KR20180118856A - 금속 나노입자 응집체를 포함하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 미세입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

금속 나노입자 응집체를 포함하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 미세입자 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 금속 나노입자 응집체를 포함하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 미세입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자는 고분자가 코팅된 금속 나노큐브 응집체를 포함하고, 상기 응집체 사이 나노갭의 존재로 인해 기존의 하이드로젤 미세입자보다 35배 정도로 표면증강라만신호를 증폭시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

금속 나노입자 응집체를 포함하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 미세입자 및 이의 제조방법{Hydrogel microparticles for surface enhanced Raman scattering comprising metal nanoparticle aggregates and methods for their preparation}
본 발명은 금속 나노입자 응집체를 포함하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 미세입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
표면증강라만산란(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)은 높은 민감도(sensitivity)로 인해 화학물질(chemical)을 탐지하고 생화학적으로 분석하는 방법으로 각광받고 있다.
라만산란은 입자의 진동과 회전 에너지로 인해 에너지를 잃거나 얻으면서 산란되는 과정을 말하고, 화학물질에 따라 고유의 스펙트럼을 방출한다. 하지만, 그 크기가 매우 작기 때문에 표면증강법을 사용하여 산란을 증가시킨다.
표면증강법은 금속나노입자에서 발생하는 플라즈모닉 현상을 이용하여 금속나노입자 표면주위에서 라만 산란을 증강시키는 것을 말한다. 이때, 사용되는 금속입자는 일반적으로 금(Au) 나노입자와 은(Ag) 나노입자를 사용한다.
종래의 표면증강라만산란은 콜로이드 상태의 금속나노입자를 사용하거나 금속나노입자 혹은 나노구조들을 기판 표면에 형성하여 사용한다. 콜로이드를 이용한 표면증강 라만산란의 경우 측정하고자 하는 화학물질과의 화학반응 및 입사해주는 빛에 의한 효과로 인해 라만산란이 균일하지 못하며, 측정을 위해 콜로이드의 농축이 필요한 문제점이 있다.
또한, 기판에 금속나노입자 혹은 나노구조를 배열하여 사용하는 경우는 균일한 신호의 증강을 얻을 수 있지만 생체 내 투여가 어렵고, 타겟물질과의 결합속도가 낮은 문제점이 있었다.
상기 문제점을 극복하고자 본 발명자는 특허문헌 1의 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 미세입자를 제조하였고 이의 특성을 분석한 결과, 특허문헌 1의 미세입자는 타겟 물질만 선택적으로 투과시켜 시료의 전처리 과정을 없앨 수 있고, 내부의 금속 입자가 오염되는 것을 방지할 수 있음을 확인하였다. 또한, 특허문헌 1의 하이드로젤 미세입자는 기판 형태가 아닌 마이크로젤 형태(입자형태)이기 때문에 주사(injection) 및 혼합이 가능하므로 타겟 물질과의 결합속도가 개선되는 것을 확인하였다. 나아가, 특허문헌 1의 하이드로젤은 내부에 금속 나노입자를 담지하는 간단한 구조이므로 제조가 용이하게 대량 생산이 용이함을 확인하였다.
하지만, 상기 특허문헌 1에 따른 하이드로젤 미세입자는 미세입자에 함유된 금속 나노입자가 물에 분산되어 있는 형태이고, 물을 증발시킴에 따라 미세입자의 부피를 감소시켜 금속 나노입자들 사이 간격을 줄인다 하더라도, 본 기술 분야에서 기대하는 우수한 정도의 플라즈몬 현상을 유도하기에는 큰 한계점이 있음이 확인하였다.
이에, 특허문헌 1에 따른 하이드로젤 미세입자와 비교하여 플라즈몬 현상을 더욱 현저히 개선시킬 수 있는, 진보된 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자를 개발하기 위하여 노력하던 중,
본 발명에 따른 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자는 고분자가 코팅된 금속 나노큐브 응집체를 포함하고, 상기 응집체 사이 나노갭의 존재로 인해 상기 특허문헌 1에 따른 하이드로젤 미세입자보다 35배 정도로 표면증강라만신호를 증폭시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
한국 공개특허 10-2016-0061482
본 발명의 목적은 종래의 하이드로젤 미세입자보다 현저히 높은 라만 신호를 발생시킬 수 있는 하이드로젤 미세입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 종래의 하이드로젤 미세입자보다 현저히 높은 라만 신호를 발생시킬 수 있는 하이드로젤 미세입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 금속 나노입자들을 함유하는 하이드로젤 입자에 있어서,
상기 금속 나노입자들은 하이드로젤 입자 내부에서 응집되어 금속 나노입자 응집체로서 존재하는 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 금속 나노입자와 하이드로젤 폴리머 단량체를 포함하는 제1 수용액과, 금속염을 포함하는 제2 수용액을 혼합함과 동시에 소수성 유체에 주입하여 액적을 제조하는 단계(단계 1); 및
상기 액적을 젤화시키는 단계(단계 2);를 포함하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자는 고분자가 코팅된 금속 나노큐브 응집체를 포함하고, 상기 응집체 사이 나노갭의 존재로 인해 기존의 하이드로젤 미세입자보다 35배 정도로 표면증강라만신호를 증폭시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1의 미세유체 시스템을 나타내는 이미지이다.
도 2는 실시예 1에서 미세유체 시스템을 사용하여 하이드로젤 입자를 제조하는 과정을 나타내는 이미지이다.
도 3은 본 발명에 따른 하이드로젤 입자의 제조과정을 도식화한 이미지이다.
