KR20220048964A - 반려견의 항암용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 반려견을 위한 항암용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 개 TRAIL 단백질 및 이를 제조하는 방법, 상기 재조합 개 TRAIL 단백질 포함하는 반려견의 항암 조성물, 상기 조성물을 포함하는 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 개 TRAIL 단백질은 반려견에 특이적인 단백질로 표적세포, 특히 암세포의 수용체(DR4, DR5 등)dp 결합하여 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 효과가 우수하므로 반려견의 다양한 암, 예를 들어 고형암 또는 혈액암 등의 예방 및 치료 목적으로 유용하게 사용가능하다.

Description

반려견의 항암용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 반려견을 위한 항암용 조성물 {A recombinant protein with anticancer for dogs and composition for treating cancer of dogs comprising the recombinant protein}
본 발명은 재조합 개 TRAIL(recombinant canine TRAIL) 단백질 및 이를 제조하는 방법, 상기 재조합 개 TRAIL 단백질 포함하는 반려견의 항암 조성물, 상기 조성물을 포함하는 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료에 관한 것이다.
여러 반려동물 중에서도 개는 가축화된 동물 중 가장 오래된 역사를 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 반려견을 키우는 인구의 수는 점차 늘어나는 추세에 있으며, 현재 우리나라 반려동물 양육 인구는 519만 가구 1418만명이고, 반려견은 598만 마리, 반려묘는 258만 마리 있는 것으로 조사되었다(농림축산식품부 ‘2019년 동물보호 국민의식조사’ 2020년 4월 29일 발표). 반려동물을 키우는 인구의 증가함과 동시에 현대사회에서는 특히 반려견의 동물권 및 동물 복지에 대한 사회적 관심이 증가하고 있다.
이러한 반려견의 동물권 및 동물 복지에 대한 관심은 반려견의 건강한 생명활동에 영향을 미치는 질환의 예방 및 치료를 위한 노력이 포함된다. 종래에는 반려견이 어떤 질환에 걸리더라도 치료를 하지 않는 경우가 다반사였으나, 지금은 반려견을 가족처럼 생각하여 반려견이 건강한 생활을 영위할 수 있도록 많은 노력과 비용을 지급하고 있다.
한편, 암은 인간의 건강을 위협하는 최대의 질병 중의 하나로서, 세포주가 일련의 돌연변이 과정을 거쳐, 무제한적이고 비조절적인 방식으로 불사화되어 발생하는 질병이다. 암 발생의 원인으로는 화학물질, 바이러스, 세균, 전리방사선 등의 환경적 또는 외적 요인과 선천성 유전자 변이등의 내적 요인을 들 수 있다(Klaunig & Kamendulis, Annu Rev Pharmacol Toxicol., 44:239-267, 2004).
이러한 암은 인간뿐만 아니라 반려견에도 빈번하게 발생하고 있는 실정이다. 더욱이 생명과학의 발달과 수의학의 발전으로 인하여 개의 평균 수명이 연장됨에 따라 노령견이 급속하게 증가하고 있으며, 이로 인해 개의 퇴행성 질환 및 암 발생이 현저하게 증가하고 있다. 개의 암 발생률은 사람에 비해 현저하고 높은 실정인데 예를 들어, 백혈병은 인간의 2배, 유방암은 4배, 골육종은 8배, 피부암은 무려 35배로 현저하게 높은 비율로 발생하고 있으며(https://dogs.lovetoknow.com/wiki/Cancer_in_Dogs) 미국에서는 매년 120만 마리 이상의 반려견들이 암으로 진단되고 있다(화이자 동물건강 보고서). 또한 10살 이상의 반려견 중 50%이상에서 암이 발생하고 전체 반려견 중 25%는 생존기간 내에 암이 발생할 것으로 전문가들이 예측하고 있다(https://cvm.ncsu.edu/one-medicine-dogs-people-and-cancer/). 수의 임상에서 사용하는 일반적인 항암치료법으로는 수술요법, 화학요법, 방사선 요법이 사용되고 있으며 이들 요법은 치료효능이 낮고 부작용과 재발 및 전이의 문제점들을 가지고 있다. 반려견을 위한 전용 항암제는 현재까지 오직 한 품목 (제품명: 팔라디아 Palladia, 성분명: 토세라닙 인산염 toceranib phosphate, 제형: 합성의약품, 제조사: 화이자 동물건강)만이 인가되어 임상에 사용되고 있으며 그것 또한 피부암의 20%를 차지하는 비만세포종에만 적용이 가능할 뿐이므로 반려견 항암치료에서는 대부분 인간에게 투여하는 항암제를 동일하게 사용하지만 그 실제적인 효과가 높지 않고, 1회성이 아닌 지속적으로 투여를 하지 않을 경우 재발 및 전이의 위험이 매우 높은 문제가 있다. 또한, 반려견의 항암 치료에 상당할 정도의 비용이 소요되므로 항암 치료 중 포기를 하고 반려견을 유기하거나 고 비용이 상당하고 지속적으로 투여를 하지 않을 경우 재발과 전이의 위험이 매우 높다.
이는 인간과 개의 유전자 지도 분석결과 인간과 개의 게놈(genome)이 일반적으로 유사하다고 알려졌으나, 개개의 유전자 서열 등에 있어서는 유사성 보다는 차이성을 나타내고 심지어 특정의 유전자들에게 있어서는 현저하게 상이한 경우가 존재한다. 이로 인해 항암기전이 인간에서 확인되는 것과 다르게 나타나거나 항암치료 약물 내지는 표적치료제에 대한 효력저하와 내성 등이 나타나게 된 원인으로 추정되고 있으며, 심지어 인간의 항암치료에서 특정 종양항원을 표적으로 하는 표적항체는 그 효력이 입증되어 광범위하게 사용되고 있음에도 수의 임상에서는 전혀 사용하고 있지 않는 것은 근본적으로는 유전적 차이로부터 비롯된다. 따라서 인간에게 광범위하게 사용되는 표적치료제나 표적항체의 경우 이를 반려견에 투여할 경우 효력이 없거나 중화항체 혹은 부작용의 문제 등을 유발할 가능성이 매우 높다. 난치성 암의 발생률이 해마다 증가하고 있고 이들 난치성 질환에 대한 새로운 치료제 개발이 매우 필요한 실정이나, 항암용 약물의 개발이 수의학 임상에서 진행되지 못하는 이유는 무엇보다도 인간에 비하여 반려견에 대한 항암에 대한 세포생물학적 내지는 면역학적 기전연구 및 임상연구가 거의 전무하기 때문이며, 현재까지도 유전체와 세포생물학적 원리를 기반으로 하여 재조합 단백질을 표적으로 하는 반려견 전용의 항암치료제 개발에 관련한 보고가 없다.
한편, TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)은 종양괴사인자(tumor necrosis factor) 계열의 다른 세포사멸 인자들과는 달리 정상세포에는 영향을 거의 미치지 않으며 TRAIL에 저항성이 있는 암세포들을 제외하고는 여러 암세포에 선택적으로 작용하여 세포사멸을 유발하고 고형암과 혈액암에 대해서도 종류에 상관없이 항암활성을 갖는 것이 증명(Wiley et al., Immunity, 3:673-682, 1995; Pitti et al., J Biol Chem., 271:12687-12690, 1996; Hao C et al., Cancer Res., 64:8502-8506, 2004)되었다. 또한 저항성이 있는 암세포조차도 현재 인간의 항암치료에 사용하고 있는 화학항암제와 병합했을 시 상승효과가 나타나거나 본래 TRAIL과 화학항암제 둘 다 저항성이었던 암세포에 대해서도 항암효능이 나타나고 보다 효과적으로 암세포를 살상하는 것이 확인되었다(Kim JH et al., Clin Cancer Res., 9(8):3134-3141, 2003; Singh TR et al., Cancer Res., 63(17):5390-5400, 2003; Nencioni A et al., Clin Cancer Res., 11(11):4259-4265, 2005; Kabore AF et al., Apoptosis. 11(7):1175-1193, 2006). 이로 인해 타 항암제와의 병합요법이 가능한 것과 병합 시 그 효과가 증대 내지는 극대화된다는 것이 항암치료제 후보물질로서 TRAIL이 갖는 강점 중의 하나이다. TRAIL이 암세포에서 강력하게 세포사멸을 유도하는 기전은 TRAIL의 수용체인 DR4와 DR5를 통해서 이루어지는 것으로 알려졌으며, 이들의 리간드인 TRAIL이 표적 암세포의 표면에서 발현되는 DR4, DR5 수용체에 결합하면 표적세포 내에서 세포사멸 신호를 전달하여 사멸시키는 것으로 알려졌다(Chaudhary et al., Immunity, 7:821-830, 1997; Schneider et al., Immunity 7: 831-836, 1997; Sheridan et al., Science 277: 818-821, 1997). 따라서, 암세포에 DR4 내지는 DR5를 과발현시키는 약물과 병합한다면 TRAIL의 항암효력은 더욱 증가시킬 수 있게 되며 이 또한 실험적으로 증명되었다(Liu X et al., Cancer Res., 67(10):4981-4988, 2007; Ding L et al., Cancer Invest., 29(8):511-520, 2011). TRAIL은 또한 같은 계열의 종양괴사인자-알파 및 Fas 리간드와 비교해서 보다 더 강력한 세포사멸 역가를 가지고 있으며, 전신투여 후에 염증을 유발하지 않는 것이 보고되었다(K Huang et al., Sci Rep., 7: 41904, 2017).
