KR20220070435A - 질환의 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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로버트 피어슨 셰퍼드
케빈 플레거
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디메릭스 바이오사이언스 피티와이 엘티디
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Abstract

적어도 하나의 안지오텐신 1형 수용체(AT1R) 차단제 및 적어도 하나의 CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 경로 억제제를 포함하는 약제학적 제형.

Description

질환의 치료를 위한 방법 및 조성물
본 발명은 (a) 적어도 하나의 안지오텐신 수용체 억제제, 및 (b) 적어도 하나의 C-X-C 모티프 케모카인 수용체 2 억제제를 포함하는, 만성 폐쇄성 폐질환의 치료 및 예방을 위한 방법 및 제형에 관한 것이다.
만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)은 폐기종(emphysema), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 기관지 확장증(bronchiectasis) 및 난치성(비가역적) 천식을 포함한 진행성 폐질환을 설명하는데 사용되는 포괄적 용어이다. 이 질환은 폐에서의 기류 제한으로 인해 숨이 차는 것이 증가하는 것을 특징으로 한다. COPD의 주요 원인은 담배 연기에 대한 노출(직접 흡연 또는 2차 연기)이지만, 다른 위험 요소는 실내 및 실외 대기 오염 및 직업적 먼지 및 매연에 대한 노출을 포함한다.
COPD는 세계에서 세 번째로 많은 사망 원인이며, COPD의 증상을 개선하기 위한 치료법이 존재하지만 상태의 진행을 늦추거나 이를 치유하기 위해 등록된 표적 치료법은 현재 없다. 또한, 5대 사망 원인 중, 사망률이 증가하고 있는 질환은 이 질환뿐이다. COPD에는 충족되지 않은 상당한 수요가 있으며, 이것은 NIH와 같은 주요 조직에 의해 및 전 세계적으로 WHO 및 CDC에 의해 인정된다. 2017년에, NIH는 질환의 연구, 진단 및 치료를 뒷받침하기 위한 노력의 일환으로 COPD 국가 행동 계획을 발표하였다. 이러한 인식에 따라, 2018년에 FDA는 COPD를 치료하기 위한 약물을 개발하는 후원자를 돕기 위해 산업 지침을 발행하였다. 새로운 지침은 대리 및 대상체(subject)-보고된 종점을 사용하여 더 짧은 임상 시험을 용이하게 할 것이다.
COPD는 완전히 가역적이지 않고 통상적으로 비정상적인 염증 반응으로 진행되는 폐 기류의 제한을 특징으로 한다(Rabe et al., 2007). COPD 대상체의 폐 기능의 장기적 감소를 방지하는 표적 약물은 존재하지 않는다. 그러나, 흡입용 항콜린제, β-아드레날린성 기관지 확장제, 및 코르티코스테로이드가 COPD의 증상 및 악화를 치료하는데 사용된다. 이러한 약물류의 고정 용량 조합을 포함하는 신제품이 일관된 속도로 승인되고 있으며, 새로운 작용 메카니즘을 가진 화합물에 대한 말기 시험이 진행 중이다.
폐기종(emphysema)에서는 폐포가 손상된다; 시간이 지남에 따라, 폐포의 내벽이 약해지고 파열되어 - 많은 작은 공기 공간 대신 더 큰 공기 공간이 생성된다. 이것은 폐의 표면적을 감소시키고, 결국, 혈류에 도달하는 산소의 양을 감소시킨다.
기관지염(bronchitis)은 기관지 내막의 염증이다. 기관지 확장증(bronchiectasis)은 비정상적이고 비가역적인 기관지 확장 또는 기도 직경의 고정된 증가를 특징으로 한다. 둘 다 매일 기침 및 점액(가래) 생성을 특징으로 한다.
난치성(비가역적) 천식은 통상의 천식 약물에 반응하지 않는다. 천식 발작에서, 기관지 기도가 조여지고 부어오른다. 약물은 통상적으로 이를 역전시켜, 기도를 열고 이를 공격-전 상태로 되돌릴 수 있다. 난치성 천식에서, 약물은 기도의 조임과 부기를 되돌릴 수 없다.
COPD를 치료하거나 예방하는 방법을 개발하거나; 또는 적어도 COPD의 증상을 개선하기 위해 이전에 알려진 방법을 보완하는 대체 방법을 제공할 필요가 있다. 따라서, 본 발명은 COPD의 치료 또는 예방을 위한 개선된 또는 대안적인 방법을 제공하고자 한다.
배경 기술에 대한 이전의 논의는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위한 것일 뿐이다. 논의는 언급된 자료 중의 어느 것이 출원 우선일에 일반적인 일반 지식의 일부이거나 일부였다는 인정 또는 승인이 아니다.
본 발명은 다음을 포함하는 약제학적 제형을 제공한다:
a) 적어도 하나의 안지오텐신 1형 수용체(AT1R) 차단제(blocker); 및
b) 적어도 하나의 CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 경로 억제제(pathway inhibitor).
바람직하게는 제형은 COPD인 상태 또는 질환의 치료, 개선(amelioration) 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는 COPD는 폐기종(emphysema), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 기관지 확장증(bronchiectasis) 및 난치성(비가역적) 천식으로부터 선택된다.
CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제는 동일한 투여 형태로 또는 별개의 투여 형태로 투여될 수 있다.
CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
CXCR2 억제제는 CXCR2 억제제의 약제학적으로 허용되는 염 및 CXCR2의 항체 억제제를 포함한다. AT1R 차단제는 AT1R 차단제의 약제학적으로 허용되는 염 및 AT1R의 항체 차단제를 포함한다. CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제는 동일한 활성제, 예를 들면 이중특이성 항체일 수 있다. 바람직하게는 CXCR2 경로 억제제는 직접 CXCR2 길항제, 음성 알로스테릭 CXCR2 조절제, CXCR2 역효능제(inverse agonist) 또는 알로스테릭 역효능제이다.
본 발명은 또한 상태 또는 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
i) (a) 안지오텐신 1형 수용체(AT1R) 차단제 및 (b) CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 경로 억제제의 조합물의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계.
본 발명은 또한 상태 또는 질환의 치료 또는 예방을 위한 투여 형태의 제조를 위한, (a) 적어도 하나의 안지오텐신 1형 수용체(AT1R) 차단제, 및 (b) 적어도 하나의 CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 경로 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명은 상태 또는 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 다음을 포함한다:
a) 적어도 하나의 안지오텐신 1형 수용체(AT1R) 차단제;
b) 적어도 하나의 CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 경로 억제제; 및
c) 사용 설명서.
본 발명은 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 제형에 사용하기 위한, 적어도 하나의 AT1R 차단제, 및 적어도 하나의 CXCR2 억제제를 제공한다.
본 발명은 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 제형에 사용하기 위한 적어도 하나의 AT1R 차단제를 제공하며, 여기서 적어도 하나의 AT1R 차단제는 적어도 하나의 CXCR2 억제제와 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여된다.
본 발명은 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 제형에 사용하기 위한 적어도 하나의 CXCR2 억제제를 제공하며, 여기서 적어도 하나의 CXCR2 억제제는 적어도 하나의 AT1R 차단제와 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여된다.
본 발명의 추가의 특징은 이의 몇 가지 비제한적인 실시양태의 하기 설명에 더욱 상세하게 기술되어 있다. 이 설명은 본 발명을 예시하기 위한 목적으로만 포함된다. 이것은 상기 제시된 바와 같은 본 발명의 광범위한 요약, 개시 또는 설명에 대한 제한으로 이해되어서는 안된다. 모든 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 신호는 일시적으로 형질감염된 인간 배아 신장(HEK) 293FT 세포로부터 37℃에서 측정되었으며 이 실험에서 cDNA 수준을 동일하게 유지하기 위해 필요한 경우 pcDNA3을 공동-형질감염시켰다는 점에 주목하여, 하기 설명은 첨부된 도면을 참조하여 이루어질 것이다:
도 1a는 10-7M (100nM) CXCL8 또는 10-6M (1μM) AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 발현된 혈구응집소 에피토프-태그된 AT1R(HA-AT1R) 없이 CXCR2/Rluc8(Rluc8로 표지된 CXCR2) 및 Venus/mGsi(Venus로 표지된 Gi 활성에 대한 센서로서의 mGsi)를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 1b는 10-7M (100nM) CXCL8 또는 10-6M (1μM) AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 2a는, AT1R cDNA(750ng) 및 CXCR2 cDNA(250ng)로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포에서, 표시된 바와 같은 CXCL8 농도 범위 또는 표시된 바와 같은 AngII 농도 범위 또는 10nM CXCL8과 조합된 표시된 바와 같은 AngII 농도 범위로 처리한 후 D-미오-이노시톨 1-포스페이트(IP1) 축적에 대한 농도-반응 곡선을 보여준다.
도 2b는, CXCR2를 안정적으로 발현하고 AT1R cDNA(500ng)로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포에서, 표시된 바와 같은 CXCL8 농도 범위 또는 표시된 바와 같은 AngII 농도 범위 또는 1nM CXCL8과 조합된 표시된 바와 같은 AngII 농도 범위로 처리한 후 D-미오-이노시톨 1-포스페이트(IP1) 축적에 대한 농도-반응 곡선을 보여준다.
도 3은 세포하 마커 위치 및 수용체 트래피킹(trafficking)의 단순화된 개략도를 보여준다(문헌[Tiulpakov et al (2016) Mol. Endocrinol. 30, 889-904]에 공개됨). 리간드-유도된 트래피킹은 원형질막 마커 Venus/Kras(K-ras) 또는 세포하 구획 마커 Rab: 초기 엔도솜에 대해 Venus/Rab5(5); 초기 엔도솜 재순환에 대해 Venus/Rab4(4); 재순환 엔도솜에 대해 Venus/Rab11a(11); 후기 엔도좀/리소좀에 대해 Venus/Rab7(7); 후기-골지망으로의 후기 엔도솜 트래피킹에 대해 Venus/Rab9(9); 초기-골지로의 소포체 트래피킹에 대해 Venus/Rab1(1); 골지체 및 후기-골지망에 대해 Venus/Rab6(6); 또는 원형질 막으로의 후기-골지망에 대해 Venus/Rab8(8)을 갖는 BRET를 통해 근접성을 측정함으로써 Rluc8-태그된 관심 단백질을 사용하여 모니터링하였다.
도 4a는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 HA-AT1R 없이 CXCR2/Rluc8 및 Venus/Kras를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4b는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Kras 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4c는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 HA-AT1R 없이 CXCR2/Rluc8 및 Venus/Rab1을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4d는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab1 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4e는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 HA-AT1R 없이 CXCR2/Rluc8 및 Venus/Rab4를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4f는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab4 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4g는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 HA-AT1R 없이 CXCR2/Rluc8 및 Venus/Rab5를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4h는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab5 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4i는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 HA-AT1R 없이 CXCR2/Rluc8 및 Venus/Rab6을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4j는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab6 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4k는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 HA-AT1R 없이 CXCR2/Rluc8 및 Venus/Rab7을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4l는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab7 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4m은 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 HA-AT1R 없이 CXCR2/Rluc8 및 Venus/Rab8을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4n은 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab8 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4o는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 HA-AT1R 없이 CXCR2/Rluc8 및 Venus/Rab9를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4p는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab9 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4q는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 HA-AT1R 없이 CXCR2/Rluc8 및 Venus/Rab11a를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 4r은 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab11a 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5a는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 비표지된 CXCR2 없이 AT1R/Rluc8 및 Venus/Kras를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5b는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 AT1R/Rluc8, Venus/Kras 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5c는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 비표지된 CXCR2 없이 AT1R/Rluc8 및 Venus/Rab1을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5d는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 AT1R/Rluc8, Venus/Rab1 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5e는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 비표지된 CXCR2 없이 AT1R/Rluc8 및 Venus/Rab4를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5f는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 AT1R/Rluc8, Venus/Rab4 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5g는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 비표지된 CXCR2 없이 AT1R/Rluc8 및 Venus/Rab5를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5h는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 AT1R/Rluc8, Venus/Rab5 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5i는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 비표지된 CXCR2 없이 AT1R/Rluc8 및 Venus/Rab6을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5j는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 AT1R/Rluc8, Venus/Rab6 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5k는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 비표지된 CXCR2 없이 AT1R/Rluc8 및 Venus/Rab7을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5l은 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 AT1R/Rluc8, Venus/Rab7 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5m은 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 비표지된 CXCR2 없이 AT1R/Rluc8 및 Venus/Rab8을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5n은 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 AT1R/Rluc8, Venus/Rab8 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5o는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 비표지된 CXCR2 없이 AT1R/Rluc8 및 Venus/Rab9를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5p는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 AT1R/Rluc8, Venus/Rab9 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5q는 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 비표지된 CXCR2 없이 AT1R/Rluc8 및 Venus/Rab11a를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 5r은 100nM CXCL8 또는 1μM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 AT1R/Rluc8, Venus/Rab11a 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 6a는 비히클로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 6b는 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610으로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 6c는 CXCR2 길항제 SB225002로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 6d는 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123)으로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 6e는 CXCR2 길항제 AZD5069로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 6f는 CXCR2 길항제 다니릭신으로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 7a는 AT1R 길항제 이르베사르탄으로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 7b는 조합된 AT1R 길항제 이르베사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 7c는 조합된 AT1R 길항제 이르베사르탄과 CXCR2 길항제 SB225002 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 7d는 조합된 AT1R 길항제 이르베사르탄과 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 7e는 조합된 AT1R 길항제 이르베사르탄과 CXCR2 길항제 AZD5069 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 7f는 조합된 AT1R 길항제 이르베사르탄과 CXCR2 길항제 다니릭신 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 8a는 AT1R 길항제 올메사르탄으로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 8b는 조합된 AT1R 길항제 올메사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 8c는 조합된 AT1R 길항제 올메사르탄과 CXCR2 길항제 SB225002 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 8d는 조합된 AT1R 길항제 올메사르탄과 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 8e는 조합된 AT1R 길항제 올메사르탄과 CXCR2 길항제 AZD5069 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 8f는 조합된 AT1R 길항제 올메사르탄과 CXCR2 길항제 다니릭신 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 9a는 AT1R 길항제 칸데사르탄으로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 9b는 조합된 AT1R 길항제 칸데사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 9c는 조합된 AT1R 길항제 칸데사르탄과 CXCR2 길항제 SB225002 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 9d는 조합된 AT1R 길항제 칸데사르탄과 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 9e는 조합된 AT1R 길항제 칸데사르탄과 CXCR2 길항제 AZD5069 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 9f는 조합된 AT1R 길항제 칸데사르탄과 CXCR2 길항제 다니릭신 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 10a는 AT1R 길항제 발사르탄으로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 10b는 조합된 AT1R 길항제 발사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 10c는 조합된 AT1R 길항제 발사르탄과 CXCR2 길항제 SB225002 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 10d는 조합된 AT1R 길항제 발사르탄과 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 10e는 조합된 AT1R 길항제 발사르탄과 CXCR2 길항제 AZD5069 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 10f는 조합된 AT1R 길항제 발사르탄과 CXCR2 길항제 다니릭신 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 11a는 AT1R 길항제 에프로사르탄으로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 11b은 조합된 AT1R 길항제 에프로사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 11c는 조합된 AT1R 길항제 에프로사르탄과 CXCR2 길항제 SB225002 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 11d는 조합된 AT1R 길항제 에프로사르탄과 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 11e는 조합된 AT1R 길항제 에프로사르탄과 CXCR2 길항제 AZD5069 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 11f는 조합된 AT1R 길항제 에프로사르탄과 CXCR2 길항제 다니릭신 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 12a는 AT1R 길항제 아질사르탄으로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 12b는 조합된 AT1R 길항제 아질사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 12c는 조합된 AT1R 길항제 아질사르탄과 CXCR2 길항제 SB225002 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 12d는 조합된 AT1R 길항제 아질사르탄과 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 12e는 조합된 AT1R 길항제 아질사르탄과 CXCR2 길항제 AZD5069 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 12f는 조합된 AT1R 길항제 아질사르탄과 CXCR2 길항제 다니릭신 