JP2022549066A - 疾患の処置のための方法および組成物 - Google Patents

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Abstract

少なくとも１つのアンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）遮断剤および少なくとも１つのＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）経路阻害剤を含む医薬製剤。本発明は、ａ）少なくとも１つのアンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）遮断剤；およびｂ）少なくとも１つのＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）経路阻害剤を含む医薬製剤を提供する。好ましくは、製剤は、ＣＯＰＤである状態もしくは疾患の処置、改善または予防における使用のためのものである。好ましくは、ＣＯＰＤは、肺気腫、慢性気管支炎、気管支拡張症および難治性（不可逆性）喘息から選択される。

Description

技術分野
本発明は、（ａ）少なくとも１つのアンジオテンシン受容体阻害剤および（ｂ）少なくとも１つのＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体２阻害剤を含む、慢性閉塞性肺疾患の処置および予防のための方法および製剤に関する。
背景技術
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、肺気腫、慢性気管支炎、気管支拡張症および難治性（不可逆性）喘息を含む進行性の肺疾患を記載するために使用される包括的な用語である。これらの疾患は、肺における空気流の制限に起因する息切れの増加によって特徴付けられる。ＣＯＰＤの主要な原因は、たばこの煙への曝露（能動喫煙または二次喫煙のいずれか）であり、しかしながら、他の危険因子としては、屋内および屋外の空気汚染、ならびに職業的な粉塵および煙への曝露が挙げられる。
ＣＯＰＤは、世界における第三位の死因であり、ＣＯＰＤの症状を改善するための処置は存在するが、現在のところ、状態の進行を遅らせるまたはそれを治癒するために登録された標的化処置は存在しない。また、死因のトップ５の中で、この疾患は、死亡率が増加している唯一のものである。ＣＯＰＤにおける著しい満たされていない必要性が存在し、これは、ＮＩＨなどの重要な組織によって、ならびにＷＨＯおよびＣＤＣによって世界的に認識されている。２０１７年に、ＮＩＨは、この疾患の研究、診断および処置を支援する試みにおいて、ＣＯＰＤ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｎを公表した。この認識後、２０１８年に、ＦＤＡは、ＣＯＰＤを処置する薬物を開発するスポンサーを助けるための業界へのガイダンスを発行した。新たなガイダンスは、代替物および対象が報告したエンドポイントを使用するより短い臨床試験を容易にする。
ＣＯＰＤは、完全に元に戻らず、通常、異常な炎症反応を伴う進行性の肺気流の制限によって特徴付けられる（Ｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。ＣＯＰＤ対象の肺機能の長期的低下を予防する標的化医薬は存在しない。しかしながら、抗コリン薬、β－アドレナリン作用性気管支拡張薬およびコルチコステロイドの吸入が、ＣＯＰＤの症状および悪化を処置するために使用される。これらの薬物クラスの固定用量の組合せを含む新たな製品は、一貫した割合で承認されており、進行中の新たな作用機構を有する化合物の後期の治験がある。
肺胞が損傷を受けた肺気腫では、経時的に、肺胞の内壁が弱くなり、破裂して、多くの小さな気腔に代わってより大きな気腔を作り出す。これは、肺の表面積、次に、血流に達する酸素の量を低減する。
気管支炎は、気管支の内層の炎症である。気管支拡張症は、異常な不可逆的な気管支拡張、または気道内径の一定の増加によって特徴付けられる。両方とも、日々の咳および粘液（痰）の生成によって特徴付けられる。
難治性（不可逆性）喘息は、通常の喘息の医薬に応答しない。喘息発作では、気管支気道が、締まり、膨張する。医薬は、通常、これを元に戻すことができ、気道を広げ、それらを、それらの発作前の状態に戻す。難治性喘息では、医薬は、気道の締め付けおよび膨張を元に戻すことができない。
ＣＯＰＤを処置もしくは予防する方法、またはＣＯＰＤの症状を改善することが既知の方法を補うための代替方法の少なくとも条件を開発する必要性が存在する。したがって、本発明は、ＣＯＰＤの処置もしくは予防のための改善された方法または代替方法を提供しようとするものである。
背景技術の以前の議論は、本発明の理解を容易にすることだけを意図する。この議論は、言及された資料のいずれかが、本出願の優先日で通常の一般知識の一部であること、もしくはそうであったということの承認または自白ではない。
発明の概要
本発明は、
ａ）少なくとも１つのアンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）遮断剤；および
ｂ）少なくとも１つのＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）経路阻害剤
を含む医薬製剤を提供する。
好ましくは、製剤は、ＣＯＰＤである状態もしくは疾患の処置、改善または予防における使用のためのものである。好ましくは、ＣＯＰＤは、肺気腫、慢性気管支炎、気管支拡張症および難治性（不可逆性）喘息から選択される。
ＣＸＣＲ２阻害剤およびＡＴ１Ｒ遮断剤は、同じ剤形中で、または別々の剤形中で投与され得る。
ＣＸＣＲ２阻害剤およびＡＴ１Ｒ遮断剤は、同時または逐次的に投与され得る。
ＣＸＣＲ２阻害剤としては、ＣＸＣＲ２阻害剤の薬学的に許容される塩およびＣＸＣＲ２の抗体阻害剤が挙げられる。ＡＴ１Ｒ遮断剤としては、ＡＴ１Ｒ遮断剤の薬学的に許容される塩およびＡＴ１Ｒの抗体遮断剤が挙げられる。ＣＸＣＲ２阻害剤およびＡＴ１Ｒ遮断剤は、同じ活性剤、例えば、二重特異性抗体であってもよい。好ましくは、ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、直接ＣＸＣＲ２アンタゴニスト、ネガティブアロステリックＣＸＣＲ２モジュレーター、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストまたはアロステリックインバースアゴニストである。
本発明は、状態もしくは疾患の処置、改善または予防のための方法であって、
ｉ）対象に治療有効量の（ａ）アンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）遮断剤および（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）経路阻害剤の組合せを投与するステップ
を含む、方法をさらに提供する。
本発明は、状態もしくは疾患の処置または予防のための剤形の製造のための、（ａ）少なくとも１つのアンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）遮断剤および（ｂ）少なくとも１つのＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）経路阻害剤の使用も提供する。
本発明は、状態もしくは疾患の処置、改善または予防のためのキットであって、
ａ）少なくとも１つのアンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）遮断剤；
ｂ）少なくとも１つのＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）経路阻害剤；および
ｃ）使用説明書
を含む、キットを提供する。
本発明は、疾患の処置、改善または予防のための製剤における使用のための、少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤および少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤を提供する。
本発明は、疾患の処置、改善または予防のための製剤における使用のための少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤であって、対象に、少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤と同時または逐次的に投与される、少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤を提供する。
本発明は、疾患の処置、改善または予防のための製剤における使用のための少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤であって、対象に、少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤と同時または逐次的に投与される、少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤を提供する。
本発明のさらなる特徴を、いくつかの非限定的なその実施形態の以下の説明においてより完全に記載する。この説明は、単に、本発明を例証する目的で含まれる。上記に提示した本発明の広範な概要、開示または説明に対する限定として理解されるべきではない。すべての生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）シグナルを、３７℃で、一過性でトランスフェクトされたヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３ＦＴ細胞から測定したこと、およびこれらの実験では、ｐｃＤＮＡ３が、ｃＤＮＡレベルを同じに保つことが必要な場合に、共トランスフェクトされたことに留意し、この説明は、添付の図面を参照して行われる。
図１Ａは、１０－７Ｍ（１００ｎＭ）のＣＸＣＬ８もしくは１０－６Ｍ（１μＭ）のＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、発現した赤血球凝集素エピトープタグ化ＡＴ１Ｒ（ＨＡ－ＡＴ１Ｒ）なしで、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８（Ｒｌｕｃ８で標識されたＣＸＣＲ２）およびＶｅｎｕｓ／ｍＧｓｉ（Ｖｅｎｕｓで標識されたＧｉ活性のためのセンサーとしてのｍＧｓｉ）を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１Ｂは、１０－７Ｍ（１００ｎＭ）のＣＸＣＬ８もしくは１０－６Ｍ（１μＭ）のＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図２Ａは、ＡＴ１Ｒ ｃＤＮＡ（７５０ｎｇ）およびＣＸＣＲ２ ｃＤＮＡ（２５０ｎｇ）で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において、示されたＣＸＣＬ８の濃度の範囲もしくは示されたＡｎｇＩＩの濃度の範囲、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８との組合せにおける示されたＡｎｇＩＩの濃度の範囲のいずれかによる処理後のＤ－ｍｙｏ－イノシトール１－リン酸（ＩＰ１）の蓄積についての濃度応答曲線を示す。
図２Ｂは、ＣＸＣＲ２を安定に発現し、ＡＴ１Ｒ ｃＤＮＡ（５００ｎｇ）で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において、示されたＣＸＣＬ８の濃度の範囲もしくは示されたＡｎｇＩＩの濃度の範囲、または１ｎＭのＣＸＣＬ８との組合せにおける示されたＡｎｇＩＩの濃度の範囲のいずれかによる処理後のＤ－ｍｙｏ－イノシトール１－リン酸（ＩＰ１）の蓄積についての濃度応答曲線を示す。
図３は、細胞内のマーカーの局在化および受容体輸送の簡略化された略図を示す（Ｔｉｕｌｐａｋｏｖ ｅｔ ａｌ （２０１６） Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ３０， ８８９－９０４において公開）。リガンド誘導輸送を、目的のＲｌｕｃ８タグ化タンパク質を使用して、細胞膜マーカーのＶｅｎｕｓ／Ｋｒａｓ（Ｋ－ｒａｓ）または細胞内コンパートメントマーカーのＲａｂ：初期エンドソームについてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ５（５）；初期エンドソームリサイクリングについてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ４（４）；リサイクリングエンドソームについてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１１ａ（１１）；後期エンドソーム／リソソームについてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ７（７）；トランスゴルジ網への後期エンドソーム輸送についてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ９（９）；シスゴルジへの小胞体輸送についてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１（１）；ゴルジ装置およびトランスゴルジ網についてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ６（６）；もしくは細胞膜へのトランスゴルジ網についてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ８（８）でＢＲＥＴを介して近接度を測定することによって、モニターした。
図４Ａは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＨＡ－ＡＴ１ＲなしでＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｋｒａｓを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｂは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ＫｒａｓおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｃは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＨＡ－ＡＴ１ＲなしでＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｄは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ１およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｅは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＨＡ－ＡＴ１ＲなしでＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ４を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｆは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ４およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｇは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＨＡ－ＡＴ１ＲなしでＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ５を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｈは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｉは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＨＡ－ＡＴ１ＲなしでＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ６を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｊは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ６およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｋは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＨＡ－ＡＴ１ＲなしでＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ７を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｌは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ７およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｍは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＨＡ－ＡＴ１ＲなしでＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ８を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｎは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ８およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｏは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＨＡ－ＡＴ１ＲなしでＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ９を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｐは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ９およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｑは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＨＡ－ＡＴ１ＲなしでＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１１ａを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図４Ｒは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ１１ａおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ａは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、非標識ＣＸＣＲ２なしでＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｋｒａｓを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｂは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｋｒａｓおよび非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｃは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、非標識ＣＸＣＲ２なしでＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｄは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ１および非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｅは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、非標識ＣＸＣＲ２なしでＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ４を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｆは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ４および非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｇは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、非標識ＣＸＣＲ２なしでＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ５を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｈは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５および非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｉは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、非標識ＣＸＣＲ２なしでＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ６を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｊは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ６および非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｋは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、非標識ＣＸＣＲ２なしでＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ７を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｌは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ７および非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｍは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、非標識ＣＸＣＲ２なしでＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ８を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｎは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ８および非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｏは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、非標識ＣＸＣＲ２なしでＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ９を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｐは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ９および非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｑは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、非標識ＣＸＣＲ２なしでＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１１ａを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図５Ｒは、１００ｎＭのＣＸＣＬ８もしくは１μＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ１１ａおよび非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図６Ａは、ビヒクルによる事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図６Ｂは、ＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図６Ｃは、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図６Ｄは、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図６Ｅは、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図６Ｆは、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシンによる事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図７Ａは、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタンによる事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図７Ｂは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのイルベサルタンおよびＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図７Ｃは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのイルベサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図７Ｄは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのイルベサルタンおよびＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図７Ｅは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのイルベサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図７Ｆは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのイルベサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシンの両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図８Ａは、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのオルメサルタンによる事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図８Ｂは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのオルメサルタンおよびＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図８Ｃは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのオルメサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図８Ｄは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのオルメサルタンおよびＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図８Ｅは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのオルメサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図８Ｆは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのオルメサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシンの両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図９Ａは、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのカンデサルタンによる事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図９Ｂは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのカンデサルタンおよびＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図９Ｃは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのカンデサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図９Ｄは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのカンデサルタンおよびＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図９Ｅは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのカンデサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図９Ｆは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのカンデサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシンの両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１０Ａは、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのバルサルタンによる事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１０Ｂは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのバルサルタンおよびＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１０Ｃは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのバルサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１０Ｄは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのバルサルタンおよびＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１０Ｅは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのバルサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１０Ｆは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのバルサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシンの両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１１Ａは、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのエプロサルタンによる事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１１Ｂは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのエプロサルタンおよびＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１１Ｃは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのエプロサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１１Ｄは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのエプロサルタンおよびＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１１Ｅは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのエプロサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１１Ｆは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのエプロサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシンの両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１２Ａは、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのアジルサルタンによる事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１２Ｂは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのアジルサルタンおよびＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１２Ｃは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのアジルサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１２Ｄは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのアジルサルタンおよびＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１２Ｅは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのアジルサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１２Ｆは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのアジルサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシンの両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１３Ａは、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのロサルタンによる事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１３Ｂは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのロサルタンおよびＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１３Ｃは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのロサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１３Ｄは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのロサルタンおよびＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１３Ｅは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのロサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１３Ｆは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのロサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシンの両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１４Ａは、ＡＴ１ＲアンタゴニストのＥＸＰ３１７４（ロサルタンの活性代謝物）による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１４Ｂは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのＥＸＰ３１７４（ロサルタンの活性代謝物）およびＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１４Ｃは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのＥＸＰ３１７４（ロサルタンの活性代謝物）およびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１４Ｄは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのＥＸＰ３１７４（ロサルタンの活性代謝物）およびＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１４Ｅは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのＥＸＰ３１７４（ロサルタンの活性代謝物）およびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１４Ｆは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのＥＸＰ３１７４（ロサルタンの活性代謝物）およびＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシンの両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１５Ａは、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのテルミサルタンによる事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１５Ｂは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのテルミサルタンおよびＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１５Ｃは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのテルミサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１５Ｄは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのテルミサルタンおよびＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１５Ｅは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのテルミサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９の両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１５Ｆは、組み合わされたＡＴ１ＲアンタゴニストのテルミサルタンおよびＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシンの両方による事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１６Ａは、ビヒクルによる事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ＫｒａｓおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１６Ｂは、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）による事前処理の５０分後、１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ＫｒａｓおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１６Ｃは、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ＫｒａｓおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１６Ｄは、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；ＳＣＨ）、アンタゴニストのＳＢ２２５００２（ＳＢ２２）またはアロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（ＳＢ２６）による事前処理の５０分後、１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ＫｒａｓおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１６Ｅは、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；ＳＣＨ）、アンタゴニストのＳＢ２２５００２（ＳＢ２２）またはアロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（ＳＢ２６）による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ＫｒａｓおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１６Ｆは、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；ＳＣＨ）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ＫｒａｓおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１６Ｇは、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（ＳＢ２２）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ＫｒａｓおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１６Ｈは、ＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（ＳＢ２６）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ＫｒａｓおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１７Ａは、ビヒクルによる事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１７Ｂは、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）による事前処理の５０分後、１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１７Ｃは、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１７Ｄは、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；ＳＣＨ）、アンタゴニストのＳＢ２２５００２（ＳＢ２２）またはアロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（ＳＢ２６）による事前処理の５０分後、１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１７Ｅは、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；ＳＣＨ）、アンタゴニストのＳＢ２２５００２（ＳＢ２２）またはアロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（ＳＢ２６）による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１７Ｆは、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；ＳＣＨ）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１７Ｇは、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（ＳＢ２２）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１７Ｈは、ＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（ＳＢ２６）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１８Ａは、ビヒクルによる事前処理の５０分後、ビヒクル、または１０ｎＭのＣＸＣＬ８のみ、または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ８およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１８Ｂは、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）による事前処理の５０分後、１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ８およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１８Ｃは、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ８およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１８Ｄは、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；ＳＣＨ）、アンタゴニストのＳＢ２２５００２（ＳＢ２２）またはアロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（ＳＢ２６）による事前処理の５０分後、１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ８およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１８Ｅは、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；ＳＣＨ）、アンタゴニストのＳＢ２２５００２（ＳＢ２２）またはアロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（ＳＢ２６）による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ８およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１８Ｆは、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；ＳＣＨ）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ８およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１８Ｇは