KR20220057598A

KR20220057598A - Bcma에 결합하는 이량체성 항원 수용체 (dar)

Info

Publication number: KR20220057598A
Application number: KR1020227011203A
Authority: KR
Inventors: 헨리 홍준 지; 원중 궈; 옌량 장; 베이 베이 딩; 군나르 에프. 카우프만
Original assignee: 소렌토 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date: 2019-09-05
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2022-05-09
Also published as: US20220251168A1; MX2022002723A; EP4025227A4; WO2021046445A1; CN114650829A; JP2022546577A; CA3149867A1; EP4025227A1; AU2020341712A1; IL291076A

Abstract

본원 개시내용은 BCMA 표적 항원에 결합하는 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 제공하고, 여기서, DAR 작제물은 1개의 폴리펩타이드 쇄 상 중쇄 결합 영역 및 별개의 폴리펩타이드 쇄 상 경쇄 결합 영역을 포함한다. 이량체성 항원 수용체를 구성하는 2개의 폴리펩타이드 쇄는 이량체화되어 항원 결합 도메인을 형성할 수 있다. 이량체성 항원 수용체는 표적 항원에 특이적으로 결합하기 때문에 항체-유사 성질을 갖는다. 이량체성 항원 수용체는 지시된 세포요법을 위해 사용할 수 있다.

Description

BCMA에 결합하는 이량체성 항원 수용체 (DAR)

관련 출원

본 출원은 2019년 9월 5일에 제출된 미국 가특허출원 번호 62/896,190. 2019년 9월 6일에 제출된 미국 가특허출원 번호 62/896,990, 2019년 10월 3일에 제출된 미국 가특허출원 번호 62/910,341, 2019년 12월 3일에 제출된 미국 가특허출원 번호 62/943,069, 및 2020년 5월 26일에 제출된 미국 가특허출원 번호 63/030,145에 관한 우선권을 주장하고, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로서 분명히 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자로 제출된 서열 목록을 포함하고, 이의 전문이 참조로서 포함된다. 상기 ASCII 카피는 2020년 7월 24일에 만들어졌고, 2020-07-24_01223-0012-00PCT_Sequence_Listing_ST25.txt로 명명되고, 167,936 바이트의 크기이다.

기술 분야

본원 개시내용은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 이량체성 항원 수용체 (DAR) 단백질 작제물, 이량체성 항원 수용체를 암호화하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터, 및 벡터를 보유하는 숙주 세포를 제공한다.

배경 및 요지

키메라 항원 수용체 (CARs)는 특히 암과 연관된 항원을 표적화하기 위해 개발되었다. 첫번째-세대 CAR은 활성화 자극 (신호 1) 단독을 전달하는 신호전달 도메인 (TCRζ)을 포함하도록 조작되었다 (참조: Geiger et al., J. Immunol. 162(10): 5931-5939, 1999; Haynes et al., J. Immunol. 166(1): 182-187, 2001) (Hombach et al. Cancer Res. 61(5): 1976-1982, 2001; Hombach et al., J. Immunol. 167(11): 6123-6131, 2001; Maher et al., Nat. Biotechnol. 20(1): 70-75, 2002). 첫번째-세대 CARs 단독으로 그래프팅된 T 세포는 최적이 아닌 활성화 때문에 제한된 항-종양 효능을 나타내었다 (참조: Beecham et al., J. Immunother. 23(6): 631-642, 2000). 두번째-세대 CAR, 면역글로불린-CD28-T 세포 수용체 (IgCD28TCR)는, 공자극성 CD28 (신호 2)을 첫번째-세대 수용체 내로 도입하고 (참조: Gerstmayer et al., J. Immunol. 158(10): 4584-4590, 1997; Emtage et al., Clin. Cancer Res. 14(24): 8112-8122, 2008; Lo, Ma et al., Clin. Cancer Res. 16(10): 2769-2780, 2010), 이는 더 큰 항-종양 능력을 갖는 CAR-T 세포를 야기하였다 (참조: Finney et al., J. Immunol. 161(6): 2791-2797,1998; Hombach et al., Cancer Res. 61(5): 1976-1982, 2001, Maher et al., Nat. Biotechnol. 20(1): 70-75, 2002). 다양한 CAR 변종을 TCRζ 또는 CD28의 신호 도메인을 유사한 기능을 갖는 분자, 예를 들면, FcRγ, 4-1BB 및 OX40와 대치하여 개발하였다 (참조: Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 90(2): 720-724, 1993). 다양한 종양 항원에 대항하는 TCR CAR-T 세포를 개발하였다 (참조: Ma et al., Cancer Gene Ther. 11(4): 297-306, 2004; Ma et al., Prostate 61(1): 12-25, 2004; Lo et al., Clin. Cancer Res. 16(10): 2769-2780, 2010; Kong et al., Clin. Cancer Res. 18(21): 5949-5960, 2012; Ma et al., Prostate 74(3): 286-296, 2014; Katz et al., Clin. Cancer Res. 21(14): 3149-3159, 2015; Junghans et al., 2016 The Prostate, 76(14):1257-1270).

다시 지시된 종양파괴 활성을 위해 키메라 항원 수용체 (CARs)로 조작된 T 세포의 주입에 의한 입양 면역요법은 전이 암의 잠재적으로 높은 특이적 치료 양식을 나타낸다. CD19, B 세포 상 발현되는 분자를 표적화하는 CAR-T 세포는, B 세포 악성종양의 치료 성공을 나타내고, FDA 승인을 받았고, 일부 시도는 지속된 완전한 반응을 포함하여 70% 이하의 반응율을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, CAR-T 세포 부적합한 면역 활성을 통해 잠재적으로 심각한 유해 사건을 야기할 수 있는 비특이적 활성화를 나타낼 수 있다.

따라서, 증가된 특이성의 CAR 치료의 강력한 효능을 활용할 필요성이 당해 기술 분야에 존재한다.

개별적인 폴리펩타이드 쇄에서 항체 중쇄 결합 영역 및 항체 경쇄 결합 영역 둘 다를 포함하는 항원 수용체 및 지시된 세포요법에서 이들의 용도는 이러한 필요성을 충족시키기 위한 시도로 본원에 개시되거나/되고, 이득을 제공하거나, 적어도 대중에게 유용한 선택을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원 개시내용은, 예를 들면, 막횡단 및 세포내 영역에 연결된 Fab 단편을 형성하는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 이량체성 항원 수용체 (DAR), 및 DAR을 발현하는 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, DAR을 발현하는 T 세포는 예를 들면, 전통적인 CAR을 발현하는 T 세포와 비교하여 표적-특이적 확장 및 세포독성을 나타낼 수 있다. 본원 개시내용에 따른 실시형태는 청구범위 및 상세한 설명에 기재되어 있다.

도 1a는 2개의 세포내 신호전달 서열을 포함하는 예시적인 이량체성 항원 수용체를 나타내는 도식이다.
도 1b는 3개의 세포내 신호전달 서열을 포함하는 예시적인 이량체성 항원 수용체를 나타내는 도식이다.
도 2a는 2개의 세포내 신호전달 서열을 포함하는 예시적인 이량체성 항원 수용체를 나타내는 도식이다.
도 2b는 3개의 세포내 신호전달 서열을 포함하는 예시적인 이량체성 항원 수용체를 나타내는 도식이다.
도 3a는 자기-절단 서열 및 3개의 세포내 신호전달 서열을 포함하는 예시적인 전구체 폴리펩타이드 분자를 나타내는 도식이다.
도 3b는 자기-절단 서열 및 2개의 세포내 신호전달 서열을 포함하는 예시적인 전구체 폴리펩타이드 분자를 나타내는 도식이다.
도 4a는 자기-절단 서열 및 3개의 세포내 신호전달 서열을 포함하는 예시적인 전구체 폴리펩타이드 분자를 나타내는 도식이다.
도 4b는 자기-절단 서열 및 2개의 세포내 신호전달 서열을 포함하는 예시적인 전구체 폴리펩타이드 분자를 나타내는 도식이다.
도 5a는 2개의 상이한 버젼의 BCMA 키메라 항원 수용체 (CAR) 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 1)를 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 형질감염-후 13 일에 수집하였다. 음성 대조군은 비-유전자삽입 활성화된 T 세포 (ATC)이다. 또다른 음성 대조군은 TRAC-minus T 세포주 (T-세포 수용체 알파 불변((T-cell receptor alpha constant)-minus)이다. 형질감염 효율 및 발현 수준 유세포분석 연구는 실시예 5에 기재되어 있다.
도 5b는 3개의 상이한 버젼의 BCMA-2C5 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 1)를 비교하는 유세포분석 연구 (11일째)의 결과를 나타낸다. 음성 대조군은 도 5a로부터의 TRAC-minus T 세포주이다. 다양한 DAR 작제물을 발현하는 유전자삽입 세포를 나타낸다: DAR V2c 작제물; DAR V3a 작제물; 및 DAR V3b 작제물. 데이터를 형질감염-후 13 일에 수집하였다. 형질감염 효율 및 발현 수준 유세포분석 연구는 실시예 5에 기재되어 있다.
도 6은 RPMI 8226 표적 세포 상 BCMA CAR, 또는 BCMA DAR을 발현하는 T 세포 (공여자 1)의 세포독성 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 라인 A는 음성 대조군 TRAC-minus T 세포주 (T-세포 수용체 알파 불변-minus)를 지정하고; 라인 B는 DAR BCMA-2C5 V2c 작제물을 지정하고; 라인 C는 CAR bb2121 작제물을 지정하고; 라인 D (점선)는 DAR BCMA-2C5 V3a 작제물을 지정하고; 라인 E는 DAR BCMA-2C5 V3b 작제물을 지정하고; 라인 F는 CAR BCMA-2C5 작제물을 지정한다. 세포독성 연구는 실시예 6에 기재되어 있다.
도 7a는 음성 대조군 TRAC-minus T 세포주 (T-세포 수용체 알파 불변-minus), 또는 다음을 발현하는 T 세포 (공여자 1)로부터 IFN-감마 방출 (표적 자극-후 40 시간)의 수준을 나타내는 막대 그래프이다: CAR bb2121 작제물; CAR BCMA-2C5 작제물; DAR BCMA-2C5 V2c 작제물; DAR BCMA-2C5 V3a 작제물; 또는 DAR BCMA-2C5 V3b 작제물. 각각의 데이터 세트는 왼쪽에서 오른쪽으로 U266 세포 (BCMA-양성 세포), K562 세포 (BCMA-음성 세포), 배지 단독, 또는 RPMI 8226 세포 (BCMA-양성 세포)를 나타낸다. 사이토킨 방출 연구는 실시예 7에 기재되어 있다.
도 7b는 음성 대조군 TRAC-minus T 세포주 (T-세포 수용체 알파 불변-minus), 또는 다음을 발현하는 T 세포 (공여자 1)로부터 GM-CSF 방출 (표적 자극-후 40 시간)의 수준을 나타내는 막대 그래프이다: CAR bb2121 작제물; CAR BCMA-2C5 작제물; DAR BCMA-2C5 V2c 작제물; DAR BCMA-2C5 V3a 작제물; 또는 DAR BCMA-2C5 V3b 작제물. 각각의 데이터 세트는 왼쪽에서 오른쪽으로 U266 세포 (BCMA-양성 세포), K562 세포 (BCMA-음성 세포), 배지 단독, 또는 RPMI 8226 세포 (BCMA-양성 세포)를 나타낸다. 사이토킨 방출 연구는 실시예 7에 기재되어 있다.
도 8a는, K562, RPMI8226, U266과 함께 공-배양되거나 또는 배지 단독의 경우, 음성 대조군 TRAC-minus T 세포주 (T-세포 수용체 알파 불변-minus)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 공-배양한지 3 일에 수집하였다. 공-배양 유세포분석 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 8b는, K562, RPMI8226, U266과 함께 공-배양되거나 또는 배지 단독의 경우, CAR BCMA bb2121 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 1)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 공-배양한지 3 일에 수집하였다. 공-배양 유세포분석 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 8c는, K562, RPMI8226, U266과 함께 공-배양되거나 또는 배지 단독의 경우, CAR BCMA-2C5 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 1)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 공-배양한지 3 일에 수집하였다. 공-배양 유세포분석 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 8d는, K562, RPMI8226, U266과 함께 공-배양되거나 또는 배지 단독의 경우, DAR BCMA-2C5 V2c 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 1)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 공-배양한지 3 일에 수집하였다. 공-배양 유세포분석 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 9는 도 8a-d로부터의 데이터를 사용하여 유전자삽입 T 세포의 확장에서 배수-변화를 나타내는 막대 그래프이고, 여기서, 유전자삽입 T 세포는 다음을 발현한다: CAR bb2121 작제물; CAR BCMA-2C5 작제물; 또는 DAR BCMA-2C5 V2c 작제물. T 세포를 K562, RPMI8226 또는 U266 세포주와 공-배양하였다. 데이터를 공-배양한지 3 일에 수집하였다. 배수-변화 확장 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 10a는, K562, RPMI8226, U266과 함께 공-배양되거나 또는 배지 단독의 경우, 음성 대조군 TRAC-minus T 세포주 (T-세포 수용체 알파 불변-minus)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다 (도 8a에 제시된 것과 동일한 데이터). 데이터를 공-배양한지 3 일에 수집하였다. 공-배양 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 10b는, K562, RPMI8226, U266과 함께 공-배양되거나 또는 배지 단독의 경우, CAR BCMA bb2121 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 1)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다 (도 10b에 제시된 것과 동일한 데이터). 데이터를 공-배양한지 3 일에 수집하였다. 공-배양 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 10c는, K562, RPMI8226, U266과 함께 공-배양되거나 또는 배지 단독의 경우, DAR BCMA-2C5 V2a 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 1)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 공-배양한지 3 일에 수집하였다. 공-배양 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 10d는, K562, RPMI8226, U266과 함께 공-배양되거나 또는 배지 단독의 경우, DAR BCMA-2C5 V2c 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 1)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 공-배양한지 3 일에 수집하였다. 공-배양 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 10e는, K562, RPMI8226, U266과 함께 공-배양되거나 또는 배지 단독의 경우, DAR BCMA-2C5 V3a 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 1)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 공-배양한지 3 일에 수집하였다. 공-배양 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 10f는, K562, RPMI8226, U266과 함께 공-배양되거나 또는 배지 단독의 경우, DAR BCMA-2C5 V3b 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 1)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 공-배양한지 3 일에 수집하였다. 공-배양 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 11은 도 10a-e로부터의 데이터를 사용하여 유전자삽입 T 세포의 확장의 배수-변화를 나타내는 막대 그래프이고, 여기서, 유전자삽입 T 세포는 다음을 발현한다: CAR bb2121 작제물; DAR BCMA-2C5 V2c 작제물; DAR BCMA-2C5 V3a 작제물; 또는 DAR BCMA-2C5 V3b 작제물. T 세포를 K562, RPMI8226 또는 U266 세포주와 공-배양하였다. 데이터를 공-배양한지 3 일에 수집하였다. 배수-변화 확장 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 12는 RPMI 8226 표적 세포 상 BCMA CAR, 또는 BCMA DAR을 발현하는 T 세포 (공여자 1)의 세포독성 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 라인 A는 음성 대조군 TRAC-minus T 세포주 (T-세포 수용체 알파 불변-minus)를 지정하고; 라인 B는 DAR BCMA-2C5 V2c 작제물을 지정하고; 라인 C (점선)는 CAR bb2121 작제물을 지정하고; 라인 D는 DAR BCMA-2C5 V3a 작제물을 지정하고; 라인 E는 DAR BCMA-2C5 V2b 작제물을 지정하고; 라인 F는 CAR BCMA-2C5 작제물을 지정한다. 세포독성 연구는 실시예 6에 기재되어 있다.
도 13a는 3개의 상이한 버젼의 BCMA-2C5 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 발현하는 T 세포 (공여자 1)와 비교하여, 도 5a에 나타낸 동일한 BCMA-2C5 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물의 유세포분석 연구 (13 일째)의 결과를 나타낸다. 음성 대조군은 도 5a로부터의 TRAC-minus T 세포주이다. 다양한 DAR 작제물을 발현하는 유전자삽입 세포의 비교를 나타낸다: DAR V2c 작제물; DAR V3a 작제물; 및 DAR V3b 작제물. 데이터를 형질감염-후 13 일에 수집하였다. 형질감염 효율 및 발현 수준 유세포분석 연구는 실시예 5에 기재되어 있다.
도 13b는 도 13a에 기재된 동일한 세포를 사용하는 항-BCMA CAR T 세포 및 DAR T 세포의 집단에서 중심 기억 T 세포의 분획을 검출하기 위한 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 중심 기억 T 세포 연구는 실시예 9에 기재되어 있다.
도 13c는 도 13a에 기재된 동일한 세포를 사용하여 항-BCMA CAR T 세포 및 DAR T 세포로부터 T 세포 탈진 마커 PD1 및 TIM3을 검출하기 위한 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. T 세포 탈진 연구는 실시예 10에 기재되어 있다.
도 14는 BCMA 키메라 항원 수용체 (CAR) 작제물 또는 2개의 상이한 버젼의 BCMA 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 2)를 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 형질감염-후 11 일에 및 확장 후 15 일에 수집하였다. 음성 대조군은 비-유전자삽입 활성화된 T 세포 (ATC)이다. 또다른 음성 대조군은 TRAC-minus T 세포주 (T-세포 수용체 알파 불변-minus)이다. 비교는 다음을 발현하는 유전자삽입 T 세포를 포함한다: CAR BCMA-2C5 작제물; DAR BCMA-2C5 V2a 작제물; 또는 DAR BCMA-2C5 V3a 작제물. 형질감염 효율 및 발현 수준 유세포분석 연구는 실시예 5에 기재되어 있다.
도 15는 RPMI 8226 표적 세포 상 BCMA-2C5 CAR 또는 BCMA-2C5 DAR 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 2)의 세포독성 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 라인 A는 음성 대조군 TRAC-minus T 세포주 (T-세포 수용체 알파 불변-minus)를 지정하고; 라인 B는 CAR BCMA-2C5 작제물을 발현하는 T 세포를 지정하고; 라인 C는 DAR BCMA-2C5 V3a 작제물을 발현하는 T 세포를 지정하고; 라인 D는 DAR BCMA-2C5 V2a 작제물을 발현하는 T 세포를 지정한다. 세포독성 연구는 실시예 6에 기재되어 있다.
도 16a는, K562, RPMI8226, Raji와 함께 공-배양되거나 배지 단독의 경우, 음성 대조군 TRAC-minus T 세포주 (T-세포 수용체 알파 불변-minus)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 공-배양한지 6 일에 수집하였다. 공-배양 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 16b는, K562, RPMI8226, Raji와 공-배양되거나 배지 단독의 경우, 비-유전자삽입 활성화된 T 세포 (ATC) (공여자 2)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 공-배양한지 6 일에 수집하였다. 공-배양 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 16c는, K562, RPMI8226, Raji와 공-배양되거나 배지 단독의 경우, CAR BCMA-2C5 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 2)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 공-배양한지 6 일에 수집하였다. 공-배양 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 16d는, K562, RPMI8226, Raji와 공-배양되거나 배지 단독의 경우, DAR BCMA-2C5 V2a 작제물 (BBZ)을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 2)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 공-배양한지 6 일에 수집하였다. 공-배양 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 16e는, K562, RPMI8226, Raji와 공-배양되거나 배지 단독의 경우, DAR BCMA-2C5 V3a 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 2)의 확장 능력을 비교하는 유세포분석 연구의 결과를 나타낸다. 데이터를 공-배양한지 6 일에 수집하였다. 공-배양 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 17은 CAR 작제물 또는 BCMA-2C5로부터 항원 결합 영역을 갖는 상이한 DAR 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 2)의 확장의 배수-변화를 나타내는 막대 그래프이다. 비교는 다음을 발현하는 T 세포를 포함한다: CAR BCMA-2C5 작제물; DAR BCMA-2C5 V2a 작제물; 및 DAR BCMA-2C5 V3a 작제물. 데이터를 공-배양한지 6 일에 수집하였다. 배수-변화 확장 연구는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 18a는 이종이식 마우스 모델에서 BCMA DAR-발현 T 세포의 종양파괴 활성의 생체발광 이미지를 나타낸다 (처리-후 12주째까지). 생체발광 종양을 보유하는 마우스에게 PBS 완충액, TRAC-minus T 세포, 또는 DAR V2c, DAR V3b 또는 DAR V3a를 포함하는 BCMA-2C5 DAR 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포를 투여하였다. 이종이식 마우스 연구는 실시예 11에 기재되어 있다.
도 18b는 도 18a에 기재된 처리된 마우스로부터 측정한 총 플럭스 (광자/sec)를 나타내는 그래프이다. 라인 A는 DAR BCMA-2C5 V3a를 지정하고; 라인 B는 DAR BCMA-2C5 V3b를 지정하고; 라인 C는 DAR BCMA-2C5 V2c를 지정하고; 라인 D는 DAR BCMA-2C5 TRAC-minus T 세포를 지정하고; 라인 E는 PBS-처리된 마우스를 지정한다. 실시예 11을 참조한다.
도 18c는 도 18a에 기재된 마우스로부터 입수한 종양 성장 억제 지수를 열거한 표이다. 당해 표는 처리-후 8 주째까지 입수한 데이터를 열거한다. 실시예 11을 참조한다.
도 18d는 도 18a에 기재된 마우스로부터의 혈액 샘플에서 검출된 CD45-양성 세포의 수를 나타내는 그래프이다. 그래프는 처리-후 12 주째까지 입수된 데이터를 나타낸다. 라인 A는 PBS-처리된 마우스를 지정하고; 라인 B는 DAR BCMA-2C5 V2c를 지정하고; 라인 C는 TRAC-minus T 세포를 지정하고; 라인 D는 DAR BCMA-2C5 V3b를 지정하고; 라인 E는 DAR BCMA-2C5 V3a를 지정한다. 실시예 11을 참조한다.
도 18e는 도 18a에 기재된 마우스로부터의 혈액 샘플에서 검출된 DAR-양성 세포의 수를 나타내는 그래프이다. 그래프는 처리-후 12 주째까지 입수된 데이터를 나타낸다. 라인 A는 TRAC-minus T 세포를 지정하고; 라인 B는 PBS-처리된 마우스를 지정하고; 라인 C는 DAR BCMA-2C5 V2c를 지정하고; 라인 D는 DAR BCMA-2C5 V3b를 지정하고; 라인 E는 DAR BCMA-2C5 V3a를 지정한다. 실시예 11을 참조한다.
도 18f는 도 18a에 기재된 마우스로부터의 혈액 샘플에서 검출된 CD3-음성 세포의 수를 나타내는 그래프이다. 그래프는 처리-후 12 주째까지 입수된 데이터를 나타낸다. 라인 A는 PBS-처리된 마우스를 지정하고; 라인 B는 DAR BCMA-2C5 V2c를 지정하고; 라인 C는 TRAC-minus T 세포를 지정하고; 라인 D는 DAR BCMA-2C5 V3b를 지정하고; 라인 E는 DAR BCMA-2C5 V3a를 지정한다. 실시예 11을 참조한다.
도 18g는 도 18a에 기재된 마우스로부터의 혈액 샘플에서 검출된 CD3-양성 세포의 수를 나타내는 그래프이다. 그래프는 처리-후 12 주째까지 입수된 데이터를 나타낸다. 라인 A는 PBS-처리된 마우스를 지정하고; 라인 B는 DAR BCMA-2C5 V2c를 지정하고; 라인 C는 TRAC-minus T 세포를 지정하고; 라인 D는 DAR BCMA-2C5 V3a를 지정하고; 라인 E는 DAR BCMA-2C5 V3b를 지정한다. 실시예 11을 참조한다.
도 18h는 도 18a에 기재된 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다. 라인 A는 PBS-처리된 마우스를 지정하고; 라인 B는 TRAC-minus T 세포를 지정하고; 라인 C는 DAR BCMA-2C5 V2c를 지정하고; 라인 D는 DAR BCMA-2C5 V3b를 지정하고; 라인 E는 DAR BCMA-2C5 V3a를 지정한다. 실시예 11을 참조한다.
도 19a는 이종이식 마우스 모델에서 BCMA DAR-발현 T 세포의 종양파괴 활성의 생체발광 이미지를 나타낸다 (처리-후 12주째까지). 생체발광 RPMI8226 종양을 보유하는 마우스는 PBS 완충액, TRAC-minus T 세포, 또는 3개의 상이한 용량 중 하나의 DAR BCMA-2C5 V3a 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포를 투여받았다. 이종이식 마우스 연구는 실시예 12에서 기술한다.
도 19b는 도 19a에 기재된 처리된 마우스로부터 측정한 총 플럭스 (광자/sec)를 나타내는 그래프이다. 그래프는 처리-후 76일째까지 입수된 데이터를 나타낸다. 라인 A는 6 x 10⁶ 세포의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 B는 1.2 x 10⁶ 세포의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 C는 2.4 x 10⁵ 세포의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 D는 TRAC-minus T 세포로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 E는 PBS로 투여된 마우스를 지정한다. 실시예 12를 참조한다.
도 19c는 도 19a에 기재된 마우스로부터 입수한 종양 성장 억제 지수를 열거하는 표이다. 당해 표는 처리-후 7 주째까지 입수한 데이터를 열거한다. 실시예 12를 참조한다.
도 19d는 도 19a에 기재된 마우스로부터의 혈액 샘플에서 검출된 CD45-양성 세포의 수를 나타내는 그래프이다. 그래프는 처리-후 65 일째까지 입수된 데이터를 나타낸다. 라인 A는 PBS-처리된 마우스을 지정하고; 라인 B는 TRAC-minus T 세포를 지정하고; 라인 C는 2.4 x 10⁵의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 D는 1.2 x 10⁶의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 E는 6 x 10⁶의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정한다. 실시예 12를 참조한다.
도 19e는 도 19a에 기재된 마우스로부터의 혈액 샘플에서 검출된 DAR-양성 세포의 수를 나타내는 그래프이다. 그래프는 처리-후 65일째까지 입수된 데이터를 나타낸다. 라인 A는 PBS-처리된 마우스을 지정하고; 라인 B는 TRAC-minus T 세포를 지정하고; 라인 C는 2.4 x 10⁵의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 D는 1.2 x 10⁶의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 E는 6 x 10⁶의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정한다. 실시예 12를 참조한다.
도 19f는 도 19a에 기재된 마우스로부터의 혈액 샘플에서 검출된 CD3-음성 세포의 수를 나타내는 그래프이다. 그래프는 처리-후 65 일째까지 입수된 데이터를 나타낸다. 라인 A는 PBS-처리된 마우스을 지정하고; 라인 B는 TRAC-minus T 세포를 지정하고; 라인 C는 2.4 x 10⁵의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 D는 1.2 x 10⁶의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 E는 6 x 10⁶의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정한다. 실시예 12를 참조한다.
도 19g는 도 19a에 기재된 마우스로부터의 혈액 샘플에서 검출된 CD3-양성 세포의 수를 나타내는 그래프이다. 그래프는 처리-후 65 일째까지 입수된 데이터를 나타낸다. 라인 A는 PBS-처리된 마우스을 지정하고; 라인 B는 2.4 x 10⁵의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 C는 1.2 x 10⁶의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 D는 TRAC-minus T 세포로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 E는 6 x 10⁶의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정한다. 실시예 12를 참조한다.
도 19h는 도 19a에 기재된 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다. 라인 A는 PBS로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 B는 TRAC-minus T 세포로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 C는 1.2 x 10⁶의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 D는 1.2 x 10⁶의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정하고; 라인 E는 6 x 10⁶의 DAR BCMA-2C5 V3a로 투여된 마우스를 지정한다. 실시예 12를 참조한다.
도 20a는 이종이식 마우스 모델에서 BCMA DAR-발현 T 세포의 종양파괴 활성의 생체발광 이미지를 나타내고, 여기서, 도 19a에 기재된 마우스에게 RPMI8226 생체발광 종양을 재-접종(re-challenged)하지만, 추가의 DAR T 세포를 투여하지 않았다. 생체발광 데이터는 재-접종-후 7 주째까지를 나타낸다. 이종이식 마우스 연구는 실시예 13에 기재되어 있다.
도 20b는 도 20a에 기재된 종양 재-접종된 마우스로부터의 혈액 샘플에서 검출된 CD45-양성 세포의 수를 나타내는 그래프이다. 그래프는 처리-후 65 일째까지 입수된 데이터를 나타낸다. 라인 A는 RPMI 종양 세포로 재-접종된 마우스를 지정하고; 라인 B는 PBS로 재-접종된 마우스를 지정한다.
도 20c는 도 20a에 기재된 종양 재-접종된 마우스로부터의 혈액 샘플에서 검출된 DAR-양성 세포의 수를 나타내는 그래프이다. 그래프는 처리-후 65 일째까지 입수된 데이터를 나타낸다. 라인 A는 RPMI 종양 세포로 재-접종된 마우스를 지정하고; 라인 B는 PBS로 재-접종된 마우스를 지정한다.
도 21은 야생형 사람 BCMA 항원, 돌연변이체-1 사람 BCMA 항원, 돌연변이체-2 사람 BCMA 항원, 사람 APRIL 항원 및 사람 BAFF 항원의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 22는 항-BCMA-2C5 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 23은 항-BCMA-2E1, -BC4C9 및 -BC5C4의 항-BCMA 중쇄 가변 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 24는 항-BCMA-BC6G8, -2D11 및 -2G2의 항-BCMA 중쇄 가변 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 25는 항-BCMA-2D8 및 -2E8의 항-BCMA 중쇄 가변 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 26은 항-BCMA-bb2121의 항-BCMA 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 27은 CAR GS 링커, CAR bb2121 링커, CD8 힌지 영역, CD28 힌지 영역, CD8 및 CD28 힌지 영역, CD28 막횡단 영역, CD8 막횡단 영역, 4-1BB 막횡단 영역 및 CD3제타 막횡단 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 28은 4-1BB, CD28, OX40, CD3제타 (ITAM 1, 2 및 3), CD3제타 ITAM 1, CD3제타 ITAM 2 및 CD3제타 ITAM 3에 대한 세포내 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 29는 V1, V2a, V2b, V2c, V3a, V3b 및 V4에 대한 CAR 세포내 도메인 28Z, 및 DAR 세포내 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 30은 V3c, V2c-alt 및 V3b-alt에 대한 DAR 세포내 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 31은 중쇄 및 경쇄 리더 서열, 및 T2A, P2A, E2A 및 F2A를 포함하는 4개의 상이한 자기-절단 서열의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 32는 CAR 28Z BCMA-2C5 및 BCMA-bb2121의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 33은 DAR V1 BCMA-2C5에 대한 전구체, 첫번째 폴리펩타이드 및 두번째 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 34는 DAR V2a BCMA-2C5에 대한 전구체, 첫번째 폴리펩타이드 및 두번째 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 35는 DAR V2b BCMA-2C5에 대한 전구체, 첫번째 폴리펩타이드 및 두번째 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 36은 DAR V2c BCMA-2C5에 대한 전구체, 첫번째 폴리펩타이드 및 두번째 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 37은 DAR V3a BCMA-2C5에 대한 전구체, 첫번째 폴리펩타이드 및 두번째 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 38은 DAR V3b BCMA-2C5에 대한 전구체, 첫번째 폴리펩타이드 및 두번째 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 39는 DAR V4 BCMA-2C5에 대한 전구체, 첫번째 폴리펩타이드 및 두번째 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 40은 DAR V2a BCMA-bb2121에 대한 전구체, 첫번째 폴리펩타이드 및 두번째 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸다.

상세한 설명

정의:

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술적 및 과학적 용어는, 달리 정의되지 않는 한, 당해 기술분야의 숙련가가 통상 이해하는 의미를 갖는다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양 기술, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 유전자삽입 세포 생산, 단백질 화학 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련된 전문용어는, 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있거나 통상 사용된다. 본원에 제공된 방법 및 기술은 일반적으로 당해 기술분야에 공지된 종래의 절차에 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 본원에 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참조에 기재된 바과 같이 수행된다. 예를 들면, 문헌을 참조한다 [참조: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)]. 다수의 기본 텍스트는 문헌에 포함된 표준 항체 생산 프로세스를 기술한다 [참조: Borrebaeck (ed) Antibody Engineering,　2nd Edition Freeman and Company, NY, 1995; McCafferty et al. Antibody Engineering, A Practical Approach IRL at Oxford Press, Oxford, England, 1996; and Paul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, N.J., 1995; Paul (ed.), Fundamental Immunology, Raven Press, N.Y, 1993; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology　(4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., and references cited therein; Coding Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed.) Academic Press, New York, N.Y., 1986, and Kohler and Milstein Nature 256: 495-497, 1975]. 본원에 인용된 모든 참조는 이들의 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 효소적 반응 및 풍부화/정제 기술은 또한 잘 공지되어 있고, 본원에 기재된 당해 기술 분야에서 통상 수행되는 제조자의 명세서에 따라서 수행한다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학적 및 약제학적 화학과 관련하여 사용된 전문용어 및 실험 절차 및 기술은 당해 기술 분야에 잘 공지되고 통상 사용된다. 표준 기술은 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제제, 제형, 및 전달, 및 환자의 처리를 위해 사용할 수 있다.