이에 본 발명자는 반려견의 유전적 분석을 통한 반려견의 질환을 치료하기 위하여 예의 노력한 결과, 반려견의 TRAIL 단백질이 인간의 TRAIL 단백질과 유전적으로 20% 정도 상이하다는 것을 확인하였다. 따라서 인간의 TRAIL 단백질을 반려견에게 투여할 경우 반려견의 생체 내에서는 효력이 저하되거나 미미해지는 문제 그리고 이종 단백질 투여에 의해 면역반응이 유발되어 중화항체가 형성되고 이로 인해 궁극적으로는 효력이 상실되거나 부작용이 발생하는 문제점 등을 고려하여 인간의 TRAIL 단백질을 반려견에 적용하는 것은 부적절하며 반려견에 특이적인 재조합 개 TRAIL 단백질이 반려견의 암 질환에 효과적임을 밝혀내고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 재조합 개 TRAIL 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 포함하는 반려견용 항암 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 포함하는 반려견용 항암 조성물을 반려견에게 투여하여 반려견의 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 포함하는 반려견의 암 예방 또는 개선을 위한 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공하는 것이다.
본 발명자는 개 TRAIL 단백질의 유전자를 클로닝 및 분석하였다. 그 결과, 반려견의 TRAIL 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어져 있음을 확인하였으며, NCBI에 등록된 반려견의 TRAIL 단백질을 구성하는 DNA 염기서열(NM_001130836.1)과 상동성을 분석한 결과 2개의 염기(base)에서 차이가 있음을 확인하였다.
또한, 서열번호 1의 아미노산 서열과 인간의 TRAIL 단백질을 코팅하는 아미노산 서열을 비교한 결과 80.4%의 동일성(identity)이 있는 것으로 확인하였다.
이들 결과를 토대로 본 발명자는 서열번호 2의 아미노산 서열로부터 TNF 계열의 보존 부위의 시작 아미노산으로 고려되는 118번째 아미노산인 아르기닌부터 218번째 아미노산인 글리신까지의 서열을 선택하고 재조합 개 TRAIL 단백질을 확립하고, 이를 포함하는 서열을 서열번호 3의 아미노산 서열로 특정하였다.
따라서, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 재조합 개 TRAIL 단백질을 제공한다.
본 발명의 상기 재조합 개 TRAIL 단백질은 총 501bp의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 것이고, 167개의 아미노산으로 번역되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기한 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4의 염기서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 염기서열인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 개 TRAIL 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
a) 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 형질전환체 또는 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 세포를 배양하는 단계; b) 상기 형질전환체 또는 세포에서 재조합 개 TRAIL 단백질의 발현을 유도하는 단계; c) 상기 재조합 개 TRAIL 단백질이 발현되는 형질전환체 또는 세포를 분쇄한 후 침전시켜 얻어진 상등액으로부터 재조합 개 TRAIL 단백질을 용출하는 단계; 및 d) 상기 용출된 재조합 개 TRAIL 단백질을 정제하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 포함하는 반려견용 항암 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 포함하는 반려견용 항암 조성물을 반려견에게 투여하여 반려견의 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 포함하는 반려견의 암 예방 또는 개선을 위한 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 개 TRAIL 단백질은 반려견에 특이적인 단백질로 표적세포, 특히 TRAIL의 수용체인 DR4 내지는 DR5를 발현하는 고형암 및 혈액암 세포에 결합하여 세포사멸(apoptosis)를 유도하여 살상하는 효과가 우수하므로 특정 암 종의 하나의 표적만을 대상으로 하는 표적치료제 및 표적항체와는 달리 반려견의 고형암 또는 혈액암에 속하는 다양한 종류의 암의 예방 및 치료 목적으로 유용하게 사용가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 비글 견종으로부터 채혈 후 수집한 단핵구로부터 개 TRAIL 유전자를 RT-PCR로 증폭한 결과를 보여주는 전기영동 사진 및 염기서열 분석을 위해 클로닝 벡터에 삽입한 과정의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 클로닝벡터에 클로닝된 개 TRAIL 유전자(클론번호 4번)의 DNA 염기서열의 분석결과를 보여주는 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 클로닝벡터에 클로닝된 개 TRAIL 유전자(클론번호 4번)의 DNA 염기서열의 분석결과(좌) 및 유전자은행에 등록된 서열과의 정렬결과를 보여주는 그림이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 클로닝벡터에 클로닝된 개 TRAIL 유전자(클론번호 4번)의 DNA 염기서열로부터 번역된 아미노산 서열과 유전자은행에 등록된 원 아미노산 서열과의 정렬결과를 보여주는 그림이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 서열번호 3을 코딩하는 서열번호 4에 대한 PCR 증폭 결과인 전기영동 사진 및 발현벡터 제조과정의 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 서열번호 3에 해당하는 개 TRAIL을 IPTG로 발현을 유도한 결과를 보여주는 SDS-PAGE 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 서열번호 3에 해당하는 개 TRAIL 단백질의 발현 및 정제 결과를 보여주는 SDS-PAGE 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 본 발명에 따른 개 TRAIL 단백질에서 내독소 제거 전후의 결과를 보여주는 SDS-PAGE 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 본 발명에 따른 개 TRAIL 단백질의 갑상선암세포주(canine thyroid adenocarcinoma, CTAC)와 개 유선암세포주(CMT-U33)에 대한 세포독성능을 농도별로 확인한 결과이다.
하나의 양태로서, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 재조합 개 TRAIL 단백질을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 개 TRAIL 단백질은 총 501bp의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 것이고, 167개의 아미노산으로 번역되며, 분자량이 19.42kDa이다.
또한, 상기 재조합 개 TRAIL 단백질은 1 내지 3번째 아미노산이 플렉시블 아미노산(flexible amino acid)인 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 재조합 개 TRAIL 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체로부터 정제하여 수득할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 재조합 개 TRAIL 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하고, 상기 제조된 형질전환체를 배양한 후 그 배양 균체 혹은 상등액으로부터 당업계에 공지된 단백질 정제방법을 통해 정제하여 수득할 수 있다. 여기서, 상기 숙주세포는 형질전환을 위해 정상적인 숙주세포에 화학적 처리를 하여 외래 유전자가 세포 내에 잘 들어가 외래 유전자의 형질을 나타낼 수 있는 능력을 가지는 세포로서, 상기 정상적인 숙주세포는 대장균(E. coli), 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 균주, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 균주, 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 균주, 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주 락토코쿠스 속(Lactococcus sp.) 균주, 루코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 균주, 페디오코쿠스 속(Pediococcus sp.) 균주, 엔터로코쿠스 속(Enterococcus sp.) 균주, 스트렙토코쿠스 속(Streptococcus sp.) 균주 및 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 균주 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 정제방법은 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등을 통해 재조합 개 TRAIL 단백질을 정제할 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 개 TRAIL 단백질은 상술한 인간 TRAIL 단백질을 구성하는 아미노산의 상동성 차이로 인간의 TRAIL 단백질 또는 인간의 재조합 TRAIL 단백질을 반려견에 투여하는 경우에 비하여 암의 예방 및 치료 효과가 우수하고 중화항체가 형성될 가능성 및 부작용의 발생 가능성이 현저히 낮아지는 효과가 있다.
