KR20220070275A - 올리고뉴클레오티드 기반 생체외 세포 요법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 요법을 위한 준비로 단리된 세포에서 표적 RNA의 발현을 감소시키는 방법으로서, 표적 RNA를 포함하는 단리된 세포를 형질감염 수단을 사용하지 않고 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 0일 내지 21일의 기간 내에 단리된 세포에 적어도 1회 투여되고, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드와의 인큐베이션 0일부터 최대 8주까지 표적 RNA와 혼성화하여 표적 RNA의 전사를 감소시키거나 표적 RNA에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 이들의 조합을 감소시키는, 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 단리된 세포 및 단리된 세포를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 단리된 세포 및 약학적 조성물은 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용된다.
Description
본 발명은 세포 요법에서의 사용을 위한 준비로 단리된 세포에서 표적 RNA를 감소시키는 생체외 방법, 상기 방법을 통해 수득될 수 있는 단리된 세포 및 단리된 세포를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 단리된 세포 및 약학적 조성물은 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다.
세포 요법(세포성 요법(cellular therapy) 또는 세포요법(cytotherapy)으로도 칭해짐)은 세포성 물질을 환자에게 주사, 이식 또는 삽입하는, 즉 세포성 물질을 살아있는 온전한 세포에 주사, 이식 또는 삽입하는 요법이다. 세포는 환자(자가 세포) 또는 공여자(동종이계 세포)로부터 유래할 수 있다. 세포 요법에서 사용되는 세포는 상이한 세포 유형으로 변환할 수 있는 이의 잠재력에 따라 분류될 수 있다. 만능 세포(pluripotent cell)는 신체의 임의의 세포 유형으로 변환할 수 있고 다분화능 세포(multipotent cell)는 다른 세포 유형으로 변환할 수 있지만, 이의 레퍼토리는 만능 세포의 것보다 제한적이다. 분화된 또는 1차 세포는 고정된 유형이다. 투여되는 세포의 유형은 치료에 의해 좌우된다. 예를 들어, 세포-매개 면역을 통해 암 세포와 싸울 수 있는 T 세포는 면역요법 과정 중에 주사될 수 있다. 세포 요법은 다수의 기관에서 및 여러 세포 전달 방식에 의해 많은 임상 적응증을 대상으로 한다. 따라서, 요법에 관련된 특정 작용 기전은 광범위하다.
예를 들어, 줄기 세포 또는 전구 세포(progenitor cell) 생착, 분화 및 손상된 조직의 장기간 교체. 이러한 패러다임에서, 다분화능 또는 단분화능 세포는 실험실에서 또는 손상 부위에 (국소 또는 전신 투여를 통해) 도달한 후 특정 세포 유형으로 분화한다. 그 다음, 이들 세포는 손상 부위에 통합되어 손상된 조직을 대체하고 따라서 장기 또는 조직의 기능 개선을 촉진한다. 이것의 예는 심근 경색 후 심근 세포를 대체하기 위한 세포의 사용이다.
측분비 또는 내분비 방식으로 작용하는 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자와 같은 가용성 인자를 방출하는 능력을 갖는 세포. 이들 인자는 장기 또는 영역의 자가-치유를 촉진한다. (국소 또는 전신 투여를 통해) 전달된 세포는 비교적 짧은 기간(수일 내지 수주) 동안 생존한 후 사멸한다. 이것은 관련 치료 인자를 자연적으로 분비하거나 세포가 특정 분자를 대량으로 방출하도록 유발하는 후성적 변화 또는 유전 공학을 겪는 세포를 포함한다. 이것의 예로는 혈관신생, 항염증 및 항-아폽토시스(apoptosis)를 촉진하는 인자를 분비하는 세포가 포함된다.
면역 세포, 혈액 세포 또는 피부 세포와 같은 세포는 일반적으로 정확한 조건이 주어지면 생체외에서 재생할 수 있다. 이를 통해 분화된 성체 면역 세포를 세포 요법에 사용할 수 있다. 세포는 신체로부터 제거되고 혼합된 세포 집단으로부터 단리되고 변형된 다음, 신체로 복귀시키기 전에 증대(expand)될 수 있다. 최근에 개발된 세포 요법은 질환-유발 세포를 사멸시키는 면역 효력을 증가시키도록 유전자 변형된 성체 자가-재생 T 림프구의 전달을 포함한다.
세포 요법의 잠재적 적용은 암, 자가면역 질환, 비뇨기 문제 및 감염성 질환의 치료, 관절의 손상된 연골의 재건, 척수 손상의 복구, 약화된 면역계의 개선 또는 또는 신경계 장애 환자의 지원을 포함한다.
단점은 불만족스러운 활성이며 이에 따라 상이한 세포 요법들 및 해당 세포 요법의 불만족스러운 결과는 종종 심각한 부작용- 이중 일부는 생명에 위협적임- 을 유발하며 이는 경험이 풍부한 전문가에 의해 관리되어야 한다. 이들 부작용은 예를 들어 변형된 세포가 빠르게 증식하여 사이토카인이라 칭해지는 물질을 대량으로 방출할 때 발생한다. 심각한 사이토카인 방출 증후군은 생명에 위협적인 다기관 손상 및 뇌 부종을 유발할 수 있다. 따라서, 세포 요법에 사용되는 변형된 세포는 사이토카인 방출 증후군, 신경학적 독성, "종양 외의 표적 작용(on target/off tumor)" 인식 및 아나필락시스를 포함하는 예상된 및 예상치 못한 독성을 유발하는 능력을 갖고 있다.
