KR20220044918A - 뉴로필린1에 특이적으로 결합하는 Non-CendR 펩타이드, 상기 펩타이드가 융합된 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

뉴로필린1에 특이적으로 결합하는 Non-CendR 펩타이드, 상기 펩타이드가 융합된 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뉴로필린1(Neuropilin 1, NRP1)에 결합하는 모든 리간드 및 펩타이드가 갖는 C-말단 아미노산 서열의 -R/K-x-x-R/K 모티프 C-말단 규칙(C-end rule/CendR)에서 벗어난 아미노산 서열을 가지면서 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 상기 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 항체, 소분자 약물, 나노입자, 리포좀, 또는 핵산, 이를 포함하는 암 또는 신생혈관 관련 진환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 및 진단용 조성물에 관한 것이다. 또한, 또한 본 발명은 상기 NRP1에 결합하는 C-말단 규칙에서 벗어나는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 상기 NRP1에 결합하는 C-말단 규칙에서 벗어나는 펩타이드를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 C-말단 규칙에서 벗어나면서 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 항암 항체는 NRP1과 결합하는 특성을 갖게 되어, 생체 내 투여시 종양조직에 선택적으로 축적되고, 종양혈관내피세포의 세포간격을 넓혀서 혈관 밖 유출이 증진되고, 종양조직 내부로의 침투가 증가한다.

Description

뉴로필린1에 특이적으로 결합하는 Non-CendR 펩타이드, 상기 펩타이드가 융합된 융합 단백질 및 이의 용도 {Neuropilin-1 Specific Binding Non-CendR Peptide, Fusion Protein Comprising the Same Fused Thereto and Use Thereof}
*본 발명은 뉴로필린1(NRP1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드로서, NRP1에 결합하는 기존의 리간드 및 펩타이드에 요구되는 -R/K-x-x-R/K 모티프(소위, C-말단 규칙(C-end rule/CendR))을 가지지 않고도, NRP1에 특이적으로 결합하는 특정 아미노산 서열 말단을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 항체, 소분자 약물, 나노입자, 리포좀, 또는 핵산에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 또는 상기 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 항체, 소분자 약물, 나노입자, 리포좀, 또는 핵산을 포함하는 암 또는 신생혈관 관련 진환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 항체, 소분자 약물, 나노입자, 리포좀 또는 핵산을 포함하는 암 또는 신생혈관 관련 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 항체 중쇄의 불변부위 C-말단에 펩타이드 라이브러리를 효모세포 표면에 구축하여, NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하는 방법에 관한 것이다.
항체는 항원에 대한 고특이성, 고친화도로 결합하여 항원을 중화시키는 작용을 하는 단백질이다. 또한 항체의 중쇄불변부위의 기능인 항체-의존성 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity) 및 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cellular cytotoxicity)을 지니고, FcRn(neonatal Fc receptor) 와의 결합을 통해 혈액 내 긴 반감기(long serum half-life)를 가진다. 항원에 대한 고특이성, 고친화도로 결합특성으로 원하지 않는 부작용을 줄일 수 있고, 항체-의존성 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity) 및 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cellular cytotoxicity)으로 질병 유발 세포의 사멸을 유도할 수 있으며, 혈액 내 긴 반감기는 장시간 동안 지속되는 항체의 효과를 기대할 수 있다. 이러한 항체의 특성 때문에, 치료용 단백질로서 개발하려는 연구가 활발하다.
현재까지 개발된 암 치료용 항체는 고형암(Solid tumor) 치료용, 혈액암(Leukemia/lymphoma) 치료용 항체, 두 가지 분류로 나뉜다. 여기서 각 분류의 항체를 단독투여시 치료 반응률(response rates)이 이 두 가지 항체에서 차이를 보인다. 현재 시판되는 여러 항체들의 통계로 혈액암 치료용 항체의 단독투여시 치료 반응률은 30~51%에 달하는 반면, 고형암 치료용 항체의 단독투여시 치료 반응률은 8~15% 로 비교적 낮은 치료 반응률을 보인다. 이는 혈액에 있는 암세포를 타겟하는 혈액암 치료용 항체와는 달리, 고형암 치료용 항체의 경우 치료 효과를 나타내기 위해서는 1)고형암 조직에 도달해야 하고, 2)암 조직에 있는 혈관에서부터 빠져나와, 3)암세포의 항원에 결합하여 작용해야 하는 과정이 추가되기 때문이다(Scott AM et al. 2012). 이러한 일련의 과정에서 고형암 치료용 항체가 암세포에 도달하는 데에 존재하는 여러 방해 요소 때문에 실제 인간의 생체 내에서 종양조직 내에 축적되는 항체의 양은 0.01~0.001% 투여량/1g 종양조직 (injected dose per gram tumor)으로 매우 낮아서, 낮은 치료 반응률을 보이게 된다(Thurber et al. 2008). 따라서 항체가 종양조직에 선택적으로 축적되고 종양조직 내부로의 고침투성를 갖도록 하는 항체 기술 개발은 고형암 치료용 항체의 치료 효과를 높일 수 있어 매우 중요하다.
