 비교적 긴(소실이 느린) 것은 IgG 분자의 샐비지 수용체로서 알려져 있는 인간 FcRn이 기능하고 있기 때문이다. 음세포작용(pinocytosis)에 의해 엔도솜으로 흡수된 IgG 분자는 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 엔도솜 내에 발현하고 있는 인간 FcRn에 결합한다. 인간 FcRn에 결합할 수 없었던 IgG 분자는 그 후 이행되는 리소좀 내에서 분해된다. 한편 인간 FcRn에 결합한 IgG 분자는 세포 표면으로 이행된다. 혈장 중의 중성 조건하에 있어서 IgG 분자는 인간 FcRn으로부터 해리되기 때문에 당해 IgG 분자는 재차 혈장 중으로 리사이클된다.

또한 항원 결합 분자가 가용형 항원에 결합하는 항체의 경우, 생체내에 투여된 항체는 항원에 결합하고, 그 후, 항체는 항원에 결합한 채로 세포내에 흡수된다. 세포내에 흡수된 항체의 대부분은 엔도솜 내에서 FcRn에 결합한 후에 세포 표면으로 이행된다. 혈장 중의 중성 조건하에 있어서 항체는 인간 FcRn으로부터 해리되기 때문에 세포외로 방출된다. 그러나 pH 등의 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되지 않는 통상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항체는 항원과 결합한 채로 세포외로 방출되기 때문에 재차 항원에 결합하는 것은 불가능하다. 따라서, 막항원에 결합하는 항체와 마찬가지로 pH 등의 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되지 않는 통상의 1분자의 IgG 항체는 3분자 이상의 항원에 결합하는 것은 불가능하다.

항원에 대해 혈장 중의 pH 중성역의 조건하에 있어서는 강하게 결합하고 엔도솜 내의 pH 산성역의 조건하에 있어서 항원으로부터 해리되는 pH 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체(항원에 대해 pH 중성역의 조건하에서 결합하고 pH 산성역의 조건하에서 해리되는 항체)나, 항원에 대해 혈장 중의 고칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서는 강하게 결합하고 엔도솜 내의 저칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서 항원으로부터 해리되는 칼슘 이온 농도 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체(항원에 대해 고칼슘 이온 농도의 조건하에서 결합하고 저칼슘 이온 농도의 조건하에서 해리되는 항체)는 엔도솜 내에서 항원으로부터 해리하는 것이 가능하다. pH 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체나 칼슘 이온 농도 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체는 항원을 해리한 후에 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클되면 재차 항원에 결합하는 것이 가능하다. 그 때문에 1분자의 항체가 복수의 항원 분자에 반복해서 결합하는 것이 가능해진다. 또한 항원 결합 분자에 결합한 항원은 엔도솜 내에서 항체로부터 해리됨으로써 혈장 중으로 리사이클되지 않고 리소좀 내에서 분해된다. 이러한 항원 결합 분자를 생체에 투여함으로써 항원의 세포내로의 흡수가 촉진되어 혈장 중의 항원 농도를 저하시키는 것이 가능해진다.

항원에 대해 혈장 중의 pH 중성역의 조건하에 있어서는 강하게 결합하고 엔도솜 내의 pH 산성역의 조건하에 있어서 항원으로부터 해리되는 pH 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체(항원에 대해 pH 중성역의 조건하에서 결합하고 pH 산성역의 조건하에서 해리되는 항체)나, 항원에 대해 혈장 중의 고칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서는 강하게 결합하고 엔도솜 내의 저칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서 항원으로부터 해리되는 칼슘 이온 농도 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체(항원에 대해 고칼슘 이온 농도의 조건하에서 결합하고 저칼슘 이온 농도의 조건하에서 해리되는 항체)에 pH 중성역의 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합능을 부여함으로써, 항원 결합 분자가 결합하는 항원의 세포내로의 흡수가 더욱 촉진된다. 즉 이러한 항원 결합 분자의 생체로의 투여에 의해 항원의 소실이 촉진되어 혈장 중의 항원 농도를 저하시키는 것이 가능해진다. pH 의존적인 항원에 대한 결합능 또는 칼슘 이온 농도 의존적인 항원에 대한 결합능을 갖지 않는 통상의 항체 및 그 항체-항원 복합체는 비특이적인 엔도시토시스에 의해 세포에 흡수되어, 엔도솜 내의 산성 조건하에서 FcRn에 결합함으로써 세포 표면에 전송되고, 세포 표면의 중성 조건하에서 FcRn으로부터 해리됨으로써 혈장 중으로 리사이클된다. 그 때문에 충분히 pH 의존적으로 항원에 대해 결합하거나(pH 중성역의 조건하에서 결합하고 pH 산성역의 조건하에서 해리되거나) 또는 충분히 칼슘 이온 농도 의존적으로 항원에 대해 결합하는(고칼슘 이온 농도의 조건하에서 결합하고 저칼슘 이온 농도의 조건하에서 해리되는) 항체가 혈장 중에서 항원에 결합하고 엔도솜 내에 있어서 결합해 있는 항원을 해리하는 경우, 항원의 소실속도는 비특이적인 엔도시토시스에 의한 항체 및 그 항체-항원 복합체의 세포로의 흡수속도와 동등해질 것으로 생각된다. 항체와 항원 간 결합의 pH 의존성 또는 칼슘 이온 농도 의존성이 불충분한 경우는 엔도솜 내에 있어서 항체로부터 해리되지 않는 항원도 항체와 함께 혈장 중으로 리사이클되어 버리나, pH 의존성 또는 칼슘 농도 의존성이 충분한 경우는 항원의 소실속도는 비특이적인 엔도시토시스에 의한 세포로의 흡수속도가 율속(律速)이 된다. 또한 FcRn은 항체를 엔도솜 내로부터 세포 표면으로 전송하기 때문에 FcRn의 일부는 세포 표면에도 존재하고 있을 것으로 생각된다.

통상 항원 결합 분자의 일태양인 IgG형 면역 글로불린은 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 거의 갖지 않는다. 본 발명자들은 pH 중성역에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 IgG형 면역 글로불린은 세포 표면에 존재하는 FcRn에 결합하는 것이 가능하고, 세포 표면에 존재하는 FcRn에 결합함으로써 당해 IgG형 면역 글로불린이 FcRn 의존적으로 세포에 흡수되는 것으로 생각되었다. FcRn을 매개로 한 세포로의 흡수속도는 비특이적인 엔도시토시스에 의한 세포로의 흡수속도보다도 빠르다. 그 때문에 pH 중성역에 있어서 FcRn에 대한 결합능을 부여함으로써 항원 결합 분자에 의한 항원의 소실속도를 추가로 빠르게 하는 것이 가능할 것으로 생각된다. 즉 pH 중성역에 있어서 FcRn에 대한 결합능을 갖는 항원 결합 분자는 천연형 IgG형 면역 글로불린보다도 신속하게 항원을 세포내로 보내, 엔도솜 내에서 항원을 해리하고, 재차 세포 표면 내지는 혈장 중으로 리사이클되어, 거기서 재차 항원에 결합하고, 또한 FcRn을 매개로 세포내에 흡수된다. pH 중성역에 있어서 FcRn에 대한 결합능을 높게 함으로써 이 사이클의 회전속도를 빠르게 하는 것이 가능해지기 때문에 혈장 중으로부터 항원을 소실시키는 속도가 빨라진다. 또한 항원 결합 분자의 pH 산성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성을 pH 중성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 저하시킴으로써 추가로 혈장 중으로부터 항원을 소실시키는 속도를 높이는 것이 가능하다. 또한 이 사이클의 회전속도를 빠르게 하는 결과 생기는 그 사이클 수의 증대에 의해 1분자의 항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 분자 수도 많아질 것으로 생각된다. 본 발명의 항원 결합 분자는 항원 결합 도메인과 FcRn 결합 도메인으로 이루어지고, FcRn 결합 도메인은 항원에 대한 결합에 영향을 주는 경우는 없기 때문에, 또한 전술한 메커니즘으로부터 생각해도 항원의 종류에 의존하는 경우가 없어, 항원 결합 분자의 pH 산성역 또는 저칼슘 이온 농도의 조건 등의 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성(결합능)을 pH 중성역 또는 고칼슘 이온 농도의 조건 등의 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성(결합능)보다 저하 및/또는 혈장 중에서의 pH에 있어서의 FcRn으로의 결합 활성을 증대시킴으로써, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시켜 항원의 소실속도를 빠르게 하는 것이 가능할 것으로 생각된다.

본 발명에 있어서 항원 결합 분자에 의한 「항원의 세포내로의 흡수」란 항원이 엔도시토시스에 의해 세포내에 흡수되는 것을 의미한다. 또한 본 발명에 있어서 「세포내로의 흡수를 촉진한다」는 것은, 혈장 중에 있어서 항원과 결합한 항원 결합 분자가 세포내에 흡수되는 속도가 촉진 및/또는 흡수된 항원이 혈장 중으로 리사이클되는 양이 감소하는 것을 의미한다. 이 경우에 있어서 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자, 또는 당해 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 동시에 pH 산성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 중성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자가, 각각 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자, 또는 pH 산성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 중성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자보다도 세포내로의 흡수속도가 촉진되어 있으면 된다. 다른 일태양에서는 본 발명의 항원 결합 분자는 천연형의 인간 IgG보다 세포내로의 흡수속도가 촉진되어 있는 것이 바람직하고, 특히 천연형의 인간 IgG보다도 촉진되어 있는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명에 있어서 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수가 촉진되었는지 여부는 항원의 세포내로의 흡수속도가 증대되었는지 여부로 판단하는 것이 가능하다. 항원의 세포내로의 흡수속도는 예를 들면 인간 FcRn 발현 세포를 포함하는 배양액에 항원 결합 분자와 항원을 첨가하고, 항원의 배양액 중 농도의 감소를 경시적으로 측정하는 것, 또는 인간 FcRn을 발현하는 세포내에 흡수된 항원의 양을 경시적으로 측정하는 것에 의해 산출될 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원의 세포내로의 흡수속도를 촉진시키는 방법을 이용함으로써, 예를 들면 항원 결합 분자를 투여함으로써 혈장 중의 항원의 소실속도를 촉진시킬 수 있다. 따라서, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수가 촉진되었는지 여부는, 예를 들면 혈장 중에 존재하는 항원의 소실속도가 가속되어 있는지 여부, 또는 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중의 총항원 농도가 저감되어 있는지 여부를 측정함으로써도 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서 「천연형의 인간 IgG」란 비수식 인간 IgG를 의미하고, IgG의 특정 서브클래스에 한정되지 않는다. 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4가 pH 산성역에 있어서 인간 FcRn에 결합할 수 있는 한, 「천연형의 인간 IgG」로서 사용될 수 있는 것을 의미한다. 바람직하게는 「천연형의 인간 IgG」는 인간 IgG1일 수 있다.

본 발명에 있어서 「혈장 중 항원 소실능」이란 항원 결합 분자가 생체내에 투여되었거나 또는 항원 결합 분자의 생체내로의 분비가 발생하였을 때에, 혈장 중에 존재하는 항원을 혈장 중으로부터 소실시키는 능력을 말한다. 따라서 본 발명에 있어서 「항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능이 증가한다」는 것은 항원 결합 분자를 투여했을 때에 항원 결합 분자의 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 증대시키거나 또는 당해 인간 FcRn으로의 결합 활성의 증대에 더하여 pH 산성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성을 pH 중성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 저하시키기 전과 비교하여, 혈장 중으로부터 항원이 소실되는 속도가 빨라져 있으면 된다. 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능이 증가했는지 여부는, 예를 들면 가용형 항원과 항원 결합 분자를 생체내에 투여하고, 투여 후의 가용형 항원의 혈장 중 농도를 측정함으로써 판단하는 것이 가능하다. 항원 결합 분자의 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 증대시키거나 또는 당해 인간 FcRn에 대한 결합 활성의 증대에 더하여 pH 산성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성을 pH 중성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 저하시킴으로써, 가용형 항원 및 항원 결합 분자의 투여 후의 혈장 중의 가용형 항원의 농도가 저하되어 있는 경우는 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능이 증가한 것으로 판단할 수 있다. 가용형 항원은 항원 결합 분자 결합 항원이어도 되고 또는 항원 결합 분자 비결합 항원이어도 되며, 그 농도는 각각 「혈장 중 항원 결합 분자 결합 항원 농도」 및 「혈장 중 항원 결합 분자 비결합 항원 농도」로서 결정할 수 있다(후자는 「혈장 중 유리 항원 농도」와 동일한 정의이다). 「혈장 중 총항원 농도」란 항원 결합 분자 결합 항원과 항원 결합 분자 비결합 항원을 합계한 농도 또는 항원 결합 분자 비결합 항원 농도인 「혈장 중 유리 항원 농도」를 의미하는 것으로부터, 가용형 항원 농도는 「혈장 중 총항원 농도」로서 결정할 수 있다. 「혈장 중 총항원 농도」 또는 「혈장 중 유리 항원 농도」를 측정하는 다양한 방법이 본 명세서에 있어서 아래에 기재하는 바와 같이 당 기술분야에 있어서 주지이다.

본 발명에 있어서 「약물동태의 향상」, 「약물동태의 개선」 및 「우수한 약물동태」는 「혈장 중(혈중) 체류성의 향상」, 「혈장 중(혈중) 체류성의 개선」, 「우수한 혈장 중(혈중) 체류성」, 「혈장 중(혈중) 체류성을 길게 한다 」고 바꿔 말하는 것이 가능하고, 이들 어구는 동일한 의미로 사용된다.

본 발명에 있어서 「약물동태가 개선된다」는 것은 항원 결합 분자가 인간 또는 마우스, 랫트, 원숭이, 토끼, 개 등의 비인간 동물에 투여된 뒤부터 혈장 중으로부터 소실될 때까지(예를 들면 세포내에서 분해되거나 하여 항원 결합 분자가 혈장 중으로 되돌아가는 것이 불가능한 상태가 될 때까지)의 시간이 길어지는 것뿐 아니라, 항원 결합 분자가 투여된 뒤부터 분해되어 소실될 때까지 사이에 항원에 결합 가능한 상태(예를 들면 항원 결합 분자가 항원에 결합해 있지 않은 상태)에서 혈장 중에 체류하는 시간이 길어지는 것도 포함한다. 천연형 Fc영역을 갖는 인간 IgG는 비인간 동물 유래의 FcRn에 결합할 수 있다. 예를 들면 천연형 Fc영역을 갖는 인간 IgG는 인간 FcRn보다 마우스 FcRn에 강하게 결합할 수 있기 때문에(Int. Immunol. (2001) 13 (12), 1551-1559), 본 발명의 항원 결합 분자의 특성을 확인할 목적으로 바람직하게는 마우스를 사용하여 투여를 행할 수 있다. 다른 예로서 본래의 FcRn 유전자가 파괴되어 있어, 인간 FcRn 유전자에 관한 트랜스진을 가지고 발현하는 마우스(Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104)도 또한 아래에 기재하는 본 발명의 항원 결합 분자의 특성을 확인할 목적으로 투여를 행하기 위해 사용할 수 있다. 구체적으로는 「약물동태가 개선된다」는 것은 또한 항원에 결합해 있지 않은 항원 결합 분자(항원 비결합형 항원 결합 분자)가 분해되어 소실될 때까지의 시간이 길어지는 것을 포함한다. 항원 결합 분자가 혈장 중에 존재하고 있어도 그 항원 결합 분자에 이미 항원이 결합해 있는 경우는 그 항원 결합 분자는 새로운 항원에 결합할 수 없다. 그 때문에 항원 결합 분자가 항원에 결합해 있지 않은 시간이 길어지면 새로운 항원에 결합할 수 있는 시간이 길어져(새로운 항원에 결합할 수 있는 기회가 많아져) 생체내에서 항원이 항원 결합 분자에 결합해 있지 않은 시간을 감소시킬 수 있어, 항원이 항원 결합 분자에 결합해 있는 시간을 길게 하는 것이 가능해진다. 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중으로부터의 항원의 소실을 가속할 수 있다면, 항원 비결합형 항원 결합 분자의 혈장 중 농도가 증가되고 또한 항원이 항원 결합 분자에 결합해 있는 시간이 길어진다. 즉 본 발명에 있어서의 「항원 결합 분자의 약물동태의 개선」이란 항원 비결합형 항원 결합 분자 중 어느 하나의 약물동태 파라미터의 개선(혈장 중 반감기의 증가, 평균 혈장 중 체류시간의 증가, 혈장 중 클리어런스의 저하 중 어느 하나) 또는 항원 결합 분자 투여 후에 항원이 항원 결합 분자에 결합해 있는 시간의 연장, 또는 항원 결합 분자에 의한 혈장 중으로부터의 항원의 소실이 가속되는 것을 포함한다. 항원 결합 분자 또는 항원 비결합형 항원 결합 분자의 혈장 중 반감기, 평균 혈장 중 체류시간, 혈장 중 클리어런스 등 중 어느 하나의 파라미터(파마코키네틱스 연습에 의한 이해(난잔도))를 측정함으로써 판단하는 것이 가능하다. 예를 들면, 항원 결합 분자를 마우스, 랫트, 원숭이, 토끼, 개, 인간 등에 투여한 경우, 항원 결합 분자 또는 항원 비결합형 항원 결합 분자의 혈장 중 농도를 측정하여 각 파라미터를 산출하고, 혈장 중 반감기가 길어졌거나 또는 평균 혈장 중 체류시간이 길어진 경우 등에는 항원 결합 분자의 약물동태가 개선되었다고 할 수 있다. 이들 파라미터는 당업자에게 공지의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하며, 예를 들면, 약물동태 해석 소프트웨어 WinNonlin(Pharsight)을 사용하여 부속의 절차 설명서에 따라 비구획(Noncompartmental) 해석을 함으로써 적당히 평가할 수 있다. 항원에 결합해 있지 않은 항원 결합 분자의 혈장 중 농도의 측정은 당업자 공지의 방법으로 실시하는 것이 가능하며, 예를 들면, Clin Pharmacol. (2008) 48(4), 406-417에 있어서 측정되고 있는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 「약물동태가 개선된다」는 것은 항원 결합 분자 투여 후에 항원이 항원 결합 분자에 결합해 있는 시간이 연장된 것도 포함한다. 항원 결합 분자 투여 후에 항원이 항원 결합 분자에 결합해 있는 시간이 연장되었는지 여부는, 유리 항원의 혈장 중 농도를 측정하고 유리 항원의 혈장 중 농도 또는 총항원 농도에 대한 유리 항원 농도의 비율이 상승될 때까지의 시간으로 판단하는 것이 가능하다.

항원 결합 분자에 결합해 있지 않은 유리 항원의 혈장 중 농도 또는 총항원 농도에 대한 유리 항원 농도의 비율은 당업자 공지의 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들면 Pharm. Res. (2006) 23 (1), 95-103에 있어서 사용되고 있는 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 또한 항원이 어떠한 기능을 생체내에서 나타내는 경우, 항원이 항원의 기능을 중화하는 항원 결합 분자(안타고니스트 분자)와 결합해 있는지 여부는 그 항원의 기능이 중화되어 있는지 여부로 평가하는 것도 가능하다. 항원의 기능이 중화되어 있는지 여부는 항원의 기능을 반영하는 어떠한 생체내 마커를 측정함으로써 평가될 수 있다. 항원이 항원의 기능을 활성화하는 항원 결합 분자(아고니스트 분자)와 결합해 있는지 여부는 항원의 기능을 반영하는 어떠한 생체내 마커를 측정함으로써 평가될 수 있다.

유리 항원의 혈장 중 농도의 측정, 혈장 중의 총항원량에 대한 혈장 중의 유리 항원량 비율의 측정, 생체내 마커의 측정 등의 측정은 특별히 한정되지 않으나, 항원 결합 분자가 투여된 뒤부터 일정 시간이 경과된 후에 행해지는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서 항원 결합 분자가 투여된 뒤부터 일정 시간이 경과된 후란 특별히 한정되지 않고, 투여된 항원 결합 분자의 성질 등에 따라 당업자가 적시 결정하는 것이 가능하고, 예를 들면 항원 결합 분자를 투여한 뒤부터 1일 경과 후, 항원 결합 분자를 투여한 뒤부터 3일 경과 후, 항원 결합 분자를 투여한 뒤부터 7일 경과 후, 항원 결합 분자를 투여한 뒤부터 14일 경과 후, 항원 결합 분자를 투여한 뒤부터 28일 경과 후 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 「혈장 중 항원 농도」란 항원 결합 분자 결합 항원과 항원 결합 분자 비결합 항원을 합계한 농도인 「혈장 중 총항원 농도」 또는 항원 결합 분자 비결합 항원 농도인 「혈장 중 유리 항원 농도」 모두 포함되는 개념이다.

혈장 중 총항원 농도는 인간 FcRn 결합 도메인으로서 천연형 Fc영역을 포함하는 인간 IgG를 참조 항원 결합 분자로서 투여한 경우와 비교하여, 또는 본 발명의 항원 결합 분자를 투여하지 않는 경우와 비교하여, 본 발명의 항원 결합 분자의 투여에 의해 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 200배, 500배, 1,000배 또는 그 이상 저감할 수 있다.

항원/항원 결합 분자 몰비는 아래에 나타내는 바와 같이 산출될 수 있다：

A값=각 시점에서의 항원의 몰농도

B값=각 시점에서의 항원 결합 분자의 몰농도

C값=각 시점에서의 항원 결합 분자의 몰농도당 항원의 몰농도(항원/항원 결합 분자 몰비)

C=A/B.

C값이 보다 작은 경우는 항원 결합 분자당 항원 소실효율이 보다 높은 것을 나타내고, C값이 보다 큰 경우는 항원 결합 분자당 항원 소실효율이 보다 낮은 것을 나타낸다.

항원/항원 결합 분자 몰비는 상기와 같이 산출될 수 있다.

항원/항원 결합 분자 몰비는 인간 FcRn 결합 도메인으로서 천연형 인간 IgG Fc영역을 포함하는 참조 항원 결합 분자를 투여한 경우와 비교하여, 본 발명의 항원 결합 분자의 투여에 의해 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 200배, 500배, 1,000배 또는 그 이상 저감할 수 있다.

본 발명에 있어서 천연형 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4는 바람직하게는 인간 FcRn 결합 활성 또는 생체내에 있어서의 결합 활성에 관하여 항원 결합 분자와 비교하는 참조 천연형 인간 IgG 용도를 위한 천연형 인간 IgG로서 사용된다. 바람직하게는 목적의 항원 결합 분자와 동일한 항원 결합 도메인 및 인간 FcRn 결합 도메인으로서 천연형 인간 IgG Fc영역을 포함하는 참조 항원 결합 분자를 적당히 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 천연형 인간 IgG1은 인간 FcRn 결합 활성 또는 생체내에 있어서의 결합 활성에 관하여 항원 결합 분자와 비교하는 참조 천연형 인간 IgG 용도로 사용된다.

혈장 중 총항원 농도 또는 항원/항체 몰비의 감소는 실시예 4, 5 및 12에 기재된 바와 같이 평가할 수 있다. 보다 구체적으로는 항원 결합 분자가 마우스 카운터파트 항원과 교차반응하지 않는 경우는 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 32 또는 계통 276(Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104)을 사용하여, 항원 항체 동시 주사 모델 또는 정상(定常)상태 항원 주입 모델 중 어느 하나에 의해 평가할 수 있다. 항원 결합 분자가 마우스 카운터파트와 교차반응하는 경우는 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 32 또는 계통 276(Jackson Laboratories)에 항원 결합 분자를 단순히 주사함으로써 평가할 수 있다. 동시 주사 모델의 경우는 항원 결합 분자와 항원의 혼합물을 마우스에 투여한다. 정상상태 항원 주입 모델의 경우는 일정 혈장 중 항원 농도를 달성하기 위해 마우스에 항원용액을 충전한 주입 펌프를 메워넣고, 다음으로 항원 결합 분자를 마우스에 주사한다. 시험 항원 결합 분자를 동일한 용량으로 투여한다. 혈장 중 총항원 농도, 혈장 중 유리 항원 농도 및 혈장 중 항원 결합 분자 농도를 당업자 공지의 방법을 사용하여 적절한 시점에서 측정한다.

투여 2일 후, 4일 후, 7일 후, 14일 후, 28일 후, 56일 후 또는 84일 후에 혈장 중의 총항원 농도 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원 결합 분자 몰비를 측정하여 본 발명의 장기효과를 평가할 수 있다. 바꿔 말하면 본 발명의 항원 결합 분자의 특성을 평가할 목적으로 장기간의 혈장 중 항원 농도가 항원 결합 분자의 투여 2일 후, 4일 후, 7일 후, 14일 후, 28일 후, 56일 후 또는 84일 후에 혈장 중의 총항원 농도 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원 결합 분자 몰비를 측정함으로써 결정된다. 본 발명에 기재된 항원 결합 분자에 의해 혈장 중 항원 농도 또는 항원/항원 결합 분자 몰비의 감소가 달성되는지 여부는 앞서 기재한 임의의 하나 또는 복수의 시점에서 그의 감소를 평가함으로써 결정될 수 있다.

투여 15분 후, 1시간 후, 2시간 후, 4시간 후, 8시간 후, 12시간 후 또는 24시간 후에 혈장 중의 총항원 농도 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원 결합 분자 몰비를 측정하여 본 발명의 단기효과를 평가할 수 있다. 바꿔 말하면 본 발명의 항원 결합 분자의 특성을 평가할 목적으로, 단기간의 혈장 중 항원 농도가 항원 결합 분자의 투여 15분 후, 1시간 후, 2시간 후, 4시간 후, 8시간 후, 12시간 후 또는 24시간 후에 혈장 중의 총항원 농도 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원 결합 분자 몰비를 측정함으로써 결정된다.

본 발명의 항원 결합 분자의 투여경로는 피내 주사, 정맥내 주사, 유리체내 주사, 피하 주사, 복강내 주사, 비경구 주사 및 근육내 주사로부터 선택할 수 있다.

본 발명에 있어서는 인간에 있어서의 항원 결합 분자의 약물동태가 개선되는 것이 바람직하다. 인간에서의 혈장 중 체류성을 측정하는 것이 곤란한 경우에는 마우스(예를 들면 정상 마우스, 인간 항원 발현 형질전환 마우스, 인간 FcRn 발현 형질전환 마우스 등) 또는 원숭이(예를 들면 게잡이원숭이 등)에서의 혈장 중 체류성을 토대로 인간에서의 혈장 중 체류성을 예측할 수 있다.

본 발명에 있어서의 「항원 결합 분자의 약물동태의 개선, 혈장 중 체류성의 향상」이란 항원 결합 분자를 생체에 투여했을 때 중 어느 하나의 약물동태 파라미터가 개선되어 있는 것(혈장 중 반감기의 증가, 평균 혈장 중 체류시간의 증가, 혈장 중 클리어런스의 저하, 생물학적 이용률(bioavailability) 중 어느 하나) 또는 투여 후의 적절한 시간에 있어서의 항원 결합 분자의 혈장 중 농도가 향상되어 있는 것을 의미한다. 항원 결합 분자의 혈장 중 반감기, 평균 혈장 중 체류시간, 혈장 중 클리어런스, 생물학적 이용률 등 중 어느 하나의 파라미터(파마코키네틱스 연습에 의한 이해(난잔도))를 측정함으로써 판단하는 것이 가능하다. 예를 들면, 항원 결합 분자를 마우스(정상 마우스 및 인간 FcRn 형질전환 마우스), 랫트, 원숭이, 토끼, 개, 인간 등에 투여한 경우, 항원 결합 분자의 혈장 중 농도를 측정하여 각 파라미터를 산출하고, 혈장 중 반감기가 길어졌거나 또는 평균 혈장 중 체류시간이 길어진 경우 등에는 항원 결합 분자의 약물동태가 개선되었다고 할 수 있다. 이들 파라미터는 당업자에게 공지의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하며, 예를 들면, 약물동태 해석 소프트웨어 WinNonlin(Pharsight)을 사용하여 부속의 절차 설명서에 따라 비구획(Noncompartmental) 해석을 함으로써 적당히 평가할 수 있다.

본 발명은 특정 이론에 구속되는 것은 아니나, pH 중성역에 있어서의 FcRn의 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자는 항원 제시 세포의 세포막 상에서 2분자의 FcRn 및 1분자의 FcγR의 4자를 포함하는 복합체를 형성하는 것이 가능하기 때문에 항원 제시 세포로의 흡수가 촉진되고 있어, 혈장 중 체류성이 저하되고 약물동태가 악화되고 있는 것으로 생각된다. FcγR과 FcRn의 세포내 도메인에는 인산화 부위가 존재한다. 일반적으로 세포 표면에 발현하고 있는 수용체의 세포내 도메인의 인산화는 수용체가 회합화함으로써 일어나고, 그 인산화에 의해 수용체의 내재화가 일어난다. 천연형 IgG1이 항원 제시 세포 상에 있어서 FcγR/IgG1의 2자 복합체를 형성해도 FcγR의 세포내 도메인의 회합화는 일어나지 않으나, pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 IgG 분자가 가령 FcγR/2분자의 FcRn/IgG의 4자를 포함하는 헤테로 복합체를 형성한 경우, FcγR과 FcRn의 3개의 세포내 도메인의 회합화가 일어나기 때문에, 그것에 의해 FcγR/2분자의 FcRn/IgG의 4자를 포함하는 헤테로 복합체의 내재화가 유도될 수 있을 것으로 생각된다. FcγR/2분자의 FcRn/IgG의 4자를 포함하는 헤테로 복합체의 형성은 FcγR과 FcRn을 모두 발현하는 항원 제시 세포 상에서 일어나는 것으로 생각되고, 그것에 의해 항체 분자가 항원 제시 세포에 흡수되는 양이 증대되며, 결과로서 약물동태가 악화될 수 있을 것으로 생각된다. 본 발명에서 발견된 양태 1, 2, 3 중 어느 하나의 방법에 의해 항원 제시 세포 상에 있어서의 상기 복합체의 형성을 저해함으로써 항원 제시 세포로의 흡수를 저감시키고, 결과로서 약물동태가 개선될 수 있을 것으로 생각된다.

이온 농도의 조건에 따라 결합 활성이 변화되는 항원 결합 분자의 제조방법

본 발명의 비한정의 일태양에서는 상기와 같이 선택된 조건에 따라 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 단리된 후에, 당해 폴리뉴클레오티드가 적절한 발현 벡터에 삽입된다. 예를 들면 항원 결합 도메인이 항체의 가변영역인 경우에는 당해 가변영역을 코드하는 cDNA가 얻어진 후에, 당해 cDNA의 양말단에 삽입된 제한효소 사이트를 인식하는 제한효소에 의해 그 cDNA가 소화된다. 바람직한 제한효소는 항원 결합 분자의 유전자를 구성하는 염기서열에 출현하는 빈도가 낮은 염기서열을 인식하여 소화한다. 또한 1 카피의 소화 단편을 벡터에 바른 방향으로 삽입하기 위해서는 부착 말단을 부여하는 제한효소의 삽입이 바람직하다. 상기와 같이 소화된 항원 결합 분자의 가변영역을 코드하는 cDNA를 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 본 발명의 항원 결합 분자의 발현 벡터가 취득될 수 있다. 이때 항체 정상영역(C영역)을 코드하는 유전자와 상기 가변영역을 코드하는 유전자가 인프레임으로 융합될 수 있다.

목적하는 항원 결합 분자를 제조하기 위해, 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 제어 서열로 작용 가능하게 연결된 태양으로 발현 벡터에 삽입된다. 제어 서열이란 예를 들면 인핸서나 프로모터를 포함한다. 또한 발현한 항원 결합 분자가 세포외로 분비되도록 적절한 시그날 서열이 아미노 말단에 연결될 수 있다. 예를 들면 시그날 서열로서 아미노산 서열 MGWSCIILFLVATATGVHS(서열번호：3)를 갖는 펩티드가 사용되나, 이것 이외에도 적합한 시그날 서열이 연결될 수 있다. 발현된 폴리펩티드는 상기 서열의 카르복실 말단 부분에서 절단되고, 절단된 폴리펩티드가 성숙 폴리펩티드로서 세포외로 분비될 수 있다. 이어서, 이 발현 벡터에 의해 적당한 숙주세포가 형질전환됨으로써 목적하는 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 재조합 세포가 취득될 수 있다. 당해 재조합 세포로부터 본 발명의 항원 결합 분자를 제조하는 방법은 상기 항체의 항목에서 기재한 방법에 준하여 제조될 수 있다.

본 발명의 비한정의 일태양에 있어서, 상기와 같이 선택된 조건에 따라 결합 활성이 변화되는 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 단리된 후에, 당해 폴리뉴클레오티드의 개변체가 적절한 발현 벡터에 삽입된다. 이러한 개변체의 하나로서 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 합성 라이브러리나 비인간 동물을 기원으로 하여 제작된 면역 라이브러리를 사용함으로써 스크리닝된 본 발명의 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드 서열이 인간화된 개변체를 바람직하게 들 수 있다. 인간화된 항원 결합 분자의 개변체의 제작방법은 상기 인간화 항체의 제작방법과 동일한 방법이 채용될 수 있다.

또한 개변체의 다른 태양으로서, 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 합성 라이브러리나 나이브 라이브러리를 사용함으로써 스크리닝된 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 친화성의 증강(친화성 성숙화)을 초래하는 개변이 단리된 폴리뉴클레오티드 서열에 행해진 개변체를 바람직하게 들 수 있다. 그러한 개변체는 CDR의 변이 유도(Yang등(J. Mol. Biol. (1995) 254, 392-403)), 체인 셔플링(Marks등(Bio/Technology (1992) 10, 779-783)), E.coli의 변이 유발주의 사용(Low등(J. Mol. Biol. (1996) 250, 359-368)), DNA 셔플링(Patten등(Curr. Opin. Biotechnol. (1997) 8, 724-733)), 파지 디스플레이(Thompson등(J. Mol. Biol. (1996) 256, 77-88)) 및 유성(有性) PCR(sexual PCR)(Clameri등(Nature (1998) 391, 288-291))을 포함하는 각종 친화성 성숙화의 공지 순서에 의해 취득될 수 있다.

상기와 같이 본 발명의 제조방법에 의해 제작되는 항원 결합 분자로서 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 들 수 있는데, Fc영역으로서 다양한 개변체가 사용될 수 있다. 이러한 Fc영역의 개변체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와, 상기와 같이 선택된 조건에 따라 결합 활성이 변화되는 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 인프레임으로 연결된 중쇄를 갖는 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 개변체의 일태양으로서 바람직하게 들 수 있다.

본 발명의 비한정의 일태양에서는 Fc영역으로서 예를 들면 서열번호：11로 표시되는 IgG1(N말단에 Ala가 부가된 AAC82527.1), 서열번호：12로 표시되는 IgG2(N말단에 Ala가 부가된 AAB59393.1), 서열번호：13으로 표시되는 IgG3(CAA27268.1), 서열번호：14로 표시되는 IgG4(N말단에 Ala가 부가된 AAB59394.1) 등의 항체의 Fc 정상영역을 바람직하게 들 수 있다. IgG 분자의 혈장 중 체류성이 비교적 긴(혈장 중으로부터의 소실이 느린) 것은 IgG 분자의 샐비지 수용체로서 알려져 있는 FcRn 특히 인간 FcRn이 기능하고 있기 때문이다. 음세포작용에 의해 엔도솜에 흡수된 IgG 분자는 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 엔도솜 내에 발현하고 있는 FcRn 특히 인간 FcRn에 결합한다. FcRn 특히 인간 FcRn에 결합할 수 없었던 IgG 분자는 리소좀으로 진행되고 거기서 분해되는데, FcRn 특히 인간 FcRn으로 결합한 IgG 분자는 세포 표면으로 이행되어 혈장 중의 중성 조건하에 있어서 FcRn 특히 인간 FcRn으로부터 해리됨으로써 재차 혈장 중으로 되돌아간다.

통상의 Fc영역을 포함하는 항체는 혈장 중의 pH 중성역의 조건하에 있어서 FcRn 특히 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않기 때문에, 통상의 항체 및 항체-항원 복합체는 비특이적인 엔도시토시스에 의해 세포에 흡수되어, 엔도솜 내의 pH 산성역의 조건하에서 FcRn 특히 인간 FcRn에 결합함으로써 세포 표면으로 전송된다. FcRn 특히 인간 FcRn은 항체를 엔도솜 내로부터 세포 표면으로 전송하기 때문에 FcRn 특히 인간 FcRn의 일부는 세포 표면에도 존재하고 있는 것으로 생각되는데, 세포 표면의 pH 중성역의 조건하에서는 항체는 FcRn 특히 인간 FcRn으로부터 해리되기 때문에 항체는 혈장 중으로 리사이클된다.

본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역은 어떠한 방법으로도 취득될 수 있으나, 구체적으로는 출발 Fc영역으로서 사용되는 인간 IgG형 면역 글로불린의 아미노산의 개변에 의해 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역이 취득될 수 있다. 개변을 위한 바람직한 IgG형 면역 글로불린의 Fc영역으로서는 예를 들면 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 및 그들의 개변체)의 Fc영역을 들 수 있다. 다른 아미노산으로의 개변은 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖거나 또는 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 높일 수 있는 한 어떠한 위치의 아미노산도 개변될 수 있다. 항원 결합 분자가 인간 Fc영역으로서 인간 IgG1의 Fc영역을 포함하고 있는 경우, pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합이 인간 IgG1의 출발 Fc영역의 결합 활성보다 증강되는 효과를 초래하는 개변이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 그러한 개변이 가능한 아미노산으로서, 예를 들면 EU 넘버링 221번 위치~225번 위치, 227번 위치, 228번 위치, 230번 위치, 232번 위치, 233번 위치~241번 위치, 243번 위치~252번 위치, 254번 위치~260번 위치, 262번 위치~272번 위치, 274번 위치, 276번 위치, 278번 위치~289번 위치, 291번 위치~312번 위치, 315번 위치~320번 위치, 324번 위치, 325번 위치, 327번 위치~339번 위치, 341번 위치, 343번 위치, 345번 위치, 360번 위치, 362번 위치, 370번 위치, 375번 위치~378번 위치, 380번 위치, 382번 위치, 385번 위치~387번 위치, 389번 위치, 396번 위치, 414번 위치, 416번 위치, 423번 위치, 424번 위치, 426번 위치~438번 위치, 440번 위치 및 442번 위치의 아미노산을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 예를 들면 표 5에 기재된 바와 같은 아미노산의 개변을 들 수 있다. 이들 아미노산의 개변에 의해 IgG형 면역 글로불린의 Fc영역의 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합이 증강된다.

본 발명에 사용하기 위해 이들 개변 중 pH 중성역에 있어서도 인간 FcRn에 대한 결합을 증강시키는 개변이 적당히 선택된다. 특히 바람직한 Fc영역 개변체의 아미노산으로서, 예를 들면 EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치, 248번 위치, 250번 위치, 252번 위치, 254번 위치, 255번 위치, 256번 위치, 257번 위치, 258번 위치, 265번 위치, 286번 위치, 289번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 303번 위치, 305번 위치, 307번 위치, 308번 위치, 309번 위치, 311번 위치, 312번 위치, 314번 위치, 315번 위치, 317번 위치, 332번 위치, 334번 위치, 360번 위치, 376번 위치, 380번 위치, 382번 위치, 384번 위치, 385번 위치, 386번 위치, 387번 위치, 389번 위치, 424번 위치, 428번 위치, 433번 위치, 434번 위치 및 436번 위치의 아미노산을 들 수 있다. 이들 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써, 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역의 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 증강시킬 수 있다.

특히 바람직한 개변으로서는 예를 들면 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는

237번 위치의 아미노산이 Met,

248번 위치의 아미노산이 Ile,

250번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

252번 위치의 아미노산이 Phe, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

254번 위치의 아미노산이 Thr,

255번 위치의 아미노산이 Glu,

256번 위치의 아미노산이 Asp, Asn, Glu 또는 Gln 중 어느 하나,

257번 위치의 아미노산이 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr 또는 Val 중 어느 하나,

258번 위치의 아미노산이 His,

265번 위치의 아미노산이 Ala,

286번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Glu 중 어느 하나,

289번 위치의 아미노산이 His,

297번 위치의 아미노산이 Ala,

303번 위치의 아미노산이 Ala,

305번 위치의 아미노산이 Ala,

307번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

308번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln 또는 Thr 중 어느 하나,

309번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Pro 또는 Arg 중 어느 하나,

311번 위치의 아미노산이 Ala, His 또는 Ile 중 어느 하나,

312번 위치의 아미노산이 Ala 또는 His 중 어느 하나,

314번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Arg 중 어느 하나,

315번 위치의 아미노산이 Ala, Asp 또는 His 중 어느 하나,

317번 위치의 아미노산이 Ala,

332번 위치의 아미노산이 Val,

334번 위치의 아미노산이 Leu,

360번 위치의 아미노산이 His,

376번 위치의 아미노산이 Ala,

380번 위치의 아미노산이 Ala,

382번 위치의 아미노산이 Ala,

384번 위치의 아미노산이 Ala,

385번 위치의 아미노산이 Asp 또는 His 중 어느 하나,

386번 위치의 아미노산이 Pro,

387번 위치의 아미노산이 Glu,

389번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Ser 중 어느 하나,

424번 위치의 아미노산이 Ala,

428번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

433번 위치의 아미노산이 Lys,

434번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, His, Ser, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나 및

436번 위치의 아미노산이 His, Ile, Leu, Phe, Thr 또는 Val

을 들 수 있다. 또한 개변되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않고, 1개소만의 아미노산이 개변될 수 있고, 2개소 이상의 아미노산이 개변될 수 있다. 2개소 이상의 아미노산 개변의 조합으로서는 예를 들면 표 6에 기재되는 바와 같은 조합을 들 수 있다.

또한 본 발명은 특정 원리에 구속되는 것은 아니나, 상기 개변에 더하여 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역과 2분자의 FcRn 및 활성형 Fcγ 수용체의 4자를 포함하는 헤테로 복합체가 형성되지 않도록 Fc영역의 개변을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법이 제공된다. 그러한 항원 결합 분자의 바람직한 양태로서, 아래의 3종류를 들 수 있다.

(양태 1) pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자

양태 1의 항원 결합 분자는 2분자의 FcRn에 결합함으로써 3자 복합체를 형성하지만, 활성형 FcγR을 포함한 복합체는 형성하지 않는다(도 49). 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은 Fc영역은 상기와 같이 천연형 Fc영역의 아미노산을 개변함으로써 제작될 수 있다. 개변 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은지 여부는 상기 결합 활성의 항목에서 기재된 방법을 사용하여 적당히 실시될 수 있다.

본 명세서에 있어서 Fc영역 개변체의 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 낮다는 것은, Fc영역 개변체의 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 이들의 인간 Fcγ 수용체에 대한 천연형 Fc영역의 결합 활성보다도 낮은 것을 말한다. 예를 들면 상기 해석방법을 토대로, 대조로 하는 천연형 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 결합 활성과 비교하여 Fc영역 개변체를 포함하는 항원 결합 분자의 결합 활성이 95% 이하, 바람직하게는 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 특히 바람직하게는 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다. 천연형 Fc영역으로서는 출발 Fc영역도 사용될 수 있고, 야생형 항체의 상이한 아이소타입의 Fc영역도 사용될 수 있다.

대조로 하는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자로서는 IgG 단일클론항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자가 적당히 선택될 수 있다. 당해 Fc영역의 구조는 서열번호：11(RefSeq 등록번호 AAC82527.1의 N끝에 A 부가), 12(RefSeq 등록번호 AAB59393.1의 N끝에 A 부가), 13(RefSeq 등록번호 CAA27268.1), 14(RefSeq 등록번호 AAB59394.1의 N끝에 A 부가)에 기재되어 있다. 또한 어떤 특정 아이소타입의 항체의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 피검물질로서 사용하는 경우에는, 당해 특정 아이소타입의 IgG 단일클론항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 대조로서 사용함으로써, 당해 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자에 의한 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성의 효과가 검증된다. 상기와 같이 하여 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 높은 것이 검증된 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 적당히 선택된다.

본 발명의 비한정의 일태양에서는 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은 Fc영역의 예로서, 상기 Fc영역의 아미노산 중 EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 270번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 325번 위치 및 329번 위치 중 어느 하나 이상의 아미노산이 천연형 Fc영역과 상이한 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역을 바람직하게 들 수 있으나, Fc영역의 개변은 상기 개변에 한정되지 않고, 예를 들면 Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685-691에 기재되어 있는 탈당쇄(N297A, N297Q), IgG1-L234A/L235A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A, IgG4-L236E 등의 개변 및 WO 2008/092117에 기재되어 있는 G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R, N325LL328R 등의 개변 및 EU 넘버링 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 237번 위치에 있어서의 아미노산의 삽입, WO 2000/042072에 기재되어 있는 개소의 개변이어도 된다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；

234번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr 또는 Trp 중 어느 하나,

235번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val 또는 Arg 중 어느 하나,

236번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,

237번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr 또는 Arg 중 어느 하나,

238번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp 또는 Arg 중 어느 하나,

239번 위치의 아미노산을 Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr 또는 Arg 중 어느 하나,

265번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,

266번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

267번 위치의 아미노산을 Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

269번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,

270번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나

271번 위치의 아미노산을 Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

295번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

296번 위치의 아미노산을 Arg, Gly, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

297번 위치의 아미노산을 Ala,

298번 위치의 아미노산을 Arg, Gly, Lys, Pro, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

300번 위치의 아미노산을 Arg, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

324번 위치의 아미노산을 Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

325번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,

327번 위치의 아미노산을 Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,

328번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Gly, His, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

329번 위치의 아미노산을 Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val 또는 Arg 중 어느 하나,

330번 위치의 아미노산을 Pro 또는 Ser 중 어느 하나,

331번 위치의 아미노산을 Arg, Gly 또는 Lys 중 어느 하나 또는

332번 위치의 아미노산을 Arg, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,

중 어느 하나 이상으로 개변되어 있는 Fc영역을 바람직하게 들 수 있다.

