KR20220054232A - 짧은 peg 링커를 이용한 방사성 표지된 항체 컨쥬게이트를 포함하는 면역 영상화제 - Google Patents

짧은 peg 링커를 이용한 방사성 표지된 항체 컨쥬게이트를 포함하는 면역 영상화제 Download PDF

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Abstract

짧은 PEG링커를 이용한 방사성 표지된 항체 컨쥬게이트를 포함하는 면역 영상화제에 관한 것으로, 일 양상에 따른 화합물-링커-단백질 컨쥬게이트는 생체 내에서 방사능 동위원소를 이용하여 생체 내 뚜렷한 영상을 만들 수 있으며, 이를 통한 질병진단이 가능한 효과가 있다. 나아가, 상기 화합물을 이용하여 생체 내 영상화를 수행하는 경우, PEG 링커의 도입에 따른 체외 배출속도의 차이 및 영상 백그라운드의 노이즈 감소 효과를 이용하여 종양을 더 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있다.

Description

짧은 PEG 링커를 이용한 방사성 표지된 항체 컨쥬게이트를 포함하는 면역 영상화제{Immuno-imgaing agent comprising radiolabeled antibody conjugate using short PEG linker}
짧은 PEG 링커를 이용한 방사성 표지된 항체 컨쥬게이트를 포함하는 면역 영상화제에 관한 것이다.
면역-PET 이미징은 양전자 방출 방사성 동위원소를 가진 항체를 생체내에서 비침습적으로 추적하고, 시각화 및 정량화하는 핵 이미징 기술 중 하나이다. 다양한 PET 방사성 동위원소의 가용성 증가와 항체를 위한 가벼운(mild) 방사성 동위원소의 개발은 종양 진단, 방사성 면역요법 및 면역학에서 그것의 광범위한 적용으로 이어지는 방사선 동위원소의 준비를 용이하게 한다. 종양 영상촬영을 위해 주변 배경 노이즈와 별도로 종양을 시각화할 수 있는 최소 대비(contrast)를 달성해야 한다. 항체는 수일의 생물학적 반감기를 가지고 있기 때문에, 적절한 영상 대조는 일반적으로 방사선 표지 항체를 주입한 후 수일이 경과되어야 달성된다. 따라서 면역-PET 이미징에는 얼마간의 시간이 필요하고, 이러한 시간이 길어질수록 몇 가지 안전 및 경제적 문제를 초래한다. 우선, 환자는 추가적인 방사선 위험에 노출되고, 적절한 방사선 관리를 위해 따로 입원을 해야 한다. 방사선 동위 원소의 경우, 89Zr (t 1/2 3.27 d) 과 124I (t 1/2 4.2 d)와 같이 반감기가 수일인, 방사성 동위 원소들만 선택하여 면역-PET 영상에 사용할 수 밖에 없다.
이와 관련하여 적절한 영상 대비를 개발하는 데 필요한 시간을 단축하기 위한 다양한 접근법이 전임상 및 임상연구 모두에서 개발되고 시험되었다. 항체 파편과 조작된 항체를 사용함으로써, 더 작은 크기의 항체의 혈액 순환 시간이 상당히 단축되었고, 더 이른 시점에서 적절한 대조를 이루었다. 또 다른 유망한 접근법은 다른 생체 분자와는 반응하지 않고, 원하는 분자와만 선택적으로 결합하는 생물직교(biorthogonal) 반응 부분(moiety)들을 가진 항체를 먼저 주입한 다음, 비표적(untargeted) 항체들이 제거되도록 충분한 시간 지연 후에, 표적에 대한 반응성을 가진 저분자 방사성 트레이서(radiotracer)를 주입하는 사전 대상화(pretargeting) 기법이다. 사전 대상화 전략에서, 방사성 트레이서를 주입 후 몇시간 이내에 적절한 대비를 달성할 수 있다. 따라서 짧은 반감기의 방사성 동위원소를 포함한 보다 다양한 PET 방사성 동위원소를 물리적 반감기 제한 없이 사용할 수 있다. 그러나 이러한 모든 접근법은 추가적인 정교한 단계를 요구하며, 대부분의 경우 이러한 전처리 단계는 시간이 많이 걸리고 임상적용에 대한 전반적인 비용을 증가시킨다.
보다 단순한 접근법으로서, 항체 접합체(conjugate)의 약동학적 특성을 보다 유리한 방법으로 바꾸기 위해 다양한 링커들을 항체에 부착하였다. 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)은 생물학적 가용성, 안정성, 안전성 및 치료적 효능을 향상시키기 위해 항체-약제 접합체의 준비에 많이 사용되었지만, 단백질 또는 나노입자의 PEG부착은 부착된 단백질 또는 나노입자의 혈액 순환 시간을 증가시킨다고 알려져 있기 때문에 방사성면역접합체 제조에서 링커로서 PEG의 사용은 제한적이었다. 방사선 표지 항체의 순환 시간을 연장함으로써 종양 흡수를 부분적으로 증가시킬 수 있고 정상 조직에서의 의도하지 않은 흡수를 감소시켜 종양 대 배경 비율을 개선할 수 있다. 하지만, 방사능의 체내 제거를 지연시킴으로써, 환자에게 원치않는 방사능 노출을 증가하는데, 이것은 임상적인 적용으로는 받아들여지지 않는다.
단일 클론 항체(mAb)는 광범위한 가용성과 특정 항원을 표적으로하는 견줄데 없는 능력 때문에 종양학에서 진단 및 치료 용도로 널리 사용되어 왔다. 면역 양성자 방출 단층촬영(immuno-PET)은 방사선 표지 항체의 생체 내 행동을 실시간으로 모니터링하는데 사용되는 강력한 핵영상기술이다. 면역-PET은 종양 진단, 면역요법, 방사선면역치료에 중요한 정보를 제공한다. 면역-PET 영상의 중요성은 최근 암 면역 요법의 성공과 함께 커지고 있다.
항체의 방사선표지과정은 복잡하다. 항체는 가혹한 조건 하에서 매우 취약하기 때문에, 반응 pH, 완충제, 온도, 반응 시간, 방사능 및 유기 용매의 선택을 신중하게 고려해야 한다. 항체는 일반적으로 40℃이상의 온도에서 분해되고 생물학적으로 비활성 상태가 된다.
일반적으로 분자량이 150 kD인 부피가 큰 항체에 단지 몇 개의 원자를 부위특이적(site-specific)으로 부착하는 것은 어려운 일이다. 이온성 방사성금속들은 일반적으로 방사성표지에 사용되며, 항체에 직접적으로 부착되지 않는다. 대신에, 이작용성 킬레이터(bifunctional chelator; BFC)를 사용하여 이들 사이에 연결을 형성합니다. BFC는 방사성금속 이온을 단단히 결합시키고 동시에 항체의 아미노산잔기와 결합한다. 항체에서 라이신 잔기의 높은 유병률(prevalence) 때문에 라이신의 아민 그룹은 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS) 에스터(ester) 및 이작용성 킬레이터의 아이소시오시아네이트(isothiocyanate) 그룹과의 결합에 가장 일반적으로 사용된다. 시스테인(cysteine)의 함량이 더 낮기 때문에, 라이신 잔기는 킬레이터의 도입에 대한 부위 특이적 결합 및 정량적 제어를 위한 더 나은 선택이다. 항체에 유입된 이작용성 킬레이터의 수와 위치는 결합 친화도에 영향을 미치며 전체 방사성 표지 항체의 약동학에 큰 영향을 미칠 수 있다. 이러한 이유로, 다른 아미노산 작용기의 사용은 때때로 더 나은 결과를 산출한다. 항체의 메티오닌(methionine) 잔기는 최근에 새롭고 유망한 결합 부위로 보고되었다. 그러나, 다양한 아미노산에 대한 선택적 결합의 효과를 직접적으로 비교하기 위해 다른 반응성 작용기이지만 공통 킬레이트 골격을 가진 일련의 BFC 유도체들을 합성하는 것은 매우 어렵다.
생체 내 영상촬영을 위해 방사성 표지 항체를 체내에 주입할 때는 다른 요인들도 고려해야 한다. 이상적으로, 방사성 동위원소는 항체에 단단히 결합되어 있고 생체 내 순환 동안 분리되지 않는다. 그러나 인체는 다양한 이화작용을 통해 외부 화합물을 포착하고 분해하는데 매우 효과적이다. 이것이 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA)과 디에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylenetriaminepentaacetic acid; DTPA)과 같은 고전적인 킬레이터가 방사성 표지를 위한 이작용 킬레이터로 사용될 가능성이 낮은 이유이다. 이러한 킬레이터에 의해 형성된 많은 방사성금속 복합체는 생체 내에서 금속 이온을 천천히 방출한다. 방사성 표지된 킬레이터의 체내 안정성은 항체 영상화에 매우 중요하다. 항체의 생물학적 반감기는 펩타이드와 같은 작은 생체분자보다 훨씬 더 길기 때문에 방사선 표지된 항체는 체내에 오래 남아있고, 체외로 배출되기 전에 탈금속화(demetallation)에 취약하다. 면역-PET 영상은 일반적으로 종양 대 배경 비율을 극대화하기 위해 주입 후 24-72시간 뒤에 촬영한다.
Cu-64는 면역-PET 영상촬영에 일반적으로 사용되는 몇 안되는 방사성 금속이온 중 하나이다. 12.7h로 적당히 긴 반감기를 가지고 있어, 생체 내 항체의 분포 및 표적 위치파악에 충분한 시간을 소요할 수 있으며, 항체 투여 후 48시간까지 쉽게 영상을 수행할 수 있다. 높은 고유활성도(specific activity)를 가진 Cu-64는 현재 대량으로 이용가능하다.
이작용성 킬레이터(bifunctional chelator;BFC) 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid (NOTA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA), 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid (TETA) 및 이들의 유도체들은 일반적으로 Cu-64로 항체를 방사선 표시하는데 사용된다. 시중에서 구할 수 있고, 반응 온도가 40℃이하로 가벼운(mild) 방사선 표지 조건 때문이다. 그러나, 최근의 연구들은 이러한 킬레이트(chelate)들도 생체 내에서는 불안정하다는 것을 보여주었다. 이들의 탈금속화는 자유구리이온들의 방출 및 순환을 일으켜, PET 영상에서 원하지 않는 배경 노이즈를 발생시킨다. 탈금속화 문제를 해결하기 위해, 매우 안정적인 구리(II) 복합체를 형성하는 새로운 범주의 propylene cross-bridged TE2A (PCB-TE2A) 킬레이터를 개발하였다. 그러나, 교차 브리드(cross-bridged) 킬레이터는 오직 고온(>80℃에서 구리 이온과 복합체를 형성하여, 열에 민감한 항체에 대한 적용은 아직 달성되지 않았다.
일 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물-링커-단백질 컨쥬게이트를 제공하는 것이다;
[화학식 1]
Figure pat00001
다른 양상은 상기 컨쥬게이트를 포함하는 생체 내 영상화를 위한 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 컨쥬게이트를 포함하는 암진단을 위한 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물-링커-단백질 컨쥬게이트를 제공하는 것이다;
[화학식 1]
Figure pat00002
D는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물이고,
[화학식 2]
Figure pat00003
상기 X는 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아마이드, 니트로, 에테르, 에스테르, 에스터, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 하이드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고;
상기 R1은 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고;
상기 A는 주변 분자에 배위결합된 금속성 방사성 동위원소이고;
상기 B는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질 또는 링커에 부착을 위한 적어도 하나 이상의 산소 또는 치환 가능한 질소를 포함하는 것 또는 H이고;
L은 (PEG)n를 포함하는 링커이고, 여기서 n은 2 내지 8의 정수이고;
P는 표적 세포 또는 표적단백질 결합능을 갖는 단백질이다.
일 구체예에 있어서, 상기 X는 에스터이고; 상기 R1은 메틸이고; 상기 B는 아민일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 D는 하기 화학식 3으로 표시되는 것일 수 있다;
[화학식 3]
Figure pat00004
상기 X는 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아마이드, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고;
상기 A는 방사성 동위원소이고;
상기 R2, R3, 및 R5 는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고;
상기 R4는 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 X는 에스터기이고; 상기 R2 및 R3는 각각 독립적으로 메틸, 에틸 및 프로필로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고; 상기 R4는 H이고; 상기 R5는 에틸인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 18F, 11C, 13C, 13N, 15O, 60Cu, 64Cu, 67Cu, 124I, 68Ga, 52Fe, 58Co, 3H, 14C, 35S, 32P, 131I, 59Fe, 60Co, 89Sr, 90Sr, 90Y, 99Mo, 133Xe, 137Cs, 153Sm, 177Lu, 186Re 123I, 125I, 201Tl 또는 67Ga 일수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (PEG)n을 포함하는 링커는 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2 내지 4, 2 내지 3 또는 3 내지 4개의 (PEG)n를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 L은 하기 화학식 4로 표시되는 것일 수 있다;
[화학식 4]
Figure pat00005
상기 E는 제 1작용기가 테트라진(tetrazine), 말레이미드(maleimide), NH2, COOH 또는 옥사지리딘(oaxziridine)이고, 제 2 작용기는 노르보넨(norbornene), 트랜스-시클로옥텐(trans-cyclooctene) 또는 1-메틸-시클로프로펜(1-methyl-cyclopropene)인 상기 두 작용기 간의 클릭 반응(Click reaction) 결과 화합물이고;
상기 F는 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아마이드, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 화학식 4에 있어서, D에 인접한 제1 (PEG)m 및, P에 인접한 제2 (PEG)m을 포함하고, 상기 m은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 E은 하기 화학식 5로 표시되는 것일 수 있다;
[화학식 5]
Figure pat00006
일 구체예에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 항체, 항원 결합 단편, 애피바디(affibody), 다이아바디(diabody) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질", "표적세포 인식능을 갖는 단백질", 또는 "표적 세포 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질"은 세포의 수용체 또는 표적 단백질을 특이적으로 인식하는 또는 세포의 수용체 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포의 수용체 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질은 항체, 항원 결합 단편, 애피바디(affibody), 다이아바디(diabody) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "항체(antibody)"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 명세서의 목적상, 항체는 표적 세포 또는 표적 세포에서 발현하는 수용체에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 명세서의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부인 항원 결합 단편도 본 명세서의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있다.
