KR20220069222A

KR20220069222A - 티로시나아제 검출용 형광 프로브 및 이를 이용한 티로시나아제 검출 방법

Info

Publication number: KR20220069222A
Application number: KR1020200156130A
Authority: KR
Inventors: 이민희; 박선영
Original assignee: 숙명여자대학교산학협력단
Priority date: 2020-11-20
Filing date: 2020-11-20
Publication date: 2022-05-27
Also published as: KR102497706B1

Abstract

본 발명은 나프탈이미드 (aphthalimide) 유도체를 이용한 티로시나아제 검출용 형광 프로브 및 이를 이용한 티로시나아제 검출 방법 또는 흑색종 진단 방법에 관한 것으로, 상기 나프탈이미드 (aphthalimide) 유도체를 이용한 형광 프로브는 세포 내 생물학적 간섭물질 존재 여부와 상관없이 비율계량적 반응을 통하여 티로시나아제의 발현 및 활성을 선택적이고 민감하게 확인할 수 있으며, 이중 공초점 현미경을 이용한 실시간 모니터링이 가능한 것으로 확인됨에 따라, 상기 형광 프로브는 흑색종 진단 및 효과적인 티로시나아제 활성 억제제 스크리닝을 위한 티로시나아제 검출용 형광 프로브로 제공될 수 있다.

Description

티로시나아제 검출용 형광 프로브 및 이를 이용한 티로시나아제 검출 방법{Fluorescence probe for detecting tyrosinase and detecting method of tyrosinase using the same}

본 발명은 나프탈이미드 (aphthalimide) 유도체를 이용한 티로시나아제 검출용 형광 프로브 및 이를 이용한 티로시나아제 검출 방법 또는 흑색종 진단 방법에 관한 것이다.

피부암은 기저세포암(Basal cell carcinoma), 편평상피세포암(Squamous cell carcinoma), 악성 흑색종 (malignant melanoma)으로 분류된다. 이 중 악성 흑색종은 국소적으로 주변 조직만을 침범하는 기저세포암 및 편평세포암과는 달리 신체의 다른 부위로 급속히 전이하는 특성이 있다. 따라서, 악성 흑생종은 조기 발견의 필요성이 높은 피부암이다. 그러나 악성 흑색종은 초기에 통증이 거의 없어서 조기 발견이 어려운 점이 있다. 따라서, 의사의 육안에 의한 판별이 없는 한 일반인이 조기에 통증이 없는 악성 흑색종을 판별하기 어렵다.

티로시니아제 (tyrosinase)는 티로신 (tyrosine)과 같은 페놀 유도체를 카테콜 유도체로 수산화한 후 상응하는 o-퀴논 생성물로 추가 산화시키는 폴리페놀 산화효소이다. 이러한 티로시나아제는 멜라닌 세포의 멜라노좀에 존재하여 멜라닌 생합성 과정에서 중요한 역할을 하는 효소이며, 티로시나아제의 과발현 수준은 빠른 성장 및 조기 전이를 동반하는 공격적인 악성 흑색종과 관련이 있다.

따라서, 살아있는 세포에서 티로시나아제 활성을 선택적이고 민감하게 검출할 수 있는 기술의 개발은 티로시나아제의 생물학적 기능 이해와 정확한 진단 및 치료에 매우 중요하며, 지금까지 세포의 티로시나아제 활성 검출을 위한 형광 프로브 개발에 관한 많은 연구가 진행됐다.

처음에는 티로시나아제에 대한 선택적인 형광 반응을 나타낼 수 있도록 티로시나아제 인식부위로 3-하이드록시벤질옥시 (3-hydroxybenzyloxy) 모이어티와 멜라노좀 티로시나아제의 모니터링을 위한 멜라노좀 타겟팅 그룹으로 모르폴린 (morpholine)이 제안되었으며, 이와 관련된 형광 Off-On 반응 방식으로 세포 티로시나아제 활성을 검출하기 위한 형광 프로브가 개발되어 왔다. 그러나 이러한 형광 Off-On 기술은 비형광 세포 영역이 티로시나아제 부족에 의한 것인지, 상응하는 프로브 부재에 의해 발생하는지에 대한 명확한 단서를 제공하지 않는 문제가 있다.