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 13a는 AT1R 길항제 로사르탄으로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 13b는 조합된 AT1R 길항제 로사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 13c는 조합된 AT1R 길항제 로사르탄과 CXCR2 길항제 SB225002 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 13d는 조합된 AT1R 길항제 로사르탄과 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 13e는 조합된 AT1R 길항제 로사르탄과 CXCR2 길항제 AZD5069 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 13f는 조합된 AT1R 길항제 로사르탄과 CXCR2 길항제 다니릭신 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 14a는 AT1R 길항제 EXP3174(로사르탄의 활성 대사산물)로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 14b는 조합된 AT1R 길항제 EXP3174(로사르탄의 활성 대사산물)과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 14c는 조합된 AT1R 길항제 EXP3174(로사르탄의 활성 대사산물)과 CXCR2 길항제 SB225002 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 14d는 조합된 AT1R 길항제 EXP3174(로사르탄의 활성 대사산물)과 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 14e는 조합된 AT1R 길항제 EXP3174(로사르탄의 활성 대사산물)과 CXCR2 길항제 AZD5069 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 14f는 조합된 AT1R 길항제 EXP3174(로사르탄의 활성 대사산물)과 CXCR2 길항제 다니릭신 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 15a는 AT1R 길항제 텔미사르탄으로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 15b는 조합된 AT1R 길항제 텔미사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 15c는 조합된 AT1R 길항제 텔미사르탄과 CXCR2 길항제 SB225002 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 15d는 조합된 AT1R 길항제 텔미사르탄과 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 15e는 조합된 AT1R 길항제 텔미사르탄과 CXCR2 길항제 AZD5069 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 15f는 조합된 AT1R 길항제 텔미사르탄과 CXCR2 길항제 다니릭신 둘 다로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 16a는 비히클로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 16b는 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil)으로 전처리한지 50분 후, 100nM AngII 단독으로의 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Kras 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 16c는 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil)으로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Kras 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 16d는 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; SCH), 길항제 SB225002(SB22) 또는 알로스테릭 역효능제 SB265610(SB26)으로 전처리한지 50분 후, 100nM AngII 단독으로의 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Kras 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 16e는 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; SCH), 길항제 SB225002(SB22) 또는 알로스테릭 역효능제 SB265610(SB26)으로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로의 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Kras 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 16f는 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; SCH)과 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로의 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Kras 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 16g는 CXCR2 길항제 SB225002(SB22)와 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로의 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Kras 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 16h는 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(SB26)와 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로의 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Kras 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 17a는 비히클로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab5 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 17b는 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil)으로 전처리한지 50분 후, 100nM AngII 단독으로의 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab5 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 17c는 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil)으로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab5 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 17d는 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; SCH), 길항제 SB225002(SB22) 또는 알로스테릭 역효능제 SB265610(SB26)으로 전처리한지 50분 후, 100nM AngII 단독으로의 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab5 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 17e는 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; SCH), 길항제 SB225002(SB22) 또는 알로스테릭 역효능제 SB265610(SB26)으로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab5 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 17f는 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; SCH)과 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab5 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 17g는 CXCR2 길항제 SB225002(SB22)와 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab5 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 17h는 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(SB26)과 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab5 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 18a는 비히클로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 10nM CXCL8 단독 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab8 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 18b는 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil)으로 전처리한지 50분 후, 100nM AngII 단독으로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab8 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 18c는 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil)으로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab8 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 18d는 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; SCH), 길항제 SB225002(SB22) 또는 알로스테릭 역효능제 SB265610(SB26)으로 전처리한지 50분 후, 100nM AngII 단독으로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab8 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 18e는 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; SCH), 길항제 SB225002(SB22) 또는 알로스테릭 역효능제 SB265610(SB26)으로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab8 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 18f는 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; SCH)과 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab8 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 18g는 CXCR2 길항제 SB225002(SB22)과 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab8 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 18h는 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(SB26)과 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Rab8 및 HA-AT1R을 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 19a는 비히클 또는 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil)으로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 100nM AngII 단독으로 처리 후 AT1R/Rluc8, Venus/Kras 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 19b는 비히클 또는 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil)으로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 AT1R/Rluc8, Venus/Kras 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 19c는 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; SCH), 길항제 SB225002(SB22), 알로스테릭 역효능제 SB265610(SB26), 길항제 AZD5069(AZD) 또는 길항제 다니릭신(Dnrx)으로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 AT1R/Rluc8, Venus/Kras 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 19d는 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; SCH)과 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 AT1R/Rluc8, Venus/Kras 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 19e는 CXCR2 길항제 SB225002(SB22)와 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 AT1R/Rluc8, Venus/Kras 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 19f는 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(SB26)과 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 AT1R/Rluc8, Venus/Kras 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 20a는 비히클 또는 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil)으로 전처리한지 50분 후, 비히클 또는 100nM AngII 단독으로 처리 후 AT1R/Rluc8, Venus/Rab5 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 20b는 비히클 또는 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil)으로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 AT1R/Rluc8, Venus/Rab5 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 20c는 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; SCH), 길항제 SB225002(SB22), 알로스테릭 역효능제 SB265610(SB26), 길항제 AZD5069(AZD) 또는 길항제 다니릭신(Dnrx)으로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 AT1R/Rluc8, Venus/Rab5 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 20d는 CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; SCH)과 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 AT1R/Rluc8, Venus/Rab5 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 20e는 CXCR2 길항제 SB225002(SB22)와 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 AT1R/Rluc8, Venus/Rab5 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
도 20f는 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(SB26)과 AT1R 길항제 이르베사르탄(Irb), 발사르탄(Val) 또는 아질사르탄(Azil) 둘 다로 전처리한지 50분 후, 조합된 10nM CXCL8과 100nM AngII 둘 다로 처리 후 AT1R/Rluc8, Venus/Rab5 및 비표지된 CXCR2를 발현하는 세포로부터의 BRET 신호를 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 예기치 않게도 안지오텐신 1형 수용체(AT1R; AT1R)와 CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 사이의 헤테로머 결합을 확인하였다. 이들 수용체 둘 다는 독립적으로 COPD의 병태생리에 연루되어 있다(Traves et al (2004) Specic CXC but not CC chemokines cause elevated monocyte migration in COPD: a role for CXCR2. J. Leukoc. Biol. 76, 441-450). CXCR2가 호중구 화학주성을 감소시키고 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)에서 점액 생성 및 기도 염증을 감소시키는 것으로 이전에 밝혀졌다. 그러나, COPD의 치료에서 CXCR2 억제제의 효능은 임상 연구 동안 실망스러웠다.
어떠한 이론에 결부됨이 없이, CXCR2 억제제가 COPD를 치료하지 못하는 것은 CXCR2 및 AT1R의 헤테로머 성질로 인한 것으로 믿어진다.
조성물
본 발명은 다음을 포함하는 약제학적 제형을 제공한다:
a) 적어도 하나의 안지오텐신 1형 수용체(AT1R) 차단제; 및
b) 적어도 하나의 CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 경로 억제제.
AT1R 차단제는 AT1R을 억제하거나 부분적으로 억제한다. 바람직하게는, AT1R 차단제는 AT1R과 직접 상호작용하며, 기능적 리간드의 생성을 방지하기 위해 AT1R의 상류에서 작용하지만 AT1R 자체와 상호작용하지 않는 안지오텐신 전환 효소 억제제(ACEi) 치료제와 같은 치료제는 포함하지 않는다.
용어 "AT1R 차단제"는 AT1R 차단제의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 대안적으로, AT1R 차단제는 AT1R의 항체 차단제일 수 있다.
CXCR2 경로 억제제는 CXCR2 및/또는 CXCR2 신호전달 경로를 억제하거나 부분적으로 억제한다. 예를 들면, CXCR2 경로 억제제는 케모카인 수용체 자체 이외의 CXCR2 경로의 성분을 억제하는 화합물 또는 제제를 포함하여, CXCR2의 신호전달과 관련된 경로 중 어느 하나를 억제하거나 부분적으로 억제하는 임의의 화합물 또는 제제를 포함할 수 있다. CXCR2 경로 억제제는 CXCR2의 길항제 또는 CXCR2 이외의 CXCR2 경로의 성분, CXCR2의 역효능제 또는 CXCR2 이외의 CXCR2 경로의 성분 또는 CXCR2의 음성 알로스테릭 조절제 또는 CXCR2 이외의 CXCR2 경로의 성분일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
CXCR2의 역효능제는 또한 CXCR2의 음성 알로스테릭 조절제일 수 있다. 이러한 경우에 이를 CXCR2 알로스테릭 역효능제라고 할 수 있다.
CXCR2 억제제는 상이한 신호전달 경로에 대한 길항제 또는 역효능제로서 작용할 수 있다. 예를 들면, CXCR2 억제제는 하나의 신호전달 경로에 대한 CXCR2 길항제이면서 다른 신호전달 경로에 대한 CXCR2 역효능제일 수 있다.
CXCR2 역효능제는 역효능제로 정의할 수 있도록 하기 위해 평가된 신호전달 경로에 대해 구성적 활성이 분명하지 않은 경우 CXCR2 길항제로 분류될 수 있다.
CXCR2 음성 알로스테릭 조절제는 CXCR2를 억제하지만 결합 방식이 명확하게 정의되지 않았거나(오르토스테릭 대 알로스테릭) 인식되지 않은 경우 CXCR2 길항제로 분류될 수 있다.
바람직하게는 CXCR2 경로 억제제는 CXCR2 경로의 상류 또는 하류 성분이 아니라 수용체 자체를 직접 억제한다.
용어 "CXCR2 억제제"는 CXCR2 억제제의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 대안적으로, CXCR2 억제제는 CXCR2의 항체 억제제일 수 있다.
CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제는 동일한 활성제, 예를 들면 이중특이성 항체일 수 있다.
약제학적 제형은 임의로 부형제, 용매, 담체 및 기타 약제학적으로 허용되는 구성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 제형과 관련하여 본원에 사용된 용어 "성분"은 AT1R 차단제 또는 CXCR2 경로 억제제를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "억제하다"는 기준과 비교할 때 검출 한계 미만으로의 감소를 의미한다. 이 문구는 바람직하지 않은 결과를 방지하기 위해 작용을 차단, 지연 또는 방해하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "부분적으로 억제하다"는 기준과 비교할 때 검출 한계 내의 임의의 감소를 의미한다. 이 문구는 바람직하지 않은 결과를 방지하기 위해 작용을 차단, 지연 또는 방해하는 것을 포함한다.
CXC 케모카인 수용체 2
CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2)는 G-단백질 결합 수용체이다.
문구 "CXCR2 경로 억제제"는 케모카인 수용체 자체 이외의 CXCR2 경로의 성분을 억제하는 화합물 또는 제제를 포함하여, CXCR2와 관련된 경로 중 어느 하나를 억제하거나 부분적으로 억제하는 임의의 화합물 또는 제제를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 억제제는 CXCR2와 결합하는 단백질을 억제하거나 부분적으로 억제할 수 있거나, CXCR2 자체 이전 및/또는 이후에 화합물 또는 경로 단계를 억제할 수 있다. 바람직하게는, CXCR2 경로 억제제는 CXCR2 길항제, CXCR2 역효능제 또는 CXCR2 음성 알로스테릭 조절제이다.
본원에 사용된 용어 "CXCR2 이외의 CXCR2 경로의 성분"은 CXCR2에 의해 촉발되는 상기 열거된 경로 중 어느 하나의 성분을 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 여기서 성분 자체는 CXCR2가 아니다. 바람직하게는, 성분은 형질도입 또는 신호전달 단백질과 같은 단백질이지만, 이에 제한되지 않는다. 케모카인 수용체 경로의 성분은 CXCR2와 직접적으로 상호작용할 수 있다. 대안적으로, 케모카인 수용체 경로의 성분은 단백질-단백질 상호작용 또는 복합체 형성에 의해 CXCR2와 간접적으로 상호작용할 수 있다. 대안적으로, 케모카인 수용체 경로의 성분은 당업계에 공지된 바와 같은 신호전달 캐스케이드에 의해 CXCR2와 간접적으로 상호작용할 수 있다.
CXCR2 경로 억제제는 직접 CXCR2 길항제, 역 CXCR2 효능제, 음성 알로스테릭 CXCR2 조절제, 알로스테릭 역 CXCR2 효능제, 간접 CXCR2 길항제, 간접 역 CXCR2 효능제, 및 간접 음성 알로스테릭 CXCR2 조절제를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, CXCR2 경로 억제제는 CXCR2 길항제, CXCR2 역효능제, CXCR2 음성 알로스테릭 조절제 또는 CXCR2 알로스테릭 역효능제이다. 바람직하게는 CXCR2 경로 억제제는 직접 CXCR2 길항제, 음성 알로스테릭 CXCR2 조절제, CXCR2 역효능제 또는 CXCR2 알로스테릭 역효능제이다.
하나의 바람직한 실시양태에서 케모카인 수용체 경로 억제제는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
i) CXCR2의 길항제 또는 CXCR2 이외의 CXCR2 경로의 성분;
ii) CXCR2의 역효능제 또는 CXCR2 이외의 CXCR2 경로의 성분;
iii) CXCR2의 음성 알로스테릭 조절제 또는 CXCR2 이외의 CXCR2 경로의 성분.
용어 "CXCR2 억제제"는 CXCR2 억제제의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 대안적으로, CXCR2 억제제는 CXCR2의 항체 억제제일 수 있다.
CXCR2의 알려진 길항제는 레퍼탁신(레파릭신), 다니릭신(GSK1325756), AZD5069, SB225002 및 엘루브릭신을 포함한다.
CXCR2의 알려진 역효능제는 SB265610 및 나바릭신(MK-7123; SCH527123)을 포함한다.
CXCR2의 알려진 음성 알로스테릭 조절제는 SB265610을 포함한다.
하나의 바람직한 실시양태에서 CXCR2 경로 억제제는 CXCR2의 길항제이다. 예를 들면, CXCR2 경로 억제제는 레퍼탁신, 다니릭신(GSK1325756), AZD5069, SB225002 및 엘루브릭신을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
하나의 바람직한 실시양태에서 CXCR2 경로 억제제는 CXCR2의 역효능제이다. 예를 들면, CXCR2 경로 억제제는 SB265610(Bradley et al (2009) Br. J. Pharmacol. 158, 328-338) 및 나바릭신(MK-7123; SCH527123; Kredel et al (2009) J Biol Screen 14, 1076-1091)을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
하나의 바람직한 실시양태에서 CXCR2 경로 억제제는 CXCR2의 음성 알로스테릭 조절제이다. 예를 들면, CXCR2 경로 억제제는 SB265610(Bradley et al (2009) Br. J. Pharmacol. 158, 328-338)을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
안지오텐신 1형 수용체
안지오텐신 1형 수용체(AT1R, AT1R, 안지오텐신 II 수용체 1형)는 G 단백질-결합 수용체이다.
"안지오텐신 1형 수용체 억제제"(안지오텐신 수용체 차단제 또는 ARB라고도 함)라는 문구는 AT1R의 활성화를 억제하거나 부분적으로 억제할 수 있는 제제 또는 화합물을 의미하는 것으로 이해된다. 이것은 AT1R에 대한 길항제, 역효능제 및 음성 알로스테릭 조절제를 포함한다.
용어 "AT1R 차단제"는 AT1R 차단제의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 대안적으로, AT1R 차단제는 AT1R의 항체 차단제일 수 있다.
예를 들면, AT1R 차단제는 다음을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다: 이르베사르탄(예를 들어 Avapro®), 에프로사르탄(예를 들어 Teveten®), 로사르탄(예를 들어 Cozaar®), 발사르탄(예를 들어 Diovan®), 텔미사르탄(예를 들어 Micardis®), 칸데사르탄(예를 들어 Atacand®), 올메사르탄(예를 들어 Benicar®), 아질사르탄(예를 들어 Edarbi®) 및 ZD-7115. 예로서, 안지오텐신 수용체 억제제는 이르베사르탄일 수 있다.
CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제 둘 다는 동일한 활성제, 예를 들면 이중특이성 항체일 수 있다.
