KR20220070228A - 이중특이적 항체 car 세포 면역요법 - Google Patents

이중특이적 항체 car 세포 면역요법 Download PDF

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cell
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마이클 칼리지우리
지안후아 유
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사이토이뮨 테라퓨틱스 인코퍼레이티드
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Abstract

본 명세서에 기재되어 있는 것은, 세포용해성 면역 세포에서 발현되면, (1) 종양 관련 항원을 표적화하는 CAR의 발현 및 (2) 선천성 및 항원 특이적 세포용해성 면역 세포 둘 다에서 발현하는 NKG2D를 한쪽 말단에서 인식하고, 다른 쪽 말단에서 종양 관련 항원을 표적화하는 이중특이적 항체의 분비 둘 다를 초래하는 단일 벡터이다. 예상치 않게, T 세포에 대한 이러한 변형은 생체내에서 생존 및 증식의 증강을 초래한다. 따라서, 치료 및 진단 용도가 개시된다.

Description

이중특이적 항체 CAR 세포 면역요법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 9월 10일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/898,503호에 대한 35 U.S.C. § 119(e)하의 우선권을 주장하고, 그 내용은 참조에 의해 그 전체가 본 출원에 도입된다.
서열 목록
본 출원은, ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 도입되는 서열 목록을 함유한다. 2020년 9월 4일에 작성된 상기 ASCII 카피는 113086-0112_SL.txt으로 명명되고, 크기는 134,417바이트이다.
기술분야
본 개시는 일반적으로 인간 면역학 분야, 특히 암 면역요법에 관한 것이다.
본 발명의 배경에 관한 하기 설명은 단지 본 발명에 대한 기술을 지원하기 위해 제공된 것이다.
현재의 암 치료 섭생은 화학 요법, 면역 조절 약물14, 모노클로날 항체15, 자가 또는 동종 이식을 포함한다. 이러한 치료법은 종종 관해를 유도하지만, 거의 모든 환자는 최종적으로 재발하고, 질환의 재발에 기인하여 사망한다. 따라서, 재발성 및/또는 난치성 질환에 대한 새로운 병용 면역요법을 포함하여 새로운 요법에 대한 충족되지 않은 필요성이 존재한다. 본 개시는 이러한 제한에 대처하고, 관련 이점도 제공한다.
키메라 항원 수용체(CAR) T 세포는 혈액 악성종양 및 고형 종양 모두의 치료를 위해 임상에서 성공적으로 사용되어 왔고, 최근 미국 FDA에 의해 승인되었다1 -4. 이중특이적 항체(BsAb)는 또한 암 치료를 위해 FDA의 승인을 받았고, CAR T 세포 요법에 대한 대체 면역요법 접근법으로 사용되고 있다5. 그러나, CAR 기반 및 BsAb 기반의 암 면역 요법은 5개의 중요한 이유로 여전히 개선이 필요하다. 첫째, 일부 경우에는, CAR T 세포가 생체내에서 확장될 수 없고, 환자에서 종양 용해를 개시하기에 충분한 기간 동안 생존할 수 없다6. CAR T 세포의 효능은 생체내에서 CAR T 세포 존재의 양 및 기간과 상관하는 것으로 보고되었다6 -8. 둘째, 종양 세포는, 특히 단일 항원만이 표적으로 되는 경우, 치료를 회피하기 위해 표적 항원을 방출할 수 있다. 셋째, 제조에 비용과 시간이 많이 소요되는 것 외에도, BsAb는 반감기가 짧고, 현재까지 치유적인 것으로 밝혀지지 않았다9 ,10. 넷째, 2개의 상이한 종양 관련 항원(tumor associated antigen)을 표적으로 하는 BsAb와 CAR T 세포의 병용 요법은 양호한 접근법이 될 수 있고; 그러나, 생체외에서 각각 개별적으로 생산하는 것은 노동 집약적이고 비용이 많이 들 것이고; 이의 BsAb가 모든 세포용해 이펙터 세포에 관여하는 단일 작제물 내에서 CAR 및 BsAb(예: 이중특이적 T 세포 관여자, 즉, BiTE 또는 이중특이적 자연 살해 세포 관여자, 즉, BiKE)를 모두 발현하도록 T 세포를 조작(engineering)하는 것은, 상가적 또는 상승적이거나 생체내에서 T 세포 생존을 증강시키는 것으로 아직 보고되거나 밝혀지지 않았다. 마지막으로, CAR 면역요법에 대한 현재의 접근법은 주로 1개의 면역 세포 유형, 즉 T 세포에 초점을 맞추고 있고, 면역계의 선천성 및 적응성 부분에서 기타 모든 세포용해 이펙터 세포를 제외한다. NKG2D는 c-렉틴 유형의 수용체이고, 이는 면역계의 선천성 및 적응성 부분 모두에서 실질적으로 모든 세포용해 이펙터 세포에서 발현된다11 ,12.
본 개시는 이들 2개 요법 양식을 전달하는, 즉 T 세포 또는 NK 세포를 생성하는 단일 벡터(vector)로 감염된 T 세포 및/또는 자연 살해(NK) 세포를 조작함으로써 이러한 문제를 부분적으로 또는 완전히 해결하기 위한 플랫폼을 제공하고, NK 세포의 CAR은 하나의 특정 종양 관련 항원을 표적으로 하고 또 다른 특정 종양 관련 항원을 표적으로 하는 BsAb를 발현 및/또는 분비한다.
따라서, 일 측면에서, 본 명세서에서 제공되는 것은, (1) (a) 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인(antigen binding domain); (b) 힌지 도메인( hinge domain), (c) 막관통 도메인(transmembrane domain), 및 (d) 세포내 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는, 키메라 항원 수용체(CAR); 및 (2) CAR이 결합하는 동일한 암 또는 종양 세포 상에서 발현되는 암 또는 종양 항원에 대해 지시된 항체의 항원 결합 도메인 및 항-NKG2D 항원 결합 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 이중특이적 항체를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는, 이중특이적 항체-키메라 항원 수용체(BsAb-CAR, 본 명세서에서 BsAb-CAR 작제물 또는 CAR 작제물로서 지칭됨)이다. 일 측면에서, 세포내 도메인은, CD28 공자극 신호전달 영역(costimulatory signaling region) 및/또는 4-1BB 공자극 도메인을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어질 수 있는 1개 이상 또는 2개 이상의 공자극 영역을 포함한다. CAR의 이중특이적 항체 부분은 항-NKG2D 항원 결합 도메인의 전에 위치한 신호전달 도메인을 추가로 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어질 수 있다. 이들 작제물을 코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터, 게다가 이들에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 본 명세서에서 추가로 제공된다. 일 측면에서, CAR 및 BsAb는 단일 인접 폴리뉴클레오티드로부터 발현되고, 암 또는 종양 표적화 항체는 숙주 세포의 세포 표면 상에서 발현되고, BsAb 성분은 CAR을 발현하는 세포에 의해 분비된다. 이들 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 게다가 시험관내 또는 생체내에서 이들에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 추가로 본 명세서에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, scFv 단편, 및/또는 링커(linker) 펩티드에 의해 임의로 연결되는 Fc 단편을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 B-세포 성숙 항원(BCMA) 및/또는 SLAMF7(CS1 또는 CD319로서 공지됨), 및/또는 이들 각각의 등가물 중의 어느 하나에 대해 지시된 항체의 관련 CDR 영역을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일 측면에서, 종양 표적화 항체는 BCMA를 표적으로 하고, BsAb는 항-CS1 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 B-세포 성숙 항원(BCMA) 및/또는 SLAMF7(또한 CS1 또는 CD319로서 공지됨) 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일 측면에서, 이 작제물은 신호전달 도메인을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 이들 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터, 게다가 시험관내 또는 생체내에서 이들에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 본 명세서에 추가로 제공된다.
특정 실시양태에서, CAR은 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 및/또는 ScFv 및 Fc 영역 및/또는 항원 결합 도메인 사이에 위치된 링커 폴리펩티드를 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 추가로 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일 측면에서, 링커 폴리펩티드는 항-NKG2D와 항-CS1의 항체 단편 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, 링커는 글리신-세린 링커이다. 추가 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 서열(글리신-세린)n을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지고, 여기서 n은 1 내지 6의 정수(서열번호 110), 예를 들면, n은 4이다. 또 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 CAR과 이중특이적 항체 사이, 예를 들면, 항-BCMA CAR과 항-NKG2D 항원 결합 도메인 사이에 위치한 T2A 펩티드 등의 자가-절단 펩티드(self-cleaving peptide)를 코딩하는 서열을 포함한다. 일 측면에서, BsAb-CAR은, 예를 들면, 항-NKG2D와 암 또는 종양 항원, 예를 들면, CS1에 결합하는 제2 항원 결합 도메인 사이에 위치하는 T2A 펩티드 등의 자가-절단 펩티드를 추가로 포함하고, 이들 둘 모두는 Fc 단편에 연결된다. 이 경우, NKG2D-Fc 또는 CS1-Fc의 호모이량체가 발생하지 않도록 "놉-인투-홀(knobs-into-holes)" 시스템을 추가하고, 2개의 이종이량체는 문헌[참조: Protein Engineering, Vol. 9(6):617-621(1996)]에 기재된 방법을 사용하여 발생할 수 있다. 일 측면에서, 이 CAR은 신호전달 도메인을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일 측면에서, 신호전달 도메인, 예를 들면, IgG1 신호 펩티드는 BsAb-CAR의 NKG2D-종양 항원 부분의 개시부에 위치한다. 기타 신호 펩티드는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이들 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터, 게다가 시험관내 또는 생체내에서 이들에 의해 코딩된 폴리펩티드가 본 명세서에 추가로 제공된다.
일 측면에서, BsAb-CAR은 도 1E에 부분적으로 도시된 구조, 즉 (a) BCMA 항원 결합 폴리펩티드, T2A 등의 자가-절단 펩티드, 항-NKG2D scFv 및 Fc 폴리펩티드, T2A 등의 제2 자가-절단 펩티드, 및 항-CS1 scFv 및 Fc 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지는 단일 BsAb-CAR을 포함한다. 이 경우, NKG2D-Fc 또는 CS1-Fc의 호모이량체가 발생하지 않도록 "놉-인투-홀" 시스템을 추가하고, 2개의 이종이량체는 문헌[참조: Protein Engineering, Vol. 9(6):617-621(1996)]에 기재된 방법을 사용하여 발생할 것이다. 항-BCMA CAR 등의 CAR은 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일 측면에서, 이 Bs-Ab CAR 작제물은 신호전달 도메인을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일 측면에서, 이러한 Bs-Ab CAR 작제물은, BsAb-CAR 작제물의 항-NKG2D-항-종양-항원의 개시부에 임의로 위치하는 신호 펩티드, 예를 들면, IgG1 신호 펩티드를 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 기타 신호 펩티드는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이들 BsAb-CAR 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터, 게다가 시험관내 또는 생체내에서 이들에 의해 코딩된 폴리펩티드가 추가로 제공된다.
일 측면에서, BsAb-CAR은 도 1F에 부분적으로 나타낸 구조, 즉 (a) BCMA 항원 결합 폴리펩티드, T2A 등의 자가-절단 펩티드, 항-NKG2D scFv 및 Fc 폴리펩티드, HMA 폴리펩티드 및 항-CS1 scFv 및 Fc 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어진 단일 CAR을 포함한다. BCMA CAR은 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일 측면에서, 이 폴리펩티드는 신호전달 도메인을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일 측면에서, 이 작제물은 BsAb-CAR의 NKG2D-종양 항원 부분의 개시부에 위치하는 신호 펩티드, 예를 들면, IgG1 신호 펩티드를 추가로 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 추가로 이들로 이루어진다. 기타 신호 펩티드는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이들 BsAb-CAR 작제물에 의해 코딩된 폴리뉴클레오티드 및 벡터, 게다가 시험관내 또는 생체내에서 이들에 의해 코딩된 폴리펩티드가 추가로 제공된다.
일 측면에서, BsAb-CAR은 도 G1에 부분적으로 도시된 구조, 즉 (a) BCMA 항원 결합 폴리펩티드, T2A 등의 자가-절단 펩티드, 항-NKG2D scFv 및 Fc 폴리펩티드, G4S 폴리펩티드 등의 링커(서열번호 134), 및 항-CS1 scFv 및 Fc 폴리펩티드를 포함하는 단일 Bs-Ab CAR을 포함한다. BCMA CAR은 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일 측면에서, 이 폴리펩티드는 신호전달 도메인을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일 측면에서, 이 작제물은 BsAb-CAR의 NKG2D-종양 항원 부분의 개시부에 위치하는 신호전달 도메인, 예를 들면, IgG1 신호 펩티드를 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 추가로 이들로 이루어진다. 기타 신호 펩티드는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이들 BsAb-CAR 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터, 게다가 시험관내 또는 생체내에서 이들에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 추가로 제공된다.
일 측면에서, (a)(i) 암 또는 종양에 결합하는 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인으로서, 상기 암 또는 종양 표적화 항체는 B-세포 돌연변이 항원(BCMA)을 표적으로 하지 않는, 항원 결합 도메인, (ii) 힌지 도메인, (iii) 막관통 도메인 및 (iv) 세포내 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 CAR; 및 (b) NKG2D를 인식하여 결합하는 항원 결합 도메인 및 CAR의 암 또는 종양 세포에 의해 발현되는 상이한 항원에 결합하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 추가로 이들로 이루어지는 이중특이적 항체가 제공된다. 분비된 BsAb와 조합된 CAR은 하나의 종류(예: CAR)에 대한 클론 내성의 가능성을 감소시키도록 설계된다. 또한, NKG2D를 사용함으로써, 이는 종양 미세환경에 (CAR에 추가하여) 다양한 세포용해 효과를 종양 베드(예: NK 세포)에 제공하고, 본 출원인은 이것이 종양 세포 사멸에 유의하게 추가되는 것을 본 명세서에서 나타낸다. 이것은 당해 기술분야의 숙련자의 지식으로부터는 예상하지 못한 것이다. 종양 특이적 조합이 보고되었지만[참조: Townsend et al.(2018), J. Exper. & Clin. Cancer Res. 37:163, 및 그 안에 인용된 참고 문헌], 지금까지는 NKG2D 요소와 조합되지 않았다.
일 측면에서, 힌지 도메인은 CD8α 힌지 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 추가로 이들로 이루어진다. 일 측면에서, 이 폴리뉴클레오티드는 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일 측면에서, 신호전달 도메인, 예를 들면, IgG1 신호 펩티드는 BsAb-CAR의 NKG2D-종양 항원 부분의 개시부에 위치한다. 기타 신호 펩티드는 당해 기술분야에 공지되어 있다.
일 측면에서, CAR의 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 세포내 도메인은 CD28 공자극 신호전달 영역, 4-1BB 공자극 신호전달 영역, ICOS 공자극 신호전달 영역 또는 OX40 공자극 영역으로부터 선택되는 1개 이상 또는 2개 이상의 공자극 영역을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 막관통 도메인은 CD28 공자극 신호전달 영역 및/또는 4-1BB 공자극 신호전달 영역을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 신호전달 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다.
일부 측면에서, 이중특이적 항체는 NKG2D의 리간드 또는 항-NKG2D scFv, 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 측면에서, NKG2D의 리간드, 항-NKG2D scFv, NKG2D에 결합하는 항체의 CDR 영역, 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 측면에서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 측면에서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체로부터 유래하는 일본쇄 가변 단편(scFv), 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다.
CAR 또는 암 또는 종양 표적화 항체에 의해 표적화된 항원의 비제한적 예는 CD19, 메조텔린, 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 암배아성 항원(CEA), CD33, GTPase-활성화 단백질(GAP), 강글리오사이드 G2(GD2), CD5, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1(ROR1), CD123, CD70, CD38, 뮤신 1, (Muc1), 에프린 A형 수용체 2 전구체(EphA2), 상피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRVIII), 인터류킨 13 수용체 알파 2(IL13Ra2), CD133, 글리피칸 3(GPC3), 상피 세포 부착 분자 전구체(EpCam), 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 암/정소(CT), 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2C), 종양-관련 당단백질-72(TAG-72), 티미딘 키나제 1(TK1) 및 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT1)의 그룹의 표적에 결합하는 항체로부터 선택된다. 추가의 종양 표적화 항체는 당해 기술분야에 공지되어 있다.
일 측면에서, CAR은 FLT3을 인식하여 결합하고, 이중특이적 항체는 CD123에 결합하고, AML을 치료하는 데 유용하다. 또 다른 측면에서, CAR은 EGFR을 인식하여 결합하고, 이중특이적 항체는 IL13Ra2에 결합하고, 교모세포종(GBM)을 치료하는 데 사용된다.
상기 언급된 CAR 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 게다가 시험관내 또는 생체내에서 이들에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 추가로 제공된다. 일 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 (a) (i) 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인으로서, 단, 상기 항체는 B-세포 성숙 항원(BCMA)을 표적으로 하지 않는, 항원 결합 도메인; (ii) 힌지 도메인; (iii) 막관통 도메인; 및 (iv) 세포내 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 CAR; 및 (b) NKG2D를 인식하여 결합하는 항원 결합 도메인, 및 CAR과는 상이한 표적인 종양 또는 암 세포 상에서 항원을 인식하여 결합하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 코딩한다. 일 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 CD8α 힌지 도메인을 코딩한다. 일 측면에서, 이 폴리뉴클레오티드는 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다.
일 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 CD8α 막관통 도메인을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 막관통 도메인을 추가로 코딩한다. 또 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 CD28 공자극 신호전달 영역 및/또는 4-1BB 공자극 신호전달 영역을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 세포내 도메인을 추가로 코딩한다. 추가 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 CD3 제타 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 NKG2D의 리간드, 또는 항-NKG2D scFv, 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 이중특이적 항체를 코딩한다. 일부 측면에서, NKG2D의 리간드 또는 항-NKG2D scFv는 NKG2D에 결합하는 항체의 CDR 영역 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 NKG2D에 대해 지시된(예를 들면, 인식 및 결합) 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 이중특이적 항체를 코딩한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 NKG2D에 대해 지시된 (예를 들면, 인식 및 결합) 항체로부터 유래하는 일본쇄 가변 단편(scFv) 및/또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 이중특이적 항체를 코딩한다.
폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체 또는 항원 결합 도메인의 비제한적인 예는 FLT3, EGFR, CD123, IL13Ra2, CD19, 메조텔린, 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 암배아성 항원(CEA), CD33, GTPase-활성화 단백질(GAP), 강글리오사이드 G2(GD2), CD5, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1(ROR1), CD123, CD70, CD38, 뮤신 1, (Muc1), 에프린 A형 수용체 2 전구체(EphA2), 상피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRVIII), 인터류킨 13 수용체 알파 2(IL13Ra2), CD133, 글리피칸 3(GPC3), 상피 세포 부착 분자 전구체(EpCam), 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 암/정소(CT), 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2C), 종양-관련 당단백질-72(TAG-72), 티미딘 키나제 1(TK1) 및 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT1)의 그룹으로부터 선택된다. 추가의 종양 표적화 항체는 당해 기술분야에 공지되어 있다.
일부 측면에서, (a) 및 (b)의 폴리뉴클레오티드는 인접하고 있다. 이와 같은 비제한적 예가 도 1E 내지 1G 및 도 3A에 도시되어 있다.
본 개시는 또한, 전술한 폴리뉴클레오티드 중 임의의 하나를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 벡터를 제공한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR, 및/또는 프로모터(promoter) 및/또는 인핸서(enhancer) 등의 이중특이적 항체의 발현을 유도하기 위한 조절 요소를 추가로 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 측면에서, 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터이고, 이의 비제한적 예는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터의 그룹으로부터 선택된다.
또한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전술한 벡터, CAR, 및/또는 폴리뉴클레오티드 중 임의의 하나를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진 단리된 세포가 제공된다. 세포는 원핵 세포(예를 들면, 세균 세포) 또는 진핵 세포일 수 있다. 진핵 세포의 비제한적 예는 효모 세포, 동물 세포, 포유동물 세포, 소과 세포(bovine cell), 고양이과 세포(feline cell), 개과 세포(canine cell), 뮤린 세포(murine cell), 말과 세포(equine cell) 또는 인간 세포를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 일부 측면에서, 진핵 세포, 포유동물 또는 인간 세포는 면역 세포이고, 임의로 T-세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 단핵구 또는 마크로파지이다. 일부 측면에서, 단리된 세포는 CAR을 발현하고, 이중특이적 항체를 분비한다.
추가로 본 명세서에서 제공하는 것은, 담체 및 전술한 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 및/또는 전술한 벡터 중 어느 하나 및/또는 전술한 단리된 세포 중 어느 하나를 포함하는 조성물이다. 일 측면에서, 담체는 약제학적으로 허용되는 담체이다.
일부 측면에서, 본 개시는, 암 또는 종양 세포에 결합된 전술한 단리된 세포 중 임의의 하나를 포함하는 단리된 복합체(isolated complex)에 관한 것이고, 여기서 암 또는 종양 세포는 CAR- 또는 BsAb-코딩 폴리뉴클레오티드에 의해 발현되는 항원 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인에 의해 단리된 세포에 결합된다.
일부 측면에서, 본 개시는 전술한 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 단리된 세포에 형질도입하는 것을 포함하는 CAR-발현 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, CAR 발현 세포는 T-세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 단핵구 또는 마크로파지로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본 개시는, 암 세포, 종양 또는 조직을 전술한 CAR 및 이중특이적 항체 및/또는 CAR 및/또는 이중특이적 항체를 발현하는 단리된 세포 중 어느 하나와 접촉시키는 것을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는, 암 또는 종양 항원 또는 암 또는 종양 세포를 포함하는 조직을 발현하는 암 세포 또는 종양의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 접촉은 시험관내 또는 생체내에서 있다. 일부 측면에서, 접촉은 생체내에서 있고, 단리된 세포는 치료되는 대상체(subject)에 대해 자가 또는 동종이계이다. 일부 측면에서, 접촉은 생체내에서 있고, 단리된 세포는 치료되는 대상체에 대해 동종이계이다. 생체내 접촉은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 세포를 투여함으로써 이루어질 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 종양 또는 암 항원의 항원 결합 도메인은 암 또는 종양 세포에 결합하고, 암 또는 종양의 성장을 치료 또는 억제하도록 선택된다.
일부 측면에서, 본 개시는, 본 명세서에 기재된 BsAb-CAR을 발현하는 유효량의 CAR 및 이중특이적 항체 및/또는 숙주 세포, 및 세포감소 요법 또는 화학요법 또는 CAR의 항원 결합 도메인의 표적 항원의 발현을 상향조절하는 요법을 대상체에게 투여함으로써 암 또는 종양 항원 또는 암 또는 종양 세포를 포함하는 조직을 발현하는 암 세포 또는 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 세포감소 요법은 화학요법, 동결요법, 온열요법, 표적 요법 및/또는 방사선 요법 중 하나 이상을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다.
일부 측면에서, 본 명세서에 제공된 것은, 전술한 CAR 및 이중특이적 항체의 어느 하나, 또는 CAR 및 이중특이적 항체를 발현하는 단리된 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암 또는 종양의 성장을 억제하는 것, 암 또는 종양의 전이를 억제하는 것, 또는 암 또는 종양을 치료하는 것 중 하나 이상을 위한 방법이다. 일부 측면에서, 단리된 세포는 이를 필요로 하는 대상체에 대해 자가 또는 동종이계이다. 일부 측면에서, 단리된 세포는 이를 필요로 하는 대상체에 대해 동종이계이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 종양의 항원 결합 도메인 또는 CAR의 암 항원은 암 또는 종양 세포에 결합하고, 암 또는 종양 세포의 성장을 치료 또는 억제하도록 선택된다.
일부 측면에서, 상기 방법은 대상체에게 세포감소 요법 또는 화학요법 또는 표적 항원의 발현을 상향조절하는 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 측면에서, 세포감소 요법은 화학요법, 동결요법, 온열요법, 표적 요법 및/또는 방사선 요법 중 하나 이상을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진다.
또한, 본 명세서에 제공된 것은, 본 명세서에 개시된 CAR, BsAb-CAR, 폴리뉴클레오티드, 세포 또는 조성물 중 하나 이상, 및 임의로 이의 제조 또는 사용 설명서를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 키트(kit)이다. 키트는, 임의로, 암 또는 종양을 치료하기 위해 적절한 CAR 또는 BsAb-CAR이 선택될 수 있도록, 환자 샘플 중의 암 또는 종양의 표현형에 대해 환자 샘플을 검정하기 위한 조성물을 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본 명세서에 제공된 것은, 상기 개시된 CAR 및 이중특이적 항체("BsAb-CAR 작제물")를 하나의 작제물에서 코딩하는 단리된 핵산이다. 일 측면에서, 단리된 핵산은 BCMA 이외의 암 또는 종양 관련 항원을 표적으로 하는 항원 결합 단편 및 이중특이적 항체, 예를 들면, AML 또는 GBM 상의 항원을 표적으로 하는 하나의 scFv(예를 들면, FLT-3, EGFR , CD123 또는 IL13Ra2), 및 인간 근육 알돌라제(HMA) 등의 비-면역원성 단백질 링커를 코딩하는 핵산에 의해 함께 연결된 항-NKG2D 항체로부터의 하나의 scFv를 코딩한다. 예시적 BsAb-CAR 벡터는 도 3에 제시되어 있다. 벡터는 임의로 프로모터, 인핸서 및 바이러스 긴 말단 반복부(LTR) 등의 조절 서열을 포함한다.
본 개시의 일부 측면은, CAR 발현 세포 또는 BsAb를 분비하는 CAR 발현 세포를 생산하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, CAR 및 BsAb를 코딩하는 핵산 서열, 또는 BsAb-CAR을 코딩하는 단리된 핵산을 단리된 세포에 형질도입하는 것을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다.
추가 측면에서, 이 방법은 CAR 또는 BsAb-CAR을 발현하는 세포를 선택하고 단리하는 것을 추가로 포함한다. 추가 측면에서, 세포는 포유동물 세포 등의 진핵 세포, 예를 들면, T-세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 단핵구, 마크로파지, 이의 임의의 서브세트 등의 인간 세포, 또는 임의의 기타 면역 세포이다. 세포는 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터를 사용하거나, 또는 대안적으로 문헌[참조: Riet et al. (2013) Meth. Mol. Biol. 969:187-201 entitled "Nonviral RNA transfection to transiently modify T cell with chimeric antigen receptors for adoptive therapy"]에 기재된 기술을 사용하여 형질도입할 수 있다.
특정 실시양태에서, 이 방법은, NKG2D를 임의로 인식하여 결합하는 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오티드를 세포에 형질도입하는 것을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 NKG2D 리간드, 임의로 코돈 최적화된 리간드를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 NKG2D, 임의로 코돈 최적화된, 또는 이들 각각의 등가물에 대해 지시된 항체의 관련 CDR 영역을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 임의로 코돈 최적화된 NKG2D에 대해 지시된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 임의로 코돈 최적화된 NKG2D에 대해 지시된 항체로부터 유래하는 일본쇄 가변 단편(scFv), 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함한다. 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터, 예를 들면, 렌티바이러스 벡터를 사용하거나, 또는 대안적으로 문헌[참조: Riet et al. (2013) Meth. Mol. Biol. 969:187-201 entitled "Nonviral RNA transfection to transiently modify T cell with chimeric antigen receptors for adoptive therapy"]에 기재된 기술을 사용하여 형질도입할 수 있다.
특정 실시양태에서, CAR 또는 BsAb-CAR 발현 세포를 생성하는 방법은 CAR 발현 세포의 집단(population)을 활성화 및 확장하는 것을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 본 개시의 특정 측면은 CAR 또는 BsAb-CAR을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 추가로 이들로 이루어지는 세포의 단리된, 활성화된 집단에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 세포는 T-세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 단핵구, 마크로파지, 이들의 임의의 서브세트, 또는 임의의 기타 면역 세포 중 하나 이상이다.
본 개시의 측면은 종양을 전술한 유효량의 단리된 세포 또는 조성물과 접촉시킴으로써, 암 또는 종양 항원을 발현하는 종양의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 접촉은 시험관내 또는 생체내에서 있을 수 있다. 접촉이 시험관내에서 있는 경우, 이 방법을 사용하여 환자의 종양에 대한 개별화 요법을 시험하거나, 병용 요법을 분석할 수 있다. 접촉이 생체내에서 있는 경우, 이 방법은 암을 앓고 있는 인간 환자 등의 이를 필요로 하는 대상체에서 종양 또는 암 세포의 성장을 억제하는데 유용하고, 환자는 유효량의 세포를 제공받는다. 특정 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다. 유효량은 단독으로 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 기타 요법과 조합하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 표적화된 암/종양은 고형 종양 또는 혈액 및/또는 골수에 영향을 미치는 암, 예를 들면, 다발성 골수종(multiple myeloma; MM), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia; AML) 또는 교모세포종(glioblastoma; GBM)이다. 특정 실시양태에서, 단리된 세포는 치료되는 대상체에 대해 자가이다. 또 다른 측면에서, 세포는 치료되는 대상체에 대해 동종이계이다. 또 다른 측면에서, 상기 방법은 유효량의 세포감소 요법을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 추가 측면에서, 이 방법은 대상체에게 투여될 세포를 단리하는 단계, 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같이, CAR 또는 BsAb-CAR을 코딩하는 유효량의 단리된 핵산으로 세포를 형질도입하는 단계, 세포를 배양하여, 임의로 확장 및 활성화되는 CAR 또는 BsAb-CAR 코딩 세포의 집단을 수득하는 단계, 및 이어서 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 조성물 및 방법은 독특하고, 제2 종양-관련 항원을 표적으로 하는 NKG2D-기반 BsAb를 동시에 분비하는 CAR 세포를 제공한다는 점에서 최첨단 기술의 한계를 극복하고, 여기서 CAR의 암 또는 종양 표적화 항체는 B 세포 성숙 항원(BCMA)을 표적으로 하지 않는다. 개시된 CAR NKGD2D 기반 BsAb는 예시일 뿐이다. 이 접근법은 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 임의 수의 종양 항원, 예를 들면, EGFR, FLT-3, IL13Ra2, EGFRVIII; CD70, 메조텔린, CD123, CD19, CEA, CD133, Her2에 대해 변형할 수 있다[참조: Townsend et al. (2018) J. Exp. & Clinical Cancer Res. 37:163]. 추가 측면에서, CAR의 암 또는 종양 표적화 항체는 B-세포 성숙 항원(BCMA), EGFRVIII; CD70, 메조텔린, CD123, CD19, CEA, CD133, Her2 중 하나 이상을 표적으로 하지 않는다.
예시적 작제물은 다발성 골수종 모델(MM)에서 시험되었다. MM은 클론 형질 세포의 축적을 특징으로 하는 악성종양이다13. 상술한 바와 같이, 화학 요법, 면역 조절 약물14, 모노클로날 항체15, 및 자가 또는 동종 이식을 포함하는 현재의 치료 섭생은 종종 관해를 유도하지만, 거의 모든 환자는 최종적으로 재발하고, 질환의 재발에 의해 사망한다. 따라서, 재발성 및/또는 난치성 MM, 고형 종양 및 기타 암에 대한 새로운 병용 면역요법을 포함하는 새로운 요법에 대한 충족되지 않은 필요성이 있다.
선천성 면역계의 성분으로서, 자연 살해(NK) 세포는 종양 성장의 방지에 중요한 역할을 하지만16, NK 세포의 항종양 활성은 다수의 MM 환자에서 억제되는 것으로 밝혀졌다17. 활성화된 또는 동종이계 NK 세포의 입양 전달은 MM18,19 및 고형 종양을 포함하는 다수의 혈액 악성종양의 치료에서 효과적 항종양 반응을 생성한다. 그러나, 다수의 경우에, NK 세포 매개된 항종양 반응은 약하고, 이는 억제 수용체의 NK 세포 발현, 생존 능력의 불충분 또는 이펙터 세포의 종양 부위로의 이동 제한으로 인해 발생할 수 있다20 -22. 한편, 입양 면역의 일부로서, T 세포는 다양한 조직으로 효율적으로 이동할 수 있고, 항원 자극에 반응하여 양호하게 증식하는 경향이 있다. 그러나, T 세포는 항원 특이적 T 세포 수용체(TCR)에 의해 결정되는 엄격한 특이성을 갖고 있다. 따라서, T 세포와 NK 세포를 모두 관여시켜, 이들 자신의 한계를 극복하는 방법은 암 면역 요법에 매우 유익할 것이다. 본 개시는 이러한 이점을 제공한다.
도 1A 내지 도 1G는 개시된 기술의 예로서 제시되는 BCMA CAR 및 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 융합 단백질을 개별적으로 또는 조합하여 발현하도록 T 세포를 조작한 결과를 나타낸다. (도 1A) CD28 및 CD3제타(ζ) 엔도도메인에 연결된 BCMA에 대한 scFv를 함유하는 BCMA CAR 렌티바이러스 작제물의 개략도. 도입유전자의 발현은 EF1알파(α) 프로모터에 의해 구동되는 GFP 발현에 의해 추적되었다. LTR, 긴 말단 반복; SP, 신호 펩티드; VH, 가변 H 쇄; L, 링커; VL, 가변 L 쇄. MyC, MyC 태그; 힌지, 힌지 쇄; CD28, T 세포 공자극 분자; CD3ζ, CD3 제타 쇄. (도 1B) 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체(BsAb)의 포유동물 발현을 위한 렌티바이러스 작제물의 개략도. 항-NKG2D-항-CS1 BsAb는 링커(L)에 의해 함께 연결된 VH 및 VL로 구성된 항-NKG2D scFv 및 항-CS1 scFv로 이루어졌다. BsAb의 발현은 렌티바이러스 LTR에 인접하는 CMV 프로모터에 의해 구동된다. (도 1C) 건강한 공여자로부터의 PBMC(말초 혈액 단핵 세포)를 CD3 및 CD28 비드로 활성화하고, pCDH 공 벡터(EV), BCMA CAR, 항-NKG2D-항-CS1 BsAb로 형질도입했다. 활성화된 T 세포는 또한, BsAb 및 BCMA-CAR로 연속적으로 형질도입되었고, 이러한 형질도입된 세포는 "BsAb-BCMA seq. trans. T"로 명명했다. GFP-양성 세포를 선별하고, 비오틴 표지된 염소 항-마우스 Fab 특이적 또는 동형(isotype)-정합된 대조군 항체로 세포를 염색한 후, 스트렙트아비딘 및 CD3 항체 염색을 수행했다. (도 1D) 비변형 T 세포, BsAb T 세포 또는 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포의 상청액을 수집하고, 개별 세포 용해물을 항-6× His-태그 항체(서열번호 111로 개시된 "6× His")를 사용하여 면역블롯 분석을 실시했다. 도 1E 내지 1G는 대안의 BsAb-CAR BCMA-NKG2A-CS1 작제물을 나타낸다. 도 1G는 "G4S"를 서열번호 134로서 개시한다.
도 2A 내지 2E는 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포가 반응에서 BCMA-CAR T 세포 또는 BsAb T 세포보다 높은 세포독성 및 IFN-감마(γ) 생산 능력을 갖는 것을 나타낸다. (도 2A) MM 세포주의 표면에서 BCMA 및 CS1 발현의 유세포 분석. 3개의 MM 세포주(MM1.S, H929 및 RPMI-8226)와 1개의 만성 골수성 백혈병 세포주(K562)를 항-CS1 mAb 항체(상부 패널) 또는 항-BCMA mAb(하부 패널)로 염색하고, 상이한 색을 사용하여, 3개의 MM 세포주, MM.1S(녹색), H929(적색) 및 RPMI-8226(회색), 뿐만 아니라 K562 세포주(청색) 또는 동형-정합된 대조군 항체(흑색 실선 및 공지)을 구별했다. (도 2B) 51Cr-표지된 MM1.S, H929, RPMI-8226 MM 세포주 및 K562 세포주(각 세포주에 대해 5 × 103)를 비변형 T 세포(T, 흑색 실선), 공 벡터-형질도입된 T 세포(EV T, 흑색 점선), 항-NKG2D-항-CS1 BsAb를 발현하는 T 세포(BsAb T, 적색 실선), BCMA CAR(BCMA CAR T, 녹색 실선) 및 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포(청색 실선)와 지시된 E:T 비율에서 4시간 동안 공배양하고, 표적 용해(51Cr 방출)를 측정했다. BsAb-BCMA seq. trans. T 대 BCMA CAR T, * p<0.05, ** p<0.01; seq. trans. T 대 BsAb T, #p<0.05, ##p<0.01. BCMA-CS1- 음성 대조군으로서의 K562 세포. (도 2C) 비변형 T 세포(백색 사각형), EV T 세포(회색 음영 사각형), BsAb T 세포(적색 사각형), BCMA CAR T 세포(녹색 사각형) 또는 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포(청색 사각형) 2 × 105를 단독으로 배양하거나(표적 없음), 또는 동일한 수의 MM.1S, H929, 또는 상이한 수준의 CS1 및 BCMA를 발현하는 RPMI-8226 MM 세포, 또는 BCMA-CS1- K562 세포로 24시간 동안 자극시키고, 상청액을 수집하여 ELISA에 의해 IFN-γ 분비를 측정했다. * p<0.05, ** p<0.01, n.s. 유의차 없음. (도 2D 및 도 2E) 세포를 (도 2C)에 기재된 바와 같이 처리하고, 세포-비함유 상청액 중의 IL-2 또는 TNF-알파(α) 분비를 각각 ELISA에 의해 측정했다. ** p<0.01, n.s. 유의차 없음.
도 3A 내지 3H는 동일한 작제물에서 BCMA CAR 및 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체(BsAb) 둘 다를 함유하는 예시적 BsAb-CAR 벡터의 생성, 및 이 작제물로 형질도입된 T 세포의 기능적 검사를 나타낸다. (도 3A) BCMA CAR 및 항-NKG2D-항-CS1 BsAb(이하 BsAb-CAR로 지칭됨) 둘 다를 발현하는 생성된 렌티바이러스 벡터의 개략도. T2A, 자가-절단 2A 유전자. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 벡터는 BMCA, EGFRVIII; CD70, 메조텔린, CD123, CD19, CEA, CD133 또는 Her2로부터 선택된 항원 이외의 암 또는 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. (도 3B) 공 벡터(EV)-형질도입된 T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포의 상청액 및 세포 용해물을, 항-6x His-태그 항체(서열번호 111로서 개시된 "6x His")를 사용하여 면역블롯 분석에 제공했다. (도 3C) 51Cr-표지된 MM1.S 세포(5 × 103)를, 비변형 T 세포(T, 흑색 실선), 공 벡터-형질도입된 T 세포(EV T, 흑색 점선) 또는 BsAb-CAR T 세포(자주색 선)과 함께 지시된 E:T 비율에서 4시간 동안 공배양하고, 표적 용해(51Cr 방출)를 측정했다. (도 3D) 건강한 공여자로부터 단리된 비변형-(흑색 실선), EV-(흑색 점선), BsAb-(적색 선), BCMA CAR-(녹색 실선) 또는 BsAb-CAR(자주색 실선)-형질도입된 CD8(+) T 세포를 51Cr 표지된 MM1.S MM 세포(5 × 103)와 지시된 E:T 비율로 4시간 동안 공배양하고, 표적 용해(51Cr 방출)를 측정했다. (도 3E) 10:1의 E:T 비율에서 MM.1S MM 세포를 사용한 4시간 51Cr 방출 분석. 상이한 양의 정상(감염되지 않은) 인간 PBMC의 존재하에 이러한 항종양 효과를 평가하기 위해, PBMC를 MM.1S MM 표적 세포의 1배, 10배, 100배 및 200배의 양으로 첨가했다. (도 3F) 5:1의 E:T 비율에서 MM.1S MM 표적 세포에 대한 비변형 T 세포(흑색 사각형), EV T 세포(패턴 사각형), BsAb T 세포(적색 사각형), BCMA-CAR T 세포(녹색 사각형) 또는 BsAb-CAR T 세포(자주색 사각형)의 51Cr 방출 분석. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 이펙터 세포와 MM.1S MM 표적 세포의 인큐베이팅 시간은 PBMC, NK 및 NKT 세포(좌측 패널)의 경우 4시간이고, CD3+T 세포, CD8+T 세포, Vγ9Vδ2 T 세포 또는 CD4+T 세포의 경우 16시간이다. * p<0.05, ** p<0.01, n.s. 유의차 없음. (도 3G) 1시간 후의 EV T 세포(GFP, 녹색) 및 MM.1S MM 세포(적색)의 공배양의 조절, 시냅스의 공초점 현미경 분석을 결정하고(스케일 10μL, 상부 패널, 스케일 20μL, 하부 패널); 하부 패널에 도시된 더 높은 출력에서도, 시냅스는 관찰되지 않는다. (도 3H) BsAb-CAR T 세포(E: GFP, 녹색) 및 MM.1S MM 세포(T: 적색)의 1시간 공배양; E/T 시냅스가 관찰되었고, 모든 프레임에서 화살표로 표시되었다(S1은 S2 및 S3과 마찬가지로 좌측에서 우측으로 이동하는 각 프레임에서 동일한 공액 E/T 쌍을 나타낸다). 좌측 상부의 프레임은 명시야(Bf, 스케일 10μL)를 나타내고; 상부 중앙 프레임은 BsAb-CAR T 세포(GFP, 녹색) 및 MM.1S MM 세포(적색) 공배양(스케일 10μL)의 면역형광 이미지를 나타낸다. 우측 상부의 프레임은 BsAb(청색, 스케일 10μL)를 식별하는 추가 항-6x-His-태그(서열번호 111로서 개시된 "6x-His")를 갖는 병합 이미지이다. 하부 3개 행은 확대된 필드(스케일 20μL)에서 시각화된 3개의 개별 E/T 접합체(S1, S2 및 S3)를 나타낸다.
도 4A-4D는 K562 세포에서 BCMA 및 CS1의 과발현이 BsAb-CAR T 세포에 의한 인식 후에 세포독성 및 사이토카인 분비의 증강을 유발한다는 것을 나타낸다. (도 4A) 세포를 CS1(좌측 패널) 또는 BCMA(우측 패널) 또는 IgG 동형 대조군(각 패널에서 흑색 점선) 항체로 염색한 후의 CS1 및 BCMA(K562-CS1-BCMA, 회색 음영) 또는 공 벡터 대조군(K562-PCDH, 흑색 실선)을 과발현하는 K562 세포의 유세포 분석. (도 4B) 4시간 51Cr 방출 검정에 의해 측정된, K562-CS1-BCMA 및 K562-PCDH 세포에 대한 공 벡터(EV)- 또는 BsAb-CAR-형질도입된 T 세포의 세포독성. K562-CS1-BCMA 또는 K562-PCDH 세포는 지시된 E:T 비율로 EV T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포와 함께 인큐베이팅했다. ** p<0.01(K562-CS1-BCMA + BsAb T 세포 대 K562-PCDH + BsAb T 세포). (도 4C) EV T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포(1 × 105)를 단독으로 배양하거나, 동일한 수의 K562-CS1-BCMA 또는 K562-PCDH 세포로 자극했다. 배양물로부터의 상청액을 사용하여, ELISA에 의해 IFN-γ 분비를 결정했다. ** p<0.01. (도 4D) 세포를 (도 4C)에서와 같이 처리하고, 세포-비함유 상청액에서 IL-2 분비를 ELISA에 의해 측정했다. ** p<0.01.
도 5A 내지 5E는 분비된 항-NKG2D-항-CS1 BsAb가 NKG2D 신호전달을 통해 CAR T 세포 증식을 증강시킨다는 것을 나타낸다. (도 5A) 비변형 T 세포(1), 2-EV T 세포(2), BsAb T 세포(3), BCMA CAR T 세포(4), BsAb-CAR T 세포(5) 또는 나이브 T 세포(6)(비증식 대조군)의 배양 후의 배지 색이 상부 패널에 표시되었다. 막대 그래프는 각 그룹에 대해 6개의 개별 샘플을 포함하는 총 세포 수의 통계 분석을 제공한다. ** p<0.01(그룹 5 대 그룹 1, 2, 4 및 그룹 3 대 그룹 1, 2, 4). T 세포 증식 또는 이의 결핍을 기록하기 위해, 자주색 세포 추적자가 사용되었고, 하부 패널에 히스토그램으로 표시되는 V450 희석으로서 표시되었다. (도 5B) 각각 1+, 2+, 4+ 또는 1, 2, 4로 지정된, (도 5A)로부터의 BsAb-CAR T 세포의 세포-비함유 상청액의 존재 또는 부재하에 비변형 T 세포, EV T 세포, 및 BCMA CAR T 세포의 5일령의 배양 배지. 세포를 계수하고, 데이터를 막대 그래프(상부)로 표시했다. ** p<0.01(4+ 대 4, 2+ 대 2, 1+ 대 1). 자주색 세포 추적자는 하부 패널(하부)의 히스토그램으로 표시되는 V450 희석으로서 표시되었다. (도 5C) 2일령의 배양 배지가 도시된다. 1A-비변형 T 세포, 2A-EV T 세포, 3A-BsAb T 세포, 4A-BCMA CAR T 세포 및 5A-BsAb-CAR T 세포. 0일차에, NKG2D 차단 항체(20μg/mL)를 1B, 2B, 3B, 4B 및 5B의 배양물에 첨가한 반면, 비반응성 동형 대조군 항체(20μg/mL)를 1A, 2A, 3A, 4A 및 5A에 첨가했다. 이들 웰 하부에는, CD3, NKG2D, F(ab)2(CAR의 발현을 나타내는 "Fab"로 표시됨), 및 세포 증식을 측정하기 위한 Ki67에 대한 유세포 분석 염색이 있다. (도 5D) AKT 단백질의 포스포릴화(p) 및 1A---비변형된 T, 2A---EV T, 3A---BsAb T, 4A---BCMA-CAR T 및 5A---BsAb-CAR T, 게다가 1B-비변형된 T 세포 + NKG2D 차단, 2A---EV T + NKG2D 차단, 3A---BsAb-T + NKG2D 차단, 4A---BCMA-CAR T + NKG2D 차단 및 5A---BsAb-CAR T + NKG2D 차단의 포스포릴화(p)를 결정하기 위해 면역블롯 분석을 수행했다. (도 5E) (도 5C)에 나타낸 동일한 세포(1A, 2A, 3A, 4A 및 5A)도 또한 MM.1S MM 세포와 48시간 동안 공배양했다. 세포 증식을 평가하기 위한 유세포 분석은 상기(도 5C)에 기재된 바와 같이 수행했다.
도 6A 내지 6C는 분비된 항-NKG2D-항-CS1 BsAb가 시험관내에서 NKG2D 신호전달을 통해 CAR T 세포 생존을 증강시킨다는 것을 나타낸다. (도 6A) 1---Un. (비변형) T + IL-2, 2---EV T + IL-2, 3---BsAb T + IL-2, 4---BCMA-CAR T + IL-2, 5---BsAb-CAR T + IL-2의 5일령 배양 배지가 표시되었다. 세포 증식을 관찰하기 위한 CD3(제1 컬럼), F(ab)2(제2 컬럼) 및 Ki67에 대한 유세포 분석 염색(제3 컬럼), 및 세포 생존을 관찰하기 위한 아넥신(Annexin) V/Sytox Blue(제4 컬럼). (도 6B) 1---비변형 T, 2---EV T, 3---BsAb T, 4---BCMA-CAR T, 및 5---BsAb-CAR T의 5일령 배양 배지(IL-2 없음)는 상부 패널에 표시되었다. 세포 증식을 검출하기 위한 CD3(제1 컬럼) 및 Ki67(제2 컬럼)에 대한 유세포 분석 염색. 아넥신 V/Sytox Blue는 세포 생존을 검출하기 위해 포함되었다(제3 컬럼). (도 6C) CD3, Ki67 증식 세포, 아넥신 V(-)Sytox Blue(-) 살아있는 세포, 아넥신 V(+) 아폽토시스 세포 및 아넥신 V(+)Sytox Blue(+) 사멸 세포의 백분율의 통계 분석이 표시되었다. 다중 t-검정, 각 그룹을 비교했다. ** p<0.01.
도 7A-7D는 BsAb-CAR 형질도입된-T 세포가 생체내에서 BCMA-CAR T 세포 및 대조군 T 세포보다 우수한 증식 및 생존 능력을 갖는 것을 나타낸다. (도 7A) 면역결핍 NSG 마우스 내로 비변형 T 세포, EV T 세포, BCMA-CAR T 세포 및 BsAb-CAR T 세포의 정맥내 주사의 설계(a, 상부). 3D 히스토그램(하부 패널, 제1 컬럼)은 주사된 인간 CD3 T 세포의 백분율을 나타낸다. 청색 히스토그램은 -1일차에 T 세포를 주사하지 않은 마우스에 대한 것이고, 주황색 히스토그램은 T 세포 주사의 1일 후를 나타내고, 흑색 히스토그램은 T 세포 주사의 14일 후를 나타낸다(적색 화살표는 BsAb-CAR T 그룹을 나타낸다). 등고선은 CD69 발현을 나타낸다(정맥내 주사 후 1일 동안 주황색, 정맥내 주사 후 14일 동안 흑색). 자주색 히스토그램(제4 컬럼)은 정맥내 주사의 35일 후에 주사된 CD3 T 세포의 백분율을 나타낸다. 자주색 등고선은 세포 증식을 나타내기 위해 4개 그룹의 Ki67 및 CD69 염색의 조합이다. 적색 등고선은 세포 아폽토시스 및 세포 사멸을 나타내기 위한 Sytox Blue 및 아넥신 V 염색의 조합이다. S-/A-는 Sytox Blue(-)/아넥신 V(-), S-/A+는 Sytox Blue-/아넥신 V+, S+/A+는 Sytox Blue+/아넥신 V+를 나타낸다. (도 7B, 도 7C) (도 7A)에 도시된 인간 CD3+(도 7B) 및 CD69+(도 7C) 세포의 통계적 분석. 비변형 T(공 직사각형), EV T(패턴 충전된 직사각형), BCMA-CAR T(회색 음영 직사각형) 및 BsAb-CAR T(흑색 직사각형). 다중 t-검정, 각 그룹을 비교했다. ** p<0.01, n.s. 유의차 없음, n= 그룹당 5마리 마우스. (도 7D) Ki67+CD69+ 증식 세포, 아넥신 V(-) Sytox Blue(-) 생존 세포, 아넥신 V(+)Sytox Blue(-) 세포 아폽토시스 및 아넥신 V(+)Sytox Blue(+) 사멸 세포의 백분율의 통계 분석. 다중 t-검정, 각 그룹을 비교했다. ** p<0.01, n.s. 유의차 없음, n=5/그룹.
도 8A 내지 8C는 BsAb-CAR T 세포가 생체외에서 CS1 또는/및 BCMA-발현 인간 원발성 다발성 골수종 세포를 특이적으로 인식 및 제거하는 것을 나타낸다. (도 8A) MM 환자의 골수로부터 단리된 CD138+ 다발성 골수종 종양 세포에서 CS1 및 BCMA 단백질에 대한 유세포 분석 표면 염색. 8명의 환자로부터의 결과가 제시된다. 8명의 환자의 MM 세포는 PE-접합된 항-CS1 mAb 항체(좌측 패널), 또는 비오틴 표지된 항-BCMA mAb를 갖는 APC-접합된 스트렙트아비딘(우측 패널)로 염색했다. 8명의 환자 또는 동형-정합 대조군 항체(회색 음영)를 각각 나타내기 위해, 다양한 색이 사용된다. (도 8B) 5 × 103 CD138+ 다발성 골수종 종양 세포를 EV T 세포(흑색 점선), BsAb T 세포(적색 선), BCMA-CAR T 세포(녹색 선) 또는 BsAb-CAR T 세포(자주색 선)와 지시된 E:T 비율로 4시간 동안 공배양하고, 표준 51Cr 방출 분석을 사용하여 특이적 용해를 측정했다. 환자 샘플 1 및 환자 샘플 4로부터의 대표적 데이터가 제시된다. 8명의 환자 데이터를 분석하여 각 환자에 대한 개별 값으로 제시했다(우측 패널). (도 8C) 지시된 형질도입된 T 세포를 CD138+ 다발성 골수종 종양 세포와 1:1의 E:T 비율로 24시간 동안 공배양하고, IFN-γ 분비를 ELISA를 통해 세포-비함유 상청액에서 측정했다.
도 9A 내지 9C는 BsAb-CAR T 세포가 생체내 MM 성장을 억제하고, MM을 갖거나 종양 세포로 재-챌린지되는 마우스의 생존을 연장하는 데 우수하다는 것을 나타낸다. (도 9A) 생물발광 이미징은 각각의 지시된 그룹으로부터의 MM.1S 종양을 갖는 5마리의 대표적 마우스에 대해 나타냈다. NSG 마우스에게 루시퍼라제를 발현하는 8 × 106 MM.1S 세포를 정맥내 접종했다(0일). 종양 이식 후 10일, 17일 및 24일차에, 각 마우스는 생리식염수(대조군) 또는 10 × 106 EV T 세포, BsAb T 세포, BSMA CAR T 세포, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포로 정맥내 주사를 제공받았다(상부 패널, 실험 스케쥴). 행의 이미지는 종양 이식 후 10일차, 조작된 T 세포 또는 대조군 T 세포의 주입 직전에 촬영되었다. 중앙 행의 이미지는 마우스가 이미 2회(10, 17일에) 치료를 받은 후, 및 3회차 치료 직전의 24일차에 촬영되었다. 하부 행의 이미지는 3회 치료(10, 17, 24일) 후 31일차의 마우스를 나타낸다. (도 9B) 종양 이식 후 80일차에, 생존한 마우스(BCMA CAR T 세포 치료 그룹 3마리, BCMA seq. trans. T 세포 치료 그룹 4마리, 및 BsAb-CAR T 세포 치료 그룹 5마리 마우스)로부터 말초 혈액(PBL)을 수집했다. PBL의 총 세포 수를 계산했다(좌측 패널). FITC 결합 항-인간 CD45 mAb 항체, 및 비오틴-표지 염소 항-마우스(Fab)2 폴리클로날 항체 또는 정상 폴리클로날 염소 면역글로불린 G(IgG) 항체를 갖는 APC-접합 스트렙트아비딘에 의한 유세포 분석 염색. Fab(+) 세포의 백분율과 수는 중앙에 제시된 바와 같이 계산되었다. (도 9C) 다양한 형질도입된 T 세포, 생리식염수(흑색 실선), EV T 세포(흑색 점선), BsAb T 세포(적색 선), BCMA CAR T 세포(녹색 선), BCMA seq. trans. T 세포(청색 선) 및 BsAb-CAR T 세포(자주색 점선)로 처리된 MM.1S-보유 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. 화살표를 갖는 회색 점선의 수직선은 마우스가 4 × 106 MM.1S 세포로 재-챌린지된 80일차를 나타낸다.
도 10A 내지 10D는 BsAb-CAR T 세포가 BCMA-CAR T 세포보다 더 효과적으로 생체내 MM 성장을 억제하고, 입양 전달된 인간 PBMC의 존재하에 MM 종양-보유 마우스의 생존을 연장하는 것을 나타낸다. (도 10A) 생물발광 이미징은 각각의 지시된 그룹으로부터 MM.1S 종양을 보유하는 3마리의 대표적 마우스에 대해 나타냈다. NSG 마우스에게 루시퍼라제를 발현하는 8 × 106 MM.1S 세포를 정맥내 접종했다(0일차). 종양 이식 후 10일, 17일 및 24일차에, 각 마우스는 생리식염수(대조군), BSMA-CAR T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포로 정맥내 주사를 제공받았다. 동일한 공여자로부터의 골수 세포-고갈된 PBMC는 종양 이식 후 10일차에 마우스에게 정맥내 주사했다(상부 패널, 실험 스케쥴). 제1 컬럼의 이미지는 종양 이식 후 10일차에, 조작된 T 세포 또는 대조군 T 세포의 주입 직전에 촬영되었다. 제2 컬럼의 이미지는 마우스가 이미 2회(10, 17일차) 치료를 받은 후 및 3회차 치료가 실시되기 직전인 19일차에 촬영되었다. 제3 컬럼의 이미지는 3회 치료(10, 17, 24일차) 후의 28일차의 마우스를 나타낸다. 제4 컬럼의 이미지는 37일차의 마우스를 나타낸다. (도 10B) 생존한 BsAb-CAR T 세포 주사된 마우스(n=5) 및 미처리 NSG 마우스(없음, n=5)로부터 혈액을 수집했다. CD19/20(+) 인간 형질 세포, CD56(+) NK 세포 및 CD3(+) T 세포에 대한 유세포 분석 염색. 인간 CD3(+)F(ab)2(+)에 게이트된 등고선의 녹색은 생존한 인간 T 세포 내의 CAR 발현의 백분율을 나타낸다. (도 10C) 인간 CD19/20(+) 형질 세포, CD56(+) NK 세포, CD3(+) T 세포, 및 CD3(+)F(ab)2(+) 생존 CAR T 세포의 백분율의 통계적 분석. (도 10D) 다양한 형질도입된 T 세포, 생리식염수(흑색 실선), BCMA-CAR T 세포(녹색 선) 또는 BsAb-CAR T 세포(자주색 점선)로 치료된 MM.1S-보유 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. P <0.0001, BsAb-CAR T 세포 대 BCMA-CAR T 세포.
도 11A 내지 11C. (도 11A) 3D 레인보우 도트 유세포 분석 맵(CD3 염색 기본, CD3 양성 세포는 황색과 녹색을 나타내고, CD3 음성 세포는 진한 청색과 자주색을 나타낸다)은 CD3(+) T 세포(흑색 원, 녹색을 갖는 황색), γδ T 세포(황색 단독), NKT 세포(주황색 원, 녹색을 갖는 황색), 및 NK 세포(청색 원, 진한 청색 및 자주색)의 백분율을 나타낸다. 2D 등고선 맵은 3D 지도의 상세를 나타낸다. (도 11B) T 세포, CD8+ T 세포, pan γδ T 세포, Vγ9Vδ2 T 세포, NKT 세포 및 NK 세포에서 NKG2D 표면 발현의 유세포 분석 염색. 제시된 데이터는 10명의 건강한 공여자로부터의 PBMC를 나타낸다. (도 11C) (B)에서 NKG2D+ 세포의 백분율의 통계적 분석. n=10.
도 12A 내지 12B. (도 12A) 10:1의 E:T 비율에서 4시간 51Cr 방출 분석 [E, 비변형 T 세포(흑색 실선) 또는 EV-(흑색 점선), BsAb-(적색 선), BCMA-CAR-(녹색 선) 또는 BsAb-CAR-형질도입 T 세포(자주색 선)의 이펙터 세포]. 표적 세포에 대해 1배, 10배, 100배 또는 200배의 상이한 양의 인간 PBMC. 3개의 대표적 실험 중 하나의 특정 용해 곡선을 A에 제시하고, 3개의 요약 데이터를 B에 제시한다. (도 12B) (a)의 51Cr 방출 검정 결과의 통계 분석, 다중 t-검정, * p<0.05 , ** p<0.01, n.s. 유의차 없음, 3회 반복.
도 13A 내지 13D. (도 13A) CD3(+) T 세포, CD8(+) 세포독성 T 세포, CD4(+) T 세포, γδ T 세포, NKT 세포 및 NK 세포는 미국 적십자사로부터 주문한 류코팩으로부터 단리했다. 프라이밍된 T에 대한 흑색 등고선 맵은 CD3 및 pan αβ TCR의 조합 염색을 나타낸다. 갈색 및 녹색 등고선 지도는 각각 선별된 CD8(+) 및 CD4(+) T 세포를 나타낸다. (도 13B) 활성화된 인간 NK 세포는 CD3 및 CD56으로 염색되었다. (도 13C) 선별된 pan γδ Τ 세포를 CD3 및 pan γδ ΤCR 항체로 염색했다. 활성화된 Vγ9γδ2 TCR T 세포에 대한 흑색 등고선 맵은 CD3, CD56, Vγ9 및 Vδ2의 조합 염색에 의해 수행되었다. (도 13D) 신규한 FACS-선별된 인간 CD3(+)CD56(+) NKT 세포를 CD3 및 CD56으로 염색했다.
도 14A 내지 14E. (도 14A) 2h, 4h, 8h 및 16h를 포함하는 상이한 시점에서 5:1의 E:T 비율로 비변형 T 세포(흑색 실선), EV T 세포(흑색 점선), BsAb T 세포(적색 선), BCMA-CAR T 세포(녹색 선) 또는 BsAb-CAR T 세포(자주색 선)의 51Cr 방출 분석. 추가의 PBMC는 첨가되지 않았다. (도 14B, 도 14C, 도 14D, 도 14E) 상기 기재된 세포독성 검정은 프라이밍된 CD3(+)T 세포, CD8(+) T 세포, CD4(+) T 세포, 및 Vγ9Vδ2 T 세포를 포함하는 벌크 T 세포 또는 개별 T 세포 서브세트의 존재 또는 부재하에 반복되었다. 이펙터 세포 대 표적 MM.1S 세포의 비율은 모든 실험에서 5:1이다.
도 15A-15J는 BsAb-CAR T 세포(녹색) 또는 EV T 세포(녹색)와 MM.1S MM 세포(적색)의 24시간 공배양 후의 공초점 현미경 분석을 나타낸다. (도 15A 내지 도 15F) 24시간 동안 MM.1S MM 세포와 BsAb-CAR T 세포의 공배양은 MM.1S MM 세포의 제거를 나타낸다. (도 15G 내지 도 15J) 24시간 동안 MM.1S MM 세포와 EV T 세포의 공배양은 MM.1S MM 세포의 지속성을 나타낸다. Bf = 명시야; 스케일, 10μL.
도 16은 CS1 및 BCMA 유전자를 안정적으로 발현하는 K562 세포의 생성을 나타낸다. 좌측 의사 색 유동 맵은 비-형질전환 K562 세포의 조절을 나타낸다. 중앙 의사 색 유동 맵은 FACS 선별된 pCDH-CS1-GFP 렌티바이러스-감염된 K562 세포를 나타낸다. 3회차 의사 색 유동 맵은 FACS 선별된 CS1(+)BCMA(+) K562 세포를 나타낸다.
