KR20220073564A

KR20220073564A - 천연물 추출물을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20220073564A
Application number: KR1020200161749A
Authority: KR
Inventors: 김응필; 장은재; 류유희; 김옥경; 박정진
Original assignee: 재단법인 전남바이오산업진흥원; 전남대학교산학협력단
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2022-06-03
Also published as: KR102551398B1; KR102572597B1; KR20220108007A; KR20220108009A; KR102550677B1; KR102468705B1; KR20220108008A

Abstract

본 발명은 천연물 추출물을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 (Exosomes) 생성 촉진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물을 줄기세포 배양에 이용하는 경우, 줄기세포의 줄기세포능 및 줄기세포 유래 엑소좀의 생산량이 증가되므로, 보다 효율적으로 양질의 줄기세포 및 줄기세포 유래 엑소좀을 생산할 수 있는 바, 이를 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

천연물 추출물을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물 {Composition for promoting the generation of exosomes derived from stem cells containing natural product extracts}

본 발명은 천연물 추출물을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 줄기세포 배양 시 줄기세포의 엑소좀 생산능을 강화시켜 줄기세포 유래 엑소좀의 생산량을 증가시키는 천연물 추출물을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물에 관한 것이다.

미세소포체 (Extracellular Vesicles)는 마이크로베지클 (Microvesicles), 엑소좀 (Exosome) 등을 포함하는 30~1000 nm 크기의 구형 지질이중층 (lipid-bilayer)으로 구성된 소포체 (vesicle)이다.

엑소좀의 지질이중층은 기원 세포 (공여세포)와 같은 인지질 이중막 구조로 되어 있으며, 세포가 세포외로 분비하는 물질의 구성체로 세포-세포간의 커뮤니케이션 및 세포성 면역 중재 등의 기능적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

엑소좀은 기원 세포 (공여세포) 특유의 생물학적 기능을 반영하는 세포특이적 구성 성분을 함유하며, 인지질, mRNA, miRNA 외에도 다양한 수용성 단백질, 외재성 단백질 및 막관통 단백질 성분 등을 포함한다.

이러한 엑소좀은 비만세포, 림프구, 성상세포, 혈소판, 신경세포, 내피세포, 상피세포 등 모든 동물 세포에서 배출되며 혈액, 소변, 점액, 타액, 담즙액, 복수액, 뇌척수액 등의 다양한 체액에서 발견된다. 엑소좀은 뇌혈관 장벽 (Blood-Brain Barrier, BBB)도 통과할 수 있으며, 표피 세포와 내피세포의 세포막 투과가 가능할 정도로 선택적 투과성이 높아 특정 약물의 나노캐리어 (nanocarrier)인 DDS(drug delivery system) 개발에도 활용되고 있다.

중간엽 줄기세포에서 분비하는 엑소좀 및 마이크로베지클 (microvesicle)은 세포-세포간 커뮤니케이션 (cell-to-cell communication)에 관여하며 줄기세포가 가지는 재생의학적인 치료 효능을 보인다고 알려져 있다.

줄기세포를 체내에 이식한 후에 장기간의 생존 없이 세포에서 분비되는 파라크린 인자 (paracrine factors)에 트로픽 효과 (trophic effect)를 가져오는 것이 알려져 있고, 이러한 인자에는 성장인자 (growth factor), 케모카인 (chemokine), 사이토카인(cytokine) 등과 같은 저분자가 엑소좀과 같은 세포외 소포체 (extracellular vesicle)에 의하여 분비되며, 이러한 엑소좀은 줄기세포에서 유래한다. 따라서 엑소좀은 줄기세포의 특성을 규명하고 이의 치료적 효능을 평가하는데 활용되고 있다.

최근에는 중간엽 줄기세포 자체를 사용하지 않고 중간엽 줄기세포가 분비하는 엑소좀을 이용하여 다양한 질환의 치료효과에 대한 연구가 활발하게 진행 중이며, 학계 및 산업계에서는 이를 통해 기존의 줄기세포 치료법의 한계를 극복할 수 있는 새로운 대안이 될 수 있을 것으로 예상한다.