、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（ＳＢ２２）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ８およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１８Ｈは、ＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（ＳＢ２６）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ８およびＨＡ－ＡＴ１Ｒを発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１９Ａは、ビヒクル、またはＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）もしくはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかによる事前処理の５０分後、ビヒクルまたは１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみによる処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｋｒａｓおよび非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１９Ｂは、ビヒクル、またはＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）もしくはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかによる事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｋｒａｓおよび非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１９Ｃは、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；ＳＣＨ）、アンタゴニストのＳＢ２２５００２（ＳＢ２２）、アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（ＳＢ２６）、アンタゴニストのＡＺＤ５０６９（ＡＺＤ）またはアンタゴニストのダニリキシン（Ｄｎｒｘ）による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｋｒａｓおよび非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１９Ｄは、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；ＳＣＨ）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｋｒａｓおよび非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１９Ｅは、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（ＳＢ２２）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｋｒａｓおよび非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図１９Ｆは、ＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（ＳＢ２６）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｋｒａｓおよび非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図２０Ａは、ビヒクル、またはＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）もしくはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかによる事前処理の５０分後、ビヒクルまたは１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみによる処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５および非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図２０Ｂは、ビヒクル、またはＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）もしくはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかによる事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５および非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図２０Ｃは、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；ＳＣＨ）、アンタゴニストのＳＢ２２５００２（ＳＢ２２）、アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（ＳＢ２６）、アンタゴニストのＡＺＤ５０６９（ＡＺＤ）またはアンタゴニストのダニリキシン（Ｄｎｒｘ）による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５および非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図２０Ｄは、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；ＳＣＨ）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５および非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図２０Ｅは、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（ＳＢ２２）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５および非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
図２０Ｆは、ＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（ＳＢ２６）およびＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン（Ｉｒｂ）、バルサルタン（Ｖａｌ）またはアジルサルタン（Ａｚｉｌ）のいずれかの両方による事前処理の５０分後、組み合わされた１０ｎＭのＣＸＣＬ８および１００ｎＭのＡｎｇＩＩの両方による処理後に、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ５および非標識ＣＸＣＲ２を発現する細胞からのＢＲＥＴシグナルを示す。
発明の説明
本発明の詳細な説明
本発明は、予想外にも、アンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ；ＡＴ１Ｒ）およびＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）の間のヘテロマー会合を特定した。これらの受容体は両方とも、独立して、ＣＯＰＤの病態生理学に関与している（Ｔｒａｖｅｓ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＸＣ ｂｕｔ ｎｏｔ ＣＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｃａｕｓｅ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ＣＯＰＤ： ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＣＸＣＲ２． Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ７６， ４４１－４５０）。ＣＸＣＲ２が、好中球走化性を低減し、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）における粘液生成および気道炎症を低減することが以前に見出されている。しかしながら、ＣＯＰＤの処置におけるＣＸＣＲ２阻害剤の有効性は、臨床研究の間に失望されていた。
任意の理論によってとらわれないが、ＣＸＣＲ２阻害剤がＣＯＰＤを処置することができないのは、ＣＸＣＲ２およびＡＴ１Ｒのヘテロマーの性質に起因すると考えられる。
組成物
本発明は、
ａ）少なくとも１つのアンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）遮断剤；および
ｂ）少なくとも１つのＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）経路阻害剤
を含む医薬製剤を提供する。
ＡＴ１Ｒ遮断剤は、ＡＴ１Ｒを阻害または部分的に阻害する。好ましくは、ＡＴ１Ｒ遮断剤は、ＡＴ１Ｒと直接相互作用し、ＡＴ１Ｒの上流で作用して、機能性リガンドの発生を防止するが、ＡＴ１Ｒそれ自体と相互作用しないアンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥｉ）の治療薬などの治療薬を含まない。
「ＡＴ１Ｒ遮断剤」という用語は、ＡＴ１Ｒ遮断剤の薬学的に許容される塩を含む。あるいは、ＡＴ１Ｒ遮断剤は、ＡＴ１Ｒの抗体遮断剤であってもよい。
ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、ＣＸＣＲ２および／もしくはＣＸＣＲ２シグナル伝達経路を阻害または部分的に阻害する。例えば、ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、ＣＸＣＲ２のシグナル伝達に関連する経路のいずれか１つを阻害または部分的に阻害する任意の化合物または薬剤を含み得、ケモカイン受容体それ自体以外のＣＸＣＲ２経路の構成成分を阻害する化合物または薬剤を含む。ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、限定されるものではないが、ＣＸＣＲ２もしくはＣＸＣＲ２以外のＣＸＣＲ２経路の構成成分のアンタゴニスト、ＣＸＣＲ２もしくはＣＸＣＲ２以外のＣＸＣＲ２経路の構成成分のインバースアゴニスト、またはＣＸＣＲ２もしくはＣＸＣＲ２以外のＣＸＣＲ２経路の構成成分のネガティブアロステリックモジュレーターであってもよい。
ＣＸＣＲ２のインバースアゴニストはまた、ＣＸＣＲ２のネガティブアロステリックモジュレーターであり得る。そのような場合では、これは、ＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストと称され得る。
ＣＸＣＲ２阻害剤は、異なるシグナル伝達経路に対するアンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用し得る。例えば、ＣＸＣＲ２阻害剤は、１つのシグナル伝達経路に対するＣＸＣＲ２アンタゴニスト、および別のシグナル伝達経路に対するＣＸＣＲ２インバースアゴニストであり得る。
ＣＸＣＲ２インバースアゴニストは、インバースアゴニストとしての定義を可能にするために、構成的活性が、評価されるシグナル伝達経路について明白ではない場合ＣＸＣＲ２アンタゴニストとして分類され得る。
ＣＸＣＲ２ネガティブアロステリックモジュレーターは、それが、ＣＸＣＲ２を阻害するが、結合様式が明確に定義されていない（オルソステリック対アロステリック）、または認識されていない場合に、ＣＸＣＲ２アンタゴニストとして分類され得る。
好ましくは、ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、ＣＸＣＲ２経路の上流または下流の構成成分よりもむしろ、受容体それ自体を直接阻害する。
「ＣＸＣＲ２阻害剤」という用語は、ＣＸＣＲ２阻害剤の薬学的に許容される塩を含む。あるいは、ＣＸＣＲ２阻害剤は、ＣＸＣＲ２の抗体阻害剤であってもよい。
ＣＸＣＲ２阻害剤およびＡＴ１Ｒ遮断剤は、同じ活性剤、例えば、二重特異性抗体であってもよい。
医薬製剤は、必要に応じて、賦形剤、溶剤、担体および他の薬学的に許容される成分を含み得る。
「構成成分」という用語は、本発明の医薬製剤の文脈において本明細書で使用される場合、ＡＴ１Ｒ遮断剤またはＣＸＣＲ２経路阻害剤のいずれかを意味する。
「阻害する」という用語は、本明細書で使用される場合、参照と比較して、検出限界を下回る低減を意味する。この語句は、望ましくない結果を防止するために、作用を遮断すること、遅らせること、または妨げることを含む。
「部分的に阻害する」という用語は、本明細書で使用される場合、参照と比較して、検出限界以内の任意の低減を意味する。この語句は、望ましくない結果を防止するために、作用を遮断すること、遅らせること、または妨げることを含む。
ＣＸＣケモカイン受容体２
ＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）は、Ｇタンパク質共役受容体である。
「ＣＸＣＲ２経路阻害剤」という語句は、ＣＸＣＲ２に関連する経路のいずれか１つを阻害または部分的に阻害する任意の化合物または薬剤を含むことを意図し、ケモカイン受容体それ自体以外のＣＸＣＲ２経路の構成成分を阻害する化合物または薬剤を含む。例えば、阻害剤は、ＣＸＣＲ２に関連するタンパク質を阻害または部分的に阻害し得るか、あるいはＣＸＣＲ２それ自体の前およびもしくは後の化合物または経路のステップを阻害し得る。好ましくは、ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、ＣＸＣＲ２アンタゴニスト、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストまたはＣＸＣＲ２ネガティブアロステリックモジュレーターである。
「ＣＸＣＲ２以外のＣＸＣＲ２経路の構成成分」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＸＣＲ２によって引き起こされる上記に列挙された経路のいずれか１つの構成成分を含むものとして理解されるべきであり、ここで、構成成分は、それ自体がＣＸＣＲ２ではない。好ましくは、構成成分は、限定されるものではないが、形質導入タンパク質またはシグナル伝達タンパク質などのタンパク質である。ケモカイン受容体経路の構成成分は、ＣＸＣＲ２と直接相互作用してもよい。あるいは、ケモカイン受容体経路の構成成分は、タンパク質－タンパク質相互作用または複合体形成を経由して、ＣＸＣＲ２と間接的に相互作用してもよい。あるいは、ケモカイン受容体経路の構成成分は、当技術分野において公知であるものなどのシグナル伝達カスケードを経由して、ＣＸＣＲ２と間接的に相互作用してもよい。
ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、直接ＣＸＣＲ２アンタゴニスト、インバースＣＸＣＲ２アゴニスト、ネガティブアロステリックＣＸＣＲ２モジュレーター、アロステリックインバースＣＸＣＲ２アゴニスト、間接ＣＸＣＲ２アンタゴニスト、間接インバースＣＸＣＲ２アゴニスト、および間接ネガティブアロステリックＣＸＣＲ２モジュレーターを含む群から選択されてもよい。好ましくは、ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、ＣＸＣＲ２アンタゴニスト、ＣＸＣＲ２インバースアゴニスト、ＣＸＣＲ２ネガティブアロステリックモジュレーターまたはＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストである。好ましくは、ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、直接ＣＸＣＲ２アンタゴニスト、ネガティブアロステリックＣＸＣＲ２モジュレーター、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストまたはＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストである。
好ましい一実施形態では、ケモカイン受容体経路阻害剤は、
ｉ）ＣＸＣＲ２またはＣＸＣＲ２以外のＣＸＣＲ２経路の構成成分のアンタゴニスト；
ｉｉ）ＣＸＣＲ２またはＣＸＣＲ２以外のＣＸＣＲ２経路の構成成分のインバースアゴニスト；
ｉｉｉ）ＣＸＣＲ２またはＣＸＣＲ２以外のＣＸＣＲ２経路の構成成分のネガティブアロステリックモジュレーター
からなる群から選択される。
「ＣＸＣＲ２阻害剤」という用語は、ＣＸＣＲ２阻害剤の薬学的に許容される塩を含む。あるいは、ＣＸＣＲ２阻害剤は、ＣＸＣＲ２の抗体阻害剤であってもよい。
ＣＸＣＲ２の公知のアンタゴニストとしては、レペルタキシン（レパリキシン）、ダニリキシン（ＧＳＫ１３２５７５６）、ＡＺＤ５０６９、ＳＢ２２５００２およびエルブリキシンが挙げられる。
ＣＸＣＲ２の公知のインバースアゴニストとしては、ＳＢ２６５６１０およびナバリキシン（ＭＫ－７１２３；ＳＣＨ５２７１２３）が挙げられる。
ＣＸＣＲ２の公知のネガティブアロステリックモジュレーターとしては、ＳＢ２６５６１０が挙げられる。
好ましい一実施形態では、ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、ＣＸＣＲ２のアンタゴニストである。例えば、ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、レペルタキシン、ダニリキシン（ＧＳＫ１３２５７５６）、ＡＺＤ５０６９、ＳＢ２２５００２およびエルブリキシンを含む群から選択されてもよい。
好ましい一実施形態では、ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、ＣＸＣＲ２のインバースアゴニストである。例えば、ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、ＳＢ２６５６１０（Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ （２００９） Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １５８， ３２８－３３８）およびナバリキシン（ＭＫ－７１２３；ＳＣＨ５２７１２３； Ｋｒｅｄｅｌ ｅｔ ａｌ （２００９） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ １４， １０７６－１０９１）を含む群から選択されてもよい。
好ましい一実施形態では、ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、ＣＸＣＲ２のネガティブアロステリックモジュレーターである。例えば、ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、ＳＢ２６５６１０（Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ （２００９） Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １５８， ３２８－３３８）を含む群から選択されてもよい。
アンジオテンシン１型受容体
アンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ、ＡＴ１Ｒ、アンジオテンシンＩＩ受容体１型）は、Ｇタンパク質共役受容体である。
「アンジオテンシン１型受容体阻害剤」（アンジオテンシン受容体遮断剤またはＡＲＢとも称する）という語句は、ＡＴ１Ｒの活性を阻害または部分的に阻害することができる薬剤または化合物を意味することが理解される。これは、ＡＴ１Ｒに対するアンタゴニスト、インバースアゴニストおよびネガティブアロステリックモジュレーターを含む。
「ＡＴ１Ｒ遮断剤」という用語は、ＡＴ１Ｒ遮断剤の薬学的に許容される塩を含む。あるいは、ＡＴ１Ｒ遮断剤は、ＡＴ１Ｒの抗体遮断剤であってもよい。
例えば、ＡＴ１Ｒ遮断剤は、イルベサルタン（例えば、Ａｖａｐｒｏ（登録商標））、エプロサルタン（例えば、Ｔｅｖｅｔｅｎ（登録商標））、ロサルタン（例えば、Ｃｏｚａａｒ（登録商標））、バルサルタン（例えば、Ｄｉｏｖａｎ（登録商標））、テルミサルタン（例えば、Ｍｉｃａｒｄｉｓ（登録商標））、カンデサルタン（例えば、Ａｔａｃａｎｄ（登録商標））、オルメサルタン（例えば、Ｂｅｎｉｃａｒ（登録商標））、アジルサルタン（例えば、Ｅｄａｒｂｉ（登録商標））およびＺＤ－７１１５を含む群から選択されてもよい。例として、アンジオテンシン受容体阻害剤は、イルベサルタンであってもよい。
ＣＸＣＲ２阻害剤およびＡＴ１Ｒ遮断剤は両方とも、同じ活性剤、例えば、二重特異性抗体であってもよい。
ＡＴ１Ｒ遮断剤およびＣＸＣＲ２阻害剤は両方とも、それぞれの活性剤の薬学的に許容される塩であってもよい。薬学的および獣医学的に許容される塩としては、本開示の化合物の生物学的な有効性および特性を保持し、生物学的にまたは他に望ましくないものではない、塩が挙げられる。多くの場合では、本明細書に開示される化合物は、アミノ基および／もしくはカルボキシル基、またはそれらに類似する基の存在のおかげで、酸および／または塩基の塩を形成することができる。許容される塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基から調製することができる。無機塩基に由来する塩としては、単なる例として、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウムの塩が挙げられる。有機塩基に由来する塩としては、限定されるものではないが、第１級、第２級および第３級アミン、例えば、単なる例として、アルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、置換アルキルアミン、ジ（置換アルキル）アミン、トリ（置換アルキル）アミン、アルケニルアミン、ジアルケニルアミン、トリアルケニルアミン、置換アルケニルアミン、ジ（置換アルケニル）アミン、トリ（置換アルケニル）アミン、シクロアルキルアミン、ジ（シクロアルキル）アミン、トリ（シクロアルキル）アミン、置換シクロアルキルアミン、ジ置換シクロアルキルアミン、トリ置換シクロアルキルアミン、シクロアルケニルアミン、ジ（シクロアルケニル）アミン、トリ（シクロアルケニル）アミン、置換シクロアルケニルアミン、ジ置換シクロアルケニルアミン、トリ置換シクロアルケニルアミン、アリールアミン、ジアリールアミン、トリアリールアミン、ヘテロアリールアミン、ジヘテロアリールアミン、トリヘテロアリールアミン、複素環アミン、ジ複素環アミン、トリ複素環アミン、アミン上の少なくとも２個の置換基が異なり、かつアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環などからなる群から選択される混合ジアミンおよびトリアミンが挙げられる。２個または３個の置換基が、アミノ窒素と一緒に、複素環基またはヘテロアリール基を形成するアミンも含まれる。
薬学的および獣医学的に許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸から調製され得る。使用することができる無機酸としては、単なる例として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。使用することができる有機酸としては、単なる例として、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸などが挙げられる。
本開示で有用な化合物の薬学的または獣医学的に許容される塩は、従来の化学方法によって、塩基部分または酸部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離の酸または塩基の形態を、水中、有機溶媒中、またはその２つの混合物中、化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好適な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． １７ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ． （１９８５）， ｐ． １４１８に見出され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。そのような許容される塩の例は、ヨウ化物、酢酸塩、フェニル酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アクリル酸塩（ａｃｒｙｌ ａｔｅ）、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ｏ－アセトキシ安息香酸塩、ナフタレン－２－安息香酸塩、臭化物、イソ酪酸塩、フェニル酪酸塩、γ－ヒドロキシ酪酸塩、β－ヒドロキシ酪酸塩、ブチン－１，４－ジオエート、ヘキシン－１，４－ジオエート、ヘキシン－１，６－ジオエート、カプロン酸塩、カプリル酸塩、塩化物、ケイ皮酸塩、クエン酸塩、デカン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘプタン酸塩、馬尿酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、ニコチン酸塩、イソニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、プロピオル酸塩、プロピオン酸塩、フェニルプロピオン酸塩、サリチル酸塩、セバシン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、ピロ硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、スルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－ブロモフェニルスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩（ｍｅｒｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ナフタレン－１－スルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、酒石酸塩などである。
状態または疾患
好ましくは、ＣＸＣＲ２経路阻害剤および／またはＡＴ１Ｒ遮断剤は、状態または疾患に関連する。より好ましくは、状態または疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。ＣＯＰＤは、肺気腫、慢性気管支炎、気管支拡張症および難治性（不可逆性）喘息を含む進行性の肺疾患を記載するために使用される包括的な用語である。これらの疾患は、肺における空気流の制限に起因する息切れの増加によって特徴付けられる。
阻害の測定
（ｉ）ＣＸＣＲ２経路阻害剤、（ｉｉ）ＡＴ１Ｒ遮断剤もしくは（ｉｉｉ）ＣＸＣＲ２経路阻害剤およびＡＴ１Ｒ遮断剤の両方の組合せによって引き起こされる、ＣＸＣＲ２経路および／またはＡＴ１Ｒの阻害または部分的な阻害は、本明細書に提示されるｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を使用して測定され得、限定されるものではないが、ＣＸＣＲ２を発現する好中球および当技術分野において公知のものなどの他の細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ走化性移動の評価のための生化学アッセイまたは細胞アッセイ、ならびにイノシトールリン酸産生、細胞外制御キナーゼ（ＥＲＫ）リン酸化、ｃＡＭＰ産生、無標識技術（インピーダンス、光屈折または電荷再分配を使用するなど）、近接レポーター系または他のアプローチを使用するＧタンパク質共役、β－アレスチン動員またはβ－アレスチン媒介シグナル伝達、転写因子に基づくレポーター系、蛍光標識を使用する顕微鏡可視化、受容体細胞局在化を評価するための抗体の使用（酵素結合免疫吸着検定法など）、細胞局在化および輸送を評価するための生物発光共鳴エネルギー移動の使用、および蛍光標識細胞分取が挙げられる。
（ｉ）ＣＸＣＲ２経路阻害剤、（ｉｉ）ＡＴ１Ｒ遮断剤もしくは（ｉｉｉ）ＣＸＣＲ２経路阻害剤およびＡＴ１Ｒ遮断剤の両方の組合せによって引き起こされる、ＣＸＣＲ２経路および／またはＡＴ１Ｒの阻害または部分的な阻害は、本明細書に提示されるｉｎ ｖｉｖｏ方法を使用して測定され得、限定されるものではないが、肺滲出液の細胞含有量およびサイトカイン含有量の測定、肺活量測定に基づく試験を使用する肺機能の身体能力、または血液ガスもしくは他の生化学的測定値の測定を使用して測定される肺機能出力、または歩行試験などの量的方法もしくは患者が報告する結果の評価などの質的方法によって測定される臨床的利点を含む機能的利点の改善を含む肺機能の測定が挙げられる。阻害または部分的阻害は、上記で述べたエンドポイントの１つまたは複数によって測定される肺構造の質的な改善によって示されてもよい。
好ましい一実施形態では、医薬製剤の総有効性は、いずれかの構成成分が他の構成成分の任意の投与なしで投与される場合のＡＴ１Ｒ遮断剤またはＣＸＣＲ２経路阻害剤の有効性と比較して高い。したがって、組合せ製剤は、多くの場合、単一化合物として投与される可能性がある２つの構成成分のいずれかよりも少ない、治療量以下の用量を含む単一用量で投与されてもよい。
好ましくは、医薬製剤の総有効性は、いずれかの構成成分が他の構成成分の任意の投与なしで投与される場合のＡＴ１Ｒ遮断剤およびＣＸＣＲ２経路阻害剤の有効性の合計と比較して高い。より好ましくは、有効性の相乗効果は、ＡＴ１Ｒ遮断剤およびＣＸＣＲ２経路阻害剤が同時または逐次的に投与される場合に観察される。
あるいは、医薬製剤の総有効性は、いずれかの構成成分が他の構成成分の任意の投与なしで投与される場合のＡＴ１Ｒ遮断剤およびＣＸＣＲ２経路阻害剤の有効性の合計と等しい。この代替のさらに好ましい実施形態として、有効性の相加効果は、ＡＴ１Ｒ遮断剤およびＣＸＣＲ２経路阻害剤が同時または逐次的に投与される場合に観察される。
さらなる代替では、医薬製剤の総有効性は、いずれかの構成成分が他の構成成分の任意の投与なしで投与される場合のＡＴ１Ｒ遮断剤およびＣＸＣＲ２経路阻害剤の有効性の合計よりも低い。さらなる実施形態では、組合せの有効性は、それぞれの構成成分が他の構成成分の任意の投与なしで投与される場合のＡＴ１Ｒ遮断剤およびＣＸＣＲ２経路阻害剤の有効性の合計よりも低いが、処置は、単独で投与されるＡＴ１Ｒ遮断剤またはＣＸＣＲ２経路阻害剤の単一処置と比較して高い有効性を提供する。
好ましくは、２つの構成成分は、同じ時に同時に（例えば、一緒に摂取される２つの錠剤として、またはそれぞれの構成成分で製剤化された単一錠剤として）、または逐次的に（例えば、１つの錠剤が摂取され、その後別の錠剤が摂取される）、投与される。それぞれの構成成分の用量は、一緒に（同時に）または逐次的に摂取され得、互いに、数秒以内、数分以内、数日以内、数週間以内、または数か月以内に摂取され得る。
本発明の組合せの１つの構成成分は、例えば、標準治療処置として、対象に既に投与されていてもよい。そのような場合では、本発明の組合せの第２の構成成分は、本発明の治療用組合せを提供するために、治療中に第２の構成成分として投与される。
処置の方法
本発明は、状態もしくは疾患の処置、改善または予防のための方法であって、
ｉ）対象に治療有効量の（ａ）アンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）遮断剤および（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）経路阻害剤の組合せを投与するステップ
を含む、方法をさらに提供する。
処置される対象は、好ましくは、ヒト哺乳動物を含む、哺乳動物である。
好ましくは、処置、改善もしくは予防される状態または疾患は、ＣＯＰＤである。好ましくは、ＣＯＰＤは、肺気腫、慢性気管支炎、気管支拡張症および難治性（不可逆性）喘息から選択される。
ＣＸＣＲ２阻害剤およびＡＴ１Ｒ遮断剤は、同じ剤形中で、または別々の剤形中で投与され得る。
ＣＸＣＲ２阻害剤および／またはＡＴ１Ｒ遮断剤は、それぞれの受容体の抗体阻害剤または遮断剤であってもよい。ＣＸＣＲ２阻害剤およびＡＴ１Ｒ遮断剤は、同じ活性剤、例えば、二重特異性抗体であってもよい。ＣＸＣＲ２阻害剤および／またはＡＴ１Ｒ遮断剤は、ＣＸＣＲ２阻害剤および／またはＡＴ１Ｒ遮断剤の薬学的に許容される塩であってもよい。
ＣＸＣＲ２阻害剤およびＡＴ１Ｒ遮断剤は、同時または逐次的に投与され得る。
本発明の組合せの１つの構成成分は、例えば、標準治療処置として、対象に既に投与されていてもよい。そのような場合では、本発明の組合せの第２の構成成分は、本発明の治療用組合せを提供するために、治療中に第２の構成成分として投与される。
任意の特定の作用機序に制限されることを意図しないが、好ましい一態様では、ＣＸＣＲ２阻害剤は、ＣＸＣＲ２がアンジオテンシン受容体ＡＴ１Ｒに会合するときにＣＸＣＲ２と相互作用する場合またはその下流の経路をモジュレートする場合に、より高い親和性および／または効力および／または有効性を有する。例えば、ＣＸＣＲ２およびアンジオテンシン受容体ＡＴ１Ｒは、ＣＸＣＲ２／ＡＴ１Ｒヘテロマーとして会合し得る。
好ましくは、本発明の組合せは、いずれか１つを単独で使用する場合よりも低い用量のＡＴ１ＲまたはＣＸＣＲ２阻害剤を提供する。例えば、ＡＴ１ＲまたはＣＸＣＲ２阻害剤の一方または両方は、治療量以下の用量で提供されてもよい。これは、ＣＯＰＤに対する同じ治療利益を有しながら、ＡＴ１ＲまたはＣＸＣＲ２阻害剤のネガティブな安全性プロファイルを低減する利益を有するだろう。
さらに好ましい実施形態では、ＣＸＣＲ２阻害剤が、対象に、ＡＴ１Ｒ遮断剤と同時または逐次的に投与される場合、組み合わされた親和性、効力および／または有効性は、ＣＸＣＲ２阻害剤がＡＴ１Ｒ遮断剤と組み合わせて（同時または逐次的であるかにかかわらず）投与されない場合に達成されるであろう親和性、効力および／または有効性と比較して高い。さらにより好ましい実施形態では、相乗効果（親和性、効力および／または有効性によって測定される）は、ＣＸＣＲ２阻害剤が、対象に、ＡＴ１Ｒ遮断剤と組み合わせて（同時または逐次的であるかにかかわらず）投与される場合に達成される。
任意の特定の作用機序に制限されることを意図しないが、好ましい一態様では、ＡＴ１Ｒ遮断剤は、アンジオテンシン受容体ＡＴ１ＲがＣＸＣＲ２に会合するときにアンジオテンシン受容体ＡＴ１Ｒと相互作用する場合に、より高い親和性および／または効力および／または有効性を有する。例えば、ＣＸＣＲ２およびアンジオテンシン受容体ＡＴ１Ｒは、ＣＸＣＲ２／ＡＴ１Ｒヘテロマーとして会合し得る。さらに好ましい実施形態では、ＡＴ１Ｒ遮断剤が、対象に、ＣＸＣＲ２阻害剤と同時または逐次的に投与される場合、組み合わされた親和性、効力および／または有効性は、ＡＴ１Ｒ遮断剤がＣＸＣＲ２阻害剤と組み合わせて（同時または逐次的であるかにかかわらず）投与されない場合に達成されるであろう親和性、効力および／または有効性と比較して高い。さらにより好ましい実施形態では、相乗効果（親和性、効力および／または有効性によって測定される）は、ＡＴ１Ｒ遮断剤が、対象に、ＣＸＣＲ２阻害剤と組み合わせて（同時または逐次的であるかにかかわらず）投与される場合に達成される。
送達
本発明によって提供される剤形は、状態もしくは疾患の処置、改善または予防のための剤形の対象への投与のための投薬量の説明書と一緒に、本発明の医薬製剤を含むバイアル、カートリッジ、容器、錠剤またはカプセル剤をさらに含んでいてもよい。
単回投薬量を生成するために担体物質と組み合わせられ得るそれぞれの活性成分の量は、処置される宿主および特定の投与の様式に応じて変わる。例えば、ヒトへの経口投与を対象とする製剤は、約０．５ｍｇ～１ｇのそれぞれの活性化合物と、総製剤の約５～９５パーセントで変わり得る適切かつ好都合な量の担体物質とを含有し得る。単位剤形は、一般に、約０．５ｍｇ～５００ｍｇの活性成分を含有する。
好ましくは、ＡＴ１Ｒ遮断剤は、１または複数の用量で提供される一日当たり５０ｍｇ～５００ｍｇで提供される。さらにより好ましくは、ＡＴ１Ｒ遮断剤は、一日当たり７５ｍｇ～３００ｍｇで提供される。例えば、ＡＴ１Ｒ遮断剤は、イルベサルタンであり、１または複数の用量で提供される一日当たり７５、１５０または３００ｍｇの用量で投与される。
好ましくは、ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、１または複数の用量で提供される一日当たり０．５ｍｇ～２０００ｍｇで提供される。さらにより好ましくは、ＣＸＣＲ２経路阻害剤は、１または複数の用量で提供される一日当たり０．５ｍｇ～５０ｍｇの用量で提供される。
それぞれの活性剤の用量は、単一剤形または２つの別々の剤形のいずれかで提供され得、約５ｍｇ～１ｇのＡＴ１Ｒ遮断剤および約０．５ｍｇ～１ｇのＣＸＣＲ２経路阻害剤を含み得る。２つの活性物の用量は、単一剤形または２つの別々の剤形のいずれかで提供され得、（ｉ）約５０ｍｇ～５００ｍｇのＡＴ１Ｒ遮断剤の一日用量および（ｉｉ）約５ｍｇ～５０ｍｇのＣＸＣＲ２経路阻害剤の一日用量を含み得る。ＡＴ１Ｒ遮断剤は、イルベサルタンであり得、剤形は、約３００ｍｇのイルベサルタンの一日用量を含み得る。
しかしながら、任意の特定の対象に対する具体的な用量レベルは、用いられる具体的な化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康、性別、食事、投与の時間、投与の経路、排出の速度、薬物の組合せおよび治療を受けている特定の状態または疾患の重症度を含む種々の因子に依存することが理解されよう。
本発明の製剤は、さまざまな態様では、注射によって投与されてもよく、または経口、肺、経鼻のため、もしくは投与の任意の他の形態のために調製されてもよい。好ましくは、製剤は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼科的、脳室内、頭蓋内、嚢内、脊髄内、大槽内、腹腔内、頬側、直腸的、経膣、鼻腔内で、またはエアロゾル投与によって、投与される。
投与の様式は、一態様では、製剤が調製される形態のために少なくとも好適である。最も有効な応答のための投与の様式は、経験的に決定され得、下記に記載される投与の手段が、例として与えられ、本発明の製剤の到達のための方法は決して限定されない。提供されるすべての製剤は、一般に製薬産業において使用され、好適には、資格のある開業医に一般に公知である。
注射可能な剤形
本発明の製剤は、ある特定の態様では、薬学的に許容される非毒性の賦形剤および担体を含んでいてもよく、皮下、静脈内および腹腔内注射などの任意の非経口技法によって投与されてもよい。加えて、製剤は、必要に応じて、１つまたは複数のアジュバントを含有していてもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的担体」は、化合物を対象に送達するための、薬学的に許容される溶剤、懸濁化剤、賦形剤またはビヒクルである。担体は、液体または固体であってもよく、計画された投与の方法を考慮して選択される。
注射可能な使用に好適な医薬形態は、必要に応じて、無菌の水性溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末を含む。あるいは、本発明の化合物は、ある特定の態様では、細胞膜を越えるそれらの輸送を支援するために、リポソーム中に封入され、注射可能な溶液中で送達される。あるいは、または加えて、そのような調製物は、細胞膜を越える輸送を容易にするために、自己集合性細孔構造の構成物質を含有する。担体は、さまざまな態様では、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する、溶剤または分散媒である。適した流動性は、例えば、限定されないが、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合では必要な粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持される。注射可能な製剤の持続的吸収は、ある特定の態様では、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの製剤中での使用によってもたらされる。
本発明は、本発明による治療的に有効な医薬製剤および放出遅延剤を含む、注射可能な持続放出医薬製剤も提供する。放出遅延剤は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンであり得る。
無菌の注射可能な溶液は、必要な量の活性化合物を、上記で列挙された１つまたは複数の他の成分とともに適切な溶剤に組み込むこと、必要により、続いて滅菌濾過することによって調製される。一般に、分散剤は、さまざまな滅菌された活性成分を、塩基性分散媒および上記で列挙されたものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合では、調製は、ある特定の態様では、限定されないが、その事前に滅菌濾過された溶液から、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥技法および凍結乾燥技法を含む。
経口剤形
経口固形剤形が本明細書における使用のために企図され、これは、参照により本明細書に組み込まれるＭａｒｔｉｎ， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ． （１９９０ Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ １８０４２） ａｔ Ｃｈａｐｔｅｒ ８９に一般に記載されている。固形剤形としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤もしくはロゼンジ剤、カシェ剤またはペレットが挙げられる。また、リポソーム封入またはプロテノイド封入を、本製剤を製剤化するために使用してもよい（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号に報告されたプロテイノイドミクロスフェアの通り）。リポソーム封入を使用してもよく、リポソームは、さまざまなポリマーで誘導体化されていてもよい（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療薬のための可能な固体剤形の説明は、参照によって本明細書に組み込まれるＭａｒｓｈａｌｌ， ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ １０， Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｒｈｏｄｅｓ ｅｄ．， （１９７９）に与えられている。一般に、製剤は、本発明の一部として記載される化合物（またはその化学的修飾形態）、ならびに胃の環境に対する保護および腸における生物活性物質の放出を可能にする不活性成分を含む。
本発明のＣＸＣＲ２経路阻害剤またはＡＴ１Ｒ遮断剤のために、放出の場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸または回腸）または大腸であり得る。当業者は、胃では溶解しないが、十二指腸または腸における他の場所で物質を放出する、利用可能な製剤を有する。一態様では、放出は、製剤の保護によって、または腸などの胃の環境を越えての化合物の放出によってのいずれかで、胃の環境の悪影響を回避する。
本発明は、本発明による治療的に有効な医薬製剤および放出遅延剤を含む、経口持続放出医薬製剤をさらに提供する。
本発明の一態様では、放出遅延剤は、水溶性、水膨潤性および／または水不溶性のポリマーである。特に、水溶性ポリマーは、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、腸溶コーティングおよび半透膜を含む群から選択される。本発明の別の態様では、放出遅延剤は、非ポリマー放出遅延剤である。より具体的には、非ポリマー放出遅延剤は、硬化ヒマシ油である。本発明の製剤は、当技術分野において公知の従来の手順に従って、粉砕または造粒、錠剤に圧縮され得るか、またはカプセル剤に封入され得る。
完全な胃抵抗性を確実にするために、少なくともｐＨ５．０に対して不浸透性のコーティングが使用される。腸溶コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分の例は、酢酸トリメリット酸セルロース（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ ５０、ＨＰＭＣＰ ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ ＳおよびＳｈｅｌｌａｃである。これらのコーティングは、混合膜として使用されてもよい。
コーティングまたはコーティングの混合物は、錠剤において使用することもでき、これは、胃に対する保護のためを対象としていない。これとしては、限定されないが、糖コーティング、または錠剤の嚥下を容易にするコーティングが挙げられる。例示的なカプセル剤は、乾燥治療薬、すなわち、粉末の送達のための硬シェル（ゼラチンなど）からなり、液体形態のためには、軟ゼラチンシェルが使用されてもよい。カシェ剤のシェル材料は、ある特定の態様では、厚いデンプン、または他の食用紙である。丸剤、ロゼンジ剤、成型錠剤または粉薬錠剤のためには、限定されないが、湿式塊化技法も企図される。
本明細書で使用される場合、「持続放出」という用語は、経口摂取後、治療用化合物の内容物の比較的長期間にわたる、緩やかであるが、継続的または持続的な放出を意味する。放出は、医薬製剤が胃を通過した後、および医薬製剤が腸に達するまで、およびその後、継続し得る。「持続放出」という語句は、治療用化合物の放出が、医薬製剤が胃に達した際に直ぐに開始されず、むしろ一定の期間、例えば、医薬製剤が腸に達するときまで遅延する、遅延放出も意味する。腸に達したら、次いで、ｐＨの上昇は、医薬製剤からの治療用化合物の放出を引き起こし得る。
「放出遅延剤」という用語が本明細書で使用されるが、経口摂取された場合に、医薬製剤からの治療用化合物の放出の速度を低減する材料を意味する。放出遅延剤は、ポリマーまたは非ポリマーであり得る。放出遅延剤は、例えば、拡散システム、溶解システムおよび／または浸透システムを含むいくつかの持続放出システムのいずれか１つに従って、使用され得る。
ある特定の態様では、治療薬は、約１ｍｍの粒子径の顆粒またはペレットの形態の微細な多数の粒子として製剤中に含まれる。カプセル剤投与のための物質の製剤は、ある特定の態様では、粉末、軽く圧縮されたプラグであるか、またはさらに錠剤である。一態様では、治療薬は、圧縮によって調製され得る。
着色剤および香味剤が、必要に応じて、含まれていてもよい。例えば、化合物は、製剤化され（例えば、限定されないが、リポソーム封入またはミクロスフェア封入によって）、次いで、着色剤および香味剤を含有する冷蔵保存された飲料などの食用製品内にさらに含有されてもよい。
治療薬の体積は、一態様では、不活性物質で希釈または増加されてもよい。これらの希釈剤としては、炭水化物、特に、マンニトール、アルファ－ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンが挙げられ得るだろう。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含むある特定の無機塩も、必要に応じて、フィラーとして使用される。一部の市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ－Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ－Ｒｘ １５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖｉｃｅｌｌである。
他の実施形態では、崩壊剤が、固形剤形への治療薬の製剤に含まれる。崩壊剤として使用される物質としては、限定されるものではないが、デンプンに基づく市販の崩壊剤、Ｅｘｐｌｏｔａｂを含むデンプンが挙げられる。デンプングリコール酸ナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラアミロペクチン（ｕｌｔｒａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、海綿およびベントナイトも企図される。崩壊剤の別の形態は、不溶性の陽イオン交換樹脂である。粉末状のガムも、必要に応じて、崩壊剤、結合剤として使用され、これらとしては、限定されないが、寒天、カラヤまたはトラガカントなどの粉末状ガムが挙げられる。アルギン酸およびそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。
結合剤は、治療用化合物を一緒に保持して、硬い錠剤を形成するために企図され、限定されないが、アカシア、トラガカント、デンプンおよびゼラチンなどの天然産物由来の物質が挙げられる。他の結合剤としては、限定されないが、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は、治療薬を造粒するためのアルコール溶液中での使用のために企図される。
