KR20220047309A - 친화도 센서, 특히 qcm 센서 - Google Patents

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시바샨카르 크리슈나무티
마테오 베기아토
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룩셈부르크 인스티튜트 오브 사이언스 앤드 테크놀로지 (리스트)
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Abstract

일 실시 예에 따른 유체에서 분석물(생체 분자)을 감지하기 위한 친화도 바이오센서에 있어서, 유체를 접촉하고 분석물의 흡착을 위한 인터페이스를 포함한다. 상기 인터페이스는 상기 분석물에 대한 친화도를 갖는 나노 스케일 영역들의 바이너리 패턴 및 부동태화된 영역을 포함한다. 상기 나노스케일 영역들은 상기 상기 인터페이스 상의 상기 분석물의 흡착이 상기 나노 스케일 영역들에 국한되는 방식으로 상기 부동태화된 영역에 의해 서로 격리된다. 상기 나노 스케일 영역들은 5내지 200 nm 범위에 포함되는 직경을 갖는다. 상기 나노 스케일 영역들은 상기 인터페이스의 표면적의 적어도 15%에 해당하는 표면적을 함께 갖는다. 본 발명의 추가적인 실시 예는 상기 센서를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

친화도 센서, 특히 QCM 센서
본 발명은 일반적으로 친화도(affinity) 센서들, 특히 수정 결정 미소저울(QCM) 센서들에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 양태는 이러한 센서를 사용하여 유체에서 분석물을 감지하는 방법에 관한 것이다.
나노 스케일(nanoscale) 구성요소들을 사용하는 감지 장치들에서 흡착물 치수들의 몇 배 정도의 작은 공간들에 대한 흡착 공정들의 제한(confinement)이 발생한다.
흡착 이벤트들의 공간적 제한은 장치 풋프린트(footprint) 소형화(miniaturization)의 결과이다. 흡착 이벤트들의 결과는 나노센서들, 세포-기질 상호작용들, 항균 표면들, 기공들 내 흡착 등을 포함하는 광범위한 응용 분야들에 관심이 있다.
콜로이드 리소그래피(colloidal lithography), 블록 공중합체 유도 나노 입자 배열들(block copolymer derived nanoparticle arrays), 다공성 알루미나(porous alumina), 전자빔 또는 나노임프린트(nanoimprint) 리소그래피, 및 AFM(원자간력 현미경)에 기반한 방법들을 포함하는 생물학적 수용체들의 나노패터닝(nanopatterning)을 위해 다양한 기술이 사용되어 왔다. 그러나, 나노크기의 흡착 면적들이 흡착 결과, 즉 흡착물의 밀도 또는 흡착 동역학에 미치는 영향은 조사되지 않았다.
콜로이드 리소그래피는 이전에, 표면 상의 서브-마이크론 패치들(sub-micron patches)에 대한 생체분자들의 선택적 흡착을 위한 바이너리 나노패턴들(binary nanopatterns)을 생성하는 데 사용되어 왔다. Krishnamoorthy, S., Himmelhaus, M.의 논문, "바이너리 나노패턴들 내에서 항원-항체 상호작용들의 제한 유도 증진으로 온칩 면역제들의 높은 효율성을 달성". Adv. Mater. 2008, 20 (14), 2782-2788, 은 이러한 패턴들이 면역 분석의 감도를 증가시키는 것을 발견했고, 이를 나노패턴들 상에서 포획 항체의 향상된 방향의 결과로 보았다. 그러나, 조사는 수용체들의 표면 농도 또는 순도 분석(assay)의 응답 시간들 상에서의 그러한 제한의 영향을 다루지 않는다.
유사하게, Agheli, H.; Malmstr
Figure pct00001
m, J.; Larsson, E. M.; Textor, M.; Sutherland, D. S.의 논문, "생물학적 응용을 위한 대규모 단백질 나노패터닝", Nano Lett. 2006, 6(6), 1165-1171은 100nm 범위에서 콜로이드 리소그래피를 사용하는 나노패치들의 어레이의 구현을 개시한다. 그 논문의 저자들은 단백질에 결합된 단일클론(monoclonal) 항체들에 대한 나노패턴들의 영향을 정량화할 수 있었고, 단백질 상의 결합 부위들이 균질한(homogeneous) 표면들 상에서 보다 나노패턴들 상에서 더 유용할 수 있다는 가능성을 열어주었다.
Valsesia, A.; Mannelli, I.; Colpo, P.; Bretagnol, F.; Rossi, F., "향상된 면역 검출 감도를 위한 단백질 나노패턴들", Anal. Chem. 2008, 80(19), 7336-7340은 템플릿 주기성과 스폿들의 직경이 상이한 PEO 매트릭스에서 COOH 스폿들의 바이너리 패턴 생성을 보고한다. 상이한 농도에서 표면을 Ab-IgG와 비교함으로써 저자들은 나노패턴들이 사용될 때 검출 한계가 더 낮은 농도로 효과적으로 이동되었음을 입증하였다. 그러나, 모든 실험들에서 변수들이 동시에 변하였기 때문에 격자상수 및 스폿 직경의 변화에 따른 영향이 결정될(determined) 수 없었다. 이들의 연구를 통해, 그들은 항-IgG(anti-IgG)로 확인함으로써 IgG의 활성(activity)이 증가되고, 나노패턴들의 존재로 인해 인식능력(recognition capability)이 향상됨을 입증하였다.
Kim, P.; Kim, D. H.; Kim, B.; Choi, S. K.; Lee, S. H.; Khademhosseini, A.; Langer, R.; Suh, K. Y.,의 “단백질 흡착 및 세포 접착을 위한 폴리에틸렌 글리콜의 나노 구조들의 제작”(나노테크놀로지 2005, 16 (10), 2420-2426) 논문에서, 형광 분석(fluorescence analysis)은 균일한 PEG 표면과 비교할 때, 단백질 흡착 테스트에 대한 나노패턴화된(nanopatterned) PEG 표면의 영향을 매핑(map)하는 데 사용되었다. 그것은 또한 표면 에너지와 관련된 다른 효과들의 가능성을 배제하지 않고 증가된 표면적에 대한 형광의 증가를 언급하였다.
단백질 흡착 연구를 통해 더 적은 염증 반응들에 도달하도록 게르마늄 나노피라미드들 상에서의 세포 거동을 개선하는 것을 목표로 하면서, Riedel, M.; M
Figure pct00002
ller, B.; Wintermantel, E.는 “게르마늄 나노피라미드들 상에서의 단백질 흡착 및 단핵구 활성화”(바이오소재 2001, 22 (16), 2307-2316)에서, 나노피라미드들의 밀도가 단백질들 자체에 대해 이용 가능한 활성 부위들에 직접적으로 영향을 미치는 지점에 이르렀다. 그 결과들이 표면적 증가와 비교되었다. 2.5-3배의 증가는 표면적의 7% 증가를 훨씬 넘어선 것이다. 게다가, 밀도가 증가하는 동안, 소-감마-글로불린의 활성은 이용가능한 최대 밀도에서 완전히 불활성화될 때까지 감소하고 있었다. Riedel et al.의 연구는 배경과 패턴들 사이의 재료 대비를 이용하고 있었는데, 이는 일반적으로 다른 연구에서는 표시되지 않으며 단백질들에 노출될 때 게르마늄과 실리콘이 상이한 질량 흡수 또는 활동적인 흡착을 가질 수 있기 때문에 더 높은 흡착 커버리지(coverage)를 설명할 수 있다. 논문에 따르면 흡착은 배경 상에서 보다 피라미드들의 상단에서 더 많이 발생했을 수 있다.