따라서, 본 발명의 상기 재조합 개 TRAIL 단백질은 반려견의 항암제로서 매우 유용하다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기한 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
이때 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4의 염기서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 폴리뉴클레오타이드 서열, 폴리뉴클레오타이드 분자, 핵산, 핵산분자, 핵산서열 등의 용어와 동등한 의미로 사용되며, 상기 핵산은 RNA(ribonucleic acid) 또는 DNA(deoxyribonucleic acid)를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “프라이머(primer)”는 단일가닥의 올리고데옥시리보뉴클레오타이드(oligodeoxyribonucleotide)로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 삼인산염 및 DNA 또는 RNA 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 완충용액 하에서 상기의 핵산으로부터 주형-의존적 DNA 합성을 개시할 수 있는 시발물질으로서 작용하는 것을 의미한다.
하나의 구체적 예로서, 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성과 서열에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 75 bp의 길이로서 사용할 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA 를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.
본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA 를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 (functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA 를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 발현벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 달성할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에 사용 가능한 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드(cosmid) 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터, 효모 발현벡터 및 효모인공염색체 벡터, 곤충세포 발현벡터, 포유동물세포 발현벡터, 식물세포 발현벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터 (promoter), 오퍼레이터 (operator), 개시코돈 (initiation codon), 종결코돈 (termination codon), 폴리아데닐화 신호 (polyadenylation signal), 인핸서 (enhancer)와 같은 발현 조절서열 외에도, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 (signal sequence) 또는 리더서열 (leader sequence)을 포함하여 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적 (constitutive) 또는 유도성 (inducible)일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커(selective marker)를 포함하고, 복제가 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원(origin)을 포함한다. 이러한 벡터의 제조, 돌연변이 유발, 서열 분석, 세포 내로의 DNA의 도입 및 유전자발현과 단백질 분석법은 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., John Wiley ＆ Sons, 1992; Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., J.F. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)에 상세히 기재되어 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 도입된 벡터는 숙주 염색체와는 독립적으로 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 염색체에 통합될 수 있으며, 본원에서 '플라스미드' 및 '벡터'는 때로 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 형질전환을 위해 정상적인 숙주세포에 화학적 처리를 하여 외래 유전자가 세포 내에 잘 들어가 외래 유전자의 형질을 나타낼 수 있는 능력을 가지는 세포로서, 상기 정상적인 숙주세포는 대장균(E. coli), 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 균주, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 균주, 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 균주, 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주 락토코쿠스 속(Lactococcus sp.) 균주, 루코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 균주, 페디오코쿠스 속(Pediococcus sp.) 균주, 엔터로코쿠스 속(Enterococcus sp.) 균주, 스트렙토코쿠스 속(Streptococcus sp.) 균주 및 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 균주 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터를 숙주세포로 형질전환하는 방법은 재조합 벡터가 숙주세포 안으로 삽입되는 것이라면 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들어, CaCl2 방법, 전기천공방법, 미세주입법 등 어느 것이나 가능하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "재조합 벡터"는 통상 이종의 DNA 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 수용성 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 재조합 벡터는 일단 수용성 세포 내에 있으면 수용성 세포의 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며, 벡터 수개의 카피 및 그의 삽입된 이종 DNA가 생성될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "형질전환"은 도입과 동등한 의미로 사용되며, 사용된 방법에 관계없이 외래 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포로의 전달을 모두 포함한다. 또한 재조합 유전자 제조 시 DNA 리가아제(DNA ligas) 반응으로 재조합된 클로닝 벡터 또는 발현벡터가 세균 내에서 증폭되거나 발현벡터에 운반된 유전자가 발현되도록 원핵세포로 벡터가 도입되는 것을 의미한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 개 TRAIL 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
a) 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 형질전환체 또는 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 세포를 배양하는 단계; b) 상기 형질전환체 또는 세포에서 재조합 개 TRAIL 단백질의 발현을 유도하는 단계; c) 상기 재조합 개 TRAIL 단백질이 발현되는 형질전환체 또는 세포를 분쇄한 후 침전시켜 얻어진 상등액으로부터 재조합 개 TRAIL 단백질을 용출하는 단계; 및 d) 상기 용출된 재조합 개 TRAIL 단백질을 정제하는 단계.
상기 제조방법에 있어서, 상기 a) 단계에서 재조합 벡터를 형질전환시킬 수 있는 숙주세포로는 외래 유전자가 세포 내에 잘 들어가 외래 유전자의 형질을 나타낼 수 있는 능력을 가지는 세포라면 어느 것이나 이용할 수 있으며, 예를 들어, 대장균(E. coli), 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 균주, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 균주 및 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 균주, 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주 락토코쿠스 속(Lactococcus sp.) 균주, 루코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 균주, 페디오코쿠스 속(Pediococcus sp.) 균주, 엔터로코쿠스 속(Enterococcus sp.) 균주, 스트렙토코쿠스 속(Streptococcus sp.) 균주 및 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 균주 등을 사용할 수 있다.
상기 a) 단계에서 형질전환체 또는 세포의 배양은 LB(Luria-Bertani) 액체 배지에서 배양할 수 있으며, 바람직하게는 상기 형질전환체 또는 세포를 선별적으로 증식시킬 수 있는 암피실린, 가나마이신, 클로람페니콜 및 테트라사이클린 등의 항생제를 포함한 LB 액체배지, 보다 바람직하게는 가나마이신을 함유한 LB 액체배지에서 배양할 수 있다.
상기 b) 단계에서 재조합 개 TRAIL 단백질의 발현 유도는 알로락토오즈(allolactose) 및 IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside) 등의 유도물질을 처리하여 유도할 수 있으며, 바람직하게는 IPTG를 최종농도가 0.01 내지 2 mM, 바람직하게는 0.05 내지 1 mM, 보다 바람직하게는 0.5 mM가 되도록 처리하여 유도할 수 있다.
상기 c) 단계에서 재조합 개 TRAIL 단백질의 용출은 재조합 개 TRAIL 단백질의 생물학적 기능에 손실을 주지 않는 무기산 또는 유기산의 염을 포함하고 있는 완충용액을 사용하여 용출할 수 있다. 예를 들어, 구연산염, 초산염, 호박산염, 유산염, 타르타르산염, 포름산염, 프로피온산염, 인산염, 또는 붕산염을 포함하는 완충용액일 수 있다.
상기 d) 단계에서 재조합 개 TRAIL 단백질의 정제는 당업계에 공지된 단백질 정제 방법을 이용하여 정제할 수 있으며, 바람직하게는 이온교환 크로마토그래피, 겔-투과 크로마토그래피, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 및 친화성 컬럼 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 정제할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 본 발명에서 발현시키고자 하는 목적 단백질은 목적 단백질 그 자체일 수 있으나, 정제를 용이하게 하거나, 항체 또는 효소와 융합하여 여러 기능을 가지도록 하거나, 또는 가용성을 증가시키기 위해 가용성을 증가시키는 서열과 융합시키는 등 융합 단백질의 형태를 취할 수 있다. 목적 단백질이 정제 등을 용이하게 하기 위한 서열을 포함하는 경우, 목적 단백질을 이러한 서열과 융합 단백질의 형태로 발현시킬 수 있다. 이러한 융합된 목적 단백질은 융합파트너-연결 펩타이드-목적 단백질로 이루어질 수 있고 각각의 종류에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 융합파트너는 생산된 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 것으로 아미노산의 일종인 히스티딘(histidine)이 연결된 히스티딘-태그(tag), 글루타치온-S-전이효소(glutathione-Stransferase), 말토스-결합 단백질(maltose-binding protein), 프로틴 A (protein A), 프로틴 G (protein G), FLAG(서열: DYKDDDDK) 펩타이드, HA(서열: YPYDVPDYA) 펩타이드, c-Myc(서열: EQKLISEEDL) 펩타이드, V5(서열: GKPIPNPLLGLDST) 펩타이드, 티오레독신 (thioredoxin), S-펩티드, 아비딘 (avidin), 스트렙타비딘 (streptavidine), 갈락토스 결합 단백질(galactose binding protein), 셀룰로즈 결합 도메인 (cellulose-binding domain), 키틴 결합 도메인 (chitin-binding domain), 폴리아르기닌 (polyarginine), 폴리시스테인 (polycysteine), 또는 폴리페닐알라닌 (polyphenylalanine) 등을 이용할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 포함하는 반려견용 항암 조성물을 제공한다.