抗摩擦剤は、必要に応じて、製剤化プロセスの間のスティッキングを防止するために、治療薬の製剤に含まれていてもよい。滑沢剤は、必要に応じて、治療薬およびダイの壁の間の層として使用されてもよく、これらとしては、限定されるものではないが、そのマグネシウムおよびカルシムの塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびワックスが挙げられ得る。例示的な可溶性の滑沢剤も使用され得、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、さまざまな分子量のポリエチレングリコール、ならびにＣａｒｂｏｗａｘ ４０００および６０００が挙げられ得る。
製剤化の間の化合物の流動特性を改善する可能性があり、圧縮の間の再構成を助けるための流動促進剤が、必要に応じて、添加される可能性がある。流動促進剤としては、限定されないが、デンプン、タルク、焼成シリカおよび水和アルミノシリケートが挙げられ得る。
治療薬の水性環境への可溶化を助けるために、界面活性剤が、ある特定の実施形態では、湿潤剤として添加される可能性がある。界面活性剤としては、例えば、限定されないが、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウムおよびジオクチルスルホン酸ナトリウムなどのアニオン性界面活性剤が挙げられ得る。カチオン性界面活性剤は、必要に応じて、使用される可能性があり、限定されないが、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウム（ｂｅｎｚｅｔｈｏｍｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）が挙げられ得る。界面活性剤として製剤に含まれ得る可能な非イオン性界面活性剤のリストとしては、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロースならびにカルボキシメチルセルロースである。使用される場合、これらの界面活性剤は、単独で、または異なる比の混合物としてのいずれかで、化合物の製剤中に存在し得る。
化合物の取り込みを潜在的に増強する添加剤も望ましくあり得る。そのような添加剤としては、脂肪酸のオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸が挙げられる。
放出制御製剤が望ましくあり得る。ある特定の態様では、化合物は、拡散または浸出機構のいずれかによる放出を可能にする不活性マトリックス、すなわち、ガムに組み込まれ得る。一部の態様では、ゆっくりと崩壊するマトリックスも製剤に組み込まれ得る。この治療薬の放出制御の別の形態は、ＯＲＯＳ（商標）治療薬システム（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）に基づく方法によってであり、すなわち、薬物は、水が、浸透圧作用に起因して、単一の小さな開口部から入り、薬物を押し出すことが可能な半透膜に包まれる。一部の腸溶コーティングも遅延放出作用を有する。
他の態様では、物質の混合が、最適なフィルムコーティングを提供するために使用される可能性がある。フィルムコーティングが、例えば、限定されないが、パンコーター中、または流動床中、または圧縮コーティングによって、行われてもよい。
肺および経鼻剤形
本明細書では、本発明の製剤の肺送達も企図される。これらの態様では、ＡＴ１Ｒ遮断剤またはＣＸＣＲ２経路阻害剤は、吸入しながら対象の肺に送達され得、肺上皮内層を越えて血流に移動し得る。
限定されるものではないが、そのすべてが当業者によく知られている噴霧器、計量式吸入器および粉末吸入器を含む、治療用製品の肺送達のために設計された広範囲の医療デバイスが、本発明の実施における使用のために企図される。
本発明の実施のために好適な市販のデバイスの一部の具体的な例は、例えば、限定されないが、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ（商標）噴霧器、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ製；Ａｃｏｒｎ（商標）ＩＩ噴霧器、Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ製；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ（商標）計量式吸入器、Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ製；およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ（商標）粉末吸入器、Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ製である。
すべてのそのようなデバイスは、化合物の予製に好適な製剤の使用を必要とする。典型的には、それぞれの製剤は、用いられるデバイスの種類に特異的であり、治療において有用な通常の希釈剤、アジュバントおよび／または担体に加えて、適切な噴霧物質の使用を含み得る。また、リポソーム、マイクロカプセルもしくはミクロスフェア、包接錯体、または他の種類の担体の使用が企図される。
噴出または超音波のいずれかの噴霧器による使用のために好適な製剤は、典型的には、水に懸濁された化合物を含む。製剤は、一態様では、緩衝剤および単糖も含み得る（例えば、タンパク質安定化および浸透圧の制御のため）。一実施形態では、噴霧器製剤は、エアロゾルの形成における溶液の噴霧化によって引き起こされる化合物の表面に誘導される凝集を低減または防止するために、界面活性剤も含有し得る。
計量式吸入器デバイスによる使用のための製剤は、一般に、一態様では、界面活性剤の助けにより噴霧剤中に懸濁された化合物を含有する微粉化された粉末を含む。噴霧剤は、この目的のために用いられる任意の従来の物質、例えば、限定されないが、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、もしくはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２－テトラフルオロエタンを含む炭化水素、またはそれらの組合せであり得る。好適な界面活性剤としては、限定されないが、ソルビタントリオレエートおよび大豆レシチンが挙げられる。オレイン酸も、ある特定の態様では、界面活性剤として有用であり得る。
粉末吸入器デバイスからの予製のための製剤は、化合物を含有する微粉化された乾燥粉末を含み、限定されないが、ラクトース、ソルビトール、スクロースまたはマンニトールなどの増量剤も、デバイスからの粉末の分散を容易にする量で、例えば、製剤の５０～９０重量％で、含み得る。ある特定の実施形態では、化合物は、肺の末梢部への最も効果的な送達のために、１０ミクロン未満、最も好ましくは０．５～５ミクロンの平均粒子径を有する粒子形態に調製される。
化合物の経鼻送達も企図される。経鼻送達は、肺における製品の蓄積を必要とせず、治療用製品を鼻に投与した後にタンパク質が血流へ直接通過することを可能にする。経鼻送達のための製剤は、これらと、例えば、限定されないが、デキストランまたはシクロデキストランとを含む。
投薬スケジュール
ある特定の態様では、本発明の製剤が、単回用量スケジュールとして、または好ましくは、複数回用量スケジュールで与えられ得ることが理解される。複数回用量スケジュールは、一次送達過程が１～１０回の別々の用量によってであり得、必要に応じて、処置を維持または強化するために必要なその後の時間間隔で与えられる他の用量が続くものである。投薬レジメンはまた、少なくとも一部分において、個体の必要性および開業医の判断によって決定される。
したがって、本発明は、本発明の医薬製剤を含む錠剤、本発明の医薬製剤を含むカプセル剤、本発明の医薬製剤を含む注射可能な懸濁剤、および本発明の医薬製剤を含む肺送達のための製剤を提供する。ＡＴ１Ｒ遮断剤およびＣＸＣＲ２経路阻害剤は、同じ製剤中で送達されてもよく、または別々の製剤中で送達されてもよい。
ＡＴ１Ｒ遮断剤およびＣＸＣＲ２経路阻害剤は、同じ剤形中にあってもよく、または別々の剤形中にあってもよい。ＡＴ１Ｒ遮断剤およびＣＸＣＲ２経路阻害剤を投与される対象は、活性剤の１つを既に受けていてもよく、本発明に従って、本発明の処置の他の構成成分を投与されていてもよい。
使用
本発明は、状態もしくは疾患の処置、改善または予防のための製剤の製造のための、（ａ）少なくとも１つのアンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）遮断剤および（ｂ）少なくとも１つのＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）経路阻害剤を含む医薬製剤の使用も提供する。
本発明は、疾患の処置、改善または予防のための製剤における使用のための、少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤および少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤をさらに提供する。
本発明は、疾患の処置、改善または予防のための製剤における使用のための少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤であって、対象に、少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤と同時または逐次的に投与される、少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤をさらに提供する。
本発明は、疾患の処置、改善または予防のための製剤における使用のための少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤であって、対象に、少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤と同時または逐次的に投与される、少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤をさらに提供する。
好ましくは、製剤は、ＣＯＰＤである状態もしくは疾患の処置、改善または予防における使用のためのものである。好ましくは、ＣＯＰＤは、肺気腫、慢性気管支炎、気管支拡張症および難治性（不可逆性）喘息から選択される。
ＣＸＣＲ２阻害剤およびＡＴ１Ｒ遮断剤は、同じ剤形中で、または別々の剤形中で投与され得る。
ＣＸＣＲ２阻害剤および／またはＡＴ１Ｒ遮断剤は、それぞれの受容体の抗体阻害剤または遮断剤であってもよい。ＣＸＣＲ２阻害剤およびＡＴ１Ｒ遮断剤は、同じ活性剤、例えば、二重特異性抗体であってもよい。ＣＸＣＲ２阻害剤および／またはＡＴ１Ｒ遮断剤は、ＣＸＣＲ２阻害剤および／またはＡＴ１Ｒ遮断剤の薬学的に許容される塩であってもよい。
ＣＸＣＲ２阻害剤およびＡＴ１Ｒ遮断剤は、同時または逐次的に投与され得る。
キット
本発明は、状態もしくは疾患の処置または予防のためのキットであって、
ａ）少なくとも１つのアンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）遮断剤；
ｂ）少なくとも１つのＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）経路阻害剤；および
ｃ）使用説明書
を含む、キットを提供する。
キットの内容物は、凍結乾燥することができ、キットは、凍結乾燥された構成成分の再構成のための好適な溶剤を追加で含有することができる。キットの個々の構成成分は、別々の容器に包装され、そのような容器に関連して、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知であり得、この通知は、ヒトの投与のための製造、使用または販売の政府機関による承認を反映する。
キットの構成成分が、１つまたは複数の液状の液剤で提供される場合、液状の液剤は、水性溶液、例えば、無菌水性溶液であり得る。ｉｎ ｖｉｖｏの使用のために、発現構築物は、薬学的に許容される注射可能な組成物に製剤化されてもよい。この場合では、容器手段は、それ自体が吸入器、シリンジ、ピペット、点眼器または他のそのような装置であり得、そこから、製剤が、動物の罹患領域、例えば、肺に適用され得、動物に注射され得、またはさらにキットの他の構成成分とともに適用および混合され得る。
キットの構成成分はまた、乾燥形態または凍結乾燥形態で提供され得る。試薬または構成成分が乾燥形態として提供される場合、再構成は、一般に、好適な溶剤の添加によってである。溶剤も別の容器手段で提供され得ることが想定される。容器の数または種類に関係なく、本発明のキットはまた、動物の体内での最終的な複雑な組成物の注射／投与または配置を支援するための器具を含んでいてもよく、またはそれで包装されていてもよい。そのような器具は、吸入器、シリンジ、ピペット、鉗子、測定スプーン、点眼器または任意のそのような医療承認された送達ビヒクルであり得る。
一般
当業者は、本明細書に記載される発明が、具体的に記載されるもの以外の変形および改変を許容することを理解する。本発明は、すべてのそのような変形および改変を含む。本発明はまた、本明細書中で、個々にまたはまとめて参照されるもしくは示されるすべてのステップ、特徴、製剤および化合物、ならびにありとあらゆるステップ、特徴の組合せまたは任意の２つもしくはそれよりも多いステップ、特徴を含む。
本文で引用されるそれぞれの文書、参考文献、特許出願または特許は、それらの全体が、参照により本明細書に明示的に組み込まれ、このことは、それが、本テキストの一部として読者によって読まれ、考慮されるべきであることを意味する。本文で引用される文書、参考文献、特許出願または特許が本文中で繰り返されないのは、単に簡潔さの目的である。
本明細書中または参照により本明細書に組み込まれる任意の文書中で述べられた任意の製品についての任意の製造者の説明書、説明、製品仕様書および製品シートは、ここに参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いられ得る。
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態のいずれかによって、範囲が限定されるべきではない。これらの実施形態は、例示の目的のみを意図する。機能的に同等の製品、製剤および方法は、明確に、本明細書に記載される発明の範囲内である。
本明細書に記載される発明は、１つまたは複数の値の範囲（例えば、サイズ、変位および電界強度など）を含み得る。値の範囲は、範囲を定義する値、および範囲への境界を定義する値に直ぐ隣接する値と同じまたは実質的に同じ結果をもたらす範囲に隣接する値を含む、範囲内のすべての値を含むことが理解される。したがって、逆のことが示されない限り、本明細書および特許請求の範囲に記述される数値パラメーターは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変わり得る近似値である。そのため、「約８０％」は、「約８０％」も「８０％」も意味する。最低限、それぞれの数値パラメーターは、有効桁数および通常の丸め手法を考慮して解釈されなければならない。
本明細書全体にわたって、文脈が他を必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられた整数または整数の群の包含を意味するが、任意の他の整数または整数の群の排除を意味しないことが理解される。本開示において、特に、特許請求の範囲および／または項において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのような用語は、米国特許法においてそれに起因する意味を有することができること、例えば、それらが、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができること、ならびに「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語が、米国特許法においてそれらに起因する意味を有すること、例えば、それらが、明示的に列挙されていない要素を可能にするが、先行技術において見出される要素、または本発明の基本的もしくは新規の特徴に影響を与える要素を除外することにも留意されたい。
本明細書で使用される選択された用語の他の定義は、本発明の詳細な説明内で見出され、全体にわたって適用され得る。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての他の科学用語および技術用語は、本発明が属する分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。「活性剤」という用語は、１つの活性剤を意味し得るか、または２つまたはそれよりも多くの活性剤を包含し得る。
以下の実施例は、上記に記載した発明を使用する方法をより完全に記載するため、および本発明のさまざまな態様を行うために企図される最良の形態を記述するための役割を果たす。これらの方法が、本発明の真の範囲を限定するものでは決してなく、むしろ、例証目的で提示されることが理解される。
本発明のさらなる特徴を、以下の非限定的な実施例においてより完全に記載する。この説明は、単に、本発明を例証する目的で含まれる。上記に提示された本発明の広範な説明に対する限定として理解されるべきではない。
独立して、以下の実施例１、３、４および５のそれぞれでは、以下の一般的な物質および方法が、文脈が他を必要としない限り、適用される。
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、６ウェルプレートに、およそ７００，０００個細胞／ウェルの密度で播種し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ； Ｂｏｖｏｇｅｎ）が補充された完全培地（０．３ｍｇ／ｍｌのグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））中、３７℃、５％のＣＯ２で維持した。一過性トランスフェクションを、播種の２４時間後に、製造者の説明書に従って、ＦｕＧｅｎｅ６（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して行った。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、０．０５％のトリプシン／０．５３ｍＭのＥＤＴＡを使用して分離し、５％のＦＣＳを含有するＨＥＰＥＳ緩衝化フェノールレッド不含完全培地に再懸濁させ、ポリ－Ｌ－リシンコーティングされた白色９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に添加した。トランスフェクションの４８時間後、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アッセイを、３７℃、５％のＣＯ２で２時間の３０μＭの最終濃度のＥｎｄｕＲｅｎ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）との細胞のプレインキュベーション後に行った。ＢＲＥＴ測定結果は、ＬＵＭＩｓｔａｒ（商標）またはＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（商標）（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、３７℃で取得した。フィルター処理した光の発光を、「ドナー波長ウィンドウ」（ＬＵＭＩｓｔａｒ（商標）について４６０～４９０ｎｍまたはＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（商標）について４１０ｎｍから４９０ｎｍ）および「アクセプター波長ウィンドウ」（ＬＵＭＩｓｔａｒ（商標）について５２０～５５０ｎｍまたはＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（商標）について５２０ｎｍから６２０ｎｍ）のそれぞれにおいて、１秒間測定した。
アンタゴニスト／インバースアゴニストアッセイのために、細胞を、ＥｎｄｕＲｅｎとともに１．５時間プレインキュベートし、続いて、ビヒクルまたはアンタゴニスト／インバースアゴニスト（１０μＭ）をさらに３０分間添加した。次いで、２０分間読み取った後、アゴニスト（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド８［ＣＸＣＬ８］１０ｎＭおよび／またはアンジオテンシンＩＩ［ＡｎｇＩＩ］１００ｎＭ）を添加し（したがって、最初のビヒクルまたはアンタゴニスト／インバースアゴニスト添加の５０分後）、アッセイを、さらに４０分間測定した。
相互作用するタンパク質の間で観察されるＢＲＥＴシグナルを、バックグラウンドのＢＲＥＴ比を減算することによって正規化する。これは、２つの方法（Ｐｆｌｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １８：１６６４－１６７０；Ｐｆｌｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １：３３６－３４４を参照されたい）の１つで行うことができる：１）ドナー構築物のみを含有する細胞試料についての４６０～４９０ｎｍまたは４１０～４９０ｎｍの発光に対する５２０～５５０ｎｍまたは５２０～６２０ｎｍの発光の比を、相互作用するアクセプターおよびドナー融合タンパク質を含有する試料についての同じ比から減算する；２）ビヒクルで処理された細胞試料についての４６０～４９０ｎｍまたは４１０～４９０ｎｍの発光に対する５２０～５５０ｎｍまたは５２０～６２０ｎｍの発光の比を、リガンドで処理された同じ細胞試料の第２のアリコートについての同じ比から減算する。以下の実施例では、２番目の計算を使用し、シグナルを、「リガンド誘導ＢＲＥＴ」と記載する。さらにまた、図４～２０に示されるデータについて、所与のセットにおけるすべてのデータポイントを、アゴニスト処理前の最終データポイントに対して補正し、これをゼロに固定する。図７～２０におけるキーでは、「＞」は「５０分後に続く」を意味し、アゴニストを、ｘ軸上の時間ゼロで添加した。
Ｍｉｎｉ Ｇ（ｍＧ）タンパク質は、Ｇαサブユニットの操作されたＧＴＰａｓｅドメインである。それらは、蛍光タンパク質と融合されたＢＲＥＴアッセイにおいて使用されて、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）活性を報告する。”Ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｍＧ ｐｒｏｔｅｉｎｓ （ｍＧｓ， ｍＧｓｉ， ｍＧｓｑ， ａｎｄ ｍＧ１２） ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ Ｇα ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｃｏｇｎａｔｅ ＧＰＣＲｓ， ａｌｌｏｗｉｎｇ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｓｕｂｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ” （Ｗａｎ ｅｔ ａｌ． （２０１８） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２９３（１９）：７４６６－７４７３）。
受容体－ヘテロマー調査技術（受容体－ＨＩＴ）は、受容体複合体に見識を提供するアッセイ構成である（Ａｙｏｕｂ ｅｔ ａｌ． （２０１５） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（３）：ｅ０１１９８０３）。これは、ＧＰＣＲを評価する場合のＧＰＣＲ－ＨＩＴとしても公知である。１つの受容体（例えば、ＣＸＣＲ２）が、近接度に基づいた受容体システム（例えば、ＢＲＥＴ）の１つの構成成分（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼバリアントのＲｌｕｃ８）で標識され、その相補的な構成成分（例えば、Ｖｅｎｕｓ黄色蛍光タンパク質）が、パートナーと相互作用する受容体（例えば、ｍＧｓｉ）に融合されることによるアッセイ構成である。ＢＲＥＴアッセイに関して非タグ化された受容体（例えば、赤血球凝集素エピトープ－タグ化ＡＴ１Ｒ；ＨＡ－ＡＴ１Ｒ）に選択的なリガンド（例えば、ＡｎｇＩＩ）による処理は、ＢＲＥＴタグ化受容体および相互作用するパートナーの近接度のモジュレーションをもたらし、２つの受容体間の機能的相互作用を示すＢＲＥＴシグナルの変化をもたらす。
（実施例１）