일 구체예에 있어서 상기 링커는 상기 단백질의 아민기에 연결된 것일 수 있다. 상기 아민기는 N-말단의 알라딘, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파트르산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글라이신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오니, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린 잔기일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 링커는 상기 항체의 Fc 영역과 연결된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서 상기 항체는 Trastuzumab, Trastuzumab Emtansine, Pertuzumab, Rituximab, Ibritumomab tiuxetan, Tositumomab, Brentuximab vedotin, Ofatumumab, Obinutuzumab, Necitumumab, Bevacizumab, Ramucirumab, Nivolumab, Pembrolizumab, Atezolizumab, Durvalumab, Ipilimumab 일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "애피바디 분자(affibody molecule)"는 특정 타겟 단백질(수용체)에 결합할 수 있는, 항체 모사체를 의미할 수 있다. 일반적으로 애피바디 분자는 20 내지 150의 아미노산 잔기로 구성되며, 2 내지 10개의 알파 헬릭스로 구성된 것일 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 애피바디 분자는 항-ErbB 애피바디 분자(ab31889), HER2-특이적 애피바디 분자(ZHER2:342), 항-EGFR 애피바디 분자(ZEGFR:2377) 등을 포함할 수 있다. 또한, 이에 한정되지 않고, 세포의 특정 수용체 또는 표적 단백질을 인식할 수 있는 애피바디 분자를 모두 포함한다. 상기 애피바디 분자가 인식할 수 있는 표적 수용체 또는 표적 단백질의 예는, 아밀로이드 베타 펩티드, 시누클레인(예를 들면, 알파-시누클레인), 아포리포프로테인(예를 들면, 아포리포프로테인 A1), 보체 인자(Complement factor)(예를 들면, C5), 탄산무수화효소(Carbonic anhydrase)(예를 들면, CAIX), 인터루킨-2 수용체 알파 사슬(IL2RA; CD25), 세포 표면의 CD 항원(예를 들면, CD28), 또는 c-Jun, Factor VIII, 프비르노겐, GP120, H-Ras, Her2, Her3, HPV16 E7, IAPP(Human islet amyloid polypeptide), 이뮤노글로불린 A(IgA), IgE, IgM, 인터루킨(예를 들면, IL-1, IL-6, IL-8, IL-17), 인슐린, 스타필로코커스 단백질 A 도메인(Staphylococcal protein A domain), Raf-1, LOV 도메인(Light-oxygen-voltage-sensing domain), 또는 RSV G 단백질일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "앱타머(Aptamer)"는 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형 핵산)을 의미할 수 있다. 본 명세서의 목적상, 앱타머는 표적 세포 또는 표적 세포에서 발현하는 수용체에 대해 특이적으로 결합하는 분자를 의미하며, SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 등의 방법에 의해 제조될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 표적 단백질은 암 관련 항원 또는 수용체 타이로신 카이네이즈(Receptor tyrosine kinases: RTKs)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, '종양'은 체내의 세포가 자율성을 가지고 과잉으로 발육한 상태를 말하며, 세균 감염, 바이러스 감염, 유전자 변이 등에 의하여 발생할 수 있다. 일반적으로 더 이상 세포분열(크기 증가)을 하지 않거나 천천히 성장하는 양성 종양과 세포분열이 빠르게 진행되고, 주변부에 파고 들거나 혈액 또는 림프관을 타고 이동하여 다른 곳에서도 성장하는 악성 종양으로 분류하며, 악성종양을 '암'으로 부르기도 한다.
상기 암은 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, AIDS-관련 암, AIDS-관련 림프종, 항문암, 충수암, 별아교세포종 (소아 소뇌 또는 대뇌), 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 뇌간 교종, 뇌 종양 (소뇌 별아교세포종, 대뇌 별아교세포종/악성 교종, 뇌실막세포종, 수모세포종, 천막위 원시 신경외배엽 종양, 시각 경로 및 시상하부 교종), 유방암, 기관지 선종/카르시노이드, 버킷 (Burkitt) 림프종, 카르시노이드 종양 (소아, 위장관), 모르는 원발성 암종, 중추 신경계 림프종 (원발성), 소뇌 별아교세포종, 대뇌 별아교세포종/악성 교종, 자궁경부암, 소아암, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식 장애, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 섬유조직형성 소형 원형 세포 종양, 자궁내막암, 뇌실막세포종, 식도암, 유잉 종양과의 유잉 육종, 두개외생식 세포 종양 (소아), 고환외 생식 세포 종양, 간외 담관암, 안구 암 (안구내 검은색종, 망막모세포종), 담낭암, 위 (위장) 암, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 간질 종양, 생식 세포 종양 (소아 두개외, 고환외, 난소), 임신 융모 종양, 교종 (성인, 소아 뇌간, 소아 대뇌 별아교세포종, 소아 시각 경로 및 시상하부), 위 카르시노이드, 털세포 백혈병, 두경부암, 간세포 (간) 암, 호지킨 림프종, 하인두 암, 시상하부 및 시각 경로 교종(소아), 안구내 검은색종, 섬세포 암종, 카포시 육종, 신장암 (신장 세포 암), 후두암, 백혈병 (급성 림프모구, 급성 골수성, 만성 림프구, 만성 골수성, 털세포), 입술 및 구강 암, 간암 (원발성), 폐암 (비소세포, 소세포), 림프종 (AIDS-관련, 버킷 (Burkitt), 피부 T-세포, 호지킨, 비-호지킨, 원발성 중추 신경계), 거대글로불린혈증 (발덴스트롬), 골의 악성 섬유성 조직구종/골육종, 수모세포종 (소아), 검은색종, 안구내 검은색종, 메르켈 세포 암종, 중피종 (성인 악성, 소아), 잠재적 원발성의 전이성 두경부 편평세포암, 구강암, 다발 내분비샘 종양 증후군 (소아), 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상 식육종, 골수형성이상 증후군, 골수형성이상/골수증식 질병, 골수성 백혈병 (만성), 골수성 백혈병 (성인 급성, 소아 급성), 다발성 골수종, 골수증식 장애 (만성), 비강 및 부비동 암, 코인두 암종, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 입암(oral cancer), 입인두암, 골의 골육종/악성 섬유성 조직구종, 난소암, 난소 상피 암 (표면 상피-간질 종양), 난소 생식 세포 종양, 난소 저 악성 잠재성 종양, 이자 암, 이자 암 (섬세포), 부비동 및 비강암, 부갑상샘암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 송과체 별아교세포종, 송과체 종자세포종, 송과체모세포종 및 천막위 원시 신경외배엽 종양 (소아), 뇌하수체 샘종, 형질 세포 신생물, 흉막폐 모세포종, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선 암, 직장암, 신장 세포 암종 (신장암), 신우 및 요관 이행 세포 암, 망막모세포종, 횡문근육종 (소아), 침샘 암, 육종 (유잉과의 종양, 카포시, 연조직, 난관), 세자리 증후군, 피부암 (비검은색종, 검은색종), 피부 암종 (메르켈 세포), 소세포 폐암, 소장 암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 잠재적 원발성 (전이성)의 두경부 편평세포 암, 위암, 천막위 원시 신경외배엽 종양 (소아), T-세포 림프종 (피부), 고환암, 인후암, 흉선종 (소아), 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 갑상선암 (소아), 신우 및 요관의 이행 세포 암, 융모 종양 (임신성), 모르는 원발 부위 (성인, 소아), 요관 및 신우 이행 세포 암, 요도 암, 난관 암 (자궁내막), 난관 육종, 질암, 시각 경로 및 시상하부 교종 (소아), 외음부 암, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 및 빌름스 종양 (소아)폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제1 중추신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 아데노마로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 수용체 타이로신 카이네이즈는 표피 성장인자 수용체, 인슐린 수용체, 혈소판 유래 성장인자 수용체, 혈관내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF) 수용체, 섬유아세포 성장인자 수용체, 콜레시스토키닌(Cholecystokinin: CCK) 수용체, 신경영양인자(Neurotrophic factor: NGF) 수용체, 간세포 성장인자 (Hepatocyte growth factor: HGF) 수용체, 에프린(Ephrin: Eph) 수용체, 안지오포이에틴 수용체, 및 RYK(related to receptor tyrosine kinase) 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에서 용어 혈관 내피 성장인자 "VEGF"는 혈관내피세포의 생장활성을 증진시키는 성장인자의 일종으로, 대시식세포, 평활근세포, 종양세포 등 여러 세포에 의하여 분비된다. 태생기 혈관 생성에 중요한 역할을 할 뿐 아니라 빠른 생장과 대사가 이루어지는 종양 조직에서 산소의 공급을 위하여, 혈관신생(angiogenesis)를 유도하는 역할을 한다. 구체적으로 또는 문맥상 달리 명시하지 않는 한, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-G 및 PLGF의 7종의 멤버를 포함하는 VEGF 패밀리의 임의의 천연, 변이체 또는 합성 VEGF 폴리펩타이드, 또는 이의 단편을 지칭하며, 모든 멤버는 각각의 단량체 내에 보존된 중심 4가닥의 β-시트의 일측 단부에 분자 사이 및 분자 내 이황화 결합에 관련된 8개의 불변 시스테인 잔지를 갖는 시스테인 매듭 (knot) 모티프로 구성되는 공통의 VEGF 상동 도메인을 가지며, 역평행의 나란한 (side-by-side) 배향으로 이합체화되고, 혈관생성에 참여한다. VEGF 패밀리 내의 각 멤버는 별개의 유전자에 의해 코딩된다; 그러나 각 멤버는 선택적인 스플라이싱 또는 단백질분해로 인해 다수의 상이한 이소폼을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 암 관련 항원은 CD19, CD20, CD30, CD33, CD52, HER2, EGFR, VEGF, CEA, EpCAM, SCC, BAP, Osteocalcin, NSE, Cyfra 21-1, TPA, CA19-9, 5-HIAA, hCGβ, NMP22, PSA, S100, Calcitonin, Thyroglobulin, CA15-3, CA27.29, ER, PR, Transferrin receptor, uPA, PAI-1, AFP, Ferritin, CA72-4, CA125, HE4, BRAF 또는 V600E 일 수 있다.
다른 양상은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물-링커-단백질 컨쥬게이트를 포함하는 생체 내 영상화를 위한 조성물을 제공한다.
상기 영상화는 자기 공명 이미징(Magnetic resonance imaging: MRI), 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography: PET) 또는 단일 광자 방출 계산된 단층촬영(single-photon emission computed tomography: SPECT)일 수 있다.
다른 양상은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물-링커-단백질 컨쥬게이트를 포함하는 암진단을 위한 조성물을 제공한다.
일 양상에 따른 화합물-링커-단백질 컨쥬게이트는 생체 내에서 방사능 동위원소를 이용하여 생체 내 뚜렷한 영상을 만들 수 있으며, 이를 통한 질병진단이 가능한 효과가 있다. 나아가, 상기 화합물을 이용하여 생체 내 영상화를 수행하는 경우, PEG 링커의 도입에 따른 체외 배출속도의 차이 및 영상 백그라운드의 노이즈 감소 효과를 이용하여 종양을 더 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있다.
도 1a는 생물직교(biorthogonal) 클릭 반응을 통한 Trastuzumab의 방사선 표지에 대한 것으로, 64Cu-NOTA-trastuzumab합성에 대한 개략도이다; 도 1b는 자유 64CuCl2(검정색) 및 64Cu-NOTA-trastuzumab(빨간색)에 대한 radio-TLC 결과 그래프이다; 도 1c는 64Cu-NOTA-PEG4-Tz 합성에 대한 개략도이다; 도 1d는 NOTA-PEG4-Tz의 1H NMR결과 그래프이다; 도 1e는 NOTA-PEG4-Tz의 13C NMR결과 그래프이다; 도 1f는 NOTA-PEG4-Tz의 HR-MS결과 그래프이다; 도 1g는 64Cu-NOTA- PEG8-trastuzumab의 합성에 대한 개략도이다; 도 1h는 64Cu-NOTA-PEG4-Tz(검정색) 및 64Cu-NOTA- PEG8-trastuzumab(빨간색)의 radio-TLC결과 그래프이다.
도 2a는 PCB-TE2A-allkyne 합성에 대한 개략도이다; 도 2b는 Cu-PCB-TE2A-allkyne 합성에 대한 개략도이다; 도 2c는 Cu-PCB-TE2A-tetrazine 합성에 대한 개략도이다; 도 2d는 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine 합성에 대한 개략도이다; 도 2e는 Cu-PCB-TE2A-tetrazine (검정색) 및 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine (빨강색)에 대한 HPLC 크로마토그램 결과 그래프이다; 도 2f는 Trastuzumab-TCO 및 64Cu-PCB-TE2A-Trastuzumab 합성에 대한 개략도이다; 도 2g는 Trastuzumab-PEG4-TCO 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-Trastuzumab 합성에 대한 개략도이다; 도 2h는 구리촉매를 이용한 아자이드-알킨 고리부가반응을 통한, PCB-TE2A-alkyne과 아자이드 유도체 사이의 반응에 의한 PCB-TE2A 접합체들의 합성에 대한 개략도이다.
도 3는 64Cu-NOTA-trastuzumab 및 64Cu-NOTA- PEG8-trastuzumab의 PBS 및 FBS 에서의 경과 시간별 안정성을 보여주는 그래프이다.
도 4은 세포주별 64Cu-NOTA-trastuzumab 및 64Cu-NOTA- PEG8-trastuzumab의 세포흡수율을 보여주는 그래프이다.
도 5는 혈액에서 64Cu-NOTA-trastuzumab 및 64Cu-NOTA- PEG8-trastuzumab의 반감기를 보여주는 그래프이다.
도 6는 NIH3T6.7 종양이 있는 누드 마우스들에게 64Cu-NOTA-trastuzumab 또는 64Cu-NOTA- PEG8-trastuzumab 주입 후, 24시간 및 48시간에서 잔존하는 방사능(Radioactivity)을 나타내는 그래프이다.
도 7은 24시간 동안 소변 및 대변에서 64Cu-NOTA-trastuzumab 및 64Cu-NOTA- PEG8-trastuzumab의 배설된 활성에 대한 것으로, 시간별로 주입량 대비 배출량의 백분율을 나타내는 그래프이다. (n=3)
도 8은 64Cu-NOTA-trastuzumab 및 64Cu-NOTA- PEG8-trastuzumab의 대사에 관한 것으로, A는 64CuCl2(검정색) 및 64Cu-NOTA-trastuzumab(빨간색)에 대한 radio-TLC 결과 그래프; B는 64CuCl2(검정색) 및 64Cu-NOTA- PEG8-trastuzumab (빨간색)에 대한 radio-TLC 결과 그래프; C는 소변샘플에서 64Cu-NOTA-trastuzumab(빨간색)에 대한 radio-TLC 결과 그래프; D는 소변샘플에서 64Cu-NOTA- PEG8-trastuzumab (빨간색)에 대한 radio-TLC 결과 그래프이다.