도 17A 내지 17D. (도 17A) 48시간의 배양. 1A-비변형 T 세포, 2A-EV T 세포, 3A-BsAb T 세포, 4A-BCMA CAR T 세포 및 5A-BsAb-CAR T 세포. CD3(+) 집단(청색 불꽃), CD3(+)NKG2D(+) 집단(적색 불꽃) 및 CD3(+)NKG2D(-) 집단(녹색 불꽃)을 관찰하기 위해 CD3 및 NKG2D에 대한 유세포 분석 염색. (도 17B) 0일차에, NKG2D 차단 항체(20㎍/mL)를 (도 17A) 배양물에 첨가하고, 1B, 2B, 3B, 4B 및 5B로 명명했다. 48시간 후, 세포 집단을 관찰하기 위해 CD3 및 F(ab)2에 대한 유세포 분석 염색. CD3(+) 집단(청색 불꽃). (도 17C) (도 17A)로부터의 48시간 배양 배지가 제시되었다. 0일차에, CS1 차단 항체(20㎍/mL)를 (도 17A) 배양물에 첨가하고, 1C, 2C, 3C, 4C 및 5C로 명명했다. 48시간 후, 항-CD3, 항-F(ab)2, 항-NKG2D, 항-Ki67로 세포를 염색한 후, 유세포 분석을 수행하여 세포 증식을 관찰했다. 세포는 CD3(+) 및 CD3(+)NKG2D(+) 집단(적색 불꽃)에 게이팅되고, CD3(+)NKG2D(-) 집단(녹색 불꽃)가 표시되었다. 적색 점의 유동 맵은 NKG2D(+)Fab(+)(상부 3개) 또는 NKG2D(+)Fab(-)(하부 2개) 세포의 증식을 나타냈다. 녹색 점의 유동 맵은 NKG2D(-)Fab(+)(상부 3개) 또는 NKG2D(-)Fab(-)(하부 2개) 세포의 증식을 나타낸다. Fab는 CAR 발현에 대한 항-F(ab)2 염색을 나타낸다. (도 17D) (도 17A)의 1A, 2A, 3A, 4A 및 5A로부터의 세포를 MM.1S 종양 세포와 48시간 동안 공배양했다. 유세포 분석은 항-CD3, 항-F(ab)2 및 항-NKG2D 항체로 세포를 염색한 후에 실시했다. Fab는 F(ab)2 염색을 나타내고, 이는 CAR 발현을 나타낸다.
도 18은 도 7의 데이터에 대한 보충 데이터를 제공한다. 도 7에서, 인간 CD3 T 세포 백분율의 도 3D 히스토그램(제1 컬럼)이 제시된다. 이것은 원래 의사 색 유동 맵이다. 청색 프레임은 -1일차에 T 세포 주사가 없는 마우스의 인간 CD3 백분율을 나타낸다(제1 컬럼). 주황색 프레임은 T 세포 주입 1일 후의 마우스의 항-인간 CD3(+) 세포를 나타내고, CAR 발현은 항 F(ab)2로 염색한 후의 유세포 분석에 의해 검출되었다(제2, 제3 컬럼). 흑색 프레임은 조작된 또는 대조군 인간 T 세포의 주입으로부터 14일 후의 마우스에서 항-인간 CD3(+) 세포를 나타낸다(제4 컬럼). 자주색 프레임은 조작된 또는 대조군 인간 T 세포의 주입으로부터 35일 후의 마우스의 항-인간 CD3(+) 세포를 나타낸다(제5 컬럼). CD3(+) 인간 세포에 대한 통계 분석을 도 7에 제시한다.
도 19A 내지 19B는 NSG 마우스에 주사되었을 때에 GVHD를 회피하기 위해 인간의 건강한 공여자의 PBMC에서 골수 세포의 고갈 효과를 나타낸다. (도 19A) 피콜-파크(Ficoll-Paque) PLUS 단리된 인간 PBMC를 염색했다. 숫자 1은 림프구 백분율을 나타내고, 2는 과립구 백분율을 나타내고, 3은 단핵구 백분율을 나타낸다. CD11c, CD14, CD33 및 CD66b를 염색하여, FACS로 선별하기 전에, 건강한 공여자의 PBMC에서 골수 세포의 백분율을 확인했다. (도 19B) 선별 후, CD11c, CD14, CD33 및 CD66b를 전술한 바와 같이 염색하고, 의사 색 하부 맵을 표시했다.
도 20은 표준 4h-51Cr 방출 검정에 의한 자가 PBMC, T 세포, NK 세포 및 형질 세포에 대한 인간 BsAb-CAR T 세포의 세포독성 평가를 제공한다. PBMC는 피콜-파크(Ficoll-Paque) PLUS 구배 원심분리에 의해 단리되었다. CD3(+) T 세포, CD56(+) NK 세포 및 CD19/20(+) 형질 세포는 PBMC로부터 FACS 선별되었다. EV T 세포를 세포독성 검정에서 대조군으로 사용했다.
도 21A 내지 21D. (도 21A) BsAb BCMA-CAR(BsAb-CAR T) 렌티바이러스에 감염된 건강한 공여자의 프라이밍된 T 세포의 상이한 시점(12h, 24h, 48h, 72h 및 96h). BF(명시야) GFP(녹색)의 동일한 시계가 표시된다. (도 21B) BsAb-CAR T 세포의 상청액에서 BsAb의 분비를 나타내는 항-His-tag를 사용한 면역블롯팅. 도 21B는 서열번호 111로서 "His 6x"를 개시한다. (도 21C) BsAb-CAR T 렌티바이러스-감염된 프라이밍된 T 세포에 대한 유세포 분석 염색. GFP-양성 세포를 선별하고, 비오틴 표지된 염소 항-마우스 Fab 특이적 또는 동형-정합된 대조군 항체로 세포를 염색한 후, 스트렙트아비딘 및 CD3 항체 염색을 했다. (도 21D) 51Cr-표지된 H929, RPMI-8226 및 K562 표적 세포주(5 × 103)를 지시된 E:T 비율로 4시간 동안 비변형 T 세포(흑색 실선), 공 벡터-형질도입된 T 세포(EV T, 흑색 점선), 또는 BsAb-CAR T 세포(자주색 선)와 공배양했다. 표적 용해(51Cr 방출)를 측정했다. BsAb-CAR T 대 비변형 T 또는 EV T, ** P<0.01, 3회 반복. BCMA(-)CS1(-) 음성 K562는 음성 대조군 표적 세포로 사용되었다.
상세 설명
본 개시는 설명된 특정 측면들로 한정되지 않고, 그 자체는 물론 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정한 측면을 설명하는 것만을 목적으로 하고, 본 개시의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 한정될 것이기 때문에 한정하는 것을 의도하는 것은 아님을 이해해야 한다. 본 개시 전반에 걸쳐, 다양한 기술 간행물은 아라비아 숫자로 참조된다. 이러한 간행물에 대한 완전한 인용은 청구범위의 직전에 기재되어 있고, 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
B-세포 성숙 항원(BCMA) 및 SLAMF7(CS1 또는 CD319) 모두는 우수한 MM 종양 항원 표적인 것으로 밝혀졌지만, NKG2D는 우수한 면역 세포 표적이다. 수용체인 NKG2D는 NK 세포, NKT 세포, CD8(+) T 세포 및 γδ T 세포를 포함하는 거의 모든 세포용해성 면역 세포에서 발현된다23. BCMA는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFRSF17 또는 CD269)의 구성원이고, 형질 세포 분화 동안 선택적으로 유도되며, 나이브 및 메모리 B 세포에는 거의 부재한다24 ,25. 항-BCMA-CAR-발현 T 세포의 입양 전달은 MM 치료를 위한 유망한 새로운 전략으로 보고되었다26 -28. CS1은 MM 세포의 표면에서 고도로 및 편재적으로 발현되기 때문에, CS1은 MM에서 또 다른 매력적인 종양 관련 표적 항원이다29 ,30. CS1은 NK 세포 및 활성화된 CD8(+) T 세포의 서브세트에서 낮은 수준으로 발현되지만, 골수 세포 및 정상 조혈 줄기 세포에서는 거의 검출할 수 없다31. CS1에 대한 치료용 모노클로날 항체는 MM32의 치료를 위해 FDA에 의해 승인되었다. 출원인의 공개된 연구는 CS1에 대해 재지시된 T 세포 또는 NK 세포의 유전적 변형이 골수종 세포의 근절을 증강시키는 것으로 나타났다29 ,30. 최근의 전임상 연구에 따르면, CS1 CAR T 세포 치료를 제공받은 환자의 MM 세포는 효과적으로 근절되지만, CS1 발현 수준이 낮은 정상 NK 세포 및 T 세포는 영향을 받지 않는 것으로 나타났다[참조: Gogishvili, 2017 Blood. 2017 Dec 28;130(26):2838-2847. doi: 10.1182/blood-2017-04-778423. Epub 2017 Oct 31]. 활성화 수용체인 NKG2D는 상기한 바와 같이 다양한 선천성 및 적응성 세포용해 세포에서 발현된다11 ,33. NKG2D를 유발하면, 선천성 및 적응성 세포 면역이 모두 활성화될 수 있다.34
본 명세서에 개시된 바와 같이, 출원인은 T 세포를 조작하여, (1) BMCA 이외, 또는 또 다른 측면에서 EGFRVIII; CD70, 메조텔린, CD123, CD19, CEA, CD133 또는 Her2 중 어느 것과도 결합하지 않는 암 또는 종양 항원에 결합하는 특정 2세대 CAR을 발현하고, (2) 동시에 항-NKG2D-BsAb를 분비할 수 있다. 이전 데이터는 이들 세포(이하 BsAb-CAR T 세포라고 지칭됨)가 재발성 및/또는 난치성 암에 대한 유망한 치료법이고, 차세대 CAR 기반 암 면역요법을 생산하기 위한 적합한 플랫폼이 될 수 있음을 시사한다.
이러한 CAR과, T 세포에 형질도입된 단일 벡터로서의 항-NKG2D 기반 이중특이적 항체의 이러한 조합은 아직 문헌에 기재되어 있지 않다. 출원인은 이 접근법이 종양에 대해 강력한 세포용해 이펙터 세포로서 기능하는 T 세포(BsAb CAR T-세포)를 생성하는 것을 입증했다. 본 명세서에서 제공되는 것은, BCMA라고 하는 다발성 골수종(MM)의 공지된 표적에 대해 지시된 T 세포 CAR의 대표적 예이고, 항-NKG2D 기반 이중특이적 항체는 NKG2D 항원을 보유하는 모든 선천성 또는 적응성 세포용해 이펙터 세포에 근접시키는, 잘 설명된 MM 종양 항원 CS1을 인식한다. 출원인은 MM, BCMA의 공지된 표적에 대해 지시된 T 세포 CAR에 대한 예를 제시하지만, 출원인은 본 명세서에서 다양한 상보적 CAR 및 항-NKG2D 기반 이중특이적 항체를 단일 벡터로 확장하여 항종양 효능을 위해 T 및 NK 세포를 감염시킨다. 출원인은 추가로, 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의 수의 암/종양 항원에 결합하는 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR에 적용할 수 있는 변형된 접근법을 설명하고, FLT-3, CD19, 메조텔린, 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 암배아성 항원(CEA), GTP-ase-활성화 단백질(GAP), 강글리오사이드 G2(GD2), CD5, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1(ROR1), CD123, CD70, CD38, B 세포 성숙 항원(BCMA), 뮤신 1, (Muc1), 에프린 A형 수용체 2 전구체(EphA2), 상피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRVIII), 인터류킨 13 수용체 알파 2(IL13Ra2), CD133, 글리피칸 3(GPC3), 상피 세포 부착 분자 전구체(EpCam), 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 암/정소(CT), 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2C), 종양-연관 당단백질-72(TAG-72), 티미딘 키나제 1(TK1) 및 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT1)를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다[참조: Townsend et al. (2018) J. Exp. & Clinical Cancer Res. 37:163].
이 접근법의 예로서, MM 세포 상의 2개의 별개의 종양 관련 항원에 대해 지시된 2개의 상보적 양식을 전달하는 단일 벡터는 어느 하나의 양식 단독보다 우수하고, 하나는 CAR을 코딩하고 다른 하나는 항-NKG2D 기반 이중특이적 항체를 코딩하는 2개의 개별 작제물로 순차적으로 감염된 T 세포의 사용보다 우수하다. 추가로, T 세포(CAR 및 항-NKG2D 기반 이중특이적 항체 둘 다를 코딩하는 실험 벡터로 감염됨)가 양 항원을 모두 발현하는 MM 세포와 조우하면, BsAb CAR T 세포는 NKG2D 매개 활성화를 통해 시험관내 및 생체내에서 증식 및 생존율의 증강 둘 다를 겪는다. 이러한 결과는 전혀 예상치 못한 것이다.
요약하면, 출원인은 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체를 또한 분비하는 BCMA CAR T 세포를 작제했고; 이들 세포는 BCMA(+) 및/또는 CS1(+) 다발성 골수종(MM) 세포를 효과적으로 표적으로 한다. BCMA CAR T 세포에 의한 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체의 분비는 NKG2D-매개 활성화를 통해 시험관내에서의 CAR T 세포 증식 및 생체내에서의 CAR T 세포 생존 및 증식을 모두 증강시킨다. 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체를 분비하는 BCMA CAR T 세포는, BCMA CAR T 또는 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체만을 분비하는 T 세포를 사용한 단일 요법과 비교하여, 종양 세포 표적에 대해 현저히 우수한 시험관내 및 생체내 효능을 나타낸다. 이러한 결과는 동일한 방식으로 사용되는 다양한 CAR에 일반화할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 이 기술이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 재료를 본 기술의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료를 이제 설명한다. 본 명세서에 인용된 모든 기술 및 특허 공개는 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 도입된다. 본 명세서의 어떠한 내용도, 본 기술이 선행 발명으로 인해 이러한 개시에 선행하는 권리가 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 기술의 실시는, 달리 명시되지 않는 한, 당해 기술분야의 기술 범위 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 종래의 기술을 사용할 것이다. 예를 들면, 문헌[참조: Green and Sambrook eds. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition; the series Ausubel et al. eds. (2015) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (2015) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; McPherson et al. (2006) PCR: The Basics (Garland Science); Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Greenfield ed. (2014) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2010) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 6th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Herdewijn ed. (2005) Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Buzdin and Lukyanov ed. (2007) Nucleic Acids Hybridization: Modern Applications; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Grandi ed. (2007) In Vitro Transcription and Translation Protocols, 2nd edition; Guisan ed. (2006) Immobilization of Enzymes and Cells; Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition; Miller and Calos eds, (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Lundblad and Macdonald eds. (2010) Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 4th edition; and Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th edition; 및 출원시에 입수가능한 이들의 최신판]을 참조한다.
범위를 포함하여, 모든 수치 지정, 예를 들면, pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량은, 필요에 따라, 1.0 또는 0.1의 증분에 의해 또는 대안적으로 +/- 15%, 또는 대안적으로 10%, 또는 대안적으로 5%, 또는 대안적으로 2%의 변동에 의해 (+) 또는 (-) 변화하는 근사치이다. 항상 명시적으로 서술된 것은 아니지만, 모든 수치 지정은 "약"이라는 용어가 선행한다는 것을 이해해야 한다. 또한, 항상 명시적으로 서술된 것은 아니지만, 본 명세서에 기재된 시약은 단지 예시이고, 이와 동등한 것이 당해 기술분야에 공지되어 있음을 이해해야 한다.
본 기술이 폴리펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 항체에 관련하는 경우, 이와 같은 동등물 또는 생물학적 동등물이 본 기술의 범위 내에서 의도되는 것은, 명시적 열거 없이 그리고 달리 의도되지 않는 한, 추론되어야 한다.
정의
이해되는 바와 같이, 본 명세서에 사용된 섹션 또는 서브섹션의 표제는 조직적 목적을 위한 것이고, 기재된 주제를 한정 및/또는 분리하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수형의 참조를 포함한다. 예를 들면, 용어 "세포"는 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 조성물 및 방법이 기재된 요소를 포함하지만, 다른 것을 배제하지 않는 것을 의미하도록 의도된다. 구성 및 방법을 정의하기 위해 사용되는 경우, "본질적으로 이루어진"은 서술된 목적을 위해 조합에 대해 본질적으로 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서에 정의된 요소로부터 본질적으로 이루어진 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터 미량의 오염물질, 및 포스페이트 완충 생리식염수, 보존제 등의 약제학적으로 허용되는 담체를 배제하지 않을 것이다. "~로 이루어진"은 다른 성분의 미량 원소, 및 본 개시의 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법 단계 또는 조성물을 생성하거나, 또는 의도된 결과를 달성하기 위한 프로세스 단계를 배제하는 것을 의미한다. 이러한 전환 용어 각각에 의해 정의되는 실시양태는 본 개시의 범위 내에 있다.
"임의" 또는 "임의로"는 후속적으로 기재되는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우가 있는 것을 의미하고, 그 결과, 설명에는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우가 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 연관된 나열된 항목 중 하나 이상의 모든 가능한 조합, 게다가 대안("또는")으로 해석되는 경우의 조합의 결여를 지칭하고, 포함한다.
"실질적으로" 또는 "본질적으로"는 거의 완전히 또는 완전히, 예를 들면, 일부 소정 양의 95% 이상을 의미한다. 일부 실시양태에서, "실질적으로" 또는 "본질적으로"는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "동물"은, 예를 들면, 포유동물 및 조류를 포함하는 범주인 살아있는 다세포 척추동물 생물을 지칭한다. "포유동물"이라는 용어는 인간 및 비-인간 포유동물을 모두 포함한다.
용어 "대상체", "숙주", "개인" 및 "환자"는, 인간 및 수의 대상체, 예를 들면, 인간, 동물, 비인간 영장류, 개, 고양이, 양, 쥐, 말, 및 소를 지칭하기 위해 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 이들은 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 지칭한다. 포유동물에는 뮤린, 랫트, 래빗, 유인원, 소과, 양과(ovine), 돼지과(porcine), 개과, 고양이과, 농장 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 말과 및 영장류, 특히 인간이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 본 개시는, 인간 치료에 유용한 것 외에도, 반려 포유동물, 외래 동물 및 포유동물, 설치류를 포함하는 가축의 수의학적 치료에도 유용하다. 일 실시양태에서, 포유동물에는 말, 개 및 고양이가 포함된다. 본 개시의 또 다른 실시양태에서, 인간은 태아, 유아, 사춘기 전의 대상체, 청소년, 소아 환자 또는 성인이다. 일 측면에서, 대상체는 발증 전의 포유동물 또는 인간이다. 또 다른 측면에서, 대상체는 질환의 최소 임상 증상을 갖는다. 대상체는 남성 또는 여성, 성인, 유아 또는 소아 대상체일 수 있다. 추가의 측면에서, 대상체는 성인이다. 일부 경우에, 성인은 성인 인간, 예를 들면, 18세 초과의 성인 인간이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들의 조합, 및 임의의 척추동물, 예를 들면, 인간, 염소, 래빗 및 마우스 등의 포유동물, 게다가 상어 면역글로불린 등의 비-포유동물 종에서 면역 반응 중에 생성되는 유사한 분자를 (예로서 및 제한 없이) 포함하는 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 분자를 집합적으로 지칭한다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 용어 "항체"는 무손상 면역글로불린, 및 기타 분자에 대한 결합을 실질적으로 배제하기 위해, 목적 분자(또는 목적의 매우 유사한 분자의 그룹)에 특이적으로 결합하는 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"을 포함한다(예를 들면, 생물학적 샘플 중의 기타 분자의 결합 상수보다 적어도 103 M-1 큰, 적어도 104 M-1 큰, 또는 105 M-1 큰 목적 분자의 결합 상수를 갖는 항체 또는 항체 단편). 용어 "항체"는 또한 키메라 항체(예를 들면, 뮤린 또는 인간화 비-영장류 항체), 헤테로접합 항체(예를 들면, 이중특이적 항체) 등의 유전자 조작된 형태를 포함한다. 또한, 문헌[참조: Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Owen et al., Kuby Immunology, 7th Ed., W.H. Freeman & Co., 2013; Murphy, Janeway's Immunobiology, 8th Ed., Garland Science, 2014; Male et al., Immunology (Roitt), 8th Ed., Saunders, 2012; Parham, The Immune System, 4th Ed., Garland Science, 2014]을 참조한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체"는 B-림프구의 모노클로날 또는 단일 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자가 형질감염된 세포에 의해 생성된 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는, 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들면, 골수종 세포와 면역 비장 세포의 융합으로부터 하이브리드 항체 형성 세포를 작제함으로써 생산된다. 모노클로날 항체에는 인간화 모노클로날 항체가 포함된다.
항체 구조와 관련하여, 면역글로불린은 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된 중쇄(H)와 경쇄(L)를 갖는다. 경쇄에는 람다(λ)와 카파(κ)의 2개 유형이 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 5개 주요 중쇄 클래스(또는 동형)가 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각각의 중쇄 및 경쇄에는 불변 영역 및 가변 영역이 포함되어 있다(이들 영역은 "도메인"이라고도 공지되어 있다). 조합하여, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 항원에 특이적으로 결합한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역에는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이라고도 하는 3개의 초가변 영역에 의해 중단된 "프레임워크" 영역이 포함되어 있다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위가 정의되어 있다[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입됨). 카뱃(Kabat) 데이터베이스는 현재 온라인으로 유지된다. 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종 내에서 비교적 보존된다. 항체의 프레임워크 영역, 즉 성분 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역은 주로 β-시트 형태를 채택하고 CDR은 루프를 형성하여 접속하고, 경우에 따라, β-시트 구조의 일부를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 쇄간, 비공유 상호작용에 의해 CDR을 정확한 방향으로 배치하기 위해 스캐폴드를 형성하도록 기능한다.
CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합에 관여한다. 각 쇄의 CDR은 일반적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지칭되고, N-말단으로부터 개시하여 순차적으로 넘버링되고, 특정 CDR이 배치된 쇄(중쇄 영역 표지된 CDHR 및 경쇄 영역 표지된 CDLR)에 의해 통상 동정된다. 따라서, CDHR3은 그것이 발견되는 항체의 중쇄의 가변 도메인으로부터의 CDR3이고, 한편 CDLR1은 그것이 발견되는 항체의 경쇄의 가변 도메인으로부터의 CDR1이다. 예를 들면, TNT 항체는 TNT 관련 항원에 고유한 특이적 VH 영역 및 VL 영역 서열, 따라서 특정 CDR 서열을 가질 것이다. 상이한 특이성(즉, 상이한 항원에 대한 상이한 결합 부위)을 갖는 항체는 상이한 CDR을 갖는다. 항체마다 상이한 CDR이 있지만, CDR 내의 제한된 수의 아미노산 위치만이 항원 결합에 직접 관여한다. CDR 내의 이러한 위치는 특이성 결정 잔기(SDR)라고 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단편 결정화 가능(Fc) 영역은 항체를 안정화시키고, 임의로 면역 세포 또는 혈소판 상의 Fc 수용체와 상호작용(예: 결합)하거나, 또는 상보체 단백질에 결합하는 항체의 테일 영역을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 서열번호 81의 경우와 같이, 인간 IgG4 Fc 영역의 것들에 대응하는 위치에 Fc 또는 이의 등가물 중의 인간 IgG4 Fc 영역의 F234A, L235A 및 N297Q의 1개 또는 2개 또는 3개 모두의 돌연변이를 포함하는 것과 같은 Fc 돌연변이체(mutant)가 사용될 수 있고, 상응하는 위치는 서열번호 81의 아미노산 (aa) 16, aa 17 및 aa 79이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 항체 분자 또는 T-세포 수용체 등의 특정 체액성 또는 세포성 면역의 생성물에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질을 지칭한다. 항원은, 예를 들면, 합텐, 단순 중간 대사산물, 당(예: 올리고당), 지질 및 호르몬, 뿐만 아니라 복합 탄수화물(예: 다당류), 인지질 및 단백질 등의 거대분자를 포함하는 임의 유형의 분자일 수 있다. 일반적 범주의 항원에는 바이러스 항원, 세균 항원, 진균 항원, 원생동물 및 기타 기생충 항원, 종양 항원, 자가면역 질환에 관여하는 항원, 알레르기 및 이식편 거부, 독소 및 기타 다양한 항원이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 항체 등의 결합 부분의 항원, 이의 항원 결합 단편 또는 CAR은 본 명세서에서 "항원" 및 그에 후속하는 결합 부분(BCMA CAR 등)의 형식으로 제공될 수 있거나, 또는 항원 전에 "항-", 항원 후에 결합 부분(항-BCMA 항체 등), 또는 결합 부분의 후에 "에 대한(to)" 또는 "에 대해 지시된(directed to)"이 후속하고, 이어서 항원(CS1에 대한 항체)을 갖는 형식으로 제공될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 종양 관련 항원(TAA), 암 항원, 종양 항원, 암 관련 항원 및 종양 관련 항원은 본 명세서에서 호환적으로 사용되고, 암 또는 종양 세포의 항원 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, TAA는 일부 종양 또는 암 세포에 및 또한 일부 정상 세포에 임의로 더 낮은 수준으로 존재한다. 일부 실시양태에서, TAA는 종양 또는 암 세포에만 존재하고, 정상 세포에는 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, TAA는 FLT3, CD19, 메조텔린, 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 암배아성 항원(CEA), CD33, GTPase-활성화 단백질(GAP), 강글리오사이드 G2(GD2), CD5, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1(ROR1), CD123, CD70, CD38, 뮤신 1, (Muc1), 에프린 A형 수용체 2 전구체(EphA2), 상피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRVIII), 인터류킨 13 수용체 알파 2(IL13Ra2), CD133, 글리피칸 3(GPC3), 상피 세포 부착 분자 전구체(EpCam), 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 암/정소(CT), 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2C), 종양-관련 당단백질-72(TAG-72), 티미딘 키나제 1(TK1) 및 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT1)로부터 선택된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 도메인"은 항원 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드 도메인을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포와 관련하여 용어 "자가"는 단리되어 동일한 대상체(수용자 또는 숙주)로 다시 주입되는 세포를 지칭한다. "동종이계"는 비-자가 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "B 세포"는 적응 면역계의 체액성 면역에서 림프구의 유형을 지칭한다. B 세포는 주로 항체를 생성하고, 항원 제시 세포로 기능하고, 사이토카인을 방출하고, 항원 상호작용에 의해 활성화된 후에 메모리 B 세포를 발달시키도록 기능한다. B 세포는 세포 표면에 B 세포 수용체가 존재함으로써 T 세포 등의 기타 림프구와 구별된다. B 세포는 단리되거나, 또는 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 B 세포주의 비제한적 예는 세포주 AHH-1(ATCC® CRL-8146™), BC-1(ATCC® CRL-2230™), BC-2(ATCC® CRL-2231™), BC-3(ATCC® CRL-2277™), CA46(ATCC® CRL-1648™), DG-75[D.G.-75](ATCC® CRL-2625™), DS-1(ATCC® CRL-11102™), EB-3[EB3](ATCC® CCL-85™), Z-138(ATCC #CRL-3001), DB(ATCC CRL-2289), 톨레도(ATCC CRL-2631), 파이퍼(Pfiffer)(ATCC CRL-2632), SR(ATCC CRL-2262), JM-1(ATCC CRL-10421), NFS-5 C-1(ATCC CRL-1693); NFS-70 C10(ATCC CRL-1694), NFS-25 C-3(ATCC CRL-1695) 및 SUP-B15(ATCC CRL-1929)를 포함한다. 추가 예에는 역형성 및 대세포 림프종으로부터 유래하는 세포주, 예를 들면, DEL, DL-40, FE-PD, JB6, Karpas 299, Ki-JK, Mac-2A Ply1, SR-786, SU-DHL-1, -2, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10 및 -16, DOHH-2, NU-DHL-1, U-937, Granda 519, USC-DHL-1, RL; 호지킨 림프종, 예를 들면, DEV, HD-70, HDLM-2, HD-MyZ, HKB-1, KM-H2, L428, L540, L1236, SBH-1, SUP-HD1, SU/RH-HD-l을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 상업적 세포주에 대한 비제한적 예시적 정보원에는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) 또는 ATCC(http://www.atcc.org/) 및 독일 미생물 및 세포 배양물 컬렉션(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(https://www.dsmz.de/)이 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "암"은 비정상적 비조절된 복제를 나타내는 세포의 대상체에서의 존재를 특징으로 하는 질환 상태이고, 일부 측면에서, 이 용어는 용어 "종양"과 호환적으로 사용될 수 있다. "암 또는 종양 항원"이라는 용어는 암 세포 또는 종양 세포 또는 조직과 표면에서 결합 및 발현되는 것으로 공지되어 있는 항원을 지칭하고, 용어 "암 또는 종양 표적화 항체"는 이러한 항원을 표적으로 하는 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체"(CAR)는 항원에 결합할 수 있는 세포외 도메인, 세포외 도메인이 유래하는 폴리펩티드와는 상이한 폴리펩티드로부터 유래하는 막관통 도메인 및 적어도 하나의 세포내 도메인을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. "키메라 항원 수용체(CAR)"는 종종 "키메라 수용체", "T-바디" 또는 "키메라 면역 수용체(CIR)"로 불린다. "항원에 결합할 수 있는 세포외 도메인"은 특정 항원에 결합할 수 있는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. "세포내 도메인" 또는 "세포내 신호전달 도메인"은 신호를 전달하여 세포 내의 생물학적 프로세스의 활성화 또는 억제를 유발하는 도메인으로서 기능하는 것이 공지되어 있는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 특정 실시양태에서, 세포내 도메인은, 1차 신호전달 도메인에 추가하여, 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들을 포함할 수 있다. "막관통 도메인"은 세포막에 걸쳐 있는 것이 공지되어 있고, 세포외 및 신호전달 도메인을 연결하도록 기능할 수 있는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이의 링커로서 기능하는 "힌지 도메인"을 임의로 포함할 수 있다. 이러한 도메인의 비제한적 예가 본 명세서에 제공된다. 예를 들면,
힌지 도메인: IgG1 중쇄 힌지 코딩 서열:
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTTGCCCG(서열번호 112)
추가의 비제한적 예에는 당해 기술분야에 공지된 바와 같은 IgG4 힌지 영역, IgD 및 CD8 도메인이 포함된다.
막관통 도메인: CD28 막관통 영역 코딩 서열:
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCTTTATTATT
TTCTGGGTG(서열번호 113)
세포내 도메인: 4-1BB 공자극 신호전달 영역 코딩 서열:
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGG
AAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(서열번호 114)
세포내 도메인: CD28 공자극 신호전달 영역 코딩 서열:
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCG
CAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(서열번호 115)
세포내 도메인: CD3 제타 신호전달 영역 코딩 서열:
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(서열번호 116)
각각의 예시적 도메인 성분의 추가 실시양태는 상기 개시된 핵산 서열에 의해 코딩된 단백질과 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 갖는 기타 단백질을 포함한다. 추가로, 이러한 도메인의 비제한적 예가 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD8α 힌지 도메인"은 이 명칭과 관련하는 특정 단백질 단편, 및 본 명세서에 제시된 CD8α 힌지 도메인 서열과 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 80% 아미노산 서열, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 갖는 임의의 기타 분자를 지칭한다. 인간, 마우스 및 기타 종에 대한 CD8α 힌지 도메인의 예시적 서열은 문헌[참조: Pinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177]에 제공되어 있다. CD8α 힌지 도메인과 관련된 서열은 문헌[참조: Pinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177]에 제공되어 있다. 이들의 비제한적 예는 하기를 포함한다:
인간 CD8 알파 힌지 도메인:
PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY(서열번호 117).
마우스 CD8 알파 힌지 도메인:
KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGGTGLDFACDIY(서열번호 118).
고양이 CD8 알파 힌지 도메인:
PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY(서열번호 119).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD8α 막관통 도메인"은 이 명칭과 관련하는 특정 단백질 단편, 및 본 명세서에 제시된 CD8α 막관통 도메인 서열과 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 갖는 임의의 기타 분자를 지칭한다. 인간 T 세포 표면 당단백질 CD8 알파 쇄(GenBank 수탁 번호: NP_001759.3)의 아미노산 위치 183 내지 203, 또는 마우스 T 세포 표면 당단백질 CD8의 아미노산 위치 197 내지 217(GenBank 수탁 번호: NP_001074579.1) 및 랫트 T-세포 표면 당단백질 CD8 알파 쇄의 아미노산 위치 190 내지 210(GenBank 수탁 번호 NP_113726.1)과 관련된 단편 서열은 CD8α 막관통 도메인의 추가의 예시적 서열을 제공한다. 수록된 각 수탁 번호와 관련된 서열은 하기와 같이 제공된다:
인간 CD8 알파 막관통 도메인: IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(서열번호 120).
마우스 CD8 알파 막관통 도메인: IWAPLAGICVALLLSLIITLI(서열번호 121).
랫트 CD8 알파 막관통 도메인: IWAPLAGICAVLLLSLVITLI(서열번호 122).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD28 막관통 도메인"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편, 및 본 명세서에 제시된 CD28 막관통 도메인 서열과 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 갖는 임의의 기타 분자를 지칭한다. GenBank 수탁 번호: XM_006712862.2 및 XM_009444056.1과 관련된 단편 서열은 CD28 막관통 도메인의 추가의 비제한적 예시 서열을 제공한다. 수록된 수탁 번호의 각각과 관련된 서열이 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "4-1BB 공자극 신호전달 영역"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편, 및 본 명세서에 제시된 4-1BB 공자극 신호전달 영역 서열과 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 갖는 임의의 기타 분자를 지칭한다. 4-1BB 공자극 신호전달 영역의 비제한적 예시 서열은 하기에 제공된 예시적 서열과 같은 미국 공개 번호 제20130266551A1호(미국 특허 출원 번호 제13/826,258호로 출원됨)에 제공된다:
4-1BB 공자극 신호전달 영역:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(서열번호 123)
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD28 공자극 신호전달 영역"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편, 및 본 명세서에 제시된 CD28 공자극 신호전달 영역 서열과 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 갖는 임의의 기타 분자를 지칭한다. 예시적 서열 CD28 공자극 신호전달 도메인은 문헌[참조: 미국 특허 제5,686,281호; Geiger, T.L. et al., Blood 98: 2364-2371 (2001); Hombach, A. et al., J Immunol 167: 6123-6131 (2001); Maher, J. et al. Nat Biotechnol 20: 70-75 (2002); Haynes, N.M. et al., J Immunol 169: 5780-5786 (2002); Haynes, N.M. et al., Blood 100: 3155-3163 (2002)]에 제공되어 있다. 비제한적 예는 하기 CD28 서열의 잔기 114 내지 220: MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS(서열번호 124), 및 이의 등가물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "ICOS 공자극 신호전달 영역"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편, 및 본 명세서에 제시된 ICOS 공자극 신호전달 영역 서열과 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 갖는 임의의 기타 분자를 지칭한다. ICOS 공자극 신호전달 영역의 비제한적 예시 서열은 하기에 제공된 예시적 폴리뉴클레오티드 서열인 미국 공개 제2015/0017141A1호에 제공되어 있다.
ICOS 공자극 신호전달 영역 코딩 서열:
ACAAAAAAGA AGTATTCATC CAGTGTGCAC GACCCTAACG GTGAATACAT GTTCATGAGA GCAGTGAACA CAGCCAAAAA ATCCAGACTC ACAGATGTGA CCCTA(서열번호 125)
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "OX40 공자극 신호전달 영역"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편, 및 본 명세서에 제시된 OX40 공자극 신호전달 영역 서열과 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 대안적으로 90% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 갖는 임의의 기타 분자를 지칭한다. OX40 공자극 신호전달 영역의 비제한적 예시 서열은 미국 공개 제2012/20148552A1호에 개시되어 있고, 하기에 제공된 예시적 서열을 포함한다.
OX40 공자극 신호전달 영역 코딩 서열:
AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGAC CCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC(서열번호 126) 및 이의 등가물.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD28 공자극 신호전달 영역"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편, 및 본 명세서에 제시된 CD28 공자극 신호전달 영역 서열과 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 대안적으로 90% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 갖는 임의의 기타 분자를 지칭한다. 예시적 서열 CD28 공자극 신호전달 도메인은 문헌[참조: 미국 특허 제5,686,281호; Geiger, T.L. et al. (2001) Blood 98: 2364-2371; Hombach, A. et al. (2001) J Immunol 167: 6123-6131; Maher, J. et al. (2002) Nat Biotechnol 20: 70-75; Haynes, N.M. et al. (2002) J Immunol 169: 5780-5786 (2002); Haynes, N.M. et al. (2002) Blood 100: 3155-3163]에 제공되어 있다. 비제한적 예는 하기의 잔기 114 내지 220 및 코딩된 서열을 포함한다:
CD28 서열 MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS(서열번호 124) 및 이의 등가물.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD3 제타 신호전달 도메인"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편, 및 본 명세서에 제시된 CD3 제타 신호전달 도메인 서열과 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 갖는 임의의 기타 분자를 지칭한다. CD3 제타 신호전달 도메인의 비제한적 예시 서열은 미국 출원 번호 제13/826,258호에 제공되어 있다:
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 3)
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 NKG2D는 최근 상당한 관심을 불러일으키고 있는 활성화 수용체를 지칭한다. 다수의 NKG2D 표적 리간드가 동정되었다. 이들 중 가장 흥미로운 것은 MICA 및 MICB(주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 쇄 관련)라고 하는 밀접하게 관련된 단백질의 쌍이다.
면역학적 및 생물학적 시약(상기 언급된 linscottsdirectory.com 참조).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "FLT3"은 이 명칭과 관련된 수용체-유형 티로신-단백질 키나제 FLT3, 임의의 이의 대체 명칭(Fms-관련 티로신 키나제, 줄기 세포 티로신 키나제, Fms-유사 티로신 키나제, FL 사이토카인 수용체, CD135 항원, EC 2.7.10.1, CD135, FLK-2, STK1, FLK2, 성장 인자 수용체 티로신 키나제 유형 III, 수용체 유형 티로신-단백질 키나제 FLT3, 태아 간 키나제 2, 태아 간 키나제-2, EC 2.7.10, FLT-3, STK-1) 또는 UniProt 수탁 번호 P36888, 및 FLT3 및 이의 임의의 변이체 또는 동형(isoform)과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 갖는 임의의 기타 분자를 지칭한다. FLT3에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체는, 예를 들면, 벡톤 디킨슨 바이오사이언시스(Becton Dickinson Biosciences) 및 기타 상업적 공급원, 예를 들면, 웹 주소: biocompare.com/Search-Antibodies/?search=FLT3&said=0에 수록된 것들로부터 상업적으로 입수 가능하다. 항원 결합 단편을 제조하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 항원 결합 도메인은 임의의 적절한 종, 예를 들면, 양 또는 인간으로부터 유래할 수 있다.
FLT3의 비제한적 예는 하기를 포함한다:
인간 FLT3 동형 1형,
MPALARDGGQLPLLVVFSAMIFGTITNQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNISFYATIGVCLLFIVVLTLLICHKYKKQFRYESQLQMVQVTGSSDNEYFYVDFREYEYDLKWEFPRENLEFGKVLGSGAFGKVMNATAYGISKTGVSIQVAVKMLKEKADSSEREALMSELKMMTQLGSHENIVNLLGACTLSGPIYLIFEYCCYGDLLNYLRSKREKFHRTWTEIFKEHNFSFYPTFQSHPNSSMPGSREVQIHPDSDQISGLHGNSFHSEDEIEYENQKRLEEEEDLNVLTFEDLLCFAYQVAKGMEFLEFKSCVHRDLAARNVLVTHGKVVKICDFGLARDIMSDSNYVVRGNARLPVKWMAPESLFEGIYTIKSDVWSYGILLWEIFSLGVNPYPGIPVDANFYKLIQNGFKMDQPFYATEEIYIIMQSCWAFDSRKRPSFPNLTSFLGCQLADAEEAMYQNVDGRVSECPHTYQNRRPFSREMDLGLLSPQAQVEDS (서열번호 127), 및 임의로 이의 등가물.
인간 FLT3 동형 2:
MPALARDGGQLPLLVVFSAMIFGTITNQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNISFYATIGVCLLFIVVLTLLICHKYKKQFRYESQLQMVQVTGSSDNEYFYVDFREYEYDLKWEFPRENLEFGKVLGSGAFGKVMNATAYGISKTGVSIQVAVKMLKEKADSSEREALMSELKMMTQLGSHENIVNLLGACTLSGPIYLIFEYCCYGDLLNYLRSKREKFHRTWTEIFKEHNFSFYPTFQSHPNSSMPGSREVQIHPDSDQISGLHGNSFHSEDEIEYENQKRLEEEEDLNVLTFEDLLCFAYQVAKGMEFLEFKSARLPVKWMAPESLFEGIYTIKSDVWSYGILLWEIFSLGVNPYPGIPVDANFYKLIQNGFKMDQPFYATEEIYIIMQSCWAFDSRKRPSFPNLTSFLGCQLADAEEAMYQNVDGRVSECPHTYQNRRPFSREMDLGLLSPQAQVEDS(서열번호 128), 및 임의로 이의 등가물.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 일부 측면에서 용어 FLT3-1은 하기에 개시된 중쇄 및 경쇄 폴리뉴클레오티드 서열에서 코딩된 CDR의 어느 하나, 바람직하게는 하기에 개시된 CDR3 영역 중 적어도 하나, 가장 바람직하게는 CDR3 영역 둘 모두와 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 CDR을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체를 지칭한다. 상기 CDR 영역의 아미노산 서열은 또한 본 명세서에서 하기에 개시되어 있다.
FLT3-1 중쇄 가변 영역 폴리뉴클레오티드 서열:
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCATTGAAGCTGTCCTGCAAGTCTTCCGGGTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATCGGAGAGATTGATCCTTCTGACAGTTATAAAGACTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTGGACAGATCCTCCAACACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGCGATTACGACGACCCCCTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(서열번호 105), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3-1 경쇄 가변 영역 폴리뉴클레오티드 서열:
GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAGTGTATTTCTGTCAACAGAGTAACACCTGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG(서열번호 103), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3-1 CDHR1:
SYWMH(서열번호 21), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3-1 CDHR2:
EIDPSDSYKDYNQKFKD(서열번호 23), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3-1 CDHR3:
AITTTPFDF(서열번호 25), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3-1 CDLR1:
RASQSISNNLH(서열번호 15), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3-1 CDLR2:
YASQSIS(서열번호 17), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3-1 CDLR3:
QQSNTWPYT(서열번호 19), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3 CDR 도메인 아미노산 서열의 추가의 비제한적 예는 미국 특허 출원 제US20180346601호의 표 1 내지 4, 미국 특허 출원 제US20180037657호의 표 V, 미국 특허 출원 제US20170037149호의 표 10, 미국 특허 출원 제US20160272716호의 표 V, 미국 특허 출원 제US20110091470호의 표 1 내지 3 및 미국 특허 출원 제US20090297529호의 표 1 내지 3에 기재되어 있다.
FLT3 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 비제한적 예는 미국 특허 출원 제US20180346601호의 표 1 및 3, 미국 특허 출원 제US20180037657호의 표 X, 미국 특허 출원 제US20170037149호의 표 10 및 미국 특허 출원 제US20160272716호의 표 VII에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 FLT3-2는 하기에 개시된 중쇄 및 경쇄 폴리뉴클레오티드 서열에 코딩된 CDR 중 어느 하나, 바람직하게는 하기에 개시된 CDR3 영역 중 적어도 하나, 가장 바람직하게는 CDR3 영역 둘 모두와 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 95% 서열 동일성을 공유하는 CDR을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체를 지칭한다. 상기 CDR 영역의 아미노산 서열은 또한 본 명세서에서 하기 개시되어 있다.
FLT3-2 중쇄 가변 영역 서열:
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTTTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAGCACAGACTATAATGCAGCTTTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAGGCTGATGACACAGCCATATACTACTGTGCCAGAAAAGGAGGGATCTACTATGCTAACCATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 106), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3-2 경쇄 가변 영역 서열:
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTATATGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG(서열번호 104), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3-2 CDHR1:
NYGLH(서열번호 22), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3-2 CDHR2:
VIWSGGSTDYNAAFIS(서열번호 24), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3-2 CDHR3:
GGIYYANHYYAMDY(서열번호 26), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3-2 CDLR1:
KSSQSLLNSGNQKNYM(서열번호 16), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3-2 CDLR2:
GASTRES(서열번호 18), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3-2 CDLR3:
QNDHSYPLT(서열번호 20), 및 임의로 이의 등가물.
FLT3 항체의 비제한적 예는 아미노산 서열(SYWMH, 서열번호 21) 또는 (NYGLH, 서열번호 22) 또는 이들 각각의 등가물을 갖는 CDHR1, 아미노산 서열(EIDPSDSYKDYNQKFKD, 서열번호 23) 또는 (VIWSGGSTDYNAAFIS, 서열번호 24) 또는 이들 각각의 등가물을 갖는 CDHR2, 및 아미노산 서열(AITTTPFDF, 서열번호 25) 또는 (GGIYYANHYYAMDY, 서열번호 26) 또는 이들 각각의 등가물을 갖는 CDHR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 아미노산 서열(RASQSISNNLH, 서열번호 15) 또는 (KSSQSLLNSGNQKNYM, 서열번호 16) 또는 이들 각각의 등가물을 갖는 CDLR1, 아미노산 서열(YASQSIS, 서열번호 17) 또는 (GASTRES, 서열번호 18) 또는 이들 각각의 등가물을 갖는 CDLR2, 아미노산 서열(QQSNTWPYT, 서열번호 19) 또는 (QNDHSYPLT, 서열번호 20) 또는 이들 각각의 등가물을 갖는 CDLR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일 측면에서, FLT3 CAR은 EF1알파 프로모터 EF1α에 의해 구동된다.
두문자어 "EGFR"은 상피 성장 인자 수용체를 의미한다. EGFR은 ErbB-1 및 HER1으로서도 공지되어 있다. 이는 세포 표면 수용체의 상피 성장 인자 패밀리의 세포 표면 수용체이다. 용어 "EGFR"은 또한 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편, 및 본 명세서에 개시된 EGFR의 임의의 동형과 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 갖는 임의의 기타 분자를 지칭한다. 동형 1은 표준 서열이고; 따라서 이하의 모든 위치 정보는 하기에 개시된 아미노산 서열을 지칭한다;
EGFR 동형 1 Uniprot P00533-1:
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA(서열번호 129)
결합 부위에는 위치 745 및 855가 포함되지만 이들로 한정되지 않고; 활성 부위에는 위치 837이 포함되지만 이들로 한정되지 않고; 기타 목적 부위에는 위치 1016이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. EGFR 동형 2(Uniprot P00533-2)는 위치 404 내지 405에 FL로부터 LS로의 치환이 있고, 위치 406 내지 1210의 영역이 결여한다. EGFR 동형 4(Uniprot P00533-4)는 위치 628에서 C로부터 S로의 치환이 있고, 위치 629 내지 1210의 영역이 결여한다. EGFR 동형 3(Uniprot P00533-3)은 위치 628 내지 705과 상이하고, 하기 서열에 따라 위치 706 내지 1210의 영역이 결여한다.
EGFR 동형 3, Uniprot P00533-3:
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGPGNESLKAMLFCLFKLSSCNQSNDGSVSHQSGSPAAQESCLGWIPSLLPSEFQLGWGGCSHLHAWPSASVIITASSCH(서열번호 130)
EGFRvIII은 다형성 교모세포종(GB)을 갖는 환자의 상당한 비율에서 발현되는 것으로 보고된 EGFR의 돌연변이 형태이다. 문헌[참조: Gan et al. 205350-5370]은 돌연변이 형태가 다른 종양에서도 발현된다는 것을 보고한다. 용어 "돌연변이 EGFR"은 EGFRvIII 또는 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편, 및 본 명세서에 제시된 EGFRvIII 또는 본 명세서에서 추가로 정의된 이의 등가물과 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 갖는 임의의 기타 분자를 지칭할 수 있다.
EGFRvIII, Uniprot P00533[30-297]:
MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKV CQGTSNKLTQ LGTFEDHFLS LQRMFNNCEV VLGNLEITYV QRNYDLSFLK TIQEVAGYVL IALNTVERIPLENLQIIRGN MYYENSYALA VLSNYDANKT GLKELPMRNL QEILHGAVRF SNNPALCNVE SIQWRDIVSS DFLSNMSMDF QNHLGSCQKC DPSCPNGSCWGAGEENCQKL TKIICAQQCS GRCRGKSPSD CCHNQCAAGC TGPRESDCLV CRKFRDEATC KDTCPPLMLY NPTTYQMDVN PEGKYSFGAT CVKKCPRNYV VTDHGSCVRA CGADSYEMEE DGVRKCKKCE GPCRKVCNGI GIGEFKDSLS INATNIKHFK NCTSISGDLH ILPVAFRGDS FTHTPPLDPQ ELDILKTVKE ITGFLLIQAW PENRTDLHAF ENLEIIRGRT KQHGQFSLAV VSLNITSLGL RSLKEISDGD VIISGNKNLC YANTINWKKL FGTSGQKTKI ISNRGENSCK ATGQVCHALC SPEGCWGPEP RDCVSCRNVS RGRECVDKCN LLEGEPREFV ENSECIQCHP ECLPQAMNIT CTGRGPDNCI QCAHYIDGPH CVKTCPAGVM GENNTLVWKY ADAGHVCHLC HPNCTYGCTG PGLEGCPTNG PKIPSIATGM VGALLLLLVV ALGIGLFMRR RHIVRKRTLR RLLQERELVE PLTPSGEAPN QALLRILKET EFKKIKVLGS GAFGTVYKGL WIPEGEKVKI PVAIKELREATSPKANKEIL DEAYVMASVD NPHVCRLLGI CLTSTVQLIT QLMPFGCLLDYVREHKDNIG SQYLLNWCVQ IAKGMNYLED RRLVHRDLAA RNVLVKTPQHVKITDFGLAK LLGAEEKEYH AEGGKVPIKW MALESILHRI YTHQSDVWSYGVTVWELMTF GSKPY DGIPA SEISSILEKG ERLPQPPICT IDVYMIMVKC WMIDADSRPK FRELIIEFSK MARDPQRYLV IQGDERMHLPLMDEEDMDDV VDADEYLIPQ QGFFSSPSTS RTPLLSSLSA TSNNSTVACIDRNGLQSCPI KEDSFLQRYS SDPTGALTED SIDDTFLPVP EYINQSVPKRPAGSVQNPVY HNQPLNPAPS RDPHYQDPHS TAVGNPEYLN TVQPTCVNSTFDSPAHWAQK GSHQISLDNP DYQQDFFPKE AKPNGIFKGS TAENAEYLRVAPQSSEFIGA(서열번호 131)
용어 "돌연변이 EGFR"은 또한, 하기 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 변이체를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 변이체를 포함하는 EGFR의 임의의 동형의 천연 변이체를 지칭할 수 있다: 위치 98에서 R로부터 Q로, 위치 266에서 P로부터 R로, 위치 428에서 G로부터 D로, 위치 521에서 R로부터 K로, 위치 674에서 V로부터 I로, 위치 709에서 E로부터 A로, 위치 709에서 E로부터 G로, 위치 709에서 E로부터 K로, 위치 719에서 G로부터 A로, 위치 719에서 G로부터 C로, 위치 719에서 G로부터 D로, 위치 719에서 G로부터 S로, 위치 724에서 G로부터 S로, 위치 734에서 E로부터 K로, 위치 746 내지 752에서 ELREATS(서열번호 172)로부터 D로, 위치 746 내지 751에서 ELREAT(서열번호 173)로부터 A로, 위치 746 내지 750에서 결실, 위치 746에서 결실, 위치 747 내지 751에서 결실, 위치 747 내지 749에서 결실, 위치 747에서 L로부터 F로, 위치 748에서 R로부터 P로, 위치 752 내지 759에서 결실, 위치 768에서 S로부터 I로, 위치 769에서 V로부터 M으로, 위치 787에서 Q로부터 R로, 위치 790에서 T로부터 M으로, 위치 833에서 L로부터 V로, 위치 834에서 V로부터 L로, 위치 835에서 H로부터 L로, 위치 838에서 L로부터 V로, 위치 858에서 L로부터 M으로, 위치 858에서 L로부터 R로, 위치 861에서 L로부터 Q로, 위치 873에서 G로부터 E로, 위치 962에서 R로부터 G로, 위치 988에서 H로부터 P로, 위치 1034에서 L로부터 R로, 위치 1210에서 A로부터 V로, 및/또는 특정 위치 중 어느 하나에서 상이한 아미노산 치환 또는 결실.
일부 실시양태에서, 항체의 중쇄 가변 영역은 하기를 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진다:
Q V Q L Q Q S G S E M A R P G A S V K L P C K A S G D T F T S Y W M H W V K Q R H G H G P E W I G N I Y P G S G G T N Y A E K F K N K V T L T V D R S S R T V Y M H L S R L T S E D S A V Y Y C T R S G G P Y F F D Y W G Q G T T L T V S S(서열번호 45) 또는 이들의 등가물, 또는 하기 폴리펩티드에 의해 코딩된 폴리뉴클레오티드:
GACATTCTAATGACCCAATCTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCTACCTGCAAAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCGACCGATTTTACCTGCAAAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCGACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTAGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATATTCCTCCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTGCGGCC(서열번호 132), 또는 이들의 등가물.
폴리펩티드 또는 이들 각각의 등가물에는 카복시-말단에서 추가로 50개 아미노산, 또는 대안적으로 약 40개 아미노산, 또는 대안적으로 약 30개 아미노산, 또는 대안적으로 약 20개 아미노산, 또는 대안적으로 약 10개 아미노산, 또는 대안적으로 약 5개 아미노산, 또는 대안적으로 약 4개, 또는 3개, 또는 2개 또는 1개 아미노산이 이어질 수 있다.
다른 측면에서, LC 가변 영역은 하기를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진다:
D I L M T Q S P L S L P V S L G D Q A S I S C R S S Q N I V H N N G I T Y L E W Y L Q R P G Q S P K L L I Y K V S D R F S G V P D R F S G S G S G T D F T L K I S R V E E D L G I Y Y C F Q G S H I P P T F G G G T K L E I K R A A (서열번호 43), 또는 이들의 등가물 또는 하기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드:
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGTCTGAGATGGCGAGGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGCCCTGCAAGGCTTCTGGCGACACATTCACCAGTTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCATGGACATGGCCCTGAGTGGATCGGAAATATTTATCCAGGTAGTGGTGGTACTAACTACGCTGAGAAGTTCAAGAACAAGGTCACTCTGACTGTAGACAGGTCCTCCCGCACAGTCTACATGCACCTCAGCAGGCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTACAAGATCGGGGGGTCCCTACTTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCC(서열번호 133), 또는 이들의 등가물.
폴리펩티드 또는 이들 각각의 등가물에는 카복시-말단에 추가의 50개 아미노산, 또는 대안적으로 약 40개 아미노산, 또는 대안적으로 약 30개 아미노산, 또는 대안적으로 약 20개 아미노산, 또는 대안적으로 약 10개 아미노산, 또는 대안적으로 약 5개 아미노산, 또는 대안적으로 약 4개, 또는 3개, 또는 2개 또는 1개 아미노산이 이어질 수 있다.
이의 등가물은 CAR에 대해 적어도 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드, 또는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상보체에 대해 높은 엄격함의 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 높은 엄격함 조건은 약 55℃ 내지 약 68℃의 배양 온도; 약 1× SSC 내지 약 0.1× SSC의 완충액 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아미드 농도; 및 약 1× SSC, 0.1× SSC 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함한다.
대안적 실시양태는 LC 가변 영역으로부터의 CDR(예를 들면, CDR1, CDR2, CDR3) 중 하나 이상을 기타 EGFR 항체 CDR로부터의 적절한 CDR 및 이들 각각의 등가물을 포함한다. 따라서, 및 일례로서, LC 가변 영역으로부터의 CDR1 및 CDR2는 또 다른 항-EGFR 항체의 LC 가변 영역의 CDR3과 조합될 수 있고, 일부 측면에서, 카복시-말단에 추가의 50개 아미노산, 또는 대안적으로 약 40개 아미노산, 또는 대안적으로 약 30개 아미노산, 또는 대안적으로 약 20개 아미노산, 또는 대안적으로 약 10개 아미노산, 또는 대안적으로 약 5개 아미노산, 또는 대안적으로 약 4개, 또는 3개, 또는 2개 또는 1개 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, EGFR CAR은 WO 제2016/164370호에 개시된 CAR이다.
"조성물"은 전형적으로 활성제, 예를 들면, 화합물 또는 조성물과, 천연 존재 또는 비천연 담체, 불활성(예: 검출가능한 약제 또는 표지) 또는 활성제, 예컨대, 보조제, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충액, 염, 친유성 용매, 보존제, 보조제 등의 조합을 의도하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 담체에는 또한 약제학적 부형제 및 첨가제 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질 및 탄수화물(예: 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류 및 올리고당을 포함하는 당, 알디톨, 알돈산, 에스테르화 당 등의 유도체화된 당; 및 다당류 또는 당 중합체)이 포함되고, 이는 단독으로 또는 조합하여 존재할 수 있고, 단독으로 또는 조합하여 1 내지 99.99 중량% 또는 용적%를 포함한다. 예시적 단백질 부형제는 혈청 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA), 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카제인 등을 포함한다. 완충 능력으로도 작용할 수 있는 대표적 아미노산/항체 성분에는 알라닌, 아르기닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 라이신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파르탐 등이 포함된다. 탄수화물 부형제는 또한 이 기술의 범위 내에서 의도되고, 이의 예로는 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등의 단당류; 락토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 셀로비오스 등의 이당류; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등의 다당류; 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨(글루시톨) 및 미오이노시톨 등의 알디톨이 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 열거된 요소를 포함하지만, 기타 것을 배제하지 않는 것을 의미하도록 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용되는 "본질적으로 이루어진"은 의도된 사용을 위한 조합에 대해 본질적으로 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미한다. 예를 들면, 본 명세서에서 정의된 요소로 본질적으로 이루어진 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터 미량의 오염 물질 및 인산염 완충 생리식염수, 방부제 등의 약제학적으로 허용되는 담체를 배제하지 않을 것이다. "이루어진"은 기타 성분의 미량 이상의 원소를 배제하는 것 및 본 명세서에 개시된 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법 단계를 배제하는 것을 의미할 것이다. 이러한 전환 용어 각각에 의해 정의된 측면은 본 개시의 범위 내에 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "컨센서스 서열"은 일련의 복수의 서열을 정렬함으로써 결정되고, 복수 서열의 각각의 대응하는 위치에서 아미노산 또는 염기의 주요 선택을 나타내는 이상적 서열을 정의하는 아미노산 또는 핵산 서열을 의미한다. 일련의 복수 서열의 서열에 따라, 그 계열에 대한 컨센서스 서열은 0개, 1개, 수개 또는 그 이상의 치환에 의해 각 서열과 상이할 수 있다. 또한, 일련의 복수 서열의 서열에 따라, 그 계열에 대해 하나 이상의 컨센서스 서열이 결정될 수 있다. 컨센서스 서열의 생성은 집중적 수학적 분석을 받았다. 다양한 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 컨센서스 서열을 결정할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CRISPR"은 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문 반복 경로에 의존하는 서열 특이적 유전자 조작의 기술을 지칭한다. CRISPR은 유전자 편집 및/또는 유전자 조절을 수행하고, 단백질을 특정 게놈 위치로 단순히 표적화하기 위해 사용할 수 있다. 유전자 편집은 표적 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결실, 삽입 또는 염기 치환의 도입에 의해 변경되는 유형의 유전자 공학을 지칭한다. 일부 측면에서, CRISPR 매개 유전자 편집은 비상동성 말단 결합(NHEJ) 또는 상동 재조합의 경로를 이용하여 편집을 수행한다. 유전자 조절은 단백질 또는 RNA 등의 특정 유전자 산물의 생산을 증가 또는 감소시키는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "gRNA" 또는 "가이드 RNA"는 CRISPR 기술을 사용하여 수정을 위해 특정 유전자를 표적으로 하기 위해 사용되는 가이드 RNA 서열을 지칭한다. 표적 특이성을 위한 gRNA 및 공여자 치료용 폴리뉴클레오티드를 설계하는 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Doench, J., et al. Nature biotechnology 2014; 32(12):1262-7, Mohr, S. et al. (2016) FEBS Journal 283: 3232-38, and Graham, D., et al. Genome Biol. 2015; 16: 260]. gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRIPSPR RNA(tracrRNA)를 포함하는 융합 폴리뉴클레오티드; 또는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRIPSPR RNA(tracrRNA)를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 측면에서, gRNA는 합성이다[참조: Kelley, M. et al. (2016) J of Biotechnology 233 (2016) 74-83]. 본 명세서에 사용된 바와 같이, gRNA의 생물학적 등가물에는, 세포 게놈의 특정 영역 등의 특정 뉴클레오티드 서열에 Cas9 또는 이의 등가물을 유도할 수 있는 폴리뉴클레오티드 또는 표적 분자가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 "세포감소 요법"에는 화학요법, 동결요법 및 방사선 요법이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 세포 증식을 감소시키도록 작용하는 약제는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 광범위하게 사용된다. 암 세포가 분열할 때만 암 세포를 사멸하는 화학요법 약물은 세포 주기 특이적이라고 한다. 이러한 약물에는 토포이소머라제 억제제 및 항-대사물질을 포함하여 S기에 작용하는 약제가 포함된다.
토포이소머라제 억제제는 토포이소머라제 효소(토포이소머라제 I 및 II)의 작용을 방해하는 약물이다. 화학 치료의 과정에서, 토포이소머라제 효소는 복제에 필요한 DNA 구조의 조작을 조절하기 때문에, 세포 주기 특이적이다. 토포이소머라제 I 억제제의 예에는 상기 열거된 캄프토테칸 유사체, 이리노테칸 및 토포테칸이 포함된다. 토포이소머라제 II 억제제의 예에는 암사크린, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트 및 테니포사이드가 포함된다.