AT1R 차단제 및 CXCR2 억제제 둘 다는 각각의 활성제의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다. 약제학적으로 및 수의학적으로 허용되는 염은 본 개시내용의 화합물의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 염을 포함한다. 많은 경우에, 본원에 개시된 화합물은 아미노 및/또는 카복실 그룹 또는 이와 유사한 그룹의 존재로 인해 산 및/또는 염기 염을 형성할 수 있다. 허용되는 염기 부가염은 무기 및 유기 염기로부터 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유도된 염은 단지 예로서 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염을 포함한다. 유기 염기로부터 유도된 염은 1급, 2급 및 3급 아민, 단지 예를 들자면 알킬 아민, 디알킬 아민, 트리알킬 아민, 치환된 알킬 아민, 디(치환된 알킬) 아민, 트리(치환된 알킬) 아민, 알케닐 아민, 디알케닐 아민, 트리알케닐 아민, 치환된 알케닐 아민, 디(치환된 알케닐) 아민, 트리(치환된 알케닐) 아민, 사이클로알킬 아민, 디(사이클로알킬) 아민, 트리(사이클로알킬) 아민, 치환된 사이클로알킬 아민, 이치환된 사이클로알킬 아민, 삼치환된 사이클로알킬 아민, 사이클로알케닐 아민, 디(사이클로알케닐) 아민, 트리(사이클로알케닐) 아민, 치환된 사이클로알케닐 아민, 이치환된 사이클로알케닐 아민, 삼치환된 사이클로알케닐 아민, 아릴 아민, 디아릴 아민, 트리아릴 아민, 헤테로아릴 아민, 디헤테로아릴 아민, 트리헤테로아릴 아민, 헤테로사이클릭 아민, 디헤테로사이클릭 아민, 트리헤테로사이클릭 아민, 혼합된 디- 및 트리-아민의 염을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 여기서 아민 상의 치환체 중 적어도 두 개는 상이하며 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또한 2개 또는 3개의 치환체가 아미노 질소와 함께 헤테로사이클릭 또는 헤테로아릴 그룹을 형성하는 아민이 포함된다.
약제학적으로 및 수의학적으로 허용되는 산 부가염은 무기산 및 유기산으로부터 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 무기산은 단지 예로서 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다. 사용될 수 있는 유기산은 단지 예로서 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등을 포함한다.
본 개시내용에서 유용한 화합물의 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 염은 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 통상적인 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매, 또는 둘의 혼합물에서 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있으며; 일반적으로 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 적합한 염의 목록은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences. 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985), p. 1418]에서 발견되며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 이러한 허용가능한 염의 예는 요오다이드, 아세테이트, 페닐 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 아크릴레이트, 아스코르베이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 메틸벤조에이트, o-아세톡시벤조에이트, 나프탈렌-2-벤조에이트, 브로마이드, 이소부티레이트, 페닐부티레이트, γ-하이드록시부티레이트, β-하이드록시부티레이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 카프로에이트, 카프릴레이트, 클로라이드, 신나메이트, 시트레이트, 데카노에이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글리콜레이트, 헵타노에이트, 히푸레이트, 락테이트, 말레이트, 말레에이트, 하이드록시말레에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메실레이트, 니코티네이트, 이소니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐포스페이트, 디하이드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 프로피올레이트, 프로피오네이트, 페닐프로피오네이트, 살리실레이트, 세바케이트, 숙시네이트, 수베레이트, 설페이트, 바이설페이트, 피로설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 설포네이트, 벤젠설포네이트, p-브로모페닐설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 프로판설포네이트, 에탄설포네이트, 2-하이드록시에탄설포네이트, 메탄설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 크실렌설포네이트, 타르트레이트 등이다.
상태 또는 질환
바람직하게는 CXCR2 경로 억제제 및/또는 AT1R 차단제는 상태 또는 질환과 연관된다. 보다 바람직하게는, 상태 또는 질환은 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)이다. COPD는 폐기종(emphysema), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 기관지 확장증(bronchiectasis) 및 난치성(비가역적) 천식을 포함한 진행성 폐질환을 설명하는데 사용되는 포괄적 용어이다. 이 질환은 폐에서의 기류 제한으로 인해 숨이 차는 것이 증가하는 것을 특징으로 한다.
억제의 측정
(i) CXCR2 경로 억제제, (ii) AT1R 차단제, 또는 (iii) CXCR2 경로 억제제와 AT1R 차단제 둘 다의 조합에 의해 유발되는 CXCR2 경로 및/또는 AT1R의 억제 또는 부분 억제는 본원에 제시된 시험관내 방법을 사용하여 측정될 수 있으며, CXCR2-발현 호중구 및 당업계에 공지된 바와 같은 기타 세포의 시험관내 화학주성 이동의 평가를 위한 생화학적 또는 세포 분석 뿐만 아니라 이노시톨 포스페이트 생산의 측정, 세포외 조절된 키나제(ERK) 인산화, cAMP 생산, 무표지 기술(예를 들어 임피던스, 빛 굴절 또는 전하 재분배 사용), 근접 리포터 시스템 또는 기타 접근법을 사용한 G 단백질 커플링, β-아레스틴 모집 또는 매개된 신호전달, 전사 인자-기반 리포터 시스템, 형광 표지를 사용한 현미경 시각화, 수용체 세포 국소화를 평가하기 위한 항체 사용(예를 들어, 효소-결합 면역흡착 분석), 세포 국소화 및 트래피킹을 평가하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달, 및 형광 활성화 세포 분류를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
(i) CXCR2 경로 억제제, (ii) AT1R 차단제, 또는 (iii) CXCR2 경로 억제제와 AT1R 차단제 둘 다의 조합에 의해 유발되는 CXCR2 경로 및/또는 AT1R의 억제 또는 부분 억제는 본원에 제시된 생체내 방법을 사용하여 측정될 수 있으며, 폐 삼출물의 세포 및 사이토카인 함량의 측정, 폐활량 측정-기반 검사를 사용한 폐 기능의 물리적 능력을 포함한 폐 기능의 측정, 또는 측정 혈액 가스 또는 기타 생화학적 측정을 사용하여 측정된 폐 기능 출력, 또는 보행 검사와 같은 정량적 방법 또는 환자 보고 결과 평가와 같은 정성적 방법으로 측정된 임상적 이점을 포함한 기능적 이점의 개선을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 억제 또는 부분 억제는 상기 언급된 종점 중 하나 이상에 의해 측정된 폐 구조의 정성적 개선으로 나타날 수 있다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 약제학적 제형의 총 효능은 어느 하나의 성분이 다른 성분의 투여 없이 투여되는 경우의 AT1R 차단제 또는 CXCR2 경로 억제제의 효능과 비교할 때 더 크다. 따라서, 조합된 제형은 치료 용량 이하(sub-therapeutic dose)를 포함하여 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 또는 두 성분 중 하나가 단일 화합물로서 투여될 수 있는 것보다 덜 자주 투여될 수 있다.
바람직하게는, 약제학적 제형의 총 효능은 어느 하나의 성분이 다른 성분의 투여 없이 투여되는 경우의 AT1R 차단제과 CXCR2 경로 억제제의 효능의 합과 비교할 때 더 크다. 보다 바람직하게는, AT1R 차단제와 CXCR2 경로 억제제가 동시에 또는 순차적으로 투여될 때 효능의 상승 효과가 관찰된다.
대안적으로, 약제학적 제형의 총 효능은 어느 하나의 성분이 다른 성분의 투여 없이 투여되는 경우의 AT1R 차단제와 CXCR2 경로 억제제의 효능의 합과 같다. 이러한 대안의 추가의 바람직한 실시양태로서, AT1R 차단제 및 CXCR2 경로 억제제가 동시에 또는 순차적으로 투여될 때 효능의 상가 효과가 관찰된다.
추가 대안에서, 약제학적 제형의 총 효능은 어느 한 성분이 다른 성분의 투여 없이 투여되는 경우의 AT1R 차단제와 CXCR2 경로 억제제의 효능의 합보다 더 작다. 추가 실시양태에서, 조합된 효능이 각 성분이 다른 성분의 투여 없이 투여될 경우의 AT1R 차단제와 CXCR2 경로 억제제의 효능의 합보다 더 작지만, 치료는 단독으로 투여된 AT1R 차단제 및 CXCR2 경로 억제제의 단일 치료에 비해 더 큰 효능을 제공한다.
바람직하게는 2개의 성분은 동시에(예를 들면, 함께 복용하는 2개의 정제로서, 또는 각 성분과 함께 제형화된 단일 정제로서) 또는 순차적으로(예를 들면, 다른 정제 후에 하나의 정제를 복용) 함께 투여된다. 각 성분의 용량은 함께(동시에) 또는 순차적으로 복용될 수 있고 서로 몇 초, 몇 분, 며칠, 몇 주 또는 몇 달 이내에 복용될 수 있다.
본 발명의 조합물의 한 성분은, 예를 들면, 표준 치료로서 대상체에게 이미 투여되고 있을 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 조합물의 제2 성분은 본 발명의 치료 조합물을 제공하기 위한 요법에서 제2 성분으로서 투여된다.
치료 방법
본 발명은 추가로 상태 또는 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
i) (a) 안지오텐신 1형 수용체(AT1R) 차단제 및 (b) CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 경로 억제제의 조합물의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계.
치료될 대상체는 바람직하게는 인간 포유동물을 포함한 포유동물이다.
바람직하게는 치료, 개선 또는 예방될 상태 또는 질환은 COPD이다. 바람직하게는 COPD는 폐기종(emphysema), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 기관지 확장증(bronchiectasis), 및 난치성(비가역적) 천식으로부터 선택된다.
CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제는 동일한 투여 형태로 또는 별개의 투여 형태로 투여될 수 있다.
CXCR2 억제제 및/또는 AT1R 차단제는 각 수용체의 항체 억제제 또는 차단제일 수 있다. CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제는 동일한 활성제, 예를 들면 이중특이성 항체일 수 있다. CXCR2 억제제 및/또는 AT1R 차단제는 CXCR2 억제제 및/또는 AT1R 차단제의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다.
CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조합물의 한 성분은, 예를 들면, 표준 치료로서 대상체에게 이미 투여되고 있을 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 조합물의 제2 성분은 본 발명의 치료 조합물을 제공하기 위한 요법에서 제2 성분으로서 투여된다.
임의의 특정 작용 방식으로 제한하려는 것은 아니지만, 하나의 바람직한 실시양태에서 CXCR2 억제제는 CXCR2와 상호작용할 때 또는 CXCR2가 안지오텐신 수용체 AT1R과 결합될 때 이의 하류 경로를 조절할 때 더 큰 친화도 및/또는 역사 및/또는 효능을 갖는다. 예를 들면, CXCR2 및 안지오텐신 수용체 AT1R은 CXCR2/AT1R 헤테로머로서 결합될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조합물은 둘 중 하나가 단독으로 사용될 때보다 더 낮은 용량의 AT1R 또는 CXCR2 억제제를 제공한다. 예를 들면, AT1R 또는 CXCR2 억제제 중 하나 또는 둘 모두는 치료 용량 이하로 제공될 수 있다. 이는 AT1R 또는 CXCR2 억제제의 부정적인 안전성 프로파일을 감소시키면서 COPD에 대해 동일한 치료 이점을 갖는 이점이 있을 것이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, CXCR2 억제제가 AT1R 차단제와 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여되는 경우, 조합된 친화도, 역가 및/또는 효능은 CXCR2 억제제가 AT1R 차단제와 함께(동시에 또는 순차적으로) 투여되지 않을 때 달성되는 친화도, 역가 및/또는 효능과 비교하여 더 크다. 더욱 추가의 바람직한 실시양태에서, CXCR2 억제제가 AT1R 차단제와 조합하여(동시에 또는 순차적으로) 대상체에게 투여될 때 (친화도, 역사 및/또는 효능에 의해 측정되는 바와 같이) 상승 효과가 달성된다.
임의의 특정 작용 방식으로 제한하려는 것은 아니지만, 하나의 바람직한 실시양태에서 AT1R 차단제는 안지오텐신 수용체 AT1R이 CXCR2와 결합되는 경우 안지오텐신 수용체 AT1R과 상호작용할 때 더 큰 친화도 및/또는 역사 및/또는 효능을 갖는다. 예를 들면, CXCR2 및 안지오텐신 수용체 AT1R은 CXCR2/AT1R 헤테로머로서 결합될 수 있다. 추가의 바람직한 실시양태에서, AT1R 차단제가 CXCR2 억제제와 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여되는 경우, 조합된 친화도, 역가 및/또는 효능은 AT1R 차단제가 CXCR2 억제제와 조합하여(동시에 또는 순차적으로) 투여되지 않을 때 달성되는 친화도, 역가 및/또는 효능과 비교하여 더 크다. 더욱 추가의 바람직한 실시양태에서, AT1R 차단제가 CXCR2 억제제와 조합하여(동시에 또는 순차적으로) 대상체에게 투여될 때 (친화도, 역가 및/또는 효능에 의해 측정되는 바와 같이) 상승 효과가 달성된다.
전달
본 발명에 의해 제공되는 투여 형태는 상태 또는 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위해 대상체에게 투여 형태를 투여하기 위한 투여 설명서와 함께 본 발명의 약제학적 제형을 포함하는 바이알, 카트리지, 용기, 정제 또는 캡슐을 추가로 포함할 수 있다.
단일 투여량을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 각 활성 성분의 양은 치료할 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 인간에 경구 투여하기 위한 제형은 약 0.5mg 내지 1g의 각 활성 화합물과 적절하고 편리한 양의 담체 물질을 함유할 수 있으며, 이것은 총 제형의 약 5 내지 95%로 다양할 수 있다. 투여 단위 형태는 일반적으로 약 0.5mg 내지 500mg의 활성 성분(들)을 함유할 것이다.
바람직하게는, AT1R 차단제는 하나 이상의 용량으로 제공되는 한 1일당 50mg 내지 500mg으로 제공된다. 훨씬 더 바람직하게는, AT1R 차단제는 1일당 75mg 내지 300mg으로 제공된다. 예를 들면, AT1R 차단제는 이르베사르탄이고 하나 이상의 용량으로 제공되는 한 1일당 75, 150 또는 300mg의 용량으로 투여된다.
바람직하게는, CXCR2 경로 억제제는 하나 이상의 용량으로 제공되는 한 1일당 0.5mg 내지 2000mg으로 제공된다. 훨씬 더 바람직하게는, CXCR2 경로 억제제는 하나 이상의 용량으로 제공되는 한 1일당 0.5mg 내지 50mg의 용량으로 제공된다.
각 활성제의 용량은 단일 투여 형태 또는 두 개의 개별 투여 형태로 제공될 수 있으며 약 5mg 내지 1g의 AT1R 차단제 및 약 0.5mg 내지 1g의 CXCR2 경로 억제제를 포함할 수 있다. 두 개의 활성제의 용량은 단일 투여 형태 또는 두 개의 개별 투여 형태로 제공될 수 있으며 (i) 약 50mg 내지 500mg의 1일 용량의 AT1R 차단제, 및 (ii) 약 5mg 내지 50mg의 1일 용량의 CXCR2 경로 억제제를 포함할 수 있다. AT1R 차단제는 이르베사르탄일 수 있고, 투여 형태는 약 300mg의 1일 용량의 이르베사르탄을 포함할 수 있다.
그러나, 임의의 특정 대상체에 대한 구체적인 용량 수준은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도, 약물 조합 및 치료 중인 특정 상태 또는 질환의 중증도를 포함한 다양한 요인에 따라 좌우될 것임을 이해할 것이다.
본 발명의 제형은, 다양한 측면에서, 주사에 의해 투여되거나, 경구, 폐, 비강 또는 임의의 다른 형태의 투여를 위해 제조될 수 있다. 바람직하게는 제형은, 예를 들면, 정맥내, 피하, 근육내, 안와내, 안과, 뇌실내, 두개내, 피막내, 척수내, 수조내, 복강내, 협측, 직장, 질내, 비강내 또는 에어로졸 투여에 의해 투여된다.
투여 방식은 하나의 측면에서 적어도 제형이 제조된 형태에 적합하다. 가장 효과적인 반응을 위한 투여 방식은 경험적으로 결정할 수 있으며, 아래 기술된 투여 수단이 예시로 제공되며, 본 발명의 제형의 전달 방식을 어떠한 방식으로든 제한하지 않는다. 제공된 모든 제형은 제약 산업에서 일반적으로 사용되며 적합한 자격을 갖춘 실무자에게 일반적으로 알려져 있다.