본원에 제공된 주제는 개시내용의 다양한 측면을 제한하는 것이 아니고, 이러한 측면을 명세서 전체를 참고하여 이해할 수 있다.

본원 맥락에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하여야 하고, 복수 용어는 단수를 포함하여야 한다. 단수 형태 하나("a", "an") 및 상기("the"), 및 이러한 단어의 단수 사용은, 하나의 지시대상인 것으로 달리 분명하고 명확하게 제한하지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다.

본원에서 대안 (예를 들면, "또는")의 사용은 대안 중 어느 하나 또는 이들 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하기 위해 사용하는 것으로 이해된다.

본원에 사용된 용어 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 다른 것의 부재하에 명시된 특징 또는 성분 각각의 특정 개시를 의미하기 위해 사용된다. 예를 들면, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 구절에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B," "A 또는 B," "A" (단독), 및 "B" (단독)을 포함하는 것을 의도한다. 또한, "A, B, 및/또는 C"와 같은 구절에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음 측면 각각을 포함하는 것을 의도한다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).

본원에 사용된 용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "갖는(having)" 및 "포함하는(containing)", 및 이들의 문법적 변형은, 비-제한적인 것을 의도하고, 이에 따라, 기재된 하나의 항목 또는 다수의 항목은 기재된 항목을 대체하거나 이에 추가될 수 있는 다른 항목을 배제하지 않는다. 용어 "포함하는(comprising)"을 갖는 측면이 본원에 기재될 때마다, 용어 "로 이루어진(consisting of)" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"의 용어로 기재된 다른 유사한 측면이 또한 제공된다는 것을 이해하여야 한다.

본원에 사용된 용어 "약"은 값 또는 조성이 측정되거나 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 좌우될 수 있는 당해 기술분야의 숙련가에 의해 측정된 특정한 값 또는 조성에 대한 허용되는 오차 범위 내의 값 또는 조성을 언급한다. 예를 들면, "약" 또는 "대략"은 당해 기술 분야의 실행에 따른 하나 이상의 하나의 표준 변차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "대략"은 측정 시스템의 한계에 좌우되어 10% 이하의 범위 (즉, ±10%) 이상을 의미할 수 있다. 예를 들면, 약 5 mg은 4.5 mg 내지 5.5 mg 사이의 임의의 수를 포함할 수 있다. 추가로, 특히 생물학적 시스템 또는 프로세스에 관련하여, 상기 용어는 자릿수까지 또는 값의 5-배 까지를 의미할 수 있다. 특정 값 또는 조성이 본 개시내용에 제공되는 경우, 달리 기재되지 않는 한, "약" 또는 "대략"의 의미는 그 특정 값 또는 조성물에 대한 허용되는 오차 범위 내에 있는 것으로 추정되어야 한다.

본원에 사용된 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", "폴리펩타이드 쇄" 및 "단백질" 및 다른 관련된 용어는 상호교환가능하게 사용되고, 아미노산의 중합체를 언급하고, 임의의 특정 길이에 제한되지 않는다. 폴리펩타이드는 천연 및 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 재조합 또는 화학적으로-합성된 형태를 포함한다. 폴리펩타이드는 또한 전구체 분자 및 성숙 분자를 포함한다. 전구체 분자는, 예를 들면 특정 아미노산 잔기에서 분비 신호 펩타이드에 의한 또는 비-효소적 절단에 의한 절단으로 아직 절단되지 않은 것들을 포함한다. 폴리펩타이드는 절단을 겪은 성숙 분자를 포함한다. 이들 용어는 자연 단백질, 재조합 단백질 및 합성 단백질, 단백질 서열의 단백질 단편 및 폴리펩타이드 유사체 (예를 들면, 뮤테인, 변종, 키메라 단백질 및 융합 단백질) 뿐만 아니라 번역-후, 또는 또는 그렇지 않으면 공유 또는 비-공유적으로, 변형된 단백질을 포함한다. 2개 이상의 폴리펩타이드 (예를 들면, 2-6개 이상의 폴리펩타이드 쇄)는 서로, 공유 및/또는 비-공유 회합을 통해 회합하여, 폴리펩타이드 복합물을 형성할 수 있다. 폴리펩타이드 쇄의 회합은 또한 펩타이드 접기(folding)를 포함할 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드 복합물은 이량체성, 삼량체성, 사량체성, 또는 복합물을 형성하는 폴리펩타이드 쇄의 수에 좌우되어 더 높은 차수 복합물일 수 있다. 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 이량체성 항원 수용체 (DAR)가 본원에 기재되어 있다.

본원에 사용된 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드" 및 다른 관련된 용어는 상호교환가능하게 사용하고, 뉴클레오티드의 중합체를 언급하고, 임의의 특정 길이에 제한되지 않는다. 핵산은 재조합 및 화학적으로-합성된 형태를 포함한다. 핵산은 DNA 분자 (cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자 (예를 들면, mRNA), 뉴클레오티드 유사체 (예를 들면, 펩타이드 핵산 및 비-천연 발생 뉴클레오티드 유사체)를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체, 및 이의 하이브리드를 포함한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 개시내용의 핵산 분자는 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물, 또는 단편 또는 scFv, 유도체, 뮤테인, 또는 이의 변종을 암호화하는 인접 개방 판독 프레임을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 핵산은 폴리뉴클레오티드의 하나의 유형 또는 2개 이상의 상이한 유형의 폴리뉴클레오티드의 혼합물을 포함한다. 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산은, 본원에 기재되어 있다. 첫번째 핵산 (예를 들면, 첫번째 폴리펩타이드를 암호화함) 및 두번째 핵산 (예를 들면, 두번째 폴리펩타이드를 암호화함)에 관련된 실시형태에 관하여, 첫번째 핵산 및 두번째 핵산은 개별적인 분자로서 또는 동일한 연속적인 분자 (예를 들면, 플라스미드 또는 첫번째 및 두번째 코딩 서열을 포함하는 다른 작제물)로 제공될 수 있다.

용어 "회수하다" 또는 "회수" 또는 "회수하는", 및 다른 관련된 용어는, 단백질 (예를 들면, DAR 또는 이의 전구체 또는 항원 결합 부분)을, 숙주 세포 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 또는 숙주 세포 막으로부터 입수함을 언급한다. 하나의 실시형태에서, 단백질은 숙주 세포로부터 (예를 들면, 포유류 숙주 세포로부터) 발현된 단백질의 분비를 매개하는 분비 신호 펩타이드 (선도 펩타이드 서열) 서열에 융합된 재조합 단백질로서 숙주 세포에 의해 발현된다. 분비된 단백질을 숙주 세포 배지로부터 회수할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 단백질은, 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있는 분비 신호 펩타이드 서열이 없는 재조합 단백질로서 숙주 세포에 의해 발현된다. 하나의 실시형태에서, 단백질은 계면활성제(detergent)를 사용하여 회수되어 숙주 세포 막으로부터 발현된 단백질로 방출될 수 있는 막-결합된 단백질로서 숙주 세포에 의해 발현된다. 하나의 실시형태에서, 단백질을 회수하기 위해 사용되는 방법에 관계없이, 단백질에 회수된 단백질로부터 세포 데브리스를 제거하는 절차를 수행할 수 있다. 예를 들면, 회수된 단백질에 크로마토그래피, 겔 전기영동 및/또는 투석을 적용한다. 하나의 실시형태에서, 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 역 상 크로마토그래피 및/또는 실리카 상 크로마토그래피를 포함하는 임의의 하나 또는 임의의 조합 또는 2개 이상의 절차를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 또는 G (스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 세포벽 성분)를 포함한다.

용어 "단리된"은 다른 세포 물질이 실질적으로 없는 단백질 (예를 들면, DAR 또는 이의 전구체 또는 항원 결합 부분) 또는 폴리뉴클레오티드를 언급한다. 단백질은 당해 기술분야에 공지된 단백질 정제 기술을 사용한 단리에 의해 천연 관련 성분 (또는 DAR을 생산하기 위해 사용되는 세포 발현 시스템 또는 화학적 합성 방법과 연관된 성분)이 실질적으로 없게 만들 수 있다. 용어 단리된은 또한 일부 실시형태에서 동일한 종의 다른 분자, 예를 들면, 각각 상이한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 갖는 다른 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 실질적으로 없는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 언급한다. 목적하는 분자의 순도 또는 균일성은 저 분해능 방법, 예를 들면, 겔 전기영동 및 고 분해능 방법, 예를 들면, HPLC 또는 질량분광분석을 포함하는 당해 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 검정할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본원 개시내용의 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분의 단리된 전구체 폴리펩타이드, 및 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄가 단리된다.

본원에 기재된 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 포함하는 항체를 변화된 항원 특이성을 갖는 면역글로불린을 포함하는 혈청 또는 혈장과 같은 공급원으로부터 수득할 수 있다. 이러한 항체에 친화도 정제를 수행하는 경우, 특정 항원 특이성에 대해 풍부화될 수 있다. 이러한 항체의 풍부화 제제는 보통 특정 항원에 대한 특이적 결합 활성을 갖는 약 10% 미만의 항체로 만들어진다. 수회 적용의 친화도 정제에 이들 제제를 적용하여 항원에 대해 특이적 결합 활성을 갖는 항체의 비율을 증가시킬 수 있다. 이러한 방식으로 제조된 항체는 종종 "단일특이성"으로 언급된다. 단일특이성 항체 제제는, 특정 항원에 대해 특이적 결합 활성을 갖는, 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 99.9% 항체로 구성될 수 있다. 항체를 하기한 재조합 핵산 기술을 사용하여 생산할 수 있다.

용어 "선도 서열" 또는 "선도 펩타이드" 또는 "펩타이드 신호전달 서열" 또는 "신호 펩타이드" 또는 "분비 신호 펩타이드"는 폴리펩타이드의 N-말단에 위치한 펩타이드 서열을 언급한다. 리더 서열은 세포 분비 경로로 폴리펩타이드 쇄를 지시하고, 폴리펩타이드의 세포성 막의 지질 이중층 내로의 통합 및 고정을 지시할 수 있다. 전형적으로, 리더 서열은 약 10-50개의 아미노산 길이이다. 리더 서열은 시토졸에서부터 세포질그물까지 전구체 폴리펩타이드의 운반을 지시할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 리더 서열은 CD8α, CD28 또는 CD16 리더 서열을 포함하는 신호전달 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 신호전달 서열은 예를 들면 마우스 또는 사람 Ig 감마 분비 신호 펩타이드를 포함하는 포유류 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 리더 서열은 마우스 Ig 감마 리더 펩타이드 서열 MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (서열번호 90)을 포함한다.

본원에 사용된 "항원 결합 단백질" 및 관련 용어는 항원에 결합하는 부분 및, 임의로, 항원 결합 부분이 항원 결합 단백질의 항원에 대한 결합을 촉진하는 형태를 채택하도록 하는 골격 또는 프레임워크 부분을 포함하는 단백질을 언급한다. 항원 결합 단백질의 예는 이량체성 항원 수용체 (DARs), 항체, 항체 단편 (예를 들면, 항체의 항원 결합 부분), 항체 유도체, 및 항체 유사체를 포함한다. 항원 결합 단백질은, 예를 들면, 그래프팅된 CDRs 또는 CDR 유도체를 갖는 대안적인 단백질 골격 또는 합성 골격을 포함할 수 있다. 이러?h 골격은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 항원 결합 단백질의 3-차원 구조를 안정화시키기 위해 도입된 돌연변이를 포함하는 항체-유래된 골격 뿐만 아니라 예를 들면, 생체적합성 중합체를 포함하는 전부 합성 골격을 포함한다. 예를 들면, 문헌을 참조한다 [참조: Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654]. 추가로, 펩타이드 항체 미메틱 ("PAMs")을 사용할 수 있고, 뿐만 아니라 항체 미메틱을 기반로 하는 골격은 피브로넥틴 성분을 골격으로 이용한다. 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 포함하는 항원 결합 단백질은 본원에 기재되어 있다.

항원 결합 단백질은, 예를 들면, 면역글로불린의 구조를 가질 수 있다. 하나의 실시형태에서, "면역글로불린"은 폴리펩타이드 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 구성된 사량체성 분자를 언급하고, 각각의 쌍은 1개의 "경" 쇄 (약 25 kDa) 및 1개의 "중" 쇄 (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 쇄의 카복시-말단 부분은 이펙터 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 정의한다. 사람 경쇄는 카파 또는 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 초과의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌을 참조한다 [참조: Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (이의 전문이 모든 목적을 위해 참조로서 포함된다). 중쇄 및/또는 경쇄는 분비를 위한 리더 서열을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성하고, 이에 무손상 면역글로불린은 2개의 항원 결합 부위를 갖는다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 단백질은, 사량체성 면역글로불린 분자와 상이하지만 여전히 표적 항원에 결합하거나 2개 이상의 표적 항원에 결합하는 구조를 갖는 합성 분자일 수 있다. 예를 들면, 합성 항원 결합 단백질은 항체 단편, 1-6개 이상의 폴리펩타이드 쇄, 폴리펩타이드의 비대칭 어셈블리, 또는 다른 합성 분자를 포함할 수 있다. 표적 항원 (예를 들면, BCMA 항원)에 특이적으로 결합하는 면역글로불린-유사 성질을 갖는 이량체성 항원 수용체 (DAR) 구조를 갖는 항원 결합 단백질은 본원에 기재되어 있다.

면역글로불린 쇄의 가변 영역은, 또한 상보성 결정 영역 또는 CDR으로 언급되는, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 상대적 보존 프레임워크 영역 (FR)의 동일한 일반적 구조를 나타낸다. N-말단에서부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 둘 다는 세그먼트 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다.

하나 이상의 CDR은 분자 내로 공유 또는 비공유로 도입되어 항원 결합 단백질을 만들 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDR(들)을 더 큰 폴리펩타이드 쇄의 부분으로서 도입할 수 있거나, CDR(들)을 또다른 폴리펩타이드 쇄에 공유 연결할 수 있거나, CDR(들)을 비공유 도입할 수 있다. CDR은 항원 결합 단백질을 관심 대상 특정 항원에 특이적으로 결합하게 한다.

각각의 도메인에 대한 아미노산의 배치는 문헌의 정의에 따른다 [참조: Kabat et al. in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991] ("Kabat 번호매김"). 면역글로불린 쇄에서 아미노산에 대한 다른 번호매김 시스템은 IMGT.RTM. (참조: international ImMunoGeneTics information system; Lefranc et al, Dev. Comp. Immunol. 29:185-203; 2005) 및 AHo (참조: Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-670; 2001); Chothia (참조: Al-Lazikani et al., 1997 Journal of Molecular Biology 273:927-948; Contact (참조: Maccallum et al., 1996 Journal of Molecular Biology 262:732-745, 및 Aho (참조: Honegger and Pluckthun 2001 Journal of Molecular Biology 309:657-670)을 포함한다.

본원에 사용된 "항체" 및 "항체들" 및 관련 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 무손상 면역글로불린 또는 이의 항원 결합 부분을 언급한다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조할 수 있다. 항원 결합 부분은, 그 중에서도, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 도메인 항체 (dAbs), 및 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 단일-쇄 항체 (scFv), 키메라 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 폴리펩타이드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.

항체는 재조합으로 제조된 항체 및 항원 결합 부분을 포함한다. 항체는 비-사람, 키메라, 사람화 및 완전 사람 항체를 포함한다. 항체는 단일특이적, 다중특이적 (예를 들면, 이중특이적, 삼중특이적 및 더 높은 차수의 특이성)를 포함한다. 항체는 사량체성 항체, 경쇄 단량체, 중쇄 단량체, 경쇄 이량체, 중쇄 이량체를 포함한다. 항체는 F(ab')₂ 단편, Fab' 단편 및 Fab 단편을 포함한다. 항체는 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단일 쇄 항체, 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 캐러멜화 항체, 아피바디(affibodies), 디설파이드-연결된 Fvs (sdFv), 항-이디오타입 항체 (항-Id), 미니바디를 포함한다. 항체는 모노클로날 및 다클론 집단을 포함한다. 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 포함하는 항체-유사 분자는 본원에 기재되어 있다.

본원에 사용된 "항원 결합 도메인," "항원 결합 영역," 또는 "항원 결합 부위" 및 다른 관련된 용어는 항원과 상호작용하고 항원에 대한 항원 결합 단백질의 특이성 및 친화력에 기여하는 아미노산 잔기 (또는 다른 모이어티)를 포함하는 항원 결합 단백질의 부분을 언급한다. 이의 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 대해, 이는 이의 CDR 도메인 중 적어도 하나의 적어도 일부를 포함할 것이다. 항원 결합 도메인을 형성하는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 갖는 이량체성 항원 수용체 (DAR)는 본원에 기재되어 있다.

항체 또는 항원 결합 단백질 또는 항체 단편의 문맥에서 본원에 사용된 용어 "특이적 결합", "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적으로 결합하는" 및 다른 관련된 용어는, 다른 분자 또는 모이어티에 상대적으로 항원으로의 비-공유 또는 공유 우선적 결합을 언급한다 (예를 들면, 항체는 다른 이용가능한 항원에 상대적으로 특정 항원에 특이적으로 결합한다). 하나의 실시형태에서, 항체는, 10^-5 M 이하, 또는 10^-6 M 이하, 또는 10^-7 M 이하, 또는 10^-8 M 이하, 또는 10^-9 M 이하, 또는 10^-10 M 이하, 또는 10^-11 M 이하의 해리 상수 K_D로 항원에 결합하는 경우, 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 이들의 표적 항원 (예를 들면, BCMA 항원)에 특이적으로 결합하는 이량체성 항원 수용체 (DAR)는 본원에 기재되어 있다.

하나의 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단백질 또는 항체 단편의 결합 특이성은 ELISA, 방사선면역 검정 (RIA), 전자화학발광 검정 (ECL), 면역방사측정 검정 (IRMA), 또는 효소 면역 검정 (EIA)에 의해 측정될 수 있다.

하나의 실시형태에서, 해리 상수 (K_D)는 BIACORE 표면 플라스몬 공명 (SPR) 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 표면 플라스몬 공명은, 단백질 농도 변화의 검출에 의해 바이오센서 매트릭스 내에서, 예를 들면 BIACORE 시스템 (Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 사용하여 실시간 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 언급한다.

본원에 사용된 "에피토프" 및 관련 용어는 항원 결합 단백질에 의해 (예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 의해) 결합된 항원의 부분을 언급한다. 에피토프는 항원 결합 단백질에 의해 결합된 2개 이상의 항원의 부분을 포함할 수 있다. 에피토프는 1개의 항원 또는 2개 이상의 항원의 비-인접 부분을 포함할 수 있다 (예를 들면, 항원의 일차적 서열에서 인접하지 않지만, 항원의 3차 및 4차 구조의 맥락에서, 서로 충분히 가까워서 항원 결합 단백질에 의해 결합되는 아미노산 잔기). 일반적으로, 항체의 가변 영역, 특히 CDR는, 에피토프와 상호작용한다. 하나의 실시형태에서, BCMA 항원의 에피토프에 결합하는 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분은 본원에 기재되어 있다.

본원에 사용된 "항체 단편", "항체 부분", "항체의 항원-결합 단편", 또는 "항체의 항원-결합 부분" 및 다른 관련된 용어는 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 언급한다. 항체 단편의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; Fd; 및 Fv 단편, 뿐만 아니라 dAb; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들면, scFv); 폴리펩타이드에 대한 특이적 항원 결합을 부여하는데 충분한 항체의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 항체의 항원 결합 부분을 재조합 DNA 기술에 의해 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산할 수 있다. 항원 결합 부분은, 그 중에서도, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 도메인 항체 (dAbs), 및 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 키메라 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 항체 단편에 항원 결합 성질을 부여하는데 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지, 막횡단 및 세포내 영역에 연결된 Fab 단편을 포함하는 이량체성 항원 수용체는 본원에 기재되어 있다.

용어 "Fab", "Fab 단편" 및 다른 관련된 용어는 가변 경쇄 영역 (V_L), 불변 경쇄 영역 (C_L), 가변 중쇄 영역 (V_H), 및 첫번째 불변 영역 (C_H1)을 포함하는 1가 단편을 언급한다. Fab는 항원에 결합할 수 있다. F(ab')₂ 단편은 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편이다. F(Ab')₂는 항원 결합 능력을 갖는다. Fd 단편은 V_H 및 C_H1 영역을 포함한다. Fv 단편은 V_L 및 V_H 영역을 포함한다. Fv는 항원에 결합할 수 있다. dAb 단편은 V_H 도메인, V_L 도메인, 또는 V_H 또는 V_L 도메인의 항원-결합 단편을 갖는다 (미국 특허 6,846,634 및 6,696,245; 미국 공보 출원 번호 2002/02512, 2004/0202995, 2004/0038291, 2004/0009507, 2003/0039958; 및 Ward et al., Nature 341:544-546, 1989). 하나의 실시형태에서, 힌지, 막횡단 및 세포내 영역에 연결된 Fab 단편을 포함하는 이량체성 항원 수용체는 본원에 기재되어 있다.

단일-쇄 항체 (scFv)는 V_L 및 V_H 영역이 링커 (예를 들면, 아미노산 잔기의 합성 서열)을 통해 연결되어 연속적인 단백질 쇄를 형성하는 항체이다. 하나의 실시형태에서, 링커는 단백질 쇄가 다시 둘로 접혀져서(fold back on itself) 1가 항원 결합 부위를 형성할 수 있도록 충분히 길다 (예를 들면, 문헌을 참조한다: Bird et al., 1988, Science 242:423-26 and Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83).

디아바디는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 2가 항체이고, 여기서, 각각의 폴리펩타이드 쇄는, 너무 짧아서 동일한 쇄 상 2개의 도메인 사이에 페어링(pairing)을 허용하지 않고, 이에 따라, 각각의 도메인이 또다른 폴리펩타이드 쇄 상에서 상보성 도메인과 페어링되는, 링커에 의해 연결된 V_H 및 V_L 도메인을 포함한다 (예를 들면, 문헌을 참조한다 [참조: Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, and Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-23]). 디아바디의 2개의 폴리펩타이드 쇄가 동일한 경우, 이들의 페어링으로부터 수득된 디아바디는 2개의 동일한 항원 결합 부위를 가질 것이다. 상이한 서열을 갖는 폴리펩타이드 쇄를 사용하여 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 디아바디를 제조할 수 있다. 유사하게는, 트리바디 및 테트라바디는 각각 3 및 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각 3 및 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 항체이고, 이는 동일하거나 상이할 수 있다. 디아바디, 트리바디 및 테트라바디 작제물은 본원에 기재된 이량체성 항원 수용체 (DAR) 중 어느 것으로부터 항원 결합 부분을 포함하여 제조할 수 있다.

용어 "사람 항체"는 사람 면역글로불린 서열으로부터 유래된 하나 이상의 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 언급한다. 하나의 실시형태에서, 가변 및 불변 도메인 모두는 사람 면역글로불린 서열 (예를 들면, 완전 사람 항체)로부터 유래된다. 이들 항체는 다양한 방식으로 제조할 수 있고, 이의 예는 하기에 기재되어 있고, 재조합 방법론 또는 유전적으로 변형되어 사람 중쇄 및/또는 경쇄-암호화 유전자로부터 유래된 항체를 발현하는 관심 대상 마우스의 항원의 면역화를 통한 방법을 포함한다. 완전 사람 항체 중쇄 가변 영역 및 완전 사람 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 이량체성 항원 수용체 (DAR)는 본원에 기재되어 있다.

"사람화" 항체는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 부가에 의해 비-사람 종으로부터 유래된 항체의 서열과 상이한 서열을 갖는 항체를 언급하고, 이에, 사람화 항체는, 사람 대상자에게 투여되는 경우, 비-사람 종 항체와 비교하여, 면역 반응을 덜 유도하는 경향이 있고/있거나, 덜 심각한 면역 반응을 유도하는 경향이 있다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 종 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 프레임워크 및 불변 도메인에서 특정 아미노산은 돌연변이되어 사람화 항체를 생산한다. 또다른 실시형태에서, 사람 항체로부터의 불변 도메인(들)은 비-사람 종의 가변 도메인(들)에 융합된다. 또다른 실시형태에서, 비-사람 항체의 하나 이상의 CDR 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기를, 사람 대상자에게 투여하는 경우, 비-사람 항체의 가능한 면역원성을 감소시키기 위해 변화시키고, 여기서, 변화된 아미노산 잔기 중 어느 하나는 이의 항원에 대한 항체의 면역특이적 결합, 또는 보존적 변화가 이루어지는 아미노산 서열에 대한 변화에서 중요하지 않고, 이에 사람화 항체의 항원에 대한 결합은 비-사람 항체의 항원에 대한 결합보다 크게 나쁘지는 않다. 사람화 항체를 만드는 방법의 예는 미국 특허 번호 6,054,297, 5,886,152 및 5,877,293에서 발견할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "키메라 항체" 및 관련 용어는 첫번째 항체로부터의 하나 이상의 영역 및 하나 이상의 다른 항체로부터의 하나 이상의 영역을 포함하는 항체를 언급한다. 하나의 실시형태에서, CDR 중 하나 이상은 사람 항체로부터 유래된다. 또다른 실시형태에서, CDR 모두는 사람 항체로부터 유래된다. 또다른 실시형태에서, 하나 초과의 사람 항체로부터의 CDR을 혼합하고, 키메라 항체에서 매치한다. 예를 들어, 키메라 항체는 첫번째 사람 항체의 경쇄로부터의 CDR1, 두번째 사람 항체의 경쇄로부터의 CDR2 및 CDR3, 및 세번째 항체로부터의 중쇄로부터의 CDR을 포함할 수 있다. 또다른 예에서, CDR은 상이한 종, 예를 들면, 사람 및 마우스, 또는 사람 및 래빗, 또는 사람 및 염소 기원이다. 당해 기술분야의 숙련가는 다른 조합이 가능하다는 것을 인식할 것이다.

추가로, 프레임워크 영역은 동일한 항체 중 하나로부터, 하나 이상의 상이한 항체, 예를 들면, 사람 항체로부터, 또는 사람화 항체로부터 유도될 수 있다. 키메라 항체의 하나의 예에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 부분은 특정 종으로부터 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체와 동일하거나, 상동이거나, 유래되는 반면, 쇄(들)의 나머지는 또다른 종으로부터 또는 또다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 (들)와 동일하거나, 상동이거나, 유래된다. 목적하는 생물학적 활성 (즉, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 능력)을 나타내는 이러한 항체의 단편이 또한 포함된다. 키메라 항체는 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분 중 어느 것의 부분으로부터 제조할 수 있고, 본원에 기재되어 있다.

본원에 사용된 용어 "변종" 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드의 "변종"은 참조 폴리펩타이드 서열에 대해 아미노산 서열에 삽입, 결실 및/또는 치환된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 언급한다. 폴리펩타이드 변종은 융합 단백질을 포함한다. 동일한 방식으로, 변종 폴리뉴클레오티드는 또다른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 뉴클레오티드 서열에 삽입, 결실 및/또는 치환된 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 변종은 융합 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본원에 사용된 용어 폴리펩타이드의 "유도체"는, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민 (예를 들면, 사람 혈청 알부민), 포스포릴화, 및 글리코실화와 같은 또다른 화학적 모이어티로의 접합을 통해 화학적으로 변형된 폴리펩타이드 (예를 들면, 항체)이다. 달리 지시되지 않는 한, 용어 "항체"는, 전체-길이 중쇄 및 전체-길이 경쇄를 포함하는 항체에 추가하여, 이의 유도체, 변종, 단편, 및 뮤테인을 포함하고, 이의 예는 하기에 기재되어 있다.

용어 "힌지"는, 일반적으로 단백질의 2개의 도메인 사이에서 발견되고, 전체 작제물의 유연성 및 도메인 중 하나 또는 이들 둘 다의 서로에 대한 이동을 가능하게 하는, 아미노산 세그먼트를 언급한다. 구조적으로, 힌지 영역은 약 10 내지 약 100개의 아미노산, 예를 들면, 약 15 내지 약 75개의 아미노산, 약 20 내지 약 50개의 아미노산, 또는 약 30 내지 약 60개의 아미노산을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 아미노산 길이이다. 힌지 영역은 천연-발생 단백질의 힌지 영역, 예를 들면, CD8 힌지 영역 또는 이의 단편, CD8α 힌지 영역, 또는 이의 단편, 항체의 힌지 영역 (예를 들면, IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 항체), 또는 항체의 불변 도메인 C_H1 및 C_H2에 연결된 힌지 영역으로부터 유래될 수 있다. 힌지 영역은 항체로부터 유래될 수 있고, 항체의 하나 이상의 불변 영역을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있거나, 힌지 영역은 항체의 힌지 영역 및 항체의 C_H3 불변 영역을 포함하거나, 힌지 영역은 항체의 힌지 영역 및 항체의 C_H2 및 C_H3 불변 영역을 포함하거나, 힌지 영역은 비-천연 발생 펩타이드이거나, 힌지 영역은 scFv의 C-말단 및 막횡단 도메인의 N-말단 사이에 배치된다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 면역글로불린 분자로부터의 상부, 코어 또는 하부 힌지 서열을 포함하는 2개 이상의 영역 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1 상부 힌지 서열 EPKSCDKTHT (서열번호 91)를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1 코어 힌지 서열 CP X C를 포함하고, 여기서, X 는 P, R 또는 S이다 (서열번호 92). 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 하부 힌지/C_H2 서열 PAPELLGGP (서열번호 93)를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지는 아미노산 서열 SVFLFPPKPKDT (서열번호 94)을 갖는 Fc 영역 (C_H2)에 연결된다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역는 상부, 코어 및 하부 힌지의 아미노산 서열을 포함하고, EPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGP (서열번호 95)를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 적어도 1, 2, 3개 이상의 쇄간 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 1, 2, 3개 이상의 시스테인을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "Fc" 또는 "Fc 영역"은 힌지 영역 내에서 또는 후에 시작하고 중쇄의 C-말단에서 말단화되는 항체 중쇄 불변 영역의 부분을 언급한다. Fc 영역은 C_H2 및 C_H3 영역의 적어도 일부를 포함하고, 힌지 영역의 부분을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. Fc 영역은 Fc 세포 표면 수용체 및 면역 보완 시스템의 일부 단백질에 결합할 수 있다. Fc 영역은 보완-의존 세포독성 (CDC), 항체-의존 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 항체-의존 포식작용 (ADP), 옵소닌화 및/또는 세포 결합을 포함하는 2개 이상의 활성 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함하는 이펙터 기능을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, Fc 영역은 이들 기능 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 증가 또는 감소시키는 돌연변이를 포함할 수 있다. Fc 영역은 FcγRI (예를 들면, CD64), FcγRII (예를 들면, CD32) 및/또는 FcγRIII (예를 들면, CD16a)을 포함하는 Fc 수용체에 결합할 수 있다. Fc 영역은 보완 성분 C1q에 결합할 수 있다. 하나의 실시형태에서, Fc 도메인은 이펙터 기능을 감소시키는 LALA-PG 돌연변이 (예를 들면, L234A, L235A, P329G과 등가)를 포함한다. 하나의 실시형태에서, Fc 도메인은 단백질 복합물의 혈청 반감기를 매개하고, Fc 도메인에서 돌연변이는 단백질 복합물의 혈청 반감기를 증가 또는 감소시킬 수 있다. 하나의 실시형태에서, Fc 도메인은 단백질 복합물의 열 안정성에 영향을 주고, Fc 도메인에서 돌연변이는 단백질 복합물의 열 안정성을 증가 또는 감소시킬 수 있다.