도 9은 주입후 24시간 및 48시간후, 정상 BALB/c 마우스에서 64Cu-NOTA-trastuzumab 및 64Cu-NOTA- PEG8-trastuzumab의 생체분포(Biodistribution)를 나타내는 그래프이다. (n=4)
도 10는 주입후 24시간 및 48시간후, NIH3T6.7 종양이 있는 BALB/c 마우스에서 64Cu-NOTA-trastuzumab 및 64Cu-NOTA- PEG8-trastuzumab의 생체분포(Biodistribution)를 나타내는 그래프이다. (n=3)
도 11은 NIH3T6.7 종양이 있는 수컷 누드마우스에 64Cu-NOTA-trastuzumab를 주입후 24시간(A) 및 48시간(B) 또는 64Cu-NOTA- PEG8-trastuzumab를 주입후 24시간(C) 및 48시간(D)에 촬영한 영상을 나타낸 것으로, 종양(흰색 화살촉), 심장(빨간색 화살표), 간(흰색 화살표), 비장(빨간색 화살촉) 및 방광(흰색 이중 화살표)을 표시한 MIP-PET/CT 이미지이다.
도 12a는 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 PBS 및 FBS 에서의 경과 시간별 안정성을 보여주는 그래프이다; 도 12b는 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab 및 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab의 생체내(혈액, 간 및 신장)에서의 안정성을 보여주는 그래프이다; 도 12c는 세포주별 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 세포흡수율을 보여주는 그래프이다; 도 12d는 NIH3T6.7 세포에서 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 결합포화도를 나타내는 그래프이다.
도 13는 주입후 24시간 및 48시간후, NIH3T6.7 종양이 있는 BALB/c 마우스에서 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 생체분포(Biodistribution)를 나타내는 그래프이다. (n=3)
도 14은 NIH3T6.7 종양이 있는 누드마우스에 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab를 주입후 24시간(A) 및 48시간(B) 또는 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab를 주입후 24시간(C) 및 48시간(D)에 촬영한 영상을 나타낸 것으로, 종양(흰색 삼각형), 심장(파란색 삼각형), 간(노란색 삼각형), 비장(보라색 삼각형) 및 방광(녹색 삼각형)을 표시한 PET/CT 이미지이다.
도 15는 NIH3T6.7 종양이 있는 누드 마우스들(n=3)에게 64Cu-PCB-TE2A- trastuzumab 또는 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab 주입 후, 24시간 및 48시간에서 잔존하는 방사능(Radioactivity)을 나타내는 그래프이다.
도 16는 이중 클릭 반응을 통해 생성된 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 개략도이다.
도 17은 이중 클릭 반응을 통해 생성된 64Cu-NOTA-trastuzumab 및 64Cu-NOTA- PEG8-trastuzumab의 개략도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. NOTA-trastuzumab의 제조
0.1M 탄산나트륨 버퍼(pH 8.5, 200 ㎕)를 용매로 하는 NOTA-Bn-NCS(102 ㎍, 0.18 μmol)용액에 Trastuzumab (5㎎, 0.034μmol)을 첨가하였다. 그후, 실온에서 14시간 동안 부드럽게 흔들었다. 그런 다음 용액을 센트리콘 YM-50 원심 필터 유닛(Millipore, MA, USA)으로 옮겨 원심분리하고, 4℃에서 Mili-Q 물로 세번 세척하였다. NOTA-trastuzumab 접합체는 Mili-Q 물 1 ㎖에 채취하여 감압하에 동결 건조하여 흰색 고체(3.55㎎)를 얻었으며, 사용 전 -20℃의 온도에서 저장하였다(도1a).
실시예 2. NOTA-trastuzumab의 방사선 표지( 64 Cu-NOTA-trastuzumab의 제조)
64CuCl2(25.9MBq)를 포함하는 0.01M HCl 0.1M에 NH4OAC 버퍼(pH 6.8) 100㎕에 용해된 NOTA-trastuzumab(30㎍)을 첨가하고 25°C에서 30분동안 가열혼합기(thermomixer)(750rpm)에 정치(incubate)하였다(도1a). 반응은 radio-TLC [iTLC-SG, 50 mM EDTA; Rf = 0.0]를 이용하여 모티터링을 하였고, 방사선 표지의 수율은 93.7%였다(도 1b). 그런 다음 방사성 표지된 항체(25.5 MBq)를 분획분자량 50,000의 원심여과장치(centrifugal filter unit)(Sartorius Vivacon-500 ㎕, 재생 셀룰로스, Millipore사, Bedford, MA, USA)에 로드(load)한 뒤, 12000 rpm으로 7분동안 원심분리하였다. 원심분리물은 PBS 200 ㎕로 세번 세척되었고, 식염수 또는 PBS에 17.98 MBq의 64Cu-NOTA-trastuzumab가 분리되었다. 최종 항체 접합체의 방사성화학적 순도는 radio-TLC [iTLC-SG, 50 mM EDTA; Rf = 0.0]를 이용하여 분석되었으며, 방사성 표지 순도는 100%로 밝혀졌다. radio-TLC 실험에서, 64Cu-NOTA- trastuzumab은 기준선에 머물러 있는 반면, 자유 64CuCl2는 용매 전선으로 용출되었다.
실시예 3. NOTA-PEG 4 -Tz의 합성
DMF 2 ㎖가 용매인 NOTA-Bn-NCS(23.1㎎, 0.041 mmol)와 메틸테트라진-PEG4-NH2(15㎎, 0.041 mmol) 혼합용액에 DIPEA(72 ㎕, 0.413 m㏖)를 방울(dropwise) 단위로 첨가하였다. 그 결과 생성된 반응 혼합용액을 실온에서 14시간 동안 저은 후 Mili-Q 물 1 ㎖로 희석한 후 감압 하에 동결 건조하였다. 생성된 조고체(crude solid)를 메탄올에 다시 녹인 후, 예비 X-terra C18 칼럼(10 ㎛, 10 Х 250 mm)과 함께 워터스 HPLC를 사용하여 0.1% TFA의 경사로 용출하여 정제되었다. 1.8 ㎖/min의 유속에서 TFA의 경사(H2O:CH3CN)는 0 내지 10분동안은 95%:5%, 10 내지 20분동안은 80%:20%, 20 내지 30분동안은 70%:30%, 30 내지 40분동안은 95%:5% 였다. 그리고, 수집된 분획(fraction)들을 감압 하에 동결 건조하여, 분홍빛을 띄는 고체인 NOTA-PEG4-Tz(10.6㎎, 31.5%)를 생산하였다. (도 1c). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 8.42 (dd, J = 7.0 Hz, 2H), 7.76 (brs, 1H), 7.43 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 9.5 Hz, 4H), 4.23 (q, 2H), 3.97-381 (m, 2H), 3.80-3.79 (m, 4H), 3.62-3.61 (m, 4H), 3.57-3.55 (m, 8H), 3.42-3.39 (m, 3H), 3.31- 3.21 (m, 5H), 3.06-3.00 (m, 8H), 2.82-2.76 (m, 2H), 2.64-2.61 (m, 1H)(도 1d); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 180.92, 173.80, 171.93, 169.75, 166.98, 163.41, 162.44, 158.68 (CH3COOH), 129.67, 124.54, 115.85, 70.42, 69.27, 68.00, 59.14, 54.71, 53.71, 52.97, 51.92, 51.33, 44.00, 33.94, and 21.18(도 1e). HR-MS (FAB) m/z: calculated for C37H51N9O10S [M + H]+ : 813.3480; found: 814.3554(도 1f).
실시예 4. NOTA-PEG 4 -Tz의 방사선 표지( 64 Cu-NOTA-PEG 4 -Tz(4)의 합성)
0.1M NH4OAC 버퍼(pH 6.8) 100㎕에 NOTA-PEG4-Tz (20㎍)을 용해한 용액을 준비한 후, 64CuCl2(316MBq)를 포함하는 0.01M HCl 0.1M을 준비한 용액에 첨가하고 37℃에서 30분동안 가열혼합기(thermomixer)(750rpm)에 정치(incubate)하였다. 반응은 radio-TLC [Merck, C-18 TLC plates developed with CH3CN:H2O (1:1); Rf = 0.55]를 이용하여 모티터링을 하였고, 방사선 표지의 수율은 96.3%였다. 방사선 표지된 킬레이트는 역상 HPLC [X-bridge C18 column (5 μm, 4.6 Х 150 mm)를 사용하는 워터스 HPLC; 이동상 A: 0.1% TFA/H2O; B: 0.1% TFA/acetonitrile]을 이용하여 정제하였다. 1㎖/min의 유속에서 40분까지 진행하였으며, 경사는 0 내지 5분에서 0%-20% B, 20분에서 20% B, 25분에서 20%-90% B, 30분에서 0% B 였다. (도 1c).
실시예 5. TCO-PEG 4 -trastuzumab (5)의 합성.
0.1M 붕산나트륨 완충액(pH 9.0) 200㎕이 용매인 TCO-PEG4-NHS(55㎍, 0.11μmol) 용액에 Trastuzumab(3.2㎎, 0.022μmol)을 첨가하였다. 혼합용액은 가열혼합기에 넣고 25℃ 에서 12.5시간 동안 정치하였다. 그후, 혼합용액을 Centricon YM-50 원심여과장치(centrifugal filter unit) (Millipore, MA, USA)으로 옮겨, 원심분리하고, Mili-Q 물로 세 번 세척하였다. 농축된 접합체는 밀리-Q 물 1 ㎖로 채취하여, 감압하에 동결 건조하여, 흰색 고체인 trastuzumab-PEG4-TCO (5) (1.7㎎)를 생성하였으며, -20℃ 온도에서 저장하였다(도 1g).
실시예 6. 64 Cu-NOTA-PEG 4 -Tz 와 trastuzumab-PEG 4 -TCO (5) 사이의 클릭 반응(Click reaction)( 64 Cu-NOTA-PEG 8 -trastuzumab의 합성)
정제된 방사선 표지 64Cu-NOTA-PEG4-Tz in 100 ㎕ PBS (pH 7.4, 29.2 MBq)에 trastuzumab-PEG4-TCO (50 μg in 10 μL of Milli-Q water)를 첨가하였다. 반응 혼합물은 25°C에서 10분간 정치하였다. radio-TLC (C-18, CH3CN:H2O [1:1]; Rf = 0)를 이용하여 접합과정을 모니터링하였으며, 접합수율은 87.0%였다. 그런 다음 방사성 표지된 항체(26.8 MBq)를 분획분자량 50,000의 원심여과장치(centrifugal filter unit)(Sartorius Vivacon-500, 재생 셀룰로스, Millipore사, Bedford, MA, USA)에 로드(load)한 뒤, 12000 rpm으로 7분동안 원심분리하였다. 원심분리물은 PBS 200㎕로 세번 세척되었고, 식염수 또는 PBS에 19.3 MBq의 방사선 표지된 면역접합체 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab이 분리되었다. 최종 항체 접합체의 방사성화학적 순도는 radio-TLC (C-18, CH3CN:H2O [1:1]; Rf = 0)를 이용하여 분석되었으며, 방사성 표지 순도는 100%로 밝혀졌다(도 1h). radio-TLC 실험에서 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab은 기준치를 유지한 반면, 64Cu-NOTA-PEG4-Tz는 0.55의 Rf 값을 보였다(도 1g).
실시예 7. di-tert-butyl 2,2'-(16-(prop-2-yn-1-yl)-1,4,8,11-tetraazabicyclo-[6.6.3]hepta-decane-4,11-diyl)diacetate 의 합성
무수 톨루엔(100 ㎖) 내 1,8-N,N-bis(carbo-tertbutoxymethyl)1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan(1, 620 ㎎, 1.45 mmol), 2-(prop-2-yn-1-yl)propane-1,3-diyl bis(4-methylbenzenesulfonate)( 2, 628㎎, 1.48mmol) 및 과량의 무수 K2CO3(950 ㎎, 6.88 mmol)의 용액은 6일 동안 환류되었다. 그 후, 반응 혼합물은 진공 증발기에서 건조시키고, CH2Cl2(100 ㎖)가 첨가되었다. 생성된 용액은 K2CO3를 제거하기 위해 와트만 여과 종이를 통해 여과시켰고, CH2Cl2(2 X 30 ㎖)로 세척하였다. 용매는 증발되었고, 20% NaOH(20 ㎖) 수용액에 다시 용해되었고, 4시간 동안 교반되었다. 그 후, 용액은 CHCl3(3 X 50 ㎖)로 추출되었다. 추출물은 염수로 세척하였고, ㎎SO4 상에서 건조시켰고, 용매는 감압 하에서 증발시켰다. 화합물은 알루미나(염기성) 및 4% CH2Cl2/methanol을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제되었고, 회백색 고체로서 순수한 생성물 3을 얻었다(404 ㎎, 55% 수율)(도 2a). 1H NMR (500 MHz, CDCl3):1.53 (s, 18H), 1.88-1.89 (m, 2H), 2.05 (s, 1H), 2.18 (d, J = 2 Hz, 2H), 2.26 (brs, 4H), 2.31-2.32 (m, 2H), 2.47 (s, 9H), 2.94 (brs, 7H), 4.03-4.05 (m, 4H) ppm; 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 20.29, 22.43, 24.98, 28.17, 28.25, 29.70, 32.60, 47.71, 48.94, 50.85, 51.48, 52.18, 54.44, 54.76, 56.04, 57.29, 58.83, 60.39, 61.94, 69.15, 80.46, 83.05, 170.87, 170.71 ppm. HRMS(ESI)는 C28H51N4O4에 대해 계산하였고, 507.3910 [(M + H)+]; 507.3912에서 발견되었다.
실시예 8. PCB-TE2A-alkyne; 2,2'-(16-(prop-2-yn-1-yl)-1,4,8,11-tetraazabicyclo[6.6.3] heptadecane-4,11-diyl)diacetic acid.2TFA 의 합성
di-tert-butyl 2,2'-(16-(prop-2-yn-1-yl)-1,4,8,11-tetraazabicyclo-[6.6.3]hepta-decane-4,11-diyl)diacetate (80 ㎎, 0.16 mmol)은 CF3CO2H (TFA) 및 CH2Cl2 (30 ㎖)의 1:1(v/v) 혼합물에 용해되었고, 상온에서 24시간동안 교반되었다. 그 후, 용매는 유성 잔류물을 제공하기 위해 감압 하에서 제거되었고, Et2O로 수세하여 TFA 염으로서 회백색 고체 PCB-TE2A-alkyne를 얻었다(69 ㎎, 70% 수율)(도 2a). 1H NMR (500 MHz, CDCl3): 1.46 (brs, 1H), 1.71 (brs, 1H), 2.17-2.18 (m, 4H), 2.35 (brs, 4H), 2.56 (brs, 2H), 2.91-3.00 (m, 6H), 3.25-3.65 (m, 10H), 3.90 (s, 4H) ppm; 13C NMR (125 MHz, D2O): δ 16.21, 19.53, 22.68, 28.79, 47.60, 48.46, 51.30, 52.69, 54.99, 55.13, 59.20, 59.91, 71.98, 80.48, 116.42 (q, JCF = 231.5 Hz, CF3COOH), 162.59 (q, JCF = 28.2 Hz, CF3COOH), 168.40, 173.78 ppm. HRMS(ESI)는 C20H35N4O4에 대해 계산하였고, 395.2658 [(M + H)+]; 395.2658에서 발견되었다.