주사 가능한 투여 형태
본 발명의 제형은 특정 측면에서 약제학적으로 허용되는 무독성 부형제 및 담체를 포함할 수 있으며 피하, 정맥내 및 복강내 주사와 같은 임의의 비경구 기술에 의해 투여될 수 있다. 또한, 제형은 임의로 하나 이상의 보조제를 함유할 수 있다. 본원에 사용된 "약제학적 담체"는 대상체에게 화합물을 전달하기 위한 약제학적으로 허용되는 용매, 현탁제, 부형제 또는 비히클이다. 담체는 액체 또는 고체일 수 있으며 계획된 투여 방식을 염두에 두고 선택된다.
주사용으로 적합한 약제학적 형태는 임의로 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 화합물은 특정 측면에서 리포솜에 캡슐화되고 세포막을 통한 이들의 수송을 돕기 위해 주사 가능한 용액으로 전달된다. 대안적으로, 또는 추가로, 이러한 제제는 세포막을 통한 수송을 용이하게 하기 위해 자가-조립 공극 구조의 성분을 함유한다. 담체는, 다양한 측면에서, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질이다. 적절한 유동성은 예를 들면 제한 없이 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지된다. 주사 가능한 제형의 연장된 흡수는 특정 측면에서 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면 알루미늄 모노-스테아레이트 및 젤라틴의 제형에서의 사용에 의해 야기된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 치료학적으로 유효한 약제학적 제형 및 방출 지연제를 포함하는 주사 가능한 서방출 약제학적 제형을 제공한다. 방출 지연제는, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴일 수 있다.
멸균 주사 용액은 필요에 따라 위에 열거된 하나 이상의 다른 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입한 다음 여과 멸균하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 위에 열거된 것들로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제제는 특정 측면에서 활성 성분의 분말과 이의 사전 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조 기술을 제한 없이 포함한다.
경구 투여 형태
경구 고체 투여 형태가 본원에서 사용하기 위해 고려되며, 이것은 일반적으로 본원에 참고로 포함된 문헌[Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990 Mack Publishing Co. Easton PA 18042) at Chapter 89]에 기술되어 있다. 고체 투여 형태는 정제, 캡슐제, 환제, 트로키 또는 로젠지, 카셰 또는 펠렛을 포함한다. 또한, 리포솜 또는 프로티노이드 캡슐화가 본 제형을 제형화하기 위해 사용될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,925,673호에 보고된 프로티노이드 미소구체로서). 리포솜 캡슐화가 사용될 수 있으며 리포솜은 다양한 중합체로 유도체화될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,013,556호). 치료제를 위한 가능한 고체 투여 형태의 설명은 본원에 참고로 포함된 문헌[Modern Pharmaceutics, Chapter 10, Banker and Rhodes ed., (1979)]에서 Marshall에 의해 제공된다. 일반적으로, 제형은 본 발명의 일부로 기술된 화합물(또는 이의 화학적으로 변형된 형태), 및 위장 환경에 대한 보호 및 장에서 생물학적 활성 물질의 방출을 허용하는 불활성 성분을 포함할 것이다.
본 발명의 CXCR2 경로 억제제 또는 AT1R 차단제에 대해 방출 위치는 위, 소장(십이지장, 공장 또는 회장) 또는 대장일 수 있다. 당업계의 숙련가는 위에서 용해되지 않지만 십이지장 또는 장의 다른 곳에서 물질을 방출하는 이용가능한 제형을 갖는다. 하나의 측면에서, 방출은 제형의 보호에 의해 또는 위 환경을 넘어, 예를 들어 장에서의 화합물의 방출에 의해 위 환경의 해로운 영향을 피할 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 치료학적으로 유효한 약제학적 제형 및 방출 지연제를 포함하는 경구 서방출 약제학적 제형을 제공한다.
본 발명의 하나의 측면에서 방출 지연제는 수용성, 수팽윤성 및/또는 수불용성 중합체이다. 특히, 수용성 중합체는 에틸셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 장용 코팅; 및 반투과 막을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 측면에서 방출 지연제는 비중합체성 방출 지연제이다. 보다 특히, 비중합체성 방출 지연제는 수소화 피마자유이다. 본 발명의 제형은 당업계에 공지된 통상적인 절차에 따라 밀링되거나 과립화되고 정제로 압축되거나 캡슐로 캡슐화될 수 있다.
완전한 위 저항성을 보장하기 위해, 적어도 pH 5.0에 불침투성인 코팅이 사용된다. 장용 코팅으로서 사용되는 보다 일반적인 불활성 성분의 예는 셀룰로스 아세테이트 트리멜리테이트(CAT), 하이드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트(HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트(CAP), Eudragit L, Eudragit S, 및 Shellac이다. 이들 코팅은 혼합된 필름으로서 사용될 수 있다.
코팅 또는 코팅의 혼합물은 정제에도 사용될 수 있으며, 이것은 위로부터 보호하기 위한 것은 아니다. 이것은 제하 없이 당 코팅, 또는 정제를 삼키기 쉽게 만드는 코팅을 포함한다. 예시적인 캡슐은 건조 치료제, 즉 분말의 전달을 위한 경질 쉘(예를 들어 젤라틴)로 구성되며; 액체 형태의 경우, 연질 젤라틴 쉘이 사용될 수 있다. 카셰의 쉘 물질은 특정 측면에서 증점성 전분 또는 기타 식용 종이이다. 환제, 로젠지, 성형 정제 또는 습제 정제의 경우, 습윤 덩어리화 기술이 또한 제한 없이 고려된다.
본원에 사용된 용어 "서방출"은 경구 섭취 후 치료 화합물 함량의 비교적 연장된 기간에 걸친 점진적이지만 연속적 또는 지속적인 방출을 의미한다. 방출은 약제학적 제형이 위를 통과한 후 약제학적 제형이 장에 도달할 때까지 및 이후에 계속될 수 있다. "서방출"이라는 문구는 또한 치료 화합물의 방출이 약제학적 제형이 위에 도달하는 즉시 개시되는 것이 아니라 오히려 일정 기간 동안, 예를 들면 약제학적 제형이 장에 도달할 때까지 지연되는 지연 방출을 의미한다. 장에 도달시, pH의 증가가 약제학적 제형으로부터의 치료 화합물의 방출을 촉발할 수 있다.
용어 "방출 지연제"가 본원에서 사용되지만, 경구 섭취될 때 약제학적 제형으로부터의 치료 화합물의 방출 속도를 감소시키는 물질을 의미한다. 방출 지연제는 중합체 또는 비중합체일 수 있다. 방출 지연제는, 예를 들면, 확산 시스템, 용해 시스템 및/또는 삼투 시스템을 포함하는 여러 서방출 시스템 중 어느 하나에 따라 사용될 수 있다.
특정 측면에서, 치료제는 약 1mm의 입자 크기의 과립 또는 펠렛 형태의 미세한 다중미립자로서 제형에 포함된다. 캡슐 투여를 위한 물질의 제형은, 특정 측면에서, 분말, 가볍게 압축된 플러그 또는 심지어 정제이다. 하나의 측면에서, 치료제는 압축에 의해 제조될 수 있다.
착색제 및 방향제가 임의로 포함될 수 있다. 예를 들면, 화합물은 (예를 들어, 제한 없이, 리포솜 또는 미소구체 캡슐화에 의해) 제형화된 다음 착색제 및 방향제를 함유하는 냉장 음료와 같은 식용 제품 내에 추가로 함유될 수 있다.
치료제의 용적은, 하나의 측면에서, 불활성 물질로 희석되거나 증가될 수 있다. 이러한 희석제는 탄수화물, 특히 만니톨, 알파-락토스, 무수 락토스, 셀룰로스, 수크로스, 변형 덱스트란 및 전분을 포함할 수 있다. 삼인산칼슘, 탄산마그네슘 및 염화나트륨을 포함한 특정 무기 염은 또한 임의로 충전제로 사용된다. 시판되는 일부 희석제는 Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress 및 Avicell이다.
또 다른 실시양태에서, 붕해제는 치료제를 고체 투여 형태로 제형화하는데 포함된다. 붕해제로 사용되는 물질은 전분을 기본으로 하는 상업용 붕해제인 Explotab을 포함하는 전분을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 나트륨 전분 글리콜레이트, 앰버라이트, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 울트라밀로펙틴, 나트륨 알기네이트, 젤라틴, 오렌지 껍질, 산성 카복시메틸 셀룰로스, 천연 스펀지 및 벤토나이트가 또한 고려된다. 붕해제의 또 다른 형태는 불용성 양이온 교환 수지이다. 분말상 검은 또한 임의로 붕해제로서 및 결합제로서 사용되며, 이들은 제한 없이 한천, 카라야 또는 트라가칸트와 같은 분말상 검을 포함한다. 알긴산 및 이의 나트륨 염이 또한 붕해제로서 유용하다.
결합제는 치료 화합물을 함께 유지시켜 경질 정제를 형성하기 위해 고려되며, 제한 없이 아카시아, 트라가칸트, 전분 및 젤라틴과 같은 천연 산물로부터의 물질을 포함한다. 다른 결합제는 제한 없이 메틸셀룰로스(MC), 에틸 셀룰로스(EC) 및 카복시메틸 셀룰로스(CMC)를 포함한다. 폴리비닐 피롤리돈(PVP) 및 하이드록시프로필메틸 셀룰로스(HPMC)는 치료제를 과립화하기 위해 알코올 용액에 사용하기 위해 고려된다.
감마찰제(antifrictional agent)는 제형화 공정 동안 점착을 방지하기 위해 치료제의 제형에 임의로 포함될 수 있다. 윤활제는 치료제와 다이 벽 사이의 층으로서 임의로 사용될 수 있으며, 이들은 마그네슘 및 칼슘 염을 포함하는 스테아르산, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 액체 파라핀, 식물성 오일 및 왁스를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 나트륨 라우릴 설페이트, 마그네슘 라우릴 설페이트, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 및 Carbowax 4000 및 6000을 포함하는 예시적인 가용성 윤활제가 또한 사용될 수 있다.
제형화 동안 화합물의 유동 특성을 개선하고 압축 동안 재배열을 도울 수 있는 활택제가 임의로 첨가될 수 있다. 활택제는 제한 없이 전분, 활석, 발열성 실리카 및 수화된 실리코알루미네이트를 포함할 수 있다.
수성 환경으로의 치료제의 용해를 돕기 위해, 계면활성제가 특정 실시양태에서 습윤제로서 첨가될 수 있다. 계면활성제는, 예를 들면, 제한 없이 나트륨 라우릴 설페이트, 디옥틸 나트륨 설포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 설포네이트와 같은 음이온성 세제를 포함할 수 있다. 양이온성 세제가 임의로 사용될 수 있고, 제한 없이 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤즈에토뮴 클로라이드를 포함할 수 있다. 계면활성제로서 제형에 포함될 수 있는 잠재적인 비이온성 세제의 목록은 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 경화된 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카복시메틸 셀룰로스이다. 사용될 때, 이들 계면활성제는 단독으로 또는 상이한 비율의 혼합물로서 화합물의 제형에 존재할 수 있다.
화합물의 흡수를 잠재적으로 향상시키는 첨가제가 바람직할 수 있다. 이러한 첨가제는 지방산 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산을 포함한다.
제어 방출 제형이 바람직할 수 있다. 특정 측면에서, 화합물은 확산 또는 침출 메커니즘에 의한 방출을 허용하는 불활성 매트릭스, 즉 검에 혼입될 수 있다. 일부 측면에서, 천천히 변성되는 매트릭스도 제형에 혼입될 수 있다. 이러한 치료제의 제어 방출의 또 다른 형태는 OROS™ 치료 시스템(Alza Corp.)을 기반으로 하는 방법에 의한 것이며, 즉, 약물은 반투과성 막으로 둘러싸여 있어 물은 들어가고 삼투 효과로 인해 단일의 작은 개구를 통해 약물은 밀어낼 수 있다. 일부 장용 코팅은 또한 지연 방출 효과를 갖는다.
또 다른 측면에서, 최적의 필름 코팅을 제공하기 위해 재료의 혼합물이 사용될 수 있다. 필름 코팅은, 예를 들면 제한 없이, 팬 코팅기에서 또는 유동층에서 또는 압축 코팅에 의해 수행될 수 있다.
폐 및 비강 투여 형태
또한 본 발명의 제형의 폐 전달이 본원에서 고려된다. 이러한 측면에서, AT1R 차단제 또는 CXCR2 경로 억제제는 흡입하는 동안 대상체의 폐로 전달되어 폐 상피 내벽을 가로질러 혈류로 횡단할 수 있다.
분무기, 계량 흡입기 및 분말 흡입기를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 치료 제품의 폐 전달을 위해 설계된 광범위한 기계적 장치가 본 발명의 실행에 사용하기 위해 고려되며, 이들 모두는 당업계의 숙련가들에게 친숙하다.
본 발명의 실행에 적합한 상업적으로 이용 가능한 장치의 일부 특정 예는, 예를 들면 제한 없이, 미주리주 세인트루이스에 소재하는 Mallinckrodt, Inc.에 의해 제조된 Ultravent™ 분무기; 콜로라도주 잉글우드에 소재하는 Marquest Medical Products에 의해 제조된 Acorn™ II 분무기; 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크에 소재하는 Glaxo Inc.에 의해 제조된 Ventolin™ 계량 흡입기; 및 매사추세츠주 베드포드에 소재하는 Fisons Corp.에 의해 제조된 Spinhaler™ 분말 흡입기이다.
이러한 모든 장치는 화합물의 분배에 적합한 제형의 사용을 필요로 한다. 전형적으로, 각 제형은 사용되는 장치의 유형에 특이적이며 치료에 유용한 통상의 희석제, 보조제 및/또는 담체 외에 적절한 추진제 물질의 사용을 수반할 수 있다. 또한, 리포솜, 마이크로캡슐 또는 미소구체, 포접 복합체, 또는 다른 유형의 담체의 사용이 고려된다.
제트 또는 초음파 분무기에 사용하기에 적합한 제형은 전형적으로 물에 현탁된 화합물을 포함할 것이다. 제형은 또한, 하나의 측면에서, 완충제 및 단순 당(예를 들어, 단백질 안정화 및 삼투압 조절을 위해)을 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 분무기 제형은 또한 에어로졸을 형성하는데 있어서 용액의 미립자화에 의해 야기되는 화합물의 표면 유도된 응집을 감소하거나 방지하기 위해 계면활성제를 함유할 수 있다.
계량 흡입기 장치에 사용하기 위한 제형은 일반적으로, 하나의 측면에서, 계면활성제의 도움으로 추진제에 현탁된 화합물을 함유하는 미분된 분말을 포함할 것이다. 추진제는 제한 없이 클로로플루오로카본, 하이드로클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본, 또는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올, 및 1,1,1,2 테트라플루오로에탄을 포함하는 탄화수소 또는 이들의 조합와 같은 이러한 목적을 위해 사용되는 임의의 통상적인 물질일 수 있다. 적합한 계면활성제는 제한 없이 소르비탄 트리올레에이트 및 대두 레시틴을 포함한다. 올레산은 또한 특정 측면에서 계면활성제로서 유용할 수 있다.
분말 흡입기 장치로부터 분배하기 위한 제형은 화합물을 함유하는 미분된 건조 분말을 포함할 것이고 또한 장치로부터 분말의 분산을 용이하게 하는 양으로, 예를 들어, 제형의 50 내지 90중량%로, 제한 없이, 락토스, 소르비톨, 수크로스 또는 만니톨과 같은 증량제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 화합물(들)은 말단 폐로의 가장 효과적인 전달을 위해 10 마이크론 미만, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5 마이크론의 평균 입자 크기를 갖는 미립자 형태로 제조된다.
화합물의 비강 전달이 또한 고려된다. 비강 전달은 제품을 폐에 침착시킬 필요 없이 코에 치료 제품을 투여한 직후 혈류로 단백질이 통과할 수 있게 한다. 비강 전달을 위한 제형은, 예를 들면 제한 없이, 덱스트란 또는 사이클로덱스트란을 갖는 것을 포함한다.