이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 천연물 추출물이 줄기세포 유래 엑소좀의 생산을 촉진하고, 발효울금, 유자, 블루베리 추출물을 줄기세포에 전처리하는 경우 줄기세포의 엑소좀 생산능, 엑소좀 내 단백질의 함량을 증가시키고 생산되는 엑소좀의 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 생산할 수 있는 효과가 월등히 우수한 것을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 천연물 추출물을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 천연물 추출물 전처리된 줄기세포 유래 엑소좀을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 천연물 추출물을 포함하는 세포배양 배지에 줄기세포를 배양하는 전처리 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 천연물 추출물을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 (Exosomes) 생성 촉진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 천연물 추출물을 포함하는 조성물 통해 배양된 줄기세포는 엑소좀 생성이 촉진되고 생산되는 엑소좀의 균일도 및 순도가 향상된다.

본 발명자들은 이에 천연물 추출물을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물은, 줄기세포 배양에 전처리 시 줄기세포에서 생산되는 엑소좀의 수 및 엑소좀 내 단백질의 함량이 크게 증가하는 것을 확인하였다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는, 토마토 추출물, 복분자 추출물, 발효울금 추출물, 유자 추출물 및 블루베리 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물이다.

본 발명의 일 구현예에서, 추출물은 발효울금 추출물, 유자 추출물 및 블루베리 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 추출물은 용매 조추출물, 특정 용매 가용 추출물 (용매 분획물), 및 용매 조추출물의 용매 분획물을 포함하며, 추출물은 용액, 농축물 또는 분말 상태일 수 있다.

본 발명에 있어서 발효울금은 생강과의 강황 덩이뿌리를 그대로 또는 주피를 제거하고 쪄서 말린 울금을 발효한 것으로, 울금은 중국 남부와 인도, 오키나와를 비롯한 동남아시아지역에서 자생, 재배되며 우리나라 남부지역에서도 재배된다. 울금의 주성분은 커큐민과 그것의 유사물로써 강한 항산화활성을 나타내어 염증을 치료하는 약재로 사용될 뿐만 아니라, 기를 소통시키고 혈액순환을 도와 생리통, 생리불순, 옆구리 통증을 치료하고 토혈, 코피, 피오줌을 치료하고, 정신을 맑게 하며 흉복부가 그득한 것을 없애주고 담즙분비 촉진과 담낭결석을 치료하며, 담즙분비, 배설촉진 및 관상동맥 내 반괴형성을 감소시키는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 발효울금은 공지된 유산균을 통해 발효된 것일 수 있다.

유산균 (lactic acid bacteria)은 탄수화물 대사의 주산물로서 유산을 생산하는 박테리아 군을 의미한다.

본 발명에 있어서 발효울금은 아스퍼질러스 오라이제 (Aspergillus oryzae), 모나스커스 러버 (Monascus ruber), 모나스커스 필로서스 (Monascus pilosus), 모나스커스 퍼퍼러스 (Monascus purpureus), 락토코커스 (Lactococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 프로리오니박테리움 (Propionibacterium), 엔테로코커스 (Enterococcus), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus) 및 페디오코커스 (Pediococcus)로 구성된 군으로부터 선택되는 유산균을 통해 발효된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 발효울금은 건조 및 멸균을 거친 울금 시료에 균주를 분말대비, 0.1 내지 40%, 1 내지 20%, 예를 들어, 1 내지 15%(v/v%)로 접종되어 제조되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 발효울금은 1 내지 60℃내지 50℃ 예를 들어, 20 내지 40℃에서 수분함유 상대습도 20 내지 90%, 40 내지 80%, 예를 들어, 50 내지 70%에서 발효되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 발효울금 추출물은 발효된 울금분말에 용매를 처리하여 수득된 것일 수 있다.

발효울금 추출 시 사용되는 용매로는 극성 용매 또는 비극성 용매가 사용될 수 있다. 극성 용매는 물, 메탄올, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜, 아세트산, DMF (dimethylformamide) 및 DMSO (dimethyl sulfoxide)일 수 있다. 비극성 용매는 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF일 수 있다.

발효울금의 추출물 제조에 사용되는 한 용매에 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 60%이상 내지 100%(v/v)미만, 또는 70%이상 내지 100%(v/v)미만의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있다.

본 발명에 있어서 유자 추출물은 유자를 물, 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 조추출물일 수 있다.

유자의 조추출물 제조에 사용되는 한 용매에 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 60%이상 내지 100%(v/v)미만, 또는 70%이상 내지 100%(v/v)미만의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있다.

알코올 수용액은 메탄올 수용액, 에탄올 수용액, 프로판올 수용액, 및 부탄올 수용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 유자 추출물은 용매 조추출물을 추가의 용매로 분획한 용매 분획물일 수 있으며, 예를 들면 용매 조추출물에 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.