실시예 9. Cu-PCB-TE2A-alkyne의 합성
3㎖의 메탄올 내 PCB-TE2A-alkyne(4, 28 ㎎, 0.07 mmol) 및 Cu(ClO4)2·6H2O (39 ㎎, 0.11 mmol)은 pH 8로 조정하기 위해 1 M의 NaOH 수용액을 적가하였다. 생성된 용액은 16시간 동안 환류되었고, 냉각되었고, 디에틸에터 확산시켰다. 증착된 청색 고체를 수집하고, 건조하였다(24.8 ㎎, 77% 수율)(도 2b). HRMS(FAB): C20H32CuN4O4에 대해 456.1798 [(M + H)+]로 계산되었고; 456.1801에서 발견되었다.
실시예 10. PCB-TE2A-tetrazine 유도체(6a 내지 6e)의 합성
H2O:tert-butanol:DMSO (1:1:1, 0.3 ㎖) 내 PCB-TE2A-alkyne(4)(5 ㎎, 0.013 mmol) 및 아자이드(azide)(5a 내지 5e, 3.3 ㎎ 내지 5.6 ㎎, 0.015 mmol, 1.2 eq.)의 혼합물에 아스코르브산 나트륨(sodium ascorbate) (3.8 ㎎, 0.019 mmol, 1.5 eq.)과 CuSO45H2O (0.79 ㎎, 0.0049 mmol, 0.38 eq.)을 순차적으로 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물들을 상온에서 48시간동안 교반후, 감압하에 동결 건조하였다. 동결 건조한 조생성물(crude product)을 MeOH에 용해하고 5분 동안 원심분리하여 미반응 시약을 침전시켰다. 상층액 층을 수집하고 X-terra C18 역상 HPLC 컬럼(10μm, 10 x 250mm)으로 정제하였다. 이동상 A(H2O)와 이동상 B(CH3CN)를 이용하여 1.8 ㎖/min의 유속으로 농도구배용리(Gradient elution)를 수행하였다. 기울기(gradient)는 B에서 20%부터 40%(0-10분)로 증가하면서 시작되었고, 이어서 60% B(25분)와 80% B(30분)로 증가하였다가 20% B(40분)로 되돌아갔다. 수집된 분획물들은 화합물 6a(2.59㎎, 26.1%), 6b(1.42㎎, 14.7%), 6c(1.42㎎, 18.2%), 6d(1.28㎎, 14.9%), 6e(1.71㎎, 20.3%)를 고체로 얻기 위해 감압하에 동결 건조하였다(도 2c 및 도 2h). NMR 특성화(characterization)를 위한 충분한 양을 얻기 위해, PCB-TE2A-알킨(5㎎)을 사용하여 다수의 소규모 반응을 수행하였다. 화합물들은 1H NMR, 13C NMR 및 HR-MS를 사용하여 특성화되었다. 화합물 6a: 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ1.36 (brs, 1H), 1.46 (brs, 1H), 1.72 (brs, 1 H), 2.08 (d, 2H), 2.20 (brs, 2H), 2.45 (brs, 3H), 2.58 (s, 4H), 2.73 (brs, 6H), 2.97 (s, 3H), 3.09-3.07 (m, 5H), 3.30-3.29 (m, 6H), 3.82-3.61 (m, 8H), 3.78-3.82 (m, 4H), 4.23 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 4.49 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 9 Hz, 2H), 7.97 (s, 1H), and 8.43 (d, J = 8.5 Hz, 2H) ppm. 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ21.20, 23.16, 26.72, 29.84, 49.89, 50.24, 55.12, 56.16, 60.09, 68.02, 69.25, 70.13, 70.23, 70.41, 115.85, 123.48, 124.55, 129.68, 144.32, 162.43, 163.41, 167.01, 173.08, and 173.97 ppm. HR-MS (ESI)이 C37H57N11O8 에 대해 [M+H]+: 784.4392로 계산되었고, 784.4493에서 발견되었다. 화합물 6b: 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ1.44 (brs, 1H), 1.49 (brs, 1H), 1.79 (brs, 1 H), 2.18 (brs, 4H), 2.30-233 (m, 4H), 2.60 (s, 4H), 2.69-2.73 (m, 4H), 2.71 (brs, 4H), 3.14-3.17 (m, 4H), 3.28-3.48 (m, 8H), 3.51 (s, 10H), 3.60 (brs, 2H), 3.81 (s, 2H), 4.50 (s, 2H), 7.01 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), and 8.04 (s, 1H) ppm. 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ19.48, 24.71, 29.10, 35.60, 39.48, 50.46, 54.99, 55.81, 59.58, 60.49, 67.14, 69.71, 70.13, 118.99, 135.06, 142.29, 172.59, 173.37, and 175.85 ppm. HR-MS (FAB)이 C35H57N9O10 에 대해 [M+H]+: 763.4228로 계산되었고, 763.4256에서 발견되었다. 화합물 6c: 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ1.38 (brs, 1H), 1.51 (brs, 1H), 1.79 (brs, 1 H), 2.14 (brs, 1H), 2.28 (brs, 2H), 2.43 (brs, 3H), 2.73-2.43 (m, 8H), 2.93 (brs, 2H), 3.12-3.56 (m, 8H), 3.39 (merge with DMSO moisture, 4H), 3.56 (brs, 12H), 3.81 (s, 2H), 4.49 (brs, 2H), and 7.92 (s, 1H) ppm. 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ19.82, 22.83, 29.02, 35.21, 50.46, 54.88, 59.56, 66.69, 69.71, 70.16, 70.23, 70.26, 115.94, 118.31, 125.63, 144.72, 158.33, 158.59, and 173.06 ppm. HR-MS (FAB)이 C28H52N8O7 에 대해 [M]+: 612.3959로 계산되었고, 612.3956에서 발견되었다. 화합물 6d: 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ1.41 (brs, 1H), 1.48 (brs, 1H), 1.79 (brs, 1 H), 2.12 (d, J = 13 Hz, 1H), 2.30 (brs, 2H), 2.43-2.45 (m, 4H), 2.58 (d, 3H), 2.59-2.73 (m, 6H), 2.93-3.22 (m, 8H), 3.35 (brs, 6H), 3.49 (s, 12H), 3.61 (t, J = 6 Hz, 2H), 3.82 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 4.51 (t, J = 4.5 Hz, 2H), and 7.93 (s, 1H) ppm. 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ22.83, 26.62, 29.79, 49.85, 55.05, 60.06, 60.81, 66.73, 69.28, 70.05, 70.08, 70.10, 70.16, 70.19, 70.22, 123.54, 144.18, and 173.39 ppm. HR-MS (FAB)이 C31H55N7O10 에 대해 [M+H]+: 686.4089로 계산되었고, 686.4081에서 발견되었다. 화합물 6e: 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ1.40 (brs, 1H), 1.48-1.51 (m, 1H), 1.80 (t, J = 10 Hz, 1H), 1.94-1.97 (m, 2H), 2.11-2.14 (m, 2H), 2.22-2.30 (m, 2H), 2.37-2.42 (m, 1H), 2.58-2.99 (m, 8H), 3.09-3.14 (m, 9H), 3.40-3.50 (m, 9H), 4.34 (t, J = 7 Hz, 2H), 5.02 (s, 1H), 7.32- 7.39 (m, 5H), and 7.95 (s, 1H) ppm. 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ19.82, 22.84, 29.12, 38.09, 48.73, 54.02, 55.37, 59.57, 60.28, 65.69, 79.64, 115.93, 118.29, 128.20, 128.80, 137.65, 156.60, 158.36, 158.62, and 173.29 ppm. HR-MS (FAB)이 C31H47N9O6 에 대해 [M+Na]+: 664.3547로 계산되었고, 664.3305에서 발견되었다.
실시예 11. Cu-PCB-TE2A-tetrazine의 합성
수성 NH4OAc(0.1 M, pH = 8.0, 200 ㎕) 내 PCB-TE2A-tetrazine(1 ㎎, 0.0013 mmol)의 용액에 CuCl2·2H2O(0.34㎎, 0.002 mmol)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물은 80℃에서 6시간동안 가열되었다(도 2c). 구리 복합체의 형성은 C18 실리카 판의 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 확인되었고(C-18, MeOH: 10% NH4OAc = 1:1), HR-MS에 의해 특성화되었다. HRMS (FAB): C37H55CuN11O8에 대해 [M+H]+ 845.3609로 계산되었고; 845.3611에서 발견되었다(도 2e).
실시예 12. PCB-TE2A-tetrazine의 방사성 표지( 64 Cu-PCB-TE2A-tetrazine의 합성)
100 ㎕의 0.1 M NH4OAc 완충액(pH 8.0) 내 64CuCl2 (1 내지 5 mCi)를 100 ㎕의 0.1 M NH4OAc 완충액(pH 8.0) 내 1 내지 2 ㎍의 PCB-TE2A-tetrazine에 첨가하였다. 반응 혼합물은 95℃에서 1시간 동안 정치되었다(도 2d). 반응의 진행은 방사성-TLC[Merck, 10% NH4OAc/methanol(1:1)로 전개된 C-18 TLC 플레이트]에 의해 모니터링되었다. 64Cu 표지된 킬레이트는 Waters XBridge 역상 C18 컬럼(5㎛, 4.6 Х 150 mm)을 사용하여 HPLC(Waters Corporation, MA, USA)을 통해 정제되었다. 이동상 A는 0.1% TFA를 포함한 H2O이고, 이동상 B는 0.1% TFA를 포함한 아세토나이트릴이다. 용출(Elution)은 5분 동안 0~20% B, 5분~25분 20~90% B, 25분~40분 90~0% B의 농도구배(gradient) 프로그램에 따라, 1 ㎖/min의 유속으로 수행되었다. 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine의 잔류시간은 29분이었다. 킬레이트는 채취되어 건조된후, PBS에 용해되었다. 킬레이트의 수율은 약 60%였다. 분리된 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine의 방사화학적 순도는 Agilent HPLC 시스템((Agilent, CA, USA) 및 Waters XBridge C18 컬럼(5㎛, 4.6 Х 150 mm)을 사용하여 분석하였다. 이동상 A는 0.1% TFA를 포함한 H2O이고, 이동상 B는 0.1% TFA를 포함한 아세토나이트릴이다. 용출은 15분 동안 20% B, 15분~30분 20~90% B, 30분~40분 90~0% B의 농도구배(gradient) 프로그램에 따라, 1 ㎖/min의 유속으로 수행되었다(도 2e).
실시예 13. Trastuzumab 에 대한 TCO-NHS 및 TCO-PEG 4 -NHS의 접합
Trastuzumab (2.5 ㎎, 0.017 μmol)을 용매가 0.1 M 붕산나트륨 완충액 (pH 9.0, 200 ㎕)인 TCO-NHS(100 ㎍, 0.37 μmol) 또는 TCO-PEG4-NHS(150 ㎍, 0.29 μmol) 용액에 첨가하였다(도 2f 및 도 2g). 생성된 용액은 상온에서 부드럽게 밤새 진탕되었다. 다음 날, 혼합물은 Centricon YM-50 원심필터유닛(Millipore, MA, USA)으로 옮겼고, 부피를 줄이기 위해 원심분리한 후, Milli-Q 물로 3회 세척하였다. 농축된 접합체는 1 ㎖의 MilliQ 물에서 수집되었고, 동결건조하여 백색 고체를 얻었고(동결건조 후 TCO-trastuzumab에 대해서 1.73 ㎎ 분리되었고, TCO-PEG4-trastuzumab에 대해서 1.71 ㎎ 분리되었음), 사용 전 -20℃에서 보관하였다.
실시예 14. Trastuzumab 에 대한 NOTA-Bn-NCS의 접합
Trastuzumab (1.3 ㎎, 0.009 μmol)은 0.1 M 탄산 나트륨 완충액(pH 8.5, 200 μL) 내 NOTA-Bn-NCS(41㎍, 0.091 μmol)의 용액에 첨가되었다. 생성된 용액은 상온에서 밤새 부드럽게 진탕되었다. 다음으로, 이 용액은 Centricon YM-50 원심필터유닛(Millipore, MA, USA)으로 옮겼고, 부피를 줄이기 위해 원심분리한 후, Milli-Q 물로 3회 세척하였다. 농축된 접합체는 1 ㎖의 MilliQ 물에서 수집되었고, 동결건조하여 백색 고체를 얻었고(동결건조 후에 1.2 ㎎ 분리), 최종적으로 사용 전에 -20
Figure pat00007
에서 보관되었다.
실시예 15. 64 Cu-PCB-TE2A-tetrazine 및 trastuzumab-TCO 또는 trastuzumab-PEG 4 -TCO 간의 클릭 반응( 64 Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 또는 64 Cu-PCB-TE2A-PEG 4 -trastuzumab 의 합성)
10㎕ Milli-Q 물 안 TCO (trastuzumab-TCO) 또는 trastuzumab-PEG4-TCO 에 묶인 항체(270 ng/MBq)에 정제된 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine(37-74 MBq in 200 ㎕ PBS)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 37℃에서 10분간 정치하였다(도 2f 및 도 2g). 반응은 10분 안에 완료되는 것으로 밝혀졌고, 방사성-TLC(C-18, 10% NH4OAc/methanol (1:1))에 의해 확인되었다. 그 후, 방사성 표지된 항체는 50 kDa 분자량 컷오프 단위를 가진 원심분리 필터(Amicon Ultra 4 Centrifugal Filtration Units, Millipore Corp.)에 넣고, 5회 세척하였고(EDTA로 2회, MilliQ 물로 3회), 식염수를 이용하여 수집하였다. 원심여과 후 64Cu-PCB-TE2A- trastuzumab과 64Cu-PCB-TE2A-PEG4- trastuzumab의 방사화학수율은 각각 61%와 74%였다. 1:1 0.1M NH4OAc/메탄올 또는 50mM EDTA을 이동상으로 하고, 실리카(SG)를 매질로 하는 instant radio-TLC를 사용하여 각 표지된 생체접합체의 방사화학 순도를 평가하였다. 모든 제조물의 방사화학적 순도는 >98%으로 밝혀졌다. 1:1 0.1M NH4OAc/메탄올으로 수행된 radio-TLC 실험에서, 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 또는 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab은 기준선에 남아있었다. 50mM EDTA으로 수행된 실험에서는, 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine는 0.76의 Rf 값을 나타냈다. 각각의 방사성 면역 접합체들은 기준선에 남아있는 반면, 자유 64Cu2+ 이온들은 용매보다 앞서 용출되었다.