또한, 종래 형광 프로브들은 티로시나아제뿐만 아니라 HOCl, H₂O₂, NO₃와 같은 활성산소족 (reactive oxygen species, ROS)이 존재할 때에도 형광 반응을 나타내기 때문에 ROS의 원치 않는 간섭으로 인하여 티로시나아제를 선택적으로 검출할 수 없다는 문제가 있다. 이와 같이 세포 내 티로시나아제 검출을 위한 여러 프로브들이 보고되어 있으나, 여전히 세포 및 조직에서 특이적이고 효과적으로 티로시나아제를 검출할 수 있는 프로브 및 센서의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2020-0032453호 (2020.03.26. 공개)

본 발명은 나프탈이미드 (aphthalimide) 유도체를 이용한 티로시나아제 검출용 형광 프로브를 제공하여 세포 내 티로시나아제를 선택적으로 정확하게 검출하여 흑색종 치료를 위한 효과적인 진단 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에 있어서,

R₁은 (C1 내지 C4)알킬, (C1 내지 C4)알콕시, 할로겐, (C1 내지 C4 알킬)모르폴린, (C1 내지 C4 알킬)피페리딘, (C1 내지 C4 알킬)피페라진 및 (C1 내지 C4 알킬)디메틸아민으로 이루어진 군에서 선택됨.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 티로시나아제 검출용 형광 프로브를 제공한다.

본 발명은 상기 형광 프로브를 포함하는 티로시나아제 검출용 형광 센서를 제공한다.

본 발명은 상기 형광 프로브와 티로시나아제를 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물의 형광파장, 형광세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 확인하는 단계를 포함하는 티로시나아제 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 형광 프로브를 포함하는 흑색종 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 멜라닌 세포에 후보물질과 상기 형광 프로브를 처리하여 배양시키는 단계; 및 상기 배양된 멜라닌 세포에 처리된 프로브의 형광파장, 형광세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 확인하는 단계를 포함하는 티로시나아제 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 나프탈이미드 (aphthalimide) 유도체를 이용한 형광 프로브는 세포 내 생물학적 간섭물질 존재 여부와 상관없이 비율계량적 반응을 통하여 티로시나아제의 발현 및 활성을 선택적이고 민감하게 확인할 수 있으며, 이중 공초점 현미경을 이용한 실시간 모니터링이 가능한 것으로 확인됨에 따라, 상기 형광 프로브는 흑색종 진단 및 효과적인 티로시나아제 활성 억제제 스크리닝을 위한 티로시나아제 검출용 형광 프로브로 제공될 수 있다.