예를 들면, 유자 추출물은 유자를 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물을 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.

본 발명에 있어서 블루베리 추출물은 블루베리를 물, 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 조추출물일 수 있다.

블루베리의 조추출물 제조에 사용되는 한 용매에 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 60%이상 내지 100%(v/v)미만, 또는 70%이상 내지 100%(v/v)미만의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있다.

본 발명에 따른 블루베리 추출물은 용매 조추출물을 추가의 용매로 분획한 용매 분획물일 수 있으며, 예를 들면 용매 조추출물에 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.

예를 들면, 블루베리 추출물은 블루베리를 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물을 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.

본 발명에 있어서 토마토 추출물은 토마토를 물, 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 조추출물일 수 있다.

토마토의 조추출물 제조에 사용되는 한 용매에 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 60%이상 내지 100%(v/v)미만, 또는 70%이상 내지 100%(v/v)미만의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있다.

본 발명에 따른 토마토 추출물은 용매 조추출물을 추가의 용매로 분획한 용매 분획물일 수 있으며, 예를 들면 용매 조추출물에 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.

예를 들면, 토마토 추출물은 토마토를 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물을 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.

본 발명에 있어서 복분자 추출물은 복분자를 물, 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 조추출물일 수 있다.

복분자의 조추출물 제조에 사용되는 한 용매에 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 60%이상 내지 100%(v/v)미만, 또는 70%이상 내지 100%(v/v)미만의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있다.

본 발명에 따른 복분자 추출물은 용매 조추출물을 추가의 용매로 분획한 용매 분획물일 수 있으며, 예를 들면, 용매 조추출물에 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.

예를 들면, 복분자 추출물은 복분자를 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물을 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.

본 발명에 사용된 추출 방법은 통상적으로 사용되는 모든 방법일 수 있으며, 예컨대, 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 또는 환류 냉각 추출법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 발효울금 추출물, 유자 추출물 및 블루베리 추출물을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물은, 추출물 외의 공지된 엑소좀 생성 촉진 물질을 더 포함할 수 있다.

본 명세서상의 용어 "엑소좀(Exosome)"은 세포 유래성 소포체로, 거의 모든 진핵 생물의 체액에 존재하는 것으로, LDL 단백질보다는 크지만, 적혈구보다는 훨씬 작은 30-100nm 정도의 직경을 갖는 소포체를 의미한다. 엑소좀은 다중소포체 (multivesicular bodies)가 세포막과 융합될 때 세포로부터 방출되거나, 세포막으로부터 곧바로 방출될 수 있고, 응고, 세포간 신호전달 등과 같은 중요하면서도 특화된 기능을 수행한다는 점이 잘 알려져 있다.

본 명세서상의 용어 "줄기세포(Stem cell)"는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에서, 줄기 세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있고, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있으며, 성체로부터 유래된 줄기세포일 수 있고, 배아로부터 유래된 줄기세포일 수 있다. 예를 들어, 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포 및 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 성체 줄기세포는 인간 또는 동물 조직 기원의 성체 줄기세포, 인간 또는 동물 조직 유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stromal cell) 및 인간 또는 동물 조직 기원의 유도만능줄기세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서상의 용어 "배아 줄기세포 (embryonic stem cell)"는 배아의 발생과정에서 추출한 세포로, 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴 (inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것을 의미한다.

배아 줄기세포는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성 (多能性, pluripotent)이거나 전능성 (全能性, totipotent)이 있는 자가재생능 (selfrenewal)을 갖는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아 줄기세포로부터 유래한 배아체 (embryoid bodies)도 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에서, 줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 배아 줄기세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서상의 용어 "성체 줄기세포(adult stem cell)"는 제대혈이나 다 자란 성인의 골수, 혈액 등에서 추출되는 세포로 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 세포를 의미하며, 필요한 때에 신체 내 조직으로 발달할 수 있는 능력을 보유한 미분화 상태의 세포를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에서, 성체 줄기세포는 인간 또는 동물의 다양한 조직 기원의 성체 줄기세포, 인간 또는 동물 조직 유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stromal cell), 인간 또는 동물의 다양한 조직 기원의 유도만능줄기세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포 및 다분화능 줄기세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 인간 또는 동물 또는 동물 조직은 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 인간 또는 동물의 다양한 조직 기원의 줄기세포는 조혈모세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 혈관내피 줄기세포, 신경 줄기세포, 후각신경 줄기세포 및 정소 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 줄기세포는 지방간엽줄기세포인 것일 수 있다.