Dolatshahi-Pirouz, A.; Rechendorff, K.; Hovgaard, M. B.; Foss, M.; Chevallier, J.; Besenbacher, F.에 의한 논문 “에서 연구된 나노 러프(nano-rough) 백금 표면들 상에서의 소 혈청 알부민 흡착” 은 평평한 표면과 비교하여 소 혈청 알부민 흡착에 대한 확률론적으로 나노 러프 백금 표면의 영향을 연구했다. 정규화된(normalized) 질량 흡수를 비교함으로써, 저자들은 표면적의 증가만을 나타낼 수 없는 증가를 알아챘다. 이러한 증가는 표면 상의 흡착물의 더 나은 입체적 배치에 기인하여 30-35% 정도의 질량 흡수 증가를 초래하였다.
위에 제시된 대부분의 작업들에서, 단백질 흡착이 일어날 때 작용하는 제3자 영향을 확인할 수 있었고(identify) 이는 표면적의 증가로만 추적할 수 없었다. 배경의 기여가 전체 용질 흡착 및 이용 가능한 표면에 여전히 분명히 기여하고 있기 때문에 특정 시나리오들은 파울링(fouling) 배경에 대한 파울링 나노패턴으로 간주될 수 있다. 한편, Valsesia et al. 및 Krishnamorthy et al.의 연구는 표면 상의 특정 영역들 상에서의 용질의 흡착을 제안했다(파울링 방지 배경 접근 방식의 파울링 패치들).
나노패턴이 용질의 흡착에 어떻게 영향을 미치는지에 대하여는 선행 기술에서 확실성이 없다. 일부 저자들은 표면적으로 인해 예상했던 것 이상으로 나노패턴들 상에서의 용질 흡착의 향상을 입증했지만, 흡착물의 종들보다 몇 자릿수 더 큰 흡착 가능했던 사이트들(sites)만이 보고된 상황은 없다.
이러한 맥락에서 하나의 중요한 도전은 분자 차원으로 미리 결정된 영역들 내에서 흡착 이벤트들을 국한시키는(confine) 것이다. 게다가, 이러한 영역들은 높은 신호 대 잡음비로 분석을 가능하게 하고/하거나 QCM, SPR(표면 플라즈몬 공명) 및 타원 측정법과 같이 큰 측정 풋프린트들을 갖는 기술들을 수용하기 위해 상대적으로 큰 표면들(예를 들어, 수 평방 밀리미터)에 걸쳐 충분히 높은 밀도로 이용 가능할 필요가 있다.
본 발명의 제1 양태는 유체(액체 또는 기체) 내의 분석물을 감지하기 위한 친화도 센서, 특히 친화도 바이오센서에 관한 것으로, 유체와 분석물의 흡착을 접촉시키기 위한 인터페이스를 포함한다. 인터페이스는 분석물과 부동태화된(passivated) 영역에 대해 친화도를 갖는 나노 스케일 영역들의 바이너리 패턴을 포함한다. 나노 스케일 영역들은 인터페이스 상에서의 분석물의 흡착이 나노 스케일 영역들에 컨파인 되는 방식으로 부동태화된 영역에 의해 서로 격리된다(isolated). 나노 스케일 영역들은 5내지 200 nm 범위에 포함되는 직경을 갖는다. 상기 나노 스케일 영역들은 상기 인터페이스 표면적의 적어도 15%에 해당하는 표면적을 함께 갖는다.
여기에 사용된 용어 "친화도 센서"는 화학 반응에서 분석물을 소비하지 않고 선택적인 성분에 대한 분석물(정성적으로 또는 바람직하게는 정량적으로 검출될 종)의 결합에 의존하는 센서를 지정한다. 본 개시내용의 맥락에서, 친화도 센서는 또한 바이오센서(친화도 바이오센서)이고, 여기서 선택적 구성요소는, 예를 들어 분석물이 결합하는 항체 또는 수용체와 같은 민감성 생물학적 요소를 포함한다. 분석물은 바람직하게는 생체분자, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산을 포함한다. 이러한 생체분자는 일부 다른 실체(또 다른 분자 또는 생체분자, 나노 입자 또는 그와 유사한 것 등)에 부착될 수 있다(attached).
본 발명의 제1 양태에 따른 친화도 센서를 사용하여, 발명자는 표면 상의 나노 스케일 영역들 상으로의 흡착물의 컨파인먼트가 수용체 밀도 및 흡착 동역학에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 입증할 수 있었다. 그들은 생체분자들, 또는 비슷한(comparable) 치수의 합성(synthetic) 나노 스케일 물체들에 대해 질적으로 유사한 효과를 추가로 언급하였다(note).
본 문서의 맥락에서, 용어 "직경"은 고려 중인 물체의 볼록한 선체에 접하는 2개의 반대방향의 평행하는 평면들 사이에 형성될 수 있는 가장 작은 거리를 의미한다. 직경의 측정은 직접 및/또는 간접 측정을 사용하여 SEM 및/또는 AFM에 의해 수행될 수 있다. 고려중인 물체들의 경계들이 깔끔하지 않아 SEM에 의한 직접적인 직경 측정이 어려운 경우(고전하 표면의 경우), AFM을 사용하거나 SEM에 의한 간접 측정을 사용하여 측정이 수행될 수 있다. AFM은 측면 분해능에 영향을 미치는 팁 컨볼루션(tip convolution) 효과들을 겪는 것으로 알려져 있다. 그럼에도 불구하고 이러한 영향들은 팁 사양들을 고려하여 어느 정도 수정될 수 있다. 피처 직경은 또한 SEM에 의해 간접적으로 측정될 수 있다. 이 기술에 따르면, 알려진 직경의 전도성(conducting)(예: 금속) 나노 입자들은 전도성 및 해상도(resolution)를 향상시키기 위해 고려 중인 물체에 흡착된다. 고려 중인 물체의 직경은 이중 나노 입자 직경을 가능한 최대 편차로 사용하여 결정될 수 있다.
센서 인터페이스가 평평하거나 3차원(3D) 표면일 수 있다는 점에 주목할 필요가 있다. 나노 스케일 영역에서도 마찬가지이다. 따라서 Anano/Ainterface(충진율) 비율을 계산하기 위해, 표면의 3D 모양을 고려해야 하고, Anano는 함께 취한 나노 스케일 영역들의 표면적이고 Ainterface는 인터페이스의 전체 표면적(나노 스케일 영역들 및 부동태화된 영역 포함)이다. 바람직하게는, 나노 스케일 영역들은 함께 인터페이스의 표면적의 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 25%, 가장 바람직하게는 적어도 30%에 달하는 표면적을 갖는다. 본 발명자들이 아는 한, 15%로 높은 충진율(fill factor)를 갖는 나노패턴화된 친화도 센서들은 문헌에 보고되지 않았다. 높은 충진율은 나노 스케일 영역들에서 흡착의 향상이, 흡착에 대해 이용가능한 표면적이 더 적은 것에도 불구하고, 패턴화되지 않은 센서들로 얻어질 수 있는 것들과 비슷하거나 훨씬 더 높은 전체의 흡착된 질량들을 초래할 수 있음을 암시한다.
나노 스케일 영역들은 부동태화된 영역으로부터 돌출된 나노돔들(nanodomes)(나노 스케일의 돔들 또는 기둥들)을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 나노 스케일 영역들은 부동태화된 영역 및/또는 부동태화된 영역과 같은 높이의 나노 스케일 영역들로부터 리세스된(recessed) 나노포어들(나노 스케일 포어들)을 포함할 수 있다. 실험들은 흡착 밀도의 향상이 60% 이상의 충진율을 구성하는 상대적으로 평평한 나노돔들에서 관찰될 수 있음을 보여주었다. 더 높은 충진율(예: 95%)은 나노 스케일 기둥들을 형성하기 위해 나노 스케일 영역들의 높이를 증가시켜 달성될 수 있다.
친화도 센서가 나노돔들을 갖는다면, 이들은 바람직하게는 실리카 코어(silica core)를 포함한다. 그럼에도 불구하고 실리카에 대한 대안들이 존재하며 배제되지 않는다. 가능한 대안들은 금속들(특히: 금) 및 폴리머들을 포함한다.