도 4는 하이드로젤 입자를 제조함에 있어, 실시예 1의 제1용액과 제2용액을 연속상으로 주입하고, UV를 조사할 때까지의 시간을 0분, 5분, 10분, 20분, 30분으로 설정하여, 은 나노큐브 응집체 형성 정도를 확인한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 5는 하이드로젤 입자를 제조함에 있어, 응집체 형성 정도를 제어하고 로다민 6G 수용액에 첨가하여 응집체 형성 정도에 따른 라만신호 증폭 정도를 평가한 이미지이다.
도 6은 라만신호 측정에 있어 613 cm-1 부근의 신호를 선택하여 그래프로 도시한 이미지이다.
도 7은 응집 시간을 30분으로 제어하여 제조한 하이드로젤 입자에 존재하는 응집체를 나타내는 이미지이다.
도 8은 건조한 하이드로젤 입자의 형상을 관찰한 이미지이다.
도 9는 응집체 위치에 따라 관찰되는 라만 신호를 관찰한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 10은 임의의 응집체 중심으로부터 얻어지는 라만 스펙트라 강도를 측정한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 11 및 12는 로다민 6G 수용액 농도를 조절함에 따라 변화하는 표면 플라즈몬 공명 신호변화를 측정한 이미지이다.
도 13은 본 발명에 따른 하이드로젤 입자가 메쉬 크기보다 작은 아스피린은 내부로 투과할 수 있는 반면, 메쉬 크기보다 크기가 큰 BSA는 내부로 투과할 수 없음을 보여주는 이미지이다.
도 14는 아스피린과 BSA가 분산된 용액에 하이드로젤 입자를 첨가하고 라만 신호를 측정한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 15는 아스피린 농도 변화에 따른 라만 신호 강도의 변화를 측정한 결과이다.
도 16은 아스피린이 나타내는 특정 위치의 피크 중에서, 810 및 1034 cm-1 부근의 피크 강도를 선택하여 그래프로 도식화한 이미지이다.
도 17은 아스피린, BSA 및 효모균 세포의 메쉬 투과 여부를 도식화한 이미지이다.
도 18은 실시예 1과 실시예 3의 하이드로젤 입자를 공초점 현미경 이미지로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 19는 실시예 1의 하이드로젤 입자, 실시예 3의 하이드로젤 입자, 은 나노큐브 응집체를 독립적으로 30 mg/dl 아스피린, 1 mM BSA 및 효모균 세포를 포함하는 PBS 버퍼에 첨가한 후 관찰되는 라만 신호를 나타내는 이미지이다.
도 20은 실시예 3의 하이드로젤 입자를 30 mg/dl의 아스피린이 분산된 용액 또는 아스피린이 없는 혈액에 첨가하여 라만 신호를 측정한 결과를 나타내는 이미지이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 금속 나노입자들을 함유하는 하이드로젤 입자에 있어서,
상기 금속 나노입자들은 하이드로젤 입자 내부에서 응집되어 금속 나노입자 응집체로서 존재하는 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자를 제공한다. 여기서, 상기 금속 나노입자는 표면 전하에 의해 분산 안정성이 확보된 것을 특징으로 한다.
상기 하이드로젤 입자는 물을 내부에 함유할 수 있고, 하이드로젤 입자의 크기는 2 내지 1000 μm이다. 그리고, 상기 금속 나노입자들은 하이드로젤 입자 총 중량에 있어 0.1 내지 30 중량% 함유되는 것이 바람직하다.
바람직하게, 상기 하이드로젤 입자의 크기는 10 내지 1000 μm, 가장 바람직하게는 10 내지 100 μm일 수 있다.
바람직하게, 상기 금속 나노입자들은 하이드로젤 입자 총 중량에 있어 0.5 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 1 내지 2 중량% 함유할 수 있다.
이때, 상기 금속 나노입자는 수용성 고분자가 코팅된 것이 바람직하고, 상기 수용성 고분자는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리플루오로술포네이트, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 또는 폴리아미드를 단독으로 사용하거나 이들을 조합하여 사용할 수 있다. 바람직하게 수용성 고분자로는 폴리비닐피롤리돈을 사용할 수 있다.
또한, 상기 수용성 고분자가 코팅된 금속 나노입자는 정다면체 형태인 것이 바람직하다. 구체적으로 정다면체는 정사면체, 정육면체, 또는 정팔면체 형태일 수 있으며, 정육면체, 즉 큐브 형태가 바람직하다.
상기 수용성 고분자가 코팅된 금속 나노입자가 큐브 형태일 경우, 큐브의 한 면의 길이는 10 내지 400 nm일 수 있고, 20 내지 350 nm일 수 있고, 30 내지 300 nm일 수 있고, 40 내지 250 nm일 수 있고, 50 내지 230 nm일 수 있고, 60 내지 210 nm일 수 있고, 70 내지 190 nm일 수 있고, 80 내지 180 nm일 수 있고, 90 내지 150 nm일 수 있고, 95 내지 120 nm일 수 있고, 100 nm일 수 있다.
하이드로젤 입자 내 응집체로서 존재하는 금속 나노입자들이 각각 정다면체 형태일 경우, 상기 응집체는 라만 신호 증폭에 유리한 나노갭(nanogap)이 다수 형성될 수 있으므로 종래의 하이드로젤 입자에 비해 우수한 신호 증폭을 확보할 수 있다.
상기 응집체는 본 발명의 실시예에 따른 30분 동안의 응집 시간에 의해 형성될 경우 직경은 5 내지 100 um, 10 내지 90 um, 15 내지 80 um, 20 내지 75 um, 22 내지 70 um, 25 내지 65 um, 28 내지 60 um, 30 내지 55 um, 31 내지 50 um, 32 내지 45 um, 33 내지 40 um, 34 내지 36 um, 35 um일 수 있다.