도 1은 프로브 1과 티로시나아제의 반응 메커니즘에 나타내는 반응식이다.
도 2(a)는 UV/Vis 흡광도이며, 도 2(b)는 티로시나아제 (100 U/mL) 존재여부에 따른 프로브 1의 형광 스펙트럼을 나타낸 결과이며, 도 2(c)는 금속 (K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Fe³⁺) (100 μM, respectively), 활성 산소/질소 종 (O₂ ^-, H₂O₂, ·OH, HOOtBu, ·OtBu, NO) (100 μM, respectively), Cys (100 μM), GSH (1 mM), Glucose (10 mM), Glycine (1 mM), Glutamic acid (1 mM), Tyrosine (1 mM), Vitamin B6 (1 mM), Vitamin C (1 mM) 및 Glucose Oxidase (150 U/mL)이 포함된 PBS/DMSO 용액 (v:v=99:1, 10 mM, pH=7.4)에서 37 ℃, 3시간 배양 후 프로브 1의 형광 강도비율 (I₅₆₀ nm/I₄₆₀ nm)을 확인한 결과이며 (λ_ex = 405 nm), 삽입된 도면은 시각적 및 형광 색상 변화를 확인한 결과이다.
도 3(a)는 다양한 농도의 티로시나아제(0 - 300 U/mL)에 대한 프로브 1 (5 μM)의 형광 스펙트럼을 확인한 결과이며, 도 3(b)는 다양한 농도의 티로시나아제(0 - 300 U/mL)에 대한 프로브 1 (5 μM)의 형광 강도 비율 (I₅₆₀ nm/I₄₆₀ nm)을 확인한 결과이며, 도 3(c)는 티로시나아제와 프로브 1의 효소 운동역학을 확인한 결과이며, 도 3(d)는 37 ℃, 3시간 동안 다른 농도의 다양한 티로시나아제 억제제 (페닐티오우레아, 코직산 및 비타민 C)와 프로브 1 배양 후 티로시나아제에 의해 유도되는 형광 반응의 억제를 확인한 결과로, 오차 막대는 SD 값을 나타낸 결과이다 (n=3, λ_ex = 405 nm).
도 4는 프로브 1의 효소 반응 및 티로시나아제에 의한 화합물 2 생성을 확인한 역상 HPLC 분석결과로, 크로마토그램의 LC 피크는 405 nm에서 흡수를 검출한 결과이다.
도 5(a)는 흑색종 (B16F10) 및 멜라닌결핍흑색종 (SK-MEL-28) 세포에서 티로시나아에 발현을 확인한 웨스턴블롯 분석결과이며, 도 5(b)는 흑색종 (B16F10) 및 멜라닌결핍흑색종 (SK-MEL-28) 세포에서 수집된 세포 펠렛에서 멜라닌 색소 함량을 확인한 결과이며, 도 5(C)는 B16F10 세포에서 프로브 1 (10 μM)의 공초점 형광 이미지이며, 도 5(d)는 SK-MEL-28 세포에서 프로브 1 (10 μM)의 공초점 형광 이미지로, 상기 공초점 형광 이미지는 각 세포와 프로브 1을 20분 및 6시간 배양하였으며, 여기 및 방출 파장은 각각 405 nm 및 청색 채널 (420-490 nm)/ 녹색 채널 (500-580 nm)이었다 (Scale bar =20 μm).
도 6(a)는 멜라닌 세포에서 이눌라보신 (inulavosin)에 의한 티로시나아제 분해를 확인한 결과이며, 도 6(b)는 이눌라보신 (20 μM) 및 류펩신 / 펩스타틴 A (leupeptin/pepstatin A, 100 μM)을 6시간 전처리한 B16F10 세포와 프로브 1을 6시간 동안 배양한 후 공초점 현미경 분석을 수행한 결과로, 모든 이미지는 405 nm 여기 파장 및 각각 청색 채널 (420-490 nm) 및 녹색 채널 (500-580 nm)의 방출 파장에서 확인되었다 (Scale bar = 20 μm).

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

티로신 산화효소인 티로시나아제 (Tyrosinase)는 흑색종의 중요한 마커로서, 본 발명의 발명자들은 티로시나아제의 양적 및 활성 수준을 보다 정확하게 확인하기 위해 멜라노솜 (melanosome)을 타겟할 수 있는 나프탈이미드 (naphthalimide) 유도체를 이용한 비율계량적 형광 프로브를 제공하여 이중 채널 공초점 현미경 이미징을 통하여 세포 내 티로시나아제의 발현 및 활성 수준을 효과적으로 확인함에 따라 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공할 수 있다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에 있어서,

보다 상세하게는 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 2로 표시되며, 세포내 티로시나아제를 타겟팅하는 것일 수 있다.

[화학식 2]

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 티로시나아제 검출용 형광 프로브를 제공할 수 있다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에 있어서,

보다 상세하게는 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 2로 표시되는 것일 수 있다.