항-대사물질은 통상 정상 대사 기질의 유사체이고, 염색체 복제에 관여하는 프로세스를 종종 방해한다. 이들은 사이클의 매우 특정한 단계에서 세포를 공격한다. 항-대사물질에는 엽산 길항제, 예를 들면, 메토트렉세이트; 피리미딘 길항제, 예를 들면, 5-플루오로우라실, 폭스우리딘, 시타라빈, 카페시타빈 및 젬시타빈; 퓨린 길항제, 예를 들면, 6-머캅토퓨린 및 6-티오구아닌; 아데노신 데아미나제 억제제, 예를 들면, 클라드리빈, 플루다라빈, 넬라라빈 및 펜토스타틴 등이 포함된다.
식물 알칼로이드는 특정 유형의 식물에서 유래한다. 빈카 알칼로이드는 대수리 식물(Catharanthus rosea)로부터 제조된다. 탁산은 태평양 주목나무(taxus)의 껍질로부터 제조된다. 빈카 알칼로이드와 탁산은 항-미세소관제로도 공지되어 있다. 포도필로톡신은 5월의 사과 식물로부터 유래한다. 캄프토테칸 유사체는 아시아 "행복한 나무"(Camptotheca acuminata)로부터 유래한다. 포도필로톡신 및 캄프토테칸 유사체도 토포이소머라제 억제제로서 분류된다. 식물 알칼로이드는 일반적으로 세포 주기 특이적이다.
이들 약제의 예에는 빈카 알칼로이드, 예를 들면, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 비노렐빈; 탁산, 예를 들면, 파클리탁셀 및 도세탁셀; 포도필로톡신, 예를 들면, 에토포시드 및 테니소피드; 및 캄프토테칸 유사체, 예를 들면, 이리노테칸 및 토포테칸이 포함된다.
동결요법에는 온도를 저하시키는 것과 관련된 요법, 예를 들면, 저체온 요법이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
방사선 요법은 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 방사선에 대한 노출, 예를 들면, 이온화 방사선, UV 방사선에 대한 노출이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 예시적인 선량에는 적어도 약 2 Gy 내지 약 10 Gy 이하 범위에서 이온화 방사선의 선량 및/또는 적어도 약 5 J/m2 내지 약 50 J/m2 이하, 통상 약 10 J/m2의 범위에서 자외선의 선량이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
"검출가능한 표지", "표지", "검출가능한 마커(marker)" 또는 "마커"는 호환적으로 사용되고, 여기에는 방사성동위원소, 형광색소, 화학발광 화합물, 염료 및 효소를 포함하는 단백질이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 검출가능한 표지는 또한 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체 또는 조성물에 부착시킬 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "검출가능한 마커"는 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 적어도 하나의 마커를 지칭한다. 이 마커의 비제한적 목록에는, 예를 들면, 비색분석, 형광, 발광, 예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 형광, 발광 염료 등의 발색단에 의해, 전자현미경에 의해 또는 전도율, 전류계, 전압전류법, 임피던스 등의 전기적 특성에 의해 검출되는 전자 밀도를 갖는 그룹, 예를 들면, 분자가 물리적 및/또는 화학적 특성에서 검출가능한 변형을 유도하기에 충분한 것들에 의해 검출가능한 신호를 생성하는 효소가 포함되고, 이러한 검출은 회절, 표면 플라즈몬 공명, 표면 변화, 접촉각 변화 등의 광학적 방법 또는 원자간력 분광법, 터널 효과 등의 물리적 방법 또는 32P, 35S 또는 125I 등의 방사성 분자에 의해 수행될 수 있다. 또한, 이 용어는 녹색 형광 단백질(GFP) 등과 같이 삽입된 서열의 발현시에 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드에 접합된 서열을 포함한다. 표지는 그 자체로 검출할 수 있거나(예: 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다. 표지는 소규모 검출에 적합하거나, 고처리량 스크리닝에 더 적합할 수 있다. 이와 같이, 적합한 표지에는 자기적 활성 동위원소, 비방사성 동위원소, 방사성 동위원소, 형광색소, 화학발광 화합물, 염료 및 효소를 포함하는 단백질이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 표지는 단순히 검출되거나 정량화될 수 있다. 단순히 감지되는 반응은 일반적으로 존재가 단순히 확인된 반응을 포함하는 반면, 정량화되는 반응은 일반적으로 강도, 편광 및/또는 기타 특성 등의 정량화 가능한(예: 수치 보고 가능한) 값을 갖는 반응을 포함한다. 발광 또는 형광 검정에서, 검출가능한 반응은 결합에 실제적으로 관여하는 분석 성분과 관련되는 발광단 또는 형광단을 직접 사용하여, 또는 다른(예: 리포터 또는 표시기) 성분과 관련되는 발광단 또는 형광단을 간접적으로 사용하여 생성될 수 있다. 신호를 생성하는 발광 표지의 예에는 생물발광 및 화학발광이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 검출가능한 발광 반응은 일반적으로 발광 신호의 변화 또는 발생을 포함한다. 검정 성분을 발광적으로 표지하기 위한 적합한 방법 및 발광단은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed)]에 기재되어 있다. 발광 프로브의 예에는 에쿼린 및 루시퍼라제가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "면역접합체"는 세포독성제, 검출가능한 제제, 방사성제, 표적화제, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 합성 항체, 반합성 항체 또는 다중특이성 항체 등의 제2 약제와 회합되거나 연결된 항체 또는 항체 유도체를 포함한다.
적합한 형광 표지의 예에는 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라사이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, 캐스케이드 블루™ 및 텍사스 레드가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 기타 적절한 광학 염료는 문헌[참조: Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)]에 기재되어 있다.
또 다른 측면에서, 형광 표지는 세포 표면 마커 등의 세포 또는 조직의 표면 내에 또는 표면 상에 존재하는 세포 성분에 대한 공유 부착을 용이하게 하도록 기능화된다. 적합한 관능기에는 이소티오시아네이트 그룹, 아미노 그룹, 할로아세틸 그룹, 말레이미드, 숙신이미딜 에스테르 및 술포닐 할라이드가 포함되지만 이들로 한정되지 않고, 이들 모두는 형광 표지를 제2 분자에 부착하기 위해 사용될 수 있다. 형광 표지의 관능기의 선택은 링커, 약제, 마커 또는 제2 표지화 제제에 대한 부착 부위에 의존한다.
"유효량" 또는 "유효한 양"은 포유동물 또는 기타 대상체의 치료를 위해 투여되는 경우, 질환을 위한 이러한 치료를 수행하기에 충분한 약제의 양, 또는 2개 이상의 약제의 조합된 양을 지칭한다. "유효량"은 약제(들), 질환 및 이의 중증도 및 치료 대상체의 연령, 체중 등에 따라 상이할 것이다.
일부 실시양태에서, 구성요소 명칭에서 용어 "제1", "제2", "제3", "제4" 등은 이들의 명칭에서 특정 속성을 공유하는 하나 이상의 구성요소를 구별 및 식별하기 위해 사용된다. 예를 들면, "제1 TAA" 및 "제2 TAA"는 2개의 TAA를 구별하기 위해 명세서 전반에 걸쳐 사용되고, 일부 실시양태에서, 제1 TAA는 본 명세서에 개시된 바와 같이 CAR에 의해 인식 및 결합되는 TAA이고, 제2 TAA는 본 명세서에 개시된 바와 같은 이중특이적 항체에 의해 인식 및 결합되는 TAA를 지칭한다.
핵산 서열에 적용되는 용어 "코딩하다"는, 이의 천연 상태에서 또는 당업자에게 공지된 방법에 의해 조작되는 경우에, 폴리펩티드를 "코딩한다"고 하고, 전사 및/또는 번역되어 폴리펩티드 및/또는 이의 단편의 mRNA를 생성할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 안티센스 쇄는 이러한 핵산의 상보체이고, 이로부터 코딩 서열을 추정할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "인핸서"는 발현되는 핵산 서열과 관련하여 이의 위치 및 방향에 관계없이 핵산 서열의 전사를 증강, 개선 또는 개량하는 서열 요소를 의미한다. 인핸서는 단일 프로모터 또는 동시에 하나 이상의 프로모터로부터의 전사를 증강시킬 수 있다. 전사를 개선하는 이러한 기능이 유지되거나, 또는 실질적으로 유지되는 한(예를 들면, 야생형 활성, 즉 전장 서열의 활성의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%), 야생형 인핸서 서열의 임의의 절단된(truncated), 돌연변이된 또는 기타 변형된 변이체도 상기 정의에 포함된다.
일 측면에서, 용어 항체의 "동등한" 또는 "생물학적 등가물"은 ELISA 또는 기타 적합한 방법에 의해 측정할 때 이의 에피토프 단백질 또는 이의 단편에 선택적으로 결합하는 항체의 능력을 의미한다. 생물학적으로 동등한 항체에는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 펩티드, 항체 단편, 항체 변이체, 항체 유도체 및 항체 모방체가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
명시적 인용 없이 및 달리 의도되지 않는 한, 본 개시가 폴리펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 항체에 관련하는 경우, 이들의 등가물 또는 생물학적 등가물이 본 개시의 범위 내에서 의도되는 것으로 추론되어야 한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "이의 생물학적 등가물"은, 참조 단백질, 항체, 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭하는 경우, "이의 등가물"과 동의어인 것으로 의도되며, 목적하는 구조 또는 기능을 여전히 유지하면서 최소한의 상동성을 갖는 것을 의도한다. 본 명세서에서 구체적으로 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 언급된 임의의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 또한 이의 등가물을 포함하는 것으로 고려된다. 예를 들면, 동등물은 적어도 약 70% 상동성 또는 동일성, 또는 적어도 80% 상동성 또는 동일성 및 대안적으로, 또는 적어도 약 85%, 또는 대안적으로 적어도 약 90%, 또는 대안적으로 적어도 약 95%, 또는 대안적으로 98%의 상동성 또는 동일성을 의도하고, 참조 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산에 대해 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 또는, 폴리뉴클레오티드를 언급하는 경우, 이의 등가물은 엄격한 조건하에서 참조 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보체에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드이다.
또 다른 서열에 대하여 특정 백분율(예를 들면, 80%, 85%, 90% 또는 95%)의 "서열 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역(또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)은, 정렬되는 경우, 2개 서열의 비교시에 염기(또는 아미노산)의 백분율이 동일한 것을 의미한다. 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 당해 기술분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들면, 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기재된 것들을 사용하여 측정할 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 파라미터가 정렬에 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 특히, 바람직한 프로그램은 하기 디폴트 파라미터를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다. 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 스트랜드 = 둘 다; 컷오프 = 60; 기대 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 선별 기준 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이러한 프로그램에 대한 상세는 하기 인터넷 주소: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST에서 발견할 수 있다.
"유전자"는 전사 및 번역된 후에 특정 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있는 적어도 하나의 개방 판독 프레임(ORF)을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
용어 "발현"은 유전자 산물의 생산을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 프로세스 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 프로세스를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래하는 경우, 발현에는 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱이 포함될 수 있다. 유전자의 발현 수준은 세포 또는 조직 샘플 중의 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 결정할 수 있다. 일 측면에서, 하나의 샘플로부터의 유전자의 발현 수준은 대조군 또는 참조 샘플로부터의 그 유전자의 발현 수준과 직접적으로 비교할 수 있다. 또 다른 측면에서, 하나의 샘플로부터의 유전자의 발현 수준은 화합물의 투여 후의 동일한 샘플로부터의 그 유전자의 발현 수준과 직접적으로 비교될 수 있다.
"유전자 산물" 또는 대안적으로 "유전자 발현 산물"은 유전자가 전사 및 번역될 때에 생성되는 아미노산(예를 들면, 펩티드 또는 폴리펩티드)을 지칭한다.
"1차" 또는 "2차" 또는 "3차"라는 문구는 환자가 받는 치료의 순서를 지칭한다. 1차 요법 섭생은 1차 요법인 반면, 2차 또는 3차 요법은 각각 1차 요법 후 또는 2차 요법 후에 제공된다. 국립 암 연구소(National Cancer Institute)는 1차 요법을 "질환 또는 병태에 대한 1차 치료"로서 정의한다. 암 환자의 경우, 1차 치료는 수술, 화학요법, 방사선 요법 또는 이들 요법의 조합일 수 있다. 1차 요법은 또한 당업자에게 "1차 요법 및 1차 치료"로 지칭된다. 2008년 5월 1일에 최후로 방문한 국립 암 연구소 웹사이트 www.cancer.gov를 참조하십시오. 통상, 환자는 1차 요법에 대하여 임상 또는 준임상 반응을 나타내지 않았거나, 1차 요법이 중단되었기 때문에, 환자에게 후속 화학 요법 섭생이 제공되었다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "상동성" 또는 "동일한", 퍼센트 "동일성" 또는 "유사성"은, 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 사용되는 경우, 동일하거나, 또는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율, 예를 들면, 특정 영역(예를 들면, 본 명세서에 기재된 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 본 명세서에 기재된 항체의 아미노산 서열)에 대해 적어도 60% 동일성, 바람직하게는 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 2개 이상의 서열 또는 부분서열을 지칭한다. 상동성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유되어 있는 경우, 분자는 그 위치에서 상동이다. 서열 간의 상동성의 정도는 서열에 의해 공유되는 정합 또는 상동 위치의 수의 함수이다. 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 당해 기술분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들면 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기재된 것들을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 파라미터가 정렬에 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 특히, 바람직한 프로그램은 하기 디폴트 파라미터를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 스트랜드 = 둘 다; 컷오프 = 60; 기대 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 선별 기준 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이러한 프로그램에 대한 상세는 하기 인터넷 주소: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST에서 발견할 수 있다. 용어 "상동성" 또는 "동일한", 퍼센트 "동일성" 또는 "유사성"은 또한 시험 서열의 상보체를 지칭하거나, 또는 이에 적용될 수 있다. 상기 용어에는 또한 결실 및/또는 부가를 갖는 서열, 뿐만 아니라 치환을 갖는 서열이 포함된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 갭 등을 설명할 수 있다. 바람직하게는, 동일성은 길이가 약 25개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역, 또는 보다 바람직하게는 길이가 50 내지 100개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재한다. "비관련" 또는 "비-상동" 서열은 본 명세서에 개시된 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 또는 대안적으로 25% 미만의 동일성을 공유한다.
"하이브리드화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여, 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성, 후그슈타인(Hoogstein) 결합 또는 이의 기타 서열-특이적 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 이중쇄 구조를 형성하는 2개의 쇄, 다중-쇄 복합체를 형성하는 3개 이상의 쇄, 단일 자가-하이브리드화 쇄, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하이브리드화 반응은 PCR 반응의 개시, 또는 리보자임에 의한 폴리뉴클레오티드의 효소적 절단 등의 보다 광범위한 프로세스의 단계를 구성할 수 있다.
엄격한 하이브리드화 조건의 예에는 하기가 포함된다: 약 25℃ 내지 약 37℃의 인큐베이션 온도; 약 6× SSC 내지 약 10× SSC의 하이브리드화 완충액 농도; 약 0% 내지 약 25%의 포름아미드 농도; 및 약 4× SSC 내지 약 8× SSC의 세척 용액. 중등도 하이브리드화 조건의 예에는 하기가 포함된다: 약 40℃ 내지 약 50℃의 인큐베이션 온도; 약 9× SSC 내지 약 2× SSC의 완충액 농도; 약 30% 내지 약 50%의 포름아미드 농도; 및 약 5× SSC 내지 약 2× SSC의 세척 용액. 높은 엄격성 조건의 예에는 하기가 포함된다: 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1× SSC 내지 약 0.1× SSC의 완충액 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아미드 농도; 및 약 1× SSC, 0.1× SSC 또는 탈이온수의 세척 용액. 일반적으로, 하이브리드화 인큐베이션 시간은 5분 내지 24시간이고, 1, 2 또는 그 이상의 세척 단계를 포함하고, 세척 인큐베이션 시간은 약 1, 2 또는 15분이다. SSC는 0.15M NaCl 및 15mM 시트레이트 완충액이다. 다른 완충액 시스템을 사용하는 SSC의 등가물도 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 기타 물질을 실질적으로 포함하지 않는 분자 또는 생물학적 물질 또는 세포 물질을 지칭한다. 일 측면에서, 용어 "단리된"은, 천연 공급원에 존재하는, 기타 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 기관으로부터 분리된, DNA 또는 RNA, 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들면, 이의 항체 또는 유도체), 또는 세포 또는 기관 등의 핵산을 지칭한다. 용어 "단리된"은 또한, 재조합 DNA 기술에 의해 생산되는 경우, 세포 물질, 바이러스 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성되는 경우, 화학적 전구체 또는 기타 화학물질을 실질적으로 포함하지 않는 핵산 또는 펩티드를 지칭한다. 추가로, "단리된 핵산"은 단편으로서 천연에 존재하지 않고, 천연 상태에서는 발견되지 않을 핵산 단편을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "단리된"은 또한, 기타 세포 단백질로부터 단리된 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용되고, 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드 둘 다를 포함하는 것을 의미한다. 용어 "단리된"은 또한, 본 명세서에서, 기타 세포 또는 조직으로부터 단리된 세포 또는 조직을 지칭하기 위해 사용되고, 배양 및 조작된 세포 또는 조직 둘 다를 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "단리된 세포"는 일반적으로 조직의 기타 세포로부터 실질적으로 분리된 세포를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 용어 "조작된" 또는 "재조합"은 천연 존재 단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 균주, 야생형 균주 또는 참조된 종의 모체 숙주 균주에서는 통상 발견되지 않는 적어도 하나의 변형을 갖는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 "조작된" 또는 "재조합"은 인간 개입에 의해 합성되는 것을 지칭한다.
"면역 세포"에는, 예를 들면, 골수에서 생성된 조혈 줄기 세포(HSC)로부터 유래하는 백혈구(백혈구), 림프구(T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포) 및 골수 유래 세포(호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 마크로파지, 수지상 세포)가 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "링커 서열", "링커 펩티드" 및 "링커 폴리펩티드"는, 1 내지 10, 또는 대안적으로 약 8, 또는 대안적으로 약 6, 또는 대안적으로 약 5, 또는 4 또는 대안적으로 3, 또는 대안적으로 2회 반복될 수 있는, 1 내지 10개, 또는 대안적으로 8개 아미노산, 또는 대안적으로 6개 아미노산, 또는 대안적으로 5개 아미노산을 포함하는 임의의 아미노산 서열과 관련하여 호환적으로 사용된다. 예를 들면, 링커는 3회 반복되는 펜타펩티드로 이루어진 최대 15개 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일 측면에서, 링커 서열은 gly-gly-gly-gly-ser(서열번호 134)의 3개 카피를 포함하는 (글리신4세린)3(서열번호 14)의 유연한 폴리펩티드 링커이다.
"종양 조직 유형에 대응하는 정상 세포"는 종양 조직과 동일한 조직 유형의 정상 세포를 지칭한다. 비제한적 예는 폐 종양을 갖는 환자로부터의 정상 폐 세포, 또는 폐암을 갖지 않는 환자로부터의 폐 조직, 또는 결장 종양을 갖는 환자로부터의 정상 결장 세포이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "T 세포"는 흉선에서 성숙하는 림프구의 유형을 지칭한다. T 세포는 세포 매개 면역에서 중요한 역할을 하고, 세포 표면에 T 세포 수용체가 존재하는 점에서 B 세포 등의 다른 림프구와 구별된다. T-세포는 단리되거나, 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있다. "T 세포"에는 T-헬퍼 세포(CD4+ 세포), 세포독성 T-세포(CD8+ 세포), 자연 살해 T-세포, T-조절 세포(Treg) 및 감마-델타 T 세포를 포함하여 CD3을 발현하는 모든 유형의 면역 세포가 포함된다. "세포독성 세포"에는 CD8+ T 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 호중구가 포함되고, 이들 세포는 세포독성 반응을 매개할 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 T-세포주의 비제한적 예에는 균주 BCL2(AAA) 주르카트(ATCC® CRL-2902™), BCL2(S70A) 주르카트(ATCC® CRL-2900™), BCL2(S87A) 주르카트(ATCC® CRL-2901™), BCL2 주르카트(ATCC® CRL-2899™), Neo 주르카트(ATCC® CRL-2898™), TALL-104 세포독성 인간 T 세포주(ATCC # CRL-11386)이 포함된다. 추가 예에는 성숙 T-세포주, 예를 들면, Deglis, EBT-8, HPB-MLp-W, HUT 78, HUT 102, Karpas 384, Ki 225, My-La, Se-Ax, SKW-3, SMZ-1 및 T34; 및 미성숙 T-세포주, 예를 들면, ALL-SIL, Be13, CCRF-CEM, CML-T1, DND-41, DU.528, EU-9, HD-Mar, HPB-ALL, H-SB2, HT-1, JK-T1, 주르카트, Karpas 45, KE-37, KOPT-K1, K-T1, L-KAW, Loucy, MAT, MOLT-1, MOLT 3, MOLT-4, MOLT 13, MOLT-16, MT-1, MT-ALL, P12/이시카와(Ichikawa), 피어(Peer), PER0117, PER-255, PF-382, PFI-285, RPMI-8402, ST-4, SUP-T1 내지 T14, TALL-1, TALL-101, TALL-103/2, TALL-104, TALL-105, TALL-106, TALL-107, TALL-197, TK-6, TLBR-1, -2, -3 및 -4, CCRF-HSB-2(CCL-120.1), J.RT3-T3.5(ATCC TIB-153), J45.01(ATCC CRL-1990), J.CaM1.6(ATCC CRL-2063), RS4;11(ATCC CRL-1873), CCRF-CEM(ATCC CRM-CCL-119); 및 피부 T-세포 림프종 세포주, 예를 들면, HuT78(ATCC CRM-TIB-161), MJ[G11](ATCC CRL-8294), HuT102(ATCC TIB-162)가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. REH, NALL-1, KM-3, L92-221을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 눌(Null) 백혈병 세포주는 면역 세포의 또 다른 상업적으로 이용 가능한 공급원이고, K562 적백혈병, THP-1 단핵구 백혈병, U937 림프종, HEL 적백혈병, HL60 백혈병, HMC-1 백혈병, KG-1 백혈병, U266 골수종 등의 기타 백혈병 및 림프종으로부터 유래하는 세포주도 마찬가지이다. 이러한 상업적으로 이용 가능한 세포주에 대한 비제한적 예시적 공급원에는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(또는 ATCC)(http://www.atcc.org/) 및 독일 미생물 및 세포 배양물 컬렉션(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(https://www.dsmz.de/)이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 자연 살해 세포라고도 공지된 용어 "NK 세포"는 골수에서 유래하고, 선천성 면역계에서 중요한 역할을 하는 림프구의 일종을 지칭한다. NK 세포는 세포 표면에 항체 및 주요 조직적합성 복합체가 존재하지 않는 경우에도 바이러스에 감염된 세포, 종양 세포 또는 기타 스트레스를 받은 세포에 대해 신속한 면역 반응을 제공한다. NK 세포는 단리되거나, 상업적으로 이용 가능한 공급원으로부터 입수할 수 있다. 상업적 NK 세포주의 비제한적 예에는 균주 NK-92(ATCC® CRL-2407™), NK-92MI(ATCC® CRL-2408™)이 포함된다. 추가 예에는 NK 계통 HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90 및 YT가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 상업적으로 이용 가능한 세포주에 대한 비제한적 예시적 공급원은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(또는 ATCC)(http://www.atcc.org/) 및 독일 미생물 및 세포 배양물 컬렉션(https://www.dsmz.de/)이 포함된다.
조절 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "작동적으로 연결된"은 조절 폴리뉴클레오티드와 그것이 연결되는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 회합을 지칭하고, 특정 단백질이 조절 폴리뉴클레오티드에 결합할 때, 연결된 폴리뉴클레오티드는 전사된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포, 조직 또는 기관과 관련하여 용어 "과발현"은 대조군 세포, 대조군 조직 또는 기관에서 생성되는 양보다 많은 양으로 단백질을 발현한다. 과발현된 단백질은 숙주 세포에 대해 내인성일 수도 있고, 숙주 세포에 대해 외인성일 수도 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 호환적으로 사용되고, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이의 유사체 중 어느 하나인 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지되거나 미지의 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예: 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론(intron), 메신저 RNA(mRNA), 전이 RNA, 리보솜 RNA, RNAi, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 등의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오티드의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 표지 성분과의 접합에 의해 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 이 용어는 또한, 이본쇄 분자 및 일본쇄 단일 분자를 모두 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 이 기술의 임의의 측면은 이본쇄 형태와, 이본쇄 형태를 구성하는 것으로 공지되어 있거나 예측되는 2개의 상보적 일본쇄 형태 각각을 모두 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 서열" 및 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 중 어느 하나의 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 따라서, 이 용어에는 일본쇄, 이본쇄 또는 다본쇄의 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 기타 천연, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 참조 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 대한 등가물은 참조에 의해 코딩되는 동일한 서열을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 참조 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 대한 등가물은, 임의로 높은 엄격성의 조건하에 참조, 상보 참조, 역(reverse) 참조 및/또는 역-보체 참조에 하이브리드화된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 동등한 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는, 참조 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 대해 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 85% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 92% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 97% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 것이거나, 또는 대안적으로 동등한 핵산은 높은 엄격함 조건에서 참조 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보체에 하이브리드화한다. 일 측면에서, 등가물은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 검정을 통해 임의로 동정될 수 있는 기능성 단백질을 코딩해야 한다. 또 다른 측면에서, 등가물은 참조 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 대해 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 85% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 92% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 97% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성을 갖거나, 또는 대안적으로 동등한 핵산은 높은 엄격성 조건하에 참조 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보체에 하이브리드화한다.
본 명세서에 사용된 용어 "프로모터"는 유전자 등의 코딩 서열의 발현을 조절하는 임의의 서열을 지칭한다. 프로모터는, 예를 들면, 구성적, 유도성, 억제성 또는 조직 특이적일 수 있다. "프로모터"는 전사의 개시 및 속도가 조절되는 폴리뉴클레오티드 서열의 영역인 조절 서열이다. RNA 폴리머라제 및 기타 전사 인자 등의 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전 요소가 포함될 수 있다. 프로모터의 비제한적 예에는 EF1알파 프로모터 및 CMV 프로모터가 포함된다. EF1알파 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, addgene.org/11154/sequences/; ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J04617, 각각 2019년 3월 13일에 최종 액세스, and Zheng and Baum(2014) Int'l.J.Med.Sci. 11(5):404-408]. CMV 프로모터 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=basic_cloning_vectors&plasmid=CMV_ promoter, 2019년 3월 13일에 최종 액세스 and Zheng and Baum(2014), 상기 참조]. 예는 다음과 같다:
EF1 알파 프로모터 서열:
AAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC(서열번호 148), 및 임의로 이의 등가물.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "T2A" 및 "2A 펩티드"는 임의의 2A 펩티드 또는 이의 단편, 임의의 2A-유사 펩티드 또는 이의 단편, 또는 컨센서스 폴리펩티드 모티프 DV/IEXNPGP(서열번호 174)(여기서, X는 일반적으로 자가-절단되는 것으로 생각되는 임의의 아미노산을 지칭한다)을 함유하는 비교적 짧은 펩티드 서열 중에 필요한 아미노산(기원의 바이러스에 따라 20개 아미노산 길이 정도)을 포함하는 인공 펩티드를 지칭한다.
IL3R알파(IL3Rα) 또는 CD123은 몇몇 혈액 악성종양에서 과발현되는 표면 수용체이다. IL3R의 초기 표적화는 천연 리간드인 IL-3을 사용하여 수행되었다. CD123 CAR 세포는 마우스 및 인간에서 AML 세포에 대해 강력한 세포독성을 나타냈다[참조: Townsend et al. (2018) J. Exper. & Clin. Cancer Res. 37:163 및 거기에 인용된 참고 문헌]. 따라서, CAR-가능 CD123 결합 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 당해 기술분야에 공지되어 있다.
IL13R알파2(IL13Rα2)는 교모세포종 세포에서 발현되는 세포 마커를 의도한다. 이는 IL-13 수용체이고, IL13Rα1 수용체와 직접 경쟁하여 하류의 STAT 신호전달을 유도함으로써 미끼로서 기능한다[참조: Townsend et al. (2018), supra.]. scFv 기반 CARS가 시험되었고, 성공적인 것으로 밝혀졌다[참조: Townsend et al. (2018), supra.].
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 호환적으로 사용되고, 이들의 가장 광범위한 의미에서, 2개 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드모방체의 화합물을 지칭한다. 서브유닛은 펩티드 결합으로 연결될 수 있다. 또 다른 측면에서, 서브유닛은 기타 결합, 예를 들면, 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 단백질 또는 펩티드 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체, 아미노산 유사체 및 펩티드모방체 둘 다를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다.
용어 등가물 및 생물학적 등가물은, 예를 들면, 참조로서 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭할 때 호환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 동등한 단백질 또는 폴리펩티드는 참조 단백질 또는 폴리펩티드에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 것이다. 일부 실시양태에서, 동등한 단백질 또는 폴리펩티드는 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 또는 단백질에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 동등한 단백질 또는 폴리펩티드는 본 명세서에 언급된 동등한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 단백질에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는다. 추가로 또는 대안적으로, 폴리뉴클레오티드의 등가물은 참조 또는 모체 폴리뉴클레오티드와 동일 또는 유사한 기능의 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩할 것이다. 일부 실시양태에서, 등가물은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 검정을 통해 임의로 동정될 수 있는 기능성 단백질이다. 또 다른 측면에서, 등가물은 참조 단백질 또는 폴리펩티드에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 참조 서열 중의 동정된 위치에 "대응하는" 목적 서열 중의 아미노산(aa) 또는 뉴클레오티드(nt) 잔기 위치는, 잔기 위치가 목적 서열과 참조 서열 사이의 서열 정렬에서 동정된 위치에 정렬되는 것을 지칭한다. 클러스탈 오메가(Clustal Omega) 및 BLAST 등의 다양한 프로그램을 사용하여 이러한 서열 정렬을 수행할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "정제된"은 절대적인 순도를 요구하지 않고; 오히려 상대적인 용어로 의도된다. 따라서, 예를 들면, 정제된 핵산, 펩티드, 단백질, 생물학적 복합체 또는 기타 활성 화합물은 단백질 또는 기타 오염물질로부터 전체 또는 부분적으로 단리된 것이다. 일반적으로, 본 개시내에서 사용하기 위한 실질적으로 정제된 펩티드, 단백질, 생물학적 복합체 또는 기타 활성 화합물은, 약제학적 담체, 부형제, 완충액, 흡수 증진제, 안정제, 방부제, 보조제 또는 치료 투여를 위한 완전한 약제학적 제형 중의 기타 공-성분과 함께 펩티드, 단백질, 생물학적 복합체 또는 기타 활성 화합물의 혼합 또는 제제화 전에 조제물 중에 존재하는 모든 거대분자 종의 80% 이상을 포함한다. 보다 전형적으로, 펩티드, 단백질, 생물학적 복합체 또는 기타 활성 화합물은, 기타 약제 성분과의 혼합 전에, 정제된 조제물 중에 존재하는 모든 거대분자 종의 90% 초과, 종종 95% 초과를 나타내도록 정제된다. 다른 경우에, 정제된 조제물은 본질적으로 균질할 수 있고, 여기서 기타 거대분자 종은 종래의 기술로 검출할 수 없다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "정제 마커"는 정제 또는 동정에 유용한 적어도 하나의 마커를 지칭한다. 이 마커의 비제한적 목록에는 His, lacZ, GST, 말토스-결합 단백질, NusA, BCCP, c-myc, CaM, FLAG, GFP, YFP, 체리, 티오레독신, 폴리(NANP), V5, Snap, HA, 키틴 결합 단백질, Softag 1, Softag 3, Strep 또는 S-단백질이 포함된다. 적합한 직접 또는 간접 형광 마커에는 FLAG, GFP, YFP, RFP, dTomato, 체리, Cy3, Cy 5, Cy 5.5, Cy 7, DNP, AMCA, 비오틴, 디곡시게닌, Tamra, 텍사스 레드, 로다민, 알렉사 플루오르, FITC, TRITC 또는 임의의 기타 형광 염료 또는 합텐이 포함된다. 일부 실시양태에서, 정제 마커는 임의로 YPYDVPDYA(서열번호 84)를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진 HA 태그이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 단백질"은 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 폴리펩티드를 지칭하고, 일반적으로 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 숙주 세포를 형질전환하여 이종 단백질을 생산하기 위해 또한 사용되는 적합한 발현 벡터에 삽입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 적어도 10-6M의 결합 친화성을 갖는 항체와 항원 간의 접촉을 의미한다. 특정 측면에서, 항체는 적어도 약 10-7M, 및 바람직하게는 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M 또는 10-12M의 친화성으로 결합한다.
"고형 종양"은 일반적으로 낭종 또는 액체 영역을 포함하지 않는 비정상적 조직 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성, 전이성 또는 비전이성일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 이들을 형성하는 세포 유형에 따라 명명된다. 고형 종양의 예에는 육종, 암종 및 림프종이 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "자살 유전자"는 세포 아폽토시스를 유도할 수 있는 유전자이고; 비제한적 예에는 HSV-TK(단순 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus) 티미딘 키나제), 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 카복실에스테라제, 시토크롬 P450 또는 PNP(퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제), 절단된 EGFR 또는 유도성 카스파제("iCasp")가 포함된다. 자살 유전자는 다양한 경로를 따라 기능할 수 있고, 일부 경우에는 소분자 등의 유도제에 의해 유도될 수 있다. 예를 들면, iCasp 자살 유전자는 유도제에 결합하도록 최적화된 단백질에 작동적으로 연결된 카스파제 단백질의 일부를 포함하고; 자살 유전자를 포함하는 세포 내로 유도제의 도입은 카스파제의 활성화 및 상기 세포의 후속적 아폽토시스를 초래한다.
키메라 항원 수용체 세포의 생산에 적용되는 용어 "형질도입하다" 또는 "형질도입"은 외래 뉴클레오티드 서열이 세포 내로 도입되는 프로세스를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이러한 형질도입은 벡터를 통해 수행된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 대상체에서의 질환의 "치료하는" 또는 "치료"는 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. "치료"의 예에는 하기가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다: 장애의 소인이 있지만 아직 장애를 갖는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 장애가 발생하는 것을 방지하는 것; 장애의 억제, 즉 장애의 발증을 저지하는 것; 및/또는 장애의 증상을 완화 또는 개선하는 것. 일 측면에서, 치료는 암 등의 질환 또는 장애의 증상의 발증을 저지하는 것이다. 일부 실시양태에서, 이는 (1) 질환의 소인이 있거나, 또는 아직 질환의 증상을 나타내지 않는 대상체에서 증상 또는 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (2) 질환을 억제하거나 질환의 발증을 저지하는 것; 또는 (3) 질환 또는 질환의 증상을 개선 또는 퇴행시키는 것을 지칭한다. 당해 기술분야에서 이해되는 바와 같이, "치료"는 임상 결과를 포함하여 유익 또는 원하는 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 기술의 목적을 위해, 유익한 또는 원하는 결과에는 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선, 병태(질환 포함)의 정도의 감소, 병태(질환 포함)의 안정화된(즉, 악화하지 않는) 상태, 병태(질환 포함)의 지연 또는 감속, 병태(질환 포함)의 진행, 개선 또는 완화, 상태 및 관해(부분적 또는 전체적)(검출가능하거나 검출 불가능하든지)가 포함된다. 개시된 조성물 및 방법을 함유하는 치료는 1차, 2차, 3차, 4차, 5차 요법일 수 있고, 단독 요법으로서, 또는 기타 적절한 요법과 조합하여 사용되는 것을 의도한다. 질환이 암인 경우, 하기 임상 종점은 치료의 비제한적 예이다: 종양 양의 감소, 종양 성장의 지연, 전체 생존 기간의 연장, 종양 진행까지의 시간 연장, 전이의 억제 또는 종양 전이의 감소. 일 측면에서, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 방지 또는 예방을 배제한다.
일 실시양태에서, 본 명세서에 사용된 용어 "질환" 또는 "장애"는 암 또는 종양(이들은 호환 가능하게 사용됨), 이러한 질환으로 진단된 상태, 이러한 질환을 갖는 것으로 의심되는 상태, 또는 이러한 질환에 걸릴 위험이 높은 상태를 지칭한다.
세포 또는 벡터 또는 기타 약제 및 이를 함유하는 조성물의 "투여" 또는 "전달"은 치료 과정 전반에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 1회 용량으로 수행될 수 있다. 가장 효과적인 투여 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 치료에 사용되는 조성물, 치료의 목적, 치료되는 표적 세포 및 치료되는 대상체에 따라 상이할 것이다. 단일 또는 다중 투여는 치료하는 의사에 의해 또는 동물의 경우는 치료를 수행하는 수의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 약제를 투여하는 적절한 투여 제형 및 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 투여 경로가 또한 결정될 수 있고, 가장 효과적인 투여 경로를 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 치료에 사용되는 조성물, 치료 목적, 치료 대상체의 건강 상태 또는 질환 단계, 및 표적 세포 또는 조직에 따라 상이할 것이다. 투여 경로의 비제한적 예에는 경구 투여, 복강내, 주입, 비강 투여, 흡입, 주사 및 국소 적용이 포함된다.
"약제학적 조성물"은 활성 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체와, 고체 지지체 등의 불활성 또는 활성의 담체와의 조합을 포함하여, 조성물을 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 진단 또는 치료학적 용도에 적합하게 하는 것을 의도한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 인산염 완충 생리식염수 용액, 물, 및 오일/물 또는 물/오일 에멀젼 등의 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제 등의 임의의 표준 약제학적 담체를 포함한다. 조성물은 또한 안정제 및 방부제를 포함할 수 있다. 담체, 안정제 및 보조제의 예에 대해서는 문헌[참조: Martin(1975) Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton)]을 참조한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 플라스미드, 바이러스, 코스미드, 파지, BAC, YAC 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는, 상이한 숙주 사이의 전달을 위해 설계된 핵산 작제물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드 벡터는 상업적으로 입수 가능한 벡터로부터 제조될 수 있다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 바쿨로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV 등으로부터 생산될 수 있다. 일 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
"바이러스 벡터"는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 숙주 세포 내로 전달되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합적으로 생산된 바이러스 또는 바이러스 입자로서 정의된다. 바이러스 벡터의 예에는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 등이 포함된다. 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 기반 벡터 및 신드비스(Sindbis) 바이러스 기반 벡터 등의 알파바이러스 벡터도 유전자 요법 및 면역 요법에 사용하기 위해 개발되었다[참조: Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 and Ying, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827].
유전자 전달이 렌티바이러스 벡터에 의해 매개되는 측면에서, 벡터 작제물은 렌티바이러스 게놈 또는 이의 일부 및 치료 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "렌티바이러스 매개 유전자 전달" 또는 "렌티바이러스 형질도입"은 동일한 의미를 갖고, 바이러스가 세포에 진입하고 이의 게놈을 숙주 세포 게놈으로 통합함으로써 유전자 또는 핵산 서열이 숙주 세포 내로 안정적으로 전달되는 프로세스를 지칭한다. 바이러스는 통상의 감염 메카니즘을 통해 숙주 세포에 진입하거나, 상이한 숙주 세포 표면 수용체 또는 리간드에 결합하여 세포에 진입하도록 변형될 수 있다. 레트로바이러스는 유전 정보를 RNA의 형태로 전달하고; 그러나, 바이러스가 세포를 감염시키면, RNA는 역전사되어 DNA 형태로 되고, 감염된 세포의 게놈 DNA에 통합된다. 통합된 DNA 형태는 프로바이러스라고 한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 렌티바이러스 벡터는 바이러스 또는 바이러스-유사 진입 메카니즘을 통해 세포에 외인성 핵산을 도입할 수 있는 바이러스 입자를 지칭한다. "렌티바이러스 벡터"는 기타 레트로바이러스 벡터와 비교하여 비분열 세포를 형질도입하는데 특정 이점을 갖는, 당해 기술분야에 공지되어 있는 유형의 레트로바이러스 벡터이다[참조: Trono D. (2002) Lentiviral vectors, New York: Spring-Verlag Berlin Heidelberg].
본 개시의 렌티바이러스 벡터는 온코레트로바이러스(MLV를 함유하는 레트로바이러스의 서브그룹) 및 렌티바이러스(HIV를 함유하는 레트로바이러스의 서브그룹)에 기초하거나, 또는 이들로부터 유래한다. 예로서는 ASLV, SNV 및 RSV가 포함되고, 이들은 모두 렌티바이러스 벡터 입자 생산 시스템을 위한 패키징 및 벡터 구성요소로 분할되었다. 본 개시에 따른 렌티바이러스 벡터 입자는 유전적으로 또는 다른 방법으로 (예를 들면, 패키징 세포 시스템의 특정 선택에 의해) 변경된 버전의 특정 레트로바이러스에 기초할 수 있다.
본 개시에 따른 벡터 입자가 특정 레트로바이러스 "기반"이라는 것은 벡터가 그 특정 레트로바이러스로부터 유래한다는 것을 의미한다. 벡터 입자의 게놈은 해당 레트로바이러스의 성분을 백본으로서 포함한다. 벡터 입자에는 역전사 및 통합 시스템을 포함하여 RNA 게놈과 호환되는 필수 벡터 성분이 포함된다. 일반적으로, 이들에는 특정 레트로바이러스에서 유래하는 gag 및 pol 단백질이 포함된다. 따라서, 벡터 입자의 대부분의 구조적 성분은 일반적으로 레트로바이러스로부터 유래할 것이지만, 원하는 유용한 특성을 제공하도록 유전적으로 또는 기타 방법으로 변경될 수 있다. 그러나, 특정 구조 성분, 특히 env 단백질은 상이한 바이러스에서 유래할 수 있다. 감염 또는 형질도입된 벡터 숙주 범위 및 세포 유형은 벡터 입자 생산 시스템에서 상이한 env 유전자를 사용하여 벡터 입자에 상이한 특이성을 부여함으로써 변경될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "아데노 관련 바이러스" 또는 "AAV"는 이 명칭과 관련되고 디펜도파보바이러스속, 파르보비리다에(Parvoviridae)과에 속하는 바이러스 부류의 구성원을 지칭한다. 이 바이러스의 복수의 혈청형은 유전자 전달에 적합한 것으로 공지되어 있고; 공지된 모든 혈청형은 다양한 조직 유형의 세포를 감염시킬 수 있다. 적어도 11개의 연속 넘버링된 AAV 혈청형이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 본 명세서에 개시된 방법에 유용한 비제한적 예시적 혈청형에는 11개 혈청형 중 임의의 것, 예를 들면, AAV2, AAV8, AAV9, 또는 변이체 또는 합성 혈청형, 예를 들면, AAV-DJ 및 AAV PHP.B가 포함된다. AAV 입자는 VP1, VP2 및 VP3의 3개 주요 바이러스 단백질을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일 실시양태에서, AAV는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV PHP.B, 또는 AAV rh74를 지칭한다. 이러한 벡터는 상업적으로 이용 가능하거나, 특허 또는 기술 문헌에 기재되어 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 성분, 범위, 투여 형태 등의 선택을 설명하기 위해 사용되는 경우의 용어 "허용되는", "효과적인" 또는 "충분한"은 상기 성분, 범위, 투여 형태 등이 개시된 공개된 목적에 적합하다는 것을 의도한다.
본 명세서에 사용된 용어 "조절 서열" "발현 조절 요소" 또는 "프로모터"는, 전사 및/또는 복제되는 표적 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되고 표적 폴리뉴클레오티드의 발현 및/또는 촉진하는 폴리뉴클레오티드를 의도한다. 프로모터는 발현 조절 요소 또는 조절 서열의 예이다. 프로모터는 유전자 또는 기타 폴리뉴클레오티드의 5' 또는 상류에 위치할 수 있고, 이는 조절된 유전자 전사를 위한 조절점을 제공한다. 폴리머라제 II 및 III는 프로모터의 예이다. MNDU3 프로모터의 서열 및 예시적 CMV 프로모터의 서열을 하기에 제공한다.
본 명세서에 사용된 신호 펩티드는 (때때로 신호 서열, 표적화 신호, 국재화 신호, 국재화 서열, 전이 펩티드, 리더 서열 또는 리더 펩티드로 지칭됨) 분비 경로로 향하는 새로 합성된 단백질의 대부분의 N-말단에 존재하는 짧은 펩티드(통상 16 내지 30개 아미노산 길이)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 IL 2 신호 펩티드 등의 분비 신호이다(예를 들면, 서열번호 4 참조). 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들면, 막관통 단백질을 세포 표면 등의 세포막에 위치하도록 지시한다. 이러한 예는 IgG1 신호 펩티드이다(예를 들면, 서열번호 5 참조).
분비 신호는 세포질로부터 분비 경로로 단백질의 수출을 가능하게 하는 분비 신호 펩티드를 의도한다. 단백질은 상이한 수준의 분비 성공을 나타낼 수 있고, 특정 단백질과 조합되면, 특정 신호 펩티드가 더 낮거나 더 높은 수준을 유발할 수 있다. 진핵생물에서, 신호 펩티드는 진핵생물 세포의 세포질에서 신호 인식 입자(SRP)에 의해 인식되는 아미노산의 소수성 스트링이다. mRNA-리보솜 복합체로부터 신호 펩티드가 생성된 후, SRP는 펩티드에 결합하여 단백질의 번역을 중지한다. 이어서, SRP는 mRNA/리보솜 복합체를 조면 소포체로 셔틀하고, 여기서 단백질이 소포체의 내강으로 번역된다. 이어서, 신호 펩티드는 단백질로부터 절단되어, 소포체에서 가용성 또는 막 태그(막관통 영역도 존재하는 경우)의 단백질을 생성한다. 이들은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 옥스포드 제네틱스(Oxford Genetics)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 절단 가능한 링커로도 지칭되는 절단 가능한 펩티드는, 예를 들면, 효소에 의해 절단될 수 있는 펩티드를 의미한다. 이러한 절단 가능한 펩티드를 포함하는 하나의 번역된 폴리펩티드는 2개의 최종 생성물을 생성할 수 있고, 따라서 하나의 개방 판독 프레임으로부터 하나 이상의 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 절단 가능한 펩티드의 일례는 2A 자가-절단 펩티드 등의 자가-절단 펩티드이다. 2A 자가-절단 펩티드는 18 내지 22개 aa 길이의 펩티드 클래스이고, 세포에서 재조합 단백질의 절단을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2A 자가-절단 펩티드는 P2A, T2A, E2A, F2A 및 BmCPV2A로부터 선택된다[참조: 예를 들면, Wang Y, et al. 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori. Sci Rep. 2015;5:16273. Published 2015 Nov 5].
본 명세서에 사용된 바와 같이, "다능성 세포"는 적어도 2개의 별개의 (유전자형 및/또는 표현형) 추가 분화된 자손 세포를 생성할 수 있는 덜 분화된 세포를 정의한다. 또 다른 측면에서, "다능성 세포"는 비다능성 세포, 전형적으로는 성인의 체세포로부터 인공적으로 유도되는 줄기 세포이고 역사적으로 하나 이상의 줄기세포 특이적 유전자의 발현을 유도함으로써 생산되는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)를 포함한다. 이러한 줄기 세포 특이적 유전자에는 옥타머 전사 인자의 패밀리, 즉 Oct-3/4; Sox 유전자의 패밀리, 즉 Sox1, Sox2, Sox3, Sox 15 및 Sox 18; Klf 유전자의 패밀리, 즉 Klf1, Klf2, Klf4 및 Klf5; Myc 유전자의 패밀리, 즉 c-myc 및 L-myc; Nanog 유전자의 패밀리, 즉, OCT4, NANOG 및 REX1; 또는 LIN28이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. iPSC의 예는 문헌[참조: Takahashi et al. (2007) Cell advance online publication 20 November 2007; Takahashi & Yamanaka (2006) Cell 126:663?76; Okita et al. (2007) Nature 448:260-262; Yu et al. (2007) Science advance online publication 20 November 2007; and Nakagawa et al. (2007) Nat. Biotechnol. Advance online publication 30 November 2007]에 기재되어 있다.
"유도된 다능성 세포"는 성체 세포로부터 미성숙 표현형으로 재프로그래밍된 배아-유사 세포를 의도한다. 다양한 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, "A simple new way to induce pluripotency: Acid." Nature, 29 January 2014 and available at sciencedaily.com/releases/2014/01/140129184445, last accessed on February 5, 2014 and U.S. Patent Application Publication No. 2010/0041054]. 인간 iPSC는 또한 줄기 세포 마커를 발현하고, 3개의 배엽 모두의 특징적 세포를 생성할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 조혈 줄기 세포(HSC)는 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 모든 유형의 혈액 세포를 발생시키는 줄기 세포 등의 세포이다. 조혈 줄기 세포는 말초 혈액 및 골수에서 발견할 수 있다.
용어 생물학적으로 적합한 담체 또는 배지와 호환적으로 사용될 수 있는 용어 약제학적으로 허용되는 담체(또는 배지)는, 치료적으로 투여되는 세포 및 기타 약제에 적합할 뿐만 아니라, 합리적 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 합리적인 이익/위험 비율을 충족시키는 기타 합병증을 수반하지 않고서 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 시약, 세포, 화합물, 물질, 조성물 및/또는 용량 형태를 지칭한다. 본 개시에 사용하기에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체에는 액체, 반고체(예를 들면, 겔) 및 고체 물질(예를 들면, 세포 스캐폴드 및 매트릭스, 튜브 시트 및 당해 기술분야에 공지되고 본 명세서에 보다 상세히 기재된 기타 이러한 물질)이 포함된다. 이러한 반고체 및 고체 물질은 체내에서의 분해에 저항하도록 설계(비-생분해성)되거나, 또는 체내 분해되도록 설계(생분해성, 생체분해성)될 수 있다. 생분해성 물질은 추가로 생흡수성 또는 생체 흡수성일 수 있고, 즉 이는 체액에 용해되어 흡수되거나(수용성 임플란트가 일례임), 다른 물질로의 전환 또는 자연 경로를 통한 분해 또는 제거에 의해 분해되어 최종적으로 신체로부터 제거될 수 있다.
세포 집단은 표현형 및/또는 유전자형이 동일(클론성) 또는 동일하지 않은 하나 이상의 세포의 집단을 의도한다. 집단은 본 명세서에 기재된 바와 같이 정제되거나, 고도로 정제되거나, 실질적으로 균질하거나 불균일할 수 있다.
"실질적으로 균질한"은, 약 50% 초과, 또는 대안적으로 약 60% 초과, 또는 대안적으로 70% 초과, 또는 대안적으로 75% 초과, 또는 대안적으로 80% 초과, 또는 대안적으로 85% 초과, 또는 대안적으로 90% 초과, 또는 대안적으로 95% 초과의 세포가 동일 또는 유사한 표현형을 갖는 세포의 집단을 기재한다. 표현형은 사전에 선택된 세포 표면 마커 또는 기타 마커에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "NKG2D"는 C형 렉틴-유사 수용체의 CD94/NKG2 패밀리에 속하고, NK-유전자 복합체 및/또는 이의 생물학적 등가물에 위치하는 유전자 KLRK1 유전자에 의해 코딩되는 막관통 단백질을 지칭한다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC12M011728, HGNC: 18788, Entrez Gene: 22914, Ensembl: ENSG00000213809, OMIM: 611817 및 UniProt1KB: P2677에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "BCMA" 및 "B-세포 성숙 항원"은 B-세포 활성화 인자(BAFF)를 인식하고, TNFRSF17 유전자에 의해 코딩되는 TNF 슈퍼패밀리에 속하는 단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC16P012058, HGNC: 11913, Entrez Gene: 608, Ensembl: ENSG00000048462, OMIM: 109545 및 UniProtKB: Q02223에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "SLAMF7", "CS1" 및 "CD319"는, 다발성 골수종에서 정상 형질 세포 및 악성 형질 세포에 대한 강력한 마커이고, SLAMF7 유전자에 의해 코딩되는 것으로 공지되어 있는 단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC01P160709, HGNC: 21394, Entrez Gene: 57823, Ensembl: ENSG00000026751, OMIM: 606625 및 UniProtKB: Q9NQ25에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD19" 및 "B-림프구 항원 CD19"는 인간에서 유전자 CD19에 의해 코딩되는 막관통 단백질로 공지된 단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 인간에서, CD19는 형질 세포를 제외한 모든 B 계열 세포 및 여포 수지상 세포에서 발현된다. 모든 B 세포에 존재하기 때문에, B 림프구 발달의 바이오마커이고, 림프종 진단은 백혈병 면역 요법의 표적으로서 이용될 수 있다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC16PO28943, HGNC: 1633, Entrez Gene: 930, Ensembl: ENSG00000177455, OMIM: 107265 및 UniProtKB: P15391에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "HER2", "HER2/neu", "CD340" 및 "ERBB2"는 인간 상피 성장 인자 수용체(HER/EGFR/ERBB) 패밀리의 구성원인 것으로 공지된 단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 종양 유전자의 증폭 또는 과발현은 특정 공격적 유형의 유방암의 발증 및 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 이 단백질은 다수의 유방암 환자의 중요한 바이오마커 및 치료 표적이 되었다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC17P039687, HGNC: 3430, Entrez Gene: 2064, Ensembl: ENSG000000141736, OMIM: 164870 및 UniProtKB: P04626에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "메조텔린" 및 "MSLN"은 인간에서 MSLN 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 메조텔린은 중피 세포에서 발현되는 40kDa 단백질이다. 메조텔린은 중피종, 난소암, 췌장 선암, 폐 선암 및 담관암을 포함하여 복수 유형의 종양에서 과발현된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC16P001100, HGNC: 7371, Entrez Gene: 10232, Ensembl: ENSG000000102854, OMIM: 601051 및 UniProtKB: Q13421에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "PSCA" 및 "전립선 줄기 세포 항원"은 인간에서 PSCA 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. PSCA는 전립선에서 고도로 발현되는 글리코실포스파티딜이노시톨 고정형 세포막 당단백질이다. PSCA는 방광, 태반, 결장, 신장, 위에서도 발현된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC08P142670, HGNC: 9500, Entrez Gene: 8000, Ensembl: ENSG000000167653, OMIM: 602470 및 UniProtKB: O43653에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CEA" 및 "암배아성 항원"은 세포 부착에 관여하는 고도로 관련된 당단백질의 세트를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. CEA는 통상 건강한 성인의 혈액에 매우 낮은 수준으로 존재한다. 그러나, 일부 유형의 암에서는 혈청 수준이 상승하여 임상 시험에서 종양 마커로서 사용할 수 있음을 나타낸다. 면역학적으로, CEA 당단백질은 CD66 분화 클러스터의 구성원으로 특징지어진다. 단백질에는 CD66a, CD66b, CD66c, CD66d 및 CD66e가 포함된다.
암배아성 항원 관련 세포 부착 분자 1로도 공지된 CD66a 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC19M042507, HGNC: 1814, Entrez Gene: 634, Ensembl: ENSG000000079385, OMIM: 109770 및 UniProtKB: P13688에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
암배아성 항원 관련 세포 부착 분자 8로도 공지된 CD66b 또는 기분 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC19M042580, HGNC: 1820, Entrez Gene: 1088, Ensembl: ENSG00000124469, OMIM: 615747 및 UniProtKB: P31997에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
암배아성 항원 관련 세포 부착 분자 6 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: Gene Cards ID: GC19P04150, HGNC: 1818, Entrez Gene: 4680, Ensembl: ENSG00000086548, OMIM: 163980 및 UniProtKB: P40199에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
암배아성 항원 관련 세포 부착 분자 3으로도 공지된 CD66d 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC19P041796, HGNC: 1815, Entrez Gene: 1084, Ensembl: ENSG00000170956, OMIM: 609142 및 UniProtKB: P40198에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
암배아성 항원 관련 세포 부착 분자 5로도 공지된 CD66e의 비제한적 예시 서열 또는 기본 유전자는 유전자 카드 ID: GC19P041709, HGNC: 1817, Entrez Gene: 1048, Ensembl: ENSG00000105388, OMIM: 114890 및 UniProtKB: P06731에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "GTPase-활성화 단백질", "GAP" 및 "RAS P21 단백질 활성화제 1"은 GTPase-활성화 단백질의 GAP1 패밀리의 구성원인 세포질 단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 단백질은 정상 RAS p21의 GTPase 활성을 자극하지만, 발암성 대응물은 자극하지 않는다. RAS 기능의 억제인자로서 기능하는 이 단백질은 RAS 단백질의 약한 고유 GTPase 활성을 강화하고, 불활성 GDP-결합된 형태의 RAS를 생성하고, 이에 의해 세포 증식 및 분화를 조절할 수 있다. 어느 하나의 단백질의 결합 부위를 변화시키는 돌연변이는 기저 세포 암종과 관련되어 있다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC05P087267, HGNC: 9871, Entrez Gene: 5921, Ensembl: ENSG000000145715, OMIM: 139150 및 UniProtKB: P20936에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "gd2", "강글리오사이드 G2" 및 "강글리오사이드 GD2"는 인간에서 다양한 유형의 악성 세포의 원형질막에서 발현되는 화학물질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. GD2의 IUPAC 명칭은 (2R,4R,5S,6S)-2-[3-[(2S,3S,4R,6S)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-5-[(2S,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-2-일]옥시-2-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)-6-[(E)-3-하이드록시-2-(옥타데카노일아미노)옥타데크-4-에녹시]옥산-3-일]옥시-3-하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-4-일]옥시-3-아미노-6-카복시-4-하이드록시옥산-2-일]-2,3-디하이드록시프로폭시]-5-아미노-4-하이드록시-6-(1,2,3-트리하이드록시프로필)옥산-2-카복실산이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD5" 및 "T-세포 표면 당단백질 CD5"는 인간에서 T 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. T 세포 신생물은 CD5를 발현하는 것으로 보고되어 있고, 만성 림프구성 백혈병 및 맨틀 세포 림프종에서도 발견된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC11P061118, HGNC: 1685, Entrez Gene: 921, Ensembl: ENSG00000110448, OMIM: 153340 및 UniProtKB: P06127에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "전립선 특이적 막 항원", "PSMA", "엽산 가수분해효소 1" 및 "FOLH1"은 M28 펩티다제 패밀리에 속하는 유형 II 막관통 당단백질인 단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 전립선에서, 단백질은 암 세포에서 상향조절되고, 전립선암의 효과적 진단 및 예후 지표로서 사용된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC11M056090, HGNC: 3788, Entrez Gene: 2346, Ensembl: ENSG00000086205, OMIM: 600934 및 UniProtKB: Q04609에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1" 및 "ROR1"은 중추신경계에서 신경돌기 성장을 조절하는 단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 발현의 증가는 B 세포 만성 림프구성 백혈병과 관련되어 있다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC01P063774, HGNC: 10256, Entrez Gene: 4919, Ensembl: ENSG00000185483, OMIM: 602336 및 UniProtKB: Q01973에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD123", "인터류킨 3 수용체 서브유닛 알파" 및 "IL-3RA"는 이종이량체 사이토카인 수용체의 인터류킨 3 특이적 서브유닛을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC0XP001336, HGNC: 6012, Entrez Gene: 3563, Ensembl: ENSG00000185291, OMIM: 430000 및 UniProtKB: P26951에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD70" 및 "종양 괴사 인자 리간드 슈퍼패밀리 구성원 7"은 종양 괴사 인자 리간드 패밀리에 속하는 사이토카인을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC19M006583, HGNC: 11937, Entrez Gene: 970, Ensembl: ENSG00000125726, OMIM: 602840 및 UniProtKB: P32970에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD38" 및 "ADP-리보실 사이클라제 1"은, 세포내 칼슘 이온 동원 메신저인 사이클릭 아데노사이드 5'-디포스페이트-리보스를 합성 및 가수분해하는 비-계통적 제한된 유형-II 막관통 당단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC04P015779, HGNC: 1667, Entrez Gene: 952, Ensembl: ENSG0000004468, OMIM: 107270 및 UniProtKB: P28907에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "뮤신 1" 및 "뮤신 1"은 뮤신 패밀리의 구성원인 막-결합 단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이러한 단백질의 과발현, 비정상적 세포내 국재화, 글리코실화 변화는 암종과 관련되어 있다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC01M155158, HGNC: 7508, Entrez Gene: 4582, Ensembl: ENSG00000185499, OMIM: 158340 및 UniProtKB: P15941에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "EPHA2" 및 "에프린 A형 수용체 2"는 에프린-A 리간드에 결합하는 단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC01M016196, HGNC: 3386, Entrez Gene: 1969, Ensembl: ENSG00000142627, OMIM: 176946 및 UniProtKB: P29317에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "EGFRvIII" 및 "표피 성장 인자 변이체 III"는 EGFR 돌연변이의 가장 일반적이고 최대 30%의 고등급 신경교종, 특히 다형성 교모세포종에서 발생하는 표피 성장 인자 변이체(vIII)를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. EGFRvIII은 공지된 리간드에 결합할 수 없는 구성적으로 활성화된 돌연변이 수용체의 형성을 유도하는 엑손 2-7의 결실로부터 발생한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "IL13RA2" 및 "인터류킨 13 수용체 서브유닛 알파 2"는 인터류킨 13 수용체 복합체의 서브유닛을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC0XM115003, HGNC: 5975, Entrez Gene: 3598, Ensembl: ENSG00000123496, OMIM: 300130 및 UniProtKB: Q14627에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD133" 및 "프로미닌 1"은 펜타스팬 막관통 당단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 단백질은 막 돌출부에 국재화되어 성체 줄기 세포 상에 발현되는 경우가 많고, 분화를 억제함으로써 줄기 세포의 특성을 유지하는 기능이 있는 것으로 생각된다. 이 단백질은 몇몇 유형의 암과 관련되어 있다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC04M015965, HGNC: 9454, Entrez Gene: 8842, Ensembl: ENSG00000007062, OMIM: 604365 및 UniProtKB: O43490에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "GPC3" 및 "글리피칸 3"은 가변 수의 헤파린 설페이트 쇄로 치환된 막-연관 단백질 코어로 구성된 세포 표면 헤파린 설페이트 프로테오글리칸을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC0XM133535, HGNC: 4451, Entrez Gene: 2719, Ensembl: ENSG00000147257, OMIM: 300037 및 UniProtKB: P51654에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "EPCAM" 및 "상피 세포 부착 분자"는 적어도 2개의 유형 I 막 단백질을 포함하는 패밀리의 구성원인 암종 관련 항원을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 항원은 대부분의 정상 상피 세포 및 위장관 암종에서 발현되고, 동형 칼슘 비의존적 부착 분자로 기능한다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC02P047345, HGNC: 11529, Entrez Gene: 4072, Ensembl: ENSG00000119888, OMIM: 185535 및 UniProtKB: P16422에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "FAP" 및 "섬유아세포 활성화 단백질 알파"는 세린 프로테아제 패밀리에 속하는 호모이량체 통합 막 젤라티나제를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이는 상피 암의 반응성 기질 섬유아세포, 치유 중의 창상의 육아 조직, 골 및 연조직 육종의 악성 세포에서 선택적으로 발현된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC02M162170, HGNC: 3590, Entrez Gene: 2191, Ensembl: ENSG00000078098, OMIM: 600403 및 UniProtKB: Q12884에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "VEGFR2", "혈관 내피 성장 인자 수용체 2" 및 "키나제 삽입 도메인 수용체"는 VEGF-유도된 내피 증식, 생존, 유주, 관상 형태형성 및 발아의 주요 매개인자로서 기능하는 단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC04M055078, HGNC: 6307, Entrez Gene: 3791, Ensembl: ENSG00000128052, OMIM: 191306 및 UniProtKB: P35968에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "암/정소 항원" 및 "CT 항원"은 정상 발현이 정소의 수컷 생식 세포로 한정되지만 성체 체세포 조직에서는 한정되지 않는 종양 항원의 범주를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 악성 종양에서, 다양한 종양이 CT 항원을 발현할 수 있다. 비제한적 예시 CT 항원에는 하기가 포함된다: CTAG1B, CTAG2, CT45A2, CT45A5, CT45A6, CT45A3, CT45A1, CT47B1, CT47A11, CT47A6, CT47A7, CT45A7, CTAG1A, AT45A8, CT45A9, CT47A1, CT47A2, CT47A3, CT47A4 및 CT47A8.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "GUCY2C" 및 "구아닐레이트 사이클라제 2C"는 내인성 펩티드 구아닐린 및 유로구아닐린에 대한 수용체로서 기능하는 막관통 단백질을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC12M014612, HGNC: 4688, Entrez Gene: 2984, Ensembl: ENSG00000070019, OMIM: 601330 및 UniProtKB: P25092에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "TAG72", "CD247" 및 "종양-관련 당단백질-72"는 T-세포 수용체 제타를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC01M167399, HGNC: 1677, Entrez Gene: 919, Ensembl: ENSG00000198821, OMIM: 186780 및 UniProtKB: P20963에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "TK1" 및 "티미딘 키나제 1"은 티미딘에 감마-포스페이트 그룹의 부가를 촉매하는 세포질 효소를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 높은 수준의 이 단백질은 다수 유형의 암을 진단 및 분류하기 위한 바이오마커로 사용되었다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC12M014612, HGNC: 4688, Entrez Gene: 2984, Ensembl: ENSG00000070019, OMIM: 601330 및 UniProtKB: P25092에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "HPRT1" 및 "하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1"은, 5-포스포리보실 1-피로포스페이트로부터 5-포스포리보실 그룹의 전달을 통해 하이포크산틴으로부터 이노신 모노포스페이트로의 전환 및 구아닌으로부터 구아노신 모노포스페이트로의 전환을 촉매하는 트랜스퍼라제를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 이 단백질 또는 기본 유전자의 비제한적 예시 서열은 유전자 카드 ID: GC0XP134460, HGNC: 5157, Entrez Gene: 3251, Ensembl: ENSG00000165704, OMIM: 308000 및 UniProtKB: P00492에서 발견할 수 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
상기 수록된 수탁 번호 및 참조 문헌의 각각과 관련되는 서열은 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
본 개시를 실시하기 위한 방식
면역조절 분자의 투여는 암 치료제로서 추구되어 왔다. 그러나, 전신 투여와 관련된 심각한 부작용으로 인해[참조: Giovarelli, M. et al. (2000) J Immunol. 164:3200-3206; Lasek, W. et al. (2014) Cancer Immunol Immunother. 63:419-435], 효과적인 면역 반응을 달성하기 위해, 관련 종양에서 이러한 면역조절 분자를 고농도로 수득하는 것은 곤란했다.