본 명세서상의 용어 "유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)"는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 의미하며, "역분화줄기세포"와 동일한 의미로 사용될 수 있다.

인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 센다이바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함할 수 있다.

유도만능줄기세포는 배아 줄기세포와 거의 동일한 특성을 가지며, 구체적으로는, 유사한 세포 모양을 가지고, 유전자, 단백질 발현이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지고, 테라토마 (teratoma)를 형성하며, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능하다.

본 발명의 일 구현예에서, 유도만능줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 유도만능줄기세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서상의 용어, "생성 촉진"이란 대조군에 비하여 특정물질의 생산, 생성, 방출 등이 동일한 시간 내에서 증가되는 것을 의미하며, 구체적으로는, 줄기세포로부터 엑소좀이 생산되는 수량과, 엑소좀 내 단백질, RNA 등의 함량이 증가되는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 배지조성물로서 줄기세포 배양에 사용될 수 있고, 생체 내 (in vivo) 엑소좀 생성 촉진용도의 약제학적 조성물로서 줄기세포와 함께 생체 내로 병행 투여되거나, 선행 또는 후행적으로 투여되어 줄기세포의 in vivo 효능을 강화할 수 있다.

본 명세서 상의 용어 "줄기세포의 in vivo 효능 강화"는, 관절염이나 신경병증 등 특정 질환에 대한 치료목적 (in vivo 효능)을 가진 줄기세포의 효능이 줄기세포가 방출하는 엑소좀에 의해 매개됨을 전제로, 본 발명의 상기 조성물을 줄기세포 투여와 함께 투여시 줄기세포로부터 엑소좀의 생성이 촉진되는 결과 줄기세포의 질환 치료 효과 (in vivo 효능)를 강화시키는 용도를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에서, 배지조성물은 생체 외 (in vitro)에서 세포의 성장과 생존 및 증식에 필요한 필수성분을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 줄기세포 배양용 배지를 모두 포함하며, 예를 들어 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium), KnockOut DMEM, E8 (Essential 8 Medium) 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지가 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 배지조성물은 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함하며, 아미노산, 항생제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 배지조성물은 본 발명의 구성성분 라니피브라노르를 종래의 줄기세포 배양용 배지 내에 첨가하여 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 발효울금 추출물, 유자 추출물 또는 블루베리 추출물은 배지 내에 1 내지 1000ug/ml, 1 내지 900ug/ml, 1 내지 800ug/ml, 1 내지 700ug/ml, 1 내지 600ug/ml, 1 내지 500ug/ml, 1 내지 400ug/ml, 1 내지 300ug/ml, 1 내지 200ug/ml, 50 내지 300ug/ml, 50 내지 250ug/ml, 50 내지 200ug/ml, 50 내지 150ug/ml, 1 내지 100ug/ml 농도로 첨가될 수 있고, 예를 들어 100ug/ml의 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태는, 발효울금 추출물, 유자 추출물 및 블루베리 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 전처리된, 줄기세포 유래 엑소좀이다.

본 발명에 따른 조성물 및 상기 줄기세포 유래 엑소좀 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태는, 다음 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생산방법이다:

발효울금 추출물, 유자 추출물 및 블루베리 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 세포배양 배지에서 줄기세포를 배양하는 배양 단계.

본 발명의 일 구현예에서, 줄기세포 유래 엑소좀의 생산방법은 다음 단계를 더 포함할 수 있다:

배양된 줄기세포를 세척한 후 세포배양 배지에서 추가로 배양하는 추가 배양 단계; 및

엑소좀을 분리하는 분리 단계.

본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀의 생산방법의 배양 단계는, 줄기세포를 천연물로 전처리하여 줄기세포에 자극을 가하는 과정이다. 본 과정에 의해 줄기세포는 상기 물질로 전처리 되지 않은 줄기세포에 비하여 더 많은 수의 엑소좀을 생산하고, 엑소좀 내 단백질의 함량도 증가된다.