참조예
참조예 1. 실험 방법 및 재료
Methyltetrazine-PEG4-NH2은 Click Chemistry Tools(Scottsdale, USA)를 이용하여 제조하였다. p-SCN-Bn-NOTA는 매크로사이클릭스(Macrocyclics) (Texas, USA), Trastuzumab은 로체(Roche)(Basel, Switzerland)에서 구입하였다. 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하여 추가적인 정제없이 사용하였다. 밀리-Q 정수 시스템(Millipore, MA, 미국)은 탈이온수(>18.2 MΩ cm-1 at 25 °C)를 생성하는 데 사용되었으며, 이는 연구를 위한 완충액 및 수용액 준비에 사용되었다. 64CuCl2는 한국 서울의 한국방사선의학연구원(KIRAMS)에서 조달한 것으로 MC50 사이클로트론(Scanditronix, Sweden)에서 64Ni(p,n)64Cu 핵반응에 의해 합성되었다. 1H 및 13C NMR은 Varian Unity Inova400 및 500MHz 기기(Varian, Midland, ON)에 의해 기록되었다. 분할 패턴은 s, singlet; d, doublet; and m, multiplet 과 같이 표시된다. 고해상도 질량 스펙트럼(HRMS) 분석이 JEOL JMS700((Jeol, Tokyo, Japan)에서 수행되었다. HPLC 추적은 Waters 600 시리즈 HPLC 시스템(Waters Corporation, Milford, MA)과 Bioscan 2000 영상 스캐너(Bioscan, Washington, DC, USA)를 사용하여 방사성-TLC 데이터를 분석하였다.
참조예 2. 체외(In vitro) 혈청 안정성
방사선 표지 면역접합체 64Cu-NOTA-trastuzumab 과 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab, (10μL, 18.5-20.5 MBq)을 소태아혈청 및 인산완충생리식염수(PBS, pH = 7.4) 500μL를 각각 희석하여 37°C 조건의 가열혼합기(500 rpm)에서 정치하였다. 탈금속화(Demetalation)는 radio-TLC(iTLC-SG, 50 mM EDTA)에 의해 각각 최대 48시간까지 모니터링 되었으며, 각 연구는 3회씩 수행하였다.
참조예 3. 세포 흡수(uptake) 연구
인간 섬유아세포 NIH3T3 세포주 NIH3T6.7과 난소암 세포주 SKOV3는 일반적으로 HER2 표적 연구에서 사용되는 세포주로, HER2-양성 세포로 사용하였다. 인간 배아 신장 세포주(HEK293)와 쥐결장암 세포주(CT26)는 HER2 음성 세포로 사용하였다. 모든 세포주들은 한국세포주은행 또는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구했다. 세포들은 high-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium 또는 소태아혈청 10%, 항생제 1%가 보충된 로즈웰 파크 기념 연구소(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지(Hyclone, Logan, UT, USA)에서 배양(culture)되었다. 세포들은 5% CO2를 포함하는 대기에서 37°C의 인큐베이터에서 배양(incubate)되었다. 모든 세포들은 한 웰(well)당 1 Х 105세포의 밀도로 6-well plate에 시드(seed)하고, 하룻밤동안 배양하였다. 64Cu-NOTA-trastuzumab 과 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab 샘플들은 37 kBq/㎖의 관련 세포배양배지에서 준비되었다. 각 웰(각 세포주들 n=3)에 샘플(1 ㎖)들을 첨가한 후, 1시간 동안 배양하였다. 그후, 세포들을 PBS로 3회 세척하였고, 0.25% 트립신-EDTA용액(Hyclone, Logan, UT, USA)으로 세포를 채취하였다. 채취된 세포는 감마 계수기(counter)((Wallac Wizard 1480, PerkinElmer, France)로 측정하였다.
참조예 4. 실험동물
모든 동물실험은 관련 지침과 규정에 따라 진행되었으며 경북대학교 동물윤리위원회(승인번호 2019-0100, 2019-0101)의 승인을 받았다. 동물들은 Hyochang Science (Daegu, Korea)에서 구입되었다. 1%-2% 이소플루란(isoflurane)이 포함된 O2을 사용하여 마취하에 동물실험을 수행하였다. 동물들은 이소플루란 가스를 과잉투여후, 경추탈골(cervical dislocation)을 통해 안락사 되었다.
참조예 5. 체내 청소율(clearance) 연구
혈액 내 64Cu-NOTA-trastuzumab 과 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 반감기는 생후 6주 된 수컷 BALB/c 마우스(n = 3 per group)에 8.5 MBq의 꼬리정맥주입 후 연속적인 안와정맥총(retro-orbital bleed) 채혈법을 통해 측정되었다. 방사선 표지 면역접합체 주사 후, 안와정맥총에 구멍(puncture)을 뚫고, 여러 시점(10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간)에서 혈액 샘플(80 ㎕)을 채취하였다. 혈액들은 즉시, 헤파린 코팅된 유리튜브에 담겨 무게측정 후, 감마 계수기로 측정되었다. 혈액 내 64Cu-NOTA-trastuzumab 과 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 반감기는 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)에 의한 2상지수적감쇠모델(two-phase exponential decay model)을 이용하여 분석하였다.
참조예 6. 대사(Metabolism) 연구
방사성 대사물의 소변 및 대변 배설 분석을 위해, 생후 6주 된 수컷 BALB/c 마우스(n = 3 per group)에게 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab를 정맥주사하였다. 이 마우스들을 대사 케이지(metabolic cage)(캐이지당 3마리)에 보관하였고, 소변과 대변은 주사 후 1, 2, 4, 8, 12, 18, 그리고 24시간 후에 따로 수집하였다. 수집된 소변과 대변의 방사능은 방사능 측정기(dose calibrator)(CRC-Ultra; Capintec, Florham Park, NJ, USA)로 측정하였다. 대사물을 프로파일링하기 위해, 채취된 샘플들 중 방사능이 가장 높은, 주사후 12시간 소변샘플들을 radio-TLC(iTLC-SG, 50 mM EDTA)로 분석하였다.
참조예 7. 생체분포(Biodistribution) 연구
건강한 마우스를 대상으로 64Cu-NOTA-trastuzumab 과 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 생체분포를 평가하였다. 생후 12주 된 수컷 BALB/c 마우스들을 무작위로 4개 그룹(n = 4 per group)으로 나누었다. 이후, 0.5MBq의 64Cu-NOTA-trastuzumab 또는 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab를 마우스들에게 정맥주사로 주입(고유활성도(specific activity): 15.2 - 18.2 μCi/㎍, 주입량: 0.82 - 0.98 ㎍)하였다. 주사후 24시간 및 48시간에 마우스들을 안락사하였다. 그리고 다양한 조직과 기관(혈액, 심장, 폐, 피부, 근육, 지방, 뼈, 비장, 신장, 장 및 간)을 채취하여 무게를 쟀다. 채취된 조직의 방사능은 감마 계수기를 사용하여 측정하였다. 64Cu-NOTA-trastuzumab 과 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 생체분포는 누드마우스에서 이종이식(xenograft)으로 검증되었다. 이종이식을 확립하기 위해 5 Х 106 NIH3T6.7 세포를 생후 6주 된 수컷 BALB/c 마우스들 어깨피하에 접종하였다. 접종 10일 후에, 0.5MBq의 64Cu-NOTA-trastuzumab 또는 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab를 NIH3T6.7 이종이식 마우스들에게 정맥주사로 주입하였다. 상기에서 설명한 바와 같이, 주사후 24시간 및 48시간에 마우스들을 안락사하고, 감마 계수기 측정을 위해 관련 장기를 채취하였다. 축적된 방사능은 그램당 주입된량 비율(%ID/g)로 계산하였다. 또한, 마우스에 남아 있는 방사능은 안락사 전에 방사능 측정기(CRC-Ultra, Capintec, NJ, USA)로 측정하였다.
참조예 8. 동물 PET 영상 연구
MicroPET 영상 연구는 나노스칸(nanoscan) PET/CT(PET 82S, Mediso, Budapest, Hungary))를 이용하여 이종이식에서 수행되었다. 이종이식을 준비하기 위해, NIH3T6.7 세포를 생후 6주 된 수컷 BALB/c 누드 마우스의 양쪽 어깨(왼쪽: 5 Х 106 세포, 오른쪽: 1 Х 107 세포)에 피하 접종하였다. 접종 10일 후, 종양은 약 100mm3의 크기에 도달하였다. 그 시점에 동물 PET 영상 스캔을 위해 NIH3T6.7 이종이식 마우스들에게 7-10 MBq의 64Cu-NOTA-trastuzumab 또는 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab를 정맥 주사하였다. (고유활성도: 15.9 - 18.2 μCi/g). 스캔은 24시간과 48시간 모두에서 45분 동안 1:3 coincidence 모드로 수행하였다. MicroPET 영상은 Nucline 소프트웨어를 사용하여 Tera-Tomo 3차원 OSEM 재구성 알고리즘으로 재구성하였다. 조영제(contrast agent)없이 MicroPET 영상 스캔 직후 CT 영상을 연속적으로 획득하였다. MicroPET/CT 영상은 자동으로 공동 등록되고 Inter View Fusion 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. . MicroPET 영상의 색상 표시줄은 표준화된 흡수(uptake)값으로 보정하였다.
참조예 9. 재료
클릭 가능한 링커들은 Click Chemistry Tools로부터 구입하였거나 FutureChem으로부터 구입하였다. Trastuzumab은 Roche로부터 구입하였고, 사이클람(cyclam)은 CheMatech으로부터 얻었다. 달리 기재되지 않는 한, 모든 다른 화학물질들은 Sigma-Aldrich로부터 얻었고, 추가 정제 없이 받은 그대로 사용하였다. 실험에 사용된 물은 매우 순수하였다 (25℃에서 >18.2 mΩ cm-1). 구리-64는 MC50 Cyclotron을 이용한 64Ni(p,n)64Cu 핵 반응에 의해 KIRAMS에서 생산하였다.
참조예 10. MALDI-TOF MS(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry)에 의한 트라스트주맙에 대해 접합된 킬레이터의 정도의 측정
Trastuzumab-TCO 및 trastuzumab-PEG4-TCO은 Milli Q 물을 이용한 연속적인 희석에 의해 약 10 내지 20 pmol/㎕의 항체로 조정되었다. 물 내 50:50 acetonitrile/0.1% (v/v) trifluoroacetic acid 내 20 ㎎/㎖ sinapinic acid(Sigma)의 혼합물이 MALDI 매트릭스로서 사용되었다. 샘플과 매트릭스를 1:1 부피비로 혼합한 후, 혼합물의 2 ㎕을 표적 플레이트 상에 스폿팅하였고, 분석 이전에 공기 중에 건조시켰다. 기기는 손상되지 않은 단백질에 대해 선형 모드로 작동되었다. 외부 교정은 데이터 수집 이후에 데이터 익스플로러 소프트웨어(AB SCIEX)로 기기에 적용되었다. IgG (M+H+ = 74249, 2M+H+ = 148500)는 외부 교정으로서 이용되었다. 스펙트럼은 샘플 웰 내에서 연속 단계 모션 모드를 사용하여 평균 600회의 레이저 샷에 의해 얻었다. 질량 범위는 50 kDa 내지 200 kDa로 적용되었고, 초점은 150 kDa이었다.
참조예 11. 고유 활성도의 결정
PBS (pH 7.4, 200 ㎕) 내 정제되고, 방사성 표지된 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine (18-170 MBq)에 PBS (pH 7.4, 100 ㎕) 내 TCO 또는 TCO-PEG4 (5 내지 46 ㎍)에 묶인 항체가 첨가되었다. 반응 혼합물은 37℃에서 10분간 정치하였다. 그 후, 방사성 표지된 항체는 50 kDa 분자량 컷오프 단위를 가진 원심분리 필터(Amicon Ultra 4 Centrifugal Filtration Units, Millipore Corp.)에 넣어 원심분리한 뒤, 비접합 64Cu-PCB-TE2A-tetrazine를 제거하기 위해 3회 세척하였다. 최종 방사선 표지된 항체 접합체의 방사화학적 순도는 radio-TLC (C-18, 10% NH4OAc/methanol (1:1) and iTLC, 50 mM EDTA)에 의해 측청하였다. 방사화학적 순도가 98% 이상일 때, 상부 방사면역접합체를 수집하여 방사능측정기(dose calibrator)를 사용하여 활성을 측정하였다. 고유 활성도는 수집된 활성양을 클릭반응동안 사용된 항체(TCO-NHS-trastuzumab 또는 TCO-PEG4-NHS-trastuzumab)의 양으로 나눈 값으로 표현되었다.
참조예 12. 64 Cu-PCB-TE2A-trastuzumab and 64 Cu-PCB-TE2A-PEG 4 -trastuzumab의 시험관 내 혈청 안정성
64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 시험관 내 혈청 안정성은 5㎕의 방사성 면역 접합체(64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab(18.5-22.2 MBq) 또는 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab(18.5-22.2 MBq))를 500㎕의 FBS(Fetal Bovine Serum)에 첨가함으로써 수행되었다. 용액은 37℃에서 인큐베이션되었고, 샘플들은 Radio-TLC에 의해 FBS에 적용 후 0분, 15분, 30분, 60분, 2시간, 4시간, 12시간, 18시간, 36시간, 52시간, 60시간 및 76시간에 분석되었다. 동일한 실험은 대조 연구로서 500㎕의 PBS로 반복되었다.
참조예 13. 생체 내 안정성 연구
37 내지 45 MBq의 방사성 면역 접합체들(64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab(11), 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab(12))을 SD 마우스(수컷, 6주, 210 내지 220 g; n = 3)에 정맥주사하였다. 주사 후 1시간에, 동물들은 희생되었고, 혈액, 간 및 신장이 수집되었고, 얼음에 보관하였다. 혈액 내 생체 접합체의 안정성을 결정하기 위해 혈액 샘플들(약 100 ㎕)을 Sephadex G-100 컬럼(높이 12 cm, 지름 1.5 cm, 실험 전에 준비된 식염수로 평형화??)에 직접 놓았고, 식염수(30 ㎖)와 함께 용출되었다. 용출된 분획들을 소량으로 수집하였고, 수집된 분획의 방사능을 γ-counter로 측정하였다. 간 및 신장 내에서 64Cu-방사성 면역 접합체들의 안정성을 결정하기 위해, 수집된 장기들을 먼저 균질화하였고(얼음 냉기 하에서), 그 다음 PBS (5 ㎖)를 첨가하였고, 그 후, 5분 간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 균질액을 2분 간 2000 rpm에서 원심분리하여, 부피 큰 조직 덩어리로부터 분리하였다. 각 상청액(100 ㎕)은 Sephadex G-100 컬럼에 넣었고, 식염수로 용출되었다. 채취된 분획들은 혈액샘플들고 마찬가지로 γ-counter로 계수되었다. 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab(12) 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab(11) 대조군들은 식염수로 100㎕당 약 37-74 kBq의 농도로 제조되었다. 대조군들을 Sephadex G-100 컬럼에 로드하고, 온전한 방사성면역접합체의 용출 시간을 검증하기 위해, 조직 샘플과 동일한 방식으로 용출하였다.