유전자 조작된 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포에 의한 자가 치료를 사용하여 B 세포 림프종 및 백혈병에서 최근 수득된 전례 없는 결과로 인해[참조: Maude, S.L. et al. (2014) New Engl. J. Med. 371:1507-1517; Porter, D.L. et al. (2011) New Engl. J. Med. 365:725-733], 다수의 실험실이 이 접근법을 난소암, 전립선암 및 췌장 종양 등의 고형 종양에 적용하기 시작했다. CAR 변형 T 세포는 모노클로날 항체의 HLA 비의존적 표적화 특이성과, 활성화된 T 세포의 세포용해 활성, 증식 및 호밍(homing) 특성을 조합하지만, 체크포인트 억제에는 반응하지 않는다. 항원 발현 표적을 직접 사멸하는 능력 때문에, CAR T 세포는 임의의 항원 양성 세포 또는 조직에 대해 매우 독성이 높고, 높은 종양 특이적 항체를 사용하여 CAR을 작제해야 한다. 현재까지, 인간 고형 종양에 대한 CAR 변형 T 세포는 α-엽산 수용체, 메조텔린, MUC-CD, PSMA 및 기타 표적에 대해 작제되었지만, 대부분은 정상 조직에서 항원의 일부 표적외 발현을 갖고 있다. 이러한 작제물은 고형 종양에 대해 사용할 수 있는 CAR T 세포 작제의 새로운 표적 및 방법을 특정하기 위한 추가 연구의 필요성을 강조하는 환자에서 동일한 예외적 결과를 나타내지 않았다.
따라서, 본 개시는, 암 또는 종양 항원에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공하고, 이는, 일부 측면에서, 항-BCMA 항체 이외의 항원의 항원 결합 도메인, 및 이중특이적 항체(예컨대, BiTE 또는 BiKE) 또는 이의 단편, BsAb-CAR 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터, 종양 또는 암 항원을 표적으로 하고 가용성 항체 단편을 분비하는 BsAb-CAR 발현 세포, 및 이의 사용 및 제조에 관한 방법 및 조성물이다.
키메라 항원 수용체 및 이의 용도
성분
본 개시는, 암 또는 종양 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공하고, CAR은 세포외, 막관통 및 세포내 도메인(또한 본 명세서에서 세포질 도메인으로 지칭됨)을 포함하는 세포 활성화 부분을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진다. 세포외 도메인은 항원 결합 도메인으로도 지칭되는 표적-특이적 결합 요소를 포함한다. 세포내 도메인 또는 세포질 도메인은 하나 이상의 공자극 신호전달 영역(들) 및 CD3 제타 쇄 부분 등의 신호전달 영역을 포함한다. CAR은 임의로 최대 300개 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개 아미노산, 더욱 바람직하게는 25 내지 50개 아미노산의 스페이서 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본 명세서에 개시된 CAR은, 암 세포 상의 종양 관련 항원(TAA), 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내/세포질 도메인을 인식하여 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, TAA는 EGFR(야생형 또는 EGFRvIII) 또는 FLT3 등의 B-세포 성숙 항원(BCMA)이 아니다. 일부 실시양태에서, TAA는 BCMA이다.
스페이서 도메인. CAR은 임의로 최대 300개 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개 아미노산, 더욱 바람직하게는 25 내지 50개 아미노산의 스페이서 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 스페이서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 또는 50개 아미노산일 수 있다. 스페이서 도메인은, 예를 들면, 인간 Fc 도메인의 일부, CH3 도메인, 또는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 등의 임의의 면역글로불린의 힌지 영역, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태는 S228P, L235E 및/또는 N297Q 돌연변이를 갖거나 갖지 않는 IgG4 힌지를 포함할 수 있다(Kabat 넘버링에 따름). 추가 스페이서에는 CD4, CD8 및 CD28 힌지 영역이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
신호 펩티드. CAR은 임의로 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있고, 임의로 CAR 및/또는 BsAb-CAR 발현 세포의 세포 표면 상에 존재하도록 CAR을 지시한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 CAR의 N 말단에, 예를 들면, CAR의 항원 결합 도메인에 대한 N 말단 측에 위치한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 등의 임의의 면역글로불린의 신호 펩티드일 수 있다. 일 실시양태에서, 신호 펩티드는 IgG1의 신호 펩티드이다. 추가 실시양태에서, 신호 펩티드는 서열번호 5의 서열 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 서열번호 5의 등가물은 여전히 CAR 및/또는 BsAb-CAR 발현 세포의 세포 표면 상에 위치하도록 CAR을 지시한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 서열번호 5의 등가물은 서열번호 5와 적어도 80%(예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일하다. 신호 펩티드가 단백질을 세포 표면에 위치하도록 지시하는지의 여부를 검출하는 방법, 예컨대, 면역염색 및 단백질 발현 세포의 영상화 등은 당업자에게 이용 가능하다.
항원 결합 도메인. 특정 실시양태에서, 본 개시는 암 또는 종양 항원에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진 CAR을 제공한다. 항원 결합 도메인은 임의의 적절한 종, 예를 들면, 뮤린, 인간 또는 인간화된 서열로부터 유래할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 항-BCMA 항체 또는 BCMA-관련 항원에 결합하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 이들 항원에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체는 상업적으로 입수 가능하다. 항원 결합 도메인은 임의의 적절한 종, 예를 들면, 뮤린, 인간 또는 인간화된 서열로부터 유래할 수 있다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 B-세포 성숙 항원(BCMA) 이외의 암 또는 종양 항원에 대한 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 항-SLAMF7 항체(항-CS1 항체 또는 항-CD319 항체로도 공지됨)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 표적-특이적 항체(즉, B-세포 성숙 항원(BCMA) 및/또는 SLAMF7(또한 CS1 또는 CD319로도 공지됨) 이외의 항원에 대한 항체, 및/또는 이들 각각의 등가물)의 단편, 예를 들면, scFv을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 본질적으로 이들로 이루어진다. scFv 영역은 짧은 링커 펩티드와 연결된 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역을 포함할 수 있다. 링커 펩티드는 1 내지 50개 아미노산 길이, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신이 풍부하지만, 이는 또한 세린 또는 트레오닌을 함유할 수도 있다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 항암 또는 항종양 항체의 항원 결합 도메인의 등가물은 하기 특징 중 하나 이상을 포함한다:
(a) 경쇄 면역글로불린 가변 영역/도메인 서열은 임의의 개시된 경쇄 서열의 경쇄 가변 영역/도메인의 CDR과 적어도 80%(예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 하나 이상(예를 들면, 1, 2, 3 또는 그 이상)의 CDR을 포함하고;
(b) 중쇄 면역글로불린 가변 영역/도메인 서열은 임의의 개시된 중쇄 서열의 중쇄 가변 도메인의 CDR과 적어도 80%(예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 하나 이상의 CDR(예를 들면, 1, 2, 3 또는 그 이상)을 포함하고;
(c) 경쇄 면역글로불린 가변 영역/도메인 서열은 임의의 개시된 경쇄 서열의 경쇄 가변 영역/도메인과 적어도 80%(예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일하고;
(d) 중쇄(HC) 면역글로불린 가변 영역/도메인 서열은 임의의 개시된 중쇄 서열의 중쇄 가변 영역/도메인과 적어도 80%(예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93% 또는 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일하고;
(e) 경쇄(LC) 면역글로불린 가변 영역/도메인 서열은 임의의 개시된 경쇄 서열의 경쇄 가변 영역/도메인과 적어도 80%(예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일하고;
(f) 항체는 임의의 개시된 서열에 의해 결합된 에피토프와 중첩하는 에피토프에 결합한다.
추가 실시양태에서, (a) 내지 (e) 중 임의의 하나 이상은 여전히 개시된 참조 서열의 동일한 에피토프를 인식하여 결합하고/하거나 개시된 참조 서열에 의해 결합된 에피토프와 중첩하는 에피토프를 인식하여 결합한다.
항원 결합 도메인 등가물의 추가 예에는, 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상보체에 높은 엄격성의 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 참조 펩티드 또는 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 95%, 또는 대안적으로 적어도 97%의 아미노산 동일성을 갖는 펩티드가 포함된다. 일부 실시양태에서, 높은 엄격성의 조건은 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1× SSC 내지 약 0.1× SSC의 완충액 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아미드 농도; 및 약 1× SSC, 0.1× SSC 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 CAR의 항원 결합 도메인은 fms-유사 티로신 키나제 3(FLT3)을 인식하여 결합하는, 즉 항-FLT3 항원 결합 도메인이다. 일부 실시양태에서, 항-FLT3 항원 결합 도메인은 하기 CDR 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개 모두를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다: RASQSISNNLH(서열번호 15), KSSQSLLNSGNQKNYM(서열번호 16), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL1; YASQSIS(서열번호 17), GASTRES(서열번호 18), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL2; QQSNTWPYT(서열번호 19), QNDHSYPLT(서열번호 20), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL3; SYWMH(서열번호 21), NYGLH(서열번호 22), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH1; EIDPSDSYKDYNQKFKD(서열번호 23), VIWSGGSTDYNAAFIS(서열번호 24), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH2; 및 AITTTPFDF(서열번호 25), GGIYYANHYYAMDY(서열번호 26), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH3. 추가 실시양태에서, 이의 CDR 등가물(들), 및/또는 이의 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 항원 결합 도메인은 FLT3을 인식하여 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-FLT3 항원 결합 도메인은
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDF
TLSINSVETEDFGVYFCQQSNTWPYTFGGGTKLEIKR(서열번호 27),
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYMAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGS
GSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPLTFGAGTKLELKR(서열번호 28) 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 경쇄 가변 영역; 및/또는
QVQLQQPGAELVKPGASLKLSCKSSGYTFTSYWMHWVRQRPGHGLEWIGEIDPSDSYKDYNQKFKDKATLT
VDRSSNTAYMHLSSLTSDDSAVYYCARAITTTPFDFWGQGTTLTVSS(서열번호 29),
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGLHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISK
DNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARKGGIYYANHYYAMDYWGQGTSVTVSS(서열번호 30) 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 중쇄 가변 영역
을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 이의 가변 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 항원 결합 도메인은 FLT3을 인식하여 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 CAR의 항원 결합 도메인은 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 예를 들면, 야생형 EGFR(EGFRwt) 및/또는 이의 변이체, 예를 들면, EGFRvIII를 인식하여 결합한다. 이 항원 결합 도메인은 또한 본 명세서에서 항-EGFR 항원 결합 도메인으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 항-EGFR 항원 결합 도메인은 하기 CDR 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다: RSSQNIVHNNGITYLE(서열번호 31), RASQGIRNNLA(서열번호 32) 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL1; KVSDRFS(서열번호 33), AASNLQS(서열번호 34), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL2; FQGSHIPPT(서열번호 35), LQHHSYPLT(서열번호 36), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL3; GDTFTSY(서열번호 37), GFTFSSY(서열번호 38), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH1; YPGSGG(서열번호 39), SGSGGS(서열번호 40), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH2; 및 SGGPYFFDY(서열번호 41), SSGWSEY(서열번호 42), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH3. 추가 실시양태에서, 이의 CDR 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 항원 결합 단편은 EGFR을 인식하여 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-EGFR 항원 결합 도메인은
DILMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHNNGITYLEWYLQRPGQSPKLLIYKVSDRFSGVPDRFSGSG
SGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHIPPTFGGGTKLEIKRAA(서열번호 43),
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNNLAWYQQKPGKAPKRLIYAASNLQSGVPSRFTGSGSGTEF
TLIVSSLQPEDFATYYCLQHHSYPLTSGGGTKVEIKYAHNS(서열번호 44), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및/또는
QVQLQQSGSEMARPGASVKLPCKASGDTFTSYWMHWVKQRHGHGPEWIGNIYPGSGGTNYAEKFKNKVTLT
VDRSSRTVYMHLSRLTSEDSAVYYCTRSGGPYFFDYWGQGTTLTVSS(서열번호 45),
EVQVLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTNYADSVKGRFTIS
RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSSGWSEYWGQGTLVTVSS(서열번호 46), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 중쇄 가변 영역
을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 이의 가변 영역 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진 항원 결합 단편은 EGFR을 인식하여 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 CAR의 항원 결합 도메인은 BCMA, 즉 항-BCMA 항원 결합 도메인을 인식하여 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 하기 CDR 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다: RASESVTILGSHLIH(서열번호 47), SASQDISNYLN(서열번호 48), RASESVTILGSHLIY(서열번호 49), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL1; LASNVQT(서열번호 50), YTSNLHS(서열번호 51), LASNVQT(서열번호 52), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL2; LQSRTIPRT(서열번호 53), QQYRKLPWT(서열번호 54), LQSRTIPRT(서열번호 55), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL3; GYTFTDY(서열번호 56), GGTFSNY(서열번호 57), GYTFRHY(서열번호 58), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH1; INTETRE(서열번호 59), YRGHSD(서열번호 60), NTESGV(서열번호 61), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH2; 및 DYSYAMDY(서열번호 62), GAIYNGYDVLDN(서열번호 63), DYLYSLDF(서열번호 64), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH3. 추가 실시양태에서, 이의 CDR 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 항원 결합 단편은 BCMA를 인식하여 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA 항원 결합 도메인은
DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGS
RTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIK(서열번호 65),
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKR(서열번호 66),
DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGS
RTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIK(서열번호 67), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및/또는
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFS
LETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS(서열번호 68),
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTIT
ADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYNGYDVLDNWGQGTLVTVSS(서열번호 69),
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFRHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTESGVPIYADDFKGRFAFS
VETSASTAYLVINNLKDEDTASYFCSNDYLYSLDFWGQGTALTVSS(서열번호 70), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 중쇄 가변 영역
을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 이의 가변 영역 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 항원 결합 단편은 BCMA를 인식하여 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 CAR의 항원 결합 도메인은 CS1, 즉 항-CS1 항원 결합 도메인을 인식하여 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-CS1 항원 결합 도메인은 하기 CDR 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다: KASQDVITGVA(서열번호 71) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL1; SASYRYT(서열번호 72) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL2; QQHYSTPLT(서열번호 73) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL3; GYSFTTY(서열번호 74) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH1; HPSDSE(서열번호 75) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH2; 및 STMIATRAMDY(서열번호 76) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH3. 추가 실시양태에서, 이의 CDR 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 항원 결합 단편은 CS1을 인식하여 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-CS1 항원 결합 도메인은
SDIVMTQSQKSMSTSVGDRVSITCKASQDVITGVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTD
FTFTISNVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK(서열번호 77),
KLELKTGAGFTLPTSYHQQCYYVALDEAQVNSITFTFDTGSGSGTFRDPVGTYRYSASYILLKPSQGPKQQ
YWAVGTIVDQSAKCTISVRDGVSTSMSKQSQTMVIDS(서열번호 154),
DIVMTQSQKSMSTSVGDRVSITCKASQDVITGVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDF
TFTISNVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK(서열번호 78), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및/또는
SVTVSTGQGWYDMARTAIMTSRACYYVASDESTPSSLQMYATSSSKDVTLTAKDKFKQNLRTESDSPHIMG
IWELGQGPRQKVWNMWYTTFSYGSAKCSLKVSAGPRVLEAGPQQLQVQS(서열번호 79),
SSVTVSTGQGWYDMARTAIMTSRACYYVASDESTPSSLQMYATSSSKDVTLTAKDKFKQNLRTESDSPHIM
GIWELGQGPRQKVWNMWYTTFSYGSAKCSLKVSAGPRVLEAGPQQLQVQ(서열번호 149),
SQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTTYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATL
TVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARSTMIATRAMDYWGQGTSVTVS(서열번호 80),
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTTYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLT
VDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARSTMIATRAMDYWGQGTSVTVSS(서열번호 150), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 경쇄 가변 영역
을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 이의 가변 영역 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 항원 결합 단편은 CS1을 인식하여 결합한다.
일부 실시양태에서, CDR, 가변 영역, 항원 결합 도메인 또는 항체 등의 참조 단백질 또는 폴리펩티드의 등가물은 참조 단백질 또는 폴리펩티드와 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 실시양태에서, CDR, 가변 영역, 항원 결합 도메인 또는 항체 등의 참조 단백질 또는 폴리펩티드의 등가물은 참조 단백질 또는 폴리펩티드의 C 말단으로부터 N 말단까지의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 예를 들면, 참조 단백질 또는 폴리펩티드는 KASQDVITGVA(서열번호 71)를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지고, 이의 등가물은 AVGTIVDQSAK(서열번호 151)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. CDR, 가변 영역, 항원 결합 도메인, 또는 참조 단백질 또는 폴리펩티드로서의 항체의 실시양태에서, 등가물은 여전히 참조의 동일한 에피토프를 인식하여 결합한다.
치료 항체는 상이한 작용 메카니즘 및 안전성 프로파일링의 관점에서 키메라 항원 수용체(CAR)에서의 성공적 사용을 보장하지 않는다. 이들은 동일한 항원을 표적으로 하여도 서로를 예측할 수 없다. 항체는 항원 결합을 이용하여 종양 아폽토시스를 유도하고/하거나, Fc 수용체가 마크로파지, 자연 살해(NK) 세포 및 호중구에 결합하여 다면적 면역 반응을 유도한다. 그러나, CAR 면역 세포(예: T 세포 및 NK 세포)는 종양 항원에 대한 특이적 결합을 이용하여, 후속적으로 인공 키메라 수용체를 통해 면역 세포 활성화를 유도한다. CAR 면역 세포와 항체 모두가 표적외 독성을 가질 수 있지만, 구체적으로 항체는 Fc-수용체 매개 독성을 유도할 수 있고[참조: Schlothauer et al. Protein Eng. Des. Sel. 29, 457-466 (2016)], CAR 면역 세포는 통상 치명적 사이토카인 방출 증후군(CRS) 및 신경학적 독성을 유발한다[참조: Gupta et al. J Emerg Med. 2020 May 27;S0736-4679(20)30352-8]. 따라서, 당업자는 공통 항원 결합 도메인에만 기초하여 CAR의 효능 및 안전성을 예측할 수 없다.
일부 측면에서, CAR의 scFv는 항체로부터 유래할 수 있지만; 기능하기 위해서는 둘 다가 종양 항원에 결합해야 한다. 그러나, 종양 항원에 대한 항체의 결합은 통상 가용성 형태이지만, CAR 상의 scFv가 종양 항원에 결합하는 것은 면역 세포의 표면으로부터의 것이다. 이러한 2개 유형의 상호 작용을 결정하는 적어도 3개의 차이점이 있다: 1) 단백질 또는 펩티드의 형태 요건은 2개 설정에서 상이하고; 2) 항체 설정에서, 2개의 Fab 영역(각각 중쇄 및 경쇄의 일부로 이루어짐) 및 중쇄 상의 Fc로 이루어진 전장 항체는 결합 친화성을 지배하고, 결합은 2개의 Fab 영역으로 인해 2가이고, CAR의 경우, 1개의 Fab 영역이 링커에 의해 서로 연결된 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)으로 이루어진 scFv는 1가 결합이고; 3) 대응하는 항체와 비교하여 1가 결합 및 scFv의 짧은 길이로 인해, 뮤린 scFv를 CAR에 사용하면, CAR의 결합 친화성은 낮아지지만, 환자에서 면역원성은 저하되고, 이는 시장에서 CAR의 대부분의 사례이다[참조: Dotti et al. Immunol Rev 257, 107-126 (2014)]. 따라서, 항체의 기능은 CAR의 기능을 예측할 수 없다. 사실, 문헌[참조: Haso et al. (Blood 121, 1165-1174 (2013)]은 최근 고친화성 항체 유래의 scFv를 사용하여 CAR의 결합 친화성을 증가시키면, 시험관내 및 생체내에서 CAR 활성을 증가시키지 못한다는 것을 입증했다[참조: Haso et al. Blood 121, 1165- 1174(2013) and Handgretinger et al. Blood 121, 1065-1066(2013)].
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항원 결합 도메인은, 예를 들면, 2개의 CDR 사이 및/또는 이의 경쇄 가변 영역 또는 이의 등가물과 이의 중쇄 가변 영역 또는 이의 등가물 사이에 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 펩티드 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 14) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14의 등가물은 1 내지 50개 아미노산 길이, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14의 등가물은 글리신이 풍부하지만, 이는 또한 세린 또는 트레오닌을 함유할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14의 등가물은 (GGGGS)n을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 여전히 이들로 이루어지고, 여기서 n은 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13, 또는 14, 또는 15, 또는 그 이상의 정수일 수 있다(서열번호 134 내지 135, 14 및 136 내지 147).
힌지 도메인. 힌지 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD8, CD28, CD3, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 등의 분화 단백질의 클러스터로부터 유래한다. 일 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD8α 힌지 도메인이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 등의 면역글로불린으로부터 유래한다. 일 실시양태에서, 힌지 도메인은 IgG1 힌지 도메인이다. 추가 실시양태에서, IgG1 힌지 도메인은 LEPKSCDKTHTCPPCPDPKGT(서열번호 1) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 서열번호 1의 등가물은 서열번호 1과 비교하여 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13, 또는 14, 또는 15, 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다.
막관통 도메인. 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래할 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막 결합 또는 막관통 단백질로부터 유래할 수 있다. 본 개시에서 특히 사용되는 막관통 영역은 CD8, CD28, CD3, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 및 TCR로부터 유래할 수 있다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성일 수 있고, 이 경우, 류신 및 발린 등의 주로 소수성 잔기를 포함한다. 바람직하게는, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항이 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 임의로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 바람직하게는 2 내지 10개 아미노산 길이가 CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호전달 도메인 사이의 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중선은 특히 적합한 링커를 제공한다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인 또는 CD28 막관통 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다.
세포질/세포내 도메인. CAR의 세포질 도메인 또는 세포내 도메인은 CAR이 배치되어 있는 면역 세포의 종래의 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화에 관여한다. 일부 실시양태에서, 세포질 도메인 또는 세포내 도메인은 세포내 신호전달 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 세포내 신호전달 도메인 또는 일부 실시양태에서 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하고, 면역 세포가 이의 특정 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 일부를 지칭한다. 절단된 부분이 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 한, 전체 신호전달 도메인 또는 이의 절단된 부분을 사용할 수 있다. TCR 및 공-수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 이의 유도체 또는 변이체는 CAR에서 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인으로서 기능할 수 있다. 본 개시에서 특히 사용되는 세포내 신호전달 도메인은 FcR, TCR, CD3, CDS, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR의 신호전달 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함할 수 있거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, CD3 제타 신호전달 도메인은
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY
SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 3) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 서열번호 3의 등가물은 서열번호 3과 비교하여 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13, 또는 14, 또는 15 또는 그 이상의 돌연변이를 포함할 수 있지만, 그럼에도 이의 이펙터 기능 신호를 전달하고, 면역 세포가 서열번호 3으로서 이의 특정 기능을 수행하도록 지시할 수 있다. 이러한 형질도입을 평가하는 예시적 방법은, 예를 들면, 문헌[참조: Bridgeman JS, et al. Clin Exp Immunol. 2014 Feb;175(2):258-67]에서 발견할 수 있다.
TCR을 통해 생성된 신호만으로는 T 세포를 완전히 활성화하기에 불충분하기 때문에, 2차 또는 공자극 신호도 필요할 수 있다. 따라서, 단백질 CD27, CD28, 4-IBB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 또는 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드의 세포질 도메인을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 공자극 신호전달 분자의 세포내 영역도 CAR의 세포질 도메인에 포함될 수 있다. 예를 들면, CAR은 신호전달 도메인(예를 들면, CD3ζ 신호전달 도메인) 외에 1개, 2개 또는 그 이상의 공자극 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 추가로 CD28 공자극 신호전달 영역, 4-1BB 공자극 신호전달 영역, ICOS 공자극 신호전달 영역 또는 OX40 공자극 영역으로부터 선택된 1개 이상 또는 2개 이상의 공자극 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체의 세포 활성화 부분은 CD8 단백질, CD28 단백질, 4-1BB 단백질, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, CD27, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD3-제타 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 단편을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 추가로 이루어지는 T-세포 신호전달 도메인이다.
일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체의 세포 활성화 부분은 CD8 단백질, CD28 단백질, 4-1BB 단백질 및 CD3-제타 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 단편을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 추가로 이루어지는 T-세포 신호전달 도메인이다.
특정 실시양태에서, CAR은 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 공자극 신호전달 영역은 CD28 공자극 신호전달 영역 및 4-1BB 공자극 신호전달 영역 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(서열번호 2) 또는 이의 등가물을 포함하는 CD28 막관통 및 세포질 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 서열번호 2의 등가물은 서열번호 32와 비교하여 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13, 또는 14, 또는 15, 또는 그 이상의 돌연변이를 갖지만, 여전히 막관통 도메인 및 공자극 신호전달 영역으로서 기능할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 CAR 및/또는 이의 세포질 도메인은 IL2Rβ 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, IL2Rβ의 단편은 면역 세포의 활성화를 촉진하는 IL2Rβ의 JAK-STAT 활성화 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CAR 및/또는 CAR의 세포내 도메인은 JAK-STAT 활성화 도메인을 포함하는 IL2Rβ 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, JAK-STAT 활성화 도메인은 JAK 결합 도메인(티로신 키나제 JAK 회합을 가능하게 하는 box-1 모티프로도 공지됨, 예를 들면, JAK1) 및/또는 신호 전달인자 및 전사 활성제(STAT3 또는 STAT5 등의 STAT) 연관 모티프를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. JAK 결합 도메인의 예는 NCBI RefSeq:NP_000869.1의 아미노산 번호 278 내지 286에서 발견할 수 있다. 추가 실시양태에서, 세포내 도메인은 내인성 또는 외인성 JAK-결합 모티프 및/또는 내인성 또는 외인성 STAT 연관 모티프를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 STAT3 연관 모티프는 YXXQ(서열번호 152), 임의로 YRHQ(서열번호 153)이다. 이러한 CAR 세포를 발현하는 세포는 항원 의존적 JAK-STAT3/5 경로의 활성화를 나타내고, 이에 의해 증식이 촉진되어 시험관내에서 최종 분화를 방지한다. 대안적으로, IL2Rβ 이외의 단백질로부터의 JAK-STAT 활성화 도메인을 여기에서 치환으로서 사용할 수 있다. 이러한 단백질의 예로는 에리트로포이에틴 수용체(EpoR), 트롬보포이에틴 수용체(TpoR), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 수용체(GM-CSFR) 또는 성장 호르몬 수용체(GHR)를 포함할 수 있다[참조: 예를 들면, US20190359685A1 and Kagoya et al. Nat Med. 2018 Mar; 24(3):352-359. doi: 10.1038/nm.4478. Epub 2018 Feb 5].
스위치 메카니즘. 일부 실시양태에서, CAR은 또한 CAR의 발현 및/또는 활성화를 조절하기 위한 스위치 메카니즘을 포함할 수 있다. 예를 들면, CAR은 세포외, 막관통 및 세포내 도메인을 포함하거나, 또는 이들로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어질 수 있고, 여기서 세포외 도메인은 표적 세포(암 세포 등) 상에서 또는 표적 세포에 의해 발현되는 표적 항원 이외의 분자에 특이적인 표지, 결합 도메인 또는 태그에 결합하는 표적-특이적 결합 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 표지, 결합 도메인 또는 태그는 표적 세포 상에서 또는 표적 세포에 의해 발현되는 표적 항원을 인식하여 결합한다. 이러한 실시양태에서, CAR의 특이성은 표적 항원 결합 도메인과, 표지, 결합 도메인 또는 태그에 의해 인식 또는 결합되는 CAR 상의 도메인을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지는 제2 작제물에 의해 제공된다[참조: 예를 들면, WO 2013/044225, WO 2016/000304, WO 2015/057834, WO 2015/057852, WO 2016/070061, US 9,233,125, US 2016/0129109]. 이러한 방식으로, CAR을 발현하는 T-세포, NK 세포 또는 기타 면역 세포는 대상체에게 투여될 수 있지만, 표지, 결합 도메인, 또는 태그를 포함하는 제2 조성물, 예를 들면, BCMA 특이적 결합 도메인이 투여된다.
본 개시의 CAR은, 마찬가지로, 이들의 기능을 활성화하기 위해 다량체화(예를 들면, US 2015/0368342, US 2016/0175359, US 2015/0368360 참조) 및/또는 T-세포 반응 또는 NK 세포 반응 등의 면역 세포 반응을 유발하기 위해 소분자 약물 등의 외인성 신호[참조: US 2016/0166613, Yung et al., Science, 2015]를 필요로 할 수 있다.
추가로, 개시된 CAR은 치료 후 CAR 세포의 세포 사멸을 유도하거나[참조: Buddee et al., PLoS One, 2013], 표적 항원에 대한 결합 후의 CAR의 발현을 하향조절(WO 2016/011210)하기 위해 "자살 스위치"(또는 "자살 유전자"로도 지칭됨)를 포함할 수 있다. 비제한적 예시적 자살 스위치 또는 자살 유전자는 iCasp이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 CAR 및/또는 이의 세포질 도메인은 자살 유전자 산물(suicide gene product)을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 자살 유전자 산물은 HSV-TK(단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제), 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 카복실에스테라제, 시토크롬 P450 또는 PNP(퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제), 절단된 EGFR, 또는 유도성 카스파제("iCasp") 중 하나 이상으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CAR은 검출가능한 마커 또는 정제 마커를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 조성물, 예를 들면, 진단 또는 요법을 위한 약제학적으로 허용되는 담체에 함유된다.
특정 실시양태에서, CAR의 암- 또는 종양-표적화 항체의 항원 결합 도메인은 링커 펩티드에 의해 임의로 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 항원에 대한 항체의 관련 CDR 영역(예: B-세포 성숙 항원(BCMA) 이외의 것들), 및/또는 SLAMF7(CS1 또는 CD319로도 공지됨), 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 특정 실시양태에서, CAR은 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 위치한 링커 폴리펩티드를 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 추가로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 링커는 글리신-세린 링커이다. 추가 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 서열(글리신-세린)n을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지고, 여기서 n은 1 내지 6의 정수이고(서열번호 110), 일 측면에서, n은 4이다.
특정 실시양태에서, CAR의 암- 또는 종양-표적화 항체의 항원 결합 도메인은 FLT3, CD19, 메조텔린, 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 암배아성 항원(CEA), GTP-ase-활성화 단백질(GAP), 강글리오사이드 G2(GD2), CD5, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1(ROR1), CD123, CD70, CD38, B 세포 성숙 항원(BCMA), 뮤신 1, (Muc1), 에프린 A형 수용체 2 전구체(EphA2), 야생형 상피 성장 인자 수용체(EGFRwt), 상피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRVIII), 인터류킨 13 수용체 알파 2(IL13Ra2), CD133, 글리피칸 3(GPC3), 상피 세포 부착 분자 전구체(EpCam), 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 암/정소(CT), 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2C), 종양-관련 당단백질-72(TAG-72), 티미딘 키나제 1(TK1), 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT1)로부터 선택된 하나 이상 등의 임의 암- 또는 종양-연관 항원에 결합한다. 이들은, 대안적으로 항원 결합 도메인의 CDR로 이루어지거나, 또는 이를 포함하는 항원 결합 도메인의 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있다.
또한, CAR 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예: 단리 및/또는 조작된 폴리펩티드) 및/또는 단리된 핵산이 제공된다. 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 필요한 조절 서열, 예를 들면, 숙주 세포, 예를 들면, 포유동물 또는 인간 숙주 세포, 예컨대, T 세포 또는 NK 세포 및/또는 인핸서 요소에서의 발현을 위한 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 CAR의 발현을 지시하는 제1 조절 서열을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 조절 서열은 프로모터, 인트론, 인핸서 또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CMV, MND 또는 EF1알파 프로모터이다. 추가 실시양태에서, CAR 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은, 코딩 폴리뉴클레오티드의 5' 측에 위치하는 프로모터 요소, 예를 들면, CMV, MND 및 EF1A 프로모터 등의 제2 조절 서열로부터 조절될 수 있는 검출가능한 또는 정제 마커 펩티드(예를 들면, GFP)를 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 EF1 알파 프로모터를 포함한다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 프로모터(들)는 숙주 발현 시스템을 위해 선택되고, 숙주 및 발현 벡터 및 의도된 용도에 따라 상이할 것이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 HSV-TK(단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제), 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 카복실에스테라제, 시토크롬 P450 또는 PNP(퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제), 절단된 EGFR 또는 유도성 카스파제("iCasp") 중 하나 이상으로부터 임의로 선택된 자살 유전자 산물을 코딩하는 자살 유전자를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 자살 유전자 산물의 발현을 지시하는 제3 조절 서열을 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 조절 서열 중 임의의 1개 또는 2개 또는 3개는 세포에서 유도 가능 또는 구성적으로 활성이다. 일 실시양태에서, 조절 서열 중 임의의 1개 또는 2개 또는 3개는 세포 특이적 또는 조직 특이적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 하기 중 하나 이상을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다:
(I) 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
ATGGGGTGGTCAAGCATTATTCTGTTTCTGGTCGCTACCGCTACAGGCGTCCAT(서열번호 86),
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT(서열번호 87), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(II) 링커 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 GGTGGGGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGAGGTGGCAGT(서열번호 88)를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(III) 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(서열번호 89)를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(IV) 신호전달 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCT
CAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAA
AGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTAC
AGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTAC
AGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(서열번호 90) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(VI) 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
CCGAGCGGCCAGGCGGGCGCGGGCGGCATCGGAGTCCCTGTTTGTGTCAAATCACGCCTAC(서열번호 92) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(VII) 항-BCMA 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
GATATTGTTCTTACTCAATCACCCCCAAGCCTTGCGATGTCTCTTGGTAAACGAGCGACAATTAGTTGTAG
AGCTTCTGAAAGCGTAACTATTCTTGGGTCACATCTTATTCATTGGTATCAACAAAAGCCGGGACAACCGC
CTACACTCTTGATTCAACTCGCGAGCAATGTTCAAACGGGTGTCCCTGCACGCTTTTCTGGGAGCGGTTCA
CGAACAGATTTTACTCTCACGATTGATCCAGTCGAAGAAGATGATGTCGCTGTATATTATTGTCTCCAAAG
TAGGACAATACCAAGAACTTTTGGTGGTGGTACAAAATTGGAAATTAAA(서열번호 93),
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCACTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATTACCTGCTC
CGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGA
TCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTC
ACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGGAAGCTCCC
CTGGACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGT(서열번호 94),
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCTGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCG
GGCCAGCGAGAGCGTGACCATCCTGGGCAGCCACCTGATCTACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCCC
CCACCCTGCTGATCCAGCTGGCTAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGC
AGAACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAG
CCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGAACAAAGCTGGAAATCAAG(서열번호 95),
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCTGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCG
GGCCAGCGAGAGCGTGACCATCCTGGGCAGCCACCTGATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCC
CCACCCTGCTGATCCAGCTCGCCAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGC
AGAACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAG
CCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAG(서열번호 96), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택되는, 뉴클레오티드 서열;
(VIII) 항-BCMA 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
CAGATCCAGCTGGTGCAGTCCGGCCCCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGAGACCGTGAAGATCTCCTGCAAGGC
CTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTCCATCAACTGGGTGAAGCGGGCCCCCGGCAAGGGCCTGAAGTGGA
TGGGCTGGATCAACACCGAGACCCGGGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTCCGGGGCCGGTTCGCCTTCTCC
CTGGAGACCTCCGCCTCCACCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTT
CTGCGCCCTGGACTACTCCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCTCCGTGACCGTGTCCTCC(서열번호 97),
CAGGTGCAGCTGGTCCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGC
CAGCGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGA
TGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCCGGGTGACCATCACC
GCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTA
CTGCGCCAGGGGCGCCATCTACAACGGCTACGACGTGCTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCG
TGTCCAGC(서열번호 98),
ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACCAGATTCAGCTGGTGCA
GAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCC
GGCACTACAGCATGAACTGGGTGAAACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCCGGATCAACACC
GAGAGCGGCGTGCCCATCTACGCCGACGACTTCAAGGGCAGATTCGCCTTCAGCGTGGAAACCAGCGCCAG
CACCGCCTACCTGGTGATCAACAACCTGAAGGACGAGGATACCGCCAGCTACTTCTGCAGCAACGACTACC
TGTACAGCCTGGACTTCTGGGGCCAGGGCACCGCCCTGACCGTGTCCAGC(서열번호 99) 또는
CAGATTCAGCTGGTGCAGAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGC
CTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATCAACTGGGTGAAAAGAGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTGGA
TGGGCTGGATCAACACCGAGACAAGAGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTCCGGGGCAGATTCGCCTTCAGC
CTGGAAACCAGCGCCAGCACCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTT
TTGCGCCCTGGACTACAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCCAGC(서열번호 100) 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택되는, 뉴클레오티드 서열;
(XI) 항-FLT3 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAG
GGCCAGCCAGAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCA
TCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTC
ACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAGTGTATTTCTGTCAACAGAGTAACACCTGGCC
GTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG(서열번호 103),
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAA
GTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTATATGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGC
AGCCTCCTAAACTGTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGT
GGATCTGGAACCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCA
GAATGATCATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG(서열번호 104) 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(XII) 항-FLT3 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCATTGAAGCTGTCCTGCAAGTC
TTCCGGGTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGA
TCGGAGAGATTGATCCTTCTGACAGTTATAAAGACTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACT
GTGGACAGATCCTCCAACACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCGGTCTATTA
TTGTGCAAGAGCGATTACGACGACCCCCTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(서열번호 105),
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGT
CTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTTTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGCCTGGAGTGGC
TGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAGCACAGACTATAATGCAGCTTTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAAG
GACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAGGCTGATGACACAGCCATATACTACTG
TGCCAGAAAAGGAGGGATCTACTATGCTAACCATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAG
TCACCGTCTCCTCA(서열번호 106) 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(XIII) 항-CS1 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
AAACTTGAGT TGAAGACCGG TGCCGGCTTC ACCTTACCGA CCAGTTATCA TCAACAATGC
TATTACGTGG CCCTGGACGA AGCACAGGTG AATTCAATTA CGTTTACGTT TGATACCGGC
TCTGGCAGCG GTACATTTCG TGATCCCGTG GGCACTTACC GCTATTCGGC GAGTTATATC
TTGCTGAAAC CTTCCCAAGG TCCGAAACAG CAGTACTGGG CGGTTGGCAC CATTGTAGAC
CAATCAGCCA AATGTACAAT CTCGGTTCGC GATGGTGTCA GTACGTCGAT GTCTAAGCAG
TCACAGACAA TGGTTATCGA T(서열번호 107) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(XIV) 항-CS1 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
AGCGTTACCG TGAGTACAGG CCAGGGCTGG TATGACATGG CACGTACAGC CATCATGACC
TCGCGCGCAT GTTACTACGT CGCGTCAGAT GAATCGACGC CTTCCTCGCT GCAAATGTAT
GCAACCTCCA GCAGCAAAGA TGTTACCCTG ACCGCAAAGG ACAAGTTTAA ACAGAATTTG
CGTACGGAGA GTGACTCCCC GCACATCATG GGAATCTGGG AGTTGGGTCA GGGGCCTCGT
CAGAAGGTAT GGAACATGTG GTATACAACT TTTTCGTACG GCTCAGCAAA ATGCAGCTTG
AAAGTGTCGG CAGGTCCGCG CGTGCTGGAG GCCGGTCCGC AGCAGCTGCA AGTCCAGTCT(서열번호 108) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열; 및
(XV) 힌지 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTTGCCCGGATCCCAAAGGTACC(서열번호 109) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열.
일부 실시양태에서, 참조 뉴클레오티드 서열의 등가물은 참조의 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 참조 뉴클레오티드 서열의 등가물은 참조와 적어도 80%(예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일하다. 추가로 또는 대안적으로, 참조 뉴클레오티드 서열의 등가물은 높은 엄격성의 조건하에 참조의 상보체에 하이브리드화한다. 일부 실시양태에서, 높은 엄격성의 조건은 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1× SSC 내지 약 0.1× SSC의 완충액 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아미드 농도; 및 약 1× SSC, 0.1× SSC 또는 탈이온수의 세척 용액. 또한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 대해 역, 상보 또는 역-상보인 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 검출가능한 또는 정제 마커 및/또는 검출가능한 또는 정제 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다.
폴리뉴클레오티드 및/또는 단리된 핵산은, 발현 벡터, 예를 들면, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터(5' 및 3' LTR 사이) 또는 아데노바이러스 벡터 또는 이로부터 유전자를 발현할 수 있는 임의의 기타 벡터 등의 벡터에 삽입될 수 있다. 도 1A는 본 개시의 예시적 작제물이다. 명백한 바와 같이, 인간 환자에서 임상적으로 사용되는 경우, 마커 또는 정제 태그는 작제물로부터 생략될 것이다. 세포는 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터를 사용하거나, 대안적으로 문헌[참조: Riet et al. (2013) Meth. Mol. Biol. 969:187-201 entitled “Nonviral RNA transfection to transiently modify T cell with chimeric antigen receptors for adoptive therapy"]"에 기재된 기술을 사용하여 형질도입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 등의 비-바이러스 벡터(non-viral vector)이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터의 그룹으로부터 임의로 선택된 바이러스 벡터이다. 추가로 또는 대안적으로, 벡터는 CAR 코딩 폴리뉴클레오티드 및/또는 단리된 핵산의 복제 및/또는 발현을 지시하는 조절 서열을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 조절 서열은 프로모터, 인트론, 인핸서 또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 검출가능한 또는 정제 마커를 추가로 포함한다.
CAR 작제물에 사용하기 위한 항체의 제조 방법
본 개시에 사용하기 위한 항체는 당해 기술분야에 공지되고, 본 명세서에 간략히 기재된 방법을 사용하여 구입 또는 제조할 수 있다. 새로운 항원이 발견되는 경우, 항체와 항체의 항원 결합 도메인을 제조해야 한다. 이들의 제조 및 용도는 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999]에 개시되어 있다. 항체는 당해 기술분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 항체의 예에는 모노클로날, 일본쇄 및 항체의 기능적 단편이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
항체는 다양한 숙주, 예를 들면, 염소, 래빗, 랫트, 마우스, 인간 등에서 생성될 수 있다. 이들은 C-말단 단편, 암 또는 종양 관련 항원 또는 BCMA 또는 NKG2D 등의 단리된 폴리펩티드 등의 면역원성 특성을 갖는 표적 항원 또는 이의 단편 또는 올리고펩티드를 주사함으로써 면역화할 수 있다. 숙주 종에 따라, 면역 반응을 증가시키기 위해 다양한 보조제를 첨가하여 사용할 수 있다. 이러한 보조제는 프로인트, 수산화알루미늄 등의 미네랄 겔, 및 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀 등의 표면 활성 물질을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 인간에게 사용되는 보조제 중에서, BCG(Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 특히 유용하다. 본 개시는 또한 단리된 폴리펩티드 및 보조제를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시의 항체는 폴리클로날, 즉 상이한 아미노산 서열을 갖는 복수 유형의 항체의 혼합물이다. 일 실시양태에서, 폴리클로날 항체는 상이한 CDR을 갖는 복수 유형의 항체의 혼합물을 포함한다. 이와 같이, 상이한 항체를 생산하는 세포의 혼합물을 배양하고, 수득된 배양물로부터 정제된 항체를 사용할 수 있다(WO 2004/061104 참조).
모노클로날 항체 생산. 암 또는 종양 항원에 대한 모노클로날 항체는 배양 중의 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 기술에는 하이브리도마 기술[참조: 예를 들면, Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)]; 트리오마 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술[참조: 예를 들면, Kozbor et al., Immunol. Today 4:72 (1983)] 및 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 EBV 하이브리도마 기술[참조: 예를 들면, Cole et al., in: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)]이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 인간 모노클로날 항체는 본 기술의 실시에 이용될 수 있고, 인간 하이브리도마를 사용함으로써[참조: 예를 들면, Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030 (1983)] 또는 시험관내에서 엡스타인 바르 바이러스로 인간 B-세포를 형질전환함으로써[참조: 예를 들면, Cole et al., in: MONOCLONAL ANTIBODIES AND Cancer THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)] 생산할 수 있다. 예를 들면, 항체의 영역을 코딩하는 핵산 집단이 단리될 수 있다. 항체의 보존된 영역을 코딩하는 서열로부터 유래하는 프라이머를 사용하는 PCR은 집단으로부터 항체의 일부를 코딩하는 서열을 증폭하고, 이어서 증폭된 서열로부터 항체 또는 이의 단편, 예를 들면, 가변 도메인을 코딩하는 DNA를 재작제하기 위해 사용된다. 이러한 증폭된 서열은 또한 파지 또는 세균 상의 융합 폴리펩티드의 발현 및 표시를 위해 기타 단백질(예: 박테리오파지 코트 또는 세균 세포 표면 단백질)을 코딩하는 DNA에 융합시킬 수 있다. 이어서, 증폭된 서열을 발현시키고, 예를 들면, BCMA 관련 항원 폴리펩티드에 존재하는 항원 또는 에피토프에 대한 발현된 항체 또는 이의 단편의 친화성에 기초하여 추가로 선택 또는 단리할 수 있다. 대안적으로, 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마는, 예를 들면, 관련 항원 또는 이의 단편의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 단리된 폴리펩티드로 대상체를 면역화하고, 이어서 통상의 방법을 사용하여 대상체의 비장으로부터 하이브리도마를 단리함으로써 제조할 수 있다[참조: 예를 들면, Milstein et al., (Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)]. 표준 방법을 사용하여 하이브리도마를 스크리닝하면, 다양한 특이성(즉, 상이한 에피토프에 대해) 및 친화성의 모노클로날 항체가 생성된다. 원하는 특성, 예를 들면, 관련 항원 결합을 갖는 선택된 모노클로날 항체는 (i) 하이브리도마에 의해 발현된 바와 같이 사용되거나, (ii) 그 특성을 변경하기 위해 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 분자에 결합되거나, 또는 (iii) 모노클로날 항체를 코딩하는 cDNA는 다양한 방식으로 단리, 서열분석 및 조작될 수 있다. 일 측면에서, 모노클로날 항체는 유전자도입 비-인간 동물, 예를 들면, 유전자도입 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산되고, 이는 불멸화된 세포에 융합된 인간 중쇄 도입유전자 및 경쇄 도입유전자를 포함하는 게놈을 갖는다. 하이브리도마 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문헌[참조: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 349 (1988); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 563-681 (1981)]에 교시되어 있다.
파지 디스플레이 기술. 상기 언급된 바와 같이, 본 개시의 항체는 재조합 DNA 및 파지 디스플레이 기술의 적용을 통해 생산될 수 있다. 예를 들면, BCMA 항체는 당해 기술분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 파지 입자의 표면에 표시된다. 목적하는 결합 특성을 갖는 파지는 항원, 전형적으로 고체 표면 또는 비드에 결합 또는 포획된 항원을 직접 선택함으로써 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들면, 인간 또는 뮤린)로부터 선택된다. 이러한 방법에 사용되는 파지는 통상 fd 및 M13을 포함하는 섬유상 파지이고, Fab, Fv 또는 디설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인이 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합되어 있다. 또한, 이 방법은 Fab 발현 라이브러리의 작제에 적합시켜[참조: 예를 들면, Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989], 관련 항원 폴리펩티드, 예를 들면, 폴리펩티드 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대해 목적하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편의 신속한 및 효과적 동정을 가능하게 할 수 있다. 본 개시의 단리된 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 다른 예에는 문헌[참조: Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 5879-5883 (1988); Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 1066-1070 (1990); Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene 187: 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280 (1994); PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; WO 96/06213; WO 92/01047 (Medical Research Council et al.); WO 97/08320 (Morphosys); WO 92/01047 (CAT/MRC); WO 91/17271 (Affymax); and U.S. Patent Nos. 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727 and 5,733,743]에 개시된 것들이 포함된다.
디설파이드 결합을 통해 폴리펩티드를 부착시킴으로써 박테리오파지 입자의 표면에 폴리펩티드를 표시하기 위해 유용한 방법은 문헌[참조: Lohning, 미국 특허 제6,753,136호]에 기재되어 있다. 상기 참고문헌에 기재된 바와 같이, 파지 선택 후, 파지로부터의 항체 코딩 영역을 단리하고, 인간 항체 또는 임의의 기타 목적하는 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생성하기 위해 사용하고, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 포함하는 임의의 목적하는 숙주에서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생산하는 기술은 문헌[참조: WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12: 864-869 (1992); Sawai et al., AJRI 34: 26-34 (1995); and Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988)]에 기재된 것 등의 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 이용할 수 있다.
일반적으로, 항체 또는 항체 단편은 파지 또는 파지미드 입자의 표면에 존재하기 때문에, 디스플레이 벡터 내로 클로닝된 하이브리드 항체 또는 하이브리드 항체 단편은 양호한 결합 활성을 유지하는 변이체를 동정하기 위해 적절한 항원에 대해 선택될 수 있다[참조: 예를 들면, Barbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)]. 그러나, 선택 및/또는 스크리닝을 위해 항체 단편 라이브러리를 용해성 파지 벡터(변형된 T7 또는 Lambda Zap 시스템)에 클로닝하는 것 등의 기타 벡터 포맷을 이 프로세스에 사용할 수 있다.
항체 생산의 대안적 방법. 항체는 또한, 림프구 집단에서 생체내 생산을 유도함으로써 또는 재조합 면역글로불린 라이브러리 또는 고도로 특이적 결합 시약의 패널을 스크리닝함으로써 생산될 수 있다[참조: Orlandi et al., PNAS 86: 3833-3837 (1989); Winter, G. et al., Nature, 349: 293-299 (1991)].
대안적으로, 일본쇄 항체를 생산하기 위한 기술을 사용할 수 있다. 일본쇄 항체(scFv)는 링커 펩티드(일반적으로 약 5 내지 25개의 아미노산 길이)와 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. scFv에서, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 동일한 항체 또는 상이한 항체로부터 유래할 수 있다. scFv는, 재조합 기술을 사용하여, 예를 들면, 이. 콜라이 등의 숙주 생물에서 scFv를 코딩하는 벡터를 발현시킴으로써 합성할 수 있다. scFv를 코딩하는 DNA는, 상기 항체의 중쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA로부터 선택된 DNA의 전체 또는 목적하는 아미노산 서열을 코딩하는 부분 DNA, 및 경쇄 또는 이의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 주형으로서 사용하여 이의 양 말단을 정의하는 프라이머 쌍을 사용한 PCR에 의해 증폭을 수행하고, 추가로 폴리펩티드 링커 부분을 코딩하는 DNA 및 이의 양 말단을 정의하는 프라이머 쌍을 조합하여 증폭을 수행하여, 링커의 양 말단을 각각 중쇄 및 경쇄에 결찰시킴으로써 수득할 수 있다. scFv를 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주는 당해 기술분야에 공지된 종래의 방법에 따라 수득될 수 있다.
항원 결합 단편, 예를 들면, 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편, 및 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원함으로써 생성될 수 있는 Fab 단편도 생성할 수 있다. 대안적으로, Fab 발현 라이브러리는 목적하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편의 신속하고 용이한 동정을 가능하게 하도록 작제될 수 있다[참조: Huse et al., Science, 256: 1275-1281 (1989)].
항체 변형. 본 개시의 항체는 항원에 대한 친화성을 증가시키기 위해 다량체화될 수 있다. 다량체화하는 항체는 동일한 항원의 복수의 에피토프를 인식하는 한 유형의 항체 또는 복수의 항체일 수 있다. 항체의 다량체화 방법으로서는, 2개의 scFv 분자에 대한 IgG CH3 도메인의 결합, 스트렙트아비딘에 대한 결합, 헬릭스-턴-헬릭스 모티프의 도입 등을 예시할 수 있다.
본 명세서에 개시된 항체 조성물은 이들 항체 중 임의의 것과 또 다른 약제(면역접합체) 사이에 형성된 접합체의 형태일 수 있다. 일 측면에서, 본 명세서에 개시된 항체는 방사성 물질에 접합된다. 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 항체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 다양한 유형의 분자에 결합될 수 있다.
항체 스크리닝. 목적하는 특이성을 갖는 항체를 동정하기 위한 스크리닝을 위해, 다양한 면역검정이 사용될 수 있다. 확립된 특이성을 갖는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하는 경쟁적 결합 또는 면역방사성 검정을 위한 다수의 프로토콜이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 면역검정은 일반적으로 관련 항원, 또는 이의 임의의 단편 또는 올리고펩티드와 이의 특이적 항체 사이의 복합체 형성의 측정을 포함한다. 2개의 비간섭 관련 항원 에피토프에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하는 2부위 모노클로날 기반 면역검정을 사용할 수 있지만, 경쟁 결합 검정도 사용할 수 있다[참조: Maddox et al., J. Exp. Med., 158: 1211-1216(1983)].
항체 정제. 본 명세서에 개시된 항체는 균질하게 정제될 수 있다. 항체의 분리 및 정제는 종래의 단백질 분리 및 정제 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
단지 예로서, 항체는 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외여과, 염 침전, 투석, 분취 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 집속 전기영동 등의 사용을 적절하게 선택 및 조합함으로써 분리 및 정제될 수 있다[참조: Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
크로마토그래피의 예에는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 흡착 크로마토그래피가 포함된다. 일 측면에서, 크로마토그래피는 HPLC 또는 FPLC 등의 액체 크로마토그래피를 사용하여 수행될 수 있다.
일 측면에서, 단백질 A 컬럼 또는 단백질 G 컬럼은 친화성 크로마토그래피에서 사용될 수 있다. 다른 예시적 컬럼에는 단백질 A 컬럼, 하이퍼(Hyper) D, POROS, 세파로스 F. F.(Pharmacia) 등이 포함된다.
이중특이적 항체
NKG2D 또는 종양 항원의 임의의 항체, 예를 들면, 항-NKG2D 항체의 항원 결합 도메인 및 CS1에 결합하는 항체의 종양 표적화 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체 작제물이 또한 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 암 세포 상의 TAA를 인식하여 결합하는 항원 결합 도메인 및 NKG2D를 인식하여 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진 이중특이적 항체가 제공된다. 일 실시양태에서, CS1을 인식하여 결합하는 항원 결합 도메인(즉, 항-CS1 항원 결합 도메인) 및 NKG2D를 인식하여 결합하는 항원 결합 도메인(즉, 항-NKG2D 항원 결합 도메인)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 이중특이적 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 CAR의 항원 결합 도메인이 결합하는 유형의 암 또는 종양 세포 상에 존재하는 항원에 결합하고, 예를 들면, 각각은 MM 세포 또는 교모세포종 세포에 결합한다. 항원 결합 도메인은 임의의 적절한 종, 예를 들면, 뮤린, 인간 또는 인간화된 서열로부터 유래할 수 있다. 이러한 예는 이러한 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 구체적으로 포함하는 2016년 2월 22일에 출원된 PCT/US2016/018955에 기재되어 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
이러한 접근법의 예로서 본 명세서에 기재된 것은 2개의 항원 결합 도메인 중 적어도 하나가 소정의 제1 항원과 공-발현되는 항원에 특이적인 작제물이다. 예를 들면, MM의 경우, BCMA 및 CS1은 MM에서 공-발현되고, CS1은 CAR 작제물의 BCMA 항원 결합 도메인을 보완하도록 선택되었다. 또는, BCMA는 항-CS1 CAR을 보완할 수 있다.
추가 측면에서, 항원 결합 도메인은 필요에 따라 코돈 최적화된 scFv 단편을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 추가 측면에서, 이중특이적 항원 결합 도메인은 펩티드 링커에 의해 연결된 가변 중쇄 및 경쇄이다. 일반적으로, 항원 결합 도메인은 펩티드 링커, 예를 들면, 인간 근육 알도스(HMA)에서 유래하는 비-면역원성 단백질 링커에 의해 함께 연결될 수 있다35. 이러한 예가 도 3A에 제공되고, 이중특이적 성분은 도 1E, 1F 또는 1G에 제시되었다. 이들 도면에 도시된 바와 같이, 작제물은 T2A, 자가-절단 2A 유전자, HMA 폴리펩티드 및/또는 링커 펩티드, 예를 들면, A G4S 펩티드 링커(서열번호 14 및 134 내지 147)를 추가로 포함할 수 있다("G4S"는 서열번호 134로 개시됨).