나노 스케일 영역들은 바람직하게는 분석물에 대해 선택적인 표면 기능화를 갖는다. 이러한 맥락에서 "선택적 기능화"는 용액 내 종들과 특정 수용체에 의해 매개되는 표면 사이의 상호작용(예: 비오틴/아비딘 상호작용 또는 항원/항체 상호작용)을 의미한다.
나노 스케일 영역들은 바람직하게는 40 내지 170 nm 범위에 포함된 평균 직경을 갖는다.
나노 스케일 영역들은 바람직하게는 육각형 격자("삼각형 격자"라고도 함)로 배치되며, 여기서 각 격자점은 약 60°의 각도로 이격되고 고려 중인 격자점으로부터 거의 동일한 거리에 위치한 6개의 가장 가까운 이웃들을 갖는다. 육각형 격자는 실제로 불규칙한 것들(irregularities)이나 결함들(defects)을 가질 수 있다는 점에 유의해야한다. 격리된 결함들과는 별도로, 결함들은 격자 구조를 그레인들(grains)로 나눌 수 있으며, 그레인들 자체는 실질적으로 규칙적인 구성을 갖는다. 바람직하게는, 격자는 격자 피치(pitch)의 적어도 5배, 바람직하게는 적어도 6, 7, 8, 9 또는 10배에 달하는 평균 그레인(grain) 직경을 갖는다.
바람직하게는, 나노 스케일 영역들이 육각형 격자를 형성할 때, 가장 가까운 이웃 나노 스케일 영역들 사이의 중심부터 중심까지의 평균 거리는 나노 스케일 영역들의 평균 직경의 1.3 내지 5배(더 바람직하게는 1.4 내지 4.7배)에 달한다. 바람직하게는, 중심부터 중심까지의 거리들은 평균 중심 간 거리의 20% 미만(더 바람직하게는 15% 미만)의 표준 편차를 보인다(exhibit).
부동태화된 영역은 방오층(anti-fouling layer)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 부동태화된 영역은 단백질 내성 폴리에틸렌 글리콜 모이어티들(moieties)의 층을 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 서술된 바와 같은 친화도 센서로서 구현된 수정 결정 미세저울 칩(quartz crystal microbalance chip)에 관한 것으로, 여기서 인터페이스는 질량을 차지하기 위한 QCM 표면에 부합한다. QCM 칩은 압전 효과(piezoelectric effect)를 통해 전단 변형들(shear deformations)을 유도하기 위해 전극들에 의해 접촉된 기판을 포함한다. 바람직하게는, QCM 칩은 소산(dissipation) 모니터링이 있는 QCM(QCM-D)에서 구현된다.
바람직한 실시예에 따르면, QCM 칩은 친화도 바이오센서로서 구현되며,
o 나노 스케일 영역들은 부동태화된 영역으로부터 돌출된 나노돔들을 포함한다;
o 나노 스케일 영역들은 분석물에 대해 선택적인 표면 기능화를 갖고, 반면에 부동태화된 영역은 방오층, 예를 들어, 단백질 내성 폴레이텔린 모이어티들의 층을 갖는다;
o 나노 스케일 영역들은 40내지 170nm 범위에 포함된 평균 직경을 갖는다;
o 나노 스케일 영역들은 육각형 격자에 배치되고;
o 가장 가까운 이웃 나노 스케일 영역들 사이의 중심부터 중심까지의 평균 거리가 나노 스케일 영역들의 평균 직경의 1.5 내지 5배에 달한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 분석되는 유체에서 분석물을 감지하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은,
o 서술된 바와 같이 친화도 바이오센서로써 구현되는 QCM 칩을 제공하는 단계
o 인터페이스를 분석되는 유체와 접촉시키는 단계, 그렇게 함으로써 인터페이스 상의 분석물의 흡착 - 상기 흡착은 나노 스케일 영역들로 컨파인된다 - 을 허용하는 단계; 그리고
o 흡착된 분석물의 양(예를 들어, 질량, 몰)을 결정하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 인터페이스가 분석되는 유체와 접촉된 후에 인터페이스는 린싱되고(rinsed), 흡착된 분석물의 양이 린싱 후에 결정된다. 흡착된 분석물의 양 결정은 린싱 전 및/또는 린싱 중에도 수행될 수 있음을 주목해야 한다. 바람직하게는, 흡착된 분석물의 양은 시간 경과에 따른 흡착물의 (겉보기) 양을 모니터하기 위해 흡착 과정 및 린싱 중에 연속적으로 또는 반복적으로 결정된다.
바람직하게는, 컨파인먼트 효과를 최대한 활용하기 위해, 분석물의 크기에 대한 나노 스케일 영역들의 평균 직경의 비율은 3 내지 50 범위, 바람직하게는 3 내지 30 범위, 보다 바람직하게는 3 내지 20의 범위, 더욱 더 바람직하게는 5 내지 15의 범위, 더욱 더 바람직하게는 5 내지 12의 범위에 놓여있다. 이 맥락에서 분석물의 크기는 크기의 가장 큰 치수(직경)에 해당하는 것으로 고려된다. 분석물이 더 큰 화합물의 일부인 경우, 예를 들어 더 큰 입자 또는 분자에 부착된 경우, 위의 비율을 계산하는 데 중요한 것은 화합물의 가장 큰 치수이다.
감지는 정적 상태들(본질적으로 유체의 흐름이 없음) 또는 동적 상태들(흐르는 유체)에서 수행될 수 있다. 감도는 정적 상태들에서 증가될 수 있다.
예로서, 본 발명의 바람직하고 비제한적인 실시예가 이제 첨부 도면을 참조하여 상세하게 설명될 것이다.
도 1은 Au 나노 입자들의 침착(deposition) 전 (a) 및 c)) 및 증착 후 (b), d)) 패턴화 되어 있지 않은 QCM 칩 표면들 및 패턴화 되어있는 QCM 칩 표면들의 AFM 이미지들과, 각각의 b) 및 d)에서와 같이 동일한 표면들에서의 SEM 현미경 사진 (e) 및 f)) 를 도시한다.
도 2는 도 1의 a), b) c) 및 d) 각각에 표시된 선들을 따른 높이 프로파일들을 나타낸 것이다.
도 3은 금 나노 입자들의 흡착 전후의 나노점들의 높이 분포를 나타낸 것이다.
도 4는 QCM에 의해 측정된, 패턴화된 센서 표면들 및 패턴화되지 않은 센서 표면들 상에서 0.85mM 농도의 현탁액으로부터 금 나노 입자의 흡착 밀도(a) 및 동역학(b)의 비교를 도시한다. 도 4(c)는 QCM으로 관찰된 나노 입자 밀도들이 SEM으로 얻어진 밀도들과 일치함을 도시한다.
도5는 현탁액 농도의 함수로서 흡착 밀도를 나타내는 그래프이다.
도 6은 x-축 상에 선형 스케일을 갖는 도 5의 그래프이다.
도 7은 SEM으로 얻어진, 금으로 코팅된 기판(왼쪽)상의 실리카 나노돔들의 패턴, AFM 라인스캔(linescan)으로 얻어진 나노돔의 높이 프로파일(오른쪽 아래) 및 패턴의 고해상도 세부 정보 (오른쪽 상단)를 도시한다.
도 8은 QCM-D에 의해 측정된 BSA 흡착 곡선들을 도시하고, (A)는 SiND 사이의 금 영역이 PEG로 부동태화된 나노패턴화된 센서 표면, (B)는 패턴화 되지 않은 제어 표면(Si로 제작) 및 (C)는 SiND 사이의 실리콘 영역의 부동태화 없이 Si 상의 SiND가 있는 나노 패턴화된 비교 표면에 대한 것이다.
도 9는 나노패턴화된 인터페이스(상단 곡선) 및 균질한 Si 인터페이스(하단 곡선) 상에서 Bcl-2 항체의 흡착된 질량들(QCM-D에 의해 측정)의 진화를 도시한다.