(양태 2) pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 억제형 FcγR에 대한 결합 활성이 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자

양태 2의 항원 결합 분자는 2분자의 FcRn과 1분자의 억제형 FcγR에 결합함으로써 이들 4자를 포함하는 복합체를 형성할 수 있다. 그러나 1분자의 항원 결합 분자는 1분자의 FcγR과만 결합할 수 있기 때문에, 1분자의 항원 결합 분자는 억제형 FcγR에 결합한 상태로 다른 활성형 FcγR에 결합하는 것은 불가능하다(도 50). 또한 억제형 FcγR에 결합한 상태로 세포내로 흡수된 항원 결합 분자는 세포막 상으로 리사이클되어 세포내에서의 분해를 회피하는 것이 보고되어 있다(Immunity (2005) 23, 503-514). 즉 억제형 FcγR에 대한 선택적 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자는 면역응답의 원인이 되는 활성형 FcγR 및 2분자의 FcRn을 포함한 헤테로 복합체를 형성할 수 없다고 생각된다.

본 명세서에 있어서 억제형 FcγR에 대한 결합 활성이 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높다는 것은, Fc영역 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 것을 말한다. 예를 들면 상기 해석방법을 토대로, Fc영역 개변체를 포함하는 항원 결합 분자의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성의 105% 이상, 바람직하게는 110% 이상, 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 특히 바람직하게는 150% 이상, 160% 이상, 170% 이상, 180% 이상, 190% 이상, 200%% 이상, 250% 이상, 300% 이상, 350% 이상, 400% 이상, 450% 이상, 500% 이상, 750% 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다.

대조로 하는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자로서는 IgG 단일클론항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자가 적당히 선택될 수 있다. 당해 Fc영역의 구조는 서열번호：11(RefSeq 등록번호 AAC82527.1의 N끝에 A 부가), 12(RefSeq 등록번호 AAB59393.1의 N끝에 A 부가), 13(RefSeq 등록번호 CAA27268.1), 14(RefSeq 등록번호 AAB59394.1의 N끝에 A 부가)에 기재되어 있다. 또한 어떤 특정 아이소타입의 항체의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 피검물질로서 사용하는 경우에는, 당해 특정 아이소타입의 IgG 단일클론항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 대조로서 사용함으로써, 당해 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자에 의한 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성의 효과가 검증된다. 상기와 같이 하여 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 높은 것이 검증된 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 적당히 선택된다.

본 발명의 비한정의 일태양에서는 억제형 FcγR에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는 Fc영역의 예로서, 상기 Fc영역의 아미노산 중 EU 넘버링으로 표시되는 238 또는 328의 아미노산이 천연형 Fc영역과 상이한 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역을 바람직하게 들 수 있다. 또한 억제형 Fcγ 수용체에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는 Fc영역으로서 US 2009/0136485에 기재되어 있는 Fc영역 또는 개변도 적당히 선택할 수 있다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서 EU 넘버링으로 표시되는 238의 아미노산이 Asp 또는 328의 아미노산이 Glu 중 어느 하나 이상으로 개변되어 있는 Fc영역을 바람직하게 들 수 있다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro의 Asp로의 치환 및 EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Trp, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Phe, EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 아미노산이 Val, EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 아미노산이 Gln, EU 넘버링으로 표시되는 268번 위치의 아미노산이 Asn, EU 넘버링으로 표시되는 271번 위치의 아미노산이 Gly, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Leu, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Gln, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Glu, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Met, EU 넘버링으로 표시되는 239번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 아미노산이 Ala, EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치의 아미노산이 Trp, EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치의 아미노산이 Tyr, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Ala, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Glu, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Leu, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Met, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Tyr, EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 아미노산이 Lys, EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 아미노산이 Arg, EU 넘버링으로 표시되는 233번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 268번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 268번 위치의 아미노산이 Glu, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Ser, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Thr, EU 넘버링으로 표시되는 323번 위치의 아미노산이 Ile, EU 넘버링으로 표시되는 323번 위치의 아미노산이 Leu, EU 넘버링으로 표시되는 323번 위치의 아미노산이 Met, EU 넘버링으로 표시되는 296번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Ala, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Asn, EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 아미노산이 Met 중 어느 하나 이상으로 개변되어 있는 Fc영역을 바람직하게 들 수 있다.

(양태 3) Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 다른 쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합능 활성을 갖지 않는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자

양태 3의 항원 결합 분자는 1분자의 FcRn과 1분자의 FcγR에 결합함으로써 3자 복합체를 형성할 수 있으나, 2분자의 FcRn과 1분자의 FcγR의 4자를 포함하는 헤테로 복합체는 형성하지 않는다(도 51). 본 양태 3의 항원 결합 분자에 포함되는, Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 다른 쪽의 폴리펩티드가 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합능 활성을 갖지 않는 Fc영역으로서, 이중 특이성 항체(bispecific 항체)를 기원으로 하는 Fc영역도 적당히 사용될 수 있다. 이중 특이성 항체란 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 2종류의 항체이다. IgG형의 이중 특이성 항체는 IgG 항체를 생산하는 하이브리도마 2종을 융합함으로써 생성되는 hybrid hybridoma(quadroma)에 의해 분비시키는 것이 가능하다(Milstein등(Nature (1983) 305, 537-540).

상기 양태 3의 항원 결합 분자를 상기 항체의 항목에서 기재된 바와 같은 재조합 수법을 사용하여 제조하는 경우, 목적의 2종의 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 세포에 도입하고 그들을 공발현시키는 방법이 채용될 수 있다. 그러나 제조되는 Fc영역은 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 다른 쪽의 폴리펩티드가 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합능 활성을 갖지 않는 Fc영역과, Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 양쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역과, Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 양쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 Fc영역이, 2：1：1의 분자 수의 비율로 존재하는 혼합물이 된다. 3종류의 IgG로부터 목적의 조합의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 정제하는 것은 곤란하다.

이러한 재조합 수법을 사용하여 양태 3의 항원 결합 분자를 제조할 때, Fc영역을 구성하는 CH3 도메인에 적당한 아미노산 치환의 개변을 가함으로써 헤테로 조합의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 우선적으로 분비될 수 있다. 구체적으로는 한쪽 중쇄의 CH3 도메인에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob(「돌기」의 의미))로 치환하고, 다른 한쪽 중쇄의 CH3 도메인에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole(「공극」의 의미))로 치환함으로써, 돌기가 공극 내에 배치될 수 있도록 하여 이종 H쇄 형성의 촉진 및 동종 H쇄 형성의 저해를 일으키는 방법이다(WO1996027011, Ridgway등(Protein Engineering (1996) 9, 617-621), Merchant등(Nat. Biotech. (1998) 16, 677-681)).

또한 폴리펩티드의 회합 또는 폴리펩티드에 의해 구성되는 이종 다량체 회합의 제어방법을 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 회합에 이용함으로써 이중 특이성 항체를 제작하는 기술도 알려져 있다. 즉 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드 내의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 개변함으로써 동일 서열을 갖는 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드의 회합이 저해되어, 서열이 상이한 2개의 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드 회합체가 형성되도록 제어하는 방법이 이중 특이성 항체의 제작에 채용될 수 있다(WO2006/106905). 이러한 방법도 본 발명의 양태 3의 항원 결합 분자를 제조할 때 채용될 수 있다.

본 발명의 비한정의 일태양에 있어서의 Fc영역으로서는 상기 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드가 적당히 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 349번 위치의 아미노산이 Cys, 366번 위치의 아미노산이 Trp이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 356번 위치의 아미노산이 Cys, 366번 위치의 아미노산이 Ser, 368번 위치의 아미노산이 Ala, 407번 위치의 아미노산이 Val인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다.

그 밖의 본 발명의 비한정의 일태양에 있어서의 Fc영역으로서는 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 409번 위치의 아미노산이 Asp이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 399번 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다. 상기 태양에서는 409번 위치의 아미노산은 Asp 대신에 Glu, 399번 위치의 아미노산은 Lys 대신에 Arg일 수도 있다. 또한 399번 위치의 아미노산인 Lys에 더하여 360번 위치의 아미노산으로서 Asp 또는 392번 위치의 아미노산으로서 Asp도 적합하게 추가될 수 있다.

본 발명의 다른 비한정의 일태양에 있어서의 Fc영역으로서는 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 370번 위치의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 357번 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다.

본 발명의 또 다른 비한정의 일태양에 있어서의 Fc영역으로서는 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 439번 위치의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 356번 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다.

본 발명의 다른 비한정의 일태양에 있어서의 Fc영역으로서는 이들이 조합된 아래의 태양 중 어느 하나；

Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 409번 위치의 아미노산이 Asp, 370번 위치의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 399번 위치의 아미노산이 Lys, 357번 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드(본 태양에서는 EU 넘버링으로 표시되는 370번 위치의 아미노산인 Glu 대신에 Asp여도 되고, EU 넘버링으로 표시되는 370번 위치의 아미노산인 Glu 대신에 392번 위치의 아미노산인 Asp여도 된다.),

Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 409번 위치의 아미노산이 Asp, 439번 위치의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 399번 위치의 아미노산이 Lys, 356번 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드(본 태양에서는 EU 넘버링으로 표시되는 439번 위치의 아미노산인 Glu 대신에 360번 위치의 아미노산인 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 392번 위치의 아미노산인 Asp 또는 439번 위치의 아미노산인 Asp여도 된다),

Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 370번 위치의 아미노산이 Glu, 439번 위치의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 357번 위치의 아미노산이 Lys, 356번 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드 또는

Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 409번 위치의 아미노산이 Asp, 370번 위치의 아미노산이 Glu, 439번 위치의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 399번 위치의 아미노산이 Lys, 357번 위치의 아미노산이 Lys, 356번 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드(본 태양에서는 EU 넘버링으로 표시되는 370번 위치의 아미노산을 Glu로 치환하지 않아도 되고, 또한 370번 위치의 아미노산을 Glu로 치환하지 않고, 439번 위치의 아미노산인 Glu 대신에 Asp 또는 439번 위치의 아미노산인 Glu 대신에 392번 위치의 아미노산인 Asp여도 된다),

가 적합하게 사용된다.

또한 본 발명의 다른 비한정의 일태양에 있어서 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 356번 위치의 아미노산이 Lys이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 435번 위치의 아미노산이 Arg, 439번 위치의 아미노산이 Glu인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드도 적합하게 사용된다.

이들 양태 1~3의 항원 결합 분자는 4자 복합체를 형성할 수 있는 항원 결합 분자와 비교하여 모두 면역원성을 저하시키고 또한 혈장 중 체류성을 향상시키는 것이 가능할 것으로 기대된다.

Fc영역의 아미노산의 개변을 위해서는 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지의 방법이 적당히 채용될 수 있다. 또한 천연의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환하는 아미노산의 개변방법으로서, 복수의 공지의 방법도 채용될 수 있다(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). 예를 들면 종지 코돈의 하나인 UAG 코돈(앰버 코돈)의 상보적 앰버 서프레서 tRNA에 비천연 아미노산이 결합된 tRNA가 포함되는 무세포 번역계 시스템(Clover Direct(Protein Express)) 등도 적합하게 사용된다.

상기와 같은 아미노산의 변이가 가해진 Fc영역의 개변체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와, 상기와 같이 선택된 조건에 따라 결합 활성이 변화되는 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 인프레임으로 연결된 중쇄를 갖는 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 개변체의 일태양으로서 제작된다.

본 발명에 의해 Fc영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 인프레임으로 연결된 이온 농도의 조건에 따라 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 작용 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 것을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법이 제공된다. 또한 벡터 중에 사전에 작용 가능하게 연결된 Fc영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드와, 이온 농도의 조건에 따라 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 작용 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 것을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법도 또한 제공된다.

의약 조성물

가용형 항원에 대한 기존의 중화 항체를 투여하면 항원이 항체에 결합함으로써 혈장 중에서의 지속성이 높아지는 것이 예상된다. 항체는 일반적으로 긴 반감기(1주간~3주간)를 갖는 한편으로, 항원은 일반적으로 짧은 반감기(1일 이하)를 갖는다. 그 때문에 혈장 중에서 항체에 결합한 항원은 항원 단독으로 존재하는 경우에 비해 현저히 긴 반감기를 갖게 된다. 그 결과로서, 기존의 중화 항체를 투여함으로써 혈장 중의 항원 농도의 상승이 일어난다. 이러한 사례는 다양한 가용형 항원을 표적으로 한 중화 항체에 있어서 보고되어 있고, 일례를 들자면 IL-6(J. Immunotoxicol. (2005) 3, 131-139), amyloid beta(mAbs (2010) 2 (5), 1-13), MCP-1(ARTHRITIS & RHEUMATISM (2006) 54,2387-2392), hepcidin(AAPS J. (2010) 4, 646-657), sIL-6 receptor(Blood (2008) 112 (10), 3959-64) 등이 있다. 기존의 중화 항체의 투여에 의해 베이스라인으로부터 대략 10배~1000배 정도(상승 정도는 항원에 따라 상이)의 혈장 중 총항원 농도의 상승이 보고되어 있다. 여기서 혈장 중 총항원 농도란 혈장 중에 존재하는 항원의 총량으로서의 농도를 의미하고 있고, 즉 항체 결합형과 항체 비결합형의 항원 농도의 합으로서 표시된다. 이러한 가용형 항원을 표적으로 한 항체 의약에 있어서는 혈장 중 총항원 농도의 상승이 일어나는 것은 바람직하지 않다. 왜냐하면 가용형 항원을 중화하기 위해서는 적어도 혈장 중 총항원 농도를 상회하는 혈장 중 항체농도가 필요하기 때문이다. 즉 혈장 중 총항원 농도가 10배~1000배 상승한다는 것은, 그것을 중화하기 위한 혈장 중 항체농도(즉 항체 투여량)로서도 혈장 중 총항원 농도의 상승이 일어나지 않는 경우에 비해 10배~1000배가 필요해지는 것을 의미한다. 한편으로 기존의 중화 항체와 비교하여 혈장 중 총항원 농도를 10배~1000배 저하할 수 있다면 항체의 투여량을 같은 분량 줄이는 것이 가능하다. 이와 같이, 혈장 중으로부터 가용형 항원을 소실시켜서 혈장 중 총항원 농도를 저하시킬 수 있는 항체는 기존의 중화 항체와 비교하여 현저히 유용성이 높다.

본 발명은 특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 예를 들면 pH 산성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮도록, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 부가적으로 pH 중성역의 조건하에서 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 항체 정상영역 등의 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자가 생체에 투여되었을 때에 생체 중의 세포로의 흡수가 촉진됨으로써, 1분자의 항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 수가 증가하는 이유 및 혈장 중 항원 농도의 소실이 촉진되는 이유는 예를 들면 아래의 같이 설명하는 것이 가능하다.

예를 들면 막항원에 결합하는 항체가 생체내에 투여된 경우, 당해 항체는 항원에 결합한 후 항원에 결합한 채로 항원과 함께 내재화(internalization)에 의해 세포내의 엔도솜에 흡수된다. 그 후, 항원에 결합한 채로 리소좀으로 이행된 항체는 항원과 함께 리소좀에 의해 분해된다. 내재화를 매개로 한 혈장 중으로부터의 소실은 항원 의존적인 소실이라 불리고 있고, 대부분의 항체 분자에서 보고되어 있다(Drug Discov Today. 2006 Jan;11(1-2):81-8). 1분자의 IgG 항체가 2가로 항원에 결합한 경우, 1분자의 항체가 2분자의 항원에 결합한 상태로 내재화되어 그대로 리소좀에서 분해된다. 따라서, 통상의 항체의 경우 1분자의 IgG 항체가 3분자 이상의 항원에 결합하는 것은 불가능하다. 예를 들면, 중화 활성을 갖는 1분자의 IgG 항체의 경우 3분자 이상의 항원을 중화하는 것은 불가능하다.

IgG 분자의 혈장 중 체류성이 비교적 긴(소실이 느린) 것은 IgG 분자의 샐비지 수용체로서 알려져 있는 인간 FcRn이 기능하고 있기 때문이다. 음세포작용에 의해 엔도솜으로 흡수된 IgG 분자는 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 엔도솜 내에 발현하고 있는 인간 FcRn에 결합한다. 인간 FcRn에 결합할 수 없었던 IgG 분자는 그 후 이행되는 리소좀 내에서 분해된다. 한편 인간 FcRn에 결합한 IgG 분자는 세포 표면으로 이행된다. 혈장 중의 중성 조건하에 있어서 IgG 분자는 인간 FcRn으로부터 해리되기 때문에 당해 IgG 분자는 재차 혈장 중으로 리사이클된다.

또한 항원 결합 분자가 가용형 항원에 결합하는 항체의 경우 생체내에 투여된 항체는 항원에 결합하고, 그 후, 항체는 항원에 결합한 채로 세포내에 흡수된다. 세포내에 흡수된 항체의 대부분은 엔도솜 내에서 FcRn에 결합한 후에 세포 표면으로 이행된다. 혈장 중의 중성 조건하에 있어서 항체는 인간 FcRn으로부터 해리되기 때문에 세포외로 방출된다. 그러나 pH 등의 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되지 않는 통상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항체는 항원과 결합한 채로 세포외로 방출되기 때문에 재차 항원에 결합하는 것은 불가능하다. 따라서, 막항원에 결합하는 항체와 마찬가지로, pH 등의 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되지 않는 통상의 1분자의 IgG 항체가 3분자 이상의 항원에 결합하는 것은 불가능하다.

항원에 대해 혈장 중의 pH 중성역의 조건하에 있어서는 강하게 결합하여, 엔도솜 내의 pH 산성역의 조건하에 있어서 항원으로부터 해리되는 pH 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체(항원에 대해 pH 중성역의 조건하에서 결합하고 pH 산성역의 조건하에서 해리되는 항체)나 항원에 대해 혈장 중의 고칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서는 강하게 결합하고, 엔도솜 내의 저칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서 항원으로부터 해리되는 칼슘 이온 농도 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체(항원에 대해 고칼슘 이온 농도의 조건하에서 결합하고 저칼슘 이온 농도의 조건하에서 해리되는 항체)는 엔도솜 내에서 항원으로부터 해리되는 것이 가능하다. pH 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체나 칼슘 이온 농도 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체는 항원을 해리한 후에 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클되면 재차 항원에 결합하는 것이 가능하다. 그 때문에 1분자의 항체가 복수의 항원 분자에 반복해서 결합하는 것이 가능해진다. 또한 항원 결합 분자에 결합한 항원은 엔도솜 내에서 항체로부터 해리됨으로써 혈장 중으로 리사이클되지 않고 리소좀 내에서 분해된다. 이러한 항원 결합 분자를 생체에 투여함으로써 항원의 세포내로의 흡수가 촉진되어 혈장 중의 항원 농도를 저하시키는 것이 가능해진다.

항원에 대해 혈장 중의 pH 중성역의 조건하에 있어서는 강하게 결합하고, 엔도솜 내의 pH 산성역의 조건하에 있어서 항원으로부터 해리되는 pH 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체(항원에 대해 pH 중성역의 조건하에서 결합하고 pH 산성역의 조건하에서 해리되는 항체)나 항원에 대해 혈장 중의 고칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서는 강하게 결합하고, 엔도솜 내의 저칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서 항원으로부터 해리되는 칼슘 이온 농도 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체(항원에 대해 고칼슘 이온 농도의 조건하에서 결합하고 저칼슘 이온 농도의 조건하에서 해리되는 항체)에 pH 중성역의 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합능을 부여함으로써, 항원 결합 분자가 결합하는 항원의 세포내로의 흡수가 더욱 촉진된다. 즉 이러한 항원 결합 분자의 생체로의 투여에 의해 항원의 소실이 촉진되어 혈장 중의 항원 농도를 저하시키는 것이 가능해진다. pH 의존적인 항원에 대한 결합능 또는 칼슘 이온 농도 의존적인 항원에 대한 결합능을 갖지 않는 통상의 항체 및 그 항체-항원 복합체는 비특이적인 엔도시토시스에 의해 세포에 흡수되고, 엔도솜 내의 산성 조건하에서 FcRn에 결합함으로써 세포 표면으로 전송되어, 세포 표면의 중성 조건하에서 FcRn으로부터 해리됨으로써 혈장 중으로 리사이클된다. 그 때문에 충분히 pH 의존적으로 항원에 대해 결합하거나(pH 중성역의 조건하에서 결합하고 pH 산성역의 조건하에서 해리되거나) 또는 충분히 칼슘 이온 농도 의존적으로 항원에 대해 결합하는(고칼슘 이온 농도의 조건하에서 결합하고 저칼슘 이온 농도의 조건하에서 해리되는) 항체가 혈장 중에서 항원에 결합하고, 엔도솜 내에 있어서 결합해 있는 항원을 해리하는 경우, 항원의 소실속도는 비특이적인 엔도시토시스에 의한 항체 및 그 항체-항원 복합체의 세포로의 흡수속도와 동등해질 것으로 생각된다. 항체와 항원 간 결합의 pH 의존성 또는 칼슘 이온 농도 의존성이 불충분한 경우는 엔도솜 내에 있어서 항체로부터 해리되지 않는 항원도 항체와 함께 혈장 중으로 리사이클되어 버리는데, pH 또는 칼슘 농도 의존성이 충분한 경우는 항원의 소실속도는 비특이적인 엔도시토시스에 의한 세포로의 흡수속도가 율속이 된다. 또한 FcRn은 항체를 엔도솜 내로부터 세포 표면으로 전송하기 때문에 FcRn의 일부는 세포 표면에도 존재하고 있을 것으로 생각된다.

통상 항원 결합 분자의 일태양인 IgG형 면역 글로불린은 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 거의 갖지 않는다. 본 발명자들은 pH 중성역에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 IgG형 면역 글로불린은 세포 표면에 존재하는 FcRn에 결합하는 것이 가능하고, 세포 표면에 존재하는 FcRn에 결합함으로써 당해 IgG형 면역 글로불린이 FcRn 의존적으로 세포에 흡수되는 것으로 생각되었다. FcRn을 매개로 한 세포로의 흡수속도는 비특이적인 엔도시토시스에 의한 세포로의 흡수속도보다도 빠르다. 그 때문에 pH 중성역에 있어서 FcRn에 대한 결합능을 부여함으로써 항원 결합 분자에 의한 항원의 소실속도를 추가로 빠르게 하는 것이 가능할 것으로 생각된다. 즉 pH 중성역에 있어서 FcRn에 대한 결합능을 갖는 항원 결합 분자는 천연형 IgG형 면역 글로불린보다도 신속하게 항원을 세포내로 보내, 엔도솜 내에서 항원을 해리하고, 재차 세포 표면 내지는 혈장 중으로 리사이클되어, 거기서 재차 항원에 결합하고, 또한 FcRn을 매개로 세포내에 흡수된다. pH 중성역에 있어서 FcRn에 대한 결합능을 높게 함으로써 이 사이클의 회전속도를 빠르게 하는 것이 가능해지기 때문에 혈장 중으로부터 항원을 소실시키는 속도가 빨라진다. 또한 항원 결합 분자의 pH 산성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성을 pH 중성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 저하시킴으로써 추가로 혈장 중으로부터 항원을 소실시키는 속도를 높이는 것이 가능하다. 또한 이 사이클의 회전속도를 빠르게 하는 결과 생기는 그 사이클 수의 증대에 의해 1분자의 항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 분자 수도 많아질 것으로 생각된다. 본 발명의 항원 결합 분자는 항원 결합 도메인과 FcRn 결합 도메인으로 이루어지고, FcRn 결합 도메인은 항원에 대한 결합에 영향을 주는 경우는 없기 때문에, 또한 전술한 메커니즘으로부터 생각해도 항원의 종류에 의존하는 경우가 없어, 항원 결합 분자의 pH 산성역 또는 저칼슘 이온 농도의 조건 등의 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성(결합능)을 pH 중성역 또는 고칼슘 이온 농도의 조건 등의 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성(결합능)보다 저하 및/또는 혈장 중에서의 pH에 있어서의 FcRn으로의 결합 활성을 증대시킴으로써, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시켜 항원의 소실속도를 빠르게 하는 것이 가능할 것으로 생각된다. 따라서 본 발명의 항원 결합 분자는 항원이 초래하는 부작용의 저감, 항체 투여량의 상승, 항체의 생체내 동태의 개선 등의 점에서 종래의 치료용 항체보다도 우수한 효과를 발휘할 것으로 생각된다.

도 1은 기존의 중화 항체에 비해 중성 pH에 있어서의 FcRn으로의 결합을 증강시킨 pH 의존적 항원 결합 항체의 투여에 의해 혈장 중으로부터 가용형 항원이 소실되는 메커니즘을 나타내고 있다. pH 의존적 항원 결합능을 갖지 않는 기존의 중화 항체는 혈장 중에서 가용형 항원에 결합한 후, 세포와의 비특이적인 상호작용에 의해 완만하게 흡수된다. 세포내로 흡수된 중화 항체와 가용형 항원의 복합체는 산성의 엔도솜으로 이행하여, FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클된다. 한편 중성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 증강시킨 pH 의존적 항원 결합 항체는 혈장 중에서 가용형 항원에 결합한 후, 세포막 상에 FcRn을 발현하고 있는 세포 중으로 신속하게 흡수된다. 여기서 pH 의존적 항원 결합 항체에 결합한 가용형 항원은 산성의 엔도솜 중에서 pH 의존적 결합능에 의해 항체로부터 해리된다. 항체로부터 해리된 가용형 항원은 그 후 리소좀으로 이행하여, 단백질 분해활성에 의한 분해를 받는다. 한편 가용형 항원을 해리한 항체는 FcRn에 의해 세포막 상으로 리사이클되어 재차 혈장 중으로 방출된다. 이와 같이 리사이클되어 프리가 된 항체는 다른 가용형 항원으로 재차 결합할 수 있다. 이러한 FcRn을 매개로 한 세포내로의 흡수, 가용형 항원의 해리와 분해, 항체의 리사이클 등의 사이클을 반복함으로써, 이러한 중성 조건하에서의 FcRn 결합을 증강시킨 pH 의존적 항원 결합 항체는 대량의 가용형 항원을 리소좀으로 이행시켜서 혈장 중 총항원 농도를 저하시킬 수 있다.

또한 즉 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자, 본 발명의 개변방법에 의해 제작된 항원 결합 분자, 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자는 그 투여에 의해 통상의 항원 결합 분자와 비교하여 혈장 중의 항원 농도를 저하시키는 작용이 높을 뿐 아니라, 투여된 생체에 의한 면역응답이나 당해 생체 중의 약물동태 등이 개변되어 있는 것으로부터 의약 조성물로서 유용하다. 본 발명의 의약 조성물에는 의약적으로 허용되는 담체가 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서 의약 조성물이란 통상 질환의 치료 또는 예방 또는 검사·진단을 위한 약제를 말한다.

본 발명의 의약 조성물은 당업자에게 공지의 방법을 사용하여 제제화될 수 있다. 예를 들면, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용 가능한 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화함으로써 제제화될 수 있다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 설정된다.

주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 통상의 제제 실시에 따라 처방될 수 있다. 주사용 수용액으로서는 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약(예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨)을 포함하는 등장액을 들 수 있다. 적절한 용해 보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트80(TM), HCO-50 등)가 병용될 수 있다.

유성액으로서는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산 벤질 및/ 또는 벤질알코올도 병용될 수 있다. 또한 완충제(예를 들면, 인산염 완충액 및 초산나트륨 완충액), 무통화제(예를 들면, 염산프로카인), 안정제(예를 들면, 벤질알코올 및 페놀), 산화 방지제와 배합될 수 있다. 조제된 주사액은 통상 적절한 앰플에 충전된다.

본 발명의 의약 조성물은 바람직하게는 비경구 투여에 의해 투여된다. 예를 들면, 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여형의 조성물이 투여된다. 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여될 수 있다.

투여방법은 환자의 연령, 증상에 따라 적당히 선택될 수 있다. 항원 결합 분자를 함유하는 의약 조성물의 투여량은 예를 들면, 1회 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎~1000 ㎎의 범위로 설정될 수 있다. 또는 예를 들면, 환자당 0.001~100000 ㎎의 투여량이 설정될 수 있으나, 본 발명은 이들 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량 및 투여방법은 환자의 체중, 연령, 증상 등에 따라 변동되나, 당업자라면 그들의 조건을 고려하여 적당한 투여량 및 투여방법을 설정하는 것이 가능하다.

또한 본 발명은 적어도 본 발명의 항원 결합 분자를 포함하는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 그 키트에는 기타 약학적으로 허용되는 담체, 매체, 사용방법을 기재한 지시서 등을 팩키징해 두는 것도 가능하다.

또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 유효성분으로 함유하는 항원 결합 분자의 약물동태 개선제 또는 항원 결합 분자의 면역원성 저감제에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 대상(피험자)에게 투여하는 공정을 포함하는 면역 염증성 질환의 치료방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자의 약물동태 개선제, 또는 항원 결합 분자의 면역원성 저감제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자에 관한 것이다.

또한 본 발명에서 기재되어 있는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산은 번역 후에 수식(예를 들면, N 말단의 글루타민의 피로글루타밀화에 의한 피로글루타민산으로의 수식은 당업자에게 잘 알려진 수식이다)을 받는 경우도 있으나, 그와 같이 아미노산이 번역 후 수식된 경우이더라도 당연히 본 발명에서 기재되어 있는 아미노산 서열에 포함된다.

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로써 본 명세서에 포함된다.

실시예

이하 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕중성 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 증강시키는 것에 의한 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 인간 항체의 혈장 중 체류성 및 면역원성에 대한 영향

혈장 중으로부터의 가용형 항원을 소실시키기 위해 FcRn과 상호작용하는 항체 등의 항원 결합 분자의 Fc영역(Nat. Rev. Immunol. (2007) 7 (9), 715-25) 등의 FcRn 결합 도메인에 pH 중성역에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 것이 중요하다. 참고 실시예 5에서 나타낸 바와 같이, FcRn 결합 도메인의 pH 중성역에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인 변이(아미노산 치환)체가 연구되어 있다. Fc 변이체로서 창생된 F1~F600의 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성이 평가되어, pH 중성역에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성을 증강시킴으로써 혈장 중으로부터의 항원의 소실을 가속시키는 것이 확인되었다. 이러한 Fc 변이체를 의약품으로서 개발하기 위해서는 약리적인 성질(FcRn의 결합 증강에 의한 혈장 중으로부터의 항원 소실의 가속 등)뿐 아니라, 항원 결합 분자의 안정성과 순도, 항원 결합 분자의 생체내에 있어서의 혈장 중 체류성이 우수하고, 면역원성이 낮은 것이 바람직하다.

중성 조건하에 있어서 FcRn에 결합함으로써 항체의 혈장 중 체류성이 악화되는 것이 알려져 있다. 중성 조건하에 있어서 FcRn에 결합해 버리면, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 FcRn에 결합함으로써 세포 표면 상으로 되돌아가더라도, 중성 조건하의 혈장 중에 있어서 IgG 항체가 FcRn으로부터 해리되지 않으면 IgG 항체가 혈장 중으로 리사이클되지 않기 때문에 반대로 혈장 중 체류성은 손상되게 된다. 예를 들면 IgG1에 대해 아미노산 치환을 도입함으로써 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서 마우스 FcRn에 대한 결합이 확인된 항체를 마우스에 투여한 경우, 항체의 혈장 중 체류성이 악화되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 10). 그러나 한편으로 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합이 확인된 항체를 게잡이원숭이에게 투여한 경우, 항체의 혈장 중 체류성은 개선되는 경우는 없고, 혈장 중 체류성에 변화가 확인되지 않은 것이 보고되어 있다(비특허문헌 10, 11 및 12).

또한 FcRn은 항원 제시 세포에 발현되고 있어 항원 제시에 관여하고 있는 것이 보고되어 있다. 항원 결합 분자는 아니지만 미엘린 염기성 단백질(MBP)에 마우스 IgG1의 Fc영역을 융합시킨 단백질(이하 MBP-Fc)의 면역원성을 평가한 보고에 있어서, MBP-Fc 특이적으로 반응하는 T세포는 MBP-Fc의 존재하에서 배양함으로써 활성화, 증식이 일어난다. 여기서 MBP-Fc의 Fc영역에 FcRn으로의 결합을 증강시키는 개변을 가함으로써, in vitro에 있어서는 항원 제시 세포에 발현하는 FcRn을 매개로 한 항원 제시 세포로의 흡수가 증대됨으로써 T세포의 활성화는 증강되는 것이 알려져 있다. 그러나, FcRn으로의 결합을 증강시키는 개변을 가함으로써 혈장 중 체류성이 악화되는 것으로부터 in vivo에 있어서는 T세포의 활성화가 반대로 감약되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 43).

이와 같이, 중성 조건하에 있어서의 FcRn의 결합을 증강시키는 것에 의한 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성 및 면역원성에 대한 영향은 충분히 조사되어 있지 않다. 항원 결합 분자를 의약품으로서 개발하는 경우, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성은 긴 쪽이 바람직하고, 또한 면역원성은 낮은 쪽이 바람직하다.

(1-1) 인간 IL-6 수용체 결합 인간 항체의 제작

이에 pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성의 평가 및 그의 항원 결합 분자의 면역원성의 평가를 행하기 위해, pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 인간 IL-6 수용체 결합 인간 항체로서, VH3-IgG1(서열번호：35)과 VL3-CK(서열번호：36)로 이루어지는 Fv4-IgG1, VH3-IgG1-F1(서열번호：37)과 VL3-CK로 이루어지는 Fv4-IgG1-F1, VH3-IgG1-F157(서열번호：38)과 VL3-CK로 이루어지는 Fv4-IgG1-F157, VH3-IgG1-F20(서열번호：39)과 VL3-CK로 이루어지는 Fv4-IgG1-F20, VH3-IgG1-F21(서열번호：40)과 VL3-CK로 이루어지는 Fv4-IgG1-F21이 참고 실시예 1 및 참고 실시예 2에 나타낸 방법에 의해 제작되었다.

(1-2) 마우스 FcRn에 대한 결합의 속도론적 해석

중쇄로서 VH3-IgG1 또는 VH3-IgG1-F1을 포함하고 경쇄로서 L(WT)-CK(서열번호：41)를 포함하는 항체가 참고 실시예 2에 나타낸 방법으로 제작되어, 하기와 같이 마우스 FcRn에 대한 결합 활성이 평가되었다.

Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 마우스 FcRn과 항체의 속도론적 해석을 행하였다. 센서칩 CM4(GE Healthcare) 상에 아민커플링법으로 프로테인 L(ACTIGEN)을 적당량 고정화하고, 거기에 목적의 항체를 포착시켰다. 다음으로 FcRn 희석액과 러닝 버퍼(참조 용액으로서)를 인젝션하고, 센서칩 상에 포착시킨 항체에 마우스 FcRn을 상호작용시켰다. 러닝 버퍼에는 50 mmol/L 인산나트륨, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v) Tween20, pH 7.4를 사용하고, FcRn의 희석에도 각각의 버퍼가 사용되었다. 센서칩의 재생에는 10 mmol/L 글리신-HCl, pH 1.5가 사용되었다. 측정은 모두 25℃에서 실시되었다. 측정으로 얻어진 센서그램으로부터 산출된 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 k_d(1/s)를 토대로 각 항체의 마우스 FcRn에 대한 KD(M)가 산출되었다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)가 사용되었다.

그 결과 IgG1의 KD(M)는 검출되지 않은 한편으로 제작된 IgG1-F1의 KD(M)는 1.06E-06(M)이었다. 제작된 IgG1-F1은 pH 중성역(pH 7.4)의 조건하에 있어서 마우스 FcRn에 대한 결합 활성이 증강되어 있는 것이 나타내어졌다.

(1-3) 정상 마우스를 사용한 in vivo PK 시험

제작된 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 인간 항체인 Fv4-IgG1 및 Fv4-IgG1-F1의 정상 마우스를 사용한 PK 시험이 하기의 방법으로 실시되었다. 정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)의 꼬리정맥 또는 배부 피하에 항인간 IL-6 수용체 항체가 1 ㎎/㎏으로 단회 투여되었다. 항인간 IL-6 수용체 항체의 투여 후 5분, 7시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일의 시점에서 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다.

(1-4) ELISA법에 의한 혈장 중 항인간 IL-6 수용체 항체농도의 측정

마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체농도는 ELISA법으로 측정되었다. 먼저, Anti-Human IgG(γ-chain specific)F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA)를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 Anti-Human IgG 고상화 플레이트가 제작되었다. 혈장 중 농도로서 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 ㎍/mL의 항인간 IL-6 수용체 항체를 포함하는 검량선 시료와 100배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료가 조제되었다. 이들의 검량선 시료 및 혈장 측정시료 100 μL에 20 ng/mL의 가용형 인간 IL-6 수용체가 200 μL 첨가된 혼합액을 실온에서 1시간 정치시켰다. 그 후 당해 혼합액이 각 웰에 분주된 Anti-Human IgG 고상화 플레이트를 추가로 실온에서 1시간 정치시켰다. 그 후 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)와 실온에서 1시간 반응시키고, 추가로 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 실온에서 1시간 반응시킨 반응액의 발색반응이 TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용해서 행해졌다. 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)를 첨가함으로써 반응이 정지된 각 웰의 반응액의 450 nm의 흡광도가 마이크로플레이트 리더로 측정되었다. 마우스 혈장 중의 항체농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출되었다.

pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 인간 항체를 정상 마우스에 정맥내 또는 피하 투여한 후의 혈장 중의 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체농도를 도 2에 나타내었다. 도 2의 결과로부터, 정맥내에 투여된 Fv4-IgG1과 비교하여 중성 조건하에 있어서 마우스 FcRn으로의 결합이 증강된 Fv4-IgG1-F1이 정맥내에 투여되었을 때의 혈장 중 체류성은 악화되는 것이 나타내어졌다. 한편 피하에 투여된 Fv4-IgG1은 정맥내에 투여되었을 때와 동등한 혈장 중 체류성을 나타내었으나, Fv4-IgG1-F1이 피하에 투여된 경우에 있어서는 투여 7일 후 이후에서 마우스 항Fv4-IgG1-F1 항체가 생산된 것에 의한 것으로 생각되는 급격한 혈장 중 농도의 저하가 확인되고, 투여 후 14일째의 시점에서 혈장 중에 Fv4-IgG1-F1은 검출되지 않았다. 이 결과로부터, 항원 결합 분자의 중성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 증강시킴으로써 혈장 중 체류성 및 면역원성이 악화되는 것이 확인되었다.

〔실시예 2〕pH 중성역의 조건하에 있어서의 마우스 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 인간 IL-6 수용체 결합 마우스 항체의 제작

아래의 방법에 의해 pH 중성역의 조건하에 있어서의 마우스 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 마우스 항체가 제작되었다.

(2-1) 인간 IL-6 수용체 결합 마우스 항체의 제작

마우스 항체의 가변영역으로서 인간 IL-6R으로의 결합능을 갖는 마우스 항체인 mouse PM-1(Sato K, et al. Cancer Res. (1993) 53(4), 851-856)의 아미노산 서열이 사용되었다. 그 이후 mouse PM-1의 중쇄 가변영역은 mPM1H(서열번호：42), 경쇄 가변영역은 mPM1L(서열번호：43)로 표기된다.

또한 중쇄 정상영역으로서 천연형 마우스 IgG1(서열번호：44, 이후는 mIgG1으로 표기된다), 경쇄 정상영역으로서 천연형 마우스 kappa(서열번호：45, 이후는 mk1으로 표기된다)가 사용되었다.

참고 실시예 1의 방법에 따라 중쇄 mPM1H-mIgG1(서열번호：46) 및 경쇄 mPM1L-mk1(서열번호：47)의 염기서열을 갖는 발현 벡터가 제작되었다. 또한 참고 실시예 2의 방법에 따라 mPM1H-mIgG1과 mPM1L-mk1으로 이루어지는 인간 IL-6R 결합 마우스 항체인 mPM1-mIgG1이 제작되었다.

(2-2) pH 중성역의 조건하에서 마우스 FcRn으로의 결합능을 갖는 mPM1 항체의 제작

제작된 mPM1-mIgG1은 천연형 마우스 Fc영역을 포함하는 마우스 항체로, pH 중성역 조건하에서의 마우스 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는다. 이에 pH 중성역 조건하에서의 마우스 FcRn에 대한 결합 활성을 부여하기 위해 mPM1-mIgG1의 중쇄 정상영역에 아미노산 개변이 도입되었다.

구체적으로는 mPM1H-mIgG1의 EU 넘버링으로 표시되는 252번 위치의 Thr이 Tyr로 치환된 아미노산 치환, EU 넘버링으로 표시되는 256번 위치의 Thr이 Glu로 치환된 아미노산 치환, EU 넘버링으로 표시되는 433번 위치의 His가 Lys로 치환된 아미노산 치환, EU 넘버링으로 표시되는 434번 위치의 Asn이 Phe로 치환된 아미노산 치환이 가해진 mPM1H-mIgG1-mF3(서열번호：48)가 제작되었다.

마찬가지로, mPM1H-mIgG1의 EU 넘버링으로 표시되는 252번 위치의 Thr이 Tyr로 치환된 아미노산 치환, EU 넘버링으로 표시되는 256번 위치의 Thr이 Glu로 치환된 아미노산 치환, EU 넘버링으로 표시되는 433번 위치의 His가 Lys로 치환된 아미노산 치환이 가해진 mPM1H-mIgG1-mF14(서열번호：49)가 제작되었다.

또한 mPM1H-mIgG1의 EU 넘버링으로 표시되는 252번 위치의 Thr이 Tyr로 치환된 아미노산 치환, EU 넘버링으로 표시되는 256번 위치의 Thr이 Glu로 치환된 아미노산 치환, EU 넘버링으로 표시되는 434번 위치의 Asn이 Trp로 치환된 아미노산 치환이 가해진 mPM1H-mIgG1-mF38(서열번호：50)이 제작되었다.

참고 실시예 2의 방법을 사용하여 pH 중성역 조건하에서의 마우스 FcRn에 대한 결합을 갖는 마우스 IgG1 항체로서, mPM1H-mIgG1-mF3와 mPM1L-mk1으로 이루어지는 mPM1-mIgG1-mF3가 제작되었다.

(2-3) Biacore에 의한 마우스 FcRn에 대한 결합 활성의 확인

mPM1-mIgG1 또는 mPM1-mIgG1-mF3의 중쇄 및 L(WT)-CK(서열번호：41)의 경쇄를 포함하는 항체가 제작되고, 이들 항체의 pH 7.0에 있어서의 마우스 FcRn에 대한 결합 활성(해리상수 KD)이 측정되었다. 결과를 아래의 표 5에 나타내었다.

〔실시예 3〕Fc영역을 갖는 항원 결합 분자의 FcRn과 FcγR에 대한 결합 실험

실시예 1에 있어서 항원 결합 분자의 중성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 증강시킴으로써 혈장 중 체류성 및 면역원성이 악화되는 것이 확인되었다. 천연형 IgG1은 중성영역에서 인간 FcRn에 대해 결합 활성을 갖지 않기 때문에, 중성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 부여함으로써 혈장 중 체류성 및 면역원성이 악화된 것으로 생각되었다.

(3-1) FcRn 결합 도메인과 FcγR 결합 도메인

항체의 Fc영역에는 FcRn에 대한 결합 도메인과 FcγR에 대한 결합 도메인이 존재한다. FcRn에 대한 결합 도메인은 Fc영역의 2개소에 존재하고, 항체 1분자의 Fc영역에 대해 2분자의 FcRn이 동시에 결합할 수 있는 것이 이미 보고되어 있다(Nature (1994) 372 (6504), 379-383). 한편으로 FcγR에 대한 결합 도메인도 Fc영역의 2개소에 존재하는데, 2분자의 FcγR이 동시에 결합하는 것은 불가능하다고 생각되고 있다. 이는 1분자째의 FcγR이 Fc영역에 결합함으로써 생긴 Fc영역의 구조 변화에 의해 2분자째의 FcγR이 결합할 수 없기 때문이다(J. Biol. Chem. (2001) 276 (19), 16469-16477).

상기와 같이 활성형 FcγR은 수상세포나 NK세포, 마크로파지, 호중구, 지방세포 등의 많은 면역세포의 세포막 상에 발현하고 있다. 또한 FcRn은 인간에 있어서 수상세포, 마크로파지, 단구 등 항원 제시 세포 등의 면역세포에 있어서 발현이 보고되어 있다(J. Immunol. (2001) 166 (5), 3266-3276). 통상의 천연형 IgG1은 pH 중성역에 있어서 FcRn에는 결합하지 못하고, FcγR에만 결합할 수 있는 것으로부터, 천연형 IgG1은 항원 제시 세포에 FcγR/IgG1의 2자 복합체를 형성함으로써 결합한다. FcγR과 FcRn의 세포내 도메인에는 인산화 부위가 존재한다. 일반적으로 세포 표면에 발현하고 있는 수용체의 세포내 도메인의 인산화는 수용체가 회합화함으로써 일어나고, 그 인산화에 의해 수용체의 내재화가 일어난다. 천연형 IgG1이 항원 제시 세포 상에 있어서 FcγR/IgG1의 2자 복합체를 형성해도 FcγR의 세포내 도메인의 회합화는 일어나지 않으나, pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 IgG 분자가 가령 FcγR/2분자의 FcRn/IgG의 4자를 포함하는 복합체를 형성한 경우, FcγR과 FcRn의 3개의 세포내 도메인의 회합화가 일어나기 때문에, 그것에 의해 FcγR/2분자의 FcRn/IgG의 4자를 포함하는 헤테로 복합체의 내재화가 유도될 수 있을 것으로 생각되었다. FcγR/2분자의 FcRn/IgG의 4자를 포함하는 헤테로 복합체의 형성은 FcγR과 FcRn을 모두 발현하는 항원 제시 세포 상에서 일어나는 것으로 생각되고, 그것에 의해 항체 분자가 항원 제시 세포에 흡수되는 혈장 중 체류성이 악화되고, 또한 면역원성이 악화될 수 있을 것으로 생각되었다.