특정 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 이중특이적 항체의 항-TAA 항원 결합 도메인은 FLT3, CD19, 메조텔린, 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 암배아성 항원(CEA), GTP-ase-활성화 단백질(GAP), 강글리오사이드 G2(GD2), CD5, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1(ROR1), CD123, CD70, CD38, B 세포 성숙 항원(BCMA), 뮤신 1, (Muc1), 에프린 A형 수용체 2 전구체(EphA2), 야생형 상피 성장 인자 수용체(EGFRwt), 상피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRVIII), 인터류킨 13 수용체 알파 2(IL13Ra2), CD133, 글리피칸 3(GPC3), 상피 세포 부착 분자 전구체(EpCam), 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 암/정소(CT), 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2C), 종양-관련 당단백질-72(TAG-72), 티미딘 키나제 1(TK1) 및 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT1)로부터 선택된 하나 이상 등의 임의의 암- 또는 종양-관련 항원을 인식하여 결합한다. 이들은 항원 결합 도메인의 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있고, 대안적으로 항원 결합 도메인의 CDR로 이루어지거나, 또는 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 이중특이적 항체의 항-TAA 항원 결합 도메인은 fms-유사 티로신 키나제 3(FLT3)을 인식하여 결합하고, 즉 항-FLT3 항원 결합 도메인이다. 일부 실시양태에서, 항-FLT3 항원 결합 도메인은 하기 CDR 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개 모두를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다: 서열번호 15, 서열번호 16, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진 CDRL1; 서열번호 17, 서열번호 18, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL2; 서열번호 19, 서열번호 20, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL3; 서열번호 21, 서열번호 22, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH1; 서열번호 23, 서열번호 24, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH2; 및 서열번호 25, 서열번호 26, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH3. 추가 실시양태에서, 이의 CDR 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 항원 결합 도메인은 FLT3을 인식하여 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-FLT3 항원 결합 도메인은, 서열번호 27, 서열번호 28, 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 경쇄 가변 영역; 및/또는 서열번호 29, 서열번호 30 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 이의 가변 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진 항원 결합 도메인은 FLT3을 인식하여 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 이중특이적 항체의 항-TAA 항원 결합 도메인은 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 예를 들면, 야생형 EGFR(EGFRwt) 및/또는 이의 변이체, 예를 들면, EGFRvIII를 인식하여 결합한다. 이 항원 결합 도메인은 또한 본 명세서에서 항-EGFR 항원 결합 도메인으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 항-EGFR 항원 결합 도메인은 하기 CDR 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다: 서열번호 31, 서열번호 32, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL1; 서열번호 33, 서열번호 34, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL2; 서열번호 35, 서열번호 36, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL3; 서열번호 37, 서열번호 38, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH1; 서열번호 39, 서열번호 40, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH2; 및 서열번호 41, 서열번호 42, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH3. 추가 실시양태에서, 이의 CDR 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 항원 결합 단편은 EGFR을 인식하여 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-EGFR 항원 결합 도메인은, 서열번호 43, 서열번호 44, 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 경쇄 가변 영역, 및/또는 서열번호 45, 서열번호 46, 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 이의 가변 영역 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 항원 결합 단편은 EGFR을 인식하여 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 이중특이적 항체의 항-TAA 항원 결합 도메인은 BCMA, 즉 항-BCMA 항원 결합 도메인을 인식하여 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 하기 CDR 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다: 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL1; 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL2; 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL3; 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH1; 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH2; 및 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH3. 추가 실시양태에서, 이의 CDR 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 항원 결합 단편은 BCMA를 인식하여 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA 항원 결합 도메인은 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 경쇄 가변 영역, 및/또는 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 이의 가변 영역 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 항원 결합 단편은 BCMA를 인식하여 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 이중특이적 항체의 항-TAA 항원 결합 도메인은 CS1, 즉 항-CS1 항원 결합 도메인을 인식하여 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-CS1 항원 결합 도메인은 하기 CDR 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다: 서열번호 71 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL1; 서열번호 72 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL2; 서열번호 73 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRL3; 서열번호 74 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH1; 서열번호 75 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CDRH2; 및 서열번호 76 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진 CDRH3. 추가 실시양태에서, 이의 CDR 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진 항원 결합 단편은 CS1을 인식하여 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-CS1 항원 결합 도메인은 서열번호 77, 서열번호 154, 서열번호 78 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 경쇄 가변 영역, 및/또는 서열번호 79, 서열번호 149, 서열번호 80, 서열번호 150 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 이의 가변 영역 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진 항원 결합 단편은 CS1을 인식하여 결합한다.
일부 실시양태에서, 항-NKG2D 항원 결합 도메인은 하기 상보성 결정 영역(CDR) 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개 모두를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다: SGSSSNIGNNAVN(서열번호 6) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 경쇄 상보성-결정 영역 1(CDRL1); YDDLLPS(서열번호 7) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDRL2); AAWDDSLNGPV(서열번호 8) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDRL3); GFTFSSY(서열번호 9) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDRH1); RYDGSN(서열번호 10) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDRH2); 및 DRGLGDGTYFDY(서열번호 11) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDRH3). 추가 실시양태에서, 이의 CDR 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 항원 결합 단편은 NKG2D를 인식하여 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-NKG2D 항원 결합 도메인은
QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTS
AFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL(서열번호 12) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 경쇄 가변 영역; 및/또는
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTIS
RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS(서열번호 13) 또는 이들 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 중쇄 가변 영역
을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 이의 가변 영역 등가물(들), 및/또는 등가물(들)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 항원 결합 단편은 NKG2D를 인식하여 결합한다.
일부 실시양태에서, CDR, 가변 영역, 항원 결합 도메인 또는 항체 등의 참조 단백질 또는 폴리펩티드의 등가물은 참조 단백질 또는 폴리펩티드와 적어도 80%, 또는 적어도 85% 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 실시양태에서, CDR, 가변 영역, 항원 결합 도메인 또는 항체 등의 참조 단백질 또는 폴리펩티드의 등가물은 참조 단백질 또는 폴리펩티드의 C 말단으로부터 N 말단까지의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 이러한 등가물은 또한 본 명세서에서 역 서열(reverse sequence)로 지칭된다. 예를 들면, KASQDVITGVA(서열번호 71) 및 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 참조 단백질 또는 폴리펩티드는 AVGTIVDQSAK(서열번호 151)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 참조 단백질 또는 폴리펩티드로서 CDR, 가변 영역, 항원 결합 도메인 또는 항체의 실시양태에서, 등가물은 여전히 참조의 동일한 에피토프를 인식하여 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항원 결합 도메인은, 예를 들면, 2개의 CDR 사이 및/또는 이의 경쇄 가변 영역 또는 이의 등가물과 이의 중쇄 가변 영역 또는 이의 등가물 사이에 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 펩티드 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 14) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14의 등가물은 1 내지 50개 아미노산 길이, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14의 등가물은 글리신이 풍부하지만, 이는 또한 세린 또는 트레오닌을 함유할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14의 등가물은 (GGGGS)n을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지고, 여기서 n은 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13, 또는 14, 또는 15 또는 그 이상의 정수일 수 있다(서열번호 134 내지 135, 14 및 136 내지 147).
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체(BsAb)는 임의로 이의 N 말단에 신호 펩티드를 추가로 포함하고, 이는 임의로 이중특이적 항체를 BsAb 또는 BsAb-CAR 발현 세포로부터 분비시키도록 지시하고/하거나, 이중특이적 항체, 이의 단편 또는 등가물의 분비를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 이중특이적 항체의 N 말단, 예를 들면, 이중특이적 항체의 항원 결합 도메인의 둘 다에 대한 N 말단 측에 위치한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 IL2 신호 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 MYRMQLLSCIALSLALVTNS(서열번호 4) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 서열번호 4의 등가물은 여전히 이중특이적 항체가 BsAb 또는 BsAb-CAR 발현 세포로부터 분비되도록 지시하고/하거나 이중특이적 항체, 이의 단편 또는 등가물의 분비를 촉진한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 서열번호 4의 등가물은 서열번호 4와 적어도 80%(예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일하다. 신호 펩티드가 단백질을 BsAb 또는 BsAb-CAR 발현 세포로부터 분비되도록 지시하는지의 여부를 검출하는 방법은 세포 배양물의 상청액에서 이러한 단백질을 나타내는 면역염색 등의 당업자에게 이용 가능하다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체(BsAb)는 검출가능한 또는 정제 마커를 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 검출가능한 마커는 YPYDVPDYA(서열번호 84)를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항원 결합 도메인은 면역글로불린, 이의 돌연변이체, 또는 이의 등가물의 단편 결정화가능(Fc) 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 영역 또는 이의 돌연변이체는 인간 Fc 영역 또는 이의 돌연변이체이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역 또는 이의 돌연변이체는 조류(예: 닭), 뮤린, 또는 소과, 또는 돼지과(swine), 낙타과, 또는 라마, 또는 상어 Fc 영역 또는 이의 돌연변이체이다. 일 실시양태에서, Fc 영역은
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK
NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 81) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK
NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 82), 또는 서열번호 81의 아미노산(aa) 16, aa 17 및 aa 79에 상응하는 위치에 돌연변이체를 갖는 Fc 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, Fc 등가물, 변이체 또는 돌연변이체는 면역 세포 및/또는 혈소판 상의 Fc 수용체에 결합한다. 추가적으로 또는 대안적으로, Fc 등가물, 변이체, 또는 돌연변이체는 상보체 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 등가물은 이의 참조와 비교하여 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13, 또는 14, 또는 15개 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 2개의 항원 결합 도메인 사이에 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 인간 근육 알돌라제(HMA)로부터 유래하고, 임의로 PSGQAGAAASESLFVSNHAY(서열번호 83)를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 일 실시양태에서, 펩티드 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 14) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14의 등가물은 1 내지 50개 아미노산 길이, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14의 등가물은 글리신이 풍부하지만, 이는 또한 세린 또는 트레오닌을 함유할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14의 등가물은 (GGGGS)n을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지고, 여기서 n은 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13, 또는 14, 또는 15 또는 그 이상의 정수일 수 있다(서열번호 134 내지 135, 14 및 136 내지 147). 일부 실시양태에서, 여기서 펩티드 링커는 절단 가능한 펩티드이다. 추가 실시양태에서, 여기서 펩티드 링커는 자가-절단 펩티드이다. 또 다른 실시양태에서, 여기에서 펩티드 링커는 T2A 펩티드이고, 이는 임의로 HVGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 85) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 서열번호 85의 등가물은 서열번호 85와 비교하여 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13, 또는 14, 또는 15, 또는 그 이상의 돌연변이체를 포함하고, 여전히 자가-절단이 가능하여 단일 폴리펩티드로부터 2개의 생성물을 방출할 수 있다. 이러한 자가-절단을 평가하는 방법은, 예를 들면, 생성물 및/또는 폴리펩티드의 분자 크기를 검출하는 웨스턴 블롯을 통한 것 등의 당업자가 이용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는, 임의로 N 말단으로부터 C 말단까지, 임의의 신호 펩티드, 항-TAA 중쇄 가변 영역, 제1 임의의 펩티드 링커, 항-TAA 경쇄 가변 영역, 임의의 Fc 영역 또는 이의 돌연변이체 또는 이들 각각의 등가물, 제2 임의의 펩티드 링커, 항-NKG2D 중쇄 가변 영역, 제3 임의의 펩티드 링커, 항- NKG2D 경쇄 가변 영역, 임의의 Fc 영역 또는 이의 돌연변이체 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는, 임의로 N 말단으로부터 C 말단까지, 임의의 신호 펩티드, 항-TAA 중쇄 가변 영역, 제1 임의의 펩티드 링커, 항-TAA 경쇄 가변 영역, 임의의 Fc 영역 또는 이의 돌연변이체 또는 이들 각각의 등가물, 제2 임의의 펩티드 링커, 항-NKG2D 경쇄 가변 영역, 제3 임의의 펩티드 링커, 항- NKG2D 중쇄 가변 영역, 임의의 Fc 영역 또는 이의 돌연변이체 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는, 임의로 N 말단으로부터 C 말단까지, 임의의 신호 펩티드, 항-TAA 경쇄 가변 영역, 제1 임의의 펩티드 링커, 항-TAA 중쇄 가변 영역, 임의의 Fc 영역 또는 이의 돌연변이체 또는 이들 각각의 등가물, 제2 임의의 펩티드 링커, 항-NKG2D 중쇄 가변 영역, 제3 임의의 펩티드 링커, 항- NKG2D 경쇄 가변 영역, 임의의 Fc 영역 또는 이의 돌연변이체 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는, 임의로 N 말단으로부터 C 말단까지, 임의의 신호 펩티드, 항-TAA 경쇄 가변 영역, 제1 임의의 펩티드 링커, 항-TAA 중쇄 가변 영역, 임의의 Fc 영역 또는 이의 돌연변이체 또는 이들 각각의 등가물, 제2 임의의 펩티드 링커, 항-NKG2D 경쇄 가변 영역, 제3 임의의 펩티드 링커, 항-NKG2D 중쇄 가변 영역, 임의의 Fc 영역 또는 이의 돌연변이체 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체의 C 말단에서 항원 결합 도메인의 가변 영역은 역 서열, 즉, 단일특이성 항체에 존재하는 경우, 가변 영역 서열의 C 말단으로부터 N 말단까지를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 이중특이적 항체의 N 말단에서 항원 결합 도메인은 Fc 영역 또는 이의 돌연변이체 또는 이들 각각의 등가물을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 추가 실시양태에서, 이중특이적 항체의 C 말단에서 항원 결합 도메인은 Fc 영역 또는 이의 돌연변이체 또는 이들 각각의 등가물을 추가로 포함하지 않는다.
또한, 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예: 단리된 및/또는 조작된 폴리펩티드) 및/또는 단리된 핵산이 제공된다. 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 필요한 조절 서열, 예를 들면, 숙주 세포, 예를 들면, T 세포 또는 NK 세포 등의 포유동물 또는 인간 숙주 세포에서의 발현을 위한 프로모터 및/또는 인핸서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 CAR의 발현을 지시하는 제1 조절 서열을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 조절 서열은 프로모터, 인트론, 인핸서 또는 폴리아데닐화 신호 중의 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CMV 또는 EF1 알파 프로모터이다. 추가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 단리된 핵산은, BsAb 코딩 폴리뉴클레오티드로부터 하류에 위치하고, 별도의 조절 요소(제2 조절 서열), 예를 들면, EF1알파 프로모터로부터 임의로 선택된 프로모터로부터 조절될 수 있는 GFP 등의 검출가능한 또는 정제 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 프로모터(들)는 숙주 발현 시스템을 위해 선택된다. 도 3A에 도시된 바와 같이, 작제물은 자가-절단 2A 유전자인 T2A를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은, HSV-TK(단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제), 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 카복실에스테라제, 시토크롬 P450 또는 PNP(퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제), 절단된 EGFR 또는 유도성 카스파제("iCasp") 중의 하나 이상으로부터 임의로 선택된 자살 유전자 산물을 코딩하는 자살 유전자를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 자살 유전자 산물의 발현을 지시하는 제3 조절 서열을 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 조절 서열 중의 임의의 1개 또는 2개 또는 3개는 세포에서 유도 가능 또는 구성적으로 활성이다. 일 실시양태에서, 조절 서열 중 임의의 1개 또는 2개 또는 3개는 세포 특이적 또는 조직 특이적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 하기 중의 하나 이상을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다:
(I) 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 86, 서열번호 87 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(II) 링커 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 88을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(V) 절단 가능한 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
CACGTGGGTTCTGGAGAAGGACGCGTTCTTGTTGACGTGTGGCGATGTAGAGGAAAATCCGGGTCCA(서열번호 91) 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(VI) 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 92 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(VII) 항-BCMA 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택되는, 뉴클레오티드 서열; (VIII) 항-BCMA 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 100 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택되는, 뉴클레오티드 서열;
(IX) 항-NKG2D 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 101 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(X) 항-NKG2D 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 102 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(XI) 항-FLT3 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 103, 서열번호 104 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(XII) 항-FLT3 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 105, 서열번호 106 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열;
(XIII) 항-CS1 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 107 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열; 및
(XIV) 항-CS1 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 108 또는 이의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 뉴클레오티드 서열.
일부 실시양태에서, 참조 뉴클레오티드 서열의 등가물은 참조의 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 참조 뉴클레오티드 서열의 등가물은 참조와 적어도 80%(예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일하다. 추가로 또는 대안적으로, 참조 뉴클레오티드 서열의 등가물은 높은 엄격성의 조건하에 참조의 상보체에 하이브리드화한다. 일부 실시양태에서, 높은 엄격성의 조건은 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1× SSC 내지 약 0.1× SSC의 완충액 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아미드 농도; 및 약 1× SSC, 0.1× SSC 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함한다. 또한, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드에 대해 역, 상보 또는 역-상보인 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 검출가능한 또는 정제 마커 및/또는 검출가능한 또는 정제 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다.
폴리뉴클레오티드 및/또는 단리된 핵산은 발현 벡터, 예를 들면, 렌티바이러스 벡터 등의 벡터 내로 5' 및 3' LTR의 사이에 삽입될 수 있다. 도 1B는 본 개시의 예시적 렌티바이러스 벡터 작제물이고, 일 측면에서 항종양 또는 항암 항체의 항원 결합 도메인은 항-BMCA 항체 이외의 것이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 작제물은 마커 펩티드 또는 정제 마커를 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 등의 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터의 그룹으로부터 임의로 선택된 바이러스 벡터이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 벡터는 폴리뉴클레오티드 및/또는 단리된 핵산을 코딩하는 항체의 복제 및/또는 발현을 지시하는 조절 서열을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 조절 서열은 프로모터, 인트론, 인핸서 또는 폴리아데닐화 신호 중의 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 검출가능한 또는 정제 마커를 추가로 포함한다.
BsAb -CAR 작제물
따라서, 일 측면에서, 본 명세서에서 제공된 것은, (a) 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인; (b) 힌지 도메인; (c) 막관통 도메인; 및 (d) 세포내 도메인, 및 NKG2D 항원 결합 도메인 및 CAR의 항원 결합 도메인과 동일한 세포 유형에 결합하도록 선택된 제2 항원 결합 도메인을 하나의 요소로서 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 이중특이적 항체를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 BsAb-CAR(또한 본 명세서에서 BsAb-CAR 작제물, BsAb-CAR 폴리펩티드 또는 폴리펩티드로도 지칭됨)이다. 일 측면에서, 본 명세서에 개시된 CAR 및 본 명세서에 개시된 이중특이적 항체를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진 폴리펩티드가 제공된다. 일 측면에서, (i)(1)암 세포 상의 제1 종양 관련 항원(TAA)을 인식하고 결합하는 항원 결합 도메인(제1 항-TAA 항원 결합 도메인)으로서, 단, 상기 제1 TAA는 B-세포 성숙 항원(BCMA)이 아닌, 항원 결합 도메인; (2) 힌지 도메인; (3) 막관통 도메인; 및 (4) 세포내 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 키메라 항원 수용체(CAR)의 아미노산 서열; 및 (ii)(1) 암 세포 상의 제2 TAA를 인식하고 결합하는 항원 결합 도메인(제2 항-TAA 항원 결합 도메인); 및 (2) NKG2D를 인식하고 결합하는 항원 결합 도메인(항-NKG2D 항원 결합 도메인)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 이중특이적 항체를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는, 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 측면에서, (i)(1) BCMA를 인식하고 결합하는 항원 결합 도메인(항-BCMA 항원 결합 도메인); (2) 힌지 도메인; (3) 막관통 도메인; 및 (4) 세포내 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 CAR의 아미노산 서열; 및 (ii)(1) NKG2D를 인식하고 결합하는 항원 결합 도메인(항-NKG2D 항원 결합 도메인) 및 (2) CS1을 인식하고 결합하는 항원 결합 도메인(항-CS1 항원 결합 도메인)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 폴리펩티드가 제공된다. CAR 요소는 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 또한 BsAb-CAR 작제물의 BsAb 부분의 전에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD28 공자극 신호전달 영역 및/또는 4-1BB 공자극 도메인을 포함할 수 있거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어질 수 있는 1개 이상, 또는 2개 이상의 공자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 TAA 및 제2 TAA는 동일한 암 또는 종양의 유형 및/또는 세포에서 발현된다.
특정 실시양태에서, 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인은 링커 펩티드에 의해 임의로 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 B-세포 성숙 항원(BCMA) 및/또는 SLAMF7(또한 CS1 또는 CD319로도 공지됨) 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 종양 표적화 항체는 BCMA를 표적으로 하고, 이중특이적 항체는 동일한 세포 또는 종양 유형, 예를 들면, 교모세포종, MM 또는 AML을 표적화 또는 결합한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 B-세포 성숙 항원(BCMA) 중 어느 하나에 대한 항체의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지고, 이중특이적 항체는 CDR, 중쇄 및 경쇄, 또는 항-SLAMF7 항체(항-CS1 또는 항-CD319 항체로도 공지됨)의 scFv 및/또는 Fv 단편, 및/또는 이들 각각의 등가물 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작제물의 CAR 부분은 신호전달 도메인 및/또는 신호 펩티드를 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 제1 TAA는 BCMA이고, 제2 TAA는 CS1이다. 일부 실시양태에서, 제1 TAA는 CS1이고, 제2 TAA는 BCMA이다.
일부 실시양태에서, BsAb는 항-FLT3 항체의 항원 결합 도메인을 포함하고, BsAb 부분은 항-NKG2D의 항원 결합 도메인 및 항-CD123 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 이 BsAb는 AML의 치료를 위한 요법이고, 이 BsAb CAR을 작제 및 사용하는 방법은 본 개시의 범위 내에 있다. BsAb의 유효량은 AML을 앓고 있는 환자에게 투여된다. 이러한 방법은 AML을 진단하고 치료 및 독성을 모니터링하기 위한 적절한 진단 방법으로 보완될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TAA는 FLT3이고, 제2 TAA는 CD123이다. 일부 실시양태에서, 제1 TAA는 CD123이고, 제2 TAA는 FLT3이다.
일부 실시양태에서, BsAb는 항-EGFR 항체의 항원 결합 도메인을 포함하고, BsAb 부분은 항-NKG2D의 항원 결합 도메인 및 항-IL13Ra2 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 이 BsAb는 교모세포종의 치료를 위한 요법이고, 이 BsAb CAR을 작제 및 사용하는 방법은 본 개시의 범위 내에 있다. 유효량의 BsAb는 교모세포종을 앓고 있는 환자에게 투여된다. 투여는 국소적(두개내 투여) 또는 전신적일 수 있다. 이러한 방법은 교모세포종을 진단하고, 치료 및 독성을 모니터링하기 위한 적절한 진단 방법으로 보완될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TAA는 EGFR이고, 제2 TAA는 IL13Ra2이다. 일부 실시양태에서, 제1 TAA는 IL13Ra2이고, 제2 TAA는 EGFR이다.
특정 실시양태에서, BsAb-CAR 작제물은 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 위치한 링커 폴리펩티드를 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 추가로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 NDG2D의 항체 단편과 기타 항원 결합 부분, 예를 들면, 항-CS1, 항-CD123 또는 항-IL13Ra2 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, 링커는 글리신-세린 링커이다. 추가 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 서열(글리신-세린)n을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지고, 여기서 n은 1 내지 6의 정수(서열번호 110), 예를 들면, n은 4이다. 일부 실시양태에서, BsAb-CAR은 암 또는 종양 세포와 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편과, 예를 들면, BMCA CAR과 NKG2D 항원 결합 도메인 사이의 이중특이적 항체 사이에 위치하는 T2A 펩티드 등의 자가-절단 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, BsAb-CAR은, 예를 들면, NKG2D와, 암 또는 종양 항원, 예를 들면, CS1에 결합하는 제2 항원 결합 도메인 사이에 위치하는 T2A 펩티드 등의 자가-절단 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 CAR 요소는 신호전달 도메인을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 신호전달 펩티드는 항-NKG2D 항체의 NKG2D 항원 결합 도메인 전에 위치한다. 일부 실시양태에서, 이 CAR 요소는 신호 펩티드를 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 제1 TAA 및 제2 TAA 중 어느 하나 또는 둘 모두는 FLT3, CD19, 메조텔린, 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 암배아성 항원(CEA), CD33, GTPase-활성화 단백질(GAP), 강글리오사이드 G2(GD2), CD5, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1(ROR1), CD123, CD70, CD38, 뮤신 1, (Muc1), 에프린 A형 수용체 2 전구체(EphA2), 상피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRVIII), 인터류킨 13 수용체 알파 2(IL13Ra2), CD133, 글리피칸 3(GPC3), 상피 세포 부착 분자 전구체(EpCam ), 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 암/정소(CT), 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2C), 종양-관련 당단백질-72(TAG-72), 티미딘 키나제 1(TK1) 및 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT1)이거나, 이들로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, BsAb-CAR 작제물(본 명세서에서 폴리펩티드로도 지칭됨)은 하기 중 임의의 2개 사이에 위치하는 펩티드 링커를 추가로 포함한다: CAR; 이중특이적 항체; 및 임의의 자살 유전자 산물. 일부 실시양태에서, BsAb-CAR 작제물은 CAR과 BsAb 사이에 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 여기서의 펩티드 링커는 절단 가능한 펩티드이다. 추가 실시양태에서, 여기서의 펩티드 링커는 자가-절단 펩티드이다. 또 다른 실시양태에서, 여기서의 펩티드 링커는 HVGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 85) 또는 이의 등가물을 임의로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 T2A 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 85의 등가물은 서열번호 85와 비교하여 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13, 또는 14, 또는 15, 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하고, 여전히 자가-절단이 가능하고, 따라서 단일 폴리펩티드로부터 2개의 산물을 방출할 수 있다. 이러한 자가-절단을 평가하는 방법은, 예를 들면, 생성물 및/또는 폴리펩티드의 분자 크기를 검출하는 웨스턴 블롯을 통해 당업자가 이용할 수 있다.
일부 실시양태에서, BsAb-CAR 작제물(본 명세서에서 폴리펩티드로도 지칭됨)은 검출가능한 마커 또는 정제 마커를 추가로 포함한다.
이들 BsAb-CAR 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터가 추가로 제공된다.
일부 실시양태에서, BsAb-CAR은 도 1E에 부분적으로 제시된 구조, 즉 BCMA CAR, T2A, NKG2D scFv 및 Fc 폴리펩티드 등의 자가-절단 펩티드, T2A 등의 제2 자가-절단 펩티드, CS1 scFv 및 Fc 폴리펩티드를 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지는 단일 BsAb-CAR를 포함한다. BCMA CAR은 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 성분은 신호전달 도메인을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, BsAb-CAR 작제물은 아미노(N) 말단에 및/또는 항-NKG2D 항원 결합 도메인 전에 위치하는 신호 펩티드를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 예시적 IgG1 신호 펩티드가 본 명세서에 제공되지만, 다른 것들은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이 펩티드를 대체할 수 있다. 이들 BsAb-CAR 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터가 추가로 제공된다.
일부 실시양태에서, BsAb-CAR은 도 1F에 부분적으로 제시된 구조, 즉 BCMA 항원 결합 폴리펩티드, T2A, NKG2D scFv 및 Fc 폴리펩티드 등의 자가-절단 펩티드, HMA 폴리펩티드, 및 CS1 scFv 및 Fc 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지는 단일 BsAb-CAR을 포함한다. BCMA CAR은 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, BCMA CAR은 아미노(N) 말단에 또는 항-NKG2D 항원 결합 도메인 전에 위치하는 신호 펩티드를 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 예시적 IgG1 신호 펩티드가 본 명세서에 제공되지만, 다른 것들은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이 펩티드를 대체할 수 있다. 이들 BsAb-CAR 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터가 추가로 제공된다.
일부 실시양태에서, BsAb-CAR은 도 1G에 부분적으로 제시된 구조, 즉, (a) BCMA 항원 결합 폴리펩티드, T2A, NKG2D scFv 및 Fc 폴리펩티드 등의 자가-절단 펩티드, G4S 폴리펩티드 등의 링커(서열번호 134), 및 CS1 scFv 및 Fc 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지는 단일 Bs-Ab CAR을 포함한다. BCMA는 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 추가로 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 아미노 말단에 또는 항-NKG2D 항원 결합 도메인 전에 위치하는 신호 펩티드를 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 예시적 IgG1 신호 펩티드가 본 명세서에 제공되지만, 다른 것들은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이 펩티드를 대체할 수 있다. 이들 BsAb-CAR 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터가 추가로 제공된다.
추가 측면에서, 본 명세서에 제공된 것은, 하나의 작제물에서, 상기 개시된 CAR 작제물 및 이중특이적 항체("BsAb-CAR 작제물")를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 단리된 및/또는 조작된 폴리펩티드) 및/또는 단리된 핵산이다. 항원 결합 도메인은 임의의 적절한 종, 예를 들면, 뮤린, 인간 또는 인간화된 서열로부터 유래할 수 있다. 일 측면에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 단리된 핵산은 BCMA 및 이중특이적 항체 이외의 암 또는 종양 항원을 표적으로 하는 항원 결합 단편, 예를 들면, 인간 근육 알도스(HMA) 등의 비-면역원성 단백질 링커에 의해 함께 연결된, 항-CS1 항체로부터의 하나의 scFv 및 항-NKG2D로부터의 하나의 scFv를 코딩한다. 일부 실시양태에서, CAR 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 BsAb를 코딩하는 핵산의 5' 측에 위치한다. 추가 실시양태에서, T2A 코딩 요소는 5' 측에 위치하는 CAR 폴리뉴클레오티드와 3' 측에 위치한 BsAb 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, CAR 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 BsAb를 코딩하는 핵산의 3' 측에 위치한다. 추가 실시양태에서, T2A 코딩 요소는 3' 측에 위치한 CAR 폴리뉴클레오티드와 5' 측에 위치하는 BsAb 사이에 위치한다. 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 필요한 조절 서열, 예를 들면, 숙주 세포, 예를 들면, 포유동물 또는 인간 숙주 세포, 예컨대, T 세포 또는 NK 세포에서의 발현을 위한 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 BsAb-CAR 작제물의 발현을 지시하는 제1 조절 서열을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 조절 서열은 프로모터, 인트론, 인핸서 또는 폴리아데닐화 신호 중의 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 측에 위치하는 EF1a 또는 CMV 프로모터이다. 추가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 단리된 핵산은 검출가능한 또는 정제 마커, 및/또는 BsAb 폴리뉴클레오티드로부터 하류에 있고 별도의 조절 요소(제2 조절 서열), 예를 들면, 프로모터, 임의로 EF1알파 프로모터의 조절하에 있을 수 있는 GFP 등의 검출가능한 또는 정제 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 프로모터(들)는 숙주 발현 시스템을 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 HSV-TK(단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제), 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 카복실에스테라제, 시토크롬 P450 또는 PNP(퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제), 절단된 EGFR 또는 유도성 카스파제("iCasp") 중의 하나 이상으로부터 임의로 선택된 자살 유전자 산물을 코딩하는 자살 유전자를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 자살 유전자 산물의 발현을 지시하는 제3 조절 서열을 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 조절 서열 중 임의의 1개 또는 2개 또는 3개는 세포에서 유도 가능하거나, 구성적으로 활성이다. 일 실시양태에서, 조절 서열 중 임의의 1개 또는 2개 또는 3개는 세포 특이적 또는 조직 특이적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산은 본 명세서에 개시된 CAR 코딩 폴리뉴클레오티드 및 본 명세서에 개시된 이중특이적 항체 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CAR 코딩 폴리뉴클레오티드 및 이중특이적 항체 코딩 폴리뉴클레오티드는 인접한다. 일부 실시양태에서, CAR 코딩 폴리뉴클레오티드 및 이중특이적 항체 코딩 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 바와 같은 절단 가능한 펩티드를 코딩하는 서열에 의해 함께 연결된다. 또한, 본 명세서에 개시된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드에 대해 역, 상보 또는 역-상보인 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 검출가능한 또는 정제 마커 및/또는 검출가능한 또는 정제 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다.
본 명세서의 임의의 개시와 관련된 일부 실시양태에서, 조절 서열은 프로모터, 인트론, 인핸서 또는 폴리아데닐화 신호 중의 하나 이상을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다.
폴리뉴클레오티드 및/또는 단리된 핵산은 발현 벡터, 예를 들면, 렌티바이러스 벡터 등의 벡터 내로 5' 및 3' LTR 사이에 삽입될 수 있다. 도 3A는 본 개시의 예시적 렌티바이러스 벡터 작제물이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 작제물은 마커 펩티드 또는 정제 마커를 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 등의 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터의 그룹으로부터 임의로 선택된 바이러스 벡터이다. 추가로 또는 대안적으로, 벡터는 폴리뉴클레오티드 및/또는 단리된 핵산을 코딩하는 BsAb-CAR의 복제 및/또는 발현을 지시하는 조절 서열을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 조절 서열은 프로모터, 인트론, 인핸서 또는 폴리아데닐화 신호 중의 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 검출가능한 또는 정제 마커를 추가로 포함한다.
CAR를 제조하기 위한 숙주 세포 및 프로세스
본 개시의 측면은 세포(본 명세서에서 숙주 세포로도 지칭됨), 예를 들면, CAR, BsAb 및/또는 BsAb-CAR을 포함하는 단리된 및/또는 조작된 세포, 및 이러한 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 일 측면에서, 하기 중의 하나 이상을 포함하는 단리된 또는 조작된 세포가 제공된다: 본 명세서에 개시된 폴리펩티드, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드, 또는 본 명세서에 개시된 벡터. 세포는 원핵 또는 진핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T-세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 단핵구, 마크로파지, 이의 임의의 서브세트, 또는 임의의 기타 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T-세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 단핵구, 마크로파지로부터 임의로 선택된 면역 세포이다. 추가 실시양태에서, 면역 세포는 조혈 줄기 세포(HSC) 및/또는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유래한다. 진핵 세포는 임의의 바람직한 종, 예를 들면, 동물 세포, 인간 등의 포유동물 세포, 소과 세포, 뮤린 세포, 말과 세포, 고양이과 세포 또는 개과 세포로부터 유래할 수 있다. 세포는 환자, 공여자 또는 기성품 등의 세포주로부터 유래할 수 있다. 세포는 치료되는 대상체에 대해 자가 또는 동종이계일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 검출가능한 또는 정제 마커를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 본 명세서에 개시된 CAR을 발현한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 세포는 본 명세서에 개시된 이중특이적 항체를 발현한다. 추가 실시양태에서, 세포는 세포 외부에서 이중특이적 항체를 분비한다. 또한, 본 명세서에 개시된 세포를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어지는 세포 집단이 제공된다. 추가 실시양태에서, 세포 집단은 실질적으로 균질하다.
특정 실시양태에서, 단리된 세포는, 암 또는 종양 항체의 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD28 공자극 신호전달 영역 및/또는 4-1BB 공자극 신호전달 영역, 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는, 외인성(예를 들면, 세포 또는 세포의 종에 대해) CAR 또는 BsAb CAR을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어진다. 별도의 실시양태에서, 단리된 세포는 본 명세서에 개시된 BsAb를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 본 명세서에 개시된 BsAb를 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리된 세포는 T-세포, 예를 들면, 동물 T-세포, 포유동물 T-세포, 고양이과 T-세포, 개과 T-세포 또는 인간 T-세포이다. 특정 실시양태에서, 단리된 세포는 NK 세포, 예를 들면, 동물 NK 세포, 포유동물 NK 세포, 고양이과 NK 세포, 개과 NK 세포 또는 인간 NK 세포이다. 특정 실시양태에서, 단리된 세포는 NKT 세포, 예를 들면, 동물 NKT 세포, 포유동물 NKT 세포, 고양이과 NKT 세포, 개과 NKT 세포 또는 인간 NKT 세포이다. 특정 실시양태에서, 단리된 세포는 B-세포, 예를 들면, 동물 B-세포, 포유동물 B-세포, 고양이과 B-세포, 개과 B-세포 또는 인간 B-세포이다. 수지상 세포, 골수 세포, 단핵구, 마크로파지, 이들의 임의의 서브세트 또는 기재된 바와 같은 T-세포, NK-세포, NTT-세포 및 B-세포 및/또는 기타 면역 세포와 관련하여 각각의 종에 대한 동일하거나 유사한 실시양태가 적용되는 것으로 이해된다. 일 측면에서, 세포는 유전자 편집 기술, 예를 들면, CRISPR 또는 TALEN을 사용하여 CD52 발현을 제거하도록 변형된 T 세포이다.
특정 실시양태에서, BsAb, CAR, 및/또는 CAR 또는 BsAb-CAR 발현 세포(임의로 BsAb를 분비함)를 생산하는 방법이 본 명세서에 개시되고, 이 방법은 본 명세서에 기재된 세포 또는 본 명세서에 기재된 세포 집단, 또는 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터 등의 BsAb, CAR, BsAb 및 CAR, 및/또는 BsAb CAR을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 단리된 세포의 집단을 형질도입하는 것을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 핵산 서열로 성공적으로 형질도입된 세포의 하위집단이 선택된다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포는 T 세포, 동물 T 세포, 포유동물 T 세포, 고양이과 T 세포, 개과 T 세포 또는 인간 T 세포이고, 이에 의해 BsAb, CAR, BsAb 및 CAR 및/또는 BsAb CAR T-세포를 생산한다. 특정 실시양태에서, 단리된 세포는 NK-세포, 예를 들면, 동물 NK-세포, 포유동물 NK-세포, 고양이과 NK-세포, 개과 NK-세포 또는 인간 NK-세포이고, 이에 의해 BsAb, CAR, BsAb 및 CAR 및/또는 BsAb CAR NK-세포를 생산한다. 특정 실시양태에서, 단리된 세포는 NKT-세포, 예를 들면, 동물 NKT-세포, 포유동물 NKT-세포, 고양이과 NKT-세포, 개과 NKT-세포 또는 인간 NKT-세포이고, 이에 의해 BsAb, CAR, BsAb 및 CAR 및/또는 BsAb CAR NKT-세포를 생산한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포는 B-세포, 동물 B-세포, 포유동물 B-세포, 고양이과 B-세포, 개과 B-세포 또는 인간 B-세포이고, 이에 의해 BsAb, CAR, BsAb 및 CAR 및/또는 BsAb CAR B-세포를 생산한다. 수지상 세포, 골수 세포, 단핵구, 마크로파지, 이들 또는 기재된 T-세포, NK-세포 및 B-세포의 임의의 서브세트, 및/또는 임의의 다른 면역 세포와 관련하여 각 종에 대한 동일하거나 유사한 실시양태가 적용되는 것으로 이해된다. 일부 실시양태에서, 세포는 조혈 줄기 세포(HSC), 유도 다능성 줄기 세포(iPSC), 또는 면역 세포로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 조혈 줄기 세포(HSC), 유도 다능성 줄기 세포(iPSC), 또는 면역 세포를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T-세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 단핵구, 또는 마크로파지로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 HSC 및/또는 iPSC로부터 유래한다. 일 실시양태에서, 세포는 유전자 편집 기술, 예를 들면, CRISPR 또는 TALEN을 사용하여 CD52 발현을 제거하도록 변형된 T 세포이다. 일 측면에서, 세포는 치료되는 대상체에 대해 자가 또는 동종이계이다.
단리된 세포의 공급원. 본 명세서에 개시된 세포의 확장 및 유전적 변형 이전에, 세포는, 예를 들면, 자가 요법을 수반하는 실시양태에서, 대상체, 또는 상업적으로 이용 가능한 세포주 또는 배양물, 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 등의 줄기 세포로부터 수득할 수 있다.
세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 포함하는 대상체의 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다.
관련 세포를 단리하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 본 출원에 용이하게 적용될 수 있으며; 예시적 방법은 하기 예에 기재되어 있다. 본 개시와 관련하여 사용하기 위한 단리 방법에는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) Dynabeads® 시스템; STEMcell 테크놀로지스 EasySep™, RoboSep™, RosetteSep™, SepMate™; 밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec) MACS™ 세포 분리 키트 및 기타 상업적으로 이용 가능한 세포 분리 및 분리 키트가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 면역 세포의 특정 아집단은 고유의 세포 표면 마커에 특이적인 이러한 키트에서 이용 가능한 비드 또는 기타 결합제를 사용함으로써 단리할 수 있다. 예를 들면, MACS™ CD4+ 및 CD8+ MicroBeads는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 단리하기 위해 사용할 수 있다. 공지된 기술에 따라 단리될 수 있는 세포의 대안의 비제한적 예는 벌크 T-세포, NK T-세포, 및 감마 델타 T-세포를 포함한다.
대안적으로, T-세포의 경우, 균주 BCL2(AAA) 주르카트(ATCC® CRL-2902™), BCL2(S70A) 주르카트(ATCC® CRL-2900™), BCL2(S87A) 주르카트(ATCC® CRL-2901™), BCL2 주르카트(ATCC® CRL-2899™), 네오 주르카트(ATCC® CRL-2898™); B 세포의 경우, 균주 AHH-1(ATCC® CRL-8146™), BC-1(ATCC® CRL-2230™), BC-2(ATCC® CRL-2231™), BC-3(ATCC® CRL-2277™), CA46(ATCC® CRL-1648™), DG-75[DG-75](ATCC® CRL-2625™), DS-1(ATCC® CRL-11102™), EB-3[EB3](ATCC® CCL-85™), Z-138(ATCC #CRL-3001), DB(ATCC CRL-2289), 톨레도(ATCC CRL-2631), 파이퍼(ATCC CRL-2632), SR(ATCC CRL-2262), JM-1(ATCC CRL-10421), NFS-5 C-1(ATCC CRL-1693); NFS-70 C10(ATCC CRL-1694), NFS-25 C-3(ATCC CRL-1695) 및 SUP-B15(ATCC CRL-1929); 및 NK 세포의 경우, 균주 NK-92(ATCC® CRL-2407™), NK-92MI(ATCC® CRL-2408™)를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 상업적으로 이용 가능한 세포 배양물에 의해 세포를 수득할 수 있다. 추가 예에는 성숙 T-세포주, 예를 들면, 데글리스(Deglis), EBT-8, HPB-MLp-W, HUT 78, HUT 102, Karpas 384, Ki 225, My-La, Se-Ax, SKW-3, SMZ-1 및 T34; 미성숙 T-세포주, 예를 들면, ALL-SIL, Be13, CCRF-CEM, CML-T1, DND-41, DU.528, EU-9, HD-Mar, HPB-ALL, H-SB2, HT-1, JK-T1, 주르카트, 카르파스(Karpas) 45, KE-37, KOPT-K1, K-T1, L-KAW, 루시(Loucy), MAT, MOLT-1, MOLT 3, MOLT-4, MOLT 13, MOLT-16, MT-1, MT-ALL, P12/이치카와(Ichikawa), 피어(Peer), PER0117, PER-255, PF-382, PFI-285, RPMI-8402, ST-4, SUP-T1 내지 T14, TALL-1, TALL-101, TALL-103/2, TALL-104, TALL-105, TALL-106, TALL-107, TALL-197, TK-6, TLBR-1, -2, -3 및 -4, CCRF-HSB-2(CCL-120.1), J.RT3-T3.5(ATCC TIB-153), J45.01(ATCC CRL-1990), J.CaM1.6(ATCC CRL-2063), RS4;11(ATCC CRL-1873), CCRF-CEM(ATCC CRM-CCL-119); 피부 T-세포 림프종 균주, 예를 들면, HuT78(ATCC CRM-TIB-161), MJ[G11](ATCC CRL-8294), HuT102(ATCC TIB-162); 역형성 및 대세포 림프종으로부터 유래하는 B 세포주, 예를 들면, DEL, DL-40, FE-PD, JB6, 카르파스(Karpas) 299, Ki-JK, Mac-2A Ply1, SR-786, SU-DHL-1, -2, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10 및 -16, DOHH-2, NU-DHL-1, U-937, 그란다(Granda) 519, USC-DHL-1, RL; 호지킨 림프종, 예를 들면, DEV, HD-70, HDLM-2, HD-MyZ, HKB-1, KM-H2, L 428, L 540, L1236, SBH-1, SUP-HD1 및 SU/RH-HD-I; 및 HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90 및 YT 등의 NK 균주를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. REH, NALL-1, KM-3, L92-221을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 눌(Null) 백혈병 세포주는, K562 적백혈병, THP-1 단핵구 백혈병, U937 림프종, HEL 적백혈병, HL60 백혈병, HMC-1 백혈병, KG-1 백혈병, U266 골수종 등의 기타 백혈병 및 림프종으로부터 유래하는 세포주와 마찬가지로, 또 다른 상업적으로 면역 세포 공급원이다. 이러한 상업적으로 입수가능한 세포주에 대한 비제한적 예시적 공급원에는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection), 또는 ATCC(atcc.org/) 및 독일 미생물 및 세포 배양물 컬렉션(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(dsmz.de/)이 포함된다.
일부 실시양태에서, 개시된 CAR을 발현하는 T-세포는 내인성 TCR의 발현을 감소 또는 제거하도록 추가로 변형될 수 있다. 내인성 TCR의 감소 또는 제거는 표적외 효과를 감소시키고, T 세포의 유효성을 증가시킬 수 있다. 기능적 TCR의 발현을 안정적으로 결여하는 T 세포는 다양한 접근법을 사용하여 생산할 수 있다. T 세포는, 전체 T 세포 수용체를 복합체로서 내재화하고, 분류하고, 분해하고, 반감기는 휴지 T 세포에서 약 10시간, 자극된 T 세포에서 3시간이다[참조: von Essen, M. et al. 2004. J. Immunol.173:384-393]. TCR 복합체가 적절하게 기능하기 위해서는, TCR 복합체를 구성하는 단백질의 적절한 화학량론적 비율이 필요하다. TCR 기능은 또한 ITAM 모티프를 갖는 2개의 기능 TCR 제타 단백질을 필요로 한다. 이의 MHC-펩티드 리간드의 관여에 의한 TCR의 활성화는 동일한 T 세포 상의 몇몇 TCR의 관여를 필요로 하고, 이들은 모두 적절하게 신호전달해야 한다. 따라서, TCR 복합체가, 적절하게 결합하지 않거나, 최적으로 신호전달할 수 없는 단백질로 불안정화하면, T 세포는 세포 반응을 개시하기에 충분히 활성화되지 않는다.
따라서, 일부 실시양태에서, TCR 발현은 RNA 간섭(예: shRNA, siRNA, miRNA 등), CRISPR, 또는 특정 TCR(예: TCR-α 및 TCR-β) 및/또는 1차 T 세포의 CD3 쇄를 코딩하는 핵산을 표적으로 하는 기타 방법을 사용하여 제거될 수 있다. 하나 이상의 이들 단백질의 발현을 차단함으로써, T 세포는 TCR 복합체의 하나 이상의 주요 성분을 생성하지 않게 되고, 이에 의해 TCR 복합체가 불안정화되고, 기능적 TCR의 세포 표면 발현이 방지될 것이다. RNA 간섭을 사용하면 일부 TCR 복합체를 세포 표면으로 재순환할 수 있지만, RNA(예: shRNA, siRNA, miRNA 등)는 TCR 단백질의 새로운 생성을 방지하여 전체 TCR 복합체의 분해 및 제거를 초래하고, 이는 기능적 TCR 발현이 안정하게 결여되어 있는 T 세포의 생산을 초래한다.
1차 T 세포에서 억제 RNA(예를 들면, shRNA, siRNA, miRNA 등)의 발현은 렌티바이러스 발현 시스템 등의 임의의 종래의 발현 시스템을 사용하여 달성될 수 있다. 렌티바이러스는 휴지 중의 1차 T 세포를 표적으로 하는 데 유용하지만, 모든 T 세포가 shRNA를 발현하는 것은 아니다. 이들 T 세포 중 일부는 T 세포의 기능적 활성을 변화시키기 위해 TCR 발현의 충분한 억제를 가능하게 하기에 충분한 양의 RNA를 발현하지 않을 수 있다. 따라서, 바이러스 형질도입 후에 중등도 내지 높은 TCR 발현을 유지하는 T 세포는, 예를 들면, 세포 선별 또는 분리 기술에 의해 제거될 수 있고, 그 결과, 잔류하는 T 세포는 세포 표면 TCR 또는 CD3가 결핍되어, 기능적 TCR 또는 CD3의 발현이 결핍되어 있는 T 세포의 단리된 집단의 확장이 가능해진다.
1차 T 세포에서 CRISPR의 발현은 종래의 CRISPR/Cas 시스템과 표적 TCR에 특이적인 가이드 RNA를 사용하여 달성할 수 있다. 적합한 발현 시스템, 예를 들면, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 발현 시스템은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 억제제 RNA의 전달과 유사하게, CRISPR 시스템을 사용하여, 휴지 중의 1차 T 세포 또는 CAR 세포 치료에 적합한 기타 면역 세포를 특이적으로 표적으로 할 수 있다. 추가로, CRISPR 편집이 실패하는 정도에서, 상기 방법에 따라 성공하도록 세포를 선택할 수 있다. 예를 들면, 상기 언급한 바와 같이, 바이러스 형질도입 후에 중등도 내지 높은 TCR 발현을 유지하는 T 세포는, 예를 들면, 세포 선별 또는 분리 기술에 의해 제거될 수 있고, 그 결과, 잔류하는 T 세포는 세포 표면 TCR 또는 CD3가 결핍되어, 기능적 TCR 또는 CD3의 발현이 결핍되어 있는 T 세포의 단리된 집단의 확장을 가능하게 한다. 추가로, CRISPR 편집 작제물은 내인성 TCR을 녹아웃시키는 것과 본 명세서에 개시된 CAR 작제물을 녹아웃시키는 것의 둘 모두에 유용할 수 있음이 이해된다. 따라서, CRISPR 시스템은 이러한 목적 중 하나 또는 둘 다를 달성하도록 설계될 수 있음을 이해해야 한다.
벡터. CAR 세포는 벡터를 사용하여 제조할 수 있다. 본 개시의 측면은, (i) CAR 또는 (ii) 면역조절 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 단리된 핵산 서열, 및 이들 핵산 및/또는 이들 각각의 상보체 및/또는 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어지는 벡터에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, CAR 성분을 코딩하는 단리된 핵산 서열은 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD28 공자극 신호전달 영역 및/또는 4-1BB 공자극 신호전달 영역, 및 CD3 제타 신호전달 영역을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 단리된 핵산 서열은 (a) 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인, 이어서 (b) CD8α 힌지 도메인, (c) CD8α 막관통 도메인, 이어서 (d) CD28 공자극 신호전달 영역 및/또는 4-1BB 공자극 신호전달 영역, 이어서 (e) CD3 제타 신호전달 도메인을 코딩하는 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어진다.
일부 실시양태에서, CAR 성분을 코딩하는 단리된 핵산 서열은 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인을 코딩하는 서열의 상류에 Kozak 컨센서스 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어진다.
일 측면에서, 항원 결합 도메인은 BCMA, FLT3 또는 EGFR 또는 대안적으로 CD19, CD123 또는 IL13Ra2를 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 HER2를 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 PSCA를 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 CEA를 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 GAP를 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 GD2를 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 CD5를 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 PSMA를 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 ROR1을 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 CD123을 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 CD70을 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 CD38을 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 Muc1을 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 EphA2를 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 EGFRVIII을 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 IL13Ra2를 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 CD133을 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 GPC3을 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 EpCam을 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 FAP를 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 VEGFR2를 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 암/정소 항원을 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 GUCY2C를 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 TAG-72를 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 TK1을 표적으로 한다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 HPRT1을 표적으로 한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 관련 CDR 영역 또는 scFv, 또는 NKG2D에 대한 항체의 scFv 및 Fv, 및 임의로 항-SLAMF7(또한 CS1 또는 CD319로도 공지됨), 예를 들면, 임의로 코돈 최적화된 scFv 및 Fv 또는 scFv 폴리펩티드, 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체 및 SLAMF7(CS1 또는 CD319로도 공지됨)에 대한 항체(임의로 코돈 최적화됨)의 관련 CDR 영역 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체 및 SLAMF7에 대한 항체(CS1 또는 CD319로도 공지됨)(임의로 코돈 최적화됨)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체로부터 유래하는 일본쇄 가변 단편(scFv) 또는 NKG2D에 대한 항체로부터 유래하는 scFv 및 Fc 단편, 및 임의로 일본쇄 가변 단편(scFv) 및 임의로 SLAMF7(CD319의 CS1로도 공지됨)(임의로 코돈 최적화됨)에 대해 지시된 항체의 scFv 및 Fc 단편 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 상기 개시된 방법에 따라 생성될 수 있는 프로모터에 작동적으로 연결된 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 검출가능한 표지 및/또는 항생제 내성을 부여하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 측면에서, 표지 또는 폴리뉴클레오티드는 단리된 핵산으로 성공적으로 형질도입된 세포를 선택하는 데 유용하다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산 서열은 벡터 내에 포함된다. 특정 실시양태에서, 벡터는 플라스미드이다. 기타 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 이러한 비제한적 예에는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터가 제한 없이 포함된다. 특정 실시양태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
예시적 벡터의 제조 및 상기 벡터를 사용한 CAR 발현 세포의 생성은 하기 실시예에서 상세히 논의된다. 요약하면, CAR 또는 면역조절 분자를 코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 CAR 폴리펩티드 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산을 프로모터에 작동적으로 연결하고, 작제물을 발현 벡터에 도입함으로써 달성된다. 유사한 방법을 사용하여, 면역조절 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 서열을 작제할 수 있다. 벡터는 진핵생물의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York].
일 측면에서, 용어 "벡터"는 비분열 및/또는 서서히 분열하는 세포에 감염 및 형질도입하고, 표적 세포의 게놈으로 통합하는 능력을 보유하는 재조합 벡터를 의도한다. 몇몇 측면에서, 벡터는 야생형 바이러스로부터 유래하거나, 이에 기초한다. 추가 측면에서, 벡터는 야생형 렌티바이러스로부터 유래하거나 이에 기초한다. 이러한 예에는 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), 말과 감염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus; EIAV), 유인원 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus; SIV) 및 고양이과 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus; FIV)가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 대안적으로, 기타 레트로바이러스는 뮤린 백혈병 바이러스(murine leukemia virus; MLV) 등의 벡터 백본에 대한 기초로서 사용될 수 있음이 고려된다. 본 개시에 따른 바이러스 벡터는 특정 바이러스의 성분으로 한정될 필요는 없다는 것이 명백할 것이다. 바이러스 벡터는 2종 이상의 상이한 바이러스로부터 유래하는 성분을 포함할 수 있고, 또한 합성 성분을 포함할 수 있다. 벡터 성분을 조작하여, 표적 세포 특이성 등의 목적하는 특성을 수득할 수 있다.
본 개시의 재조합 벡터는 영장류 및 비-영장류로부터 유래한다. 영장류 렌티바이러스의 예에는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 후천성 면역결핍 증후군(human acquired immunodeficiency syndrome; AIDS)의 원인 물질 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)가 포함된다. 비-영장류 렌티바이러스 그룹에는 프로토타입의 "슬로우 바이러스" 비스나/마에디 바이러스(visna/maedi virus; VMV), 게다가 관련 염소과 관절염-뇌염 바이러스(caprine arthritis-encephalitis virus; CAEV), 말과 감염성 빈혈 바이러스(EIAV) 및 보다 최근에 기재된 고양이과 면역결핍 바이러스(FIV) 및 소과 면역결핍 바이러스(bovine immunodeficiency virus; BIV)가 포함된다. 종래 기술의 재조합 렌티바이러스 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제6,924,123호; 제7,056,699호; 제7,419,829호 및 제7,442,551호, 이는 참조에 의해 본 명세서에 도입됨).
미국 특허 제6,924,123호는 특정 레트로바이러스 서열이 표적 세포 게놈으로의 통합을 용이하게 한다는 것을 개시하고 있다. 이 특허는 각 레트로바이러스 게놈이 비리온 단백질 및 효소를 코딩하는 gag, pol 및 env라는 유전자를 포함하는 것을 교시한다. 이 유전자의 양 말단에는 긴 말단 반복부(LTR)라고 불리는 영역이 인접하고 있다. LTR은 프로바이러스 통합 및 전사를 담당한다. 이들은 또한 인핸서-프로모터 서열로서도 기능한다. 달리 말하면, LTR은 바이러스 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 레트로바이러스 RNA의 캡슐화는 바이러스 게놈의 5' 말단에 위치하는 psi 서열에 의해 발생한다. LTR 자체는 동일한 서열이고, U3, R 및 U5라고 하는 3개 요소로 분할할 수 있다. U3는 RNA의 3' 말단에 고유한 서열로부터 유래한다. R은 RNA의 양 말단에 반복되는 서열로부터 유래하고, U5는 RNA의 5' 말단에 고유한 서열로부터 유래한다. 3개 요소의 크기는 레트로바이러스에 따라 상당히 상이할 수 있다. 바이러스 게놈의 경우, 폴리(A) 부가(종결) 부위는 우측 LTR에서 R과 U5 사이의 경계에 있다. U3에는 바이러스의 전사 조절 요소의 대부분이 포함되어 있고, 여기에는 세포 및 경우에 따라 바이러스 전사 활성화인자 단백질에 반응하는 프로모터 및 복수의 인핸서 서열이 포함된다.
구조 유전자 gag, pol 및 env 자체와 관련하여, gag는 바이러스의 내부 구조 단백질을 코딩한다. gag 단백질은 단백질분해에 의해 성숙 단백질 MA(매트릭스), CA(캡시드) 및 NC(뉴클레오캡시드)로 프로세싱된다. pol 유전자는, DNA 폴리머라제, 연관된 RNase H 및 게놈 복제를 매개하는 인테그라제(IN)를 포함하는 역전사효소(RT)를 코딩한다.
바이러스 벡터 입자의 생산을 위해, 벡터 RNA 게놈은 숙주 세포에서 이를 코딩하는 DNA 작제물로부터 발현된다. 벡터 게놈에 의해 코딩되지 않은 입자의 성분은 숙주 세포에서 발현되는 추가의 핵산 서열(통상, gag/pol 및 env 유전자 중의 하나 또는 둘 모두를 포함하는 "패키징 시스템")에 의해 트랜스로 제공된다. 바이러스 벡터 입자의 생산에 필요한 서열의 세트는 일시적 형질감염에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있거나, 또는 이들은 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있거나, 또는 이들은 혼합 방식으로 제공될 수 있다. 관련된 기술은 당업자에게 공지되어 있다.
본 개시에서 사용하기 위한 레트로바이러스 벡터에는 인비트로겐(Invitrogen)의 pLenti 시리즈 버전 4, 6 및 6.2; 레티겐 코포레이션(Lentigen Corp.)에서 제조된 "ViraPower" 시스템; pHIV-7-GFP, 시티 오브 호프 리서치 인스티튜트(City of Hope Research Institute)에서 생성 및 사용하는 랩; 클론테크(Clontech)에 의해 제조된 "Lenti-X" 렌티바이러스 벡터, pLVX; 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)에 의해 제조된 pLKO.1-puro; 오픈 바이오시스템스(Open Biosystems)에 의해 제조된 pLemiR; 독일 베를린 소재의 샤리테 메디칼 스쿨, 인스티튜트 오브 바이올로지(Charite Medical School, Institute of Virology; CBF)에서 생성 및 사용되는 랩이다.
당해 기술분야에서 외인성 핵산을 도입하는 추가 방법은 공지되어 있고, RNA 전기천공, 나노기술, 슬리핑 뷰티(sleeping beauty) 벡터, 레트로바이러스 및/또는 아데노바이러스 중의 하나 이상을 사용한 유전자 전달이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하거나, 달리는 세포를 본 개시의 억제제에 노출시키기 위해 사용된 방법에 관계없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에는, 예를 들면, 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR 등의 당업자에게 공지된 "분자 생물학적" 검정; "생화학적" 검정, 예를 들면, 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본 개시의 범위 내에 속하는 약제를 동정하기 위해 본 명세서에 기재된 검정에 의한 특정 펩티드의 존재 또는 부재의 검출이 포함된다.
패키징 벡터 및 세포주. 단리된 핵산은 패키징 벡터 및 세포주를 사용하여 레트로바이러스 패키징 시스템에 패키징할 수 있다. 패키징 벡터에는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노 관련 바이러스 벡터가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 패키징 벡터에는 유전 물질을 세포로 전달하는 것을 용이하게 하는 요소와 서열이 포함되어 있다. 예를 들면, 레트로바이러스 작제물은, 복제 불능 레트로바이러스 벡터를 패키징하고, 복제능 헬퍼 바이러스의 생산 없이, 복제-불능 레트로바이러스 벡터를 높은 역가로 패키징할 수 있는 비리온 단백질을 생산하는 데 필요한 모든 비리온 단백질을 트랜스로 코딩하는 복제-불능 레트로바이러스 게놈으로부터 유래하는 적어도 하나의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열을 포함하는 패키징 벡터이다. 레트로바이러스 DNA 서열에는 바이러스의 바이러스 5' LTR의 네이티브 인핸서 및/또는 프로모터를 코딩하는 영역이 없고, 헬퍼 게놈과 3' LTR의 패키징에 관여하는 psi 기능 서열이 모두 결여되어 있지만, 외래 폴리아데닐화 부위, 예를 들면, SV40 폴리아데닐화 부위, 및 바이러스 생산이 필요한 세포 유형에서 효율적 전사를 지시하는 외래 인핸서 및/또는 프로모터를 코딩한다. 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus; MMLV), 인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus; HIV) 또는 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(Gibbon Ape Leukemia virus; GALV) 등의 백혈병 바이러스이다. 외래 인핸서 및 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 즉시 초기(IE) 인핸서 및 프로모터, 몰로니 뮤린 육종 바이러스(Moloney Murine Sarcoma Virus; MMSV)의 인핸서 및 프로모터(U3 영역), 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus; RSV)의 U3 영역, 비장 포커스 형성 바이러스(Spleen Focus Forming Virus; SFFV)의 U3 영역, 또는 네이티브 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus; MMLV) 프로모터에 결합된 HCMV IE 인핸서일 수 있다. 레트로바이러스 패키징 벡터는, 플라스미드 기반 발현 벡터에 의해 코딩된 2개의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열로 이루어질 수 있고, 예를 들면, 여기서 제1 헬퍼 서열은 에코트로픽 MMLV 또는 GALV의 gag 및 pol 단백질을 코딩하는 cDNA를 포함하고, 제2 헬퍼 서열은 env 단백질을 코딩하는 cDNA를 포함한다. 숙주 범위를 결정하는 Env 유전자는, 이종지향성(xenotropic), 양향성(amphotropic), 에코트로픽(ecotropic), 폴리트로픽(polytropic)(밍크 포커스 형성) 또는 10A1 뮤린 백혈병 바이러스 env 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV env 단백질, 인간 면역결핍 바이러스 env(gp160) 단백질, 수포성 구내염 바이러스(VSV) G 단백질, 인간 T 세포 백혈병(HTLV) 유형 I 및 II env 유전자 산물, 전술한 env 유전자 중의 하나 이상의 조합으로부터 유래하는 키메라 엔벨로프 유전자 또는 전술한 env 유전자 산물의 세포질 및 막관통을 코딩하는 키메라 엔벨로프 유전자 및 목적하는 표적 세포 상의 특정 표면 분자에 대해 지시된 모노클로날 항체로부터 유래할 수 있다.
패키징 프로세스에서, 패키징 벡터 및 레트로바이러스 벡터는 인간 배아 신장 세포, 예를 들면, 293 세포(ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, Md.) 등의 바이러스를 생산할 수 있는 포유동물 세포의 제1 집단에 일시적으로 공-형질감염되어 고역가의 재조합 레트로바이러스-함유 상청액을 생성한다. 본 개시의 또 다른 방법에서, 이 일시적으로 형질감염된 세포의 제1 집단은 이어서 포유동물 표적 세포, 예를 들면, 인간 림프구와 공배양되어, 표적 세포에 외래 유전자를 고효율로 형질도입한다. 본 개시의 또 다른 방법에서, 상기 기재된 일시적으로 형질감염된 세포의 제1 집단으로부터의 상청액을, 포유동물 표적 세포, 예를 들면, 인간 림프구 또는 조혈 줄기 세포와 함께 인큐베이션하여, 표적 세포에 외래 유전자를 고효율로 형질도입한다.