나아가, 상기 금속은 금(Au) 또는 은(Ag)인 것이 바람직하지만, 표면 증강 라만 스펙트럼(SERS) 측정에 사용할 수 있는 금속이라면 특별한 제한 없이 사용할 수 있다.
또한, 상기 하이드로젤 입자는 메쉬 사이즈(mesh size)가 금속 나노입자 사이즈보다 작은 3차원적 그물망 구조를 형성하여, 상기 금속 나노입자를 내부에 고정시키는 것이 바람직하다. 이때, 상기 메쉬 사이즈는 0.5 내지 50 nm이고, 상기 금속 나노입자 사이즈는 3 내지 1000 nm이다.
바람직하게, 상기 메쉬 사이즈는 1 내지 50 nm이고, 더욱 바람직하게는 5 내지 20 nm이다.
나아가, 상기 하이드로젤은 하이드로젤 폴리머 단량체의 가교에 의해 형성된 것이 바람직하며, 상기 하이드로젤 폴리머 단량체는 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(Polyethylene (glycol) Diacrylate), 폴리에틸렌글리콜 메틸에테르 아크릴레이트, 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide), 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)(Poly(N-isopropylacrylamide)), 하이드록시에틸 메타크릴레이트 등을 단독으로 사용하거나 이들을 조합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(Polyethylene (glycol) Diacrylate)를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로젤 입자는 담지된 물의 함량이 제어되어 입자 부피가 축소 또는 팽창 가능하며, 입자 부피가 축소될 경우 라만 신호의 증폭 정도가 증가한다.
또한, 본 발명은 금속 나노입자와 하이드로젤 폴리머 단량체를 포함하는 제1 수용액과, 금속염을 포함하는 제2 수용액을 혼합함과 동시에 소수성 유체에 주입하여 액적을 제조하는 단계(단계 1); 및
상기 액적을 젤화시키는 단계(단계 2);를 포함하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 표면 증강 라만 표지용 하이드로젤 입자의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 금속 나노입자와 하이드로젤 폴리머 단량체를 포함하는 제1 수용액과, 금속염을 포함하는 제2 수용액을 혼합함과 동시에 소수성 유체에 주입(또는 적하)하여 액적을 제조하는 단계이다.
이때, 상기 제1 수용액은 하이드로젤 폴리머 단량체의 가교를 유도하는 광개시제를 더 포함할 수 있으며, 상기 광개시제는 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논, 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논 또는 1-[4-(2-하이드록시에톡시)-페닐]-2-하이드록시-2-메틸-1-프로판-1-온을 단독으로 사용하거나 이들을 조합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논(Irgacure)을 사용할 수 있다.
후술하는 단계 2에의 젤화를 광 중합으로 수행하지 않고 열중합을 통해 수행할 경우 열개시제로서 포타슘 퍼설페이트, 2,2'-아조비스이소부티로나이트릴(AIBN), 벤조일 퍼옥사이드 등을 사용할 수 있다. 후술하는 단계 2에의 젤화를 광 중합으로 수행하지 않고 이온중합을 통해 수행할 경우 이온중합이 가능한 물질로는 알지네이트(Alginate) 등이 있으며, 이온의 투입에 따른 젤화가 일어나는 모든 물질이 가능하다. 후술하는 단계 2에의 젤화를 광 중합으로 수행하지 않고 냉각에 따른 물리적 젤화를 통해 수행할 경우 냉각에 따른 물리적 젤화가 가능한 물질로는 아가(Agar), 젤라틴 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제1 수용액 전체 중량 대비, 상기 금속 나노입자는 0.1 내지 30 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 1 내지 2 중량%를 사용하고, 하이드로젤 폴리머 단량체는 0.2 내지 85 중량%, 바람직하게는 1 내지 85 중량%, 가장 바람직하게는 5 내지 50 중량%를 사용할 수 있다.
제1 수용액이 광 개시제를 추가로 포함할 경우에는, 제1 수용액 전체 중량 대비 광 개시제 0.01 내지 100 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 1 중량%를 사용할 수 있다.
또한, 상기 금속염은, 상기 금속 나노입자의 응집을 유도하여 응집체로 형성시키는 역할을 수행한다. 이때, 상기 금속염의 금속은 금속 나노입자의 응집을 유도할 수 있는 것이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 구체적인 예시로는 알칼리금속, 알칼리토금속, 란타넘족금속, 악티늄족금속, 전이금속, 전이후금속, 준금속 들을 사용할 수 있다. 바람직하게는 알칼리금속을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 알칼리금속 중 나트륨을 사용할 수 있다. 또한, 상기 금속염의 음이온은 금속 양이온과 염을 이룰 수 있는 음이온이면 제한 없이 사용 가능하며, 구체적인 예시로는 염화이온, 브롬화이온, 요오드화이온, 산화이온, 황화이온, 수산화이온, 질산이온, 탄산이온, 황산이온, 과망간산이온, 아세트산이온, 인산이온 등이 있다. 가장 바람직하게는 염화이온을 사용할 수 있다.
나아가, 상기 소수성 유체는 미네랄 오일 또는 실리콘 오일을 사용할 수 있으나, 제1 수용액과 제2 수용액을 액적 형태로 유도할 수 있는 소수성 유체라면 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 제1 수용액 및 제2 수용액이 친수성을 갖기 때문에 소수성을 갖는 미네랄 오일 등을 연속상으로 사용하여, 오일 내에서 제1 수용액 및 제2 수용액의 혼합물이 구슬(방울)처럼 구형체를 형성하도록 한다.