그러나 지금까지 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역 등의 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자가, FcγR과 FcRn을 모두 발현하고 있는 항원 제시 세포 등의 면역세포에 대해 어떠한 형태로 결합해 있는지를 검증한 보고가 없다.

FcγR/2분자의 FcRn/IgG의 4자 복합체를 형성할 수 있는지 여부는 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 FcγR과 FcRn에 대해 동시에 결합할 수 있는지 여부로 판단하는 것이 가능하다. 이에 하기의 방법에 따라 항원 결합 분자가 포함하는 Fc영역의 FcRn과 FcγR에 대한 동시 결합 실험이 실시되었다.

(3-2) Biacore를 사용한 FcRn과 FcγR에 대한 동시 결합의 평가

Biacore T100 또는 T200(GE Healthcare)을 사용하여 인간 또는 마우스 FcRn과 인간 또는 마우스 FcγRs가 항원 결합 분자에 동시에 결합하는지가 평가되었다. Sensor chip CM4(GE Healthcare) 상에 아민커플링법에 의해 고정화된 인간 또는 마우스 FcRn에 피험대상의 항원 결합 분자를 캡쳐시켰다. 다음으로 인간 또는 마우스 FcγRs의 희석액과 블랭크로서 사용된 러닝 버퍼가 주입되고, 센서칩 상의 FcRn에 결합한 항원 결합 분자에 인간 또는 마우스 FcγRs를 상호작용시켰다. 러닝 버퍼로서 50 mmol/L sodium phosphate, 150 mmol/L NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, pH 7.4가 사용되고, FcγRs의 희석에도 이 버퍼가 사용되었다. 센서칩의 재생에는 10 mmol/L Trsi-HCl, pH 9.5가 사용되었다. 결합의 측정은 모두 25℃에서 실시되었다.

(3-3) 인간 IgG, 인간 FcRn, 인간 FcγR 또는 마우스 FcγR의 동시 결합 실험

pH 중성역에 있어서의 조건하에서 인간 FcRn에 대한 결합능을 갖는 인간 항체인 실시예 1에서 제작된 Fv4-IgG1-F157이 인간 FcRn에 결합하는 것과 동시에 각종 인간 FcγR 또는 각종 마우스 FcγR에 결합하는지 여부가 평가되었다.

그 결과 Fv4-IgG1-F157이 인간 FcRn에 결합하는 것과 동시에 인간 FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa(F)에 대해 결합할 수 있는 것이 나타내어졌다(도 3, 4, 5, 6, 7). 또한 Fv4-IgG1-F157은 마찬가지로, 인간 FcRn에 결합하는 것과 동시에 마우스 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII, FcγRIV에 대해서도 결합할 수 있는 것이 나타내어졌다(도 8, 9, 10, 11).

이상의 사실로부터, pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 인간 항체가 인간 FcRn에 결합하는 것과 동시에 인간 FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa(F)나 마우스 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII, FcγRIV 등의 각종 인간 FcγR 및 각종 마우스 FcγR에 대해서도 결합할 수 있는 것이 나타내어졌다.

(3-4) 인간 IgG, 마우스 FcRn, 마우스 FcγR의 동시 결합 실험

pH 중성역에 있어서의 조건하에서 마우스 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 인간 항체인 실시예 1에서 제작된 Fv4-IgG1-F20이 마우스 FcRn에 결합하는 것과 동시에 각종 마우스 FcγR에 결합하는지 여부가 평가되었다.

그 결과 Fv4-IgG1-F20이 마우스 FcRn에 결합하는 것과 동시에 마우스 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII, FcγRIV에 대해 결합할 수 있는 것이 나타내어졌다(도 12).

(3-5) 마우스 IgG, 마우스 FcRn, 마우스 FcγR의 동시 결합 실험

pH 중성역에 있어서의 조건하에서 마우스 FcRn에 대한 결합능을 갖는 마우스 항체인 실시예 2에서 제작된 mPM1-mIgG1-mF3가 마우스 FcRn에 결합하는 것과 동시에 각종 마우스 FcγR에 결합하는지 여부가 평가되었다.

그 결과 mPM1-mIgG1-mF3는 마우스 FcRn에 결합하는 것과 동시에 마우스 FcγRIIb 및 FcγRIII에 대해 결합할 수 있는 것이 나타내어졌다(도 13). 마우스 FcγRI 및 IV에 대해 결합이 확인되지 않은 결과는 마우스 IgG1 항체는 마우스 FcγRI 및 IV에 대해 결합능을 갖지 않는다는 보고(J. Immunol. (2011) 187 (4), 1754-1763))로부터 판단할 때 타당한 결과로 생각된다.

이들 사실로부터, pH 중성역의 조건하에 있어서의 마우스 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 인간 항체 및 마우스 항체는 마우스 FcRn에 결합하는 것과 동시에 각종 마우스 FcγR에 대해서도 결합할 수 있는 것이 나타내어졌다.

이상의 사실로부터, 인간 및 마우스 IgG의 Fc영역에는 FcRn으로의 결합영역과 FcγR으로의 결합영역이 존재하는데, 그들은 서로 간섭하지 않고 1분자의 Fc와 2분자의 FcRn, 1분자의 FcγR의 4자를 포함하는 헤테로 복합체를 형성하는 것이 가능한 것이 나타내어졌다.

항체의 Fc영역이 이러한 헤테로 복합체를 형성할 수 있다고 하는 성질은 지금까지는 보고되어 있지 않고, 금번에 비로소 명확해졌다. 전술한 바와 같이, 항원 제시 세포 상에는 각종 활성형 FcγR 및 FcRn이 발현하고 있어, 항원 결합 분자가 항원 제시 세포 상에서 이러한 4자 복합체를 형성하는 것은 항원 제시 세포에 대한 친화성을 향상시키고, 또한 세포내 도메인을 회합화시킴으로써 내재화 시그날을 증강시켜, 항원 제시 세포로의 흡수가 촉진되는 것이 시사된다. 일반적으로 항원 제시 세포에 흡수된 항원 결합 분자는 항원 제시 세포내의 리소좀에 있어서 분해되어 T세포로 제시된다.

즉 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자는 1분자의 활성형 FcγR과 2분자의 FcRn의 4자를 포함하는 헤테로 복합체를 형성함으로써 항원 제시 세포로의 흡수가 증대되고, 혈장 중 체류성이 악화되며, 또한 면역원성이 악화된 것으로 생각되었다.

그 때문에 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자에 대해 변이를 도입하고, 이러한 4자 복합체를 형성하는 능력이 저하된 항원 결합 분자를 제작하여, 그 항원 결합 분자가 생체에 투여된 경우, 당해 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성이 향상되고, 또한 당해 생체에 의한 면역응답의 야기가 억제될 수 있다(즉 면역원성이 저하될 수 있다). 이러한 복합체를 형성하지 않고 세포내로 흡수되는 항원 결합 분자의 바람직한 양태로서 아래의 3종류를 들 수 있다.

(양태 1) pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자

양태 1의 항원 결합 분자는 2분자의 FcRn에 결합함으로써 3자를 포함하는 복합체를 형성하지만, 활성형 FcγR을 포함한 복합체는 형성하지 않는다.

(양태 2) pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 억제성 FcγR에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자

양태 2의 항원 결합 분자는 2분자의 FcRn과 1분자의 억제성 FcγR에 결합함으로써 이들 4자를 포함하는 복합체를 형성할 수 있다. 그러나 1분자의 항원 결합 분자는 1분자의 FcγR과만 결합할 수 있기 때문에, 1분자의 항원 결합 분자는 억제성 FcγR에 결합한 상태로 다른 활성형 FcγR에 결합하는 것은 불가능하다. 또한 억제성 FcγR에 결합한 상태로 세포내로 흡수된 항원 결합 분자는 세포막 상으로 리사이클되어, 세포내에서의 분해를 회피하는 것이 보고되어 있다(Immunity (2005) 23, 503-514). 즉 억제성 FcγR에 대한 선택적 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자는 면역응답의 원인이 되는 활성형 FcγR을 포함한 복합체를 형성할 수 없을 것으로 생각된다.

(양태 3) FcRn 결합 도메인을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽만 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 다른 한쪽은 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자

양태 3의 항원 결합 분자는 1분자의 FcRn과 1분자의 FcγR에 결합함으로써 3자 복합체를 형성할 수 있지만, 2분자의 FcRn과 1분자의 FcγR의 4자를 포함하는 헤테로 복합체는 형성하지 않는다.

이들 양태 1~3의 항원 결합 분자는 2분자의 FcRn과 1분자의 FcγR의 4자를 포함하는 복합체를 형성할 수 있는 항원 결합 분자와 비교하여 모두 혈장 체류성을 향상시키고 면역원성을 저하시키는 것이 가능할 것으로 기대된다.

〔실시예 4〕pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 인간 및 마우스 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 인간 항체의 혈장 중 체류성의 평가

(4-1) 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다 낮고, pH 의존적으로 인간 IL-6 수용체에 결합하는 항체의 제작

실시예 3에서 나타내어진 3개의 태양 중 양태 1의 항원 결합 분자, 즉 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자가 아래와 같이 제작되었다.

실시예 1에서 제작된 Fv4-IgG1-F21 및 Fv4-IgG1-F157은 pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 pH 의존적으로 인간 IL-6 수용체에 결합하는 항체이다. 이들 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 아미노산 치환에 의해 마우스 FcγR에 대한 결합을 저하시킨 개변체가 제작되었다. 구체적으로는 VH3-IgG1-F21의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 VH3-IgG1-F140(서열번호：51)이 제작되었다. 또한 VH3-IgG1-F157의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 VH3-IgG1-F424(서열번호：52)가 제작되었다.

참고 실시예 2의 방법을 사용하여 이들 중쇄 및 VL3-CK의 경쇄를 포함하는 Fv4-IgG1-F140 및 Fv4-IgG1-F424가 제작되었다.

(4-2) 인간 FcRn 및 마우스 FcγR에 대한 결합 활성의 확인

제작된 VH3-IgG1-F21, VH3-IgG1-F140, VH3-IgG1-F157 또는 VH3-IgG1-F424를 중쇄로서 포함하고 L(WT)-CK를 경쇄로서 포함하는 항체의 pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성(해리상수 KD) 및 pH 7.4에 있어서의 마우스 FcγR에 대한 결합 활성이 하기의 방법을 사용하여 측정되었다.

(4-3) 인간 FcRn에 대한 결합의 속도론적 해석

Biacore T100 또는 T200(GE Healthcare)을 사용하여 인간 FcRn과 상기 항체의 결합의 속도론적 해석을 행하였다. 아민커플링법으로 protein L(ACTIGEN)이 적당량 고정화된 Sensor chip CM4(GE Healthcare)에 피검대상의 항체를 캡쳐시켰다. 다음으로 인간 FcRn의 희석액과 블랭크로서 사용된 러닝 버퍼가 주입되고, 센서칩 상에 캡쳐된 항체에 인간 FcRn을 상호작용시켰다. 러닝 버퍼로서 50 mmol/L sodium phosphate, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v)Tween20, pH 7.0 또는 pH 7.4가 사용되고, 인간 FcRn의 희석에도 각각의 버퍼가 사용되었다. 센서칩의 재생에는 10 mmol/L Glycine-HCl, pH 1.5가 사용되었다. 결합의 측정은 모두 25℃에서 실시되었다. 측정으로 얻어진 센서그램으로부터 산출된 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)를 토대로 각 항체의 인간 FcRn에 대한 해리상수 K_D(M)가 산출되었다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore T100 또는 T200 Evaluation Software(GE Healthcare)가 사용되었다.

그 결과를 아래의 표 6에 나타내었다.

아래의 방법을 사용하여 pH 7.4에 있어서의 마우스 FcγR으로의 결합 활성의 측정을 실시하였다.

(4-4) 마우스 FcγR에 대한 결합 활성의 평가

Biacore T100 또는 T200(GE Healthcare)을 사용하여 마우스 FcγRI, FcγRII, FcγRIII, FcγRIV(R&D sytems, Sino Biological)(이하, 마우스 FcγRs라 불린다)와 항체의 결합 활성이 평가되었다. Sensor chip CM4(GE Healthcare) 상에 아민커플링법으로 적당량 고정화된 protein L(ACTIGEN)에 피검대상의 항체를 캡쳐시켰다. 다음으로 마우스 FcγRs의 희석액과 블랭크로서 사용된 러닝 버퍼가 주입되고, 센서칩 상에 캡쳐된 항체에 상호작용시켰다. 러닝 버퍼로서 20 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v)Tween20, pH 7.4가 사용되고, 마우스 FcγRs의 희석에도 이 버퍼가 사용되었다. 센서칩의 재생에는 10 mmol/L Glycine-HCl, pH 1.5가 사용되었다. 측정은 모두 25℃에서 실시되었다.

마우스 FcγRs에 대한 결합 활성은 마우스 FcγRs에 대한 상대적인 결합 활성에 의해 표시될 수 있다. Protein L에 항체를 캡쳐시키고, 그 항체를 캡쳐시킨 전후에서의 센서그램의 변화량을 X1으로 하였다. 다음으로 그 항체에 마우스 FcγRs를 상호작용시키고, 그 전후에서의 센서그램의 변화량(△A1)으로서 표시된 마우스 FcγRs의 결합 활성을 각 항체의 캡쳐량(X)으로 나눈 값을 1500배한 값으로부터, Protein L에 캡쳐시킨 항체에 러닝 버퍼를 상호작용시킨 전후에서의 센서그램의 변화량(△A2)으로서 표시된 마우스 FcγRs의 결합 활성을 뺀 값을, 각 항체의 캡쳐량(X)으로 나눈 값을 1500배한 값(Y)을 마우스 FcγRs의 결합 활성으로 하였다(식 1).

〔식 1〕

마우스 FcγRs의 결합 활성(Y) = (△A1-△A2)/X×1500

그 결과를 아래의 표 7에 나타내었다.

표 2 및 표 3의 결과로부터, Fv4-IgG1-F140 및 Fv4-IgG1-F424는 Fv4-IgG1-F21 및 Fv4-IgG1-F157에 비해 인간 FcRn에 대한 결합 활성에는 영향을 미치지 않고, 마우스 FcγR에 대한 결합이 저하되어 있는 것이 나타내어졌다.

(4-5) 인간 FcRn 형질전환 마우스를 사용한 in vivo PK 시험

제작된 Fv4-IgG1-F140, Fv4-IgG1-F424, Fv4-IgG1-F21 및 Fv4-IgG1-F157이 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여되었을 때의 PK 시험이 하기의 방법으로 실시되었다.

인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104)의 꼬리정맥에 항인간 IL-6 수용체 항체가 1 ㎎/㎏으로 단회 투여되었다. 항인간 IL-6 수용체 항체의 투여 후 15분, 7시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일의 시점에서 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다.

(4-6) ELISA법에 의한 혈장 중 항인간 IL-6 수용체 항체농도의 측정

마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체농도는 ELISA법으로 측정되었다. 먼저 Anti-Human IgG(γ-chain specific)F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA)를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge nunc International)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 Anti-Human IgG 고상화 플레이트가 제작되었다. 혈장 중 농도로서 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 ㎍/mL의 항인간 IL-6 수용체 항체를 포함하는 검량선 시료와 100배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료가 조제되었다. 이들 검량선 시료 및 혈장 측정시료 100 μL에 20 ng/mL의 가용형 인간 IL-6 수용체가 200 μL 첨가된 혼합액을 실온에서 1시간 정치시켰다. 그 후 당해 혼합액이 각 웰에 분주된 Anti-Human IgG 고상화 플레이트를 추가로 실온에서 1시간 정치시켰다. 그 후 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)와 실온에서 1시간 반응시키고, 추가로 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 실온에서 1시간 반응시킨 반응액의 발색반응이 TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용하여 행해졌다. 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)를 첨가함으로써 반응이 정지된 각 웰의 반응액의 450 nm의 흡광도가 마이크로플레이트 리더로 측정되었다. 마우스 혈장 중의 항체농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출되었다.

pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체를 인간 FcRn 형질전환 마우스에 정맥내 투여한 후의 혈장 중의 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체농도를 도 14에 나타내었다.

도 14의 결과로부터 Fv4-IgG1-F21와 비교하여 마우스 FcγR으로의 결합이 낮은 Fv4-IgG1-F140은 Fv4-IgG1-F21과 비교하여 혈장 중 체류성의 향상이 확인되었다. 마찬가지로, Fv4-IgG1-F157과 비교하여 마우스 FcγR으로의 결합이 낮은 Fv4-IgG1-F424는 Fv4-IgG1-F157과 비교하여 혈장 중 체류성의 연장이 확인되었다.

이 사실로부터 pH 중성역 조건하에서의 인간 FcRn에 대한 결합을 갖고, FcγR에 대한 결합이 통상의 FcγR 결합 도메인보다도 낮은 FcγR 결합 도메인을 갖는 항체는 통상의 FcγR 결합 도메인을 갖는 항체보다도 혈장 중 체류성이 높은 것이 나타내어졌다.

본 발명은 특정 이론에 구속되는 것은 아니나 항원 결합 분자의 이러한 혈장 중 체류성의 향상이 관찰된 이유로서, 당해 항원 결합 분자는 pH 중성역 조건하에서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인보다도 낮은 FcγR 결합 도메인을 갖는 것으로부터, 실시예 3에서 기재된 4자 복합체의 형성이 저해되었기 때문이라고도 생각된다. 즉 항원 제시 세포의 세포막 상에서 4자 복합체를 형성하는 Fv4-IgG1-F21 및 Fv4-IgG1-F157은 항원 제시 세포로의 흡수가 일어나기 쉬워져 있다고 생각된다. 한편 실시예 3에서 나타낸 양태 1에 대한 항원 제시 세포의 세포막 상에서 4자 복합체를 형성하지 않는 Fv4-IgG1-F140 및 Fv4-IgG1-F424에 있어서는 항원 제시 세포로의 흡수가 저해되고 있다고 생각된다. 여기서 예를 들면 혈관 내피세포 등의 활성형 FcγR을 발현하고 있지 않은 세포로의 항원 결합 분자의 흡수는 비특이적인 흡수 또는 세포막 상의 FcRn을 매개로 하는 흡수가 주라고 생각되고, FcγR으로의 결합 활성의 저하에 의한 영향은 없는 것으로 생각된다. 즉 상기에서 관찰된 혈장 중 체류성의 향상은 항원 제시 세포를 포함하는 면역세포로의 흡수를 선택적으로 저해하였기 때문으로 생각된다.

〔실시예 5〕pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합을 갖고 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 갖지 않는 인간 항체의 혈장 중 체류성 평가

(5-1) 인간 및 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 갖지 않는 pH 의존적으로 인간 IL-6 수용체에 결합하는 인간 항체의 제작

인간 및 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 갖지 않는 pH 의존적으로 인간 IL-6 수용체에 결합하는 인간 항체를 제작하기 위해, 아래와 같이 항체 제작이 행해졌다.

VH3-IgG1의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 235번 위치의 Leu가 Arg로 치환된 아미노산 치환 및 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 아미노산 치환에 의해 인간 및 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 갖지 않는 VH3-IgG1-F760(서열번호：53)이 제작되었다.

마찬가지로, VH3-IgG1-F11(서열번호：54), VH3-IgG1-F890(서열번호：55) 및 VH3-IgG1-F947(서열번호：56)의 각각의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 235번 위치의 Leu가 Arg로 치환된 아미노산 치환 및 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 아미노산 치환에 의해, 인간 및 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 갖지 않는 VH3-IgG1-F821(서열번호：57), VH3-IgG1-F939(서열번호：58) 및 VH3-IgG1-F1009(서열번호：59)가 제작되었다.

참고 실시예 2의 방법을 사용하여 이들 중쇄 및 VL3-CK의 경쇄를 포함하는 Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4-IgG1-F760, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 및 Fv4-IgG1-F1009가 제작되었다.

(5-2) 인간 FcRn 및 마우스 FcγR에 대한 결합 활성의 확인

참고 실시예 2의 방법으로 제작된 VH3-IgG1, VH3-IgG1-F11, VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F947, VH3-IgG1-F760, VH3-IgG1-F821, VH3-IgG1-F939 또는 VH3-IgG1-F1009를 중쇄로서 포함하고 L(WT)-CK를 경쇄로서 포함하는 항체의 pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성(해리상수 KD)이 실시예 4의 방법을 사용하여 측정되었다. 측정한 결과를 아래의 표 8에 나타내었다.

실시예 4의 방법과 마찬가지로, VH3-IgG1, VH3-IgG1-F11, VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F947, VH3-IgG1-F760, VH3-IgG1-F821, VH3-IgG1-F939 또는 VH3-IgG1-F1009를 중쇄로서 포함하고 L(WT)-CK를 경쇄로서 포함하는 항체의 pH 7.4에 있어서의 마우스 FcγR에 대한 결합 활성이 측정되었다. 측정한 결과를 아래의 표 9에 나타내었다.

표 4 및 표 5의 결과로부터 Fv4-IgG1-F760, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 및 Fv4-IgG1-F1009는 Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890 및 Fv4-IgG1-F947과 비교하여, 인간 FcRn에 대한 결합 활성에는 영향을 미치지 않고, 마우스 FcγR에 대한 결합이 저하되어 있는 것이 나타내어졌다.

(5-3) 인간 FcRn 형질전환 마우스를 사용한 in vivo PK 시험

제작된 Fv4-IgG1 및 Fv4-IgG1-F760이 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여되었을 때의 PK 시험이 하기의 방법으로 실시되었다.

인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104)의 꼬리정맥에 항인간 IL-6 수용체 항체가 1 ㎎/㎏으로 단회 투여되었다. 항인간 IL-6 수용체 항체의 투여 후 15분, 7시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일의 시점에서 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다.

마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체농도는 실시예 4의 방법과 동일하게 ELISA법으로 측정되었다. 그 결과를 도 15에 나타내었다. Fv4-IgG1의 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 저하시킨 Fv4-IgG1-F760은 Fv4-IgG1-F11과 비교하여 거의 동등한 혈장 중 체류성을 나타내고, FcγR에 대한 결합 활성을 저하시키는 것에 의한 혈장 체류성의 향상효과는 보이지 않았다.

(5-4) 인간 FcRn 형질전환 마우스를 사용한 in vivo PK 시험

제작된 Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 및 Fv4-IgG1-F1009가 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여되었을 때의 PK 시험이 하기의 방법으로 실시되었다.

인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104)의 배부 피하에 항인간 IL-6 수용체 항체가 1 ㎎/㎏으로 단회 투여되었다. 항인간 IL-6 수용체 항체의 투여 후 15분, 7시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일의 시점에서 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다.

마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체농도는 실시예 4의 방법과 동일하게 ELISA법으로 측정되었다. 그 결과를 도 16에 나타내었다. Fv4-IgG1-F11의 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 저하시킨 Fv4-IgG1-F821은 Fv4-IgG1-F11과 비교하여 동등한 혈장 중 체류성을 나타내었다. 한편으로 Fv4-IgG1-F890의 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 저하시킨 Fv4-IgG1-F939는 Fv4-IgG1-F890과 비교하여 혈장 중 체류성의 향상이 확인되었다. 마찬가지로, Fv4-IgG1-F947의 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 저하시킨 Fv4-IgG1-F1009는 Fv4-IgG1-F947과 비교하여 혈장 중 체류성의 향상이 확인되었다.

한편 Fv4-IgG1과 IgG1-F760의 양자에 있어서는 혈장 중 체류성의 차이는 확인되지 않으며, pH 중성역에 있어서의 FcRn 결합 활성을 갖지 않는 Fv4-IgG1은 면역세포 상에서 FcγR의 2자 복합체를 형성하고, 4자 복합체를 형성할 수 없는 것으로부터, FcγR으로의 결합 활성의 저하에 의해 혈장 중 체류성의 향상이 확인되지 않은 것으로 생각되었다. 즉 pH 중성역에 있어서의 FcRn 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자에 대해, FcγR으로의 결합 활성을 저하시키고 4자 복합체의 형성을 저해함으로써 비로소 혈장 중 체류성의 향상이 확인되었다고 할 수 있다. 이 사실로부터도 4자 복합체의 형성이 혈장 중 체류성의 악화에 중요한 역할을 하고 있다고 생각된다.

(5-5) 인간 및 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 갖지 않는 pH 의존적으로 인간 IL-6 수용체에 결합하는 인간 항체의 제작

VH3-IgG1-F947(서열번호：56)의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치의 Leu가 Ala로 치환된 아미노산 치환 및 235번 위치의 Leu가 Ala로 치환된 아미노산 치환에 의해, 인간 및 마우스 FcγR에 대한 결합 활성이 저하된 VH3-IgG1-F1326(서열번호：155)이 제작되었다.

참고 실시예 2의 방법을 사용하여 VH3-IgG1-F1326의 중쇄 및 VL3-CK의 경쇄를 포함하는 Fv4-IgG1-F1326이 제작되었다.

(5-6) 인간 FcRn 및 마우스 FcγR에 대한 결합 활성의 확인

참고 실시예 2의 방법으로 제작된 VH3-IgG1-F1326을 중쇄로서 포함하고 L(WT)-CK를 경쇄로서 포함하는 항체의 pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성(해리상수 KD)이 실시예 4의 방법을 사용하여 측정되었다. 또한 실시예 4의 방법과 동일하게 pH 7.4에 있어서의 마우스 FcγR에 대한 결합 활성이 측정되었다. 측정한 결과를 아래의 표 10에 나타내었다.

표 10의 결과로부터 Fv4-IgG1-F1326은 Fv4-IgG1-F947과 비교하여, 인간 FcRn에 대한 결합 활성에는 영향을 미치지 않고, 마우스 FcγR에 대한 결합이 저하되어 있는 것이 나타내어졌다.

(5-7) 인간 FcRn 형질전환 마우스를 사용한 in vivo PK 시험

제작된 Fv4-IgG1-F1326이 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여되었을 때의 PK 시험이 실시예 5-4의 방법과 동일하게 실시되었다. 마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체농도는 실시예 4의 방법과 동일하게 ELISA법으로 측정되었다. 그 결과를 실시예 5-4에서 얻어진 Fv4-IgG1-F947의 결과와 함께 도 54에 나타내었다. Fv4-IgG1-F947의 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 저하시킨 Fv4-IgG1-F1326은 Fv4-IgG1-F947과 비교하여 혈장 중 체류성의 향상이 확인되었다.

이상의 사실로부터, 중성 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 증강시킨 인간 항체에 있어서 마우스 FcγR으로의 결합 활성을 저하시키고 4자 복합체의 형성을 저해함으로써, 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 혈장 중 체류성의 향상이 가능한 것이 나타내어졌다. 여기서 마우스 FcγR으로의 결합 활성을 저하시킴으로써 혈장 중 체류성 향상의 효과가 나타내어지기 위해서는, 바람직하게는 인간 FcRn으로의 pH 7.0에서의 친화성(KD)이 310 nM보다도 강하고, 더욱 바람직하게는 110 nM 이하이다.

결과로서, 실시예 4와 동일하게 항원 결합 분자에 대해 양태 1의 성질을 부여함으로써 혈장 중 체류성의 향상이 확인되었다. 여기서 보이고 있는 혈장 중 체류성의 향상은 항원 제시 세포를 포함하는 면역세포로의 흡수를 선택적으로 저해하였기 때문이라고 생각되고, 그 결과로서 면역응답의 야기를 저해하는 것도 가능할 것으로 기대된다.

〔실시예 6〕pH 중성역에 있어서의 마우스 FcRn에 대한 결합을 갖고 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 갖지 않는 마우스 항체의 혈장 중 체류성의 평가

(6-1) 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 갖지 않는 인간 IL-6 수용체에 결합하는 마우스 항체의 제작

실시예 4 및 5에 있어서, pH 중성역의 조건하에 있어서 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 마우스 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 FcγR 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자는 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 혈장 중 체류성이 향상되어 있는 것이 나타내어졌다. 마찬가지로, pH 중성역의 조건하에 있어서 마우스 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 마우스 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 FcγR 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 정상 마우스에 있어서의 혈장 중 체류성이 향상되어 있는지 여부가 검증되었다.

실시예 2에서 제작된 mPM1H-mIgG1-mF38의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 235번 위치의 Pro가 Lys로 치환된 아미노산 치환 및 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 아미노산 치환에 의해 mPM1H-mIgG1-mF40(서열번호：60)이, mPM1H-mIgG1-mF14의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 235번 위치의 Pro가 Lys로 치환된 아미노산 치환 및 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 아미노산 치환에 의해 mPM1H-mIgG1-mF39(서열번호：61)가 제작되었다.

(6-2) 마우스 FcRn 및 마우스 FcγR에 대한 결합 활성의 확인

실시예 2의 방법을 사용하여 pH 7.0에 있어서의 마우스 FcRn에 대한 결합 활성(해리상수 KD)이 측정되었다. 그 결과를 아래의 표 11에 나타내었다.

실시예 4의 방법을 사용하여 pH 7.4에 있어서의 마우스 FcγR에 대한 결합 활성이 측정되었다. 그 결과를 아래의 표 12에 나타내었다.

(6-3) 정상 마우스를 사용한 in vivo PK 시험

제작된 mPM1-mIgG1-mF14, mPM1-mIgG1-mF38, mPM1-mIgG1-mF39, mPM1-mIgG1-mF40이 정상 마우스에 투여되었을 때의 PK 시험이 하기의 방법으로 실시되었다.

정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)의 배부 피하에 항인간 IL-6 수용체 항체가 1 ㎎/㎏으로 단회 투여되었다. 항인간 IL-6 수용체 항체의 투여 후 5분, 7시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 14일의 시점에서 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다.

(6-4) ELISA법에 의한 혈장 중 항인간 IL-6 수용체 마우스 항체농도의 측정

마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 마우스 항체농도는 ELISA법으로 측정되었다. 먼저 가용형 인간 IL-6 수용체를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 가용형 인간 IL-6 수용체 고상화 플레이트가 제작되었다. 혈장 중 농도로서 1.25, 0.625, 0.313, 0.156, 0.078, 0.039, 0.020 ㎍/mL의 항인간 IL-6 수용체 마우스 항체를 포함하는 검량선 시료와 100배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료가 조제되었다. 이들 검량선 시료 및 혈장 측정시료 100 μL가 각 웰에 분주된 가용형 인간 IL-6 수용체 고상화 플레이트를 실온에서 2시간 정치시켰다. 그 후 Anti-Mouse IgG-Peroxidase antibody(SIGMA)와 실온에서 1시간 반응시키고, 추가로 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 실온에서 1시간 반응시킨 반응액의 발색반응이 TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용하여 행해졌다. 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)를 첨가함으로써 반응이 정지된 각 웰의 반응액의 450 nm의 흡광도가 마이크로플레이트 리더로 측정되었다. 마우스 혈장 중의 항체농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출되었다. 이 방법으로 측정된 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 혈장 중의 항체농도 추이를 도 17에 나타내었다.

도 17의 결과로부터 마우스 FcγR에 대한 결합을 갖지 않는 mPM1-mIgG1-mF40은 mPM1-mIgG1-mF38과 비교하여 혈장 중 체류성의 향상이 확인되었다. 또한 마우스 FcγR에 대한 결합을 갖지 않는 mPM1-mIgG1-mF39는 mPM1-mIgG1-mF14와 비교하여 혈장 중 체류성의 향상이 확인되었다.

이상의 사실로부터, pH 중성역의 조건하에 있어서의 마우스 FcRn에 대한 결합을 갖고, 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 갖지 않는 FcγR 결합 도메인을 갖는 항체는 통상의 FcγR 결합 도메인을 갖는 항체보다도 정상 마우스에 있어서의 혈장 중 체류성이 높은 것이 나타내어졌다.

결과로서, 실시예 4 및 5와 동일하게 항원 결합 분자에 대해 양태 1의 성질을 갖는 항원 결합 분자는 혈장 중 체류성이 높은 것이 확인되었다. 본 발명은 특정 이론에 구속되는 것은 아니나 여기서 관찰된 혈장 중 체류성의 향상은 항원 제시 세포 등의 면역세포로의 흡수를 선택적으로 저해하였기 때문이라고 생각되고, 그 결과로서 면역응답의 야기를 저해하는 것도 가능할 것으로 기대된다.

〔실시예 7〕pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합을 갖고, 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 FcγR 결합 도메인을 포함하는 인간화 항체(항인간 IL-6 수용체 항체)의 in vitro 면역원성의 평가

양태 1의 항원 결합 분자, 즉 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 인간에 있어서의 면역원성을 평가하기 위해, 하기 방법에 의해 당해 항원 결합 분자에 대한 in vitro에 있어서의 T세포 응답이 평가되었다.

(7-1) 인간 FcRn에 대한 결합 활성의 확인

실시예 4에서 측정된 VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F21 및 VH3/L(WT)-IgG1-F140의 pH 중성역의 조건하(pH 7.0)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합상수(KD)를 아래의 표 13에 나타내었다.

(7-2) 인간 FcγR에 대한 결합 활성의 평가

아래의 방법을 사용하여 VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F21, VH3/L(WT)-IgG1-F140의 pH 7.4에 있어서의 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 측정되었다.

Biacore T100 또는 T200(GE Healthcare)을 사용하여 인간 FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb, FcγRIIIa(F)(이하, 인간 FcγRs로 불린다)와 항체의 결합 활성이 평가되었다. Sensor chip CM4(GE Healthcare) 상에 아민커플링법으로 적절한 양 고정화된 protein L(ACTIGEN)에 피검대상의 항체를 캡쳐시켰다. 다음으로 인간 FcγRs의 희석액과 블랭크로서 사용된 러닝 버퍼가 주입되어, 센서칩 상에 캡쳐된 항체에 상호작용시켰다. 러닝 버퍼로서 20 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v)Tween20, pH 7.4가 사용되고, 인간 FcγRs의 희석에도 이 버퍼가 사용되었다. 센서칩의 재생에는 10 mmol/L Glycine-HCl, pH 1.5가 사용되었다. 측정은 모두 25℃에서 실시되었다.

인간 FcγRs에 대한 결합 활성은 인간 FcγRs에 대한 상대적인 결합 활성에 의해 표시될 수 있다. Protein L에 항체를 캡쳐시키고, 그 항체를 캡쳐시킨 전후에서의 센서그램의 변화량을 X1으로 하였다. 다음으로 그 항체에 인간 FcγRs를 상호작용시키고, 그 전후에서의 센서그램의 변화량(△A1)으로서 표시된 인간 FcγRs의 결합 활성을 각 항체의 캡쳐량(X)으로 나눈 값을 1500배한 값으로부터, Protein L에 캡쳐시킨 항체에 러닝 버퍼를 상호작용시킨 전후에서의 센서그램의 변화량(△A2)으로서 표시된 인간 FcγRs의 결합 활성을 뺀 값을, 각 항체의 캡쳐량(X)으로 나눈 값을 1500배한 값(Y)을 인간 FcγRs의 결합 활성으로 하였다(식 2).

〔식 2〕

인간 FcγRs의 결합 활성(Y) = (△A1-△A2)/X×1500

그 결과를 아래의 표 14에 나타내었다.

표 14의 결과로부터 Fv4-IgG1-F140은 Fv4-IgG1-F21과 비교하여 인간 FcRn에 대한 결합 활성에는 영향을 미치지 않고, 각종 인간 FcγR에 대한 결합이 저하되어 있는 것이 나타내어졌다.

(7-3) 인간 PBMC를 사용한 in vitro 면역원성 시험

실시예 1에서 제작된 Fv4-IgG1-F21, Fv4-IgG1-F140를 사용하여 하기와 같이 in vitro 면역원성 시험이 실시되었다.

말초혈 단핵구 세포(PBMC)가 건강한 정상인 자원봉사자로부터 채취한 혈액으로부터 단리되었다. Ficoll(GE Healthcare) 밀도 원심분리에 의해 혈액으로부터 분리된 PBMC로부터 Dynabeads CD8(invitrogen)을 사용하여 부속의 표준 프로토콜에 따라 마그네트에 의해 CD8⁺ T세포가 제거되었다. 이어서 Dynabeads CD25(invitrogen)를 사용하여 부속의 표준 프로토콜에 따라 CD25^hi T세포가 마그네트에 의해 제거되었다.

증식 어세이가 아래와 같이 실시되었다. CD8⁺ 및 CD25^hi T세포가 제거되고, 2×10⁶/mL가 되도록 3% 불활성화 인간 혈청을 포함하는 AIMV 배지(Invitrogen)에 재현탁된 각 도너의 PBMC가 바닥이 평평한 24 웰 플레이트에 1웰당 2×10⁶ 세포 첨가되었다. 37℃, 5%CO₂의 조건하에서 2시간의 배양 후, 각 피검물질이 최종농도 10, 30, 100, 300 ㎍/mL가 되도록 첨가된 세포가 8일간 배양되었다. 배양 6, 7 및 8일의 시점에서 바닥이 둥근 96 웰 플레이트로 옮겨진 배양 중의 세포 현탁액 150 μL에 대해 BrdU(Bromodeoxyuridine)가 첨가되고, 추가로 당해 세포가 24시간 배양되었다. BrdU와 함께 배양된 세포의 핵 내에 흡수된 BrdU가 BrdU Flow Kit(BD bioscience)를 사용하여 부속의 표준 프로토콜에 따라 염색되는 것과 동시에 항CD3, CD4 및 CD19 항체(BD bioscience)에 의해 표면 항원(CD3, CD4 및 CD19)이 염색되었다. 이어서 BD FACS Calibur 또는 BD FACS CantII(BD)에 의해 BrdU 양성 CD4⁺ T세포의 비율이 검출되었다. 배양 6, 7 및 8일에 있어서, 피검물질의 10, 30, 100, 300 ㎍/mL의 각 최종농도에서의 BrdU 양성 CD4⁺ T세포의 비율이 산출되어, 그들의 평균값이 산출되었다.

결과를 도 18에 나타내었다. 도 18에서는 CD8⁺ 및 CD25^hi T세포가 제거된 5인의 인간 도너의 PBMC 중의 Fv4-IgG1-F21, Fv4-IgG1-F140에 대한 CD4⁺ T세포의 증식응답이 나타내어져 있다. 먼저 음성 대조와 비교하여 피검물질을 첨가한 것에 의한 도너 A, B 및 D의 PBMC에서의 CD4⁺ T세포의 증식응답의 증가는 관찰되지 않았다. 이들 도너는 처음부터 피검물질에 대한 면역응답을 일으키지 않을 것으로 생각된다. 한편 음성 대조와 비교하여 피검물질을 첨가한 것에 의한 도너 C 및 E의 PBMC에서의 CD4⁺ T세포의 증식응답이 관찰되었다. 착안해야 할 점으로서 도너 C, E 모두에 있어서 Fv4-IgG1-F21과 비교하여 Fv4-IgG1-F140에 대한 CD4⁺ T세포의 증식응답이 저하되는 경향을 들 수 있다. 전술한 바와 같이, Fv4-IgG1-F140은 Fv4-IgG1-F21보다도 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 낮고, 양태 1의 성질을 가지고 있다. 이상의 결과로부터 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합을 갖고, 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자에 대한 면역원성이 억제될 수 있는 것이 시사되었다.

〔실시예 8〕pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인을 포함하는 인간화 항체(항인간 A33 항체)의 in vitro 면역원성 평가

(8-1) hA33-IgG1의 제작

실시예 7에서 나타내어진 바와 같이, Fv4-IgG1-F21에 대한 인간 PBMC의 면역응답성이 원래 낮기 때문에, FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인을 포함하는 Fv4-IgG1-F140에 대한 면역응답의 억제를 평가하기 위해서는 적합하지 않은 것이 시사되었다. 이에 in vitro 면역원성 평가계에 있어서, 면역원성 저감효과의 검출력을 높이기 위해 A33 항원에 대한 인간화 IgG1 항체인 인간화 A33 항체(hA33-IgG1)가 제작되었다.

hA33-IgG1은 임상시험에 있어서 33-73%의 피험자에서 항항체의 생산이 확인되고 있다(Hwang등(Methods (2005) 36, 3-10) 및 Walle등(Expert Opin. Bio. Ther. (2007) 7 (3), 405-418)). hA33-IgG1은 이 높은 면역원성은 가변영역 서열에 의한 것인 것으로부터, hA33-IgG1에 대해 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 증강시킨 분자에 대해, FcγR에 대한 결합 활성을 저하시켜 4자 복합체 형성을 저해하는 것에 의한 면역원성 저감효과를 검출하기 쉬운 것으로 생각되었다.

인간화 A33 항체의 중쇄 가변영역으로서 hA33H(서열번호：62) 및 경쇄 가변영역으로서 hA33L(서열번호：63)의 아미노산 서열은 공지의 정보(British Journal of Cancer (1995) 72, 1364-1372)로부터 취득되었다. 또한 중쇄 정상영역으로서 천연형 인간 IgG1(서열번호：11, 이후는 IgG1으로 표기된다), 경쇄 정상영역으로서 천연형 인간 kappa(서열번호：64, 이후는 k0로 표기된다)가 사용되었다.

참고 실시예 1의 방법에 따라 중쇄 hA33H-IgG1 및 경쇄 hA33L-k0의 염기서열을 포함하는 발현 벡터가 제작되었다. 또한 참고 실시예 2의 방법에 따라 중쇄 hA33H-IgG1 및 경쇄 hA33L-k0를 포함하는 인간화 A33 항체인 hA33-IgG1이 제작되었다.

(8-2) pH 중성역 조건하에서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 A33 결합 항체의 제작

제작된 hA33-IgG1은 천연형 인간 Fc영역을 갖는 인간 항체이기 때문에 pH 중성역 조건하에서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는다. 이에 pH 중성역 조건하에서의 인간 FcRn에 대한 결합능을 부여하기 위해 hA33-IgG1의 중쇄 정상영역에 아미노산 개변이 도입되었다.

구체적으로는 hA33-IgG1의 중쇄 정상영역인 hA33H-IgG1의 EU 넘버링으로 표시되는 252번 위치의 아미노산이 Met로부터 Tyr로 치환되고, EU 넘버링으로 표시되는 308번 위치의 아미노산이 Val로부터 Pro로 치환되며, EU 넘버링으로 표시되는 434번 위치의 아미노산이 Asn으로부터 Tyr로 치환됨으로써, hA33H-IgG1-F21(서열번호：65)이 제작되었다. 참고 실시예 2의 방법을 사용하여 pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 A33 결합 항체로서, hA33H-IgG1-F21을 중쇄로서 포함하고 hA33L-k0를 경쇄로서 포함하는 hA33-IgG1-F21이 제작되었다.

(8-3) pH 중성역 조건하에서의 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 FcγR 결합 도메인을 포함하는 A33 결합 항체의 제작

hA33-IgG1-F21의 인간 FcγR에 대한 결합 활성을 저하시키기 위해, hA33H-IgG1-F21의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 hA33H-IgG1-F140(서열번호：66)이 제작되었다.

(8-4) in vitro T-cell 어세이에 의한 각종 A33 결합 항체의 면역원성 평가

실시예 7과 동일한 방법을 사용하여 제작된 hA33-IgG1-F21, hA33-IgG1-F140에 대한 면역원성의 평가가 행해졌다. 또한 도너인 건강한 정상인 자원봉사자는 실시예 7에서 사용된 PBMC가 단리된 건강한 정상인 자원봉사자와는 동일 개체는 아니다. 즉 실시예 7에 있어서의 도너 A와 당시험에 있어서의 도너 A는 다른 개체의 건강한 정상인 자원봉사자이다.

시험의 결과를 도 19에 나타내었다. 도 19에서는 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합을 갖는 hA33-IgG1-F21과, 추가로 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 FcγR 결합 도메인을 포함하는 hA33-IgG1-F140의 결과가 비교되어 있다. 음성 대조와 비교하여 도너 C, D 및 F로부터 단리된 PBMC의 hA33-IgG1-F21에 대한 반응은 관찰되고 있지 않기 때문에, 도너 C, D 및 F는 hA33-IgG1-F21에 대해 면역응답을 일으키지 않는 도너인 것으로 생각된다. 그 이외의 7명의 도너(도너 A, B, E, G, H, I 및 J)로부터 단리된 PBMC에 있어서는 hA33-IgG1-F21에 대한 면역응답이 음성 대조와 비교하여 높은 것이 관찰되고 있어, hA33-IgG1-F21은 in vitro에 있어서 기대대로 높은 면역원성을 나타내었다. 한편으로 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 FcγR 결합 도메인을 포함하는 hA33-IgG1-F140에 대한, 이들 7명의 전체 도너(도너 A, B, E, G, H, I 및 J)로부터 단리된 PBMC의 면역응답이 hA33-IgG1-F21에 대한 그것과 비교하여 저하되어 있는 효과가 관찰된다. 또한 hA33-IgG1-F140에 대한 도너 E 및 J로부터 단리된 PBMC의 면역응답은 음성 대조와 같은 정도인 것으로부터도, pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자에 있어서, 인간 FcγR에 대한 결합 활성을 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮게 하여 4자 복합체의 형성을 저해함으로써 면역원성을 저감할 수 있을 것으로 생각되었다.