도 10은 포화 상태에서 농도의 함수로서 흡착에 이용할 수 있는 표면적에 의해 정규화된 유동 하에서 침착된 Au 나노 입자들의 질량 밀도를 도시한다.
도 11은 흡착에 이용할 수 있는 표면과 해당 표면 커버리지(재밍 한계의 백분율)에 의해 정규화된 도 10의 흡착된 Au 나노 입자들의 밀도를 도시한다.
도 12는 패턴화 되지 않은 다른 인터페이스들과 상이한 충진율들을 갖는 나노패턴화된 2개의 인터페이스들(이용 가능한 표면적에 의한 정규화 없음)에 대한 포화 상태에서 Au 나노 입자들의 흡착된 질량을 도시한다.
도 13은 이용 가능한 표면적에 의한 정규화 이후에 도 12의 흡착된 질량들을 도시한다.
도14는 나노패턴화된 QCM 센서 인터페이스의 부분 단면도인 개략적인 투시도이다.
도 15는 생체분자에 특이적인 캐리(carry) 포획 항체들을 운반하는 나노돔들의 바이너리 패턴을 포함하는 친화도 바이오센서의 개략도이다.
도 16은 나노돔들로 패턴화된 표면 상에 고트(goat) 항-마우스(mouse) IgG 항체들(PBS에서 24㎍/mL)의 흡착을 패턴화 되지 않은 금 표면과 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 17은 패턴화 되지 않은 참조 샘플과 비교하여, 도 15의 친화도 바이오센서 상의 표적 생체분자들의 흡착을 나타내는 그래프이다.
도 18은 도 15의 친화도 바이오센서의 포획 항체들에 결합된 표적 생체분자들의 예시이다.
도 14는 유체에서 분석물을 감지하기 위한 QCM 센서의 세부사항을 도시한다. QCM 센서는 유체와 분석물의 흡착을 접촉시키기 위한 인터페이스(12)를 갖는다. 인터페이스는 분석물이 흡착될 수 있는 나노 스케일 영역들(14)과 부동태화된 영역(16)으로 구성되어 있다. 나노 스케일 영역들(14)은 바다에서의 섬들과 같은 부동태화된 영역(16)에 의해 서로 격리된다. 부동태화 덕분에, 인터페이스 상에서의 분석 물의 흡착은 나노 스케일 영역들(14)로 컨파인 된다. 나노 스케일 영역들은 5 내지 200nm의 직경을 갖는다. 바람직하게는, 직경은 분석물 크기의 단지 몇 배(예: 최대 20배)에 이른다. 나노 스케일 영역들의 크기 및 밀도는 나노 스케일 영역들이 함께 전체 인터페이스(12)의 표면적의 적어도 10%에 이르는 표면적을 갖도록 선택된다.
실시예 1: QCM 센서 표면상에서의 금 나노 입자들의 흡착
QCM 칩 표면상에 자가 조립된 공중합체 콜로이드 템플릿들을 사용하여 나노 스케일 영역들에 선택적 흡착을 가능하게 하는 바이너리 나노 패턴들이 준비될 수 있다(prepared). 넓은 영역들에 걸쳐 있는 나노 스케일 피처들(features)의 고밀도 패턴들을 생성(creating)하는 것을 허용할 수 있는 이 접근 방식에 대한 세부 정보들이 발견될 수 있고, 예를 들어, Yap, F. L.; Thoniyot, P.; Krishnan, S.; Krishnamoorthy, S. Nanoparticle의 논문 “평평한 기판들 및 광섬유들 상에서의 직접적인 자가 조립을 통한 고성능 SERS를 위한 클러스터 어레이들(cluster arrays)”ACS Nano 2012, 6 (3) 및 Nurmawati, M. H.; Ajikumar, P. K.; Renu, R.; Valiyaveettil, S.의 논문 “기능성 고분자 지지체를 사용하여 2차원 어레이들로의 나노 물질들의 계층적 자기 조직화”, Adv. Funct. Mater. 2008, 18 (20), 3213-3218, 이 있다.
표면상의 유기 공중합체 템플릿들은 표면상에서 잘 정의된 나노 스케일 피처들에 상에서 국한되고 선택적인 흡착을 가능하게 하는 패턴들로 변환될 수 있다. 크기(높이, 직경 및 피치)에서 낮은 표준 편차를 갖는 템플릿들을 선택함으로써, 피처들의 치수(나노 스케일 영역들) 및 피처 밀도(단위 면적당 피처들의 수)가 상대적으로 균일할 것이다. 실제 실험들에서, 상이한 기하학적 변수들(높이, 직경 및 피치)에 대한 5-15%까지의 표준 편차가 입증될 수 있었다. 이것은 나노 스케일 영역들의 표면적을 용이하게 계산할 수 있게 하고, 이것을 QCM 측정들과 상관시킬 수 있게 한다.
구체적으로, 역 미셀들의 코어 내에 존재하는 염기성 피리딜 그룹들 때문에, 표면 상의 폴리스티렌-블록-폴리비닐피리딘(PS-b-PVP) 역 미셀들(reverse micelles)의 어레이를 중성 pH의 물에 잠기게 하여(immersed) 양전하 어레이를 생성했다. 이 프로세스에 대한 세부사항들은 Meiners, J. C.; Quintel-Ritzi, A.; Mlynek, J.; Elbs, H.; Krausch, G.의 논문 "선택적 용매에서 블록 공중합체 미셀의 흡착", Macromolecules 1997, 30(17), 4945-4951.에서 찾을 수 있다. 양전하를 띤 피처들은 정전기 인력으로 인해 피처들 상으로 음전하를 띤 안정된 구연산염 금 나노 입자들을 선택적으로 끌어당길 수 있다.
이 접근법은 패턴화 되지 않은 양으로 대전된 제어 표면(control surface)과 비교하여 생성된 피처 밀도 및 동역학에 대한 금 나노 입자들(직경 10.9 ± 1.7 nm)의 흡착 제한의 영향을 연구하는 데 사용되었다. 흡착 밀도 및 동역학은 QCM-D를 사용하여 측정되었다. 금 코팅된 QCM 칩들은 Polymer Source Inc.(몬트리올, 캐나다, m-자일렌에서 0.5 mg/ml)로부터 얻어진 PS-b-P2VP (폴리(스티렌-블록-2-비닐피리딘), 248 KDa-b-195 KDa의 역미셀 필름들로 코팅된다(coated). 어레이들의 주기성은 스핀 코팅 속도에 의해 차례로 변경될 수 있는 증발 속도에 의해 제어될 수 있다. 코팅된 표면은 Plasmatherm 790(St. Petersburg, FL, USA)에서 20W 및 15sccm의 가스 압력을 사용하여 산소 플라즈마 대기에서 20-30초 동안 반응성 이온 에칭(RIE)에 노출되었다. 이와 같이 준비된 인터페이스 상에서의 금 나노 입자들의 흡착이 측정되었다.
도1은 패턴화 되지 않은 QCM 칩 표면들의 AFM 이미지들을 (a), b))에서 도시하고 패턴화 되어 있는 QCM 칩 표면들의 AFM 이미지들을 (c), d))에서 도시하고, 금 나노 입자들의 침착 전을 (a), c))에서 침착 후를 (b), d))에서 도시한다. 도1의 e), f)는 b), d)처럼 같은 표면들의 SEM 현미경 사진들을 도시한다. SEM과 AFM을 사용하여 나노 패턴화된 표면 상으로 나노 입자들의 흡착의 끝단(end point)이 측정되었고, 실제로 역미셀 피처들 상으로 선택적으로 흡착이 일어나는 것이 확인되었다.