[화학식 2]

상기 형광 프로브는 세포 내 티로시나아제의 발현 또는 활성 증가에 따라 녹색 (green) 형광이 증가하는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 형광 프로브를 포함하는 티로시나아제 검출용 형광 센서를 제공할 수 있다.

본 발명은 상기 형광 프로브와 티로시나아제를 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물의 형광파장, 형광세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 확인하는 단계를 포함하는 티로시나아제 검출 방법을 제공할 수 있다.

상기 광학적 변화는 티로시나아제 존재 또는 활성 여부에 따라 프로브의 형광색이 청색에서 녹색으로 변화하는 것일 수 있다.

또한, 상기 지표를 확인하는 단계는 420-490 nm (I_blue) 및 500-580 nm (I_green)에서 형광세기비율 (I_green/I_blue)을 확인하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 티로시나아제 활성에 대한 프로브 1의 감지 능력을 1% DMSO이 포함된 PBS (10 mM, pH=7.4) 용액에서 UV/Vis 흡수 및 형광 변화로 확인한 결과, 도 2a 및 도 2b와 같이 프로브 1의 흡수 및 방출은 각각 374 및 460 nm에서 나타났으며, 티로시나아제를 프로브 1 용액에 첨가한 경우, 흡수 및 방출이 초기에 감소하였으나, 450 및 560 nm에서 각각 현저하게 증가하였다. 또한, 시각 및 형광색이 동시에 무색에서 노란색으로, 파랑(Φ_f=0.02)에서 노란색(Φ_f=0.07)으로 각각 변화한 것을 확인할 수 있었다.

한편, 티로시나아제에 대한 프로브 1의 시간의존적 흡수 및 형광 스펙트럼 변화를 확인한 결과, 흡수 밴드가 374 nm에서 감소한 반면, 450 nm에서 흡수 밴드가 405 nm의 등흡수점과 함께 점진적으로 증가하였으며, 방출 밴드는 460 nm에서 감소하였으나, 560 nm에서 방출 밴드가 500 nm의 등흡수점과 함께 현저한 증가를 나타내었다. 형광강도비율(I₅₆₀ nm/I₄₆₀ nm)은 티로시나아제와 프로브의 인큐베이션 시간 함수에 의해 증가하였으며, 이와 대조적으로 티로시나아제가 존재하지 않는 조건에서 프로브 1은 형광반응이 확인되지 않았다.

또한, 티로시나아제 농도 함수로 프로브 1의 형광변화를 확인한 결과, 도 3a와 같이 티로시나아제 농도 증가에 따라, 방출밴드가 460 nm에서 점진적으로 감소하였으며, 560 nm에서는 현저하게 증가되었으며, 도 3b와 같이 0-300 U/mL의 범위에서 형광비율 (I₅₆₀ nm/I₄₆₀ nm) 및 [티로시나아제] 사이에 좋은 선형 상관관계가 확인되었다.

상기 결과로부터 티로시나아제 활성 의존적으로 프로브 1의 비율계량적 형광 변화가 나타나는 것이 확인되었다.

또한, 티올 및 활성 산소/질소종이 포함된 산화환원 종, 글루코스, 글루코스 산화효소, 글리신, 글루탐산, 티로신, 비타민 및 금속이온과 같은 잠재적인 다른 생물학적 간섭물질에 대한 프로브 1의 형광반응을 확인한 결과, 도 2c와 같이 티로시나아제 활성에 대한 프로브 1의 형광비율 (I₅₆₀ nm/I₄₆₀ nm)이 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 프로브 1은 다른 생체분자의 존재와 상관없이 살아있는 세포 내 티로시아나제에 대한 선택적 비율계량 형광 검출에 중요한 역할을 할 수 있음이 확인되었다.

