KR20220046070A - 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법 및 이의 방법으로 제조된 복합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표면 증강 라만 산란 활성을 갖는 복합체 및 이의 방법으로 복합체에 관한 것으로, 상세하게는 하이드로겔 전구체, 금속 나노입자 전구체 및 광 개시제를 혼합한 혼합용액을 제조하는 단계; 및 상기 혼합용액에 광을 조사하여 하이드로겔 및 금속 나노입자를 동시에 형성하는 단계;를 포함하며, 표면 증강 라만 산란 활성을 갖는 복합체를 제조하는 것을 특징으로 하는, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법 및 이의 방법으로 제조된 복합체에 관한 것이다.
사망을 야기할 수 있는 병 중 하나인 폐혈증은 감염에 대한 면역 체계의 과잉 반응에 의해 야기된다. 슈도모나스(Pseudomonas) 감염은 폐혈증의 주요 원인 중 하나이다. 비록 즉각적인 처리가 매우 중요하지만, 미생물 배양(bacteriological culture)과 같이 진단을 위한 종래의 방법은 진단을 위해 적어도 하루가 소모되는 문제가 있다.
이와 같이, 공중 보건 분야에서, 독성 물질의 현장에서의 신속한 검출은 매우 중요하고, 독성물질의 급속한 확산 이전에 신속한 처치가 요구된다. 일반적으로 검출 절차에 있어서, 독성 분자는 복합 혼합물의 샘플로부터 크로마토그래피하여 분리되고, 이어서 질량 분석법으로 확인된다. 하지만 이러한 방법은 높은 정밀도에도 불구하고, 실험실 규모의 장비와 긴 시간이 요구되는 바, 현장 현시 분석(on-site, real time analysis)으로는 부적합하다.
한편, 분자 지문으로 사용되는 라만 스펙트럼이 분자 식별에 사용될 수 있다. 라만 산란은 빛이 입자와 충돌하여 산란하는 경우 에너지를 잃거나 얻는 비탄성산란 과정을 말하고, 화학물질에 따라 고유의 라만 스펙트럼을 방출한다. 하지만, 그 크기가 매우 작기 때문에 극소량의 분자 검출에 어려운 반면, 표면증강법을 사용하여 산란을 증가시킨 표면 증강 라만 산란(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)은 높은 민감도(sensitivity)를 가질 수 있어, 현장 현시 분석을 위한 유망한 기술 중 하나로 여겨져 왔다.
대부분의 생물학적 유체는 금속 표면에 비선택적으로 비가역적으로 흡착되는 다양한 단백질을 함유하고 있어, 작은 표적 분자의 접근을 방해한다.
하지만 이러한 표면 증강 라만 산란을 현장 현시 분석에 사용하기 위해 시료의 전처리 없이 복합 혼합물에 녹아있는 작은 분자(small molecules)를 직접적으로 검출하는 것은 여전히 어려운 과제이다.
이에, 금속 나노입자를 단백질 흡착으로부터 보호하고, 높은 강도의 라만 신호를 얻기 위한 기술 개발이 요구되고 있고, 궁극적으로 공중 보건 분야 등 다양한 분자 검출 분야에 적용될 수 있는 기술 개발이 요구되고 있다.
이와 관련하여 종래의 기술로, F Wang, R G Widejko, Z Yang, K T Nguyen, H Chen, L P Fernando, K A Christensen, J N Anker Anal Chem 2012, 84, 8013에서는, 단백질을 흡착시키지 않고 타켓 분자만을 선택적으로 금속 나노입자의 표면에 수용하도록 금속 나노입자의 표면에 보호층(protect layers)을 코팅한 미세 입자가 개시된 바 있으며, D. J. Kim, S. G. Park, D. H. Kim, S. H. Kim. Small 2018, 14, 1802520에서는 상기 보호층으로 하이드로겔을 사용한 바 있다. 하이드로겔은 단백질을 흡착시키지 않고 선택적 분자만을 투과할 수 있어, 상기 분자에 대한 라만 신호를 선택적으로 증폭시킬 수 있다.
하지만, 라만 신호를 보다 균일하고 보다 크게 증폭시키기 위해서는 하이드로겔 내에 균일한 크기를 갖는 금속 나노입자를 응집(aggregation)없이 고밀도로 고분산 시켜야 하지만 금속 나노입자를 고밀도로 포함하는 경우, 응집(agglomeration)이 일어나 라만 신호를 균일하면서도 크게 증폭시키기 어려운 문제가 발생될 수 있다.
이에 본 발명자는 3차원의 그물망 구조의 하이드로겔 내에 금속 나노입자가 고밀도로 균일하게 분산되어 있어, 단백질을 흡착시키지 않고 선택적 분자만을 투과할 수 있으며 라만 신호를 보다 증폭시킬 수 있는 복합체를 제조하는 간단하고 용이한 방법을 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
F Wang, R G Widejko, Z Yang, K T Nguyen, H Chen, L P Fernando, K A Christensen, J N Anker Anal Chem 2012, 84, 8013
D. J. Kim, S. G. Park, D. H. Kim, S. H. Kim. Small 2018, 14, 1802520
일 측면에서의 목적은 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법 및 이의 제조방법으로 제조된 표면 증강 라만 산란용 복합체를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
일 측면에서는
하이드로겔 전구체, 금속 나노입자 전구체 및 광 개시제를 혼합한 혼합용액을 제조하는 단계; 및
상기 혼합용액에 광을 조사하여 하이드로겔 및 금속 나노입자를 동시에 형성하는 단계;를 포함하며, 표면 증강 라만 산란 활성을 갖는 복합체를 제조하는 것을 특징으로 하는, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법이 제공된다.
이때, 상기 하이드로겔 전구체는 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(Polyethylene (glycol) Diacrylate), 폴리에틸렌글리콜 메틸에테르 아크릴레이트, 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide), 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)(Poly(N-isopropylacrylamide)) 및 하이드록시에틸 메타크릴레이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 광은 2분 내지 5분 동안 조사될 수 있다.
상기 광 개시제는 1-[4-(2-하이드록시에톡시)-페닐]-2-하이드록시-2-메틸-1-프로판-1-온, 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논, 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논 및 이의 혼합물로부터 선택되는 1종 이상을 포함될 수 있다.
상기 복합체는 3차원의 그물망 구조의 하이드로겔 및 상기 하이드로겔 그물망의 기공보다 큰 직경을 갖는 금속 나노입자를 포함할 수 있다.
상기 금속 나노입자는 평균 직경이 5nm 내지 30nm일 수 있다.
상기 혼합용액은 시트르산염을 더 포함할 수 있다.
상기 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법은 상기 광을 조사하는 단계 이후, 열처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 열처리는 40℃ 내지 70℃의 온도에서 수행될 수 있다.
상기 혼합용액에서 상기 금속 나노입자 전구체 및 상기 시트르산염의 몰 농도 비가 20:1 내지 10:3일 수 있다.
상기 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법은 상기 혼합용액을 제조하는 단계 이후, 상기 혼합용액을 소수성 유체에 주입하여 액적을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 소수성 유체는, 미네랄 오일, 실리콘 오일, 하이드로카본 오일 및 플로로카본 오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 액적을 제조하는 단계는 미세 유체 장치를 이용하여 수행할 수 있다.
또한, 다른 일 측면에서는
제조방법으로 제조되며, 3차원의 그물망 구조의 하이드로겔 및 상기 하이드로겔의 그물망 기공보다 큰 직경을 갖는 금속 나노입자를 포함하는, 표면 증강 라만 산란용 복합체가 제공된다.
이때 상기 복합체는 입자 또는 필름 형태일 수 있다.