본 발명에 따른 표면 증강 라만 표지용 하이드로젤 입자의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 액적을 젤화시키는 단계이다.
이때, 상기 젤화는 광 조사(UV 조사)에 의해 수행되며, 광 조사에 의해 상기 제1 수용액 내의 하이드로젤 폴리머 단량체가 3차원적인 그물망 구조의 하이드로젤 입자 형태로 가교된다. 이때, 상기 그물망 구조는 복수 개의 메쉬를 포함하며, 상기 메쉬 사이즈는 상기 금속 나노입자 사이즈보다 작아 금속 나노입자를 하이드로젤 입자 내부에 고정하게 된다. 다만, 상기 젤화는 필요할 경우 광 중합뿐만 아니라 열중합, 이온중합 또는 냉각에 따른 물리적 젤화를 통해 수행할 수도 있다. 그리고, 상기 하이드로젤 폴리머 단량체의 농도 또는 분자량을 제어하여 그물망의 메쉬 사이즈를 조절할 수 있다.
또한, 상기 광 조사에 있어 자외선 조사는 1 내지 100 mW/cm2의 광도에서 0.1 내지 10초 동안 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자는 고분자가 코팅된 금속 나노큐브 응집체를 포함하고, 상기 응집체 사이 나노갭의 존재로 인해 기존의 하이드로젤 미세입자보다 35배 정도로 표면증강라만신호를 증폭시킬 수 있는 효과가 있다. 이를 입증하기 위하여, 하기와 같은 구체적인 실험을 수행하였다.
먼저, 본 발명에 따른 하이드로젤 입자의 제조에 있어서, 제1용액과 제2용액을 연속상에 주입하고, UV를 조사할 때까지의 시간동안 은 나노큐브의 응집이 유도되며, 상기 응집 시간에 따라 응집체의 형성 정도를 확인하기 위하여 실험을 수행한 결과, 제1용액과 제2용액을 연속상에 주입하고부터 시간이 경과함에 따라 은 나노큐브가 응집하여 응집체가 형성됨을 알 수 있다. 또한, 도 4에는 나타나 있지 않으나 30분보다 오랜 시간 응집을 유도하더라도 30분이 경과한 시점의 응집체와는 크기 변화가 없는 것으로 나타났다. 이로부터 최적의 응집 유도 시간은 30분임을 확인하였다(실험예 1의 도 4 참조).
또한, 상기 <실험예 1>과 같이 실험을 수행하되, 각 시간에서 형성된 응집체가 나타내는 표면 플라즈몬 공명 신호를 측정하여 응집체 형성 정도에 따른 표면 플라즈몬 공명 신호변화를 평가한 결과, 은 나노큐브의 응집을 유도하여 응집체의 크기가 클수록, 결과적으로 라만 신호가 증폭되는 것으로 나타났다. 이는 은 나노큐브 응집체에 존재하는 간극(interstices), 즉, 나노갭(nanogap)의 존재로 인하여 라만 신호가 대폭 증폭되는 것임을 알 수 있다. 은 나노큐브는 큐브 형상을 갖고 있으므로 이들이 응집하면 라만 신호의 증폭에 유리한 수많은 나노갭을 형성할 수 있고, 결과적으로 라만 신호의 증폭을 유도할 수 있음을 확인하였다(실험예 2의 도 5, 도 6 참조).
나아가, 하이드로젤 입자 내 형성된 응집체의 위치에 따라 표면 플라즈몬 공명 신호가 변화하는지 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 응집체의 중심부에서 관찰되는 라만 신호는 강한 반면(#1,#2), 응집체 측면이나 표면에서 관찰되는 라만 신호는 #1, #2에 비해 약한 것으로 나타났다(#3, #4). 응집체가 형성되지 않은 부분에서 관찰한 라만 신호는 측정되지 않았다(#5). 612, 775, 및 1505 cm-1 에서의 변화 계수는 독립적으로 4.9%, 1.38%, 및 3.93%로 측정되었다(실험예 3의 도 7, 도 8, 도 9, 도 10 참조).
또한, 분석대상물질 농도에 따른 표면 플라즈몬 공명 신호변화와 검출 한계(limit of detection, LOD)를 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 분석대상물질에 해당하는 로다민 6G 수용액의 농도가 높아질수록 라만 신호의 증폭도 현저한 것으로 나타났다. 그리고, 본 발명에 따른 하이드로젤 입자의 검출 한계는 10 및 100 pM 정도임을 확인하였다(실험예 4의 도 11, 도 12 참조).
나아가, 본 발명에 따른 하이드로젤 입자가 고분자 가교에 의한 메쉬가 형성되며, 상기 메쉬 사이즈보다 작은 물질만을 선택적으로 투과하여 검출할 수 있음을 입증하기 위하여 실험을 수행한 결과, BSA에 대한 라만 신호는 측정되지 않았고, 오직 상기 하이드로젤 입자의 메쉬 크기보다 작은 R6G에 대한 라만 신호만 측정되어, 이로부터 본 발명의 하이드로젤 입자는 메쉬 사이즈보다 작은 분석대상물질만을 선택적으로 측정할 수 있음을 확인하였다. 동일한 원리로, pH 7.4의 PBS 용액에 용해된 30 mg/dl 아스피린 및 1 mM BSA에 상기 하이드로젤 입자를 첨가하고 라만 신호를 측정한 결과, 아스피린에 대한 라만 신호만 측정되었으며, BSA에 대한 라만 신호는 측정되지 않았다(실험예 5의 도 13, 도 14 참조).