항체가 조직으로 침투가 잘 되지 않는 원인으로는 크게 1) 항체의 본질적인 특성(크기(~150 kDa), 항원결합특성(antigen-binding barrier) 등(Thurber and Dane Wittrup, 2012), 및 2) 정상조직과는 다른 종양 조직의 미세조직학적/생리학적 특성(예, 불완전하고 비정상적인 혈관 생성, 매우 낮은 림파선 형성, 높은 세포 밀도, 높은 세포외 기질 밀도 등) 두 가지에 기인한다고 볼 수 있다(Jain and Stylianopoulos, 2010). 따라서 항체의 크기 및 항원결합특이성을 조절하는 항체공학기술을 이용하거나, 항체의 종양조직침투를 증진시키는 분자(소위 promoter agents)와의 병용투여 방법 등 여러 방법을 이용하여 항체의 종양조직 침투성을 증진시키려는 노력이 경주되어 왔다.
항체는 12개의 도메인으로 이루어져있는 150 kDa의 큰 분자이기 때문에, 혈액에 있는 항체들이 확산 또는 대류를 통하여 종양 조직으로 전달되기 어렵다(Baker et al. 2008). 따라서, 이를 극복하기 위해 크기가 감소된 항체의 항원과 결합하는 항원결합절편(antigen binding fragment(Fab), 50 kDa), 단일사슬항체절편(single chain variable fragment(scFv), 30kDa), 중쇄가변부위 단일도메인(heavy chain variable domain (VH), 14kDa)와 같은 항체 절편만 투여하는 시도가 있었다. 다만, 항체의 절편은 Fc 부분이 없고, 크기가 작아서, 생체내 투여 시 다량 신장으로 빠져나가 반감기(Half-Life)가 짧아져서 항체의 효능이 크게 향상되지는 않았다(Behr et al. 1998).
항체가 조직 내에 많이 분포하지 못하는 또 하나의 원인은 항체의 항원 결합능이다. 고형암 치료용 항체는 종양에 관련된 항원(Tumor-Associated antigen), 또는 종양에 과발현되며 종양의 생장에 중요한 타겟에 대하여 높은 친화도를 갖는다. 항체는 특정 항원이 있는 조직에 도달하여도, 항원 발현양이 많은 세포로 이루어진 종양조직에서는 항체의 높은 친화도 때문에 항체가 종양조직 표면의 세포에 발현된 항원에 결합된 채 종양조직 표면에 머무르게 된다(Lee and Tannock, 2010). 또한 결합 후 항원과 함께 세포 내 유입(Endocytosis)되어 세포내에서 파괴된다. 결과적으로 항체가 종양조직표면에는 위치할 수 있지만, 과발현되어 있는 종양항원에 결합하여 파괴되므로, 결국 종양조직내부로의 효율적인 침투가 일어나지 않는다. 따라서 종양혈관에서 멀리 떨어진 조직내부의 종양세포항원에는 항체가 도달할 수가 없게 되어, 종양성장억제 활성이 감소하고, 항체 내성과 종양 재발을 유도할 수 있다. 이를 극복하기 위하여, 친화도를 조절하거나, 반감기를 늘리기 위한 연구가 진행되고 있다(Dennis et al. 2007).
항체의 종양조직 내부로의 침투 및 분포를 방해하는 종양조직의 생리학적 성질은 크게 4가지로 분류될 수 있으며, 이는 내피 장벽(Endothelial Barrier), 높은 종양 조직 내 유압(interstitial fluid pressure), 기질 장벽(Stromal impediment), 상피 장벽(Epithelial Barrier)이다.
내피 장벽(Endothelial Barrier)에 있어서, 종양은 급격하게 성장하는 속도에 따라 많은 양의 영양분을 공급받기 위해 혈관 주위에 위치한 혈관내피세포 생장을 촉진시키는 인자(Pro-angiogenic Factor)를 과발현 및 분비한다. 이에 따라 신생혈관이 불균일하게 다량 생성되어 전체적인 혈류의 속도가 감소하게 된다. 이를 극복하기 위해 일혈(Extravasation)을 증가시켜서 치료제가 혈관으로부터 빠져나와 조직으로 분포되게 하는 방법이 있다. 일혈과 관련된 염증반응 사이토카인인 TNF-α 와 IL-2, 일혈을 촉진하는 화학 물질(Promoter chemical drug)과 치료제를 병용투여(Coadministration)하여 종양 조직으로 약물전달을 증진시킨 사례가 있다(Marcucci et al. 2013). 하지만 이러한 시도들은 항체 및 일혈촉진제의 두 가지 물질을 생산하여야 한다는 점에서 실용화 및 임상실험에 어려움이 있다.