일 측면에서 제공되는 복합체의 제조방법은 3차원의 그물망 구조의 하이드로겔 및 금속 나노입자를 동시 합성하여, 상기 하이드로겔 내에 응집 없이 고농도의 금속 나노입자를 균일하게 분산시킬 수 있다.
상기 복합체의 상기 하이드로겔은 단백질의 흡착을 방지하고 선택적 분자만 침투를 허용할 수 있어 분석물의 전처리과정 또는 정제과정 없이 표면 증강 라만 분석을 수행하여 소분자(samll moleculers)의 존재 여부를 검출할 수 있고, 상기 금속 나노입자는 5 내지 20nm의 균일한 크기를 가지며, 상기 하이드로겔 내에 고농도로 응집없이 형성되어, 표면 증강 라만 산란을 현저히 증가시킬 수 있다.
이에 상기 제조방법으로 제조된 복합체는 표면 증강 라만 산란을 이용하여 별도의 전처리 과정없이 분석물 내의 극미량의 소분자를 검출하는 데 사용될 수 있다.
도 1은 일 실시 예에 따른 복합체의 제조방법을 개략적으로 나타낸 모식도이고,
도 2는 실시 예에 따른 미세 유체 장치의 모식도 및 상기 미세 유체 장치의 A 부분을 광학현미경(OM)으로 관찰한 사진이고,
도 3은 실시 예에 따른 복합체의 제조방법을 이용하여 마이크로 플레이트를 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이고,
도 4는 도 3의 방법으로 제조된 마이크로 플레이트 사진(상) 및 상기 마이크로 플레이트를 이용하여 표면 증강 라만 산란 분석을 수행하는 방법(하)을 나타낸 모식도이고,
도 5 내지 도 8은 제조 예 1 내지 10에 의해 제조된 혼합용액에 대해, UV 조사에 따른 변화를 관찰한 결과를 나타낸 사진 또는 흡광 그래프이고,
도 9는 실시 예에 의해 제조된 UV 조사 전 액적, UV 조사 후 액적 및 열처리 후 생성된 복합체(After thermal treatmet)를 광학 현미경으로 관찰한 사진이고,
도 10은 실시 예에 의해 제조된 UV 조사 전 액적, UV 조사 후 액적 및 열처리 후 생성된 복합체(After thermal treatmet)를 UV-Vis 분광분석기를 이용하여 분석한 흡광 스펙트럼이고,
도 11은 실시 예 및 비교 예에 따라 제조된 복합체를 광학 현미경으로 관찰한 사진이고,
도 12는 실시 예 및 비교 예에 따라 제조된 복합체를 UV-Vis 분광분석기를 이용하여 분석한 흡광 스펙트럼이고,
도 13은 실시 예에 따라 제조된 복합체를 로다민6G(R6G)가 용해된 혼합용액 내에 분산시킨 후 라만 분광 분석기를 이용하여 분석한 결과이고,
도 14는 실시 예 및 비교 예에 따라 제조된 복합체를 투과전자현미경(TEM)으로 관찰한 사진이고,
도 15는 실시 예에 따라 제조된 복합체를 서로 다른 농도로 R6G를 함유된 혼합용액에 분산시킨 후 라만 분광 분석기를 이용하여 분석한 결과이고,
도 16은 실시 예에 따라 제조된 복합체를 파이오시아닌(pyocyanin)을 10μM 내지 100 nM농도로 용해시킨 용액에 분산시킨 후 라만 분광 분석기를 이용하여 분석한 결과이다.
도 2는 실시 예에 따른 미세 유체 장치의 모식도 및 상기 미세 유체 장치의 A 부분을 광학현미경(OM)으로 관찰한 사진이고,
도 3은 실시 예에 따른 복합체의 제조방법을 이용하여 마이크로 플레이트를 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이고,
도 4는 도 3의 방법으로 제조된 마이크로 플레이트 사진(상) 및 상기 마이크로 플레이트를 이용하여 표면 증강 라만 산란 분석을 수행하는 방법(하)을 나타낸 모식도이고,
도 5 내지 도 8은 제조 예 1 내지 10에 의해 제조된 혼합용액에 대해, UV 조사에 따른 변화를 관찰한 결과를 나타낸 사진 또는 흡광 그래프이고,
도 9는 실시 예에 의해 제조된 UV 조사 전 액적, UV 조사 후 액적 및 열처리 후 생성된 복합체(After thermal treatmet)를 광학 현미경으로 관찰한 사진이고,
도 10은 실시 예에 의해 제조된 UV 조사 전 액적, UV 조사 후 액적 및 열처리 후 생성된 복합체(After thermal treatmet)를 UV-Vis 분광분석기를 이용하여 분석한 흡광 스펙트럼이고,
도 11은 실시 예 및 비교 예에 따라 제조된 복합체를 광학 현미경으로 관찰한 사진이고,
도 12는 실시 예 및 비교 예에 따라 제조된 복합체를 UV-Vis 분광분석기를 이용하여 분석한 흡광 스펙트럼이고,
도 13은 실시 예에 따라 제조된 복합체를 로다민6G(R6G)가 용해된 혼합용액 내에 분산시킨 후 라만 분광 분석기를 이용하여 분석한 결과이고,
도 14는 실시 예 및 비교 예에 따라 제조된 복합체를 투과전자현미경(TEM)으로 관찰한 사진이고,
도 15는 실시 예에 따라 제조된 복합체를 서로 다른 농도로 R6G를 함유된 혼합용액에 분산시킨 후 라만 분광 분석기를 이용하여 분석한 결과이고,
도 16은 실시 예에 따라 제조된 복합체를 파이오시아닌(pyocyanin)을 10μM 내지 100 nM농도로 용해시킨 용액에 분산시킨 후 라만 분광 분석기를 이용하여 분석한 결과이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 예를 설명한다. 그러나 본 발명의 실시 예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하에서 설명하는 실시 예로 한정되는 것은 아니다. 또한, 이하의 실시 예는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 도면에서의 요소들의 형상 및 크기 등은 보다 명확한 설명을 위해 과장될 수 있으며, 도면상의 동일한 부호로 표시되는 요소는 동일한 요소이다. 또한, 유사한 기능 및 작용을 하는 부분에 대해서는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부호를 사용한다. 덧붙여, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
일 측면에서는,
하이드로겔 전구체, 금속 나노입자 전구체 및 광 개시제를 혼합한 혼합용액을 제조하는 단계; 및
상기 혼합용액에 광을 조사하여 하이드로겔 및 금속 나노입자를 동시에 형성하는 단계;를 포함하며, 표면 증강 라만 산란 활성을 갖는 복합체를 제조하는 것을 특징으로 하는, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법이 제공된다.
이하, 일 측면에서 제공되는 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법을 도면을 참조하여 각 단계별로 상세히 설명한다.
도 1은 일 측면에 따른 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 1에 참조하면, 상기 복합체는 3차원의 그물망 구조의 하이드로겔 및 상기 하이드로겔 내에 분산된 금속 나노입자를 포함한다.
먼저, 일 측면에서 제공되는 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법은 하이드로겔 전구체, 금속 나노입자 전구체 및 광 개시제를 혼합한 혼합용액을 제조하는 단계;를 수행할 수 있다.
상기 단계는 복합체를 제조하기 위한 전구체 용액을 혼합하는 단계일 수 있다.
상기 하이드로겔 전구체는 하이드로겔을 형성하기 위한 물질로서, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA), 폴리에틸렌글리콜 메틸에테르 아크릴레이트, 폴리아크릴아마이드, 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드) 및 하이드록시에틸 메타크릴레이트 등을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있고 구체적인 일례로, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)를 사용할 수 있으나 이에 제한된 것은 하이드로겔을 형성할 수 있는 다양한 친수성 고분자 단량체를 포함하는 물질이 사용될 수 있다.