또 다른 측면에서, 패키징 벡터는 인간 배아 신장 세포, 예를 들면, 293 세포 등의 바이러스를 생성할 수 있는 포유동물 세포의 제1 집단에서 안정적으로 발현된다. 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터는 선택 가능한 마커에 의한 공-형질감염 또는 의사형(pseudotyped) 바이러스 감염에 의해 세포에 도입된다. 양 경우 모두, 벡터는 통합된다. 또는, 벡터는 에피솜으로 유지되는 플라스미드에 도입될 수 있다. 고역가 재조합 레트로바이러스 함유 상청액이 생성된다.
CAR 세포의 활성화 및 확장. 목적하는 CAR을 발현하기 위한 세포의 유전적 변형 전 또는 후에, 문헌[참조: U.S. Patent Nos. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7, 172,869; 7,232,566; 7, 175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041 및 참조문헌, 예컨대, Lapateva et al. (2014) Crit Rev Oncog 19(1-2):121-32; Tam et al. (2003) Cytotherapy 5(3):259-72; Garcia-Marquez et al. (2014) Cytotherapy 16(11):1537-44]에 기재된 것 등의 일반적으로 공지된 방법을 사용하여, 세포를 활성화 및 확장할 수 있다. 생체외에서 종양 관련 항원에 의한 자극은 선택된 CAR 발현 세포 아집단을 활성화 및 확장할 수 있다. 또는, 세포는 종양 관련 항원과의 상호작용에 의해 생체내에서 활성화시킬 수 있다.
특정 면역 세포의 경우, 세포를 활성화하고 확장하기 위해, 추가의 세포 집단, 가용성 리간드 및/또는 사이토카인, 또는 자극제가 필요할 수 있다. 관련 시약은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 공지된 면역학적 원리에 따라 선택된다. 예를 들면, 가용성 CD-40 리간드는 특정 B 세포 집단을 활성화하고 확장하는 역할을 할 수 있고; 유사하게, 조사된 피더(feeder) 세포는 NK 세포의 활성화 및 확장을 위한 절차에 사용될 수 있다.
관련 세포를 활성화하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 본 출원에 용이하게 적용될 수 있으며; 예시적 방법은 하기 실시예에 기재되어 있다. 본 개시와 관련하여 사용하기 위한 단리 방법에는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) Dynabeads® 시스템 활성화 및 확장 키트; BD 바이오사이언시스(Biosciences) Phosflow™ 활성화 키트, 밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec) MACS™ 활성화/확장 키트 및 관련 세포의 활성화 부분에 특이적인 기타 상업적으로 이용 가능한 세포 키트가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 면역 세포의 특정 아집단은 이러한 키트에서 사용할 수 있는 비드 또는 기타 약제의 사용을 통해 활성화되거나 확장될 수 있다. 예를 들면, α-CD3/α-CD28 Dynabeads®를 사용하여, 단리된 T 세포 집단을 활성화하고 확장할 수 있다.
사용 방법
치료적 적용. 본 개시의 방법 측면은 시험관내 또는 생체내에서 종양 또는 암 세포(예를 들면, MM, AML 또는 GB 세포)의 성장을 억제하는 방법 및/또는 이를 필요로 하는 암 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 혈액 및/또는 골수에 영향을 미치는 암, 예를 들면, MM이다. 일부 실시양태에서, 암 또는 종양 세포는, 암 또는 종양 항원 CS1을 발현하거나 과발현한다. 시험관내에서 실시하는 경우, 이 방법은 정밀 의학 응용을 위한 시험관내 검정, 및 새로운 조합 및 요법을 시험하기 위한 유용한 검정을 제공한다.
일 측면에서, 종양 관련 항원(TAA)을 발현하는 암 세포 또는 암 세포를 포함하는 조직의 성장을 억제하는 방법이 제공된다. 이 방법은 암 세포 또는 조직을, 임의로, 유효한 양의, 본 명세서에 개시된 바와 같은 단리 또는 조작된 세포 또는 세포 집단과 접촉시키는 것을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 접촉은 시험관내 또는 생체내에서 있다. 일부 실시양태에서, 접촉은 생체내에서 있고, 단리된 세포는 치료되는 대상체에 대해 자가 또는 동종이계이다. 일부 실시양태에서, 접촉은 생체내에서 있고, 단리된 세포는 치료되는 대상체에 대해 동종이계이다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 암 세포 또는 조직을 유효량의 세포감소 요법 또는 TAA의 발현을 상향조절하는 요법과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포감소 요법은 화학요법, 동결요법, 온열요법, 표적 요법 및/또는 방사선 요법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 본 명세서에 개시된 바와 같은 제1 TAA 또는 BCMA를 발현한다. 추가로 또는 대안적으로, 암 세포는 본 명세서에 개시된 바와 같은 제2 TAA 또는 CS1을 발현한다.
일 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체에서 암의 성장을 억제하거나, 암의 전이를 억제하거나, 또는 암을 치료하는 것 중 하나 이상을 위한 방법이 제공된다. 이 방법은, 예를 들면, 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 개시된 바와 같은 유효량의 단리 또는 조작된 세포 또는 세포 집단을 투여하는 것을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 단리 또는 조작된 세포는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가이다. 일부 실시양태에서, 단리 또는 조작된 세포는 이를 필요로 하는 대상체에 대해 동종이계이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 본 명세서에 개시된 제1 TAA 또는 BCMA, 및/또는 본 명세서에 개시된 제2 TAA 또는 CS1 중 하나 또는 둘 모두의 발현을 결정함으로써 요법을 위해 선택된다. 추가 실시양태에서, 발현은 시험관내 또는 생체내에서 TAA 또는 BCMA 또는 CS1을 인식 및 결합하는 항원 결합 도메인과 대상체의 샘플을 접촉시키고, 샘플과 항원 결합 도메인 사이의 결합을 검출함으로써 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 검출가능한 마커를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 유효량의 세포감소 요법 또는 TAA의 발현을 상향조절하는 요법을 대상체에게 실시하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포감소 요법은 화학요법, 동결요법, 온열요법, 표적 요법 및/또는 방사선 요법을 포함한다.
일 측면에서, 치료를 위해 선택된 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은, 예를 들면, 유효량의 단리 또는 조작된 세포 또는 본 명세서에 개시된 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 대상체의 암 세포가 본 명세서에 개시된 제1 TAA 또는 BCMA, 및/또는 본 명세서에 개시된 제2 TAA 또는 CS1 중의 하나 또는 둘 다를 발현하는 경우, 대상체가 선택된다. 일부 실시양태에서, TAA 발현은 대상체의 샘플을 시험관내 또는 생체내에서 TAA 또는 BCMA 또는 CS1을 인식 및 결합하는 항원 결합 도메인과 접촉시키고, 샘플과 항원 결합 도메인 사이의 결합을 검출함으로써 결정된다. 추가 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 검출가능한 마커를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리 또는 조작된 세포는 이를 필요로 하는 대상체에 대해 자가이다. 일부 실시양태에서, 단리 또는 조작된 세포는 이를 필요로 하는 대상체에 대해 동종이계이다.
특정 실시양태에서, 이들 방법은 CAR을 포함하는 단리된 세포 (예를 들면, 유효량)를 대상체 또는 환자에게 투여하는 것을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 이 단리된 세포는 CAR 및/또는 이중특이적 항체를 포함하거나 발현한다. 일부 실시양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 BCMA에 대한 항체, 또는 대안적으로 B-세포 성숙 항원(BCMA) 및/또는 SLAMF7(CS1 또는 CD319로도 공지됨) 이외의 항체의 CDR 영역, 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 BCMA 및/또는 SLAMF7(또한 CS1 또는 CD319) 이외의 항원에 대한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역, 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 세포는 T-세포 또는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 NKG2D 리간드 및 임의로 SLAMF7(CD319의 CS1로도 공지됨) 리간드를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체의 관련 CDR 영역 및 임의로 SLAMF7(CS1 또는 CD319로도 알려짐), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 및 임의로 SLAMF7(CS1 또는 CD319로도 공지됨) 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 일본쇄 가변 단편(scFv)을 단독으로 또는 NKG2D에 대한 항체로부터 유래하는 Fc 단편과 조합하여 포함하고, 임의로 일본쇄 가변 단편(scFv)을 단독으로 또는 SLAMF7(CD319의 CS1로도 공지됨)로부터 유래하는 항체의 Fc 단편 및/또는 이들 각각의 등가물과 조합하여 포함한다. 이 방법은 치료를 수행하는 의사 또는 수의사에 의해 결정된 추가의 항암 요법 및 수술과 조합될 수 있다.
일 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 CAR 및/또는 이중특이적 항체를 포함하거나 발현하는 단리된 세포를 투여하는 방법이 본 명세서에 제공되고, 여기서 BsAb는 항-FLT3 항체의 항원 결합 도메인을 포함하고, BsAb 부분은 항-NKG2D의 항원 결합 도메인 및 항-CD123 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 이 BsAb는 AML의 치료를 위한 요법이고, 이 BsAb CAR을 제조 및 사용하는 방법은 본 개시의 범위 내에 있다. 유효량의 BsAb가 AML을 앓고 있는 환자에게 투여된다. 이러한 방법은 AML을 진단하고, 치료 및 독성을 모니터링하기 위한 적절한 진단 방법으로 보완될 수 있다. 이 방법은 치료를 수행하는 의사 또는 수의사에 의해 결정된 추가의 항암 요법 및 수술과 조합될 수 있다.
또 다른 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 CAR 및/또는 이중특이적 항체를 포함하거나 발현하는 단리된 세포를 투여하는 방법이 본 명세서에 제공되고, 여기서 BsAb는 항-EGFR 항체의 항원 결합 도메인을 포함하고, BsAb 부분은 항-NKG2D의 항원 결합 도메인 및 항-IL13Ra2 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 이 BsAb는 교모세포종의 치료를 위한 요법이고, 이 BsAb CAR을 제조 및 사용하는 방법은 본 개시의 범위 내에 있다. 유효량의 BsAb는 교모세포종을 앓고 있는 환자에게 투여된다. 투여는 국소적(두개내 투여) 또는 전신적일 수 있다. 이러한 방법은 교모세포종을 진단하고, 치료 및 독성을 모니터링하기 위한 적절한 진단 방법으로 보완될 수 있다. 이 방법은 치료를 수행하는 의사 또는 수의사에 의해 결정된 추가의 항암 요법 및 수술과 조합될 수 있다.
일 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 CAR 및/또는 이중특이적 항체를 포함하거나 발현하는 단리된 세포를 투여하는 방법이 본 명세서에 제공되고, 여기서 BsAb 및 BsAb-CAR은 도 1E에 부분적으로 제시된 구조, 즉 BCMA CAR, T2A, NKG2D scFv 및 Fc 폴리펩티드 등의 자가-절단 펩티드, T2A 등의 제2 자가-절단 펩티드, CS1 scFv 및 Fc 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지는 단일 BsAb-CAR을 포함한다. BCMA CAR은 힌지 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일 측면에서, CAR 성분은 아미노 말단에 또는 항-NKG2D 항원 결합 도메인 전에 위치하는 신호전달 도메인을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어진다. 예시적 IgG1 신호 펩티드가 본 명세서에서 제공되지만, 기타의 것들은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이 펩티드를 대체할 수 있다. 이 BsAb는 MM의 치료를 위한 요법이고, 이 BsAb CAR을 제조 및 사용하는 방법은 본 개시의 범위 내에 있다. 유효량의 BsAb가 MM을 앓고 있는 환자에게 투여된다. 이러한 방법은 MM을 진단하고, 치료 및 독성을 모니터링하기 위한 적절한 진단 방법으로 보완될 수 있다. 이 방법은 치료를 수행하는 의사 또는 수의사에 의해 결정된 추가 항암 요법 및 수술과 조합될 수 있다.
또 다른 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 CAR 및/또는 이중특이적 항체를 포함하거나 발현하는 단리된 세포를 투여하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 BsAb는 도 1F에 부분적으로 나타낸 구조, 즉 BCMA 항원 결합 폴리펩티드, T2A, NKG2D scFv 및 Fc 폴리펩티드 등의 자가-절단 펩티드, HMA 폴리펩티드, 및 CS1 scFv 및 Fc 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어진 단일 BsAb-CAR을 포함한다. BCMA CAR은 힌지 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일 측면에서, BCMA CAR은 아미노 말단에 또는 항-NKG2D 항원 결합 도메인 전에 위치하는 신호전달 도메인을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 예시적 IgG1 신호 펩티드가 본 명세서에 제공되지만, 기타의 것들은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이 펩티드를 대체할 수 있다. 이 BsAb는 MM의 치료를 위한 요법이고, 이 BsAb CAR을 제조 및 사용하는 방법은 본 개시의 범위 내에 있다. 유효량의 BsAb가 MM을 앓고 있는 환자에게 투여된다. 이러한 방법은 MM을 진단하고, 치료 및 독성을 모니터링하기 위한 적절한 진단 방법으로 보완될 수 있다. 이 방법은 치료를 수행하는 의사 또는 수의사에 의해 결정된 추가 항암 요법 및 수술과 조합될 수 있다.
일 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 CAR 및/또는 이중특이적 항체를 포함하거나 발현하는 단리된 세포를 투여하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 BsAb 및 BsAb-CAR은 도 1G에 부분적으로 제시된 구조, 즉, (a) BCMA 항원 결합 폴리펩티드, T2A, NKG2D scFv 및 Fc 폴리펩티드 등의 자가-절단 펩티드, G4S 폴리펩티드 등의 링커(서열번호 134), 및 CS1 scFv 및 Fc 폴리펩티드를 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지는 단일 Bs-Ab CAR을 포함한다. BCMA는 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 추가로 포함하거나, 또는 이들로 본질적으로 이루어진다. 일 측면에서, 이 폴리펩티드는 아미노 말단에 또는 항-NKG2D 항원 결합 도메인 전에 위치하는 신호전달 도메인을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 예시적 IgG1 신호 펩티드가 본 명세서에 제공되지만, 기타의 것들은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이 펩티드를 대체할 수 있다. 이 BsAb는 MM의 치료를 위한 요법이고, 이 BsAb CAR을 제조 및 사용하는 방법은 본 개시의 범위 내에 있다. 유효량의 BsAb가 MM을 앓고 있는 환자에게 투여된다. 이러한 방법은 MM을 진단하고 치료 및 독성을 모니터링하기 위한 적절한 진단 방법으로 보완될 수 있다. 이 방법은 치료를 수행하는 의사 또는 수의사에 의해 결정된 추가 항암 요법 및 수술과 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 세포는 치료되는 대상체 또는 환자에 대해 자가이다. 추가 측면에서, 종양은 암 또는 종양 항원을 발현하고, 대상체는 CAR에 의해 표적화된 종양 또는 암 관련 항원을 인식하여 결합하는 항체의 사용 등의 진단에 의해 요법을 위해 선택되었다. 대상체는 동물, 포유동물, 개과, 고양이과, 소과, 말과, 뮤린 또는 인간 환자이다.
본 명세서에서 개시되는 CAR 세포는 단독으로, 또는 본 명세서에서 개시된 이중특이적 항체와 함께, 또는 대안적으로 본 명세서에서 기재된 바와 같은 하나의 세포에서, 희석제, 공지된 항암 치료제 및/또는 사이토카인 등의 기타 성분 또는 면역조절제인 기타 세포 집단과 함께 투여될 수 있다. 이들은 1차 요법, 2차 요법, 3차 요법 또는 추가 요법으로 투여될 수 있다. 추가 요법의 비제한적 예에는 방사선 요법, 동결요법 또는 화학요법 등의 세포감소 요법, 또는 생물학적 제제가 포함된다. 추가의 비제한적 예에는, 비변형된 면역 세포, 하나 이상의 면역조절 분자를 발현하는 벡터를 포함하는 변형된 면역 세포, 또는 본 명세서에 개시된 것과는 상이한 항원에 특이적인 CAR 세포 등의 기타 관련 세포 유형이 포함된다. 본 개시의 CAR 세포와 마찬가지로, 일부 실시양태에서, 이들 세포는 자가 또는 동종이계일 수 있다. 적절한 치료 섭생은 치료를 수행하는 의사 또는 수의사에 의해 결정된다.
본 개시의 약제학적 조성물은 치료 또는 예방되는 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양과 빈도는 환자의 상태, 환자의 질환의 유형 및 중증도 등의 요인에 의해 결정되지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다. 일 측면에서, 이들은 직접 주사에 의해 직접 투여되거나, 정맥내 주사 등의 전신적으로 투여된다.
본 개시의 양태는 환자가 CAR 요법에 반응할 가능성이 있는지 또는 반응할 가능성이 없는지를 결정하기 위한 예시적 방법을 제공한다. 이 방법은, 환자로부터 단리된 종양 샘플에서 괴사의 존재 또는 부재를 결정하고, 암 또는 종양 항원을 발현하는 암 또는 종양 세포의 양을 정량하는 것을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 이 방법은 CAR 요법에 반응할 가능성이 있는 것으로 결정된 환자에게 유효량의 CAR 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. CAR 요법은 환자에 대해 자가 또는 동종이계일 수 있고, 환자는 고형 종양을 앓고 있는 대상체, 동물 또는 인간일 수 있다.
괴사를 위한 조직학적 염색 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, "H&E 염색"이라고도 지칭되는 헤마톡실린 및 에오신 염색은 조직, 특히 종양형성성 또는 암성 성장에서 괴사의 존재를 특정하기 위한 일반적 기술이다. 세포질 H&E 염색은 일부는 세포질 RNA의 손실에, 일부는 변성된 세포질 단백질에 기인하는 호산구 증가증의 증가를 나타낸다. 괴사 조직 염색에서, 세포질 소기관의 효소 소화로 인해 세포질이 종종 "섭취"로 나타난다. 미엘린 상, 석회화 및 기타 세포로의 식균 작용의 증거도 조직학적 염색에 의해 검출할 수 있는 괴사 조직의 특징이다. 괴사 조직은 또한 핵 염색에서 특정의 특징을 갖고 있고, 세포 사멸의 결과로서 종종 핵분해, 핵농축 및 핵붕괴를 입증한다. 현미경 검사와 이러한 괴사의 특징의 수동 또는 자동 정량화를 사용하여, CAR 요법의 관련성을 결정할 수 있다. 바이오마커 기반 또는 이미징 기반 진단을 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 종양형성성 또는 암성 성장 또는 괴사 조직을 일반적으로 검출하는 대체 수단은, 환자가 특정 유형의 CAR 요법에 반응할지의 여부를 결정하는 것과 동등하게 관련되고, 이에 따라 사용할 수 있다. 명백한 바와 같이, CAR-BsAb 요법은 항원 결합 도메인이 특정 암 또는 종양을 표적으로 하여 치료할 수 있도록 환자 샘플 중의 암 또는 종양의 유전자형 및/또는 표현형에 기초하여 선택된다.
담체
본 개시의 추가 측면은, 담체 및 본 명세서에 개시된 실시양태에서 하나 이상의 생성물(예를 들면, 본 명세서에 개시된 세포 집단, CAR, CAR을 포함하는 단리된 세포, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 단리된 핵산, 벡터, 세포, 세포 집단, 및 본 명세서에 개시된 CAR 및/또는 이중특이적 항체 및/또는 이를 코딩하는 핵산을 함유하는 단리된 세포)를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어지는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 담체는 약제학적으로 허용되는 담체이다. 추가 측면에서, 조성물은 면역조절 분자 및/또는 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 BCMA 및/또는 NKG2D에 대한 항체의 관련 CDR 영역, 임의로 SLAMF7(CS1 또는 CD319로도 공지됨), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역, 임의로 SLAMF7(CS1 또는 CD319로도 공지됨)(이는 임의로 코돈 최적화됨) 및/또는 이들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 일본쇄 가변 단편(scFv)을 단독으로 또는 NKG2D에 대한 항체로부터 유래하는 Fc 단편과 조합하여, 임의로, 일본쇄 가변 단편(scFv)을 단독으로 또는 SLAMF7(CD319의 CS1로도 공지됨)(이는 임의로 코돈 최적화됨)로부터 유래하는 Fc 단편 및/또는 이들 각각의 등가물과 조합하여 포함한다.
간단히 말하면, 본 개시의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여, 본 명세서에 기재된 청구된 조성물 중 어느 하나를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 조성물은 중성 완충 생리식염수, 인산염 완충 생리식염수 등의 완충액; 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨 등의 탄수화물; 단백질; 글리신 등의 폴리펩티드 또는 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온 등의 킬레이트제; 보조제(예: 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 개시의 조성물은 국소 또는 전신 투여, 예를 들면, 경구, 정맥내, 두개내, 국소, 장내 및/또는 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시의 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다.
세포 또는 조성물의 투여는 치료 과정 전체에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 1회 용량으로 수행될 수 있고, 목적하는 치료 이점을 달성하기 위한 유효량이 제공된다. 가장 효과적 투여 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 치료에 사용되는 조성물, 치료의 목적 및 치료되는 대상체에 따라 달라질 것이다. 단일 또는 다중 투여는 치료를 수행하는 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 적절한 투여 제형 및 약제를 투여하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 추가 측면에서, 본 개시의 세포 및 조성물은 기타 치료와 조합하여 투여될 수 있다.
세포 및 세포 집단은 당해 기술분야에 공지되고, 예를 들면, PCT/US2011/064191에 기재된 방법을 사용하여 숙주 및/또는 대상체에게 투여된다. 본 개시의 세포 또는 조성물의 이러한 투여는 실험 및 스크리닝 검정을 위한 목적하는 질환, 장애 또는 상태의 동물 모델을 생성하기 위해 수행될 수 있다.
또한, 하기 중 하나 또는 둘 모두를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진 단리된 복합체가 제공된다: 암 세포에 결합된 본 명세서에 개시된 단리 또는 조작된 세포, 및/또는 암 세포에 결합된 본 명세서에 개시된 폴리펩티드. 일부 실시양태에서, 암 세포는 본 명세서에 개시된 제1 항-TAA 항원 결합 도메인 또는 본 명세서에 개시된 항-BCMA 항원 결합 도메인에 의해 단리된 세포에 결합된다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 본 명세서에 개시된 제1 항-TAA 항원 결합 도메인 또는 본 명세서에 개시된 항-BCMA 항원 결합 도메인에 의해 폴리펩티드에 결합된다. 추가로 또는 대안적으로, 암 세포는 본 명세서에 개시된 제2 항-TAA 항원 결합 도메인 또는 본 명세서에 개시된 항-CS1 항원 결합 도메인에 의해 폴리펩티드에 결합된다.
병용 요법
본 명세서에 기재된 조성물은 1차, 2차, 3차, 4차 요법 또는 기타 요법으로서 투여될 수 있고, 세포감소 개입과 조합될 수 있다. 치료 의사에 의해 결정된 바와 같이, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들은 CAR 및/또는 BsAb가 결합하는 종양 또는 기타 항원의 발현을 상향조절할 수 있는 요법과 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 일부 임상 약물은 표적 항원을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, CS1 표면 발현은 FDA가 승인한 다발성 골수종에 대한 면역 조절제인 레날리도마이드에 의해 증가될 수 있다[참조: Wang et al. (2018) Clin. Cancer Res. Jan 1;24(1):106-119]. 또 다른 예는, CAR-BsAb가 FLT3 항원을 표적으로 하는 경우, FLT3 발현을 증가시키는 FDA 승인 약물 미도스타우린이다. 일부 실시양태에서, 이들은 암 또는 종양의 외과적 제거와 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포감소 요법은 화학요법, 동결요법, 온열요법, 표적 요법 및/또는 방사선 요법을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다.
키트
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시는 CAR 및/또는 BsAb CAR 세포를 생성하고 투여하는 방법을 제공한다. 하나의 특정 측면에서, 본 개시는 이들 방법을 수행하기 위한 키트, 게다가 세포 및/또는 조직을 수집하고/하거나 스크리닝/형질도입 등을 수행하고/하거나 그 결과를 분석하는 등의 본 개시의 방법을 수행하기 위한 지시를 제공한다.
일 측면에서, 키트는 하기 중의 임의의 하나 이상을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어진다: 본 명세서에 개시된 폴리펩티드, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드, 본 명세서에 개시된 벡터, 본 명세서에 개시된 단리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 본 명세서에 개시된 세포, 예컨대, 단리된 동종이형 세포, 바람직하게는 T 세포 또는 NK 세포, 본 명세서에 개시된 세포 집단, 본 명세서에 개시된 조성물, 본 명세서에 개시된 단리된 복합체, 및/또는 환자로부터의 자가 세포의 조달에 대한 임의의 지시. 이러한 키트는 또한, CAR 및/또는 BsAb CAR 발현 세포, 예컨대, 본 명세서에 개시된 것들의 형질도입 및/또는 선택 및/또는 활성화 및/또는 확장에 적절한 배지 및 기타 시약을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 여전히 추가로 이들로 이루어질 수 있다.
일 측면에서, 키트는 단리된 CAR 및/또는 BsAb CAR 발현 세포 또는 이의 집단을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 이 키트의 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 전에 활성화 및/또는 확장을 필요로 할 수 있다. 추가 실시양태에서, 키트는 단리된 CAR 및/또는 BsAb CAR 발현 세포를 활성화 및/또는 확장하기 위해, 상기 개시에서 커버하는 것들 등의 배지 및 시약을 추가로 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 CAR 요법에 사용된다. 추가 실시양태에서, 키트는 CAR 요법을 필요로 하는 환자에 대한 단리된 세포의 투여에 관한 지시를 포함한다.
본 개시의 키트는 또한, 예를 들면, 완충액, 보존제 또는 단백질-안정화제를 포함할 수 있다. 키트는 검출가능한 표지를 검출하는 데 필요한 성분, 예를 들면, 효소 또는 기질을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 대조군 샘플 또는 일련의 대조군 샘플을 포함할 수 있고, 이들 샘플은 검정되거나, 시험 샘플과 비교될 수 있다. 키트의 각 성분은 개별 용기에 포함될 수 있고, 다양한 컨테이너는 모두 키트를 사용하여 수행된 검정의 결과를 해석하기 위한 지시와 함께 단일 패키지에 포함될 수 있다. 본 개시의 키트는 키트 용기 상에 또는 내에 서면 제품을 함유할 수 있다. 서면 제품에는 키트에 포함되는 시약의 사용 방법이 설명되어 있다.
수용할 수 있는 한, 이러한 제안된 키트 성분은 당업자에 의해 사용하기 위한 관습적 방식으로 포장될 수 있다. 예를 들면, 이러한 제안된 키트 성분은 용액 또는 액체 분산액 등으로 제공될 수 있다.
하기 실시예는 본 개시를 실시할 때에 다양한 경우에 사용될 수 있는 절차를 예시한다.
실시예 1 - BsAb CAR T-세포 생성 및 효능
키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 및 이중특이적 항체(BsAb)는 FDA 승인 치료법이고, 암의 치유 가능성이 매우 높은 것을 나타낸다. 그러나, 대부분의 경우, 둘 다는 아직 치료 효과가 있는 것으로 밝혀지지 않았다. 이는 치료 기간에 일부 기인할 수 있고, 즉, CAR T 세포는 생체내에서 충분히 장기간 생존하지 못할 수 있고, BsAb의 반감기는 매우 짧고, 제조 프로세스에 비용과 시간이 걸리기 때문에, 이들의 효능 및 광범위한 응용이 제한된다. 여기에서, 출원인은 CAR T 세포 요법과 BsAb 요법을 조합하는 플랫폼을 성공적으로 작성했고, 이들은 둘 다 장기적 효과의 가능성이 있다. 출원인은, 다발성 골수종(MM)의 설정에서 이 플랫폼을 시험했고, 이는 현재 FDA 승인 요법에 따라 재발률이 높은 난치성 암이다. 출원인은 2개의 MM 표적 항원, CS1 및 BCMA를 이용하여 개념을 검증하고, BCMA CAR을 발현할 뿐만 아니라 가용성 항-NKG2D-항-CS1 BsAb를 분비하는 BsAb-CAR T 세포를 생성하기 위해 신규하고 효과적인 단일 렌티바이러스 작제물을 생성했고, 전자는 BCMA(+) MM 종양 세포를 공격하고, 후자는, CS1(+) MM에 대한 세포독성 활성을 촉진할 목적으로, CD8(+) T 세포, γδ T 세포, 자연 살해(NK) T 세포 및 NK 세포를 포함한 모든 NKG2D(+) 세포용해 세포에 관여한다. 이 올인원의 다면적 면역 방식은 2개의 "살아 있는 약물", 즉 CAR T 세포 및 BsAb를 동시에 제공하고, 동일한 악성 집단의 상이한 표적 항원에서 지시된 선천성 및 적응성 면역 이펙터 세포를 모두 포획한다. 출원인은, BCMA CAR T 세포 또는 BsAb 형질도입 T 세포와 비교하여, BsAb-CAR T 세포가 보다 많은 IFN-γ를 분비하고 더 높은 탈과립 능력을 나타내면서, MM 세포주 및 원발성 MM 종양 세포를 포함한 MM 종양 세포를 표적으로 함으로써 시험관내에서 세포독성의 증강을 나타낸다는 것을 발견했다. 이 2개 항원의 내인성 발현을 결여하는 표적 세포에서 BCMA 및 CS1의 이소성 강제 발현은 표적 세포 용해를 증강시켰다. 중요하게는, BCMA CAR T 세포로부터 분비되는 항-NKG2D-항-CS1 BsAb는 자가분비 방식으로 작용하고, NKG2D 신호전달의 활성화를 통해 각각 시험관내 BCMA CAR T 세포 증식과 생체내 증식 및 생존의 증강을 유발한다. 이러한 다면적 효과는 생체내에서 강력한 항종양 활성을 초래했다. 종합적으로, 본 명세서에서 제공된 것은, CAR T 세포 요법과 항-NKG2D 이중특이적 항체 요법을 단일 플랫폼으로 조합하여 지속 시간을 증가시키고 효능을 증강시킬 수 있는 능력, 게다가 선천성 및 적응성 세포용해 이펙터 세포 둘 다의 특정 항-종양 활성을 포획하는 능력을 구비한, 차세대 암 면역요법을 생성하는 증거이다.
세포 배양: 세포주, MM.1S, H929, RPMI-8226(인간 다발성 골수종 세포주) 및 K562(인간 적백혈병 세포주)는 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 구입했다. 이들 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)(Invitrogen, CA, USA) 및 1% 항생제-항진균제(Invitrogen)를 함유하는 RPMI 1640 배지(Sigma, St. Louis, USA)로 배양했다. ATCC에서 구입하여 렌티바이러스 생산에 사용된 293T 세포주는 RPMI 1640와 동일한 보충제 및 DMEM(Sigma)에서 배양했다. 건강한 공여자와 MM 환자로부터의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는, 제조원의 지시에 따라 피콜-파크 플러스(GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) 밀도 구배 원심분리에 의해 단리했다. 인간 CD56+ NK 세포, CD3+CD56+ NKT 세포 및 CD3+γδTCR+ T 세포는 각각 인간 NK, NKT 및 γδT 세포 분리 키트(MACS, Miltenyi Biotech, Auburn, CA, USA)를 사용하여 제조원의 지침에 따라 단리했다. 1차 MM 환자 샘플은 OSU 종합 암 센터와 제임스 암 병원의 백혈병 조직 은행 공유 리소스로부터 제공되었다. 인간 대상체에 대한 모든 작업은 오하이오 주립 대학 윤리 위원회(Ohio State University Institutional Review Board)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다.
마우스: 6주 내지 8주령의 NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) 마우스는 잭슨 라보라토리즈(Jackson Laboratories)(Bar Harbor, ME, USA)로부터 구입하여 모든 생체내 연구에 사용했다. 모든 동물 작업은 오하이오 주립 대학 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다. MM 질환의 진행을 주의 깊게 모니터링하고, 생존 데이터를 기록했다. 뒷다리 마비, 혼수 및 명백한 체중 감소가 관찰된 시점에서 마우스를 희생시켰다.
BCMA -CAR, 항- NKG2D -항-CS1 BsAb , 및 BsAb - BCMA CAR- 렌티바이러스 작제물의 생성: BCMA CAR의 경우, 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역에 대한 BCMA 코딩 도메인 서열은 하이브리도마로부터 유래하고, 링커를 사용하여 재조합되었다. VH-링커-VL 단편은 CD28-CD3zeta 부분과 함께 프레임에 도입되었다. 항-BCMA-scFv-CD28-CD3제타 단편을 렌티바이러스 벡터 pCDH 내로 서브클로닝하여, 2세대 pCDH-BCMA CAR 작제물을 생성했다. 항-NKG2D-항-CS1 BsAb 렌티바이러스 작제물을 생성하기 위해, 인간 근육 알도스35로부터 유래하는 비-면역원성 단백질 링커에 의해 함께 결합된 항-CS1 모노클로날 항체29 및 항-NKG2D 항체로부터의 2개의 코돈 최적화된 일본쇄 가변 단편(scFv)을 pCDH 렌티바이러스 벡터에 클로닝했다. "올인원" BsAb-BCMA CAR의 경우, 항-BCMA-scFv-CD28-CD3ζ-T2A 카세트를 pCDH 항-CS1-NKG2D BsAb-EF1a-GFP에 도입하여, 완전한 pCDH-BCMA CAR-T2A-BsAb-EF1a-GFP 렌티바이러스 작제물을 생성했다. 이들 방법은 본 명세서에 기재된 BsAb-CAR을 생성하기 위해 사용된다.
렌티바이러스 생산 및 T 세포의 형질도입: 렌티바이러스 형질감염 및 감염은 이전에 보고된 프로토콜에 기재된 바와 같이 수행했다36 ,37.
CS1 및 BCMA 유전자를 안정적으로 발현하는 K562 세포의 생성: 인간 CS1 코딩 서열을 함유하는 전장 pCDH-CMV-CS1-EF1α-GFP 작제물은 이전에 보고되었다30. 렌티바이러스를 생산하기 위해, lipofectamine® 2000(Invitrogen)을 사용하여, 293T 세포에 pCDH-CS1 플라스미드 또는 pCDH 공 벡터 플라스미드와 패키징 플라스미드 pCMV-VSVG 및 pCMV-δr9를 공-형질감염했다. 이어서, 렌티바이러스 상청액을 수확하고, 이전에 공개된 프로토콜36 ,38을 사용하여 K562 세포에 감염시키기 위해 사용했다. 이어서, GFP-양성 세포를 FACS Aria II 세포 선별기(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 선별했다. BCMA-K562는 전장 BCMA cDNA를 갖는 벡터로 형질도입된 K562 세포이다. 렌티바이러스 생산, 감염 및 선별은 상기에서 설명한 방법을 사용하여 수행되었다. CS1+BCMA+K562 세포는 pCDH-CMV-BCMA-EF1α-GFP 렌티바이러스 작제물을 상기 기재된 CS1-K562 세포에 형질도입함으로써 생성되었다. 이중-형질도입된 세포를 APC-항-BCMA mAb로 염색하고, 이어서 GFP+BCMA+ 집단에 대해 선별했다. 실험에 사용되기 전에, 이러한 GFP+BCMA+ 이중 양성 세포를 배양물에서 수회 통과시켜, 항-BCMA mAb-결합 세포의 손실을 보장했다.
유세포 분석: 세포 표면에서 CAR 발현의 검출은 이전에 보고된 바와 같이 수행되었다30. 이 연구에 사용된 항체는 다음과 같다: FITC 및 비오틴-표지된 염소 항-마우스(Fab)2 폴리클로날 항체 또는 정상 폴리클로날 염소 면역글로불린 G(IgG) 항체(Jackson ImmunoResearch), 알로피코시아닌(APC)-접합된 스트렙트아비딘(Jackson ImmunoResearch), PerCP/Cy5.5-접합된 스트렙트아비딘(Biolegend), PE, PerCP/Cy5.5 및 BV421 항-인간 CD3(hCD3, 클론 UCHT1 및 SK7, BD Biosciences), APC 및 PE 항-hCD56(클론 TULY56 및 CMSSB, eBioscience), FITC 및 PC5.5 항-TCR apan γ/δ(클론 IMMU510, Beckman Coulter, Inc. CA, USA), PC5 항-TCR pan α/β(클론 IP26A, Beckman), FITC 항-TCR Vγ9(클론 IMMU 360, Beckman) 및 퍼시픽 블루(Pacific Blue) 항-TCR Vδ2(클론 IMMU 389, Beckman), 비접합 및 APC-항 hNKG2D(클론 1D11BD Biosciences), PE-Cy7 항-hCD8(클론 SK1, BD Biosciences), APC-Cy7 항-hCD4(클론 SK3, BD Biosciences), BV421 항-인간 CD1d(클론 CD1d42, BD OptiBuild), V450 항-hCD11c(클론 B-ly6, BD Horizon), APC-H7 항-hCD19(클론 HIB19, BD Pharmingen), APC-H7 항-hCD20(클론 2H7, BD Biosciences), FITC 항-hCD45(클론 J.33, Beckman), 비오틴 및 FITC 항-hCD14(클론 63D3 및 M5E2, Biolegend), 비오틴 및 PE 항-hCD33(클론 P67.6, Biolegend 및 WM53, BD Pharmingen), 비오틴 항-hCD66b(클론 G10F5, Biolegend), 비접합 및 PE-항 hCS1(클론 162, eBioscience), APC-항 hBCMA(클론 19F2, Biolegend), PE-항 Ki67(클론 SolA15, BD Biosciences), PE-hCD69(클론 FN50, BD Biosciences). 세포를 4% 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS로 1회 세척하고, 항체로 실온에서 20분 동안 염색하고, LSRII 유세포 분석기(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 분석했다.
면역블롯팅: 이중특이적 항체의 세포내 발현 및 분비를 검출하기 위해, BsAb-형질도입된 T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포 및 이들 세포의 배양물로부터의 세포-비함유 상청액을 6x-his-태그 mAb(서열번호 111로 개시된 "6x-his")(클론 4A12E4, Invitrogen)를 사용하여 면역블롯팅을 위해 수집했다. 면역블롯팅은 출원인이 이전에 보고한 표준 면역블롯팅 프로토콜에 따라 수행되었다30 ,37. 이전에 보고된 바와 같이, CAR 발현의 검출을 위해, CAR-형질도입된 T 세포를 용해시키고, 단백질을 면역블롯팅용으로 추출하고, 마우스 항-인간 CD3ζ mAb(BD Pharmingen)로 프로빙했다30,37.
세포독성 검정: 세포를 51Cr로 표지하고, 4시간 동안 37℃에서 96-웰 V-바닥 플레이트의 웰에서 다양한 이펙터:표적 비(E:T)로 형질도입된 T 세포와 공배양하고, 이어서 TopCount 계수기(Canberra Packard)를 사용하여, 표적 세포로부터 51Cr의 방출을 측정하기 위해 상청액을 회수했다. BsAb가 PBMC에 관여하는 능력을 연구하는 경우, CD3+T 세포, CD8+ 세포독성 T 세포, γδ T 세포, NKT 세포 및 NK 세포는 미국 적십자사로부터 주문한 류코팩으로부터 단리했다. T 세포를 IL-2(500U/mL) 및 IL-15(500U/mL)와 함께 DynabeadsTM 인간 T-활성화인자 CD3/CD28(4×104/μL, Beads:T=1:1)로, 상기 설명한 표준 4시간 51Cr 방출 검정 전에, 5 내지 14일 동안 프라이밍했다. 세포독성 분석 전에, 인간 NK 세포를 IL-2(500U/mL)에 의해 활성화했다. 단리된 인간 CD3+CD56+ NKT 세포는 IL-2(100U/mL)39와 함께 α-GalCer(α-갈락토실세라마이드, KRN7000, Enzo Biochem Inc. NY, USA. 100ng/mL)에 의해 7 내지 10일 동안 활성화시켰다. CD3+γδTCR+ T 세포 활성화를 위해, IL-2(100U/mL)40, 41와 함께 HMBPP((E)-1-하이드록시-2-메틸-2-부테닐 4-피로포스페이트, Sigma. 10nM)를 사용하고, 14일 동안 배양했다. 류코팩(leukopacks)으로부터 이러한 세포를 단리하기 위한 프로토콜은 오하이오 주립대학의 윤리 위원회(Ohio State University Institutional Review Board)의 승인을 받았다.
ELISA: 배양 상청액 중의 인간 IFN-γ의 존재는 제조원의 프로토콜에 따라 R&D 시스템스(Minneapolis, MN, USA)의 키트를 사용하여 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 검정되었다. 배양 상청액 중의 인간 IL-2 및 TNF-α의 수준도 ELISA 키트(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)로 검정했다. 이러한 ELISA 분석을 위해, 환자의 골수종 세포주 또는 1차 MM 세포의 2.5 × 105 세포를 2.5 × 105 조작된 T 세포 또는 대조군 T 세포와 함께 96웰 V 바닥 플레이트에서 24시간 동안 인큐베이팅했다. 데이터는 Synergy HT 마이크로플레이트 판독기(Biotek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 450nm에서 판독했다.
MM-보유 마우스의 생체내 치료 및 생물발광 이미징: 반딧불이 루시퍼라제 유전자, MM.1S-GL3을 발현하는 MM.1S 골수종 세포는 이전에 기재되었다30. 이종이식편 동소성 MM 모델을 구축하기 위해, NSG 마우스(수컷)에 200μL의 생리식염수 중의 8 × 106 MM.1S-GL3 세포를 0일차에 꼬리 정맥으로부터 정맥내 주사했다. 10, 17 및 24일차에, 마우스에게 (1) 비히클 대조군(생리식염수) 또는 (2) 공 벡터 형질도입된 T 세포, (3) BsAb 형질도입된 T 세포, (4) BCMA-CAR-형질도입된 T 세포, (5) BsAb 및 BCMA-CAR로 순차적으로 형질도입된 T 세포, 또는 (6) BsAb-CAR-형질도입된 T 세포를 각각 200μL 식염수로 꼬리-정맥 정맥내 주사에 의해 투여했다. MM.1S-GL3 세포에 의한 접종으로부터 10일, 24일, 31일 후에, D-루시페린(150mg/kg 체중; Gold Biotechnology)을 모든 마우스에게 복강내 주사했다. 이미징은 리빙 이미지(Living Image) 소프트웨어(PerkinElmer)와 함께 생체내 이미징 시스템(In Vivo Imaging System; IVIS)을 사용하여 수행되었다. 80일차에, 200μl의 식염수에서 마우스당 4 × 106 MM1.S 세포를 꼬리 정맥에 정맥내 주사함으로써 생존한 마우스에게 챌린지하고, 생존 데이터를 수집하고, 140일차에 폐쇄했다. BsAb의 효과를 조사하기 위해, 인간 골수 세포의 고갈을 수반하는 PBMC의 존재하에 상기 실험을 반복했다. 이러한 목적을 위해, NSG 마우스는 0일차에 꼬리 정맥을 통해 200mL의 생리식염수 중의 8 × 106 MM.1S-GL3 세포를 정맥내 주사했다. 10일차에, 마우스에게 3 × 106 다양한 형질도입 T 세포를 투여하고, 이어서 3 × 106 CD33-CD14-CD66b- 인간 PBMC를 모두 정맥내로 투여했다. 17일차와 24일차에, 마우스는 3 × 106 조작된 T 세포를 동일한 공여자로부터 정맥내 생성한다. 10일, 19일, 28일 및 37일차에, 마우스에게 D-루시페린을 주입하고, 상기 설명한 바와 같이 이미징했다.
면역형광 현미경에 의해 검출된 면역-시냅스: 주로 분비된 항-NKG2D-항-CS1 BsAb를 표지하기 위해, BsAb CAR T 세포로부터의 상청액을 수집하고, 6x-His Tag mAb(서열번호 111로 개시된 "6x-His")(클론 4E3D10H2/E3, Invitrogen)에 의해 1시간 동안 1:500의 희석에서 37℃ 인큐베이션으로 염색하고, 알렉사 플루오로(Alexa Fluor®)350(청색, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)으로 표지했다. MM.1S 세포를 회수하고, CellTrackerTM Deep Red Dye(20μM, Thermo Fisher Scientific)와 함께 성장 조건하에 45분 동안 인큐베이팅했다. 면역 시냅스를 확인하기 위해, BsAb-CAR T 세포(GFP, 녹색) 또는 공 벡터-형질도입된 대조군 T 세포(GFP, 녹색)를 MM.1S 세포(적색) 및 His Tag 표지된 상청액과 1시간 또는 24시간 동안 공배양했다. 살아있는 세포 형광 이미징은 짜이즈 현미경 시스템(Zeiss Microscope Systems)(Zeiss Axio Observer Z1, Carl Zeiss Inc., NY, USA)에 의해 관찰되었다. 비디오 촬영을 위해, BsAb-CAR T 세포(GFP, 녹색) 또는 공 벡터 형질도입된 T 세포(GFP, 녹색)를 MM.1S 세포(적색)와 1시간 동안 공배양하고, 현미경을 사용하여 면역-시냅스를 2시간 동안 관찰했다.
결과: BCMA-특이적 CAR 및/또는 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체를 발현하는 1차 T 세포의 생성: 출원인은, 신호 펩티드(SP), 중쇄 가변 영역(VH), 글리신-세린(GS) 링커, 경쇄 가변 영역(VL), Myc 태그, 힌지, CD28 및 CD3ζ로 순차적으로 이루어진 렌티바이러스 벡터 골격을 갖는 특정 BCMA-CAR 작제물을 생성했다(도 1A). 이어서, 출원인은 렌티바이러스 벡터 골격을 갖는 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체("BsAb"로 지칭됨) 작제물을 설계했다. 이는 항-NKG2D 항체 및 항-CS1 모노클로날 항체로부터의 2개의 코돈 최적화된 일본쇄 가변 단편(scFv)으로 이루어졌고, 인간 근육 알도스로부터 유래하는 비면역원성 단백질 링커로 연결되었다. 각각의 scFv는 글리신-세린(GS) 링커에 의해 연결된 대응하는 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)를 함유한다(도 1B). 건강한 공여자로부터 단리되고 항-인간 CD3/CD28 항체 비드에 의해 활성화된 동일한 공여자 T 세포를 공 벡터(EV), BsAb 작제물, BCMA-CAR 작제물로 형질도입하거나, BsAb 작제물로 먼저 형질도입한 후, 순차적으로 BCMA-CAR 작제물(이하 BsAb-BCMA seq. trans. T 작제물로 지칭됨)로 형질도입했다. 세포 표면에서 BCMA CAR의 발현은 형질도입된 T 세포를 항-Fab로 염색함으로써 입증되었고, 이는 BCMA CAR 작제물 또는 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 작제물로 형질도입된 FACS 풍부한 T 세포의 80% 이상에서 scFv의 발현을 검출했고, 비변형된 T 세포, EV-형질도입된 T 세포 및 BsAb T 세포에서는 발현을 거의 검출할 수 없었다(도 1C). BsAb T 세포와 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포가 성공적으로 형질도입되었는지를 결정하기 위해, 4일간 배양물로부터 세포-비함유 상청액을 수확하고, 4일간 배양물로부터 세포 펠렛을 용해시켰다. 이어서, 상청액 및 세포 용해물 둘 모두를 6x-his 태그된 Ab(서열번호 111로 개시된 "6x-his")를 사용하여 면역블롯팅에 제공했다. 결과는 BsAb-T 세포와 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포가 세포성 BsAb와 분비된 BsAb를 모두 생산한 반면, 비변형된 T 세포 상청액과 용해물로부터의 대조군은 BsAb를 생산하지 않았다(도 1D).
BsAb-BCMA seq. trans. T 세포는 시험관내에서 각각의 벡터만을 형질도입한 T 세포보다 더 효과적인 MM의 킬러이다: BsAb는 항-NKG2D 수용체 부분과 항-CS1 부분을 함유하고 있기 때문에, 출원인은 NKG2D+ 세포용해성 면역 세포에서 NKG2D 활성화를 유발하려고 시도했고, MM 관련 항원인 CS1을 통해 MM 세포에 동시에 관여하는지의 여부를 시험했다. 출원인은 먼저 유세포 분석에 의해 일반적으로 사용되는 3개의 MM 세포주 MM.1S, H929, RPMI-8226 및 인간 적백혈병 세포주 K562에서 CS1 및 BCMA의 표면 발현을 평가했다. 결과는 4개의 MM 세포주에서 다양한 수준의 BCMA 및 CS1 발현을 나타냈다. MM1.S MM 세포주는 높은 수준의 BCMA 및 CS1 모두의 발현을 나타내고; H929 MM 세포주는 높은 수준의 BCMA 및 중정도(int) 수준의 CS1 발현을 나타내고; RPMI-8226 MM 세포주는 중등도 수준의 BCMA 발현을 나타낸 반면, CS1 발현은 매우 낮다. 음성 대조군으로서, K562 적백혈병 세포주는 세포 표면에서 CS1 또는 BCMA를 발현하지 않았다(도 2A). 상기 언급한 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포(순차적으로 형질도입된 BCMA CAR 및 항-NKG2D-항-CS1 BsAb를 포함)가 MM 세포주의 보다 효율적인 종양 세포 용해를 유발할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, K562 적백혈병 세포주를 음성 표적 대조군으로 사용하여 표준 4시간 51Cr 방출 검정을 수행했다. 단일 작제물-조작된 BsAb-CAR T 세포를 생성하기 전에, 출원인은 MM 종양 세포 사멸을 T 세포의 5개 그룹에서 비교했다: (1) 비변형 T 세포, (2) 공 벡터(EV)-형질도입된 T 세포(EV T), (3) 항-NKG2D-항-CS1-BsAb-형질도입된 T 세포(이하 BsAb T로 지칭됨), (4) BCMA-CAR-형질도입된 T 세포(이하 BCMA-CAR T로 지칭됨), 및 (5) 항-NKG2D-항-CS1 BsAb 및 BCMA-CAR이 순차적으로 형질도입된 T 세포(BsAb-BCMA seq. trans. T로 지칭됨). 표적 MM 세포주 BCMAhighCS1high MM.1S 및 BCMAhighCS1int H929의 경우, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포는 BsAb T 세포 또는 BCMA-CAR T 세포보다 유의하게 우수한 사멸을 생성했다. 표적 MM 세포주 BCMAintCS1low RPMI-8226의 경우, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포는 BsAb T 세포보다 우수하게 수행되었지만, BCMA-CAR T 세포보다 더 우수하지는 않았다. 중요하게도, 단일 또는 조합 항원 표적화는 음성 대조군 K562 적백혈병 표적 세포주에 대해 활성이 없었다(도 2B). 주목할 것으로, BCMA-CAR T 세포는 BsAb T 세포, EV T 세포 및 비변형된 T 세포의 효과와 비교하는 경우, MM 표적 세포의 용해에서 더 효과적이었다. 통계 분석은, 표적 MM 세포주가 중간 내지 높은 수준의 CS1 및 BCMA(즉, MM1.S 및 H929)를 발현할 때, 이펙터 세포의 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 집단으로 수행된 세포독성 검정에서 상승 효과가 관찰되었음을 나타냈고, 표적 세포가 낮은 수준 또는 중간 수준의 2개 항원(즉, RPMI-8226)을 발현하는 경우에는 이 효과가 관찰되지 않았다(도 2B).
CS1 및 BCMA를 내인적으로 발현하는 MM 세포의 인식시에 상기 형질도입된 T 세포의 활성화를 추가로 결정하기 위해, 출원인은 비변형 T 세포, EV T 세포, BCMA-CAR T 세포, BsAb T 세포, 및 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포로부터의 상청액에서 ELISA를 통해 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α 분비를 측정했다. BsAb-BCMA seq. trans. T 세포로부터의 IFN-γ 분비는, BCMAhighCS1high MM.1S 또는 BCMAhighCS1int H929 MM 세포주와 공배양하는 경우, BsAb T 세포 또는 BCMA CAR T 세포 단독보다 유의하게 더 높았다. BCMAintCS1low RPMI-8226 MM 세포주와의 공배양 조건에서, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포로부터의 IFN-γ 분비는 BsAb T 세포보다 유의하게 높았지만, BCMA T 세포와 비교하여 유의하게 높지는 않았다. CS1-BCMA- K562 적백혈병 세포주와의 공배양 조건 또는 종양 표적 세포 부재하에서, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포는 BsAb T 세포 또는 BCMA-CAR T 세포에 의한 단일 항원 표적화보다 우수하지 않았다(도 2C). BsAb T 세포, BCMA-CAR T 세포 또는 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포에서 IL-2 생산은, MM.1S, H929 또는 RPMI-8226 MM 세포주와 공배양하는 경우, 비변형 T 세포 또는 EV T 세포보다 극적으로 높았다(도 2D). 흥미롭게도, 음성 대조군 K562 적백혈병 세포주와의 공배양 또는 표적 세포 부재하에서도, BsAb T 세포 및 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포는 BCMA CAR T 세포에서 관찰되는 IL-2 분비보다 유의하게 높은 수준의 고도의 IL-2를 분비했고(도 2D), 이는 적어도 이 경우에 그 효과가, MM 표적 세포로부터의 것이 아닌, 분비된 BsAb 자체의 존재에 기인하여 나타나는 것을 시사한다. TNF-α 분비는 IFN-γ 분비와 일치했다(도 2E). 전반적으로, 이러한 결과는, BsAb T 세포 또는 BCMA-CAR T 세포와 비교하여, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포가 MM 표적 세포를 보다 구체적으로 인식할 수 있고, 이러한 MM 세포의 인식 후에 추가로 활성화되는 것을 나타냈다. 더욱이, 다른 조건과 비교하여, 출원인은 또한, BsAb 작제물을 발현하지 않는 T 세포와 비교하여 이들의 매우 풍부한 IL-2 생산에 의해 입증되는 바와 같이, BsAb T 세포 또는 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포로부터 분비된 BsAb가 MM 세포의 유무에 관계없이 T 세포 활성화를 유발하는 것으로 나타났음에 주목했다(도 2D). 이것은 세포독성 CD8(+) T 세포에서 발현된 NKG2D 수용체가 분비된 BsAb의 존재에 의해 활성화되어 있음을 시사했다.
MM에서 BCMA와 CS1을 모두 표적으로 하는 단일 작제물-조작된 BsAb-CAR T 세포의 생성: 출원인은 2개의 개별 작제물(즉, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포)에 의해 전달된 BCMA-CAR 및 항-NKG2D-항-CS1 BsAb를 공발현하는 T 세포가, BCMA-CAR 또는 BsAb를 발현하는 T 세포와 비교하는 경우, MM 세포의 사멸에 우수한 것에 주의했다. BsAb 및 CAR 둘 다를 발현하는 단일 작제물(이하, BsAb-CAR이라 지칭됨)은 (1) 단일 T 세포에서 양 작제물의 효과적인 발현을 생성하고; (2) 제조 비용의 감소; (3) 시간 절약에서 더 실용적일 것이다. 따라서, 출원인은 T2A에 의해 연결된 렌티바이러스 벡터 골격에서 양 부분을 모두 포함하는 단일 BsAb-CAR 작제물을 생성했다(도 3A). BsAb-CAR을 발현하는 1차 T 세포를 생성하기 위해, 출원인은 상기 기재된 동일한 방법을 사용하고, 이어서 BsAb-CAR-형질도입된 T 세포가 성공적으로 형질도입되었는지의 여부를 결정했다. CAR의 표면 발현은 유세포 분석에 의해 확인했다(도 21C). BsAb 융합 단백질은, 세포 용해물과 혈청-비함유 배지에서 4일차에 6x-his-태그된 Ab(서열번호 111로서 개시된 "6x-his")를 사용하여 성공적으로 검출되었다(도 3B). 추가로, BsAb 분비를 동적으로 측정하기 위해, 출원인은 5일차에 혈청-비함유 배지에서 BsAb-CAR T 세포를 재-파종하고, 이어서 12h, 24h, 48h, 72h 및 96h에서 세포-비함유 상청액을 수집했다. 결과는 발현이 12시간 이전에 개시되고, 시간 의존적 방식으로 계속 증가함에 따라, BsAb 분비가 강력하다는 것을 나타냈다(도 21A-B). 이어서, 출원인은 미분획 BsAb-CAR T 세포가, EV T 세포 및 비변형 T 세포에 의한 사멸과 비교하여, BCMAhighCS1high MM 세포주 MM.1S의 유의하게 우수한 사멸을 나타냄을 입증했다(도 3C). BCMAhighCS1int H929 및 BCMAintCS1low RPMI-8226 MM 표적 세포주에 대해 유사한 결과가 수득되었지만, 음성 대조군 K562 적백혈병 세포주에 대해서는 사멸이 없었다(도 21D). CD8+ T 세포의 대략 80%가 NKG2D의 높은 표면 밀도 발현을 나타내기 때문에(미분획 T 세포의 30%에 대해; 도 11A), 출원인은 BsAb-CAR 작제물을 사용하여 고도로 풍부한 CD8+ T 세포에 형질도입했다. 아마도 예상대로, 출원인은 이들 세포가, BCMAhighCS1high MM.1S MM 세포주에 대해, CD8+ BsAb T 세포 및 CD8+ BCMA-CAR T 세포보다 높은 세포독성, 게다가 2개의 음성 대조군, 비변형 T 세포 및 EV T 세포보다 더 높은 세포독성을 나타내는 것을 발견했다(도 3D).
CAR T 세포에 의해 분비되는 BsAb는 기능하기 위해 2개의 항원을 필요로 한다: 종양 세포 상에서 발현되는 CS1 및 면역 세포 상에서 발현되는 NKG2D. 출원인은 먼저 PBMC 중 TCR pan α/β CD3+T, TCR pan γ/δ CD3+T, CD3+CD56+NKT 및 CD3-CD56+NK 세포의 백분율을 평가했고, 이는 각각 PBMC의 약 50%, 1%, 8% 및 15%를 나타낸다(도 11A). 또한, 출원인은 NKG2D가 T 세포의 약 30%, CD8+T 세포의 80%, γδ T 세포의 70%, NKT 세포의 60% 및 NK 세포의 90%에서 발현되는 것을 확인했다. 주목해야 할 것으로, γδ T 세포의 서브세트인 Vγ9Vδ2 T 세포의 거의 90%가 NKG2D를 발현했다(도 11B 및 11C). 항-NKG2D-항-CS1 BsAb가 NKG2D+ 면역 세포를 유발하는지의 여부를 결정하기 위해, 출원인은 1개의 표적 세포(MM.1S)에 대해 10개의 이펙터(형질도입 또는 비변형된 T 세포)의 비율로 상기한 바와 같은 4시간의 크롬-51 방출 검정을 수행했지만, 상이한 양의 인간 PBMC, 즉 1배, 10배, 100배 또는 200배의 종양 세포를 첨가했다. 출원인은, BsAb T 세포 및/또는 BsAb-CAR T 세포로부터 분비된 BsAb가 비형질도입 NKG2D+ 세포용해 이펙터 세포를 CS1+ MM 세포주 표적으로 동원하는 경우, 비형질도입된 PBMC의 첨가에 의한 희석이 증가함에 따라 표적의 사멸이 증가할 것이라고 가정했다. 이들 가설을 뒷받침하기 위해, 비형질도입된 PBMC가 증가함에 따라, BsAb를 분비하는 형질도입된 T 세포(즉, BsAb T 세포 및 BsAb-CAR T 세포)를 함유하는 배양물만이 BCMAhighCS1high MM.1S MM 세포주에 대해 세포독성의 증가를 나타냈다(도 3E). 예상대로, 효과는 MM.1S MM 세포주보다 CS1의 발현이 낮은 BCMAhighCS1int H929 세포주에 대해 더 완만했고, BCMAintCS1low RPMI-8226 MM 표적 세포주에 대해서는 존재하지 않았다(도 12A, 12B).
이어서, 출원인은 PBMC의 각 서브세트, 즉 NK 세포, NKT 세포, CD8+ T 세포 및 γ9Vδ2 T 세포를 거의 98% 순도로 농후화하고(도 13), 각각 IL-2, CalCer + IL-2, CD3/CD28 Dynabeads + IL-2 및 HMBPP + IL-2로 프라이밍하고, 각각 대조군 또는 실험 벡터 중 하나로 형질도입하고, 이어서 각각에 대해 5:1의 E:T 비에서 BCMAhighCS1high MM.1S MM 세포주에 대한 4시간(도 3F, 좌측) 또는 16시간(도 3F, 우측) 51Cr-방출 세포독성 검정을 수행했다. 4시간 이상의 인큐베이션에서, 결과는 BsAb CAR T 세포가, T 세포 서브세트 또는 활성화 방법에 관계없이, 기타 작제물로 형질도입된 동일한 세포보다 유의하게 더 높은 세포독성을 갖는다는 것을 나타냈다(도 3F 및 14). 중요하게도, 조사된 BsAb CAR T 세포 집단 중에서, 대조군 세포와 비교하여, 활성화된 CD4+ BsAb CAR T 세포는 세포독성 활성의 증가가 가장 적었고(도 3F, 우측 및 도 14), 이는 아마도 적어도 부분적으로는 이 집단에서의 NKG2D의 비교적 낮은 표면 밀도의 발현에 기인하는 것일 수 있다.
BsAb-CAR T 세포에 의해 분비된 BsAb가 BsAb-CAR T 세포와 MM.1S MM 세포 사이의 시냅스 형성을 유도할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 공초점 현미경 분석은 1시간의 공-인큐베이션 후에 수행했다. EV T 세포와 MM.1S MM 세포의 공배양의 조절이 관찰된 경우, 시냅스가 보이지 않았다(도 3G). 대조적으로, BsAb-CAR T 세포와 MM.1S MM 세포의 공배양 동안 시냅스가 관찰되었다(도 3H).
추가로, BsAb CAR-T 세포(녹색)와 표적 MM.1S MM 세포(적색)의 24시간 공배양이 관찰되었을 때, 출원인은 BsAb CAR-T 집단(녹색)만이 존재하지만(도 15A-F); 그러나 EV T 세포와 MM.1S MM 세포의 공배양에서는 표적 MM.1S MM 세포와 이펙터 EV T 세포(녹색) 둘 다가 여전히 존재했음을 관찰했다(도 15G-M).