본 발명의 일 구현예에서, 추가 배양 단계의 추가 배양은 추가 배양은 12시간 내지 120 시간, 24시간 내지 96시간, 48시간 내지 96시간, 또는 60시간 내지 84시간, 예를 들어, 72시간 동안 배양될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀의 생산방법의 분리 단계에서, 추가 배양 단계에서 추가 배양한 줄기세포의 배양 배지를 3000xg에서 5 내지 25분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포 잔여물을 제거한 뒤, 상층액을 취하여 1,000-2,000xg로 10-70분간 고속원심분리한 후 상층액을 제거함으로써 하층에 남아 있는 엑소좀을 얻을 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 천연물 추출물의 제조과정을 간략하게 보여주는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 천연물 추출물을 줄기세포에 처리하였을 때의 독성평가 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 천연물 추출물이 전처리된 지방간엽줄기세포 유래 엑소좀의 엑소좀 내 단백질의 농도를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 천연물 추출물이 전처리된 지방간엽줄기세포 유래 엑소좀들의 크기 분포를 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 천연물 추출물이 전처리된 지방간엽줄기세포 유래 엑소좀 입자의 분포도를 시각적으로 나타내는 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 천연물 추출물이 전처리된 지방간엽줄기세포 유래 엑소좀에서 엑소좀 특이마커인 CD63을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 사진이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 천연물 추출물의 제조

1-1. 블루베리 추출물의 제조

블루베리 물 추출물(VW)의 제조

전남 담양산 블루베리를 수득하고 건조시켜 분쇄한 블루베리 100g을 100%물 2L (건조물 중량의 20배)에 넣고 250℃에서 3시간 동안 환류 추출하고 식힌 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거한 다음 불순물은 여과하고 여과액을 얻었다. 그 후 여과액을 50℃, 750mmHg 조건으로 감압농축하고 동결건조기를 이용하여 -80℃에서 건조하였다. 건조 후, 실험에 사용하기까지 -20℃ 냉동고에 보관하였다.

블루베리 에탈올 추출물(VE)의 제조

전남 담양산 블루베리를 수득하고 건조시켜 분쇄한 블루베리 100g을 70% 에탄올 용매 2L (건조물 중량의 20배)에 넣고 250℃에서 3시간 동안 환류 추출하고 식힌 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거한 다음 불순물은 여과하고 여과액을 얻었다. 그 후 여과액을 50℃, 750mmHg 조건으로 감압농축하고 동결건조기를 이용하여 -80℃에서 건조하였다. 건조 후, 실험에 사용하기까지 -20℃냉동고에 보관하였다.

1-2. 복분자 추출물의 제조

복분자 물 추출물(RW)의 제조

전남 광양산 복분자를 수득하고 건조시켜 분쇄한 복분자 100g을 100%물 2L (건조물 중량의 20배)에 넣고 250℃에서 3시간 동안 환류 추출하고 식힌 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거한 다음 불순물은 여과하고 여과액을 얻었다. 그 후 여과액을 50℃, 750mmHg 조건으로 감압농축하고 동결건조기를 이용하여 -80℃에서 건조하였다. 건조 후, 실험에 사용하기까지 -20℃냉동고에 보관하였다.

복분자 에탈올 추출물(RE)의 제조

전남 광양산 복분자를 수득하고 건조시켜 분쇄한 복분자 100g을 70% 에탄올 용매 2L (건조물 중량의 20배)에 넣고 250℃에서 3시간 동안 환류 추출하고 식힌 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거한 다음 불순물은 여과하고 여과액을 얻었다. 그 후 여과액을 50℃, 750mmHg 조건으로 감압농축하고 동결건조기를 이용하여 -80℃에서 건조하였다. 건조 후, 실험에 사용하기까지 -20℃냉동고에 보관하였다.

1-3. 토마토 추출물의 제조

토마토 물 추출물(LW)의 제조

전남 화순산 토마토를 수득하고 건조시켜 분쇄한 토마토 100g을 100%물 2L (건조물 중량의 20배)에 넣고 250℃에서 3시간 동안 환류 추출하고 식힌 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거한 다음 불순물은 여과하고 여과액을 얻었다. 그 후 여과액을 50℃, 750mmHg 조건으로 감압농축하고 동결건조기를 이용하여 -80℃에서 건조하였다. 건조 후, 실험에 사용하기까지 -20℃냉동고에 보관하였다.

토마토 에탈올 추출물(LE)의 제조

전남 화순산 토마토를 수득하고 건조시켜 분쇄한 토마토 100g을 70% 에탄올 용매 2L (건조물 중량의 20배)에 넣고 250℃에서 3시간 동안 환류 추출하고 식힌 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거한 다음 불순물은 여과하고 여과액을 얻었다. 그 후 여과액을 50℃, 750mmHg 조건으로 감압농축하고 동결건조기를 이용하여 -80℃에서 건조하였다. 건조 후, 실험에 사용하기까지 -20℃냉동고에 보관하였다.