도 2는 도 1의 a), b) c) 및 d) 각각에 표시된 선들을 따른 높이 프로파일들 도시한다. 도 3은 금 나노 입자들의 흡착 전후의 도트들의 높이 분포를 나타낸다. 도트들의 평균 높이는 나노 입자들의 평균 직경만큼 증가함을 알 수 있다.
도 4는 QCM에 의해 측정된, 패턴화된 센서 표면들 및 패턴화되지 않은 센서 표면들 상에서 0.85mM 농도(리터당 0.85밀리몰의 금 나노 입자들)의 현탁액으로부터 금 나노 입자들의 흡착 밀도(a) 및 동역학(b)의 비교를 나타낸다. QCM 센서 주파수의 감소는 Sauerbrey의 방정식을 사용하여 질량으로 변환되었다. 도 4(a)의 곡선들은 각각의 활성 표면적에 대해 정규화 되었다. 도 4(b)의 곡선들은 흡착된 질량을 나노 입자당 (추정된) 질량으로 나누어 나노 입자들의 수(NP)에 도달하고 각각의 포화된 구성으로 정규화함으로써 얻어졌다.
도 4(c)는 QCM에 의해 관찰된 나노 입자들의 밀도가 SEM에 의해 얻어진 것들과 합리적으로 일치함을 도시한다. 결과들은 패턴화되지 않은 제어 표면들(균일한 자기조립 4-아미노티오페놀(4-ATP) 단층 또는 균일한 자가조립 4-비닐피리딘(4-VP) 단층으로 덮인 금 표면) 상에서 얻어진 결과들과 추가로 비교되었다.
패턴화된 표면에 대해 얻어진 흡착 곡선은 흡착에 이용가능한 활성 표면적(즉, 나노돔들의 표면적)으로 정규화 되었다. 정규화 인자는 AFM 및 SEM 측정들로부터 얻어진 것처럼 각 나노돔의 표면적 및 나노돔들의 밀도(단위 면적당 나노돔들의 수)로부터 얻어졌다. 나노돔 당 표면적은 나노돔을 반구로 모델링하여 AFM으로부터 측정된 높이 및 SEM으로부터 직경을 사용하여 얻어졌다.
나노 패턴은 33나노돔들/μm2로 나노돔당 9800 nm2의 표면적을 나타냈다. 따라서 나노돔들의 표면적은 전체 표면적의 ~33%를 구성하였다.
표 1은 패턴화된 인터페이스 및 패턴화되지 않은(균일한) 제어 표면 상의 Au 나노 입자들의 흡착에 대해 얻어진 결과들을 요약한다. QCM(흡착 곡선들)에서 파생된 값들은 "(QCM)"으로 표시되고 SEM에 의해 교차 확인되었다. SEM에 기초한 해당 값들은 표 1에서 "(SEM)"으로 표시된다.
표면 나노 패턴화 균일(uniform)
나노돔 당 표면적 9780 nm2　±　10% /
흡착에 이용 가능한 표면적 33% 100%
나노돔들의 밀도 33.75/μm2 /
흡착된 나노 입자들의 수 (나노돔 당) 23 (SEM)
25 (QCM)		 /
나노 입자들의 이론상 최대(RSA) 수 48 (나노돔 당) 4921 (per μm2)
(포화 시) 흡착에 이용가능한 표면적 당 나노 입자들의 수 2518/μm2 (QCM)
2350/μm2 (SEM)		 958/μm2 (QCM)
1250/μm2 (SEM)
이론상 최대값(RSA)에 대한 나노 입자 커버리지 51% (QCM)
48% (SEM)		 19% (QCM)
25% (SEM)
흡착에 이용 가능한 단위 표면적당 나노 입자 커버리지 28% (QCM)
6% (SEM)		 11% (QCM)
14% (SEM)
나노 패터닝(nanopatterning)으로 인해, 포화 시 나노 입자들의 밀도는 188%까지 증가할 수 있었다(SEM 현미경 사진 카운트에 기초하여: 188%=2350/1250). 또한, 95%(포화값에 대해)의 커버리지는 패턴화된 표면 상에서 85분 만에 에 이루어진 반면, 패턴화 되지 않은 대응물 상에서는 130분이 소요되어 흡착 동역학의 분명한 증가를 확인하였다.
게다가, 나노 패턴화된 센서 인터페이스들은 패턴화 되지 않은 센서 인터페이스들보다 몇 배 낮은 농도에서 민감한 것으로 관찰되었다(도 5 및 6 참조). 선형 상태(regime)에서 표면 밀도 대 분석물 농도의 변화는 나노 패턴화된 인터페이스에 대해 11.2ng/(μM·cm2)의 기울기를 갖는 반면, 패턴화 되지 않은 표면에 대해 기울기는 2.8ng/(μM·cm2))에 불과했다. 이는 나노 패턴들로 인한 감도에 있어서 6배 증가를 나타낸다. 나노 패턴들은 그들의 더 낮은 표면 커버리지(예에서는 ~33%)에도 불구하고 균일한 표면의 나노입자 밀도와 같거나 더 높은 나노입자 밀도에 도달한다.
센서 인터페이스에 대한 나노입자 흡착이 무작위 순차 흡착(RSA) 프로세스들에 의해 모델링될 수 있다고 가정하는 경우, 최대 표면 커버리지(이론적 한계, "재밍 한계")는 54.7%이다. 포화 시 나노입자 커버리지는 나노돔들 상에서 28%(재밍 한계의 51%에 해당)에 근접한 반면, 패턴화 되지 않은 인터페이스의 경우 나노 입자 커버리지는 11%(재밍 한계의 19%에 해당)에 불과했다.
실시예 1a: 유동 하에서 QCM 센서 표면 상에서의 금 나노입자들의 흡착
실시예 1의 실험들은 정적 조건들에서 이루어졌다. 유동 조건들 하에서 실험들이 반복되었다. 실시예 1에 서술된 바와 같이 QCM 칩들 상에서 바이너리 패턴들이 준비되었다. 금 나노입자들에 대한 친화도를 갖는 나노 스케일 영역들은 전체 인터페이스 표면적의 33%에 달하는 표면적을 가졌다. 금 나노입자들은 85nM 내지 0.85mM 농도의 현탁액으로부터 침착되었다. 현탁액의 흐름은 10μL/분(분당 마이크로리터)으로 설정되었고, 센서 표면 위의 챔버는 40μl의 부피를 가지며 온도는 실온에서 일정하게 유지되었다. 금 나노입자들의 침착은 QCM-D에 의해 모니터링 된다. 도 10은 농도의 함수로서 포화 상태에서 흡착에 이용가능한 표면적에 의해 정규화된, 침착된 질량 밀도를 나타낸다. 패턴화되지 않은 표면 상에서보다 훨씬 더 높은 흡착 밀도가 유동 하에서도 얻어질 수 있음을 알 수 있다. 이 결과는 미세 유체 장치들이 본 발명의 이점을 얻을 수 있음을 나타냅니다. 도 11은 도 10을 기초로 하며, 흡착에 이용가능한 표면 및 대응하는 표면 커버리지(재밍 한계의 백분율로서)에 의해 정규화된, 흡착된 나노입자들의 밀도를 도시한다.
실시예 1b: 나노패턴의 충진율의 영향
금 나노입자들의 흡착에 대한 QCM-D 측정들은 상이한 충진율들을 갖는 나노 패턴화된 센서 인터페이스들을 사용하여 이전의 실시예들에서와 같이 이루어졌다. 제1 바이너리 패턴은 실시예 1 및 1a에서 사용된 패턴에 대응하고 33%의 충진율을 가졌다. 두 번째 나노 패턴은 61%의 충진율을 가졌고, 금 나노 입자들에 대한 친화도를 갖는 나노 스케일 영역들은 제1바이너리 패턴의 그것들과 크기는 같지만 영역들의 밀도는 증가되었다. 충진율이 증가될 때 전체 흡착(전체 센서 인터페이스를 고려함)이 증가하는 것으로 관찰되었다. 친화도를 갖는 영역 내 흡착 밀도에 대한 충진율의 영향이 있는지 이해하기 위해, 흡착된 질량들은 흡착에 이용가능한 표면적에 의해 정규화 되었다. 중요한 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 각 피처 내의 흡착된 나노 입자들의 밀도가 테스트된(tested) 충진율들에 대해 동일하게 유지되었음을 나타낸다. 흡착 밀도에 대한 나노 패턴의 긍정적인 영향은 충진율이 61%로 증가될 때 유지한다. 이것은 나노 패턴들에 대한 우선적인 흡착의 효과를 절충 시키지 않으면서 "비활성" 영역들(흡착이 일어나지 않는 영역들)을 감소시키는 것을 허용할 수 있기 때문에 주목할 만한 결과이다.