본 발명은 상기 형광 프로브를 포함하는 흑색종 진단용 키트를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 멜라닌 세포에 후보물질과 상기 형광 프로브를 처리하여 배양시키는 단계; 및 상기 배양된 멜라닌 세포에 처리된 프로브의 형광파장, 형광세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 확인하는 단계를 포함하는 티로시나아제 억제제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

보다 상세하게는 상기 스크리닝 방법은 프로브의 청색 (blue) 형광 발현이 증가할수록 후보물질의 티로시나아제 억제 효과가 높은 것으로 판단하는 것일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 화합물 1 합성

CH₃CN 50 mL에 용해시킨 화합물 2 (244 mg, 1.0 mmol) 용액에 NaH (60 mg, 2 mmol)를 첨가하고 N2 대기 하에서 10분간 교반하였다. 이후, CH₃CN 50 mL에 용해시킨 화합물 3 (278 mg, 2 mmol) 용액을 적가하였다.

반응 혼합물을 60 ℃에서 12시간 동안 교반하고, 용매를 감압하에서 증발시켜 제거한 후 CH₂Cl₂ (50 mL) 및 물 (50 mL)을 첨가하였다. 유기층을 수집하여 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 증발시킨 후 전사를 용리액 (CH₂Cl₂/MeOH, v/v, 200:1)을 이용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 옅은 노란색의 화합물 1 (55 mg, 17 %)을 얻었다.

433.1685, [M+H]⁺ obs. 433.1683. ¹H NMR (MeOD-d₄, 500 MHz): δ 8.62-8.61 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.52-8.51 (d, J = 7.5 Hz, 1 H), 8.47-8.45 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.75-7.72 (t, J = 7.75 Hz, 1 H), 7.28-7.23 (m, 2 H), 7.02 (s, 1 H), 7.00 (s, 1 H), 6.80-6.79 (m, 1 H), 5.36 (s, 1 H), 4.31-4.29 (t, J = 6.75 Hz, 2 H), 3.67-3.65 (t, J =4.25 Hz, 4 H), 3.64 (s, 2 H), 2.71-2.68 (t, J = 6.75 Hz, 2 H), 2.60 (s, 4 H) ppm. ¹³C NMR (MeOD-d₄, 125 MHz): δ 164.4, 163.9, 161.1, 159.9, 157.6, 137.4, 133.3, 131.0, 129.5, 129.0, 128.4, 125.7, 123.2, 121.9, 118.3, 114.9, 114.3, 114.0, 106.6, 105.3, 66.2, 55.6, 53.5, 36.3, 29.5 ppm.

2. 효소반응속도 (Enzyme kinetics) 확인

티로시나아제 (tyrosinase, 100 U/mL)에 대하여 다양한 농도의 화합물 1의 시간의존적 형광반응을 560 nm에서 5분 동안 1초의 시간 간격으로 확인하였다.

모든 측정은 PBS/DMSO 용액 (v:v=99:1, 10 mM, pH=7.4)을 37 ℃에서 인큐베이션하여 기록되었다 (λ_ex = 405 nm). Michelis-Menten 반응식 (OriginPro 8.0)을 위해 K_m 및 V_max 값을 속도 (μMs^-1) 대 [프로브 1] (μM)을 플로팅하여 확인하였다.

3. 억제 확인 (Inhibition test)

물을 이용하여 코직산 (kojic acid) 및 비타민 C (ascorbic acid)의 저장용액을 준비하였으며, 페닐티오우레아 (phenylthiourea)를 DMSO에 용해시켜 저장용액을 준비하였다. 티로시나아제(100 U/mL)에 대한 화합물 1 (5 μM)의 형광 강도 비율 (I₅₆₀ nm/I₄₆₀ nm)은 다양한 농도의 코직산 (0, 10, 50, 100, 200 및 300 μM), 비타민 C (0, 50, 100, 200 및 300 μM) 및 페닐티오우레아 (0, 1, 10, 50, 100, 200 및 300 μM) 존재 하에서 기록되었다.

모든 측정은 PBS/DMSO 용액 (v/v=96:4, 10 mM, pH=7.4)에서 기록되었으며, 독립적으로 3회 수행된 실험결과의 평균± 표준편차로 오차 막대를 나타내었다. λ_ex = 405 nm.