1-4. 발효울금 추출물의 제조

발효울금의 제조

전남 진도군 지산면에 소재한 진도 강황 영농 조합에서 구입한 울금을 절단 및 건조한 후에 분쇄하여 분말화한 울금 건조 분말 100kg을 원재료로 사용하였다. 발효에 사용한 균주는 충무 발효에서 구입한 황국균 (Aspergillus oryzae)를 사용하였다. 울금을 흐르는 물로 3회 세척한 후에 표면을 건조시켜 절단 (두께 5 mm이하)하였다. 이어서 절된된 울금을 전열건조기 (대신기공)로 24시간 건조 (수분함량 5 %이하)한 후에 1차분쇄(조절), 2차분쇄(조말), 3차분쇄(세말)의 과정을 거쳐 100mesh 체를 통과한 울금 분말을 기밀포장하고 실온에 보관하여 울금분말을 준비하였다. 준비된 울금분말을 경북 안동시에 소재한 경북바이오산업연구원이 보유하고 있는 고체발효기 (3ton, 이노바이오 제작)를 이용하여 멸균하였다. (멸균조건 121℃, 1.0기압, 20min). 울금 분말의 멸균이 완료된 후, 발효탱크에 황국균주를 분말대비 2% (v/v%)로 접종하고 온도 25℃, 수분60%, 발효시간 36시간 동안 발효를 수행하여 발효 울금을 제조하였다.

발효울금 물 추출물(FW)의 제조

준비된 발효 울금 50 g에 정제수 1 L를 가하여 250℃에서 3시간 동안 열수에서 가열추출하고 여액을 감압농축기 ((주)한신, HS-2000)로 농축한 후, 건조하여 울금 발효 물 가열 추출 건조물을 얻어 하기 실험에 사용하였다.

발효울금 에탈올 추출물(FE)의 제조

준비된 발효 울금 50 g에 에탄올 1 L를 가하여 250℃에서 3시간 동안 열수에서 가열추출하고 여액을 감압농축기 ((주)한신, HS-2000)로 농축한 후, 건조하여 울금 발효 물 가열 추출 건조물을 얻어 하기 실험에 사용하였다.

1-5. 유자 추출물의 제조

유자 물 추출물(CW)의 제조

전남 완도산 유자를 구입하여 과육+과피를 건조시켜 분쇄한 유자 50 g을 100% 물 1 L에 넣고 250℃에서 3시간 동안 환류 추출하고 식힌 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거한 다음 불순물은 여과하고 여과액을 얻었다. 그 후 여과액을 50℃, 750 mmHg 조건으로 감압 농축하고 동결건조기를 이용하여 -80℃에서 건조하여 건조추출물을 수득하였다.

유자 에탈올 추출물(CE)의 제조

전남 완도산 유자를 구입하여 과육+과피를 건조시켜 분쇄한 유자 50 g을 100% 에탄올 1 L에 넣고 250℃에서 3시간 동안 환류 추출하고 식힌 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거한 다음 불순물은 여과하고 여과액을 얻었다. 그 후 여과액을 50℃, 750 mmHg 조건으로 감압 농축하고 동결건조기를 이용하여 -80℃에서 건조하여 건조추출물을 수득하였다.

실시예 2: 추출물 처리에 따른 줄기세포 유래 엑소좀 분리

추출물 전처리

지방유래 줄기세포를 10% fetal bovine serum (FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin)이 포함된 DMEM high glucose배지로 5% CO2, 37℃조건에서 배양하고 플레이트에 세포가 90% 찼을 때 계대배양 하였다. 2일동안 배양하고 PBS로 워싱 후 엑소좀-결여 배지 (exosome depleted media)로 교체한 후 블루베리 물 추출물, 블루베리 에탄올 추출물, 복분자 물 추출물, 복분자 에탄올 추출물, 토마토 물 추출물, 토마토 에탄올 추출물, 발효울금 물 추출물, 발효울금 에탄올 추출물, 유자 물 추출물 및 유자 에탄올 추출물을 각각 처리하였다. 이때, 천연물 추출물은 각각 50μg/ml, 100μg/ml 또는 200μg/ml 이 되게 처리하였다. 배양액은 이틀 뒤 회수하였다.