폴리펩타이드에 대해 본원에 사용된 용어 "표지화된" 또는 관련 용어는 검출을 위한 검출가능한 표지 또는 모이어티에 대한 이의 조인더(joinder)를 언급한다. 예시적인 검출가능한 표지 또는 모이어티는 방사성, 비색, 항원성, 효소적 표지/모이어티, 검출가능한 비드 (예를 들면, 자기 또는 전자고밀도(electrodense) (예를 들면, 금) 비드), 비오틴, 스트렙타비딘 또는 단백질 A를 포함한다. 다양한 표지를 이용할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 방사성핵종, 형광물질, 효소, 효소 기질, 효소 공동인자, 효소 억제제 및 리간드 (예를 들면, 비오틴, 합텐)를 포함한다. 본원에 기재된 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분 중 어느 것은 비표지될 수 있거나, 검출가능한 표지 또는 검출가능한 모이어티에 연결될 수 있다.

본원에 사용된 "퍼센트 동일성" 또는 "퍼센트 상동성" 및 관련 용어는 2개의 폴리펩타이드 간의 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 유사성의 정량적 측정치를 언급한다. 2개의 폴리펩타이드 서열 간의 퍼센트 동일성은 2개의 폴리펩타이드 서열 간에 공유된 정렬된 위치에서 동일한 아미노산의 수의 함수이고, 2개의 폴리펩타이드 서열의 정렬을 최적화하기 위해 도입될 필요가 있을 수 있는 갭(gaps)의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 유사한 방식으로, 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 퍼센트 동일성은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 간에 공유된 정렬된 위치에서 동일한 뉴클레오티드의 수의 함수이고, 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 정렬을 최적화하기 위해 도입될 필요가 있을 수 있는 갭의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 2개의 폴리펩타이드 서열 간의, 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 측정을, 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 "퍼센트 동일성" 또는 "퍼센트 상동성"은 이의 디폴트 파라미터를 사용하는 GAP 컴퓨터 프로그램 (GCG Wisconsin Package의 파트, 버젼 10.3 (Accelrys, San Diego, Calif.))을 사용하여 서열을 비교하여 측정할 수 있다. 시험 서열과 관련하여 "Y와 적어도 X% 동일성을 갖는 서열을 포함한다"와 같은 표현은 상기한 바와 같이 서열 Y에 정렬될 때, 시험 서열은 Y의 잔기의 적어도 X%와 동일한 잔기를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 시험 작제물 (예를 들면, DAR)의 아미노산 서열은 본원에 기재된 주어진 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분을 구성하는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 어느 것과 유사하지만 반드시 동일하지 않을 수 있다. 시험 작제물 및 폴리펩타이드 간의 유사성은, 본원에 기재되어 있는 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분을 구성하는 폴리펩타이드 중 어느 것과 적어도 95% 동일, 또는 적어도 96% 동일, 또는 적어도 97% 동일, 또는 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 유사한 폴리펩타이드는 중쇄 및/또는 경쇄 내에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 아미노산 치환은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질 (예를 들면, 하전 또는 소수성)을 갖는 측쇄 (R 그룹)을 갖는 또다른 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 퍼센트 서열 동일성 또는 유사성 정도는 치환의 보존적 성질을 수정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 수행하는 수단은 당해 기술분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331]을 참조하고, 이의 전문이 참조로서 포함된다. 유사한 화학적 성질을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예는 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 시스테인 및 메티오닌인 황-함유 측쇄를 포함한다.

용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 세포내 신호전달 도메인에 융합된 세포외 항원-결합 단백질을 포함하는 단일 쇄 융합 단백질을 언급한다. CAR 세포외 결합 도메인은 모노클로날 항체, 예를 들면, 사람 모노클로날 항체의 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 융합하여 유도된 단일 쇄 가변 단편 (scFv 또는 sFv)이다. 하나의 실시형태에서, CAR은 (i) 중쇄 가변 (V_H) 도메인 및 경쇄 가변 (V_L) 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질, 여기서, V_H 및 V_L 도메인은 펩타이드 링커에 의해 함께 연결된다; (ii) 힌지 도메인, (iii) 막횡단 도메인; 및 (iv) 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다. 개시된 작제물은, DAR이 표적화를 위해 단일 쇄 항체를 사용하지 않고 대신에 개별적인 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 영역을 사용한다는 점에서, CAR과 다른 DAR이다.

본원에 사용된 "벡터" 및 관련 용어는 외래의 유전적 물질 (예를 들면, 핵산 전이유전자(transgene))에 작동가능하게 연결될 수 있는 핵산 분자 (예를 들면, DNA 또는 RNA)를 언급한다. 벡터는 외래의 유전적 물질을 세포 (예를 들면, 숙주 세포) 내로 도입하기 위한 비히클로서 사용될 수 있다. 벡터는 전이유전자의 벡터 내로의 삽입을 위한 적어도 하나의 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 항생제 내성 또는 벡터-전이유전자 작제물을 보유하는 숙주 세포의 선택을 돕는 선택가능한 특성을 부여하는 적어도 하나의 유전자 서열를 포함할 수 있다. 벡터는 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 분자일 수 있다. 벡터는 선형 또는 원형 핵산 분자일 수 있다. 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN 또는 CRISPR/Cas를 이용하는 유전자 편집 방법을 위해 사용되는 공여자 핵산은 벡터의 유형일 수 있다. 벡터의 하나의 유형은 "플라스미드"이고, 이는 전이유전자에 연결될 수 있고, 숙주 세포에서 복제할 수 있고, 전이유전자를 전사 및/또는 번역할 수 있는 선형 또는 원형 이중 가닥 염색체외 DNA 분자를 언급한다. 바이러스 벡터는 전형적으로 전이유전자에 연결될 수 있는 바이러스 RNA 또는 DNA 백본 서열을 포함한다. 바이러스 백본 서열은 감염을 불가능하게 하지만 바이러스 백본 및 공동-연결된 전이유전자의 숙주 세포 게놈 내로 삽입을 유지하도록 변형될 수 있다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련, 바큘로바이러스, 파포바바이러스, 우두 바이러스, 단순헤르페스 바이러스 및 엡스타인 바 바이러스 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다 (예를 들면, 복제의 세균 기원을 포함하는 세균 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터 (예를 들면, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되고, 이에 의해 숙주 게놈와 함께 복제된다.

"발현 벡터"는 하나 이상의 조절 서열, 예를 들면, 유발가능 및/또는 구성적 프로모터 및 인핸서를 포함할 수 있는 벡터의 유형이다. 발현 벡터는 리보솜 결합 부위 및/또는 폴리아데닐화 부위를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 복제 서열의 하나 이상의 기원을 포함할 수 있다. 조절 서열은 숙주 세포 내로 형질도입된 발현 벡터에 연결된 전이유전자의 전사, 또는 전사 및 번역을 지시한다. 조절 서열(들)은 전이유전자의 발현의 수준, 타이밍 및/또는 위치를 제어할 수 있다. 조절 서열은, 예를 들면, 전이유전자에 대해 직접적으로 또는 하나 이상의 다른 분자 (예를 들면, 조절 서열 및/또는 핵산에 결합하는 폴리펩타이드)의 작용을 통해 이의 효과를 발휘할 수 있다. 조절 서열은 벡터의 부분일 수 있다. 조절 서열의 추가 예는, 예를 들면, 문헌에 기재되어 있다[참조: Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. and Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-3606]. 발현 벡터는 본원에 기재된 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분 중 어느 것 중 적어도 일부를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.

전이유전자와 벡터 사이의 연결이 존재하여 벡터에 포함된 전이유전자 서열의 기능 또는 발현을 가능하게 하는 경우, 전이유전자는 벡터에 "작동가능하게 연결된다". 하나의 실시형태에서, 조절 서열이 전이유전자의 발현 (예를 들면, 수준, 타이밍, 또는 발현 위치)에 영향을 미치는 경우, 전이유전자는 조절 서열에 "작동가능하게 연결된다".

본원에 사용된 용어 "형질감염된(transfected)" 또는 "형질전환된(transformed)" 또는 "형질도입된(transduced)" 또는 다른 관련된 용어는 외인 핵산 (예를 들면, 전이유전자)이 숙주 세포 내로 전달 또는 도입되는 과정을 언급한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 숙주 세포는 외인 핵산 (전이유전자)과 함께 도입된 것이다. 숙주 세포는 일차적인 대상자 세포 및 이의 자손을 포함한다. 본원에 기재된 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분 중 어느 것 중 적어도 일부를 암호화하는 외인 핵산은 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 본원에 기재된 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분 중 어느 것 중 적어도 일부를 포함하는 발현 벡터는, 숙주 세포 내로 도입할 수 있고, 숙주 세포는 본원에 기재된 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분 중 적어도 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "숙주 세포" 또는 "숙주 세포의 집단" 또는 관련 용어는 외래의 (외인 또는 전이유전자) 핵산이 도입되는 세포 (또는 이의 집단)를 언급한다. 외래의 핵산은 전이유전자에 작동가능하게 연결된 발현 벡터를 포함할 수 있고, 숙주 세포를 사용하여 외래의 핵산 (전이유전자)에 의해 암호화된 핵산 및/또는 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. 숙주 세포 (또는 이의 집단)는 배양된 세포일 수 있거나, 대상자로부터 추출될 수 있다. 숙주 세포 (또는 이의 집단)는 계대의 수에 관련되지 않고 일차적인 대상자 세포 및 이의 자손을 포함한다. 숙주 세포 (또는 이의 집단)은 불멸의 세포주를 포함한다. 자손 세포는 모 세포와 비교하여 동일한 유전적 물질을 보유할 수 있거나 보유할 수 없을 수 있다. 숙주 세포는 자손 세포를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 본원에 개시된 항체를 발현시키는 임의의 방식으로 변형되고, 형질감염되고, 형질도입되고, 형질전환되고/되거나, 조작된 임의의 세포 (이의 자손를 포함함)를 기술한다. 하나의 예에서, 숙주 세포 (또는 이의 집단)는 목적하는 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 벡터와 함께 도입될 수 있다. 숙주 세포 및 이의 집단은 숙주의 게놈 내로 안정하게 통합되는 발현 벡터를 보유할 수 있거나, 염색체외 발현 벡터를 보유할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포 및 이의 집단은 수회의 세포 분열 후 존재하거나 일시적으로 존재하고 수회의 세포 분열 후 손실되는 염색체외 벡터를 보유할 수 있다.

유전자삽입 숙주 세포는 아연 핑거 뉴클레아제, TALENS, 마가뉴클레아제를 포함하는 잘 공지되어 있는 디자이너 뉴클레아제를 포함하여 또는 CRISPR/Cas를 사용하는 유전자 편집에 의해 비-바이러스 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 전이유전자를 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하여 숙주 세포의 게놈 내로 도입할 수 있다. 아연 핑거 뉴클레아제는 키메라 단백질의 쌍을 포함하고, 이들 각각은 조작된 아연 핑거 모티프로부터 DNA-결합 도메인에 융합된 제한 엔도뉴클레아제 (예를 들면, FokI)의 비-특이적 엔도뉴클레아제 도메인을 포함한다. DNA-결합 도메인은 숙주의 게놈에서 특이적 서열에 결합하도록 조작될 수 있고, 엔도뉴클레아제 도메인은 이중-가닥 절단을 만든다. 공여자 DNA는 전이유전자, 예를 들면 본원에 기재된 CAR 또는 DAR 작제물을 암호화하는 임의의 핵산, 및 숙주 세포의 게놈에서 의도된 삽입 부위의 어느 한 쪽 상 영역에 대해 상동인 인접 서열을 보유한다. 숙주 세포의 DNA 복구 기전(machinery)은 상동 DNA 복구에 의한 전이유전자의 정확한 삽입을 가능하게 한다. 유전자삽입 포유류 숙주 세포를 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하여 제조하였다 (미국 특허 번호 9,597,357, 9,616,090, 9,816,074 및 8,945,868). 유전자삽입 숙주 세포는 정확한 전이유전자 삽입을 전달할 수 있는 DNA-결합 도메인에 융합된 비-특이적 엔도뉴클레아제 도메인을 포함한다는 점에서 아연 핑거 뉴클레아제와 유사한 TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases)를 사용하여 제조할 수 있다. 아연 핑거 뉴클레아제처럼, TALEN은 또한 이중-가닥 절단을 숙주의 DNA 내로 도입한다. 유전자삽입 숙주 세포를, 이중-가닥 DNA 약 12-40 길이 베이스 쌍 상에서 인식 부위를 인지하는, 부위-특이적, 희귀-절단 엔도뉴클레아제로서 작용하는 메가뉴클레아제를 사용하여 제조할 수 있다. 메가뉴클레아제는 진행생물 단세포 유기체의 미토콘드리아 및 엽록체에서 가장 자주 발견되는 LAGLIDADG 부류로부터의 것을 포함한다. 게놈을 변형시키는데 사용되는 메가뉴클레아제 시스템의 예는 예를 들면 미국 특허 번호 9,889,160에 기재되어 있다. 유전자삽입 숙주 세포를 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)를 사용하여 제조할 수 있다. CRISPR은 특이적 공여자 DNA 통합을 위한 가이드 RNA에 커플링된 Cas 엔도뉴클레아제를 이용한다. 가이드 RNA는 표적 DNA에서 gRNA-결합 영역의 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열 업스트림을 포함하는 보존 다중-뉴클레오티드를 포함하고, 숙주 세포 표적 부위에 하이브리드화하고, 여기서, Cas 엔도뉴클레아제는 이중-가닥 표적 DNA를 절단한다. 가이드 RNA를 설계하여 특이적 표적 부위에 하이브리드화할 수 있다. 아연 핑거 뉴클레아제 및 TALEN에 유사하게, CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 삽입 부위에 상동성을 갖는 인접 서열을 갖는 공여자 DNA의 부위 특이적 삽입을 도입할 수 있다. 게놈을 변형시키는데 사용되는 CRISPR/Cas 시스템의 예는, 예를 들면, 미국 특허 번호 8,697,359, 10,000,772, 9,790,490, 및 미국 특허 출원 공보 번호 US 2018/0346927에 기재되어 있다. 하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포는 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN 또는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 제조할 수 있고, 숙주 표적 부위는 TRAC 유전자 (T 세포 수용체 알파 불변)(T Cell Receptor Alpha Constant)일 수 있다. 공여자 DNA는 예를 들면 본원에 기재된 CAR 또는 DAR 작제물을 암호화하는 임의의 핵산을 포함할 수 있다. 전기천공, 뉴클레오펙션 또는 리포펙션을 사용하여 숙주 세포 내로 공여자 DNA를 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN 또는 CRISPR/Cas 시스템과 함께 공동-전달할 수 있다.

유전자삽입 숙주 세포는 숙주 세포 (예를 들면, T 세포)를 CAR 또는 DAR 작제물을 암호화하는 핵산을 보유하는 레트로바이러스 벡터와 함께 형질도입하여 제조할 수 있다. 형질도입은 문헌에 기재된 바와 같이 본질적으로 수행할 수 있다 [참조: Ma et al., 2004 The Prostate 61:12-25; and Ma et al., The Prostate 74(3):286-296, 2014 (이의 개시내용은 이들의 전문이 본원에 참조로서 포함된다). 레트로바이러스 벡터를 FuGene 시약 (Promega, Madison, WI)을 사용하여 Phoenix-Eco 세포주 (ATCC) 내로 형질감염시켜 동종숙주역(Ecotropic) 레트로바이러스를 제조할 수 있고, 이어서, 일과성 바이러스 상청액 (동종숙주역 바이러스)를 사용하여 PG13 패키징 세포를 Gal-V 외피와 함께 형질도입하여 레트로바이러스를 제조하여 사람 세포를 감염시킬 수 있다. PG13 세포로부터의 바이러스 상청액을 사용하여 CD3 또는 CD3/CD28 활성화 후 2 내지 3 일에 활성화된 T 세포 (또는 PBMCs)를 형질도입할 수 있다. 활성화된 사람 T 세포를 정상의 건강한 공여자 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 제조자의 메뉴얼에 따른 100 ng/ml 마우스 항-사람 CD3 항체 OKT3 (Orth Biotech, Rartian, NJ) 또는 항-CD3, 항-CD28 TransAct (Miltenyi Biotech, German) 및 300-1000 U/ml IL2와 함께 5% FBS가 보충된 AIM-V 성장 배지 (GIBCO-Thermo Fisher scientific, Waltham, MA) 중에 2 일 동안 활성화시켜 제조할 수 있다. 대략 5×10⁶ 활성화된 사람 T 세포를 10 ug/ml 레트로넥틴 (Takara Bio USA) 사전-코팅된 6-웰 플레이트 내로 3 ml 바이러스 상청액과 함께 형질도입하고, 1000 g에서 약 1 시간 동안 대략 32℃에서 원심분리할 수 있다. 형질도입 후, 형질도입된 T 세포를 5% FBS 및 300-1000 U/ml IL2가 보충된 AIM-V 성장 배지에서 확장할 수 있다.

숙주 세포는 원핵생물, 예를 들면, 이. 콜리(E. coli)일 수 있거나, 진핵생물, 예를 들면, 단-세포 진핵생물 (예를 들면, 이스트 또는 다른 균류), 식물 세포 (예를 들면, 담배 또는 토마토 식물 세포), 포유류 세포 (예를 들면, 사람 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포, 래트 세포, 마우스 세포, 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 목적하는 항체를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 벡터와 함께 도입되고, 이에 의해 형질감염/형질전환된 숙주 세포를 생성할 수 있고, 이를 형질감염/형질전환된 숙주 세포에 의해 항체를 발현시키기 위해 적합한 조건하에 배양하고, 항체를 형질감염/형질전환된 숙주 세포로부터 임의로 회수하거나 (예를 들면, 숙주 세포 용해물로부터 회수) 또는 배양 배지로부터 회수한다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 CHO, BHK, NS0, SP2/0, 및 YB2/0를 포함하는 비-사람 세포를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 HEK293, HT-1080, Huh-7 및 PER.C6을 포함하는 사람 세포를 포함한다. 숙주 세포의 예는 원숭이 신장 세포 (ATCC CRL 1651) (참조: Gluzman et al., 1981, Cell 23: 175), L 세포, C127 세포, 3T3 세포 (ATCC CCL 163), 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 이들의 유도체의 COS-7 세포주, 예를 들면, 무-혈청 배지에서 성장하는 Veggie CHO 및 관련 세포주 (참조: Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31) 또는 DHFR 결핍 CHO 균주 DX-B 11 (참조: Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20), HeLa 세포, BHK (ATCC CRL 10) 세포주, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포주 CV1로부터 유래된 CV1/EBNA 세포주 (ATCC CCL 70) (참조: McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821), 사람 배아 신장 세포, 예를 들면, 293, 293 EBNA 또는 MSR 293, 사람 표피 A431 세포, 사람 Colo 205 세포, 다른 형질전환된 영장류 세포주, 정상 두배수체 세포, 일차적 조직, 일차적 체외이식편, HL-60, U937, HaK 또는 JurkaT 세포의 시험관내 배양으로부터 유래된 세포 균주 배양물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 림프구 세포, 예를 들면, Y0, NS0 또는 Sp20을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 포유류 숙주 세포이지만, 사람 숙주 세포가 아니다. 전형적으로, 숙주 세포는 폴리펩타이드-암호화 핵산과 함께 형질전환되거나 형질감염될 수 있고 이어서 숙주 세포에서 발현될 수 있는 배양된 세포이다. 구절 "유전자삽입 숙주 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"를 사용하여 외인 핵산과 함께 도입(예를 들면, 형질도입, 형질전환 또는 형질감염)되어 발현되거나 발현되지 않은 숙주 세포를 나타낼 수 있다. 숙주 세포는 또한 핵산을 포함하지만 핵산과 함께 작동가능하게 연결된 조절 서열이 숙주 세포 내로 도입되지 않는 한 목적하는 수준으로 이를 발현하지 않는 세포일 수 있다. 용어 숙주 세포는 특정 대상자 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 언급하는 것을 이해하여야 한다. 이러한 변형은, 예를 들면, 돌연변이 또는 환경적 영향 때문에 계속되는 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은, 사실상, 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용되는 용어의 범위 내에 포함된다. 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산에 작동가능하게 연결된 벡터 (예를 들면, 발현 벡터)를 보유하는 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단이 본원에 기재되어 있다.

숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은 T 림프구 (예를 들면, T 세포, 조절 T 세포, 감마-델타 T 세포, 및 세포독성 T 세포), NK (자연 킬러) 세포, 대식세포, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구, B 림프구, 단핵구를 포함한다. 하나의 실시형태에서, NK 세포는 제대혈-유래된 NK 세포, 또는 태반 유래된 NK 세포를 포함한다.

본원 개시내용의 폴리펩타이드 (예를 들면, 이량체성 항원 수용체 (DAR))는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 하나의 예에서, 폴리펩타이드를 재조합 핵산 방법에 의해 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 (예를 들면, DNA)을 재조합 발현 벡터 내로 삽입하여 제조되고, 이는 숙주 세포 내로 도입되고, 발현을 촉진하는 조건하에 숙주 세포에 의해 발현된다.

재조합 핵산 조작을 위한 일반적 기술은, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989, or F. Ausubel et al., in Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987)]에 기재되어 있고, 정기적으로 업데이트되고, 본원에 이들의 전문이 참조로서 포함된다. 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 (예를 들면, DNA)은 포유류, 바이러스, 또는 곤충 유전자로부터 유래되는 하나 이상의 적합한 전사 또는 번역 조절 인자를 운반하는 발현 벡터에 작동가능하게 연결된다. 이러한 조절 요소는 전사 프로모터, 전사를 조절하는 임의의 작동자 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 번역의 종료를 제어하는 서열을 포함한다. 발현 벡터는 숙주 세포에 복제 능력을 부여하는 기원 또는 복제를 포함한다. 발현 벡터는 유전자삽입 숙주 세포의 인식을 실행하는 선택을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다 (예를 들면, 형질전환주).

재조합 DNA는 또한 단백질을 정제하는데 유용할 수 있는 임의의 유형의 단백질 태그 서열을 암호화할 수 있다. 단백질 태그의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 히스티딘 태그, FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, 또는 GST 태그를 포함한다. 세균, 균류, 이스트, 및 포유류 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적합한 클로닝 및 발현 벡터를 문헌에서 발견할 수 있다 [참조: Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, N.Y., 1985)].

발현 벡터 작제물을 숙주 세포에 대해 적합한 방법을 사용하여 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 숙주 세포 내로 다양한 핵산의 도입 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 전기천공; 칼슘 클로라이드, 루비듐 클로라이드, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 이용하는 형질감염; 바이러스 형질감염; 비-바이러스 형질감염; 미세투시물 포격; 리포펙션; 및 감염 (예를 들면, 여기서, 벡터는 감염원이다)을 포함한다. 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 이스트, 포유류 세포, 또는 세균 세포를 포함한다.

적합한 세균은 그램 음성 또는 그램 양성 유기체, 예를 들면, 이. 콜리 또는 바실루스 종(Bacillus spp.)을 포함한다. 예를 들면 사카로마이세스(Saccharomyces) 종 유래, 예를 들면, 에스. 세레비시아애(S. cerevisiae) 이스트는, 또한 폴리펩타이드의 생산을 위해 사용될 수 있다. 다양한 포유류 또는 곤충 세포 배양 시스템을 또한 이용하여 재조합 단백질을 발현할 수 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템은 문헌[참조: Luckow and Summers, (Bio/Technology, 6:47, 1988)]에 평가되어 있다. 적합한 포유류 숙주 세포주의 예는 내피 세포, COS-7 원숭이 신장 세포, CV-1, L 세포, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소 (CHO), 사람 배아 신장 세포, HeLa, 293, 293T, 및 BHK 세포주를 포함한다. 정제된 폴리펩타이드를 적합한 숙주/벡터 시스템을 배양하여 재조합 단백질을 발현하도록 제조한다. 이어서, 단백질을 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제한다. 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것은, 유전자삽입 숙주 세포에 의해 발현된다.

본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단백질을 또한 세포-번역 시스템을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 목적을 위해 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 시험관내 전사가 mRNA를 생성할 수 있도록 그리고 이용되는 특정 무-세포 시스템에서 무-세포 번역이 가능하도록 변형하여야 한다 (진행생물, 예를 들면, 포유류 또는 이스트 무-세포 번역 시스템 또는 원핵생물, 예를 들면, 세균 무-세포 번역 시스템).

본원에 개시된 다양한 폴리펩타이드 중 어느 것을 암호화하는 핵산을 화학적으로 합성할 수 있다. 코돈 용법은 세포에서 발현을 개선하기 위해 선택될 수 있다. 이러한 코돈 용법은 선택된 세포 유형에 좌우될 것이다. 전문화된 코돈 용법 패턴은 이. 콜리 및 다른 세균, 뿐만 아니라 포유류 세포, 식물 세포, 이스트 세포 및 곤충 세포를 위해 개발하였다. 예를 들면 문헌을 참조한다 [참조: Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003 100(2):438-42; Sinclair et al. Protein Expr. Purif. 2002 (1):96-105; Connell N D. Curr. Opin. Biotechnol. 2001 12(5):446-9; Makrides et al. Microbiol. Rev. 1996 60(3):512-38; and Sharp et al. Yeast. 1991 7(7):657-78].

본원에 기재된 항체 및 항원 결합 단백질은 또한 화학적 합성으로 (예를 들면, 문헌에 기재된 방법 [참조: Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.])으로 제조할 수 있다. 단백질에 대한 변형은 또한 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.

본원에 기재된 항체 및 항원 결합 단백질은 단백질 화학 분야에서 일반적으로 공지된 단백질의 단리/정제 방법으로 정제할 수 있다. 비-제한적인 예는 추출, 재결정화, 염석 (예를 들면, 암모늄 설페이트 또는 나트륨 설페이트를 사용함), 원심분리, 투석, 한외여과, 흡착 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 정상 크로마토그래피, 역-상 크로마토그래피, 겔 여과, 겔 침투 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동, 향류 분배 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 정제 후, 폴리펩타이드는 상이한 완충액으로 교환될 수 있고/있거나, 이에 제한되는 것은 아니지만, 여과 및 투석을 포함하는 당해 기술분야에 공지된 임의의 다양한 방법에 의해 농축될 수 있다.

하나의 실시형태에서, 유전자삽입 DAR T 세포의 제조는 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 발현하는 T 세포 풍부화일 수 있다. 예를 들면, 항-BCMA DAR T 세포는 PBMC로부터 제조하여 비-유전자삽입 T 세포 및 유전자삽입 T 세포의 혼합물을 포함하는 T 세포 집단을 생성할 수 있다. 항-BCMA DAR 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포는, 비-유전자삽입 T 세포보다 유전자삽입 T 세포의 증식을 우선적으로 유도하기 위해 적합한 세포 분류 (예를 들면, 형광-활성화된 세포 분류), 구배 정제, 또는 배양법을 사용하여 비-유전자삽입 T 세포의 퍼센트 또는 수를 감소시키기 위해, 풍부화할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 풍부화 단계는 비-유전자삽입 T 세포와 비교하여 유전자삽입 DAR T 세포의 수를 약 2-5 배, 또는 약 5-10 배, 또는 약 10-15 배, 또는 약 15-20 배, 또는 약 20-50 배, 또는 더 높은 -배 수준의 풍부화까지 증가시킨다.

특정 실시형태에서, 본원에 기재된 항체 및 항원 결합 단백질 (예를 들면, DAR)은 추가로 번역-후 변형을 포함할 수 있다. 예시적인 번역-후 단백질 변형은 폴리펩타이드 측쇄 또는 소수성 그룹의 포스포릴화, 아세틸화, 메틸화, ADP-리보실화, 유비퀴틴화, 글리코실화, 아푸코실화, 카르보닐화, 수모일화(sumoylation), 바이오티닐화 또는 첨가를 포함한다. 결과적으로, 변형된 폴리펩타이드는 비-아미노산 요소, 예를 들면, 지질, 폴리- 또는 모노-삭카라이드, 및 포스페이트를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 글리코실화는 하나 이상의 시알산 모이어티를 폴리펩타이드에 접합시키는 시알릴화일 수 있다. 시알산 모이어티는 용해도 및 혈청 반감기를 개선시키면서 또한 단백질의 가능한 면역원성을 감소시킨다. 문헌을 참조한다 [참조: Raju et al. Biochemistry. 2001 31; 40(30):8868-76].

본원 개시내용은 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분 중 어느 것 또는 본원에 기재된 유전자삽입 숙주 세포 (예를 들면, DAR을 발현함)를 약제학적으로-허용되는 부형제와 혼합하여 포함한 치료학적 조성물을 제공한다. 부형제는 담체, 안정화제 및 부형제를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 부형제의 예는, 예를 들면 불활성 희석제 또는 필러 (예를 들면, 수크로스 및 소르비톨), 윤활제, 활주제, 및 항-접착제 (예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 수소화 식물성 오일, 또는 탈크)를 포함한다. 추가의 예는 완충제, 안정화제, 보존제, 비-이온성 계면활성제, 항-산화제 및 등장화제를 포함한다. 치료학적 조성물이 세포를 포함하는 경우, 약제학적으로-허용되는 부형제는 세포의 생존력 또는 활성을 간섭하지 않도록 선택될 것이다.

치료학적 조성물 및 이의 제조 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌에서 발견된다 [참조: "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A. R. Gennaro A R., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)]. 치료학적 조성물을 비경구 투여를 위해 제형화할 수 있고, 예를 들면, 부형제, 멸균수, 염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 기원 오일, 또는 수소화 나프탈렌을 포함할 수 있다. 생체적합성, 생분해성 락타이드 중합체, 락타이드/글리콜라이드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 사용하여 본원에 기재된 항체 (또는 이의 항원 결합 단백질)의 방출을 제어할 수 있다. 나노미립자 제형 (예를 들면, 생분해성 나노입자, 고형 지질 나노입자, 리포솜)을 사용하여 항체 (또는 이의 항원 결합 단백질)의 생체분포를 제어할 수 있다. 다른 잠재적으로 유용한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투압 펌프, 이식가능한 주입 시스템, 및 리포솜을 포함한다. 제형 중 항체 (또는 이의 항원 결합 단백질)의 농도는 투여되는 약물의 투여량 및 투여 경로를 포함하는 다수의 인자에 좌우되어 가변적이다.

본원에 기재된 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분 중 어느 것은 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들면, 비-독성산 부가 염 또는 약제학적 산업에서 통상 사용되는 금속 착물로서 투여될 수 있다. 산 부가 염의 예는 유기산, 예를 들면, 아세트산, 락트산, 파모산, 말레산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 석신산, 벤조산, 팔미트산, 수베르산, 살리실산, 타르타르산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산, 또는 트리플루오로아세트산 등; 중합체성 산, 예를 들면, 탄닌산, 카복시메틸 셀룰로스 등; 및 무기산, 예를 들면, 염화수소산, 브롬화수소산, 황산 인산 등을 포함한다. 금속 착물은 아연, 철 등을 포함한다. 하나의 예에서, DAR (또는 이의 항원 결합 부분)을 나트륨 아세테이트의 존재하에 제형화하여 열적 안정성을 증가시킨다.

본원에 사용된 용어 "대상자"는 사람 및 척추동물, 포유동물 및 비-포유동물을 포함하는 비-사람 동물을 언급한다. 하나의 실시형태에서, 대상자는 사람, 비-사람 영장류, 원숭이(simian), 유인원, 뮤린 (예를 들면, 마우스 및 래트), 소, 돼지, 말, 개, 고양이, 염소, 이리, 두꺼비종 또는 물고기일 수 있다.

용어 "투여하는", "투여되는" 및 문법적 변형은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 어느 것을 사용하여 대상자에게 제제의 신체적 도입을 언급한다. 본원에 개시된 제형을 위한 예시적인 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들면 주사 또는 주입에 의한 투여 경로를 포함한다. 본원에 사용된 구절 "비경구 투여"는 장관 및 국소 투여가 아닌 보통 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 림프내, 병변내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수강내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 제형을 비-비경구 경로, 예를 들면, 구강을 통해 투여한다. 다른 비-비경구 경로는 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들면, 비강내, 질, 직장, 설하 또는 국소를 포함한다. 투여는 또한, 예를 들면, 1회, 다수 회, 및/또는 하나 이상의 확장된 기간 동안 수행할 수 있다. 본원에 기재된 이량체성 항원 수용체 (DAR) 또는 이의 항원-결합 부분 중 어느 것을 당해 기술분야에 공지된 방법 및 전달 경로를 사용하여 대상자에게 투여할 수 있다.