BsAb-CAR T 세포의 기능적으로 증강된 인식 및 활성화는 CS1 및 BCMA-의존적이다: BsAb-CAR T 세포의 세포독성 효과의 증강이 종양 항원의 표적화에 의존한다는 것을 입증하기 위해, 이어서 출원인은 BsAb-CAR T 세포 내성 K562 세포주에서 CS1 및 BCMA의 강제 과발현이 이 이펙터 집단에 대한 용해의 역치를 저하시킬 수 있는지의 여부를 조사했다. 이러한 목적을 위해, 출원인은, 인간 CS1 및 BCMA(또는 대조군으로서 공 벡터 PCDH)를 코딩하는 렌티바이러스를 K562 세포에 순차적으로 형질도입하여, CS1 및 BCMA를 이소성으로 발현하는 K562 세포주를 생성했다(도 16). 표적 세포주 생성의 성공을 확인한 후(도 4A), 출원인은 51Cr 방출 검정을 수행했고, 그 결과는 K562 적백혈병 세포주에서 CS1 및 BCMA의 과발현이, EV T 세포를 사용한 세포독성과 비교하여, 이 K562 세포주에 대한 BsAb-CAR T 세포의 세포독성 활성의 유의한 증가를 초래한 것을 나타냈다(도 4B, 자주색 선). 이어서, 출원인은 ELISA 분석을 수행했고, 이는, EV T 세포와 K562-CS1-BCMA 세포와의 공배양과 비교하여, BsAb-CAR T 세포 및 K562-CS1-BCMA 세포의 공배양에서 IFN-γ 및 IL-2 분비의 증가를 나타냈다(도 4C, 4D). 그러나, K562-PCDH와 함께 인큐베이팅된 경우, BsAb-CAR T 세포와 EV T 세포 사이에서 세포독성, IFN-γ 및 IL-2 생산에는 차이가 없었다(도 4B-D). 종합적으로, 이러한 데이터는 BsAb-CAR T 세포에 의한 표적 세포의 인식, 사멸 및 사이토카인 분비의 증가가 CS1 및 BCMA 의존적 방식으로 발생한 것을 시사했다.
분비된 항-NKG2D-항-CS1 BsAb는 NKG2D 신호 전달을 통해 시험관내 CAR T 세포 증식 및 생체내 생존 및 증식을 모두 증강시킨다. 일부 환자에서, CAR T 세포는 확장 및 생존 능력의 제한으로 인해 매우 오래 생존하지 못하고, 이에 의해 이들 세포의 효능이 제한될 수 있다42. 예상외로, 출원인은 BsAb 형질도입된 T 세포 및 BsAb-CAR T 세포의 배양 배지가 유사한 시점에서 BsAb 부재하의 다른 조건과 비교하여 더 산성인 것을 발견했고, 이는 세포 대사율이 높은 것을 시사한다(도 5A, 상부). 이 관찰은 이러한 BsAb 형질도입 세포가 표적 세포의 부재 또는 BCMA-CS1- 표적 세포의 존재하에서도 더 많은 사이토카인을 분비할 수 있다는 상기 기재된 데이터와 일치한다(도 2D). 출원인은 BsAb의 발현 및 분비가 T 세포 증식, 생존 및/또는 이의 활성화를 유도할 수 있다고 추측했다. 세포 계수는, 기타 배양 조건과 비교하여, BsAb 또는 BsAb-CAR 작제물로 형질도입된 T 세포를 함유하는 것이 실제로 유의하게 대량의 세포를 함유하고 있음을 확인했고(도 5A, 막대 그래프), 이는, 자주색 세포 추적자에 의해 기록되고, 하부 패널의 히스토그램에 표시된 V450 희석으로 도시되는 T 세포 증식에 기인했다(도 5A, 히스토그램).
이러한 예상치 못한 결과를 확인하기 위해, 출원인은, 도 5A에 도시된 BsAb-CAR T 세포 배양물로부터의 상청액을, BsAb 부재하의 세포 배양 조건, 즉 BCMA CAR T 세포, EV T 세포 및 비변형 T 세포에 첨가했다. 실제로, BsAb-CAR T 세포 배양물로부터의 상청액의 첨가는, BsAb-CAR T 세포 배지로부터의 상청액이 보충되지 않은 BCMA CAR T 세포, EV T 세포 및 비변형 T 세포의 배양물과 비교하여(도시되지 않음), 세포 대사회전에서 발생하는 배지의 황색에 의해 입증되는 바와 같이, 인큐베이션 5일 후에 세포 대사의 정도가 대폭 향상되었다. 세포 계수는, 기타 배양 조건과 비교하여, BsAb-CAR T 세포 배양물로부터의 배지에 대한 이들 보충이 실제로 유의하게 대량의 세포를 함유하고 있음을 확인했고(도 5B, 상부), 이는, 자주색 세포 추적자에 의해 기록되고, 하부 패널의 히스토그램에 표시된 V450 희석으로 도시되는 T 세포 증식에 기인했다(도 5B, 하부). Ki67 염색은, BsAb T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포를 함유하는 배양물에서, 대다수의 NKG2D+ 세포의 대부분 및 NKG2D- 세포의 거의 절반이 증식하고 있음을 나타냈고(도 5C 및 도 17A), 이는 BsAb-활성화된 NKG2D+ 세포가, 정도는 낮았지만, NKG2D- 세포를 또한 활성화할 수 있음을 나타낸다. 더욱이, NKG2D 차단 항체는 분비된 BsAb의 증식 효과를 경감시켰다(도 5C 청색 프레임, 도 17B). 면역블롯 분석을 수행하여 AKT 단백질의 포스포릴화(p)를 결정하고, 분비된 BsAb가 BsAb T 및 BsAb-CAR T 세포 배양 조건하에서 NKG2D+ 세포 증식 및 활성화를 유발할 수 있음을 확인했고, 이는 이들 조건에서는 p-AKT의 수준이 높기 때문이다(도 5D).
지금까지 제시된 데이터는 BsAb에 의한 NKG2D+ 면역 세포의 활성화가 NKG2D 경로를 통해 발생하고 있다는 개념을 뒷받침했다. 이어서, 출원인은, MM 세포뿐만 아니라 NK, NKT, CD8+ T 및 B 세포 또는 이들의 서브세트에서도 발현되는 CS1을 통해 활성화가 발생하는지를 질문했다[참조: Veillette and Guo Crit Rev Oncol Hematol. 2013 Oct;88(1):168-77. doi: 10.1016/j.critrevonc.2013.04.003. Epub 2013 Jun 2; Gogishvili et al. Blood. 2017 Dec 28;130(26):2838-2847. doi: 10.1182/blood-2017-04-778423. Epub 2017 Oct 31.]. 분비된 BsAb가 CS1의 발현과 CS1+ 신호전달 경로를 통해 NKG2D+ 면역 세포도 자극하는지의 여부를 결정하기 위해, 이어서 출원인은 항-CS1 차단 항체를 사용하여 이 경로를 차단했다. 출원인은 CS1 차단이 면역 세포의 활성화 상태에 영향을 미치지 않는다는 것을 발견했다(도 17C). 더욱이, 출원인은 NKG2D 및 CS1 이중 차단을 수행했고, 결과는 NKG2D 단일 차단과 비교하여 차이가 없음을 입증했다(데이터는 제시되지 않음). 종합하면, 이러한 데이터는, BsAb를 분비하는 면역 세포의 활성화가 NKG2D 신호전달 경로를 통해서만 발생한다는 것을 시사한다.
상기 발견에 기초하여, 출원인은, T 세포와 표적 집단인 MM.1S MM 세포와의 공배양에서, 면역 활성화가 NKG2D에 엄격하게 의존하지 않고, T 세포의 NKG2D+ 서브세트에 제한되지 않을 것이라고 예상했다. 예를 들면, BsAb T 및 BsAb-CAR T 세포를 MM.1S MM 세포와 공배양한 경우, CD3+ T 세포의 NKG2D+(도 5E에서 적색; 83% 내지 94%) 및 NKG2D-(도 5E에서 녹색; 79% 내지 87%) 분획은 Ki67 염색에 의해 측정된 바와 같이 광범위한 증식을 나타냈다. 마찬가지로, BCMA CAR만을 발현하는 CD3+ T 세포의 경우(도 5E에서 Fab+로 표시), CD3+ T 세포의 NKG2D+(적색; 90.4%) 및 NKG2D-(녹색; 85.8%) 분획 모두는, NKG2D+ 및 NKG2D- BsAb-CAR T 세포 둘 다에서 관찰된 것보다 약간 적었지만, Ki67 염색에 의해 측정된 바와 같이 광범위한 증식을 나타냈다.
형질도입된 T 세포가 시험관내에서 생존하는 능력을 조사하기 위해, 출원인은 IL-2의 존재 또는 부재하에 다양한 형질도입된 T 세포를 배양했다. IL-2 조건에서, 모든 세포는 높은 Ki67 발현과 낮은 아넥신 V 및/또는 Sytox Blue 발현을 나타냈다(도 6a). 흥미롭게도, IL-2 결핍 조건(도 6b)에서, BsAb T 세포 및 BsAb-CAR T 세포(BsAb를 분비하고 NKG2D를 통해 T 세포를 활성화함)만이 약 80%의 Ki67 발현으로서 더 우수한 증식 능력을 나타냈고, 이는 도 2D에 제시된 데이터와 일치하고 아넥신 V 및/또는 Sytox Blue 염색의 낮은 발현으로 나타낸 바와 같이 세포 아폽토시스 및 사멸의 감소와 일치한다(도 6b). 이러한 결과는 기타 3개 그룹(비변형 T 세포, EV T 세포 및 BCMA-CAR T 세포, 또한 도 6c에서)과 비교된다. 따라서, BsAb-CAR T는 아마도 NKG2D 신호전달 경로를 통해 세포 증식을 증강시키고, 세포 생존을 증대시켰다.
비변형 T 세포, EV T 세포, BCMA CAR T 세포, 및 BsAb-CAR T 세포의 생체내에서의 생존 및 증식을 비교하기 위해, 출원인은 이들 인간 세포를 면역결핍 NSG 마우스에 주사(i.v.)했다(도 7A, 상부). 인간 세포의 정맥내 주사 전의 배경 염색은 또한 -1일에 평가했다(도 7A 및 도 18). +1일차에, 각각의 인간 T 세포 주사를 제공받은 마우스는 동일한 인간 CD3 발현을 나타냈고, 2개의 CAR T 세포 집단은 또한 이들의 F(ab)2 발현에 의해 확인되었다. 더욱이, 활성화 마커 CD69는 NSG 마우스로부터 단리된 4개의 T 세포 집단 모두의 97%에서 검출되었다(도 7A 및 도 18). 흥미롭게도, T 세포 주입의 14일 후, BsAb-CAR T 세포 그룹만이 CD3 및 CD69의 높은 공발현을 유지한 반면, 다른 3개 그룹에서는 CD69 발현이 실질적으로 감소했다(도 7A 및 도 18). 통계 분석은, BsAb-CAR T 세포 그룹의 CD3 및 CD3+CD69+ T 세포 둘 다의 +14일 백분율이 다른 3개 그룹보다 유의하게 높은 것을 나타냈다(도 7B 및 7C). 다양한 형질도입된 T 세포 주사의 35일 후, 히스토그램은 BsAb-CAR T 세포를 주사한 마우스만이 여전히 높은 백분율의 hCD3 T 세포를 보유하는 것을 나타냈다(도 7B). 생체내 증식 데이터는, Ki67+CD69+ 백분율이 약 61.1%이고, 비형질도입 또는 형질도입된 T 세포를 제공받은 다른 3개 그룹보다 유의적으로 높은 것을 나타냈다(도 7a 자주색 코트 패널, 도 7c). 더욱이, 출원인은 또한, 생체내에서의 BsAb-CAR T 세포의 생존을 결정하고, 살아있는 (아넥신 V-Sytox Blue-) BsAb-CAR T 세포의 백분율이 약 87%이고, 사멸(아넥신 V+ Sytox Blue+) BsAb-CAR T 세포의 백분율이 약 5%였음을 관찰했다. 통계 분석은, BsAb-CAR T 세포가, 다른 3개 그룹과 비교하여, 살아있는 세포의 비율이 더 높고 사멸 세포의 비율이 더 낮은 것을 나타냈다(도 7D). 종합하면, BsAb-CAR T 세포는 시험관내에서 NKG2D 신호 전달 경로를 통해 세포 증식의 증강을 나타낼 뿐만 아니라, 주사된 세포의 다른 그룹(BCMA CAR T 세포 포함)과 비교하는 경우, 생체내에서 증식 및 생존의 증강을 입증했다.
생체외에서 BsAb-CAR T 세포에 의한 원발성 골수종 세포의 인식 및 사멸의 개선: BsAb-CAR T 세포의 임상적 관련성을 평가하기 위해, 출원인은 환자로부터 단리된 MM 세포를 효율적으로 인식하여 사멸하고, 생체외에서 IFN-γ 생산을 향상시킬 수 있는지를 조사했다. 8명 환자의 골수로부터 수득된 1차 CD138+ MM 세포는 양성 자기 선택을 사용하여 단리하고, 유세포 분석을 사용하여, BCMA 및 CS1의 표면 발현을 평가했다(도 8A). 자가 PBMC의 부재하에 수행된 51Cr 방출 분석을 사용하여, 출원인은 환자로부터의 MM 세포가 8명의 환자 모두에서 EV-형질도입된 T 세포 매개 용해에 대해 고도로 내성이 있음을 관찰했다. BCMA CAR T 세포 또는 BsAb T 세포와 비교하여, BsAb-CAR T 세포는, 종양 세포가 매우 낮은 CS1의 표면 밀도 발현을 갖는 환자 1을 포함하여, 시험된 8명의 환자 모두에서 유의하게 더 높은 세포독성을 나타냈다. BsAb-CAR T 세포와 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 사이의 세포용해 활성에는 유의한 차이가 없다(도 8B). 출원인은 또한 유사한 공배양 검정에서 24시간 후에 IFN-γ를 측정했고; BsAb-CAR T 세포는 또한, EV-형질도입된 T 세포, BsAb T 세포 또는 BCMA-CAR T 세포보다 유의하게 높은 수준의 IFN-γ를 분비했다(도 8C). 이러한 발견은 BsAb-CAR T 세포가 생체외에서 환자의 MM 세포를 근절하는 우수한 능력을 갖고 있음을 입증한다.
BsAb-CAR T 세포는 동소성 이종이식 MM 모델에서 MM 종양 성장을 억제하고, 종양-보유 마우스의 생존을 연장한다: BsAb-CAR T 세포의 잠재적 치료 적용을 추가로 다루기 위해, 출원인은 MM.1S MM 이식 NSG 마우스 모델에서 이들의 항종양 활성을 조사했다. MM.1S MM 세포의 정맥내 주사는 MM의 마우스 이종이식 모델을 확립하기 위해 광범위하게 사용되어 왔고, 이는 골수 생착, 뿐만 아니라 인간 MM을 밀접하게 재현하는 다발성 골 용해 병변의 일관된 확립을 유도할 수 있기 때문이다43 ,44. 종양 성장의 모니터링을 용이하게 하기 위해, 출원인은 레트로바이러스 감염에 의해 GFP와 반딧불이 루시퍼라제를 모두 발현하도록 MM.1S MM 세포를 조작하고, 이전에 보고된 바와 같이, 0일차에 NSG 마우스를 이식하기 위해 이러한 MM 세포의 8 × 106의 정맥내 주사를 사용했다. 이어서, 이 마우스에게 3회(10일차, 17일차 및 24일차)에 i.v. 생리식염수 또는 1 × 107 EV T 세포, 1 × 107 BsAb T 세포, 1 × 107 BCMA CAR T 세포, 1 × 107 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포, 또는 1 × 107 BsAb-CAR T 세포를 주입했다. 80일까지 생존한 마우스의 경우, 출원인은 말초 혈액 림프구를 수집하고, 1 × 104 MM.1S MM 세포로 마우스를 다시 챌린지했다. 생물발광 이미징을 사용하여 MM.1S MM 성장을 모니터링하고, 6개 치료 그룹 모두에서 31일차까지 조기 질환 진행을 나타낸다(도 9A). BCMA CAR T 세포를 확인하기 위해 항-F(ab)2 항체를 사용하여, 출원인은, 80일차에, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 및 BsAb-CAR T 세포의 백분율이 BCMA CAR T보다 MM.1S MM 마우스의 혈액에서 유의하게 더 높았지만(도 9B), 각 마우스의 총 림프구 수는 유사했음을 관찰했다(데이터는 제시되지 않음). 면역블롯팅은, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포로 처리된 80일차 MM.1S MM 마우스로부터의 혈청이 여전히 분비된 BsAb를 함유했음을 나타냈다(제시되지 않음). 80일차까지, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포로 처리된 MM.1S MM 마우스는 생리식염수 대조군, EV T 세포 또는 BsAb T 세포로 처리된 유사한 마우스와 비교하여 유의하게 연장된 생존을 나타냈다. BCMA CAR T 세포로 처리된 MM.1S MM 마우스는 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포로 처리된 MM.1S MM 마우스보다 약간 더 악화되었다(도 9D). 140일차(제1 종양 재-챌린지로부터 60일 후)에, BsAb-CAR T 그룹으로 처리된 MM.1S MM 마우스 5마리 모두가 생존했다(도 9D). 종양 재-챌린지 후의 이러한 생존 데이터는 상기 도 7에서 기재된 BsAb-CAR T 세포의 생체내 생존율의 증가 및 생체내 증식의 증식을 나타낼 수 있다. 전체적으로, 이러한 결과는 BsAb-CAR T 세포가, MM 종양 성장을 억제하고, 동소성 이종이식 MM 모델에서 종양 보유 마우스의 생존을 연장하는 능력에서, 다른 비형질도입 또는 형질도입 T 세포 집단보다 우수함을 나타낸다.
동소성 이종이식 MM 모델(즉, 도 3E에 도시된 시험관내 실험에 대한 생체내 대응물)에서 인간 비형질도입된 NKG2D+ 림프구의 관련성을 결정하기 위해, 이어서 출원인은, 동일한 공여자로부터 단리된 골수 세포-고갈된 PBMC를 공주입하면, MM.1S MM-보유 NSG 마우스에서 생리식염수 대조군, EV T 세포, BCMA CAR T 세포, 또는 BsAb-CAR T 세포의 항-종양 효능을 조사했다. GVHD를 회피하기 위해, 선별에 의한 골수 세포의 고갈이 수행되었다(도 10A, 10B). MM.1S MM 세포, 정상 인간 림프구 및 다양한 형질도입된 T 세포의 주입에 대한 도식은 도 10A에 제시되어 있고, 37일차까지의 MM 진행을 기록한 이미징도 나타낸다. 도 10B 및 10C는 이들 마우스의 혈액에서 검출된 인간 림프구 백분율을 예시한다. 이러한 조건하에서 추가 시간으로, 출원인은 BCMA CAR T 세포로 처리된 마우스(BsAb를 분비하지 않음, 100일차까지 0% 생존)와 BsAb-CAR T 세포로 처리된 마우스(BsAb를 분비하지 않음; 140일차에 100% 생존, 도 10D) 사이에 극적 차이를 발견했다. 이러한 데이터는, 관여하는 NKG2D+ 면역 세포가 많으면, BsAb-CAR T 세포의 종양 근절에 대한 효능이 높아지는 것을 시사한다.
실시예 2 - BsAb CAR T-세포: 생성 및 효능
본 개시의 BsAb CAR은 제1 항원을 인식하여 결합하는 CAR을 포함하는 반면, BsAb는 제2 항원을 인식하여 결합한다. 두 항원은 하기 목록으로부터 선택되고 서로 상이하다: FLT3, CD19, 메조텔린, 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 암배아성 항원(CEA), GTP-ase-활성화 단백질(GAP), 강글리오사이드 G2(GD2), CD5, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1(ROR1), CD123, CD70, CD38, B 세포 성숙 항원(BCMA), 뮤신 1, ( Muc1), 에프린 A형 수용체 2 전구체(EphA2), 야생형 상피 성장 인자 수용체(EGFRwt), 상피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRVIII), 인터류킨 13 수용체 알파 2(IL13Ra2), CD133, 글리피칸 3(GPC3), 상피 세포 부착 분자 전구체(EpCam), 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 암/정소(CT), 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2C), 종양-관련 당단백질-72(TAG-72), 티미딘 키나제 1(TK1) 및 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT 1).
CAR의 경우, 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 항-제1-TAA 가변 영역에 대한 코딩 서열을 재조합으로 생성하거나, 하이브리도마로부터 유도하고, 링커를 사용하여 재조합할 수 있다. VH-링커-VL 단편은 CD28-CD3제타 부분과 함께 프레임에 도입된다. 항-제1-TAA-scFv-CD28-CD3제타 단편을 pCDH 등의 렌티바이러스 벡터에 서브클로닝하여 2세대 pCDH-제1-TAA CAR 작제물을 생성한다. 항-NKG2D-항-제2-TAA BsAb 렌티바이러스 작제물을 제조하기 위해, 인간 근육 알도스로부터 유래하는 비-면역원성 단백질 링커에 의해 함께 연결된 항-제2-TAA 모노클로날 항체29 및 항-NKG2D 항체로부터 2개의 scFV 또는 1 또는 2개의 코돈 최적화된 일본쇄 가변 단편(scFv)을 pCDH 렌티바이러스 벡터에 클로닝한다. "올인원" BsAb-항-1차 CAR의 경우, 항-제1-TAA-scFv-CD28-CD3ζ-T2A 카세트가 pCDH 항-제2-TAA-NKG2D BsAb-EF1a(임의)-GFP(임의)에 도입하여 완전한 pCDH-항-제1-TAA-CAR-T2A-항-제2-TAA-BsAb-EF1a(임의)-GFP(임의) 렌티바이러스 작제물을 생성한다. 숙련된 기술자에게 명백한 바와 같이, 임상 작제물은 GFP 및 이의 프로모터를 포함하지 않을 것이다. 이들 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 BsAb-CAR을 생성하기 위해 사용된다.
렌티바이러스 형질감염 및 감염은 이전에 보고된 프로토콜에 기재된 바와 같이 수행된다.36 ,37
렌티바이러스를 생산하기 위해, 293T 세포는, 리포펙타민(lipofectamine®) 2000(Invitrogen)을 사용하여 pCDH-항-제1-TAA-CAR-T2A-항-제2-TAA-BsAb-EF1a-GFP 플라스미드 또는 pCDH 공 벡터 플라스미드 + 패키징 플라스미드 pCMV-VSVG 및 pCMV-δr9로 공-형질감염시킨다. 이어서, 렌티바이러스 상청액을 수확하고, 이전에 공개된 프로토콜을 사용하여 K562 세포를 감염시키기 위해 사용한다36 ,38. 형질감염된 세포를 단리하거나, GFP-양성 세포를 FACS Aria II 세포 선별기(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 선별한다.
제1-TAA-K562 K562 세포는, 전장 제1 TAA를 코딩하는 cDNA를 운반하는 벡터로 형질도입된다. 렌티바이러스 생산, 감염 및 선별은 상기 설명한 방법을 사용하여 수행된다. 제2-TAA+제1-TAA+K562 세포는 pCDH-CMV-제2-TAA-EF1α-GFP 렌티바이러스 작제물을 상기 기재된 제1-TAA-K562 세포에 형질도입함으로써 생성된다. 이중 형질도입된 세포를 APC-항-제1-TAA mAb로 염색하고, 이어서 GFP+ 제2-TAA+ 집단에 대해 선별한다. 실험에 사용하기 전에, 이러한 GFP+ 제2-TAA+ 이중 양성 세포는 항-제1-TAA mAb 결합 세포의 손실을 보장하기 위해 배양에서 수회 계대된다.
유세포 분석, 면역블롯팅, 세포독성 검정, ELISA, MM-보유 마우스의 생체내 치료 및 생물발광 이미징, 면역형광 현미경에 의해 검출된 면역-시냅스, 세포 배양, 및 마우스 실험을 상기 기재된 바와 같이 수행했다.
항-제1-TAA-특이적 CAR 및/또는 항-NKG2D-항-제2-TAA 이중특이적 항체를 발현하는 제1 T 세포가 생성된다. 렌티바이러스 벡터 골격을 갖는 특정 항-제1-TAA-CAR 작제물이 생성되고, 이는 순차로 신호 펩티드(SP), 항-제1-TAA 중쇄 가변 영역(VH), 글리신-세린(GS) 링커, 항-제1-TAA 경쇄 가변 영역(VL), 임의의 Myc 태그, 힌지, CD28 막관통 도메인 및 공-자극 도메인, 및 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진다. 이어서, 항-NKG2D-항-제2-TAA 이중특이적 항체("BsAb"로 지칭됨) 작제물은 렌티바이러스 벡터 골격을 사용하여 설계된다. 이것은 인간 근육 알도스(HMA)로부터 유래하는 비면역원성 단백질 링커에 의해 함께 연결된 항-NKG2D 항체 및 항-제2-TAA 모노클로날 항체의 일본쇄 가변 단편(scFv)으로 이루어진다. 각 scFv는 글리신-세린(GS) 링커에 의해 연결된 대응하는 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)를 포함한다. 건강한 공여자로부터 단리되고 항-인간 CD3/CD28 항체 비드에 의해 활성화된 동일한 공여자 T 세포에 공 벡터(EV), BsAb 작제물, 항-제1-TAA-CAR 작제물을 형질도입하거나, 먼저 BsAb 작제물을 형질도입하고, 이어서 항-제1-TAA-CAR 작제물을 순차적으로 형질도입한다. BsAb 작제물 및 항-제1-TAA-CAR 작제물이 성공적으로 형질도입되었는지의 여부를 결정하기 위해, 세포 표면 상의 항-제1-TAA CAR의 발현은 형질도입된 T 세포를 항-Fab로 염색함으로써 입증된다. 추가로, 4일차 배양으로부터 세포-비함유 상청액을 회수하고, 4일간 배양으로부터 세포 펠렛을 용해한다. 이어서, 상청액 및 세포 용해물 둘 모두를, 6x-his 태그된 Ab(서열번호 111로 개시된 "6x-his")를 사용하여 면역블롯팅에 제공한다. 세포 및 분비 BsAb 둘 다의 생산은 BsAb 작제물의 성공적 형질도입을 나타낸다.
이어서, 형질도입된 T 세포는, 시험관내에서 각각의 벡터만을 사용하여 형질도입된 T 세포와 비교하여, MM 세포 등의 암 세포를 사멸하는 효과에 대해 시험된다. 암 세포 및/또는 세포주에서 제1 및 제2 TAA의 표면 발현은, 예를 들면, 유세포 분석에 의해 시험된다. 음성 표적 대조군으로서 제1 TAA 또는 제2 TAA를 발현하지 않는 세포주를 사용하여, 표준 4시간 51Cr 방출 분석을 수행할 수 있다. T 세포의 5개 그룹을 비교한다: (1) 비변형 T 세포, (2) 공 벡터(EV)-형질도입된 T 세포(EV T), (3) 항-NKG2D-항-제2-TAA-BsAb-형질도입된 T 세포(이하 BsAb T로 지칭됨), (4) 항-제1-TAA-CAR-형질도입된 T 세포(이하 항-제1-TAA-CAR T로 지칭됨), 및 (5) 항-NKG2D-항-제2-TAA BsAb 및 항-제1-TAA-CAR 순차 형질도입된 T 세포(BsAb-항-제1-TAA-CAR seq. trans. T로 지칭됨).
제1 TAA 및 제2 TAA를 내인적으로 발현하는 암 세포의 인식시에 상기 형질도입된-T 세포의 활성화를 추가로 결정하기 위해, IFN-γ, IL-2 및 TNF-α 분비는 비변형 T 세포, EV T 세포, 항-제1-TAA-CAR T 세포, BsAb T 세포 및 BsAb-항-제1-TAA-CAR seq. trans.로부터의 상청액에서 ELISA를 통해 측정한다. 결과는 세포독성 CD8(+) T 세포 상에 발현된 NKG2D 수용체가 분비된 BsAb의 존재에 의해 활성화되고 있는 것을 시사할 수 있다.
MM 등의 암 세포에서 제1 TAA 및 제2 TAA 둘 다를 표적으로 하기 위한 단일 작제물-조작된 BsAb-CAR T 세포의 생성: BsAb 및 CAR 둘 다를 발현하는 단일 작제물(이하 BsAb-CAR)은 (1) 단일 T 세포에서 양 작제물의 효과적 발현을 생성하고; (2) 제조 비용의 감소; (3) 시간의 절약에서 더욱 실용적일 것이다. 따라서, 출원인은 T2A에 의해 연결된 렌티바이러스 벡터 골격에서 두 부분을 모두 포함하는 단일 BsAb-CAR 작제물을 생성한다. BsAb-CAR을 발현하는 제1 T 세포를 생성하기 위해, 상기와 동일한 방법을 이용하고, BsAb-CAR-형질도입된 T 세포가 성공적으로 형질도입되었는지의 여부를 결정한다. CAR의 표면 발현은 유세포 분석에 의해 확인할 수 있다. BsAb 융합 단백질은 세포 용해물 및 혈청-비함유 배지 모두에서 4일차에 6x-his-태그된 Ab(서열번호 111로 개시된 "6x-his")를 사용하여 성공적으로 검출될 수 있다. 추가로, BsAb 분비를 동적으로 측정하기 위해, BsAb-CAR T 세포를 5일차에 혈청-비함유 배지에 파종하고, 이어서 세포-비함유 상청액을 12h, 24h, 48h, 72h 및 96h에서 수집한다. 이어서, 미분획 BsAb-CAR T 세포의 세포독성을 시험하고, EV T 세포 및 비변형 T 세포에 의한 표적 세포 사멸과 비교했다.
CAR T 세포에 의해 분비되는 BsAb는 기능하기 위해 2개의 항원을 필요로 한다: 종양 세포 상에서 발현되는 제2 TAA 및 면역 세포 상에서 발현되는 NKG2D. 항-NKG2D-항-제2-TAA BsAb가 NKG2D+ 면역 세포를 유발하는지의 여부를 결정하기 위해, 4시간 크롬-51 방출 검정은 상기한 바와 같이 1개의 표적 세포에 대한 10개의 이펙터(형질도입 또는 비변형된 T 세포)의 비율로 수행하지만, 상이한 양의 인간 PBMC, 즉 1배, 10배, 100배, 또는 200배의 종양 세포를 첨가했다. 이론에 구속되기를 원하지 않고 실시예 1에서 수득된 결과에 기초하여, BsAb T 세포 및/또는 BsAb-CAR T 세포로부터 분비된 BsAb가 비형질도입 NKG2D+ 세포용해 이펙터 세포를 제2 TAA + 암 세포주 표적에 동원하는 경우, 표적의 사멸은 비형질도입 PBMC의 첨가에 의해 희석의 증가에 따라 증대될 것이다.
PBMC의 각 서브세트, 즉 NK 세포, NKT 세포, CD8+ T 세포 및 γ9Vδ2 T 세포는 거의 98% 순도로 농후화시키고, IL-2, CalCer + IL-2, CD3/CD28 Dynabeads + IL-2 및 HMBPP + IL-2으로 각각 프라이밍하고, 대조군 또는 실험 벡터 중 하나로 각각 형질도입하고, 이어서 각각 5:1의 E:T 비율에서 암 세포주에 대한 4h 또는 16h 51Cr-방출 세포독성 검정을 수행했다.
BsAb-CAR T 세포에 의해 분비되는 BsAb가 BsAb-CAR T 세포와 암 세포 사이의 시냅스 형성을 유도할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 공동 현미경 분석은 1시간의 공-인큐베이션 후에 수행된다. 이어서, 공-국재화가 관찰된다.
BsAb-CAR T 세포의 세포독성 효과의 증강이 종양 항원의 표적화에 의존한다는 것을 입증하기 위해, BsAb-CAR T 세포-내성 K562 세포주에서 제1 TAA 및 제2 TAA의 강제적 과발현을 생성하고, 이 이펙터 집단에 대한 용해 역치를 저하시킬 수 있는지에 대해 시험했다. 이 목적을 위해, K562 세포는 제1 TAA와 제2 TAA(또는 대조군으로서 공 벡터 PCDH)를 코딩하는 렌티바이러스로 형질도입되고 제1 TAA와 제2 TAA를 이소적으로 발현하는 K562 세포주를 생성한다. 표적 세포주 생성의 성공을 확인한 후, 51Cr 방출 검정이 수행된다. ELISA 검정을 추가로 수행하여, EV T 세포와 K562-제1-TAA-제2-TAA의 공배양과 비교하여, BsAb-CAR T 세포와 K562-제1-TAA-제2-TAA 세포의 공배양에서 IFN-γ 및 IL-2 분비가 증가하는지의 여부를 나타낸다.
추가로, 분비된 항-NKG2D-항-제2-TAA BsAb가 시험관내 CAR T 세포 증식을 증강시키고, NKG2D 신호전달을 통해 생체내에서 생존 및 증식 둘 다를 증강시키는지의 여부를 시험한다. 세포 수, 세포 증식, 세포 생존율 및 대사는, 유사한 시점에서 BsAb 부재하의 기타 조건과 비교하여, BsAb-형질도입된 T 세포의 배양 배지에서 배양된 BsAb-CAR T 세포에서 측정된다.
형질도입된 T 세포가 시험관내에서 생존하는 능력을 조사하기 위해, 다양한 형질도입된 T 세포를 IL-2의 존재 또는 부재하에 배양한다. Ki67, 아넥신 V 및/또는 Sytox Blue 발현이 평가된다. 비변형 T 세포, EV T 세포, 항-제1 TAA CAR T 세포 및 BsAb-CAR T 세포의 생존 및 증식을 생체내에서 비교하기 위해, 이들 인간 세포를 면역결핍 NSG 마우스에 (정맥내) 주사한다. 인간 세포의 정맥내 주사 전에 배경 염색을 또한 -1일차에 평가한다. CD3, F(ab)2, 활성화 마커 CD69는 주사 후 14일차 및 주사 후 35일차 등의 다양한 날짜에 평가된다.
BsAb-CAR T 세포에 의한 원발성 암 세포의 인식 및 사멸의 개선을 생체외에서 시험한다: BsAb-CAR T 세포의 임상적 관련성을 평가하기 위해, 이들이 환자로부터 단리된 암 세포를 효율적으로 인식하여 사멸시키고, 생체외에서 IFN-γ 생산을 증강시킬 수 있는지를 조사한다. 원발성 암 세포는 환자로부터 수득하고, 양성 자기 선택을 사용하여 단리한다. 유세포 분석은 제1 TAA와 제2 TAA의 표면 발현을 평가하기 위해 사용된다. 51Cr 방출 검정은 자가 PBMC의 부재하에 수행된다. IFN-γ는 유사한 공배양 검정에서 24시간 후에 측정된다.
또한, BsAb-CAR T 세포가 암 종양의 성장을 억제하고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 동소성 이종이식편 MM 모델 등의 암 동물 모델에서 종양 보유 마우스의 생존을 연장하는지의 여부를 시험한다. 암 동물 모델에서 인간 비형질도입 NKG2D+ 림프구의 관련성을 결정하기 위해, 항종양 효능은, 동일한 공여자로부터 단리된 골수 세포가 고갈된 PBMC를 동시 주입하면서, 암 세포-보유 NSG 마우스에서 생리식염수 대조군, EV T 세포, 항-제1-TAA CAR T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포에 대해 검사한다. GVHD를 회피하기 위해, 선별에 의한 골수 세포의 고갈이 수행된다. 암 진행은 37일 이후, 예컨대, 100일, 140일 또는 그 이상 동안 이미지화된다. 인간 림프구의 백분율은 이들 마우스의 혈액에서 검출된다.
등가물
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 이 기술이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 예시적으로 기재된 본 기술은, 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들 없이 적절하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "함유하는(containing)" 등은 제한 없이 광범위하게 읽혀야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 용어로 사용되었고, 이러한 용어 및 표현을 사용하여 표시 및 설명된 특징 또는 그 일부의 임의의 등가물을 배제하려는 의도는 없지만, 청구된 본 기술의 범위 내에서 다양한 수정이 가능하다는 것이 인정된다.
따라서, 본 명세서에 제공된 재료, 방법 및 예는 바람직한 측면을 대표하고, 예시적인 것이며, 본 기술의 범위를 한정하는 것을 의도하는 것은 아니라는 것을 이해해야 한다.
본 기술은 본 명세서에서 광범위하고 일반적으로 설명되었다. 포괄적 개시에 포함되는 더 좁은 종 및 아-속 그룹의 각각은 또한 본 기술의 일부를 형성한다. 여기에는 삭제된 자료가 본 명세서에 구체적으로 기재되었는지의 여부에 관계없이, 속으로부터 주제를 삭제하는 단서 또는 부정적 제한을 수반하는 본 기술의 일반적인 설명이 포함된다.
또한, 본 기술의 특징 또는 측면이 마르쿠쉬(Markush) 그룹의 관점에서 설명되는 경우, 당업자는 본 기술이 이에 의해 마르쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 서브그룹과 관련하여 설명된다는 것을 인식할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 각각이 참조에 의해 개별적으로 도입되는 것과 동일한 정도로 그 전체가 참조에 의해 명시적으로 도입된다. 모순하는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선한다.
기타 측면은 하기 청구범위 내에서 기재된다.
참조문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
부분 서열 목록
IgGl 힌지 도메인: LEPKSCDKTHTCPPCPDPKGT (서열번호 1)
CD28 막관통 및 세포질 도메인:
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(서열번호 2)
CD3 제타 신호전달 도메인:
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SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호 3)
IL2 신호 펩티드: MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 4),
IgGl 신호 펩티드: MGWSSIILFLVATATGVH (서열번호 5)
항-NKG2D 항원 결합 도메인의 CDR:
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CDRL2: YTSNLHS (서열번호 51)
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TLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKR (서열번호 66)
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항-BCMA 중쇄 가변 영역 3:
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFRHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTESGVPIYADDFKGRFAFS
VETSASTAYLVINNLKDEDTASYFCSNDYLYSLDFWGQGTALTVSS (서열번호 70)
항-CS1 항원 결합 도메인의 CDR:
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CDRL2: SASYRYT (서열번호 72)
CDRL3: QQHYSTPLT (서열번호 73)
CDRH1: GYSFTTY (서열번호 74)
CDRH2: HPSDSE (서열번호 75)
CDRH3: STMIATRAMDY (서열번호 76)
항-CS1 경쇄 가변 영역:
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FTFTISNVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK (서열번호 77) 또는
KLELKTGAGFTLPTSYHQQCYYVALDEAQVNSITFTFDTGSGSGTFRDPVGTYRYSASYILLKPSQGPKQQ
YWAVGTIVDQSAKCTISVRDGVSTSMSKQSQTMVIDS (서열번호 154) 또는
DIVMTQSQKSMSTSVGDRVSITCKASQDVITGVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDF
TFTISNVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK (서열번호 78)
항-CS1 중쇄 가변 영역:
SVTVSTGQGWYDMARTAIMTSRACYYVASDESTPSSLQMYATSSSKDVTLTAKDKFKQNLRTESDSPHIMG
IWELGQGPRQKVWNMWYTTFSYGSAKCSLKVSAGPRVLEAGPQQLQVQS (서열번호 79) 또는
SSVTVSTGQGWYDMARTAIMTSRACYYVASDESTPSSLQMYATSSSKDVTLTAKDKFKQNLRTESDSPHIM
GIWELGQGPRQKVWNMWYTTFSYGSAKCSLKVSAGPRVLEAGPQQLQVQ (서열번호 149) 또는
SQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTTYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATL
TVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARSTMIATRAMDYWGQGTSVTVS (서열번호 80) 또는
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTTYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLT
VDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARSTMIATRAMDYWGQGTSVTVSS (서열번호 150)
인간 IgG4 Fc 영역:
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 81)
F234A, L235A 및 N297Q 돌연변이체(즉, 각각 서열번호 81의 aa 16, aa 17 및 aa 79에서 돌연변이체)를 갖는 인간 IgG4 Fc 영역
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 82)
인간 근육 알도라제(HMA) 펩티드 링커: PSGQAGAAASESLFVSNHAY (서열번호 83)
검출가능한 마커: YPYDVPDYA (서열번호 84)
T2A 펩티드: HVGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (서열번호 85)
신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
ATGGGGTGGTCAAGCATTATTCTGTTTCTGGTCGCTACCGCTACAGGCGTCCAT (서열번호 86)
신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT (서열번호 87)
링커 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
GGTGGGGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGAGGTGGCAGT (서열번호 88)
막관통 도메인 및 세포질 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (서열번호 89)
신호전달 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (서열번호 90) 또는 이의 등가물;
절단가능한 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
CACGTGGGTTCTGGAGAAGGACGCGGTTCCTTGTTGACGTGTGGCGATGTAGAGGAAAATCCGGGTCCA (서열번호 91)
링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
CCGAGCGGCCAGGCGGGCGCGGCGGCATCGGAGTCCCTGTTTGTGTCAAATCACGCCTAC (서열번호 92)
항-BCMA 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
GATATTGTTCTTACTCAATCACCCCCAAGCCTTGCGATGTCTCTTGGTAAACGAGCGACAATTAGTTGTAGAGCTTCTGAAAGCGTAACTATTCTTGGGTCACATCTTATTCATTGGTATCAACAAAAGCCGGGACAACCGCCTACACTCTTGATTCAACTCGCGAGCAATGTTCAAACGGGTGTCCCTGCACGCTTTTCTGGGAGCGGTTCACGAACAGATTTTACTCTCACGATTGATCCAGTCGAAGAAGATGATGTCGCTGTATATTATTGTCTCCAAAGTAGGACAATACCAAGAACTTTTGGTGGTGGTACAAAATTGGAAATTAAA (서열번호 93)
항-BCMA 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCACTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATTACCTGCTCCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGGAAGCTCCCCTGGACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGT (서열번호 94)
항-BCMA 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 즉 항-BCMA 서열 1 scFv 경쇄:
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCTGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGACCATCCTGGGCAGCCACCTGATCTACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCCCCCACCCTGCTGATCCAGCTGGCTAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCAGAACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAGCCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGAACAAAGCTGGAAATCAAG (서열번호 95)
항-BCMA 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCTGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGACCATCCTGGGCAGCCACCTGATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCACCCTGCTGATCCAGCTCGCCAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCAGAACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAGCCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAG (서열번호 96)
항-BCMA 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
CAGATCCAGCTGGTGCAGTCCGGCCCCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGAGACCGTGAAGATCTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTCCATCAACTGGGTGAAGCGGGCCCCCGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCTGGATCAACACCGAGACCCGGGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTCCGGGGCCGGTTCGCCTTCTCCCTGGAGACCTCCGCCTCCACCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTTCTGCGCCCTGGACTACTCCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCTCCGTGACCGTGTCCTCC (서열번호 97)
항-BCMA 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
CAGGTGCAGCTGGTCCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGGGCGCCATCTACAACGGCTACGACGTGCTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC (서열번호 98)
항-BCMA 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 즉 항-BCMA 서열 1 scFv 중쇄:
ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACCAGATTCAGCTGGTGCAGAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCCGGCACTACAGCATGAACTGGGTGAAACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCCGGATCAACACCGAGAGCGGCGTGCCCATCTACGCCGACGACTTCAAGGGCAGATTCGCCTTCAGCGTGGAAACCAGCGCCAGCACCGCCTACCTGGTGATCAACAACCTGAAGGACGAGGATACCGCCAGCTACTTCTGCAGCAACGACTACCTGTACAGCCTGGACTTCTGGGGCCAGGGCACCGCCCTGACCGTGTCCAGC (서열번호 99)
항-BCMA 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
CAGATTCAGCTGGTGCAGAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATCAACTGGGTGAAAAGAGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCTGGATCAACACCGAGACAAGAGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTCCGGGGCAGATTCGCCTTCAGCCTGGAAACCAGCGCCAGCACCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTTTTGCGCCCTGGACTACAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCCAGC (서열번호 100)
항-NKG2D 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
CAGTCAGCGCTTACGCAGCCGGCGTCGGTGTCGGGTTCCCCGGGTCAGTCGATCACGATCAGCTGTAGTGGGAGCAGCTCCAACATCGGTAACAACGCAGTGAACTGGTATCAGCAACTGCCGGGAAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTACTATGATGATTTGCTGCCAAGTGGAGTTAGTGACCGCTTTTCCGGCAGTAAATCGGGTACCTCGGCTTTTCTGGCTATTTCGGGTCTCCAGAGCGAGGATGAAGCTGATTATTATTGCGCCGCATGGGATGATAGCTTAAATGGCCCAGTTTTTGGCGGCGGTACTAAACTGACCGTGCTG (서열번호 101)
항-NKG2D 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
CAAGTGCAGCTGGTTGAATCCGGTGGCGGTCTGGTCAAGCCGGGCGGCTCTTTGCGTCTGAGCTGTGCCGCGTCGGGTTTTACCTTCAGCTCTTATGGTATGCATTGGGTGCGTCAGGCGCCTGGCAAAGGTCTGGAGTGGGTTGCGTTCATCCGCTACGATGGGTCTAACAAATATTATGCCGACTCAGTAAAAGGACGCTTCACTATTAGCCGCGACAATAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAAATGAATAGCCTGCGCGCCGAAGATACCGCCGTTTACTATTGCGCTAAAGATCGTGGCCTGGGTGATGGTACGTACTTCGATTACTGGGGTCAGGGCACCACCGTTACCGTTAGTTCA (서열번호 102)
항-FLT3 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAGTGTATTTCTGTCAACAGAGTAACACCTGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG (서열번호 103)
항-FLT3 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTATATGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG (서열번호 104)
항-FLT3 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCATTGAAGCTGTCCTGCAAGTCTTCCGGGTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATCGGAGAGATTGATCCTTCTGACAGTTATAAAGACTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTGGACAGATCCTCCAACACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGCGATTACGACGACCCCCTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (서열번호 105)
항-FLT3 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTTTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAGCACAGACTATAATGCAGCTTTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAGGCTGATGACACAGCCATATACTACTGTGCCAGAAAAGGAGGGATCTACTATGCTAACCATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 106)
항-CS1 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
AAACTTGAGT TGAAGACCGG TGCCGGCTTC ACCTTACCGA CCAGTTATCA TCAACAATGC TATTACGTGG CCCTGGACGA AGCACAGGTG AATTCAATTA CGTTTACGTT TGATACCGGC TCTGGCAGCG GTACATTTCG TGATCCCGTG GGCACTTACC GCTATTCGGC GAGTTATATC TTGCTGAAAC CTTCCCAAGG TCCGAAACAG CAGTACTGGG CGGTTGGCAC CATTGTAGAC CAATCAGCCA AATGTACAAT CTCGGTTCGC GATGGTGTCA GTACGTCGAT GTCTAAGCAG TCACAGACAA TGGTTATCGA T (서열번호 107)
항-CS1 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
AGCGTTACCG TGAGTACAGG CCAGGGCTGG TATGACATGG CACGTACAGC CATCATGACC TCGCGCGCAT GTTACTACGT CGCGTCAGAT GAATCGACGC CTTCCTCGCT GCAAATGTAT GCAACCTCCA GCAGCAAAGA TGTTACCCTG ACCGCAAAGG ACAAGTTTAA ACAGAATTTG CGTACGGAGA GTGACTCCCC GCACATCATG GGAATCTGGG AGTTGGGTCA GGGGCCTCGT CAGAAGGTAT GGAACATGTG GTATACAACT TTTTCGTACG GCTCAGCAAA ATGCAGCTTG AAAGTGTCGG CAGGTCCGCG CGTGCTGGAG GCCGGTCCGC AGCAGCTGCA AGTCCAGTCT (서열번호 108)
힌지 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열:
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCGGATCCCAAAGGTACC (서열번호 109)
펩티드 링커: (글리신-세린)n (여기서, n은 1 내지 6의 정수이다) (서열번호 110)
6x His tag: His His His His His His (서열번호 111)
힌지 도메인: IgGl 중쇄 힌지 코딩 서열:
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG (서열번호 112)
CD28 막관통 영역 코딩 서열:
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAA CAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG (서열번호 113)
4-1BB 공-자극 신호전달 영역 코딩 서열:
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGA
GGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG (서열번호 114)
CD28 공-자극 신호전달 영역 코딩 서열:
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCG
CAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (서열번호 115)
CD3 제타 신호전달 영역 코딩 서열:
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA (서열번호 116)
인간 CD8 알파 힌지 도메인:
PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY (서열번호 117).
마우스 CD8 알파 힌지 도메인:
KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY (서열번호 118)
고양이 CD8 알파 힌지 도메인:
PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY (서열번호 119)
인간 CD8 알파 막관통 도메인: IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (서열번호 120).
마우스 CD8 알파 막관통 도메인: IWAPLAGICVALLLSLIITLI (서열번호 121).
랫트 CD8 알파 막관통 도메인: IWAPLAGICAVLLLSLVITLI (서열번호 122)
4-1BB 공자극 신호전달 영역:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (서열번호 123)
CD28 서열: MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS (서열번호 124)
ICOS 공자극 신호전달 영역 코딩 서열:
ACAAAAAAGA AGTATTCATC CAGTGTGCAC GACCCTAACG GTGAATACAT GTTCATGAGA GCAGTGAACA CAGCCAAAAA ATCCAGACTC ACAGATGTGA CCCTA (서열번호 125)
0X40 공자극 신호전달 영역 코딩 서열:
AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGAC CCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC (서열번호 126)
인간 FLT3 동형 1,
MPALARDGGQLPLLVVFSAMIFGTITNQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNISFYATIGVCLLFIVVLTLLICHKYKKQFRYESQLQMVQVTGSSDNEYFYVDFREYEYDLKWEFPRENLEFGKVLGSGAFGKVMNATAYGISKTGVSIQVAVKMLKEKADSSEREALMSELKMMTQLGSHENIVNLLGACTLSGPIYLIFEYCCYGDLLNYLRSKREKFHRTWTEIFKEHNFSFYPTFQSHPNSSMPGSREVQIHPDSDQISGLHGNSFHSEDEIEYENQKRLEEEEDLNVLTFEDLLCFAYQVAKGMEFLEFKSCVHRDLAARNVLVTHGKVVKICDFGLARDIMSDSNYVVRGNARLPVKWMAPESLFEGIYTIKSDVWSYGILLWEIFSLGVNPYPGIPVDANFYKLIQNGFKMDQPFYATEEIYIIMQSCWAFDSRKRPSFPNLTSFLGCQLADAEEAMYQNVDGRVSECPHTYQNRRPFSREMDLGLLSPQAQVEDS (서열번호 127)
인간 FLT3 동형 2:
MPALARDGGQLPLLVVFSAMIFGTITNQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNISFYATIGVCLLFIVVLTLLICHKYKKQFRYESQLQMVQVTGSSDNEYFYVDFREYEYDLKWEFPRENLEFGKVLGSGAFGKVMNATAYGISKTGVSIQVAVKMLKEKADSSEREALMSELKMMTQLGSHENIVNLLGACTLSGPIYLIFEYCCYGDLLNYLRSKREKFHRTWTEIFKEHNFSFYPTFQSHPNSSMPGSREVQIHPDSDQISGLHGNSFHSEDEIEYENQKRLEEEEDLNVLTFEDLLCFAYQVAKGMEFLEFKSARLPVKWMAPESLFEGIYTIKSDVWSYGILLWEIFSLGVNPYPGIPVDANFYKLIQNGFKMDQPFYATEEIYIIMQSCWAFDSRKRPSFPNLTSFLGCQLADAEEAMYQNVDGRVSECPHTYQNRRPFSREMDLGLLSPQAQVEDS (서열번호 128)
EGFR 동형 1, Uniprot P00533-1 :
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA (서열번호 129)
EGFR 동형 3, Uniprot P00533-3 :
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGPGNESLKAMLFCLFKLSSCNQSNDGSVSHQSGSPAAQESCLGWIPSLLPSEFQLGWGGCSHLHAWPSASVIITASSCH (서열번호 130)
EGFRvIII, Uniprot P00533 [30-297]:
MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKV CQGTSNKLTQ LGTFEDHFLS LQRMFNNCEV VLGNLEITYV QRNYDLSFLK TIQEVAGYVL IALNTVERIPLENLQIIRGN MYYENSYALA VLSNYDANKT GLKELPMRNL QEILHGAVRF SNNPALCNVE SIQWRDIVSS DFLSNMSMDF QNHLGSCQKC DPSCPNGSCWGAGEENCQKL TKIICAQQCS GRCRGKSPSD CCHNQCAAGC TGPRESDCLV CRKFRDEATC KDTCPPLMLY NPTTYQMDVN PEGKYSFGAT CVKKCPRNYV VTDHGSCVRA CGADSYEMEE DGVRKCKKCE GPCRKVCNGI GIGEFKDSLS INATNIKHFK NCTSISGDLH ILPVAFRGDS FTHTPPLDPQ ELDILKTVKE ITGFLLIQAW PENRTDLHAF ENLEIIRGRT KQHGQFSLAV VSLNITSLGL RSLKEISDGD VIISGNKNLC YANTINWKKL FGTSGQKTKI ISNRGENSCK ATGQVCHALC SPEGCWGPEP RDCVSCRNVS RGRECVDKCN LLEGEPREFV ENSECIQCHP ECLPQAMNIT CTGRGPDNCI QCAHYIDGPH CVKTCPAGVM GENNTLVWKY ADAGHVCHLC HPNCTYGCTG PGLEGCPTNG PKIPSIATGM VGALLLLLVV ALGIGLFMRR RHIVRKRTLR RLLQERELVE PLTPSGEAPN QALLRILKET EFKKIKVLGS GAFGTVYKGL WIPEGEKVKI PVAIKELREATSPKANKEIL DEAYVMASVD NPHVCRLLGI CLTSTVQLIT QLMPFGCLLDYVREHKDNIG SQYLLNWCVQ IAKGMNYLED RRLVHRDLAA RNVLVKTPQHVKITDFGLAK LLGAEEKEYH AEGGKVPIKW MALESILHRI YTHQSDVWSYGVTVWELMTF GSKPYDGIPA SEISSILEKG ERLPQPPICT IDVYMIMVKC WMIDADSRPK FRELIIEFSK MARDPQRYLV IQGDERMHLPLMDEEDMDDV VDADEYLIPQ QGFFSSPSTS RTPLLSSLSA TSNNSTVACIDRNGLQSCPI KEDSFLQRYS SDPTGALTED SIDDTFLPVP EYINQSVPKRPAGSVQNPVY HNQPLNPAPS RDPHYQDPHS TAVGNPEYLN TVQPTCVNSTFDSPAHWAQK GSHQISLDNP DYQQDFFPKE AKPNGIFKGS TAENAEYLRVAPQSSEFIGA (서열번호 131)
항-EGFR 중쇄 가변 영역 1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드:
GACATTCTAATGACCCAATCTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCTACCTGCAAAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCGACCGATTTTACCTGCAAAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCGACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTAGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATATTCCTCCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTGCGGCC (서열번호 132)
항-EGFR 경쇄 가변 영역 1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드:
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGTCTGAGATGGCGAGGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGCCCTGCAAGGCTTCTGGCGACACATTCACCAGTTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCATGGACATGGCCCTGAGTGGATCGGAAATATTTATCCAGGTAGTGGTGGTACTAACTACGCTGAGAAGTTCAAGAACAAGGTCACTCTGACTGTAGACAGGTCCTCCCGCACAGTCTACATGCACCTCAGCAGGCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTACAAGATCGGGGGGTCCCTACTTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCC (서열번호 133)
링커: GGGGS (서열번호 134).
링커: (GGGGS)n, 여기서, n은 1 (서열번호 134), 또는 2 (서열번호 135), 또는 3 (서열번호 14), 또는 4 (서열번호 136), 또는 5 (서열번호 137), 또는 6 (서열번호 138), 또는 7 (서열번호 139), 또는 8 (서열번호 140), 또는 9 (서열번호 141), 또는 10 (서열번호 142), 또는 11 (서열번호 143), 또는 12 (서열번호 144), 또는 13 (서열번호 145), 또는 14 (서열번호 146), 또는 15 (서열번호 147), 또는 그 이상의 정수이다.
EF1 알파 프로모터 서열:
AAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC (서열번호 148)
서열번호 71의 역 서열: AVGTIVDQSAK (서열번호 151)
STAT3 관련 모티프: YXXQ (서열번호 152)
STAT3 관련 모티프: YRHQ (서열번호 153).