또한, 상기 금속 나노입자 전구체는 금속 나노입자를 형성하기 위한 물질로서, 표면 증강 라만 산란 활성용 금속염을 포함하는 염화물일 수 있고, 바람직하게는 금(Au) 및 은(Ag) 중 적어도 하나를 포함하는 염화물일 수 있고, 금(Au)를 포함하는 염화물로서 구체적인 일례로, 일례로 HAuCl4, AuCl, AuCl2, AuCl3, Na2Au2Cl8, NaAuCl2 및 이의 수화물 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
또한, 상기 광 개시제는 1-[4-(2-하이드록시에톡시)-페닐]-2-하이드록시-2-메틸-1-프로판-1-온, 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논, 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논 및 이의 혼합물로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 구체적인 일례로 1-[4-(2-하이드록시에톡시)-페닐]-2-하이드록시-2-메틸-1-프로판-1-온이 사용될 수 있으나 이에 제한된 것은 아니다.
상기 광 개시제는 광 조사시 하이드로겔 및 금속 나노입자의 동시 합성 속도를 조절하기 위한 구성일 수 있다.
즉, 광 개시제를 포함하지 않는 경우 대비 광 개시제를 포함하는 경우 광중합 및 광 환원 속도를 증가시켜 하이드로겔 및 금속 나노입자를 보다 빠르게 동시 합성하도록 조절할 수 있다.
상기 광 개시제의 함량은 상기 혼합용액의 전체 중량 대비 0.1% w/w 내지 2.0% w/w일 수 있고, 0.3% w/w 내지 1.5% w/w일 수 있으며, 0.5% w/w 내지 1.2% w/w일 수 있다.
한편, 상기 혼합용액은 시트르산염을 더 포함할 수 있다.
상기 시스트르산염은 상기 금속 나노입자 전구체의 광 환원을 억제하고 열에 의한 환원을 진행시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 시트르산염은 시트르산을 포함하는 다양한 염화물이 사용될 수 있고, 구체적인 일례로 시트르산 나트륨(sodium citrate)이 사용될 수 있다.
상기 혼합용액은 상기 금속 나노입자 전구체 및 시트르산염을 20:1 ~ 10:3의 몰농도 비로 포함할 수 있다.
이는, 보다 고농도의 금속 나노입자를 제조하기 위한 것일 수 있다.
이때, 상기 시트르산염이 상기 범위보다 적게 포함될 경우, 낮은 농도에 의해 단시간에 임계 크기의 핵 생성을 이루지 못해 후속 열처리 단계에서 금속 나노입자가 생성되지 않고 기 생성된 금속 입자의 성장을 촉진하여 표면 증강 라만 산란의 신호가 증폭되는 정도가 보다 작을 수 있다.
또한, 일 측면에서 제공되는 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법은 상기 혼합용액을 제조하는 단계 이후, 상기 혼합용액을 소수성 유체에 주입하여 액적을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 단계는 수중유(water-in-oil) 에멀젼 액적을 단분산되도록 형성하여, 복합체를 균일한 크기를 갖는 입자 형태로 형성하기 위해 수행될 수 있다.
한편, 상기 액적이 형성되기 전에 상기 시트르산염에 의해 상기 금속 입자 전구체가 환원되어 금속 나노입자를 생성하는 것을 방지하기 위해 상기 혼합용액은 금속입자 전구체를 포함하는 제1 혼합용액 및 시트르산염을 포함하는 제2 혼합용액 각각으로 분리할 수 있고, 상기 제1 혼합용액 및 제2 혼합용액을 혼합 후 빠른 시간 내에 상기 소수성 유체에 주입하여 액적을 제조할 수 있다. 이때, 상기 제1 혼합용액 및 제2 혼합용액은 하이드로겔 전구체 및 광 개시제를 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 소수성 유체는 미네랄 오일, 실리콘 오일, 하이드로카본 오일 및 플로로카본 오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있고, 구체적인 일례로 미네랄 오일을 사용할 수 있으나 이에 제한된 것은 아니며 다른 소수성 유체가 사용될 수 있다.
또한, 상기 소수성 유체는 상기 소수성 유체의 흐름을 안정화시키기 위해 계면활성제를 더 포함할 수 있으며, 상기 계면활성제는 비이온성 계면 활성제, 음이온계 계면 활성제, 양이온계 계면 활성제 및 양성 계면 활성제 등의 계면 활성제를 사용할 수 있으나, 상기 소수성 유체의 흐름을 안정화시킬 수 있는 계면활성제면 이에 제한되지 않고 사용할 수 있다.
상기 계면활성제의 함량은 상기 소수성 유체의 함량 대비 0.1% w/w 내지 10% w/w일 수 있고, 3% w/w 내지 8% w/w일 수 있다.
한편, 상기 액적을 형성하는 단계는 미세 유체 장치를 이용하여 수행될 수 있다.
도 2는 실시 예에 따른 미세 유체 장치의 모식도 및 상기 유체 장치의 제1 주입관(100) 및 제2 주입관(200)의 교차점인 A 부분을 광학현미경(OM)으로 관찰한 사진을 나타낸다.
도 2를 참조하면 상기 미세 유체 장치는 하이드로겔 전구체 및 금속입자 전구체를 포함하는 제1 혼합용액이 주입되는 제1-1 주입구(11), 하이드로겔 전구체 및 시트르산염을 포함하는 제2 혼합용액이 주입되는 제1-2 주입구(12), 상기 제1-1 주입구(11) 및 제1-2 주입구(12)로부터 연장 형성되며 상기 제1 및 제2 혼합용액이 혼합되어 흐르는 Y자형 채널(13) 및 상기 Y형 채널(13)로부터 혼합된 제1 및 제2 혼합용액을 유출하는 제1 유출구(14)를 포함하는 제1 주입관(100);
상기 소수성 유체가 주입되는 제2 주입구(21), 상기 제1 주입관을 둘러싸는 외곽 채널(22) 및 상기 제1 유출구(14)와 연통되며 상기 소수성 유체가 유출되며 상기 제1 유출구(14)와 연통되는 제2 유출구(24)를 포함하는 제2 주입관(200);
상기 제1 유출구(14) 및 상기 제2 유출구(24)로부터 연장 형성되어 상기 액적이 흐르는 유출관(300);을 포함할 수 있다.
이때, 상기 제1 주입관(100), 제2 주입관(200) 및 유출관(300) 각각은 20 μm 내지 60μm의 너비 및 30μm 내지 70μm의 높이를 가질 수 있으나 이에 제한된 것은 아니다.
또한, 분산상인 상기 제1 혼합용액 및 제2 혼합용액은 상기 제1 주입관(100)을 통해 0.1ml/h 내지 0.5ml/h의 유속으로 흐를 수 있고, 연속상인 상기 소수성 유체는 상기 제2 주입관(200)을 통해 1ml/h 내지 3ml/h의 유속으로 흐를 수 있으나 이에 제한된 것은 아니다.
도 2에서와 같이, 상기 액적은 상기 제1 유출구(14) 및 상기 제2 유출구(24)의 교차점으로부터 상기 유출관(300)으로 생성되어 나올 수 있다.
상기 미세 유출 시스템을 이용하여 소수성 유체 내에 30μm 내지 60μm 의 직경을 갖는 단분산 액적을 형성할 수 있다.
다음, 일 측면에 따른 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법은 상기 혼합용액에 광을 조사하여 하이드로겔 및 금속 나노입자를 동시에 형성하는 단계를 수행할 수 있다.
상기 단계는 상기 혼합용액에 직접적으로 광을 조사할 수 있으며, 또는 상기 액적에 광을 조사하는 방법으로 수행될 수 있다.