참조예 14. 세포 흡수 연구
64Cu-PCB-TE2A- trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4- trastuzumab 은 네 개의 다른 세포주인 NIH3T6.7, SKOV3, HEK293 및 CT26을 포함하는 플레이트상에서 60분간 개별적으로 배양되었다. 다음으로, 세포들은 PBS(phosphate buffered saline)으로 세척되었고, trypsin-EDTA 처리하여 수확되었다. 세포 내 존재하는 활성은 γ-counter (Wallach, Turku, Finland)를 이용하여 계수되었다.
참조예 15. 64 Cu 표지된 trastuzumab HER2 결합분석
64Cu-PCB-TE2A- trastuzumab과 64Cu-PCB-TE2A-PEG4- trastuzumab의 HER2 결합 친화도는 NIH3T6.7 인간의 HER2를 과발현시킨 세포를 사용하여 수용체 포화 결합 분석을 수행하여 측정되었다. 간단히, 1% BSA가 함유된 PBS를 사용하여, 5㎖ 시험관(test tube)에 고정된 NIH3T6.7 세포 (2 Х 106 cell/㎖)의 부분표본(aliquot) 2개를 제조하였다. 비특이적 결합의 후속 결정을 위한 결합부위를 포화시키기 위해, 하나의 부분표본에 표지되지 않은 trastuzumab을 최종 농도 50㎍/㎖로 가하였다. 초기 농도 30㎍/㎖에서 1% BSA의 PBS를 사용하여 64Cu 표지된 trastuzumab 을 9회 연속 1:2 희석하였다. 최종 세포 농도는 1.3 Х 106 cell/㎖였다. 희석 후 64Cu 표지된 trastuzumab의 최종 농도는 10㎍/㎖에서 20ng/㎖까지 다양했다. 시험관은 세포들이 잘 부유(well-suspended)될수 있도록 4 ℃, 천천히 흔들리는 랙(rack)에서 배양되었다. 3시간 동안 배양한 후 원심분리를 통해 세포를 채취하여 재현탁(resuspend)한 후 차가운 PBS로 두 번 세척하였다. 그후, γ-counter 를 사용하여 시헙관의 방사능을 측정하였다. 특이적 결합(nmol/L)은 총 세포결합 방사능에서 비특이적 결합을 빼서 계산하였고, 첨가된 64Cu 표지된 trastuzumab(nmol/L) 농도에 대하여 도표를 작성하였다. 이 데이터는 프리즘 버전 7.0 소프트웨어(GraphPad, San Diego, CA, USA)를 사용하여 분석되었으며, 64Cu 표지된 trastuzumab의 해리 상수(KD)는 적합한 one-site 결합곡선을 통해 계산하였다.
참조예 16. 동물 모델
모든 동물 실험들은 경북대학교의 동물관리 및 이용 위원회 요구 사항(승인번호. 2017-0096)을 준수하여 수행되었다. NIH3T6.7 세포주의 이종 이식 종양 모델은 6주령 Balb/c nu/nu 수컷 누드 마우스를 이용하여 제조되었다. 생체 분포 연구를 위해, 총 5 x 106의 NIH3T6.7 세포들이 각 마우스의 오른쪽 어깨에 피하 접종이 된 반면(각 그룹당 n = 3), PET/CT 영상 모델은 5 x 106 및 1 x 106 세포들을 어깨들에 각각 주사함(각 그룹당 n = 3)으로써 제조되었다. 적절한 크기의 종양들은 주로 종양세포 이식 후 10일 이내에 성장하였다.
참조예 17. NIH3T6.7 종양을 보유한 누드 마우스들의 생체분포
64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 또는 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab이 NIH3T6.7 종양을 보유한 BALB/c　누드 마우스들의 꼬리 정맥을 통해 개별적으로 주사되었다(각 n = 3, 24시간 및 48시간 동안 각 쥐당 200 ㎕ PBS 내 0.74 및 9.0 MBq). 모든 동물들은 주사 후 24시간 및 48시간에 희생되었고, 혈액, 심장, 폐, 피부, 지방, 뼈, 비장, 신장, 장, 간 및 종양이 수집되었고, 중량이 측정되었고, γ-counter를 이용해 분석되었다. g당 투여량의 백분율(%ID/g)은 중량 및 계수 기준과 비교하여 계산되었다.
참조예 18. NIH3T6.7 종양을 보유한 누드 마우드들의 MicroPET 영상
64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab (9, ~9.1 MBq)및　64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab (11, ~9.0 MBq)은 꼬리 정맥을 통해 주사되었고, 영상은 주사 후 24시간 및 48시간 후에 2% isoflurane으로 쥐를 마취함으로써 종합 PET-CT 스캐너 nanoScan PET/CT(PET 82S, Mediso, Budapest, Hungary) 기기를 이용하여 기록되었다. 스캔된 PET은 주사 후 24시간에 40분간 수행되었고, PET 영상의 해부학적 기준 및 감쇠 보정을 위해 CT 스캔을 약 10분 간 수행하였다. 주사 후 48시간에, 스캔 시간이 70분으로 증가한 것을 제외하고는 동일한 스캔 과정이 반복되었다. PET 영상 재구축은 3차원 반복 알고리즘(Tera-Tomo 3D, Mediso)을 이용하여, 상호작용의 깊이, 방사성 핵종 붕괴, 검출기 표준화, 크리스탈 데드 타임(crystal dead time) 및 감쇠에 대한 보정과 함께 수행되었다. 검출은 3개의 하위 집합으로 4회 반복하여 1:3 일치 모드에서 수행되었다. PET 및 CT 영상은 자동적으로 공동등록되었다. 획득한 PET 영상 분석은 InterView Fusion (Mediso)를 이용해 수행되었다.
참조예 19. 통계학적 분석 연구
데이터는 프리즘 5.03 소프트웨어(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 분석되고, 평균 ± 표준 편차(SD)로 보고되었다. 생체분포 연구에서 통계적 유의성은 단방향 분산 분석(ANOVA)에 의해 결정되었고 Tukey 사후 분석으로 이어졌다. 비대응표본(unpaired) 또는 대응표본(paired) t-검정(Student's t-test)는 혈청 안정성, 생체 내 안정성 및 세포 흡수 연구에 대한 유의성을 계산하기 위해 사용되었다. p 값 <0.05는 유의한 것으로 간주되었다.
실험예 1. 방사성면역접합체 64 Cu-NOTA-trastuzumab 과 64 Cu-NOTA-PEG 8 -trastuzumab의 안정성
영상촬영을 위한 방사성 표지 항체는 생체 내 순환 동안 동위원소 및 항체가 분리되지 않고 안정적으로 존재해야 할 필요가 있다. 따라서 상기 실시예에 따른 방사성면역접합체의 안정성을 확인하고자 하였다.
64Cu-NOTA-trastuzumab 과 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab을 37℃조건에서 48시간동안 인산염완충액(phosphate buffer;PBS) 및 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS)에 정치하였다(n=3).(참조예 1 및 2 참조)
In vitro 실험결과, PBS 및 FBS에서 방사성면역접합체들은 모든 시점에서 95%의 안정성을 보여주었다. 따라서 상기 방사성면역접합체는 체내 영상촬영에 이용하기 적합한 접합체의 안정성을 보여주었다(도 3).
실험예 2. 64 Cu-NOTA- Trastuzumab 및 64 Cu-NOTA-PEG 8 -Trastuzumab의 세포 흡수율
항체에 유입된 이작용성 킬레이터의 수와 위치는 결합 친화도에 영향을 미치며 전체 방사성 표지 항체의 약동학에 큰 영향을 미칠 수 있다. 따라서 방사선면역복합체의 세포흡수율을 통해 표적세포에 대한 결합친화도를 확인하였다.
두 HER2 양성 세포주(NIH3T6.7 및 SKOV3)과 두 HER2 음성 세포주(HEK293 및 CT26)에 방사선 표지 된 상기 면역접합체(64Cu-NOTA- Trastuzumab 및 64Cu-NOTA-PEG8-Trastuzumab)를 투여후, 감마 계수기를 통해 세포흡수율을 측정하였다.(참조예 1 및 3 참조)
두 방사성 면역접합체 모두 HER2 양성 NIH3T6.7 및 SKOV3 세포에 더 높은 결합 친화성을 보였다. HER2 음성 HEK293 세포에 비해, NIH3T6.7 세포에서 64Cu-NOTA- Trastuzumab 및 64Cu-NOTA-PEG8-Trastuzumab의 세포 흡수가 각각 약 25배와 30배 높았다. (12.7 ± 2.6% vs. 0.5 ± 0.2%; 10.6 ± 1.0% vs. 0.35 ± 0.1%). 64Cu-NOTA- Trastuzumab은 HER2 양성 세포에서 64Cu-NOTA-PEG8-Trastuzumab보다 약간 높은 결합 친화도를 보였지만, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(도 4).
이러한 세포 결합 결과는 짧은 PEG 링커가 Trastuzumab가 HER2에 결합하는 것을 방해하지 않는다는 것을 보여주었다.
실험예 3. 64 Cu-NOTA- Trastuzumab 및 64 Cu-NOTA-PEG 8 -Trastuzumab의 혈액 청소율(clearance)
종양 영상촬영을 위해 종양을 시각화할 수 있는 최소 대비(contrast)를 달성해야 한다. 이러한 대비 달성을 위해서는 표적세포에 흡수된 방사성 트레이서를 제외한 비결합 방사성 트레이서들의 배출이 필요하다. 따라서 상기 면역접합체들의 혈액 청소율을 확인하였다.
생체내 연구에서, 방사선 표지된 면역접합체(64Cu-NOTA- Trastuzumab 또는 64Cu-NOTA-PEG8-Trastuzumab)를 마우스에 주입하고, 그들의 청소율(clearance) 패턴을 평가하였다. 역궤도 혈액 샘플링(retro-orbital blood sampling)을 이용하여, 혈액 청소율(clearance)을 모니터링했으며, 혈액의 반감기는 2상지수적감쇠모델(two-phase exponential decay model)을 사용하여 측정하였다.(참조예 1, 4 및 5 참조)
혈액에서 64Cu-NOTA- Trastuzumab와 64Cu-NOTA-PEG8-Trastuzumab의 2상 반감기는 각각 8.45시간과 6.15시간이었다(도 5). 24시간 후에 64Cu-NOTA- Trastuzumab(9.61 ± 0.28 %ID/g)의 혈액 활성은 64Cu-NOTA-PEG8-Trastuzumab (1.22 ± 0.26 %ID/g)보다 7.8배 높았다. 개별 마우스의 활성을 측정했을 때, 64Cu-NOTA-PEG8-Trastuzumab의 체내 청소율은 64Cu-NOTA- Trastuzumab보다 3배 더 빨랐다. 64Cu-NOTA- Trastuzumab가 주입된 마우스에는 활성화된 방사성면역접합체가 24시간에는 95.1 ± 1.7%, 48시간에는 87.0 ± 1.3%가 체내에 남아 있었지만, 64Cu-NOTA-PEG8-Trastuzumab를 주입한 마우스에서는 24시간에는 31.4 ± 4.7%, 48시간에는 28.4 ± 4.3%의 활성화된 접합제가 발견되었다(도 6).
짧은 PEG8 링커를 가진 64Cu-NOTA-PEG8-Trastuzumab은 PEG링커를 가지지않은 64Cu-NOTA- Trastuzumab보다 혈액 청소율이 더 빠르다는 것을 보여주었다.
실험예 4. 64 Cu-NOTA- Trastuzumab 및 64 Cu-NOTA-PEG 8 -Trastuzumab의 대사(체외 배출)
표적세포에 흡수된 방사성 트레이서를 제외한 비결합 방사성 트레이서들의 체외배출에 대해 확인하였다.
방사성 면역접합체 64Cu-NOTA- Trastuzumab 및 64Cu-NOTA-PEG8-Trastuzumab를 마우스의 꼬리 정맥 주입 후, 대사 케이지(metabolism cages)를 넣어 24시간까지 소변 및 대변 샘플을 채취하였다. 데이터는 주입량 백분율로 표시하였다.(각 방사성 면역접합체 당 n=3)(참조예 1, 4 및 6 참조)
혈액 반감기 및 체내 청소율 데이터(도 5 및 도 6)와 잘 일치한다. 대부분의 배설이 신장을 통한 배설(소변)이었지만, PEG링커가 있는 64Cu-NOTA-PEG8-Trastuzumab이 PEG링커가 없는 64Cu-NOTA- Trastuzumab보다 약 3배 더 빨리 배설되었다(도 7). radio-TLC scanner로 소변 샘플을 분석했을 때, 각 방사성 면역접합체의 소변 대사물들은 매우 독특했으며, 이는 비PEGylated 항체와 PEGylated 항체가 다른 방식으로 대사되었음을 의미한다(도 8).
실험예 5. BALB/c 마우스에서의 64 Cu-NOTA-trastuzumab 및 64 Cu-NOTA-PEG 8 -trastuzumab의 생체분포확인
건강한 BALB/c 마우스를 통해, 생체내 주입된 방사성 면연접합체 64Cu-NOTA-trastuzumab 및 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 상세한 체내 분포 및 청소율 패턴을 확인하고자 하였다.
생후 12주 된 수컷 BALB/c 마우스들을 무작위로 4개 그룹(n = 4 per group)으로 나누었다. 이후, 0.5MBq의 64Cu-NOTA-trastuzumab 또는 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab를 마우스들에게 정맥주사로 주입(고유활성도(specific activity): 15.2 - 18.2 μCi/㎍, 주입량: 0.82 - 0.98 ㎍)하였다. 주사후 24시간 및 48시간에 마우스들을 안락사하였다. 그리고 다양한 조직과 기관(혈액, 심장, 폐, 피부, 근육, 지방, 뼈, 비장, 신장, 장 및 간)을 채취하여 무게를 쟀다. 채취된 조직의 방사능은 감마 계수기를 사용하여 측정하였다. (참조예 1, 4 및 7 참조)
실험결과는 도 9 및 하기 표 1에 나타내었다.