본 발명의 반려견용 항암 조성물의 유효성분인 상기 재조합 개 TRAIL 단백질은 표적세포, 특히 암세포의 수용체(DR4, DR5 등)에 결합하여 세포사멸(apoptosis)를 유도하므로 반려견의 다양한 암, 예를 들어 고형암 또는 혈액암 등의 예방 및 치료 목적으로 유용하게 사용가능하다. 상기 개의 암은 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 덩어리라면 특별히 제한하지 않으며 고형암과 혈액암 등이 있다. 상기 고형암은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 간암, 담낭암, 위암, 신장암, 췌장암, 대장암, 식도암, 방광암, 전립선암, 고환암, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 뇌암, 두경부암, 폐암, 갑상선암, 피부암, 섬유육종, 횡문근육종, 또는 골육종 등이 있다. 상기 혈액암은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 백혈병, 림프종, 다발골수종 등이 있다.
본 발명의 반려견용 항암 조성물은 유효성분으로 상기 재조합 개 TRAIL 단백질 이외에 동일 또는 유사한 기능을 나타내거나 이를 보조하는 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 예컨대 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함한다. 경구 투여용의 경우, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 환제, 산제, 과립제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 글리세린, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함하며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 사용할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995).
본 발명에 따른 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 또는 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 다양한 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화할 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 (예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로스 및/또는 글리신)와 활택제 (예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물의 투여 경로로는 경구적으로 또는 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강 내 등과 같은 비경구적으로 반려견에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육내 주사, 복강주사, 정맥 주사, 종양 직접 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 본 발명의 재조합 단백질의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 반려견에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 조성물은 나이, 성별, 체중 및 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 반려견 성체를 기준으로 1 회 투여 시 0.01 내지 10 mg/kg의 유효 투여량, 바람직하게는 0.05 내지 5 mg/kg의 유효 투여량으로 하루에 1회 내지 수회로 나누어 투여될 수 있다. 그러나 상기 재조합 단백질의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 반려견의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설을 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 재조합 단백질의 항암제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 포함하는 반려견용 항암 조성물을 반려견에게 투여하여 반려견의 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 암이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 반려견에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 투여하는 방법은, 상기에 전술한 바와 같다.
상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 포함하는 약학적 조성물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 조성물은 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제는 전술한 바와 같다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 반려견의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 구체적으로, 반려견 성체를 기준으로 1 회 투여 시 0.01 내지 10 mg/kg의 유효 투여량, 바람직하게는 0.05 내지 5 mg/kg의 유효 투여량으로 하루에 1회 내지 수회로 나누어 투여될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 포함하는 반려견의 암 예방 또는 개선을 위한 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.
본 발명의 재조합 개 TRAIL 단백질을 함유하는 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.
상기 동물사료 첨가제용 재조합 개 TRAIL 단백질은 동물에게 단독으로 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다.
또한, 상기 동물사료 첨가제용 재조합 개 TRAIL 단백질은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다.
상기 동물사료 첨가제용 재조합 개 TRAIL 단백질을 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 추출물의 투여 형태는 이들을 비-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 재조합 개 TRAIL 단백질의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분 산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 또한 이들은 암 질환의 개선 및 예방상 유용한 다른 물질을 함유할 수 있다.
또한, 재조합 개 TRAIL 단백질이 동물사료 첨가제로 포함되는 동물사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.
상기의 동물사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 동물사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 개 TRAIL 단백질을 포함한 동물용 사료 배합 방법은, 솔잎 추출물을 동물 사료에 건조 중량 기준으로 사료 1 ㎏당 약 1 mg 내지 1000 mg의 양으로 혼입한다.
또한, 사료 혼합물은 완전히 혼합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어진다. 이것을 매시로서 공급하거나, 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성한다. 이 때, 저장 중에 분리되는 것을 방지하기 위해, 동물 사료에 물을 첨가하고, 이어서 통상의 펠릿화, 팽창화, 또는 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 개 TRAIL 유전자 클로닝 및 분석
개 TRAIL 유전자를 클로닝하기 위해, NCBI 사이트의 유전자은행에 등록된 코딩서열(NM_001130836.1)을 토대로 하여 개 TRAIL 유전자에 특이적인 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 쌍을 디자인하였다. 서열번호 5 및 서열번호 6은 서열번호 1로 표현되는 개 TRAIL 코딩 서열 846 bp를 증폭하기 위해 제작한 프라이머이다. 개 TRAIL 유전자는 역전사-PCR 기법으로 증폭하였는데, 이를 위해 TRAIL의 mRNA를 발현하는 세포들을 수집하고 이를 파쇄한 상등액에서 추출된 전 시료 RNA 분자들로부터 상보적 cDNA를 합성한 후, 서열번호 5와 서열번호 6을 프라이머로 이용하여 TRAIL 유전자서열을 증폭하였다.
개 TRAIL에 대한 mRNA를 발현하고 있는 세포를 수집하기 위해 개의 말초혈액에서 백혈구 중 단핵구세포들을 불연속 밀도구배 용액을 이용하여 분리하였다. 이를 위해 전남대학교 수의과대학의 실험동물사육시설에서 사육하는 개 중에서 혈액검사와 정기적인 건강검진을 통해 건강하다고 인정되는 3세의 비글 성견의 경정맥에서 10mL의 말초혈액을 무균적으로 헤파린튜브(BD Biosciences사, Vacutainer Sodium Heparin)를 이용하여 채혈하였다.
상기 말초혈액 10mL에 PBS 완충액(phosphate-buffered saline buffer; WEL GENE사, DPBS)을 20mL 첨가하고 피펫으로 반복적으로 혼합하여 희석된 말초혈액을 제조하였다. 또한, 밀도구배(density gradients) 용액을 이용하여 상기 희석한 말초혈액에서 단핵구 세포를 분리하였다.
상기 밀도구배 용액인 100% 농도의 Lymphoprep(비중 1.077g/mL, Axis-Shield사, LymphoprepTM) 15mL를 50mL 용적의 원뿔 튜브(Cornical Tube, SPL사)에 먼저 분주하고 그 위에 상기 희석된 말초혈액 30mL 용액을 피펫을 이용하여 조심스럽게 중첩한 후 원심분리기(Eppendorf사 5810R)를 이용하여 상온에서 25분 동안 400 × g로 원심분리하여 개 단핵구 세포를 분리하였다.
상기 분리한 개 단핵구를 24-웰 플라이트(BD Biosciences사, Tissue Culture Plate24-Well)에 1×106 cells/well로 넣은 후, 열처리로 불활성화된 소혈청액(FBS, Invitrogen사)이 10% 함유된 RPMI1640(Invitrogen사) 배지(조성: RPMI1640 450mL + FBS 50mL)에 1 ㎍/mL 농도의 지질다당류(Sigma-Aldrich사, Lipopolysaccharides)를 첨가하여 24시간 동안 자극하면서 37℃, 5% CO2배양기(Sanyo사, MCO-175)에서 배양하였다. 그 후 배양된 세포들을 원심분리기(Eppendorf사 5810R)로 수집하였고 식염수로 세척한 후 세척한 세포들을 TAKARA사의 트리졸(Trizol)용액을 이용하여 제작사의 매뉴얼에 따라 전체 RNA 분자를 추출하였다.
상기 RNA 분자에 올리고 데옥시티민(oligo dT, TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) 프라이머와 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성하기 위해서 상기 RNA 분자 1 ㎍과 상기 올리고 데옥시티민(Invitrogen사, 50 uM) 1uL와 혼합하고 70℃에서 5분간 처리한 후 역전사효소 키트(Promega사, ImProm-II Reverse Transcriptase system)에 포함된 재료를 제조사의 매뉴얼대로 10 mM dNTPs 1uL, 25 mM MgCl2 4.8uL, 5× 반응완충액 4uL, 역전사효소 1uL, 및 멸균된 증류수를 첨가하여 최종 용적이 20uL가 되도록 250uL-PCR 반응튜브(Axygen사) 내에서 혼합하고 밀폐한 후 Veriti 96-Well Thermal cycler(Applied Biosystem사) 장치에서 삽입하여 25℃에서 5분, 42℃에서 90분간 반응하였다.