투여 일정
특정 측면에서, 본 발명의 제형은 단일 투여 일정으로서, 또는 바람직하게는 다중 투여 일정으로서 제공될 수 있음을 인지할 것이다. 다중 투여 일정은 1차 전달 과정이 1 내지 10회 개별 투여일 수 있고, 임의로 치료를 유지하거나 강화하는데 필요한 후속 시간 간격으로 또 다른 용량이 제공되는 것이다. 투여 섭생은 또한, 적어도 부분적으로, 개인의 필요 및 의사의 판단에 의해 결정될 것이다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 약제학적 제형을 포함하는 정제; 본 발명의 약제학적 제형을 포함하는 캡슐, 본 발명의 약제학적 제형을 포함하는 주사가능한 현탁액, 및 본 발명의 약제학적 제형을 포함하는 폐 전달용 제형을 제공한다. AT1R 차단제 및 CXCR2 경로 억제제는 동일한 제형으로 전달될 수 있거나, 별개의 제형으로 전달될 수 있다.
AT1R 차단제 및 CXCR2 경로 억제제는 동일한 투여 형태일 수 있거나, 별개의 투여 형태일 수 있다. AT1R 차단제 및 CXCR2 경로 억제제가 투여되는 대상체는 활성제 중 하나를 이미 제공받고 있을 수 있고, 본 발명에 따르면, 본 발명의 치료의 다른 성분이 투여될 수 있다.
용도
본 발명은 또한 상태 또는 질환의 치료, 개선 또는 예방용 제형의 제조를 위한, (a) 적어도 하나의 안지오텐신 1형 수용체(AT1R) 차단제, 및 (b) 적어도 하나의 CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 경로 억제제를 포함하는 약제학적 제형의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로 질환의 치료, 개선 또는 예방용 제형에 사용하기 위한, 적어도 하나의 AT1R 차단제, 및 적어도 하나의 CXCR2 억제제를 제공한다.
본 발명은 추가로 질환의 치료, 개선 또는 예방용 제형에 사용하기 위한 적어도 하나의 AT1R 차단제를 제공하며, 여기서 적어도 하나의 AT1R 차단제는 적어도 하나의 CXCR2 억제제와 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여된다.
본 발명은 추가로 질환의 치료, 개선 또는 예방용 제형에 사용하기 위한 적어도 하나의 CXCR2 억제제를 제공하며, 여기서 적어도 하나의 CXCR2 억제제는 적어도 하나의 AT1R 차단제와 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여된다.
바람직하게는 제형은 COPD인 상태 또는 질병의 치료, 개선 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는 COPD는 폐기종(emphysema), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 기관지 확장증(bronchiectasis), 및 난치성(비가역적) 천식으로부터 선택된다.
CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제는 동일한 투여 형태로 또는 별개의 투여 형태로 투여될 수 있다.
CXCR2 억제제 및/또는 AT1R 차단제는 각 수용체의 항체 억제제 또는 차단제일 수 있다. CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제는 동일한 활성제, 예를 들면 이중특이성 항체일 수 있다. CXCR2 억제제 및/또는 AT1R 차단제는 CXCR2 억제제 및/또는 AT1R 차단제의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다.
CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
키트
본 발명은 상태 또는 질환의 치료 또는 예방을 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 다음을 포함한다:
a) 적어도 하나의 안지오텐신 1형 수용체(AT1R) 차단제;
b) 적어도 하나의 CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 경로 억제제; 및
c) 사용 설명서.
키트의 내용물은 동결건조될 수 있으며 키트는 동결건조된 성분의 재구성을 위한 적절한 용매를 추가로 함유할 수 있다. 키트의 개별 성분은 별도의 용기에 포장되며, 이러한 용기와 관련하여, 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형식의 통지일 수 있으며, 이러한 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다.
키트의 성분이 하나 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 수용액, 예를 들면 멸균 수용액일 수 있다. 생체내 사용을 위해, 발현 작제물은 약제학적으로 허용되는 주사 가능한 조성물로 제형화될 수 있다. 이 경우 용기 수단은 그 자체가 흡입제, 주사기, 피펫, 점안기 또는 기타 이러한 유사한 장치일 수 있으며, 이로부터 제형이 폐와 같은 동물의 환부에 적용되거나, 동물에게 주사되거나, 또는 심지어 키트의 다른 성분에 적용되고 혼합될 수 있다.
키트의 성분은 또한 건조되거나 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 시약 또는 성분이 건조된 형태로 제공되는 경우, 재구성은 일반적으로 적절한 용매의 첨가에 의해 이루어진다. 용매는 또한 다른 용기 수단에 제공될 수 있다고 생각된다. 용기의 수 또는 유형에 관계없이, 본 발명의 키트는 또한 동물의 체내에 최종 복합 조성물의 주사/투여 또는 배치를 돕기 위한 기구를 포함하거나 이와 함께 포장될 수 있다. 이러한 기구는 흡입제, 주사기, 피펫, 집게, 계량 스푼, 점안기 또는 이러한 의학적으로 승인된 전달 비히클일 수 있다.
일반
당업계의 숙련가들은 본원에 기술된 발명이 구체적으로 기술된 것 이외의 변형 및 수정이 가능하다는 것을 인지할 것이다. 본 발명은 이러한 모든 변형 및 수정을 포함한다. 본 발명은 또한 개별적으로 또는 집합적으로 명세서에서 언급되거나 표시된 모든 단계, 특징, 제형 및 화합물, 및 단계 또는 특징의 임의의 및 모든 조합 또는 이들 중 임의의 둘 이상을 포함한다.
이러한 텍스트에 인용된 각 문서, 참조, 특허 출원 또는 특허는 전문이 본원에 참고로 명시적으로 포함되며, 이것은 독자가 이 텍스트의 일부로 읽고 고려해야 함을 의미한다. 이 텍스트에서 인용된 문서, 참조, 특허 출원 또는 특허는 단지 간결함의 이유로 이 텍스트에서 반복되지 않는다.
본원에 또는 또는 본원에 참고로 포함된 임의의 문서에 언급된 모든 제품에 대한 임의의 제조업체의 설명서, 설명, 제품 사양, 및 제품 설명서는 본원에 참고로 포함되며, 본 발명의 실행에 사용될 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 실시양태 중 어느 것에 의해 범위가 제한되지 않는다. 이러한 실시양태는 단지 예시의 목적을 위한 것이다. 기능적으로 등가인 제품, 제형 및 방법은 명백하게 본원에 기술된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있다.
본원에 기술된 발명은 하나 이상의 값 범위(예를 들어 크기, 변위 및 전계 강도 등)를 포함할 수 있다. 값의 범위는 범위를 정의하는 값 및 범위에 대한 경계를 정의하는 값에 바로 인접한 값과 동일하거나 실질적으로 동일한 결과를 초래하는 범위에 인접한 값을 포함하여 범위 내의 모든 값을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 제시된 수치 매개변수는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 따라서 "약 80%"는 "약 80%" 및 또한 "80%"를 의미한다. 적어도, 각 수치 매개변수는 유효 자릿수와 일반적인 반올림 방식에 비추어 해석되어야 한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수 그룹의 포함을 의미하지만 임의의 다른 정수 또는 정수 그룹의 배제를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다. 또한, 본 개시내용, 특히 청구범위 및/또는 단락에서, "포함하다(comprises)", "포함한(comprised)", "포함하는(comprising)" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 그에 부여된 의미를 가질 수 있고; 예를 들어, 이들은 "포함하다(includes)", "포함한(included)", "포함하는(including)" 등을 의미할 수 있으며; terms such as "본질적으로 구성된(consisting essentially of)" 및 "본질적으로 구성된다(consists essentially of)"와 같은 용어는 미국 특허법에서 이들에 부여된 의미를 가지며, 예를 들어, 이들은 명시적으로 언급되지 않은 요소는 허용하지만 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특성에 영향을 미치는 요소는 제외하는 것으로 주지된다.
본원에 사용된 선택된 용어에 대한 또 다른 정의는 본 발명의 상세한 설명 내에서 찾을 수 있고 전반에 걸쳐 적용될 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 다른 모든 과학 용어 및 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련가에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. "활성제"라는 용어는 하나의 활성제를 의미할 수 있거나 2개 이상의 활성제를 포함할 수 있다.
하기 실시예는 전술한 발명을 사용하는 방식을 보다 충분히 설명할 뿐만 아니라 본 발명의 다양한 측면을 수행하기 위해 고려되는 최상의 방식을 제시하는 역할을 한다. 이러한 방법은 본 발명의 진정한 범위를 제한하는 역할을 하지 않으며 오히려 예시 목적으로 제공되는 것으로 이해된다.
실시예
본 발명의 추가 특징은 하기 비제한적인 실시예에서 보다 충분히 기술된다. 이 설명은 본 발명을 예시하기 위한 목적으로만 포함된다. 이것이 상기 제시된 바와 같이 본 발명의 광범위한 설명에 대한 제한으로 이해되어서는 안된다.
하기 실시예 1, 3, 4 및 5 각각에서 , 독립적으로, 문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 하기 일반 재료 및 방법이 적용된다.
HEK293FT 세포를 대략 700,000개 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩하고 10% 소 태아 혈청(FCS; Bovogen)이 보충된 완전 배지(0.3mg/ml 글루타민, 100IU/ml 페니실린 및 100mg/ml 스트렙토마이신(Gibco/Thermo Fisher)을 함유하는 DMEM)에서 37℃, 5% CO2에 유지시켰다. 제조사 설명서에 따라 FuGene6™(Promega)을 사용하여 시딩한지 24시간 후 일시적 형질감염을 수행하였다. 형질감염 24시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 0.05% 트립신/0.53mM EDTA를 사용하여 분리하고, 5% FCS를 함유하는 HEPES-완충 페놀 레드 무함유 완전 배지에 재현탁하고, 폴리-L-리신 코팅된 백색 96-웰 마이크로플레이트(Greiner Bio-One)에 첨가하였다. 형질감염 48시간 후, 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 30mM의 최종 농도로 EnduRen™(Promega)과 함께 세포를 사전-배양한 후 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 분석을 수행하였다. BRET 측정은 LUMIstar™ 또는 CLARIOstar™(BMG Labtech)를 사용하여 37℃에서 수행하였다. 필터링된 광 방출을 각각의 '공여자 파장 창'(LUMIstar™의 경우 460-490nm 또는 CLARIOstar™의 경우 410-490nm) 및 '수용자 파장 창'(LUMIstar™의 520-550nm 또는 CLARIOstar™의 경우 520-620nm)에서 1초 동안 측정하였다.
길항제/역효능제 분석의 경우, 세포를 EnduRen과 함께 1.5시간 동안 사전-배양한 다음 또 다른 30분 동안 비히클 또는 길항제/역효능제(10μM)를 첨가하였다. 20분 동안 판독한 후, 효능제(CXC 모티프 케모카인 리간드 8 [CXCL8] 10nM 및/또는 안지오텐신 II [AngII] 100nM)를 첨가하고(따라서 초기 비히클 또는 길항제/역효능제 첨가 후 50분) 또 다른 40분 동안 분석을 측정하였다.
상호작용하는 단백질 사이에서 관찰된 BRET 신호는 배경 BRET 비율을 공제함으로써 정규화된다. 이것은 두 가지 방법 중 하나로 수행할 수 있다(문헌 참조; Pfleger et al. (2006) Cell Signal 18:1664-1670; Pfleger et al. (2006) Nat Protoc 1:336-344): 1) 공여자 작제물만을 함유하는 세포 샘플에 대해 460-490nm 또는 410-490nm 방출에 대한 520-550nm 또는 520-620nm 방출의 비율을 상호작용하는 수용체 및 공여자 융합 단백질을 포함하는 샘플에 대한 동일한 비율에서 공제한다; 2) 비히클로 처리된 세포 샘플에 대해 460-490nm 또는 410-490nm 방출에 대한 520-550nm 또는 520-620nm 방출의 비율을 리간드로 처리된 동일한 세포 샘플의 제2 분취량에 대한 동일한 비율에서 공제한다. 하기 실시예에서, 두 번째 계산이 사용될 것이며 신호는 '리간드-유도된 BRET'로 설명된다. 또한, 도 4 내지 20에 도시된 데이터의 경우, 주어진 세트의 모든 데이터 포인트는 0으로 고정된 효능제 처리 이전의 최종 데이터 포인트에 대해 보정된다. 도 7 내지 20의 키에서, ">"는 x축의 시간 0에서 효능제를 추가한지 "50분 후"를 의미한다.
Mini G(mG) 단백질은 Gα 하위단위의 조작된 GTPase 도메인이다. 이들은 G 단백질-결합 수용체(GPCR) 활성에 대해 보고하기 위해 형광 단백질에 융합된 BRET 분석에 사용되었다. "Gα 하위단위의 네 가지 계열에 해당하는 mG 단백질의 변이체(mGs, mGsi, mGsq 및 mG12)는 이들의 동족 GPCR에 적절한 커플링을 나타내어 개별 수용체에 대한 하위유형-특이적 커플링의 정량적 프로파일링을 가능하게 한다"(Wan et al. (2018) J Biol Chem. 293(19):7466-7473).
수용체-헤테로머 조사 기술(Receptor-HIT)은 수용체 복합체에 대한 통찰력을 제공하는 분석 형태이다(Ayoub et al. (2015) PLoS One 10(3):e0119803). 이것은 GPCR을 평가할 때 GPCR-HIT라고도 알려져 있다. 이것은 하나의 수용체(예를 들어 CXCR2)가 근접-기반 리포터 시스템(예를 들어, BRET)의 한 구성요소(예를 들어 Renilla 루시퍼라제 변이체 Rluc8)로 표지되고, 이의 상보적 구성요소(예를 들어 Venus 황색 형광 단백질)은 수용체 상호작용 파트너(예를 들어 mGsi)에 융합되는 분석 형태이다. BRET 분석(예를 들어, 혈구응집소 에피토프-태그된 AT1R; HA-AT1R)과 관련하여 태그되지 않은 수용체에 대해 선택적인 리간드(예를 들어 AngII)로 처리하면 BRET-태그된 수용체와 상호작용 파트너의 근접성이 조절되어, 두 수용체 사이의 기능적 상호작용을 나타내는 BRET 신호의 변화를 초래한다.
실시예 1
이제 도 1을 참조하면, 10-7M (100nM) CXCL8 또는 10-6M (1μM) AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 HA-AT1R로 CXCR2/Rluc8(Rluc8로 표지된 CXCR2) 및 Venus/mGsi(Venus로 표지된 Gi 활성에 대한 센서로서의 mGsi)를 일시적으로 발현하는 세포로부터 BRET 신호를 측정하였다. 동시에 10-7M (100nM) CXCL8 또는 10-6M (1μM) AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로 처리한 후 CXCR2/Rluc8 및 Venus/mGsi(HA-AT1R 발현 없음; cDNA 수준을 동일하게 유지하기 위해 대신 pcDNA3 형질감염됨)를 일시적으로 발현하는 세포로부터 BRET 신호를 측정하였다.
리간드 처리(0분에 추가) 전에, 각 조합에 대해 기준선 BRET 신호를 기록하였다. HA-AT1R 없이 CXCR2/Rluc8 및 Venus/mGsi를 발현하는 세포의 AngII 처리는 리간드-유도된 BRET의 증가를 초래하지 않았다(도 1a). HA-AT1R 없이 CXCR2/Rluc8 및 Venus/mGsi를 발현하는 세포의 CXCL8 처리는 약 0.6에 도달하는 BRET 신호를 초래하였다. 유사한 BRET 신호가 이들 세포에서 AngII 및 CXCL8을 사용한 조합 처리로 관찰되었다.
대조적으로, 식별 가능한 리간드-유도된 BRET 신호가 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 공동-발현하는 세포의 AngII 처리 후에 관찰되었다(도 1b). 이 신호는 대략 0.05였다. CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 공동-발현하는 세포를 CXCL8로 처리하면 대략 0.4의 신호를 초래하였다. CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 공동-발현하는 세포를 AngII와 CXCL8 둘 다로 처리하면 CXCL8 또는 AngII 단독의 첨가 후에 관찰된 것보다 실질적으로 더 큰 대략 0.6의 신호를 초래하였다.