ここで、図１を参照して、ＢＲＥＴシグナルを、１０－７Ｍ（１００ｎＭ）のＣＸＣＬ８もしくは１０－６Ｍ（１μＭ）のＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８（Ｒｌｕｃ８で標識されたＣＸＣＲ２）およびＶｅｎｕｓ／ｍＧｓｉ（Ｖｅｎｕｓで標識されたＧｉ活性のためのセンサーとしてのｍＧｓｉ）とＨＡ－ＡＴ１Ｒとを一過性発現する細胞から測定した。並行して、ＢＲＥＴシグナルを、１０－７Ｍ（１００ｎＭ）のＣＸＣＬ８もしくは１０－６Ｍ（１μＭ）のＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方のいずれかによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／ｍＧｓｉ（ＨＡ－ＡＴ１Ｒ発現なし；ｐｃＤＮＡ３を代わりにトランスフェクトしてｃＤＮＡレベルを同じに保った）を一過性発現する細胞から測定した。
リガンド処理（０分で添加される）の前に、ベースラインＢＲＥＴシグナルを、組合せのそれぞれについて記録した。ＨＡ－ＡＴ１ＲなしでＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／ｍＧｓｉを発現する細胞のＡｎｇＩＩ処理は、リガンド誘導ＢＲＥＴの増加をもたらさなかった（図１Ａ）。ＨＡ－ＡＴ１ＲなしでＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／ｍＧｓｉを発現する細胞のＣＸＣＬ８処理は、約０．６に達するＢＲＥＴシグナルをもたらした。同様のＢＲＥＴシグナルが、これらの細胞におけるＡｎｇＩＩおよびＣＸＣＬ８による組合せ処理で観察された。
対照的に、識別可能なリガンド誘導ＢＲＥＴシグナルが、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを共発現する細胞のＡｎｇＩＩ処理後に観察された（図１Ｂ）。このシグナルは、およそ０．０５であった。ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを共発現する細胞のＣＸＣＬ８による処理は、およそ０．４のシグナルをもたらした。ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを共発現する細胞のＡｎｇＩＩおよびＣＸＣＬ８の両方による処理は、およそ０．６のシグナルをもたらし、ＣＸＣＬ８またはＡｎｇＩＩ単独の添加後に観察されるシグナルよりも実質的に大きかった。
この実施例は、ＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩによる組合せ処理の相加効果よりも高いことを実証し、ＡＴ１ＲのＡｎｇＩＩ活性化が、ＣＸＣＬ８活性化ＣＸＣＲ２へのＧｉ共役の促進に対する相乗効果を有することを示す。
（実施例２）
ここで、図２を参照して、ホスホリパーゼＣ経路の受容体活性化を、競合イムノアッセイ（ＩＰ－ｏｎｅ－Ｇｑキット、Ｃｉｓｂｉｏ ６２ＩＰＡＰＥＣ）によるＤ－ｍｙｏ－イノシトール１－リン酸（ＩＰ１）の測定により検出した。ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞を、懸濁液中、ＡＧＴＲ１ベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ ＲＣ２１２００８）単独で一過性トランスフェクト、またはＦｕＧｅｎｅ（商標）ＨＤ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ２３１１）を使用してＣＸＣＲ２ベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｃａｔ ＲＣ２０７７９４）で共トランスフェクトした。２４時間後、実験を、必要な最終アッセイ濃度の３．５μｌのビヒクルまたはアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ、Ｔｏｃｒｉｓ １１５８）、および３．５μｌのビヒクルまたはインターロイキン８（ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、アミノ酸２８～９９、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ２０８－ＩＬ－０５０）を用いて、３８４ウェルの白色Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ６００７２９９）に２０，０００個細胞／ウェル（７μｌ）が分散した、刺激緩衝液（Ｃｉｓｂｉｏ、６２ＩＰＡＰＥＣ）＋０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で行った。アゴニストを、刺激緩衝液＋０．１％のＢＳＡ中の３倍連続希釈で調製し、適切な最終濃度応答曲線および必要により単一濃度での共刺激を与えるために、アッセイに添加した。ＩＰ１標準曲線も、１４μｌの刺激緩衝液＋０．１％のＢＳＡ中で構築した。インキュベーションを、３７℃、５％のＣＯ２で９０分間実施し、その後、溶解および検出緩衝液中の３μｌのＩＰ１－ｄ２試薬および３μｌのＩＰ１ Ｔｂクリプテート抗体（Ｃｉｓｂｉｏ ６２ＩＰＡＰＥＣ）を、それぞれのウェルに、室温で６０分間添加した。プレートを、３３７ｎｍの励起を使用し、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍのドナー／アクセプター発光を収集する、ＨＴＲＦ（登録商標）適合リーダー（ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（商標）、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）において読み取った。標準曲線を、プロットして、未知のＨＴＲＦ比（６６５／６２０×１００００）の測定結果をＩＰ１濃度（ｎＭ）として内挿した。次いで、アゴニストの濃度応答データを、４つのパラメーターのシグモイド曲線にフィットさせて、ｌｏｇ ＥＣ５０、および適切な場合、最大応答Ｒｍａｘを導き出した。
Ｄ－ｍｙｏ－イノシトール１－リン酸（ＩＰ１）の蓄積は、Ｇｑタンパク質を活性化する受容体の結果として起こり、次に、ホスホリパーゼＣの活性化をもたらすことが公知である。ＡＴ１Ｒは、Ｇｑシグナル伝達経路を活性化することが周知である（Ｃａｂａｎａ ｅｔ ａｌ （２０１５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０， １５８３５－１５８５４）。Ｇｉタンパク質（百日咳毒素感受性である）の活性化が、Ｇβγサブユニットを介したホスホリパーゼＣのある特定のアイソフォームも活性化することができることも十分に確立されている（Ｃａｍｐｓ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３６０， ６８４－６８６； Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３６０， ６８６－６８９）。ＣＸＣＲ２は、古典的には、Ｇｉタンパク質の活性化を介してシグナル伝達する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ （２０２０） Ｎａｔｕｒｅ ５８５， １３５－１４０）。
ここで、図２Ａを参照して、ＣＸＣＬ８のみで処理された、ＡＴ１ＲおよびＣＸＣＲ２で一過性トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、－７．４０のｌｏｇＥＣ５０（Ｍ）および２５１ｎＭのＲｍａｘを有する濃度応答曲線をもたらした。ＡｎｇＩＩのみによる処理は、－９．２１のｌｏｇＥＣ５０（Ｍ）および５６７ｎＭのＲｍａｘを有する濃度応答曲線をもたらした。１０ｎＭのＣＸＣＬ８および濃度範囲のＡｎｇＩＩによる処理は、－９．１８のｌｏｇＥＣ５０（Ｍ）および７１７ｎＭのＲｍａｘを有する濃度応答曲線をもたらした。ＡｎｇＩＩ非存在下での１０ｎＭのＣＸＣＬ８が、ベースライン（ビヒクルのみで処理された細胞；１５９ｎＭ）よりも約１２ｎＭだけ高い、約１７１ｎＭの［ＩＰ１］をもたらすことは注目に値する。
ここで、図２Ｂを参照して、ＣＸＣＬ８のみで処理された、ＣＸＣＲ２を安定に発現し、ＡＴ１Ｒで一過性トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、－７．７９のｌｏｇＥＣ５０（Ｍ）および６８ｎＭのＲｍａｘを有する濃度応答曲線をもたらした。ＡｎｇＩＩのみによる処理は、－８．７７のｌｏｇＥＣ５０（Ｍ）および２０９ｎＭのＲｍａｘを有する濃度応答曲線をもたらした。１ｎＭのＣＸＣＬ８および濃度範囲のＡｎｇＩＩによる処理は、－８．７２のｌｏｇＥＣ５０（Ｍ）および２６６ｎＭのＲｍａｘを有する濃度応答曲線をもたらした。ＡｎｇＩＩ非存在下での１ｎＭのＣＸＣＬ８が、ベースラインと見るからに異ならない［ＩＰ１］をもたらすことは注目に値する。
この実施例は、［ＩＰ１］、したがって、ＡｎｇＩＩでＡＴ１Ｒ、およびＣＸＣＬ８でＣＸＣＲ２の両方を活性化する結果としてのホスホリパーゼＣ活性のかなりの相乗作用が存在することを実証する。さらにまた、この相乗作用は、ＡＴ１ＲおよびＣＸＣＲ２の両方が存在する場合に、Ｇｉ共役に対するＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処置の相加効果より大きいことを示すデータと一致する（バイオセンサーのｍＧｓｉとの近接度によって実証される通り）。
（実施例３）
ここで、図３を参照して（Ｔｉｕｌｐａｋｏｖ ｅｔ ａｌ （２０１６） Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ３０， ８８９－９０４に公開）、Ｒｌｕｃ８タグ化受容体のＶｅｎｕｓタグ化Ｋｒａｓ細胞膜マーカーまたは別個の細胞内の場所に特異的なＶｅｎｕｓタグ化Ｒａｂへの近接度を、生細胞中で、リアルタイムに、ＢＲＥＴを使用してモニターする。Ｒａｂマーカーは以下である：初期エンドソームについてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ５（５）；初期エンドソームリサイクリングについてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ４（４）；リサイクリングエンドソームについてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１１ａ（１１）；後期エンドソーム／リソソームについてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ７（７）；トランスゴルジ網への後期エンドソーム輸送についてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ９（９）；シスゴルジへの小胞体輸送についてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１（１）；ゴルジ装置およびトランスゴルジ網についてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ６（６）；または細胞膜へのトランスゴルジ網についてＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ８（８）。
ここで、図４Ａを参照して、ＡＴ１Ｒの非存在下、ＣＸＣＬ８処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８の細胞膜マーカーのＶｅｎｕｓ／Ｋｒａｓへの近接度の著しい低減をもたらし、ＣＸＣＲ２が、細胞に内部移行することを示す。ＡｎｇＩＩは、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＣＸＣＬ８のみと同じ効果を有する。
ここで、図４Ｂを参照して、ＡＴ１Ｒの存在下、ＣＸＣＬ８処理は、再び、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８の細胞膜マーカーのＶｅｎｕｓ／Ｋｒａｓへの近接度の著しい低減をもたらし、再び、ＣＸＣＲ２が、細胞に内部移行することを示す。しかしながら、対照的に、ＡｎｇＩＩ処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｋｒａｓの近接度の増加をもたらし、細胞膜におけるＣＸＣＲ２の量を増加させるＡｎｇＩＩによるＡＴ１Ｒの活性化についての証拠を提供する。理論に縛られることを望まないが、これらのデータは、ＣＸＣＲ２が、ＡＴ１ＲのＡｎｇＩＩ活性化によって阻害される顕著な恒常的内部移行を示すこと、および／またはＡｎｇＩＩによるＡＴ１Ｒの活性化が、ＣＸＣＲ２の細胞膜への正の輸送を増加させて、細胞膜におけるＣＸＣＲ２の発現を増加させることのいずれかを示す。ＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理は、ＣＸＣＬ８のみと比較して、ＣＸＣＬ８によって誘導される内部移行の正味の効果、およびＡｎｇＩＩによるＡＴ１Ｒ活性化によって誘導されるＣＸＣＲ２の細胞膜への正の輸送であり得る、低いＣＸＣＲ２の正味の内部移行をもたらす。
ここで、図４Ｃを参照して、ＡＴ１Ｒの非存在下、ＣＸＣＬ８処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１への近接度の小さな増加をもたらし、小胞体からシスゴルジへのＣＸＣＲ２輸送の小さな増加を示す。ＡｎｇＩＩは、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＣＸＣＬ８のみと同じ効果を有する。
ここで、図４Ｄを参照して、ＡＴ１Ｒの存在下、ＣＸＣＬ８処理は、再び、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１への近接度の小さな増加をもたらし、再び、小胞体からシスゴルジへのＣＸＣＲ２輸送の小さな増加を示す。ＡｎｇＩＩのみのわずかな任意の効果が存在するが、しかしながら、ＡｎｇＩＩによる共処理は、ＣＸＣＬ８の効果を低減するように見える。
ここで、図４Ｅを参照して、ＡＴ１Ｒの非存在下、ＣＸＣＬ８処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ４への近接度の増加をもたらし、ＣＸＣＲ２の初期エンドソームのリサイクリングの増加を示す。ＡｎｇＩＩは、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＣＸＣＬ８のみと同じ効果を有する。
ここで、図４Ｆを参照して、ＡＴ１Ｒの存在下、ＣＸＣＬ８処理は、再び、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ４への近接度の増加をもたらし、ＣＸＣＲ２の初期エンドソームのリサイクリングの増加を示す。ＡｎｇＩＩのみは、より後の時点で、ＣＸＣＲ２の初期エンドソームのリサイクリングの非常に小さな増加をもたらすが、しかしながら、ＡｎｇＩＩによる共処理は、ＣＸＣＬ８の効果を、特に、より早い時点で、低減するように見える。
ここで、図４Ｇを参照して、ＡＴ１Ｒの非存在下、ＣＸＣＬ８処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ５への近接度の実質的な増加をもたらし、初期エンドソームにおけるＣＸＣＲ２の実質的な増加を示す。ＡｎｇＩＩは、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＣＸＣＬ８のみと同じ効果を有する。
ここで、図４Ｈを参照して、ＡＴ１Ｒの存在下、ＣＸＣＬ８処理は、再び、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ５への近接度の実質的な増加をもたらし、初期エンドソームにおけるＣＸＣＲ２の実質的な増加を示す。ＡｎｇＩＩのみは、初期エンドソームにおけるＣＸＣＲ２の非常に小さな増加をもたらすが、しかしながら、ＡｎｇＩＩによる共処理は、ＣＸＣＬ８の効果を実質的に低減するように見える。これは、ＡｎｇＩＩによって活性化されたＡＴ１Ｒの存在下でのＣＸＣＲ２のＣＸＣＬ８誘導内部移行の低減と一致し、Ｋｒａｓデータで観察されるように、細胞膜における増加したＣＸＣＲ２をもたらす。
ここで、図４Ｉを参照して、ＡＴ１Ｒの非存在下、ＣＸＣＬ８処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ６への近接度の小さな減少をもたらし、ゴルジ装置を通るトランスゴルジ網へのＣＸＣＲ２輸送の小さな減少を示す。ＡｎｇＩＩは、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＣＸＣＬ８のみと同じ効果を有する。
ここで、図４Ｊを参照して、ＡＴ１Ｒの存在下、ＣＸＣＬ８処理は、再び、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ６への近接度の小さな減少をもたらし、再び、ゴルジ装置を通るトランスゴルジ網へのＣＸＣＲ２輸送の小さな減少を示す。対照的に、ＡｎｇＩＩのみの処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ６への近接度の小さな増加をもたらし、ＡｎｇＩＩによるＡＴ１Ｒ活性化が、ゴルジ装置を通るトランスゴルジ網へのＣＸＣＲ２輸送の小さな増加を促進することを示す。したがって、ＡＮＧＩＩによる共処理は、より後の時点でのＣＸＣＬ８の効果を無価値にするように見え、逆もまた同様である。
ここで、図４Ｋを参照して、ＡＴ１Ｒの非存在下、ＣＸＣＬ８処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ７への近接度の小さな増加をもたらし、後期エンドソーム／リソソームにおけるＣＸＣＲ２の小さな増加を示す。ＡｎｇＩＩは、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＣＸＣＬ８のみと同じ効果を有する。
ここで、図４Ｌを参照して、ＡＴ１Ｒの存在下、ＣＸＣＬ８処理は、再び、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ７への近接度の小さな増加をもたらし、再び、後期エンドソーム／リソソームにおけるＣＸＣＲ２の小さな増加を示す。ＡｎｇＩＩのみのわずかな任意の効果が存在するが、しかしながら、ＡｎｇＩＩおよびＣＸＣＬ８の両方による処理は、特に、より後の時点で、ＣＸＣＬ８のみで観察されるよりも近接度のより高い増加をもたらす。
ここで、図４Ｍを参照して、ＡＴ１Ｒの非存在下、ＣＸＣＬ８処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ８への近接度の小さな減少をもたらし、トランスゴルジ網から細胞膜へのＣＸＣＲ２輸送の小さな減少を示す。ＡｎｇＩＩは、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＣＸＣＬ８のみと同じ効果を有する。
ここで、図４Ｎを参照して、ＡＴ１Ｒの存在下、ＣＸＣＬ８処理は、再び、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ８への近接度の小さな減少をもたらすが、これは、おそらく、ＡＴ１Ｒの非存在下で観察されるよりも目立たない。際立って、ＡｎｇＩＩのみの処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ８への近接度の明確な増加をもたらす。ＡｎｇＩＩおよびＣＸＣＬ８の両方による処理は、ＡｎｇＩＩのみと比較してわずかに低減された近接度の明確な増加を依然としてもたらす。これらのデータは、ＡｎｇＩＩによるＡＴ１Ｒの活性化が、ＡｎｇＩＩによるＡＴ１Ｒの活性化の際にＶｅｎｕｓ／ＫｒａｓへのＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８の近接度の観察された増加と一致して、トランスゴルジ網から細胞膜へのＣＸＣＲ２の正の輸送を促進することを示す。
ここで、図４Ｏを参照して、ＡＴ１Ｒの非存在下、ＣＸＣＬ８処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ９への近接度の増加をもたらし、後期エンドソームからトランスゴルジ網へのＣＸＣＲ２輸送の増加を示す。ＡｎｇＩＩは、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＣＸＣＬ８のみと同じ効果を有する。
ここで、図４Ｐを参照して、ＡＴ１Ｒの存在下、ＣＸＣＬ８処理は、再び、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ９への近接度の増加をもたらし、後期エンドソームからトランスゴルジ網へのＣＸＣＲ２輸送の増加を示す。ＡｎｇＩＩのみは、小さな増加をもたらすが、ＡｎｇＩＩによる共処理は、ＣＸＣＬ８の効果をわずかに低減する。
ここで、図４Ｑを参照して、ＡＴ１Ｒの非存在下、ＣＸＣＬ８処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１１ａへの近接度の増加をもたらし、リサイクリングエンドソームを通るＣＸＣＲ２輸送の増加を示す。ＡｎｇＩＩは、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＣＸＣＬ８のみと同じ効果を有する。
ここで、図４Ｒを参照して、ＡＴ１Ｒの存在下、ＣＸＣＬ８処理は、再び、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１１ａへの近接度の増加をもたらし、再び、リサイクリングエンドソームを通るＣＸＣＲ２輸送の増加を示す。ＡｎｇＩＩのみのわずかな任意の効果が存在するが、しかしながら、ＡｎｇＩＩによる共処理は、ＣＸＣＬ８の効果を低減する。
ここで、図５Ａを参照して、ＣＸＣＲ２の非存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８の細胞膜マーカーのＶｅｎｕｓ／Ｋｒａｓへの近接度の著しい低減をもたらし、ＡＴ１Ｒが、細胞に内部移行することを示す。ＣＸＣＬ８は、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＡｎｇＩＩのみと同じ効果を有する。
ここで、図５Ｂを参照して、ＣＸＣＲ２の存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、再び、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８の細胞膜マーカーのＶｅｎｕｓ／Ｋｒａｓへの近接度の著しい低減をもたらし、再び、ＡＴ１Ｒが、細胞に内部移行することを示す。他の適応において観察されたものとは対照的に（図４Ｂ）、ＡｎｇＩＩ処理は、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｋｒａｓの近接度の注目に値する増加をもたらさず、ＣＸＣＬ８によるＣＸＣＲ２の活性化が、細胞膜におけるＡＴ１Ｒの量を増加させないことを示す。したがって、図４Ｂにおいて明確に観察される効果は、相互関係を表すようには見えない。ＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理は、ＡｎｇＩＩのみと比較して低いＡＴ１Ｒ内部移行をもたらした。
ここで、図５Ｃを参照して、ＣＸＣＲ２の非存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１への近接度の増加をもたらし、小胞体からシスゴルジへのＡＴ１Ｒ輸送の増加を示す。ＣＸＣＬ８は、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＡｎｇＩＩのみと同じ効果を有する。
ここで、図５Ｄを参照して、ＣＸＣＲ２の存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、再び、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１への近接度の増加をもたらし、再び、小胞体からシスゴルジへのＡＴ１Ｒ輸送の増加を示す。ＣＸＣＬ８のみのわずかな任意の効果が存在し（おそらく、わずかな減少）、ＣＸＣＬ８による共処理は、ＡｎｇＩＩの効果に対する最小限の影響を有する。
ここで、図５Ｅを参照して、ＣＸＣＲ２の非存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ４への近接度の増加をもたらし、ＡＴ１Ｒの初期エンドソームのリサイクリングの増加を示す。ＣＸＣＬ８は、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＡｎｇＩＩのみと同じ効果を有する。
ここで、図５Ｆを参照して、ＣＸＣＲ２の存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、再び、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ４への近接度の増加をもたらし、再び、ＡＴ１Ｒの初期エンドソームのリサイクリングの増加を示す。ＣＸＣＬ８のみのわずかな任意の効果が存在するが（おそらく、わずかな減少）、ＣＸＣＬ８による共処理は、ＡｎｇＩＩの効果を低減する。