따라서, 부작용이 감소되고 적어도 기존의 세포 요법의 효율성 또는 심지어 증가된 효율성을 갖는 세포 요법을 개발할 긴급한 요구가 있다. 본 발명은 이러한 요구를 만족시킨다.
본 발명은 세포 요법을 위한 준비로 단리된 세포에서 표적 RNA의 발현을 감소시키는 방법으로서, 표적 RNA를 포함하는 단리된 세포를 형질감염 수단의 사용 없이 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 0일 내지 21일의 기간 내에 단리된 세포에 적어도 1회 투여되고, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드와의 인큐베이션 0일부터 최대 8주까지 표적 RNA와 혼성화하고 표적 RNA의 전사를 감소시키거나 표적 RNA의 전사를 감소시키거나 표적 RNA에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 이들의 조합을 감소시키는, 방법에 관한 것이다. 표적 RNA는 예를 들어 mRNA, 프리(pre)-mRNA, lncRNA 및/또는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 세포는 예를 들어 면역 세포이다. 면역 세포는 예를 들어 T 세포, 수지상 세포, 자연 살해(NK) 세포, 말초혈 단핵 세포(PBMC), 줄기 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포 및/또는 유도 만능 줄기 세포, B 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 면역 세포는 T-세포이고 표적 RNA는 예를 들어 PD-1, TIGIT, TIM-3, LAG-3, TGFBR, CD39, CD73, 2B4, BTLA, VISTA, CD304, PQR-prot, Chop, XBP1, PERK, FOXP3, GMCSF, IFNg, TNFa, TGFb, IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-9, STAT3, IL-6 수용체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 면역 세포의 효능 및/또는 안전성에 영향을 미치는 단백질을 코딩하거나, 표적 RNA는 예를 들어 BID, BIM, BAD, NOXA, PUMA, BAX, BAK, BOK, BCL-rambo, BCL-Xs, Hrk, Blk, BMf, p53 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 면역 세포의 증대 및/또는 생존에 영향을 미치는 단백질을 코딩한다.
단리된 세포는 예를 들어 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하기 전 또는 후에 유전자 전달 기술에 의해 유전자 변형된다. 임의로, 면역 세포와 같은 단리된 유전자 변형된 세포는 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하기 전 또는 후에 증대된다.
본 발명의 세포 요법에서의 사용을 위한 준비로 단리된 세포에서 표적 RNA의 발현을 감소시키는 방법은 임의로 단리된 세포를 면역 세포와 같은 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하기 전 및/또는 후에 정제하는 단계를 추가로 포함한다 .
임의로, 본 방법은 면역 세포와 같은 단리된 세포를 면역 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하기 전 및/또는 후에 농축시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 임의로 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단리된 면역 세포에 첨가된다.
임의로, 본 방법은 면역 세포와 같은 단리된 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션할 때, 면역 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하기 전, 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션한 후 또는 이들의 조합에서 냉동보존하는 단계를 추가로 포함한다.
세포 요법에서의 사용을 위한 준비로 단리된 세포에서 표적 RNA의 발현을 감소시키는 방법에 사용되는 단리된 면역 세포의 경우에, 세포는 T-세포, 또는 수지상 세포, 자연 살해(NK) 세포, 말초혈 단핵 세포(PBMC), 줄기 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포 및/또는 유도 만능 줄기 세포, B 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
표적 RNA는 예를 들어, PD-1, TIGIT, TIM-3, LAG-3, TGFBR, CD39, CD73, 2B4, BTLA, VISTA, CD304, PQR-prot, Chop, XBP1, PERK, FOXP3, GMCSF, IFNg, TNFa, TGFb, IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-9, STAT3, IL-6 수용체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 면역 세포, 예컨대 수지상 세포, 자연 살해(NK) 세포, 말초혈 단핵 세포(PBMC), 줄기 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포 및/또는 유도 만능 줄기 세포, B 세포 및 이들의 조합의 효능 및/또는 안전성에 영향을 미치는 단백질을 코딩하거나, 표적 RNA는 예를 들어, BID, BIM, BAD, NOXA, PUMA, BAX, BAK, BOK, BCL-rambo, BCL-Xs, Hrk, Blk, BMf, p53 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 면역 세포의 증대 및/또는 생존에 영향을 미치는 단백질을 코딩한다.
본 발명의 방법에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 0일 내지 21일, 0일 내지 20일, 0일 내지 19일, 0일 내지 18일, 0일 내지 17일, 0일 내지 16일, 0일 내지 15일, 0일 내지 14일, 0일 내지 13일, 0일 내지 12일, 0일 내지 11일, 0일 내지 10일, 0일 내지 9일, 0일 내지 8일, 0일 내지 7일, 0일 내지 6일, 0일 내지 5일, 0일 내지 4일, 0일 내지 3일, 0일 내지 2일 또는 0일 내지 1일의 기간 내에 투여된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 기간의 매일, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 7일마다, 8일마다, 9일마다 또는 10일마다 투여된다.
임의로, 본 발명의 방법에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 동일한 기간 동안 동일한 시점에 또는 동일하거나 상이한 기간 동안 상이한 시점에 투여되는 2가지 이상의 표적 RNA와 혼성화한다.