용어 "유효량", "치료학적 유효량" 또는 "유효한 용량" 또는 관련 용어는 상호교환가능하게 사용할 수 있고, 대상자에게 투여되는 경우, 종양 또는 암 항원 발현에 관련된 질환 또는 장애의 측정가능한 개선 또는 예방하는데 충분한 본원에 기재된 이량체성 항원 수용체 (DAR) 중 어느 것의 소정량을 언급한다. 본원에 제공된 DAR의 치료학적 유효량은, 단독으로 또는 조합하여 사용되는 경우, 항체의 상대적 활성 및 조합 (예를 들면, 세포 성장 억제에서)에 좌우되어 및 대상자 및 치료될 질환 상태, 대상자의 체중 및 연령 및 성별, 대상자에서 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등에 좌우되어 가변적일 것이고, 당해 기술분야의 숙련가가 용이하게 결정할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 치료학적 유효량은 치료될 대상자 및 치료될 장애의 특정 측면에 좌우될 것이고, 공지된 기술을 사용하여 당해 기술분야의 숙련가가 확인할 수 있다. 일반적으로, DAR T 세포는 대상자에게 약 10³ - 10⁴ 세포/kg, 또는 약 10⁴ - 10⁵ 세포/kg, 또는 약 10⁵ - 10⁶ 세포/kg, 또는 약 10⁶ - 10⁷ 세포/kg, 또는 약 10⁷ - 10⁸ 세포/kg, 또는 약 10⁸ - 10⁹ 세포/kg, 또는 약 10⁹ - 10¹² 세포/kg로 투여될 수 있다. DAR T 세포는 단지 1회, 또는 매일 (예를 들면, 매일 1회, 2회, 3회, 또는 4회), 덜 빈번하게 (예를 들면, 매주, 2 주마다, 3 주마다, 달마다, 또는 분기별로) 투여될 수 있다. 추가로, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 연령 뿐만 아니라 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호작용, 및 질환의 중증도에 대한 조정이 필수적일 수 있다.

하나의 실시형태에서, 치료학적 유효량은 대상자에게 투여되는 약 10³ - 10¹² 유전자삽입 숙주 세포의 용량을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포는 본원에 기재된 DAR 중 어느 것을 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 발현하는 하나 이상의 발현 벡터를 보유한다. 치료학적 유효량은 치료학적 유효량을 투여받는 대상자 및 당해 기술분야의 숙련가에 의해 공지된 기술을 사용하여 확인될 수 있는 치료되는 질환/장애를 고려하여 결정할 수 있다. 치료학적 유효량은 대상자와 관련된 인자, 예를 들면, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호작용, 및 질환/장애의 중증도를 고려할 수 있다. 치료학적 유효량은 약 65% - 98% 또는 더 높은 수준의 순도일 수 있는 유전자삽입 숙주 세포의 순도를 고려할 수 있다. 유전자삽입 숙주 세포의 치료학적 유효량은 대상자에게 적어도 1회, 또는 2회, 3 회, 4 회, 5 회 이상 소정 시간 기간 동안 투여할 수 있다. 시간 기간은 매일, 매주, 매달, 또는 매년일 수 있다. 대상자에게 투여되는 유전자삽입 세포의 치료학적 유효량은 각 시점에서 동일할 수 있거나, 각각의 투여 사건에서 증가 또는 감소될 수 있다. 유전자삽입 세포의 치료학적 유효량을 종양 크기 또는 암 세포의 수가 유전자삽입 숙주 세포의 투여 전 종양 크기 또는 암 세포의 수와 비교하여 5% - 90% 이상까지 감소할 때까지 대상자에게 투여할 수 있다.

본원 개시내용은 하나 이상의 종양-관련 항원의 발현 또는 과-발현과 연관된 질환/장애를 갖는 대상자를 치료하는 방법을 제공한다. 질환은 종양-관련 항원, 예를 들면 BCMA 항원을 발현하는 암 또는 종양 세포를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 암 또는 종양은 전립선, 유방, 난소, 두경부, 방광, 피부, 직장결장, 항문, 직장, 췌장, 폐 (비-소세포 폐 및 소세포 폐 암을 포함함), 평활근종, 뇌, 신경아교종, 아교모세포종, 식도, 간, 신장, 위, 결장, 자궁목, 자궁, 자궁내막, 외음, 후두, 질, 뼈, 비강, 부비동, 코인두, 구강, 입인두, 후두, 하후두, 침샘, 요관, 요도, 음경 및 고환의 암을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 암은 백혈병, 림프종, 골수종 및 B 세포 림프종을 포함하는 혈액암을 포함한다. 혈액암은 다발 골수종 (MM), 버킷림프종 (BL)을 포함하는 비호지킨 림프종 (NHL), B 만성 림프구 백혈병 (B-CLL), 전신홍반루푸스 (SLE), B 및 T 급성 림프구 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 미만성 큰 B 세포 림프종, 만성 골수성 백혈병 (CML), 털세포 백혈병 (HCL), 소포 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 외투 세포 림프종, 호지킨 림프종 (HL), 혈장 세포 골수종, 전구체 B 세포 림프모구 백혈병/림프종, 형질세포종, 거대 세포 골수종, 혈장 세포 골수종, 중-쇄 골수종, 경쇄 또는 벤스-존스 골수종, 림프종모양 육아종증, 이식-후 림프구증식 장애, 면역조절 장애, 류마티스 관절염, 중증근육무력증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 항-인지질 증후군, 샤가스병, 그레이브병, 베게너 육아종증, 결절다발동맥염, 쇼그렌 증후군, 보통천포창, 공피증, 다발경화증, 항-인지질 증후군, ANCA 관련 혈관염, 굿파스처병, 가와사키병, 자가면역용혈빈혈, 및 급속 진행 사구체신염, 중-쇄 질환, 원발성 또는 면역세포-관련 아밀로이드증, 및 의미미결정 모노클로날 감마글로불린병증을 포함한다.

이량체성 항원 수용체 (DARs)

본원 개시내용은 막횡단 영역 및 세포내 영역에 연결된 Fab 단편을 포함하는 이량체성 항원 수용체 (DARs)를 제공한다. 하나의 실시형태에서, DAR 작제물은 Fab 단편 및 막횡단 영역 사이의 임의의 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 DAR 구조는, 예를 들면, Fab 포맷 항체를 갖는 DAR 구조를 동일한 항체의 scFv 포맷을 갖는 CAR 구조와 비교하는 것에 근거하여 예상치 못한 놀라운 결과를 제공한다. 게다가, DAR 및 CAR 포맷은, 힌지 영역, 막횡단 영역 및 2개의 세포내 영역이 동일할 수 있기 때문에 직접적으로 비교될 수 있다. 여전히 DAR 포맷은 상응하는 CAR 포맷에 비해 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 결합 (예를 들면, 특이적 결합), 항원-유도 사이토킨 방출 및/또는 항원-유도 세포독성에서 우수한 결과를 제공할 수 있다.

본원 개시내용은 1개의 폴리펩타이드 쇄 상 중쇄 결합 영역 및 개별적인 폴리펩타이드 쇄 상 경쇄 결합 영역을 포함하는 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 제공한다. 이량체성 항원 수용체를 구성하는 2개의 폴리펩타이드 쇄는 이량체화되어 scFv과 비교하여 Fab 구조를 더 근접하게 모방하는 단백질 복합물을 형성할 수 있다. 이량체성 항원 수용체는 표적 항원에 특이적으로 결합하기 때문에 항체-유사 성질을 갖는다. 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물에서, 1개의 폴리펩타이드 쇄 상 중쇄 가변 및 불변 영역은 개재 링커 서열이 없을 수 있고, 개별적인 폴리펩타이드 쇄 상 경쇄 가변 및 불변 영역은 또한 개재 링커 서열이 없을 수 있다. DAR 폴리펩타이드 쇄 상 개재 링커 서열이 없는 것은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역 사이에 개재 링커 서열를 포함하는 scFv과 비교하여 면역원성을 감소시킬 수 있다. 이량체성 항원 수용체는 표적 항원에 특이적으로 결합하기 때문에 항체-유사 성질을 갖는다. 이량체성 항원 수용체는 지시된 세포요법을 위해 사용할 수 있다.

본원 개시내용은 항원-결합 세포외 부분, 임의의 힌지 부분, 막횡단 부분, 및 공-자극성 및/또는 세포내 신호전달 영역을 갖는 세포내 부분을 갖는 항-BCMA 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 발현하도록 조작된 유전자삽입 T 세포를 제공한다. 세포외 부분은 BCMA-발현 병적 조혈 세포에 결합하는 높은 친화력 및 항원항체결합력을 나타내어 정상 세포를 보존하면서 T 세포 활성화 및 병적-세포 사멸을 야기한다. 항-BCMA DAR 작제물의 세포내 부분은, 항원 결합시 T 세포 활성화를 중재하여 기억 T 세포의 형성, 향상된 T 세포 확장 (예를 들면, 기억 T 세포 확장), 및/또는 감소된 T 세포 탈진을 야기할 수 있는, 공-자극성 및/또는 신호전달 영역을 포함한다. 기억 T 세포의 형성은 BCMA-과발현 관련 질환을 앓고 있는 대상자에서 질환 재발을 예방하기 위해 중요하다고 상정한다. 세포내 공-자극성 및 신호전달 영역의 유형 및 수가 상이한 DAR 작제물의 다중 배치가 본원에 기재되고, 강력하고 신속한 이펙터 반응 (예를 들면, 세포내 CD28 공-자극성 영역을 포함하는 DAR 작제물)을 생산하고/하거나 더 길게-지속되는 기억 T 세포 집단 (예를 들면, 세포내 4-1BB 공-자극성 영역을 포함하는 DAR 작제물)을 생성하기 위해 DAR 작제물 설계시 유연성을 제공한다.

하나의 실시형태에서, 항-BCMA DAR을 발현하는 유전자삽입 T 세포의 집단은 기억 T 세포 (T_M)로의 다양한 분화 단계에서 나이브(naive) T 세포 (T_N) 또는 항원-경험 T 세포인 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물을 포함한다. 기억 T 세포 (T_M)의 집단은 이들의 세포 수용체 발현 패턴이 상이한 중심 기억 (T_CM) 및 이펙터 기억 (T_EM) T 세포의 부분집합 집단을 포함하는 이질성(heterogenous)이고, 다양한 정도의 항-종양 효능, 시험관내 증식 능력 및 생체내 지속성을 나타낼 수 있다. 일반적으로, 사람 나이브 T 세포 (T_N) 상 세포 수용체 발현 패턴은 CD62L+, CCR7+, CD45RA+, CD45RO- 및 CD27+를 포함한다. 중심 기억 T 세포 (T_CM)는 CD62L+, CCR7+, CD45RA+, CD45RO+ 및 CD27+이다. 이펙터 기억 T 세포 (T_EM)는 CD62L-, CCR7-, CD45RA-, CD45RO- 및 CD27-이다. 대조적으로, 이펙터 T 세포 (T_E)는 CD62L-, CCR7-, CD45RO- 및 CD27-이다. 항원-경험 기억 T 세포는 줄기 세포-유사 기억 T 세포 (T_SCM)로부터 중심 기억 T 세포 (T_CM)로 이펙터 기억 T 세포 (T_EM)로 말단 분화된 이펙터 T 세포로 분화된다는 것을 상정한다. 중심 기억 T 세포 (T_CM)는 조기 분화된 선조세포로 분류되고, 자가 갱신 (재생)될 수 있고, 수명이-긴 줄기 세포-유사 T 세포 기억 성질을 유지할 수 있다. 이펙터 기억 T 세포 (T_EM)는, 세포독성인 말단 분화된 이펙터 T 세포 (T_E)로 분화할 수 있고, 염증성 사이토킨을 생성하고 미미한 증식 능력을 갖는 중심 기억 T 세포 (T_CM)보다 더 분화될 수 있는 것으로 나타난다. 항원 자극에 반응하여, CD8+ 중심 기억 (T_CM) 및 이펙터 기억 (T_EM) T 세포는 상승된 수준의 퍼포린 및 그랜자임 (예를 들면, 그랜자임 A 및/또는 B)을 발현하고 수명이-짧은 세포용해 이펙터 T 세포 (T_E)로 분화될 수 있고, 따라서, 세포용해 이펙터 T 세포 (T_E)와 비교하여 항-종양 효능, 증가된 시험관내 증식 능력 및 생체내 지속성을 나타내는, 증가된 수준의 중심 기억 (T_CM) 및 이펙터 기억 (T_EM) T 세포를 포함하는 항-BCMA DAR T 세포의 집단을 생성하는 것이 유리하다.

하나의 실시형태에서, 본원에 기재된 유전자삽입 DAR T 세포는, 중심 기억 T 세포 (T_CM) 및 이펙터 기억 T 세포 (T_EM)의 고유한 세포 수용체 발현 패턴을 나타내고, 이들이 항-종양 효능, 시험관내 증식 능력 및 생체내 지속성을 나타내기 때문에 이들을 생체내 입양 전달에 적합하도록 하는 성질을 갖는, CD8+ 및 CD4+ 기억 T 세포를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 유전자삽입 항-BCMA DAR T 세포를 종양 또는 암 과-발현 BCMA 항원을 갖는 대상자에게 투여하여 종양 부하를 감소시킬 수 있다. 하나의 실시형태에서, 유전자삽입 DAR T 세포는 대상자에게 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여할 수 있다. 항-BCMA DAR T 세포는, 기억 T 세포 성질을 갖는 DAR T 세포의 존재와 관련될 수 있거나 관련되지 않는, 대상자 (예를 들면, 생체내)에서 확장될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 항-BCMA DAR T 세포는 단일 용량 후 처리된 대상자에서 생체내 확장될 수 있다. 확장은 처리-후 수일, 수주, 또는 수개월에 검출할 수 있다. 항-BCMA DAR T 세포는 처리-후 수일, 수주 또는 수개월 내에 대상자에서 지속될 수 있다.

하나의 실시형태에서, 대상자에서 유전자삽입 항-BCMA DAR T 세포의 기능 지속성은 수일, 수주, 또는 수개월 동안 장-기간 종양 면역을 부여한다. 지속성 수준은 동물 모델에서 종양 재-접종 실험을 수행하여 검정할 수 있다. 예를 들면, 항-BCMA DAR T 세포의 단일 용량을 원발성 종양 부하를 갖는 적어도 하나의 동물 대상자에게 투여할 수 있다. 원발성 종양 부하가 감소된 후, 동물에게 이차적 종양 세포를 재-접종하고, 이차적 종양 부하를 모니터링한다. 이차적 종양 성장 (종양 재발)의 지연 또는 종양 제거는 항-BCMA DAR T 세포의 단일 용량은 생체내 지속적이고, 장-기간 생체내 확장을 나타낼 수 있음을 나타낸다. 지연은 수일, 수주 또는 수개월 내로 측정될 수 있다. 종양 처리를 위해 항-BCMA DAR T 세포를 투여받은 사람 대상자는 또한 수일, 수주 또는 수개월 동안 장-기간 종양 면역으로부터 이득을 얻을 수 있다.

하나의 실시형태에서, 항-BCMA DAR을 발현하는 유전자삽입 T 세포의 집단은 항-BCMA CAR (키메라 항원 수용체)를 발현하는 유전자삽입 T 세포와 비교하여 감소된 수준의 T 세포 탈진을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, DAR T 세포의 집단 중 감소된 퍼센트의 DAR T 세포는 CAR T 세포의 집단과 비교하여 T 세포 탈진을 나타낸다. T 세포 탈진은 지속적인 항원 자극에 의해 야기되는 기능장애 상태를 언급한다. CD8+ 및 CD4+ DAR T 세포 둘 다에서, 탈진은 PD-1, CTLA4, LAG3, TIM3, 2B4/CD244/CD244/SLAMF4, CD160 및/또는 TIGIT 중 2개 이상의 임의의 조합을 포함하는 억제 수용체의 공-발현을 특징으로 한다. DAR T 세포에서 T 세포 탈진은 또한 IL-2 생산의 손실, 심각하게 감소된 증식 능력 및 세포용해 활성의 손실을 특징으로 한다. CD8+ T 세포에서, 탈진은 T 세포 사멸을 야기할 수 있다. T 세포 탈진은 후기 T 세포 분화를 나타내는 것으로 상정된다. T 세포 탈진은 CAR T 세포 요법 실패의 원인이 되는 것으로 고려된다.

하나의 실시형태에서, T 세포 탈진 수용체 마커 (예를 들면, PD-1, CTLA4, LAG3, TIM3, 2B4/CD244/CD244/SLAMF4, CD160 및/또는 TIGIT 중 2개 이상의 임의의 조합)를 나타내는 DAR T 세포의 수는 동일한 T 세포 탈진 수용체를 나타내는 CAR T 세포의 수와 비교하여 감소되고, 감소는 약 2-배, 또는 약 3-배, 또는 약 4-배, 또는 약 5-배, 또는 더 높은-배수 감소 수준, 약 2-배 미만의 감소 수준이다.

하나의 실시형태에서, 항-BCMA DAR T 세포는, 나이브 또는 기억 T 세포 집단 (예를 들면, 중심 기억 또는 이펙터 기억 T 세포)의 사전-풍부화(pre-enrichment) 없이, 다클론 T 세포 집단 (예를 들면, PBMCs)으로부터 제조될 수 있다. 사전-풍부화 절차는 세포 배양법, 세포 분류 (예를 들면, 형광-활성화된 세포 분류), 또는 구배 정제를 포함할 수 있다.

유전자삽입 항-BCMA DAR T 세포를 제조하고, 이어서, 시험관내 검정에서 향후 사용을 위해 또는 대상자에게 투여하기 위해 저장될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 항-BCMA DAR T 세포는 냉동보존 조건하에 수시간, 수일 또는 수개월 동안 저장될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 냉동보존된 항-BCMA DAR T 세포는 해동될 수 있고, 해동된 DAR T 세포는 냉동보존되고 해동되지 않은 새로-제조된 항-BCMA DAR T 세포와 비교하여 유사한 수준의 생존력 및 기능을 유지한다. 하나의 실시형태에서, 항-BCMA DAR T 세포를 약 1-24 시간 동안 냉동보존한다. 하나의 실시형태에서, 항-BCMA DAR T 세포를 약 1-30 일 동안 냉동보존한다. 하나의 실시형태에서, 항-BCMA DAR T 세포를 약 1-2 개월, 또는 약 2-3 개월, 또는 약 3-4 개월, 또는 약 4-5 개월, 또는 약 5-6 개월, 또는 6 개월 이상 동안 냉동보존한다. 하나의 실시형태에서, 항-BCMA DAR T 세포는 약 -80 내지 -100℃, 또는 약 -100 내지 -150℃의 온도 범위에서 냉동보존할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 냉동보존된 항-BCMA DAR T 세포는 해동하고, 생존력을 유지할 수 있고, 여기서, 약 55-65%의 해동된 세포는 생존가능하고, 또는 약 65-75%, 또는 약 75-85% 또는 약 85-95%, 또는 약 95-99%의 해동된 세포는 생존가능하다.

하나의 실시형태에서, 항-BCMA DAR T 세포는 70% AIM-V 배지, 20% FBS 및 10% DMSO을 포함하는 냉동 배지에서 냉동보존할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 약 1 x 10⁵ - 1 x 10⁹ 항-BCMA DAR T 세포는 냉동 배지에서 냉동보존할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 항-BCMA DAR T 세포를 냉동 배지에서 재현탁하고, -80℃에서 밤새 정치하고, 이어서, 저장을 위해 -150℃로 이동할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 항-BCMA DAR T 세포를 냉동 배지에서 재현탁하고, 저장을 위해 직접적으로 -80℃ 또는 -150℃에서 정치할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 냉동보존된 항-BCMA DAR T 세포는 해동될 때까지 37℃에서 정치할 수 있고, 이어서, 사용 준비까지 얼음 위에서 정치할 수 있다.

본원 개시내용은 서로 회합되어 BCMA 단백질 (예를 들면, 표적 항원)에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 갖는 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 제공한다. 하나의 실시형태에서, BCMA 단백질은 사람, 유인원 (예를 들면, 침팬지), 원숭이 (예를 들면, 시노몰구스), 뮤린 (예를 들면, 마우스 및/또는 래트), 개(canine) (예를 들면, 개(dog)) 및/또는 고양이(feline) (예를 들면, 고양이(cat))에서 유래한다. 하나의 실시형태에서, BCMA 단백질은 사람 BCMA (예를 들면, UniProt Q02223)를 포함한다. 하나의 실시형태에서, BCMA 단백질은 야생형 사람 (예를 들면, 서열번호 1) 또는 돌연변이체 사람 BCMA 단백질 (예를 들면, 서열번호 2 또는 3)을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 이량체성 항원 수용체 (DAR)는 야생형 사람 BCMA 단백질 (서열번호 1) 또는 이의 임의의 부분에 결합하지만, 돌연변이체 BCMA 단백질에 결합하지 않는다 (서열번호 2 및 3). 하나의 실시형태에서, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물은 APRIL ( A PR oliferation- I nducing L igand) (예를 들면, UniProtKB O75888 TNF13 사람, 서열번호 4) 및/또는 BAFF (예를 들면, UniProt Q9Y275 TN13B 사람, 서열번호 5)에 결합한다.

본원 개시내용은 첫번째 폴리펩타이드 쇄 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 갖는 DAR (이량체성 항원 수용체) 작제물에 대한 구조를 제공하고, 여기서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄 및 두번째 폴리펩타이드 쇄 둘 다가 동일한 세포에 의해 발현되는 경우, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 하나 또는 다수의 디설파이드 결합에 의해 형질도입된 세포의 외부 영역에서 두번째 폴리펩타이드 쇄에 연결된다. 일부 실시형태에서, DAR 작제물은, 차례로, 가변 도메인 영역 및 C_H1 영역을 갖는 항체 중쇄, 힌지 영역, 막횡단 영역, 및 2-5개의 신호전달 도메인을 갖는 세포내 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄, 및 상응하는 CL/CK 영역을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인 영역 (카파 (K) 또는 람다 (L))을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서, 각각의 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄에서 C_H1 및 CL/CK 영역은 1개 또는 2개의 디설파이드 결합으로 연결된다 (예를 들면, 도 1a 및 b를 참조한다).

본원 개시내용은 첫번째 폴리펩타이드 쇄 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 갖는 DAR (이량체성 항원 수용체) 작제물에 대한 구조를 제공하고, 여기서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄 및 두번째 폴리펩타이드 쇄 둘 다가 동일한 세포에 의해 발현되는 경우, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 형질도입된 세포의 외부 영역에서 하나 또는 다수의 디설파이드 결합에 의해 두번째 폴리펩타이드 쇄에 연결된다. 일부 실시형태에서, DAR 작제물은, 차례로, 상응하는 CL/CK 영역을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인 영역 (카파 (K) 또는 람다 (L)), 힌지 영역, 막횡단 영역, 및 2-5개의 신호전달 도메인을 갖는 세포내 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄, 및 항체 중쇄 가변 도메인 영역 및 C_H1 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서, 각각의 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄에서 CL/CK 및 C_H1 영역은 1개 또는 2개의 디설파이드 결합으로 연결된다 (예를 들면, 도 2a 및 b를 참조한다).

하나의 실시형태에서, DAR 작제물은 개별적인 폴리펩타이드 쇄 상 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 항원 결합 도메인을 형성한다.

하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 약 10 내지 약 100개의 아미노산 길이이다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 독립적으로 CD8 힌지 영역 또는 이의 단편, CD8α 힌지 영역 또는 이의 단편, 항체의 불변 도메인 C_H1 및 C_H2를 연결하는 항체의 힌지 영역 (IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 힌지 영역은 항체로부터 유래될 수 있고, 항체의 하나 이상의 불변 영역을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.

하나의 실시형태에서, 막횡단 도메인은 CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD137, CD154, LFA-1 T 세포 공-수용체, CD2 T 세포 공-수용체/부착 분자, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS, 및 FGFR2B로 이루어진 그룹으로부터 선택된 막 단백질 서열 영역으로부터 유래될 수 있다.

하나의 실시형태에서, 신호전달 영역은 CD3-제타 쇄, 4-1BB, CD28, CD27, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프 난모세포 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, GITR (TNFRSF18), DR3 (TNFRSF25), TNFR2, CD226, 및 이의 조합으로부터의 신호전달 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

하나의 실시형태에서, 이량체성 항원 수용체의 일반적 설계는 첫번째 폴리펩타이드 쇄 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 이량체화 영역에 연결된, 힌지 영역에 연결된, 막횡단 영역에 연결된, 및 하나 또는 다수의 세포내 서열 영역(들)에 연결된 항원 결합 영역을 포함하고, 여기서, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 항원 결합 도메인 및 이량체화 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 하나 또는 이들 둘 다 상 항원 결합 도메인은 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 사이토킨 수용체의 세포외 영역, 단일 도메인 항체, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 하나 또는 이들 둘 다 상 이량체화 도메인은 카파 경쇄 불변 영역, 람다 경쇄 불변 영역, 류신 지퍼, myc-max 성분, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 도 1a-b 및 2a-b에서, "S-S"는 디설파이드 결합, 류신 지퍼 또는 myc-max 성분을 포함하는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄의 이량체화를 야기하는 임의의 화학 결합 또는 회합을 나타낸다.

본원 개시내용은 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 제공하고, 여기서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 중쇄 가변 (V_H) 및 중쇄 불변 영역 (C_H)을 보유하고, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 경쇄 가변 (V_L) 및 경쇄 불변 영역 (C_L)을 보유한다 (예를 들면, 도 1a 및 b). 하나의 실시형태에서, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물은 다음을 포함한다: (a) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 중쇄 가변 영역 (V_H), (ii) 항체 중쇄 불변 영역 (C_H), (iii) 임의의 힌지 영역, (iv) 막횡단 영역 (T_M), 및 (v) 세포내 영역; (b) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 경쇄 가변 영역 (V_L) (예를 들면, 카파 또는 람다), 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역 (C_L).

본원 개시내용은 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 제공하고, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 경쇄 가변 (V_L) 및 경쇄 불변 영역 (C_L)을 보유하고, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 중쇄 가변 (V_H) 및 중쇄 불변 영역 (C_H)을 보유한다 (예를 들면, 도 2a 및 b). 하나의 실시형태에서, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물은 다음을 포함한다: (a) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 경쇄 가변 영역 (V_L), (ii) 항체 경쇄 불변 영역 (C_L), (iii) 임의의 힌지 영역, (iv) 막횡단 영역 (T_M), 및 (v) 세포내 영역; (b) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 중쇄 가변 영역 (V_H), 및 (ii) 항체 중쇄 불변 영역 (C_H).

하나의 실시형태에서, 도 1a 및 b, 및 2a 및 b에 나타낸 이량체성 항원 수용체의 경우, 항체 중쇄 불변 영역 (C_H) 및 항체 경쇄 불변 영역 (C_L)은 이량체화되어 이량체화 도메인을 형성할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 항체 중쇄 불변 영역 및 항체 경쇄 불변 영역이 1개 또는 2개의 디설파이드 결합을 통해 이량체화된다.

하나의 실시형태에서, 도 1a 및 b, 및 도 2a 및 b에 나타낸 이량체성 항원 수용체의 경우, 항체 중쇄 가변 영역 (V_H) 및 항체 경쇄 가변 영역 (V_L)은 서로 회합되어 항원 결합 도메인을 형성한다. 예를 들면, 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역은 항체 중쇄 불변 영역 및 항체 경쇄 불변 영역이 이량체화되는 경우 서로 회합된다.

하나의 실시형태에서, 도 1a 및 b, 및 2a 및 b에 나타낸 이량체성 항원 수용체의 경우, 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역으로부터 형성되는, 항원 결합 도메인은, 표적 항원에 결합한다.

하나의 실시형태에서, 도 1a 및 b, 및 2a 및 b에 나타낸 이량체성 항원 수용체의 경우, 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역은 완전 사람 항체 영역, 사람화 항체 영역, 또는 키메라 항체 영역이다.

하나의 실시형태에서, 도 1a 및 b, 및 2a 및 b에 나타낸 이량체성 항원 수용체의 경우, 힌지 영역은 약 10 내지 약 100개의 아미노산 길이이다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 항체 (예를 들면, IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD)로부터의 힌지 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 CD8 (예를 들면, CD8α) 및/또는 CD28 힌지 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 CPPC 또는 SPPC 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 CD8 및 CD28 둘 다의 힌지 서열 (예를 들면, 긴 힌지 영역), 단지 CD8 서열 단독 (짧은 힌지) 또는 단지 CD28 힌지 서열 단독 (예를 들면, 짧은 힌지 영역)을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 도 1a 또는 b, 또는 도 2a 또는 b에 나타낸 이량체성 항원 수용체 중 어느 것은 힌지 영역을 포함하지 않는다.

하나의 실시형태에서, 도 1a 및 b, 및 2a 및 b에 나타낸 이량체성 항원 수용체의 경우, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄의 막횡단 영역은 독립적으로 CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD137, CD154, LFA-1 T 세포 공-수용체, CD2 T 세포 공-수용체/부착 분자, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS, 및 FGFR2B로부터 유래될 수 있다.

하나의 실시형태에서, 도 1a 및 b, 및 2a 및 b에 나타낸 이량체성 항원 수용체의 경우, 첫번째 폴리펩타이드의 세포내 영역은 4-1BB, CD3제타, CD28, CD27, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, GITR (TNFRSF18), DR3 (TNFRSF25), TNFR2, CD226, 및 이의 조합으로부터의 2-5개의 세포내 서열의 임의의 순서 및 임의의 조합의 세포내 공-자극성 및/또는 신호전달 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 세포내 영역은 CD28, 4-1BB 및/또는 CD3-제타 세포내 서열의 2개 이상 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 세포내 영역은 CD28 공-자극성 및 CD3-제타 세포내 신호전달 서열, 또는 4-1BB 공-자극성 및 CD3-제타 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 세포내 신호전달 영역의 CD3-제타 부분은 ITAM (면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프) 모티프 1, 2 및 3 (예를 들면, 긴 CD3-제타)을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 세포내 신호전달 영역의 CD3-제타 부분은 단지 하나의 ITAM 모티프, 예를 들면, 단지 ITAM 1, 2 또는 3만을 포함한다 (예를 들면, 짧은 CD3-제타).

하나의 실시형태에서, 이량체성 항원 수용체의 첫번째 폴리펩타이드 쇄 (도 1a 및 1b)는 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 중쇄 불변 영역은 사람 항체 불변 영역, 예를 들면, 사람 C_H1 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 중쇄 불변 영역은 IgM, IgA, IgG, IgE 또는 IgD 항체로부터 유래될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 항체 중쇄 불변 영역은 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 중쇄 불변 영역은 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 힌지, 또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지, 또는 서열번호 36의 CD28 및 CD8 힌지 서열을 포함하는 힌지 영역 (예를 들면, 긴 힌지)을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 폴리펩타이드는 힌지 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 막횡단 영역은 서열번호 37 (CD28로부터), 서열번호 38 (CD8로부터), 서열번호 39 (4-1BB로부터), 또는 서열번호 40 (CD3제타로부터)의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 세포내 영역은 서열번호 41 (4-1BB로부터), 서열번호 42 (CD28로부터), 서열번호 43 (OX40으로부터), 서열번호 44 (CD3제타 ITAM 1, 2 및 3), 서열번호 45 (CD3제타 ITAM 1), 서열번호 46 (CD3제타 ITAM 2) 및/또는 서열번호 47 (CD3제타 ITAM 3)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 세포내 서열 중 어느 하나 또는 임의의 조합으로부터의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 54 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 리더 서열을 포함하거나, 첫번째 폴리펩타이드는 리더 서열을 포함하지 않는다.

하나의 실시형태에서, 이량체성 항원 수용체의 두번째 폴리펩타이드 쇄 (도 1a 및 1b)는 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 경쇄 불변 영역은 사람 경쇄 불변 영역으로부터의 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역으로부터의 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 경쇄 불변 영역은 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 경쇄 불변 영역은 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 55 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 리더 서열을 포함하거나, 두번째 폴리펩타이드는 리더 서열을 포함하지 않는다.

하나의 실시형태에서, 이량체성 항원 수용체의 첫번째 폴리펩타이드 쇄 (도 2a 및 2b)는 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 경쇄 불변 영역은 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 힌지, 또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지, 또는 서열번호 36의 CD28 및 CD8 힌지 서열을 포함하는 힌지 영역 (예를 들면, 긴 힌지)을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 폴리펩타이드는 힌지 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 막횡단 영역은 서열번호 37 (CD28로부터), 서열번호 38 (CD8로부터), 서열번호 39 (4-1BB로부터), 또는 서열번호 40 (CD3제타로부터)의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 세포내 영역은 서열번호 41 (4-1BB로부터), 서열번호 42 (CD28로부터), 서열번호 43 (OX40으로부터), 서열번호 44 (CD3제타 ITAM 1, 2 및 3), 서열번호 45 (CD3제타 ITAM 1), 서열번호 46 (CD3제타 ITAM 2) 및/또는 서열번호 47 (CD3제타 ITAM 3)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 세포내 서열 중 어느 하나 또는 임의의 조합으로부터의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 55 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 리더 서열을 포함하거나, 첫번째 폴리펩타이드는 리더 서열을 포함하지 않는다.