개 TRAIL 유전자를 PCR기법으로 증폭하기 위해 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표현되는 프라이머를 이용하고, 상기 Thermal cycler 장치를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 상기 합성된 20uL cDNA 반응물 중에서 1uL와 10 pmole/mL로 용해된 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 각각 1uL, 멸균수 17uL를 바이오니아사의 PCR PreMix에 현탁하였고 Veriti 96-Well Thermal cycler(Applied Biosystem사)장치에서 95℃에서 5분 동안 초기 변성(pre-denaturation)과정을 수행한 후, 94℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 30초로 구성된 증폭과정을 35회 반복 수행하였고, 마지막 단계인 추가연장(extension) 과정을 72℃에서 10분 동안 진행하였다. 상기 PCR 수행으로 증폭된 DNA 산물은 1% 아가로스 겔(agarose gel, TAKARA사)에서 100V로 35분 동안 전기 영동한 후, 브롬화 에티디움(Sigma사, EtBr)으로 15분간 염색하여 UV-transilluminator 상에서 상기 PCR로 증폭된 DNA 단편을 확인하였고, 그 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1의 M은 1 kb 사이즈 마커(size marker, 바이오니아사)이고, 라인 1은 상기 증폭된 846 bp 길이의 증폭된 DNA 단편이다.
상기 PCR 증폭 DNA 단편은 QIAquick PCR Purification kit(QIAGEN사)을 이용하여 제작사의 매뉴얼에 따라 최종 용량 20uL로 정제하였고, 상기 정제된 DNA 단편 1uL를 pGEM T easy vector(Promega사) 1uL와 혼합 후 멸균된 증류수 3uL 및 DNA Ligation Kit(TAKARA사) 5uL를 첨가하고 Veriti 96-Well Thermal cycler(Applied Biosystem사) 장치에 삽입하여 16℃에서 16시간 동안 반응하여 라이게이션(ligation) 반응물을 제조하였다.
형질전환을 위한 수용능(compeptent) 대장균 제조는 0.1 M 농도의 염화칼슘(CaCl2, Sigma사) 분말과 10 mM의 농도의 Tris(Sigma사) 분말을 증류수에 균질하게 녹인 후 0.22um Steritop 필터(Merk Millipore사)로 여과멸균하여 제조된 수용능 세포 완충액을 이용하였다.
구체적으로는, 대장균 DH5-alpha를 50mL의 LB 액상배지(BD Biosicences사)에 접종하고 37℃에서 분당 150 회전수로 진탕배양기(한백과학사)에서 배양하였다. 이후 600 nm 파장에서 흡광도가 0.5 일 때 진탕배양을 중단하고 배양액을 얼음에 20 분간 보존하여 차갑게 한 후, 4000 rpm, 4 ℃에서 10분간 원심분리기(Eppendorf사 5810R)로 균체를 침전시켜 상등액을 제거하였다. 상기 염화칼슘 완충액 20mL로 세척하고 다시 상기 조건에서 원심분리기로 침전시켜 상등액을 모두 제거하였다. 침전된 균체를 상기 염화칼슘 완충액 4mL로 재현탁(resuspend)하고 DMSO(Sigma-Aldrich사) 0.3mL을 첨가 및 혼합하여 수용능(compeptent) 대장균 DH5-alpha를 제조하였다. 이후 상기 수용성 대장균에 열충격방법으로 라이게이션 반응물을 형질전환하여 재조합 클로닝벡터를 제조하였다. 상기 클로닝 과정 모식도는 도 1에 나타내었다.
상기 수용능 대장균 DH5-alpha 100uL에 상기 라이게이션 반응물 10uL를 미세원심분리튜브(1.5mL, Axygen사)에서 혼합하고 얼음에 1 시간 동안 보존한 후 히팅블록(제이오텍사) 장치에 삽입하여 42℃에서 1분간 열충격을 주었고 신속하게 얼음에 1분간 보존하여 차갑게 하였다. 상기 수용능 대장균 및 라이게이션 혼합물에 200uL의 LB 액상배지(BD Biosicences사)를 첨가하고 상기의 히팅블록에서 37℃에서 20분간 배양하였다. 배양된 균체는 최종농도 100ug/mL의 앰피실린(Sigma사)이 포함된 LB-한천 배지(BD Biosicences사)에 도말하여 배양기(한백과학사)를 이용하여 37 ℃에서 16시간 배양하였다. 형질전환 수행 다음날, 앰피실린(Sigma사)에 저항성을 나타내는 콜로니 10개를 선별하여 3mL의 LB-앰피실린 배지(BD Biosicences사)에 최종농도 100ug/mL의 앰피실린(Sigma사)이 담긴 15mL 원뿔 튜브(SPL사)에 접종하고 진탕배양기(한백과학사)에서 37℃에서 분당 150 회전수로 16시간 진탕배양하였다. 진탕배양 완료 후 원심분리기(Eppendorf사 5810R)로 균체를 침전 및 회수하였고, 플라스미드 DNA는 DNA-spin plasmid DNA purification Kit(인트론사)로 제작사의 매뉴얼에 따라 정제하고 코스모진텍사에 DNA 염기서열분석을 의뢰하였다.
그 결과, 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 나타낸 바와 같이, 281개의 아미노산으로 구성된 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 총 길이 846 bp의 염기서열임을 확인하였다. 또한, 상기의 분석결과로부터 클로닝된 개 TRAIL 유전자서열 상에서 543번째 티민이 시토신(543T>C)으로 559번째 시토신이 아데닌(559C>A) 등 2개의 변이가 공통적으로 나타나는 것을 발견되었고, 그 외에는 변이가 없는 온전한 서열을 운반하는 한 개의 재조합 클론(clone 4, 서열번호 1)을 획득하였으며, 본 발명자들은 이를 운반하는 클로닝벡터를 pGEMT-cTRAIL(도 1 참조)이라 명명하였다. 상기 코스모진텍사에 의뢰한 염기서열 분석결과는 도 2에 나타내었으며, 해독방향은 역방향(antisense)이다.
상기 확인된 서열번호 1의 염기서열을 NCBI 사이트의 유전자은행에 등록된 서열(NM_001130836.1)과 비교한 결과 2개의 염기(base)가 차이를 보였으나, 유전암호서열로부터 번역(translation)한 아미노산 서열은 100% 완벽하게 동일함을 확인하였다. 상기 염기서열 정렬결과는 도 3에 나타내었으며 분석기법은 NCBI의 BLASTN programs을 이용하여 pairwise alignment를 수행하였다.
또한, 서열번호 1의 염기서열을 인간 TRAIL 단백질을 코딩하는 아미노산 서열과 상동성 분석한 결과 인간 TRAIL 단백질을 코딩하는 총 281 아미노산서열 중 226 아미노산이 동일한 위치에서 일치하여 80.1%의 identity를 가지는 것을 확인하였다. 상기 아미노산 서열 분석결과는 도 4에 나타내었으며 분석기법은 NCBI의 BLASTP programs을 이용하여 pairwise alignment를 수행하였다.
실시예 2: 재조합 개 TRAIL 유전자 발현벡터 제조
서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열(서열번호 4)에 특이적인 프라이머 쌍(서열번호 7 및 8)을 이용하여, 실시예 1에서 수득한 pGEMT-cTRAIL을 주형으로 Veriti 96-Well Thermal cycler(Applied Biosystem사) 장치를 사용하여 PCR을 수행하였다. 상기 pGEMT-cTRAIL을 멸균수로 200배 희석된 용액 1uL와 최종농도 10 pmole/uL 용해된 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 각각 1uL, 멸균수 17uL를 PCR PreMix(바이오니아사)에 현탁하였고, 상기 현탁액을 Veriti 96-Well Thermal cycler(Applied Biosystem사)장치에서 95℃에서 5분 동안 초기 변성(pre-denaturation)과정을 수행한 후, 94℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 30초로 구성된 증폭과정을 35회 반복 수행하였고, 마지막 단계인 추가연장(extension) 과정을 72℃에서 1분 동안 진행하였다. 상기 PCR 수행으로 증폭된 DNA 산물은 1% 아가로스 겔(agarose gel, TAKARA사)에서 100V로 35분 동안 전기 영동한 후, 브롬화 에티디움(Sigma사, EtBr)으로 15분간 염색하여 UV-transilluminator 상에서 상기 PCR로 증폭된 DNA 단편을 확인하였고, 그 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5의 M은 1 kb 사이즈 마커(바이오니아사)이고, 라인 1은 상기 증폭된 545 bp 길이의 증폭된 DNA 단편이며 이 단편에는 서열번호 3을 코딩하는 서열번호 4를 포함하고 있다.