본 발명은 추가로 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 단리된 면역 세포와 같은 세포에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 면역 세포는 질환을 앓고 있는 환자 또는 건강한 대상체로부터 유래하고, 본 발명의 방법에 따라 표적 RNA와 혼성화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 생체외 인큐베이션되어 표적 RNA의 발현을 감소시키고, 단리된 면역 세포와 안티센스 올리고뉴클레오티드의 인큐베이션 후, 단리된 면역 세포는 환자에게 재도입되거나 환자에게 도입된다. 따라서, 면역 세포는 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있고 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용된다.
또한, 본 발명은 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 단리된 면역 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 질환을 앓고 있는 환자 또는 건강한 대상체는 예를 들어 인간 또는 인간이 아닌 동물이다. 질환은 예를 들어 암, 자가면역 질환, 이식편대숙주 질환 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
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도 1은 단리된 세포의 초기 시딩(seeding) 밀도와 무관한 표적 RNA의 강력한 녹다운(knockdown)을 도시한다.
도 2는 이전의 안티센스 올리고뉴클레오티드 인큐베이션에 기초한 냉동보존 후 표적 RNA 발현의 감소를 나타낸다.
도 3은 수지상 세포에서 2가지 상이한 안티센스 올리고뉴클레오티드와의 병렬 인큐베이션을 통한 상이한 표적 RNA의 발현의 병렬 감소를 도시한다.
도 4a는 상이한 표적 RNA의 발현의 병렬 감소를 도시하고, 도 4b는 T 세포에서 2가지 상이한 안티센스 올리고뉴클레오티드와의 병렬 인큐베이션을 통한 상이한 단백질의 발현의 병렬 감소를 도시한다.
도 5는 표적-특이적 siRNA와 비교하여 T 세포에서 표적-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드의 우수한 표적 RNA 감소를 나타낸다.
도 2는 이전의 안티센스 올리고뉴클레오티드 인큐베이션에 기초한 냉동보존 후 표적 RNA 발현의 감소를 나타낸다.
도 3은 수지상 세포에서 2가지 상이한 안티센스 올리고뉴클레오티드와의 병렬 인큐베이션을 통한 상이한 표적 RNA의 발현의 병렬 감소를 도시한다.
도 4a는 상이한 표적 RNA의 발현의 병렬 감소를 도시하고, 도 4b는 T 세포에서 2가지 상이한 안티센스 올리고뉴클레오티드와의 병렬 인큐베이션을 통한 상이한 단백질의 발현의 병렬 감소를 도시한다.
도 5는 표적-특이적 siRNA와 비교하여 T 세포에서 표적-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드의 우수한 표적 RNA 감소를 나타낸다.
본 발명은 세포 요법에서의 사용을 위한 준비로 면역 세포와 같은 단리된 세포에서 표적 RNA의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 짐노틱(gymnotic) 형질감염과 같이 표적 RNA를 포함하는 면역 세포와 같은 단리된 세포를 형질감염 수단의 사용 없이 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 0일 내지 21일의 기간 내에 면역 세포와 같은 단리된 세포에 적어도 1회 투여된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드와의 인큐베이션 0일부터 최대 8주까지 표적 RNA와 혼성화하고 표적 RNA의 전사를 감소시키거나 표적 RNA에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 이들의 조합을 감소시킨다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여는 표적 RNA의 전사, 기능 및/또는 발현을 영구적으로 차단하지 않기 때문에, RNA 전사, 기능 및/또는 발현의 영구적 차단에 기초한 부작용이 회피된다. 또한, 형질감염 수단의 부재 하의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여는 세포에 대한 스트레스를 상당히 감소시키고 다른 형질감염 수단에 의해 야기되는 부작용을 감소시키거나 심지어 회피한다.
이하, 본 발명의 요소에 대하여 보다 상세하게 설명한다. 이들 요소는 구체적 실시양태와 함께 나열되지만, 추가 실시양태를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 다양하게 설명된 예 및 실시양태는 본 발명을 명시적으로 설명된 실시양태로만 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이러한 설명은 명시적으로 설명된 실시양태를 임의의 수의 개시된 요소와 조합하는 실시양태를 뒷받침하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 더욱이, 본 출원에서 설명된 모든 요소의 임의의 순열 및 조합은 문맥이 달리 지시하지 않는 한 본 출원의 설명에 의해 개시되는 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형어는 언급된 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 군의 포함을 암시하지만, 임의의 다른 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 군의 배제를 암시하지는 않는다. 본 발명을 설명하는 맥락에서(특히 청구범위의 맥락에서) 사용되는 용어들(원문의 "a", "an" 및 "the") 및 유사한 지시대상은 본원에서 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 명백하게 부인되지 않는 한, 단수형과 복수형 둘 다를 포함하는 것으로 해석될 것이다. 본원에서의 값 범위의 언급은 단순히 그 범위에 포함되는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 단축 방법으로서 기능하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 그것이 본원에서 개별적으로 열거되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 본원에 기재된 모든 방법은, 본원에서 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 명백하게 부인되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 실시될 수 있다. 본원에서 제공되는 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "와 같은(예컨대)", "예를 들어")의 사용은 단순히 본 발명을 더 잘 예시하기 위함이고, 청구된 본 발명의 범위를 달리 한정하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 발명의 세포는 예를 들어 면역 세포, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 예컨대 유도 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포 또는 이들의 조합이다. 면역 세포는 예를 들어 T-세포, 또는 수지상 세포, 자연 살해(NK) 세포, 말초혈 단핵 세포(PBMC), 줄기 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포 및/또는 또는 유도 만능 줄기 세포, B 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
T-세포가 선택되는 경우, T-세포는 예를 들어 PD-1, TIGIT, TIM-3, LAG-3, TGFBR, CD39, CD73, 2B4, BTLA, VISTA, CD304, PQR-prot, Chop, XBP1, PERK, FOXP3, GMCSF, IFNg, TNFa, TGFb, IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-9, STAT3, IL-6 수용체, BID, BIM, BAD, NOXA, PUMA, BAX, BAK, BOK, BCL-rambo, BCL-Xs, Hrk, Blk, BMf, p53 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 발현한다. T-세포가 선택되는 경우, 표적 RNA는 예를 들어 PD-1, TIGIT, TIM-3, LAG-3, TGFBR, CD39, CD73, 2B4, BTLA, VISTA, CD304, PQR-prot, Chop, XBP1, PERK, FOXP3, GMCSF, IFNg, TNFa, TGFb, IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-9, STAT3, IL-6 수용체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, T-세포의 효능 및/또는 안전성에 영향을 미치는 단백질을 코딩하거나, BID, BIM, BAD, NOXA, PUMA, BAX, BAK, BOK, BCL-rambo, BCL-Xs, Hrk, Blk, BMf, p53 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, T-세포의 증대 및/또는 생존에 영향을 미치는 단백질을 코딩한다.