<실시예 1> 프로브 1의 분광 분석 (Spectroscopic analysis)

티로시나아제 활성에 대한 프로브 1의 감지 능력을 1% DMSO이 포함된 PBS (10 mM, pH=7.4) 용액에서 UV/Vis 흡수 및 형광 변화로 확인하였다.

그 결과, 도 2a 및 도 2b와 같이 프로브 1의 흡수 및 방출은 각각 374 및 460 nm에서 나타났다. 티로시나아제를 프로브 1 용액에 첨가한 경우, 흡수 및 방출이 초기에 감소하였으나, 450 및 560 nm에서 각각 현저하게 증가하였다. 또한, 시각 및 형광색이 동시에 무색에서 노란색으로, 파랑(Φ_f=0.02)에서 노란색(Φ_f=0.07)으로 각각 변화한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 티로시나아제에 대한 프로브 1의 시간의존적 흡수 및 형광 스펙트럼 변화를 확인한 결과, 흡수 밴드가 374 nm에서 감소한 반면, 450 nm에서 흡수 밴드가 405 nm의 등흡수점과 함께 점진적으로 증가하였다.

그 후, 방출 밴드는 460 nm에서 감소하였으나, 560 nm에서 방출 밴드가 500 nm의 등흡수점과 함께 현저한 증가를 나타내었다.

형광강도비율(I₅₆₀ nm/I₄₆₀ nm)은 티로시나아제와 프로브의 인큐베이션 시간 함수에 의해 증가하였다. 대조적으로 티로시나아제가 존재하지 않는 조건에서 프로브 1은 형광반응이 확인되지 않았다.

또한, 티올 및 활성 산소/질소종이 포함된 산화환원 종, 글루코스, 글루코스 산화효소, 글리신, 글루탐산, 티로신, 비타민 및 금속이온과 같은 잠재적인 다른 생물학적 간섭물질에 대한 프로브 1의 형광반응을 확인하였다.

그 결과, 도 2c와 같이 티로시나아제 활성에 대한 프로브 1의 형광비율 (I₅₆₀ nm/I₄₆₀ nm)이 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다.

추가적으로, 티로시나아제 농도 함수로 프로브 1의 형광변화를 확인하였다.

그 결과, 도 3a와 같이 티로시나아제 농도 증가에 따라, 방출밴드가 460 nm에서 점진적으로 감소하였으며, 560 nm에서는 현저하게 증가되었다.

또한, 도 3b와 같이 0-300 U/mL의 범위에서 형광비율 (I₅₆₀ nm/I₄₆₀ nm) 및 [티로시나아제] 사이에 좋은 선형 상관관계가 확인되었다.

도 3c를 참고하면, 검출 한계(k=3)는 LOD=0.4 U/mL으로 확인되었다. 더욱이 Michaelis-Menten 분석을 기초로 한 티로시나아제에 대한 프로브 1의 운동학적 실험으로 운동 데이터, 미하엘리스 상수 (K_m)=0.8965 (± 0.1103) 및 최대 속도 (V_max)=3.5456× 10^-4 (± 1.0317× 10^-5) μM s^-1를 확인하였다.

프로브 1의 형광변화가 티로시나아제의 효소 반응에 의한 것인지를 확인하기 위해, 코직산, 비타민 C 및 페닐티오우레아와 같은 티로시나아제 억제제 존재하에서 프로브 1의 형광반응을 확인하였다.

그 결과, 도 3d와 같이 억제제의 농도가 증가함에 따라, 프로브 1의 형광비율이 감소하였으며 각 억제제의 효능과 상당히 관련이 있었다.

상기 결과로부터, 프로브 1은 도 1의 반응식에서 제안된 바와 같이 티로시나아제 활성에 의해 매개되는 형광반응을 나타내며, 형광비율 변화를 통해 정확하게 측정되는 것이 확인됨에 따라, 프로브 1은 잠재적인 치료 약제로서 높은 처리 함량의 티로시나아제 억제제 스크리닝에 적합하다.