또한, 본 발명에 따른 하이드로젤 입자를 사용하여 혈액 내 아스피린 농도에 따른 라만 신호변화를 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 아스피린의 농도가 증가할수록 라만 신호가 증폭하는 것으로 나타났다. 또한, 아스피린 농도가 5 mg/dl일 경우 본 발명의 하이드로젤 입자는 라만 피크를 나타내지 않는 것을 확인하였다(실험예 6의 도 15, 도 16 참조).
나아가, 상기 <실험예 5>와 동일하게 수행하되, 실시예 1과 실시예 3의 하이드로젤 입자를 사용하고, 분석대상물질로는 아스피린(< 1nm), 효모균(> 1μm), BSA(~7 nm)을 사용하여 실험을 수행한 결과, 실시예 3의 하이드로젤 입자는 오직 아스피린만을 내부에 수용하는 반면, 실시예 3보다 메쉬 크기가 큰 실시예 1의 하이드로젤 입자는 아스피린뿐만 아니라 BSA를 수용할 수 있는 것으로 나타났다. 반면, 은 나노큐브 응집체는 선택적 투과 없이 아스피린, BSA 및 효모균 세포(평균 직경 3μm)가 모두 접근 가능한 것을 확인하였다. 또한, 이러한 선택적 투과는 라만 신호 측정에서도 나타났는데, 아스피린만을 선택적으로 투과하는 실시예 3 하이드로젤(Dense microgel)은 종래 알려진 아스피린의 특정 피크만을 나타내는 것을 확인하였다(실험예 7의 도 17, 도 18, 도 19, 도 20 참조).
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다.
단, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
< 제조예 1> 폴리비닐피롤리돈 ( Polyvinylpyrrolidone , PVP )이 코팅된 은 나노큐브 ( Ag NCs capped by PVP, 평균 직경 100 nm, 0.8wt%)의 제조
에틸렌 글리콜 (EG; 5 mL, J. T. Baker, 9300-01)을 20 mL 바이알에 넣고 뚜껑을 덮고 140 ℃의 오일 배스에서 1 시간 동안 교반하면서 가열하였다. HCl (EG 중의 3 mM 용액 1 mL)을 신속하게 첨가하고 바이알을 다시 봉인하였다. 10 분 후, AgNO3 (EG 중의 94mM 용액 3 ㎖; Aldrich, 209139-100G) 및 폴리(비닐피롤리돈) (PVP; EG (147 ㎖ 반복 단위 환산) 내 3 mL) Mr ~ 55000, Aldrich, 856568-100G)를 교반 용액에 시간 당 45 mL의 속도로 2 채널 주사기 펌프 (KDS-200, Stoelting, Wood Dale, IL)로 동시에 첨가 하였다. 그 다음에 바이알을 140 ℃에서 열처리 하였다. AgNO3 용액의 주입 시, 반응 혼합물은 유백색, 담황색, 투명, 적색 및 황색을 포함하는 일련의 색 변화를 겪었다. 양성자와 염소의 역할(roles)을 분리하기 위해 HNO3에 의한 HCl 대체를 제외하고 동일한 조건 하에서 합성을 수행했다. 스케일-업(scale-up) 합성을 위해, 상기 바이알을 100 mL 플라스크로 대체하고, 모든 용액의 부피를 5 배 증가시켰다. 이와 같은 과정을 통해 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone, PVP)이 코팅된 은 나노큐브(Ag NCs capped by PVP, 평균 직경 100 nm, 0.8wt%)를 제조하였다.
< 실시예 1> 하이드로젤 입자 제조 1
도 1의 미세유체 시스템을 사용하여 하이드로젤 입자를 제조하였다.
보다 구체적으로, 도 1의 미세유체 시스템은 두 개의 평행한 채널로 구성되는 주입구와, 주입구로부터 배출되는 에멀젼 입자를 수용하기 위한 수집구(수집 모세관), 그리고 상기 주입구와 수집구를 모두 수용하며 주입구와 수집구 바깥 위치에 연속상을 수용할 수 있는 하나의 채널을 갖는 모세관들을 동축으로 배치한 것이다.
하이드로젤을 형성할 수 있는 단량체인 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)(10wt%)(분자량 700), UV를 조사받아 상기 PEGDA의 가교를 유도하는 광개시제 Irgacure(1wt%), 상기 제조예 1에서 제조한 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone, PVP)이 코팅된 은 나노큐브(Ag NCs capped by PVP, 평균 직경 100 nm, 0.8wt%) 및 잔량으로 물을 포함하는 제1용액과;
응집제로서 상기 폴리비닐피롤리돈이 코팅된 은 나노큐브를 응집시켜 나노갭(nanogap)을 형성시키기 위한 NaCl 수용액(3 wt%)을 포함하는 제2용액과;
연속상으로, 계면활성제인 5 wt%ABIL EM90 surfactant (Evonik Industries)를 함유하는 광유(Mineral oil)를 준비하였다.
도 1의 미세유체 시스템에서 두 개의 평행한 채널로 구성되는 주입구의 각 채널에 상기 제1용액과 제2용액을 독립적으로 위치시키고, 상기 주입구 바깥 채널로는 상기 연속상을 흘려주었다. 다음으로, 제1용액과 제2용액을 동시에 연속상으로 주입하여 유상의(emulsified) 단일 액적을 제조하였다.
이때, 폴리비닐피롤리돈이 코팅된 은 나노큐브는 음전하를 띄므로, 반대 이온인 Na+가 상기 제2용액을 불안정하게 유도하여 상기 폴리비닐피롤리돈이 코팅된 은 나노큐브가 액적 내 응집되어 응집체가 될 수 있다.