면역 세포, 예컨대 T 세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 말초혈 단핵 세포, 줄기 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포 및/또는 유도 만능 줄기 세포, B 세포는 예를 들어 키메라 항원 수용체와 같은 항원-특이적 수용체 또는 T 세포 수용체와 같은 면역 세포 수용체를 발현하도록 유전자 변형된다. 이들 세포는 항원-특이적 수용체를 통해 종양 세포의 표면 상의 항원을 인식하여 T 세포와 같은 면역 세포의 활성화를 유도함으로써 항종양 기능을 발휘할 수 있다. T 세포와 같은 활성화된 면역 세포는 예를 들어 사이토카인 및 독성 분자를 방출하여 종양 세포의 파괴를 유도한다.
본 발명에 따른 표적 RNA의 발현을 감소시키는 것은 상이한 양의 표적 RNA의 전사, 기능 및/또는 발현을 감소시키는 것 내지 최대 완전한 억제를 의미한다. 세포에서의 전사, 기능 및/또는 발현 수준은 예를 들어 처리, 즉 올리고뉴클레오티드의 투여 전과 처리 후에 표적 RNA의 전사, 기능 및/또는 발현 수준을 측정하고 비교함으로써 결정된다.
표적 RNA는 예를 들어 mRNA, 프리-mRNA, lncRNA 및/또는 miRNA이다. 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 특정 서열과 혼성화하고 이러한 서열로 이루어지거나 이러한 서열을 포함하는 표적 RNA의 전사, 기능 및/또는 발현을 감소시킨다. 표적 RNA는 예를 들어 질환의 유발 및/또는 유지에 직접 또는 간접적으로 관여한다. 표적 RNA는 예를 들어 증식의 증가, 탈진(exhaustion)의 감소, 더 빠른 세포 성장, 대사 활성의 증가, 기능의 개선, 면역조절 효과의 개선 및 세크레톰(secretome)의 효율성의 증가 및/또는 효력의 증가에 직접 또는 간접적으로 영향을 미친다. 본 발명의 방법은 면역 세포와 같은 세포에서 표적 RNA의 양의 감소를 초래한다.
lncRNA는 예를 들어 신호, 미끼, 스캐폴드, 가이드, 인핸서 RNA 및 심지어 짧은 펩티드로서 기능할 수 있다. 신호 lncRNA의 주요 기능은 예를 들어 다양한 자극에 반응하여 전사를 조절하는 분자 신호 역할을 하는 것이다. 미끼 lncRNA는 예를 들어 "미끼" 결합 부위를 제시함으로써 조절 인자의 이용가능성을 제한한다. lncRNA는 예를 들어 전사 인자, 촉매 단백질, 더 큰 염색질 변형 복합체의 서브유닛뿐만 아니라 miRNA를 포함하는 조절 인자를 격리하여 이들의 이용가능성을 감소시킴으로써 전사를 조절한다. lncRNA의 스캐폴드 부류의 전사체는 예를 들어 리보핵단백질(RNP) 복합체와 같은 다성분 복합체의 조립을 위한 플랫폼을 제공함으로써 구조적 역할을 한다. 가이드 lncRNA는 RNP와 상호작용하고 RNP를 예를 들어 특정 표적 유전자로 지시한다. 이들 가이드 lncRNA는 예를 들어 RNP의 적절한 국재화에 필수적이다. 인핸서 RNA(eRNA)는 인핸서 영역으로부터 생성되며 예를 들어 "염색질 상호작용"으로 알려진 DNA의 3차원(3D) 구성에 영향을 미친다. 또한, lncRNA는 예를 들어 짧은 조절 펩티드를 코딩한다.
표적 RNA는 예를 들어 PD-1, TIGIT, TIM-3, LAG-3, TGFBR, CD39, CD73, 2B4, BTLA, VISTA, CD304, PQR-prot, Chop, XBP1, PERK, FOXP3, GMCSF, IFNg, TNFa, TGFb, IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-9, STAT3, IL-6 수용체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 면역 세포의 효능 및/또는 안전성에 영향을 미치는 단백질을 코딩하거나, BID, BIM, BAD, NOXA, PUMA, BAX, BAK, BOK, BCL-rambo, BCL-Xs, Hrk, Blk, BMf, p53 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 면역 세포의 증대 및/또는 생존에 영향을 미치는 단백질을 코딩한다.