하나의 실시형태에서, 이량체성 항원 수용체의 두번째 폴리펩타이드 쇄 (도 2a 및 2b)는 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 중쇄 불변 영역은 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 54 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 리더 서열을 포함하거나, 두번째 폴리펩타이드는 리더 서열을 포함하지 않는다.

본원 개시내용은 중쇄 가변 (V_H) 및 중쇄 불변 영역 (C_H)을 보유하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄, 및 경쇄 가변 (V_L) 및 경쇄 불변 영역 (C_L)을 보유하는 두번째 폴리펩타이드 쇄 (예를 들면, 도 1)을 포함하는 버젼 1 (예를 들면, V1) 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 제공하고, 여기서, (a) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 중쇄 가변 영역 (V_H), (ii) 항체 중쇄 불변 영역 (C_H), (iii) CD8 및 CD28 힌지 서열 (예를 들면, 서열번호 36)을 포함하는 긴 힌지 영역, (iv) CD28 막횡단 서열 (예를 들면, 서열번호 37)을 포함하는 막횡단 영역 (T_M), 및 (v) CD28 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 42) 및 ITAM 모티프 1, 2 및 3을 갖는 CD3-제타 신호전달 서열 (예를 들면, 서열번호 44)을 포함하는 세포내 영역; (b) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 경쇄 가변 영역 (V_L) (예를 들면, 카파 또는 람다), 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역 (C_L). 하나의 실시형태에서, 항체 중쇄 가변 영역 (V_H)은 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 중쇄 가변 영역을 포함하고, 항체 경쇄 가변 영역 (V_L)은 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

본원 개시내용은 중쇄 가변 (V_H) 및 중쇄 불변 영역 (C_H)을 보유하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄, 및 경쇄 가변 (V_L) 및 경쇄 불변 영역 (C_L)을 보유하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 버젼 2 (예를 들면, V2) 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 제공하고 (예를 들면, 도 1 및 2), 여기서, (a) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 중쇄 가변 영역 (V_H), (ii) 항체 중쇄 불변 영역 (C_H), (iii) CD28 힌지 서열 (예를 들면, 서열번호 35)을 포함하는 짧은 힌지 영역, (iv) CD28 막횡단 서열 (예를 들면, 서열번호 37)을 포함하는 막횡단 영역 (T_M), 및 (v) (1) 4-1BB 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 41) 및 ITAM 모티프 1, 2 및 3을 갖는 CD3-제타 (예를 들면, 서열번호 44), 또는 (2) CD28 (예를 들면, 서열번호 42) 신호전달 서열 및 ITAM 모티프 1, 2 및 3을 갖는 CD3-제타 (예를 들면, 서열번호 44), 또는 (3) 4-1BB (예를 들면, 서열번호 41) 신호전달 서열 및 CD28 (예를 들면, 서열번호 42) 신호전달 서열 및 ITAM 모티프 1, 2 및 3을 갖는 CD3-제타 (예를 들면, 서열번호 44)을 포함하는 세포내 영역; (b) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 경쇄 가변 영역 (V_L) (예를 들면, 카파 또는 람다), 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역 (C_L).

하나의 실시형태에서, 버젼 2a (V2a) DAR 작제물은 4-1BB 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 41) 및 ITAM 모티프 1, 2 및 3을 갖는 CD3-제타 (예를 들면, 서열번호 44)를 갖는 세포내 영역을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 버젼 2b (V2b) DAR 작제물은 CD28 (예를 들면, 서열번호 42) 신호전달 서열 및 ITAM 모티프 1, 2 및 3을 갖는 CD3-제타 (예를 들면, 서열번호 44)를 갖는 세포내 영역을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 버젼 2c (V2c) DAR 작제물은 4-1BB (예를 들면, 서열번호 41) 신호전달 서열 및 CD28 (예를 들면, 서열번호 42) 신호전달 서열 및 ITAM 모티프 1, 2 및 3을 갖는 CD3-제타 (예를 들면, 서열번호 44)를 갖는 세포내 영역을 포함한다.

하나의 실시형태에서, DAR V2a 및 V2b는 두번째 세대 DAR 작제물인 반면, DAR V2c는 세번째 세대 DAR 작제물이다.

하나의 실시형태에서, DAR V2a, V2b 및 V2c 작제물에서, 항체 중쇄 가변 영역 (V_H)은 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 중쇄 가변 영역을 포함하고, 항체 경쇄 가변 영역 (V_L)은 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

본원 개시내용은 중쇄 가변 (V_H) 및 중쇄 불변 영역 (C_H)을 보유하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄, 및 경쇄 가변 (V_L) 및 경쇄 불변 영역 (C_L)을 보유하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 버젼 3a, 3b 및 3c (예를 들면, V3a, V3b 및 V3c) 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 제공하고 (예를 들면, 도 1), 여기서, (a) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 중쇄 가변 영역 (V_H), (ii) 항체 중쇄 불변 영역 (C_H), (iii) CD28 힌지 서열 (예를 들면, 서열번호 35)을 포함하는 짧은 힌지 영역, (iv) CD28 막횡단 서열 (예를 들면, 서열번호 37)을 포함하는 막횡단 영역 (T_M), 및 (v) 4-1BB 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 41) 및 단지 ITAM 모티프 3만을 갖는 CD3-제타 신호전달 서열 (예를 들면, 서열번호 47)을 포함하는 세포내 영역; (b) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 경쇄 가변 영역 (V_L) (예를 들면, 카파 또는 람다), 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역 (C_L).

하나의 실시형태에서, 버젼 3a (V3a) DAR 작제물은 4-1BB 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 41) 및 ITAM 모티프 3을 갖는 CD3-제타 (예를 들면, 서열번호 47)를 갖는 세포내 영역을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 버젼 3b (V3b) DAR 작제물은 CD28 (예를 들면, 서열번호 42) 신호전달 서열 및 ITAM 모티프 3을 갖는 CD3-제타 (예를 들면, 서열번호 47)를 갖는 세포내 영역을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 버젼 3c (V3c) DAR 작제물은 4-1BB (예를 들면, 서열번호 41) 신호전달 서열 및 CD28 (예를 들면, 서열번호 42) 신호전달 서열 및 ITAM 모티프 3을 갖는 CD3-제타 (예를 들면, 서열번호 47)를 갖는 세포내 영역을 포함한다.

하나의 실시형태에서, DAR V3a 및 V3b는 두번째 세대 DAR 작제물인 반면, DAR V3c는 세번째 세대 DAR 작제물이다.

하나의 실시형태에서, DAR V3a, V3b 및 V3c 작제물에서, 항체 중쇄 가변 영역 (V_H)은 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 중쇄 가변 영역을 포함하고, 항체 경쇄 가변 영역 (V_L)은 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, DAR 버젼 3b (예를 들면, V3b)는 CD28 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 42)을 포함하는 세번째 세대 DAR 작제물이다.

본원 개시내용은 중쇄 가변 (V_H) 및 중쇄 불변 영역 (C_H)을 보유하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄, 및 경쇄 가변 (V_L) 및 경쇄 불변 영역 (C_L)을 보유하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 버젼 4 (예를 들면, V4) 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 제공하고, 여기서, (a) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 중쇄 가변 영역 (V_H), (ii) 항체 중쇄 불변 영역 (C_H), (iii) CD28 막횡단 서열 (예를 들면, 서열번호 37)을 포함하는 막횡단 영역 (T_M), 및 (iv) 4-1BB 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 41) 및 단지 ITAM 모티프 3만을 갖는 CD3-제타 신호전달 서열 (예를 들면, 서열번호 47)을 포함하는 세포내 영역; (b) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 경쇄 가변 영역 (V_L) (예를 들면, 카파 또는 람다), 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역 (C_L). DAR V4 작제물은 힌지 서열을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, DAR V4 작제물에서, 항체 중쇄 가변 영역 (V_H)은 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 중쇄 가변 영역을 포함하고, 항체 경쇄 가변 영역 (V_L)은 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

전구체 폴리펩타이드

본원 개시내용은 전구체 폴리펩타이드를 제공한다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드는 회합/조립하여 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 형성하는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄가 되도록 프로세싱할 수 있다. 자기-절단 서열을 포함하는 본원에 기재된 전구체 폴리펩타이드 실시형태 중 어느 것에서, 자기-절단 서열은 T2A, P2A, E2A, 또는 F2A 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 자기-절단 서열은 T2A 서열이 아니고, 예를 들면, 자기-절단 서열은 P2A, E2A, 또는 F2A 서열이다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 제공한다: (i) 중쇄 리더 서열 (ii) 항체 중쇄 가변 영역, (iii) 항체 중쇄 불변 영역, (iv) 임의의 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, (vi) 세포내 영역, (vii) 자기-절단 서열, (viii) 경쇄 리더 서열, (ix) 항체 경쇄 가변 영역, 및 (x) 항체 경쇄 불변 영역 (도 3a 및 b). 비-제한적인 예에서, 세포내 영역은 4-1BB, CD3제타 및/또는 CD28 중 적어도 2개의 임의의 조합을 포함한다 (도 3a 및 b). 당해 기술분야의 숙련가는 다른 세포내 공-자극성 및/또는 신호전달 서열의 조합이 가능하다는 것을 인식할 것이다. 자기-절단 서열은 2개의 개별적인 폴리펩타이드를 생성하는 리보솜 스키핑(skipping) 및 단백질 번역의 재개를 촉진하는 아미노산 서열이다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드의 집단은 자기-절단 서열에서 절단되거나 절단되지 않은 폴리펩타이드의 혼합물 및/또는 중쇄 및/또는 경쇄 리더 서열에서 절단되거나 절단되지 않은 폴리펩타이드의 혼합물을 포함한다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 제공한다: (i) 경쇄 리더 서열 (ii) 항체 경쇄 가변 영역, (iii) 항체 경쇄 불변 영역, (iv) 임의의 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, (vi) 세포내 영역, (vii) 자기-절단 서열, (viii) 중쇄 리더 서열, (ix) 항체 중쇄 가변 영역, 및 (x) 항체 중쇄 불변 영역 (도 4a 및 b). 비-제한적인 예에서, 세포내 영역은 4-1BB, CD3제타 및/또는 CD28 중 적어도 2개의 임의의 조합을 포함한다 (도 4a 및 b). 당해 기술분야의 숙련가는 다른 세포내 공동-자극성 및/또는 신호전달 서열의 조합이 가능하다는 것을 인식할 것이다. 자기-절단 서열은 2개의 개별적인 폴리펩타이드를 생성하는 리보솜 스키핑 및 단백질 번역의 재개를 촉진하는 아미노산 서열이다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드의 집단은 자기-절단 서열에서 절단되거나 절단되지 않은 폴리펩타이드의 혼합물, 및/또는 중쇄 및/또는 경쇄 리더 서열에서 절단되거나 절단되지 않은 폴리펩타이드의 혼합물을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 도 3a 및 b, 및 도 4a 및 b에 나타낸 전구체 폴리펩타이드의 경우, 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 세포의 분비 경로에 대해 폴리펩타이드 쇄 (예를 들면, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄)를 표적화하는 펩타이드 신호전달 서열을 포함하고, 폴리펩타이드의 세포성 막의 지질 이중층 내로의 통합 및 고정을 가능하게 할 것이다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 시토졸에서 숙주 세포의 세포질그물까지 전구체 폴리펩타이드의 운반을 지시할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 세포질그물에서 세포성 막의 지질 이중층까지 전구체 폴리펩타이드의 운반을 지시할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 CD8α, CD28 또는 CD16 리더 서열을 포함하는 신호전달 서열을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 도 3a 및 b, 및 도 4a 및 b에 나타낸 전구체 폴리펩타이드의 경우, 전구체 폴리펩타이드의 N-말단 종점은 첫번째 펩타이드 신호전달 서열 (예를 들면, 중쇄 또는 경쇄 리더 서열)을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 도 3a 및 b, 및 도 4a 및 b에 나타낸 전구체 폴리펩타이드의 경우, 전구체 폴리펩타이드는 절단 서열 후 위치된 두번째 펩타이드 신호전달 서열 (예를 들면, 중쇄 또는 경쇄 리더 서열)을 포함할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드는 절단 서열에서 절단되어 각각 이들의 N-말단 종점에서 펩타이드 신호전달 서열을 갖는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 생성할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 도 3a 및 b, 및 도 4a 및 b에 나타낸 전구체 폴리펩타이드의 경우, 전구체 폴리펩타이드의 프로세싱은 전구체를 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄로 절단하고, 전구체를 분비시키고/시키거나, 세포성 막 내에 전구체를 고정함을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 도 3a 및 b, 및 도 4a 및 b에 나타낸 전구체 폴리펩타이드의 경우, 전구체 폴리펩타이드 쇄를 절단하여 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 생성한 후, (폴리펩타이드 쇄 중 하나의) 항체 중쇄 불변 영역 (C_H) 및 (다른 폴리펩타이드 쇄의) 항체 경쇄 불변 영역 (C_L)을 이량체화하여 이량체화 도메인을 형성할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 항체 중쇄 불변 영역 및 항체 경쇄 불변 영역은 1개 또는 2개의 디설파이드 결합을 통해 이량체화된다 (예를 들면, 도 1a 및 b, 및 2a 및 b 참조).

하나의 실시형태에서, 도 3a 및 b, 및 도 4a 및 b에 나타낸 전구체 폴리펩타이드의 경우, 전구체 폴리펩타이드 쇄를 절단하여 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 생성한 후, (폴리펩타이드 쇄 중 하나의) 항체 중쇄 가변 영역 (V_H) 및 (다른 폴리펩타이드 쇄의) 항체 경쇄 가변 영역 (V_L)은 서로 회합하여 항원 결합 도메인을 형성한다. 예를 들면, 항체 중쇄 불변 영역 및 항체 경쇄 불변 영역이 이량체화되는 경우, 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역은 서로 회합된다 (예를 들면, 도 1a 및 b, 및 2a 및 b 참조).

하나의 실시형태에서, 도 3a 및 b, 및 도 4a 및 b에 나타낸 전구체 폴리펩타이드의 경우, 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역으로부터 형성된 항원 결합 도메인은, 표적 항원에 결합한다.

하나의 실시형태에서, 도 3a 및 b, 및 도 4a 및 b에 나타낸 전구체 폴리펩타이드의 경우, 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역은 완전 사람, 사람화 또는 키메라 항체 영역을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 도 3a 및 b, 및 도 4a 및 b에 나타낸 전구체 폴리펩타이드의 경우, 힌지 영역은 약 10 내지 약 100개의 아미노산 길이이다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 항체 (예를 들면, IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD)로부터의 힌지 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 CD8 (예를 들면, CD8α) 또는 CD28 힌지 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 CPPC 또는 SPPC 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 CD8 및 CD28 둘 다의 힌지 서열 (예를 들면, 긴 힌지 영역), CD8 서열 단독 (짧은 힌지) 또는 CD28 힌지 서열 단독 (예를 들면, 짧은 힌지 영역)을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드는 힌지 영역을 포함하지 않는다.

하나의 실시형태에서, 도 3a 및 b, 및 도 4a 및 b에 나타낸 전구체 폴리펩타이드의 경우, 전구체 폴리펩타이드 쇄의 막횡단 영역은 CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD137, CD154, LFA-1 T 세포 공-수용체, CD2 T 세포 공-수용체/부착 분자, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS, 및 FGFR2B로부터 유래될 수 있다.

하나의 실시형태에서, 도 3a 및 b, 및 도 4a 및 b에 나타낸 전구체 폴리펩타이드의 경우, 첫번째 폴리펩타이드의 세포내 영역은 4-1BB, CD3제타, CD28, CD27, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, GITR (TNFRSF18), DR3 (TNFRSF25), TNFR2 및/또는 CD226을 포함하는 2 내지 5개의 세포내 서열의 임의의 순서 및 임의의 조합의 세포내 신호전달 및/또는 공-자극성 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 세포내 영역은 CD28, 4-1BB 및/또는 CD3-제타 중 2개 이상의 어느 하나 또는 임의의 조합으로부터의 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 세포내 영역은 CD28 및 CD3-제타 세포내 서열, 또는 4-1BB 및 CD3-제타 세포내 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 세포내 영역의 CD3-제타 부분은 ITAM (면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프) 모티프 1, 2 및 3 (예를 들면, 긴 CD3-제타)을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 세포내 영역의 CD3-제타 부분은 ITAM 모티프 중 단지 하나, 예를 들면, 단지 ITAM 1, 2 또는 3 (예를 들면, 짧은 CD3-제타)만을 포함한다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 제공한다: (i) 서열번호 54 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 리더 서열; (ii) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; (iii) 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 불변 영역; (iv) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 힌지 영역 및 임의로 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지; (v) 서열번호 37 (CD28로부터), 서열번호 38 (CD8로부터), 서열번호 39 (4-1BB로부터), 또는 서열번호 40 (CD3제타로부터)의 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 영역; (vi) 서열번호 41 (4-1BB로부터), 서열번호 42 (CD28로부터), 서열번호 43 (OX40으로부터), 서열번호 44 (CD3제타 ITAM 1, 2 및 3), 서열번호 45 (CD3제타 ITAM 1), 서열번호 46 (CD3제타 ITAM 2) 및/또는 서열번호 47 (CD3제타 ITAM 3)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 세포내 서열 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함하는 세포내 영역; (vii) 서열번호 57, 58, 59 또는 60의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 자기-절단 서열; (viii) 서열번호 55 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 리더 서열; (ix) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; 및 (x) 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 전체길이 전구체 폴리펩타이드는 서열번호 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81 또는 84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 자기-절단 서열에서 절단하여 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 방출하고, 전구체를 분비시키고/시키거나, 세포성 막 내에 전구체를 고정하여 프로세싱할 수 있다. 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄는 항체 중쇄 불변 영역 및 항체 경쇄 불변 영역 사이에 적어도 하나의 디설파이드 결합을 통해 이량체화할 수 있고, 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역은 BCMA 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드는 힌지 영역을 포함하지 않는다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 제공한다: (i) 서열번호 55 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 리더 서열; (ii) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; (iii) 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 불변 영역; (iv) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 힌지 영역 및 임의로 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지; (v) 서열번호 37 (CD28로부터), 서열번호 38 (CD8로부터), 서열번호 39 (4-1BB로부터), 또는 서열번호 40 (CD3제타로부터)의 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 영역; (vi) 서열번호 41 (4-1BB로부터), 서열번호 42 (CD28로부터), 서열번호 43 (OX40으로부터), 서열번호 44 (CD3제타 ITAM 1, 2 및 3), 서열번호 45 (CD3제타 ITAM 1), 서열번호 46 (CD3제타 ITAM 2) 및/또는 서열번호 47 (CD3제타 ITAM 3)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 세포내 서열 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함하는 세포내 영역; (vii) 서열번호 57, 58, 59 또는 60의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 자기-절단 서열; (viii) 서열번호 54 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 리더 서열; (ix) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; 및 (x) 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 자기-절단 서열에서 절단하여 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 방출하고, 전구체를 분비시키고/시키거나, 세포성 막 내에 전구체를 고정하여 프로세싱할 수 있다. 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄는 항체 중쇄 불변 영역 및 항체 경쇄 불변 영역 사이에 적어도 하나의 디설파이드 결합을 통해 이량체화할 수 있고, 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역은 BCMA 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드는 힌지 영역을 포함하지 않는다.

이량체성 항원 수용체를 암호화하는 핵산 및 관련 분자

본원 개시내용은 본원에 기재된 첫번째 폴리펩타이드 쇄, 두번째 폴리펩타이드 쇄, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄, 이량체성 항원 수용체 또는 전구체 폴리펩타이드 중 어느 것을 암호화하는 핵산을 제공한다. 자기-절단 서열을 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 본원에 기재된 핵산 실시형태 중 어느 것에서, 자기-절단 서열은 T2A, P2A, E2A, 또는 F2A 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 자기-절단 서열은 T2A 서열이 아니고, 예를 들면, 자기-절단 서열은 P2A, E2A, 또는 F2A 서열이다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다: (i) 중쇄 리더 영역, (ii) 항체 중쇄 가변 영역, (iii) 항체 중쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, (vi) 2 내지 5개의 세포내 서열을 갖는 세포내 영역, (vii) 자기-절단 서열 영역, (viii) 경쇄 리더 영역, (ix) 항체 경쇄 가변 영역 (예를 들면, 카파 또는 람다), 및 (x) 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 핵산은 도 3a 또는 b에 예시된 전구체 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 힌지 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 중쇄 리더 영역 및/또는 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다: (i) 서열번호 54 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 리더 서열; (ii) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; (iii) 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 불변 영역; (iv) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 힌지 영역 및 임의로 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지; (v) 서열번호 37 (CD28로부터), 서열번호 38 (CD8로부터), 서열번호 39 (4-1BB로부터), 또는 서열번호 40 (CD3제타로부터)의 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 영역; (vi) 서열번호 41 (4-1BB로부터), 서열번호 42 (CD28로부터), 서열번호 43 (OX40으로부터), 서열번호 44 (CD3제타 ITAM 1, 2 및 3), 서열번호 45 (CD3제타 ITAM 1), 서열번호 46 (CD3제타 ITAM 2) 및/또는 서열번호 47 (CD3제타 ITAM 3)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 세포내 서열 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함하는 세포내 영역; (vii) 서열번호 57, 58, 59 또는 60의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 자기-절단 서열; (viii) 서열번호 55 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 리더 서열; (ix) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; 및 (1x 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 핵산은 도 3a 또는 b에 예시된 전구체 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 힌지 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 중쇄 리더 영역 및/또는 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다: (i) 경쇄 리더 영역, (ii) 항체 경쇄 가변 영역 (예를 들면, 카파 또는 람다), (iii) 항체 경쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, (vi) 2 내지 5개의 세포내 서열을 갖는 세포내 영역, (vii) 자기-절단 서열 영역, (viii) 중쇄 리더 영역, (ix) 항체 중쇄 가변 영역, 및 (x) 항체 중쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 핵산은 도 4a 또는 b에 예시된 전구체 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 힌지 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 중쇄 리더 영역 및/또는 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다: (i) 서열번호 55 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 리더 서열; (ii) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; (iii) 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 불변 영역; (iv) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 힌지 영역 및 임의로 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지; (v) 서열번호 37 (CD28로부터), 서열번호 38 (CD8로부터), 서열번호 39 (4-1BB로부터), 또는 서열번호 40 (CD3제타로부터)의 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 영역; (vi) 서열번호 41 (4-1BB로부터), 서열번호 42 (CD28로부터), 서열번호 43 (OX40으로부터), 서열번호 44 (CD3제타 ITAM 1, 2 및 3), 서열번호 45 (CD3제타 ITAM 1), 서열번호 46 (CD3제타 ITAM 2) 및/또는 서열번호 47 (CD3제타 ITAM 3)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 세포내 서열 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함하는 세포내 영역; (vii) 서열번호 57, 58, 59 또는 60의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 자기-절단 서열; (viii) 서열번호 54 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 리더 서열; (ix) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; 및 (x) 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 핵산은 도 4a 또는 b에 예시된 전구체 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 힌지 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 중쇄 리더 영역 및/또는 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 첫번째 핵산을 제공한다: (i) 중쇄 리더 영역, (ii) 항체 중쇄 가변 영역, (iii) 항체 중쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, 및 (vi) 세포내 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 중쇄 리더 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 도 1a 또는 b에 예시되는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 두번째 핵산을 제공한다: (i) 경쇄 리더 영역, (ii) 항체 경쇄 가변 영역 (예를 들면, 카파 또는 람다), 및 (iii) 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 두번째 핵산은 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 핵산은 도 1a 또는 b에 예시된 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다.

하나의 실시형태에서, 핵산은 다음을 포함하는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다: (a) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 중쇄 리더 서열, (ii) 항체 중쇄 가변 영역, (iii) 항체 중쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, 및 (vi) 2 내지 5개의 세포내 서열을 갖는 세포내 영역; 및 (b) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 경쇄 가변 영역 (예를 들면, 카파 또는 람다), 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 단일 핵산은 중쇄 리더 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드를 암호화하고/하거나, 단일 핵산은 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 단일 핵산은 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 단일 핵산은 도 1a 또는 b에 예시된 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 첫번째 핵산을 제공한다: (i) 경쇄 리더 영역, (ii) 항체 경쇄 가변 영역 (예를 들면, 카파 또는 람다), (iii) 항체 경쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, 및 (vi) 세포내 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 도 2a 또는 b로 예시된 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 두번째 핵산을 제공한다: (i) 중쇄 리더 영역, (ii) 항체 중쇄 가변 영역, 및 (iii) 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 두번째 핵산은 중쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 핵산은 도 2a 또는 b에 예시된 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다.

하나의 실시형태에서, 핵산은 다음을 포함하는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다: (a) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 경쇄 리더 서열, (ii) 항체 경쇄 가변 영역 (예를 들면, 카파 또는 람다), (iii) 항체 경쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, 및 (vi) 2 내지 5개의 세포내 서열을 갖는 세포내 영역; 및 (b) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 중쇄 가변 영역, 및 (ii) 항체 중쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 단일 핵산은 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드를 암호화하고/하거나, 단일 핵산은 중쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드를암호화한다. 하나의 실시형태에서, 단일 핵산은 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 단일 핵산은 도 2a 또는 b로 예시되는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산을 제공한다: (i) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; (ii) 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 불변 영역; (iii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 힌지 영역 및 임의로 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지; (iv) 서열번호 37 (CD28로부터), 서열번호 38 (CD8로부터), 서열번호 39 (4-1BB로부터), 또는 서열번호 40 (CD3제타로부터)의 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 영역; 및 (v) 서열번호 41 (4-1BB로부터), 서열번호 42 (CD28로부터), 서열번호 43 (OX40으로부터), 서열번호 44 (CD3제타 ITAM 1, 2 및 3), 서열번호 45 (CD3제타 ITAM 1), 서열번호 46 (CD3제타 ITAM 2) 및/또는 서열번호 47 (CD3제타 ITAM 3)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 세포내 서열 중 어느 하나 또는 임의의 조합으로부터의 아미노산 서열을 포함하는 세포내 영역. 하나의 실시형태에서, 핵산은 서열번호 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82 또는 85 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하고, 여기서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 리더 서열 (예를 들면, 서열번호 54 또는 55)을 포함하거나 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 핵산은 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산을 제공한다: (i) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역, 및 (ii) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 핵산은 서열번호 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83 또는 86 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하고, 여기서, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 리더 서열 (예를 들면, 서열번호 55 또는 56)을 포함하거나 포함하지 않는다.

본원 개시내용은 중쇄 가변 (V_H) 및 중쇄 불변 영역 (C_H)을 보유하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄, 및 경쇄 가변 (V_L) (예를 들면, 카파 또는 람다) 및 경쇄 불변 영역 (C_L)을 보유하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 버젼 1 (예를 들면, V1) 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 암호화하는 핵산을 제공하고 (예를 들면, 도 1a), 여기서, (a) 첫번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하고: (i) 항체 중쇄 가변 영역 (V_H); (ii) 항체 중쇄 불변 영역 (C_H); (iii) CD8 및 CD28 힌지 서열 (예를 들면, 서열번호 36)을 포함하는 긴 힌지 영역; (iv) CD28 막횡단 서열 (예를 들면, 서열번호 37)을 포함하는 막횡단 영역 (T_M); 및 (v) CD28 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 42) 및 ITAM 모티프 1, 2 및 3을 갖는 CD3-제타 신호전달 서열 (예를 들면, 서열번호 44)을 포함하는 세포내 영역; (b) 두번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다: (i) 항체 경쇄 가변 영역 (V_L) (예를 들면, 카파 또는 람다), 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역 (C_L). 하나의 실시형태에서, 항체 중쇄 가변 영역 (V_H)은 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-BCMA 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 경쇄 가변 영역 (V_L)은 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-BCMA 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

본원 개시내용은 중쇄 가변 (V_H) 및 중쇄 불변 영역 (C_H)을 보유하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄, 및 경쇄 가변 (V_L) 및 경쇄 불변 영역 (C_L)을 보유하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 버젼 2 (예를 들면, V2) 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 암호화하는 핵산을 제공하고 (예를 들면, 도 1a 또는 b), 여기서, (a) 첫번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하고: (i) 항체 중쇄 가변 영역 (V_H), (ii) 항체 중쇄 불변 영역 (C_H), (iii) CD28 힌지 서열 (예를 들면, 서열번호 37)을 포함하는 짧은 힌지 영역, (iv) CD28 막횡단 서열 (예를 들면, 서열번호 37)을 포함하는 막횡단 영역 (T_M), 및 (v) (1) 4-1BB 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 41) 및 ITAM 모티프 1, 2 및 3을 갖는 CD3-제타 신호전달 서열 (예를 들면, 서열번호 44), 또는 (2) CD28 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 42) 및 ITAM 모티프 1, 2 및 3을 갖는 CD3-제타 신호전달 서열 (예를 들면, 서열번호 44), 또는 (3) 4-1BB 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 41) 및 CD28 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 42) 및 ITAM 모티프 1, 2 및 3을 갖는 CD3-제타 신호전달 서열 (예를 들면, 서열번호 44)을 포함하는 세포내 영역; (b) 두번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다: (i) 항체 경쇄 가변 영역 (V_L) (예를 들면, 카파 또는 람다), 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역 (C_L).

하나의 실시형태에서, 핵산은 4-1BB 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 41) 및 ITAM 모티프 1, 2 및 3을 갖는 CD3-제타 신호전달 서열 (예를 들면, 서열번호 44)을 갖는 세포내 영역을 포함하는 버젼 2a (V2a) DAR 작제물을 암호화한다.

하나의 실시형태에서, 핵산은 CD28 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 42) 및 ITAM 모티프 1, 2 및 3을 갖는 CD3-제타 신호전달 서열 (예를 들면, 서열번호 44)을 갖는 세포내 영역을 포함하는 버젼 2b (V2b) DAR 작제물을 암호화한다.

하나의 실시형태에서, 핵산은 4-1BB 공-자극성 영역 (예를 들면, 서열번호 41) 및 CD28 공-자극성 영역 (예를 들면, 서열번호 42) 및 ITAM 모티프 1, 2 및 3을 갖는 CD3-제타 신호전달 서열 (예를 들면, 서열번호 44)을 갖는 세포내 영역을 포함하는 버젼 2c (V2c) DAR 작제물을 암호화한다. 하나의 실시형태에서, DAR V2a 및 V2b는 두번째 세대 DAR 작제물인 반면, DAR V2c는 세번째 세대 DAR 작제물이다. 하나의 실시형태에서, 항체 중쇄 가변 영역 (V_H)은 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-BCMA 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 경쇄 가변 영역 (V_L)은 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-BCMA 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

본원 개시내용은 중쇄 가변 (V_H) 및 중쇄 불변 영역 (C_H)을 보유하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄, 및 경쇄 가변 (V_L) 및 경쇄 불변 영역 (C_L)을 보유하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 버젼 3a (예를 들면, V3a) 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 암호화하는 핵산을 제공하고 (예를 들면, 도 1a), 여기서, (a) 첫번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하고: (i) 항체 중쇄 가변 영역 (V_H), (ii) 항체 중쇄 불변 영역 (C_H), (iii) CD28 힌지 서열 (예를 들면, 서열번호 35)을 포함하는 짧은 힌지 영역, (iv) CD28 막횡단 서열 (예를 들면, 서열번호 37)을 포함하는 막횡단 영역 (T_M), 및 (v) (1) 4-1BB 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 41) 및 ITAM 모티프 3을 갖는 CD3-제타 신호전달 서열 (예를 들면, 서열번호 47), 또는 (2) CD28 (예를 들면, 서열번호 42) 신호전달 서열 및 ITAM 모티프 3을 갖는 CD3-제타 (예를 들면, 서열번호 47), 또는 (3) 4-1BB (예를 들면, 서열번호 41) 신호전달 서열 및 CD28 (예를 들면, 서열번호 42) 신호전달 서열 및 ITAM 모티프 3을 갖는 CD3-제타 (예를 들면, 서열번호 47)을 포함하는 세포내 영역; (b) 두번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다: (i) 항체 경쇄 가변 영역 (V_L) (예를 들면, 카파 또는 람다), 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역 (C_L). 하나의 실시형태에서, 항체 중쇄 가변 영역 (V_H)은 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-BCMA 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 경쇄 가변 영역 (V_L)은 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-BCMA 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 핵산은 4-1BB 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 41) 및 ITAM 모티프 3을 갖는 CD3-제타 (예를 들면, 서열번호 47)을 갖는 세포내 영역을 포함하는 버젼 3a (V3a) DAR 작제물을 암호화한다.