상기 단계는 상기 광 조사에 통해 상기 하이드로겔 전구체로부터 3차원적인 그물망 구조의 하이드로겔을 형성하는 동시에 상기 금속 나노입자를 광 환원시키는 단계이다.
상기 단계는, 금속 나노입자를 하이드로겔과 동시 생성되도록 함으로써, 금속 나노입자가 응집(aggregation)되지 않고 상기 하이드로겔의 그물망 내에 균일하게 분산 형성되도록 할 수 있다.
상기 단계에서 생성되는 금속 나노입자의 평균 직경은 상기 하이드로겔의 그물망 구조의 기공 크기보다 크며, 이를 통해 상기 금속 나노입자는 상기 하이드로겔의 그물망 구조에 트랩되어 서로 응집되지 않을 수 있다. 이때 상기 하이드로겔의 그물망 구조에 형성된 기공 크기는 상기 혼합용액 내 하이드로겔 전구체의 농도를 달리하여 변경시킬 수 있다.
한편, 상기 혼합용액에 시트르산염이 포함될 경우, 상기 단계에서 시트르산염은 금속 나노입자 전구체의 광 환원을 일부 억제시키는 데 사용될 수 있다.
이때, 상기 광은 바람직하게는 자외선(UV)일 수 있다.
상기 광 조사는 2분 이상 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 2분 내지 10분 동안 수행될 수 있고, 보다 바람직하게는 2분 내지 5분 동안 수행될 수 있다.
만약, 상기 광 조사를 2분 미만으로 수행할 경우, 그물망 구조의 하이드로겔이 완전히 형성되지 않는 문제가 발생될 수 있다.
또한, 상기 혼합용액에 시트르산염이 포함될 경우, 상기 광 조사는 40℃ 미만의 온도에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 10℃ 내지 30℃의 온도에서 수행될 수 있다. 이는 상기 단계에서, 상기 시스트산염에 의해 상기 금속 나노입자 전구체가 열환원되는 것을 방지하기 위한 것으로, 만약, 상기 광 조사를 40℃ 이상에서 수행하는 경우 상기 단계에서 시트르산염에 의한 열 환원이 동시에 진행되어 불균일한 크기의 금속 나노입자가 형성될 수 있으며, 이로 인해 라만 산란 신호가 불균일한 세기로 발생될 수 있다.
다음, 일 측면에 따른 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법은 상기 혼합용액을 열처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 단계는 상기 광 조사 단계에서 반응하지 않고 남은 잔여 금속 나노입자 전구체를 추가적으로 환원시켜 상기 하이드로겔 내에 보다 많은 금속 나노입자를 형성하기 위한 단계이다.
상기 광 조사 단계에서 반응하지 않고 남은 잔여 금속 나노입자 전구체는 상기 시트르산염과 결합하여 복합물을 형성할 수 있고 상기 복합물은 열에 의해 환원되어 금속 나노입자를 추가적으로 더 생성할 수 있다.
일 측면에 따른 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법은 상기 광 조사에 의해 금속 나노입자 하이드로겔과 동시 생성하고, 상기 열처리에 의해 금속 나노입자를 2차적으로 더 생성함으로써, 하이드로겔 내에 보다 많은 금속 나노입자를 응집 없이 생성할 수 있다.
이때, 상기 복합물의 생성량은 상기 금속 나노입자 전구체 및 시트르산염의 함량에 의존할 수 있다.
즉, 상기 혼합용액 내에 상기 금속 나노입자 전구체 및 시트르산염을 20:1 내지 10:3의 몰농도 비로 포함할 경우, 상기 시트르산염 및 금속 나노입자 전구체의 반응에 의해 형성된 상기 복합물은 금속 입자의 핵 생성을 위한 짧은 확산 거리를 가질 수 있어, 단시간에 임계 크기의 핵을 생성함으로써 새로운 금속 나노입자를 생성시킬 수 있으며, 이를 통해 하이드로겔 내에 금속 나노입자를 고밀도로 형성시킬 수 있다.
반면 상기 혼합용액에 시트르산이 포함되지 않을 경우, 열처리 후 금속 나노입자가 추가 생성되지 않을 수 있고, 상기 시트르산염이 상기 범위보다 적은 농도로 포함될 경우, 상기 시트르산염에 의해 형성되는 복합물의 양이 작아, 상기 복합물에 의해 환원된 금은 새로이 핵 생성이 되지 않고 기 생성된 금 나노입자의 크기를 성장시키는데 사용되며 이로 인해 표면 증강 라만 산란 신호가 증폭되는 정도가 보다 작을 수 있다.
상기 열처리는 40℃ 이상의 온도에서 수행할 수 있고 보다 바람직하게는 40℃ 내지 70℃의 온도에서 수행할 수 있다. 또한, 상기 열처리는 36시간 내지 60시간 동안 수행될 수 있고, 보다 바람직하게는 45 내지 55시간 동안 수행될 수 있다.
일 측면에 따른 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법은 상기 열처리 단계를 통해 3차원 그물망 구조의 하이드로겔 내에 금속 나노입자를 고농도로 형성할 수 있으며 바람직하게는 평균 직경이 5nm 내지 20nm인 금속 나노입자를 10nm 이하의 나노갭을 갖도록 고밀도로 형성할 수 있다.
한편, 다른 일 측면에서는,
상기 제조방법으로 제조되며, 3차원의 그물망 구조의 하이드로겔 및 상기 하이드로겔의 그물망 기공보다 큰 직경을 갖는 금속 나노입자를 포함하는 표면 증강 라만 산란용 복합체가 제공된다.
상기 제조방법으로 제조된 복합체는, 하이드로겔에 의해 단백질의 흡착을 방지하고 선택적 소분자만 침투를 허용할 수 있어 분석물의 전처리과정 또는 정제과정 없이 표면 증강 라만 분석을 수행하여 소분자(samll moleculers)의 존재 여부를 검출할 수 있고, 상기 하이드로겔 내에 분산된 고농도의 금속 나노입자에 의해 표면 증강 라만 산란을 현저히 증가시킬 수 있어, 극소량의 소분자도 민감하게 검출할 수 있는 장점이 있다.
상기 복합체는 입자 형태일 수 있고, 또는 필름 형태일 수 있다.
도 3은 실시 예에 따른 복합체의 제조방법을 이용하여 마이크로 플레이트를 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이고, 도 4는 상기 제조방법으로 제조된 마이크로 플레이트 사진(상) 및 상기 마이크로 플레이트를 이용하여 표면 증강 라만 산란 분석을 수행하는 방법(하)을 나타낸 모식도이다.
도 3을 참조하면, 상기 마이크로 플레이트는 복수의 웰(well)을 포함할 수 있고, 상기 복수의 웰(well) 각각의 바닥면에는 상기 제조방법으로 복합체를 필름형태로 형성할 수 있다.
도 3을 참조하면, 상기 마이크로 플레이트는 하이드로겔 전구체, 금속 나노입자 전구체 및 시트르산염을 혼합한 혼합용액을 상기 복수의 웰 각각의 바닥면에 투입하여 필름층을 형성한 후 상기 필름층에 광을 조사하고, 이후 상기 필름층을 열처리하여 형성될 수 있다.
상기 마이크로 플레이트는 복수의 웰 각각의 바닥면에 3차원 구조의 그물망구조의 하이드로겔 및 상기 하이드로겔 내에 고밀도로 분산된 금속 나노입자를 포함하는 복합체가 형성되어 있을 수 있다.