상기 PCR로 증폭된 DNA 단편은 QIAquick PCR Purification kit(QIAGEN사)을 이용하여 제작사의 매뉴얼에 따라 최종 용량 20uL로 정제하였고, 미세원심분리튜브(1.5mL, Axygen사)에 상기 정제된 증폭산물 10uL에 멸균수 11uL, 10배 농축 반응완충액 3uL, 제한효소 NdeI 및 XhoI(각각 TAKARA사) 각각 3uL씩 첨가하고 혼합한 후 히팅블록(제이오텍사)에서 37℃에서 3시간 반응하였다. 또한 pET30a(+)벡터(Novagen사) 10uL를 상기와 동일한 방법으로 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단하고 QIAquick PCR Purification kit(QIAGEN사)를 사용하여 제작사의 매뉴얼에 따라 정제한 후 실시예 1과 같은 방법으로 라이게이션을 수행하였다. 라이게이션 수행 후 상기 실시예 1과 같은 방법으로 수용능 대장균 BL21(DE3)를 제조하고 형질전환하여 그 중 5개의 콜로니를 선별하여 최종농도 50ug/mL의 가나마이신(Sigma사)이 포함된 5mL의 LB 액상배지(BD Biosicences사)가 담긴 15mL 원뿔 튜브(SPL사)에 접종하였다. 접종된 콜로니는 진탕배양기(한백과학사)에서 37℃에서 분당 150 회전수로 16시간 배양하였다. 진탕배양 완료 후 원심분리기(Eppendorf사 5810R)로 균체를 침전 및 회수하였고, 플라스미드 DNA는 DNA-spin plasmid DNA purification Kit(인트론사)로 제작사의 매뉴얼에 따라 정제하고 코스모진텍사에 DNA 염기서열분석을 의뢰하였다.
상기 염기서열 분석 결과, 대장균 발현벡터에 변이가 없는 온전한 서열을 운반하는 3개의 개 TRAIL 발현벡터를 획득하였으며, 본 발명자들은 이를 pET30-cTRAIL이라 명명하였다(도 5).
실시예 3: 재조합 개 TRAIL 단백질 발현 유도
재조합 개 TRAIL 단백질을 발현시키기 위하여, 상기 실시예 2에서 제조된 pET30-cTRAIL 클론을 대장균 E. coli BL-21(DE3)(Novagen사)에 실시예 1과 같은 방법으로 형질전환하여 재조합 개 TRAIL 발현 클론을 제조하였다. 상기 재조합 개 TRAIL 발현 클론 중에서 가나마이신(Sigma사)에 저항성을 나타내는 콜로니를 선별하여 최종농도 50ug/mL의 가나마이신(Sigma사)이 포함된 10mL의 LB 액상배지(BD Biosicences사)가 담긴 50mL 원뿔 튜브(SPL사)에 접종하고 진탕배양기(한백과학사)에서 37℃에서 분당 150 회전수로 8시간 동안 배양하면서 최종 0.5 mM 농도의 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside, Promega사)를 첨가하여 재조합 개 TRAIL의 발현을 유도(induction)하였다.
상기 진탕배양 후 발현유도 전 200uL의 배양액과 유도 후 50uL의 배양액을 미세원심분리튜브(1.5mL, Axygen사)에 담아 미세원심분리기(Eppendorf사 5415R)로 침전시켜 얻은 균체를 SDS-PAGE용 염료(Thermo SCIENTIFIC사, Fermentas4X SDS-PAGE sample loading buffer) 5uL와 증류수 15uL로 재현탁하였다. 이후 100℃에서 5분간 끓인 후 12% SDS-PAGE 젤 상에서 BIO-RAD사의 Tris/Glycine/SDS premixed electrophoresis buffer 완충용액 및 MiniPROTEAN Tetra Cell장치를 이용하여 100V로 70분간 전기영동하여 TRAIL의 발현여부를 확인하였다. 상기 발현유도에 대한 전기영동 결과는 도면 6에 나타내었다.
도 6의 Mw는 BIO-RAD사의 단백질 사이즈 마커(size marker)이고, -로 명명된 라인은 발현 유도 전의 세포 파쇄액을 전기영동한 결과이고, IPTG와 lactose로 명명된 라인은 IPTG 혹은 lactose로 유도된 형질전환한 pET30-cTRAIL 클론의 세포 파쇄액을 전기영동한 결과이다.
도 6에서 확인되는 바와 같이, 115번째 글리신에서 281번째 글리신까지를 포함하는 TRAIL(서열번호 3)의 발현이 잘 유도됨을 확인하였고, 예상했던 단백질의 크기인 19.42 kDa에 6개의 히스티딘 His-태그가 부착되어 약 20.37 kDa 크기의 재조합 개 TRAIL 융합 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 재조합 개 TRAIL의 발현 및 정제
상기 실시예 3의 재조합 개 TRAIL 발현 클론에서 재조합 개 TRAIL 단백질을 대량으로 발현시키기 위해, 실시예 3에서 수득한 재조합 개 TRAIL 발현 클론을 최종농도 50ug/mL의 가나마이신(Sigma사)이 포함된 10mL의 LB 액상배지(BD Biosicences사)가 담긴 50mL 원뿔 튜브(SPL사)에 접종하고 진탕배양기(한백과학사)에서 37℃에서 분당 150 회전수로 12시간 동안 배양하였다. 상기 진탕배양액 2mL를 50ug/mL의 가나마이신(Sigma사)이 포함된 200mL의 LB 액상배지(BD Biosicences사)가 담긴 1L 삼각 유리플라스크(동성과학사)에 접종하여 37℃에서 3시간 동안 진탕배양기(한백과학사)에서 37℃에서 분당 150 회전수로 12시간 동안 배양하였다. 이후 600 nm 파장에서 흡광도가 0.7일 때 최종 0.5 mM 농도가 되도록 IPTG(Promega사)를 첨가하고 37℃에서 7시간 동안 진탕배양기(한백과학사)에서 배양하여 재조합 개 TRAIL 단백질의 발현을 유도하였다.
상기 진탕배양 완료 후 배양액을 얼음에 30 분간 보존하여 차갑게 한 후, 4℃에서 원심분리기(Eppendorf사 5810R)로 균체를 침전시켜 상등액을 제거하고 차가운 식염수(웰진사)로 세척하고 다시 4℃에서 원심분리기(Eppendorf사 5810R)로 침전시켜 상등액을 모두 제거하였다. 세척한 균체를 배양액 200mL당 20mL의 가수분해 완충액(lysis buffer, 성분: 20 mM Tris-Cl pH 8.0, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazole, Sigma사)을 혼합하여 재현탁(resuspend)하고 여기에 트리톤(Triton) X-100(Sigma사)을 최종 1%가 되도록 첨가한 후 얼음 상에서 20분 동안 가수분해시켰다.
이후 초음파분쇄기(sonicator, Sonics & Materials사)를 이용하여 4℃에서 20분 동안 세포를 파쇄시키고 상기 파쇄액을 1.5mL씩 미세원심분리용 튜브(Axygen사)로 분주 후 4℃에서 원심분리(Eppendorf사 5415R)하여 상등액만을 회수하였다. 상기 상등액에 Ni-NTA agarose(QIAGEN사) 2mL를 함유한 컬럼(BIO-RAD사)을 이용하여 제작사의 메뉴얼에 따라 단백질 정제를 수행하였다.