서열번호 77의 역 서열:
KLELKTGAGFTLPTSYHQQCYYVALDEAQVNSITFTFDTGSGSGTFRDPVGTYRYSASYILLKPSQGPKQQYWAVGTIVDQSAKCTISVRDGVSTSMSKQSQTMVIDS (서열번호 154)
항-BCMA 서열 2 scFv 중쇄 (서열번호 99 및 95)
ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACCAGATTCAGCTGGTGCAGAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATCAACTGGGTGAAAAGAGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCTGGATCAACACCGAGACAAGAGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTCCGGGGCAGATTCGCCTTCAGCCTGGAAACCAGCGCCAGCACCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTTTTGCGCCCTGGACTACAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCCAGC (서열번호 155)
항-BCMA 서열 2 scFv 경쇄
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCTGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGACCATCCTGGGCAGCCACCTGATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCACCCTGCTGATCCAGCTCGCCAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCAGAACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAGCCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAG (서열번호 156)
항-CS-1 scFv 중쇄 DNA 서열
AGCGTTACCG TGAGTACAGG CCAGGGCTGG TATGACATGG CACGTACAGC CATCATGACC TCGCGCGCAT GTTACTACGT CGCGTCAGAT GAATCGACGC CTTCCTCGCT GCAAATGTAT GCAACCTCCA GCAGCAAAGA TGTTACCCTG ACCGCAAAGG ACAAGTTTAA ACAGAATTTG CGTACGGAGA GTGACTCCCC GCACATCATG GGAATCTGGG AGTTGGGTCA GGGGCCTCGT CAGAAGGTAT GGAACATGTG GTATACAACT TTTTCGTACG GCTCAGCAAA ATGCAGCTTG AAAGTGTCGG CAGGTCCGCG CGTGCTGGAG GCCGGTCCGC AGCAGCTGCA AGTCCAGTCT (서열번호 157)
항-CS-1 scFv 경쇄 DNA 서열
AAACTTGAGT TGAAGACCGG TGCCGGCTTC ACCTTACCGA CCAGTTATCA TCAACAATGC TATTACGTGG CCCTGGACGA AGCACAGGTG AATTCAATTA CGTTTACGTT TGATACCGGC TCTGGCAGCG GTACATTTCG TGATCCCGTG GGCACTTACC GCTATTCGGC GAGTTATATC TTGCTGAAAC CTTCCCAAGG TCCGAAACAG CAGTACTGGG CGGTTGGCAC CATTGTAGAC CAATCAGCCA AATGTACAAT CTCGGTTCGC GATGGTGTCA GTACGTCGAT GTCTAAGCAG TCACAGACAA TGGTTATCGA T (서열번호 158)
항-NKG2D 중쇄 DNA 서열
CAAGTGCAGC TGGTTGAATC CGGTGGCGGT CTGGTCAAGC CGGGCGGCTC TTTGCGTCTG AGCTGTGCCG CGTCGGGTTT TACCTTCAGC TCTTATGGTA TGCATTGGGT GCGTCAGGCG CCTGGCAAAG GTCTGGAGTG GGTTGCGTTC ATCCGCTACG ATGGGTCTAA CAAATATTAT GCCGACTCAG TAAAAGGACG CTTCACTATT AGCCGCGACA ATAGCAAAAA TACCCTGTAC CTGCAAATGA ATAGCCTGCG CGCCGAAGAT ACCGCCGTTT ACTATTGCGC TAAAGATCGT GGCCTGGGTG ATGGTACGTA CTTCGATTAC TGGGGTCAGG GCACCACCGT TACCGTTAGT TCA (서열번호 159)
항-NKG2D 경쇄 DNA 서열
CAGTCAGCGC TTACGCAGCC GGCGTCGGTG TCGGGTTCCC CGGGTCAGTC GATCACGATC AGCTGTAGTG GGAGCAGCTC CAACATCGGT AACAACGCAG TGAACTGGTA TCAGCAACTG CCGGGAAAAG CGCCGAAACT GCTGATTTAC TATGATGATT TGCTGCCAAG TGGAGTTAGT GACCGCTTTT CCGGCAGTAA ATCGGGTACC TCGGCTTTTC TGGCTATTTC GGGTCTCCAG AGCGAGGATG AAGCTGATTA TTATTGCGCC GCATGGGATG ATAGCTTAAA TGGCCCAGTT TTTGGCGGCG GTACTAAACT GACCGTGCTG (서열번호 160)
링커
GGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCT (서열번호 161)
항-NKG2D 중쇄
CAAGTGCAGCTGGTTGAATCCGGTGGCGGTCTGGTCAAGCCGGGCGGCTCTTTGCGTCTGAGCTGTGCCGCGTCGGGTTTTACCTTCAGCTCTTATGGTATGCATTGGGTGCGTCAGGCGCCTGGCAAAGGTCTGGAGTGGGTTGCGTTCATCCGCTACGATGGGTCTAACAAATATTATGCCGACTCAGTAAAAGGACGCTTCACTATTAGCCGCGACAATAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAAATGAATAGCCTGCGCGCCGAAGATACCGCCGTTTACTATTGCGCTAAAGATCGTGGCCTGGGTGATGGTACGTACTTCGATTACTGGGGTCAGGGCACCACCGTTACCGTTAGTTCAGGTGGGGGCGGCTCT (서열번호 162)
항-NKG2D 경쇄
CAGCGCTTACGCAGCCGGCGTCGGTGTCGGGTTCCCCGGGTCAGTCGATCACGATCAGCTGTAGTGGGAGCAGCTCCAACATCGGTAACAACGCAGTGAACTGGTATCAGCAACTGCCGGGAAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTACTATGATGATTTGCTGCCAAGTGGAGTTAGTGACCGCTTTTCCGGCAGTAAATCGGGTACCTCGGCTTTTCTGGCTATTTCGGGTCTCCAGAGCGAGGATGAAGCTGATTATTATTGCGCCGCATGGGATGATAGCTTAAATGGCCCAGTTTTTGGCGGCGGTACTAAACTGACCGTGCTG (서열번호 163)
항-CS1 중쇄
CTCCGTGACGGTGTCGACGGGCCAAGGATGGTACGATATGGCACGGACCGCGATTATGACATCGCGGGCGTGCTATTACGTGGCCAGCGATGAGTCGACCCCTTCCTCTCTGCAAATGTATGCCACCTCCTCTTCAAAAGACGTGACTCTGACTGCGAAAGACAAATTTAAACAGAATCTGCGCACCGAAAGCGATAGCCCACATATCATGGGCATCTGGGAACTGGGCCAGGGCCCCCGCCAGAAAGTGTGGAACATGTGGTACACCACCTTCAGCTATGGTTCGGCCAAATGTTCCCTGAAGGTATCAGCCGGCCCGCGCGTTCTTGAGGCGGGTCCGCAGCAGCTGCAGGTACAGAGC (서열번호 164)
항-CS1 경쇄
AAACTGGAACTCAAGACGGGTGCGGGATTTACCCTCCCTACGAGCTATCACCAGCAGTGCTATTACGTGGCGCTTGACGAAGCGCAGGTGAACTCTATTACCTTTACCTTTGATACAGGATCAGGCAGCGGTACGTTCCGTGATCCGGTAGGTACGTACCGGTATAGTGCAAGCTATATCCTTCTGAAACCTTCTCAGGGTCCGAAACAGCAGTACTGGGCGGTGGGAACGATCGTGGACCAGTCTGCCAAATGTACAATTTCAGTTCGCGACGGAGTTAGCACCTCCATGAGCAAGCAGTCCCAAACCATGGTGATTGACTCT (서열번호 165)
항-BCMA 중쇄 서열 2
CAGATTCAGCTGGTGCAGAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATCAACTGGGTGAAAAGAGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCTGGATCAACACCGAGACAAGAGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTCCGGGGCAGATTCGCCTTCAGCCTGGAAACCAGCGCCAGCACCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTTTTGCGCCCTGGACTACAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCCAGC (서열번호 166)
항-BCMA 경쇄 서열 2
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCTGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGACCATCCTGGGCAGCCACCTGATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCACCCTGCTGATCCAGCTCGCCAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCAGAACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAGCCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAG (서열번호 167)
IgGl 중쇄 신호 펩티드
DNA
ATGGAATTTGGGCTGCGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGATGTCCAGTGT (서열번호 168)
단백질
MEFGLRWVFLVAILKDVQC (서열번호 169)
IgGl FcDNA
GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGAGCTGCAACTGGAGGAGAGCTGTGCGGAGGCGCAGGACGGGGAGCTGGACGGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCATCACACTCTTCCTGTTAAGCGTGTGCTACAGTGCCACCGTCACCTTCTTCAAGGTGAAGTGGATCTTCTCCTCGGTGGTGGACCTGAAGCAGACCATCATCCCCGACTACAGGAACATGATCGGACAGGGGGCC (서열번호 170)
IgGl FcDNA에 의해 코딩된 단백질
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESCAEAQDGELDGLWTTITIFITLFLLSVCYSATVTFFKVKWIFSSVVDLKQTIIPDYRNMIGQGA (서열번호 171)
SEQUENCE LISTING <110> CYTOIMMUNE THERAPEUTICS, INC. <120> BISPECIFIC ANTIBODY CAR CELL IMMUNOTHERAPY <130> 113086-0113 <150> 62/898,503 <151> 2019-09-10 <160> 174 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 Asp Pro Lys Gly Thr 20 <210> 2 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser 20 25 30 Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly 35 40 45 Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala 50 55 60 Ala Tyr Arg Ser 65 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Arg Val 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 13 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Ser Gly Gly Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Ser Ser Gly Trp Ser Glu Tyr 1 5 <210> 43 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 43 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Asn 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala Ala 115 <210> 44 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Val Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His His Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Tyr Ala His Asn Ser 100 105 110 <210> 45 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Met Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Pro Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly His Gly Pro Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His 1 5 10 15 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Gly Tyr Thr 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1 5 <210> 65 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly 1 5 10 15 Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu 20 25 30 Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg 85 90 95 Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 66 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 66 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 68 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 69 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 69 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Thr Gly Val Ala 1 5 10 <210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 74 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 1 5 <210> 75 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 His Pro Ser Asp Ser Glu 1 5 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Ser Thr Met Ile Ala Thr Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 77 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 77 Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Ser Met Ser Thr Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Thr 20 25 30 Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Asn Val Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 78 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 78 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Ser Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Thr Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 80 Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr 20 25 30 Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys 50 55 60 Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Ala Thr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 115 120 <210> 81 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 ggtgggggcg gctctggtgg cggtggcagc ggcggaggtg gcagt 45 <210> 89 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 89 ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60 gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120 aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180 cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204 <210> 90 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 90 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336 <210> 91 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 cacgtgggtt ctggagaagg acgcggttcc ttgttgacgt gtggcgatgt agaggaaaat 60 ccgggtcca 69 <210> 92 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 ccgagcggcc aggcgggcgc ggcggcatcg gagtccctgt ttgtgtcaaa tcacgcctac 60 <210> 93 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 93 gatattgttc ttactcaatc acccccaagc cttgcgatgt ctcttggtaa acgagcgaca 60 attagttgta gagcttctga aagcgtaact attcttgggt cacatcttat tcattggtat 120 caacaaaagc cgggacaacc gcctacactc ttgattcaac tcgcgagcaa tgttcaaacg 180 ggtgtccctg cacgcttttc tgggagcggt tcacgaacag attttactct cacgattgat 240 ccagtcgaag aagatgatgt cgctgtatat tattgtctcc aaagtaggac aataccaaga 300 acttttggtg gtggtacaaa attggaaatt aaa 333 <210> 94 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 94 gacatccaga tgacccagag ccctagctca ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60 attacctgct ccgccagcca ggacatcagc aactacctga actggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac acctccaacc tgcactccgg cgtgcccagc 180 aggttcagcg gaagcggcag cggcaccgat ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaggaagc tcccctggac tttcggccag 300 ggcaccaaac tggagatcaa gcgt 324 <210> 95 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 95 gacatcgtgc tgacccagag cccccccagc ctggccatgt ctctgggcaa gagagccacc 60 atcagctgcc gggccagcga gagcgtgacc atcctgggca gccacctgat ctactggtat 120 cagcagaagc ctggccagcc ccccaccctg ctgatccagc tggctagcaa tgtgcagacc 180 ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc agcagaaccg acttcaccct gaccatcgac 240 cccgtggaag aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagccggac catcccccgg 300 acctttggcg gaggaacaaa gctggaaatc aag 333 <210> 96 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 96 gacatcgtgc tgacccagag cccccccagc ctggccatgt ctctgggcaa gagagccacc 60 atcagctgcc gggccagcga gagcgtgacc atcctgggca gccacctgat ccactggtat 120 cagcagaagc ccggccagcc ccccaccctg ctgatccagc tcgccagcaa tgtgcagacc 180 ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc agcagaaccg acttcaccct gaccatcgac 240 cccgtggaag aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagccggac catcccccgg 300 acctttggcg gaggcaccaa actggaaatc aag 333 <210> 97 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 97 cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgaagaagc ccggcgagac cgtgaagatc 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactactcca tcaactgggt gaagcgggcc 120 cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacaccg agacccggga gcccgcctac 180 gcctacgact tccggggccg gttcgccttc tccctggaga cctccgcctc caccgcctac 240 ctgcagatca acaacctgaa gtacgaggac accgccacct acttctgcgc cctggactac 300 tcctacgcca tggactactg gggccagggc acctccgtga ccgtgtcctc c 351 <210> 98 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 98 caggtgcagc tggtccagag cggcgccgaa gtgaagaagc ccggcagctc cgtgaaagtg 60 agctgcaagg ccagcggcgg caccttcagc aactactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cccggacagg gcctggagtg gatgggcgcc acctacaggg gccacagcga cacctactac 180 aaccagaagt tcaagggccg ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctcag gagcgaggac accgctgtgt attactgcgc caggggcgcc 300 atctacaacg gctacgacgt gctggacaac tggggccagg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agc 363 <210> 99 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 99 atgggatgga gctctatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccaccagatt 60 cagctggtgc agagcggccc tgagctgaag aaacccggcg agacagtgaa gatcagctgc 120 aaggcctccg gctacacctt ccggcactac agcatgaact gggtgaaaca ggcccctggc 180 aagggcctga agtggatggg ccggatcaac accgagagcg gcgtgcccat ctacgccgac 240 gacttcaagg gcagattcgc cttcagcgtg gaaaccagcg ccagcaccgc ctacctggtg 300 atcaacaacc tgaaggacga ggataccgcc agctacttct gcagcaacga ctacctgtac 360 agcctggact tctggggcca gggcaccgcc ctgaccgtgt ccagc 405 <210> 100 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 100 cagattcagc tggtgcagag cggccctgag ctgaagaaac ccggcgagac agtgaagatc 60 agctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacagca tcaactgggt gaaaagagcc 120 cctggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacaccg agacaagaga gcccgcctac 180 gcctacgact tccggggcag attcgccttc agcctggaaa ccagcgccag caccgcctac 240 ctgcagatca acaacctgaa gtacgaggac accgccacct acttttgcgc cctggactac 300 agctacgcca tggactactg gggccagggc accagcgtga ccgtgtccag c 351 <210> 101 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 101 cagtcagcgc ttacgcagcc ggcgtcggtg tcgggttccc cgggtcagtc gatcacgatc 60 agctgtagtg ggagcagctc caacatcggt aacaacgcag tgaactggta tcagcaactg 120 ccgggaaaag cgccgaaact gctgatttac tatgatgatt tgctgccaag tggagttagt 180 gaccgctttt ccggcagtaa atcgggtacc tcggcttttc tggctatttc gggtctccag 240 agcgaggatg aagctgatta ttattgcgcc gcatgggatg atagcttaaa tggcccagtt 300 tttggcggcg gtactaaact gaccgtgctg 330 <210> 102 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 102 caagtgcagc tggttgaatc cggtggcggt ctggtcaagc cgggcggctc tttgcgtctg 60 agctgtgccg cgtcgggttt taccttcagc tcttatggta tgcattgggt gcgtcaggcg 120 cctggcaaag gtctggagtg ggttgcgttc atccgctacg atgggtctaa caaatattat 180 gccgactcag taaaaggacg cttcactatt agccgcgaca atagcaaaaa taccctgtac 240 ctgcaaatga atagcctgcg cgccgaagat accgccgttt actattgcgc taaagatcgt 300 ggcctgggtg atggtacgta cttcgattac tggggtcagg gcaccaccgt taccgttagt 360 tca 363 <210> 103 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 103 gatattgtgc taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcagt 60 ctttcctgca gggccagcca gagtattagc aacaacctac actggtatca acaaaaatca 120 catgagtctc caaggcttct catcaagtat gcttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 180 aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca gtatcaacag tgtggagact 240 gaagattttg gagtgtattt ctgtcaacag agtaacacct ggccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa acgg 324 <210> 104 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 104 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgagtgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctatatggcc 120 tggtatcagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctacggggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaaccgattt cactcttacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga tcatagttat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gg 342 <210> 105 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 105 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc attgaagctg 60 tcctgcaagt cttccgggta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaggcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgacagtta taaagactac 180 aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtggaca gatcctccaa cacagcctac 240 atgcacctca gcagcctgac atctgatgac tctgcggtct attattgtgc aagagcgatt 300 acgacgaccc cctttgactt ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 106 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 106 caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60 acctgcacag tctctggttt ctcattaact aactatggtt tacactgggt tcgccagtct 120 ccaggaaagg gcctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaagcac agactataat 180 gcagctttca tatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttcttt 240 aaaatgaaca gtctgcaggc tgatgacaca gccatatact actgtgccag aaaaggaggg 300 atctactatg ctaaccatta ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 107 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 107 aaacttgagt tgaagaccgg tgccggcttc accttaccga ccagttatca tcaacaatgc 60 tattacgtgg ccctggacga agcacaggtg aattcaatta cgtttacgtt tgataccggc 120 tctggcagcg gtacatttcg tgatcccgtg ggcacttacc gctattcggc gagttatatc 180 ttgctgaaac cttcccaagg tccgaaacag cagtactggg cggttggcac cattgtagac 240 caatcagcca aatgtacaat ctcggttcgc gatggtgtca gtacgtcgat gtctaagcag 300 tcacagacaa tggttatcga t 321 <210> 108 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 108 agcgttaccg tgagtacagg ccagggctgg tatgacatgg cacgtacagc catcatgacc 60 tcgcgcgcat gttactacgt cgcgtcagat gaatcgacgc cttcctcgct gcaaatgtat 120 gcaacctcca gcagcaaaga tgttaccctg accgcaaagg acaagtttaa acagaatttg 180 cgtacggaga gtgactcccc gcacatcatg ggaatctggg agttgggtca ggggcctcgt 240 cagaaggtat ggaacatgtg gtatacaact ttttcgtacg gctcagcaaa atgcagcttg 300 aaagtgtcgg caggtccgcg cgtgctggag gccggtccgc agcagctgca agtccagtct 360 <210> 109 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 ctcgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccgga tcccaaaggt 60 acc 63 <210> 110 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> This sequence may encompass 1-6 "Gly Ser" repeating units <400> 110 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 111 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 111 His His His His His His 1 5 <210> 112 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 ctcgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccg 48 <210> 113 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60 gcctttatta ttttctgggt g 81 <210> 114 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 114 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 115 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 115 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 116 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 116 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339 <210> 117 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 1 5 10 15 Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg 20 25 30 Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 35 40 45 Asp Ile Tyr 50 <210> 118 <211> 49 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 118 Lys Val Asn Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro 1 5 10 15 Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg 20 25 30 Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 35 40 45 Tyr <210> 119 <211> 51 <212> PRT <213> Felis sp. <400> 119 Pro Val Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Gln Ala 1 5 10 15 Pro Ile Thr Thr Ser Gln Arg Val Ser Leu Arg Pro Gly Thr Cys Gln 20 25 30 Pro Ser Ala Gly Ser Thr Val Glu Ala Ser Gly Leu Asp Leu Ser Cys 35 40 45 Asp Ile Tyr 50 <210> 120 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr 20 <210> 121 <211> 21 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 121 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ile Ile Thr Leu Ile 20 <210> 122 <211> 21 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 122 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Ala Val Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Val Ile Thr Leu Ile 20 <210> 123 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 123 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 124 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 124 Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 1 5 10 15 Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 20 25 30 Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 35 40 45 Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 50 55 60 Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 65 70 75 80 Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 85 90 95 Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 115 120 125 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 130 135 140 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 145 150 155 160 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 165 170 175 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 180 185 190 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 195 200 205 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 210 215 220 <210> 125 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 125 acaaaaaaga agtattcatc cagtgtgcac gaccctaacg gtgaatacat gttcatgaga 60 gcagtgaaca cagccaaaaa atccagactc acagatgtga cccta 105 <210> 126 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 126 agggaccaga ggctgccccc cgatgcccac aagccccctg ggggaggcag tttccggacc 60 cccatccaag aggagcaggc cgacgcccac tccaccctgg ccaagatc 108 <210> 127 <211> 993 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Met Pro Ala Leu Ala Arg Asp Gly Gly Gln Leu Pro Leu Leu Val Val 1 5 10 15 Phe Ser Ala Met Ile Phe Gly Thr Ile Thr Asn Gln Asp Leu Pro Val 20 25 30 Ile Lys Cys Val Leu Ile Asn His Lys Asn Asn Asp Ser Ser Val Gly 35 40 45 Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu Ser Pro Glu Asp Leu Gly 50 55 60 Cys Ala Leu Arg Pro Gln Ser Ser Gly Thr Val Tyr Glu Ala Ala Ala 65 70 75 80 Val Glu Val Asp Val Ser Ala Ser Ile Thr Leu Gln Val Leu Val Asp 85 90 95 Ala Pro Gly Asn Ile Ser Cys Leu Trp Val Phe Lys His Ser Ser Leu 100 105 110 Asn Cys Gln Pro His Phe Asp Leu Gln Asn Arg Gly Val Val Ser Met 115 120 125 Val Ile Leu Lys Met Thr Glu Thr Gln Ala Gly Glu Tyr Leu Leu Phe 130 135 140 Ile Gln Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Thr Ile Leu Phe Thr Val Ser Ile 145 150 155 160 Arg Asn Thr Leu Leu Tyr Thr Leu Arg Arg Pro Tyr Phe Arg Lys Met 165 170 175 Glu Asn Gln Asp Ala Leu Val Cys Ile Ser Glu Ser Val Pro Glu Pro 180 185 190 Ile Val Glu Trp Val Leu Cys Asp Ser Gln Gly Glu Ser Cys Lys Glu 195 200 205 Glu Ser Pro Ala Val Val Lys Lys Glu Glu Lys Val Leu His Glu Leu 210 215 220 Phe Gly Thr Asp Ile Arg Cys Cys Ala Arg Asn Glu Leu Gly Arg Glu 225 230 235 240 Cys Thr Arg Leu Phe Thr Ile Asp Leu Asn Gln Thr Pro Gln Thr Thr 245 250 255 Leu Pro Gln Leu Phe Leu Lys Val Gly Glu Pro Leu Trp Ile Arg Cys 260 265 270 Lys Ala Val His Val Asn His Gly Phe Gly Leu Thr Trp Glu Leu Glu 275 280 285 Asn Lys Ala Leu Glu Glu Gly Asn Tyr Phe Glu Met Ser Thr Tyr Ser 290 295 300 Thr Asn Arg Thr Met Ile Arg Ile Leu Phe Ala Phe Val Ser Ser Val 305 310 315 320 Ala Arg Asn Asp Thr Gly Tyr Tyr Thr Cys Ser Ser Ser Lys His Pro 325 330 335 Ser Gln Ser Ala Leu Val Thr Ile Val Glu Lys Gly Phe Ile Asn Ala 340 345 350 Thr Asn Ser Ser Glu Asp Tyr Glu Ile Asp Gln Tyr Glu Glu Phe Cys 355 360 365 Phe Ser Val Arg Phe Lys Ala Tyr Pro Gln Ile Arg Cys Thr Trp Thr 370 375 380 Phe Ser Arg Lys Ser Phe Pro Cys Glu Gln Lys Gly Leu Asp Asn Gly 385 390 395 400 Tyr Ser Ile Ser Lys Phe Cys Asn His Lys His Gln Pro Gly Glu Tyr 405 410 415 Ile Phe His Ala Glu Asn Asp Asp Ala Gln Phe Thr Lys Met Phe Thr 420 425 430 Leu Asn Ile Arg Arg Lys Pro Gln Val Leu Ala Glu Ala Ser Ala Ser 435 440 445 Gln Ala Ser Cys Phe Ser Asp Gly Tyr Pro Leu Pro Ser Trp 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polynucleotide <400> 133 caggtccagc tgcagcagtc tgggtctgag atggcgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60 ccctgcaagg cttctggcga cacattcacc agttactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 catggacatg gccctgagtg gatcggaaat atttatccag gtagtggtgg tactaactac 180 gctgagaagt tcaagaacaa ggtcactctg actgtagaca ggtcctcccg cacagtctac 240 atgcacctca gcaggctgac atctgaggac tctgcggtct attattgtac aagatcgggg 300 ggtccctact tctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcc 354 <210> 134 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 134 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 135 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 135 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 136 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 136 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 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caggtccgcg cgtgctggag gccggtccgc agcagctgca agtccagtct 360 <210> 158 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 158 aaacttgagt tgaagaccgg tgccggcttc accttaccga ccagttatca tcaacaatgc 60 tattacgtgg ccctggacga agcacaggtg aattcaatta cgtttacgtt tgataccggc 120 tctggcagcg gtacatttcg tgatcccgtg ggcacttacc gctattcggc gagttatatc 180 ttgctgaaac cttcccaagg tccgaaacag cagtactggg cggttggcac cattgtagac 240 caatcagcca aatgtacaat ctcggttcgc gatggtgtca gtacgtcgat gtctaagcag 300 tcacagacaa tggttatcga t 321 <210> 159 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 159 caagtgcagc tggttgaatc cggtggcggt ctggtcaagc cgggcggctc tttgcgtctg 60 agctgtgccg cgtcgggttt taccttcagc tcttatggta tgcattgggt gcgtcaggcg 120 cctggcaaag gtctggagtg ggttgcgttc atccgctacg atgggtctaa caaatattat 180 gccgactcag taaaaggacg cttcactatt agccgcgaca atagcaaaaa taccctgtac 240 ctgcaaatga atagcctgcg cgccgaagat accgccgttt actattgcgc taaagatcgt 300 ggcctgggtg atggtacgta cttcgattac tggggtcagg gcaccaccgt taccgttagt 360 tca 363 <210> 160 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 160 cagtcagcgc ttacgcagcc ggcgtcggtg tcgggttccc cgggtcagtc gatcacgatc 60 agctgtagtg ggagcagctc caacatcggt aacaacgcag tgaactggta tcagcaactg 120 ccgggaaaag cgccgaaact gctgatttac tatgatgatt tgctgccaag tggagttagt 180 gaccgctttt ccggcagtaa atcgggtacc tcggcttttc tggctatttc gggtctccag 240 agcgaggatg aagctgatta ttattgcgcc gcatgggatg atagcttaaa tggcccagtt 300 tttggcggcg gtactaaact gaccgtgctg 330 <210> 161 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 161 ggcggtggcg gttctggtgg cggtggctcc ggcggtggcg gttct 45 <210> 162 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 162 caagtgcagc tggttgaatc cggtggcggt ctggtcaagc cgggcggctc tttgcgtctg 60 agctgtgccg cgtcgggttt taccttcagc tcttatggta tgcattgggt gcgtcaggcg 120 cctggcaaag gtctggagtg ggttgcgttc atccgctacg atgggtctaa caaatattat 180 gccgactcag taaaaggacg cttcactatt agccgcgaca atagcaaaaa taccctgtac 240 ctgcaaatga atagcctgcg cgccgaagat accgccgttt actattgcgc taaagatcgt 300 ggcctgggtg atggtacgta cttcgattac tggggtcagg gcaccaccgt taccgttagt 360 tcaggtgggg gcggctct 378 <210> 163 <211> 326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 163 cagcgcttac gcagccggcg tcggtgtcgg gttccccggg tcagtcgatc acgatcagct 60 gtagtgggag cagctccaac atcggtaaca acgcagtgaa ctggtatcag caactgccgg 120 gaaaagcgcc gaaactgctg atttactatg atgatttgct gccaagtgga gttagtgacc 180 gcttttccgg cagtaaatcg ggtacctcgg cttttctggc tatttcgggt ctccagagcg 240 aggatgaagc tgattattat tgcgccgcat gggatgatag cttaaatggc ccagtttttg 300 gcggcggtac taaactgacc gtgctg 326 <210> 164 <211> 361 <212> DNA 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gcacctccat gagcaagcag 300 tcccaaacca tggtgattga ctct 324 <210> 166 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 166 cagattcagc tggtgcagag cggccctgag ctgaagaaac ccggcgagac agtgaagatc 60 agctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacagca tcaactgggt gaaaagagcc 120 cctggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacaccg agacaagaga gcccgcctac 180 gcctacgact tccggggcag attcgccttc agcctggaaa ccagcgccag caccgcctac 240 ctgcagatca acaacctgaa gtacgaggac accgccacct acttttgcgc cctggactac 300 agctacgcca tggactactg gggccagggc accagcgtga ccgtgtccag c 351 <210> 167 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 167 gacatcgtgc tgacccagag cccccccagc ctggccatgt ctctgggcaa gagagccacc 60 atcagctgcc gggccagcga gagcgtgacc atcctgggca gccacctgat ccactggtat 120 cagcagaagc ccggccagcc ccccaccctg ctgatccagc tcgccagcaa tgtgcagacc 180 ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc agcagaaccg acttcaccct gaccatcgac 240 cccgtggaag aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagccggac catcccccgg 300 acctttggcg gaggcaccaa actggaaatc aag 333 <210> 168 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 168 atggaatttg ggctgcgctg ggttttcctt gttgctattt taaaagatgt ccagtgt 57 <210> 169 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 169 Met Glu Phe Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Asp 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 170 <211> 903 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 170 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacacaga agagcctctc cctgtctccg gagctgcaac tggaggagag ctgtgcggag 720 gcgcaggacg gggagctgga cgggctgtgg acgaccatca ccatcttcat cacactcttc 780 ctgttaagcg tgtgctacag tgccaccgtc accttcttca aggtgaagtg gatcttctcc 840 tcggtggtgg acctgaagca gaccatcatc cccgactaca ggaacatgat cggacagggg 900 gcc 903 <210> 171 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 171 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys Ala Glu 225 230 235 240 Ala Gln Asp Gly Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe 245 250 255 Ile Thr Leu Phe Leu Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Phe 260 265 270 Phe Lys Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr 275 280 285 Ile Ile Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala 290 295 300 <210> 172 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 1 5 <210> 173 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 173 Glu Leu Arg Glu Ala Thr 1 5 <210> 174 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Val or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <400> 174 Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro 1 5

Claims (130)

  1. 폴리펩티드로서,
    (a) (i) (1) 암 세포 상의 제1 종양 관련 항원(tumor associated antigen; TAA)을 인식하고 결합하는 항원 결합 도메인(antigen binding domain)(제1 항-TAA 항원 결합 도메인)으로서, 단 상기 제1 종양 관련 항원(TAA)이 B-세포 성숙 항원(BCMA)이 아닌, 항원 결합 도메인;
    (2) 힌지 도메인(hinge domain);
    (3) 막관통 도메인(transmembrane domain); 및
    (4) 세포내 도메인
    을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 아미노산 서열: 및
    (ii) (1) 암 세포 상의 제2 TAA를 인식하고 결합하는 항원 결합 도메인(제2 항-TAA 항원 결합 도메인); 및
    (2) NKG2D를 인식하고 결합하는 항원 결합 도메인(항-NKG2D 항원 결합 도메인)
    을 포함하는 이중특이적 항체; 또는
    (b) (i) (1) BCMA를 인식하고 결합하는 항원 결합 도메인(항-BCMA 항원 결합 도메인);
    (2) 힌지 도메인;
    (3) 막관통 도메인; 및
    (4) 세포내 도메인
    을 포함하는 CAR의 아미노산 서열: 및
    (ii) (1) NKG2D를 인식하고 결합하는 항원 결합 도메인(항-NKG2D 항원 결합 도메인) 및
    (2) CS1을 인식하고 결합하는 항원 결합 도메인(항-CS1 항원 결합 도메인)
    을 포함하는 이중특이적 항체
    를 포함하는, 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 힌지 도메인이 CD8α 힌지 도메인 또는 IgG1 힌지 도메인을 포함하는, 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 IgG1 힌지 도메인이 LEPKSCDKTHTCPPCPDPKGT(서열번호 1) 또는 이의 등가물을 포함하는, 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 CD8α 막관통 도메인 또는 CD28 막관통 도메인을 포함하는, 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 도메인이 CD28 공자극 신호전달 영역, 4-1BB 공자극 신호전달 영역(costimulatory signaling region), ICOS 공자극 신호전달 영역 또는 OX40 공자극 영역으로부터 선택된 1개 이상 또는 2개 이상의 공자극 영역을 포함하는, 폴리펩티드.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 CAR이
    FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(서열번호 2) 또는 이의 등가물을 포함하는 CD28 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는, 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 도메인이 CD3 제타 신호전달 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 CD3 제타 신호전달 도메인이
    RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY
    SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 3) 또는 이의 등가물을 포함하는, 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 도메인이 IL2Rβ, 또는 JAK-STAT 활성화 도메인을 포함하는 이의 단편을 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 자살 유전자 산물(suicide gene product)을 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 자살 유전자 산물이 HSV-TK(단순 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus) 티미딘 키나제), 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 카복실에스테라제, 시토크롬 P450 또는 PNP(퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제), 절단된(truncated) EGFR, 또는 유도성 카스파제("iCasp") 중 하나 이상으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 이의 N 말단에 신호 펩티드를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 MGWSSIILFLVATATGVH(서열번호 5) 또는 이의 등가물을 포함하는, 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 검출가능한 또는 정제 마커(marker)를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-NKG2D 항원 결합 도메인이 하기 상보성 결정 영역(CDR) 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개 모두를 포함하는, 폴리펩티드:
    SGSSSNIGNNAVN(서열번호 6) 또는 이의 등가물을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDRL1);
    YDDLLPS(서열번호 7) 또는 이의 등가물을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDRL2);
    AAWDDSLNGPV(서열번호 8) 또는 이의 등가물을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDRL3);
    GFTFSSY(서열번호 9) 또는 이의 등가물을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDRH1);
    RYDGSN(서열번호 10) 또는 이의 등가물을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDRH2); 및
    DRGLGDGTYFDY(서열번호 11) 또는 이의 등가물을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDRH3),
    (여기서, 이의 등가물은 NKG2D를 인식하고 결합한다).
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-NKG2D 항원 결합 도메인이
    QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTS
    AFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL(서열번호 12) 또는 이의 등가물을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는
    QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTIS
    RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS(서열번호 13) 또는 이의 등가물을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하고, 여기서 이의 등가물은 NKG2D를 인식하고 결합하는, 폴리펩티드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 서열번호 12 또는 13의 등가물이 각각 서열번호 12 또는 13과 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한, 폴리펩티드.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 서열번호 6 내지 13의 등가물이 각각 서열번호 6 내지 13의 C 말단으로부터 N 말단까지의 아미노산 도메인을 포함하는, 폴리펩티드.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-NKG2D 항원 결합 도메인이 경쇄 가변 영역 또는 이의 등가물과 중쇄 가변 영역 또는 이의 등가물 사이에 펩티드 링커를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-NKG2D 항원 결합 도메인이 경쇄 가변 영역 또는 이의 등가물과 중쇄 가변 영역 또는 이의 등가물 사이에 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 14) 또는 이의 등가물을 포함하는 펩티드 링커를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 TAA가 fms-유사 티로신 키나제 3(FLT3)인, 폴리펩티드.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제1 항-TAA 항원 결합 도메인이 하기 CDR 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개 모두를 포함하는 항-FLT3 항원 결합 도메인인, 폴리펩티드:
    RASQSISNNLH(서열번호 15), KSSQSLLNSGNQKNYM(서열번호 16), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRL1;
    YASQSIS(서열번호 17), GASTRES(서열번호 18), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRL2;
    QQSNTWPYT(서열번호 19), QNDHSYPLT(서열번호 20), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRL3;
    SYWMH(서열번호 21), NYGLH(서열번호 22), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRH1;
    EIDPSDSYKDYNQKFKD(서열번호 23), VIWSGGSTDYNAAFIS(서열번호 24), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRH2; 및
    AITTTPFDF(서열번호 25), GGIYYANHYYAMDY(서열번호 26), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRH3,
    (여기서, 이의 등가물은 FLT3을 인식하고 결합한다).
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 항-FLT3 항원 결합 도메인이
    DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDF
    TLSINSVETEDFGVYFCQQSNTWPYTFGGGTKLEIKR(서열번호 27),
    DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYMAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGS
    GSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPLTFGAGTKLELKR(서열번호 28), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는
    QVQLQQPGAELVKPGASLKLSCKSSGYTFTSYWMHWVRQRPGHGLEWIGEIDPSDSYKDYNQKFKDKATLT
    VDRSSNTAYMHLSSLTSDDSAVYYCARAITTTPFDFWGQGTTLTVSS(서열번호 29),
    QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGLHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISK
    DNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARKGGIYYANHYYAMDYWGQGTSVTVSS(서열번호 30), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하고,
    여기서, 상기 등가물은 FLT3을 인식하고 결합하는, 폴리펩티드.
  24. 제23항에 있어서, 상기 서열번호 27 내지 30의 등가물이 각각 서열번호 27 내지 30과 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한, 폴리펩티드.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열번호 15 내지 30의 등가물이 각각 서열번호 15 내지 30의 C 말단으로부터 N 말단까지의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-FLT3 항원 결합 도메인이 경쇄 가변 영역 또는 이의 등가물과 중쇄 가변 영역 또는 이의 등가물 사이에 펩티드 링커를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-FLT3 항원 결합 도메인이 경쇄 가변 영역 또는 이의 등가물과 중쇄 가변 영역 또는 이의 등가물 사이에 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 14) 또는 이의 등가물을 포함하는 펩티드 링커를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 TAA가 CD123인, 폴리펩티드.
  29. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 TAA가 상피 성장 인자 수용체(EGFR)인, 폴리펩티드.
  30. 제29항에 있어서, 상기 제1 항-TAA 항원 결합 도메인이 하기 CDR 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개를 포함하는 항-EGFR 항원 결합 도메인인, 폴리펩티드:
    RSSQNIVHNNGITYLE(서열번호 31), RASQGIRNNLA(서열번호 32), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRL1;
    KVSDRFS(서열번호 33), AASNLQS(서열번호 34), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRL2;
    FQGSHIPPT(서열번호 35), LQHHSYPLT(서열번호 36), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRL3;
    GDTFTSY(서열번호 37), GFTFSSY(서열번호 38), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRH1;
    YPGSGG(서열번호 39), SGSGGS(서열번호 40), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRH2; 및
    SGGPYFFDY(서열번호 41), SSGWSEY(서열번호 42), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRH3,
    (여기서, 이의 등가물은 EGFR을 인식하고 결합한다).
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 항-EGFR 항원 결합 도메인이
    DILMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHNNGITYLEWYLQRPGQSPKLLIYKVSDRFSGVPDRFSGSG
    SGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHIPPTFGGGTKLEIKRAA(서열번호 43),
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNNLAWYQQKPGKAPKRLIYAASNLQSGVPSRFTGSGSGTEF
    TLIVSSLQPEDFATYYCLQHHSYPLTSGGGTKVEIKYAHNS(서열번호 44), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는
    QVQLQQSGSEMARPGASVKLPCKASGDTFTSYWMHWVKQRHGHGPEWIGNIYPGSGGTNYAEKFKNKVTLT
    VDRSSRTVYMHLSRLTSEDSAVYYCTRSGGPYFFDYWGQGTTLTVSS(서열번호 45),
    EVQVLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTNYADSVKGRFTIS
    RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSSGWSEYWGQGTLVTVSS(서열번호 46), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 포함하고,
    여기서, 이의 등가물은 EGFR을 인식하고 결합하는, 폴리펩티드.
  32. 제31항에 있어서, 상기 서열번호 43 내지 46의 등가물이 각각 서열번호 43 내지 46과 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한, 폴리펩티드.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열번호 31 내지 46의 등가물이 각각 서열번호 31 내지 46의 C 말단으로부터 N 말단까지의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-EGFR 항원 결합 도메인이 경쇄 가변 영역 또는 이의 등가물과 중쇄 가변 영역 또는 이의 등가물 사이에 펩티드 링커(linker)를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-EGFR 항원 결합 도메인이 경쇄 가변 영역 또는 이의 등가물과 중쇄 가변 영역 또는 이의 등가물 사이에 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 14) 또는 이의 등가물을 포함하는 펩티드 링커를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  36. 제1항 내지 제27항 및 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 TAA가 IL13Ra2인, 폴리펩티드.
  37. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-BCMA 항원 결합 도메인이 하기 CDR 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개를 포함하는, 폴리뉴클레오티드:
    RASESVTILGSHLIH(서열번호 47), SASQDISNYLN(서열번호 48), RASESVTILGSHLIY(서열번호 49), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRL1;
    LASNVQT(서열번호 50), YTSNLHS(서열번호 51), LASNVQT(서열번호 52), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRL2;
    LQSRTIPRT(서열번호 53), QQYRKLPWT(서열번호 54), LQSRTIPRT(서열번호 55), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRL3;
    GYTFTDY(서열번호 56), GGTFSNY(서열번호 57), GYTFRHY(서열번호 58), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRH1;
    INTETRE(서열번호 59), YRGHSD(서열번호 60), NTESGV(서열번호 61), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRH2; 및
    DYSYAMDY(서열번호 62), GAIYNGYDVLDN(서열번호 63), DYLYSLDF(서열번호 64) 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는 CDRH3,
    (여기서, 이의 등가물은 BCMA를 인식하고 결합한다).
  38. 제37항에 있어서, 상기 항-BCMA 항원 결합 도메인이
    DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGS
    RTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIK(서열번호 65),
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDF
    TLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKR(서열번호 66),
    DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGS
    RTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIK(서열번호 67), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는
    QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFS
    LETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS(서열번호 68),
    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTIT
    ADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYNGYDVLDNWGQGTLVTVSS(서열번호 69),
    QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFRHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTESGVPIYADDFKGRFAFS
    VETSASTAYLVINNLKDEDTASYFCSNDYLYSLDFWGQGTALTVSS(서열번호 70), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 중쇄 가변 영역
    을 포함하고,
    여기서, 이의 등가물은 BCMA를 인식하고 결합하는, 폴리펩티드.
  39. 제38항에 있어서, 상기 서열번호 65 내지 70의 등가물이 각각 서열번호 65 내지 70과 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한, 폴리펩티드.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열번호 47 내지 70의 등가물이 각각 서열번호 47 내지 70의 C 말단으로부터 N 말단까지의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-BCMA 항원 결합 도메인이 경쇄 가변 영역 또는 이의 등가물과 중쇄 가변 영역 또는 이의 등가물 사이에 펩티드 링커를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-BCMA 항원 결합 도메인이 경쇄 가변 영역 또는 이의 등가물과 중쇄 가변 영역 또는 이의 등가물 사이에 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 14) 또는 이의 등가물을 포함하는 펩티드 링커를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  43. 제1항 내지 제27항 및 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 TAA가 CS1이고, 상기 제2 항-TAA 항원 결합 도메인이 항-CS1 항원 결합 도메인인, 폴리펩티드.
  44. 제1항 및 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CS1 항원 결합 도메인이 하기 CDR 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개를 포함하는, 폴리펩티드:
    KASQDVITGVA(서열번호 71) 또는 이의 등가물을 포함하는 CDRL1;
    SASYRYT(서열번호 72) 또는 이의 등가물을 포함하는 CDRL2;
    QQHYSTPLT(서열번호 73) 또는 이의 등가물을 포함하는 CDRL3;
    GYSFTTY(서열번호 74) 또는 이의 등가물을 포함하는 CDRH1;
    HPSDSE(서열번호 75) 또는 이의 등가물을 포함하는 CDRH2; 및
    STMIATRAMDY(서열번호 76) 또는 이의 등가물을 포함하는 CDRH3,
    (여기서, 이의 등가물은 CS1을 인식하고 결합한다).
  45. 제44항에 있어서, 상기 항-CS1 항원 결합 도메인이
    SDIVMTQSQKSMSTSVGDRVSITCKASQDVITGVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTD
    FTFTISNVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK(서열번호 77),
    KLELKTGAGFTLPTSYHQQCYYVALDEAQVNSITFTFDTGSGSGTFRDPVGTYRYSASYILLKPSQGPKQQ
    YWAVGTIVDQSAKCTISVRDGVSTSMSKQSQTMVIDS(서열번호 154),
    DIVMTQSQKSMSTSVGDRVSITCKASQDVITGVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDF
    TFTISNVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK(서열번호 78), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는
    SVTVSTGQGWYDMARTAIMTSRACYYVASDESTPSSLQMYATSSSKDVTLTAKDKFKQNLRTESDSPHIMG
    IWELGQGPRQKVWNMWYTTFSYGSAKCSLKVSAGPRVLEAGPQQLQVQS(서열번호 79),
    SSVTVSTGQGWYDMARTAIMTSRACYYVASDESTPSSLQMYATSSSKDVTLTAKDKFKQNLRTESDSPHIM
    GIWELGQGPRQKVWNMWYTTFSYGSAKCSLKVSAGPRVLEAGPQQLQVQ(서열번호 149),
    SQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTTYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATL
    TVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARSTMIATRAMDYWGQGTSVTVS(서열번호 80),
    QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTTYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLT
    VDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARSTMIATRAMDYWGQGTSVTVSS(서열번호 150), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하고,
    여기서, 이의 등가물은 CS1을 인식하고 결합하는, 폴리펩티드.
  46. 제45항에 있어서, 상기 서열번호 77 내지 80의 등가물이 각각 서열번호 77 내지 80과 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한, 폴리펩티드.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열번호 71 내지 80, 149 내지 150 및 154의 등가물이 각각 서열번호 71 내지 80, 149 내지 150 및 154의 C 말단으로부터 N 말단까지의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CS1 항원 결합 도메인이 경쇄 가변 영역 또는 이의 등가물과 중쇄 가변 영역 또는 이의 등가물 사이에 펩티드 링커를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CS1 항원 결합 도메인이 경쇄 가변 영역 또는 이의 등가물과 중쇄 가변 영역 또는 이의 등가물 사이에 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 14) 또는 이의 등가물을 포함하는 펩티드 링커를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체가 면역글로불린, 이의 돌연변이체(mutant) 또는 이의 등가물의 단편 결정화가능(Fc) 영역을 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  51. 제50항에 있어서, 상기 Fc 영역 또는 이의 돌연변이체가 인간 Fc 영역 또는 이의 돌연변이체인, 폴리펩티드.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 Fc 영역이
    ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT
    KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK
    NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA
    LHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 81), 또는 면역 세포 또는 혈소판 상의 Fc 수용체에 결합하거나 상보체 단백질에 결합하는 이의 등가물
    을 포함하는, 폴리펩티드.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역이
    ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT
    KPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK
    NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA
    LHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 82), 또는 서열번호 81의 아미노산(aa) 16, aa 17 및 aa 79에 대응하는 위치에 돌연변이를 갖고, 면역 세포 또는 혈소판 상의 Fc 수용체에 결합하거나 상보체 단백질에 결합하는 Fc 등가물
    을 포함하는, 폴리펩티드.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체가 2개의 항원 결합 도메인 사이에 펩티드 링커를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  55. 제54항에 있어서, 상기 펩티드 링커가 PSGQAGAAASESLFVSNHAY(서열번호 83)를 포함하는, 폴리펩티드.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체가, 이의 N 말단에, 임의로 CAR의 신호 펩티드와는 상이한 신호 펩티드를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  57. 제56항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 MYRMQLLSCIALSLALVTNS(서열번호 4), 또는 이중특이적 항체, 이의 단편 또는 등가물, IL-2 신호 펩티드의 분비를 촉진하는 이의 등가물로부터 선택된 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체가 검출가능한 또는 정제 마커를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  59. 제58항에 있어서, 상기 검출가능한 마커가 YPYDVPDYA(서열번호 84)를 포함하는, 폴리펩티드.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 및 CAR이 인접 서열인, 폴리펩티드.
  61. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 중 임의의 2개 사이에 위치하는 절단 가능한 펩티드를 추가로 포함하는, 폴리펩티드:
    CAR;
    이중특이적 항체; 및
    임의의 자살 유전자 산물.
  62. 제61항에 있어서, 상기 절단 가능한 펩티드가 자가-절단 펩티드(self-cleaving peptide)인, 폴리펩티드.
  63. 제62항에 있어서, 상기 자가-절단 펩티드가 T2A 펩티드인, 폴리펩티드.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 가능한 펩티드 또는 자가-절단 펩티드 또는 T2A 펩티드가 HVGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 85) 또는 이의 등가물을 포함하는, 폴리펩티드.
  65. 제1항 내지 제20항 및 제50항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 TAA 및 제2 TAA 중 어느 하나 또는 둘 모두가 FLT3, CD19, 메조텔린, 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 암배아성 항원(CEA), CD33, GTPase-활성화 단백질(GAP), 강글리오사이드 G2(GD2), CD5, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1(ROR1), CD123, CD70, CD38, 뮤신 1, (Muc1), 에프린 A형 수용체 2 전구체(EphA2), 상피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRVIII), 인터류킨 13 수용체 알파 2(IL13Ra2), CD133, 글리피칸 3(GPC3), 상피 세포 부착 분자 전구체(EpCam), 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 암/정소(CT), 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2C), 종양-관련 당단백질-72(TAG-72), 티미딘 키나제 1(TK1) 및 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT1)로부터 선택되는, 폴리펩티드.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 또는 정제 마커를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 CAR, 또는 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 이중특이적 항체 중 하나 이상을 코딩하는(encoding) 폴리뉴클레오티드.
  68. 제67항에 있어서, 하기 중 임의의 하나 또는 임의의 2개 또는 3개 모두를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드:
    폴리펩티드의 발현을 지시하는 제1 조절 서열;
    이중특이적 항체의 발현을 지시하는 제2 조절 서열; 및
    CAR의 발현을 지시하는 제3 조절 서열.
  69. 제68항에 있어서, 각각의 조절 서열이 프로모터(promoter), 인트론(intron), 인핸서(enhancer) 또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 자살 유전자를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  71. 제70항에 있어서, 상기 자살 유전자가 HSV-TK(단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제), 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 카복실에스테라제, 시토크롬 P450 또는 PNP(퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제), 절단된 EGFR 또는 유도성 카스파제("iCasp") 중 하나 이상으로부터 선택된 생성물을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 자살 유전자의 발현을 지시하는 유도성 조절 서열을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  73. 제67항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드:
    (I) 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
    ATGGGGTGGTCAAGCATTATTCTGTTTCTGGTCGCTACCGCTACAGGCGTCCAT(서열번호 86),
    ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT(서열번호 87), 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는, 뉴클레오티드 서열;
    (II) 링커 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 GGTGGGGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGAGGTGGCAGT(서열번호 88)를 포함하는, 뉴클레오티드 서열;
    (III) 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
    TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(서열번호 89)를 포함하는, 뉴클레오티드 서열;
    (IV) 신호전달 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
    AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCT
    CAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAA
    AGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTAC
    AGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTAC
    AGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(서열번호 90) 또는 이의 등가물을 포함하는, 뉴클레오티드 서열;
    (V) 절단 가능한 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
    CACGTGGGTTCTGGAGAAGGACGCGGTTCCTTGTTGACGTGTGGCGATGTAGAGGAAAATCCGGGTCCA(서열번호 91) 또는 이의 등가물을 포함하는, 뉴클레오티드 서열;
    (VI) 링커, 예를 들면, HMA a 서열로도 본 명세서에서 지칭되는 HMA 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
    CCGAGCGGCCAGGCGGGCGCGGGCGGCATCGGAGTCCCTGTTTGTGTCAAATCACGCCTAC(서열번호 92) 또는 이의 등가물을 포함하는, 뉴클레오티드 서열;
    (VII) 항-BCMA 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
    GATATTGTTCTTACTCAATCACCCCCAAGCCTTGCGATGTCTCTTGGTAAACGAGCGACAATTAGTTGTAGAGCTTCTGAAAGCGTAACTATTCTTGGGTCACATCTTATTCATTGGTATCAACAAAAGCCGGGACAACCGCCTACACTCTTGATTCAACTCGCGAGCAATGTTCAAACGGGTGTCCCTGCACGCTTTTCTGGGAGCGGTTCACGAACAGATTTTACTCTCACGATTGATCCAGTCGAAGAAGATGATGTCGCTGTATATTATTGTCTCCAAAGTAGGACAATACCAAGAACTTTTGGTGGTGGTACAAAATTGGAAATTAAA(서열번호 93),
    GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCACTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATTACCTGCTCCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGGAAGCTCCCCTGGACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGT(서열번호 94),
    GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCTGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGACCATCCTGGGCAGCCACCTGATCTACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCCCCCACCCTGCTGATCCAGCTGGCTAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCAGAACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAGCCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGAACAAAGCTGGAAATCAAG(서열번호 95),
    GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCTGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGACCATCCTGGGCAGCCACCTGATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCACCCTGCTGATCCAGCTCGCCAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCAGAACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAGCCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAG(서열번호 96), 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택되는, 뉴클레오티드 서열;
    (VIII) 항-BCMA 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
    CAGATCCAGCTGGTGCAGTCCGGCCCCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGAGACCGTGAAGATCTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTCCATCAACTGGGTGAAGCGGGCCCCCGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCTGGATCAACACCGAGACCCGGGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTCCGGGGCCGGTTCGCCTTCTCCCTGGAGACCTCCGCCTCCACCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTTCTGCGCCCTGGACTACTCCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCTCCGTGACCGTGTCCTCC(서열번호 97),
    CAGGTGCAGCTGGTCCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGGGCGCCATCTACAACGGCTACGACGTGCTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC(서열번호 98),
    ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACCAGATTCAGCTGGTGCAGAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCCGGCACTACAGCATGAACTGGGTGAAACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCCGGATCAACACCGAGAGCGGCGTGCCCATCTACGCCGACGACTTCAAGGGCAGATTCGCCTTCAGCGTGGAAACCAGCGCCAGCACCGCCTACCTGGTGATCAACAACCTGAAGGACGAGGATACCGCCAGCTACTTCTGCAGCAACGACTACCTGTACAGCCTGGACTTCTGGGGCCAGGGCACCGCCCTGACCGTGTCCAGC(서열번호 99) 또는
    CAGATTCAGCTGGTGCAGAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATCAACTGGGTGAAAAGAGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCTGGATCAACACCGAGACAAGAGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTCCGGGGCAGATTCGCCTTCAGCCTGGAAACCAGCGCCAGCACCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTTTTGCGCCCTGGACTACAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCCAGC(서열번호 100) 또는 이들 각각의 등가물로부터 선택되는, 뉴클레오티드 서열;
    (IX) 항-NKG2D 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
    CAGTCAGCGCTTACGCAGCCGGCGTCGGTGTCGGGTTCCCCGGGTCAGTCGATCACGATCAGCTGTAGTGGGAGCAGCTCCAACATCGGTAACAACGCAGTGAACTGGTATCAGCAACTGCCGGGAAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTACTATGATGATTTGCTGCCAAGTGGAGTTAGTGACCGCTTTTCCGGCAGTAAATCGGGTACCTCGGCTTTTCTGGCTATTTCGGGTCTCCAGAGCGAGGATGAAGCTGATTATTATTGCGCCGCATGGGATGATAGCTTAAATGGCCCAGTTTTTGGCGGCGGTACTAAACTGACCGTGCTG(서열번호 101) 또는 이의 등가물을 포함하는, 뉴클레오티드 서열;
    (X) 항-NKG2D 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
    CAAGTGCAGCTGGTTGAATCCGGTGGCGGTCTGGTCAAGCCGGGCGGCTCTTTGCGTCTGAGCTGTGCCGCGTCGGGTTTTACCTTCAGCTCTTATGGTATGCATTGGGTGCGTCAGGCGCCTGGCAAAGGTCTGGAGTGGGTTGCGTTCATCCGCTACGATGGGTCTAACAAATATTATGCCGACTCAGTAAAAGGACGCTTCACTATTAGCCGCGACAATAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAAATGAATAGCCTGCGCGCCGAAGATACCGCCGTTTACTATTGCGCTAAAGATCGTGGCCTGGGTGATGGTACGTACTTCGATTACTGGGGTCAGGGCACCACCGTTACCGTTAGTTCA(서열번호 102) 또는 이의 등가물을 포함하는, 뉴클레오티드 서열;
    (XI) 항-FLT3 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
    GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAGTGTATTTCTGTCAACAGAGTAACACCTGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG(서열번호 103),
    GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTATATGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG(서열번호 104) 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는, 뉴클레오티드 서열;
    (XII) 항-FLT3 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
    CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCATTGAAGCTGTCCTGCAAGTCTTCCGGGTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATCGGAGAGATTGATCCTTCTGACAGTTATAAAGACTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTGGACAGATCCTCCAACACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGCGATTACGACGACCCCCTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(서열번호 105),
    CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTTTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAGCACAGACTATAATGCAGCTTTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAGGCTGATGACACAGCCATATACTACTGTGCCAGAAAAGGAGGGATCTACTATGCTAACCATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 106) 또는 이들 각각의 등가물을 포함하는, 뉴클레오티드 서열;
    (XIII) 항-CS1 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
    AAACTTGAGT TGAAGACCGG TGCCGGCTTC ACCTTACCGA CCAGTTATCA TCAACAATGC TATTACGTGG CCCTGGACGA AGCACAGGTG AATTCAATTA CGTTTACGTT TGATACCGGC TCTGGCAGCG GTACATTTCG TGATCCCGTG GGCACTTACC GCTATTCGGC GAGTTATATC TTGCTGAAAC CTTCCCAAGG TCCGAAACAG CAGTACTGGG CGGTTGGCAC CATTGTAGAC CAATCAGCCA AATGTACAAT CTCGGTTCGC GATGGTGTCA GTACGTCGAT GTCTAAGCAG TCACAGACAA TGGTTATCGA T(서열번호 107) 또는 이의 등가물을 포함하는, 뉴클레오티드 서열;
    (XIV) 항-CS1 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
    AGCGTTACCG TGAGTACAGG CCAGGGCTGG TATGACATGG CACGTACAGC CATCATGACC TCGCGCGCAT GTTACTACGT CGCGTCAGAT GAATCGACGC CTTCCTCGCT GCAAATGTAT GCAACCTCCA GCAGCAAAGA TGTTACCCTG ACCGCAAAGG ACAAGTTTAA ACAGAATTTG CGTACGGAGA GTGACTCCCC GCACATCATG GGAATCTGGG AGTTGGGTCA GGGGCCTCGT CAGAAGGTAT GGAACATGTG GTATACAACT TTTTCGTACG GCTCAGCAAA ATGCAGCTTG AAAGTGTCGG CAGGTCCGCG CGTGCTGGAG GCCGGTCCGC AGCAGCTGCA AGTCCAGTCT(서열번호 108) 또는 이의 등가물을 포함하는, 뉴클레오티드 서열; 및
    (XV) 힌지 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은
    CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTTGCCCGGATCCCAAAGGTACC(서열번호 109) 또는 이의 등가물을 포함하는, 뉴클레오티드 서열.
  74. 제67항 내지 제73항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 대해 역(reverse), 상보성 또는 역-상보성인, 폴리뉴클레오티드.
  75. 제67항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 또는 정제 마커를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  76. 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(vector).
  77. 제76항에 있어서, 비-바이러스 벡터(non-viral vector) 또는 바이러스 벡터인, 벡터.
  78. 제77항에 있어서, 상기 비-바이러스 벡터가 플라스미드인, 벡터.
  79. 제77항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터의 그룹으로부터 선택되는, 벡터.
  80. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 발현을 지시하는 조절 서열을 추가로 포함하는, 벡터.
  81. 제80항에 있어서, 상기 조절 서열이 프로모터, 인트론, 인핸서 또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함하는, 벡터.
  82. 제76항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 또는 정제 마커를 추가로 포함하는, 벡터.
  83. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 또는 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터 중 하나 이상을 포함하는, 단리된 또는 조작된(engineered) 세포.
  84. 제83항에 있어서, 상기 세포가 원핵 세포 또는 진핵 세포인, 단리된 또는 조작된 세포.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포인, 단리된 또는 조작된 세포.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 상기 진핵 세포가 동물 세포, 포유동물 세포, 소과 세포(bovine cell), 고양이과 세포(feline cell), 개과 세포(canine cell), 뮤린 세포(murine cell), 말과 세포(equine cell) 또는 인간 세포로부터 선택되는, 단리된 또는 조작된 세포.
  87. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진핵 세포가 면역 세포이고, 임의로 T-세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 단핵구 또는 마크로파지로부터 선택되는, 단리된 또는 조작된 세포.
  88. 제87항에 있어서, 상기 면역 세포가 조혈 줄기 세포(HSC) 및/또는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유래되는, 단리된 또는 조작된 세포.
  89. 제83항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드의 이중특이적 항체를 분비하는, 단리된 또는 조작된 세포.
  90. 제83항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 또는 정제 마커를 추가로 포함하는, 단리된 또는 조작된 세포.
  91. 제83항 내지 제90항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 세포 집단(cell population).
  92. 제91항에 있어서, 실질적으로 균질한, 세포 집단.
  93. 담체, 및 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터; 제83항 내지 제90항 중 어느 한 항의 단리된 또는 조작된 세포, 및/또는 제91항 또는 제92항의 세포 집단 중의 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  94. 제93항에 있어서, 상기 담체가 약제학적으로 허용되는 담체인, 조성물.
  95. 단리된 복합체(isolated complex)로서,
    암 세포에 결합된 제83항 내지 제90항 중 어느 한 항의 단리된 또는 조작된 세포로서, 상기 암 세포는 제1(a)항의 제1 항-TAA 항원 결합 도메인 또는 제1(b)항의 항-BCMA 항원 결합 도메인에 의해 단리된 세포에 결합되는, 단리된 또는 조작된 세포; 또는
    암 세포에 결합된 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 폴리펩티드로서, 상기 암 세포는 제1(a)항의 제1 항-TAA 항원 결합 도메인 또는 제1(b)항의 항-BCMA 항원 결합 도메인, 및/또는 제1(a)항의 제2 항-TAA 항원 결합 도메인 또는 제1(b)항의 항-CS1 항원 결합 도메인 중 어느 하나 또는 둘 모두에 의해 폴리펩티드에 결합되는, 폴리펩티드
    를 포함하는, 단리된 복합체.
  96. 세포 또는 세포 집단을 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 및/또는 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터로 형질도입 또는 형질감염시키는 것을 포함하는, CAR을 발현하고 이중특이적 항체를 분비하는 세포를 생산하는 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 세포가 조혈 줄기 세포(HSC), 유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 또는 면역 세포로부터 선택되는, 방법.
  98. 제96항에 있어서, 상기 세포 집단이 조혈 줄기 세포(HSC), 유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 또는 면역 세포를 포함하는, 방법.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 상기 면역 세포가 T-세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 단핵구 또는 마크로파지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  100. 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 HSC 및/또는 iPSC로부터 유래되는, 방법.
  101. 암 세포 또는 조직을 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항의 단리된 또는 조작된 세포 또는 제91항 또는 제92항의 세포 집단과 접촉시키는 것을 포함하는, 종양 관련 항원(TAA)을 발현하는 암 세포, 또는 암 세포를 포함하는 조직의 성장을 억제하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 접촉이 시험관내 또는 생체내에서 있는, 방법.
  103. 제101항 또는 제102항에 있어서, 상기 접촉이 생체내에서 있고, 단리된 세포가 치료되는 대상체(subject)에 대해 자가 또는 동종이계인, 방법.
  104. 제101항 또는 제102항에 있어서, 상기 접촉이 생체내에서 있고, 단리된 세포가 치료되는 대상체에 대해 동종이계인, 방법.
  105. 제101항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포 또는 조직을 유효량의 세포감소 요법 또는 TAA의 발현을 상향조절하는 요법과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  106. 제105항에 있어서, 상기 세포감소 요법이 화학요법, 동결요법, 온열요법, 표적 요법 및/또는 방사선 요법을 포함하는, 방법.
  107. 제103항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 포유동물, 개과, 고양이과, 말과, 뮤린 또는 인간 환자인, 방법.
  108. 제101항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포가 제1(a)항의 제1 TAA 또는 제1(b)항의 BCMA를 발현하는, 방법.
  109. 제101항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포가 제1(a)항의 제2 TAA 또는 제1(b)항의 CS1을 발현하는, 방법.
  110. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항의 단리된 또는 조작된 세포 또는 또는 제91항 또는 제92항의 세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암의 성장을 억제하거나, 암의 전이를 억제하거나, 암을 치료하는 것 중의 하나 이상을 위한 방법.
  111. 제110항에 있어서, 상기 단리된 또는 조작된 세포가 이를 필요로 하는 대상체에 대해 자가인, 방법.
  112. 제110항에 있어서, 상기 단리된 또는 조작된 세포가 이를 필요로 하는 대상체에 대해 동종이계인, 방법.
  113. 제110항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 제1(a)항의 제1 TAA 또는 제1(b)항의 BCMA 및/또는 제1(a)항의 제2 TAA 또는 제1(b)항의 CS1 중 어느 하나 또는 둘 모두의 발현을 결정함으로써 요법을 위해 선택되는, 방법.
  114. 제113항에 있어서, 상기 발현이 대상체의 샘플을 시험관내 또는 생체내에서 TAA 또는 BCMA 또는 CS1을 인식 및 결합하는 항원 결합 도메인과 접촉시키고, 샘플과 항원 결합 도메인 사이의 결합을 검출함으로써 결정되는, 방법.
  115. 제114항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 검출가능한 마커를 추가로 포함하는, 방법.
  116. 제110항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 세포감소 요법 또는 TAA의 발현을 상향조절하는 요법을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  117. 제116항에 있어서, 상기 세포감소 요법이 화학요법, 동결요법, 온열요법, 표적 요법 및/또는 방사선 요법을 포함하는, 방법.
  118. 제110항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 포유동물, 개과, 고양이과, 말과, 뮤린 또는 인간 환자인, 방법.
  119. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항의 단리된 또는 조작된 세포 또는 제91항 또는 제92항의 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 위해 선택된 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  120. 제119항에 있어서, 상기 대상체의 암 세포가 제1(a)항의 제1 TAA 또는 제1(b)항의 BCMA 및/또는 제1(a)항의 제2 TAA 또는 제1(b)항의 CS1 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하는 경우, 상기 대상체가 선택되는, 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 TAA 발현이 대상체의 샘플을 시험관내 또는 생체내에서 TAA 또는 BCMA 또는 CS1을 인식 및 결합하는 항원 결합 도메인과 접촉시키고, 샘플과 항원 결합 도메인 사이의 결합을 검출함으로써 결정되는, 방법.
  122. 제121항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 검출가능한 마커를 추가로 포함하는, 방법.
  123. 제119항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 또는 조작된 세포가 이를 필요로 하는 대상체에 대해 자가인, 방법.
  124. 제119항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 또는 조작된 세포가 이를 필요로 하는 대상체에 대해 동종이계인, 방법.
  125. 제119항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 세포감소 요법 또는 TAA의 발현을 상향조절하는 요법을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  126. 제125항에 있어서, 상기 세포감소 요법이 화학요법, 동결요법, 온열요법, 표적 요법 및/또는 방사선 요법을 포함하는, 방법.
  127. 제119항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 포유동물, 개과, 고양이과, 말과, 뮤린 또는 인간 환자인, 방법.
  128. 제110항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 1차 요법, 또는 2차 요법, 또는 3차 요법, 또는 4차 요법으로서 대상체에게 적용되는, 방법.
  129. 제101항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 다발성 골수종(MM)인, 방법.
  130. 임의의 사용 설명서, 및 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터, 제83항 내지 제90항 중 어느 한 항의 단리된 또는 조작된 세포, 제91항 또는 제92항의 세포 집단, 제93항 또는 제94항의 조성물 또는 제95항의 단리된 복합체 중 하나 이상을 포함하는, 키트(kit).
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