이때 상기 복합체의 상기 하이드로겔은 단백질의 흡착을 방지하고 선택적 분자만 침투를 허용할 수 있어 분석물의 전처리과정 또는 정제과정 없이 표면 증강 라만 분석을 수행하여 소분자(samll moleculers)의 존재 여부를 검출할 수 있고, 상기 하이드로겔 내에 분산된 금속 나노입자는 5 내지 20nm의 균일한 크기를 가지며 상기 복수의 금속 나노입자 사이에 10 nm 이하의 나노갭이 고밀도로 형성되어 표면 증강 라만 산란을 현저히 증가시킬 수 있어, 극소량의 소분자도 민감하게 검출할 수 있는 장점이 있다.
또한, 상기 마이크로 플레이트는 복수의 웰 각각에 서로 다른 시료를 투입하여 표면 증강 라만 산란 분석을 수행할 수 있어, 다중 시료 분석용으로 사용할 수 있는 장점이 있다.
이하, 제조 예, 실시 예 및 실험 예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시 예 및 실험 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시 예 1> 복합체 제조
단계 1: PEGDA(70 % w/w, Mn 700 g mol-1, Sigma-Aldrich), HAuCl4(13.6% w/w), 광 개시제로서 1-[4-(2-하이드록시에톡시)-페닐]-2-하이드록시-2-메틸-1-프로판-1-온(1 % w/w) 및 탈 이온수를 포함하는 제1 혼합용액을 제조하고, PEGDA(70 % w/w, Mn 700 g mol-1, Sigma-Aldrich), 10mM의 시트르산 나트륨(Sigma-Aldrich), 상기 광 개시제 1 % w/w 및 탈 이온수를 포함하는 제2 혼합용액을 제조하였다.
단계 2: 도 2의 미세 유세 시스템을 이용하여 상기 제1 혼합용액 및 상기 제2 혼합용액 각각을 제1-1 주입구 및 제1-2 주입구를 통해 주입한 후 실린지 펌프를 이용하여 0.1 ml/h 및 0.2 ml/h의 유속으로 흘려주었으며, 계면 활성제로서 폴리글리세롤 폴리리시놀리에이트(PGPR, Ilshinwells)를 5% w/w 포함하는 미네랄 오일을 제2 주입구를 통해 주입한 후 2 ml/h의 유속으로 흘려주어, 상기 제1 유출구(14) 및 상기 제2 유출구(24)의 교차점에서 액적(시트르산 나트륨:HAuCl4=5mM:200mM)을 형성하여 상기 유출관(300)으로 유출되도록 하였다.
단계 3: 상기 액적은 UV 시스템을 이용하여 상온에서 UV를 약 2분 동안 조사하였다.
단계 4: 상기 UV 조사 후 상기 액적을 50℃로 약 48시간 동안 열처리하여 복합체를 제조하였다.
단계 5: 상기 미네랄 오일에 분산된 상기 복합체를 이소프로필을 이용하여 2회 세척하고 탈 이온수를 이용하여 3회 세척한 후 탈 이온수 내에 전이시켰다.
<실시 예 2> 복합체 제조
상기 실시 예 1에서 시트르산 나트륨을 60mM 사용하여 액적(시트르산 나트륨:HAuCl4=30mM:200mM)을 형성한 것으로 달리한 것을 제외하고 실시 예 1과 동일한 방법을 수행하였다.
<실시 예 3> 복합체 제조
상기 실시 예 1에서 시트르산 나트륨을 150mM 사용하여 액적(시트르산 나트륨:HAuCl4=75mM:200mM)을 형성한 것으로 달리한 것을 제외하고 실시 예 1과 동일한 방법을 수행하였다.
<실시 예 4> 복합체 제조
상기 실시 예 1에서 시트르산 나트륨을 사용하지 않은 것(0mM)으로 변경한 것을 제외하고 실시 예 1과 동일한 방법을 수행하였다.
<실험 예 1>
일 측면에 따른 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법에서, 자외선(UV) 조사에 따른 하이드로겔 및 금속 나노입자의 동시 합성에 대한 메커니즘을 확인하기 위해 하기 표 1에서와 같이, 혼합용액 성분의 조성을 달리하여 하기 표 1의 제조 예 1 내지 10에서와 같이 제조하여 용기에 담은 후 미네랄 오일을 용액의 상부에 넣어 상기 혼합용액이 기화되지 않도록 하였으며 이후, 자외선을 120s 내지 300s 동안 조사하여 반응을 관찰하였으며 그 결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다.
| 제조예 | 하이드로겔 전구체 | HAuCl4 (mM) |
광개시제 (% w/w) |
시트르산 나트륨 (mM) |
| 1 | PEGDA | 200 | 1 | 30 |
| 2 | PEGDA | 200 | 1 | 0 |
| 3 | - | 200 | 0.5 | 30 |
| 4 | - | 200 | 0.5 | 0 |
| 5 | PEG 400 | 200 | 1 | 30 |
| 6 | PEG 400 | 200 | 1 | 0 |
| 7 | PEG 6000 | 200 | 1 | 30 |
| 8 | PEG 6000 | 200 | 1 | 0 |
| 9 | Acrylic acid | 200 | 1 | 30 |
| 10 | Acrylic acid | 200 | 1 | 0 |
| 11 | PEGDA | 200 | 0 | 30 |
| 12 | PEGDA | 200 | 0 | 0 |
도 5를 참조하면 제조 예 1의 관찰 결과, UV를 조사한 시간이 120s 미만인 경우 용액이 황색을 나타내었으며, 120s 이상인 경우 점점 황색 겔로 변하는 것을 확인할 수 있으며 또한, 금 나노입자는 UV의 신호가 가장 강한 상기 혼합용액 및 오일의 계면에 동시에 형성되었다. 이를 통해, 하이드로겔 및 금 나노입자를 동시 합성하기 위해서는 적어도 2분 동안 광을 조사해야 하는 것을 알 수 있다.한편, HAuCl4를 포함하지 않는 경우, PEGDA는 약 4s만에 겔화를 완료하는 반면, HAuCl4를 포함하는 경우, 120s 이상의 시간이 소요됨을 알 수 있으며, 이는 광 개시제의 광분해에 의해 생성된 라이컬이 HAuCl4의 환원 및 PEGDA의 광가교에 경쟁적으로 사용되었음을 의미한다.
또한, 하이드로겔 및 금 나노입자를 동시 합성 시, 시트르산염의 영향을 확인하기 위해, 시트르산 나트륨의 사용 유무에 따른 변화를 관찰한 결과, 거의 유사한 것으로 나타났으며, 이를 통해 시트르산 나트륨은 상온(room temperature)의 UV 조사 단계에서 환원제로서 기능하지 않음을 알 수 있다(제조 예 1 및 2 도 5 참조).
또한, 하이드로겔 및 금 나노입자를 동시 합성 시, 하이드로겔 전구체의 영향을 확인하기 위해, PEGDA의 사용 유무에 따른 변화를 관찰한 결과 PEGDA를 사용하지 않은 경우 시트르산 나트륨을 포함하더라도 UV를 600s초 동안 조사하더라도 겔화가 진행되지 않고 금 나노입자가 환원되지 않았으며, 이를 통해 시트르산 나트륨은 광 환원제로서 작용하지 않으며, PEGDA가 HAuCl4을 광 환원시켜 금 나노입자를 형성하기 위해 필수적으로 필요함을 알 수 있다(제조 예 3 및 4 참조).
또한, 도 6 및 도 7을 참조하면, PEGDA 대신, 400g/mol의 분자량을 갖는 PEG, 6000g/mol의 분자량을 갖는 PEG, 아크릴산을 사용하여 혼합용액을 형성한 후 UV를 60s 내지 600s 동안 조사한 결과, 상기 경우 각각에서 시트르산 나트륨의 존재 여부와 무관하게 투명한 황색 용액은 UV 조사 후 불투명한 어두운 황색으로 변화하였으며, 이를 통해 HAuCl4가 환원되어 금 입자를 생성한 것을 알 수 있다. 또한, UV를 600s 동안 조사한 후 흡광 분석 결과, 약 550nm 내지 600nm의 파장 범위에서 넓은 피크(broad peak)가 나타났다. 상기 피크의 세기가 약하긴 하지만, 이를 통해 금 입자의 생성을 확인할 수 있다(제조 예 5 내지 10 참조).