하나의 실시형태에서, 핵산은 CD28 (예를 들면, 서열번호 42) 신호전달 서열 및 ITAM 모티프 3을 갖는 CD3-제타 (예를 들면, 서열번호 47)을 갖는 세포내 영역을 포함하는 버젼 3b (V3b) DAR 작제물을 암호화한다.

하나의 실시형태에서, 핵산은 4-1BB (예를 들면, 서열번호 41) 신호전달 서열 및 CD28 (예를 들면, 서열번호 42) 신호전달 서열 및 ITAM 모티프 3을 갖는 CD3-제타 (예를 들면, 서열번호 47)을 갖는 세포내 영역을 포함하는 버젼 3c (V3c) DAR 작제물을 암호화한다.

하나의 실시형태에서, DAR V3a, V3b 및 V3c 작제물에서, 항체 중쇄 가변 영역 (V_H)은 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 중쇄 가변 영역을 포함하고, 항체 경쇄 가변 영역 (V_H)은 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

본원 개시내용은 중쇄 가변 (V_H) 및 중쇄 불변 영역 (C_H)을 보유하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄, 및 경쇄 가변 (V_L) 및 경쇄 불변 영역 (C_L)을 보유하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 버젼 4 (예를 들면, V4) 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 암호화하는 핵산을 제공하고 (예를 들면, 도 1a 그러나 힌지 부재), 여기서, (a) 첫번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하고: (i) 항체 중쇄 가변 영역 (V_H), (ii) 항체 중쇄 불변 영역 (C_H), (iii) CD28 막횡단 서열 (예를 들면, 서열번호 37)을 포함하는 막횡단 영역 (T_M), 및 (iv) 4-1BB 공-자극성 서열 (예를 들면, 서열번호 41) 및 ITAM 모티프 3을 갖는 CD3-제타 신호전달 서열 (예를 들면, 서열번호 47)을 포함하는 세포내 영역; (b) 두번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다: (i) 항체 경쇄 가변 영역 (V_L) (예를 들면, 카파 또는 람다), 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역 (C_L). DAR V4 작제물은 힌지 서열을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 항체 중쇄 가변 영역 (V_H)은 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-BCMA 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 경쇄 가변 영역 (V_L)은 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-BCMA 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

벡터

본원 개시내용은 본원에 기재된 전구체 폴리펩타이드, 첫번째 폴리펩타이드 쇄, 두번째 폴리펩타이드 쇄, 또는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것을 암호화하는 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 벡터를 제공한다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 벡터를 제공한다: (i) 중쇄 리더 영역, (ii) 항체 중쇄 가변 영역, (iii) 항체 중쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, (vi) 2 내지 5개의 세포내 서열을 갖는 세포내 영역, (vii) 자기-절단 서열 영역, (viii) 경쇄 리더 영역, (ix) 항체 경쇄 가변 영역, 및 (x) 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드는 힌지 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드는 중쇄 리더 영역 및/또는 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드는 도 3a 또는 b에 예시된다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 벡터를 제공한다: (i) 서열번호 54 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 리더 서열; (ii) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; (iii) 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 불변 영역; (iv) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 힌지 영역 및 임의로 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지; (v) 서열번호 37 (CD28로부터), 서열번호 38 (CD8로부터), 서열번호 39 (4-1BB로부터), 또는 서열번호 40 (CD3제타로부터)의 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 영역; (vi) 서열번호 41 (4-1BB로부터), 서열번호 42 (CD28로부터), 서열번호 43 (OX40으로부터), 서열번호 44 (CD3제타 ITAM 1, 2 및 3), 서열번호 45 (CD3제타 ITAM 1), 서열번호 46 (CD3제타 ITAM 2) 및/또는 서열번호 47 (CD3제타 ITAM 3)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 세포내 서열 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함하는 세포내 영역; (vii) 서열번호 57, 58, 59 또는 60의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 자기-절단 서열; (viii) 서열번호 55 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 리더 서열; (ix) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; 및 (x) 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 핵산은 도 3a 또는 b에 예시된 전구체 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 힌지 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 중쇄 리더 영역 및/또는 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 벡터를 제공한다: (i) 경쇄 리더 영역, (ii) 항체 경쇄 가변 영역, (iii) 항체 경쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, (vi) 2 내지 5개의 세포내 서열을 갖는 세포내 영역, (vii) 자기-절단 서열 영역, (viii) 중쇄 리더 영역, (ix) 항체 중쇄 가변 영역, 및 (x) 항체 중쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드는 힌지 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드는 중쇄 리더 영역 및/또는 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드는 도 4a 또는 b에 예시된다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 첫번째 핵산에 작동가능하게 연결된 첫번째 벡터를 제공한다: (i) 중쇄 리더 영역, (ii) 항체 중쇄 가변 영역, (iii) 항체 중쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, 및 (vi) 세포내 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 벡터는 중쇄 리더 영역을 포함하지 않고/않거나 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 첫번째 핵산에 작동가능하게 연결된다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 도 1a 또는 b에 예시된다.

하나의 실시형태에서, 첫번째 벡터는 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 첫번째 핵산에 작동가능하게 연결된다: (i) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 리더 서열; (ii) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; (iii) 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 불변 영역; (iv) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 힌지 영역 및 임의로 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지; (v) 서열번호 37 (CD28로부터), 서열번호 38 (CD8로부터), 서열번호 39 (4-1BB로부터), 또는 서열번호 40 (CD3제타로부터)의 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 영역; (vi) 서열번호 41 (4-1BB로부터), 서열번호 42 (CD28로부터), 서열번호 43 (OX40으로부터), 서열번호 44 (CD3제타 ITAM 1, 2 및 3), 서열번호 45 (CD3제타 ITAM 1), 서열번호 46 (CD3제타 ITAM 2) 및/또는 서열번호 47 (CD3제타 ITAM 3)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 세포내 서열 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함하는 세포내 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 벡터는 중쇄 리더 영역을 포함하지 않고/않거나 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 첫번째 핵산에 작동가능하게 연결된다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 도 1a 또는 b에 예시된다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 두번째 핵산에 작동가능하게 연결된 두번째 벡터를 제공한다: (i) 경쇄 리더 영역, (ii) 항체 경쇄 가변 영역, 및 (iii) 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 두번째 벡터는 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 두번째 핵산에 작동가능하게 연결된다. 하나의 실시형태에서, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 도 1a 또는 b에 예시된다.

하나의 실시형태에서, 두번째 벡터는 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 두번째 핵산에 작동가능하게 연결된다: (i) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 리더 서열; (ii) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; 및 (iii) 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 두번째 벡터는 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 두번째 핵산에 작동가능하게 연결된다. 하나의 실시형태에서, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 도 1a 또는 b에 예시된다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 첫번째 핵산에 작동가능하게 연결된 첫번째 벡터를 제공한다: (i) 경쇄 리더 영역, (ii) 항체 경쇄 가변 영역, (iii) 항체 경쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, 및 (vi) 세포내 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 벡터는 중쇄 리더 영역을 포함하지 않고/않거나 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 첫번째 핵산에 작동가능하게 연결된다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 도 2a 또는 b에 예시된다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 첫번째 핵산에 작동가능하게 연결된 첫번째 벡터를 제공한다: (i) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 리더 서열; (ii) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; (iii) 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 불변 영역; (iv) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 힌지 영역 및 임의로 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지; (v) 서열번호 37 (CD28로부터), 서열번호 38 (CD8로부터), 서열번호 39 (4-1BB로부터), 또는 서열번호 40 (CD3제타로부터)의 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 영역; (vi) 서열번호 41 (4-1BB로부터), 서열번호 42 (CD28로부터), 서열번호 43 (OX40으로부터), 서열번호 44 (CD3제타 ITAM 1, 2 및 3), 서열번호 45 (CD3제타 ITAM 1), 서열번호 46 (CD3제타 ITAM 2) 및/또는 서열번호 47 (CD3제타 ITAM 3)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 세포내 서열 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함하는 세포내 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 벡터는 경쇄 리더 영역을 포함하지 않고/않거나 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 첫번째 핵산에 작동가능하게 연결된다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 도 2a 또는 b에 예시된다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 두번째 핵산에 작동가능하게 연결된 두번째 벡터를 제공한다: (i) 중쇄 리더 영역, (ii) 항체 중쇄 가변 영역, 및 (iii) 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 두번째 벡터는 중쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 두번째 핵산에 작동가능하게 연결된다. 하나의 실시형태에서, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 도 2a 또는 b에 예시된다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 두번째 핵산에 작동가능하게 연결된 두번째 벡터를 제공한다: (i) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 리더 서열; (ii) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; 및 (iii) 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 두번째 벡터는 중쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 두번째 핵산에 작동가능하게 연결된다. 하나의 실시형태에서, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 도 2a 또는 b에 예시된다.

본원 개시내용은 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 벡터를 제공한다: (a) 첫번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하고: (i) 중쇄 리더 서열, (ii) 항체 중쇄 가변 영역, (iii) 항체 중쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, 및 (vi) 2 내지 5개의 세포내 서열을 갖는 세포내 영역; 및 (b) 두번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다: (i) 항체 경쇄 가변 영역, 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 중쇄 리더 영역을 포함하지 않고/않거나 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 핵산은 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄는 도 1a 또는 b에 예시된다.

본원 개시내용은 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 벡터를 제공한다: (a) 첫번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드를 암호화하고: (i) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 리더 서열; (ii) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; (iii) 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 불변 영역; (iv) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 힌지 영역 및 임의로 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지; (v) 서열번호 37 (CD28로부터), 서열번호 38 (CD8로부터), 서열번호 39 (4-1BB로부터), 또는 서열번호 40 (CD3제타로부터)의 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 영역; (vi) 서열번호 41(4-1BB로부터), 서열번호 42 (CD28로부터), 서열번호 43 (OX40으로부터), 서열번호 44 (CD3제타 ITAM 1, 2 및 3), 서열번호 45 (CD3제타 ITAM 1), 서열번호 46 (CD3제타 ITAM 2) 및/또는 서열번호 47 (CD3제타 ITAM 3)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 세포내 서열 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함하는 세포내 영역; 및 (b) 두번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드를 암호화한다: (i) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 리더 서열; (ii) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; 및 (iii) 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 중쇄 리더 영역을 포함하지 않고/않거나 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 핵산은 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄는 도 1a 또는 b에 예시된다.

본원 개시내용은 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 벡터를 제공한다: (a) 첫번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하고: (i) 경쇄 리더 서열, (ii) 항체 경쇄 가변 영역, (iii) 항체 경쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, 및 (vi) 2 내지 5개의 세포내 서열을 갖는 세포내 영역; 및 (b) 두번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다: (i) 항체 중쇄 가변 영역, 및 (ii) 항체 중쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 경쇄 리더 영역을 포함하지 않고/않거나 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 핵산은 중쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄는 도 2a 또는 b에 예시된다.

본원 개시내용은 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 벡터를 제공한다: (a) 첫번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드를 암호화하고: (i) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 리더 서열; (ii) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; (iii) 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 불변 영역; (iv) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 힌지 영역 및 임의로 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지; (v) 서열번호 37 (CD28로부터), 서열번호 38 (CD8로부터), 서열번호 39 (4-1BB로부터), 또는 서열번호 40 (CD3제타로부터)의 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 영역; (vi) 서열번호 41 (4-1BB로부터), 서열번호 42 (CD28로부터), 서열번호 43 (OX40으로부터), 서열번호 44 (CD3제타 ITAM 1, 2 및 3), 서열번호 45 (CD3제타 ITAM 1), 서열번호 46 (CD3제타 ITAM 2) 및/또는 서열번호 47 (CD3제타 ITAM 3)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 세포내 서열 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함하는 세포내 영역; 및 (b) 두번째 핵산은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드를 암호화한다: (i) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 리더 서열; (ii) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; 및 (iii) 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 경쇄 리더 영역을 포함하지 않고/않거나 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 핵산은 중쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄는 도 2a 또는 b에 예시된다.

숙주 세포

본원 개시내용은 본원에 기재된 첫번째 폴리펩타이드 쇄, 두번째 폴리펩타이드 쇄, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄, 이량체성 항원 수용체 또는 전구체 폴리펩타이드 중 어느 것을 암호화하는 핵산 전이유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단을 제공한다.

하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은 하나 이상의 발현 벡터와 함께 도입되고, 여기서, 벡터는 본원에 기재된 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물 중 어느 것을 암호화하는 핵산 전이유전자에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은 T 림프구 (예를 들면, T 세포, 조절 T 세포, 감마-델타 T 세포, 및 세포독성 T 세포), NK (자연 킬러) 세포, 대식세포, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구, B 림프구, 단핵구를 포함한다. 하나의 실시형태에서, NK 세포는 제대혈-유래된 NK 세포, 또는 태반 유래된 NK 세포를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은 자가이고, 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현하는 숙주 세포의 처리를 받는 대상자 (예를 들면, 수령자 대상자)로부터 유래된다. 하나의 실시형태에서, 혈액 (예를 들면, 전혈)을 수령자 대상자로부터 입수할 수 있고, 목적하는 세포 (예를 들면, T 세포)는 수령자 대상자의 혈액로부터 회수/풍부화될 수 있고, 자가 유전자삽입 세포는 본원에 기재된 이량체성 항원 수용체 중 어느 것을 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발현 벡터를 목적하는 세포 내로 도입하여 제조할 수 있다. 이량체성 항원 수용체 작제물을 발현하는 자가 유전자삽입 T 세포를 수령자 대상자에게 투여하는 것은 대상자에서 이식편 대 숙주 질환을 크게 줄일 수 있다.

하나의 실시형태에서, 대상자를 치료하기 위해 사용되는 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은 동종이형이고, 상이한 대상자 (예를 들면, 공여자 대상자)로부터 또는 다수 공여자 대상자로부터 유래된다. 하나의 실시형태에서, 공여자 대상자(들)은 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현하는 숙주 세포의 처리를 받지 못할 것이다. 하나의 실시형태에서, 동종이형 숙주 세포는 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현하는 숙주 세포의 처리를 받지 못하는 동일한 쌍둥이 공여자로부터 유래된 유전적 동계의 숙주 세포를 포함한다. 동종이형 세포는 자가 세포에 이용되는 유사한 방식으로 적어도 하나의 공여자로부터의 혈액 (예를 들면, 전혈)으로부터 입수할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 혈액 (예를 들면, 전혈)을 적어도 하나의 공여자로부터 입수할 수 있고, 목적하는 세포는 공여자의 (또는 공여자들의) 혈액으로부터 회수/풍부화될 수 있고, 동종이형 유전자삽입 세포는 공여자의 (또는 공여자들의) 목적하는 세포 내로 본원에 기재된 이량체성 항원 수용체 중 어느 것을 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발현 벡터를 도입하여 제조할 수 있다. 이량체성 항원 수용체 작제물을 발현하는 동종이형 유전자삽입 T 세포를 대상자에게 투여하는 것은 대상자에서 이식편 대 숙주 질환을 야기할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 대상자의 혈액으로부터, 또는 공여자의 혈액으로부터 회수된 목적하는 세포는, T 림프구 (예를 들면, T 세포, 조절 T 세포, 감마-델타 T 세포, 및 세포독성 T 세포), NK (자연 킬러) 세포, 대식세포, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구, B 림프구, 단핵구를 포함한다. 하나의 실시형태에서, NK 세포는 제대혈-유래된 NK 세포, 또는 태반 유래된 NK 세포를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은 숙주 세포 내로 전이유전자의 일과성 도입 또는 숙주 세포의 게놈 내로 전이유전자의 안정한 삽입을 지시할 수 있는 하나 이상의 발현 벡터를 보유하고, 여기서, 전이유전자는 본원에 기재된 이량체성 항원 수용체 중 어느 것을 암호화하는 핵산을 포함한다. 발현 벡터(들)는 숙주 세포에서 전이유전자의 전사 및/또는 번역을 지시할 수 있다. 발현 벡터는 하나 이상의 조절 서열, 예를 들면, 유발가능 및/또는 구성적 프로모터 및 인핸서를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 리보솜 결합 부위 및/또는 폴리아데닐화 부위를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 벡터는, 유전자삽입 숙주 세포의 표면 상에 나타날 수 있는 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물의 생산을 지시할 수 있거나, 이량체성 항원 수용체는 세포 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 이량체성 항원 수용체 중 어느 것을 암호화하는 핵산 전이유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발현 벡터를 보유할 수 있고, 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하여 일시적으로 또는 안정하게 이량체성 항원 수용체 작제물을 발현시킬 수 있다.

하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은 바이러스, 예를 들면 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스로부터 유래된 핵산 백본 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 보유한다. 하나의 실시형태에서, 발현 벡터는 전이유전자의 숙주 세포의 게놈 내로 삽입 또는 대치를 위해 CRISPR (cluster regularly interspaced short palindromic repeats) 시스템과 함께 사용하는 상동 지시된 복구를 위한 전이유전자 및 서열을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, CRISPR 시스템에서 사용되는 전이유전자는 이량체성 항원 수용체의 구성적 또는 유발가능 전사를 매개하기 위해 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 하나의 실시형태에서, CRISPR은 Cas9 또는 Cpf1 (Cas12a)을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 발현 벡터는 전이유전자를 유전자전위효소-기반 시스템과 함께 사용하기 위해 전위유전단위로 포함한다. 유전자전위효소 시스템의 예는 시판되는 시스템, 예를 들면, PIGGYBAC, SUPER PIGGYBAC 및 SLEEPING BEAUTY (SB100X를 포함함)를 포함한다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단을 제공한다: (i) 중쇄 리더 영역, (ii) 항체 중쇄 가변 영역, (iii) 항체 중쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, (vi) 2 내지 5개의 세포내 공-자극성 및/또는 신호전달 서열을 갖는 세포내 영역, (vii) 자기-절단 서열 영역, (viii) 경쇄 리더 영역, (ix) 항체 경쇄 가변 영역, 및 (x) 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 힌지 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 중쇄 리더 영역 및/또는 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드는 도 3a 또는 b에 예시된다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은, 서열번호 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81 또는 84의 아미노산 서열을 갖는 전구체 폴리펩타이드 중 어느 하나를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 벡터를 보유한다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은, 전구체 폴리펩타이드를 발현한다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단을 제공한다: (i) 경쇄 리더 영역, (ii) 항체 경쇄 가변 영역, (iii) 항체 경쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, (vi) 2 내지 5개의 세포내 공-자극성 및/또는 신호전달 서열을 갖는 세포내 영역, (vii) 자기-절단 서열 영역, (viii) 중쇄 리더 영역, (ix) 항체 중쇄 가변 영역, 및 (x) 항체 중쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 힌지 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 중쇄 리더 영역 및/또는 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 전구체 폴리펩타이드는 도 4a 또는 b에 예시된다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은, 전구체 폴리펩타이드를 발현하다.

하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 벡터를 보유한다: (a) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 중쇄 리더 서열, (ii) 항체 중쇄 가변 영역, (iii) 항체 중쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, 및 (vi) 2 내지 5개의 세포내 서열을 갖는 세포내 영역; 및 (b) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 경쇄 가변 영역, 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 중쇄 리더 영역을 포함하지 않고/않거나 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 도 1a 또는 b에 예시된다. 하나의 실시형태에서, 두번째 핵산은 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 도 1a 또는 b에 예시된다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 발현한다.

하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은, 다음을 포함하는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 벡터를 보유한다: (a) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 경쇄 리더 서열, (ii) 항체 경쇄 가변 영역, (iii) 항체 경쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, 및 (vi) 2 내지 5개의 세포내 서열을 갖는 세포내 영역; 및 (b) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 중쇄 가변 영역, 및 (ii) 항체 중쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 중쇄 리더 영역을 포함하지 않고/않거나 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 도 2a 또는 b에 예시된다. 하나의 실시형태에서, 두번째 핵산은 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 도 2a 또는 b에 예시된다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 발현한다.

하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은, 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 첫번째 발현 벡터를 보유하고, 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 두번째 발현 벡터를 보유한다: (a) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 중쇄 리더 서열, (ii) 항체 중쇄 가변 영역, (iii) 항체 중쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, 및 (vi) 2 내지 5개의 세포내 서열을 갖는 세포내 영역; 및 (b) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 경쇄 가변 영역, 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 중쇄 리더 영역을 포함하지 않고/않거나 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 도 1a 또는 b에 예시된다. 하나의 실시형태에서, 두번째 핵산은 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 도 1a 또는 b에 예시된다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 발현한다.

하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은, 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 첫번째 발현 벡터를 보유하고, 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 두번째 발현 벡터를 보유한다: (a) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 경쇄 리더 서열, (ii) 항체 경쇄 가변 영역, (iii) 항체 경쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, 및 (vi) 2 내지 5개의 세포내 서열을 갖는 세포내 영역; 및 (b) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 중쇄 가변 영역, 및 (ii) 항체 중쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 중쇄 리더 영역을 포함하지 않고/않거나 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 도 2a 또는 b에 예시된다. 하나의 실시형태에서, 두번째 핵산은 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 도 2a 또는 b에 예시된다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은, 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 발현한다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 첫번째 발현 벡터를 보유하는 첫번째 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 첫번째 집단을 제공한다: (i) 중쇄 리더 영역, (ii) 항체 중쇄 가변 영역, (iii) 항체 중쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, 및 (vi) 세포내 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 중쇄 리더 영역을 포함하지 않고/않거나 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 도 1a 또는 b에 예시된다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 첫번째 집단은, 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 발현한다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 두번째 발현 벡터를 보유하는 두번째 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 두번째 집단을 제공한다: (i) 경쇄 리더 영역, (ii) 항체 경쇄 가변 영역, 및 (iii) 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 두번째 핵산은 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 도 1a 또는 b에 예시된다. 하나의 실시형태에서, 두번째 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 두번째 집단은, 두번째 폴리펩타이드 쇄를 발현한다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 첫번째 발현 벡터를 보유하는 첫번째 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 첫번째 집단을 제공한다: (i) 경쇄 리더 영역, (ii) 항체 경쇄 가변 영역, (iii) 항체 경쇄 불변 영역, (iv) 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, 및 (vi) 세포내 영역. 하나의 실시형태에서, 첫번째 핵산은 중쇄 리더 영역을 포함하지 않고/않거나 힌지 영역을 포함하지 않는 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 폴리펩타이드 쇄는 도 2a 또는 b에 예시된다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 첫번째 집단은, 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 발현한다.

본원 개시내용은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 두번째 발현 벡터를 보유하는 두번째 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 두번째 집단을 제공한다: (i) 중쇄 리더 영역, (ii) 항체 중쇄 가변 영역, 및 (iii) 항체 경쇄 불변 영역. 하나의 실시형태에서, 두번째 핵산은 경쇄 리더 영역을 포함하지 않는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 폴리펩타이드 쇄는 도 1a 또는 b에 예시된다. 하나의 실시형태에서, 두번째 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 두번째 집단은, 두번째 폴리펩타이드 쇄를 발현한다.

본원 개시내용은 이량체성 항원 수용체를 암호화하는 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 적어도 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단을 제공하고, 여기서, 핵산(들)은 전구체 폴리펩타이드를 암호화하거나, 첫번째 및/또는 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화한다.

하나의 실시형태에서, BCMA 항체 중쇄 가변 영역은 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

하나의 실시형태에서, BCMA 항체 중쇄 불변 영역은 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 힌지 영역 및 임의로 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지 영역을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 막횡단 영역은 서열번호 37 (CD28로부터), 서열번호 38 (CD8로부터), 서열번호 39 (4-1BB로부터), 또는 서열번호 40 (CD3제타로부터)의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 CD28 막횡단 영역을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 세포내 영역은 서열번호 41 (4-1BB로부터), 서열번호 42 (CD28로부터), 서열번호 43 (OX40으로부터), 서열번호 44 (CD3제타 ITAM 1, 2 및 3), 서열번호 45 (CD3제타 ITAM 1), 서열번호 46 (CD3제타 ITAM 2) 및/또는 서열번호 47 (CD3제타 ITAM 3)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2 내지 5개의 세포내 서열을 임의의 순서 및 임의의 조합으로 포함한다.

하나의 실시형태에서, BCMA 항체 경쇄 가변 영역은 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

하나의 실시형태에서, BCMA 항체 경쇄 불변 영역은 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 중쇄 리더 서열은 서열번호 54 또는 56의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 경쇄 리더 서열은 서열번호 55 또는 56의 아미노산 서열을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 자기-절단 서열은 서열번호 57, 58, 59 또는 60 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

조성물 및 약제학적 조성물

본원 개시내용은 V1, V2a, V2b, V2c, V3a, V3b, V3c 또는 V4 이량체성 항원 수용체 (DAR) 중 어느 하나를 포함하는 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물 중 어느 하나를 발현시키기 위해 조작되는 유전자삽입 숙주 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 집단의 선택을 치료될 질환의 유형 및/또는 대상자에서 목적하는 반응 유형을 기초로 할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 조성물은 V1, V2a, V2b, V2c, V3a, V3b, V3c 또는 V4 이량체성 항원 수용체 (DAR) 중 어느 하나를 포함하는 BCMA 항원에 결합하는 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현하는 다수의 유전자삽입 숙주 세포를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 다수의 유전자삽입 숙주 세포는, 유전자삽입 숙주 세포에 의해 발현되고 프로세싱되어 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드를 생성할 수 있고, 서로 회합되어 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 형성할 수 있는, 본원에 기재된 첫번째 폴리펩타이드 쇄 또는 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 전구체 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것을 암호화하는 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 발현 벡터를 보유한다. 하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 집단은 약제학적으로-허용되는 부형제와 혼합된다.

본원 개시내용은 상이한 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 발현하는 유전자삽입 숙주 세포의 2개 이상의 집단의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 조성물은 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 및 두번째 집단을 포함하고, 여기서, 첫번째 및 두번째 집단을 조작하여 상이한 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 발현시켰다. 하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 및 두번째 집단의 선택은 치료될 질환의 유형 및/또는 대상자에서 목적하는 반응 유형을 기초로 할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 조성물은 V1, V2a, V2b, V2c, V3a, V3b, V3c 또는 V4 이량체성 항원 수용체 (DAR) 중 어느 하나를 포함하는 BCMA 항원에 결합하는 첫번째 유형의 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현하는 다수의 첫번째 유전자삽입 숙주 세포를 포함하는 첫번째 집단을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 다수의 첫번째 유전자삽입 숙주 세포는 본원에 기재된 첫번째 폴리펩타이드 쇄 또는 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 전구체 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것을 암호화하는 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 발현 벡터를 보유하고, 여기서, 핵산(들)은 유전자삽입 숙주 세포에 의해 발현될 수 있고, 발현된 폴리펩타이드(들)은 유전자삽입 숙주 세포에 의해 프로세싱하여 서로 회합되어 첫번째 유형의 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 형성하는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 집단은 약제학적으로-허용되는 부형제와 혼합된다.

하나의 실시형태에서, 조성물은 V1, V2a, V2b, V2c, V3a, V3b, V3c 또는 V4 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 포함하는 BCMA 항원에 결합하는 두번째 유형의 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현할 수 있는 다수의 두번째 유전자삽입 숙주 세포를 포함하는 두번째 집단을 포함하고, 여기서, 두번째 유형의 이량체성 항원 수용체 (DAR)는 첫번째 유형의 이량체성 항원 수용체 (DAR)와 상이하다. 하나의 실시형태에서, 다수의 두번째 유전자삽입 숙주 세포는 본원에 기재된 첫번째 폴리펩타이드 쇄 또는 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 전구체 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것을 암호화하는 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 발현 벡터를 보유하고, 여기서, 핵산(들)은 유전자삽입 숙주 세포에 의해 발현될 수 있고, 발현된 폴리펩타이드(들)는 유전자삽입 숙주 세포에 의해 프로세싱하여 서로 회합되어 두번째 유형의 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 형성하는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 두번째 집단은 약제학적으로-허용되는 부형제와 혼합된다.

하나의 실시형태에서, 조성물에 대한 첫번째 및 두번째 DAR-발현 유전자삽입 숙주 세포의 유형의 선택은, 예를 들면, 세포 사멸 능력, 기억 T 세포를 발달시키는 능력, 시험관내 확장 능력, 생체내 지속성 능력, 감소된 T 세포 탈진 성질, 및/또는 냉동보존 성질을 포함하는 DAR T 세포의 임의의 특성을 기초로 할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 집단은 (i) CD28 세포내 서열을 갖는 세포내 영역 및 (ii) CD3제타 ITAM 1, 2 및 3, 또는 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는 V1, V2b 또는 V3b 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현할 수 있다. 하나의 실시형태에서, V1-, V2b- 또는 V3b-발현 유전자삽입 숙주 세포 (예를 들면, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 집단)는 대상자에게 투여되는 경우 강력하고 신속한 이펙터 반응을 유도할 수 있고, 여기서, 반응은 선택된 DAR T 세포의 CD28 세포내 영역에 의해 매개될 수 있다.

하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 두번째 집단은 (i) 4-1BB 세포내 서열을 갖는 세포내 영역 및 (ii) CD3제타 ITAM 1, 2 및 3, 또는 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는 V2a, V3a 또는 V4 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현할 수 있다. 하나의 실시형태에서, V2a-, V3a- 또는 V4-발현 유전자삽입 숙주 세포 (예를 들면, 유전자삽입 숙주 세포의 두번째 집단)는 대상자에게 투여되는 경우 더 길게-지속되는 기억 T 세포 집단의 발달을 유도할 수 있고, 여기서, DAR T 세포의 성질은 선택된 DAR T 세포의 4-1BB 세포내 영역에 의해 매개될 수 있다.

하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 또는 두번째 집단은 (i) CD28 및 4-1BB 세포내 서열을 갖는 세포내 영역 및 (ii) CD3제타 ITAM 1, 2 및 3, 또는 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는 V2c 또는 V3c 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현할 수 있다. 하나의 실시형태에서, V2c- 또는 V3c-발현 유전자삽입 숙주 세포 (예를 들면, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 또는 두번째 집단)는 대상자에서 강력하고 신속한 이펙터 반응, 및 더 길게-지속되는 기억 T 세포 집단의 발달의 조합을 유도할 수 있고, 여기서, DAR T 세포의 성질은 선택된 DAR T 세포의 CD28 및 4-1BB 세포내 영역에 의해 매개될 수 있다.

본원 개시내용은 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 및 두번째 집단을 적어도 포함하는 유전자삽입 숙주 세포의 2개 이상의 집단의 혼합물을 포함하는 치료학적 조성물을 제공하고, 여기서, (i) 첫번째 집단은, 다수의 첫번째 유전자삽입 숙주 세포에 의해 발현되고 프로세싱되어 서로 회합되어 첫번째 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 형성하는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드를 생성할 수 있는, 본원에 기재된 첫번째 폴리펩타이드 쇄 또는 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 전구체 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것을 암호화하는 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 발현 벡터를 보유하는 첫번째 다수의 유전자삽입 숙주 세포를 포함하고, (ii) 두번째 집단은, 다수의 두번째 유전자삽입 숙주 세포에 의해 발현되고 프로세싱되어 서로 회합되어 첫번째 이량체성 항원 수용체 (DAR)과 상이한 두번째 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 형성하는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드를 생성할 수 있는, 본원에 기재된 첫번째 폴리펩타이드 쇄 또는 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 전구체 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것을 암호화하는 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 발현 벡터를 보유하는 두번째 다수의 유전자삽입 숙주 세포를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 첫번째 다수의 숙주 세포는 V1, V2a, V2b, V2c, V3a, V3b, V3c 또는 V4를 포함하는 첫번째 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 발현하다. 하나의 실시형태에서, 두번째 다수의 숙주 세포는 V1, V2a, V2b, V2c, V3a, V3b, V3c 또는 V4를 포함하는 두번째 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 발현하고, 여기서, 두번째 DAR 작제물은 첫번째 DAR 작제물과 상이하다. 하나의 실시형태에서, 치료학적 조성물은 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 집단의 첫번째 양, 및 유전자삽입 숙주 세포의 두번째 집단의 두번째 양을 포함하고, 여기서, 첫번째 및 두번째 양은 동일하거나 상이하다. 하나의 실시형태에서, 치료학적 조성물은 추가로 약제학적으로-허용되는 부형제를 포함한다.