올리고뉴클레오티드는 직접적 및/또는 간접적 효과를 갖는다: 이는 관심대상의 인자, 예를 들어 PD-1, TIGIT, TIM-3, LAG-3, TGFBR, CD39, CD73, 2B4, BTLA, VISTA, CD304, PQR-prot, Chop, XBP1, PERK, FOXP3, GMCSF, IFNg, TNFa, TGFb, IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-9, STAT3, IL-6 수용체, BID, BIM, BAD, NOXA, PUMA, BAX, BAK, BOK, BCL-rambo, BCL-Xs, Hrk, Blk, BMf, p53 또는 이들의 조합을 발현하는 표적 RNA와 혼성화하고/하거나(직접적 효과), 이는 관심대상의 인자에 영향을 미치는, 예를 들어 관심대상의 인자를 억제하거나 활성화하는 다른 인자의 표적 RNA와 혼성화한다(간접적 효과).
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 압타머이다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 가교된 뉴클레오티드, 예를 들어 잠금 핵산(locked nucleic acid: LNA, 예를 들어, 2',4'-LNA), cET, ENA, 2'플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 변형을 포함한다.
단리된 세포에서 표적 RNA의 감소는 예를 들어, 각각 단리된 세포의 및 단리된 세포에서의 더 높은 증식, 더 적은 탈진, 더 빠른 성장, 더 강력한 세크레톰, 더 높은 대사 활성, 더 우수한 기능, 개선된 면역조절 효과, 더 적은 부작용, 유리한 사이토카인 프로파일 및/또는 더 높은 효능의 원인이 된다.
본 발명의 방법에서 사용되는 세포는 예를 들어 인간 또는 인간이 아닌 동물로부터 단리된다. 인간 동물은 예를 들어 임의의 유전적 배경을 가진 인간이고; 인간이 아닌 동물은 임의의 유전적 배경을 가진, 말, 소, 돼지, 양, 고양이, 개, 기니피그, 햄스터 등과 같은 포유동물; 송어, 연어, 잔더(zander)와 같은 어류; 거위, 오리, 타조 등과 같은 조류를 포함한다.
단리된 세포는 1) (생)화학적 방법에 의한 형질감염, 2) 물리적 방법에 의한 형질감염 및 3) 바이러스-매개 형질도입을 포함하는 유전자 전달 기술에 의해 임의로 유전자 변형된다. (생)화학적 방법은 예를 들어 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란을 사용한 형질감염 또는 리포펙션이고; 물리적 방법은 예를 들어 전기천공, 뉴클레오펙션, 미세주사, 입자 충격에 의한 형질감염 또는 초음파에 의한 형질감염이고; 바이러스-매개 형질도입은 예를 들어 고 수준의 일시적 발현을 갖는 단기간 감염을 위한 아데노바이러스, 장기간 발현을 위한 헤르페스바이러스 또는 숙주 세포 게놈 내로의 DNA의 안정한 통합을 위한 레트로바이러스를 사용한다. 유전자 변형 후 세포가 증대된다.
단리된 세포는 예를 들어 유전자 변형 전 또는 후에 및/또는 유전자 변형된 세포의 증대 전 또는 후에 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션된다. 임의로, 단리된 세포는 올리고뉴클레오티드와의 인큐베이션 전 및/또는 후에 예를 들어 1회 이상의 세척 단계에 의해 정제된다.
본 발명의 방법은 임의로 농축 단계를 포함하며, 여기서 단리된 세포는 올리고뉴클레오티드와의 인큐베이션 전 및/또는 후에 당업계의 임의의 농축 방법을 통해 농축된다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 농축 단계 후에 단리된 세포에 다시 투여된다.
추가로, 단리된 세포는 예를 들어 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션될 때, 올리고뉴클레오티드와의 인큐베이션 전 및/또는 올리고뉴클레오티드와의 인큐베이션 후, 임의의 정제 단계 후, 임의의 농축 단계 후 또는 이들의 조합에서 냉동보존된다. 면역 세포와 같은 냉동보존된 단리된 세포는 놀랍게도 표적 RNA의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 녹다운 효능을 유지한다. 표적 RNA의 전사 및/또는 번역의 감소 또는 증가에 있어서 및/또는 표적 RNA의 감소에 있어서 비-냉동보존된 단리된 세포와 비교하여 냉동보존된 단리된 세포 효능은 매우 유사하다.
본 발명에 따른 단리는 공급원으로부터 세포를 수득하는 것, 예를 들어 혈액으로부터 면역 세포, 골수 또는 탯줄의 혈액 등으로부터 줄기 세포를 수득하는 것 및/또는 이전에 단리된 세포 또는 세포 집단로부터 세포의 하위집단을 수득하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 정제는 예를 들어 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 등을 통해 세포외 물질과 같은 원하지 않는 물질로부터 단리된 세포를 세정하는 것을 의미한다.
본 발명의 방법은 임의로 활성화 단계를 포함하며, 여기서 단리된 세포는 올리고뉴클레오티드와의 인큐베이션 전 및/또는 후에, 예를 들어 T 세포 표면 상의 CD3 또는 CD23에 특이적인 단클론 항체를 사용하여 세포를 자극함으로써 또는 CD40 리간드(CD40L)를 사용하여 B 세포를 자극함으로써 당업계의 임의의 활성화 방법을 통해 활성화된다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 활성화 단계 후에 단리된 세포에 다시 투여된다.