Organs Radioimmunoconjugates
64Cu-NOTA-trastuzumab 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab
24h 48h 24h 48h
Blood 20.90±1.42 13.93±1.82 3.07±0.31 1.42±0.94
Heart 3.32±1.41 3.52±0.20 1.57±0.21 1.20±0.13
Lung 5.30±0.39 5.79±0.52 2.58±0.20 1.33±0.40
Skin 2.88±0.25 1.67±0.11 1.66±0.21 1.96±0.60
Muscle 1.50±0.62 1.18±0.26 0.66±0.06 1.50±0.95
Fat 1.68±0.03 2.06±0.28 0.96±0.07 1.41±1.11
Bone 3.33±0.20 2.31±0.15 1.19±0.11 1.11±0.63
Spleen 11.77±1.08 5.93±0.73 7.31±0.50 7.36±0.83
Kidneys 5.12±0.75 6.29±0.26 2.47±0.31 2.28±0.39
Intestine 2.04±0.25 1.65±0.21 1.08±0.18 0.86±0.17
Liver 17.28±0.81 13.69±0.88 21.94±1.16 21.46±2.58
NOTA 킬레이터(chelator)로 방사성 표지된 Trastuzumab인 64Cu-NOTA- Trastuzumab는 다른 방사선 동위원소들 및 킬레이터들을 이용하여 방사성 표지된 Trastuzumab의 전형적인 생물분포 패턴을 나타냈다. 가장 높은 활성을 보인 곳은 혈액(24시간 후 20.9 ± 1.4 %ID/g, 48시간 후 13.9 ±1.8 %ID/g)이었다. 다음으로는 간(24시간 후 17.2 ± 0.8 %ID/g, 48시간 후 13.7 ± 0.9 %ID/g), 비장(24시간 후 11.8 ± 1.1 %ID/g, 48시간 후 5.9 ± 0.7 %ID/g)이 그 뒤를 이었다. 혈액에서의 높은 활성은 주로 간담도(hepatobiliary tract)를 통한 느린 청소율을 보여주었다. 혈액 활성의 33%만이 주사 후 24시간에서 48시간 동안 배설되었다. 간으로부터의 활성 배설은 훨씬 더 느리게 진행되었다. 같은 기간 동안 간 활성의 20%만이 추가로 제거되었다.
반면, 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab는 이와는 상이한 생물분배 패턴을 보였다. 첫째, 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 혈액 흡수가 매우 낮았다. 혈액 내 그램당 투여량(%ID/g) 비율은 24시간 및 48시간에서 각각 3.1 ± 0.3 %ID/g와 1.4 ± 0.9% ID/g에 불과했으며, 이는 같은 시점에서 64Cu-NOTA- Trastuzumab의 혈액 활성의 각각 15%와 10%에 해당한다. 그러나, 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 간 흡수는 64Cu-NOTA- Trastuzumab보다 더 높았다. (각각 24시간 및 48시간에서 21.9 1.2% ID/g 및 21.5 2.6% ID/g). 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 비장 흡수는 64Cu-NOTA- Trastuzumab와 비슷했다. 장에서 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 최소 흡수를 고려할 때(각각 24시간 및 48시간에서 1.1 ± 0.2 %ID/g 및 0.9 ± 0.2 %ID/g) 방사성 표지된 trastuzumab은 간에서 지속되었고, 장으로의 배설이 매우 느렸다. 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 신장 흡수(24시간 및 48시간에서 각각 2.5 ± 0.3 %ID/g 및 2.3 ± 0.4 %ID/g)가 간 흡수보다 훨씬 낮았지만, 훨씬 빠른 혈액 청소율(도 5 및 도 9) 및 신체 배설(도 6)을 고려했을 때, 일부 활성은 신장 청소율를 통해 배설되는 것으로 나타났다.
실험예 6. NIH3T6.7 종양 보유 BALB/c 마우스에서의 64 Cu-NOTA-trastuzumab 및 64 Cu-NOTA-PEG 8 -trastuzumab의 생체분포확인
종양 흡수에서 짧은 PEG링커 접합의 영향을 조사하기 위해, NIH3T6.7 종양 보유 BALB/c 누드 마우스에서 생체분포 연구를 수행하였다.
64Cu-NOTA-trastuzumab 및 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab에 대한 종양 보유 BALB/c 누드 마우스 생체분포는 이종이식(xenograft)을 통해 검증되었다. 이종이식을 확립하기 위해 5 Х 106 NIH3T6.7 세포를 생후 6주 된 수컷 BALB/c 마우스들 어깨피하에 접종하였다. 접종 10일 후에, 0.5MBq의 64Cu-NOTA-trastuzumab 또는 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab를 NIH3T6.7 이종이식 마우스들에게 정맥주사로 주입하였다. 주사후 24시간 및 48시간에 마우스들을 안락사하고, 감마 계수기 측정을 위해 관련 장기를 채취하였다. 축적된 방사능은 그램당 주입량 비율(%ID/g)로 계산하였다. (참조예 1, 4 및 7 참조)
실험결과는 도 10 및 하기 표 2에 나타내었다.
Organs Radioimmunoconjugates
64Cu-NOTA-trastuzumab 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab
24h 48h 24h 48h
Blood 15.65±0.17 12.92±0.64 0.97±0.06 0.71±0.04
Heart 2.86±0.27 3.14±0.31 1.05±0.07 1.09±0.06
Lung 3.75±0.94 4.74±0.95 1.87±0.07 1.66±0.32
Skin 4.48±1.24 4.79±1.29 0.16±0.03 0.27±0.02
Muscle 0.89±0.16 1.51±0.19 0.33±0.02 0.30±0.03
Fat 0.77±0.16 0.69±0.04 0.07±0.003 0.24±0.02
Bone 1.71±0.21 3.02±0.26 0.42±0.01 0.83±0.10
Spleen 13.41±1.75 9.42±0.29 1.77±0.09 2.32±0.13
Kidneys 4.25±0.56 4.25±0.63 1.52±0.17 1.62±0.23
Intestine 2.95±0.62 2.16±0.14 0.97±0.12 0.68±0.04
Liver 11.65±1.17 6.79±0.58 4.10±0.30 3.24±0.42
Tumor 12.07±0.53 13.84±1.13 16.50±2.51 16.25±3.41
짧은 PEG링커를 지닌 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab은 PEG링커를 지니지 않은 64Cu-NOTA-trastuzumab보다 훨씬 더 높은 종양 흡수를 보였다. (64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab: 24시간: 6, 16.5 ± 2.5 % ID/g, 48시간 : 16.3 ± 3.4% ID/g, 64Cu-NOTA-trastuzumab: 24시간 : 12.1 ± 0.5% ID/g, 48시간 : 13.8 ± 1.1% ID/g). 종양 모델에서 종양를 제외한, 다른 모든 장기에서 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 대부분의 활성은 64Cu-NOTA-trastuzumab와 비교하여 현저히 낮았다. 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 혈액 흡수(각각 24시간 및 48시간에서 0.97 ± 0.06 %ID/g 및 0.71 ± 0.04 %ID/g)는 64Cu-NOTA-trastuzumab (15.7 ± 0.2 %ID/g 및 12.9 ± 0.6% ID/g)보다 최소 16배 낮았다. 건강한 생쥐에서의 두 면역접합체의 간 흡수 패턴이 비슷한 것과 대조적으로, 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 간 흡수(각각 24시간 및 48시간에서 4.1 ± 0.3 %ID/g 및 3.2 ± 0.4% ID/g)은 64Cu-NOTA-trastuzumab (11.7 ± 1.2% ID/g)보다 유의하게 낮았다. 마찬가지로, 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 비장 흡수(각각 24시간 및 48시간에서 1.8 ± 0.1%ID/g 및 2.3 ± 0.1%ID/g)은 64Cu-NOTA-trastuzumab의 비장 흡수(13.4 ± 1.8%ID/g 및 9.4 ± 0.3%ID/g)보다 7.4배, 4.1배 낮았다. 심장과 폐에 더하여, 피부, 근육, 그리고 지방 조직에서 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 배경 활성(background activity)은 64Cu-NOTA-trastuzumab보다 현저히 낮았다. 혈액, 피부, 근육, 지방, 뼈 및 장의 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 모든 활성은 24시간과 48시간 모두에서 1%ID/g 미만이었다.
상기 표 2의 생체분포 데이터를 통해 두 면역접합체의 종양 대 타기관의 흡수비율을 하기 표 3에 나타내었다.
Ratio Radioimmunoconjugates
64Cu-NOTA-trastuzumab 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab
24h 48h 24h 48h
Tumor-to- blood 0.77±0.03 1.08±0.14 17.13±3.64** 22.79±4.36***
Tumor-to-liver 1.04±0.12 2.06±0.34 4.06±0.79** 4.98±0.47***
Tumor-to-spleen 0.88±0.13 0.72±0.08 2.32±0.20*** 1.39±0.12**
Tumor-to-kidney 2.86±0.33 3.32±0.69 10.92±1.84** 10.34±3.28*
Tumor-to-muscle 13.87±2.38 9.32±1.73 50.11±6.01*** 54.34±8.69***
(*p < 0.05. **p < 0.005. ***p < 0.001)
64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 종양 대 혈액 비율은 24시간 및 48시간에서 각각 17.1 ± 3.6과 22.8 ± 4.4로 64Cu-NOTA-trastuzumab의 종양 비율(각각 0.77 ± 0.03과 1.08 ± 0.14)보다 22배, 21배 높았다(표 3). 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 종양 대 근육 비율은 각각 24시간과 48시간에서 50.1±6.0과 54.3±8.7으로, 64Cu-NOTA-trastuzumab (13.9±2.4와 9.3±1.7)를 훨씬 능가하였다. 또한 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 종양 대 간(T/L), 종양 대 염(T/S), 종양 대 신장(T/K) 비율도 64Cu-NOTA-trastuzumab의 비율보다 2 내지 4배 높았다.
이를 통해 짧은 PEG링커를 지닌 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 높은 종양 흡수 및 다른 기관에서의 빠른 청소율을 통해 종양 대 장기 비율을 극대화 할 수 있음을 확인하였다.
실험예 7. 64 Cu-NOTA-trastuzumab 및 64 Cu-NOTA-PEG 8 -trastuzumab를 이용한 동물 PET영상비교
두 방사성 면역 접합체의 종양 시각화를 직접 비교하기 위해 NIH3T6.7 종양 보유 누드 마우스를 사용하여 면역-PET 영상 연구를 수행했다
NIH3T6.7 세포를 생후 6주 된 수컷 BALB/c 누드 마우스의 양쪽 어깨(왼쪽: 5 Х 106 세포, 오른쪽: 1 Х 107 세포)에 피하 접종하여 종양을 키운 뒤, 방사성 면역 접합체(64Cu-NOTA-trastuzumab 또는 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab)를 정맥주사하여, MicroPET 영상 스캔을 수행하였다. (참조예 1, 4 및 8 참조)
실험결과는 (도 11)에 나타내었다.
생물분포 연구에서 예상한 바와 같이, 짧은 PEG링커를 지닌 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab과 PEG링커를 지니지 않은 64Cu-NOTA-trastuzumab 사이에 큰 차이가 있었다. 마우스 어깨의 종양은 두 면역 접합체로 쉽게 시각화 되었지만, 64Cu-NOTA-trastuzumab의 배경 노이즈는 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab보다 상당히 높았다(도 11). 게다가, 64Cu-NOTA-trastuzumab를 주입한 마우스에서 전신에 걸쳐 상당한 배경 노이즈가 발생하였다. 최대 강도 투영 PET(MIP-PET) 영상에서 64Cu-NOTA-trastuzumab를 주입한지 24시간 및 48시간 후, 혈액(심장), 간 및 비장의 강한 흡수 신호가 종양 흡수 신호를 방해하였다(도 11 A 및 11 B). 대조적으로, 배경 노이즈는 24시간 이내에 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 MIP-PET 영상에서 거의 보이지 않았다. 신호는 강한 종양 흡수 외에도 간과 방광의 소변에서만 관찰되었다(도 11 C). 시간이 48시간으로 진행됨에 따라 간 흡수는 더욱 감소했고 종양은 극도로 높은 종양 대 배경비로만 시각화되었다(도 11 D).
전반적으로 동물 PET 영상 결과는 짧은 PEG링커를 지닌 64Cu-NOTA-PEG8-trastuzumab의 종양 대 장기 비율 극대화를 보여주는 종양 모델의 생체분포 연구 결과를 입증하였다(도 10). 이를 통해 종양 영상촬영에서 종양을 선명히 표지하여 월등히 우수한 선명도로 촬영할 수 있음을 확인하였다.
실험예 8. 방사성면역접합체 64 Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및　 64 Cu-PCB-TE2A-PEG 4 -trastuzumab의 안정성
영상촬영을 위한 방사성 표지 항체는 생체 내 순환 동안 동위원소 및 항체가 분리되지 않고 안정적으로 존재해야 할 필요가 있다. 따라서 상기 실시예에 따른 방사성면역접합체의 안정성을 확인하고자 하였다.
시험관 내 혈청 안정성 실험에서, 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab을 37℃조건에서 72시간동안 PBS 및 FBS에 정치하였다. 생체 내 안정성 연구에서는 37 내지 45 MBq의 방사성 면역 접합체들(64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab, 64Cu-NOTA-Bn-NCS-trastuzumab)을 SD 마우스(수컷, 6주, 210 내지 220 g; n = 3)에 정맥주사한 뒤, 혈액, 간 및 신장 등의 장기를 적출하여 방사성면역접합체들을 계수하였다.(참조예 9, 12, 13 및 19참조)
시험관 내 혈청 안정성 실험결과, PBS에서는 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab은 모든 시점에서 95%이상의 안정성을 보여주었고, FBS에서는 모든 시점에서 90%이상의 안정성을 보여주었다 (도 12a). 생체 내 안정성 실험결과, 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab은 혈액에서 100%, 간에서 88.2 ± 5.8%, 신장에서 88.3 ± 2.9%의 안정성을 보여주었다(도 12b).
시험관 내 혈청 안정성 실험 및 생체 내 안정성 실험결과, 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab는 체내 영상촬영에 이용하기 적합한 접합체의 안정성을 보여주었다.
실험예 9. 방사성면역접합체 64 Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및　 64 Cu-PCB-TE2A-PEG 4 -trastuzumab의 세포흡수율
항체에 유입된 이작용성 킬레이터의 수와 위치는 결합 친화도에 영향을 미치며 전체 방사성 표지 항체의 약동학에 큰 영향을 미칠 수 있다. 따라서 방사선면역복합체의 세포흡수율을 통해 표적세포에 대한 결합친화도를 확인하였다.