치료 방법

본원 개시내용은 추가로 V1, V2a, V2b, V2c, V3a, V3b, V3c 또는 V4 DAR 작제물 중 어느 하나를 포함하는 항-BCMA 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물 중 어느 하나를 발현시키기 위해 조작된 유전자삽입 숙주 세포의 집단의 유효량을 대상자에게 투여하여 입양 세포요법을 수행하는 방법을 제공한다. DAR-발현 유전자삽입 숙주 세포의 선택은 치료될 질환의 유형 및 대상자에서 목적하는 반응 유형을 기초로 할 수 있다.

본원 개시내용은 추가로 종양 항원의 유해한 발현 (예를 들면, 상승된 발현)과 연관된 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상자의 치료 방법을 제공한다. 이러한 방법은 본원에 기재된 첫번째 폴리펩타이드 쇄 또는 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 전구체 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것을 암호화하는 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포의 집단의 유효량을 대상자에게 투여함을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은 본원에 기재된 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 전구체 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것을 발현한다.

본원 개시내용은 유전자삽입 숙주 세포의 적어도 2개의 집단의 조합의 유효량을 대상자에게 투여하여 입양 세포요법을 수행하는 방법을 제공하고, 여기서, 각각의 집단은 상이한 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 발현하도록 조작되었다. 하나의 실시형태에서, 입양 세포요법을 수행하는 방법은 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 및 두번째 집단의 조합의 유효량을 대상자에게 투여함을 포함하고, 여기서, 첫번째 및 두번째 집단은 상이한 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 발현시키기 위해 조작되었다. 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 및 두번째 집단의 선택은 치료될 질환의 유형 및/또는 대상자에서 목적하는 반응 유형을 기초로 할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 첫번째 집단은, V1, V2a, V2b, V2c, V3a, V3b, V3c 또는 V4 이량체성 항원 수용체 (DAR) 중 어느 하나를 포함하는 BCMA 항원에 결합하는 첫번째 유형의 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현하는 다수의 첫번째 유전자삽입 숙주 세포를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 다수의 첫번째 유전자삽입 숙주 세포는 본원에 기재된 첫번째 폴리펩타이드 쇄 또는 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 전구체 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것을 암호화하는 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 발현 벡터를 보유하고, 여기서, 핵산(들)은 유전자삽입 숙주 세포에 의해 발현될 수 있고, 발현된 폴리펩타이드(들)는 유전자삽입 숙주 세포에 의해 프로세싱하여 서로 회합되어 첫번째 유형의 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 형성하는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 집단은 약제학적으로-허용되는 부형제와 혼합된다.

하나의 실시형태에서, 두번째 집단은 V1, V2a, V2b, V2c, V3a, V3b, V3c 또는 V4 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 포함하는 BCMA 항원에 결합하는 두번째 유형의 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현할 수 있는 다수의 두번째 유전자삽입 숙주 세포를 포함하고, 여기서, 두번째 유형의 이량체성 항원 수용체 (DAR)는 첫번째 유형의 이량체성 항원 수용체 (DAR)와 상이하다. 하나의 실시형태에서, 다수의 두번째 유전자삽입 숙주 세포는 본원에 기재된 첫번째 폴리펩타이드 쇄 또는 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것, 또는 전구체 폴리펩타이드 쇄 중 어느 것을 암호화하는 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 발현 벡터를 보유하고, 여기서, 핵산(들)은 유전자삽입 숙주 세포에 의해 발현될 수 있고, 발현된 폴리펩타이드(들)는 유전자삽입 숙주 세포에 의해 프로세싱하여 서로 회합되어 두번째 유형의 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 형성하는 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 두번째 집단은 약제학적으로-허용되는 부형제와 혼합된다.

하나의 실시형태에서, 대상자에게 투여하기 위한 첫번째 및 두번째 DAR-발현 유전자삽입 숙주 세포의 유형의 선택은, 예를 들면, 세포 사멸 능력, 기억 T 세포를 발달시키는 능력, 시험관내 확장 능력, 생체내 지속성 능력, 감소된 T 세포 탈진 성질, 및/또는 냉동보존 성질을 포함하는 DAR T 세포의 임의의 특성을 기초로 할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 집단은, (i) CD28 세포내 서열을 갖는 세포내 영역 및 (ii) CD3제타 ITAM 1, 2 및 3, 또는 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는 V1, V2b 또는 V3b 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현할 수 있다. 하나의 실시형태에서, V1-, V2b- 또는 V3b-발현 유전자삽입 숙주 세포 (예를 들면, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 집단)를 선택된 DAR T 세포의 CD28 세포내 영역에 의해 매개될 수 있는 대상자에서 강력하고 신속한 이펙터 반응을 유도할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 두번째 집단은 (i) 4-1BB 세포내 서열을 갖는 세포내 영역 및 (ii) CD3제타 ITAM 1, 2 및 3, 또는 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는 V2a, V3a 또는 V4 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현할 수 있다. 하나의 실시형태에서, V2a-, V3a- 또는 V4-발현 유전자삽입 숙주 세포 (예를 들면, 유전자삽입 숙주 세포의 두번째 집단)는 선택된 DAR T 세포의 4-1BB 세포내 영역에 의해 매개될 수 있는 대상자에서 더 길게-지속되는 기억 T 세포 집단의 발달을 유도할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 또는 두번째 집단은, (i) CD28 및 4-1BB 세포내 서열을 갖는 세포내 영역 및 (ii) CD3제타 ITAM 1, 2 및 3, 또는 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는, V2c 또는 V3c 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현할 수 있다. 하나의 실시형태에서, V2c- 또는 V3c-발현 유전자삽입 숙주 세포 (예를 들면, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 또는 두번째 집단)를, 선택된 DAR T 세포의 CD28 및 4-1BB 세포내 영역에 의해 매개될 수 있는 대상자에서 강력하고 신속한 이펙터 반응, 및 더 길게-지속되는 기억 T 세포 집단의 발달과 조합하여 유도할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 및 두번째 집단을 대상자에게 동일한 시간에 (예를 들면, 동시에 또는 본질적으로 동시에) 투여할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 및 두번째 집단을 대상자에게 순차적으로 어떤 순서로든 투여할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 및 두번째 집단의 동일한 용량 또는 상이한 용량을 대상자에게 투여할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 및 두번째 집단의 단일 용량을 대상자에게 투여할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 및 두번째 집단의 적어도 2개의 용량을 대상자에게 투여할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 대상자에게 투여되는 유전자삽입 숙주 세포의 첫번째 및 두번째 집단의 용량의 수는 동일하거나 상이할 수 있다.

본원 개시내용은 종양 항원의 유해한 발현과 연관된 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상자의 치료 방법을 제공하고, 여기서, 장애는, 이에 제한되는 것은 아니지만 혈액 암, 유방 암, 난소 암, 전립선 암, 두경부 암, 폐 암, 방광 암, 흑색종, 직장결장 암, 췌장 암, 폐 암, 간 암, 신장 암, 식도 암, 평활근종, 평활근육종, 신경아교종, 및 아교모세포종을 포함하는 암이다.

하나의 실시형태에서, 암은 비호지킨 림프종 (NHL), 버킷림프종 (BL), B 만성 림프구 백혈병 (B-CLL), B 및 T 급성 림프구 백혈병 (ALL), T 세포 림프종 (TCL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 털세포 백혈병 (HCL), 호지킨 림프종 (HL), 만성 골수성 백혈병 (CML) 및 다발 골수종 (MM)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 혈액암이다. 일부 실시형태에서, 암은 BCMA-양성 암, 예를 들면, BCMA-양성 혈액암, 예를 들면, BCMA-양성 B-세포 혈액암 (예를 들면, 림프종 (예를 들면, NHL), 백혈병 (예를 들면, CLL), 또는 골수종이다.

실시예

하기 실시예는 예시하는 것을 의도하고, 본원 개시내용의 실시형태를 추가로 이해하기 위해 사용할 수 있고, 어떠한 방식으로든 당해 교시의 범위를 제한하는 것으로 간주하여서는 안된다.

실시예 1: 사람 PBMC 세포 및 일차적 T 세포의 단리

일차적 사람 T 세포를 백혈구연층 (San Diego blood bank), 신선한 혈액 또는 백혈구성분채집 제품 (StemCell)으로부터의 건강한 사람 공여자로부터 단리하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다.

공여자 1 세포의 제조: EASYSEP 사람 T 세포 단리 키트 (제조원: STEMCELL Technologies, 카탈로그 번호 17951)를 사용하는 자기 음성 선택에 의해 또는 양성 선택에 의해 및 DYNABEADS Human T-Expander CD3/CD28 (제조원: Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 11141D)에 의한 활성화에 의해 제조자의 지시에 따라서 PBMC로부터 T 세포를 단리하였다. 공여자 1 세포를 BCMA CAR 또는 DAR을 암호화하는 핵산과 함께 도입하여 CAR 또는 DAR 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포를 생성하였다. 유전자삽입 세포를 검정을 위해 사용하여 도 5a-11에 제시된 데이터를 생성하였다.

공여자 2 세포의 제조: 단핵구를 고갈시키기 위해, PBMC를 세포 배양 코팅된 플라스크에서 1 내지 2 시간 동안 플레이팅하였다. 비점착성 림프구를 플라스크로부터 세척 제거하고, T 세포 TRANSACT (제조원: Miltenyi, 카탈로그 번호 130-111-160)를 사용하여 새 플라스크에서 제조자의 지시에 따라서 활성화시켰다. 공여자 2 세포를 BCMA CAR 또는 DAR을 암호화하는 핵산와 함께 도입하여 CAR 또는 DAR 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포를 생성하였다. 유전자삽입 세포를 검정을 위해 사용하여 도 12-15에 제시된 데이터를 생성하였다.

실시예 2: 일차적 T 세포 배양

일차적 T 세포를 300U/mL IL-2 (Proleukin)와 함께 5% CTS Immune Cell SR (Thermo Fisher Scientific)로 보충된 CTS OPTMIZER T Cell Expansion SFM에서 mL당 10⁶ 세포의 밀도로 배양하였다. 단리된 T 세포를 신선하게 또는 냉동된 탱크에서 자극하였다. 세포를 T Cell TRANSACT (Miltenyi)로 mL당 3uL/ 10⁶ 세포로 2 내지 3 일 동안 활성화하였다. 형질감염 후, T 세포를 300U/mL에서 IL-2를 갖는 배지에서 배양하였다.

실시예 3: CAR 및 DAR T 세포의 제조

활성화된 T 세포 (대략 9 x 10⁶ 세포)를 CAR 작제물 또는 전구체 DAR을 암호화하는 핵산과 함께 도입하였다. 이들의 각각의 힌지 및 세포내 영역을 갖는 BCMA CAR 및 BCMA DAR 작제물의 명명 지정을, 하기 표 1에 열거한다.

유전자삽입 CAR 및 DAR T 세포를 신선하게 사용하거나, 향후 사용을 위해 냉동보존하였다. 냉동보존된 CAR 및 DAR T 세포의 경우, 세포를 냉동 배지 (70% AIM-V 배지, 20% FBS 및 10% DMSO)에서 재-현탁하고, 멸균 원심분리 튜브로 이동시키고, 1300 RPM에서 4℃에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 폐기하였다. 세포 펠릿을 2 mL 냉동 배지를 1 x 10⁸ 세포까지 첨가하여 신속하게 재-현탁시켰다. 세포를 밤새 -80℃에서 냉동시켰다. 세포를 -150℃로, 전형적으로 1-2 개월 내에 이동시켰다.

세포를 해동하기 위해, 세포를 -150℃ 냉동고로부터 제거하고, 수욕 중에 37℃에서 해동될 때까지 유지하였다. 해동된 세포를 멸균 원심분리 튜브로 50 mL DPBS와 함께 이동하고, 1300 RPM에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 폐기하였다. 신선한 DPBS를 첨가하여 세포를 재-현탁하였다. 세포를 계수하였다. 세포 농도를 필요한 경우 조정하고, 30 um 세포 여과기를 통해 여과하였다. 세포를 사용할 때까지 얼음 위에 위치시켰다. CAR 및 DAR T 세포를 -80℃에서 2 개월 이하 동안, 또는 -150℃에서 4개월 내지 6개월 이하 동안 저장하고, 여전히 우수한 시험관내 및 생체내 종양 사멸 능력을 나타내었다.

실시예 4: 종양 세포주

다발 골수종 세포주 RPMI 8226을 ATCC로부터 입수하고, 루시퍼라제 및 GFP 유전자를 운반하는 렌티바이러스를 사용하여 형질도입하였다. 루시퍼라제 및 GFP 발현을 갖는 단일 세포 클론을 선택하였다 (RPMI8226-FLuc). K562 세포를 RPE 유전자를 운반하는 렌티바이러스와 함께 형질도입하여 유사하게 K562/RPE 세포를 제조하였다. 둘 다의 세포주를 10% 소태아 혈청(Sigma)이 보충된 RPMI1640 배지 (ATCC)에서 배양하였다.

실시예 5: DAR-발현 T 세포의 형질감염 효율 및 발현 수준

유전자삽입 T 세포로부터의 항-BCMA 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 항-BCMA 이량체성 항원 수용체 (DAR)의 형질감염 및 발현 수준을 유세포분석을 사용하여 비교하였다.

다양한 BCMA (bb2121 또는 2C5) CAR 또는 DAR 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 1)의 형질감염 효율은 서로 유사하다 (도 5a 및 e 11 일째; 도 37 13 일째). BCMA-2C5 CAR (83X)을 발현하는 세포의 세포 확장 수준은 BCMA-bb2121 CAR (42X)의 거의 두배였다. BCMA-2C5 DAR V3b (72X)를 발현하는 세포의 세포 확장 수준은 BCMA-2C5 DAR V2c (57X) 및 V3a (56X)를 발현하는 세포와 비교하여 더 높았다 (도 5b). BCMA bb2121 DAR을 발현하는 유전자삽입 T 세포의 형질감염 효율은 10% 미만이었다 (데이터를 나타내지 않음).

BCMA-2C5 CAR 또는 DAR 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포 (공여자 2)의 형질감염 효율은 가변적이고, 여기서, BCMA-2C5 CAR을 발현하는 T 세포는 BCMA-2C5 V2a (27%) 또는 V3a (17%)를 발현하는 T 세포와 비교하여 더 높은 효율 (62%)을 나타내었다. BCMA-2C5 CAR (72X)을 발현하는 세포의 세포 확장 수준은 BCMA-2C5 DAR V2c (15X) 또는 V3a (49X)를 발현하는 세포와 비교하여 더 높았다 (도 12).

실시예 6: 시험관내 세포독성 검정

CAR, DAR 및 대조군 T 세포를 제조한지 2 내지 3 주 후, 세포에 밤새 IL-2로 영양 기아(nutrient starvation)를 수행하였다. 세포를 BCMA 양성 RPMI-8226/GFP 세포 또는 BCMA 음성 K562/RPE 세포의 표적 세포 혼합물과 공-배양하였다. 이펙터 대 표적 세포의 비는 0.16:1 내지 5:1의 범위였다. 밤새 인큐베이션 후, 세포를 유세포분석하여 GFP 세포 집단을 측정하여 항-BCMA CAR 또는 DAR T 세포에 의한 특이적 표적 세포 사멸을 측정하였다.

BCMA-2C5 CAR (라인 F)을 발현하는 유전자삽입 세포 (공여자 1)는, BCMA-2C5 DAR V3b (라인 E), DAR V3a (라인 D) 및 DAR V3a (라인 B)와 비교하여, 더 높은 수준의 세포 사멸을 나타내었다. BCMA bb2121 CAR (라인 C)을 발현하는 유전자삽입 세포는, BCMA-2C5 DAR V3a (라인 B)와 비교하여, 더 높은 수준의 세포 사멸을 나타내었다 (도 6).

BCMA-2C5 DAR V2a (라인 D)를 발현하는 유전자삽입 세포 (공여자 2)는, BCMA-2C5 DAR V3a (라인 C) 또는 CAR (라인 B)를 발현하는 세포와 비교하여, 더 높은 수준의 세포 사멸을 나타내었다 (도 13). 또한 도 40을 참조한다.

실시예 7: 시험관내 사이토킨 분비 검정

CAR, DAR 및 대조군 T 세포를 제조한지 2 내지 3 주에, 세포에 밤새 IL-2로 영양 기아를 수행하였다. 세포를 BCMA-음성 K562, 또는 BCMA-양성 U266 또는 RPMI8226 세포와 공배양하였다. 이펙터 대 표적 세포의 비는 2:1이었다. 40 시간 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하여 사이토킨 IFN-감마 (ELISA MAX Delux Set, 제조원: BioLegend, 카탈로그 번호 430104) 또는 GM-CSF (Human Gm-CSF Uncoated ELISA 키트, 제조원: Invitrogen/Thermo Fisher, 카탈로그 번호 88-8337)를 검출하기 위한 상청액을 제조자의 지시에 따라 수집하였다.

도 7a에서의 결과는 BCMA-2C5 DAR V3a 또는 V3b을 발현하는 T 세포 (공여자 1)가 RPMI8226 세포와 함께 공-배양하는 경우, BCMA-bb2121 CAR, BCMA-2C5 CAR, 또는 BCMA-2C5 DAR V2c와 비교하여, 더 높은 수준의 IFN-감마를 분비한다는 것을 나타낸다.

도 7b에서의 결과는 BCMA-2C5 DAR V3a 또는 V3b를 발현하는 T 세포 (공여자 1)가 RPMI8226 세포와 함께 공-배양하는 경우, BCMA-bb2121 CAR, BCMA-2C5 CAR, 또는 BCMA-2C5 DAR V2c와 비교하여, 훨씬 더 높은 수준의 GM-CSF를 분비한다는 것을 나타낸다.

실시예 8: 공-배양된 유전자삽입 세포의 시험관내 확장

CAR, DAR 및 대조군 T 세포를 제조한지 2 내지 3 주에, 세포에 밤새 IL-2로 영양 기아를 수행하였다. 세포를 BCMA-음성 K562, 또는 BCMA-양성 U266 또는 RPMI8226 세포와 공-배양하였다. 세포 확장 수준을 유세포분석을 사용하여 측정하였다.

음성 대조군 세포는 거의 없거나 약간 확장을 나타내었다 (도 8a 및 10a). BCMA bb2121 CAR을 발현하는 유전자삽입 세포 (공여자 1)는 RPMI8226 또는 U266 세포와 함께 공-배양하는 경우, K562 세포와 함께 공-배양한 것과 비교하여, 더 높은 확장 수준을 나타내었다 (도 8b및 10b). BCMA-2C5 CAR을 발현하는 유전자삽입 세포는, 비-특이적 반응을 나타내는 RPMI8226, U266 및 K562 세포와 함께 공-배양하는 경우, 예상외로 높은 수준의 확장을 나타내었다 (도 8c). BCMA-2C5 DAR V2c를 발현하는 유전자삽입 세포는 RPMI8226 또는 U266 세포와 함께 공-배양하는 경우, K562 세포와 함께 공-배양한 것과 비교하여, 더 높은 확장 수준을 나타내었다 (도 8d).

도 8a-d로부터 공-배양된 유전자삽입 세포의 세포 확장의 배수-변화는 도 9에서 막대 그래프로 나타낸다. BCMA bb2121 CAR을 발현하는 유전자삽입 세포 (공여자 1)는 RPMI8226 또는 U266 세포와 함께 공-배양하는 경우, BCMA-2C5 DAR V2a를 발현하는 유전자삽입 세포와 비교하여, 더 높은 세포 확장의 배수-변화를 갖는다. BCMA-2C5 CAR을 발현하는 유전자삽입 세포는 매우 낮은 세포 확장의 배수-변화를 갖는다.

BCMA-2C5 DAR V2c를 발현하는 유전자삽입 세포 (공여자 1)는 RPMI8226 또는 U266 세포와 함께 공-배양하는 경우, K562 세포와 함께 공-배양한 것과 비교하여, 더 높은 확장 수준을 나타내었다 (도 10c 및 44e). BCMA-2C5 DAR V2a (도 44a) 또는 BCMA-2C5 DAR V3a (도 10d) 또는 BCMA-2C5 DAR V3b (도 10e)를 발현하는 유전자삽입 세포는 RPMI8226 또는 U266 세포와 함께 공-배양하는 경우, K562 세포와 함께 공-배양한 것과 비교하여, 훨씬 더 높은 확장 수준을 나타내었다.

도 10a-e로부터 공-배양된 유전자삽입 세포의 세포 확장의 배수-변화를 도 11에서 막대 그래프로 나타낸다. BCMA bb2121 CAR을 발현하는 유전자삽입 세포 (공여자 1)는 RPMI8226 세포와 함께 공-배양하는 경우, BCMA-2C5 DAR V2c, V3a 및 V3b를 발현하는 유전자삽입 세포와 비교하여, 더 높은 세포 확장의 배수-변화를 갖는다. BCMA-2C5 DAR V3a를 발현하는 유전자삽입 세포는 U266 세포와 함께 공-배양하는 경우, BCMA bb2121 CAR, 또는 BCMA-2C5 DAR V2c 또는 DAR V3b를 발현하는 유전자삽입 세포와 비교하여, 더 높은 세포 확장의 배수-변화를 갖는다.

음성 대조군 세포 (TCR-minus 및 ATC)는, K562, RPMI8226 또는 Raji 세포와 함께 공-배양하는 경우, 거의 없거나 약간 확장을 나타내었다 (도 14a 및 b). BCMA-2C5 CAR을 발현하는 유전자삽입 세포 (공여자 2)는, 비-특이적 반응을 나타내는 K562, RPMI8226 또는 Raji 세포와 함께 공-배양하는 경우, 예상외로 높은 수준의 확장을 나타내었다 (도 14c). BCMA-2C5 DAR V2a를 발현하는 유전자삽입 세포는 Raji 세포와 함께 공-배양하는 경우, K562 또는 RPMI8226 세포와 함께 공-배양한 것과 비교하여 더 높은 확장 수준을 나타내었다 (도 14d). BCMA-2C5 DAR V3a를 발현하는 유전자삽입 세포는 Raji 세포와 함께 공-배양하는 경우, K562 또는 RPMI8226 세포와 함께 공-배양하는 것과 비교하여, 더 높은 확장 수준을 나타내었다 (도 14e).

도 14a-e로부터 공-배양된 유전자삽입 세포의 세포 확장의 배수-변화를 도 15에서 막대 그래프로 나타낸다. BCMA-2C5 DAR V2a 및 V3a를 발현하는 유전자삽입 세포 (공여자 2)는 Raji 세포와 함께 공-배양하는 경우, K562 또는 RPMI8226 세포와 함께 공-배양하는 경우 BCMA-2C5 DAR V2a 및 V3a를 발현하는 유전자삽입 세포와 비교하여, 유사한 더 높은 세포 확장의 배수-변화를 갖는다.

실시예 9: 기억 T 세포 및 중심 기억 T 세포의 검출

항-BCMA-2C5 DAR T 세포 (공여자 2 세포로부터)를 DPBS 5% 사람 혈청 알부민으로 세척하고, 항-CD3-BV421 항체 (SK7, BioLegend) 및 PE 또는 APC 접합된 BCMA-Fc 단백질 (Chimerigen Laboratories)로 30-60 분 동안 4℃에서 염색하였다. CD3 및 BCMA를 iQue Screener Plus (Intellicyte Co) 또는 Attune NxT (AFC2) (Life Technologies)를 사용하여 검출하였다. 이펙터 기억 T 세포 및 T 세포의 중심 기억 부분을 확인하는 마커는 CD45RO (BioLegend) 및 CCR7 (BioLegend)이었다. 중심 기억 T 세포는 CD45RO 및 CCR7 이중 양성 집단이고, 이펙터 기억 T 세포는 CD45RO 양성 CCR7 음성 집단이었다. 결과를 도 13b에 나타낸다.

실시예 10: T 세포 탈진 마커의 검출

항-BCMA 2C5 DAR T 세포 또는 대조군 T 세포를 DPBS 5% 사람 혈청 알부민으로 세척하고, 이어서, BV421 접합된 항-PD1 항체 (EH12.2H7 및 NAT105, 제조원: BioLegend) 및 APC/Cy7 접합된 TIM3 항체 (F38-2E2, 제조원: BioLegend)로 30-60 분 동안 4℃에서 염색하였다. PD1 및 TIM3 세포 마커를 Attune NxT (AFC2) (Life Technologies)를 사용하여 검출하였다. 결과를 도 13c에 나타낸다.

실시예 11: 3개의 상이한 DAR 작제물 중 하나를 발현하는 유전자삽입 T 세포를 비교하는 마우스 모델에서 생체내 종양 사멸

항-BCMA DAR T 세포의 종양파괴 활성을 RPMI8226 이종이식 마우스 모델에서 시험하였다. 8 주령 암컷 NSG 마우스를 연구를 위해 사용하였다. 다발 골수종 세포주 RPMI8226을 ATCC로부터 입수하고, 루시퍼라제 및 GFP 유전자와 함께 렌티바이러스 벡터로 형질감염시켰다. 루시퍼라제 및 GFP 발현을 갖는 단일 클론을 선택하였다 (RPMI8226-FLuc). 총 8 x 10⁶ 세포의 RPMI8226-Fluc를 200 μL PBS 중에 현탁하고, 이어서, 각각의 마우스의 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사하였다. 매우 작은 또는 매우 큰 종양 부하를 갖는 동물을 IVIS 이미징으로부터 생물발광을 기초로 하여 제외하였다. 연구에서 선택된 동물을 상이한 그룹으로 무작위배정하였다.

각각의 동물에게 단일 용량의 PBS, 대조군 TCR-minus T 세포, 또는 조작된 항-BCMA DAR T 세포 (공여자 1로부터 T 세포)를 꼬리 정맥을 통해 200 μL의 PBS 중에서 종양 접종 후 22 일째에 투여하였다. 투여된 용량을 하기 표 2에 열거하였다.

종양 성장을 IVIS Lumina III In Vivo Imaging System (Perkin Elmer Health Sciences, Inc)를 사용하여 종양 세포 접종 후 매주 각각의 마우스의 등쪽 상 총 광자 플럭스를 측정하여 모니터링하였다. 종양 접종 후 1 주째에, BCMA-2C5 DAR V2c, V3b 또는 V3a 작제물을 발현하는 T 세포로 처리된 마우스는, TCR-minus T 세포 또는 PBS로 처리된 마우스와 비교하여, 현저하게 감소된 종양 부하를 나타내었다 (도 18a). 도 18b는 도 18a에 나타낸 발광 데이터에 상응하는 생체발광 신호 플럭스 (마우스의 각 그룹에 대해 평균함)를 나타내는 그래프이다. 도 18c는 도 18a에 나타낸 발광 데이터와 상응하는 종양 성장 억제 지수를 열거한 표이다.

말초 혈액 FACS 분석:

혈액 샘플을 용량 투여 후 1일째에 및 이후 매주 각각의 동물로부터 수집하였다. 40 uL 혈액 샘플을 마우스 꼬리 정맥으로부터 입수하였다. 혈액 샘플로부터의 세포를 염색하고, 유세포분석을 통해 CD45-양성 세포 (도 18d), BCMA DAR-양성 세포 (도 18e), CD3-음성 세포 (도 18f), 및 CD3-양성 세포 (도 18g)의 퍼센트 및 총수에 대해 분석하였다. 동물 생존율을 또한 측정하였다 (도 18h).

실시예 12: V3a DAR 작제물을 발현하는 유전자삽입 T 세포의 3개의 상이한 용량을 비교하는 마우스 모델에서 생체내 종양 사멸

DAR BCMA-2C5 V3a 작제물을 발현하는 항-BCMA DAR T 세포의 3개의 상이한 용량의 종양파괴 활성을 RPMI8226 이종이식 마우스 모델에서 시험하였다. 8 주령 암컷 NSG 마우스를 연구를 위해 사용하였다. 다발 골수종 세포주 RPMI8226을 ATCC로부터 입수하고, 루시퍼라제 및 GFP 유전자와 함께 렌티바이러스 벡터로 형질감염시켰다. 루시퍼라제 및 GFP 발현을 갖는 단일 클론을 선택하였다 (RPMI8226-FLuc). 총 8 x 10⁶ 세포의 RPMI8226-Fluc를 200 μL PBS 중에 현탁하고, 이어서, 각각의 마우스의 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사하였다. 매우 작은 또는 매우 큰 종양 부하를 갖는 동물을 IVIS 이미징으로부터 생물발광을 기초로 하여 제외하였다. 연구에서 선택된 동물을 상이한 그룹으로 무작위배정하였다.

각각의 동물에게 단일 용량의 PBS, 대조군 TCR-minus T 세포, 또는 DAR BCMa-2C5 V3a 작제물을 발현하는 조작된 항-BCMA DAR T 세포의 3개의 용량 중 1개를, 꼬리 정맥을 통해 PBS의 200 μL 중에 종양 접종 후 22 일째에 투여하였다. 투여된 용량을 하기 표 3에 열거하였다.

종양 성장을 IVIS Lumina III 생체내 이미징 시스템 (Perkin Elmer Health Sciences, Inc)을 사용하여 종양 세포 접종 후 매주 각각의 마우스의 등쪽 상 총 광자 플럭스를 측정하여 모니터링하였다. 종양 접종 후 1 및 2 주째에, BCMA-2C5 DAR V3a 작제물을 발현하는 최고 용량 (6 x 10⁶) T 세포로 처리된 마우스는, 중간 및 낮은 용량 (1.2 x 10⁶ 또는 2.4 x 10⁵)의 BCMA-2C5 DAR V3a 작제물을 발현하는 T 세포로 처리된 마우스와 비교하여, 현저하게 감소된 종양 부하를 나타내었다 (도 19a). 도 19b는 도 19a에 나타낸 발광 데이터와 상응하는 생체발광 신호 플럭스 (마우스의 각 그룹에 대해 평균함)를 나타내는 그래프이다. 도 19c는 도 19a에 나타낸 발광 데이터와 상응하는 종양 성장 억제 지수를 열거한 표이다.

말초 혈액 FACS 분석:

혈액 샘플을 각각의 동물로부터 용량 투여 후 1일째에 및 이후 매주 수집하였다. 40 uL 혈액 샘플을 마우스 꼬리 정맥으로부터 입수하였다. 혈액 샘플로부터의 세포를 염색하고, 유세포분석을 통해 CD45-양성 세포 (도 19d), BCMA DAR-양성 세포 (도 19e), CD3-음성 세포 (도 19f), 및 CD3-양성 세포 (도 19g)의 퍼센트 및 총수에 대해 분석하였다. 동물 생존율을 또한 측정하였다 (도 19h).

실시예 13: 생체내 종양 재-접종 연구

상기 실시예 12에 기재된 용량 연구를 위해 사용된 마우스를 종양 재-접종 연구를 위해 사용하였다. DAR T 세포 (V3a)로 처리된 마우스의 각 그룹에서, 절반은 200 uL의 PBS를 투여받고, 다른 절반은 200 uL 중 1 x 10⁷ RPMI8226-Fluc를 투여하여 재-접종하였다. 이러한 재-접종 연구에서, 어떠한 마우스도 DAR T 세포 (V3a)의 두번째 용량을 투여받지 않았다.

종양 성장 및 재-성장을 IVIS Lumina III In Vivo Imaging System (Perkin Elmer Health Sciences, Inc)을 사용하여 7주 동안 매주 각각의 마우스의 등쪽 상 총 광자 플럭스를 측정하여 모니터링하였다. 종양 재-접종 연구를 시작하기 전 12 주째에 마우스의 생체발광 이미지를 도 20a의 상부에 나타낸다. PBS 또는 종양 재-접종 연구에 적용된 마우스의 이미지를, 각 용량 그룹에 대해, 도 20a에 나타내었다. 어떠한 종양 성장도 종양 재-접종된 최고 용량 투약된 마우스 (6 x 10⁶ DAR T 세포 V3a)에서 검출되지 않았다 (도 20a). 종양 성장 및 재-성장을 종양 재-접종된 중간 용량 투약된 마우스 (1.2 x 10⁶) 중 4마리에서 검출하고, 한마리의 마우스는 종양 성장을 나타내지 않았다 (흑색 삼각형으로 나타냄) (도 20a). 종양 성장 및 재-성장을 종양 재-접종된 최저 용량 투약된 마우스 (2.4 x 10⁵) 중 4 마리에서 검출하였고 (이들 마우스 중 3마리는 죽었다), 1마리 마우스는 어떠한 종양 성장도 나타내지 않았다 (흑색 삼각형으로 나타냄) (도 20a).