본 발명의 방법은 임의로 증대 단계를 포함하며, 여기서 단리된 세포는 예를 들어 올리고뉴클레오티드와의 인큐베이션 전 및/또는 후에 중간엽 줄기 세포에 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF2)를 첨가함으로써 또는 올리고뉴클레오티드와의 인큐베이션 전 및/또는 후에 NK 세포에 인터루킨-2(IL-2) 및/또는 인터루킨-15(IL-15)를 첨가함으로써 당업계의 임의의 증대 방법을 통해 증대된다.
본 발명의 방법은 임의로 분화 단계를 포함하며, 여기서 단리된 세포는 예를 들어 올리고뉴클레오티드와의 인큐베이션 전 및/또는 후에 세포에 인터루킨-4(IL-4) 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 첨가함으로써 미성숙 DC로 분화되는 단핵구이다.
본 발명의 방법은 임의로 성숙 단계를 포함하며, 여기서 단리된 세포는 예를 들어 미성숙 DC이며, 이는 예를 들어 R848 또는 LPS와 같은 톨(toll)-유사 수용체 리간드를 첨가하거나 인터페론 감마(IFN-γ)와 같은 사이토카인을 첨가함으로써 성숙한 DC로 성숙되는, 예를 들어 상기 기재한 바와 같은 단핵구의 분화 단계로부터 유래하는 천연 미성숙 DC 또는 인공 미성숙 DC이다.
단리된 세포는 예를 들어 0일 내지 21일, 0일 내지 20일, 0일 내지 19일, 0일 내지 18일, 0일 내지 17일, 0일 내지 16일, 0일 내지 15일, 0일 내지 14일, 0일 내지 13일, 0일 내지 12일, 0일 내지 11일, 0일 내지 10일, 0일 내지 9일, 0일 내지 8일, 0일 내지 7일, 0일 내지 6일, 0일 내지 5일, 0일 내지 4일, 0일 내지 3일, 0일 내지 2일 또는 0일 내지 1일의 기간(인큐베이션 기간) 동안 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션된다. 0일은 제1 올리고뉴클레오티드가 단리된 세포에 처음으로 첨가되는 날이다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 단리된 세포에 1회만 첨가되거나, 또는 기간 동안 매일 또는 기간의 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 7일마다, 8일마다, 9일마다, 10일마다 또는 기간의 첫날 및 마지막 날에만 첨가되고, 이는 투여 패턴을 나타낸다. 인큐베이션 기간 동안 임의의 투여 패턴이 조합될 수 있으며, 예를 들어 인큐베이션 기간은 0일 내지 9일이며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 5일 동안 매일 및 4일 동안 2일마다 투여된다. 해당 기간 후에, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 단리된 세포로부터 제거된다. 올리고뉴클레오티드는 나노몰 또는 마이크로몰 범위, 예를 들어 0,1 nmol 내지 1000 μmol, 0,5 nmol 내지 900 μmol, 1 nmol 내지 800 μmol, 50 nmol 내지 700 μmol, 100 nmol 내지 600 μmol, 200 nmol 내지 500 μmol, 300 nmol 내지 400 μmol, 500 nmol 내지 300 μmol, 600 nmol 내지 200 μmol, 700 nmol 내지 100 μmol 또는 800 nmol 내지 50 μmol로 단리된 세포에 첨가된다.
올리고뉴클레오티드는 예를 들어 인큐베이션 기간의 0일부터 적어도 10주 동안, 적어도 8주 동안, 적어도 6주 동안 또는 적어도 4주 동안 표적 RNA의 발현을 감소시킨다. 표적 RNA의 발현 감소는 예를 들어 올리고뉴클레오티드와의 인큐베이션 기간과 무관하다. 표적 RNA의 발현의 이들 감소 조건은 상기 언급한 각각의 인큐베이션 기간에 도달한다.
단리된 세포는 예를 들어 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10가지의 상이한 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션된다. 상이한 올리고뉴클레오티드는 동일한 기간 동안 동일한 시점에서, 상이한 기간 동안 동일한 시점에서, 동일한 기간 동안 상이한 시점에서 또는 상이한 기간 동안 상이한 시점에서 단리된 세포에 투여된다.
대안적으로 또는 추가적으로, 표적 RNA는 하나 이상의 표적 RNA이고, 즉 동일한 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 하나 초과의 표적 RNA의 발현을 감소시키고, 상이한 올리고뉴클레오티드는 상이한 표적 RNA의 발현을 감소시키며, 예를 들어 동시에 또는 후속적으로 관심 인자에 대한 직접적 및/또는 간접적 효과를 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 단리된 면역 세포와 같은 단리된 세포에 관한 것이다. 단리된, 예를 들어 면역 세포는 예를 들어 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 세포를 예를 들어 질환을 앓고 있는 환자 또는 건강한 대상체로부터 단리하고, 단리된 세포를 본 발명의 방법에 따라 표적 RNA와 혼성화하는 올리고뉴클레오티드와 함께 생체외에서 인큐베이션한다. 단리된 면역 세포와 같은 단리된 세포를 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션한 후, 단리된 세포를 이 세포가 단리된 환자에게 재도입한다. 대안적으로, 건강한 대상체로부터 단리되고 본 발명의 방법에 따라 표적 RNA와 혼성화하는 올리고뉴클레오티드와 함께 생체외 인큐베이션된 세포를 환자에게 도입한다. 질환을 앓고 있는 환자는 예를 들어 증식의 증가, 탈진의 감소, 더 빠른 세포 성장, 대사 활성의 증가, 기능의 개선, 면역조절 효과의 개선 및 세크레톰의 효율성의 증가 및/또는 효력의 증가에 직접 또는 간접적으로 영향을 미치는 RNA를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에 의해 치료될 수 있다. 따라서, 본 발명은 동종이계 세포 요법을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 환자에게 정맥내, 복강내, 근육내 및/또는 피하로 재도입되거나 도입된다.