다음으로, 수집 모세관 후단에서 10초 동안 UV를 조사하여 상기 에멀젼 입자를 경화하여 실시예 1에 따른 하이드로젤 입자를 제조하였다.
이때, 상기 하이드로젤 입자는 네트워크 형태의 메쉬가 형성되며, 상기 메쉬 크기는 단일의 상기 폴리비닐피롤리돈이 코팅된 은 나노큐브보다 작아 은 나노큐브를 가둘 수 있고, 동시에 추가적인 응집을 억제할 수 있다.
마지막으로, 상기 형성된 하이드로젤 입자는 증류수로 옮기고, 이소프로판올과 물로 3 내지 4번 반복하여 세척하였다.
도 3에 본 발명에 따른 하이드로젤 입자의 제조과정을 도식화하여 나타내었다.
< 실시예 2> 하이드로젤 입자 제조 2
폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)의 함량을 30wt%로 투입하는 것을 제외하고, 상기 <실시예 1>과 동일한 과정을 통해 하이드로젤 입자를 제조하였다.
< 실시예 3> 하이드로젤 입자 제조 3
폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)의 함량을 70wt%로 투입하는 것을 제외하고, 상기 <실시예 1>과 동일한 과정을 통해 하이드로젤 입자를 제조하였다.
< 실험예 1> 응집체 형성 제어 평가
본 발명에 따른 하이드로젤 입자의 제조에 있어서, 제1용액과 제2용액을 연속상에 주입하고, UV를 조사할 때까지의 시간동안 은 나노큐브의 응집이 유도되며, 상기 응집 시간에 따라 응집체의 형성 정도를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 <실시예 1>에 따라 하이드로젤 입자를 제조하되, 제1용액과 제2용액을 연속상으로 주입하고, UV를 조사할 때까지의 시간을 0분, 5분, 10분, 20분, 30분으로 설정하여, 은 나노큐브 응집체 형성 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 하이드로젤 입자를 제조함에 있어, 실시예 1의 제1용액과 제2용액을 연속상으로 주입하고, UV를 조사할 때까지의 시간을 0분, 5분, 10분, 20분, 30분으로 설정하여, 은 나노큐브 응집체 형성 정도를 확인한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 제1용액과 제2용액을 연속상에 주입하고부터 시간이 경과함에 따라 은 나노큐브가 응집하여 응집체가 형성됨을 알 수 있다. 또한, 도 4에는 나타나 있지 않으나 30분보다 오랜 시간 응집을 유도하더라도 30분이 경과한 시점의 응집체와는 크기 변화가 없었다.
< 실험예 2> 응집체 형성 정도에 따른 표면 플라즈몬 공명 신호변화 평가
상기 <실험예 1>과 같이 실험을 수행하되, 각 시간에서 형성된 응집체가 나타내는 표면 플라즈몬 공명 신호를 측정하여 응집체 형성 정도에 따른 표면 플라즈몬 공명 신호변화를 평가하였다.
보다 구체적으로, 0분, 5분, 10분, 20분, 30분 동안 응집을 유도하여 <실시예 1> 과정을 통해 제조한 하이드로젤 입자를 10-7M의 로다민 6G 수용액에 첨가하고 SERS 스펙트라를 얻었다. High-resolution dispersive Raman microscope (Horbia Jobin Yvon, LabRAM HR UV/Vis/NIR) 장비를 사용하였다. 1 micrometer의 beam size를 갖는 633 nm 파장의 레이저를 하이드로젤 미세입자에 10초간 조사하여 발생하는 라만신호를 얻었다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5는 하이드로젤 입자를 제조함에 있어, 응집체 형성 정도를 제어하고 로다민 6G 수용액에 첨가하여 응집체 형성 정도에 따른 라만신호 증폭 정도를 평가한 이미지이다.
도 6은 라만신호 측정에 있어 613 cm-1 부근의 신호를 선택하여 그래프로 도시한 이미지이다.
도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 은 나노큐브의 응집을 유도하여 응집체의 크기가 클수록, 결과적으로 라만 신호가 증폭되는 것으로 나타났다. 이는 은 나노큐브 응집체에 존재하는 간극(interstices), 즉, 나노갭(nanogap)의 존재로 인하여 라만 신호가 대폭 증폭되는 것임을 알 수 있다.
은 나노큐브는 큐브 형상을 갖고 있으므로 이들이 응집하면 라만 신호의 증폭에 유리한 수많은 나노갭을 형성할 수 있고, 결과적으로 라만 신호의 증폭을 유도할 수 있음을 확인하였다.
< 실험예 3> 응집체 위치에 따른 표면 플라즈몬 공명 신호변화 평가
하이드로젤 입자 내 형성된 응집체의 위치에 따라 표면 플라즈몬 공명 신호가 변화하는지 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 보다 구체적으로, 본 실험은 응집체가 하이드로젤 입자 내 특정 부분에 존재하게 되므로, 응집체 위치에 따른 신호 증폭 정도에 차이가 있는지 확인하기 위한 것이다.
먼저, 응집 시간을 30분으로 제어하여 제조한 하이드로젤 입자에 존재하는 응집체를 도 7을 통해 확인하였고, 도 8은 건조한 하이드로젤 입자의 형상을 관찰한 이미지이다.
도 7에서 라만 신호를 관찰한 구체적인 응집체 위치를 #1, #2, #3, #4, #5로 표시하였으며, 상기 <실험예 2>와 같이 10-7M의 로다민 6G 수용액을 사용하여 상기 응집체 위치에서 발생하는 라만 신호를 측정하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9는 응집체 위치에 따라 관찰되는 라만 신호를 관찰한 결과를 나타내는 이미지이다.