한편, 프로브 1의 pH 영향을 확인한 결과, 프로브 1이 생물학적으로 관련된 4.5-8.5 pH 범위에서에서 눈에 띄게 형광비율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 이와 대조적으로, 티로시나아제 부재 시 프로브 1은 상기 pH 범위에서 형광반응을 나타내지 않았다.

또한, 온도가 프로브 1에 미치는 영향을 확인한 결과, 프로브 1은 화학적으로 안정한 반면, 25-50 ℃에서 프로브는 티로시나아제 활성에 빠르게 반응하여 비율계량적 형광 변화가 확인되었다.

프로브 1이 티로시나아제 매개 반응을 통하여 화합물 2로 전환되는 제안된 메커니즘을 확인하기 위해, 역상 HPLC 및 ESIMS 분광 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 4와 같이 프로브 1은 9.4 분에 LC 피크를 나타내었으며, 프로브 1과 티로시나아제를 함께 배양한 결과, 초기 피크가 사라지고 새로운 LC 피크가 8.8 분에 확인되었다. 상기 8.8 분에 확인된 피크는 화합물 2의 HPLC 크로마토그램과 일치하는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 ESI-MS 분광법에 의해 추가로 확인되었다.

<실시예 2> 흑색종 세포에서 프로브 1의 공초점 현미경 확인

프로브 1을 사용한 세포 이미지 확인에 앞서, 흑색종 B16F10 및 멜라닌결핍 흑색종 (amelanotic-melanoma) SK-MEL-28 세포에서 티로시나아제 발현 수준을 웨스턴 블롯 및 멜라닌 함량 분석으로 확인하였다.

그 결과, 도 5a와 같이 흑색종 B16F10 세포에서는 티로시나아제가 매우 높게 증가된 반면, 멜라닌결핍 흑색종 SK-MEL-28 세포에서는 드물게 발현된 것이 확인되었으며, 도 5b와 같이 흑색종 B16F10 펠렛 수집물의 멜라닌 색소 함량이 멜라닌결핍 흑색종 SK-MEL-28 세포보다 높은 것으로 확인되었다.

또한, 프로브 1 및 화합물 2의 세포독성을 확인한 결과, 24시간 처리 후에도 B16F10 및 SKMEL-28 세포에서 세포 독성은 매우 적거나 나타나지 않았다.

다음으로, 공초점 형미경을 이용하여 세포 티로시나아제 이미지에서 프로브 1의 이중 채널 감지 능력을 확인하였다.

그 결과, 도 5c와 같이 흑색종 B16F10 세포에 프로브 1의 처리 시 다른 배양 시간 시점 (20분 및 6시간)에서 이미지가 검출되었다. 보다 상세하게 20분 배양에서는 프로브 1이 강한 청색을 방출하였으며, 6시간 배양 후 분명하게 프로브 1의 티로시나아제 매개 형광 변화에 따라 청색 방출이 감소하고, 강한 녹색 방출이 확인되었다.

이와 대조적으로 도 5d를 참고하면, 멜라닌결핍 흑색종 SK-MEL-28 세포의 경우, 티로시나아제 부재에 의해 프로브 1의 녹색 방출이 확인되지 않았다.

프로브 1이 처리된 세포에서 세포 형광변화가 티로시나아제에 의해 발생되는 지를 확인하기 위해, 티로시나아제 억제제인 코직산 및 페닐티오우레아를 처리하여 세포 형광변화를 확인하였다.

예상대로, 코직산 및 페닐티오우레아가 처리된 흑색종 B16F10 세포에서는 형광변화가 확인되지 않았으며, 프로브 1의 형광이미지가 흑색종 B16F10 세포에서 lysotracker-DND 99의 형광과 일치하는 것이 확인됨에 따라, 프로브 1은 초기에 멜라노좀에 국한되어 있음이 확인되었다. 이러한 결과는 티로시나아제가 발현되는 멜라노좀은 리소좀과 같은 소기관이며, lysotrackers에 의해 시각화될 수 있을 것으로 제안될 수 있다.