도 12는 이용가능한 표면적에 의한 정규화 없이 상이한 패턴화 되지 않은 인터페이스들 및 2개의 나노 패턴화된 인터페이스들에 대한 포화 시 흡착된 질량을 도시한다. 33%의 충진율을 갖는 나노 패턴은 "D0.5"로 라벨링 되는 반면 61%의 충진율을 갖는 나노 패턴은 "D1.4"로 라벨링 된다(labelled). D0.5 나노 패턴의 풋프린트(기판에 대한 친화도를 갖는 영역들의 수직 투영)가 16%에 이른다는 점은 주목할 만하다. 61%의 충진율을 갖는 나노 패턴화된 인터페이스 상에서의 전체 흡착된 질량은 균일한 인터페이스들 상에서의 흡착된 질량을 훨씬 초과함을 알 수 있다. 도 13은 이용가능한 표면적에 의한 정규화 이후 포화 시 흡착된 질량들을 도시한다.
실시예2: 단백질 흡착(BSA)
실시예 1이 나노입자들의 정전기적 부착 상에서 나노 스케일 국한의 효과를 보여주지만, 그러한 효과가 상이한 유형들의 흡착 이벤트들로 얻어질 수 있음이 입증될 필요가 있었다. 이 실시예에서, 2개의 상이한 생체분자들, 소 혈청 알부민(BSA) 및 면역글로불린(IgG)의 물리 흡착에 대한 나노 스케일 국한의 영향이 조사되었다.
첫 번째 단계에서, 생체분자 흡착을 센서 인터페이스의 미리 정의된 영역들로 국한시킬 수 있는 나노 패턴들이 제조되었다.
실리카 및 금의 사용으로 바이너리 패턴이 얻어진 반면, 이러한 일련의 경험들에 대한 패턴화 되지 않은 컨트롤은 베어 실리카 표면이었다.
PS-b-PVP 자가 조립을 이용하여 QCM 칩의 금 표면 상에 복귀된(reverted) 미셀들의 육각형 격자 패킹을 생성함으로써 단단한 물질 대조 패턴이 생성되었다: 금 표면 상에서의 실리카 나노 영역들. PS-b-PVP 코팅된 금 표면을 TEOS(tetraethyl orthosilicate) 대기에 6시간 동안 노출시켜 규산염이 복귀된 미셀들로 확산되도록 허용하여 복귀된 미셀들의 패턴의 이미지인 실리카 나노 영역들의 육각형 상추(lettuce)를 얻는다. 이 메커니즘은 Cha, J. N.; Zhang, Y.; Philip Wong, H. S.; Raoux, S.; Rettner, C.; Krupp, L.; Deline, V.의 "고밀도 나노 패턴화된 어레이들의 제작을 위한 생체모방 접근법들" Chem. Mater. 2007, 19(4), 839-843,에서 더 자세히 설명되어 있다. TEOS의 가수분해는 미셀들의 친핵성 코어들(즉, 비닐피리딘 도메인들에서)에서 발생하며, 본질적으로 외부 폴리스티렌 쉘들을 변형하지 않고, 따라서 후자가 산소 플라즈마에 의해 제거되도록 허용한다. 생성된 실리카 나노돔들(이제부터 SiND)의 토포그래피(topography) 및 상면도가 도 7에 도시된다. SiND의 높이는 35 ± 5 nm에 달하고 직경은 40 nm ± 4.3 nm에 이르는 것으로 밝혀졌다.
BSA 및 IgG의 물리적 흡착을 방지하기 위해, SiND 사이의 금 영역은 티올(thiol) 그룹들에 의해 금 표면에 결합된 단백질 내성 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티들로 선택적으로 기능화된다. 단백질-저항성 PEG 코팅의 효율을 테스트 되었고 80%에 달하는 것으로 밝혀졌다. 효율성은 다음과 같이 측정된다:
Figure pct00003
여기서 mBSA on PEG는 단백질 내성 분자들(PEG)로 기능화된 표면 상에 흡착된 BSA 질량이다. mBSA on Au는 일반 금 표면(표준) 상에 흡착된 BSA 질량이다. 부동태화의 효율은 바람직하게는 위에서 측정된 바와 같이 적어도 80%이다. 금 영역을 부동태화함으로써, 생체 분자들의 흡착이 SiND 상에서 (거의 독점적으로) 발생하도록 강제되며, 이 예에서는 인터페이스의 ~17%를 나타낸다(그것의 3D 모양을 고려함).
도 8은 다음에 대한 QCM-D에 의해 측정된 BSA 흡착 곡선들을 도시한다:
A. SiND 사이의 금 영역이 PEG로 부동태화된 나노 패턴화된 센서 표면;
B. 패턴화 되지 않은 제어 표면(Si로 만들어짐); 및
C. SiND 사이의 실리콘 영역의 부동태화 없이 Si 상의 SiND를 갖는 나노 패턴화된 비교 표면.
도 8에서 흡착된 질량들은 각각 흡착에 이용 가능한 표면적을 고려하여 정규화 되었다.
BSA를 사용한 흡착 시험은 다음과 같이 수행하였다: BSA는 PBS(인산염 식염수) 1mg/ml에 용해되고, 1시간 동안 10μL/min의 유속으로 흘렸다(도 8의 단계 I 및 II). 두 번째 단계에서, PBS는 과량의 BSA를 제거하기 위해 60분동안 흘려진다. 패턴화 되지 않은 제어(도 8, 곡선 B)상에서의 BSA 흡착은 400ng/cm2의 흡착 밀도를 제공하는 반면, 나노 패턴화된 센서 표면의 흡착 밀도는 국한 조건들에서 180ng/cm2에 달한다(도 8, 곡선 A). SiND가 센서 인터페이스의 ~17%를 나타낸다는 것을 고려하면, 패턴화되지 않은 제어 표면의 값들을 기반으로 하고 부동태화 층의 불완전성을 고려하면 180ng/cm2가 아닌 65ng/cm2의 흡착 밀도가 측정된다. 따라서, 바이너리 나노패턴은 흡착 밀도 측면에서 190%의 증가를 야기하였다. 도 8의 곡선 C는 부동태화 없이 실리콘 기판 상의 SiND 상의 BSA 흡착을 도시한다. SiND로 인한 평면 기판에 대한 표면적 증가를 고려하면, 패턴화되지 않은 제어 표면의 흡착 거동과 매우 유사한 흡착 거동을 발견할 수 있다. 이것은 분석물에 대한 친화도 및 부동태화된 영역을 갖는 나노 스케일 영역들과 함께 바이너리 패턴을 갖는 것의 중요성을 입증한다. 린싱 단계(도 8, 단계 III) 동안 흡착된 질량의 명백한 감소는 단계 I 및 II 동안 느슨하게 결합되거나 센서 표면에 짧은 거리에 있는 BSA의 존재에 의해 설명될 수 있다. 이 "겉보기" 질량은 흐름이 완충 용액으로 전환될 때 사라진다(단계 III).