엑소좀 분리

엑소좀은 도 1과 같은 과정에 따라 분리되었다. 엑소좀은 ExoQuick kit를 사용하여 분리하였다. 회수한 배양액 은 3000xg에서 15분동안 원심분리하여 세포 잔여물을 제거해주고 상층액만 새 튜브에 옮겨 배양액 10ml당 exoquick시약 2ml을 넣어주고 잘 섞은 다음 냉장고에 보관한다. 다음날 1500xg에서 30분동안 원심분리하고 상층액은 버리고 가라앉은 엑소좀에 PBS 적당량 넣어 잘 풀어주고 -20℃에 보관하였다.

실시예 3: 추출물의 줄기세포에 대한 독성평가

상기 실시예 1에서 제조한 추출물의 지방간엽줄기세포에 미치는 독성평가를 위하여 MTT 어세이를 실시하였다.

블루베리 물 추출물, 블루베리 에탄올 추출물, 복분자 물 추출물, 복분자 에탄올 추출물, 토마토 물 추출물, 토마토 에탄올 추출물, 발효울금 물 추출물, 발효울금 에탄올 추출물, 유자 물 추출물 및 유자 에탄올 추출물이 처리된 줄기세포를 MTT 키트를 사용하여 550nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 평가하였다.

MTT 어세이 결과 도 2에서 확인할 수 있듯이, 블루베리 물 추출물, 블루베리 에탈올 추출물, 토마토 물 추출물, 토마토 에탈올 추출물, 발효울금 물 추출물, 발효울금 에탈올 추출물, 유자 물 추출물, 유자 에탈올 추출물 모두 100ug/ml 농도까지 지방간엽줄기세포에 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.

실시예 4: 추출물 처리에 따른 엑소좀 유래 단백질 양 증가

0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000ug/ml의 농도의 BSA standard를 준비하였다. BCA reagent A와 B를 50:1 비율로 샘플 수에 맞춰 준비하였다. 마이크로플레이트에 스탠다드와 블루베리 물 추출물, 블루베리 에탈올 추출물, 발효울금 물 추출물, 발효울금 에탈올 추출물, 유자 물 추출물, 유자 에탈올 추출물을 각 15ul씩 웰에 넣고, BCA reagent A+B mixture를 200ul씩 넣어주고, 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

	CON	CW	CE	FW	FE	VW	VE
엑소좀 유래 단백질의 농도 (ug/mL)	1189.815	926.11	997.963	1006.481	1078.7	906.85	1221.3

실험결과, 표 1 및 도 3에서 확인할 수 있듯이, 블루베리 에탈올 추출물 전처리된 지방간엽줄기세포 유래 엑소좀에서 엑소좀 유래 단백질의 농도가 대조군에 비해 유의하게 높은 것을 확인하였다.

실시예 5: 추출물 처리에 따른 엑소좀의 균일도 향상 확인

ZetaSizer ZS90 (Malvern Instruments, UK)를 이용하여 엑소좀의 크기 및 균일도를 측정하였다. 각 샘플은 1:100 PBS (Phosphate buffered saline)으로 희석하여 측정하였다. (Refractive Index = 1.330, 점도 = 0.8882, 온도 = 25℃).

처리 물질	평균 입자 크기 (r.nm)	분산 정도 (PDI)
Control	49.87	0.696
CW	42.85	0.598
CE	37.26	0.539
FW	54.24	0.656
FE	87.37	0.589
VW	24.18	0.505
VE	50.27	0.520

실험 결과, 표 2에서 확인할 수 있듯이 추출물이 처리된 지방간엽줄기세포 유래 엑소좀의 평균 크기는 모두 200nm이하로 측정되었다. 일반적으로 엑소좀의 크기는 200nm 이하인 것으로 판단되는 점을 고려하였을 때, 본 발명에 따른 추출물 전처리된 지방간엽줄기세포 유래 엑소좀은 모두 엑소좀의 특성을 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 표 2와 같이 대조군에 비해 유자 물 추출물, 유자 에탈올 추출물, 발효울금 물 추출물, 발효울금 에탈올 추출물, 블루베리 물 추출물 및 블루베리 에탈올 추출물이 전처리된 지방간엽줄기세포에서 엑소좀의 분산 정도(PDI)가 단일물질에 가까운 것을 확인하였다. 나아가, 블루베리 물 추출물 및 블루베리 에탈올추출물의 분산도가 0.5에 가까게 나타나, 엑소좀의 균일도가 가장 우수한 것을 확인하였다.