상기 결과로부터 프로브 1은 특히 티로시나아제에 민감하여 흑색종 세포에서 비율계량적 형광반응을 나타내는 것이 확인되었다.

또한, 멜라닌 생성 억제제인 이눌라보신 (inulavosin) 존재 하에서 프로브 1을 이용하여 티로시나아제 활성 검출 효과를 확인하였다.

이눌라보신은 멜라노좀에서 리소좀으로 티로시나아제 이동을 유도하고 리소좀 소화를 통하여 티로시나아제 분해를 유도하는 멜라닌 생성 억제제로, 도 6a를 참고하면, 이눌라보신이 처리된 흑색종 B16F10 세포 중 대조군에서 프로브 1은 티로시나아제의 리소좀 분해에 의해 녹색 방출이 나타내지 않았다. 그러나 도 6b와 같이 리소좀 프로테아제 억제제인 류펩신 (leupeptin) 및 펩스타틴 A (pepstatin A)가 처리된 흑색종 세포에서는 리소좀 분해가 억제됨에 따라, 프로브 1이 강한 녹색 형광을 나타내었다.

상기 결과로부터 이눌라보신에 의한 리소좀으로의 티로시아나제 이동이 흑색종 암세포에서 티로시나아제 활성을 감소시키는 효과를 나타내는 것을 프로브 1을 통하여 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 1]

상기 화학식 1에 있어서,
R₁은 (C1 내지 C4)알킬, (C1 내지 C4)알콕시, 할로겐, (C1 내지 C4 알킬)모르폴린, (C1 내지 C4 알킬)피페리딘, (C1 내지 C4 알킬)피페라진 및 (C1 내지 C4 알킬)디메틸아민으로 이루어진 군에서 선택됨.
청구항 1에 있어서,
상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 2로 표시되며, 세포 내 티로시나아제를 타겟팅하는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
[화학식 2]
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 티로시나아제 검출용 형광 프로브.
[화학식 1]

상기 화학식 1에 있어서,
R₁은 (C1 내지 C4)알킬, (C1 내지 C4)알콕시, 할로겐, (C1 내지 C4 알킬)모르폴린, (C1 내지 C4 알킬)피페리딘, (C1 내지 C4 알킬)피페라진 및 (C1 내지 C4 알킬)디메틸아민으로 이루어진 군에서 선택됨.
청구항 3에 있어서,
상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 티로시나아제 검출용 형광 프로브.
[화학식 2]
청구항 3에 따른 형광 프로브를 포함하는 티로시나아제 검출용 형광 센서.
청구항 3에 따른 형광 프로브와 티로시나아제를 반응시키는 단계; 및
상기 반응시킨 반응물의 형광파장, 형광세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 확인하는 단계를 포함하는 티로시나아제 검출 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 광학적 변화는 티로시나아제 존재 또는 활성 여부에 따라 프로브의 형광색이 청색에서 녹색으로 변화하는 것을 특징으로 하는 티로시나아제 검출 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 지표를 확인하는 단계는 420-490 nm (I_blue) 및 500-580 nm (I_green)에서 형광세기비율 (I_green/I_blue)을 확인하는 것을 특징으로 하는 티로신 산화효소 검출 방법.
청구항 3에 따른 형광 프로브를 포함하는 흑색종 진단용 키트.
멜라닌 세포에 후보물질과 청구항 3항의 형광 프로브를 처리하여 배양시키는 단계; 및
상기 배양된 멜라닌 세포에 처리된 프로브의 형광파장, 형광세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 확인하는 단계를 포함하는 티로시나아제 억제제 스크리닝 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 프로브의 청색 (blue) 형광 발현이 증가할수록 후보물질의 티로시나아제 억제 효과가 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 티로시나아제 억제제 스크리닝 방법.