ここで、図５Ｇを参照して、ＣＸＣＲ２の非存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ５への近接度の実質的な増加をもたらし、初期エンドソームにおけるＡＴ１Ｒの実質的な増加を示す。ＣＸＣＬ８は、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＡｎｇＩＩのみと同じ効果を有する。
ここで、図５Ｈを参照して、ＣＸＣＲ２の存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、再び、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ５への近接度の実質的な増加をもたらし、初期エンドソームにおけるＡＴ１Ｒの実質的な増加を示す。ＣＸＣＬ８のみは、識別可能な効果を有さないが、しかしながら、ＣＸＣＬ８による共処理は、ＡｎｇＩＩの効果を実質的に低減するように見える。これは、ＣＸＣＬ８によって活性化されたＣＸＣＲ２の存在下でのＡＴ１ＲのＡｎｇＩＩ誘導内部移行の低減と一致し、Ｋｒａｓデータで観察されるように、細胞膜における増加したＣＸＣＲ２をもたらす。
ここで、図５Ｉを参照して、ＣＸＣＲ２の非存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ６への近接度に対するわずかな効果を有し（おそらく、非常に小さな一過性の減少）、ゴルジ装置を通るトランスゴルジ網へのＡＴ１Ｒ輸送に対するわずかな効果を示す。ＣＸＣＬ８は、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＡｎｇＩＩのみと同じ効果を有する。
ここで、図５Ｊを参照して、ＣＸＣＲ２の存在は、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ６へのＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８の近接度に関して、ＣＸＣＲ２の非存在下で観察される結果と比較して、ほとんど相違を生じない。
ここで、図５Ｋを参照して、ＣＸＣＲ２の非存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ７への近接度の増加をもたらし、後期エンドソーム／リソソームにおけるＡＴ１Ｒの増加を示す。ＣＸＣＬ８は、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＡｎｇＩＩのみと同じ効果を有する。
ここで、図５Ｌを参照して、ＣＸＣＲ２の存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、再び、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ７への近接度の増加をもたらし、再び、後期エンドソーム／リソソームにおけるＡＴ１Ｒの増加を示す。ＣＸＣＬ８のみの効果は存在せず、ＣＸＣＬ８による共処理は、おそらく、より後の時点でＡｎｇＩＩで観察される効果を増加させる。
ここで、図５Ｍを参照して、ＣＸＣＲ２の非存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ８への近接度のより後の時点での小さな増加をもたらし、トランスゴルジ網から細胞膜へのＡＴ１Ｒ輸送に対する小さな効果を示す。ＣＸＣＬ８は、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＡｎｇＩＩのみと同じ効果を有する。
ここで、図５Ｎを参照して、ＣＸＣＲ２の存在は、Ｖｅｎｕｓ／Ｒａｂ８へのＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８の近接度に関して、ＣＸＣＲ２の非存在下で観察される結果と比較して、わずかな相違を生じる。それどころか、ＣＸＣＬ８は、近接度を低減し、ＡｎｇＩＩは、効果が少なく、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、再び、ＡｎｇＩＩのみと同じ効果を有する。
ここで、図５Ｏを参照して、ＣＸＣＲ２の非存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ９への近接度の増加をもたらし、後期エンドソームからトランスゴルジ網へのＡＴ１Ｒ輸送の増加を示す。ＣＸＣＬ８は、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＡｎｇＩＩのみと同じ効果を有する。
ここで、図５Ｐを参照して、ＣＸＣＲ２の存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、再び、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ９への近接度の増加をもたらし、再び、後期エンドソームからトランスゴルジ網へのＡＴ１Ｒ輸送の増加を示す。ＣＸＣＬ８のみのわずかな任意の効果が存在するが、ＣＸＣＬ８による共処理は、ＡｎｇＩＩの効果を低減する。
ここで、図５Ｑを参照して、ＣＸＣＲ２の非存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１１ａへの近接度の実質的な増加をもたらし、リサイクリングエンドソームを通るＡＴ１Ｒ輸送の実質的な増加を示す。ＣＸＣＬ８は、効果を有さず、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方は、ＡｎｇＩＩのみと同じ効果を有する。
ここで、図５Ｒを参照して、ＣＸＣＲ２の存在下、ＡｎｇＩＩ処理は、再び、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ１１ａへの近接度の実質的な増加をもたらし、リサイクリングエンドソームを通るＡＴ１Ｒ輸送の実質的な増加を示す。ＣＸＣＬ８のみは、識別可能な効果を有さないが、しかしながら、ＣＸＣＬ８による共処理は、ＡｎｇＩＩの効果を低減する。
この実施例は、ＡＴ１Ｒの活性化が、ＣＸＣＲ２内部移行の量を低減することによって、および／またはトランスゴルジ網から最大で細胞膜までのＣＸＣＲ２の正の輸送を増加させることによって、細胞膜におけるＣＸＣＲ２の発現を増加させることを実証する。さらにまた、ＡＴ１Ｒ活性化の結果としての細胞膜におけるＣＸＣＲ２発現のこの増加は、ＡＴ１ＲおよびＣＸＣＲ２の両方が存在する場合に、Ｇｉ共役に対するＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処置の相加効果より大きいことを示すデータと一致する（バイオセンサーのｍＧｓｉとの近接度によって実証される通り）。また、ＡＴ１Ｒ活性化の結果としての細胞膜におけるＣＸＣＲ２発現のこの増加は、細胞が、ＡｎｇＩＩの濃度範囲に加えて、ＣＸＣＬ８の固定濃度により共処理される場合に観察されるホスホリパーゼＣの活性の相乗作用（ＩＰ－１蓄積の相乗作用によって実証される通り）と一致する。
この実施例は、ＣＸＣＲ２の活性化が、ＡＴ１Ｒ内部移行の量を低減し、これに関して、ＡＴ１Ｒが活性化される場合にＣＸＣＲ２において観察される効果と相互一致することを実証する。しかしながら、対照的に、ＣＸＣＲ２の活性化は、トランスゴルジ網から最大で細胞膜までのＡＴ１Ｒの正の輸送を増加させず、それにより、これに関して、ＡＴ１Ｒが活性化される場合にＣＸＣＲ２において観察される効果と相互一致しない。
（実施例４）
ここで、図６～１５を参照して、ＢＲＥＴシグナルを、ビヒクルまたはアンタゴニスト／インバースアゴニスト（１０μＭ）による事前処理、続いて、５０分後に１０ｎＭのＣＸＣＬ８または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方（図１Ｂについてのデータを生成するために使用される濃度の１０分の１の濃度）のいずれかによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを一過性発現する細胞から測定した。アゴニスト処理（０分で添加される）の前に、ベースラインＢＲＥＴシグナルを、組合せのそれぞれについて２０分間記録した。データを、「ビヒクルに続いてビヒクル」（ｖｅｈ＞ｖｅｈ）のデータセットに対するリガンド誘導ＢＲＥＴとして計算した。
ここで、図６Ａを参照して、細胞を、「ビヒクルに続いてビヒクル」ベースラインを確立するための対照としてビヒクルで事前処理し、アンタゴニスト／インバースアゴニストを用いる後の実験について使用される濃度で、ＣＸＣＬ８のみ、ＡｎｇＩＩのみ、ならびに組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果を示す。
ここで、図６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅおよび６Ｆを参照して、細胞を、ＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（図６Ｂ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（図６Ｃ）、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；図６Ｄ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９（図６Ｅ）またはＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシン（図６Ｆ）で事前処理し、ＣＸＣＬ８の効果が完全に阻害されているが、ＡｎｇＩＩの効果が変化しないという結果を得た。組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの効果は、それぞれの場合において、ＡｎｇＩＩのみで観察される効果と区別できない。
ここで、図７Ａを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタンで事前処理し、ＡｎｇＩＩの効果が完全に阻害されているが、ＣＸＣＬ８の効果が変化していないという結果を得た。組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの効果は、ＣＸＣＬ８のみで観察される効果と区別できない。
ここで、図７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅおよび７Ｆを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、ならびにＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（図７Ｂ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（図７Ｃ）、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；図７Ｄ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９（図７Ｅ）またはＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシン（図７Ｆ）のいずれかとの両方で事前処理し、ＣＸＣＬ８のみの効果、ＡｎｇＩＩのみの効果または組み合わされた両方の効果が完全に阻害されているという結果を得た。
ここで、図８Ａを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのオルメサルタンで事前処理し、ＡｎｇＩＩの効果が完全に阻害されているが、ＣＸＣＬ８の効果が変化していないという結果を得た。組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの効果は、ＣＸＣＬ８のみで観察される効果と区別できない。
ここで、図８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、８Ｅおよび８Ｆを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのオルメサルタン、ならびにＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（図８Ｂ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（図８Ｃ）、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；図８Ｄ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９（図８Ｅ）またはＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシン（図８Ｆ）のいずれかとの両方で事前処理し、ＣＸＣＬ８のみの効果、ＡｎｇＩＩのみの効果または組み合わされた両方の効果が完全に阻害されているという結果を得た。
ここで、図９Ａを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのカンデサルタンで事前処理し、ＡｎｇＩＩの効果が完全に阻害されているが、ＣＸＣＬ８の効果が変化していないという結果を得た。組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの効果は、ＣＸＣＬ８のみで観察される効果と区別できない。
ここで、図９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅおよび９Ｆを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのカンデサルタン、ならびにＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（図９Ｂ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（図９Ｃ）、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；図９Ｄ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９（図９Ｅ）またはＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシン（図９Ｆ）のいずれかとの両方で事前処理し、ＣＸＣＬ８のみの効果、ＡｎｇＩＩのみの効果または組み合わされた両方の効果が完全に阻害されているという結果を得た。
ここで、図１０Ａを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのバルサルタンで事前処理し、ＡｎｇＩＩの効果が完全に阻害されているが、ＣＸＣＬ８の効果が変化していないという結果を得た。組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの効果は、ＣＸＣＬ８のみで観察される効果と区別できない。
ここで、図１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅおよび１０Ｆを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのバルサルタン、ならびにＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（図１０Ｂ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（図１０Ｃ）、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；図１０Ｄ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９（図１０Ｅ）またはＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシン（図１０Ｆ）のいずれかとの両方で事前処理し、ＣＸＣＬ８のみの効果、ＡｎｇＩＩのみの効果または組み合わされた両方の効果が完全に阻害されているという結果を得た。
ここで、図１１Ａを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのエプロサルタンで事前処理し、ＡｎｇＩＩの効果が完全に阻害されているが、ＣＸＣＬ８の効果が変化していないという結果を得た。組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの効果は、ＣＸＣＬ８のみで観察される効果と区別できない。
ここで、図１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅおよび１１Ｆを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのエプロサルタン、ならびにＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（図１１Ｂ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（図１１Ｃ）、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；図１１Ｄ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９（図１１Ｅ）またはＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシン（図１１Ｆ）のいずれかとの両方で事前処理し、ＣＸＣＬ８のみの効果、ＡｎｇＩＩのみの効果または組み合わされた両方の効果が完全に阻害されているという結果を得た。
ここで、図１２Ａを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのアジルサルタンで事前処理し、ＡｎｇＩＩの効果が完全に阻害されているが、ＣＸＣＬ８の効果が変化していないという結果を得た。組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの効果は、ＣＸＣＬ８のみで観察される効果と区別できない。
ここで、図１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｅおよび１２Ｆを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのアジルサルタン、ならびにＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（図１２Ｂ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（図１２Ｃ）、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；図１２Ｄ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９（図１２Ｅ）またはＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシン（図１２Ｆ）のいずれかとの両方で事前処理し、ＣＸＣＬ８のみの効果、ＡｎｇＩＩのみの効果または組み合わされた両方の効果が完全に阻害されているという結果を得た。
ここで、図１３Ａを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのロサルタンで事前処理し、ＡｎｇＩＩの効果が完全に阻害されているが、ＣＸＣＬ８の効果が変化していないという結果を得た。組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの効果は、ＣＸＣＬ８のみで観察される効果と区別できない。
ここで、図１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ、１３Ｅおよび１３Ｆを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのロサルタン、ならびにＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（図１３Ｂ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（図１３Ｃ）、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；図１３Ｄ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９（図１３Ｅ）またはＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシン（図１３Ｆ）のいずれかとの両方で事前処理し、ＣＸＣＬ８のみの効果、ＡｎｇＩＩのみの効果または組み合わされた両方の効果が完全に阻害されているという結果を得た。
ここで、図１４Ａを参照して、細胞を、ロサルタンの活性代謝物であるＡＴ１ＲアンタゴニストのＥＸＰ３１７４で事前処理し、ＡｎｇＩＩの効果が完全に阻害されているが、ＣＸＣＬ８の効果が変化していないという結果を得た。組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの効果は、ＣＸＣＬ８のみで観察される効果と区別できない。
ここで、図１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄ、１４Ｅおよび１４Ｆを参照して、細胞を、ロサルタンの活性代謝物であるＡＴ１ＲアンタゴニストのＥＸＰ３１７４、ならびにＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（図１４Ｂ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（図１４Ｃ）、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；図１４Ｄ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９（図１４Ｅ）またはＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシン（図１４Ｆ）のいずれかとの両方で事前処理し、ＣＸＣＬ８のみの効果、ＡｎｇＩＩのみの効果または組み合わされた両方の効果が完全に阻害されているという結果を得た。
ここで、図１５Ａを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのテルミサルタンで事前処理し、ＡｎｇＩＩの効果が完全に阻害されているが、ＣＸＣＬ８の効果が変化していないという結果を得た。組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの効果は、ＣＸＣＬ８のみで観察される効果と区別できない。
ここで、図１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ、１５Ｅおよび１５Ｆを参照して、細胞を、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのテルミサルタン、ならびにＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０（図１５Ｂ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（図１５Ｃ）、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３；図１５Ｄ）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９（図１５Ｅ）またはＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシン（図１５Ｆ）のいずれかとの両方で事前処理し、ＣＸＣＬ８のみの効果、ＡｎｇＩＩのみの効果または組み合わされた両方の効果が完全に阻害されているという結果を得た。
この実施例は、ＡＴ１Ｒ－ＣＸＣＲ２ヘテロマーにおけるＣＸＣＲ２およびＡＴ１Ｒの両方の活性化の際のＧｉ共役（Ｖｅｎｕｓ／ｍＧｓｉバイオセンサーへのＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８の近接度の増加によって示される）が、ＣＸＣＲ２アンタゴニスト、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストまたはＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニスト（ＣＸＣＲ２インバースアゴニストでもあるＣＸＣＲ２ネガティブアロステリックモジュレーターの例として）との組合せでのＡＴ１Ｒアンタゴニストの添加によって、完全に阻害されることを実証する。
（実施例５）