응집체의 중심부에서 관찰되는 라만 신호는 강한 반면(#1,#2), 응집체 측면이나 표면에서 관찰되는 라만 신호는 #1, #2에 비해 약한 것으로 나타났다(#3, #4). 응집체가 형성되지 않은 부분에서 관찰한 라만 신호는 측정되지 않았다(#5).
임의의 응집체 중심으로부터 얻어지는 라만 스펙트라 강도를 측정한 결과는 도 10에 나타내었다. 612, 775, 및 1505 cm-1 에서의 변화 계수는 독립적으로 4.9%, 1.38%, 및 3.93%로 측정되었다.
< 실험예 4> 분석대상물질 농도에 따른 표면 플라즈몬 공명 신호변화 평가
분석대상물질 농도에 따른 표면 플라즈몬 공명 신호변화와 검출 한계(limit of detection, LOD)를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 로다민 6G 수용액 농도를 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M으로 조절한 각 용액에, 응집 시간을 30분으로 제어한 하이드로젤 입자를 넣고 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 표면 플라즈몬 공명 신호를 측정하였다. 그 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다.
도 11 및 12는 로다민 6G 수용액 농도를 조절함에 따라 변화하는 표면 플라즈몬 공명 신호변화를 측정한 이미지이다.
도 11 및 12에 나타난 바와 같이, 분석대상물질에 해당하는 로다민 6G 수용액의 농도가 높아질수록 라만 신호의 증폭도 현저한 것으로 나타났다. 또한, 도 11 및 12로부터 본 발명에 따른 하이드로젤 입자의 검출 한계는 10 및 100 pM 정도임을 확인하였다.
< 실험예 5> 하이드로젤 입자 메쉬 사이즈에 따른 투과 평가 1
본 발명에 따른 하이드로젤 입자는 고분자 가교에 의한 메쉬가 형성되며, 상기 메쉬 사이즈보다 작은 물질만을 선택적으로 투과하여 검출할 수 있다. 이를 입증하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)의 함량을 70wt%로 투입하여 제조한 <실시예 3>의 하이드로젤 입자의 침투 절단값(cut-off value)는 5 내지 7 nm이다. 이 하이드로젤 입자를, 1nM의 R6G와 1mM의 BSA(bovine serum albumin)이 혼합된 증류수에 분산하였다. BSA는 혈액 내 주요 성분이고, 어떠한 표면에도 잘 접착하는 특성이 있으며, 직경은 약 7 nm로 상기 하이드로젤 입자의 절단값보다 크다.
대조군으로는 1nM의 R6G만 분산된 증류수에 상기 하이드로젤 입자를 분산하여 상기 <실험예 2>와 같이 라만 신호를 측정하였다.
그 결과, BSA에 대한 라만 신호는 측정되지 않았고, 오직 상기 하이드로젤 입자의 메쉬 크기보다 작은 R6G에 대한 라만 신호만 측정되어, 이로부터 본 발명의 하이드로젤 입자는 메쉬 사이즈보다 작은 분석대상물질만을 선택적으로 측정할 수 있음을 확인하였다.
동일한 원리로, pH 7.4의 PBS 용액에 용해된 30 mg/dl 아스피린 및 1 mM BSA에 상기 하이드로젤 입자를 첨가하고 라만 신호를 측정한 결과, 아스피린에 대한 라만 신호만 측정되었으며, BSA에 대한 라만 신호는 측정되지 않았다. 이와 관련한 결과는 도 13 및 14에 나타내었다.
도 13은 본 발명에 따른 하이드로젤 입자가 메쉬 크기보다 작은 아스피린은 내부로 투과할 수 있는 반면, 메쉬 크기보다 크기가 큰 BSA는 내부로 투과할 수 없음을 보여주는 이미지이다.
도 14는 아스피린과 BSA가 분산된 용액에 하이드로젤 입자를 첨가하고 라만 신호를 측정한 결과를 나타내는 이미지이다.
아스피린의 피크가 810, 1034, 1145, 1248, 1309, 1379 및 1618 cm-1에 나타나는 공지 내용과 도 14 결과를 비교할 때, 본 발명의 하이드로젤 입자는 아스피린만을 선택적으로 수용하여 라만 신호를 발생시킴을 알 수 있다.
< 실험예 6> 아스피린 농도에 따른 라만 신호변화 평가
아스피린은 혈액 내 10 mg/dl 농도 이하일 때 통증 경감 및 혈전을 억제하는 효능을 나타내지만, 아스피린의 과도한 투여로 인해 혈중 농도가 30 mg/dl 이상이면 두통, 구토 및 현기증을 느껴 생명에 위협을 느끼게 된다. 따라서, 혈액 내 아스피린 농도를 정확히 측정하는 것이 필요하다.
본 발명에 따른 하이드로젤 입자를 사용하여 혈액 내 아스피린 농도에 따른 라만 신호변화를 평가하기 위하여 10 mg/dl, 20 mg/dl, 30 mg/dl, 40 mg/dl, 50 mg/dl 농도의 아스피린과 1 mM의 BSA 혼합 용액에 본 발명에 따른 하이드로젤 입자를 첨가하고 상기 <실험예 2>와 같이 라만 신호를 측정하였다. 그 결과를 도 15 및 도 16에 나타내었다.
도 15는 아스피린 농도 변화에 따른 라만 신호 강도의 변화를 측정한 결과이다.