당해 실시예는 CXCL8 및 AngII를 사용한 병용 치료의 상가 효과 이상을 입증하며, 이것은 AT1R의 AngII 활성화가 CXCL8-활성화된 CXCR2에 대한 Gi 커플링을 촉진하는데 상승 효과를 가짐을 나타낸다.
실시예 2
이제 도 2를 참조하면, 포스포리파제 C 경로의 수용체 활성화는 경쟁적 면역분석법(IP-one - Gq Kit, Cisbio 62IPAPEC)에 의한 D-미오-이노시톨 1-포스페이트(IP1)의 측정을 통해 검출하였다. 인간 배아 신장(HEK) 293 세포를 AGTR1 벡터(Origene RC212008) 단독으로 현탁액에서 일시적으로 형질감염시키거나 FuGene™ HD 시약(Promega E2311)을 사용하여 CXCR2 벡터(Origene Cat RC207794)로 공동-형질감염시켰다. 24시간 후, 실험을 자극 완충액(Cisbio, 62IPAPEC) + 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)에서 수행하였으며, 필요한 최종 분석 농도로 3.5μl 비히클 또는 안지오텐신 II(AngII, Tocris 1158), 및 3.5μl 비히클 또는 인터루킨 8(IL8, CXCL8, 아미노산 28 - 99, R&D 시스템 208-IL-050)과 함께 20,000개 세포/웰(7μl)을 384웰 백색 Optiplate™(Perkin Elmer 6007299)에 분배하였다. 효능제를 자극 완충액 + 0.1% BSA에서 3배 연속 희석하여 제조하고 분석에 첨가하여 적절한 최종 농도-반응 곡선을 제공하고, 필요에 따라 단일 농도에서 공동-자극을 제공하였다. IP1 표준 곡선을 또한 14μl 자극 완충액 + 0.1% BSA에서 구성하였다. 배양은 37℃, 5% CO2에서 90분 동안 수행하였으며, 그 후 Lysis & Detection 완충액 중의 3μl IP1-d2 시약과 3μl IP1 Tb 크립테이트 항체(Cisbio 62IPAPEC)를 실온에서 60분 동안 각 웰에 첨가하였다. 337nm 여기를 사용하고 620nm 및 665nm에서 공여자/수용자 방출을 수집하여 HTRF® 호환 가능한 판독기(PHERAstar™, BMG Labtech)에서 플레이트를 판독하였다. 미지의 HTRF 비율(665/620 x 10 000) 측정값을 IP1 농도(nM)로 보간하기 위해 표준 곡선을 작성하였다. 그후 효능제 농도-반응 데이터를 4 매개변수 S자 곡선에 피팅하여 log EC50 및 적절한 경우 최대 반응 Rmax를 유도하였다.
D-미오-이노시톨 1-포스페이트(IP1)의 축적은 수용체가 Gq 단백질을 활성화하여 결과적으로 포스포리파제 C의 활성화를 초래하는 결과로 발생하는 것으로 알려져 있다. AT1R은 Gq 신호전달 경로를 활성화하는 것으로 잘 알려져 있다(Cabana et al (2015) J Biol Chem 290, 15835-15854). 또한 Gi 단백질(백일해 독소에 민감함)의 활성화가 Gβγ 하위단위를 통해 포스포리파제 C의 특정 이소형을 활성화할 수 있다는 것이 잘 확립되어 있다(Camps et al (1992) Nature 360, 684-686; Katz et al (1992) Nature 360, 686-689). CXCR2는 고전적으로 Gi 단백질의 활성화를 통해 신호를 보낸다(Liu et al (2020) Nature 585, 135-140).
이제 도 2a를 참조하면, CXCL8 단독으로 처리된 AT1R 및 CXCR2로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포는 -7.40의 logEC50(M) 및 251nM의 Rmax를 갖는 농도-반응 곡선을 생성하였다. AngII 단독으로의 처리는 -9.21의 logEC50(M) 및 567nM의 Rmax를 갖는 농도-반응 곡선을 생성하였다. 10nM CXCL8과 다양한 농도의 AngII로의 처리는 -9.18의 logEC50(M) 및 717nM의 Rmax를 갖는 농도-반응 곡선을 생성하였다. AngII의 부재하에서 10nM CXCL8은 기준선(비히클로만 처리된 세포; 159nM)보다 단지 약 12nM 높은 약 171nM의 [IP1]를 초래한다는 것은 주목할 만하다.
이제 도 2b를 참조하면, CXCR2를 안정적으로 발현하고 CXCL8로 처리된 AT1R로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포는 -7.79의 logEC50(M) 및 68nM의 Rmax를 갖는 농도-반응 곡선을 생성하였다. AngII 단독으로의 처리는 -8.77의 logEC50(M) 및 209nM의 Rmax를 갖는 농도-반응 곡선을 생성하였다. 1nM CXCL8과 다양한 농도의 AngII로의 처리는 -8.72의 logEC50(M)과 266nM의 Rmax를 갖는 농도-반응 곡선을 생성하였다. AngII의 부재하에서 1nM CXCL8은 기준선과 식별 가능하게 다르지 않은 [IP1]를 초래한다는 것은 주목할 만하다.
당해 실시예는 AngII로 AT1R을 활성화하고 CXCL8로 CXCR2를 활성화한 결과 [IP1] 및 이에 따라 포스포리파제 C 활성의 실질적인 강화가 있음을 입증한다. 또한, 이러한 강화는 AT1R과 CXCR2가 모두 존재할 때 (바이오센서 mGsi에 대한 근접성에 의해 입증된 바와 같은) Gi 커플링에 대한 CXCL8과 AngII 둘 다를 사용한 치료의 상가 효과 이상을 보여주는 데이터와 일치한다.
실시예 3
이제 도 3을 참조하면(문헌[Tiulpakov et al (2016) Mol. Endocrinol. 30, 889-904]에 공개됨), Venus-태그된 Kras 원형질막 마커, 또는 별개의 세포하 위치에 특이적인 Venus-태그된 Rab에 대한 Rluc8-태그된 수용체의 근접성을 살아있는 세포에서 BRET를 사용하여 실시간으로 모니터링한다. Rab 마커는 다음과 같다: 초기 엔도솜에 대해 Venus/Rab5(5); 초기 엔도솜 재순환에 대해 Venus/Rab4(4); 재순환 엔도솜에 대해 Venus/Rab11a(11); 후기 엔도좀/리소좀에 대해 Venus/Rab7(7); 후기-골지망으로의 후기 엔도솜 트래피킹에 대해 Venus/Rab9(9); 초기-골지로의 소포체 트래피킹에 대해 Venus/Rab1(1); 골지체 및 후기-골지망에 대해 Venus/Rab6(6); 또는 원형질 막으로의 후기-골지망에 대해 Venus/Rab8(8).
이제 도 4a를 참조하면, AT1R의 부재하에서 CXCL8 처리는 원형질막 마커 Venus/Kras에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 현저하게 감소시켰으며, 이것은 CXCR2가 세포 내로 내재화되었음을 나타낸다. AngII는 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 CXCL8 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 4b를 참조하면, AT1R의 존재하에 CXCL8 처리는 다시 원형질막 마커 Venus/Kras에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 현저하게 감소시켰으며, 이것은 다시 CXCR2가 세포 내로 내재화되었음을 나타낸다. 그러나, 대조적으로, AngII 처리는 CXCR2/Rluc8 및 Venus/Kras의 근접성을 증가시켜, AngII에 의한 AT1R의 활성화가 원형질막에서 CXCR2의 양을 증가시킨다는 증거를 제공한다. 이론에 결부시키고자 함이 없이, 이들 데이터는 CXCR2가 AT1R의 AngII 활성화에 의해 억제되는 상당한 구성적 내재화를 나타내고/내거나, AngII에 의한 AT1R의 활성화가 원형질막으로의 CXCR2의 순방향 트래피킹을 증가시켜 원형질막 상의 CXCR2의 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸다. CXCL8과 AngII 둘 다로의 처리는 CXCL8 단독에 비해 CXCR2 순 내재화가 더 적었으며, 이것이 CXCL8에 의해 유도된 내재화 및 AngII에 의한 AT1R 활성화에 의해 유도된 원형질막으로의 CXCR2의 순방향 트래피킹의 순 효과일 수 있다.
이제 도 4c를 참조하면, AT1R의 부재하에서 CXCL8 처리는 Venus/Rab1에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 약간 증가시켰으며, 이것은 소포체에서 초기-골지로의 CXCR2 트래피킹의 작은 증가를 나타낸다. AngII는 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 CXCL8 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 4d를 참조하면, AT1R의 존재하에서 CXCL8 처리는 Venus/Rab1에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 약간 증가시켰으며, 이것은 다시 소포체에서 초기-골지로의 CXCR2 트래피킹의 작은 증가를 나타낸다. AngII 단독의 효과는 거의 없지만, AngII로의 공동-처리는 CXCL8의 효과를 감소시키는 것으로 보인다.
이제 도 4e를 참조하면, AT1R의 부재하에서 CXCL8 처리는 Venus/Rab4에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 증가시키며, 이것은 CXCR2의 초기 엔도솜 재순환의 증가를 나타낸다. AngII는 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 CXCL8 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 4f를 참조하면, AT1R의 존재하에서 CXCL8 처리는 Venus/Rab4에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 증가시키며, 이것은 CXCR2의 초기 엔도솜 재순환의 증가를 나타낸다. AngII 단독은 나중 시점에서 CXCR2의 초기 엔도솜 재순환을 아주 약간만 증가시키지만, AngII로의 공동-처리는 특히 초기 시점에서 CXCL8의 효과를 감소시키는 것으로 보인다.
이제 도 4g를 참조하면, AT1R의 부재하에서 CXCL8 처리는 Venus/Rab5에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 상당히 증가시키며, 이것은 초기 엔도솜에서 CXCR2의 상당한 증가를 나타낸다. AngII는 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 CXCL8 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 4h를 참조하면, AT1R의 존재하에서 CXCL8 처리는 다시 Venus/Rab5에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 상당히 증가시키며, 이것은 초기 엔도솜에서 CXCR2의 상당한 증가를 나타낸다. AngII 단독은 초기 엔도솜에서 CXCR2를 아주 약간만 증가시키지만, AngII로의 공동-처리는 CXCL8의 효과를 상당히 감소시키는 것으로 보인다. 이것은 AngII에 의해 활성화된 AT1R의 존재하에서 CXCR2의 감소된 CXCL8-유도 내재화와 일치하여, Kras 데이터에서 관찰된 바와 같이 원형질막에서 CXCR2를 증가시킨다.
이제 도 4i를 참조하면, AT1R의 부재하에서 CXCL8 처리는 Venus/Rab6에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 약간 감소시키며, 이것은 골지체를 통해 후기-골지망으로의 CXCR2 트래피킹의 작은 감소를 나타낸다. AngII는 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 CXCL8 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 4j를 참조하면, AT1R의 존재하에서 CXCL8 처리는 다시 Venus/Rab6에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 약간 감소시키며, 이것은 다시 골지체를 통해 후기-골지망으로의 CXCR2 트래피킹의 작은 감소를 나타낸다. 대조적으로, AngII 단독 처리는 Venus/Rab6에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 약간 증가시키며, 이것은 AngII에 의한 AT1R 활성화가 골지체를 통한 후기-골지망으로의 CXCR2 트래피킹의 약간의 증가를 촉진함을 나타낸다. 따라서 AngII로의 공동-처리는 나중 시점에서 CXCL8의 효과를 무효화하는 것으로 보이며 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
이제 도 4k를 참조하면, AT1R의 부재하에서 CXCL8 처리는 Venus/Rab7에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 약간 증가시키며, 이것은 후기 엔도솜/리소좀에서 CXCR2의 작은 증가를 나타낸다. AngII는 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 CXCL8 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 4l을 참조하면, AT1R의 부재하에서 CXCL8 처리는 다시 Venus/Rab7에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 약간 증가시키며, 이것은 다시 후기 엔도솜/리소좀에서 CXCR2의 작은 증가를 나타낸다. AngII 단독의 효과는 거의 없지만 AngII와 CXCL8 둘 다로의 처리는 특히 나중 시점에서 CXCL 단독에서 관찰된 것보다 근접성이 더 크게 증가한다.
이제 도 4m을 참조하면, AT1R의 부재하에서 CXCL8 처리는 Venus/Rab8에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 약간 감소시키며, 이것은 후기-골지망에서 원형질막으로의 CXCR2 트래피킹의 작은 감소를 나타낸다. AngII는 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 CXCL8 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 4n을 참조하면, AT1R의 존재하에서 CXCL8 처리는 다시 AT1R의 부재하에서 관찰된 것보다 덜 뚜렷하지만 Venus/Rab8에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 약간 감소시킨다. 두드러지게도, AngII 단독 처리는 Venus/Rab8에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 분명히 증가시킨다. AngII와 CXCL8 둘 다로의 처리는 여전히 근접성의 뚜렷한 증가를 야기하며, AngII 단독에 비해 약간 감소된다. 이러한 데이터는 AngII에 의한 AT1R의 활성화가 후기-골지망에서 원형질막으로의 CXCR2의 순방향 트래피킹을 촉진한다는 것을 나타내며, 이것은 AngII에 의한 AT1R의 활성화시 Venus/Kras에 대한 CXCR2/Rluc8 근접성의 관찰된 증가와 일치한다.
이제 도 4o를 참조하면, AT1R의 부재하에서 CXCL8 처리는 Venus/Rab9에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 증가시키며, 이것은 후기 엔도솜에서 후기-골지망으로의 CXCR2 트래피킹의 증가를 나타낸다. AngII는 효과가 없으며 ㅈ조합된 CL8과 AngII 둘 다는 CXCL8 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 4p를 참조하면, AT1R의 존재하에서 CXCL8 처리는 Venus/Rab9에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 증가시키며, 이것은 후기 엔도솜에서 후기-골지망으로의 CXCR2 트래피킹의 증가를 나타낸다. AngII 단독은 약간만 증가하지만 AngII로의 공동-처리는 CXCL8의 효과를 약간 감소시킨다.
이제 도 4q를 참조하면, AT1R의 부재하에서 CXCL8 처리는 Venus/Rab11a에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 증가시키며, 이것은 재순환 엔도솜을 통한 CXCR2 트래피킹의 증가를 나타낸다. AngII는 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 CXCL8 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 4r을 참조하면, AT1R의 존재하에서 CXCL8 처리는 다시 Venus/Rab11a에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 증가시키며, 이것은 다시 재순환 엔도솜을 통한 CXCR2 트래피킹의 증가를 나타낸다. AngII 단독의 효과는 거의 없지만 AngII로의 공동-처리는 CXCL8의 효과를 감소시킨다.
이제 도 5a를 참조하면, CXCR2의 부재하에서, AngII 처리는 원형질막 마커 Venus/Kras에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 현저하게 감소시키며, 이것은 AT1R이 세포 내로 내재화됨을 나타낸다. CXCL8은 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 AngII 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 5b를 참조하면, CXCR2의 존재하에서, AngII 처리는 다시 원형질막 마커 Venus/Kras에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 현저하게 감소시키며, 이것은 다시 AT1R이 세포 내로 내재화됨을 나타낸다. 다른 방향(도 4b)에서 관찰된 것과 대조적으로, AngII 처리는 AT1R/Rluc8 및 Venus/Kras의 근접성에서 눈에 띄는 증가를 초래하지 않으며, 이것은 CXCL8에 의한 CXCR2의 활성화가 원형질막 상의 AT1R의 양을 증가시키지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, 도 4b에서 명확하게 관찰된 효과는 상호적인 것으로 보이지 않는다. CXCL8 및 AngII 둘 다로의 처리는 AngII 단독에 비해 AT1R 내재화가 더 적었다.