말초 혈액 FACS 분석:

혈액 샘플을 용량 투여 후 1일째에 및 이후 매주 각각의 동물로부터 수집하였다. 40 uL 혈액 샘플을 마우스 꼬리 정맥으로부터 입수하였다. 혈액 샘플로부터의 세포를 염색하고, 유세포분석을 통해 CD45-양성 세포 (도 20b), 및 BCMA DAR-양성 세포 (도 20c)의 퍼센트 및 총수에 대해 분석하였다.

SEQUENCE LISTING <110> SORRENTO THERAPEUTICS, INC. <120> DIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (DAR) THAT BIND BCMA <130> 01223-0012-00PCT <150> US 62/896,190 <151> 2019-09-05 <150> US 62/896,990 <151> 2019-09-06 <150> US 62/910,341 <151> 2019-10-03 <150> US 62/943,069 <151> 2019-12-03 <150> US 63/030,145 <151> 2020-05-26 <160> 95 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15 Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 20 25 30 Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser 35 40 45 Val Lys Gly Thr Asn Ala 50 <210> 2 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant-1 human BCMA antigen <400> 2 Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15 Gly Gly His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 20 25 30 Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser 35 40 45 Val Lys Gly Thr Asn Ala 50 <210> 3 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35 40 45 Gly Arg Ile Lys Ser Lys Ser Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr 225 230 235 240 Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly 245 250 255 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 260 265 270 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 275 280 285 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 290 295 300 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 305 310 315 320 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 325 330 335 Leu Pro Pro Arg 340 <210> 83 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DAR V4 BCMA-2C5 2nd polypeptide <400> 83 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Ala His Gly Gly His 20 25 30 Tyr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Gly Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 84 <211> 724 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DAR V2a BCMA-bb2121 precursor <400> 84 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala 65 70 75 80 Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp 245 250 255 Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu 260 265 270 Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu 275 280 285 Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val 290 295 300 Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 305 310 315 320 Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu 325 330 335 Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 340 345 350 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 355 360 365 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 370 375 380 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 385 390 395 400 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 405 410 415 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 420 425 430 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 435 440 445 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 450 455 460 Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val 465 470 475 480 Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu 485 490 495 Leu Leu Leu Trp Leu Thr Asp Ala Arg Cys Asp Ile Val Leu Thr Gln 500 505 510 Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser 515 520 525 Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His 530 535 540 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu 545 550 555 560 Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 565 570 575 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp 580 585 590 Val Ala Ile Tyr Ser Cys Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr Phe 595 600 605 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 610 615 620 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 625 630 635 640 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 645 650 655 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 660 665 670 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 675 680 685 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 690 695 700 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 705 710 715 720 Arg Gly Glu Cys <210> 85 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DAR V2a BCMA-bb2121 1st polypeptide <400> 85 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys 225 230 235 240 Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser 245 250 255 Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val 260 265 270 Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile 275 280 285 Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys 290 295 300 Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys 305 310 315 320 Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val 325 330 335 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 340 345 350 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 355 360 365 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 370 375 380 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 385 390 395 400 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 405 410 415 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 420 425 430 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 435 440 445 <210> 86 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DAR V2a BCMA-bb2121 2nd polypeptide <400> 86 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly 1 5 10 15 Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile 20 25 30 Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Ile Tyr Ser Cys Leu Gln Ser Arg 85 90 95 Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 87 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DAR V3c intracellular domain <400> 87 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 35 40 45 Ala Asp Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 50 55 60 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 65 70 75 80 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 85 <210> 88 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DAR V2c-alt intracellular domain <400> 88 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu 35 40 45 Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln 50 55 60 Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly 65 70 75 80 Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 85 90 95 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 100 105 110 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 115 120 125 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 145 150 155 160 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 165 170 175 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 180 185 190 Pro Pro Arg 195 <210> 89 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DAR V3b-alt intracellular domain <400> 89 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu 35 40 45 Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln 50 55 60 Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly 65 70 75 80 Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Lys Gly Glu Arg 85 90 95 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 100 105 110 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 115 120 125 <210> 90 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 90 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 upper hinge sequence <400> 91 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 92 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 core hinge sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X = P, R or S <400> 92 Cys Pro Xaa Cys 1 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lower hinge/CH2 sequence <400> 93 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 <210> 94 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary Fc region (CH2) <400> 94 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 1 5 10 <210> 95 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region including an upper, core and lower hinge <400> 95 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20

Claims

아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드로서: (i) 중쇄 리더(leader) 서열, (ii) 항체 중쇄 가변 영역, (iii) 항체 중쇄 불변 영역, (iv) 임의의 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, (vi) 세포내 영역, (vii) 자기-절단 서열, (viii) 경쇄 리더 서열, (ix) 항체 경쇄 가변 영역, 및 (x) 항체 경쇄 불변 영역; 여기서, 상기 자기-절단 서열이 상기 전구체 폴리펩타이드를 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄로 절단되도록 하는, 전구체 폴리펩타이드.
아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 전구체 폴리펩타이드로서: (i) 경쇄 리더 서열 (ii) 항체 경쇄 가변 영역, (iii) 항체 경쇄 불변 영역, (iv) 임의의 힌지 영역, (v) 막횡단 영역, (vi) 세포내 영역, (vii) 자기-절단 서열, (viii) 중쇄 리더 서열, (ix) 항체 중쇄 가변 영역, 및 (x) 항체 중쇄 불변 영역; 여기서, 상기 자기-절단 서열이 상기 전구체 폴리펩타이드를 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄로 절단되도록 하는, 전구체 폴리펩타이드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 중쇄 가변 영역이 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는, 전구체 폴리펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄 불변 영역이:
a) 사람 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM CH1 도메인;
b) 사람 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH1 도메인;
c) 사람 IgG1 도메인;
d) 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
e) 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열
을 포함하는, 전구체 폴리펩타이드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 경쇄 가변 영역이 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는, 전구체 폴리펩타이드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 경쇄 불변 영역이:
a) 사람 Ig 카파 불변 도메인;
b) 사람 Ig 람다 불변 도메인;
c) 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
d) 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열
을 포함하는, 전구체 폴리펩타이드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역이 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체로부터의 힌지 서열을 포함하는, 전구체 폴리펩타이드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지가 CD8α 및/또는 CD28 힌지 영역을 포함하는, 전구체 폴리펩타이드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역이 CPPC 또는 SPPC 아미노산 서열을 포함하는, 전구체 폴리펩타이드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역이 서열번호 34, 35 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는, 전구체 폴리펩타이드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막횡단 영역이 CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD137, CD154, LFA-1 T 세포 공-수용체, CD2 T 세포 공-수용체/부착 분자, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS, 및 FGFR2B로부터의 막횡단 서열을 포함하는, 전구체 폴리펩타이드.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막횡단 영역이 서열번호 37, 38, 39 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는, 전구체 폴리펩타이드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 영역이, 4-1BB, ITAM 1, 2 및 3을 갖는 CD3제타, ITAM 1을 갖는 CD3제타, ITAM 3을 갖는 CD3제타, CD28, CD27, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, GITR (TNFRSF18), DR3 (TNFRSF25), TNFR2 및/또는 CD226으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포내 서열 중 1개의 세포내 서열을 포함하거나, 상기 그룹으로부터 선택된 세포내 서열의 임의의 순서 및 임의의 조합의 2-5개의 세포내 서열을 포함하는, 전구체 폴리펩타이드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 영역이:
i) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM 1, 2 및 3을 갖는 CD3제타,
ii) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CD3제타 ITAM 1,
iii) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CD3제타 ITAM 2, 또는
iv) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM 3을 갖는 CD3제타
를 포함하는, 전구체 폴리펩타이드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 영역이:
i) 서열번호 48 또는 50의 아미노산 서열을 포함하는, CD28로부터의 및 ITAM 1, 2 및 3을 갖는 CD3제타로부터의 세포내 서열, 또는
ii) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는, 4-1BB로부터의 및 ITAM 1, 2 및 3을 갖는 CD3제타로부터의 세포내 서열, 또는
iii) 서열번호 51 또는 88의 아미노산 서열을 포함하는, CD28로부터의, 4-1BB로부터의 및 ITAM 1, 2 및 3을 갖는 CD3제타로부터의 세포내 서열, 또는
iv) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는, 4-1BB로부터의 및 ITAM 3을 갖는 CD3제타로부터의 세포내 서열, 또는
v) CD28 (서열번호 42)로부터의 및 ITAM 3을 갖는 CD3제타 (서열번호 47)로부터의 세포내 서열, 또는
vi) 서열번호 53 또는 89의 아미노산 서열을 포함하는, CD28로부터의, 4-1BB로부터의 및 ITAM 3을 갖는 CD3제타로부터의 세포내 서열
을 포함하는, 전구체 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 서열번호 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81 또는 84의 아미노산 서열을 포함하는, 전구체 분자.
제2항에 있어서, 도 4a 및 b에 나타낸 배향 및 아미노산 서열을 포함하는, 전구체 분자.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기-절단 서열이 T2A 서열이 아니고, 예를 들면, 상기 자기-절단 서열이 P2A, E2A, 또는 F2A 서열인, 전구체 분자.
a) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 중쇄 가변 영역, (ii) 항체 중쇄 불변 영역, (iii) 임의의 힌지 영역, (iv) 막횡단 영역, 및 (v) 세포내 영역;
b) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 경쇄 가변 영역, 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역
을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 (dimeric antigen receptor; DAR) 작제물로서,
상기 항체 중쇄 불변 영역 및 상기 항체 경쇄 불변 영역이 상기 이량체성 항원 수용체 (DAR)의 형성을 위한 이량체화 도메인을 형성하고,
상기 항체 중쇄 가변 영역 및 상기 항체 경쇄 가변 영역이 항원 결합 도메인을 형성하는, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
a) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 첫번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 경쇄 가변 영역, (ii) 항체 경쇄 불변 영역, (iii) 임의의 힌지 영역, (iv) 막횡단 영역, 및 (v) 세포내 영역;
b) 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역을 포함하는 두번째 폴리펩타이드 쇄: (i) 항체 중쇄 가변 영역, 및 (ii) 항체 중쇄 불변 영역
을 포함하는 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물로서,
상기 항체 중쇄 불변 영역 및 상기 항체 경쇄 불변 영역이 상기 이량체성 항원 수용체 (DAR)의 형성을 위한 이량체화 도메인을 형성하고,
상기 항체 중쇄 가변 영역 및 상기 항체 경쇄 가변 영역이 항원 결합 도메인을 형성하는, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 항체 중쇄 불변 영역 및 상기 항체 경쇄 불변 영역이 1개 또는 2개의 디설파이드 결합을 통해 이량체화되는, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역이 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체로부터의 힌지 서열을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 작제물.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지가 CD8α 및/또는 CD28 힌지 영역을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 작제물.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역이 CPPC 또는 SPPC 아미노산 서열을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 작제물.
제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막횡단 영역이 CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD137, CD154, LFA-1 T 세포 공-수용체, CD2 T 세포 공-수용체/부착 분자, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS, 및 FGFR2B로부터의 막횡단 서열을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 작제물.
제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 영역이, 4-1BB, CD3제타, CD28, CD27, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, GITR (TNFRSF18), DR3 (TNFRSF25), TNFR2 및/또는 CD226으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포내 서열 중 1개의 세포내 서열을 포함하거나, 상기 그룹으로부터 선택된 세포내 서열의 임의의 순서 및 임의의 조합의 2-5개의 세포내 서열을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 작제물.
제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 BMCA (B-세포 성숙 항원) 단백질에 결합하는, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서, 상기 BMCA (B-세포 성숙 항원) 단백질이 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서, 상기 항체 중쇄 가변 영역이 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서, 상기 항체 중쇄 불변 영역이 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서, 상기 항체 경쇄 가변 영역이 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서, 상기 항체 경쇄 불변 영역이 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서, 상기 힌지 영역이 서열번호 34, 35 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서, 상기 막횡단 영역이 서열번호 37, 38, 39 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서, 상기 세포내 영역이:
i) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM 1, 2 및 3을 갖는 CD3제타,
ii) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CD3제타 ITAM 1,
iii) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CD3제타 ITAM 2, 또는
iv) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM 3을 갖는 CD3제타
를 포함하는, 이량체성 항원 수용체.
제27항에 있어서, 상기 세포내 영역이:
i) 서열번호 48 또는 50의 아미노산 서열을 포함하는, CD28로부터의 및 ITAM 1, 2 및 3을 갖는 CD3제타로부터의 세포내 서열, 또는
ii) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는, 4-1BB로부터의 및 ITAM 1, 2 및 3을 갖는 CD3제타로부터의 세포내 서열, 또는
iii) 서열번호 51 또는 88의 아미노산 서열을 포함하는, CD28로부터의, 4-1BB로부터의 및 ITAM 1, 2 및 3을 갖는 CD3제타로부터의 세포내 서열, 또는
iv) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는, 4-1BB로부터의 및 ITAM 3을 갖는 CD3제타로부터의 세포내 서열, 또는
v) CD28 (서열번호 42)로부터의 및 ITAM 3을 갖는 CD3제타 (서열번호 47)로부터의 세포내 서열, 또는
vi) 서열번호 53 또는 89의 아미노산 서열을 포함하는, CD28로부터의, 4-1BB로부터의 및 ITAM 3을 갖는 CD3제타로부터의 세포내 서열
을 포함하는, 이량체성 항원 수용체.
제27항에 있어서, 상기 첫번째 폴리펩타이드 쇄가 서열번호 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82 또는 85의 아미노산 서열을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서, 상기 두번째 폴리펩타이드 쇄가 서열번호 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 또는 86의 아미노산 서열을 포함하는, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기-절단 서열의 절단시, 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역이 BMCA (B-세포 성숙 항원) 단백질에 결합하는 항원-결합 도메인을 형성할 수 있고, 임의로 상기 BMCA (B-세포 성숙 항원) 단백질이 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는, 전구체 폴리펩타이드.
제27항에 있어서,
a) 상기 첫번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; (ii) 항체 중쇄 불변 영역; (iii) CD8 및 CD28 힌지 영역을 포함하는 힌지 영역; (iv) CD28 막횡단 영역; 및 (v) CD28 공-자극성 서열 및 CD3제타 ITAM 1, 2 및 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역을 포함하고;
b) 상기 두번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역을 포함하고,
상기 항체 중쇄 불변 영역 및 상기 항체 경쇄 불변 영역이 이량체화 도메인을 형성하고,
상기 항체 중쇄 가변 영역 및 상기 항체 경쇄 가변 영역이 BCMA 단백질에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하고,
임의로 상기 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물이 DAR V1 작제물인, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서,
a) 상기 첫번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; (ii) 항체 중쇄 불변 영역; (iii) CD28 힌지 영역을 포함하는 힌지 영역; (iv) CD28 막횡단 영역; 및 (v) 4-1BB 공-자극성 서열 및 CD3제타 ITAM 1, 2 및 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역을 포함하고;
b) 상기 두번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역을 포함하고,
상기 항체 중쇄 불변 영역 및 상기 항체 경쇄 불변 영역이 이량체화 도메인을 형성하고,
상기 항체 중쇄 가변 영역 및 상기 항체 경쇄 가변 영역이 BCMA 단백질에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하고,
임의로 상기 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물이 DAR V2a 작제물인,
이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서,
a) 상기 첫번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; (ii) 항체 중쇄 불변 영역; (iii) 힌지 영역; (iv) CD28 막횡단 영역; 및 (v) CD28 공-자극성 서열 및 CD3제타 ITAM 1, 2 및 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역을 포함하고;
b) 상기 두번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역을 포함하고,
상기 항체 중쇄 불변 영역 및 상기 항체 경쇄 불변 영역이 이량체화 도메인을 형성하고,
상기 항체 중쇄 가변 영역 및 상기 항체 경쇄 가변 영역이 BCMA 단백질에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하고,
임의로, 상기 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물이 DAR V2b 작제물인, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서,
a) 상기 첫번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; (ii) 항체 중쇄 불변 영역; (iii) CD28 힌지 영역을 포함하는 힌지 영역; (iv) CD28 막횡단 영역; 및 (v) 4-1BB 공-자극성 서열, CD28 공-자극성 서열, 및 CD3제타 ITAM 1, 2 및 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역을 포함하고;
b) 상기 두번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역을 포함하고,
상기 항체 중쇄 불변 영역 및 상기 항체 경쇄 불변 영역이 이량체화 도메인을 형성하고,
상기 항체 중쇄 가변 영역 및 상기 항체 경쇄 가변 영역이 BCMA 단백질에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하고,
임의로, 상기 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물이 DAR V2c 작제물인, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서,
a) 상기 첫번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; (ii) 항체 중쇄 불변 영역; (iii) CD28 힌지 영역을 포함하는 힌지 영역; (iv) CD28 막횡단 영역; 및 (v) 4-1BB 공-자극성 서열 및 CD3제타 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역을 포함하고; 여기서, 상기 세포내 영역은 임의로 세포내 CD28 공-자극성 서열을 포함하고;
b) 상기 두번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역을 포함하고,
상기 항체 중쇄 불변 영역 및 상기 항체 경쇄 불변 영역이 이량체화 도메인을 형성하고,
상기 항체 중쇄 가변 영역 및 상기 항체 경쇄 가변 영역이 BCMA 단백질에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하고,
임의로, 상기 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물이 DAR V3 작제물인, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서,
a) 상기 첫번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; (ii) 항체 중쇄 불변 영역; (iii) CD28 막횡단 영역; 및 (iv) 4-1BB 공-자극성 서열 및 CD3제타 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역을 포함하고;
b) 상기 두번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역을 포함하고,
상기 항체 중쇄 불변 영역 및 상기 항체 경쇄 불변 영역이 이량체화 도메인을 형성하고,
상기 항체 중쇄 가변 영역 및 상기 항체 경쇄 가변 영역이 BCMA 단백질에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하고,
임의로, 상기 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물이 DAR V4 작제물인, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서,
a) 상기 첫번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; (ii) 항체 중쇄 불변 영역; (iii) CD28 힌지 영역을 포함하는 힌지 영역; (iv) CD28 막횡단 영역; 및 (v) CD28 공-자극성 서열 및 CD3제타 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역을 포함하고; 여기서, 상기 세포내 영역은 임의로 세포내 CD28 및 4-1BB 공-자극성 서열을 포함하고;
b) 상기 두번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역을 포함하고,
상기 항체 중쇄 불변 영역 및 상기 항체 경쇄 불변 영역이 이량체화 도메인을 형성하고,
상기 항체 중쇄 가변 영역 및 상기 항체 경쇄 가변 영역이 BCMA 단백질에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하고,
임의로, 상기 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물이 DAR V3c 작제물인, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제27항에 있어서,
c) 상기 첫번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 중쇄 가변 영역; (ii) 항체 중쇄 불변 영역; (iii) CD28 막횡단 영역; 및 (iv) 4-1BB 공-자극성 서열 및 CD3제타 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역을 포함하고;
d) 상기 두번째 폴리펩타이드 쇄가 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬된 하기한 다수의 영역: (i) 서열번호 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA 항체 경쇄 가변 영역; 및 (ii) 항체 경쇄 불변 영역을 포함하고,
상기 항체 중쇄 불변 영역 및 상기 항체 경쇄 불변 영역이 이량체화 도메인을 형성하고,
상기 항체 중쇄 가변 영역 및 상기 항체 경쇄 가변 영역이 BCMA 단백질에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하고,
임의로, 상기 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물이 DAR V4 작제물인, 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물.
제41항에 있어서, 상기 4-1BB 공-자극성 서열 및 CD3제타 ITAM 1, 2 및 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역이 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는, DAR 작제물.
제42항에 있어서, 상기 CD28 공-자극성 서열 및 CD3제타 ITAM 1, 2 및 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역이 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, DAR 작제물.
제43항에 있어서, 상기 4-1BB 공-자극성 서열, CD28 공-자극성 서열, 및 CD3제타 ITAM 1, 2 및 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역이 서열번호 51 또는 88의 아미노산 서열을 포함하는, DAR 작제물.
제44항에 있어서, 상기 4-1BB 공-자극성 서열 및 CD3제타 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역이 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 4-1BB 공-자극성 서열, CD28 공-자극성 서열 및 CD3제타 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역이 서열번호 53 또는 89의 아미노산 서열을 포함하는, DAR 작제물.
제45항에 있어서, 상기 4-1BB 공-자극성 서열 및 CD3제타 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역이 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는, DAR 작제물.
제46항에 있어서, 상기 CD28 공-자극성 서열 및 CD3제타 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역이 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는, DAR 작제물.
제47항에 있어서, 상기 4-1BB 공-자극성 서열 및 CD3제타 ITAM 3 세포내 서열을 포함하는 세포내 영역이 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는, DAR 작제물.
제40항 또는 제51항에 있어서, 상기 CD8 및 CD28 힌지 영역이 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는, DAR 작제물.
제41항 내지 제44항, 제46항 내지 제49항, 또는 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역이 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 힌지 영역을 포함하는, DAR 작제물.
제40항, 제45항, 또는 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD28 막횡단 영역이 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는, DAR 작제물.
제40항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역이:
a) 사람 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM CH1 도메인;
b) 사람 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH1 도메인;
c) 사람 IgG1 도메인;
d) 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
e) 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열
을 포함하는, DAR 작제물.
제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역이:
a) 사람 Ig 카파 불변 도메인;
b) 사람 Ig 람다 불변 도메인;
c) 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
d) 서열번호 11 또는 31의 아미노산 서열
을 포함하는, DAR 작제물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
프로모터에 작동가능하게 연결된 제60항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
프로모터에 작동가능하게 연결된 제60항의 핵산을 보유하는 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단으로서, 임의로 상기 핵산이 발현 벡터에 존재하는, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단.
제62항에 있어서, 상기 숙주 세포가 T 림프구 (예를 들면, 조절 T 세포, 감마-델타 T 세포 또는 세포독성 T 세포), NK (자연 킬러) 세포, 대식세포, 수지상 세포, 비만세포, 호산구, B 림프구, 또는 단핵구이거나, 상기 숙주 세포의 집단이 T 림프구 (예를 들면, 조절 T 세포, 감마-델타 T 세포 또는 세포독성 T 세포), NK (자연 킬러) 세포, 대식세포, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구, B 림프구 또는 단핵구를 포함하는, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단.
제62항에 있어서, 상기 숙주 세포가 자가 숙주 세포이거나, 상기 집단이 자가 숙주 세포를 포함하는, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단.
제62항에 있어서, 상기 숙주 세포가 동종이형 숙주 세포이거나, 상기 집단이 동종이형 숙주 세포를 포함하는, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단.
제62항 내지 제65항 중 어느 한 항의 숙주 세포의 집단을, 다수의 상기 전구체 폴리펩타이드를 숙주 세포의 집단의 의해 발현시키기 위해 적합한 조건하에, 및 상기 다수의 전구체 폴리펩타이드를 숙주 세포의 집단의 의해 다수의 이량체성 항원 수용체 (DARs)로 프로세싱하기 위해 적합한 조건하에, 배양함을 포함하는 다수의 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 발현하는 숙주 세포의 집단의 제조 방법으로서,
상기 숙주 세포의 집단에 의한 프로세싱이 상기 다수의 전구체 폴리펩타이드를 다수의 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄로 절단하고, 상기 다수의 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 서로 조립하여 다수의 이량체성 항원 수용체 (DARs)를 형성하고, 상기 다수의 이량체성 항원 수용체 (DARs)를 상기 숙주 세포의 집단의 세포성 막 내에 고정함을 포함하는, 방법.
제66항에 있어서, 상기 발현 벡터가 상기 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 상기 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단 내로의 일과성 도입을 지시하는, 방법.
제66항에 있어서, 상기 발현 벡터가 상기 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 상기 숙주 세포의 게놈내로의 안정한 삽입을 지시하는, 방법.
제66항에 있어서, 상기 발현 벡터가 상기 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단에서 상기 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 전사 및/또는 번역을 지시하는, 방법.
제66항에 있어서, 상기 발현 벡터가 상기 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단에서 상기 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 발현을 지시하고, 발현이 상기 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 전사 및/또는 번역을 포함하는, 방법.
제66항 내지 제70항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 숙주 세포의 집단의 세포성 막 내에 고정된 다수의 이량체성 항원 수용체 (DARs)를 포함하는 숙주 세포의 집단.
제19항 내지 제59항 중 어느 한 항의 다수의 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 발현하는 숙주 세포의 집단으로서, 상기 DAR 작제물이 상기 숙주 세포의 집단의 세포성 막 내에 고정되는, 숙주 세포의 집단.
제71항 또는 제72항의 숙주 세포의 집단 및 약제학적으로-허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
대상자에서 종양 항원의 유해한 발현과 연관된 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상자를 치료하는 방법으로서, 제71항 또는 제72항의 숙주 세포의 집단 또는 제73항의 약제학적 조성물을 상기 대상자에게 투여함을 포함하는, 방법.
제74항에 있어서, 상기 질환이 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma; NHL), 버킷림프종 (Burkitt's lymphoma; BL), B 만성 림프구 백혈병 (B chronic lymphocytic leukemia; B-CLL), B 및 T 급성 림프구 백혈병 (acute lymphocytic leukemia; ALL), T 세포 림프종 (T cell lymphoma; TCL), 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia; AML), 털세포 백혈병 (hairy cell leukemia; HCL), 호지킨 림프종 (Hodgkin's Lymphoma; HL), 만성 골수성 백혈병 (chronic myeloid leukemia; CML) 및 다발 골수종 (multiple myeloma; MM)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 혈액암인, 방법.
제19항 내지 제59항 중 어느 한 항의 첫번째 폴리펩타이드를 암호화하는 첫번째 핵산.
제19항 내지 제59항 중 어느 한 항의 두번째 폴리펩타이드를 암호화하는 두번째 핵산.
제19항 내지 제59항 중 어느 한 항의 첫번째 폴리펩타이드를 암호화하는 첫번째 핵산 및 두번째 폴리펩타이드를 암호화하는 두번째 핵산.
프로모터에 작동가능하게 연결된 제78항의 첫번째 핵산을 포함하는 첫번째 발현 벡터, 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 제78항의 두번째 핵산을 포함하는 두번째 발현 벡터.
프로모터에 작동가능하게 연결된 제78항의 첫번째 및 두번째 핵산을 포함하는 발현 벡터.
제79항의 첫번째 발현 벡터를 보유하는 첫번째 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 첫번째 집단.
제79항의 두번째 발현 벡터를 보유하는 두번째 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 두번째 집단.
제79항의 첫번째 발현 벡터를 보유하는 첫번째 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 첫번째 집단, 및 제79항의 두번째 발현 벡터를 보유하는 두번째 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 두번째 집단.
제79항의 첫번째 및 두번째 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단.
제80항의 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단.
제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 T 림프구 (예를 들면, 조절 T 세포, 감마-델타 T 세포 또는 세포독성 T 세포), NK (자연 킬러) 세포, 대식세포, 수지상 세포, 비만세포, 호산구, B 림프구, 또는 단핵구이거나, 상기 집단이 T 림프구 (예를 들면, 조절 T 세포, 감마-델타 T 세포 또는 세포독성 T 세포), NK (자연 킬러) 세포, 대식세포, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구, B 림프구 또는 단핵구를 포함하는, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단.
제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 자가 숙주 세포이거나, 상기 집단이 자가 숙주 세포를 포함하는, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단.
제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 동종이형 숙주 세포이거나, 상기 집단이 동종이형 숙주 세포를 포함하는, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단.
제83항의 숙주 세포의 첫번째 및 두번째 집단을, 다수의 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 발현시키기 위해 적합한 조건하에 배양함을 포함하는, 다수의 이량체성 항원 수용체 (DAR)의 제조 방법.
제84항의 숙주 세포의 집단을, 상기 숙주 세포의 집단의 의해 다수의 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 발현시키기 위해 적합한 조건하에, 및 다수의 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드를 상기 숙주 세포의 집단의 의해 다수의 이량체성 항원 수용체 (DARs)로 프로세싱하기 위해 적합한 조건하에 배양함을 포함하는, 다수의 이량체성 항원 수용체 (DAR)의 제조 방법으로서,
상기 숙주 세포의 집단에 의한 프로세싱이, 다수의 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 서로 조립하여 다수의 이량체성 항원 수용체 (DARs)를 형성하고, 상기 다수의 이량체성 항원 수용체 (DARs)를 상기 숙주 세포의 집단의 세포성 막 내에 고정함을 포함하는, 방법.
다수의 이량체성 항원 수용체 (DAR)를 제조하는 방법으로서, 제85항의 숙주 세포의 집단을, 다수의 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 상기 숙주 세포의 집단의 의해 발현시키기 위해 적합한 조건하에, 및 다수의 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드를 숙주 세포의 집단의 의해 다수의 이량체성 항원 수용체 (DARs)로 프로세싱하기 위해 적합한 조건하에 배양하고, 여기서, 상기 숙주 세포의 집단에 의한 프로세싱이, 다수의 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 서로 조립하여 다수의 이량체성 항원 수용체 (DARs)를 형성하고, 상기 다수의 이량체성 항원 수용체 (DARs)를 상기 숙주 세포의 집단의 세포성 막 내에 고정함을 포함하는, 방법.
제89항에 있어서, 상기 첫번째 발현 벡터가 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 첫번째 숙주 세포 또는 숙주 세포의 첫번째 집단 내로의 일과성 도입을 지시하고, 상기 두번째 발현 벡터가 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 두번째 숙주 세포 또는 숙주 세포의 두번째 집단 내로의 일과성 도입을 지시하는, 방법.
제89항에 있어서, 상기 첫번째 발현 벡터가 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 첫번째 숙주 세포의 게놈 내로의 안정한 삽입을 지시하고, 상기 두번째 발현 벡터가 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 두번째 숙주 세포의 게놈 내로의 안정한 삽입을 지시하는, 방법.
제89항에 있어서, 상기 첫번째 발현 벡터가 첫번째 숙주 세포 또는 숙주 세포의 첫번째 집단에서 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 전사 및/또는 번역을 지시하고, 상기 두번째 발현 벡터가 두번째 숙주 세포 또는 숙주 세포의 두번째 집단에서 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 전사 및/또는 번역을 지시하는, 방법.
제90항에 있어서, 상기 첫번째 발현 벡터가 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 상기 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단 내로의 일과성 도입을 지시하고, 상기 두번째 발현 벡터가 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 상기 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단 내로의 일과성 도입을 지시하는, 방법.
제90항에 있어서, 상기 첫번째 발현 벡터가 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 상기 숙주 세포의 게놈 내로의 안정한 삽입을 지시하고, 상기 두번째 발현 벡터가 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 상기 숙주 세포의 게놈 내로의 안정한 삽입을 지시하는, 방법.
제90항에 있어서, 상기 첫번째 발현 벡터가 상기 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단에서 첫번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 전사 및/또는 번역을 지시하고, 상기 두번째 발현 벡터가 상기 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단에서 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 전사 및/또는 번역을 지시하는, 방법.
제91항에 있어서, 상기 발현 벡터가 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 상기 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단 내로의 일과성 도입을 지시하는, 방법.
제91항에 있어서, 상기 발현 벡터가 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 상기 숙주 세포의 게놈 내로의 안정한 삽입을 지시하는, 방법.
제91항에 있어서, 상기 발현 벡터가 상기 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단에서 첫번째 및 두번째 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 전사 및/또는 번역을 지시하는, 방법.
제90항 내지 제100항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 숙주 세포의 집단의 세포성 막에 고정된 다수의 이량체성 항원 수용체 (DARs)를 포함하는 숙주 세포의 집단.
숙주 세포의 집단의 세포성 막에 고정된 제19항 내지 제59항 중 어느 한 항의 다수의 이량체성 항원 수용체 (DAR) 작제물을 발현하는 숙주 세포의 집단.
제101항 또는 제102항의 숙주 세포의 집단 및 약제학적으로-허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
제101항 또는 제102항의 숙주 세포의 집단 또는 제103항의 약제학적 조성물을 종양 항원의 유해한 발현 또는 과-발현과 연관된 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상자에게 투여함을 포함하는, 상기 대상자에서 종양 항원의 유해한 발현 또는 과-발현과 연관된 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상자를 치료하는 방법.
제104항에 있어서, 상기 질환이 비호지킨 림프종 (NHL), 버킷림프종 (BL), B 만성 림프구 백혈병 (B-CLL), B 및 T 급성 림프구 백혈병 (ALL), T 세포 림프종 (TCL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 털세포 백혈병 (HCL), 호지킨 림프종 (HL), 만성 골수성 백혈병 (CML) 및 다발 골수종 (MM)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 혈액암인, 방법.