이를 통해, 상기 PEG 및 아크릴레이트는 HAuCl4를 직접적으로 환원시키지는 못하지만 HAuCl4와 PEG 또는 아크릴레이트 사이의 HAuCl4 --PEG등의 복합물의 생성은 환원을 촉진시킬 수 있음을 알 수 있다.
즉, HAuCl4은 UV에 의한 상기 복합물의 활성에 의해 환원될 수 있고, 또는 UV에 의해 광 개시제로부터 생성된 라디칼과 상기 복합물의 반응에 의해 환원될 수 있다.
또한, 도 8을 참조하면, 광 개시제를 사용 유무에 따른 영향을 확인하기 위해 실험한 결과, 광 개시제를 포함하지 않은 경우, 180s까지 황색 용액이 유지되었으며, 약 300s 이후에 겔화가 진행되고, 450s 내지 600s에서 점점 어두운 갈색으로 변색되었으며 시트르산 나트륨을 포함하지 않은 경우에도 유사하게 나타났다(제조 예 11 및 12 참조). 상기 결과를 통해, 광 개시제를 사용하지 않는 경우, 광 개시제를 사용하는 경우 대비 금 나노입자의 생성을 위해 약 3배 이상의 시간이 더 소요되는 것을 알 수 있다. 즉, 광 개시제를 사용하지 않는 경우 대비 광 개시제를 사용하는 경우, 전체 반응이 촉진되어 하이드로젤 및 금 나노입자가 보다 빨리 형성되는 것을 알 수 있다.
종합적으로, 시트르산 나트륨 및 광 개시제 유래 라디칼은 HAuCl4를 직접적으로 환원시키지 않음을 알 수 있다. 하지만 HAuCl4 및 PEGDA는 UV 조사 시 복합물을 형성하며, 상기 복합물은 광 개시제 유래 라디칼(케틸 라디칼)에 의해 대부분 환원되며, 동시에 상기 라디칼은 라디칼 중합을 통해 PEGDA를 가교시키는데 사용되는 것으로 예상해볼 수 있다. 또한, 광 환원 및 광 중합에서의 상기 라디칼의 경쟁적 사용은 PEGDA의 겔화를 지연시켜 궁극적으로 하이드로겔 및 금 나노입자의 동시 합성하며, 결과적으로 상기 하이드로겔 내에 금 나노입자가 고농도로 균일하게 분산된 복합체를 생성하는 것으로 예상해볼 수 있다.
<실험 예 2> 복합체의 형성 확인
실시 예 2에서 제조한 UV 조사전 액적(Droplet as-prepared), UV 조사 후 액적(After IV irradation) 및 열처리 후 생성된 복합체(After thermal treatmet)의 변화를 확인하기 위해 광학 현미경(Eclipse L150, Nikon)으로 관찰한 결과를 도 9에 나타내고, UV-Vis 분광분석기(Infinite M200 Pro, Tecan)를 이용하여 400nm 내지 800nm 파장범위에서의 흡광 스펙트럼을 얻은 결과를 도 10에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, UV 조사전 액적(Droplet as-prepared)은 투명 황색의 약 45μm의 평균 직경을 갖는 원형 입자 형태로 형성된 것을 알 수 있으며, Image-Pro Plus라는 프로그램을 이용하여 광학현미경으로 찍은 에멀젼 사진의 사이즈를 직접 측정하는 방법으로 변동 계수(coefficient of variation, CV)를 계산한 결과, 2.76%로 매우 균일하게 형성된 것을 알 수 있다. 상기 색상은 HAuCl4에 의한 것으로 예상할 수 있다.
상기 액적은 UV 조사 후 보라빛 적색(violet-red)로 변색 되었으며, 이를 통해 UV 조사 후 금속 나노입자가 형성된 것으로 예상할 수 있다. 또한, 상기 액적은 열처리 후 불투명한 어두운 적색(dark-red)으로 변한 것을 알 수 있다.
또한, 도 10에 나타난 바와 같이, UV-Vis 분광분석 결과 흡광 스펙트럼의 피크 위치가 한 UV 조사전 액적(Droplet as-prepared), UV 조사 후 액적(After IV irradation) 및 열처리 후 생성된 복합체(After thermal treatmet)에서 각각 400nm, 522nm 및 565nm에서 나타났다.
상기 결과를 통해, UV 조사를 통해 금 나노입자가 형성되고, 일부 환원되지 않은 HAuCl4가 포함되어 있는 반면, 열처리를 통해 잔여 HAuCl4가 환원된 것으로 예상해볼 수 있다.
<실험 예 3>
일 측면에 따른 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법에서, 시트르산 나트륨의 농도에 따른 영향을 확인하기 위해, 실시 예 4(0mM), 실시 예 2(30mM) 및 실시 예 3(75mM)의 복합체에 대해 광학 현미경을 이용하여 열처리 전후를 형태 변화를 관찰하였으며 그 결과를 도 11(상:열처리 전, 하:열처리 후)에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, UV조사 후 열처리 전 실시 예 4(0mM), 실시 예 2(30mM) 및 실시 예 3(75mM)의 복합체는 각각 어두운 적색, 보라빛 적색, 밝은 적색으로 나타나 실시 예 4 대비 실시 예 1 및 3에서 보다 투명한 형태로 형성된 것을 알 수 있다.
상기 결과를 통해, 시트르산 나트륨을 포함하지 않는 실시 예 4의 경우 대비 시트르산 나트륨을 포함하는 실시 예 2 및 3의 경우 HAuCl4의 광 환원이 억제된 것을 알 수 있다.
또한, 열처리 후 실시 예 4(0mM), 실시 예 2(30mM) 및 실시 예 3(75mM)의 복합체 각각은 어두운 적색, 불투명한 어두운 적색 및 밝은 적색으로 나타났다. 즉, 실시 예 4 및 실시 예 3의 경우 열처리 전후 색상 변화가 미비한 반면, 실시 예2의 경우 열처리에 의해 변화된 것을 알 수 있다.
상기 결과를 통해, 시트르산 나트륨은 HAuCl4의 광 환원을 억제시키는 반면, 특정양으로 포함하는 경우, HAuCl4의 열 환원을 진행시키는 것을 알 수 있다.
이는 UV 조사를 통해 PEGDA 생성 후 시트르산 나트륨이 HAuCl4과 반응해 AuCl3 --citrate 형태의 복합물을 형성하고, 상기 복합물은 UV 조사에 의해서는 환원되지 않아 HAuCl4의 광 환원을 억제시킨 것으로 볼 수 있다. 또한, 상기 복합물은 열에 의해 환원되어 금 입자의 성장 또는 새로운 입자의 생성을 야기하는 것으로 볼 수 있다.
<실험 예 4>
일 측면에 따른 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법에서, 시트르산 나트륨의 농도에 따른 영향을 확인하기 위해, 열처리를 완료한 후 미네랄 오일 내에 분산된 실시 예 4(0mM), 실시 예 1(5mM), 실시 예 2(30mM) 및 실시 예 3(75mM)의 복합체에 대해 UV-Vis 분광분석기(Infinite M200 Pro, Tecan)를 이용하여 흡광 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 실시 예 4(0mM), 실시 예 1(5mM), 실시 예 2(30mM) 및 실시 예 3(75mM)의 복합체의 흡광 피크가 각각 525nm, 553nm, 564nm 및 522nm로 나타났으며, 이를 통해 시트르산 나트륨의 농도에 따라 제조되는 복합체의 특성이 달라짐을 알 수 있다.