ここで、図１６を参照して、ＢＲＥＴシグナルを、ビヒクルまたはアンタゴニスト／インバースアゴニスト（１０μＭ）による事前処理、続いて、５０分後に、示された通りに、１０ｎＭのＣＸＣＬ８または１００ｎＭのＡｎｇＩＩのみ、または組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方（図４Ｂについてのデータを生成するために使用される濃度の１０分の１の濃度）のいずれかによる処理後に、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８、Ｖｅｎｕｓ／ＫｒａｓおよびＨＡ－ＡＴ１Ｒを一過性で発現する細胞から測定した。アゴニスト処理（０分で添加される）の前に、ベースラインＢＲＥＴシグナルを、組合せのそれぞれについて２０分間記録した。データを、「ビヒクルに続いてビヒクル」（ｖｅｈ＞ｖｅｈ）のデータセットに対するリガンド誘導ＢＲＥＴとして計算した。
ここで、図１６Ａを参照して、図４Ｂにおいて観察されるように、ＣＸＣＬ８処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８の細胞膜マーカーのＶｅｎｕｓ／Ｋｒａｓへの近接度の著しい低減をもたらし、ＣＸＣＲ２が、細胞に内部移行することを示す。しかしながら、対照的に、ＡｎｇＩＩ処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８およびＶｅｎｕｓ／Ｋｒａｓの近接度の増加をもたらし、細胞膜におけるＣＸＣＲ２の量を増加させるＡｎｇＩＩによるＡＴ１Ｒの活性化についての証拠を提供する。ＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理は、ＣＸＣＬ８のみと比較して、ＣＸＣＬ８によって誘導される内部移行の正味の効果、およびＡｎｇＩＩによるＡＴ１Ｒ活性化によって誘導されるＣＸＣＲ２の細胞膜への正の輸送であり得る、低いＣＸＣＲ２の正味の内部移行をもたらす。細胞を、「ビヒクルに続いてビヒクル」ベースラインを確立するための対照としてビヒクルで事前処理し、アンタゴニスト／インバースアゴニストを用いる後の実験について使用される濃度で、ＣＸＣＬ８のみ、ＡｎｇＩＩのみ、ならびに組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果を示す。
ここで、図１６Ｂを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンによる事前処理は、ＡｎｇＩＩの効果を完全に阻害した。
ここで、図１６Ｃを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンによる事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が、細胞がビヒクルで事前処理される場合にＣＸＣＬ８のみで観察される効果と区別できないという結果をもたらした。
ここで、図１６Ｄを参照して、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２またはＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０による事前処理は、ＡｎｇＩＩの効果を変化させなかった。
ここで、図１６Ｅを参照して、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２またはＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が、細胞がビヒクルで事前処理される場合にＡｎｇＩＩのみで観察される効果と区別できないという結果をもたらした。
ここで、１６Ｆを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が阻害されているという結果をもたらした。
ここで、１６Ｇを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が阻害されているという結果をもたらした。
ここで、１６Ｈを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が阻害されているという結果をもたらした。
ここで、図１７Ａを参照して、図４Ｈにおいて観察されるように、ＣＸＣＬ８処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ５への近接度の実質的な増加をもたらし、初期エンドソームにおけるＣＸＣＲ２の実質的な増加を示す。ＡｎｇＩＩのみは、初期エンドソームにおけるＣＸＣＲ２の非常に小さな増加をもたらすが、しかしながら、ＡｎｇＩＩによる共処理は、ＣＸＣＬ８の効果を実質的に低減する。これは、ＡｎｇＩＩによって活性化されたＡＴ１Ｒの存在下でのＣＸＣＲ２のＣＸＣＬ８誘導内部移行の低減と一致し、Ｋｒａｓデータで観察されるように、細胞膜における増加したＣＸＣＲ２をもたらす。細胞を、「ビヒクルに続いてビヒクル」ベースラインを確立するための対照としてビヒクルで事前処理し、アンタゴニスト／インバースアゴニストを用いる後の実験について使用される濃度で、ＣＸＣＬ８のみ、ＡｎｇＩＩのみ、ならびに組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果を示す。
ここで、図１７Ｂを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンによる事前処理は、ＡｎｇＩＩの効果を完全に阻害した。
ここで、図１７Ｃを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンによる事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が、細胞がビヒクルで事前処理される場合にＣＸＣＬ８のみで観察される効果と区別できないという結果をもたらした。
ここで、図１７Ｄを参照して、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）による事前処理は、ＡｎｇＩＩの効果を変化させなかったが、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２またはＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０による事前処理は、ＡｎｇＩＩの効果を阻害するように見えた。
ここで、図１７Ｅを参照して、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が、細胞がビヒクルで事前処理される場合にＡｎｇＩＩのみで観察される効果と区別できないという結果をもたらした。対照的に、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２またはＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０による事前処理は、ＣＸＣＬ８と同様にＡｎｇＩＩの効果を阻害するように見える。
ここで、１７Ｆを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が完全に阻害されているという結果をもたらした。
ここで、１７Ｇを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が完全に阻害されているという結果をもたらした。
ここで、１７Ｈを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が完全に阻害されているという結果をもたらした。
ここで、図１８Ａを参照して、図４Ｎにおいて観察されるように、ＣＸＣＬ８処理は、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ８への近接度の小さな減少をもたらす。際立って、ＡｎｇＩＩのみの処理は、組み合わされたＡｎｇＩＩおよびＣＸＣＬ８の両方による処理のように、ＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８のＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ８への近接度の明確な増加をもたらす。これらのデータは、ＡｎｇＩＩによるＡＴ１Ｒの活性化が、ＡｎｇＩＩによるＡＴ１Ｒの活性化の際にＶｅｎｕｓ／ＫｒａｓへのＣＸＣＲ２／Ｒｌｕｃ８の近接度の観察された増加と一致して、トランスゴルジ網から細胞膜へのＣＸＣＲ２の正の輸送を促進することを示す。細胞を、「ビヒクルに続いてビヒクル」ベースラインを確立するための対照としてビヒクルで事前処理し、アンタゴニスト／インバースアゴニストを用いる後の実験について使用される濃度で、ＣＸＣＬ８のみ、ＡｎｇＩＩのみ、ならびに組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果を示す。
ここで、図１８Ｂを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンによる事前処理は、ＡｎｇＩＩの効果を完全に阻害した。
ここで、１８Ｃを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンによる事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が完全に阻害されているという結果をもたらした。
ここで、図１８Ｄを参照して、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２またはＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０による事前処理は、ＡｎｇＩＩの効果を変化させなかった。
ここで、図１８Ｅを参照して、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２またはＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が、細胞がビヒクルで事前処理される場合にＡｎｇＩＩのみで観察される効果と区別できないという結果をもたらした。
ここで、１８Ｆを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が完全に阻害されているという結果をもたらした。
ここで、１８Ｇを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が完全に阻害されているという結果をもたらした。
ここで、１８Ｈを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が完全に阻害されているという結果をもたらした。
ここで、図１９Ａを参照して、ＡｎｇＩＩ処理は、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８の細胞膜マーカーのＶｅｎｕｓ／Ｋｒａｓへの近接度の著しい低減をもたらし、ＡＴ１Ｒが、細胞に内部移行することを示す。一部の細胞を、「ビヒクルに続いてビヒクル」ベースラインを確立するための対照としてビヒクルで事前処理し、アンタゴニスト／インバースアゴニストを用いる後の実験について使用される濃度で、ＡｎｇＩＩのみの効果を示す。ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンによる事前処理は、ＡｎｇＩＩの効果を完全に阻害した。
ここで、図１９Ｂを参照して、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果は、ＡｎｇＩＩのみで観察される効果よりもわずかに低かった（図１９Ａ）。ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンによる事前処理は、この効果を完全に阻害しているという結果をもたらした。
ここで、図１９Ｃを参照して、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２、ＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９またはＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシン（ｄａｎｉｒｘｉｎ）による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に観察される効果が、ビヒクルで事前処理される場合にＡｎｇＩＩのみで観察される効果と区別できないという結果をもたらした（図１９Ａ）。
ここで、１９Ｄを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が完全に阻害されているという結果をもたらした。
ここで、１９Ｅを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が完全に阻害されているという結果をもたらした。
ここで、１９Ｆを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が完全に阻害されているという結果をもたらした。
ここで、図２０Ａを参照して、ＡｎｇＩＩ処理は、ＡＴ１Ｒ／Ｒｌｕｃ８の初期エンドソームマーカーのＶｅｎｕｓ／Ｒａｂ５への近接度の著しい増加をもたらし、ＡＴ１Ｒが、細胞に内部移行することを示す。一部の細胞を、「ビヒクルに続いてビヒクル」ベースラインを確立するための対照としてビヒクルで事前処理し、アンタゴニスト／インバースアゴニストを用いる後の実験について使用される濃度で、ＡｎｇＩＩのみの効果を示す。ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンによる事前処理は、ＡｎｇＩＩの効果を完全に阻害した。
ここで、図２０Ｂを参照して、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果は、ＡｎｇＩＩのみで観察される効果よりも小さかった（図２０Ａ）。ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンによる事前処理は、この効果を完全に阻害しているという結果をもたらした。
ここで、図２０Ｃを参照して、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２、ＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０、ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＡＺＤ５０６９またはＣＸＣＲ２アンタゴニストのダニリキシンによる事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方による処理後に観察される効果が、ビヒクルで事前処理される場合にＡｎｇＩＩのみで観察される効果と区別できないという結果をもたらした（図１９Ａ）。
ここで、図２０Ｄを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２インバースアゴニストのナバリキシン（ＳＣＨ５２７１２３）による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が完全に阻害されているという結果をもたらした。
ここで、２０Ｅを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果がほぼ完全に阻害されているという結果をもたらした。
ここで、２０Ｆを参照して、ＡＴ１Ｒアンタゴニストのイルベサルタン、バルサルタンまたはアジルサルタンとの組合せでのＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニストのＳＢ２６５６１０による事前処理は、組み合わされたＣＸＣＬ８およびＡｎｇＩＩの両方の効果が完全に阻害されているという結果をもたらした。
この実施例は、ＡＴ１Ｒ－ＣＸＣＲ２ヘテロマーにおけるＣＸＣＲ２およびＡＴ１Ｒの両方の活性化の際に観察される内部移行に対する効果が、ＣＸＣＲ２アンタゴニスト、ＣＸＣＲ２インバースアゴニストまたはＣＸＣＲ２アロステリックインバースアゴニスト（ＣＸＣＲ２インバースアゴニストでもあるＣＸＣＲ２ネガティブアロステリックモジュレーターの例として）との組合せでのＡＴ１Ｒアンタゴニストの添加によって、阻害されることを実証する。
さらにまた、この実施例は、ＣＸＣＲ２の正の輸送に対する効果が、ＡＴ１Ｒアンタゴニストの添加によって完全に阻害されることを実証し、２つの受容体間の機能的相互作用をさらに支持し、ＡＴ１Ｒ活性化が細胞膜におけるＣＸＣＲ２発現を増加させるというより多くの証拠を提供する。次に、これは、ＣＸＣＲ２によって媒介される炎症シグナル伝達の増強に寄与する機構を提供し、したがって、慢性閉塞性肺疾患などの状態において炎症を低減するためにＡＴ１ＲならびにＣＸＣＲ２を阻害することについての論拠を提供する。

Claims (23)

  1. ａ）少なくとも１つのアンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）遮断剤；および
    ｂ）少なくとも１つのＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）経路阻害剤
    を含む医薬製剤。
  2. ＣＯＰＤである状態もしくは疾患の処置、改善または予防における使用のためのものである、請求項１に記載の医薬製剤。
  3. 前記ＣＯＰＤが、肺気腫、慢性気管支炎、気管支拡張症および難治性（不可逆性）喘息から選択される、請求項２に記載の医薬製剤。
  4. 前記ＣＸＣＲ２阻害剤および前記ＡＴ１Ｒ遮断剤が、
    ｉ）同じ剤形中で；
    ｉｉ）別々の剤形中で
    投与される、請求項１に記載の医薬製剤。
  5. 前記ＣＸＣＲ２阻害剤および前記ＡＴ１Ｒ遮断剤が、
    ｉ）同時に；
    ｉｉ）逐次的に
    投与される、請求項１に記載の医薬製剤。
  6. 前記ＣＸＣＲ２阻害剤が、直接ＣＸＣＲ２アンタゴニスト、ネガティブアロステリックＣＸＣＲ２モジュレーター、インバースアゴニストまたはアロステリックインバースアゴニストから選択される、請求項１に記載の医薬製剤。
  7. 状態もしくは疾患の処置、改善または予防のための方法であって、
    ｉ）対象に治療有効量の（ａ）アンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）遮断剤および（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）経路阻害剤の組合せを投与するステップ
    を含む、方法。
  8. 状態もしくは疾患の処置または予防のための剤形の製造のための、（ａ）少なくとも１つのアンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）遮断剤および（ｂ）少なくとも１つのＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）経路阻害剤の使用。
  9. 状態もしくは疾患の処置、改善または予防のためのキットであって、
    ｉ）少なくとも１つのアンジオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）遮断剤；
    ｉｉ）少なくとも１つのＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）経路阻害剤；および
    ｉｉｉ）使用説明書
    を含む、キット。
  10. 前記製剤が、ＣＯＰＤである状態もしくは疾患の処置、改善または予防における使用のためのものである、請求項７に記載の方法、請求項８に記載の使用または請求項９に記載のキット。
  11. 前記ＣＯＰＤが、肺気腫、慢性気管支炎、気管支拡張症および難治性（不可逆性）喘息から選択される、請求項１０に記載の方法、使用またはキット。
  12. 前記ＣＸＣＲ２阻害剤および前記ＡＴ１Ｒ遮断剤が、
    ｉ）同じ剤形中で；
    ｉｉ）別々の剤形中で
    投与される、請求項７に記載の方法、請求項８に記載の使用または請求項９に記載のキット。
  13. 前記ＣＸＣＲ２阻害剤および前記ＡＴ１Ｒ遮断剤が、
    ｉ）同時に；
    ｉｉ）逐次的に
    投与される、請求項７に記載の方法、請求項８に記載の使用または請求項９に記載のキット。
  14. 前記ＣＸＣＲ２阻害剤が、直接ＣＸＣＲ２アンタゴニスト、ネガティブアロステリックＣＸＣＲ２モジュレーター、インバースアゴニストまたはアロステリックインバースアゴニストから選択される、請求項７に記載の方法、請求項８に記載の使用または請求項９に記載のキット。
  15. 疾患の処置、改善または予防のための製剤における使用のための、少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤および少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤。
  16. 疾患の処置、改善または予防のための製剤における使用のための少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤であって、対象に、少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤と同時または逐次的に投与される、少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤。
  17. 疾患の処置、改善または予防のための製剤における使用のための少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤であって、対象に、少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤と同時または逐次的に投与される、少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤。
  18. 前記疾患が、ＣＯＰＤである、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の使用のための少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤および少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤。
  19. 前記ＣＯＰＤが、肺気腫、慢性気管支炎、気管支拡張症および難治性（不可逆性）喘息から選択される疾患である、請求項１８に記載の使用のための少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤および少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤。
  20. 前記少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤および／または少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤が、
    ｉ）別々の剤形中で；
    ｉｉ）同じ剤形中で
    投与される、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の使用のための少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤または使用のための少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤。
  21. ｉ）同時に；
    ｉｉ）逐次的に
    投与される、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の使用のための少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤および少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤。
  22. 直接ＣＸＣＲ２アンタゴニスト、ネガティブアロステリックＣＸＣＲ２モジュレーター、インバースアゴニストまたはアロステリックインバースアゴニストから選択される、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の使用のための少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤。
  23. 前記ＡＴ１Ｒ遮断剤を含有する剤形が、約５ｍｇ～１ｇの前記ＡＴ１Ｒ遮断剤を含み、前記ＣＸＣＲ２阻害剤を含有する剤形が、約５ｍｇ～１ｇの前記ＣＸＣＲ２阻害剤を含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の使用のための少なくとも１つのＡＴ１Ｒ遮断剤および／または少なくとも１つのＣＸＣＲ２阻害剤。
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