〔실시예 9〕pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 인간 FcγR에 대한 결합 활성을 갖지 않는 인간화 항체(항인간 A33 항체)의 in vitro 면역원성 평가

(9-1) pH 중성역 조건하에서의 인간 FcRn에 대한 강한 결합 활성을 갖는 A33 결합 항체의 제작

hA33H-IgG1에 대해 EU 넘버링으로 표시되는 252번 위치의 아미노산이 Met로부터 Tyr로 치환되고, EU 넘버링으로 표시되는 286번 위치의 아미노산이 Asn으로부터 Glu로 치환되며, EU 넘버링으로 표시되는 307번 위치의 아미노산이 Thr로부터 Gln으로 치환되고, EU 넘버링으로 표시되는 311번 위치의 아미노산이 Gln으로부터 Ala로 치환되며, EU 넘버링으로 표시되는 434번 위치의 아미노산이 Asn으로부터 Tyr로 치환됨으로써, hA33H-IgG1-F698(서열번호：67)이 참고 실시예 1의 방법으로 제작되었다. pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 강한 결합 활성을 갖는 인간 A33 결합 항체로서, hA33H-IgG1-F698을 중쇄로서 포함하고 hA33L-k0를 경쇄로서 포함하는 hA33-IgG1-F698이 제작되었다.

(9-2) pH 중성역 조건하에서의 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인을 포함하는 A33 결합 항체의 제작

hA33H-F698의 EU 넘버링으로 표시되는 239번째의 Ser이 Lys로 치환되고, 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인을 포함하는 hA33H-IgG1-F699(서열번호：68)가 제작되었다.

실시예 4의 방법을 사용하여 VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F698 및 VH3/L(WT)-IgG1-F699의 pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성이 측정되었다. 또한 실시예 7의 방법을 사용하여 pH 7.4에 있어서의 인간 FcγR에 대한 VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F698 및 VH3/L(WT)-IgG1-F699의 결합 활성이 측정되었다. 그 결과를 함께 아래의 표 15에 나타내었다.

표 15에 나타내어지는 바와 같이, 각종 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인을 포함하는, EU 넘버링으로 표시되는 239번의 Ser이 Lys로 치환된 VH3/L(WT)-IgG1-F699는 hFcgRIIa(R), hFcgRIIa(H), hFcgRIIb, hFcgRIIIa(F)에 대한 결합은 저하되어 있지만, hFcgRI에 대한 결합 활성을 가지고 있었다.

(9-3) 각종 A33 결합 항체의 in vitro T-cell 어세이에 의한 면역원성 평가

제작된 hA33-IgG1-F698, hA33-IgG1-F699에 대한 면역원성의 평가가 실시예 7과 동일한 방법으로 행해졌다. 또한 도너인 건강한 정상인 자원봉사자는 실시예 7 및 8에서 사용된 PBMC가 단리된 건강한 정상인 자원봉사자와는 동일 개체는 아니다. 즉 실시예 7 및 실시예 8에 있어서의 도너 A와 당시험에 있어서의 도너 A는 다른 개체의 건강한 정상인 자원봉사자이다.

시험의 결과를 도 20에 나타내었다. 도 20에서는 pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 강한 결합 활성을 갖는 hA33-IgG1-F698과, 추가로 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 도메인의 결합 활성보다도 낮은 FcγR 결합 도메인을 포함하는 hA33-IgG1-F699의 결과가 비교되어 있다. 음성 대조와 비교하여 도너 G 및 I로부터 단리된 PBMC의 hA33-IgG1-F698에 대한 반응은 관찰되고 있지 않기 때문에, 도너 G 및 I는 hA33-IgG1-F698에 대해 면역응답을 일으키지 않는 도너인 것으로 생각된다. 그것 이외의 7명의 도너(도너 A, B, C, D, E, F 및 H)로부터 단리된 PBMC에 있어서는 hA33-IgG1-F698에 대한 면역응답이 음성 대조와 비교하여 높은 것이 관찰되고 있어, 전술한 hA33-IgG1-F21과 동일하게 in vitro에 있어서 높은 면역원성을 나타내었다. 한편으로 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 도메인의 결합 활성보다도 낮은 FcγR 결합 도메인을 포함하는 hA33-IgG1-F699에 대한, 5명의 도너(도너 A, B, C, D 및 F)로부터 단리된 PBMC의 면역응답이 hA33-IgG1-F698에 대한 그것과 비교하여 저하되어 있는 효과가 관찰된다. 특히 hA33-IgG1-F699에 대한 도너 C 및 F로부터 단리된 PBMC의 면역응답은 음성 대조와 같은 정도인 것이 확인되었다. hA33-IgG1-F21뿐 아니라 인간 FcRn에 대해 보다 강한 결합 활성을 갖는 hA33-IgG1-F698에 대해서도 면역원성 저감효과가 확인된 것으로부터 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자에 있어서, 인간 FcγR에 대한 결합 활성을 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮게 하여 4자 복합체의 형성을 저해함으로써 면역원성을 저감할 수 있는 것이 나타내어졌다.

(9-4) pH 중성역 조건하에서의 인간 FcγRIa에 대한 결합 활성을 갖지 않는 A33 결합 항체의 제작

(9-3)에 기재한 바와 같이, hA33-IgG1-F698의 EU 넘버링으로 표시되는 239번의 Ser을 Lys로 치환함으로써 각종 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 hA33-IgG1-F699는 hFcgRIIa(R), hFcgRIIa(H), hFcgRIIb, hFcgRIIIa(F)에 대한 결합은 현저히 저하되어 있지만 hFcgRI에 대한 결합은 잔존하고 있었다.

이에 hFcgRIa도 포함한 모든 인간 FcγR에 대한 결합을 갖지 않는 FcγR 결합 도메인을 포함하는 A33 결합 항체를 제작하기 위해, hA33H-IgG1-F698(서열번호：67)의 EU 넘버링으로 표시되는 235번 위치의 Leu가 Arg로 치환되고, EU 넘버링으로 표시되는 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 hA33H-IgG1-F763(서열번호：69)이 제작되었다.

실시예 4의 방법을 사용하여 VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F698, VH3/L(WT)-IgG1-F763의 pH 중성역의 조건하(pH 7.0)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합상수(KD)가 측정되었다. 또한 실시예 7에 기재된 방법으로 VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F698, VH3/L(WT)-IgG1-F763의 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 평가되었다. 그 결과에 대해서도 함께 아래의 표 16에 나타내었다.

표 16에 나타낸 바와 같이, EU 넘버링으로 표시되는 235번 위치의 Leu가 Arg로 치환되고, EU 넘버링으로 표시되는 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 IgG1-F763은 hFcγRIa도 포함한 모든 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 것이 나타내어졌다.

(9-5) 각종 A33 결합 항체의 in vitro T-cell 어세이에 의한 면역원성 평가

실시예 7과 동일한 방법을 사용하여 제작된 hA33-IgG1-F698, hA33-IgG1-F763의 면역원성이 평가되었다. 또한 지금까지와 동일하게 도너인 건강한 정상인 자원봉사자는 상기 실시예에서 사용된 PBMC가 단리된 건강한 정상인 자원봉사자와는 동일 개체는 아니다. 즉 상기 실시예에 있어서의 도너 A와 당시험에 있어서의 도너 A는 다른 개체의 건강한 정상인 자원봉사자이다.

시험의 결과를 도 21에 나타내었다. 도 21에서는 pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 강한 결합 활성을 갖는 hA33-IgG1-F698과, 추가로 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 도메인의 결합 활성보다도 낮은 FcγR 결합 도메인을 포함하는 hA33-IgG1-F763의 결과가 비교되어 있다. 음성 대조와 비교하여 도너 B, E, F 및 K로부터 단리된 PBMC의 hA33-IgG1-F698에 대한 반응은 관찰되고 있지 않기 때문에, 도너 B, E, F 및 K는 hA33-IgG1-F698에 대해 면역응답을 일으키지 않는 도너인 것으로 생각된다. 그것 이외의 7명의 도너(도너 A, C, D, G, H, I 및 J)로부터 단리된 PBMC에 있어서는 hA33-IgG1-F698에 대한 면역응답이 음성 대조에 비해 높은 것이 관찰되고 있다. 한편으로 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 도메인의 결합 활성보다도 낮은 FcγR 결합 도메인을 포함하는 hA33-IgG1-F763에 대한, 4명의 도너(도너 A, C, D 및 H)로부터 단리된 PBMC의 면역응답이 hA33-IgG1-F698에 대한 그것과 비교하여 저하되어 있는 효과가 관찰된다. 이들 4명의 도너 중 특히 도너 C, D 및 H로부터 단리된 PBMC의 hA33-IgG1-F763에 대한 면역응답은 음성 대조와 같은 정도이고, FcγR으로의 결합을 저하시킴으로써 PBMC의 면역응답이 저하되어 있었던 4명의 도너 중 실제로 3명까지가 PBMC의 면역응답을 완전히 억제하는 것이 가능하였다. 이 사실로부터도, 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 낮은 FcγR 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자는 면역원성이 저감된 매우 유효한 분자인 것으로 생각된다.

실시예 7, 8 및 9의 결과로부터 항원 제시 세포 상에서 4자 복합체를 형성할 수 있는 항원 결합 분자에 비해, 활성형 FcγR으로의 결합을 저감시킴으로써 4자 복합체의 형성을 저해한 항원 결합 분자(양태 1)에 대한 면역응답은 많은 도너에 있어서 억제되어 있는 것이 확인되었다. 이상의 결과로부터 항원 제시 세포상에서 4자 복합체를 형성하는 것이 항원 결합 분자의 면역응답에 중요하고, 당해 복합체를 형성하지 않는 항원 결합 분자는 많은 도너에 있어서 면역원성을 저감시키는 것이 가능한 것이 나타내어졌다.

〔실시예 10〕pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 갖지 않는 인간화 항체의 in vivo 면역원성 평가

실시예 7, 8 및 9에 있어서, pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 FcγR 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자는, FcγR 결합 활성이 저하되어 있지 않은 항원 결합 분자와 비교하여 면역원성이 저감되어 있는 것이 in vitro의 실험에 있어서 나타내어졌다. 이 효과가 in vivo에 있어서도 나타내어지는 것을 확인하기 위해 하기의 시험이 실시되었다.

(10-1) 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 in vivo 면역원성 시험

실시예 5에서 얻어진 마우스 혈장을 사용하여 Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939, Fv4-IgG1-F1009에 대한 항체 생산이 하기의 방법으로 평가되었다.

(10-2) 전기화학 발광법에 의한 혈장 중 항투여 검체 항체 측정

마우스의 혈장 중 항투여 검체 항체는 전기화학 발광법으로 측정되었다. 먼저 투여 검체가 Uncoated MULTI-ARRAY Plate(Meso Scale Discovery)에 분주되고, 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 투여 검체 고상화 플레이트가 제작되었다. 50배로 희석된 마우스 혈장 측정시료가 조제되고, 투여 검체 고상화 플레이트에 분주하여 4℃에서 하룻밤 반응되었다. 그 후 SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 Anti-Mouse IgG(whole molecule)(SIGMA)를 실온에서 1시간 반응시키고, Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)를 분주하고 바로 SECTOR PR 400(Meso Scale Discovery)으로 측정이 행해졌다. 측정계별로 항체가 투여되어 있지 않은 개체 5개체의 혈장이 음성 대조 샘플로서 측정되고, 그 5개체의 혈장을 사용하여 측정된 수치의 평균값(MEAN)에, 5개체의 혈장을 사용하여 측정된 수치의 표준편차(SD)의 1.645배를 더한 수치(X)가 양성 판정기준으로서 사용되었다(식 3). 어느 하나의 채혈일에 있어서 1도라도 양성 판정기준을 상회하는 반응이 나타난 개체가 피검물질에 대한 항체 생산 응답이 양성인 것으로 판정되었다.

〔식 3〕

항체 생산의 양성 판정기준(X) = MEAN + 1.645×SD

(10-3) FcγR으로의 결합 활성을 저하시키는 것에 의한 in vivo 면역원성의 억제효과

그 결과를 도 22~도 27에 나타내었다. 도 22에 Fv4-IgG1-F11이 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여된 뒤부터 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 Fv4-IgG1-F11에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내었다. 투여 후 어느 채혈일에 있어서도 3마리의 마우스 중 1마리의 마우스(#3)에 있어서, Fv4-IgG1-F11에 대한 마우스 항체의 생산이 양성인 것이 나타내어졌다(양성률 1/3). 한편으로 도 23에 Fv4-IgG1-F821이 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여된 뒤부터 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 Fv4-IgG1-F821에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내었다. 투여 후 어느 채혈일에 있어서도 3마리의 마우스 모두에 있어서 Fv4-IgG1-F821에 대한 마우스 항체의 생산은 음성인 것이 나타내어졌다(양성률 0/3).

도 24A 및 그의 확대도인 도 24B에 Fv4-IgG1-F890이 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여된 뒤부터 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 Fv4-IgG1-F890에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내었다. 투여로부터 21일 후 및 28일 후의 시점에서 3마리의 마우스 중 2마리의 마우스(#1, #3)에 있어서 Fv4-IgG1-F890에 대한 마우스 항체의 생산이 양성인 것이 나타내어졌다(양성률 2/3). 한편으로 도 25에 Fv4-IgG1-F939가 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여된 뒤부터 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 Fv4-IgG1-F939에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내었다. 투여 후 어느 채혈일에 있어서도 3마리의 마우스 모두에 있어서 Fv4-IgG1-F939에 대한 마우스 항체의 생산은 음성인 것이 나타내어졌다(양성률 0/3).

도 26에 Fv4-IgG1-F947이 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여된 뒤부터 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 Fv4-IgG1-F947에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내었다. 투여로부터 14일 후의 시점에서 3마리의 마우스 중 2마리의 마우스(#1, #3)에 있어서 Fv4-IgG1-F947에 대한 마우스 항체의 생산이 양성인 것이 나타내어졌다(양성률 2/3). 한편으로 도 27에 Fv4-IgG1-F1009가 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여된 뒤부터 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 Fv4-IgG1-F1009에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내었다. 투여로부터 7일 후 이후의 채혈일에 있어서 3마리의 마우스 중 2마리의 마우스(#4, #5)에 있어서 Fv4-IgG1-F1009에 대한 마우스 항체의 생산이 양성인 것이 나타내어졌다(양성률 2/3).

실시예 5에 있어서 나타내어진 바와 같이, Fv4-IgG1-F11에 대해 각종 마우스 FcγR으로의 결합을 저하시킨 것이 Fv4-IgG1-F821이고, 마찬가지로 Fv4-IgG1-F890에 대해 각종 마우스 FcγR으로의 결합을 저하시킨 것이 Fv4-IgG1-F939이며, 마찬가지로 Fv4-IgG1-F947에 대해 각종 마우스 FcγR으로의 결합을 저하시킨 것이 Fv4-IgG1-F1009이다.

Fv4-IgG1-F11 및 Fv4-IgG1-F890에 대해서는 각종 마우스 FcγR으로의 결합을 저하시킴으로써 생체내에 있어서의 면역원성을 현저히 저감시키는 것이 가능한 것이 나타내어졌다. 한편 Fv4-IgG1-F947에 대해서는 각종 마우스 FcγR으로의 결합을 저하시키는 것에 의한 생체내에 있어서의 면역원성을 저하시키는 효과는 나타내어지지 않았다.

특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 이러한 면역원성의 억제효과가 보인 이유로서 아래와 같이 설명하는 것도 가능하다.

실시예 3에 기재된 바와 같이, pH 중성역의 조건하에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자에 대해, FcγR으로의 결합 활성을 저하시킴으로써 항원 제시 세포의 세포막 상에 있어서의 4자 복합체의 형성을 저해하는 것이 가능할 것으로 생각된다. 4자 복합체의 형성이 저해됨으로써 항원 제시 세포로의 항원 결합 분자의 흡수가 억제되어, 결과적으로 항원 결합 분자에 대한 면역원성의 유도가 억제될 것으로 생각된다. Fv4-IgG1-F11 및 Fv4-IgG1-F890에 대해서는 FcγR으로의 결합 활성을 저하시킴으로써 이와 같이 하여 면역원성의 유도가 억제되었다고도 생각된다.

한편으로 Fv4-IgG1-F947에 대해서는 FcγR으로의 결합 활성을 저하시키는 것에 의한 면역원성의 억제효과가 나타내어지지 않았다. 특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 그 이유로서는 아래와 같이 고찰하는 것도 가능하다.

도 16에 나타내어진 바와 같이, Fv4-IgG1-F947 및 Fv4-IgG1-F1009의 혈장 중으로부터의 소실은 매우 빠르다. 여기서 Fv4-IgG1-F1009는 마우스 FcγR으로의 결합 활성이 저하되어 있어, 항원 제시 세포 상에서의 4자 복합체의 형성은 저해되고 있는 것으로 생각된다. 그 때문에 Fv4-IgG1-F1009는 혈관 내피세포나 혈구계 세포 등의 세포막 상에 발현하고 있는 FcRn에만 결합함으로써 세포내로 흡수되고 있는 것으로 생각된다. 여기서 일부의 항원 제시 세포의 세포막 상에도 FcRn이 발현하고 있는 것으로부터, Fv4-IgG1-F1009는 FcRn에만 결합함으로써도 항원 제시 세포에 흡수될 수 있다. 즉 Fv4-IgG1-F1009의 혈장 중으로부터의 급속한 소실 중 일부는 항원 제시 세포로의 흡수가 일어나고 있을 가능성이 있다.

또한 Fv4-IgG1-F1009는 인간 항체로 마우스에 있어서는 완전히 이종 단백질이다. 즉 마우스는 Fv4-IgG1-F1009에 대해 특이적으로 응답하는 많은 T세포 집단을 가지고 있는 것으로 생각된다. 항원 제시 세포에 조금이라도 흡수된 Fv4-IgG1-F1009는 세포내에서 프로세싱을 받은 후 T세포로 제시될 수 있는데, 마우스는 Fv4-IgG1-F1009에 대해 특이적으로 응답하는 많은 T세포 집단을 가지고 있기 때문에, Fv4-IgG1-F1009에 대한 면역응답이 유도되기 쉽다고도 생각된다. 실제로 참고 실시예 4에 나타낸 바와 같이 마우스에 이종 단백질인 인간 가용형 IL-6 수용체를 투여하면 인간 가용형 IL-6 수용체는 단시간에 소실되어, 인간 가용형 IL-6 수용체에 대한 면역응답이 유도된다. 인간 가용형 IL-6 수용체는 pH 중성역에 있어서의 FcRn 및 FcγR에 대한 결합 활성을 갖지 않음에도 불구하고 면역원성이 유도된 것은 인간 가용형 IL-6 수용체의 소실이 빠르고 항원 제시 세포에 흡수되는 양이 많기 때문인 것으로 생각된다.

즉 항원 결합 분자가 이종 단백질(인간 단백질을 마우스에 투여)인 경우에는, 항원 결합 분자가 동종 단백질(마우스 단백질을 마우스에 투여)인 경우와 비교하여, 항원 제시 세포 상에서의 4자 복합체의 형성을 저해함으로써 면역응답을 억제하는 것은 보다 곤란할 것으로도 생각된다.

실제로 항원 결합 분자가 항체인 경우, 인간에게 투여되는 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체인 것으로부터, 동종 단백질에 대한 면역응답이 일어나게 된다. 이에 실시예 11에 있어서 4자 복합체의 형성 저해가 면역원성의 저감으로 이어지는지 여부에 대해서 마우스 항체를 마우스에 투여함으로써 평가되었다.

〔실시예 11〕pH 중성역의 조건하에 있어서의 마우스 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 갖지 않는 마우스 항체의 in vivo 면역원성 평가

(11-1) 정상 마우스에 있어서의 in vivo 면역원성 시험

항원 결합 분자가 동종 단백질(마우스 항체를 마우스에 투여)인 경우의 항원 제시 세포 상에서의 4자 복합체의 형성을 저해하는 것에 의한 면역원성의 억제효과를 검증할 목적으로, 아래와 같은 시험이 실시되었다.

실시예 6에서 얻어진 마우스 혈장을 사용하여 아래의 방법으로 mPM1-mIgG1-mF38, mPM1-mIgG1-mF40, mPM1-mIgG1-mF14, mPM1-mIgG1-mF39에 대한 항체 생산이 평가되었다.

(11-2) 전기화학 발광법에 의한 혈장 중 항투여 검체 항체 측정

마우스의 혈장 중 항투여 검체 항체는 전기화학 발광법으로 측정되었다. MULTI-ARRAY 96 well plate에 투여 검체가 분주되고, 실온에서 1hr 반응시켰다. plate를 세정 후에 50배 희석된 마우스 혈장 측정시료가 조제되고, 실온에서 2hr 반응시켜서 세정된 후, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 투여 검체를 분주하여 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 다음날 plate를 세정 후에 Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)가 분주되고 바로 SECTOR PR 2400 reader(Meso Scale Discovery)로 측정이 행해졌다. 측정계별로 항체가 투여되어 있지 않은 개체 5개체의 혈장이 음성 대조 샘플로서 측정되고, 그 5개체의 혈장을 사용하여 측정된 수치의 평균값(MEAN)에, 5개체의 혈장을 사용하여 측정된 수치의 표준편차(SD)의 1.645배를 더한 수치(X)가 양성 판정기준으로서 사용되었다(식 3). 어느 하나의 채혈일에 있어서 1도라도 양성 판단기준을 상회하는 반응이 나타내어진 개체가 피검물질에 대한 항체생산응답이 양성인 것으로 판정되었다.

〔식 3〕

항체 생산의 양성 판정기준(X) = MEAN + 1.645×SD

(11-3) FcγR으로의 결합 활성을 저하시키는 것에 의한 in vivo 면역원성의 억제효과

그 결과를 도 28~도 31에 나타내었다. 도 28에 mPM1-mIgG1-mF14가 정상 마우스에 투여된 뒤부터 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 mPM1-mIgG1-mF14에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가가 나타내어져 있다. 투여로부터 21일 후의 시점에서 3마리의 마우스 모두에 있어서 mPM1-mIgG1-mF14에 대한 마우스 항체의 생산이 양성인 것이 나타내어졌다(양성률 3/3). 한편으로 도 29에는 mPM1-mIgG1-mF39가 정상 마우스에 투여된 뒤부터 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 mPM1-mIgG1-mF39에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가가 나타내어져 있다. 투여 후 어느 채혈일에 있어서도 3마리의 마우스 모두에 있어서 mPM1-mIgG1-mF39에 대한 마우스 항체의 생산은 음성인 것이 나타내어졌다(양성률 0/3).

도 30에 mPM1-mIgG1-mF38이 정상 마우스에 투여된 뒤부터 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 mPM1-mIgG1-mF38에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내었다. 투여로부터 28일 후의 시점에서 3마리의 마우스 중 2마리의 마우스(#1, #2)에 있어서 mPM1-mIgG1-mF38에 대한 마우스 항체의 생산이 양성인 것이 나타내어졌다(양성률 2/3). 한편으로 도 31에 mPM1-mIgG1-mF40이 정상 마우스에 투여된 뒤부터 14일 후, 21일 후 및 28일 후의 mPM1-mIgG1-mF40에 대해 생산된 마우스 항체의 항체가를 나타내었다. 투여 후 어느 채혈일에 있어서도 3마리의 마우스 모두에 있어서 mPM1-mIgG1-mF40에 대한 마우스 항체의 생산은 음성인 것이 나타내어졌다(양성률 0/3).

실시예 6에 있어서 나타내어진 바와 같이, mPM1-mIgG1-mF38에 대해 각종 마우스 FcγR으로의 결합을 저하시킨 것이 mPM1-mIgG1-mF40이고, 마찬가지로 mPM1-mIgG1-mF14에 대해 각종 마우스 FcγR으로의 결합을 저하시킨 것이 mPM1-mIgG1-mF39이다.

이들의 결과로부터 동종 단백질인 마우스 항체인 mPM1-mIgG1-mF38 및 mPM1-mIgG1-mF14를 정상 마우스에 투여해도 투여 항체에 대한 항체 생산이 확인되고 면역응답이 확인되었다. 이는 실시예 1, 2에서 나타낸 바와 같이, pH 중성역에 있어서 FcRn으로의 결합 활성을 증강시켜 항원 제시 세포 상에서 4자 복합체를 형성함으로써 항원 제시 세포로의 흡수가 촉진되었기 때문이라고 생각된다.

이러한 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자에 대해, 각종 마우스 FcγR으로의 결합을 저하시킴으로써 4자 복합체의 형성을 저해함으로써 생체내에 있어서의 면역원성을 저감하는 것이 가능한 것이 나타내어졌다.

이상의 사실로부터, in vitro 및 in vivo의 양쪽에 있어서 pH 중성역의 조건하에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자에 대해, FcγR으로의 결합 활성을 저하시킴으로써 당해 항원 결합 분자의 면역원성을 매우 유효하게 저하시키는 것이 가능한 것이 나타내어졌다. 바꿔 말하면, pH 중성역의 조건하에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자(즉 실시예 3에서 기재한 양태 1의 항원 결합 분자)는, 천연형 FcγR 결합 도메인과 같은 정도의 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자(즉 실시예 3에서 기재한 4자 복합체를 형성할 수 있는 항원 결합 분자)와 비교하여 면역원성이 현저히 저하되어 있는 것이 나타내어졌다.

〔실시예 12〕pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 인간 항체의 제작 및 평가

(12-1) pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 인간 IgG1 항체의 제작 및 평가

본 발명의 비한정의 일태양에서는 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은 Fc영역의 예로서, 상기 Fc영역의 아미노산 중 EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 270번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 325번 위치 및 329번 위치 중 어느 하나 이상의 아미노산이 천연형 Fc영역과 상이한 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역을 바람직하게 들 수 있으나, Fc영역의 개변은 상기 개변에 한정되지 않고, 예를 들면 Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685-691에 기재되어 있는 탈당쇄 (N297A, N297Q), IgG1-L234A/L235A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A, IgG4-L236E 등의 개변 및 WO 2008/092117에 기재되어 있는 G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R, N325LL328R 등의 개변 및 EU 넘버링 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 237번 위치에 있어서의 아미노산의 삽입, WO 2000/042072에 기재되어 있는 개소의 개변이어도 된다.

실시예 5에서 제작된 Fv4-IgG1-F890 및 Fv4-IgG1-F947은 pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 pH 의존적으로 인간 IL-6 수용체에 결합하는 항체이다. 이들 아미노산 서열에 아미노산 치환을 도입하고, 인간 FcγR에 대한 결합을 저하시킨 다양한 개변체가 제작되었다(표 17). 구체적으로는

VH3-IgG1-F890의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 235번 위치의 Leu가 Lys로 치환되고, 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 VH3-IgG1-F938(서열번호：156),

VH3-IgG1-F890의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 Gly가 Lys로 치환되고, 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 VH3-IgG1-F1315(서열번호：157),

VH3-IgG1-F890의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 Gly가 Arg로 치환되고, 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 VH3-IgG1-F1316(서열번호：158),

VH3-IgG1-F890의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환되고, 329번 위치의 Pro가 Lys로 치환된 VH3-IgG1-F1317(서열번호：159),

VH3-IgG1-F890의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환되고, 329번 위치의 Pro가 Arg로 치환된 VH3-IgG1-F1318(서열번호：160),

VH3-IgG1-F890의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치의 Leu가 Ala로 치환되고, 235번 위치의 Leu가 Ala로 치환된 VH3-IgG1-F1324(서열번호：161),

VH3-IgG1-F890의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치의 Leu가 Ala로 치환되고, 235번 위치의 Leu가 Ala로 치환되며, 297번 위치의 Asn이 Ala로 치환된 VH3-IgG1-F1325(서열번호：162),

VH3-IgG1-F890의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 235번 위치의 Leu가 Arg로 치환되고, 236번 위치의 Gly가 Arg로 치환되며, 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 VH3-IgG1-F1333(서열번호：163),

VH3-IgG1-F890의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 236번 위치의 Gly가 Arg로 치환되고, 328번 위치의 Leu가 Arg로 치환된 VH3-IgG1-F1356(서열번호：164),

VH3-IgG1-F947의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치의 Leu가 Ala로 치환되고, 235번 위치의 Leu가 Ala로 치환된 VH3-IgG1-F1326(서열번호：155),

VH3-IgG1-F947의 아미노산 서열의 EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치의 Leu가 Ala로 치환되고, 235번 위치의 Leu가 Ala로 치환되며, 297번 위치의 Asn이 Ala로 치환된 VH3-IgG1-F1327(서열번호：165)이 제작되었다.

(12-2) 인간 FcRn 및 인간 FcγR에 대한 결합 활성의 확인

(12-1)에서 제작된 각각의 아미노산 서열을 중쇄로서 포함하고 L(WT)-CK를 경쇄로서 포함하는 항체의 pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성(해리상수 KD)이 실시예 4의 방법을 사용하여 측정되었다. 또한 pH 7.4에 있어서의 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 실시예 7의 방법을 사용하여 측정되었다. 측정한 결과를 아래의 표 18에 나타내었다.

표 18의 결과로부터 각종 인간 FcγR에 대한 결합 활성을 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성과 비교하여 저하시키기 위해 도입되는 아미노산 개변은 특별히 한정되지 않고, 다양한 아미노산 개변에 의해 달성 가능한 것이 나타내어졌다.

(12-3) 항글리피칸 3 결합 항체의 제작

천연형 IgG1과 비교하여 FcgR으로의 결합이 저하되어 있는 개변을 발견하기 위해, IgG1의 Fc영역에 있어서 FcγR에 대한 결합 부위로 생각되는 아미노산 잔기의 개변체의 각 FcγR에 대한 결합이 망라적으로 해석되었다. 항체 H쇄로서 WO2009/041062에 개시되어 있는 혈장 중 동태가 개선된 항글리피칸 3 항체인 GpH7의 CDR을 포함하는 글리피칸 3 항체의 가변영역(서열번호：74)이 사용되었다. 마찬가지로, 항체 L쇄로서 WO2009/041062에 개시되는 혈장 중 동태가 개선된 글리피칸 3 항체의 GpL16-k0(서열번호：75)가 공통으로 사용되었다. 또한 항체 H쇄 정상영역으로서, IgG1의 C말단의 Gly 및 Lys가 결실된 G1d에 K439E의 변이가 도입된 B3(서열번호：76)가 사용되었다. 이후 이 H쇄는 GpH7-B3(서열번호：77), L쇄는 GpL16-k0(서열번호：75)로 불린다.

(12-4) 각종 FcγR에 대한 결합의 속도론적 해석

먼저 GpH7-B3/GpL16-k0를 대조로 하여 망라적으로 해석하는 것의 타당성을 검증하기 위해, GpH7-B3/GpL16-k0와 GpH7-G1d/GpL16-k0의 각 FcgR에 대한 결합능이 비교되었다(표 19). 참고 실시예 2의 방법에 의해 발현, 정제된 양 항체의 각 인간 FcγR(FcγRIa, FcγRIIa H형, FcγRIIa R형, FcγRIIb, FcγRIIIaF형)에 대한 결합이 아래의 방법으로 평가되었다.

Biacore T100(GE 헬스케어), Biacore T200(GE 헬스케어), Biacore A100, Biacore 4000을 사용하여 각 개변 항체와 상기에서 조제된 Fcγ 수용체의 상호작용이 해석되었다. 러닝 버퍼로서 HBS-EP+(GE 헬스케어)를 사용하여 25℃에서 측정되었다. Series S Sensor Chip CM5(GE 헬스케어) 또는 Series S sensor Chip CM4(GE 헬스케어)에 아민커플링법으로 항원 펩티드, ProteinA(Thermo Scientific), Protein A/G(Thermo Scientific), Protein L(ACTIGEN 또는 BioVision)이 고정화된 칩 또는 Series S Sensor Chip SA(certified)(GE 헬스케어)에 대해 사전에 비오틴화해둔 항원 펩티드를 상호작용시켜 고정화한 칩이 사용되었다. 이들의 센서칩에 목적의 항체를 캡쳐시키고, 러닝 버퍼로 희석된 Fcγ 수용체를 상호작용시켜 항체에 대한 결합량이 측정되었다. 당해 결합량은 항체 간에 비교되었다. 단 Fcγ 수용체의 결합량은 캡쳐한 항체의 양에 의존하기 때문에, 각 항체의 캡쳐량으로 Fcγ 수용체의 결합량을 나눈 보정값이 비교되었다. 10 mM glycine-HCl, pH 1.5를 반응시킴으로써 센서칩에 캡쳐한 항체를 세정함으로써 재생된 센서칩이 반복해서 사용되었다.

각각의 FcγR과의 상호작용 해석결과로부터 아래의 방법에 따라 결합의 강도가 해석되었다. GpH7-B3/GpL16-k0의 FcγR에 대한 결합량의 값을 GpH7-G1d/GpL16-k0의 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누고, 그 값을 추가로 100배한 값이 각 FcγR에 대한 상대적인 결합 활성의 지표로서 표시되었다. 표 19에 나타내어진 결과로부터, GpH7-B3/GpL16-k0의 각 FcgR에 대한 결합은 GpH7-G1d/GpL16-k0의 그것과 같은 정도였던 것으로부터, 이것 이후의 검토에 있어서 GpH7-B3/GpL16-k0를 대조로서 사용하는 것이 가능한 것으로 판단되었다.

(12-5) Fc 변이체의 제작과 평가

다음으로 GpH7-B3의 아미노산 서열에 있어서 FcγR의 결합에 관여하는 것으로 생각되는 아미노산과 그 주변의 아미노산(EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치~239번 위치, 265번 위치~271번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 298번 위치, 300번 위치, 324번 위치~337번 위치)이 원래의 아미노산과 Cys를 제외한 18종류의 아미노산으로 각각 치환되었다. 이들의 Fc 변이체는 B3 variant로 불린다. 참고 실시예 2의 방법에 의해 발현, 정제된 B3 variant의 각 FcγR(FcγRIa, FcγRIIa H형, FcγRIIa R형, FcγRIIb, FcγRIIIaF형)에 대한 결합이 (12-4)의 방법에 의해 망라적으로 평가되었다.

각각의 FcγR과의 상호작용의 해석결과로부터, 아래의 방법에 따라 결합의 강도가 평가되었다. 각 B3 variant에 유래하는 항체의 FcγR에 대한 결합량의 값을, B3에 변이를 도입하지 않은 비교 대상이 되는 항체(EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치~239번 위치, 265번 위치~271번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 298번 위치, 300번 위치, 324번 위치~337번 위치가 인간 천연형 IgG1의 서열을 갖는 항체)의 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누었다. 그 값을 추가로 100배한 값이 각 FcγR에 대한 상대적인 결합 활성의 지표로서 표시되었다.

해석된 개변체 중에서 모든 FcgR에 대해 결합을 저하시키는 개변을 표 21에 나타내었다. 표 20에 나타낸 236종류의 개변은 개변을 도입하기 전의 항체(GpH7-B3/GpL16-k0)와 비교하여 적어도 1종류의 FcgR에 대한 결합을 저감하는 개변이고, 천연형 IgG1에 도입한 경우도 마찬가지로 적어도 1종류의 FcgR에 대한 결합을 저감하는 효과가 있는 개변인 것으로 생각되었다.

그 때문에 각종 인간 FcγR에 대한 결합 활성을 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성과 비교하여 저하시키기 위해 도입되는 아미노산 개변은 특별히 한정되지 않고, 표 20에 나타내어진 아미노산 개변을 적어도 1개소 도입함으로써 달성 가능한 것이 나타내어졌다. 또한 여기서 도입되는 아미노산 개변은 1개소여도 되고 복수 개소의 조합이어도 된다.

(12-6) pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 인간 IgG2 및 인간 IgG4 항체의 제작 및 평가

인간 IgG2 또는 인간 IgG4를 사용하여 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 Fc영역을 아래와 같이 제작하였다.

인간 IgG2를 정상영역으로서 갖는 인간 IL-6 수용체 결합 항체로서, VH3-IgG2(서열번호：166)를 중쇄로서 포함하고 L(WT)-CK(서열번호：41)를 경쇄로서 포함하는 항체가 참고 실시예 2에 나타낸 방법으로 제작되었다. 마찬가지로, 인간 IgG4를 정상영역으로서 갖는 인간 IL-6 수용체 결합 항체로서, VH3-IgG4(서열번호：167)를 중쇄로서 포함하고 L(WT)-CK(서열번호：41)를 경쇄로서 포함하는 항체가 참고 실시예 2에 나타낸 방법으로 제작되었다.

VH3-IgG2 및 VH3-IgG4에 대해 pH 중성역 조건하에서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 부여하기 위해 각각의 정상영역에 아미노산 개변이 도입되었다. 구체적으로는 VH3-IgG2 및 VH3-IgG4에 대해 EU 넘버링으로 표시되는 252번 위치의 Met가 Tyr로 치환되고, 434번 위치의 Asn이 Tyr로 치환되며, 436번 위치의 Tyr이 Val로 치환된 VH3-IgG2-F890(서열번호：168) 및 VH3-IgG4-F890(서열번호：169)이 제작되었다.

VH3-IgG2-F890 및 VH3-IgG4-F890에 대해 인간 FcγR에 대한 결합을 저하시키기 위해 각각의 정상영역에 아미노산 개변이 도입되었다. 구체적으로는 VH3-IgG2-F890에 대해 EU 넘버링으로 표시되는 235번 위치의 Ala가 Arg로 치환되고, 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 VH3-IgG2-F939(서열번호：170)가 제작되었다. 또한 VH3-IgG4-F890에 대해 EU 넘버링으로 표시되는 235번 위치의 Leu가 Arg로 치환되고, 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 VH3-IgG4-F939(서열번호：171)가 제작되었다.

제작된 VH3-IgG2-F890, VH3-IgG4-F890, VH3-IgG2-F939 또는 VH3-IgG4-F939를 중쇄로서 포함하고 L(WT)-CK(서열번호：41)를 경쇄로서 포함하는 항체가 참고 실시예 2에 나타낸 방법으로 제작되었다.

(12-7) pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 인간 IgG2 및 인간 IgG4 항체의 평가

(12-6)에서 제작된 항체(표 21)의 pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성(해리상수 KD)이 실시예 4의 방법을 사용하여 측정되었다. 또한 pH 7.4에 있어서의 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 실시예 7의 방법을 사용하여 측정되었다. 측정한 결과를 아래의 표 22에 나타내었다.

표 22의 결과로부터 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 인간 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 FcγR 결합 도메인의 결합 활성보다도 낮은 Fc영역으로서는 인간 IgG1에는 특별히 한정되지 않고, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4를 사용함으로써도 달성 가능한 것이 나타내어졌다.

〔실시예 13〕FcRn 결합 도메인을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽만 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합을 갖는 항원 결합 분자의 제작과 평가

실시예 3에 있어서 양태 3으로서 나타내어진 FcRn 결합 도메인을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽만 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합을 갖고, 다른 한쪽은 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자의 제작이 아래와 같이 행해졌다.

(13-1) FcRn 결합 도메인을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽만 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 다른 한쪽은 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자의 제작

먼저 pH 중성역의 조건하에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 갖는 항인간 IL-6R 항체의 중쇄로서, VH3-IgG1-F947(서열번호：70)이 참고 실시예 1의 방법으로 제작되었다. 또한 pH 산성역 및 pH 중성역 양쪽의 조건하에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자로서, VH3-IgG1에 대해 EU 넘버링으로 표시되는 253번 위치의 Ile를 Ala로 치환하는 아미노산을 더하여 VH3-IgG1-F46(서열번호：71)이 제작되었다.

항체의 헤테로 이량체를 고순도로 얻기 위한 방법으로서, 항체 중 한쪽의 Fc영역이 EU 넘버링으로 표시되는 356번 위치의 Asp가 Lys로, EU 넘버링으로 표시되는 357번 위치의 Glu가 Lys로 치환되어 있고, 다른 한쪽의 Fc영역이 EU 넘버링으로 표시되는 370번 위치의 Lys가 Glu로, EU 넘버링으로 표시되는 435번 위치의 His가 Arg로 및 EU 넘버링으로 표시되는 439번 위치의 Lys가 Glu로 치환된 Fc영역을 사용하는 것이 알려져 있다(WO2006/106905).

VH3-IgG1-F947의 EU 넘버링으로 표시되는 356번 위치의 Asp가 Lys로 및 EU 넘버링으로 표시되는 357번 위치의 Glu가 Lys로 치환된 VH3-IgG1-FA6a(서열번호：72)가 제작되었다(이하, 중쇄 A로 불린다). 또한 VH3-IgG1-F46의 EU 넘버링으로 표시되는 370번 위치의 Lys가 Glu로, EU 넘버링으로 표시되는 435번 위치의 His가 Arg로 및 EU 넘버링으로 표시되는 439번 위치의 Lys가 Glu로 치환된 VH3-IgG1-FB4a(서열번호：73)가 제작되었다(이하, 중쇄 B로 불린다)(표 23).

참고 실시예 2의 방법을 참고로 중쇄 플라스미드로서 VH3-IgG1-FA6a 및 VH3-IgG1-FB4a를 등량씩 첨가함으로써, 중쇄로서 VH3-IgG1-FA6a 및 VH3-IgG1-FB4a를 갖고 경쇄로서 VL3-CK를 갖는 Fv4-IgG1-FA6a/FB4a가 제작되었다.

(13-2) FcRn 결합 도메인을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽만 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 다른 한쪽은 중성역의 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자의 PK 시험

Fv4-IgG1-F947 및 Fv4-IgG1-FA6a/FB4a가 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여되었을 때의 PK 시험이 하기의 방법으로 실시되었다.

인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104)의 배부 피하에 항인간 IL-6 수용체 항체가 1 ㎎/㎏으로 단회 투여되었다. 항인간 IL-6 수용체 항체의 투여 후 15분, 7시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 7일의 시점에서 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다.

마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체농도는 실시예 4의 방법과 동일하게 ELISA법으로 측정되었다. 그 결과를 도 32에 나타내었다. 인간 FcRn에 대해 2개소의 결합영역을 매개로 2분자의 FcRn에 결합할 수 있는 Fv4-IgG1-F947에 비해, 인간 FcRn에 대해 1개소의 결합영역을 매개로 1분자의 FcRn에만 결합할 수 있는 Fv4-IgG1-FA6a/FB4a는 높은 혈장 중 농도 추이가 나타내어졌다.

전술한 바와 같이, IgG의 Fc영역에는 2개의 FcRn 결합영역이 존재하는데, 2개의 FcRn 결합영역 중 편측의 FcRn 결합영역을 결손시킨 Fc를 갖는 분자는 천연형의 Fc를 갖는 분자와 비교하여 혈장 중으로부터의 소실이 빨라지는 것이 보고되어 있다(Scand J Immunol 1994;40:457-465.). 즉 pH 산성역의 조건하에서 FcRn에 결합하는 2개의 결합영역을 갖는 IgG는 하나의 FcRn 결합영역을 갖는 IgG에 비해 혈장 중 체류성이 향상되는 것이 알려져 있다. 이 사실로부터, 세포내에 흡수된 IgG는 엔도솜 내에 있어서 FcRn에 결합함으로써 재차 혈장 중으로 리사이클되는데, 천연형 IgG는 2개소의 FcRn 결합영역을 매개로 2분자의 FcRn에 결합하는 것이 가능하기 때문에, 높은 결합능으로 FcRn에 결합하고 그 대부분이 리사이클되고 있는 것으로 생각된다. 한편 하나의 FcRn 결합영역만 갖는 IgG는 엔도솜 내에 있어서의 FcRn으로의 결합능이 낮아 충분히 리사이클되는 것이 불가능하기 때문에, 혈장 중으로부터의 소실이 빨라지는 것으로 생각되고 있었다.

그 때문에 도 32에서 나타낸 바와 같은 pH 중성역의 조건하에 있어서 1개소의 FcRn 결합영역을 갖는 Fv4-IgG1-FA6a/FB4a에 있어서 혈장 중 체류성의 향상이 보인다는 현상은 천연형 IgG의 경우와는 반대인 것으로부터 완전히 예상외의 것이었다.

본 발명은 특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 이러한 높은 혈장 중 농도 추이가 관찰된 이유로서는 항체를 마우스의 피하에 투여했을 때의 피하로부터의 흡수율이 증가하고 있는 것을 이유로서 들 수 있다.

일반적으로 피하에 투여된 항체는 림프계를 매개로 흡수되어 혈장 중으로 이행하는 것으로 생각되고 있다(J. Pharm. Sci. (2000) 89 (3), 297-310.). 림프계에는 다량의 면역세포가 존재하기 때문에, 피하에 투여된 항체는 다량의 면역세포에 폭로된 후 혈장 중으로 이행하는 것으로 생각된다. 일반적으로 항체 의약품이 피하 투여된 경우, 정맥내 투여된 경우와 비교하여 면역원성이 높아지는 것이 알려져 있는데, 그 하나의 원인으로서 피하에 투여된 항체가 림프계에 있어서 다량의 면역세포에 폭로되는 것이 생각된다. 실제로 실시예 1에 있어서 나타내어진 바와 같이, Fv4-IgG1-F1은 피하 투여된 경우에 있어서는 Fv4-IgG1-F1의 혈장 중으로부터의 급속한 소실이 확인되어 Fv4-IgG1-F1에 대한 마우스 항체의 생산이 시사되었다. 한편으로 정맥내 투여된 경우에 있어서는 Fv4-IgG1-F1의 혈장 중으로부터의 급속한 소실은 확인되지 않아 Fv4-IgG1-F1에 대한 마우스 항체는 생산되고 있지 않은 것이 시사되었다.

즉 피하에 투여된 항체가 그 흡수과정에 있어서 림프계에 존재하는 면역세포에 흡수되면, 생물학적 이용률(Bioavailablity)의 저하가 일어나는 동시에 면역원성의 원인으로도 될 수 있다.