실시예 6: 추출물 처리에 따른 엑소좀 수 증가 확인

NS300 (Malvern) 488nm 레이저를 이용하여 입자의 크기 및 분포를 측정하였다. 모든 샘플은 1×10⁸ ~ 1×10⁹ particles/ml의 분포에 들어 가는 범위 내에서 PBS로 희석하여 최종 용량은 1ml로 통일하여 입자의 분포도를 측정하였다.

처리 물질	입자 크기 (nm)	농도 (NO/ml)
Control	95.9 ± 94.5	1.75×10¹¹ ± 7.95×10¹⁰
CW	123.5 ± 3.4	2.23×10¹¹ ± 1.4×10¹⁰
CE	116.4 ± 18.0	2.58×10¹¹ ± 1.10×10¹⁰
FW	113.4 ± 8.3	2.16×10¹¹ ± 9.95×10⁹
FE	107.6 ± 6.4	1.95×10¹¹ ± 4.99×10⁹
VW	95.5 ± 7.5	1.34×10¹¹ ± 1.11×10¹⁰
VE	102.5 ± 9.5	3.22×10¹¹ ± 6.85×10¹⁰

분석결과, 도 4 내지 도 5 및 표 3과 같이 각각의 추출물이 전처리된 지방간엽줄기세포 유래 엑소좀은 100nm 내외의 직경을 나타내는 것으로 확인하였으며, 이에 따라 추출물 전처리된 지방간엽줄기세포 유래 엑소좀은 모두 엑소좀의 특성을 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 대조군에 비해 유자 물 추출물, 유자 에탈올 추출물, 블룹리 물 추출물 및 블루베리 에탈올 추출물 전처리된 경우 줄기세포 유래 엑소좀 생산이 증가하는 것을 확인하였다. 특히 블루베리 에탈올 추출물의 경우, 줄기세포의 엑소좀 생성능을 가장 크게 향상시키는 것을 확인하였다.

실시예 7: 추출물 처리에 따른 엑소좀 마커의 발현 확인

BCA 방법으로 엑소좀 단백질 정량을 통해 같은 농도로 맞춰 준 다음 5% stacking, 10% seperating겔 사용하여 300mA로 전기영동을 진행하였다. 트랜스퍼 과정을 통해 단백을 겔에서 멤브레인으로 옮겨주고 한 시간 동안 블로킹 하였다. 1차 항체인 CD63 항체를 붙여 4℃ 밤새 배양하였다. 워싱 후 2차 항체 붙여주고 결합되지 않은 2차항체를 워싱 버퍼로 씻어낸 뒤 밴드를 측정하였다.

실험결과, 도 6에 나타낸 것과 같이 유자 물 추출물, 유자 에탈올 추출물, 발효울금 물 유출물, 발효울금 에탈올 추출물, 블루베리 물 추출물 및 블루베리 에탈올 추출물이 전처리된 줄기세포 유래 엑소좀에서 엑소좀 특이 마커인 CD63이 발현되는 것을 확인하였다.

Claims

토마토 추출물, 복분자 추출물, 발효울금 추출물, 유자 추출물 및 블루베리 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 발효울금 추출물, 유자 추출물 및 블루베리 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포 및 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 인간 또는 동물 조직 기원의 성체 줄기세포, 인간 또는 동물 조직 유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stromal cell) 및 인간 또는 동물 조직 기원의 유도만능줄기세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 인간 또는 동물 조직은 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 인간 또는 동물 조직 기원의 성체 줄기세포는 조혈모세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 혈관내피 줄기세포, 신경 줄기세포, 후각신경 줄기세포 및 정소 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 지방간엽줄기세포인 것인, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 발효울금 추출물, 유자 추출물 및 블루베리 추출물은 물 추출물 또는 에탄올 추출물인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 블루베리 에탄올 추출물을 포함하는 것인, 조성물.
토마토 추출물, 복분자 추출물, 발효울금 추출물, 유자 추출물 및 블루베리 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 전처리된, 줄기세포 유래 엑소좀.
제10항에 있어서, 상기 엑소좀은 발효울금 추출물, 유자 추출물 및 블루베리 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 전처리된 것인, 엑소좀.
제10항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포 및 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
제10항에 있어서, 상기 엑소좀은 블루베리 에탄올 추출물로 전처리된 것인, 엑소좀.
다음 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생산방법:
발효울금 추출물, 유자 추출물 및 블루베리 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 세포배양 배지에서 줄기세포를 배양하는 배양 단계.