이제 도 5c를 참조하면, CXCR2의 부재하에서, AngII 처리는 Venus/Rab1에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 증가시키며, 이것은 소포체에서 초기-골지로의 AT1R 트래피킹의 증가를 나타낸다. CXCL8은 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 AngII 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 5d를 참조하면, CXCR2의 존재하에서, AngII 처리는 다시 Venus/Rab1에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 증가시키며, 이것은 다시 소포체에서 초기-골지로의 AT1R 트래피킹의 증가를 나타낸다. CXCL8 단독의 효과는 거의 없으며(약간 감소할 수 있음), CXCL8로의 공동-처리는 AngII의 효과에 최소한의 영향을 미친다.
이제 도 5e를 참조하면, CXCR2의 부재하에서, AngII 처리는 Venus/Rab4에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 증가시키며, 이것은 AT1R의 초기 엔도솜 재순환의 증가를 나타낸다. CXCL8은 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 AngII 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 5f를 참조하면, CXCR2의 존재하에서, AngII 처리는 다시 Venus/Rab4에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 증가시키며, 이것은 다시 AT1R의 초기 엔도솜 재순환의 증가를 나타낸다. CXCL8로의 rrhd동-처리가 AngII의 효과를 감소시키기는 하지만 CXCL8 단독의 효과는 거의 없다(약간 감소할 수 있음).
이제 도 5g를 참조하면, CXCR2의 부재하에서, AngII 처리는 Venus/Rab5에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 상당히 증가시키며, 이것은 초기 엔도솜에서 AT1R의 상당한 증가를 나타낸다. CXCL8은 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 AngII 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 5h를 참조하면, CXCR2의 존재하에서, AngII 처리는 다시 Venus/Rab5에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 상당히 증가시키며, 이것은 초기 엔도솜에서 AT1R의 상당한 증가를 나타낸다. CXCL8 단독은 식별 가능한 효과가 없지만 CXCL8로의 공동-처리는 AngII의 효과를 실질적으로 감소시키는 것으로 보인다. 이것은 CXCL8에 의해 활성화된 CXCR2의 존재하에 AT1R의 감소된 AngII-유도 내재화와 일치하여, Kras 데이터에서 관찰된 바와 같이 원형질막에서 CXCR2를 증가시킨다.
이제 도 5i를 참조하면, CXCR2의 부재하에서, AngII 처리는 Venus/Rab6에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성에 거의 영향을 미치지 않으며(매우 작고 일시적인 감소일 수 있음), 이것은 골지체를 통한 후기-골지망으로의 AT1R 트래피킹에 거의 영향을 미치지 않음을 나타낸다. CXCL8은 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 AngII 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 5j를 참조하면, CXCR2의 존재는 Venus/Rab6에 대한 AT1R/Rluc8 근접성과 관련하여 CXCR2의 부재하에서 관찰된 결과와 비교하여 거의 차이를 만들지 않는다.
이제 도 5k를 참조하면, CXCR2의 부재하에서, AngII 처리는 Venus/Rab7에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 증가시키며, 이것은 후기 엔도솜/리소좀에서 AT1R의 증가를 나타낸다. CXCL8은 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 AngII 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 5l을 참조하면, CXCR2의 존재하에서, AngII 처리는 다시 Venus/Rab7에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 증가시키며, 이것은 다시 후기 엔도솜/리소좀에서 AT1R의 증가를 나타낸다. CXCL8 단독의 효과는 없으며, CXCL8로의 공동-처리는 아마도 나중 시점에서 AngII로 관찰된 효과를 증가시킨다).
이제 도 5m을 참조하면, CXCR2의 부재하에서, AngII 처리는 Venus/Rab8에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성에 있어 나중 시점에서 약간의 증가를 초래하며, 이것은 후기-골지망에서 원형질막으로의 AT1R 트래피킹에 대해 작은 효과를 나타낸다. CXCL8은 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 AngII 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 5n을 참조하면, CXCR2의 존재는 Venus/Rab8에 대한 AT1R/Rluc8 근접성과 관련하여 CXCR2의 부재하에서 관찰된 결과와 비교하여 거의 차이를 만들지 않는다. 어쨌든, CXCL8은 근접성을 감소시키고, AngII는 효과가 적으며, 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 다시 AngII 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 5o를 참조하면, CXCR2의 부재하에서, AngII 처리는 Venus/Rab9에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 증가시키며, 이것은 후기 엔도솜에서 후기-골지망으로의 AT1R 트래피킹의 증가를 나타낸다. CXCL8은 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 AngII 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 5p를 참조하면, CXCR2의 존재하에서, AngII 처리는 다시 Venus/Rab9에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 증가시키며, 이것은 다시 후기 엔도솜에서 후기-골지망으로의 AT1R 트래피킹의 증가를 나타낸다. CXCL8로의 공동-처리가 AngII의 효과를 감소시키기는 하지만 CXCL8 단독의 효과는 거의 없다.
이제 도 5q를 참조하면, CXCR2의 부재하에서, AngII 처리는 Venus/Rab11a에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 상당히 증가시키며, 이것은 재순환 엔도솜을 통한 AT1R 트래피킹의 상당한 증가를 나타낸다. CXCL8은 효과가 없으며 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다는 AngII 단독과 동일한 효과를 갖는다.
이제 도 5r을 참조하면, CXCR2의 존재하에서, AngII 처리는 다시 Venus/Rab11a에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 상당히 증가시키며, 이것은 재순환 엔도솜을 통한 AT1R 트래피킹의 상당한 증가를 나타낸다. CXCL8 단독은 식별 가능한 효과가 없지만, CXCL8로의 공동-처리는 AngII의 효과를 감소시킨다.
당해 실시예는 AT1R의 활성화가 CXCR2 내재화의 양을 감소시키고 및/또는 후기-골지망에서 원형질막까지의 CXCR2의 순방향 트래피킹을 증가시킴으로써 원형질막 상의 CXCR2의 발현을 증가시킨다는 것을 입증한다. 더욱이, AT1R 활성화의 결과로서 원형질막에서의 CXCR2 발현의 이러한 증가는 AT1R 및 CXCR2 둘 다가 존재할 때 (바이오센서 mGsi에 대한 근접성에 의해 입증되는 바와 같이) Gi 커플링에 대한 CXCL8 및 AngII 둘 다로의 처리의 상기 효과 이상을 보여주는 데이터와 일치한다. 또한, AT1R 활성화의 결과로서 원형질막에서의 CXCR2 발현의 이러한 증가는 세포를 다양한 농도의 AngII에 추가하여 고정 농도의 CXCL8로 공동-처리할 때 관찰되는 (IP-1 축적의 강화에 의해 입증되는 바와 같은) 포스포리파제 C 활성의 강화와 일치한다.
당해 실시예는 또한 CXCR2의 활성화가 AT1R 내재화의 양을 감소시킨다는 것을 입증하며, 이와 관련하여 AT1R이 활성화될 때 CXCR2에 대해 관찰된 효과에 보답한다. 그러나 대조적으로, CXCR2 활성화는 후기-골지망에서 원형질막까지 AT1R의 순방향 트래피킹을 증가시키지 않으며, 따라서 이와 관련하여 AT1R이 활성화될 때 CXCR2에 대해 관찰된 효과에 보답하지 않는다.
실시예 4
이제 도 6-15를 참조하면, 비히클 또는 길항제/역효능제(10mM)로 전처리한 다음 50분 후 10nM CXCL8 또는 100nM AngII 단독 또는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다(도 1b에 대한 데이터를 생성하는데 사용된 것보다 10배 더 낮은 농도)로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/mGsi 및 HA-AT1R을 일시적으로 발현하는 세포로부터 BRET 신호를 측정하였다. 효능제 처리(0분에 추가) 전에, 20분 동안 각 조합에 대해 기준선 BRET 신호를 기록하였다. 데이터는 '비히클 다음 비히클(vehicle followed by vehicle)'(veh > veh) 데이터 세트에 비한 리간드-유도된 BRET로서 계산하였다.
이제 도 6a를 참조하면, 세포를 '비히클 다음 비히클' 기준선을 설정하고 길항제/역효능제를 사용한 실험에 사용된 농도의 CXCL8 단독, AngII 단독 및 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과를 보여주기 위해 대조군으로서 비히클로 전처리하였다.
이제 도 6b, 6c, 6d, 6e 및 6f를 참조하면, 세포를 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(도 6b), CXCR2 길항제 SB225002(도 6c), CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; 도 6d), CXCR2 길항제 AZD5069(도 6e) 또는 CXCR2 길항제 다니릭신(도 6f)으로 전처리하여, CXCL8의 효과는 완전히 억제되지만 AngII의 효과는 변경되지 않았다. 조합된 CXCL8과 AngII의 효과는 각 경우에 AngII 단독에서 관찰된 것과 구별할 수 없다.
이제 도 7a를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 이르베사르탄으로 전처리하여, AngII의 효과는 완전히 억제되었지만 CXCL8의 효과는 변경되지 않았다. 조합된 CXCL8과 AngII의 효과는 CXCL8 단독에서 관찰된 것과 구별할 수 없다.
이제 도 7b, 7c, 7d, 7e 및 7f를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 이르베사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(도 7b), CXCR2 길항제 SB225002(도 7c), CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; 도 7d), CXCR2 길항제 AZD5069(도 7e) 또는 CXCR2 길항제 다니릭신(도 7f) 둘 다로 전처리하여, CXCL8 단독의 효과, AngII 단독의 효과 또는 둘 다 조합된 효과는 완전히 억제되었다.
이제 도 8a를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 올메사르탄으로 전처리하여, AngII의 효과는 완전히 억제되었지만 CXCL8의 효과는 변경되지 않았다. 조합된 CXCL8과 AngII의 효과는 CXCL8 단독에서 관찰된 것과 구별할 수 없다.
이제 도 8b, 8c, 8d, 8e 및 8f를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 올메사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(도 8b), CXCR2 길항제 SB225002(도 8c), CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; 도 8d), CXCR2 길항제 AZD5069(도 8e) 또는 CXCR2 길항제 다니릭신(도 8f) 둘 다로 전처리하여, CXCL8 단독의 효과, AngII 단독의 효과 또는 둘 다 조합된 효과는 완전히 억제되었다.
이제 도 9a를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 칸데사르탄으로 전처리하여, AngII의 효과는 완전히 억제되었지만 CXCL8의 효과는 변경되지 않았다. 조합된 CXCL8과 AngII의 효과는 CXCL8 단독에서 관찰된 것과 구별할 수 없다.
이제 도 9b, 9c, 9d, 9e 및 9f를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 칸데사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(도 9b), CXCR2 길항제 SB225002(도 9c), CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; 도 9d), CXCR2 길항제 AZD5069(도 9e) 또는 CXCR2 길항제 다니릭신(도 9f) 둘 다로 전처리하여, CXCL8 단독의 효과, AngII 단독의 효과 또는 둘 다 조합된 효과는 완전히 억제되었다.
이제 도 10a를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 발사르탄으로 전처리하여, AngII의 효과는 완전히 억제되었지만 CXCL8의 효과는 변경되지 않았다. 조합된 CXCL8과 AngII의 효과는 CXCL8 단독에서 관찰된 것과 구별할 수 없다.
이제 도 10b, 10c, 10d, 10e 및 10f를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 발사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(도 10b), CXCR2 길항제 SB225002(도 10c), CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; 도 10d), CXCR2 길항제 AZD5069(도 10e) 또는 CXCR2 길항제 다니릭신(도 10f) 둘 다로 전처리하여, CXCL8 단독의 효과, AngII 단독의 효과 또는 둘 다 조합된 효과는 완전히 억제되었다.
이제 도 11a를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 에프로사르탄으로 전처리하여, AngII의 효과는 완전히 억제되었지만 CXCL8의 효과는 변경되지 않았다. 조합된 CXCL8과 AngII의 효과는 CXCL8 단독에서 관찰된 것과 구별할 수 없다.
이제 도 11b, 11c, 11d, 11e 및 11f를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 에프로사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(도 11b), CXCR2 길항제 SB225002(도 11c), CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; 도 11d), CXCR2 길항제 AZD5069(도 11e) 또는 CXCR2 길항제 다니릭신(도 11f) 둘 다로 전처리하여, CXCL8 단독의 효과, AngII 단독의 효과 또는 둘 다 조합된 효과는 완전히 억제되었다.
이제 도 12a를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 아질사르탄으로 전처리하여, AngII의 효과는 완전히 억제되었지만 CXCL8의 효과는 변경되지 않았다. 조합된 CXCL8과 AngII의 효과는 CXCL8 단독에서 관찰된 것과 구별할 수 없다.
이제 도 12b, 12c, 12d, 12e 및 12f를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 아질사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(도 12b), CXCR2 길항제 SB225002(도 12c), CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; 도 12d), CXCR2 길항제 AZD5069(도 12e) 또는 CXCR2 길항제 다니릭신(도 12f) 둘 다로 전처리하여, CXCL8 단독의 효과, AngII 단독의 효과 또는 둘 다 조합된 효과는 완전히 억제되었다.
이제 도 13a를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 로사르탄으로 전처리하여, AngII의 효과는 완전히 억제되었지만 CXCL8의 효과는 변경되지 않았다. 조합된 CXCL8과 AngII의 효과는 CXCL8 단독에서 관찰된 것과 구별할 수 없다.
이제 도 13b, 13c, 13d, 13e 및 13f를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 로사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(도 13b), CXCR2 길항제 SB225002(도 13c), CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; 도 13d), CXCR2 길항제 AZD5069(도 13e) 또는 CXCR2 길항제 다니릭신(도 13f) 둘 다로 전처리하여, CXCL8 단독의 효과, AngII 단독의 효과 또는 둘 다 조합된 효과는 완전히 억제되었다.
이제 도 14a를 참조하면, 세포를 로사르탄의 활성 대사산물인 AT1R 길항제 EXP3174로 전처리하여, AngII의 효과는 완전히 억제되었지만 CXCL8의 효과는 변경되지 않았다. 조합된 CXCL8과 AngII의 효과는 CXCL8 단독에서 관찰된 것과 구별할 수 없다.
이제 도 14b, 14c, 14d, 14e 및 14f를 참조하면, 세포를 로사르탄의 활성 대사산물인 AT1R 길항제 EXP3174와 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(도 14b), CXCR2 길항제 SB225002(도 14c), CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; 도 14d), CXCR2 길항제 AZD5069(도 14e) 또는 CXCR2 길항제 다니릭신(도 14f) 둘 다로 전처리하여, CXCL8 단독의 효과, AngII 단독의 효과 또는 둘 다 조합된 효과는 완전히 억제되었다.
이제 도 15a를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 텔미사르탄으로 전처리하여, AngII의 효과는 완전히 억제되었지만 CXCL8의 효과는 변경되지 않았다. 조합된 CXCL8과 AngII의 효과는 CXCL8 단독에서 관찰된 것과 구별할 수 없다.
이제 도 15b, 15c, 15d, 15e 및 15f를 참조하면, 세포를 AT1R 길항제 텔미사르탄과 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610(도 15b), CXCR2 길항제 SB225002(도 15c), CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123; 도 15d), CXCR2 길항제 AZD5069(도 15e) 또는 CXCR2 길항제 다니릭신(도 15f) 둘 다로 전처리하여, CXCL8 단독의 효과, AngII 단독의 효과 또는 둘 다 조합된 효과는 완전히 억제되었다.
당해 실시예는 AT1R-CXCR2 헤테로머에서 CXCR2와 AT1R 둘 다의 활성화시 (Venus/mGsi 바이오센서에 대한 CXCR2/Rluc8 근접성의 증가에 의해 나타나는 바와 같은) Gi 커플링이 CXCR2 길항제, CXCR2 역효능제 또는 CXCR2 알로스테릭 역효능제(CXCR2 역효능제이기도 한 CXCR2 음성 알로스테릭 조절제의 예로서)와 조합된 AT1R 길항제의 첨가에 의해 완전히 억제된다는 것을 입증한다.
실시예 5
이제 도 16을 참조하면, 비히클 또는 길항제/역효능제(10mM)로 전처리한 다음 50분 후 10nM CXCL8 또는 100nM AngII 단독 또는 나타낸 바와 같이 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다(도 1b에 대한 데이터를 생성하는데 사용된 것보다 10배 더 낮은 농도)로 처리한 후 CXCR2/Rluc8, Venus/Kras 및 HA-AT1R을 일시적으로 발현하는 세포로부터 BRET 신호를 측정하였다. 효능제 처리(0분에 추가) 전에, 20분 동안 각 조합에 대해 기준선 BRET 신호를 기록하였다. 데이터는 '비히클 다음 비히클(vehicle followed by vehicle)'(veh > veh) 데이터 세트에 비한 리간드-유도된 BRET로서 계산하였다.