네 개의 다른 세포주인 NIH3T6.7, SKOV3, HEK293 및 CT26에 방사성 면역 접합체(64Cu-PCB-TE2A- trastuzumab 또는 64Cu-PCB-TE2A-PEG4- trastuzumab)를 투여후, 감마 계수기를 통해 세포흡수율을 측정하였다. 또한 NIH3T6.7 세포주를 이용하여 HER2 결합 친화도를 측정하였다. (참조예 9, 14, 15 및 19참조)
HER2 양성 NIH3T6.7 세포주에서 방사성 면역접합체의 흡수율은 8.5%(64Cu-PCB-TE2A- trastuzumab) 및 10.2%(64Cu-PCB-TE2A-PEG4- trastuzumab)였고, HER2 양성 SKOV3 세포에서는 7.3%%(64Cu-PCB-TE2A- trastuzumab) 8.0%(64Cu-PCB-TE2A-PEG4- trastuzumab)였다. HER2 음성 HEK293 세포에서는 0.6%(64Cu-PCB-TE2A- trastuzumab) 와 0.2%(64Cu-PCB-TE2A-PEG4- trastuzumab) 였고, HER2 음성 CT26 세포에서는 0.6%(64Cu-PCB-TE2A- trastuzumab)와 0.8%(64Cu-PCB-TE2A-PEG4- trastuzumab였다(도 12c). HER2 양성 세포들의 방사성 면역접합체 흡수율은 HER2 음성 세포들의 흡수율보다 약 10배 높았다. 또한, 64Cu-PCB-TE2A- trastuzumab의 해리 상수(KD)는 24.5 ± 1.1nM으로, 64Cu-PCB-TE2A-PEG4- trastuzumab의 해리 상수(KD)는 28.3 ± 7.9nM로 추정되었다. 이는 방사선 표지된 trastuzumab 허용 KD 범위에 해당한다.
이러한 결과는 더블클릭 전략을 이용하여 열에 민감한 항체가 초안정(ultra-stable) 교차결합 킬레이터로 방사선 표지되었고, 면역반응을 유지한다는 것을 보여주었다. 또한, 추가적인 PEG4 링커를 지닌 방사선 면역접합체의 흡수율 및 결합친화도가 더 좋은 것을 확인하였다(도 11d).
실험예 10. 방사성면역접합체 64 Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및　 64 Cu-PCB-TE2A-PEG 4 -trastuzumab의 생체분포확인
생체내 주입된 방사성 면연접합체 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및　64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 상세한 체내 분포, 청소율 패턴 및 종양 흡수에서 짧은 PEG링커 접합의 영향을 확인하고자 하였다.
64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 또는　64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab이 NIH3T6.7 종양을 보유한 BALB/c 누드 마우스들의 꼬리 정맥을 통해 개별적으로 주사한 뒤, 종양 및 장기들을 수집하여 분석하였다. (참조예 9, 16, 17 및 19참조)
64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab은 종양에서 가장 높은 흡수율을 보였고, 혈액, 간, 비장, 신장 순으로 그 뒤를 이었다. 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab의 종양 흡수는 24시간 동안 21.4 ± 1.8% ID/g였으며, 48시간에는 16.6 ± 1.5% ID/g로 점차 감소했다. 혈액에서의 활성은 24시간에서 10.1 ± 1.2ID/g, 48시간에서 각각 와 8.4 ± 0.7% ID/g였다. 간 흡수율은 24시간 동안 10.9 ± 0.2% ID/g로 신장(5.6 ± 0.2% ID/g)의 거의 두 배에 달했다. 간(5.8 ± 0.9% ID/g)과 신장(2.9 ± 0.6% ID/g) 사이의 흡수 비율은 48시간까지 상당히 일정하게 유지되었다(도 13).
64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab은 종양에서의 흡수률이 가장 높았으며, 24시간에서 13.5 ± 2.0ID/g, 48시간에서 6.2 ± 0.9% ID/g였다. 그리고, 간(7.3 ± 0.6% ID/g), 비장(3.5 ± 0.1% ID/g)이 그 뒤를 이었다. 간에서의 활성은 24시간에서는 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab활성의 67%, 48시간에서는 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab활성의 50%인 반면, 신장에서의 활성은 24시간에서는 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab활성의 26%, 48시간에서는 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 활성의 22%였다. 혈액 의 흡수율은 24시간 동안 2.9 ± 0.1 % ID/g에 불과하며 이는 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab의 3분의 1에도 미치지 못한다. 혈액 활성의 60% 이상이 48시간까지 추가로 제거되어 1.1 ± 0.2% ID/g로 감소했다. 피부, 근육, 지방, 뼈 및 장의 다른 모든 활동은 24시간 동안 1% ID/g 미만이었다.
상기 생체분포 결과를 기초로 종양 대 장기의 활성비를 계산하여 하기 표 4에 나타내었다.
Ratio Radioimmunoconjugates
64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 64Cu- PCB-TE2A -PEG4-trastuzumab
24h 48h 24h 48h
Tumor-to- blood 2.12±0.26 1.98±0.43 4.63±0.99* 5.70±0.34*
Tumor-to-liver 1.96±0.80 2.85±0.30 1.85±0.71 2.16±0.26
Tumor-to-kidney 3.81±0.80 5.73±0.45 9.27±0.86* 9.72±0.35*
Tumor-to-muscle 24.44±0.80 19.49±0.71 55.99±0.99* 34.94±0.43*
(*동일 시점에서 다른 그룹보다 현저히 높음(p < 0.05))
24시간에서 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab의 종양 대 혈액(T/B), 종양 대 간(T/L), 종양 대 신장(T/K), 종양 대 근육(T/M) 비율은 각각 2.1, 2.0, 3.8, 24였다. 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 T/B와 T/M 비율은 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab에 비해 각각 2.2배와 2.3배 증가하였다. 종양에 비해 혈액순환에서 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 활성이 더 빠르게 제거됨에 따라, T/B 비율은 24시간 4.6에서 48시간 5.7로 더욱 증가하였다.
일반적으로 주사 후 48시간 동안 혈액 내 64Cu 표지된 trastuzumab의 활성은 10 내지 25% ID/g 범위에 있다. 48시간에서 얻은 1.1% ID/g 혈액 흡수값은 방사성 동위원소 및 종양 세포주에 관계없이 종양 모델에서 보고된 모든 방사성 표지된 trastuzumab에 대한 값 중 가장 낮은 것으로 판단되었다. 이로 인해 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 종양 대 혈액 비율은 24 내지 48시간에서 1.0 내지 2.5 범위의 일반적으로 보고된 trastuzumab 항체 값에 비해 유난히 높게 나왔다. 혈액 흐름에서 빠르게 빠져나간 후 PCB-TE2A 킬레이터에서 자유 구리 이온의 무시할 수 있는 탈착물화반응(decomplexation)을 고려할 때, 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 우수한 혈액 청소율은 trastuzumab 항체와 킬레이터 사이에 삽입된 PEG4 링커로부터 기인할 수 있다. 이에 비해 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab의 T/B 비는 일반적인 범위인 1-2.5에 속하였다. 신장 청소율 또한 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab가 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab보다 2.4배 빠르게 측정이 되었다. 따라서, 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab보다 짧은 PEG링커를 지닌 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab가 종양에 대비되는 타기관들 내의 청소율을 향상시켜, 종양과의 대비를 더욱 크게 만드는 것을 확인하였다.
실험예 11. 64 Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및　 64 Cu-PCB-TE2A-PEG 4 -trastuzumab를 이용한 MicroPET 영상비교
두 방사성 면역 접합체의 종양 시각화를 직접 비교하기 위해 NIH3T6.7 종양 보유 누드 마우스를 사용하여 면역-PET 영상 연구를 수행했다.
64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab (~9.1 MBq)및　64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab(~9.0 MBq)은 꼬리 정맥을 통해 주사되었고, 영상은 주사 후 24시간 및 48시간 후에 2% isoflurane으로 쥐를 마취함으로써 종합 PET-CT 스캐너 nanoScan PET/CT(PET 82S, Mediso, Budapest, Hungary) 기기를 이용하여 기록되었다. (참조예 9, 16, 18 및 19참조)
24시간 내에 획득한 PET 영상에서 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab의 종양 흡수 신호가 높지만(도 14 A)상당한 수준의 배경 노이즈가 혈액(심장), 간, 비장 및 방광에서 상당한 상승과 함께 전신 신호를 방해한다. trastuzumab 의 생물학적 반감기가 길기 때문에 종양 대 배경 비율은 48시간까지 크게 개선되지 않았다. (도 14 B)마우스의 전신 활성을 측정했을 때, 64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab의 주입 활성의 16%와 31%만이 각각 24시간과 48시간까지 몸밖으로 배설되었다(도 15). 대조적으로, 추가적인 PEG4 링커가 있는 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab는 시점과 상관없이 최소한의 배경으로 종양을 생생하게 시각화하였다(도 14 C 및 D)종양을 제외하고, 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab을 사용한 PET 영상에는 간과 방광만이 보였다.
두 방사성 면역 접합체(64Cu-PCB-TE2A-trastuzumab 및　64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab)를 사용하는 PET 영상 결과는 전체적으로 상기 시행한 생체분포와 일치하였다. 주사 후 24시간, 48시간 동안 64Cu-PCB-TE2A-PEG4-trastuzumab의 주입된 활성 중 29와 12%만이 체내에서 발견된 것을 통해(도 15), 추가 PEG 링커(Scheme 3)는 방사선 표지된 trastuzumab 의 신체 배설을 가속화하여, 종양 대 장기 비율 극대화할 수 있음을 시각적으로 재확인하였다. 이를 통해 종양 영상촬영에서 종양을 선명히 표지하여, 월등히 우수한 선명도로 촬영할 수 있는 방사성 면역항원제로서의 잠재력를 확인하였다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물-링커-단백질 컨쥬게이트;
    [화학식 1]
    Figure pat00008

    D는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물이고,
    [화학식 2]
    Figure pat00009

    상기 X는 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아마이드, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 하이드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고;
    상기 R1은 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고;
    상기 A는 주변 분자에 배위결합된 금속성 방사성 동위원소이고;
    상기 B는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질 또는 링커에 부착을 위한 적어도 하나 이상의 산소 또는 치환 가능한 질소를 포함하는 것 또는 H이고;
    L은 (PEG)n를 포함하는 링커이고, 여기서 n은 2 내지 8의 정수이고;
    P는 표적 세포 또는 표적단백질 결합능을 갖는 단백질이다.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 X는 에스터이고;
    상기 R1은 메틸이고;
    상기 R4는 H이고;
    상기 R5는 아민인 것인 컨쥬게이트.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 D는 하기 화학식 3으로 표시되는 것인 컨쥬게이트;
    [화학식 3]
    Figure pat00010

    상기 X는 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아마이드, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고;
    상기 A는 방사성 동위원소이고;
    상기 R2, R3, 및 R5 는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고;
    상기 R4는 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환알키닐, 치환 또는 비치환된 알킬아릴, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아미도, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 X는 에스터기이고;
    상기 R2 및 R3는 각각 독립적으로 메틸, 에틸 및 프로필로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고;
    상기 R4는 H이고;
    상기 R5는 에틸인 것인 컨쥬게이트.
  5. 청구항 1 또는 3에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 18F, 11C, 13C, 13N, 15O, 60Cu, 64Cu, 67Cu, 124I, 68Ga, 52Fe, 58Co, 3H, 14C, 35S, 32P, 131I, 59Fe, 60Co, 89Sr, 90Sr, 90Y, 99Mo, 133Xe, 137Cs, 153Sm, 177Lu, 186Re 123I, 125I, 201Tl 또는 67Ga인 것인 컨쥬게이트.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 (PEG)n을 포함하는 링커는 2 내지 4개의 (PEG)n을 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 L은 하기 화학식 4으로 표시되는 것인 컨쥬게이트;
    [화학식 4]
    Figure pat00011

    상기 E는 제 1작용기가 테트라진(tetrazine), 말레이미드(maleimide), NH2, COOH 또는 옥사지리딘(oaxziridine)이고, 제 2 작용기는 노르보넨(norbornene), 트랜스-시클로옥텐(trans-cyclooctene) 또는 1-메틸-시클로프로펜(1-methyl-cyclopropene)인 상기 두 작용기 간의 클릭 반응(Click reaction) 결과 화합물이고;
    상기 F는 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 방향족, 알콜, 알콕시, 아미노, 아마이드, 니트로, 에테르, 에스테르, 할로겐, 케톤, 시아노, 카르복시, 히드록시, 티올, 알데하이드, 카보닐, 인, 황, 포스페이트, 포스파트, 포스피트, 술페이트, 디술피드, 옥시, 머캅토 및 히드로카르빌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 m은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수인 컨쥬게이트.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 E는 하기 화학식 5로 표시되는 것인 컨쥬게이트;
    [화학식 5]
    Figure pat00012
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 항체, 항원 결합 단편, 애피바디(affibody), 다이아바디(diabody) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 컨쥬게이트.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 단백질은 암 관련 항원 또는 수용체 타이로신 카이네이즈(Receptor tyrosine kinases: RTKs)인 것인 컨쥬게이트.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 암 관련 항원은 CD19, CD20, CD30, CD33, CD52, HER2, EGFR, VEGF, CEA, PD-1, PD-L1, CTLA-4 또는 EpCAM 인 것인 컨쥬게이트.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 링커는 상기 단백질의 아민기에 연결된 것인 컨쥬게이트.
  14. 청구항 10에 있어서, 상기 항체의 Fc 영역과 연결된 것인 컨쥬게이트.
  15. 청구항 10에 있어서, 상기 항체는 Trastuzumab, Trastuzumab Emtansine, Pertuzumab, Rituximab, Ibritumomab tiuxetan, Tositumomab, Brentuximab vedotin, Ofatumumab, Obinutuzumab, Necitumumab, Bevacizumab, Ramucirumab, Nivolumab, Pembrolizumab, Atezolizumab, Durvalumab, Ipilimumab 인 것인 컨쥬게이트.
  16. 청구항 1의 컨쥬게이트를 포함하는 생체 내 영상화를 위한 조성물.
  17. 청구항 17에 있어서, 상기 영상화는 자기 공명 이미징(Magnetic resonance imaging: MRI), 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography: PET) 또는 단일 광자 방출 계산된 단층촬영(single-photon emission computed tomography: SPECT)인 것인 조성물.
  18. 청구항 1의 컨쥬게이트를 포함하는 암진단을 위한 조성물.
KR1020210143110A 2020-10-23 2021-10-25 짧은 peg 링커를 이용한 방사성 표지된 항체 컨쥬게이트를 포함하는 면역 영상화제 KR20220054232A (ko)

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