질환의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 면역 세포와 같은 세포는 본 발명에 따른 표적 RNA와 혼성화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 생체외에서 인큐베이션된, 환자, 건강한 대상체 또는 이들의 조합으로부터의 단리된 면역 세포와 같은 단리된 세포를 포함한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 단리된 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 약학적 조성물은 예를 들어 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 것으로, 여기서 약학적 조성물은 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내 또는 피하 투여된다. 단리된 세포 또는 약학적 조성물의 투여는 예를 들어 주입 또는 주사에 기초한다.
질환은 예를 들어 암, 자가면역 질환, 이식편대숙주 질환, 뇌졸중, 척수 손상, 뼈 질환, 연령 관련 황반 변성, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 당뇨병 및 이들의 조합이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 상이한 실시양태를 예시하지만, 본 발명은 이들 실시예로 제한되지 않는다. 하기 실험에서는 형질감염제가 사용되지 않고, 즉 짐노틱 전달이 수행된다.
실시예 1: 형질감염 시약의 사용 없는 인간 T 세포에서의 녹다운 효능은 세포 시딩 밀도와 무관하다.
CD3+ 인간 T 세포를 0일차에 96웰 u-바닥 플레이트에 상이한 밀도, 즉 웰당 20.000, 50.000, 75.000 및 100.000로 시딩하고 0일차 및 3일차에 5 μM의 표적-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 대조군 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 표적 단백질 발현은 6일차에 유세포분석에 의해 조사하였다. 강력한 표적 녹다운은 초기 시딩 밀도와 무관하게 달성될 수 있었다. 결과는 도 1에 도시되어 있다.
실시예 2: 녹다운은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 제거 및 세포의 냉동보존 후 수일 동안 지속된다
CD3+ 인간 T 세포를 T25 플라스크에 시딩하고 활성화하고 모의, 대조군 올리고 또는 표적-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드로 6일 동안 처리하였다. 그 다음, 세포의 일부분을 배양물에서 보관하고("배양물"), 다른 부분을 6일차에 냉동보존하였다. 냉동보존된 세포를 7일차에 해동하고("냉동/해동"), 대조군 올리고 또는 표적-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가 없이 조건 "배양물" 및 "냉동/해동"을 재자극하였다. 표적 발현을 재자극 후 8일까지 단백질 수준에서 시간 경과에 따라 측정하였다. 잠재적 표적 녹다운을 모든 시험된 시점에서 측정하였고, 조건 "배양물"과 "냉동/해동" 간에 차이는 없었다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 녹다운은 도 2에 도시된 바와 같이 냉동보존/해동 과정 전반에 걸쳐 지속된다.
실시예 3: 수지상 세포에서 두 표적의 동시 녹다운
CD14+ 단핵구를 성숙한 수지상 세포(DC)로 분화시키고 대조군 올리고, 표적 1-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드, 표적 2-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 표적 1-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 2-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드의 조합으로 처리하였다. 표적 단백질 발현을 3일차에 분석하였다. 표적 1 및 2의 강력한 표적 녹다운은 각각의 단일요법 설정에서 관찰될 수 있었다. 놀랍게도, 세포를 표적 1-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 2-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드의 조합으로 처리하였을 때, 두 표적 모두의 강력한 녹다운이 달성될 수 있었다. 결과는 도 3에 도시되어 있다.
실시예 4: T 세포에서 두 표적의 동시 녹다운
0일차에 표적 3 및 표적 4의 발현을 유도하기 위해 T 세포를 단리하고 활성화하였다. 대조군 올리고뉴클레오티드(neg1, 최종 농도: 5 μM), 표적 3-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드(최종 농도: 5 μM), 표적 4-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드(최종 농도: 5 μM), 표적 3-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 4-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드의 조합(최종 농도: 각각 5 μM) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드(neg1, 최종 농도: 10 μM)를 0일차에 세포에 첨가하였다. 표적 mRNA 및 HPRT1 mRNA(하우스키퍼(housekeeper)) 발현을 3일차에 제조업체의 지침에 따라 Quantigene SinglePlex 분석(ThermoFisher)에 의해 분석하였다. 표적 발현 값을 HPRT1 발현 값에 대해 정규화하고 모의 처리된 세포와 비교한 상대적 발현을 계산하였다.
표적 단백질-발현 세포의 백분율을 5일차에 유세포분석에 의해 조사하였다. 모의-처리된 세포와 비교한 표적 단백질-발현 세포의 상대적 백분율이 도시되어 있다. 표적 3-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용한 표적 3의 강력한 녹다운 및 표적 4-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용한 표적 4의 강력한 녹다운이 관찰되었다. 놀랍게도, 표적 3 및 표적 4 안티센스 올리고뉴클레오티드를 조합하여 세포에 첨가하였을 때, 세포가 각각의 안티센스 올리고뉴클레오티드 단독으로 처리된 조건에 필적하는 효능으로 두 표적 모두의 녹다운이 관찰되었다. 결과는 도 4a(mRNA) 및 도 4b(단백질)에 도시한다.