<실험 예 5>
일 측면에 따른 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법에서, 시트르산 나트륨의 농도에 따른 라만 산란 신호의 영향을 확인하기 위해, 열처리를 완료한 실시 예 4(0mM), 실시 예 1(5mM), 실시 예 2(30mM) 및 실시 예 3(75mM)의 복합체를 1μm의 로다민6G(R6G)이 용해된 혼합용액 내에 분산시킨 후 라만 분광 분석기를 이용하여 상기 R6G에 대한 신호를 측정하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
이때, 라만 분광 분석을 위해 1 μm 스팟 사이즈 및 633nm의 레이저가 사용되었으며, R6G의 특정 피크인 612, 774, 1310, and 1364 cm-1의 신호 강도를 비교하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, 실시 예2의 복합체에서 신호 강도가 가장 컸으며, 실시 예 1> 실시 예 2> 실시 예 4> 실시 예 3의 순으로 신호 강도가 컸다.
<실험 예 6>
일 측면에 따른 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법에서, 시트르산 나트륨의 농도에 따른 라만 산란 신호의 영향을 확인하기 위해, 열처리를 완료한 실시 예 4(0mM), 실시 예 1(5mM), 실시 예 2(30mM) 및 실시 예 3(75mM)의 복합체를 FIB(foced ion beam)을 사용하여 100nm 두께로 절단하였으며. 절단면을 투과전자현미경(TEM)으로 관찰하고 그 결과를 도 14에 나타내었고, 변동 계수는 실험 예 1과 동일한 방법으로 계산하고, Image-Pro Plus라는 프로그램을 이용하여 TEM 사진에 있는 금 나노입자들의 크기를 직접 측정하는 방법으로 개수 밀도(number density)를 계산하였고, 입자 간 거리는 이하의 방법으로 계산하였다.
- 입자간 평균 거리(interparticle separation, IPS) 계산방법
: 금 입자가 임의로 밀착 충전(random close-packing, RCP)되어 구체의 중심 위치 사이의 거리를 입자가 거리로 가정하고 입자의 직경 및 부피 분율을 각각 d 및 φ로 나타내었다. RCP에 대한 입자의 부피 분율은 이하의 식 1로 표현될 수 있다.
<식 1>
이때, RCP에서의 구의 부피 분율인 φRCP는 0.63이다.
이에, 입자간 평균 거리(IPS)는 이하의 식 2로 표현될 수 있다.
<식 2>
이때, φ는 아래의 식 3으로 표시되며, 금 입자의 평균 직경(d) 및 개수 밀도(N)로부터 추정될 수 있다.
<식 3>
투과전자현미경(TEM) 분석 결과, 실시 예 4의 경우, 평균 직경이 20nm, 변동 계수(CV)는 12%, 개수 밀도(number density)는 2400μm- 3로 나타났고, 실시 예 1의 경우, 평균 직경이 34nm, 변동 계수(CV)는 10%, 개수 밀도(number density)는 1700μm-3로 나타났으며, 실시 예 2의 경우 평균 직경이 12nm로 가장 작았고, 변동 계수(CV)는 19%, 개수 밀도(number density)는 2870μm- 3로 가장 컸으며, 입자간 평균 거리는 위 식을 통해 계산 했을 경우 약 23nm인 것으로 나타났다.
상기 결과를 통해, 실시 예 2에서 보다 긴 파장의 빛을 흡수하고, 라만 신호의 강도가 보다 센 이유가 입자 간 거리가 보다 짧은 입자가 고농도로 함유되었기 때문인 것으로 볼 수 있다.
반면 실시 예 1의 경우, 평균 직경이 34nm로 금 입자가 실시 예 1 내지 4에 의해 형성된 금 입자 중 가장 크게 형성되며, 실시 예 4 대비 흡광 피크가 적색 편이 되고, 라만 신호의 강도도 보다 높은 것을 알 수 있다.
상기 결과에 대해, UV 조사를 통해 PEGDA 생성 후 시트르산 나트륨이 HAuCl4과 반응해 형성된 AuCl3 --citrate 형태의 복합물은 열에 의해 환원되되, 5mM의 시트르산 나트륨을 사용한 실시 예 1에서는 기 생성된 금 입자를 성장시켰고, 30mM의 시트르산 나트륨을 사용한 실시 예 2에서는 새로운 금 입자를 생성시킨 것을 알 수 있다.
이는, 30mM의 시트르산 나트륨을 사용한 경우, 보다 고농도의 AuCl3 --citrate 복합물을 형성할 수 있고, 상기 고농도의 AuCl3 --citrate 복합물은 단시간 내에 임계 크기의 핵을 생성할 수 있어 금 입자를 추가적으로 생성한 반면, 5mM의 시트르산 나트륨을 사용한 경우, 저동도의 AuCl3 --citrate 복합물가 형성되어 금 입자의 핵 생성을 이루지 못하여 기 형성된 금 입자 상에 환원되어 금 입자를 보다 성장시킨 것으로 볼 수 있다.
<실험 예 7>
일 측면에 따른 복합체를 이용하여 표면 증강 라만 산란으로 소분자의 검출시의 민감도를 확인하기 위해 실시 예2에서 제조한 복합체를 1 μM 내지 0.1 nM의 농도로 R6G를 함유된 혼합용액 내에 분산시켰으며 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 15의 (a)에 나타난 바와 같이 R6G의 농도가 0.1nM 이하에서는 라만 신호가 노이즈와 구별되기 어려웠으며, 이에, 상기 복합체를 이용하여 R6G를 검출하는 검출 한계(limit of detection, LOD)는 0.1nM인 것을 알 수 있다. 상기 검출 한계는 종래의 금 입자를 포함하는 복합체의 검출한계보다 현저히 우수한 값이다.
상기 라만 신호의 높은 민감도는 일 측면에 따른 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법으로 복합체 제조 시 금 나노입자가 형성됨과 동시에 3차원 그물망 구조의 하이드로겔에 트랩되어 분산 안정성이 고농도에서 달성되기 때문인 것으로 볼 수 있다.
또한, 도 15의 (b) 나타난 바와 같이, R6G의 특정 피크 중 612cm-1 피크 신호의 크기를 R6G의 농도가 증가될수록 선형적으로 증가하는 것을 알 수 있다.
또한, 도 15의 (c)는, 복합체의 신호 균일성을 평가하기 위해, R6G를 0.5mM의 농도로 함유한 혼합용액 내에 실시 예 2의 복합체를 분산시킨 후, 전체 투영 영역에 대해, 2μm의 크기를 갖는 픽셀로부터 라만 스펙트럼을 얻어 색 지표(color code)로 라만 신호의 강도를 맵핑하여 나타낸 것으로, 도 15 (c)에 나타난 바와 같이, 전체영역에 대해 라만 신호 강도가 매우 균일하게 나타나는 것을 알 수 있으며, 모든 픽셀에 대한 612cm-1 피크 신호 세기의 변동 계수(CV)는 11.9%로 매우 균일한 것을 알 수 있다.
이러한 높은 균일성은 상기 복합체 내에 분산된 금 나노입자의 균일 분포에 의한 것으로 볼 수 있다.