그러나 실시예 3에 있어서 양태 3으로서 나타내어진 FcRn 결합 도메인을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽만 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합을 갖고, 다른 한쪽은 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자가 피하에 투여된 경우에는, 그 흡수과정에 있어서 림프계에 존재하는 면역세포에 폭로되어도 면역세포의 세포막 상에 있어서 4자 복합체가 형성되지 않을 것으로 생각된다. 그 때문에 림프계에 존재하는 면역세포로의 흡수가 저해됨으로써 생물학적 이용률(Bioavailablity)의 상승이 일어나, 그 결과로서 혈장 중 농도의 상승이 일어난 것으로도 생각될 수 있다.

이러한 피하에 투여된 항체의 생물학적 이용률(Bioavailablity)을 상승시킴으로써 혈장 중 농도를 상승시키거나 또는 면역원성을 저하시키는 방법은 실시예 3에 있어서 양태 3으로서 나타내어진 항원 결합 분자에 한정되지 않고, 면역세포의 세포막 상에서 4자 복합체를 형성하지 않는 항원 결합 분자라면 어느 것을 사용해도 될 것으로 생각된다. 즉 양태 1, 2, 3의 어느 항원 결합 분자에 있어서도 4자 복합체를 형성 가능한 항원 결합 분자에 비해 피하에 투여되었을 때의 생물학적 이용률(Bioavailablity)을 상승시키는 동시에 혈장 중 체류성을 향상시키며, 또한 면역원성을 저하시키는 것이 가능할 것으로 생각된다.

혈장 중을 체류하는 항원 결합 분자는 항상 그 일부가 림프계로도 이행하고 있는 것으로 생각된다. 또한 혈장 중에 있어서도 면역세포는 존재한다. 그 때문에 본 발명의 적응이 특정 투여경로에 한정되는 일은 결코 없으나, 특히 효과를 발휘하기 쉬울 것으로 기대되는 예를 들자면, 항원 결합 분자의 흡수과정에 있어서 림프계를 매개로 하는 투여경로인 것이 생각되고, 그 일례로서는 피하 투여를 들 수 있다.

〔실시예 14〕pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 억제형 FcγR에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는 항체의 제작

또한 중성 조건하에서의 FcRn으로의 결합을 증강시킨 항원 결합 분자에 대해 억제형 FcγRIIb에 대한 선택적인 결합 활성의 증강을 초래하는 개변을 사용함으로써, 실시예 3에서 나타내어진 양태 2의 항원 결합 분자를 제작하는 것이 가능하다. 즉 중성 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 또한 억제형 FcγRIIb에 대한 선택적인 결합 활성의 증강을 초래하는 개변이 도입된 항원 결합 분자는 2분자의 FcRn과 1분자의 FcγR을 매개로 한 4자 복합체를 형성할 수 있다. 그러나 당해 개변의 효과에 의해 억제성 FcγR에 대한 선택적 결합이 초래되어 있기 때문에 활성형 FcγR에 대한 결합 활성은 저하되어 있다. 그 결과 항원 제시 세포 상에서는 억제형 FcγR을 포함하는 4자 복합체가 우위로 형성될 것으로 생각된다. 전술한 바와 같이, 면역원성에는 활성형 FcγR을 포함하는 4자 복합체의 형성이 원인이 될 것으로 생각되어, 이와 같이 억제형 FcγR을 포함하는 4자 복합체를 형성시킴으로써 면역응답의 억제가 가능할 것으로 생각된다.

이에 억제형 FcγRIIb에 대한 선택적인 결합 활성의 증강을 초래하는 아미노산 변이를 발견하기 위해, 아리에 나타내는 검토가 실시되었다.

(14-1) Fc 개변체의 FcγR에 대한 결합의 망라적 해석

천연형 IgG1과 비교하여 활성형 FcγR, 특히 FcγRIIa의 H형 및 R형 중 어느 유전자 다형에 대해서도 Fc를 매개로 한 결합이 감소하며, 또한 FcγRIIb에 대한 결합이 증강되는 변이가 도입된 복수의 IgG1 항체 개변체의 각 FcγR에 대한 결합 활성이 망라적으로 해석되었다.

항체 H쇄에는 WO2009/041062에 개시되어 있는 혈장 중 동태가 개선된 항글리피칸 3 항체인 GpH7의 CDR을 포함하는 글리피칸 3 항체의 가변영역(서열번호：74)이 사용되었다. 마찬가지로, 항체 L쇄에는 WO2009/041062에 개시되는 혈장 중 동태가 개선된 글리피칸 3 항체의 GpL16-k0(서열번호：75)가 다른 H쇄와의 조합에 있어서 공통으로 사용되었다. 또한 항체 H쇄 정상영역으로서 IgG1의 C말단의 Gly 및 Lys가 결실된 G1d에 K439E의 변이가 도입된 B3(서열번호：76)가 사용되었다. 이후 이 H쇄는 GpH7-B3(서열번호：77), L쇄는 GpL16-k0(서열번호：75)로 각각 불린다.

GpH7-B3에 대해 FcγR의 결합에 관여하는 것으로 생각되는 아미노산과 그 주변의 아미노산(EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치~239번 위치, 265번 위치~271번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 298번 위치, 300번 위치, 324번 위치~337번 위치)이 개변 전의 아미노산과 Cys를 제외한 18종류의 아미노산으로 각각 치환되었다. 이들의 Fc 개변체는 B3 variant로 불린다. 참고 실시예 2의 방법에 의해 발현 및 정제된 B3 variant의 각 FcγR(FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb, FcγRIIIa)에 대한 결합 활성이 실시예 9에 기재되는 방법에 준하여 망라적으로 평가되었다.

각각의 FcγR에 대해서 아래의 방법에 따라 도면이 제작되었다. 각 B3 variant에 유래하는 항체와 각 FcγR에 대한 결합량의 값이 B3에 전혀 변이가 도입되어 있지 않은 대조 항체(EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치~239번 위치, 265번 위치~271번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 298번 위치, 300번 위치, 324번 위치~337번 위치가 인간 천연형 IgG1의 서열을 갖는 항체)의 값으로 나누어졌다. 그 값에 추가로 100을 곱한 값이 각 FcγR에 대한 결합의 값으로서 표시되었다. 가로축에 각 변이체의 FcγRIIb에 대한 결합, 세로축에 각 변이체의 각 활성형 FcγR인 FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIIa의 값을 각각 표시하였다(도 33, 34, 35, 36).

그 결과 도 33~36에 라벨로 표시한 바와 같이, 전체 개변 중 mutation A(EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 개변) 및 mutation B(EU 넘버링으로 표시되는 328번 위치의 Leu가 Glu로 치환된 개변) 천연형 IgG1과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합이 현저히 증강되어, FcγRIIa의 양 타입에 대한 결합을 현저히 억제하는 효과가 있는 것을 발견하였다.

(14-2) FcγRIIb 선택적 결합 개변체의 SPR 해석

(14-1)에서 발견된 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 개변체의 각 FcγR에 대한 결합이 보다 상세하게 해석되었다.

항체 H쇄 가변영역으로서 WO2009/125825에 개시되는 인간 인터류킨 6 수용체에 대한 항체의 가변영역인 IL6R-H의 가변영역(서열번호：78)과, 항체 H쇄 정상영역으로서 인간 IgG1의 C말단의 Gly 및 Lys가 제거된 G1d 정상영역을 포함하는 IL6R-G1d(서열번호：79)가 IgG1의 H쇄로서 사용되었다. IL6R-G1d의 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 개변된 IL6R-G1d_v1(서열번호：80)이 제작되었다. 다음으로 IL6R-G1d의 EU 넘버링으로 표시되는 328번 위치의 Leu가 Glu로 개변된 IL6R-G1d_v2(서열번호：81)가 제작되었다. 또한 비교를 위해 공지의 변이(Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933)인 EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 Ser이 Glu로 치환되고, EU 넘버링으로 표시되는 328번 위치의 Leu가 Phe로 치환된 IL6R-G1d의 개변체인 IL6R-G1d_v3(서열번호：82)가 제작되었다. 항체 L쇄로서는 토실리주맙의 L쇄인 IL6R-L(서열번호：83)이 이들 중쇄와의 조합에 있어서 공통으로 사용되었다. 참고 실시예 2의 방법에 따라 항체가 발현, 정제되었다. 항체 H쇄로서 IL6R-G1d, IL6R-G1d_v1, IL6R-G1d_v2, IL6R-G1d_v3를 포함하는 항체는 이하 각각 IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2, IgG1-v3로 불린다.

다음으로 이들 항체와 FcγR의 상호작용이 Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 속도론적으로 해석되었다. 러닝 버퍼로서 HBS-EP+(GE Healthcare)를 사용하여 당해 상호작용이 25℃의 온도에서 측정되었다. 아민커플링법으로 Protein A가 고정화된 Series S Sencor Chip CM5(GE Healthcare)가 사용되었다. 목적의 항체를 캡쳐시킨 칩에 대해, 러닝 버퍼로 희석된 각 FcγR을 작용시킴으로써 각 FcγR의 항체에 대한 결합이 측정되었다. 측정 후에는 10 mM glycine-HCl, pH 1.5를 반응시킴으로써 칩에 캡쳐된 항체가 세정되었다. 이와 같이 재생된 칩은 반복해서 사용되었다. Biacore Evaluation Software를 사용하여 측정결과를 1:1 Langmuir binding model로 global fitting함으로써 산출된 결합속도상수 ka(L/mol/s), 해리속도상수 kd(1/s)로부터 해리상수 KD(mol/L)가 산출되었다.

IgG1-v1과 IgG1-v2의 FcγRIIa(H) 또는 FcγRIIIa에 대한 결합은 미약하였기 때문에, Biacore Evaluation Software를 사용하여 측정결과를 상기 1:1 Langmuir binding model로 global fitting함으로써는 KD가 산출되지 않았다. IgG1-v1과 IgG1-v2의 FcγRIIa(H) 또는 FcγRIIIa의 상호작용에 대해서는 Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE에 기재되어 있는 아래의 1:1 결합 모델식을 이용함으로써 KD가 산출되었다.

1:1 binding model로 상호작용하는 분자의 Biacore 상에서의 거동은 아래의 식 4로 나타내어질 수 있다.

〔식 4〕

Req=C×Rmax/(KD + C) + RI

상기 〔식 4〕 중의 각 항목의 의미는 하기；

Req(RU): 정상상태 결합 레벨(Steady state binding levels)

C(M): 애널라이트 농도(Analyte concentration)

C: concentration

Rmax(RU):애널라이트의 표면 결합능(Analyte binding capacity of the surface)

RI(RU):시료 중의 용적 굴절률 기여(Bulk refractive index contribution in the sample)

KD(M): 평형 해리상수(Equilibrium dissociation constant)

로 나타내어진다.

이 식 4를 변형하면 KD는 아래의 식 5와 같이 나타낼 수 있다.

〔식 5〕

KD = C×Rmax/(Req - RI) - C

이 식에 Rmax, RI, C의 값을 대입함으로써 KD가 산출될 수 있다. 금번의 측정 조건에서는 RI=0, C=2 μmol/L이 대입되었다. Rmax에는 각 FcγR에 대한 IgG1의 상호작용 해석결과에 대해서 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시켰을 때에 얻어진 Rmax의 값을 IgG1의 캡쳐량으로 나누고, IgG1-v1, IgG1-v2의 캡쳐량으로 곱하여 얻어진 값으로 하였다.

금번의 측정 조건에서는 FcγRIIa(H)에 대한 IgG1-v1, IgG1-v2의 결합은 각각 약 2.5, 10 RU, FcγRIIIa에 대한 IgG1-v1, IgG1-v2의 결합은 각각 약 2.5, 5 RU였다. FcγRIIa(H)에 대한 IgG1의 상호작용을 해석했을 때의 IgG1-v1, IgG1-v2의 항체의 센서칩의 캡쳐량은 469.2, 444.2 RU이고, FcγRIIIa에 대한 IgG1의 상호작용을 해석했을 때의 IgG1-v1, IgG1-v2의 항체의 센서칩의 캡쳐량은 470.8, 447.1 RU였다. 또한 FcγRIIa H형, FcγRIIIa에 대한 IgG1의 상호작용 해석결과에 대해서 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시켰을 때에 얻어진 Rmax는 각각 69.8, 63.8 RU, 항체의 센서칩으로의 캡쳐량은 452, 454.5 RU였다. 이들 값을 사용하여 FcγRIIa(H)에 대한 IgG1-v1, IgG1-v2의 Rmax는 각각 72.5, 68.6 RU, FcγRIIIa에 대한 IgG1-v1, IgG1-v2의 Rmax는 각각 66.0, 62.7 RU로 산출되었다. 이들 값을 식 5의 식에 대입하여 IgG1-v1, IgG1-v2의 FcγRIIa(H) 및 FcγRIIIa에 대한 KD가 산출되었다.

〔식 5〕

KD = C×Rmax/(Req - RI) - C

IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2, IgG1-v3의 각 FcγR에 대한 KD값을 표 24(각 항체의 각 FcγR에 대한 KD값)에, 또한 IgG1의 각 FcγR에 대한 KD값을 IgG1-v1, IgG1-v2, IgG1-v3의 각 FcγR에 대한 KD값으로 나눈 IgG1-v1, IgG1-v2, IgG1-v3의 상대적인 KD값을 표 25(각 항체의 각 FcγR에 대한 상대적인 KD값)에 나타내었다.

상기 표 24 중 *는 FcγR의 IgG에 대한 결합이 충분히 관찰되지 않았기 때문에 식 5의 식을 이용하여 산출된 KD가 표시되어 있다.

〔식 5〕

KD = C×Rmax/(Req - RI) - C

표 25에 나타내어진 바와 같이, IgG1과 비교하여 IgG1-v1은 FcγRIa에 대한 친화성이 0.047배로 저하되고, FcγR IIa(R)에 대한 친화성은 0.10배로 저하되며, FcγRIIa(H)에 대한 친화성이 0.014배로 저하되고, FcγRIIIa에 대한 친화성은 0.061배로 저하되어 있었다. 한편으로 FcγRIIb에 대한 친화성은 4.8배 향상되어 있었다.

또한 표 25에 나타낸 바와 같이, IgG1과 비교하여 IgG1-v2는 FcγRIa에 대한 친화성이 0.74배로 저하되고, FcγR IIa(R)에 대한 친화성은 0.41배로 저하되며, FcγRIIa(H)에 대한 친화성이 0.064배로 저하되고, FcγRIIIa에 대한 친화성은 0.14배로 저하되어 있었다. 한편으로 FcγRIIb에 대한 친화성은 2.3배 향상되어 있었다.

즉 이 결과로부터 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 IgG1-v1 및 EU 넘버링으로 표시되는 328번 위치의 Leu가 Glu로 치환된 IgG1-v2는 FcγRIIa의 양 유전자 다형을 포함하는 활성형의 전체 FcγR에 대한 결합이 감소되어 있는 한편으로 억제형 FcγR인 FcγRIIb에 대한 결합이 증가되어 있는 것이 명확해졌다. 이러한 성질을 갖는 개변체는 지금까지 보고가 없고, 또한 도 33~36에 나타낸 바와 같이 매우 흔하지 않다. EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 개변체나 EU 넘버링으로 표시되는 328번 위치의 Leu가 Glu로 치환된 개변체는 면역 염증성 질환 등의 치료제의 개발에 매우 유용하다.

또한 표 25에 나타낸 바와 같이 IgG1-v3는 확실히 FcγRIIb에 대한 결합이 408배 향상되고, FcγRIIa(H)에 대한 결합은 0.51배로 감소되어 있지만, 한편으로 FcγRIIa(R)에 대한 결합이 522배 향상되어 있다. 즉 IgG1-v1 및 IgG1-v2는 FcγRIIa(R) 및 FcγRIIa(H) 양쪽에 대한 결합이 억제되며, 또한 FcγRIIb에 대한 결합이 향상되는 것으로부터, IgG1-v3와 비교하여 FcγRIIb에 대해 보다 선택적으로 결합하는 개변체인 것으로 생각된다. 즉 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 개변체나 EU 넘버링으로 표시되는 328번 위치의 Leu가 Glu로 치환된 개변체는 면역 염증성 질환 등의 치료제의 개발에 매우 유용하다.

(14-3) FcγRIIb에 대한 선택적 결합의 개변과 다른 Fc영역의 아미노산 치환의 조합에 의한 효과

(14-2)에 있어서 인간 천연형 IgG1의 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 개변체 또는 EU 넘버링으로 표시되는 328번 위치의 Leu가 Glu로 치환된 개변체는 FcγRIa, FcγRIIIa 및 FcγRIIa 중 어느 유전자 다형에 대해서도 Fc를 매개로 한 결합이 감소하고, 또한 FcγRIIb에 대한 결합이 향상되는 것이 발견되었다. 이에 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 개변체 또는EU 넘버링으로 표시되는 328번 위치의 Leu가 Glu로 치환된 개변체에 대해, 추가로 아미노산 치환을 도입함으로써 FcγRI, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIIa 중 어느 하나에 대한 결합이 추가로 저감되었거나 또는 FcγRIIb에 대한 결합이 추가로 향상된 Fc 개변체의 창출이 행해진다.

(14-4) pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합 활성을 갖고 인간 FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합 활성이 증강된 항체의 제작

VH3-IgG1 및 VH3-IgG1-F11에 대해, 인간 FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합 활성을 증강시키기 위해 아래의 방법으로 항체를 제작하였다. VH3-IgG1에 대해 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro를 Asp로 치환하기 위한 아미노산 치환이 참고 실시예 1의 방법으로 도입되어 VH3-IgG1-F648(서열번호：84)이 제작되었다. 마찬가지로 VH3-IgG1-F11에 대해 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro를 Asp로 치환하기 위한 아미노산 치환이 참고 실시예 1의 방법으로 도입되어 VH3-IgG1-F652(서열번호：85)가 제작되었다.

(14-5) pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합 활성을 갖고 인간 FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합 활성이 증강된 항체의 평가

VH3-IgG1, VH3-IgG1-F648, VH3-IgG1-F11, 또는 VH3-IgG1-F652를 중쇄로서 포함하고 L(WT)-CK를 경쇄로서 포함하는 항체가 참고 실시예 2의 방법으로 제작되었다.

이들 항체와 FcγRIIa(R) 및 FcγRIIb의 상호작용을 Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 해석하였다. 러닝 버퍼로서 20 mM ACES, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, pH 7.4를 사용하여 25℃의 온도에서 측정하였다. 아민커플링법으로 Protein L이 고정화된 Series S Sencor Chip CM4(GE Healthcare)를 사용하였다. 목적의 항체를 캡쳐시킨 칩에 대해 러닝 버퍼로 희석된 각 FcγR을 작용시킴으로써 각 FcγR의 항체에 대한 상호작용을 측정하였다. 측정 후에는 10 mM glycine-HCl, pH 1.5를 반응시킴으로써 칩에 캡쳐된 항체를 세정하고, 이와 같이 재생한 칩은 반복해서 사용되었다.

측정결과는 Biacore Evaluation Software를 사용하여 해석하였다. Protein L에 항체를 캡쳐시키고, 그 항체를 캡쳐시킨 전후에서의 센서그램의 변화량을 X1으로 하였다. 다음으로 그 항체에 인간 FcγRs를 상호작용시키고, 그 전후에서의 센서그램의 변화량(△A1)으로서 표시된 인간 FcγRs의 결합 활성을 각 항체의 캡쳐량(X)으로 나눈 값을 1500배한 값으로부터, Protein L에 캡쳐시킨 항체에 러닝 버퍼를 상호작용시킨 전후에서의 센서그램의 변화량(△A2)으로서 표시된 인간 FcγRs의 결합 활성을 뺀 값을, 각 항체의 캡쳐량(X)으로 나눈 값을 1500배한 값(Y)을 인간 FcγRs의 결합 활성으로 하였다(식 1).

〔식 1〕

마우스 FcγRs의 결합 활성(Y) = (△A1 - △A2)/X×1500

결과를 아래의 표 26에 나타내었다. EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro를 Asp로 치환하는 변이를 도입함으로써 인간 FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합 활성이 증강되는 효과는, pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합 활성을 갖는 항체에 도입한 경우에 있어서도 동등하게 보이는 것이 확인되었다.

여기에서 얻어진 IgG1-F652는 pH 중성역의 조건하에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 억제성 FcγRIIb에 대한 선택적인 결합 활성의 증강이 초래된 항체이다. 즉 실시예 3에서 나타내어진 양태 2의 항원 결합 분자에 해당한다. 즉 IgG1-F652는 2분자의 FcRn과 1분자의 FcγR을 매개로 한 4자 복합체를 형성할 수 있는데, 억제성 FcγR에 대한 선택적인 결합 활성의 증강이 초래되고 있기 때문에 활성형 FcγR에 대한 결합 활성은 저하되고 있다. 그 결과 항원 제시 세포 상에서는 억제형 FcγR을 포함하는 4자 복합체가 우위로 형성되는 것으로 생각된다. 전술한 바와 같이, 면역원성에는 활성형 FcγR을 포함하는 4자 복합체의 형성이 원인이 되는 것으로 생각되고, 이와 같이 억제형 FcγR을 포함하는 4자 복합체를 형성시킴으로써 면역응답의 억제가 가능한 것으로 생각된다.

〔참고 실시예 1〕 아미노산이 치환된 IgG 항체의 발현 벡터의 구축

QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하여 첨부 설명서에 기재된 방법으로 제작된 변이체를 포함하는 플라스미드 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입함으로써 목적의 H쇄 발현 벡터 및 L쇄 발현 벡터가 제작되었다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정되었다.

〔참고 실시예 2〕IgG 항체의 발현과 정제

항체의 발현은 아래의 방법을 사용하여 행해졌다. 인간 태아 신장암 세포 유래 HEK293H주(Invitrogen)를 10% Fetal Bovine Serum(Invitrogen)을 포함하는 DMEM배지(Invitrogen)로 현탁하고, 5~6×10⁵ 세포/mL의 세포밀도로 접착세포용 접시(직경 10 ㎝, CORNING)의 각 접시로 10 mL씩 파종하고 CO₂ 인큐베이터(37℃, 5% CO₂) 내에서 하루 배양한 후에, 배지를 흡인 제거하고, CHO-S-SFM-II(Invitrogen)배지 6.9 mL를 첨가하였다. 조제한 플라스미드를 lipofection법으로 세포로 도입하였다. 얻어진 배양상청을 회수한 후, 원심분리(약 2000 g, 5분간, 실온)하여 세포를 제거하고, 추가로 0.22 ㎛ 필터 MILLEX(R)-GV(Millipore)를 통과시켜 멸균하여 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청에 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 정제하였다. 정제 항체농도는 분광 광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 값으로부터 Protein Science 1995; 4:2411-2423에 기재된 방법으로 산출된 흡광계수를 사용하여 항체농도를 산출하였다.

〔참고 실시예 3〕 가용형 인간 IL-6 수용체(hsIL-6R)의 조제

항원인 인간 IL-6 수용체의 재조합 인간 IL-6 수용체는 아래와 같이 조제되었다. J. Immunol. (1994) 152, 4958-4968에서 보고되어 있는 N말단측 1번째~357번째의 아미노산 서열로 이루어지는 가용형 인간 IL-6 수용체(이하, hsIL-6R으로도 표기된다)를 정상적으로 발현하는 CHO주가 당업자 공지의 방법으로 구축되었다. 당해 CHO주를 배양함으로써 가용형 인간 IL-6 수용체를 발현시켰다. 얻어진 당해 CHO주의 배양상청으로부터 Blue Sepharose 6 FF 칼럼 크로마토그래피, 겔여과 칼럼크로마토그래피의 2공정에 의해 가용형 인간 IL-6 수용체가 정제되었다. 최종 공정에 있어서 메인 피크로서 용출된 분획이 최종 정제품으로서 사용되었다.

〔참고 실시예 4〕정상 마우스에 있어서의 가용형 인간 IL-6 수용체 및 인간 항체의 PK 시험

정상 마우스에 있어서의 가용형 인간 IL-6 수용체 및 인간 항체의 혈장 중 체류성과 면역원성을 평가할 목적으로 아래와 같이 시험이 실시되었다.

(4-1) 정상 마우스에 있어서의 가용형 인간 IL-6 수용체의 혈장 중 체류성 및 면역원성 평가

정상 마우스에 있어서의 가용형 인간 IL-6 수용체의 혈장 중 체류성 및 면역원성을 평가할 목적으로 아래의 시험이 실시되었다.

정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)의 꼬리정맥에 가용형 인간 IL-6 수용체(참고 실시예 3에서 제작)가 50 ㎍/㎏으로 단회 투여되었다. 가용형 인간 IL-6 수용체의 투여 후 15분, 7시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 7일, 14일, 21일의 시점에서 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다. 가용형 인간 IL-6 수용체의 혈장 중 농도 및 마우스항 가용형 인간 IL-6 수용체 항체의 항체가는 아래의 방법으로 측정되었다.

마우스의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 전기화학 발광법으로 측정되었다. 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 pg/mL로 조제된 가용형 인간 IL-6 수용체 검량선 시료 및 50배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료를 SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D) 및 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D) 및 Tocilizumab과 혼합함으로써 37℃에서 하룻밤 반응시켰다. Tocilizumab의 최종농도는 333 ㎍/mL가 되도록 조제되었다. 그 후 반응액이 MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주되었다. 추가로 실온에서 1시간 반응시킨 반응액을 세정 후, Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)가 분주되었다. 그 후 바로 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)로 측정이 행해졌다. 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출되었다.

마우스 혈장 중의 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 항체가가 전기화학 발광법으로 측정되었다. 먼저 인간 IL-6 수용체를 MA100 PR Uncoated Plate(Meso Scale Discovery)에 분주하고 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 인간 IL-6 수용체 고상화 플레이트가 제작되었다. 50배 희석된 마우스 혈장 측정시료가 분주된 인간 IL-6 수용체 고상화 플레이트가 4℃에서 하룻밤 정치되었다. 그 후 SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 anti-mouse IgG(whole molecule)(Sigma-Aldrich)를 실온에서 1시간 반응시킨 당해 플레이트가 세정되었다. 당해 플레이트에 Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)가 분주된 후에 바로 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)로 측정이 행해졌다.

그 결과를 도 37에 나타내었다. 이 결과로부터 마우스 혈장 중의 가용형 인간 IL-6 수용체는 신속하게 소실되는 것이 나타내어졌다. 또한 가용형 인간 IL-6 수용체가 투여된 3마리의 마우스 중 #1과 #3의 2마리에 있어서 혈장 중의 마우스 항가용형 인간 IL-6 수용체 항체의 항체가의 상승이 보였다. 이들 2마리의 마우스에 있어서는 가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 면역응답이 일어난 결과로서 마우스 항체가 생산되고 있는 것이 시사된다.

(4-2) 가용형 인간 IL-6 수용체의 정상상태 모델에 있어서의 면역원성 평가

가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 마우스 항체가 생산되는 것에 의한 가용형 인간 IL-6 수용체의 혈장 중 농도로의 영향을 평가할 목적으로 아래의 시험이 실시되었다.

가용형 인간 IL-6 수용체의 혈장 중 농도를 정상상태(약 20 ng/mL)로 유지하는 모델로서 아래의 시험 모델이 구축되었다. 정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)의 배부 피하에 가용형 인간 IL-6 수용체를 충전한 infusion pump(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004, alzet)를 메워넣음으로써, 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 정상상태로 유지되는 동물 모델이 제작되었다.

시험은 2군(각 군 N=4)에서 실시되었다. 면역관용이 모방된 군의 마우스에 대해 가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 마우스 항체의 생산을 억제하기 위해, monoclonal anti-mouse CD4 antibody(R&D)가 그 꼬리정맥에 20 ㎎/㎏으로 단회 투여된 후, 10일에 1회 동일하게 투여되었다(이하, 항마우스 CD4 항체 투여군으로 불린다). 다른 한쪽의 군은 대조군, 즉 monoclonal anti-mouse CD4 antibody가 투여되지 않는 항마우스 CD4 항체 비투여군으로서 사용되었다. 그 후 92.8 ㎍/mL의 가용형 인간 IL-6 수용체가 충전된 infusion pump의 마우스 배부 피하로의 메워넣기가 실시되었다. Infusion pump 메워넣기 후부터 경시적으로 채취된 혈액을 채취 후 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다. 가용형 인간 IL-6 수용체(hsIL-6R)의 혈장 중 농도는 참고 실시예 4-1과 동일한 방법으로 측정되었다.

이 방법으로 측정한 정상 마우스에 있어서의 개체별 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 도 38에 나타내었다.

그 결과 항마우스 CD4 항체 비투여군의 모든 마우스에 있어서 infusion pump의 마우스 배부 피하로의 메워넣기 14일 후에는 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도의 저하가 확인되었다. 한편 가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 마우스 항체의 생산을 억제할 목적으로 항마우스 CD4 항체가 투여된 군의 모든 마우스에 있어서, 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도의 저하는 관찰되지 않았다.

(4-1) 및 (4-2)의 결과로부터 아래의 3점이 나타내어졌다. 즉

(1) 가용형 인간 IL-6 수용체가 마우스에 투여된 후의 혈장 중으로부터의 소실이 매우 빠른 것,

(2) 마우스에 있어서 이종 단백질인 가용형 인간 IL-6 수용체는 마우스에 투여된 경우에 면역원성을 갖고, 가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 마우스 항체의 생산이 일어나는 것,

(3) 가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 마우스 항체의 생산이 일어나면, 가용형 인간 IL-6 수용체의 소실이 더우 빨라져, 가용형 인간 IL-6 수용체의 혈장 중 농도를 일정하게 유지하는 모델에 있어서도 혈장 중 농도의 저하가 일어나는 것,

의 3점이 나타내어졌다.

(4-3) 정상 마우스에 있어서의 인간 항체의 혈장 중 체류성 및 면역원성 평가

정상 마우스에 있어서의 인간 항체의 혈장 중 체류성 및 면역원성을 평가할 목적으로 아래의 시험이 실시되었다.

정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)의 꼬리정맥에 항인간 IL-6 수용체 항체인 Fv4-IgG1이 1 ㎎/㎏으로 단회 투여되었다. 항인간 IL-6 수용체 항체의 투여 후 15분, 7시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 7일, 14일, 21일의 시점에서 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다.

마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체농도는 ELISA법으로 측정되었다. 먼저 Anti-Human IgG(γ-chain specific)F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA)를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)에 분주하고 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 Anti-Human IgG 고상화 플레이트가 제작되었다. 혈장 중 농도로서 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 ㎍/mL의 항인간 IL-6 수용체 항체를 포함하는 검량선 시료와 100배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료가 조제되었다. 이들의 검량선 시료 및 혈장 측정시료 100 μL에 20 ng/mL의 가용형 인간 IL-6 수용체가 200 μL 첨가된 혼합액을 실온에서 1시간 정치시켰다. 그 후 당해 혼합액이 각 웰에 분주된 Anti-Human IgG 고상화 플레이트를 추가로 실온에서 1시간 정치시켰다. 그 후 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)와 실온에서 1시간 반응시키고, 추가로 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 실온에서 1시간 반응시킨 반응액의 발색반응이 TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용하여 행해졌다. 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)를 첨가함으로써 반응이 정지된 각 웰의 반응액의 450 nm의 흡광도가 마이크로플레이트 리더로 측정되었다. 마우스 혈장 중의 항체농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용하여 산출되었다.

그 결과를 도 39에 나타내었다. 마우스에 인간 항체가 단회 투여되었을 때의 인간 항체의 혈장 중 체류성은 가용형 인간 IL-6 수용체가 단회 투여되었을 때의 가용형 인간 IL-6 수용체의 혈장 중 체류성(도 37)에 비해 현저히 높고, 투여 후 21일에 있어서도 높은 혈장 중 농도를 유지하는 것이 나타내어졌다. 이는 세포내로 흡수된 인간 항체가 엔도솜 내에 있어서 마우스 FcRn에 결합함으로써, 재차 혈장 중으로 리사이클되는 것에 의한 것으로 생각된다. 한편 세포내로 흡수된 가용형 인간 IL-6 수용체는 엔도솜 내로부터 리사이클되는 경로를 갖지 않기 때문에 혈장 중으로부터 신속하게 소실되는 것으로 생각된다.

또한 인간 항체가 투여된 3마리의 마우스의 전례에 있어서, 가용형 인간 IL-6 수용체의 정상상태 모델(도 38)에서 보인 바와 같은 혈장 중 농도의 저하는 확인되지 않았다. 즉 인간 IL-6 수용체와는 달리 인간 항체에 대해서는 마우스 항체가 생산되고 있지 않은 것이 시사되었다.

(4-1), (4-2) 및 (4-3)의 결과로부터 아래와 같이 생각하는 것이 가능하다. 먼저 마우스에 있어서는 인간 가용형 IL-6 수용체 및 인간 항체 모두 이종 단백질인 것으로부터, 마우스는 이들에 대해 특이적으로 응답하는 많은 T세포 집단을 가지고 있는 것으로 생각된다.

마우스에 이종 단백질인 인간 가용형 IL-6 수용체가 투여된 경우, 인간 가용형 IL-6 수용체는 혈장 중으로부터 단시간에 소실되고, 또한 인간 가용형 IL-6 수용체에 대한 면역응답이 확인되었다. 여기서 혈장 중으로부터의 인간 가용형 IL-6 수용체의 소실이 빠르다는 것은, 많은 인간 가용형 IL-6 수용체가 단시간 내에 항원 제시 세포에 흡수되어, 세포내에서 프로세싱을 받은 후, 인간 가용형 IL-6 수용체에 특이적으로 응답하는 T세포를 활성화하는 것으로 생각된다. 그 결과로서, 인간 가용형 IL-6 수용체에 대한 면역응답(즉 인간 가용형 IL-6 수용체에 대한 마우스 항체의 생산)이 일어난 것으로 생각된다.

한편 마우스에 이종 단백질인 인간 항체가 투여된 경우, 인간 항체의 혈장 중 체류성은 인간 가용형 IL-6 수용체에 비해 현저히 길고, 인간 항체에 대한 면역응답은 일어나지 않았다. 혈장 중 체류성이 길다는 것은, 항원 제시 세포에 흡수되어 세포내에서 프로세싱을 받는 인간 항체가 극히 조금만 존재하는 것을 의미한다. 그 때문에 마우스가 인간 항체에 대해 특이적으로 응답하는 T세포 집단을 가지고 있었다고 하더라도 항원 제시에 의한 T세포의 활성화가 일어나지 않아, 결과로서 인간 항체에 대한 면역응답(즉 인간 항체에 대한 마우스 항체의 생산)은 일어나지 않았던 것으로 생각된다.

〔참고 실시예 5〕중성 pH에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성이 증대된 다양한 항체 Fc 개변체의 제작과 그의 평가

(5-1) 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성이 증대된 다양한 항체 Fc 개변체의 제작과 그의 결합 활성 평가

pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성을 증대시키는 것을 목적으로 다양한 변이가 VH3-IgG1(서열번호：35)에 도입되어 평가가 이루어졌다. 제작된 중쇄와 경쇄인 L(WT)-CK(서열번호：41)를 각각 포함하는 개변체(IgG1-F1~IgG1-F1052)가 참고 실시예 2에 기재된 방법에 준하여 발현 및 정제되었다.

항체와 인간 FcRn의 결합이 실시예 4에 기재되는 방법에 준하여 해석되었다. 즉 Biacore를 사용한 중성 조건하(pH 7.0)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 개변체의 결합 활성을 표 27-1~27-32에 나타내었다.

[표 27-1]

표 27-2는 표 27-1의 계속되는 표이다.

[표 27-2]

표 27-3은 표 27-2의 계속되는 표이다.

[표 27-3]

표 27-4는 표 27-3의 계속되는 표이다.

[표 27-4]

표 27-5는 표 27-4의 계속되는 표이다.

[표 27-5]

표 27-6은 표 27-5의 계속되는 표이다.

[표 27-6]

표 27-7은 표 27-6의 계속되는 표이다.

[표 27-7]

표 27-8은 표 27-7의 계속되는 표이다.

[표 27-8]

표 27-9는 표 27-8의 계속되는 표이다.

[표 27-9]

표 27-10은 표 27-9의 계속되는 표이다.

[표 27-10]

표 27-11은 표 27-10의 계속되는 표이다.

[표 27-11]

표 27-12는 표 27-11의 계속되는 표이다.

[표 27-12]

표 27-13은 표 27-12의 계속되는 표이다.

[표 27-13]

표 27-14는 표 27-13의 계속되는 표이다.

[표 27-14]

표 27-15는 표 27-14의 계속되는 표이다.

[표 27-15]

표 27-16은 표 27-15의 계속되는 표이다.

[표 27-16]

표 27-17은 표 27-16의 계속되는 표이다.

[표 27-17]

표 27-18은 표 27-17의 계속되는 표이다.

[표 27-18]

표 27-19는 표 27-18의 계속되는 표이다.

[표 27-19]

표 27-20은 표 27-19의 계속되는 표이다.

[표 27-20]

표 27-21은 표 27-20의 계속되는 표이다.

[표 27-21]

표 27-22는 표 27-21의 계속되는 표이다.

[표 27-22]

표 27-23은 표 27-22의 계속되는 표이다.

[표 27-23]

표 27-24는 표 27-23의 계속되는 표이다.

[표 27-24]

표 27-25는 표 27-24의 계속되는 표이다.

[표 27-25]

표 27-26은 표 27-25의 계속되는 표이다.

[표 27-26]

표 27-27은 표 27-26의 계속되는 표이다.

[표 27-27]

표 27-28은 표 27-27의 계속되는 표이다.

[표 27-28]

표 27-29는 표 27-28의 계속되는 표이다.

[표 27-29]

표 27-30은 표 27-29의 계속되는 표이다.

[표 27-30]

표 27-31은 표 27-30의 계속되는 표이다.

[표 27-31]

표 27-32는 표 27-31의 계속되는 표이다.

[표 27-32]

(5-2) pH 중성역의 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 증강시킨 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체의 in vivo 시험

실시예 5-1에서 조제한 중성 조건하에서의 인간 FcRn으로의 결합능을 부여한 중쇄를 사용하여 중성 조건하에서의 인간 FcRn으로의 결합능을 갖는 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체를 제작하고, in vivo에서의 항원 소실효과의 검증을 행하였다. 구체적으로는,

VH3-IgG1(서열번호：35)과 VL3-CK(서열번호：36)를 포함하는 Fv4-IgG1,

VH3-IgG1-F1(서열번호：37)과 VL3-CK(서열번호：36)를 포함하는 Fv4-IgG1-v2,

VH3-IgG1-F14(서열번호：86)와 VL3-CK(서열번호：36)를 포함하는 Fv4-IgG1-F14,

VH3-IgG1-F20(서열번호：39)과 VL3-CK(서열번호：36)를 포함하는 Fv4-IgG1-F20,

VH3-IgG1-F21(서열번호：40)과 VL3-CK(서열번호：36)를 포함하는 Fv4-IgG1-F21,

VH3-IgG1-F25(서열번호：87)와 VL3-CK(서열번호：36)를 포함하는 Fv4-IgG1-F25,

VH3-IgG1-F29(서열번호：88)와 VL3-CK(서열번호：36)를 포함하는 Fv4-IgG1-F29,

VH3-IgG1-F35(서열번호：89)와 VL3-CK(서열번호：36)를 포함하는 Fv4-IgG1-F35,

VH3-IgG1-F48(서열번호：90)과 VL3-CK(서열번호：36)를 포함하는 Fv4-IgG1-F48,

VH3-IgG1-F93(서열번호：91)과 VL3-CK(서열번호：36)를 포함하는 Fv4-IgG1-F93,

VH3-IgG1-F94(서열번호：92)와 VL3-CK(서열번호：36)를 포함하는 Fv4-IgG1-F94

를 참고 실시예 2에 기재된 당업자 공지의 방법으로 발현시켜서 정제하였다.

조제한 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체에 대해서, 인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg계통 276 +/+마우스, Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. 2010;602:93-104.)를 사용한 in vivo 시험이 아래와 같이 실시되었다.

인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg계통 276 +/+마우스, Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. 2010;602:93-104.) 및 정상 마우스(C57BL/6J 마우스, Charles River Japan)에 hsIL-6R(가용형 인간 IL-6 수용체：참고예 3에서 조제)을 단독 투여 또는 가용형 인간 IL-6 수용체 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 후의 가용형 인간 IL-6 수용체 및 항인간 IL-6 수용체 항체의 생체내에 있어서의 약물동태를 평가하였다. 가용형 인간 IL-6 수용체 용액(5 ㎍/mL) 또는 가용형 인간 IL-6 수용체 및 항인간 IL-6 수용체 항체의 혼합 용액(각각 5 ㎍/mL, 0.1 ㎎/mL)을 꼬리정맥에 10 mL/㎏으로 단회 투여하였다. 이때 가용형 인간 IL-6 수용체에 대해 항인간 IL-6 수용체 항체는 충분량 과잉으로 존재하는 것으로부터, 가용형 인간 IL-6 수용체는 거의 모두 항체에 결합해 있는 것으로 생각된다. 투여 15분 후, 7시간 후, 1일 후, 2일 후, 3일 후, 4일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후, 28일 후에 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다.

(5-3) 전기화학 발광법에 의한 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 측정

마우스의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 전기화학 발광법으로 측정되었다. 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 pg/mL로 조제된 가용형 인간 IL-6 수용체 검량선 시료 및 50배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료를 SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D) 및 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D) 및 Tocilizumab과 혼합함으로써 37℃에서 하룻밤 반응시켰다. Tocilizumab의 최종농도는 333 ㎍/mL가 되도록 조제되었다. 그 후 반응액이 MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주되었다. 추가로 실온에서 1시간 반응시킨 반응액을 세정 후, Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)가 분주되었다. 그 후 바로 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)로 측정이 행해졌다. 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용하여 산출되었다.

얻어진 정맥내 투여 후의 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 도 40에 나타내었다. 시험의 결과, 중성 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 증강시킨 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체는 모두 중성 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합능을 거의 갖지 않는 Fv4-IgG1과 비교하여 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 낮게 추이되는 것이 나타내어졌다. 그 중에서도 특히 현저한 효과를 나타낸 것으로서 예를 들자면, Fv4-IgG1-F14와 동시에 투여된 가용형 인간 IL-6 수용체의 1일 후의 혈장 중 농도는 Fv4-IgG1과 동시에 투여된 그것과 비교하여 약 54배 저하되는 것이 나타내어졌다. 또한 Fv4-IgG1-F21과 동시에 투여된 가용형 인간 IL-6 수용체의 7시간 후의 혈장 중 농도는 Fv4-IgG1과 동시에 투여된 그것과 비교하여 약 24배 저하되는 것이 나타내어졌다. 더 나아가서는 Fv4-IgG1-F25와 동시에 투여된 가용형 인간 IL-6 수용체의 7시간 후의 혈장 중 농도는 검출한계(1.56 ng/mL) 이하이고, Fv4-IgG1과 동시에 투여된 그것과 비교하여 200배 이상의 현저한 항원 농도의 저하가 가능한 것으로 생각되었다.

이들 사실로부터 항원 소실효과를 증강시키는 것을 목적으로 pH 의존적 항원 결합 항체에 대해 중성 조건하에서의 인간 FcRn으로의 결합을 증강시키는 것은 매우 유효한 것이 나타내어졌다. 또한 항원 소실효과를 증강시키기 위해 도입되는, 중성 조건하에서의 인간 FcRn으로의 결합을 증강시키는 아미노산 개변의 종류는 표 16에 기재된 개변을 포함하여 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개변을 도입해도 in vivo에 있어서 항원 소실효과를 증강시키는 것이 가능할 것으로 생각된다.

〔참고 실시예 6〕파지 디스플레이 기술을 사용한 인간 항체 라이브러리로부터의 Ca 의존적으로 IL-6 수용체에 결합하는 항체의 취득

(6-1) 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리의 제작

인간 PBMC로부터 제작한 폴리 A RNA나 시판되고 있는 인간 폴리 A RNA 등을 주형으로 하여 당업자에게 공지인 방법에 따라 서로 다른 인간 항체 서열의 Fab 도메인을 제시하는 복수의 파지로 이루어지는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리가 구축되었다.

(6-2) 비드 패닝에 의한 라이브러리로부터의 Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체 단편의 취득

구축된 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 최초의 선발은, 항원(IL-6 수용체)으로의 결합능을 갖는 항체 단편만의 농축, 또는 Ca 농도 의존적인 항원(IL-6 수용체)으로의 결합능을 지표로 한 항체 단편의 농축에 의해 실시되었다. Ca 농도 의존적인 항원(IL-6 수용체)으로의 결합능을 지표로서 항체 단편의 농축은 Ca 이온을 킬레이트하는 EDTA를 사용하여 Ca 이온 존재하에서 IL-6 수용체와 결합시킨 파지 라이브러리로부터 파지를 용출함으로써 실시되었다. 항원으로서 비오틴 표지된 IL-6 수용체가 사용되었다.

구축한 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 파지 생산이 행해졌다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가함으로써 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로 파지 라이브러리액에 최종농도 4%BSA 및 1.2 mM 칼슘 이온 농도가 되도록 BSA 및 CaCl₂가 첨가되었다. 패닝방법으로서 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝방법이 참조되었다(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9, J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203, Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20, Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). 자기 비드로서 NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다.

구체적으로는 조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써 당해 파지 라이브러리액을 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBS(1.2 mM CaCl₂를 포함하는 TBS)로 1회 세정되었다. 그 후 IL-6 수용체로의 결합능을 갖는 항체 단편을 농축하는 경우에는, 일반적인 방법에 의한 용출에 의해 Ca 농도 의존적인 IL-6 수용체로의 결합능을 지표로서 항체 단편을 농축하는 경우에는, 2 mM EDTA/TBS(2mM EDTA를 포함하는 TBS)에 현탁된 비드로부터의 용출에 의해 파지 용액이 회수되었다. 회수된 파지 용액이 대수 증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 TG1에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.