예상되는 질량은 패턴이 고려될 때 나타나고, 다음과 같이 계산된다:
Figure pct00004
여기서 munpatt는 패턴화되지 않은 컨트롤에 흡착되는 질량이고 Sfeature 는 패턴화된 컨트롤 상에 흡착할 수 있는 표면이다. 밀도 측면에서 향상 백분율은 다음과 같이 계산된다:
Figure pct00005
향상 백분율은 위와 같이 표현되며, 여기서 mpatt는 실험적으로 얻어진 질량, munspec 은 부동태화된 영역들 상에 선택적으로 축적되지 않은 질량, Sbck는 부동태화된 표면적이고, mexp는 위에서 정의된 바와 같이, 예상되는 질량이다.
실시예 3: Bcl-2 포획 항체의 물리 흡착
나노 패턴화된 QCM 센서 인터페이스가 실시예 2에서와 같이 준비되었다(금으로 코팅된 기판 상의 실리카 나노돔들, 노출된 금 표면은 방오층으로 부동태화됨). 비교를 위해, 노출된 실리카 표면을 갖는 QCM 칩이 동일한 실험을 거쳤다.
인간의 총 Bcl-2 포획 항체가 PBS에서 재구성된 다음, 사용을 위해 27㎍/ml로 희석되었다. Bcl-2 포획 항체가 30분 동안 10μL/min의 유속으로 테스트 표면들로 가져와진 다음, 유동은 20분 동안 완충제로 전환하였다. 도 9는 나노 패턴화된 인터페이스(상단 곡선) 및 균질한 Si 인터페이스(하단 곡선) 상에서 흡착된 질량들(QCM-D에 의해 측정됨)의 진화를 도시한다. 항체는 단계 II 동안 주입되었다. 단계 III 동안, 시스템을 완충 용액으로 린싱 되었다.
이 실시예에서, 성능 지수는 실시예 2에서 위에 보고된 것과 동일하였다. munpatt는 450ng/cm2와 동일하였다. mpatt는 185ng/cm2였다. 단백질 저항성 층에서 유사한 효율(85% 효율)을 고려한다면, 예상되는 질량은 125ng/cm2와 같다. 그러면 향상 백분율은 180%에 있다. 단백질 저항성 층의 효율은 munspec으로 다음과 같이 계산된다:
Figure pct00006
여기서 munpatt는 패턴화 되지 않은 컨트롤에 흡착된 질량이고 manti-fouling은 방오 모이어티들로 특별히 기능화되고 Bcl-2에 대해 테스트된 컨트롤에 흡착된 질량이다.
실시예4
도 15는 나노돔들(22)의 바이너리 패턴을 포함하는 친화도 바이오센서(20)를 개략적으로 도시한다. 나노돔들(22) 사이의 영역(24)은 메톡시폴리에틸렌(methoxypolyethylene) 글리콜 티올(SH-PEG-CH3) 층과 같은 부동태화 층(26)으로 덮인다. 나노돔들(22)은 생체분자(예: 마우스 IgG)에 대한 친화도를 갖는 포획 항체들(28)(예: 고트 항-마우스 IgG)를 운반한다.
나노돔들은 PS-b-PVP 자가 조립에 의해 기판(30)(금으로 코팅된 QCM 센서) 상에서 제작되어, 복귀된 미셀의 육각 격자 패킹이 생성되었다. 그 다음, 표면은 산소 플라즈마 대기에서 20-30초 동안 반응성 이온 에칭(RIE)에 노출되었다. 그 다음, 얻어진 표면은 증기(vapour) 침착 프로세스를 사용하여 금의 얇은 층(32)으로 코팅되었다. 이어서, 금 층(32)은 부동태화 층으로 코팅되었다.
나노돔들(22) 상의 부동태화 층의 제거는 먼저 전체 표면을 PMMA로 코팅하고, 이어서 산소 플라즈마 대기에서 RIE의 또 다른 단계에 의해 수행되었다(effected). PMMA 층의 두께가 나노돔들 사이에서 가장 높기 때문에, 그 영역에서 부동태화 층은 그것의 완전한 에칭까지 PMMA에 의해 보호된 채로 남아 있다. 그 결과, 금 코팅은 나노돔들 상에 노출되지만 나노돔들(22) 사이의 부동태화 층(26)으로 덮인 채로 남아 있다.
실시예에서, 총 인터페이스 표면의 ~21%의 흡착에 이용가능한 표면으로 33 피처들/㎛의 피처 밀도가 달성되었다.
도 16은 패턴화 되지 않은 금 표면과 비교하여, 나노돔들로 패턴화된 표면 상에 고트 항-마우스 IgG 항체들(PBS에서 24㎍/mL)의 흡착을 도시한다. 그 결과 나온 바이오센서(20)는 도 15에 개략적으로 도시된 것이다.
도 15의 친화도 바이오센서는 마우스 IgG(PBS에서 25㎍/mL)에 대해 테스트되었다. 대응하는 흡착 플롯(plot)은 패턴화 되지 않은 참조 샘플과 비교하여 도 17에 도시된다. 도 18은 포획 항체들(28)에 결합된 표적 분자들(34)을 보여준다.
실시예들에 사용된 재료들
금으로 코팅된 수정 결정(5MHz의 공칭 주파수, AT-컷)은 쿼츠프로(Quartzpro)(J
Figure pct00007
rf
Figure pct00008
lla, Sweden)로부터 얻어졌고, 아세톤 및 에탄올로 철저히 세척한 후 Jelight Company Inc. (Irvine CA, USA)로부터 얻어진 UV-오존 클리너에서 30분 후에 사용되었다.
폴리(스티렌-블록-2-비닐 피리딘)(PS-b-P2VP)(248KDa-b-195KDa)은 Polymer Source Inc(Montreal, Canada)로부터 얻어졌다.
4-아미노티오페놀(4-ATP), 4-티올피리딘(4-TP), 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS), 및 테트라클로로금산(HAuCl4·3H2O)은 Sigma-Aldrich로부터 구입되었다.
분광 등급 m-크실렌(m-xylene), 에탄올 및 아세톤도 Sigma-Aldrich로부터 얻어졌다.
소 혈청 알부민(BSA)도 Sigma-Aldrich로부터 구입되었다.
인산염 완충 식염수(PBS), 인간 총 Bcl-2 항체들은 R&D 시스템(Minneapolis, MN, USA)에서 구입되었다.
상이한 길이 및 크기들의 폴리에틸렌 글리콜 티올(PEG-티올)은 BroadPharm(미국 캘리포니아주 샌디에고)으로부터 얻어졌다: -OH 작용기를 갖는 PEG3(Mw = 166.2) 및 -COOH 작용기를 갖는 PEG12(Mw = 634.8).
실시예들에서 사용된 방법들
패턴화 되지 않은 컨트롤은 일반적으로 >16시간 동안 4-ATP 용액(에탄올 중 5mM)에 금 코팅된 수정 결정을 침전시킨 다음, 세척하고 취입 건조함으로써 준비되었다.
미셀 주형은 Meiners, J.C.; Quintel-Ritzi, A.; Mlynek, J.; Elbs, H.; Krausch, G., "선택적 용매로부터 블록 공중합체 미셀들의 흡착", Macromolecules 1997, 30(17), 4945-4951로부터 보고된 프로세스에 의해 얻어졌다. 간략하게, PS-b-P2VP(m-자일렌에서 0.5 mg/ml)는 QCM 칩 상에서 코팅되었다. 어레이드의 주기성은 차례로 스핀 코팅 속도에 의해 변화하는 증발 속도에 의해 제어되었다. 그 다음, 표면은 Plasmatherm 790(St. Petersburg, FL, USA)을 사용하여 20W 및 15sccm의 가스 압력을 사용하여 산소 플라즈마 대기에서 20-30초 동안 반응성 이온 에칭(RIE)에 노출되었다.
구연산 나트륨을 환원제로 사용하여 직경 10nm의 금 나노입자들이 생산되었다.