한편, 미세 유체 시스템을 통해 제조된 다량의 복합체에서의 균일성을 확인하기 위해, 임의의 5개의 복합체에 대해, 각각에서 선택한 1μm의 크기의 영역에서 라만 신호를 측정하였으며, 그 결과를 도 9의 (d)에 나타내었다. 도 15의 (d)에 나타난 바와 같이, 임의의 5개의 복합체에서의 신호 세기는 매우 유사했으며, 612cm-1 피크 신호 세기의 변동 계수(CV)를 계산한 결과 3.02%로 매우 균일한 것을 알 수 있다. 이를 통해, 미세 유체 시스템을 이용하여 액적 형태로 제조할 경우, 유사한 특성을 갖는 복합체를 용이하게 다량 생성할 수 있음을 알 수 있다.
<실험 예 8>
일 측면에 따른 복합체를 이용하여 표면 증강 라만 산란으로 단백질 용액 내 용해된 소분자의 검출 민감도를 확인하기 위하여 슈도모나스(Pseudomonas) 감염의 바이오마커인 파이오시아닌(pyocyanin)을 타액(saliva) 내에서 전처리 없이 직접적으로 검출하는 실험을 수행하였다.
먼저, 타액 내의 파이오시아닌(pyocyanin)의 검출 전, 탈이온수 내에 파이오시아닌(pyocyanin)을 10μM 내지 100 nM농도로 용해시킨 용액에 상기 실시 예2에 의해 제조된 복합체를 분산시킨 후 라만 산란을 수행하였으며, 그 결과를 도 16(a)에 나타내었다.
도 16(a)에 나타난 바와 같이, 파이오시아닌(pyocyanin)의 특정 라만 피크는 424, 547, 676, 880, 1354, 1407, 1456, 1564, 1594, and 1608 cm-1에서 나타났으며,도 16(b)에 나타난 바와 같이, 파이오시아닌(pyocyanin)의 농도가 증가될수록 1354cm-1에서의 신호 세기가 커지는 것을 알 수 있다. 또한, 도 16(a)에 10 μM에서 100nM에서는 파이오시아닌(pyocyanin)에 대한 특정 피크가 나타나지 않은 것으로 보다 검출 한계(limit of detection, LOD)는 100 nM인 것으로 볼 수 있다. 상기 검출 한계는 종래 대비 현저히 높은 값이다.
도 16(c)는 상기 복합체의 접착 단백질인 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)은 침투시키지 않고, 소분자인 파이오시아닌(pyocyanin, PYO)만 침투시킴을 나타낸 모식도이다.
상기 복합체의 선택적 침투를 확인하기 위하여, 플루오레세인이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate, FITC)를 이용하여 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 시각화한 후 복합체를 분산시킨 용액에 상기 알부민을 1 mM 농도로 용해시킨 경우 및 용해시키지 않은 경우에서의 파이오시아닌(pyocyanin, PYO)에 대한 라만 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 10(d)에 나타내었다.
도 16(d)의 인셋 사진은 컨포컬 현미경으로 관찰한 사진으로, 상기 복합체는 상기 BSA를 배척함을 알 수 있고, 그 결과, BSA를 1mM 농도로 용해시킨 용액에 용해된 파이오시아닌(pyocyanin, PYO)에 대한 라만 신호는 상기 BSA를 포함하지 않은 경우와 유사하게 나타났다.
또한, 도 16(e)는 서로 다른 위치에서의 얻은 라만 분석 결과로 상기 라만 신호의 강도가 임의의 위치에서 매우 균일한 것을 알 수 있으며, 이는 상기 복합체의 하이드로겔 내에 금 나노입자가 균일한 크기로 균일하게 분산되어 있기 때문인 것으로 볼 수 있다.
또한, 70 % w/w 농도의 PEGDA에 의해 제조된 하이드로겔은 약 5nm 내지 7nm의 침투 임계값을 가져, 물질이 복합체 내에 침투하기 위해서는 약 5nm 내지 7nm 미만의 크기를 가져야 하는 반면, 상기 BSA는 유체 역학적 직경(hydrodynamic diameter)이 약 7nm로 상기 침투 임계값보다 커 상기 BSA로부터 상기 금 나노입자를 효과적으로 보호할 수 있는 것을 알 수 있다.
또한, 도 16(f)는 타액(saliva), 타액 내 파이오시아닌(pyocyanin, PYO)를 100 mM 용해시킨 용액, 및 탈이온수 내에 파이오시아닌(pyocyanin, PYO)을 100 mM 용해시킨 용액 내 실시 예 2의 복합체를 분산시킨 후 라만 분석을 수행항 결과로, 도 10(f)에서와 같이, 타액 내 파이오시아닌(pyocyanin, PYO)가 용해되어 있는 경우에도 상기 파이오시아닌(pyocyanin, PYO)을 용이하게 검출할 수 있는 것을 알 수 있다.
이를 통해, 상기 제조방법으로 제조된 복합체를 사용할 경우, 점액, 백혈구, 상피세포, 효소, 전해액 등 다양한 물질을 포함하는 분석물 내에 파이오시아닌(pyocyanin, PYO)이 포함되어 있더라도 전처리 없이 현장 현시 분석(on-site, real time analysis)으로 파이오시아닌(pyocyanin, PYO)등의 소분자를 효과적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
Claims (15)
- 하이드로겔 전구체, 금속 나노입자 전구체 및 광 개시제를 혼합한 혼합용액을 제조하는 단계; 및
상기 혼합용액에 광을 조사하여 하이드로겔 및 금속 나노입자를 동시에 형성하는 단계;를 포함하며, 표면 증강 라만 산란 활성을 갖는 복합체를 제조하는 것을 특징으로 하는, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 하이드로겔 전구체는,
폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(Polyethylene (glycol) Diacrylate), 폴리에틸렌글리콜 메틸에테르 아크릴레이트, 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide), 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)(Poly(N-isopropylacrylamide)) 및 하이드록시에틸 메타크릴레이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 광은 2분 내지 5분 동안 조사되는, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 광 개시제는
1-[4-(2-하이드록시에톡시)-페닐]-2-하이드록시-2-메틸-1-프로판-1-온, 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논, 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논 및 이의 혼합물로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 복합체는 3차원의 그물망 구조의 하이드로겔 및 상기 하이드로겔 그물망의 기공보다 큰 직경을 갖는 금속 나노입자를 포함하는, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법.
- 제12항에 있어서,
상기 금속 나노입자는 평균 직경이 5nm 내지 30nm인, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 혼합용액은 시트르산염을 더 포함하는, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법은
상기 광을 조사하는 단계 이후, 열처리하는 단계를 더 포함하는, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법.
- 제8항에 있어서,
상기 열처리는 40℃ 내지 70℃의 온도에서 수행하는, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 혼합용액에서 상기 금속 나노입자 전구체 및 상기 시트르산염의 몰 농도 비가 20:1 내지 10:3인, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법은
상기 혼합용액을 제조하는 단계 이후, 상기 혼합용액을 소수성 유체에 주입하여 액적을 제조하는 단계를 더 포함하는, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법.
- 제11항에 있어서,
상기 소수성 유체는, 미네랄 오일, 실리콘 오일, 하이드로카본 오일 및 플로로카본 오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법.
- 제11항에 있어서,
상기 액적을 제조하는 단계는 미세 유체 장치를 이용하여 수행되는, 표면 증강 라만 산란용 복합체의 제조방법.
- 제1항의 제조방법으로 제조되며, 3차원의 그물망 구조의 하이드로겔 및 상기 하이드로겔의 그물망 기공보다 큰 직경을 갖는 금속 나노입자를 포함하는, 표면 증강 라만 산란용 복합체.
- 제14항에 있어서,
상기 복합체는 입자 또는 필름 형태인, 표면 증강 라만 산란용 복합체.
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| F Wang, R G Widejko, Z Yang, K T Nguyen, H Chen, L P Fernando, K A Christensen, J N Anker Anal Chem 2012, 84, 8013 |
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| KR102415633B1 (ko) | 2022-07-04 |
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