이제 도 16a를 참조하면, 도 4b에서 관찰된 바와 같이, CXCL8 처리는 원형질막 마커 Venus/Kras에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 현저하게 감소시키며, 이것은 CXCR2가 세포 내로 내재화됨을 나타낸다. 그러나, 대조적으로, AngII 처리는 CXCR2/Rluc8 및 Venus/Kras의 근접성을 증가시켜, AngII에 의한 AT1R의 활성화가 원형질막에서 CXCR2의 양을 증가시킨다는 증거를 제공한다. CXCL8과 AngII 둘 다로의 처리는 CXCL8 단독에 비해 CXCR2 순 내재화가 더 적었으며, 이것이 CXCL8에 의해 유도된 내재화 및 AngII에 의한 AT1R 활성화에 의해 유도된 원형질막으로 CXCR2의 순방향 트래피킹의 순 효과일 수 있다. 세포를 '비히클 다음 비히클' 기준선을 설정하고 길항제/역효능제를 사용한 다음 실험에 사용된 농도의 CXCL8 단독, AngII 단독 및 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과를 보여주기 위해 대조군으로서 비히클로 전처리하였다.
이제 도 16b를 참조하면, AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄으로의 전처리는 AngII의 효과를 완전히 억제하였다.
이제 도 16c를 참조하면, AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄으로의 전처리는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 세포를 비히클로 전처리한 경우 CXCL8 단독에서 관찰된 효과와 구별할 수 없는 결과를 초래하였다.
이제 도 16d를 참조하면, CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123), CXCR2 길항제 SB225002 또는 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610로의 전처리는 AngII의 효과를 변경하지 않았다.
이제 도 16e를 참조하면, CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123), CXCR2 길항제 SB225002 또는 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610으로의 전처리는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 세포를 비히클로 전처리한 경우 AngII 단독에서 관찰된 효과와 구별할 수 없는 결과를 초래하였다.
이제 도 16f를 참조하면, CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123)을 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 억제되는 결과가 초래되었다.
이제 도 16g를 참조하면, CXCR2 길항제 SB225002를 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 억제되는 결과가 초래되었다.
이제 도 16h를 참조하면, CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610을 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 억제되는 결과가 초래되었다.
이제 도 17a를 참조하면, 도 4h에서 관찰된 바와 같이, CXCL8 처리는 Venus/Rab5에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 상당히 증가시키며, 이것은 초기 엔도솜에서 CXCR2의 상당한 증가를 나타낸다. AngII 단독은 초기 엔도솜에서 CXCR2를 아주 약간만 증가시키지만, AngII로의 공동-처리는 CXCL8의 효과를 상당히 감소시킨다. 이것은 AngII에 의해 활성화된 AT1R의 존재하에서 CXCR2의 감소된 CXCL8-유도 내재화와 일치하여, Kras 데이터에서 관찰된 바와 같이 원형질막에서 CXCR2를 증가시킨다. 세포를 '비히클 다음 비히클' 기준선을 설정하고 길항제/역효능제를 사용한 다음 실험에 사용된 농도의 CXCL8 단독, AngII 단독 및 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과를 보여주기 위해 대조군으로서 비히클로 전처리하였다.
이제 도 17b를 참조하면, AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄으로의 전처리는 AngII의 효과를 완전히 억제하였다.
이제 도 17c를 참조하면, AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄으로의 전처리는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 세포를 비히클로 전처리한 경우 CXCL8 단독에서 관찰된 효과와 구별할 수 없는 결과를 초래하였다.
이제 도 17d를 참조하면, CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123)으로의 전처리는 AngII의 효과를 변경하지 않은 반면, CXCR2 길항제 SB225002 또는 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610으로의 전처리는 AngII의 효과를 억제하는 것으로 보인다.
이제 도 17e를 참조하면, CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123)으로의 전처리는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 세포를 비히클로 전처리한 경우 AngII 단독에서 관찰된 효과와 구별할 수 없는 결과를 초래하였다. 대조적으로, CXCR2 길항제 SB225002 또는 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610로의 전처리는 AngII의 효과 뿐만 아니라 CXCL8의 효과를 억제하는 것을 보인다.
이제 도 17f를 참조하면, CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123)을 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 완전히 억제되는 결과가 초래되었다.
이제 도 17g를 참조하면, CXCR2 길항제 SB225002를 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 완전히 억제되는 결과가 초래되었다.
이제 도 17h를 참조하면, CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610을 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 완전히 억제되는 결과가 초래되었다.
이제 도 18a를 참조하면, 도 4n에서 관찰된 바와 같이, CXCL8 처리는 Venus/Rab8에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 약간 감소시킨다. 두드러지게도, AngII 단독 처리는 조합된 AngII와 CXCL8 둘 다로의 처리와 마찬가지로 Venus/Rab8에 대한 CXCR2/Rluc8의 근접성을 분명히 증가시킨다. 이러한 데이터는 AngII에 의한 AT1R의 활성화가 후기-골지망에서 원형질막으로의 CXCR2의 순방향 트래피킹을 촉진한다는 것을 나타내며, 이것은 AngII에 의한 AT1R의 활성화시 Venus/Kras에 대한 CXCR2/Rluc8 근접성의 관찰된 증가와 일치한다. 세포를 '비히클 다음 비히클' 기준선을 설정하고 길항제/역효능제를 사용한 다음 실험에 사용된 농도의 CXCL8 단독, AngII 단독 및 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과를 보여주기 위해 대조군으로서 비히클로 전처리하였다.
이제 도 18b를 참조하면, AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄으로의 전처리는 AngII의 효과를 완전히 억제하였다.
이제 도 18c를 참조하면, AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄으로의 전처리는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 완전히 억제되는 결과를 초래하였다.
이제 도 18d를 참조하면, CXCR2 역효능제 나바릭신 (SCH527123), CXCR2 길항제 SB225002 또는 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610으로의 전처리는 AngII의 효과를 변경하지 않았다.
이제 도 18e를 참조하면, CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123), CXCR2 길항제 SB225002 또는 CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610으로의 전처리는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 세포를 비히클로 전처리한 경우 AngII 단독에서 관찰된 효과와 구별할 수 없는 결과를 초래하였다.
이제 도 18f를 참조하면, CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123)을 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 완전히 억제되는 결과가 초래되었다.
이제 도 18g를 참조하면, CXCR2 길항제 SB225002를 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 완전히 억제되는 결과가 초래되었다.
이제 도 18h를 참조하면, CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610을 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 완전히 억제되는 결과가 초래되었다.
이제 도 19a를 참조하면, AngII 처리는 원형질막 마커 Venus/Kras에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 현저하게 감소시키며, 이것은 AT1R이 세포 내로 내재화됨을 나타낸다. 일부 세포를 '비히클 다음 비히클' 기준선을 설정하고 길항제/역효능제를 사용한 다음 실험에 사용된 농도의 AngII 단독의 효과를 보여주기 위해 대조군으로서 비히클로 전처리하였다. AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄으로의 전처리는 AngII의 효과를 완전히 억제하였다.
이제 도 19b를 참조하면, 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과는 AngII 단독에서 관찰된 효과보다 약간 덜하였다(도 19a). AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄으로의 전처리는 이 효과가 완전히 억제되는 결과를 초래하였다.
이제 도 19c를 참조하면, CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123), CXCR2 길항제 SB225002, CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610, CXCR2 길항제 AZD5069 또는 CXCR2 길항제 다니릭신으로의 전처리는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로의 처리 후 관찰된 효과가 비히클로 전처리한 경우 AngII 단독에서 관찰된 효과(도 19a)와 구별할 수 없는 결과를 초래하였다.
이제 도 19d를 참조하면, CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123)을 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 완전히 억제되는 결과가 초래되었다.
이제 도 19e를 참조하면, CXCR2 길항제 SB225002를 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 완전히 억제되는 결과가 초래되었다.
이제 도 19f를 참조하면, CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610을 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 완전히 억제되는 결과가 초래되었다.
이제 도 20a를 참조하면, AngII 처리는 초기 엔도솜 마커 Venus/Rab5에 대한 AT1R/Rluc8의 근접성을 현저하게 감소시키며, 이것은 AT1R이 세포 내로 내재화됨을 나타낸다. 일부 세포를 '비히클 다음 비히클' 기준선을 설정하고 길항제/역효능제를 사용한 다음 실험에 사용된 농도의 AngII 단독의 효과를 보여주기 위해 대조군으로서 비히클로 전처리하였다. AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄으로의 전처리는 AngII의 효과를 완전히 억제하였다.
이제 도 20b를 참조하면, 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과는 AngII 단독에서 관찰된 효과보다 작았다(도 20a). AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄으로의 전처리는 이 효과가 완전히 억제되는 결과를 초래하였다.
이제 도 20c를 참조하면, CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123), CXCR2 길항제 SB225002, CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610, CXCR2 길항제 AZD5069 또는 CXCR2 길항제 다니릭신으로의 전처리는 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다로의 처리 후 관찰된 효과가 비히클로 전처리한 경우 AngII 단독에서 관찰된 효과(도 19a)와 구별할 수 없는 결과를 초래하였다.
이제 도 20d를 참조하면, CXCR2 역효능제 나바릭신(SCH527123)을 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 완전히 억제되는 결과가 초래되었다.
이제 도 20e를 참조하면, CXCR2 길항제 SB225002를 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 거의 완전히 억제되는 결과가 초래되었다.
이제 도 20f를 참조하면, CXCR2 알로스테릭 역효능제 SB265610을 AT1R 길항제인 이르베사르탄, 발사르탄 또는 아질사르탄과 함께 전처리하면 조합된 CXCL8과 AngII 둘 다의 효과가 완전히 억제되는 결과가 초래되었다.
당해 실시예는 AT1R-CXCR2 헤테로머에서 CXCR2와 AT1R 둘 다의 활성화시 관찰된 내재화에 대한 효과가 CXCR2 길항제, CXCR2 역효능제 또는 CXCR2 알로스테릭 역효능제(CXCR2 역효능제이기도 한 CXCR2 음성 알로스테릭 조절제의 예로서)와 조합된 AT1R 길항제의 첨가에 의해 억제된다는 것을 입증한다.
또한 당해 실시예는 CXCR2 순방향 트래피킹에 대한 효과가 AT1R 길항제의 첨가에 의해 완전히 억제된다는 것을 입증하며, 이것은 두 수용체 간의 기능적 상호작용을 추가로 뒷받침하고 AT1R 활성화가 원형질막에서 CXCR2 발현을 증가시킨다는 더 많은 증거를 제공한다. 이것은 CXCR2에 의해 매개되는 향상된 염증 신호전달에 기여하는 메커니즘을 제공하며 이에 따라 AT1R 및 CXCR2를 억제하여 만성 폐쇄성 폐질환과 같은 상태에서 염증을 감소시키는 근거를 제공한다.

Claims (23)

  1. a) 적어도 하나의 안지오텐신 1형 수용체(AT1R) 차단제(blocker); 및
    b) 적어도 하나의 CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 경로 억제제(pathway inhibitor)를 포함하는 약제학적 제형.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제형이 COPD인 상태 또는 질환의 치료, 개선(amelioration) 또는 예방에 사용하기 위한 것인 약제학적 제형.
  3. 제2항에 있어서, 상기 COPD가 폐기종(emphysema), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 기관지 확장증(bronchiectasis), 및 난치성(비가역적) 천식으로부터 선택되는 약제학적 제형.
  4. 제1항에 있어서, 상기 CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제가
    i) 동일한 투여 형태로;
    ii) 별개의 투여 형태로 투여되는 약제학적 제형.
  5. 제1항에 있어서, 상기 CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제가
    i) 동시에;
    ii) 순차적으로 투여되는 약제학적 제형.
  6. 제1항에 있어서, 상기 CXCR2 억제제가 직접 CXCR2 길항제, 음성 알로스테릭 CXCR2 조절제, 역효능제(inverse agonist) 또는 알로스테릭 역효능제로부터 선택되는 약제학적 제형.
  7. i) (a) 안지오텐신 1형 수용체(AT1R) 차단제 및 (b) CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 경로 억제제의 조합물의 치료학적 유효량을 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 상태 또는 질환의 치료, 개선 또는 예방 방법.
  8. 상태 또는 질환의 치료 또는 예방을 위한 투여 형태의 제조를 위한, (a) 적어도 하나의 안지오텐신 1형 수용체(AT1R) 차단제, 및 (b) 적어도 하나의 CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 경로 억제제의 용도.
  9. i) 적어도 하나의 안지오텐신 1형 수용체(AT1R) 차단제;
    ii) 적어도 하나의 CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 경로 억제제; 및
    iii) 사용 설명서를 포함하는, 상태 또는 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 키트.
  10. 제형이 COPD인 상태 또는 질환의 치료, 개선 또는 예방에 사용하기 위한 것인, 제7항의 방법, 제8항의 용도 또는 제9항의 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 COPD가 폐기종(emphysema), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 기관지 확장증(bronchiectasis), 및 난치성(비가역적) 천식으로부터 선택되는, 방법, 용도 또는 키트.
  12. CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제가
    i) 동일한 투여 형태로;
    ii) 별개의 투여 형태로 투여되는, 제7항의 방법, 제8항의 용도 또는 제9항의 키트.
  13. CXCR2 억제제 및 AT1R 차단제가
    i) 동시에;
    ii) 순차적으로 투여되는, 제7항의 방법, 제8항의 용도 또는 제9항의 키트.
  14. CXCR2 억제제가 직접 CXCR2 길항제, 음성 알로스테릭 CXCR2 조절제, 역효능제 또는 알로스테릭 역효능제로부터 선택되는, 제7항의 방법, 제8항의 용도 또는 제9항의 키트.
  15. 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 제형에 사용하기 위한, 적어도 하나의 AT1R 차단제, 및 적어도 하나의 CXCR2 억제제.
  16. 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 제형에 사용하기 위한 적어도 하나의 AT1R 차단제로서, 여기서 적어도 하나의 AT1R 차단제가 적어도 하나의 CXCR2 억제제와 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여되는 적어도 하나의 AT1R 차단제.
  17. 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 제형에 사용하기 위한 적어도 하나의 CXCR2 억제제로서, 여기서 적어도 하나의 CXCR2 억제제가 적어도 하나의 AT1R 차단제와 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여되는 적어도 하나의 CXCR2 억제제.
  18. 제15항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 COPD인, 적어도 하나의 AT1R 차단제 및 적어도 하나의 CXCR2 억제제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 COPD가 폐기종(emphysema), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 기관지 확장증(bronchiectasis), 및 난치성(비가역적) 천식으로부터 선택되는 질환인, 적어도 하나의 AT1R 차단제 및 적어도 하나의 CXCR2 억제제.
  20. 제15항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 AT1R 차단제 및/또는 적어도 하나의 CXCR2 억제제가
    i) 별개의 투여 형태로;
    ii) 동일한 투여 형태로 투여되는, 적어도 하나의 AT1R 차단제 또는 적어도 하나의 CXCR2 억제제.
  21. 제15항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 AT1R 차단제 및 적어도 하나의 CXCR2 억제제가
    i) 동시에;
    ii) 순차적으로 투여되는, 적어도 하나의 AT1R 차단제 및 적어도 하나의 CXCR2 억제제.
  22. 제15항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 CXCR2 억제제가 직접 CXCR2 길항제, 음성 알로스테릭 CXCR2 조절제, 역효능제 또는 알로스테릭 역효능제로부터 선택되는 적어도 하나의 CXCR2 억제제.
  23. 제15항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 AT1R 차단제를 함유하는 투여 형태가 약 5mg 내지 1g의 AT1R 차단제를 포함하고, CXCR2 억제제를 함유하는 투여 형태가 약 5mg 내지 1g의 CXCR2 억제제를 포함하는, 적어도 하나의 AT1R 차단제 및/또는 적어도 하나의 CXCR2 억제제.
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