실시예 5: 표적 3-특이적 siRNA와 표적 3-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드의 비교
0일차에 표적 3의 발현을 유도하기 위해 T 세포를 단리하고 활성화하였다. 대조군 올리고뉴클레오티드(neg1, 최종 농도 5 μM) 또는 표적 3-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드(최종 농도 5μM)를 형질감염 시약의 사용 없이 0일차에 세포에 첨가하였다. 비교로서, 비표적화 siRNA(Ambion, 최종 농도: 30 nM 및 60 nM) 또는 표적 3-특이적 siRNA(Ambion, 최종 농도: 30 nM 및 60 nM)를 리포펙타민 2000(ThermoFisher)을 사용한 표준 형질감염 프로토콜을 사용하여 0일차에 T 세포에 형질감염시켰다. 표적 3 단백질-발현 세포의 백분율을 5일차에 유세포분석에 의해 조사하였다. 모의-처리된 세포와 비교한 표적 3 단백질 발현 세포의 상대적 백분율이 도시되어 있다. 세포가 표적 3-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리되었을 때 강력한 표적 3 녹다운이 관찰되었다. 대조적으로, 세포를 두 시험 농도(30 nM 및 60 nM) 모두에서 표적 3-특이적 siRNA로 형질감염시켰을 때 표적 3-발현 세포의 감소는 없었다. 결과는 도 5에 도시되어 있다.
Claims (15)
- 세포 요법에서의 사용을 위한 준비로 수지상 세포, 자연 살해(NK) 세포, 말초혈 단핵 세포(PBMC), 줄기 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포 및/또는 또는 유도 만능 줄기 세포, B 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 면역 세포에서 표적 RNA의 발현을 감소시키는 방법으로서,
표적 RNA를 포함하는 단리된 면역 세포를 형질감염 수단의 사용 없이 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 0일 내지 21일의 기간 내에 단리된 세포에 적어도 1회 투여되고, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드와의 인큐베이션 0일부터 최대 8주까지 표적 RNA와 혼성화하고 표적 RNA의 전사를 감소시키거나 표적 RNA의 기능을 감소시키거나 표적 RNA에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 이들의 조합을 감소시키는, 방법. - 제1항에 있어서, 표적 RNA가 mRNA, 프리(pre)-mRNA, lncRNA 및/또는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단리된 면역 세포가 면역 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하기 전 또는 후에 유전자 전달 기술에 의해 유전자 변형되는, 방법.
- 제3항에 있어서, 단리된 유전자 변형된 면역 세포가 면역 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하기 전 또는 후에 증대(expand)되는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 면역 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하기 전 및/또는 후에 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 면역 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하기 전 및/또는 후에 농축시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 임의로 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 농축 단계 후에 단리된 면역 세포에 첨가되는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 면역 세포를, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션할 때, 면역 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하기 전, 면역 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션한 후 또는 이들의 조합에서 냉동보존하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA가 PD-1, TIGIT, TIM-3, LAG-3, TGFBR, CD39, CD73, 2B4, BTLA, VISTA, CD304, PQR-prot, Chop, XBP1, PERK, FOXP3, GMCSF, IFNg, TNFa, TGFb, IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-9, STAT3, IL-6 수용체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 면역 세포의 효능 및/또는 안전성에 영향을 미치는 단백질을 코딩하거나, 표적 RNA가 BID, BIM, BAD, NOXA, PUMA, BAX, BAK, BOK, BCL-rambo, BCL-Xs, Hrk, Blk, BMf, p53 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 면역 세포의 증대 및/또는 생존에 영향을 미치는 단백질을 코딩하는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 0일 내지 20일, 0일 내지 19일, 0일 내지 18일, 0일 내지 17일, 0일 내지 16일, 0일 내지 15일, 0일 내지 14일, 0일 내지 13일, 0일 내지 12일, 0일 내지 11일, 0일 내지 10일, 0일 내지 9일, 0일 내지 8일, 0일 내지 7일, 0일 내지 6일, 0일 내지 5일, 0일 내지 4일, 0일 내지 3일, 0일 내지 2일 또는 0일 내지 1일의 기간 내에 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 기간의 매일, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 7일마다, 8일마다, 9일마다 또는 10일마다 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 2가지 이상의 표적 RNA와 혼성화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 동일하거나 상이한 기간 동안 동일한 시점에 또는 동일하거나 상이한 기간 동안 상이한 시점에 투여되는, 방법.
- 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서의 사용을 위한 단리된 면역 세포로서, 상기 단리된 면역 세포는 질환을 앓고 있는 환자 또는 건강한 대상체로부터 유래하고 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 따라 표적과 혼성화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 생체외 인큐베이션되어 표적 RNA의 발현을 감소시키고, 단리된 면역 세포와 안티센스 올리고뉴클레오티드의 인큐베이션 후, 상기 단리된 면역 세포는 환자에게 재도입되거나 환자에게 도입되는, 단리된 면역 세포.
- 제12항에 따른 사용을 위한 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
- 환자 및/또는 건강한 대상체가 인간 또는 인간이 아닌 동물인, 제12항에 따른 사용을 위한 위한 면역 세포 또는 제13항에 따른 약학적 조성물.
- 질환이 암, 자가면역 질환, 이식편대숙주 질환 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제12항 또는 제14항에 따른 사용을 위한 면역 세포 또는 제13항 또는 제14항에 따른 약학적 조성물.
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