금 기판 상의 실리카 입자들: PS-b-P2VP 패턴이 특정 표면상에 생성된 다음 60°C 오븐에서 TEOS 및 물(각각 1mL)이 있는 데시케이터(dessicator)에서 다양한 시간(1-24시간) 동안 방치된다(left). 일단 샘플들이 데시케이터로부터 제거되면, 샘플들은 쉘을 구성하는 중합체의 완전한 제거를 보장하고 원래의 템플릿의 주기와 일치하는 주기를 갖는 SiO2 입자 어레이를 얻기 위해 3분 동안 O2플라즈마에 노출된다.
단백질 물리 흡착을 위한 표면 준비: 금 기판 상의 실리카 입자들은 위에서 서술된 바와 같이 얻어졌다. 그 다음, 실리카 입자들에 의해 차지되지 않은 샘플의 표면이 PEG 분자들에 의해 취해져서 단백질 내성이 만들어질 때까지 표면은 폴리에틸렌 글리콜 티올 용액(물 중 5mM)에 4시간 동안 담구어졌다.
단백질 물리 흡착: 생체분자들을 유동에 도입하기 전에, 시스템을 좋은 기준선이 달성될 때까지 가변적인 시간 동안 안정화되도록 두었다. 소 혈청 알부민(BSA)은 PBS(1%)에 용해되었고 1시간 동안 표면 상에서 물리 흡착되도록 한 다음, 안정한 신호가 달성될 때까지(최대 60분의 완충액 유동) 표면은 완충제로 린싱 되었다. 전형적인 유속은 10μL/min이었다. 인간의 총 Bcl-2 포획 항체는 PBS에서 재구성된 다음 사용을 위해 27μg/mL로 희석되었다. Bcl-2 포획 항체는 10μL/분으로 30분 동안 실행된 다음, 유동은 20분 동안 완충액으로 전환되었다.
패턴들의 특성화: 나노 패턴들은 탭핑 모드에서 Innova, Bruker 시스템(프랑스 파리) 및 Nanosensors(스위스 Neuchatel)로부터의 알루미늄으로 코팅된 실리콘 프로브들(10-130 N/m)을 사용하여 원자력 현미경에 의해 조사되었다. 전자 현미경 마이크로그래프 스캐닝은 일반적으로 2-5kV 가속 전압 및 25pA 빔 전류에서 Helios 650 FIB-SEM(Hillsboro, Orgeon, USA)을 사용하여 얻어졌다. QCM 측정들은 Biolin Scientific AB(스웨덴 고텐버그 소재)로부터 얻어진 소산 모듈이 있는 수정 결정 미세저울(QSense Explorer, QCM-D)을 사용하여 수행되었으며, 분석 물질과 기판 사이의 상호 작용에 대한 40 μL의 부피를 갖는 유동 모듈과 조합하여 사용되었다. 표면 커버리지에 대한 값들은 Sauerbrey의 방정식을 사용하여 추출되었다: Δm　=　-CΔf/n, 여기서 C는 센서 특성들(C = 17.7ng/(Hz/cm2))에 대한 상수이고, n은 홀수 배음 수(n = 9는 제공된 모든 데이터에 대해 취함)이고 Δf는 주파수 변화이다. 위에서 서술된 바와 같이 흡착된 질량 계산의 허용 가능성은 센서와 센서 위의 층이 강성인 경우에만 가능하다. 수치적 측면에서, 요건은 ΔD/(Δf/i)　<　0.4 * 10-6 Hz-1 이다. 이 요건은 여기에 제시된 실험들 전반에 걸쳐 충족되었다.
특정 실시예들 및 예들이 여기에서 상세하게 설명되었지만, 당업자는 이러한 상세한 설명들에 대한 다양한 수정들 및 대안들이 본 개시의 전체 교시들에 비추어 개발될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 개시된 특정 배치들은 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 모든 등가물들의 전체 폭이 주어지는 본 발명의 범위에 대해 제한적이지 않고 단지 예시적인 것만을 의미한다.

Claims (16)

  1. 유체에서 분석물을 감지하기 위한 친화도 바이오센서에 있어서,
    상기 바이오센서는 유체를 접촉하고 분석물의 흡착을 위한 인터페이스를 포함하고,
    상기 인터페이스는 상기 분석물에 대한 친화도를 갖는 나노 스케일 영역들의 바이너리 패턴을 포함하는 것을 특징으로 하고,
    상기 나노 스케일 영역들은 상기 인터페이스 상의 상기 분석물의 흡착이 상기 나노 스케일 영역들에 국한되는 방식으로 부동태화된 영역에 의해 서로 격리되고,
    상기 나노 스케일 영역들은 5내지 200 nm 범위에 포함되는 직경을 갖고,
    상기 나노 스케일 영역들은 상기 인터페이스의 표면적의 적어도 15%에 해당하는 표면적을 함께 갖는,
    유체에서 분석물을 감지하기 위한 친화도 바이오센서.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노 스케일 영역들은 상기 부동태화된 영역으로부터 돌출된 나노돔들을 포함하는,
    친화도 바이오센서.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 나노돔들은 실리카 코어를 포함하는,
    친화도 바이오센서.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노 스케일 영역들은 상기 분석물에 대해 선택적인 표면 기능화를 갖는,
    친화도 바이오센서.
  5. 제1항 내지 제4항에 있어서,
    상기 나노 스케일 영역들은 40 내지 170 nm 범위에 포함된 평균 직경을 갖는,
    친화도 바이오센서.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노 스케일 영역들은 육각 격자로 배치되는,
    친화도 바이오센서.
  7. 제6항에 있어서,
    가장 가까운 이웃 나노 스케일 영역들 사이의 중심부터 중심까지의 평균 거리가 나노 스케일 영역들의 평균 직경의 1.5배 내지 5배에 달하는,
    친화도 바이오센서.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분석물은 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산, 상기 나노 스케일 영역들에서 상기 분석물이 결합할 수 있는 항체들 또는 수용체들을 포함하는 친화도 바이오센서와 같은 생체분자를 포함하는,
    친화도 바이오센서.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 부동태화된 영역은 방오층을 포함하는,
    친화도 센서.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 부동태화된 영역은 단백질 내성 폴리에틸렌 모이어티들의 층을 포함하는,
    친화도 센서.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노 스케일 영역들이 함께 상기 인터페이스의 상기 표면적의 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 25%, 가장 바람직하게는 적어도 30%에 달하는 표면적을 갖는,
    친화도 센서.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 친화도 바이오센서로 구현되는 수정 결정 미소저울 칩에 있어서,
    압전 효과를 통해 전단 변형들을 유도하기 위해 전극들에 의해 접촉된 기판을 포함하는,
    수정 결정 미소저울 칩.
  13. 제12항에 있어서,
    제2항, 제4항, 제5항, 제6항, 제7항, 제8항 및 제9항에 따른 친화도 바이오센서를 조합하여 구현되는,
    수정 결정 미소저울 칩.
  14. 분석되는 유체에서 분석물을 감지하는 방법에 있어서,
    제12항 또는 제13항에 따른 수정 결정 미소저울 칩을 제공하는 단계,
    상기 인터페이스를 분석되는 상기 유체와 접촉시켜, 상기 인터페이스 상의 상기 분석물의 흡착 - 상기 흡착은 상기 나노 스케일 영역들로 국한됨 - 을 허용하는 단계,
    흡착된 분석물의 양(질량, 몰)을 결정하는 단계를 포함하는,
    분석되는 유체에서 분석물을 감지하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 인터페이스가 분석되는 상기 유체와 접촉된 후에 상기 인터페이스를 린싱하는 단계를 포함하고, 상기 흡착된 분석물의 양이 상기 린싱 후에 결정되는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 분석물의 사이즈에 대한 상기 나노 스케일 영역들의 평균 직경의 사이즈의 비율은 3 내지 20의 범위, 바람직하게는 3 내지 15의 범위, 더욱 더 바람직하게는 5 내지 12의 범위에 놓여 있는 방법.


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