2회째 이후의 패닝에서는 Ca 의존적 결합능을 지표로 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는 조제한 파지 라이브러리액에 40 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBST와 1.2 mM CaCl₂/TBS로 세정되었다. 그 후 0.1 mL의 2 mM EDTA/TBS가 첨가된 비드는 실온에서 현탁된 후, 바로 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지 용액이 회수되었다. 회수된 파지 용액이 대수 증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 TG1에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 회수되었다. Ca 의존적 결합능을 지표로 하는 패닝이 복수 회 반복되었다.

(6-3) 파지 ELISA에 의한 평가

상기 방법에 의해 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라 파지 함유 배양상청이 회수되었다.

최종농도 4%BSA 및 1.2 mM 칼슘 이온 농도가 되도록 BSA 및 CaCl₂가 첨가된 파지를 함유하는 배양상청이 아래의 순서로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원을 포함하는 100 μL의 PBS로 하룻밤 코팅되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 PBST로 세정함으로써 항원이 제거된 후, 당해 웰이 1시간 이상 250 μL의 4%BSA-TBS로 블로킹되었다. 4%BSA-TBS가 제거된 각 웰에 조제된 배양상청이 첨가된 당해 플레이트를 37℃에서 1시간 정치함으로써 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정된 각 웰에 1.2 mM CaCl₂/TBS 또는 1 mM EDTA/TBS가 첨가되고, 당해 플레이트는 37℃에서 30분간 정치하여 인큐베이트되었다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정된 후에, 최종농도 4%의 BSA 및 1.2 mM의 이온화 칼슘 농도로 한 TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 각 웰에 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.

상기 파지 ELISA의 결과, Ca 의존적인 항원에 대한 결합능이 있다고 판단되는 항체 단편을 주형으로 하여 특이적인 프라이머에 의해 증폭된 유전자의 염기서열 해석이 행해졌다.

(6-4) 항체의 발현과 정제

파지 ELISA의 결과, Ca 의존적인 항원에 대한 결합능이 있다고 판단된 클론이 동물 세포 발현용 플라스미드로 도입되었다. 항체의 발현은 아래의 방법을 사용하여 행해졌다. 인간 태아 신장 세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 FreeStyle 293 Expression Medium 배지(Invitrogen)에 현탁되고, 1.33×10⁶ 세포/mL의 세포밀도로 6 웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는 리포펙션법으로 세포로 도입되었다. CO₂ 인큐베이터(37도, 8%CO₂, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행해졌다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법을 사용하여 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광 광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 사용함으로써 얻어진 측정값으로 항체농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

〔참고 실시예 7〕취득된 항체의 인간 IL-6 수용체에 대한 Ca 의존적 결합능의 평가

참고 실시예 6에서 취득된 항체 6RL#9-IgG1(중쇄(서열번호：9에 IgG1 유래의 정상영역 서열이 연결된 것), 경쇄(서열번호：93)) 및 FH4-IgG1(중쇄(서열번호：94), 경쇄(서열번호：95))의 인간 IL-6 수용체에 대한 결합 활성이 Ca 의존적인지 여부를 판단하기 위해, 이들 항체와 인간 IL-6 수용체의 항원 항체 반응의 속도론적 해석이 Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 행해졌다. 인간 IL-6 수용체에 대한 Ca 의존성 결합 활성을 갖지 않는 대조 항체로서, WO2009/125825에 기재되어 있는 H54/L28-IgG1(중쇄 가변영역(서열번호：96), 경쇄 가변영역(서열번호：97))이 사용되었다. 고칼슘 이온 농도 및 저칼슘 이온 농도의 조건으로서, 각각 2 mM 및 3 μM의 칼슘 이온 농도의 용액 중에서 항원 항체 반응의 속도론적 해석이 행해졌다. 아민커플링법으로 protein A(Invitrogen)가 적당량 고정화된 Sensor chip CM4(GE Healthcare) 상에 목적의 항체가 캡쳐되었다. 러닝 버퍼에는 10 mM ACES, 150 mM NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, 2 mM CaCl₂(pH 7.4) 또는 10 mM ACES, 150 mM NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, 3 μmol/L CaCl₂(pH 7.4)의 2종류의 완충액이 사용되었다. 인간 IL-6 수용체의 희석에도 각각의 버퍼가 사용되었다. 측정은 모두 37℃에서 실시되었다.

H54L28-IgG1 항체를 사용한 항원 항체 반응의 속도론적 해석시에 IL-6 수용체의 희석액과 블랭크인 러닝 버퍼를 유속 20 μL/min로 3분간 인젝트함으로써 센서칩 상에 캡쳐시킨 H54L28-IgG1 항체에 IL-6 수용체를 상호작용시켰다. 그 후 유속 20 μL/min로 10분간 러닝 버퍼를 흘려 IL-6 수용체의 해리가 관찰된 후, 10 mM Glycine-HCl(pH 1.5)을 유속 30 μL/min로 30초간 인젝트함으로써 센서칩이 재생되었다. 측정에서 얻어진 센서그램으로부터 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)가 산출되었다. 이들 값을 사용하여 H54L28-IgG1 항체의 인간 IL-6 수용체에 대한 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)가 사용되었다.

FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체를 사용한 항원 항체 반응의 속도론적 해석시에는 IL-6 수용체의 희석액과 블랭크인 러닝 버퍼를 유속 5 μL/min로 15분간 인젝트함으로써, 센서칩 상에 캡쳐시킨 FH4-IgG1 항체 또는 6RL#9-IgG1 항체에 IL-6 수용체를 상호작용시켰다. 그 후, 10 mM Glycine-HCl(pH 1.5)을 유속 30 μL/min로 30초간 인젝트함으로써 센서칩이 재생되었다. 측정에서 얻어진 센서그램으로부터 steady state affinity model을 사용하여 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)가 사용되었다.

이 방법으로 결정된 2 mM CaCl₂ 존재하에 있어서의 각 항체와 IL-6 수용체의 해리상수 KD를 표 28에 나타내었다.

Ca 농도가 3 μM인 조건하에서의 H54/L28-IgG1 항체의 KD는 2 mM Ca 농도 존재하와 동일한 방법으로 산출하는 것이 가능하다. Ca 농도가 3 μM인 조건하에서는 FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체는 IL-6 수용체에 대한 결합은 거의 관찰되지 않았기 때문에 상기 방법에 의한 KD의 산출은 곤란하다. 그러나 실시예 13에 기재되어 있는 식 5(Biacore T100 Software Handbook, BR-1006-48, AE 01/2007)를 사용함으로써, Ca 농도가 3 μM인 조건하에서의 이들 항체의 KD를 예측하는 것이 가능하다.

실시예 13에서 기재되는 식 3을 사용한 Ca 농도가 3μmol/L인 경우의 각 항체와 IL-6 수용체의 해리상수 KD의 예측되는 개산결과를 표 29에 나타내었다. 표 29 중의 Req, Rmax, RI, C는 측정결과를 토대로 가정된 값이다.

상기 결과로부터 FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체는 버퍼 중의 CaCl₂의 농도를 2 mM로부터 3 μM로 감소시킴으로써, IL-6 수용체에 대한 KD가 각각 약 60배, 약 120배 상승(60배, 120배 이상 친화성이 저감)될 것으로 예측되었다.

표 30에 H54/L28-IgG1, FH4-IgG1, 6RL#9-IgG1의 3종류의 항체의 2 mM CaCl₂ 존재하 및 3 μM CaCl₂ 존재하에 있어서의 KD값 및 KD값의 Ca 의존성에 대해서 정리하였다.

Ca 농도의 차이에 따른 H54/L28-IgG1 항체의 IL-6 수용체에 대한 결합의 차이는 관찰되지 않았다. 그 한편 저농도의 Ca 조건하에서는 FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체의 IL-6 수용체에 대한 결합의 현저한 감약이 관찰되었다(표 30).

〔참고 실시예 8〕취득된 항체로의 칼슘 이온 결합 평가

다음으로 항체로의 칼슘 이온의 결합 평가의 지표로서, 시차주사형 열량측정(DSC)에 의한 열변성 중간온도(Tm값)가 측정되었다(MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal). 열변성 중간온도(Tm값)는 안정성의 지표로 칼슘 이온의 결합에 의해 단백질이 안정화되면, 열변성 중간온도(Tm값)는 칼슘 이온이 결합해 있지 않은 경우에 비해 높아진다(J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140 - 25149). 항체 용액 중의 칼슘 이온 농도의 변화에 따른 항체의 Tm값의 변화를 평가함으로써, 항체로의 칼슘 이온의 결합 활성이 평가되었다. 정제된 항체가 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂(pH 7.4) 또는 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 3 μM CaCl₂(pH 7.4)의 용액을 외액으로 하는 투석(EasySEP, TOMY)처리에 제공되었다. 투석에 사용된 용액을 사용하여 대략 0.1 ㎎/mL로 조제된 항체 용액을 피검물질로 하여 20℃부터 115℃까지 240℃/hr의 승온속도로 DSC 측정이 행해졌다. 얻어진 DSC의 변성 곡선을 토대로 산출된 각 항체의 Fab 도메인의 열변성 중간온도(Tm값)를 표 31에 나타내었다.

표 31의 결과로부터 칼슘 의존적 결합능을 나타내는 FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체의 Fab의 Tm값은 칼슘 이온의 농도 변화에 따라 변동되고, 칼슘 의존적 결합능을 나타내지 않는 H54/L28-IgG1 항체의 Fab의 Tm값은 칼슘 이온의 농도 변화에 따라 변동되지 않는 것이 나타내어졌다. FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체의 Fab의 Tm값의 변동은, 이들 항체에 칼슘 이온이 결합하여, Fab 부분이 안정화된 것을 나타내고 있다. 상기 결과로부터 FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체에는 칼슘 이온이 결합하는 한편으로 H54/L28-IgG1 항체에는 칼슘 이온이 결합해 있지 않은 것이 나타내어졌다.

〔참고 실시예 9〕6RL#9 항체의 칼슘 이온 결합 부위의 X선결정구조 해석에 의한 동정

(9-1) X선결정구조 해석

참고 실시예 8에 나타내어진 바와 같이, 6RL#9 항체는 칼슘 이온과 결합하는 것이 열변성 온도 Tm값의 측정으로부터 시사되었다. 그러나, 6RL#9 항체의 어느 부위가 칼슘 이온과 결합해 있는지 예상할 수 없었기 때문에, X선결정구조 해석의 수법을 사용함으로써, 칼슘 이온이 상호작용하는 6RL#9 항체의 서열 중의 잔기가 특정되었다.

(9-2) 6RL#9 항체의 발현 및 정제

X선결정구조 해석에 사용하기 위해 발현시킨 6RL#9 항체가 정제되었다. 구체적으로는 6RL#9 항체의 중쇄(서열번호：9에 IgG1 유래의 정상영역 서열이 연결된 것)와 경쇄(서열번호：93)를 각각 발현시킬 수 있도록 조제된 동물 발현용 플라스미드가 동물세포에 일과적으로 도입되었다. 최종 세포밀도 1×10⁶ 세포/mL가 되도록 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)로 현탁된 800 mL의 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)에, 리포펙션법에 의해 조제된 플라스미드가 도입되었다. 플라스미드가 도입된 세포는 CO₂ 인큐베이터(37℃, 8%CO₂, 90 rpm) 중에서 5일간 배양되었다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용한 당업자 공지의 방법에 따라, 상기와 같이 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용하여 측정값으로부터 항체농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

(9-3) 6RL#9 항체로부터의 Fab 프래그먼트의 정제

분자량 분획 사이즈 10000MWCO의 한외여과막을 사용하여 6RL#9 항체가 21 ㎎/mL까지 농축되었다. L-Cystein 4 mM, EDTA 5 mM, 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)을 사용하여 5 ㎎/mL에 의해 희석된 2.5 mL의 당해 항체의 시료가 조제되었다. 0.125 ㎎의 Papain(Roche Applied Science)을 첨가하여 교반된 당해 시료가 35℃에서 2시간 정치되었다. 정치 후, 프로테아제 인히비터 칵테일 미니, EDTA 프리(Roche Applied Science) 1정을 녹인 10 mL의 25 mM MES 완충액(pH 6)을 추가로 당해 시료에 첨가하고, 얼음 속에 정치함으로써, Papain에 의한 프로테아제 반응이 정지되었다. 다음으로 당해 시료가 하류에 1 mL 사이즈의 ProteinA 담체 칼럼 HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)가 직렬로 연결된 25 mM MES 완충액 pH 6으로 평형화된 1 mL 사이즈의 양이온 교환 칼럼 HiTrap SP HP(GE Healthcare)에 첨가되었다. 동 완충액 중 NaCl 농도를 300 mM까지 직선적으로 올려 용출을 행함으로써 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 정제 분획이 얻어졌다. 다음으로 얻어진 정제 분획이 5000MWCO의 한외여과막에 의해 0.8 mL 정도까지 농축되었다. 50 mM NaCl을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 8)으로 평형화된 겔여과 칼럼 Superdex 200 10/300 GL(GE Healthcare)에 농축액이 첨가되었다. 결정화용 정제 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트가 동 완충액을 사용하여 칼럼으로부터 용출되었다. 또한 상기의 모든 칼럼조작은 6~7.5℃의 저온하에서 실시되었다.

(9-4) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정화

사전에 일반적인 조건 설정으로 6RL#9 Fab 프래그먼트의 종결정이 얻어졌다. 다음으로 5 mM가 되도록 CaCl₂가 첨가된 정제 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트가 5000MWCO의 한외여과막을 사용하여 12 ㎎/mL로 농축되었다. 다음으로 행잉 드롭 증기 확산법으로 상기와 같이 농축된 시료의 결정화가 실시되었다. 리저버 용액(reservoir solution)으로서 20-29%의 PEG4000을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5)이 사용되었다. 커버글래스 상에서 0.8 ㎕의 리저버 용액 및 0.8 ㎕의 상기 농축시료의 혼합액에 대해, 29% PEG4000 및 5 mM CaCl₂를 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5) 중에서 파쇄된 상기 종결정이 100-10000배로 희석된 희석 계열의 용액 0.2 ㎕를 첨가함으로써 결정화 드롭이 조제되었다. 당해 결정화 드롭을 20℃에 2일 내지 3일 정치함으로써 얻어진 얇은 판상 결정의 X선 회절 데이터가 측정되었다.

(9-5) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서의 결정화

정제 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트가 5000MWCO의 한외여과막을 사용하여 15 ㎎/㎖로 농축되었다. 다음으로 행잉 드롭 증기 확산법으로 상기와 같이 농축된 시료의 결정화가 실시되었다. 리저버 용액으로서 18-25%의 PEG4000을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5)이 사용되었다. 커버글래스 상에서 0.8 ㎕의 리저버 용액 및 0.8 ㎕의 상기 농축시료의 혼합액에 대해, 25% PEG4000을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5) 중에서 파쇄된 Ca 존재하에서 얻어진 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 결정이 100-10000배로 희석된 희석 계열의 용액 0.2 ㎕를 첨가함으로써 결정화 드롭이 조제되었다. 당해 결정화 드롭을 20℃에 2일 내지 3일 정치함으로써 얻어진 얇은 판상 결정의 X선 회절 데이터가 측정되었다.

(9-6) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정의 X선 회절 데이터의 측정

35% PEG4000 및 5 mM CaCl₂를 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5)의 용액에 침지된 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서 얻어진 단결정 하나를, 미소한 나일론 루프가 부착된 핀을 사용하여 외액째로 떠냄으로써, 당해 단결정이 액체질소 중에서 동결되었다. 고에너지 가속기 연구기구의 방사광 시설 포톤 팩토리의 빔라인 BL-17A를 사용하여, 상기 동결 결정의 X선 회절 데이터가 측정되었다. 또한 측정 중에는 항상 -178℃의 질소기류 중에 동결 결정을 둠으로써 동결상태가 유지되었다. 빔라인에 비치된 CCD 디텍터 Quantum315r(ADSC)을 사용하여, 결정을 1°씩 회전시키면서 토탈 180매의 회절 화상이 수집되었다. 격자상수의 결정, 회절 반점의 지수 부여 및 회절 데이터의 처리가 프로그램 Xia2(CCP4 Software Suite), XDS Package(Walfgang Kabsch) 및 Scala(CCP4 Software Suite)에 의해 행해졌다. 최종적으로 분해능 2.2Å까지의 회절강도 데이터가 얻어졌다. 본 결정은 공간군 P212121에 속하고, 격자상수 a=45.47Å, b=79.86Å, c=116.25Å, α=90°, β=90°, γ=90°였다.

(9-7) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서의 결정의 X선 회절 데이터의 측정

35% PEG4000을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5)의 용액에 침지된 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서 얻어진 단결정 하나를, 미소한 나일론 루프가 부착된 핀을 사용하여 외액째로 떠냄으로써, 당해 단결정이 액체질소 중에서 동결되었다. 고에너지 가속기 연구기구의 방사광 시설 포톤 팩토리의 빔라인 BL-17A를 사용하여, 상기 동결 결정의 X선 회절 데이터가 측정되었다. 또한 측정 중에는 항상 -178℃의 질소기류 중에 동결 결정을 둠으로써 동결상태가 유지되었다. 빔라인에 비치된 CCD 디텍터 Quantum210r(ADSC)을 사용하여, 결정을 1°씩 회전시키면서 토탈 180매의 회절 화상이 수집되었다. 격자상수의 결정, 회절 반점의 지수 부여 및 회절 데이터의 처리가 프로그램 Xia2(CCP4 Software Suite), XDS Package(Walfgang Kabsch) 및 Scala(CCP4 Software Suite)에 의해 행해졌다. 최종적으로 분해능 2.3Å까지의 회절강도 데이터가 얻어졌다. 본 결정은 공간군 P212121에 속하고, 격자상수 a=45.40Å, b=79.63Å, c=116.07Å, α=90°, β=90°, γ=90°로, Ca 존재하의 결정과 동형이었다.

(9-8) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정의 구조해석

프로그램 Phaser(CCP4 Software Suite)를 사용한 분자 치환법에 의해, 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정의 구조가 결정되었다. 얻어진 결정격자의 크기와 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 분자량으로부터, 비대칭 단위 중의 분자 수가 1개라고 예상되었다. 1차 서열 상의 상동성을 토대로 PDB code: 1ZA6의 구조좌표로부터 취출된 A쇄 112-220번 및 B쇄 116-218번의 아미노산 잔기 부분이 CL 및 CH1 영역의 탐색용 모델 분자가 되었다. 다음으로 PDB code: 1ZA6의 구조좌표로부터 취출된 B쇄 1-115번의 아미노산 잔기 부분이 VH 영역의 탐색용 모델 분자가 되었다. 마지막으로 PDB code 2A9M의 구조좌표로부터 취출된 경쇄 3-147번의 아미노산 잔기가 VL 영역의 탐색용 모델 분자가 되었다. 이 순번에 따라 각 탐색용 모델 분자의 결정 격자 내에서의 방향과 위치를 회전 함수 및 병진 함수로부터 결정함으로써, 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 초기 구조 모델이 얻어졌다. 당해 초기 구조 모델에 대해 VH, VL, CH1, CL의 각 도메인을 움직이는 강체 정밀화를 행함으로써, 25-3.0Å의 반사 데이터에 대한 결정학적 신뢰도 인자 R값은 46.9%, Free R값은 48.6%가 되었다. 또한 프로그램 Refmac5(CCP4 Software Suite)를 사용한 구조 정밀화와, 실험적으로 결정된 구조 인자 Fo와 모델로부터 계산된 구조 인자 Fc 및 위상을 사용하여 계산된 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 지도를 참조하면서 모델 수정을 반복하여 프로그램 Coot(Paul Emsley) 상에서 행함으로써 모델의 정밀화가 행해졌다. 마지막으로 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 지도를 토대로 Ca 이온 및 물분자를 모델에 삽입함으로써, 프로그램 Refmac5(CCP4 Software Suite)를 사용하여 정밀화가 행해졌다. 분해능 25-2.2Å의 21020개의 반사 데이터를 사용함으로써, 최종적으로 3440 원자의 모델에 대한 결정학적 신뢰도 인자 R값은 20.0%, Free R값은 27.9%가 되었다.

(9-9) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서의 결정의 X선 회절 데이터의 측정

6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서의 결정의 구조는 동형인 Ca 존재하 결정의 구조를 사용해서 결정되었다. 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정의 구조좌표로부터 물분자와 Ca 이온 분자가 제외되고, VH, VL, CH1, CL의 각 도메인을 움직이는 강체 정밀화가 행해졌다. 25-3.0Å의 반사 데이터에 대한 결정학적 신뢰도 인자 R값은 30.3%, Free R값은 31.7%가 되었다. 또한 프로그램 Refmac5(CCP4 Software Suite)를 사용한 구조 정밀화와, 실험적으로 결정된 구조 인자 Fo와 모델로부터 계산된 구조 인자 Fc 및 위상을 사용하여 계산된 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 지도를 참조하면서 모델을 수정을 반복하여 프로그램 Coot(Paul Emsley) 상에서 행함으로써 모델의 정밀화가 행해졌다. 마지막으로 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 지도를 토대로 물분자를 모델에 삽입함으로써, 프로그램 Refmac5(CCP4 Software Suite)를 사용하여 정밀화가 행해졌다. 분해능 25-2.3Å의 18357개의 반사 데이터를 사용함으로써, 최종적으로 3351 원자의 모델에 대한 결정학적 신뢰도 인자 R값은 20.9%, Free R값은 27.7%가 되었다.

(9-10) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재 또는 비존재하에서의 결정의 X선 회절 데이터의 비교

6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정 및 Ca 비존재하에서의 결정의 구조를 비교하자, 중쇄 CDR3에 커다란 변화가 보였다. X선결정구조 해석으로 결정된 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 중쇄 CDR3의 구조를 도 41에 나타내었다. 구체적으로는 Ca 존재하에서의 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 결정에서는 중쇄 CDR3 루프 부분의 중심 부분에 칼슘 이온이 존재하고 있었다. 칼슘 이온은 중쇄 CDR3의 95번 위치, 96번 위치 및 100a번 위치(Kabat 넘버링)와 상호작용하고 있는 것으로 생각되었다. Ca 존재하에서는 항원과의 결합에 중요한 중쇄 CDR3 루프가 칼슘과 결합함으로써 안정화되어, 항원과의 결합에 최적인 구조로 되어 있는 것이 생각되었다. 항체의 중쇄 CDR3에 칼슘이 결합하는 예는 지금까지 보고되어 있지 않아, 항체의 중쇄 CDR3에 칼슘이 결합한 구조는 신규한 구조이다.

6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 구조로부터 명확해진 중쇄 CDR3에 존재하는 칼슘 결합 모티브도 Ca 라이브러리 디자인의 새로운 요소가 될 수 있다. 예를 들면 6RL#9 항체의 중쇄 CDR3를 포함하고, 경쇄를 포함하는 그것 이외의 CDR에 플렉시블 잔기를 포함하는 라이브러리가 생각된다.

〔참고 실시예 10〕파지 디스플레이 기술을 이용한 인간 항체 라이브러리로부터의 Ca 의존적으로 IL-6에 결합하는 항체의 취득

(10-1) 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리의 제작

인간 PBMC로부터 제작한 폴리A RNA나 시판되고 있는 인간 폴리A RNA 등을 주형으로 하여 당업자에게 공지의 방법에 따라, 서로 다른 인간 항체 서열의 Fab 도메인을 제시하는 복수의 파지로 이루어지는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리가 구축되었다.

(10-2) 비드 패닝에 의한 라이브러리로부터의 Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체 단편의 취득

구축된 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 최초의 선발은 항원(IL-6)으로의 결합능을 갖는 항체 단편만의 농축에 의해 실시되었다. 항원으로서 비오틴 표지된 IL-6이 사용되었다.

구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 파지 생산이 행해졌다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10%PEG를 첨가함으로써 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로 파지 라이브러리액에 최종농도 4%BSA 및 1.2 mM 칼슘 이온 농도가 되도록 BSA 및 CaCl₂가 첨가되었다. 패닝방법으로서 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝 방법이 참조되었다(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9, J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203, Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20, Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). 자기 비드로서, NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다.

구체적으로는 조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써, 당해 파지 라이브러리액을 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1.2 mM CaCl₂/TBST(1.2 mM CaCl₂를 포함하는 TBST)로 3회 세정된 후, 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBS(1.2 mM CaCl₂를 포함하는 TBS)로 추가로 2회 세정되었다. 그 후, 0.5 mL의 1 ㎎/mL의 트립신이 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 후, 즉석에서 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.5)가 된 10 mL의 대장균주 TG1에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.

2회째 이후의 패닝에서는 Ca 의존적 결합능을 지표로 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는 조제한 파지 라이브러리액에 40 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써, 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBST와 1.2 mM CaCl₂/TBS로 세정되었다. 그 후 0.1 mL의 2 mM EDTA/TBS가 첨가된 비드는 실온에서 현탁된 후, 즉석에서 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액에 100 ㎎/mL의 트립신 5 μL를 첨가함으로써, Fab를 제시하지 않는 파지의 pIII 단백질(헬퍼파지 유래의 pIII 단백질)이 절단되어, Fab를 제시하지 않는 파지의 대장균에 대한 감염능을 상실시켰다. 트립신 처리된 파지용액으로부터 회수된 파지가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 TG1에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 회수되었다. Ca 의존적 결합능을 지표로 하는 패닝이 3회 반복되었다.

(10-3) 파지 ELISA에 의한 평가

상기 방법에 의해 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터, 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라 파지 함유 배양상청이 회수되었다.

최종농도 4%BSA 및 1.2 mM 칼슘 이온 농도가 되도록 BSA 및 CaCl₂가 첨가된 파지를 함유하는 배양상청이 이하의 순서로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원을 포함하는 100 μL의 PBS로 하룻밤 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 PBST로 세정함으로써 항원이 제거된 후, 당해 웰이 1시간 이상 250 μL의 4%BSA-TBS로 블로킹되었다. 4%BSA-TBS가 제거된 각 웰에 조제된 배양상청이 첨가된 당해 플레이트를 37℃에서 1시간 정치함으로써, 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정된 각 웰에 1.2 mM CaCl₂/TBS 또는 1 mM EDTA/TBS가 첨가되고, 당해 플레이트는 37℃에서 30분간 정치하고 인큐베이트되었다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정된 후에, 최종농도 4%의 BSA 및 1.2 mM의 이온화 칼슘 농도로 한 TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 각 웰에 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.

단리된 96 클론을 사용하여 파지 ELISA를 행함으로써, IL-6에 대한 Ca 의존적인 결합능을 갖는 6KC4-1#85 항체가 얻어졌다. 상기의 파지 ELISA의 결과, Ca 의존적인 항원에 대한 결합능이 있다고 판단되는 항체 단편을 주형으로 하여 특이적인 프라이머에 의해 증폭된 유전자의 염기서열 해석이 행해졌다. 6KC4-1#85 항체의 중쇄 가변영역의 서열을 서열번호：10에, 경쇄 가변영역의 서열을 서열번호：98에 기재하였다. 6KC4-1#85 항체의 중쇄 가변영역(서열번호：10)을 코드하는 폴리뉴클레오티드가, PCR법에 의해 IgG1 유래 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 DNA 단편이 동물세포 발현용 벡터에 삽입되어, 서열번호：99로 표시되는 중쇄를 발현하는 벡터가 구축되었다. 6KC4-1#85 항체의 경쇄 가변영역(서열번호：98)을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 PCR법에 의해 천연형 Kappa쇄의 정상영역(서열번호：100)을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결되어 서열번호：101로 표시된 서열을 코드하는 DNA 단편이 동물세포 발현용 벡터에 삽입되었다. 제작된 개변체의 서열은 당업자 공지의 방법으로 확인되었다.

(10-4) 항체의 발현과 정제

파지 ELISA의 결과, Ca 의존적인 항원에 대한 결합능이 있다고 판단된 클론 6KC4-1#85가 동물세포 발현용 플라스미드로 도입되었다. 항체의 발현은 아래의 방법을 사용하여 행해졌다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)에 현탁되어, 1.33×10⁶ 세포/mL의 세포밀도로 6웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는 리포펙션법에 의해 세포로 도입되었다. CO₂ 인큐베이터(37도, 8%CO₂, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행해져다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법을 사용해서, 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용함으로써 얻어진 측정값으로부터 항체농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

〔참고 실시예 11〕6KC4-1#85 항체의 칼슘 이온 결합 평가

(11-1) 6KC4-1#85 항체의 칼슘 이온 결합 평가

인간 항체 라이브러리로부터 취득된 칼슘 의존적 항원 결합 항체 6KC4-1#85 항체가 칼슘과 결합하는지 평가되었다. 이온화 칼슘 농도가 상이한 조건에서 측정되는 Tm값이 변동되는지 여부가 참고 실시예 6에 기재된 방법으로 평가되었다.

6KC4-1#85 항체의 Fab 도메인의 Tm값을 표 32에 나타내었다. 표 32에 나타낸 바와 같이, 6KC4-1#85 항체의 Fab 도메인의 Tm값은 칼슘 이온의 농도에 따라 변동되고 있는 것으로부터, 6KC4-1#85 항체가 칼슘과 결합하는 것이 명확해졌다.

(11-2) 6KC4-1#85 항체의 칼슘 이온 결합 부위의 동정

참고 실시예 11의 (11-1)에서 6KC4-1#85 항체는 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌으나, 6KC4-1#85는 hVk5-2 서열의 검토로부터 명확해진 칼슘 결합 모티브를 갖지 않는다. 이에 칼슘 이온이 6KC4-1#85 항체의 어느 잔기와 칼슘 이온이 결합해 있는지 동정하기 위해, 6KC4-1#85 항체의 CDR에 존재하는 Asp(D) 잔기를 칼슘 이온의 결합 또는 킬레이트에 관여할 수 없는 Ala(A) 잔기로 치환한 개변 중쇄(6_H1-11(서열번호：102), 6_H1-12(서열번호：103), 6_H1-13(서열번호：104), 6_H1-14(서열번호：105), 6_H1-15(서열번호：106)) 또는 개변 경쇄(6_L1-5(서열번호：107) 및 6_L1-6(서열번호：108))가 제작되었다. 개변 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 동물세포의 배양액으로부터, 개변 항체가 참고 실시예 6에 기재된 방법에 따라 정제되었다. 정제된 개변 항체의 칼슘 결합이 참고 실시예 6에 기재된 방법에 따라 측정되었다. 측정된 결과를 표 33에 나타내었다. 표 33에 나타내어져 있는 바와 같이, 6KC4-1#85 항체의 중쇄 CDR3의 95번 위치 또는 101번 위치(Kabat 넘버링)를 Ala 잔기로 치환함으로써 6KC4-1#85 항체의 칼슘 결합능이 상실되는 것으로부터 이 잔기가 칼슘과의 결합에 중요하다고 생각된다. 6KC4-1#85 항체의 개변 항체의 칼슘 결합성으로부터 명확해진 6KC4-1#85 항체의 중쇄 CDR3의 루프 부착 밑둥 부근에 존재하는 칼슘 결합 모티브도, 참고 실시예 9에서 기재된 바와 같은 Ca 라이브러리 디자인의 새로운 요소가 될 수 있다. 즉 참고 실시예 20 등에서 구체예로 들어진 경쇄 가변영역에 칼슘 결합 모티브가 도입된 라이브러리 외에, 예를 들면 6KC4-1#85 항체의 중쇄 CDR3에 존재하는 칼슘 결합 모티브를 포함하고, 그것 이외의 아미노산 잔기에 플렉시블 잔기를 포함하는 라이브러리가 생각된다.

〔참고 실시예 12〕정상 마우스를 사용한 Ca 의존성 결합 항체의 항원의 혈장 중 체류성에 대한 영향의 평가

(12-1) 정상 마우스를 사용한 in vivo 시험

정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)에 hsIL-6R(가용형 인간 IL-6 수용체：참고 실시예 3에서 제작)을 단독 투여 또는 가용형 인간 IL-6 수용체 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 후의 가용형 인간 IL-6 수용체 및 항인간 IL-6 수용체 항체의 체내동태가 평가되었다. 가용형 인간 IL-6 수용체 용액(5 ㎍/mL) 또는 가용형 인간 IL-6 수용체와 항인간 IL-6 수용체 항체의 혼합용액이 꼬리정맥에 10 mL/㎏으로 단회 투여되었다. 항인간 IL-6 수용체 항체로서는 상기 H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1, FH4-IgG1이 사용되었다.

혼합용액 중의 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 모두 5 ㎍/mL인데 항인간 IL-6 수용체 항체농도는 항체마다 달라, H54/L28-IgG1은 0.1 ㎎/mL, 6RL#9-IgG1 및 FH4-IgG1은 10 ㎎/mL, 이때 가용형 인간 IL-6 수용체에 대해 항인간 IL-6 수용체 항체는 충분량 과잉으로 존재하는 것으로부터, 가용형 인간 IL-6 수용체는 대부분이 항체에 결합해 있는 것으로 생각되었다. 투여 후 15분, 7시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일의 시점에서 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장을 얻었다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에서 보존되었다.

(12-2) ELISA법에 의한 정상 마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체농도의 측정

마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체농도는 ELISA법으로 측정되었다. 먼저 Anti-Human IgG(γ-chain specific) F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA)를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)에 분주하고 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 Anti-Human IgG 고상화 플레이트가 제작되었다. 혈장 중 농도로서 0.64, 0.32, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 ㎍/mL의 검량선 시료 및 100배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료의 각각이 분주된 Anti-Human IgG 고상화 플레이트가 25℃에서 1시간 인큐베이션되었다. 그 후 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)를 25℃에서 1시간 반응시킨 후에 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 25℃에서 0.5시간 반응시켰다. TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용하여 발색반응이 행해졌다. 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)에 의해 발색반응이 정지된 후, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 발색액의 450 nm에 있어서의 흡광도가 측정되었다. 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용하여 마우스 혈장 중 농도가 검량선의 흡광도를 기준으로 산출되었다. 이 방법으로 측정된 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1, FH4-IgG1의 혈장 중의 항체농도 추이를 도 42에 나타내었다.

(12-3) 전기화학 발광법에 의한 혈장 중의 가용형 인간 IL-6 수용체 농도의 측정

마우스의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 전기화학 발광법으로 측정되었다. 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 pg/mL로 조정된 가용형 인간 IL-6 수용체 검량선 시료 및 50배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료와, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D) 및 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D) 및 토실리주맙(중쇄 서열번호：109, 경쇄 서열번호：83) 용액의 혼합액을 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 샘플 중의 중의 Free Ca 농도를 저하시키고, 샘플 중의 거의 모든 가용형 인간 IL-6 수용체가 6RL#9-IgG1 또는 FH4-IgG1으로부터 해리되어, 첨가한 토실리주맙과 결합한 상태로 하기 위해 그때의 Assay buffer에는 10 mM EDTA가 포함되어 있었다. 그 후 당해 반응액이 MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주되었다. 추가로 25℃에서 1시간 반응시킨 플레이트의 각 웰이 세정된 후, 각 웰에 Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)가 분주되었다. 바로 반응액은 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)를 사용하여 측정되었다. 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용하여 산출되었다. 상기 방법으로 측정된 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 혈장 중의 가용형 인간 IL-6 수용체의 농도 추이를 도 43에 나타내었다.

그 결과 가용형 인간 IL-6 수용체 단독으로는 매우 빠른 소실을 나타낸 것에 대해, 가용형 인간 IL-6 수용체와 Ca 의존적인 결합이 없는 통상의 항체인 H54/L28-IgG1을 동시에 투여한 경우는, 가용형 인간 IL-6 수용체의 소실을 대폭 지연시켰다. 그것에 대해 가용형 인간 IL-6 수용체와 100배 이상의 Ca 의존적인 결합을 갖는 6RL#9-IgG1 또는 FH4-IgG1을 동시에 투여한 경우는, 가용형 인간 IL-6 수용체의 소실이 대폭 가속되었다. H54/L28-IgG1을 동시에 투여한 경우와 비교하여, 6RL#9-IgG1 및 FH4-IgG1을 동시에 투여한 경우는, 1일 후의 혈장 중의 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 각각 39배 및 2배 저감되었다. 이것으로부터 칼슘 의존적 결합 항체가 혈장 중으로부터의 항원의 소실을 가속 가능한 것이 확인되었다.

〔참고 실시예 13〕Ca 의존적 항원 결합 항체의 항원 소실 가속효과의 향상 검토(항체 제작)

(13-1) IgG 항체의 FcRn으로의 결합에 관하여

IgG 항체는 FcRn에 결합함으로써 긴 혈장 중 체류성을 갖는다. IgG와 FcRn의 결합은 산성 조건하(pH 6.0)에 있어서만 확인되고, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서 그 결합은 거의 확인되지 않는다. IgG 항체는 비특이적으로 세포에 흡수되는데, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 엔도솜 내의 FcRn에 결합함으로써 세포 표면 상으로 되돌아가, 혈장 중의 중성 조건하에 있어서 FcRn으로부터 해리된다. IgG의 Fc영역에 변이를 도입하고, 산성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 상실시키면, 엔도솜 내로부터 혈장 중으로 리사이클되지 않게 되기 때문에 항체의 혈장 중 체류성은 현저히 손상된다.

IgG 항체의 혈장 중 체류성을 개선시키는 방법으로서, 산성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 향상시키는 방법이 보고되어 있다. IgG 항체의 Fc영역에 아미노산 치환을 도입하고 산성 조건하의 FcRn으로의 결합을 향상시킴으로써, 엔도솜 내로부터 혈장 중으로의 IgG 항체의 리사이클 효율이 상승한다. 그 결과 IgG 항체의 혈장 중의 체류성이 개선된다. 아미노산의 치환을 도입할 때 중요하다고 생각되고 있는 것은 중성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 높일 수 없는 것이었다. 중성 조건하에 있어서 FcRn에 결합하는 IgG 항체는 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 FcRn에 결합함으로써 세포 표면 상으로 되돌아가는 것은 가능하더라도, 중성 조건하의 혈장 중에 있어서 IgG 항체가 FcRn으로부터 해리되지 않고 혈장 중으로 리사이클되지 않기 때문에, 반대로 IgG 항체의 혈장 중 체류성은 손상되는 것으로 생각되고 있었다.

예를 들면 Dall' Acqua등(J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180)에 기재되어 있는 바와 같이, 마우스에 투여된, 아미노산 치환을 도입함으로써 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서 마우스 FcRn에 대한 결합이 확인된 IgG1 항체의 혈장 중 체류성이 악화되는 것이 보고되어 있다. 또한 Yeung등(J. Immunol. (2009) 182 (12), 7663-7671), Datta-Mannan등(J. Biol. Chem. (2007) 282 (3), 1709-1717), Dall' Acqua등(J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180)에 기재되어 있는 바와 같이, 아미노산 치환을 도입함으로써 산성 조건하(pH 6.0)에 있어서의 인간 FcRn의 결합이 향상되는 IgG1 항체 개변체는 동시에 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합이 확인된다. 게잡이원숭이에게 투여된 당해 항체의 혈장 중 체류성은 개선되지 않아, 혈장 중 체류성에 변화가 확인되지 않은 것이 보고되어 있다. 그 때문에 항체의 기능을 향상시키는 항체 공학기술에 있어서는 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합을 증가시키지 않고 산성 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 증가시킴으로써 항체의 혈장 중 체류성을 개선시키는 것에 주력되고 있었다. 즉 그 Fc영역에 아미노산 치환을 도입함으로써 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합이 증가된 IgG1 항체의 이점은 지금까지 보고되어 있지 않다.

Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체는 가용형 항원의 소실을 가속시켜, 하나의 항체 분자가 복수 회 반복해서 가용형의 항원에 결합하는 효과를 갖는 것으로부터 매우 유용하다. 이 항원 소실 가속효과를 추가로 향상시키는 방법으로서, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 증강시키는 방법이 검증되었다.

(13-2) 중성 조건하에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Ca 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체의 조제

칼슘 의존적 항원 결합능을 갖는 FH4-IgG1, 6RL#9-IgG1 및 대조로서 사용된 칼슘 의존적 항원 결합능을 갖지 않는 H54/L28-IgG1의 Fc영역에 아미노산 변이를 도입함으로써 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 갖는 개변체가 제작되었다. 아미노산 변이의 도입은 PCR을 사용한 당업자 공지의 방법을 사용해서 행해졌다. 구체적으로는 IgG1의 중쇄 정상영역에 대해, EU 넘버링으로 표시되는 434번 위치의 아미노산인 Asn이 Trp로 치환된 FH4-N434W(중쇄서열번호：110, 경쇄서열번호：95)와 6RL#9-N434W(중쇄서열번호：111, 경쇄서열번호：93)와 H54/L28-N434W(중쇄서열번호：112, 경쇄서열번호：97)가 제작되었다. QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하여 첨부 설명서 기재의 방법을 사용하여 그 아미노산이 치환된 변이체를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 동물세포 발현 벡터가 제작되었다. 항체의 발현, 정제, 농도 측정은 참고 실시예 6에 기재된 방법에 준하여 실시되었다.

〔참고 실시예 14〕정상 마우스를 사용한 Ca 의존성 결합 항체의 소실 가속효과의 평가

(14-1) 정상 마우스를 사용한 in vivo 시험

정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)에 hsIL-6R(가용형 인간 IL-6 수용체：참고 실시예 3에서 제작)이 단독으로 투여되었거나 또는 가용형 인간 IL-6 수용체 및 항인간 IL-6 수용체 항체가 동시 투여된 후의 가용형 인간 IL-6 수용체 및 항인간 IL-6 수용체 항체의 체내동태가 평가되었다. 가용형 인간 IL-6 수용체 용액(5 ㎍/mL) 또는 가용형 인간 IL-6 수용체와 항인간 IL-6 수용체 항체의 혼합용액이 꼬리정맥에 10 mL/㎏으로 단회 투여되었다. 항인간 IL-6 수용체 항체로서 전술한 H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W, FH4-N434W가 사용되었다.

혼합용액 중의 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 모두 5 ㎍/mL인데 항인간 IL-6 수용체 항체의 농도는 항체마다 달라, H54/L28-N434W는 0.042 ㎎/mL, 6RL#9-N434W는 0.55 ㎎/mL, FH4-N434W는 1 ㎎/mL로 조제되었다. 이때 가용형 인간 IL-6 수용체에 대해 항인간 IL-6 수용체 항체는 충분량 과잉으로 존재하기 때문에, 가용형 인간 IL-6 수용체의 대부분은 항체에 결합해 있는 것으로 생각되었다. 투여 후 15분, 7시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일의 시점에서 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에서 보존되었다.

(14-2) ELISA법에 의한 정상 마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체의 농도 측정

마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체농도는 참고 실시예 12와 동일한 ELISA법으로 측정되었다. 이 방법으로 측정된 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W, FH4-N434W 항체의 혈장 중의 항체농도 추이를 도 44에 나타내었다.

(14-3) 전기화학 발광법에 의한 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 측정

마우스의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 전기화학 발광법으로 측정되었다. 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 pg/mL로 조제된 가용형 인간 IL-6 수용체 검량선 시료 및 50배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료와, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D) 및 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)의 혼합액을 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 샘플 중의 Free Ca 농도를 저하시켜, 샘플 중의 거의 모든 가용형 인간 IL-6 수용체가 6RL#9-N434W 또는 FH4-N434W로부터 해리되어 free체로서 존재하는 상태로 하기 위해, 그때의 Assay buffer에는 10 mM EDTA가 포함되어 있었다. 그 후, 당해 반응액이 MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주되었다. 추가로 25℃에서 1시간 반응시킨 플레이트의 각 웰이 세정된 후, 각 웰에 Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)가 분주되었다. 바로 반응액은 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)를 사용하여 측정되었다. 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용하여 산출되었다. 상기의 방법으로 측정된 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 혈장 중의 가용형 인간 IL-6 수용체의 농도 추이를 도 45에 나타내었다.

그 결과 pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 한편으로 가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 Ca 의존적인 결합 활성을 갖지 않는 H54/L28-N434W 항체가 동시에 투여된 경우는, 가용형 인간 IL-6 수용체가 단독으로 투여된 경우와 비교하여 가용형 인간 IL-6 수용체의 소실이 대폭으로 지연되었다. 그것에 대해, 가용형 인간 IL-6 수용체에 대해 100배 이상의 Ca 의존적인 결합을 갖고, pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 갖는 6RL#9-N434W 항체 또는 FH4-N434W 항체가 동시에 투여된 경우는, 가용형 인간 IL-6 수용체가 단독으로 투여된 경우보다도 가용형 인간 IL-6 수용체의 소실이 가속되었다. 가용형 인간 IL-6 수용체가 단독으로 투여된 경우와 비교하여, 6RL#9-N434W 항체 또는 FH4-N434W 항체가 동시에 투여된 경우는, 투여 후 1일에서의 혈장 중의 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 각각 3배 및 8배 저감되었다. 그 결과 칼슘 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체에 대해 pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 부여함으로써 혈장 중으로부터의 항원의 소실이 더욱 가속될 수 있는 것이 확인되었다.

가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 Ca 의존적인 결합을 갖지 않는 H54/L28-IgG1 항체와 비교하여, 가용형 인간 IL-6 수용체에 대해 100배 이상의 Ca 의존적인 결합 활성을 갖는 6RL#9-IgG1 항체 또는 FH4-IgG1 항체는 가용형 인간 IL-6 수용체의 소실을 증대시키는 효과가 확인되었다. 가용형 인간 IL-6 수용체에 대해 100배 이상의 Ca 의존적인 결합을 갖고, pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 갖는 6RL#9-N434W 항체 또는 FH4-N434W 항체는 가용형 인간 IL-6 수용체의 소실을 가용형 인간 IL-6 수용체 단독의 투여보다도 가속시키는 것이 확인되었다. 이들의 데이터는 pH 의존적으로 항원에 결합하는 항체와 마찬가지로, Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체가 엔도솜 내에서 항원을 해리하는 것을 나타내고 있다.