상기 단백질 정제에서 얻어진 단백질에서 재조합 개 TRAIL 단백질이 정제되었는지를 확인하기 위하여, 용출 완충액(elution buffer, 성분: 20 mM Tris-Cl pH 8.0, 150 mM NaCl, 500 mM Imidazole, Sigma사) 1.5mL로 상기 단백질 정제에서 얻어진 시료 중 20uL를 12% SDS-PAGE 상에서 전기영동을 수행하였다. 상기 전기영동 결과는 도 7에 나타냈다.
도 7의 Mw는 BIO-RAD사의 단백질 사이즈 마커(size marker)이고, -로 명명된 라인은 발현 유도 전의 세포 파쇄액을 전기영동한 결과이고, IPTG로 명명된 라인은 IPTG로 유도된 형질전환한 pET30-cTRAIL 클론의 세포 파쇄액을 전기영동한 것이며 elution으로 명명된 라인은 Ni-NTA agarose(QIAGEN사)를 이용하여 제작사의 메뉴얼에 따라 정제된 단백질 결과이다.
도 7에서 확인되는 바와 같이, 발현이 유도된 6개의 히스티딘 His-태그가 부착되고 115번째 글리신에서 281번째 글리신까지를 포함하는 약 20.37 kDa 크기의 재조합 개 TRAIL(서열번호 3) 단백질이 정제되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 재조합 개 TRAIL의 정제 및 내독소 제거
상시 실시예 4에서 수행한 대장균에서 발현 및 정제한 재조합 단백질은 정제과정에서 대장균 외막 지질 성분인 내독소(endotoxin A) 및 지질다당류(LPS, lipopolysaccharides)가 함유된다. 상기 내독소 및 지질다당류는 동물의 생체 내에서 염증을 강력하게 유발하는 물질이므로 경구용 및 비경구용 방식으로 생체 주입을 목적으로 하는 경우에는 단백질 정제 후 반드시 제거되어야 한다. 따라서, 상기 실시예 4에서 정제가 확인된 재조합 개 TRAIL 단백질을 정제한 후 염증유발 물질인 내독소 및 지질다당류 제거작업을 수행하였다.
내독소를 제거하기 위해, 상기 실시예 4에서 제조한 재조합 개 TRAIL 단백질을 Pierce High-Capacity Endotoxin Removal Resin(Thermo SCIENTIFIC사)을 이용하여 제작사의 매뉴얼에 따라 내독소 성분을 제거하여 내독소가 제거된 재조합 개 TRAIL 단백질 시료를 제조하였다.
또한, 상기 내독소가 제거된 단백질 시료 중에서 실시예 4에서 용출완충액의 성분으로 사용했던 이미다졸(imidazole) 성분 및 완충액 Tris 성분을 제거하고 단백질 시료 내의 완충액(이하, "액상"으로 기재)을 생리식염수로 교체하기 위해서, 분자량 제거수준이 10 kDa인 sartorius stedim biotech사의 시료농축용 컬럼(Vivaspin 20, 10,000 MWCO PES)를 이용하여 완충액 교체작업 및 농축작업을 수행하였다.
구체적으로, 상기 내독소가 제거된 재조합 개 TRAIL 단백질 시료 20mL를 상기의 농축용 컬럼에 첨가하고 분당 회전수 3000 rpm의 속도에서 100분간 4℃에서 원심분리기(Eppendorf사, 5810R)로 회전하여 컬럼 내 필터 하부에 응집된 액상은 제거하고 상기 컬럼에 멸균된 생리식염수를 20mL 첨가한 후 다시 원심분리기를 가동하였다. 상기 과정을 총 3번 반복한 후 마지막 단계에서 생리식염수 2mL를 첨가하여 필터 위에 존재하는 내독소가 제거된 재조합 개 TRAIL 단백질을 회수하였다. 상기 내독소가 제거된 재조합 개 TRAIL 단백질 시료는 분자량이 20.37 kDa이므로 10,000 Da 사이즈의 컬럼을 통과하지 못하고 필터 막에 정체되기 때문에 필터 위에 존재하는 것이다.
이후 회수한 재조합 개 TRAIL 단백질의 농도는 BIORAD사의 브래드포드(Bradford) 시약을 이용하여 제조사의 매뉴얼대로 단백질의 농도를 결정하였고, 주사제로 사용하기 위해, 최종적으로 멸균용 0.2 ㎛ 주사기 필터(PALL사)를 통과시켜 멸균하여 멸균된 재조합 개 TRAIL 단백질을 제조하였다.
상기 멸균된 재조합 개 TRAIL 단백질 20uL를 SDS-PAGE용 염료(Thermo SCIENTIFIC사, Fermentas4X SDS-PAGE sample loading buffer) 5uL와 혼합하고 100 ℃에서 5분간 끓인 후 12% SDS-PAGE 젤 상에서 BIO-RAD사의 Tris/Glycine/SDS premixed electrophoresis buffer 완충용액 및 MiniPROTEAN Tetra Cell장치를 이용하여 100V로 70분간 전기영동을 수행하였다. 상기 전기영동 결과는 도 8에 나타냈다.
도 8의 Mw는 BIO-RAD사의 단백질 사이즈 마커(size marker)이고, before로 명명된 라인은 내독소 제거 전이며 after로 명명된 라인은 Pierce High-Capacity Endotoxin Removal Resin(Thermo SCIENTIFIC사)을 이용하여 제작사의 매뉴얼에 따라 내독소 성분 제거 후의 결과이다.
도 8에서 확인되는 바와 같이, 내독소 제거 전후로 해서 정제된 재조합 개 TRAIL(서열번호 3) 단백질이 분해되지 않는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 개 암세포주에 대한 재조합 개 TRAIL의 세포독성능 평가
TRAIL은 암세포에 표면에 있는 수용체 분자인 DR4 및 DR5에 결합하여 암세포 내에 세포사멸(apoptosis)을 유발하여 암세포주에 대한 직접적인 세포독성능(cytotoxicity)을 갖는다. 실시예 5에서 제조된 재조합 개 TRAIL의 직접적인 항암효능을 검증하기 위해 암세포주인 개 갑상선 암세포주(canine thyroid adenocarcinoma, CTAC)와 유선암세포주인 CMT-U334에 대하여 세포독성능을 평가하였다.
구체적으로, 실험 전날 상기 표적세포주(ATCC, American Type Culture Collection 분양)들에 대해 각각 미디어를 피펫으로 제거하고 1mL의 트립신(Invitrogen사)을 1분간 처리한 후 10mL 피펫(SPL사)으로 10mL의 RPMI1640 배지(Invitrogen사, 조성: RPMI1640 450mL + FBS 50mL)로 세포주들을 현탁하고 15mL 원뿔튜브(SPL사)에 분주하여 분당 회전수 1000 rpm의 속도에서 3분간 상온에서 원심분리기(Eppendorf사 5810R)로 회전하여 침전시킨 후 다시 상기 RPMI1640배지 10mL로 현탁하고 상기 표적세포들의 세포수를 계산하였다. 세포수 계산은 상기 세포현탁액 10uL를 마이크로 피펫(Gilson사)으로 혈구세포 계수기인 Neubauer Chamber slide(Paul Marienfeld사)에 분주하고 커버슬라이드(Paul Marienfeld사)를 얹은 후 광학현미경(Leica사)에서 세포 수를 직접 세어 mL 당 세포 수를 계산하였다. 상기 표적세포들은 96-웰 평판 플레이트(SPL사, 96-well Cell Culture Plate flat-type)에 웰(well) 당 100 uL의 RPMI1640배지에 1×104개의 세포를 각각 분주하여 이산화탄소-배양기(파나소닉사)에 넣고 37℃, 5% CO2 공급조건에서 밤샘 배양하였다. 분석 당일 날 표적세포들이 배양된 96-웰 평판 플레이트에 있는 배지를 각각 마이크로 피펫(Gilson사)을 이용하여 제거하고 실시예5에서 제조된 재조합 개 TRAIL을 각 웰 당 0, 0.05, 0.1, 0.5ug/ml의 농도로 RPMI1640배지에 현탁하고 각각의 웰에 100uL의 용량으로 마이크로 피펫(Gilson사)으로 분주하고 이산화탄소-배양기(파나소닉사)에 넣고 37℃, 5% CO2 공급조건에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, Cell Counting Kit 8(WST-8/CCK8) (abcam사)의 매뉴얼에 따라 WST-1 발색시약 10uL를 첨가하고 37℃, 5% CO2 공급조건에서 1시간 더 추가 배양하였다. 상기 추가 배양 이후, 분당 회전수 2000 rpm의 속도에서 3분간 상온에서 원심분리기(Eppendorf사 5810R)로 원심분리 후 상층액 90uL를 마이크로 피펫(Gilson사)으로 취하여 새 96-웰 평판 플레이트(SPL사)에 분주하고 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 infinite M200 pro(TECAN사)를 측정하였고, 이후 하기 수학식 1로 세포독성능을 계산하였다. 상기 세포독성능 분석 결과는 도 9에 나타냈다.