도 16은 아스피린이 나타내는 특정 위치의 피크 중에서, 810 및 1034 cm-1 부근의 피크 강도를 선택하여 그래프로 도식화한 이미지이다.
도 15 및 도 16에 나타난 바와 같이, 아스피린의 농도가 증가할수록 라만 신호가 증폭하는 것으로 나타났다. 또한, 아스피린 농도가 5 mg/dl일 경우 본 발명의 하이드로젤 입자는 라만 피크를 나타내지 않는 것을 확인하였다.
< 실험예 7> 하이드로젤 입자 메쉬 사이즈에 따른 투과 평가 2
상기 <실험예 5>와 동일하게 수행하되, 실시예 1과 실시예 3의 하이드로젤 입자를 사용하고, 분석대상물질로는 아스피린(< 1nm), 효모균(> 1μm), BSA(~7 nm)을 사용하여 실험을 수행하였다.
폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)(10wt%)를 사용하여 제조한 실시예 1의 하이드로젤 입자는 메쉬 크기가 다소 크고(Loose microgel), 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)(70wt%)를 사용하여 제조한 실시예 3의 하이드로젤 입자는 메쉬 크기가 다소 작다(Dense microgel).
따라서, 상기 실시예 1의 하이드로젤 입자는 침투 절단값(cut-off value)이 9 내지 12 nm이고, 상기 실시예 3의 하이드로젤 입자는 침투 절단값(cut-off value)이 5 내지 7 nm이다.
또한, 대조군으로는 하이드로젤 없이 오직 은 나노큐브 응집체만을 준비하여 동일한 실험을 수행하여 하이드로젤의 존재 여부에 따른 차이를 확인하였다.
상기 준비한 실시예 1의 하이드로젤 입자, 실시예 3의 하이드로젤 입자, 은 나노큐브 응집체를 독립적으로 30 mg/dl 아스피린, 1 mM BSA 및 효모균 세포를 포함하는 PBS 버퍼에 첨가하여 라만 신호를 측정하였다. 이때, 아스피린, BSA 및 효모균 세포의 메쉬 투과 여부를 도식화하여 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, 실시예 3의 하이드로젤 입자는 오직 아스피린만을 내부에 수용하는 반면, 실시예 3보다 메쉬 크기가 큰 실시예 1의 하이드로젤 입자는 아스피린뿐만 아니라 BSA를 수용할 수 있는 것으로 나타났다. 반면, 은 나노큐브 응집체는 선택적 투과 없이 아스피린, BSA 및 효모균 세포(평균 직경 3μm)가 모두 접근 가능한 것을 알 수 있다.
도 18은 실시예 1과 실시예 3의 하이드로젤 입자를 공초점 현미경 이미지로 관찰한 결과를 나타낸다.
이러한 선택적 투과는 라만 신호 측정에서도 나타났다. 도 19는 실시예 1의 하이드로젤 입자, 실시예 3의 하이드로젤 입자, 은 나노큐브 응집체를 독립적으로 30 mg/dl 아스피린, 1 mM BSA 및 효모균 세포를 포함하는 PBS 버퍼에 첨가한 후 관찰되는 라만 신호를 나타내는 이미지이다.
도 19에 나타난 바와 같이 아스피린만을 선택적으로 투과하는 실시예 3 하이드로젤(Dense microgel)은 종래 알려진 아스피린의 특정 피크만을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 실시예 3의 하이드로젤 입자를 30 mg/dl의 아스피린이 분산된 용액 또는 아스피린이 없는 혈액에 첨가하여 라만 신호를 측정한 결과, 실시예 3의 하이드로젤 입자는 아스피린에 대하여 선택적으로 라만 신호를 나타낼 수 있음을 도 20을 통해 다시 확인하였다.

Claims (15)

  1. 금속 나노입자들을 함유하는 하이드로젤 입자에 있어서,
    상기 금속 나노입자들은 하이드로젤 입자 내부에서 응집되어 금속 나노입자 응집체로서 존재하는 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 금속 나노입자는 수용성 고분자가 코팅된 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 수용성 고분자는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리플루오로술포네이트, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트 및 폴리아미드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 수용성 고분자가 코팅된 금속 나노입자는 원 형태, 타원 형태 또는 정다면체 형태인 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 정다면체는 정사면체, 정육면체, 또는 정팔면체인 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 금속은 금(Au) 또는 은(Ag)인 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로젤 입자는 메쉬 사이즈(mesh size)가 금속 나노입자 사이즈보다 작은 3차원적 그물망 구조를 형성하여, 상기 금속 나노입자를 내부에 고정시키는 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 금속 나노입자 응집체는 나노갭(nanogap)이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자.
  9. 금속 나노입자와 하이드로젤 폴리머 단량체를 포함하는 제1 수용액과, 금속염을 포함하는 제2 수용액을 혼합함과 동시에 소수성 유체에 주입하여 액적을 제조하는 단계(단계 1); 및
    상기 액적을 젤화시키는 단계(단계 2);를 포함하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제1 수용액은 하이드로젤 폴리머 단량체의 가교를 유도하는 광개시제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 염은, 상기 금속 나노입자의 응집을 유도하여 응집체로 형성시키는 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자의 제조방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 소수성 유체는 미네랄 오일, 실리콘 오일, 하이드로카본 오일 또는 플로로카본 오일인 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자의 제조방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 소수성 유체는 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자의 제조방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 젤화는 광 조사에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자의 제조방법.
  15. 제9항에 있어서,
    단계 2를 수행하여 제조되는 하이드로젤 입자를, 물에 재분산하는 단계(단계 3);를 더 포함하는 표면 증강 라만 산란용 하이드로젤 입자의 제조방법.
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