〔참고 실시예 15〕칼슘 이온에 결합하는 인간 생식세포 계열 서열의 탐색

(15-1) 칼슘 의존적으로 항원에 결합하는 항체

칼슘 의존적으로 항원에 결합하는 항체(칼슘 의존적 항원 결합 항체)는 칼슘의 농도에 따라 항원과의 상호작용이 변화되는 항체이다. 칼슘 의존적 항원 결합 항체는 칼슘 이온을 매개로 항원에 결합하는 것으로 생각되기 때문에, 항원측의 에피토프를 형성하는 아미노산은 칼슘 이온을 킬레이트하는 것이 가능한 음전하의 아미노산 또는 수소 결합 액셉터가 될 수 있는 아미노산이다. 이러한 에피토프를 형성하는 아미노산의 성질로부터 히스티딘을 도입함으로써 제작되는 pH 의존적으로 항원에 결합하는 결합 분자 이외의 에피토프를 타겟하는 것이 가능해진다. 칼슘 의존적 및 pH 의존적으로 항원에 결합하는 성질을 겸비하는 항원 결합 분자를 사용함으로써 폭 넓은 성질을 갖는 다양한 에피토프를 각각 타겟하는 것이 가능한 항원 결합 분자를 제작하는 것이 가능해질 것으로 생각된다. 이에 칼슘이 결합하는 모티브를 포함하는 분자의 집합(Ca 라이브러리)을 구축하고, 이 분자의 집단으로부터 항원 결합 분자를 취득하면, 칼슘 의존적 항원 결합 항체가 효율적으로 얻어질 것으로 생각된다.

(15-2) 인간 생식세포 계열 서열의 취득

칼슘이 결합하는 모티브를 포함하는 분자 집합의 예로서, 당해 분자가 항체인 예를 생각할 수 있다. 바꿔 말하면 칼슘이 결합하는 모티브를 포함하는 항체 라이브러리가 Ca 라이브러리인 경우를 생각할 수 있다.

인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 항체에서 칼슘 이온이 결합하는 것은 지금까지 보고되어 있지 않다. 이에 인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부를 판정하기 위해, Human Fetal Spreen Poly RNA(Clontech)로부터 조제된 cDNA를 주형으로 하여 인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 항체의 생식세포 계열의 서열이 클로닝되었다. 클로닝된 DNA 단편은 동물세포 발현 벡터에 삽입되었다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열을 당업자 공지의 방법으로 결정하고, 그 서열번호를 표 34에 나타내었다. 서열번호：5(Vk1), 서열번호：6(Vk2), 서열번호：7(Vk3), 서열번호：8(Vk4) 및 서열번호：4(Vk5)를 코드하는 폴리뉴클레오티드가, PCR법에 의해 천연형 Kappa쇄의 정상영역(서열번호：100)을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 DNA 단편이, 동물세포 발현용 벡터에 삽입되었다. 또한 서열번호：113(Vk1), 서열번호：114(Vk2), 서열번호：115(Vk3), 서열번호：116(Vk4) 및 서열번호：117(Vk5)을 코드하는 폴리뉴클레오티드가, PCR법에 의해 서열번호：11로 표시되는 IgG1의 C 말단 2 아미노산이 결실된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 DNA 단편이, 동물세포 발현용 벡터에 삽입되었다. 제작된 개변체의 서열은 당업자 공지의 방법으로 확인되었다.

(15-3) 항체의 발현과 정제

취득된 5종류의 인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 DNA 단편이 삽입된 동물세포 발현 벡터가 동물세포로 도입되었다. 항체의 발현은 아래의 방법을 사용해서 행해졌다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)에 현탁되어, 1.33×10⁶ 세포/mL의 세포밀도로 6 웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는 리포펙션법에 의해 세포로 도입되었다. CO₂ 인큐베이터(37도, 8%CO₂, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행해졌다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법을 사용해서, 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용함으로써 얻어진 측정값으로부터 항체농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

(15-4) 인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 항체의 칼슘 이온 결합 활성의 평가

정제된 항체의 칼슘 이온 결합 활성이 평가되었다. 항체로의 칼슘 이온의 결합 평가의 지표로서 시차주사형 열량측정(DSC)에 의한 열변성 중간온도(Tm값)가 측정되었다(MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal). 열변성 중간온도(Tm값)는 안정성의 지표로, 칼슘 이온의 결합에 의해 단백질이 안정화되면, 열변성 중간온도(Tm값)는 칼슘 이온이 결합해 있지 않은 경우에 비해 높아진다(J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149). 항체 용액 중의 칼슘 이온 농도의 변화에 따른 항체의 Tm값의 변화를 평가함으로써 항체로의 칼슘 이온의 결합 활성이 평가되었다. 정제된 항체가 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂(pH 7.4) 또는 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 3 μM CaCl₂(pH 7.4)의 용액을 외액으로 하는 투석(EasySEP, TOMY) 처리에 제공되었다. 투석에 사용된 용액을 사용하여 대략 0.1 ㎎/mL로 조제된 항체 용액을 피험물질로 하여, 20℃부터 115℃까지 240℃/hr의 승온속도로 DSC 측정이 행해졌다. 얻어진 DSC의 변성 곡선을 토대로 산출된 각 항체의 Fab 도메인의 열변성 중간온도(Tm값)를 35에 나타내었다.

그 결과 Vk1, Vk2, Vk3, Vk4 서열을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값은 당해 Fab 도메인을 포함하는 용액 중의 칼슘 이온의 농도에 상관없이 변동되지 않았다. 한편으로 Vk5 서열을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값은 당해 Fab 도메인을 포함하는 항체 용액 중의 칼슘 이온의 농도에 따라 변동된 것으로부터, Vk5 서열이 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌다.

〔참고 실시예 16〕인간 Vk5(hVk5) 서열의 평가

(16-1) hVk5 서열

Kabat 데이터 베이스 중에는 hVk5 서열로서 hVk5-2 서열만이 등록되어 있다. 이하에서는 hVk5와 hVk5-2는 동일한 정의로 취급된다. WO2010/136598에서는 hVk5-2 서열의 생식세포 계열 서열 중의 존재비는 0.4%로 기재되어 있다. 다른 보고에서도 hVk5-2 서열의 생식세포 계열 서열 중의 존재비는 0~0.06%로 기술되어 있다(J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86, Proc. Natl. Acad. Sci. (2009) 106, 48, 20216-20221). 상기와 같이 hVk5-2 서열은 생식세포 계열 서열 중에서 출현 빈도가 낮은 서열이기 때문에, 인간 생식세포 계열 서열로 구성되는 항체 라이브러리나 인간 항체를 발현하는 마우스로의 면역에 의해 취득된 B세포로부터, 칼슘과 결합하는 항체를 취득하는 것은 비효율적으로 생각되었다. 이에 인간 hVk5-2 서열을 포함하는 Ca 라이브러리를 설계할 수 있을 것으로 생각되는데, hVk5-2 서열의 물성은 보고되어 있지 않아 그 가능성의 실현은 미지였다.

(16-2) 당쇄 비부가형 hVk5-2 서열의 구축, 발현 및 정제

hVk5-2 서열은 20번 위치(Kabat 넘버링)의 아미노산에 N형 당쇄가 부가되는 서열을 갖는다. 단백질에 부가하는 당쇄에는 이질성(heterogeneity)이 존재하기 때문에 물질의 균일성 관점에서 당쇄는 부가되지 않는 편이 바람직하다. 이에 20번 위치(Kabat 넘버링)의 Asn(N) 잔기가 Thr(T) 잔기로 치환된 개변체 hVk5-2_L65(서열번호：118)가 제작되었다. 아미노산의 치환은 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하는 당업자 공지의 방법으로 행해졌다. 개변체 hVk5-2_L65를 코드하는 DNA가 동물 발현용 벡터에 삽입되었다. 제작된 개변체 hVk5-2_L65의 DNA가 삽입된 동물 발현용 벡터는 중쇄로서 CIM_H(서열번호：117)가 발현되도록 삽입된 동물 발현용 벡터와, 참고 실시예 6에서 기재한 방법으로 함께 동물세포 중에 도입되었다. 도입된 동물세포 중에서 발현된 hVk5-2_L65 및 CIM_H를 포함하는 항체가 참고 실시예 6에서 기재한 방법으로 정제되었다.

(16-3) 당쇄 비부가형 hVk5-2 서열을 포함하는 항체의 물성 평가

취득된 개변 서열 hVk5-2_L65를 포함하는 항체가 개변에 제공된 원래의 hVk5-2 서열을 포함하는 항체보다도 그 이질성이 감소되어 있는지 여부가 이온 교환 크로마토그래피를 사용해서 분석되었다. 이온 교환 크로마토그래피의 방법을 표 36에 나타내었다. 분석 결과, 도 46에 나타낸 바와 같이 당쇄 부가 부위가 개변된 hVk5-2_L65는 원래의 hVk5-2 서열보다도 이질성이 감소되어 있는 것이 나타내어졌다.

다음으로 이질성이 감소된 hVk5-2_L65 서열을 포함하는 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가 참고 실시예 15에 기재된 방법을 사용해서 평가되었다. 그 결과 표 37에 나타낸 바와 같이, 당쇄 부가 부위가 개변된 hVk5-2_L65를 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값도 항체 용액 중의 칼슘 이온의 농도 변화에 따라 변동되었다. 즉, 당쇄 부가 부위가 개변된 hVk5-2_L65를 포함하는 항체의 Fab 도메인에 칼슘 이온이 결합하는 것이 나타내어졌다.

〔참고 실시예 17〕hVk5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 항체 분자에 대한 칼슘 이온의 결합 활성의 평가

(17-1) hVk5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 개변 항체의 제작, 발현 및 정제

hVk5-2_L65 서열은 인간 Vk5-2 서열의 프레임워크에 존재하는 당쇄 부가 부위의 아미노산이 개변된 서열이다. 참고 실시예 16에서 당쇄 부가 부위를 개변해도 칼슘 이온이 결합하는 것이 나타내어졌으나, 프레임워크 서열은 생식세포 계열의 서열인 것이 면역원성의 관점에서 일반적으로는 바람직하다. 이에 항체의 프레임워크 서열을 당해 항체에 대한 칼슘 이온의 결합 활성을 유지하면서, 당쇄가 부가되지 않는 생식세포 계열 서열의 프레임워크 서열로 치환하는 것이 가능한지 여부가 검토되었다.

화학 합성된 hVk5-2 서열의 프레임워크 서열이 hVk1, hVk2, hVk3 및 hVk4 서열로 개변된 서열(각각 CaVk1(서열번호：119), CaVk2(서열번호：120), CaVk3(서열번호：121), CaVk4(서열번호：122)를 코드하는 폴리뉴클레오티드가, PCR법에 의해 천연형 Kappa쇄의 정상영역(서열번호：100)을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 DNA 단편이, 동물세포 발현용 벡터에 삽입되었다. 제작된 개변체의 서열은 당업자 공지의 방법으로 확인되었다. 상기와 같이 제작된 각 플라스미드는 중쇄 CIM_H(서열번호：117)를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 플라스미드와 함께 참고 실시예 6에서 기재된 방법으로 동물세포에 도입되었다. 상기와 같이 도입된 동물세포의 배양액으로부터, 발현된 목적하는 항체 분자가 정제되었다.

(17-2) hVk5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 개변 항체의 칼슘 이온 결합 활성의 평가

hVk5-2 서열 이외의 생식세포 계열 서열(hVk1, hVk2, hVk3, hVk4)의 프레임워크 서열 및 hVK5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 개변 항체에, 칼슘 이온이 결합하는지 여부가 실시예 6에 기재된 방법으로 평가되었다. 평가된 결과를 표 38에 나타내었다. 각 개변 항체의 Fab 도메인의 Tm값은 항체 용액 중의 칼슘 이온 농도의 변화에 따라 변동되는 것이 나타내어졌다. 따라서 hVk5-2 서열의 프레임워크 서열 이외의 프레임워크 서열을 포함하는 항체도 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌다.

또한 hVk5-2 서열 이외의 생식세포 계열 서열(hVk1, hVk2, hVk3, hVk4)의 프레임워크 서열 및 hVK5-2 서열의 CDR 서열을 포함하도록 개변된 각 항체의 Fab 도메인의 열안정성 지표인 열변성 온도(Tm값)는 개변에 제공된 원래의 hVk5-2 서열을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값보다도 증가하는 것이 명확해졌다. 이 결과로부터, hVk1, hVk2, hVk3, hVk4의 프레임워크 서열 및 hVk5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 항체는 칼슘 이온과 결합하는 성질을 가질 뿐 아니라, 열안정성의 관점에서도 우수한 분자인 것이 발견되었다.

〔참고 실시예 18〕인간 생식세포 계열 hVk5-2 서열에 존재하는 칼슘 이온 결합 부위의 동정

(18-1) hVk5-2 서열의 CDR 서열 중의 변이 부위의 설계

참고 실시예 17에 기재되어 있는 바와 같이, hVk5-2 서열의 CDR 부분이 다른 생식세포 계열의 프레임워크 서열에 도입된 경쇄를 포함하는 항체도 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌다. 이 결과로부터 hVk5-2에 존재하는 칼슘 이온 결합 부위는 CDR 중에 존재하는 것이 시사되었다. 칼슘 이온과 결합하는 즉, 칼슘 이온을 킬레이트하는 아미노산으로서 음전하의 아미노산 또는 수소 결합의 액셉터가 될 수 있는 아미노산을 들 수 있다. 이에 hVk5-2 서열의 CDR 서열 중에 존재하는 Asp(D) 잔기 또는 Glu(E) 잔기가 Ala(A) 잔기로 치환된 변이 hVk5-2 서열을 포함하는 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가 평가되었다.

(18-2) hVk5-2 서열의 Ala 치환체의 제작 및 항체의 발현 및 정제

hVk5-2 서열의 CDR 서열 중에 존재하는 Asp 및/ 또는 Glu 잔기가 Ala 잔기로 개변된 경쇄를 포함하는 항체 분자가 제작되었다. 참고 실시예 16에서 기재되는 바와 같이, 당쇄가 부가되지 않는 개변체 hVk5-2_L65는 칼슘 이온 결합을 유지하고 있었던 것으로부터, 칼슘 이온 결합성이라는 관점에서는 hVk5-2 서열과 동등하다고 생각된다. 본 실시예에서는 hVk5-2_L65를 템플레이트 서열로 하여 아미노산 치환이 행해졌다. 제작된 개변체를 표 39에 나타내었다. 아미노산의 치환은 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene), PCR 또는 In fusion Advantage PCR cloning kit(TAKARA) 등의 당업자 공지의 방법에 의해 행해져, 아미노산이 치환된 개변 경쇄의 발현 벡터가 구축되었다.

얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정되었다. 제작된 개변 경쇄의 발현 벡터를 중쇄 CIM_H(서열번호：117)의 발현 벡터와 함께, 인간 태아 신장 암세포 유래 HEK293H주(Invitrogen) 또는 FreeStyle293세포(Invitrogen)에 일과성으로 도입함으로써 항체를 발현시켰다. 얻어진 배양상청으로부터, rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE헬스케어)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체가 정제되었다. 정제된 항체 용액의 280 nm에서의 흡광도가 분광광도계를 사용하여 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용함으로써 얻어진 측정값으로부터 항체농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

(18-3) hVk5-2 서열의 Ala 치환체를 포함하는 항체의 칼슘 이온 결합 활성 평가

얻어진 정제 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가 참고 실시예 15에 기재된 방법에 의해 판정되었다. 그 결과를 표 40에 나타내었다. hVk5-2 서열의 CDR 서열 중에 존재하는 Asp 또는 Glu 잔기를 칼슘 이온의 결합 또는 킬레이트에 관여할 수 없는 Ala 잔기로 치환함으로써, 항체 용액의 칼슘 이온 농도의 변화에 따라 그 Fab 도메인의 Tm값이 변동되지 않는 항체가 존재하였다. Ala 치환에 의해 Tm값이 변동되지 않는 치환 부위(32번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링))는 칼슘 이온과 항체의 결합에 특히 중요한 것이 나타내어졌다.

〔참고 실시예 19〕칼슘 이온 결합 모티브를 갖는 hVk1 서열을 포함하는 항체의 칼슘 이온 결합 활성의 평가

(19-1) 칼슘 이온 결합 모티브를 갖는 hVk1 서열의 제작 및 항체의 발현 및 정제

참고 실시예 18에서 기재된 Ala 치환체의 칼슘의 결합 활성의 결과로부터, hVk5-2 서열의 CDR 서열 중에서 Asp나 Glu 잔기가 칼슘 결합에 중요한 것이 나타내어졌다. 이에 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링)의 잔기만을 다른 생식세포 계열의 가변영역 서열에 도입해도 칼슘 이온과 결합할 수 있는지 여부가 평가되었다. 구체적으로는 인간 생식세포계 서열인 hVk1 서열의 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링)의 잔기가 hVk5-2 서열의 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링)의 잔기로 치환된 개변체 LfVk1_Ca(서열번호：131)가 제작되었다. 즉, hVk5-2 서열 중의 이들의 5 잔기만이 도입된 hVk1 서열을 포함하는 항체가 칼슘과 결합할 수 있는지 여부가 판정되었다. 개변체의 제작은 참고 실시예 17과 동일하게 행해졌다. 얻어진 경쇄 개변체 LfVk1_Ca 및 경쇄 hVk1 서열을 포함하는 LfVk1(서열번호：132)을 중쇄 CIM_H(서열번호：117)와 함께 발현시켰다. 항체의 발현 및 정제는 참고 실시예 18과 동일한 방법으로 실시되었다.

(19-2) 칼슘 이온 결합 모티브를 갖는 인간 hVk1 서열을 포함하는 항체의 칼슘 이온 결합 활성의 평가

상기와 같이 얻어진 정제 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가 참고 실시예 15에 기재된 방법으로 판정되었다. 그 결과를 표 41에 나타내었다. hVk1 서열을 갖는 LfVk1을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값은 항체 용액 중의 칼슘의 농도 변화에 따라서는 변동되지 않는 한편으로, LfVk1_Ca를 포함하는 항체 서열의 Tm값은 항체 용액 중의 칼슘의 농도 변화에 따라 1℃ 이상 변화된 것으로부터, LfVk1_Ca를 포함하는 항체가 칼슘과 결합하는 것이 나타내어졌다. 상기 결과로부터, 칼슘 이온의 결합에는 hVk5-2의 CDR 서열이 모두 필요하지 않고, LfVk1_Ca 서열을 구축할 때 도입된 잔기만으로도 충분한 것이 나타내어졌다.

〔참고 실시예 20〕Ca 농도 의존적으로 항원에 결합하는 결합 항체를 효율적으로 취득할 수 있도록, 칼슘 이온 결합 모티브가 가변영역에 도입된 항체 분자의 집단(Ca 라이브러리)의 설계

칼슘 결합 모티브로서, 예를 들면 hVk5-2 서열이나 그의 CDR 서열, 추가로 잔기가 좁혀진 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치, 92번 위치(Kabat 넘버링)를 바람직하게 들 수 있다. 그 밖에도 칼슘과 결합하는 단백질이 갖는 EF 핸드 모티브(칼모듈린 등)나 C타입 렉틴(ASGPR 등)도 칼슘 결합 모티브에 해당한다.

Ca 라이브러리는 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역으로 구성된다. 중쇄 가변영역은 인간 항체 서열이 사용되고, 경쇄 가변영역에 칼슘 결합 모티브가 도입되었다. 칼슘 결합 모티브가 도입되는 경쇄 가변영역의 템플레이트 서열로서 hVk1 서열이 선택되었다. hVk1 서열에 칼슘 결합 모티브 중 하나인 hVk5-2의 CDR 서열이 도입된 LfVk1_Ca 서열을 포함하는 항체는 참고 실시예 19에서 나타낸 바와 같이 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌다. 템플레이트 서열에 복수의 아미노산을 출현시켜서 라이브러리를 구성하는 항원 결합 분자의 다양성이 확대되었다. 복수의 아미노산을 출현시키는 위치는 항원과 상호작용할 가능성이 높은 가변영역의 표면에 노출되는 위치가 선택되었다. 구체적으로는 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 34번 위치, 50번 위치, 53번 위치, 91번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치 및 96번 위치(Kabat 넘버링)가 이러한 플렉시블 잔기로서 선택되었다.

다음으로 출현시키는 아미노산 잔기의 종류과 그의 출현율이 설정되었다. Kabat 데이터 베이스(KABAT, E.A. ET AL.: 'Sequences of proteins of immunological interest', vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION)에 등록되어 있는 hVk1과 hVk3의 서열 중의 플렉시블 잔기에 있어서의 아미노산의 출현 빈도가 해석되었다. 해석 결과를 토대로 각 위치에서 출현 빈도가 높은 아미노산으로부터 Ca 라이브러리에서 출현시키는 아미노산의 종류가 선택되었다. 이때 아미노산의 성질이 치우치지 않도록 해석 결과에서는 출현 빈도가 적은 것으로 판정된 아미노산도 선택되었다. 또한 선택된 아미노산의 출현 빈도는 Kabat 데이터 베이스의 해석 결과를 참고로 하여 설정되었다.

이상과 같이 설정된 아미노산 및 출현 빈도를 고려함으로써 Ca 라이브러리로서 칼슘 결합 모티브를 포함하고, 당해 모티브 이외의 각 염기에서 복수의 아미노산을 포함하는 서열의 다양성이 중시된 Ca 라이브러리가 설계되었다. 표 1 및 2에 Ca 라이브러리의 상세한 디자인을 나타내었다(각 표 중의 위치는 EU 넘버링을 나타낸다). 또한 표 1 및 2에서 기재된 아미노산의 출현 빈도는 Kabat 넘버링으로 표시되는 92번 위치가 Asn(N)인 경우 94번 위치는 Ser(S)이 아니라 Leu(L)로 할 수 있다.

〔참고 실시예 21〕Ca 라이브러리의 제작

인간 PBMC로부터 제작한 폴리 A RNA나 시판되고 있는 인간 폴리 A RNA 등을 주형으로 하여 PCR법에 의해 항체 중쇄 가변영역의 유전자 라이브러리가 증폭되었다. 항체 경쇄 가변영역 부분에 대해서는 참고 실시예 20에 기재된 바와 같이, 칼슘 결합 모티브를 유지하여 칼슘 농도 의존적으로 항원에 대해 결합 가능한 항체의 출현 빈도를 높인 항체 가변영역 경쇄 부분이 설계되었다. 또한 플렉시블 잔기 중 칼슘 결합 모티브가 도입된 잔기 이외의 아미노산 잔기로서, 천연 인간 항체에서의 아미노산 출현 빈도의 정보((KABAT, E.A. ET AL.: 'Sequences of proteins of immunological interest', vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION)가 참고로 되고, 천연 인간 항체의 서열 중에서 출현 빈도가 높은 아미노산을 균등하게 분포시킨 항체 경쇄 가변영역의 라이브러리가 설계되었다. 이와 같이 제작된 항체 중쇄 가변영역의 유전자 라이브러리와 항체 경쇄 가변영역의 유전자 라이브러리의 조합이 파지미드 벡터로 삽입되어, 인간 항체 서열로 이루어지는 Fab 도메인을 제시하는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리(Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100)가 구축되었다. 상기 라이브러리의 구축시에는 파지미드의 Fab와 파지 pIII 단백질을 연결하는 링커 부분 및 헬퍼 파지 pIII 단백 유전자의 N2 도메인과 CT 도메인 사이에 트립신 절단 서열이 삽입된 파지 디스플레이 라이브러리의 서열이 사용되었다. 항체 유전자 라이브러리가 도입된 대장균으로부터 단리된 항체 유전자 부분의 서열이 확인되어, 290종류의 클론의 서열정보가 얻어졌다. 설계된 아미노산 분포와 확인된 서열 중의 아미노산의 분포가 도 52에 나타내어져 있다. 설계된 아미노산 분포에 대응하는 다양한 서열을 포함하는 라이브러리가 구축되었다.

〔참고 실시예 22〕Ca 라이브러리에 포함되는 분자의 칼슘 이온 결합 활성의 평가

(22-1) Ca 라이브러리에 포함되는 분자의 칼슘 이온 결합 활성

참고 실시예 14에 나타내어져 있는 바와 같이, 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어진 hVk5-2 서열은 생식세포 계열 서열 중에서 출현 빈도가 낮은 서열이기 때문에, 인간 생식세포 계열 서열로 구성되는 항체 라이브러리나 인간 항체를 발현하는 마우스로의 면역에 의해 취득된 B세포로부터 칼슘과 결합하는 항체를 취득하는 것은 비효율적이라고 생각되었다. 이에 참고 실시예 21에서 Ca 라이브러리가 구축되었다. 구축된 Ca 라이브러리에 칼슘 결합을 나타내는 클론이 존재하는지 평가되었다.

(22-2) 항체의 발현과 정제

Ca 라이브러리에 포함되는 클론이 동물세포 발현용 플라스미드로 도입되었다. 항체의 발현은 아래의 방법을 사용해서 행해졌다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)에 현탁되어, 1.33×10⁶ 세포/mL의 세포밀도로 6 웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는 리포펙션법에 의해 세포로 도입되었다. CO₂ 인큐베이터(37℃, 8%CO₂, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행해졌다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법을 사용해서 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용함으로써 얻어진 측정값으로부터 항체농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

(22-3) 취득된 항체로의 칼슘 이온 결합 평가

상기와 같이 얻어진 정제 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가 참고 실시예 6에 기재된 방법으로 판정되었다. 그 결과를 표 42에 나타내었다. Ca 라이브러리에 포함되는 복수의 항체의 Fab 도메인의 Tm은 칼슘 이온 농도에 따라 변동되어, 칼슘 이온과 결합하는 분자가 포함되는 것이 나타내어졌다.

〔참고 실시예 23〕pH 의존적 결합 항체 라이브러리의 설계

(23-1) pH 의존적 결합 항체의 취득방법

WO2009/125825는 항원 결합 분자에 히스티딘을 도입함으로써 pH 중성영역과 pH 산성영역에서 성질이 변화되는 pH 의존적 항원 결합 항체를 개시하고 있다. 개시된 pH 의존적 결합 항체는 목적하는 항원 결합 분자의 아미노산 서열의 일부를 히스티딘으로 치환하는 개변에 의해 취득되고 있다. 개변하는 대상의 항원 결합 분자를 사전에 얻지 않고, pH 의존적 결합 항체를 보다 효율적으로 취득하기 위해, 히스티딘을 가변영역(보다 바람직하게는 항원 결합에 관여할 가능성이 있는 위치)에 도입한 항원 결합 분자의 집단(His 라이브러리라 부른다)으로부터 목적하는 항원에 결합하는 항원 결합 분자를 취득하는 방법을 생각할 수 있다. His 라이브러리로부터 얻어지는 항원 결합 분자는 통상의 항체 라이브러리보다도 히스티딘이 높은 빈도로 출현하기 때문에, 목적하는 성질을 갖는 항원 결합 분자를 효율적으로 취득할 수 있을 것으로 생각된다.

(23-2) pH 의존적으로 항원에 결합하는 결합 항체를 효율적으로 취득할 수 있도록 히스티딘 잔기가 가변영역에 도입된 항체 분자의 집단(His 라이브러리)의 설계

먼저 His 라이브러리로 히스티딘을 도입하는 위치가 선택되었다. WO2009/125825에서는 IL-6 수용체 항체, IL-6 항체 및 IL-31 수용체 항체의 서열 중의 아미노산 잔기를 히스티딘으로 치환함으로써 pH 의존적 항원 결합 항체를 제작한 것이 개시되어 있다. 또한 항원 결합 분자의 아미노산 서열을 히스티딘으로 치환함으로써 pH 의존적 항원 결합능을 갖는 항난백 리소자임 항체(FEBS Letter 11483, 309, 1, 85-88) 및 항헵시딘 항체(WO2009/139822)가 제작되어 있다. IL-6 수용체 항체, IL-6 항체, IL-31 수용체 항체, 난백 리소자임 항체 및 헵시딘 항체로 히스티딘을 도입한 위치를 표 43에 나타내었다. 표 43에 나타낸 위치는 항원과 항체의 결합을 제어할 수 있는 위치의 후보로서 들 수 있다. 또한 표 43에서 나타내어진 위치 이외에도 항원과 접촉할 가능성이 높은 위치도 히스티딘을 도입하는 위치로서 적절한 것으로 생각되었다.

중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역으로 구성되는 His 라이브러리 중 중쇄 가변영역은 인간 항체 서열이 사용되고, 경쇄 가변영역에 히스티딘이 도입되었다. His 라이브러리로 히스티딘을 도입하는 위치로서 상기에서 예로 들어진 위치와 항원 결합에 관여할 가능성이 있는 위치, 즉 경쇄의 30번 위치, 32번 위치, 50번 위치, 53번 위치, 91번 위치, 92번 위치 및 93번 위치(Kabat 넘버링, Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH)가 선택되었다. 또한 히스티딘을 도입하는 경쇄 가변영역의 템플레이트 서열로서 Vk1 서열이 선택되었다. 템플레이트 서열에 복수의 아미노산을 출현시켜서 라이브러리를 구성하는 항원 결합 분자의 다양성이 확대되었다. 복수의 아미노산을 출현시키는 위치는 항원과 상호작용할 가능성이 높은 가변영역의 표면에 노출되는 위치가 선택되었다. 구체적으로는 경쇄의 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 34번 위치, 50번 위치, 53번 위치, 91번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치 및 96번 위치(Kabat 넘버링, Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH)가 이러한 플렉시블 잔기로서 선택되었다.

다음으로 출현시키는 아미노산 잔기의 종류와 그의 출현율이 설정되었다. Kabat 데이터 베이스(KABAT, E.A. ET AL.: 'Sequences of proteins of immunological interest', vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION)에 등록되어 있는 hVk1과 hVk3의 서열 중의 플렉시블 잔기에 있어서의 아미노산의 출현 빈도가 해석되었다. 해석 결과를 토대로 각 위치에서 출현 빈도가 높은 아미노산으로부터 His 라이브러리에서 출현시키는 아미노산의 종류가 선택되었다. 이때 아미노산의 성질이 치우치지 않도록 해석 결과에서는 출현 빈도가 적은 것으로 판정된 아미노산도 선택되었다. 또한 선택된 아미노산의 출현 빈도는 Kabat 데이터 베이스의 해석 결과를 참고로 하여 설정되었다.

이상과 같이 설정된 아미노산 및 출현 빈도를 고려함으로써 His 라이브러리로서, 히스티딘이 각 CDR에서 하나 반드시 들어가도록 고정되어 있는 His 라이브러리 1과 His 라이브러리 1보다도 서열의 다양성이 중시된 His 라이브러리 2가 설계되었다. His 라이브러리 1 및 His 라이브러리 2의 상세한 디자인은 표 3 및 표 4에 나타내어져 있다(각 표 중의 위치는 Kabat 넘버링을 나타낸다). 또한 표 3 및 표 4에서 기재되는 아미노산의 출현 빈도는 Kabat 넘버링으로 표시되는 92번 위치가 Asn(N)인 경우는 94번 위치는 Ser(S)을 제외할 수 있다.

〔참고 실시예 24〕pH 의존적으로 항원에 결합하는 항체를 취득하기 위한 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리(His 라이브러리 1)의 제작

인간 PBMC로부터 제작한 폴리 A RNA나 시판되고 있는 인간 폴리 A RNA 등을 주형으로 하여 PCR법에 의해 항체 중쇄 가변영역의 유전자 라이브러리가 증폭되었다. 실시예 1에 기재된 His 라이브러리 1로서 설계된 항체 경쇄 가변영역의 유전자 라이브러리가 PCR법을 사용하여 증폭되었다. 이와 같이 제작된 항체 중쇄 가변영역의 유전자 라이브러리와 항체 경쇄 가변영역의 유전자 라이브러리의 조합이 파지미드 벡터로 삽입되어, 인간 항체 서열로 이루어지는 Fab 도메인을 제시하는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리가 구축되었다. 구축방법으로서 (Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100)이 참고가 되었다. 상기 라이브러리의 구축시에는 파지미드의 Fab와 파지 pIII 단백질을 연결하는 링커 부분 및 헬퍼 파지 pIII 단백 유전자의 N2 도메인과 CT 도메인 사이에 트립신 절단 서열이 삽입된 파지 디스플레이 라이브러리의 서열이 사용되었다. 항체 유전자 라이브러리가 도입된 대장균으로부터 단리된 항체 유전자 부분의 서열이 확인되어 132 클론의 서열정보가 얻어졌다. 설계된 아미노산 분포와 확인된 서열 중 아미노산의 분포를 도 53에 나타내었다. 설계된 아미노산 분포에 대응하는 다양한 서열을 포함하는 라이브러리가 구축되었다.

〔참고 실시예 25〕pH 의존적으로 항원에 결합하는 항체를 취득하기 위한 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리(His 라이브러리 2)의 제작

인간 PBMC로부터 제작한 폴리 A RNA나 시판되고 있는 인간 폴리 A RNA 등을 주형으로 하여 PCR법에 의해 항체 중쇄 가변영역의 유전자 라이브러리가 증폭되었다. 참고 실시예 23에 기재된 바와 같이, pH 의존적 항원 결합능을 갖는 항체의 출현 빈도를 향상시키기 위해, 항체 가변영역의 경쇄 부분 중 항원 접촉 부위가 될 가능성이 높은 부위의 히스티딘 잔기의 출현 빈도를 높인 항체 가변영역 경쇄 부분이 설계된다. 또한 플렉시블 잔기 중 히스티딘이 도입된 잔기 이외의 아미노산 잔기로서, 천연 인간 항체에서의 아미노산 출현 빈도의 정보로부터 특정되는 출현 빈도가 높은 아미노산을 균등하게 분포시킨 항체 경쇄 가변영역의 라이브러리가 설계된다. 상기와 같이 설계된 항체 경쇄 가변영역의 유전자 라이브러리가 합성된다. 라이브러리의 합성은 상업적인 수탁회사 등에 위탁하여 제작하는 것도 가능하다. 이와 같이 제작된 항체 중쇄 가변영역의 유전자 라이브러리와 항체 경쇄 가변영역의 유전자 라이브러리의 조합이 파지미드 벡터로 삽입되어, 공지의 방법(Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100)에 준하여 인간 항체 서열로 이루어지는 Fab 도메인을 제시하는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리가 구축된다. 참고 실시예 24에 기재된 방법에 준하여 항체 유전자 라이브러리가 도입된 대장균으로부터 단리된 항체 유전자 부분의 서열이 확인된다.

〔참고 실시예 26〕FcγRIIb 선택적 결합 개변과 다른 Fc영역의 아미노산 치환의 조합에 의한 효과

실시예 14에서 발견된 FcγRIIb에 대한 선택성이 향상된 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 개변체를 개변함으로써 FcγRIIb에 대한 선택성을 추가로 증강시키는 것이 시도되었다.

먼저 IL6R-G1d의 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro를 Asp로 치환한 개변이 도입된 IL6R-G1d-v1(서열번호：80)에 대해, 실시예 14에 기재된 FcγRIIb에 대한 선택성을 증강시키는 EU 넘버링으로 표시되는 328번 위치의 Leu의 Glu으로의 치환이 도입된 개변체 IL6R-G1d-v4(서열번호：172)가 제작되었다. L쇄로서 사용된 IL6R-L(서열번호：83)과 조합하여 발현된 IL6R-G1d-v4, 참고 실시예 2와 동일한 방법에 따라 조제되었다. 여기서 얻어진 항체 H쇄로서 IL6R-G1d-v4에 유래하는 아미노산 서열을 갖는 항체는 IgG1-v4로 기재된다. 실시예 14와 동일한 방법에 따라 평가된 IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2, IgG1-v4의 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 표 44에 나타내었다. 표 중의 개변이란 IL6R-G1d에 대해 도입된 개변을 나타낸다.

표 44의 결과로부터 L328E는 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 IgG1과 비교하여 2.3배 향상시키는 것으로부터, 동일하게 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 IgG1과 비교하여 4.8배 향상시키는 P238D와 조합하면, FcγRIIb에 대한 결합 활성의 향상 정도가 더욱 증가될 것이 기대되었으나, 실제로는 그들의 개변을 조합한 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성은 IgG1과 비교하여 0.47배로 저하되어 버리는 것이 명확해졌다. 이 결과는 각각의 개변의 효과로부터는 예측할 수 없는 효과이다.

동일하게 하여 IL6R-G1d에 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 개변이 도입된 IL6R-G1d-v1(서열번호：80)에 대해, 실시예 14에 기재된 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 향상시키는 EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 Ser의 Glu로의 치환 및 EU 넘버링으로 표시되는 328번 위치의 Leu의 Phe로의 치환이 도입된 개변체 IL6R-G1d-v5(서열번호：173)가 참고 실시예 2의 방법에 따라 조제되었다. 여기서 얻어진 항체 H쇄로서 IL6R-G1d-v5에 유래하는 아미노산 서열을 갖는 항체는 IgG1-v5로 기재된다. 실시예 14의 방법에 따라 평가된 IgG1, IgG1-v1, IgG1-v3, IgG1-v5의 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 표 45에 나타내었다.　

P238D 개변체에 대해 실시예 14에서 FcγRIIb에 대한 증강효과가 있었던 개변(S267E/L328F)이 도입되었다. 당해 개변의 도입 전후에서의 FcγRIIb에 대한 결합 활성의 변화를 표 45에 나타내었다.

표 45의 결과로부터 S267E/L328F는 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 IgG1과 비교하여 408배 향상시키는 것으로부터, 동일하게 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 IgG1과 비교하여 4.8배 향상시키는 P238D와 조합하면 FcγRIIb에 대한 결합 활성의 향상 정도가 더욱 증가되는 것이 기대되었으나, 실제로는 앞선 예와 마찬가지로 그들의 개변을 조합한 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성은 IgG1과 비교하여 12배 정도만 향상되고 있는 것이 명확해졌다. 이 결과도 각각의 개변의 효과로부터는 예측할 수 없는 효과이다.

이들 결과로부터 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro의 Asp로의 치환은 그것 단독으로는 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 향상시키지만, 그 밖의 FcγRIIb에 대한 결합 활성 향상 개변과 조합한 경우에는 그 효과를 발휘하지 않는 것이 명확해졌다. 이 하나의 요인으로서 Fc와 FcγR의 상호작용에 관여하는 계면의 구조가 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro의 Asp로의 치환을 도입함으로써 변화되어 버려, 천연형 항체에 있어서 관찰된 개변의 효과를 반영하지 않게 되어버린 것으로 생각된다. 이 사실로부터, EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro의 Asp로의 치환을 포함하는 Fc를 주형으로 하여 더욱 FcγRIIb에 대한 선택성이 우수한 Fc를 창출하는 것은, 천연형 항체에서 얻어진 개변 효과의 정보를 활용할 수 없어 매우 곤란한 것으로 생각되었다.

〔참고 실시예 27〕P238D 개변에 더하여 hinge 부분의 개변을 도입한 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합의 망락적 해석

참고 실시예 26에서 나타내어진 바와 같이, 인간 천연형 IgG1에 대해 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 Fc에 대해, 추가로 FcγRIIb로의 결합을 올리면 천연형 항체의 해석으로부터 예측되는 다른 개변을 조합해도 기대되는 조합효과는 얻어지지 않았다. 이에 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 개변 Fc에 대해 망라적 개변을 도입함으로써 추가로 FcγRIIb로의 결합을 증강시키는 개변체를 발견하는 것이 시도되었다. 항체 H쇄로서 사용된 IL6R-G1d(서열번호：79)의 EU 넘버링으로 표시되는 252번 위치의 Met를 Tyr로 치환하는 개변, EU 넘버링으로 표시되는 434번 위치의 Asn을 Tyr로 치환하는 개변이 도입된 IL6R-F11(서열번호：174)이 제작되었다. 또한 IL6R-F11에 대해 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro를 Asp로 치환하는 개변이 도입된 IL6R-F652(서열번호：175)가 제작되었다. IL6R-F652에 대해 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 잔기 근방의 영역(EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치~237번 위치, 239번 위치)이 원래의 아미노산과 시스테인을 제외한 18종류의 아미노산으로 각각 치환된 항체 H쇄 서열을 포함하는 발현 플라스미드가 각각 조제되었다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호：83)이 공통적으로 사용되었다. 이들 개변체가 참고 실시예 2와 동일한 방법으로 발현, 정제되었다. 이들 Fc 변이체는 PD variant로 불린다. 실시예 14와 동일한 방법에 의해 각 PD variant의 FcγRIIa R형 및 FcγRIIb에 대한 상호작용이 망라적으로 평가되었다.

아래의 방법에 따라 각각의 FcγR과의 상호작용 해석결과를 나타내는 도면이 작성되었다. 각 PD variant의 각 FcγR에 대한 결합량의 값을 대조로 한 개변 도입 전의 항체(EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 개변인 IL6R-F652/IL6R-L)의 각 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값이 각 PD variant의 각 FcγR에 대한 상대적인 결합 활성의 값으로서 표시되었다. 가로축에 각 PD variant의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 세로축에 각 PD variant의 FcγRIIa R형에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 각각 표시하였다(도 55).

그 결과 11종류의 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합이 당해 각 개변 도입 전의 항체와 비교하여 증강되고, FcγRIIa R형에 대한 결합을 유지 또는 증강시키는 효과가 있는 것이 발견되었다. 이들 11종류의 개변체의 FcγRIIb 및 FcγRIIa R에 대한 결합 활성을 정리한 결과를 표 46에 나타내었다. 또한 표 중의 서열번호는 평가한 개변체의 H쇄의 서열번호를, 또한 개변이란 IL6R-F11(서열번호：174)에 대해 도입한 개변을 나타낸다.

P238D가 도입된 개변체에 대해 상기 11종류의 개변이 추가로 조합되어 도입된 개변체의 상대적인 FcγRIIb에 대한 결합 활성의 값 및 P238D를 포함하지 않는 Fc에 당해 개변이 도입된 개변체의 상대적인 FcγRIIb에 대한 결합 활성의 값을 도 56에 나타내었다. 이들 11종류의 개변은 P238D 개변에 추가로 도입하면 도입 전에 비해 FcγRIIb에 대한 결합량이 증강되어 있었다. 한편 G237F, G237W 및 S239D를 제외한 8종류의 개변이 실시예 14에서 사용된 P238D를 포함하지 않는 개변체(GpH7-B3/GpL16-k0)에 도입된 경우, FcγRIIb에 대한 결합을 저감하는 효과를 나타내고 있었다. 참고 실시예 26과 이 결과로부터 천연형 IgG1에 대해 도입한 개변의 효과를 토대로 P238D 개변이 포함되는 개변체에 대해 동 개변을 조합하여 도입했을 때의 효과를 예측하는 것은 곤란한 것이 명확해졌다. 또한 바꿔 말하면 금번 발견된 8종류의 개변은 P238D 개변이 포함되는 개변체에 대해 동 개변을 조합하여 도입하는 본 검토를 행하지 않으면 발견하는 것이 불가능한 개변이다.

표 46에 나타낸 개변체의 FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb, FcγRIIIaV에 대한 KD값을 실시예 14와 동일한 방법으로 측정한 결과를 표 47에 나타내었다. 또한 표 중의 서열번호는 평가된 개변체의 H쇄의 서열번호를, 또한 개변이란 IL6R-F11(서열번호：174)에 대해 도입된 개변을 나타낸다. 단 IL6R-F11을 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-G1d/IL6R-L에 대해서는 *로서 나타내었다. 또한 표 중의 KD(IIaR)/KD(IIb) 및 KD(IIaH)/KD(IIb)는 각각 각 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값, 각 개변체의 FcγRIIaH에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 모체 폴리펩티드(parent polypeptide)의 KD(IIb)/개변 폴리펩티드의 KD(IIb)는 모체 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 가리킨다. 이들에 더하여 각 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값/모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값을 표 47에 나타내었다. 여기서 모체 폴리펩티드란 IL6R-F11(서열번호：27)을 H쇄에 갖는 개변체를 가리킨다. 또한 표 47 중 회색으로 칠해진 셀은 FcγR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 실시예 14에 기재된

〔식 5〕

KD = C×Rmax/(Req - RI) - C

의 식을 이용하여 산출한 값이다.

표 47에 나타내어진 바와 같이, 어느 개변체도 IL6R-F11과 비교하여 FcγRIIb에 대한 친화성이 향상되고, 그 향상의 폭은 1.9배~5.0배였다. 각 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD값/각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값의 비 및 각 개변체의 FcγRIIaH에 대한 KD값/각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값의 비는 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성에 대한 상대적인 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 나타낸다. 즉 이 값은 각 개변체의 FcγRIIb로의 결합 선택성의 높이를 나타낸 값으로, 이 값이 크면 클수록 FcγRIIb에 대해 결합 선택성이 높다. 모체 폴리펩티드인 IL6R-F11/IL6R-L의 FcγRIIaR에 대한 KD값/FcγRIIb에 대한 KD값의 비 및 FcγRIIaH에 대한 KD값/FcγRIIb에 대한 KD값의 비는 모두 0.7이기 때문에, 표 47 중 어느 개변체도 모체 폴리펩티드보다도 FcγRIIb로의 결합 선택성이 향상되어 있었다. 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값/모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값이 1 이상이라는 것은, 그 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합이 모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합과 동등하거나, 보다 저감되어 있는 것을 의미한다. 금번 얻어진 개변체에서는 이 값이 0.7~5.0이었기 때문에, 금번 얻어진 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합은 모체 폴리펩티드의 그것과 비교하여 거의 동등하거나, 그것보다도 저감되어 있었다고 할 수 있다. 이들 결과로부터 금번 얻어진 개변체에서는 모체 폴리펩티드와 비교하여, FcγRIIa R형 및 H형으로의 결합 활성을 유지 또는 저감하면서 FcγRIIb로의 결합 활성을 증강시키고 있어, FcγRIIb로의 선택성이 향상되고 있는 것이 명확해졌다. 또한 FcγRIa 및 FcγRIIIaV에 대해서는 어느 개변체도 IL6R-F11과 비교하여 친화성이 저하되어 있었다.