<수학식 1>
세포독성능(%) = 100 - 100×[TRAIL처치 웰의 A450값 ÷ 순수표적세포 웰의 A450값]
이때, A450값은 450 ㎚에서의 흡광도이다.
도 9에서 확인되는 바와 같이, 재조합 개 TRAIL은 개 갑상선암세포주(canine thyroid adenocarcinoma, CTAC)와 개 유선암세포주(CMT-U334)에 대하여 직접적인 세포독성능을 농도별로 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명의 반려견용 항암 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
<제제예 1> 주사제의 제조
재조합 개 TRAIL 단백질 10 mg, 소디움 메타비설파이트 3.0 mg, 메틸파라벤 0.8 mg, 프로필파라벤 0.1 mg 및 주사용 멸균증류수 적량을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2 ㎖이 되도록 제조한 후, 2 ㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.
<제제예 2> 정제의 제조
재조합 개 TRAIL 단백질 10 mg, 유당 100 mg, 전분 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.
<제제예 3> 캡슐제의 제조
재조합 개 TRAIL 단백질 10 mg, 유당 50 ㎎, 전분 50 ㎎, 탈크 2 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<110> SHIN, Dongjun KIM, Gwuicheol <120> A recombinant protein with anticancer for dogs and composition for treating cancer of dogs comprising the recombinant protein <130> PA-21-0256 <150> KR 10-2020-0132218 <151> 2020-10-13 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 846 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> gene <222> (1)..(846) <223> TRAIL gene <400> 1 atgcaggccc cggggggccc cagcctcggg ctgacgtgcg tgctgatcct catcttcact 60 gtgctgctcc agtccctctg cgtggccgtc acctacatgt acttcaccag ggagctgaag 120 cagatgcagg acaagtactc ccaaagtggc atcgcttgtt tcttaaagga agatgatatc 180 ccctgggacc ccagtgatga agagagtatg aacaacccct gctggcaagt gaagtggcaa 240 ctccgccagt ttgttagaaa gatgattttg aaaacctatg aggaaaccat tcctacagct 300 ccagaaaagc agctaaatat tccttacgta gtaagcgacc gaggttctca gagagtagct 360 gctcacataa ctggaaccag tcggagaagc atgtttccaa ttccaagctc caagaatgat 420 aaagctttgg gccacaaaat aaactcctgg gattccacaa gaaaaggaca ttcattcttg 480 aataatttgc acttgaggaa cggagagctg gttatccatc aaagggggtt ttattacatc 540 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Gly Ser Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Ser Arg 115 120 125 Arg Ser Met Phe Pro Ile Pro Ser Ser Lys Asn Asp Lys Ala Leu Gly 130 135 140 His Lys Ile Asn Ser Trp Asp Ser Thr Arg Lys Gly His Ser Phe Leu 145 150 155 160 Asn Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Gln Arg Gly 165 170 175 Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Pro Glu 180 185 190 Glu Ile Pro Thr Gly Gln Asn Arg Lys Arg Asn Lys Gln Met Val Gln 195 200 205 Tyr Ile Tyr Lys His Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys 210 215 220 Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ser Glu Tyr Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile 245 250 255 Phe Val Ser Val Ser Asn Glu Gln Leu Ile Asp Met Asp Gln Glu Ala 260 265 270 Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Ile Gly 275 280 <210> 3 <211> 167 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(167) <223> recombinant canine TRAIL <400> 3 Gly Ser Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Ser Arg Arg Ser 1 5 10 15 Met Phe Pro Ile Pro Ser Ser Lys Asn Asp Lys Ala Leu Gly His Lys 20 25 30 Ile Asn Ser Trp Asp Ser Thr Arg Lys Gly His Ser Phe Leu Asn Asn 35 40 45 Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Gln Arg Gly Phe Tyr 50 55 60 Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Pro Glu Glu Ile 65 70 75 80 Pro Thr Gly Gln Asn Arg Lys Arg Asn Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile 85 90 95 Tyr Lys His Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala 100 105 110 Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ser Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile 115 120 125 Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val 130 135 140 Ser Val Ser Asn Glu Gln Leu Ile Asp Met Asp Gln Glu Ala Ser Phe 145 150 155 160 Phe Gly Ala Phe Leu Ile Gly 165 <210> 4 <211> 501 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> gene <222> (1)..(501) <223> recombinant canine TRAIL <400> 4 ggttctcaga gagtagctgc tcacataact ggaaccagtc ggagaagcat gtttccaatt 60 ccaagctcca agaatgataa agctttgggc cacaaaataa actcctggga ttccacaaga 120 aaaggacatt cattcttgaa taatttgcac ttgaggaacg gagagctggt tatccatcaa 180 agggggtttt attacatcta ctcccaaaca tactttagat ttcaggaacc tgaggaaatt 240 ccaacaggac agaacagaaa gagaaacaaa caaatggtcc aatatattta caaacacacg 300 agttatccgg accctatact gctgatgaaa agtgctagaa atagttgttg gtctaaagat 360 tctgaatatg gactctattc catctatcaa ggtgggatat ttgagcttaa ggaaaacgat 420 agaatttttg tctctgtatc taacgagcaa ttgattgaca tggaccaaga agccagtttt 480 ttcggggcct ttttaatcgg c 501 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for canine TRAIL gene <400> 5 atggctatga tggaggtcca g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for canine TRAIL gene <400> 6 ttagccaact aaaaaggccc c 21 <210> 7 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for recombinant canine TRAIL gene <400> 7 tttttcatat gcaccaccac caccaccacg gttctcagag agtagctgc 49 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for recombinant canine TRAIL gene <400> 8 tttctcgagt tattagccga ttaaaaaggc ccc 33

Claims (12)

  1. 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 재조합 개 TRAIL 단백질.
  2. 제1항의 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 서열번호 4의 염기서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 염기서열인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제2항의 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현벡터.
  4. 제2항의 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체.
  5. a) 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 형질전환체 또는 상기 재조합 개 TRAIL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 세포를 배양하는 단계; b) 상기 형질전환체 또는 세포에서 재조합 개 TRAIL 단백질의 발현을 유도하는 단계; c) 상기 재조합 개 TRAIL 단백질이 발현되는 형질전환체 또는 세포를 분쇄한 후 침전시켜 얻어진 상등액으로부터 재조합 개 TRAIL 단백질을 용출하는 단계; 및 d) 상기 용출된 재조합 개 TRAIL 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 재조합 개 TRAIL 단백질 제조방법.
  6. 제1항의 재조합 개 TRAIL 단백질을 포함하는 반려견용 항암 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 암은 고형암 또는 혈액암인 것을 특징으로 하는 반려견용 항암 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 고형암은 간암, 담낭암, 위암, 신장암, 췌장암, 대장암, 식도암, 방광암, 전립선암, 고환암, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 뇌암, 두경부암, 폐암, 갑상선암, 피부암, 섬유육종, 횡문근육종, 또는 골육종으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 반려견용 항암 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 혈액암은 백혈병, 림프종, 다발골수종으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 반려견용 항암 조성물.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 반려견용 항암 조성물을 반려견에게 투여하여 반려견의 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  11. 제1항의 재조합 개 TRAIL 단백질을 포함하는 반려견의 암 예방 또는 개선을 위한 동물사료 첨가제.
  12. 제11항의 동물사료 첨가제를 포함하는 반려견의 암 예방 또는 개선용 사료.
KR1020210135805A 2020-10-13 2021-10-13 반려견의 항암용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 반려견을 위한 항암용 조성물 KR20220048964A (ko)

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