〔참고 실시예 28〕P238D를 포함하는 Fc와 FcγRIIb 세포외영역의 복합체의 X선결정구조 해석

앞선 참고 실시예 27에 나타낸 바와 같이, P238D를 포함하는 Fc에 대해 FcγRIIb와의 결합 활성을 향상시키거나 또는 FcγRIIb로의 선택성을 향상시키면 천연형 IgG1 항체의 해석으로부터 예측된 개벼을 도입해도 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 감약되어 버리는 것이 명확해지고, 그 원인으로서 Fc와 FcγRIIb의 상호작용 계면의 구조가 P238D를 도입함으로써 변화되고 있는 것이 생각되었다. 이에 이 현상의 원인을 추궁하기 위해 P238D의 변이를 갖는 IgG1의 Fc(이하, Fc(P238D)와 FcγRIIb 세포외영역의 복합체의 입체구조를 X선결정구조 해석에 의해 명확하게 하고, 천연형 IgG1의 Fc(이하, Fc(WT))와 FcγRIIb 세포외영역의 복합체와의 입체구조를 대비함으로써 이들 결합양식이 비교되었다. 또한 Fc와 FcγR 세포외영역의 복합체의 입체구조에 관한 복수의 보고가 이미 있어, Fc(WT)/FcγRIIIb 세포외영역 복합체(Nature, 2000, 400, 267-273; J.Biol.Chem. 2011, 276, 16469-16477), Fc(WT)/FcγRIIIa 세포외영역 복합체(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2011, 108, 12669-126674) 및 Fc(WT)/FcγRIIa 세포외영역 복합체(J. Imunol. 2011, 187, 3208-3217)의 입체구조가 해석되어 있다. 지금까지 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 입체구조는 해석되어 있지 않으나, Fc(WT)와의 복합체의 입체구조가 기지인 FcγRIIa와 FcγRIIb에서는 세포외영역에 있어서 아미노산 서열의 93%가 일치하여 매우 높은 상동성을 가지고 있는 것으로부터, Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 입체구조는 Fc(WT)/FcγRIIa 세포외영역 복합체의 결정구조로부터 모델링에 의해 추정되었다.

Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체에 대해서는 X선결정구조 해석에 의해 분해능 2.6Å에서 입체구조를 결정하였다. 그 해석결과의 구조를 도 57에 나타내었다. 2개의 Fc CH2 도메인 사이에 FcγRIIb 세포외영역이 끼워지도록 결합해 있어, 지금까지 해석된 Fc(WT)와 FcγRIIIa, FcγRIIIb, FcγRIIa의 각 세포외영역과의 복합체의 입체구조와 유사하였다.

다음으로 상세한 비교를 위해 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정구조와 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델구조를 FcγRIIb 세포외영역 및 Fc CH2 도메인 A에 대해 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소이승법에 의해 중합하였다(도 58). 그때 Fc CH2 도메인 B끼리의 겹침 정도는 양호하지 않아, 이 부분에 입체구조적인 차이가 있는 것이 명확해졌다. 또한 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정구조 및 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델구조를 사용하여 추출된 FcγRIIb 세포외영역과 Fc CH2 도메인 B 사이에서 그 거리가 3.7Å 이하의 원자쌍을 비교함으로써 FcγRIIb와 Fc(WT) CH2 도메인 B 사이의 원자간 상호작용과 FcγRIIb와 Fc(P238D) CH2 도메인 B 사이의 원자간 상호작용이 비교되었다. 표 48에 나타내는 바와 같이, Fc(P238D)와 Fc(WT)에서는 Fc CH2 도메인 B와 FcγRIIb 사이의 원자간 상호작용은 일치하지 않았다.

또한 Fc CH2 도메인 A 및 Fc CH2 도메인 B 단독끼리 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소이승법에 의해, Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선결정구조와 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델구조의 중합을 행함으로써 P238D 부근의 상세 구조가 비교되었다. Fc(P238D)의 변이 도입 위치인 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 아미노산 잔기의 위치가 Fc(WT)와는 변화되는 것에 수반하여, 힌지영역으로부터 이어지는 238번 위치의 아미노산 잔기 근방의 루프구조가 Fc(P238D)와 Fc(WT)에서는 변화되어 있는 것을 알 수 있다(도 59). 애초부터 Fc(WT)에 있어서는 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro는 Fc의 내측에 있고, 238번 위치 주위의 잔기와 소수성 코어를 형성하고 있다. 그런데 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 전하를 가져 매우 친수적인 Asp로 변화된 경우, 변화된 Asp 잔기가 그대로 소수성 코어에 존재하는 것은 탈용매화(desolvation)의 관점에서 에너지적으로 불리해진다. 이에 Fc(P238D)에서 는 이 에너지적인 불리를 해소하기 위해, EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 아미노산 잔기가 용매측에 배향하는 형태로 변화되어, 238번 위치의 아미노산 잔기 부근의 루프구조의 변화를 초래한 것으로 생각된다. 또한 이 루프는 S-S 결합으로 가교된 힌지영역으로부터 거리적으로 멀지 않은 것으로부터, 그 구조 변화가 국소적인 변화에 그치지 않고, Fc CH2 도메인 A와 도메인 B의 상대적인 배치에도 영향을 미쳐, 그 결과 FcγRIIb와 Fc CH2 도메인 B 사이의 원자간 상호작용에 차이를 초래한 것으로 추찰된다. 이 때문에 P238D 개변을 이미 갖는 Fc에 천연형 IgG에 있어서 FcγRIIb에 대한 선택성, 결합 활성을 향상시키는 개변을 조합해도 예측되는 효과가 얻어지지 않은 것으로 생각된다.

또한 P238D의 도입에 의한 구조 변화의 결과, Fc CH2 도메인 A에 있어서는 변이가 도입된 P238D에 인접하는 EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 Gly의 주쇄와 FcγRIIb의 160번 위치의 Tyr 사이에 수소 결합이 확인된다(도 60). 이 Tyr160에 상당하는 잔기는 FcγRIIa에서는 Phe이고, FcγRIIa와의 결합인 경우에는 이 수소 결합은 형성되지 않는다. 160번 위치의 아미노산은 Fc와의 상호작용 계면에 있어서의 FcγRIIa와 FcγRIIb 사이의 적은 차이의 하나인 것을 함께 고려할 때, FcγRIIb 특유의 이 수소 결합의 유무가 Fc(P238D)의 FcγRIIb에 대한 결합 활성의 향상과 FcγRIIa에 대한 결합 활성의 저감을 초래하여, 선택성 향상의 원인이 된 것으로 추측된다. 또한 Fc CH2 도메인 B에 대해서는 EU 넘버링으로 표시되는 270번 위치의 Asp와 FcγRIIb의 131번 위치의 Arg 사이에 정전적인 상호작용이 확인된다(도 61). FcγRIIa의 알로타입의 하나인 FcγRIIa H형에서는 FcγRIIb의 131번 위치의 Arg에 대응하는 잔기가 His로, 이 정전 상호작용은 형성할 수 없다. 이 사실로부터 FcγRIIa R형과 비교하여 FcγRIIa H형에서는 Fc(P238D)에 대한 결합 활성이 저감되어 있는 이유가 설명 가능하다. 이와 같은 X선결정구조 해석결과에 기초하는 고찰로부터, P238D의 도입에 의한 그 부근의 루프구조의 변화와 그에 따른 도메인 배치의 상대적인 변화가 천연형 IgG와 FcγR의 결합에서는 보이지 않는 새로운 상호작용이 형성되어, P238D 개변체의 FcγRIIb에 대한 선택적인 결합 프로파일로 연결되어 있을 가능성이 있는 것이 명확해졌다.

［Fc(P238D)의 발현 정제］

P238D 개변을 포함하는 Fc의 조제는 아래와 같이 행해졌다. 먼저 hIL6R-IgG1-v1(서열번호：80)의 EU 넘버링으로 표시되는 220번 위치의 Cys를 Ser로 치환하고, EU 넘버링으로 표시되는 236번 위치의 Glu로부터 그의 C말단을 PCR에 의해 클로닝한 유전자 서열 Fc(P238D)를 참고 실시예 1 및 2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 발현 벡터의 제작, 발현 및 정제가 행해졌다. 또한 EU 넘버링으로 표시되는 220번 위치의 Cys는 통상의 IgG1에 있어서는 L쇄의 Cys와 disulfide bond를 형성하고 있는데, Fc만을 조제하는 경우에는 L쇄를 공발현시키지 않는 것으로부터, 불필요한 disulfide bond 형성을 회피하기 위해 당해 Cys 잔기는 Ser로 치환되었다.

［FcγRIIb 세포외영역의 발현 정제］

FcγRIIb 세포외영역은 실시예 14의 방법에 따라 조제되었다.

［Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 정제］

결정화에 사용하기 위해 얻어진 FcγRIIb 세포외영역 샘플 2 ㎎에 대해 glutathione S-transferase와의 융합 단백으로서 대장균에 의해 발현 정제한 Endo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622) 0.29 ㎎을 첨가하고, 0.1M Bis-Tris pH 6.5의 Buffer 조건으로 실온에서 3일간 정치함으로써, FcγRIIb 세포외영역의 Asn에 직접 결합한 N-acetylglucosamine 이외의 N형 당쇄가 절단되었다. 다음으로 5000MWCO의 한외여과막에 의해 농축된 당쇄 절단처리가 행해진 FcγRIIb 세포외영역 샘플이 20 mM HEPS pH 7.5, 0.05M NaCl로 평형화한 겔여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200 10/300)에 의해 정제되었다. 추가로 얻어진 당쇄 절편 FcγRIIb 세포외영역 분획에 Fc(P238D)를 몰비로 FcγRIIb 세포외영역 쪽이 약간 과잉이 되도록 혼합되었다. 10000MWCO의 한외여과막에 의해 농축된 상기 혼합액을 20 mM HEPS pH 7.5, 0.05M NaCl로 평형화한 겔여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200 10/300)를 사용하여 정제함으로써 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 샘플이 얻어졌다.

［Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정화］

10000MWCO의 한외여과막에 의해 약 10 ㎎/㎖까지 농축된 상기 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 시료를 사용하여 시팅 드롭 증기확산법에 의해 당해 복합체가 결정화되었다. 결정화에는 Hydra II Plus One(MATRIX)을 사용하고, 100 mM Bis-Tris pH 6.5, 17% PEG3350, 0.2M Ammonium acetate 및 2.7%(w/v) D-Galactose의 리저버용액에 대해, 리저버용액：결정화 샘플을 0.2 ㎕：0.2 ㎕로 혼합하여 결정화 드롭을 제작하였다. 실링된 당해 결정화 드롭을 20℃에 정치함으로써 얇은 판상의 결정이 얻어졌다.

［Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체 결정으로부터의 X선 회절 데이터의 측정］

얻어진 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 단결정 하나가 100 mM Bis-Tris pH 6.5, 20% PEG3350, Ammonium acetate, 2.7%(w/v) D-Galactose, Ethylene glycol 22.5%(v/v)의 용액에 침지되었다. 미소한 나일론 루프가 부착된 핀을 사용하여 용액째로 떠올린 단결정을 액체질소 중에서 동결시켰다. 고에너지 가속기 연구기구의 방사광 시설 포톤 팩토리 BL-1A로 당해 결정의 X선 회절 데이터가 측정되었다. 또한 측정 중에는 항상 -178℃의 질소기류 중에 둠으로써 동결상태가 유지되고, 빔라인에 비치된 CCD 디텍터 Quantum 270(ADSC)에 의해 결정을 0.8°씩 회전시키면서 토탈 225매의 X선 회절 화상이 수집되었다. 얻어진 회절 화상으로부터의 격자상수의 결정, 회절 반점의 지수 부여 및 회절 데이터의 처리에는 프로그램 Xia2(CCP4 Software Suite), XDS Package(Walfgang Kabsch) 및 Scala(CCP4 Software Suite)를 사용하고, 최종적으로 분해능 2.46Å까지의 당해 결정의 회절강도 데이터가 얻어졌다. 본 결정은 공간군 P₂₁에 속하고, 격자상수 a＝48.85Å, b＝76.01Å, c＝115.09Å, α＝90°, β＝100.70°, γ＝90°였다.

［Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선결정구조 해석］

Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정구조 결정은 프로그램 Phaser(CCP4 Software Suite)를 사용한 분자 치환법에 의해 행해졌다. 얻어진 결정격자의 크기와 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 분자량으로부터 비대칭 단위 중의 복합체의 수는 1개로 예상되었다. Fc(WT)/FcγRIIIa 세포외영역 복합체의 결정구조인 PDB code:3SGJ의 구조좌표로부터, A쇄 239-340번 및 B쇄 239-340번의 아미노산 잔기 부분을 별도 좌표로서 취출하여, 각각 Fc CH2 도메인의 탐색용 모델로 설정하였다. 동일하게 PDB code:3SGJ의 구조좌표로부터 A쇄 341-444번과 B쇄 341-443번의 아미노산 잔기 부분을 하나의 좌표로서 취출하여, Fc CH3 도메인의 탐색용 모델로 설정하였다. 마지막으로 FcγRIIb 세포외영역의 결정구조인 PDB code:2FCB의 구조좌표로부터 A쇄 6-178번의 아미노산 잔기 부분을 취출하여 FcγRIIb 세포외영역의 탐색용 모델로 설정하였다. Fc CH3 도메인, FcγRIIb 세포외영역, Fc CH2 도메인의 순번으로 각 탐색용 모델의 결정격자 내에서의 방향과 위치를 회전함수 및 병진함수로부터 결정하고, Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체 결정구조의 초기 모델이 얻어졌다. 얻어진 초기 모델에 대해 2개의 Fc CH2 도메인, 2개의 Fc CH3 도메인 및 FcγRIIb 세포외영역을 움직이는 강체 정밀화를 행한 바, 이 시점에서 25-3.0Å의 회절강도 데이터에 대해, 결정학적 신뢰도 인자 R값은 40.4%, Free R값은 41.9%가 되었다. 또한 프로그램 Refmac5(CCP4 Software Suite)를 사용한 구조 정밀화와, 실험적으로 결정된 구조 인자 Fo와 모델로부터 계산된 구조 인자 Fc 및 모델로부터 계산된 위상을 토대로 산출된 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 지도를 보면서 모델 수정을 프로그램 Coot(Paul Emsley)로 행하였다. 이들 작업을 반복함으로써 모델의 정밀화가 행해졌다. 마지막으로 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 지도를 토대로 물분자를 모델에 삽입하고, 정밀화를 행함으로써, 최종적으로 분해능 25-2.6Å의 24291개의 회절강도 데이터를 사용하여, 4846개의 비수소원자를 포함하는 모델에 대해 결정학적 신뢰도 인자 R값은 23.7%, Free R값은 27.6%가 되었다.

［Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델구조 제작］

Fc(WT)/FcγRIIa 세포외영역 복합체의 결정구조인 PDB code:3RY6의 구조좌표를 베이스로, 프로그램 Disovery Studio 3.1(Accelrys)의 Build Mutants 기능을 사용하여, FcγRIIb의 아미노산 서열과 일치하도록 구조좌표 중 FcγRIIa에 변이가 도입되었다. 그때 Optimization Level을 High, Cut Radius를 4.5로 하여 5개의 모델을 발생시키고, 그 중에서 가장 에너지 스코어가 좋은 것을 채용하여, Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델구조로 설정하였다.

〔참고 실시예 29〕결정구조를 토대로 개변 개소를 결정한 Fc 개변체의 FcγR에 대한 결합의 해석

참고 실시예 28에서 얻어진 Fc(P238D)와 FcγRIIb 세포외영역의 복합체의 X선결정구조 해석의 결과를 토대로, EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 개변 Fc에 있어서 FcγRIIb와의 상호작용에 영향을 미치는 것이 예측되는 부위(EU 넘버링으로 표시되는 233번 위치, 240번 위치, 241번 위치, 263번 위치, 265번 위치, 266번 위치, 267번 위치, 268번 위치, 271번 위치, 273번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 298번 위치, 300번 위치, 323번 위치, 325번 위치, 326번 위치, 327번 위치, 328번 위치, 330번 위치, 332번 위치, 334번 위치의 잔기)에 대해 망라적인 개변이 도입된 개변체를 구축함으로써 P238D 개변에 더하여 추가로 FcγRIIb와의 결합을 증강시키는 개변의 조합을 얻는 것이 가능한 것이 검토되었다.

실시예 14에서 제작된 IL6R-G1d(서열번호：79)에 대해 EU 넘버링으로 표시되는 439번 위치의 Lys가 Glu로 치환된 IL6R-B3(서열번호：187)이 제작되었다. 다음으로 IL6R-B3의 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 IL6R-BF648이 제작되었다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호：83)이 공통으로 사용되었다. 참고 실시예 2와 동일한 방법에 따라 발현시킨 이들 항체의 개변체가 정제되었다. 실시예 14의 방법에 의해 각 FcγR(FcγRIa, FcγRIIa H형, FcγRIIa R형, FcγRIIb, FcγRIIIa V형)에 대한 이들 항체 개변체의 결합이 망라적으로 평가되었다.

아래의 방법에 따라 각각의 FcγR과의 상호작용 해석결과를 나타내는 도면이 작성되었다. 각 개변체의 각 FcγR에 대한 결합량의 값을 대조로 한 개변 도입 전의 항체(EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 개변인 IL6R-BF648/IL6R-L)의 각 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값이 각 개변체의 각 FcγR에 대한 상대적인 결합 활성의 값으로서 표시되었다. 가로축에 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 세로축에 각 개변체의 FcγRIIa R형에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 각각 표시하였다(도 62).

그 결과 도 62에 나타내는 바와 같이, 전체 개변 중 24종류의 개변체는 개변 도입 전의 항체와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합이 유지 또는 증강되어 있는 것이 발견되었다. 이들 개변체 각각의 FcγR에 대한 결합을 표 49에 나타내었다. 또한 표 중의 개변이란 IL6R-B3(서열번호：187)에 대해 도입된 개변을 나타낸다. 단 IL6R-B3를 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-G1d/IL6R-L에 대해서는 *로서 나타내었다.

표 49에 나타낸 개변체의 FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb, FcγRIIIa V형에 대한 KD값을 실시예 14의 방법으로 측정한 결과를 표 50에 정리하였다. 표 중의 개변이란 IL6R-B3(서열번호：187)에 대해 도입한 개변을 나타낸다. 단 IL6R-B3를 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-G1d/IL6R-L에 대해서는 *로서 나타내었다. 또한 표 중의 KD(IIaR)/KD(IIb) 및 KD(IIaH)/KD(IIb)는 각각 각 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값, 각 개변체의 FcγRIIaH에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 모체 폴리펩티드의 KD(IIb)/개변 폴리펩티드의 KD(IIb)는 모체 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 가리킨다. 이들에 더하여 각 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값/모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값을 표 50에 나타내었다. 여기서 모체 폴리펩티드란 IL6R-B3(서열번호：187)를 H쇄에 갖는 개변체를 가리킨다. 또한 표 50 중 회색으로 칠해진 셀은 FcγR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 실시예 14에 기재된

〔식 5〕

KD = C×Rmax/(Req - RI) - C

의 식을 이용하여 산출한 값이다.

표 50으로부터 어느 개변체도 IL6R-B3와 비교하여 FcγRIIb에 대한 친화성이 향상되고, 그 향상의 폭은 2.1배~9.7배였다. 각 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD값/각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값의 비 및 각 개변체의 FcγRIIaH에 대한 KD값/각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값의 비는, FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성에 대한 상대적인 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 나타낸다. 즉 이 값은 각 개변체의 FcγRIIb로의 결합 선택성의 높이를 나타낸 값으로, 이 값이 크면 클수록 FcγRIIb에 대해 결합 선택성이 높다. 모체 폴리펩티드인 IL6R-B3/IL6R-L의 FcγRIIaR에 대한 KD값/FcγRIIb에 대한 KD값의 비 및 FcγRIIaH에 대한 KD값/FcγRIIb에 대한 KD값의 비는 각각 0.3, 0.2이기 때문에, 표 50의 어느 개변체도 모체 폴리펩티드보다도 FcγRIIb로의 결합 선택성이 향상되어 있었다. 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값/모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값이 1 이상이란, 그 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합이 모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합과 동등하거나 보다 저감되어 있는 것을 의미한다. 금번 얻어진 개변체에서는 이 값이 4.6~34.0이었기 때문에, 금번 얻어진 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합은 모체 폴리펩티드의 그것보다도 저감되어 있었다고 할 수 있다. 이들 결과로부터 금번 얻어진 개변체에서는 모체 폴리펩티드와 비교하여, FcγRIIa R형 및 H형으로의 결합 활성을 유지 또는 저감하면서 FcγRIIb로의 결합 활성을 증강시키고 있어, FcγRIIb로의 선택성을 향상시키고 있는 것이 명확해졌다. 또한 FcγRIa 및 FcγRIIIaV에 대해서는 어느 개변체도 IL6R-B3와 비교하여 친화성이 저하되어 있었다.

얻어진 조합 개변체 중 유망한 것에 대해서 결정구조로부터 그 효과의 요인이 고찰되었다. 도 63에는 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정구조를 나타내었다. 이 중에서 좌측에 위치하는 H쇄를 Fc Chain A, 우측에 위치하는 H쇄를 Fc Chain B로 한다. 여기서 Fc Chain A에 있어서의 EU 넘버링으로 표시되는 233번 위치의 부위는 FcγRIIb의 113번 위치의 Lys의 근방에 위치하는 것을 알 수 있다. 단 본 결정구조에 있어서는 E233의 측쇄는 그의 전자밀도가 잘 관찰되고 있지 않아, 상당히 운동성이 높은 상태에 있다. 따라서 EU 넘버링으로 표시되는 233번 위치의 Glu를 Asp로 치환하는 개변은 측쇄가 1탄소분량 짧아짐으로써 측쇄의 자유도가 작아져, 그 결과 FcγRIIb의 113번 위치의 Lys와의 상호작용 형성시의 엔트로피 손실이 저감되어, 결과적으로 결합 자유에너지의 향상에 기여하고 있는 것으로 추측된다.

도 64에는 동일하게 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 구조 중 EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 부위 근방의 환경을 나타내었다. 이 도면으로부터 Fc(P238D)의 Fc Chain A의 EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 부위 주변은 FcγRIIb의 85번 위치의 Ser, 86번 위치의 Glu, 163번 위치의 Lys 등으로 구성되는 친수적인 환경인 것을 알 수 있다. 따라서 EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 Ala를 Lys, 또는 Arg로 치환하는 개변은 FcγRIIb의 85번 위치의 Ser 내지 86번 위치의 Glu와의 상호작용 강화에 기여하고 있는 것으로 추측된다.

도 65에는 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체 및 Fc(WT)/FcγRIIIa 세포외영역 복합체의 결정구조를 Fc Chain B에 대해 Cα원자간 거리를 토대로 최소이승법에 의해 중합하고, EU 넘버링으로 표시되는 271번 위치의 Pro의 구조를 나타내었다. 이들 2개의 구조는 잘 일치하지만, EU 넘버링으로 표시되는 271번 위치의 Pro의 부위에 있어서는 상이한 입체구조로 되어 있다. 또한 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체 결정구조에 있어서는 이 주변의 전자밀도가 약한 것을 고려할 때, Fc(P238D)/FcγRIIb에 있어서는 EU 넘버링으로 표시되는 271번 위치가 Pro인 것으로 인해 구조상 커다란 부하가 걸리고 있어, 그것에 의해 이 루프구조가 최적의 구조를 취하지 못하고 있을 가능성이 시사되었다. 따라서 EU 넘버링으로 표시되는 271번 위치의 Pro를 Gly로 치환하는 개변은 이 루프구조에 유연성을 부여하여 FcγRIIb와 상호작용하는 데 있어서 최적의 구조를 취하게 할 때의 에너지적인 장애를 경감함으로써 결합 증강에 기여하고 있는 것으로 추측된다.

〔실시예 30〕P238D와 조합시킴으로써 FcγRIIb로의 결합을 증강시키는 개변의 조합효과의 검증

참고 실시예 27 및 29에 있어서 얻어진 개변 중에서, FcγRIIb로의 결합을 증강시키는 효과 또는 FcγRIIb로의 결합을 유지하고, 다른 FcγR으로의 결합을 억제하는 효과가 보인 개변끼리를 조합시키는 것에 의한 효과가 검증되었다.

참고 실시예 29의 방법과 동일하게 표 46 및 49로부터 선택된 특히 우수한 개변이 항체 H쇄 IL6R-BF648에 대해 도입되었다. 항체 L쇄로서 공통적으로 IL6R-L이 사용되고, 참고 실시예 2와 동일한 방법에 따라 발현한 항체가 정제되었다. 실시예 14와 동일한 방법에 의해 각 FcγR(FcγRIa, FcγRIIa H형, FcγRIIa R형, FcγRIIb, FcγRIIIa V형)에 대한 결합이 망라적으로 평가되었다.

아래의 방법에 따라 각각의 FcγR과의 상호작용 해석결과에 대해서 상대적 결합활성이 산출되었다. 각 개변체의 각 FcγR에 대한 결합량의 값을, 대조로 한 개변 도입 전의 항체(EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 IL6R-BF648/IL6R-L)의 각 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값이 각 개변체의 각 FcγR에 대한 상대적인 결합 활성의 값으로서 표시되었다(표 51).

또한 표 중의 개변이란 IL6R-B3(서열번호：187)에 대해 도입한 개변을 나타낸다. 단 IL6R-B3를 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-G1d/IL6R-L에 대해서는 *로서 나타내었다.

표 51에 나타낸 개변체의 FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb, FcγRIIIa V형에 대한 KD값을 실시예 14의 방법으로 측정한 결과를 표 52-1 및 52-2에 정리하였다. 표 중의 개변이란 IL6R-B3(서열번호：187)에 대해 도입한 개변을 나타낸다. 단 IL6R-B3를 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-G1d/IL6R-L에 대해서는 *로서 나타내었다. 또한 표 중의 KD(IIaR)/KD(IIb) 및 KD(IIaH)/KD(IIb)는 각각 각 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값, 각 개변체의 FcγRIIaH에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 모체 폴리펩티드의 KD(IIb)/개변폴리펩티드의 KD(IIb)는 모체 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 가리킨다. 이들에 더하여 각 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값/모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값을 표 52-1 및 52-2에 나타내었다. 여기서 모체 폴리펩티드란 IL6R-B3(서열번호：187)를 H쇄에 갖는 개변체를 가리킨다. 또한 표 52-1 및 52-2 중 회색으로 칠한 셀은 FcγR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없을 것으로 판단되었기 때문에, 실시예 14에 기재된

〔식 5〕

KD = C×Rmax/(Req - RI) - C

의 식을 이용하여 산출한 값이다.

표 52-1 및 52-2로부터 어느 개변체도 IL6R-B3와 비교하여 FcγRIIb에 대한 친화성이 향상되고, 그 향상의 폭은 3.0배~99.0배였다. 각 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD값/각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값의 비 및 각 개변체의 FcγRIIaH에 대한 KD값/각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값의 비는 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성에 대한 상대적인 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 나타낸다. 즉 이 값은 각 개변체의 FcγRIIb로의 결합 선택성의 높이를 나타낸 값으로, 이 값이 크면 클수록 FcγRIIb에 대해 결합 선택성이 높다. 모체 폴리펩티드인 IL6R-B3/IL6R-L의 FcγRIIaR에 대한 KD값/FcγRIIb에 대한 KD값의 비 및 FcγRIIaH에 대한 KD값/FcγRIIb에 대한 KD값의 비는 각각 0.3, 0.2이기 때문에, 표 52-1 및 52-2의 어느 개변체도 모체 폴리펩티드보다도 FcγRIIb로의 결합 선택성이 향상되어 있었다. 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값/모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값이 1 이상이란, 그 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합이 모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합과 동등하거나 보다 저감되어 있는 것을 의미한다. 금번 얻어진 개변체에서는 이 값이 0.7~29.9였기 때문에, 금번 얻어진 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합은 모체 폴리펩티드의 그것과 비교하여 거의 동등하거나 그보다도 저감되어 있었다고 할 수 있다. 이들 결과로부터 금번 얻어진 개변체에서는 모체 폴리펩티드와 비교하여, FcγRIIa R형 및 H형으로의 결합 활성을 유지 또는 저감하면서 FcγRIIb로의 결합 활성을 증강시키고 있어, FcγRIIb로의 선택성을 향상시키고 있는 것이 명확해졌다. 또한 FcγRIa 및 FcγRIIIaV에 대해서는 어느 개변체도 IL6R-B3와 비교하여 친화성이 저하되어 있었다.

[표 52-1]

표 52-2는 표 52-1의 계속되는 표이다.

[표 52-2]

본 발명에 의해 항원 결합 분자의 약물동태를 개선하는 방법, 또는 항원 결합 분자의 면역원성을 저감시키는 방법이 제공되었다. 본 발명에 의해 통상의 항체와 비교하여 생체에 있어서의 바람직하지 않은 사상(事象)을 일으키지 않고 항체에 의한 치료를 행하는 것이 가능해진다.

SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> METHOD OF IMPROVING RETENTIVITY IN PLASMA AND IMMUNOGENICITY OF ANTIGEN BINDING MOLECULES <130> C1A1004Y1PPP <150> PCT/JP2011/001888 <151> 2011-03-30 <150> PCT/JP2011/072550 <151> 2011-09-30 <150> PCT/JP2012/054624 <151> 2012-02-24 <160> 187 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 468 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg 20 25 30 Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro 35 40 45 Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys 50 55 60 Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg 65 70 75 80 Leu Leu Leu Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys 85 90 95 Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val 100 105 110 Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser 115 120 125 Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr 130 135 140 Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp 145 150 155 160 Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys 165 170 175 Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met 180 185 190 Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe 195 200 205 Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val 210 215 220 Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp 225 230 235 240 Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg 245 250 255 Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp 260 265 270 Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His 275 280 285 Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser 290 295 300 Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser 305 310 315 320 Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr 325 330 335 Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr 340 345 350 Ser Leu Pro Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro Thr Phe Leu 355 360 365 Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys Ile Ala Ile 370 375 380 Val Leu Arg Phe Lys Lys Thr Trp Lys Leu Arg Ala Leu Lys Glu Gly 385 390 395 400 Lys Thr Ser Met His Pro Pro Tyr Ser Leu Gly Gln Leu Val Pro Glu 405 410 415 Arg Pro Arg Pro Thr Pro Val Leu Val Pro Leu Ile Ser Pro Pro Val 420 425 430 Ser Pro Ser Ser Leu Gly Ser Asp Asn Thr Ser Ser His Asn Arg Pro 435 440 445 Asp Ala Arg Asp Pro Arg Ser Pro Tyr Asp Ile Ser Asn Thr Asp Tyr 450 455 460 Phe Phe Pro Arg 465 <210> 2 <211> 1407 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgctggccg tcggctgcgc gctgctggct gccctgctgg ccgcgccggg agcggcgctg 60 gccccaaggc gctgccctgc gcaggaggtg gcgagaggcg tgctgaccag tctgccagga 120 gacagcgtga ctctgacctg cccgggggta gagccggaag acaatgccac tgttcactgg 180 gtgctcagga agccggctgc aggctcccac cccagcagat gggctggcat gggaaggagg 240 ctgctgctga ggtcggtgca gctccacgac tctggaaact attcatgcta ccgggccggc 300 cgcccagctg ggactgtgca cttgctggtg gatgttcccc ccgaggagcc ccagctctcc 360 tgcttccgga agagccccct cagcaatgtt gtttgtgagt ggggtcctcg gagcacccca 420 tccctgacga caaaggctgt gctcttggtg aggaagtttc agaacagtcc ggccgaagac 480 ttccaggagc cgtgccagta ttcccaggag tcccagaagt tctcctgcca gttagcagtc 540 ccggagggag acagctcttt ctacatagtg tccatgtgcg tcgccagtag tgtcgggagc 600 aagttcagca aaactcaaac ctttcagggt tgtggaatct tgcagcctga tccgcctgcc 660 aacatcacag tcactgccgt ggccagaaac ccccgctggc tcagtgtcac ctggcaagac 720 ccccactcct ggaactcatc tttctacaga ctacggtttg agctcagata tcgggctgaa 780 cggtcaaaga cattcacaac atggatggtc aaggacctcc agcatcactg tgtcatccac 840 gacgcctgga gcggcctgag gcacgtggtg cagcttcgtg cccaggagga gttcgggcaa 900 ggcgagtgga gcgagtggag cccggaggcc atgggcacgc cttggacaga atccaggagt 960 cctccagctg agaacgaggt gtccaccccc atgcaggcac ttactactaa taaagacgat 1020 gataatattc tcttcagaga ttctgcaaat gcgacaagcc tcccagtgca agattcttct 1080 tcagtaccac tgcccacatt cctggttgct ggagggagcc tggccttcgg aacgctcctc 1140 tgcattgcca ttgttctgag gttcaagaag acgtggaagc tgcgggctct gaaggaaggc 1200 aagacaagca tgcatccgcc gtactctttg gggcagctgg tcccggagag gcctcgaccc 1260 accccagtgc ttgttcctct catctcccca ccggtgtccc ccagcagcct ggggtctgac 1320 aatacctcga gccacaaccg accagatgcc agggacccac ggagccctta tgacatcagc 1380 aatacagact acttcttccc cagatag 1407 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 3 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Lys Val Asn Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Ala Ile Phe Ile Ile 35 40 45 Gln Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly Ile Ser Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gln His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asp Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Val 85 90 95 Leu Arg Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Gln 100 105 110 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Glu Ser Leu Val Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Trp Ala Ser Ile Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Asp Leu Gln Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Ala Pro Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asp Pro Gly Gly Gly Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 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Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 12 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 12 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 13 <211> 377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 14 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 14 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 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Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210> 186 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 186 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp 20 25 30 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp 225 230 235 240 Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210> 187 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 187 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp 20 25 30 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445

Claims (20)

1. 항원 결합 분자의 제조방법으로서,
   (a) 이온 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 수득하는 공정; 및
   (b) 상기 항원 결합 분자의 Fc영역을 pH 중성역에서 2분자의 FcRn 및 1분자의 활성형 Fcγ 수용체를 포함하는 헤테로 복합체를 형성하지 않는 Fc영역으로 개변하는 공정을 포함하고,
   상기 헤테로 복합체를 형성하지 않는 Fc영역으로 개변하는 것이, Fc영역의 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 당해 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 낮은 Fc영역으로 개변되는 것을 포함하는, 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 활성형 Fcγ 수용체가 인간 FcγRIa, 인간 FcγRIIa(R), 인간 FcγRIIa(H), 인간 FcγRIIIa(V) 또는 인간 FcγRIIIa(F)인 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 Fc영역의 아미노산 중 EU 넘버링으로 표시되는 235번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 270번 위치, 298번 위치, 325번 위치 및 329번 위치 중 어느 하나 이상의 아미노산을 치환하는 것을 포함하는 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；
   234번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr 및 Trp 중 어느 하나,
   235번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val 및 Arg 중 어느 하나,
   236번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro 및 Tyr 중 어느 하나,
   237번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr 및 Arg 중 어느 하나,
   238번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp 및 Arg 중 어느 하나,
   239번 위치의 아미노산을 Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr 및 Arg 중 어느 하나,
   265번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val 중 어느 하나,
   266번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp 및 Tyr 중 어느 하나,
   267번 위치의 아미노산을 Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp 및 Tyr 중 어느 하나,
   269번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val 중 어느 하나,
   270번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val 중 어느 하나,
   271번 위치의 아미노산을 Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp 및 Tyr 중 어느 하나,
   295번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp 및 Tyr 중 어느 하나,
   296번 위치의 아미노산을 Arg, Gly, Lys 및 Pro 중 어느 하나,
   297번 위치의 아미노산을 Ala,
   298번 위치의 아미노산을 Arg, Gly, Lys, Pro, Trp 및 Tyr 중 어느 하나,
   300번 위치의 아미노산을 Arg, Lys 및 Pro 중 어느 하나,
   324번 위치의 아미노산을 Lys 또는 Pro,
   325번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 및 Val 중 어느 하나,
   327번 위치의 아미노산을 Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val 중 어느 하나,
   328번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Gly, His, Lys 및 Pro 중 어느 하나,
   329번 위치의 아미노산을 Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val 및 Arg 중 어느 하나,
   330번 위치의 아미노산을 Pro 또는 Ser,
   331번 위치의 아미노산을 Arg, Gly 및 Lys 중 어느 하나, 및
   332번 위치의 아미노산을 Arg, Lys 및 Pro 중 어느 하나
   중 어느 하나 이상으로 치환하는 것을 포함하는 방법.
5. 항원 결합 분자의 제조방법으로서,
   (a) 이온 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 수득하는 공정; 및
   (b) 상기 항원 결합 분자의 Fc영역을 pH 중성역에서 2분자의 FcRn 및 1분자의 활성형 Fcγ 수용체를 포함하는 헤테로 복합체를 형성하지 않는 Fc영역으로 개변하는 공정을 포함하고,
   상기 헤테로 복합체를 형성하지 않는 Fc영역으로 개변하는 것이, Fc영역의 억제형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 Fc영역으로 개변되는 것을 포함하는, 방법.
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 억제형 Fcγ 수용체가 인간 FcγRIIb인 방법.
7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
   상기 활성형 Fcγ 수용체가 인간 FcγRIa, 인간 FcγRIIa(R), 인간 FcγRIIa(H), 인간 FcγRIIIa(V) 또는 인간 FcγRIIIa(F)인 방법.
8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
   EU 넘버링으로 표시되는 238 또는 328의 아미노산을 치환하는 것을 포함하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서,
   EU 넘버링으로 표시되는 238의 아미노산을 Asp 또는 328의 아미노산을 Glu로 치환하는 것을 포함하는 방법.
10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；
    233번 위치의 아미노산을 Asp,
    234번 위치의 아미노산을 Trp 또는 Tyr,
    237번 위치의 아미노산을 Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp 및 Tyr 중 어느 하나,
    239번 위치의 아미노산을 Asp,
    267번 위치의 아미노산을 Ala, Gln 및 Val 중 어느 하나,
    268번 위치의 아미노산을 Asn, Asp 및 Glu 중 어느 하나,
    271번 위치의 아미노산을 Gly,
    326번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser 및 Thr 중 어느 하나,
    330번 위치의 아미노산을 Arg, Lys 및 Met 중 어느 하나,
    323번 위치의 아미노산을 Ile, Leu 및 Met 중 어느 하나, 및
    296번 위치의 아미노산을 Asp
    중 어느 하나 이상으로 치환하는 것을 포함하는 방법.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc영역의 아미노산 중 EU 넘버링으로 표시되는 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 및 436 중 어느 하나 이상의 아미노산이 천연형 Fc영역의 아미노산과 상이한 아미노산을 포함하는 Fc영역인 방법.
12. 제 11 항에 있어서,
    상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；
    237번 위치의 아미노산이 Met,
    248번 위치의 아미노산이 Ile,
    250번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나,
    252번 위치의 아미노산이 Phe, Trp 및 Tyr 중 어느 하나,
    254번 위치의 아미노산이 Thr,
    255번 위치의 아미노산이 Glu,
    256번 위치의 아미노산이 Asn, Asp, Glu 및 Gln 중 어느 하나,
    257번 위치의 아미노산이 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr 및 Val 중 어느 하나,
    258번 위치의 아미노산이 His,
    265번 위치의 아미노산이 Ala,
    286번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Glu,
    289번 위치의 아미노산이 His,
    297번 위치의 아미노산이 Ala,
    298번 위치의 아미노산이 Gly,
    303번 위치의 아미노산이 Ala,
    305번 위치의 아미노산이 Ala,
    307번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나,
    308번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln 및 Thr 중 어느 하나,
    309번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Pro 및 Arg 중 어느 하나,
    311번 위치의 아미노산이 Ala, His 및 Ile 중 어느 하나,
    312번 위치의 아미노산이 Ala 또는 His,
    314번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Arg,
    315번 위치의 아미노산이 Ala, Asp 및 His 중 어느 하나,
    317번 위치의 아미노산이 Ala,
    332번 위치의 아미노산이 Val,
    334번 위치의 아미노산이 Leu,
    360번 위치의 아미노산이 His,
    376번 위치의 아미노산이 Ala,
    380번 위치의 아미노산이 Ala,
    382번 위치의 아미노산이 Ala,
    384번 위치의 아미노산이 Ala,
    385번 위치의 아미노산이 Asp 또는 His,
    386번 위치의 아미노산이 Pro,
    387번 위치의 아미노산이 Glu,
    389번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Ser,
    424번 위치의 아미노산이 Ala,
    428번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나,
    433번 위치의 아미노산이 Lys,
    434번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, His, Ser, Trp 및 Tyr 중 어느 하나, 및
    436번 위치의 아미노산이 His, Ile, Leu, Phe, Thr 및 Val 중 어느 하나
    중 어느 하나 이상의 조합인 방법.
13. 항원 결합 분자의 제조방법으로서,
    (a) 이온 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 수득하는 공정; 및
    (b) 상기 항원 결합 분자의 Fc영역을 pH 중성역에서 2분자의 FcRn 및 1분자의 활성형 Fcγ 수용체를 포함하는 헤테로 복합체를 형성하지 않는 Fc영역으로 개변하는 공정을 포함하고,
    상기 헤테로 복합체를 형성하지 않는 Fc영역으로 개변하는 것이, Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 다른 쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 Fc영역으로 개변되는 것을 포함하는, 방법.
14. 제 13 항에 있어서,
    상기 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽 아미노산 서열 중, EU 넘버링으로 표시되는 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 및 436 중 어느 하나 이상의 아미노산을 치환하는 것을 포함하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서,
    상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；
    237번 위치의 아미노산을 Met,
    248번 위치의 아미노산을 Ile,
    250번 위치의 아미노산을 Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp 또는 Tyr,
    252번 위치의 아미노산을 Phe, Trp 또는 Tyr,
    254번 위치의 아미노산을 Thr,
    255번 위치의 아미노산을 Glu,
    256번 위치의 아미노산을 Asn, Asp, Glu 또는 Gln,
    257번 위치의 아미노산을 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr 또는 Val,
    258번 위치의 아미노산을 His,
    265번 위치의 아미노산을 Ala,
    286번 위치의 아미노산을 Ala 또는 Glu,
    289번 위치의 아미노산을 His,
    297번 위치의 아미노산을 Ala,
    298번 위치의 아미노산을 Gly,
    303번 위치의 아미노산을 Ala,
    305번 위치의 아미노산을 Ala,
    307번 위치의 아미노산을 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr,
    308번 위치의 아미노산을 Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln 또는 Thr,
    309번 위치의 아미노산을 Ala, Asp, Glu, Pro 또는 Arg,
    311번 위치의 아미노산을 Ala, His 또는 Ile,
    312번 위치의 아미노산을 Ala 또는 His,
    314번 위치의 아미노산을 Lys 또는 Arg,
    315번 위치의 아미노산을 Ala, Asp 또는 His,
    317번 위치의 아미노산을 Ala,
    332번 위치의 아미노산을 Val,
    334번 위치의 아미노산을 Leu,
    360번 위치의 아미노산을 His,
    376번 위치의 아미노산을 Ala,
    380번 위치의 아미노산을 Ala,
    382번 위치의 아미노산을 Ala,
    384번 위치의 아미노산을 Ala,
    385번 위치의 아미노산을 Asp 또는 His,
    386번 위치의 아미노산을 Pro,
    387번 위치의 아미노산을 Glu,
    389번 위치의 아미노산을 Ala 또는 Ser,
    424번 위치의 아미노산을 Ala,
    428번 위치의 아미노산을 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr,
    433번 위치의 아미노산을 Lys,
    434번 위치의 아미노산을 Ala, Phe, His, Ser, Trp 또는 Tyr, 및
    436번 위치의 아미노산을 His, Ile, Leu, Phe, Thr 또는 Val
    중 어느 하나 이상으로 치환하는 것을 포함하는 방법.
16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인이 칼슘 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인인 방법.
17. 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인이 pH의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인인 방법.
18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인이 항체의 가변영역인 방법.
19. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인이 하기 (i) 또는 (ii)의 항원 결합 도메인인 방법:
    (i) 하나 이상의 아미노산의 히스티딘으로의 치환의 변이 또는 하나 이상의 히스티딘의 삽입의 변이를 포함하는 항원 결합 도메인; 또는
    (ii) 하기로부터 선택되는 아미노산 중 하나 이상의 아미노산의 히스티딘으로의 치환의 변이 또는 하나 이상의 히스티딘의 삽입의 변이를 포함하는 항원 결합 도메인:
    중쇄: 27번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 33번 위치, 35번 위치, 50번 위치, 58번 위치, 59번 위치, 61번 위치, 62번 위치, 99번 위치, 100b번 위치 및 102번 위치(Kabat 넘버링);
    경쇄: 24번 위치, 27번 위치, 28번 위치, 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 34번 위치, 50번 위치, 51번 위치, 52번 위치, 53번 위치, 54번 위치, 55번 위치, 56번 위치, 89번 위치, 90번 위치, 91번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치, 95a번 위치 및 96번 위치(Kabat 넘버링).
20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 분자가 항체인 방법.

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