높은 종양 조직 내 유압(interstitial fluid pressure)은 약물이 혈관에서부터 조직으로 대류 되기 위한 압력 차가 작거나 심지어 조직의 유압이 혈액의 유압보다 높은 상황으로부터 야기된다. 이는 정상조직과는 달리, 종양조직에 림프관이 부재하여 조직내부 유체가 축적됨으로써 주로 발생하고, 비정상적인 혈관생성(abnormal angiogenesis)도 기여한다. 이를 극복하기 위해서 혈관내피세포 생장을 촉진시키는 인자, 특히 혈관내피세포 생장인자-A(VEGF165A)의 작용을 막아 신생혈관 생성을 억제하여 혈관을 정상화하는 방법 또는 혈관의 유압을 증가시키는 방법이 시도되었다. 혈관의 유압을 증가시키는 방법은 혈장 단백질인 알부민을 항체와 병용 투여하여 혈관의 삼투압을 증가시켜 항체의 종양조직 전달효과를 향상시킨 사례가 있다(Hofmann et al. 2009).
기질 장벽(Stromal impediment)은 항체가 미세혈관으로 빠져 나와 조직으로 대류될 때 만나는 세포 외 기질 장벽(Extracellular matrix barrier)으로써 주로 콜라겐(Collagen)과 히알루로난(Hyaluronan)으로 구성되어 있다. 세포 외 기질에 따라 종양의 모양은 크게 영향을 받는다. 그에 따라 약물이 잘 분포되는 곳과 그렇지 못한 곳의 차이가 나기 때문에 약물 분포가 불균일하게 된다. 또한 세포 외 기질의 발현 양이 많아지면 고형암 압박(Solid stress)으로 높은 세포 밀도로 인한 종양 조직 유압이 상승하게 된다. 이를 극복하기 위한 접근 방법은 종양 조직 세포의 사멸을 유도하여 종양 조직 내 세포밀도를 줄이는 방법이 있다. 또한 종양 조직의 콜라겐을 분해하는 효소(Collagenase)를 처리하여 고형암 압박을 줄여서 대조군과 비교하여 약물전달 효과를 약 2배 높힌 사례가 있다(Eikenes et al. 2004).
상피 장벽(Epithelial Barrier)은 종양조직 상피세포들의 세포-세포간 접착 인자들이 빽빽하게 세포 간극을 채우고 있어 치료제가 세포 사이로 확산 또는 대류가 일어나지 못하게 된다. E-카데린(E-cadherin)은 이러한 세포-세포간 접착의 주요 인자로 알려져 있다. 이러한 E-카데린을 감소 시키는 물질이 바이러스(Adenovirus-3)에서 발견되어, 바이러스를 구성하는 단백질 중 세포의 E-카데린을 감소시키는 활성을 가진 부분(JO-1)만 항체와 병용 투여하여 항체의 항암효과를 증진시킨 사례가 있다(Beyer et al. 2011).
또한 항체의 종양조직 침투를 증진시키고자 종양혈관세포 및 종양세포에 과발현되는 뉴로필린(NRP, Neuropilin)에 결합하는 펩타이드를 이용하는 방법이 있다. 뉴로필린에 결합하는 펩타이드를 이용한 방법중의 하나는 iRGD 펩타이드를 항체와 함께 병용투여(Co-administration)하는 것이다 (Sugahara et al. 2010). 하지만, 펩타이드 병용투여 방법의 경우, 펩타이드의 작은 분자의 크기에서 기인한 약물동태학적(pharmacokinetics)으로 매우 짧은 반감기(half-life)때문에 실제 환자에게 투여하는 양과 투여횟수가 매우 많아야 한다. 더욱이 병용투여의 불가피한 과정인 치료제 및 종양투과작용 물질을 각각 생산해야 함으로써 산업적으로 실용 가능성이 낮다. 이를 극복하기 위한 최근의 기술은 단일클론항체의 중쇄 C-말단에 뉴로필린과 결합하는 A22p 및 TPP11 펩타이드를 융합하여, 항체의 긴 반감기를 그대로 이용하고, 항체의 종양조직 침투를 증진시킨 예가 있다(kim et al. 2015).
뉴로필린은 막투과성 당단백질(transmembrane glycoprotein)으로서, 뉴로필린1 및 뉴로필린2의 두 가지 형태가 있다(Kolodkin et al. 1997). 뉴로필린은 세포밖 a1, a2, b1, b2, MAM 도메인과 세포내 PDZ 결합 도메인으로 구성되어 있다(Appleton et al. 2007). 뉴로필린은 정상세포에 매우 미약하게 발현되는 반면, 대부분의 종양혈관 내피세포, 고형암 세포, 혈액종양 세포에 과발현되어 있다(Grandclement, C. and C. Borg 2011). 뉴로필린은 VEGF 패밀리 리간드 결합에 의해 VEGFRs(VEGF receptors)들의 공수용체(coreceptor)로 작용한다. 특히 NRP1은 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3의 공수용체로 작용하여 다양한 VEGF 리간드와 결합함으로써, 종양조직에서 신혈관생성(angiogenesis), 세포 생존, 이동/부착(migration & adhesion) 및 침윤(invasion) 등에 기여한다. 반면 NRP2는 VEGFR2, VEGFR3의 공수용체로 작용하여 림프관 형성(lymphangiogenesis) 및 세포부착(adhesion)에 기여한다. 또한 뉴로필린1/2는 Plexin family receptors의 공수용체로 작용하여 분비된 세마포린 3계열 리간드(class 3 semaphorins : Sema3A, Sema3B, Sema3C, Sema3D, Sema3E, Sema3F, Sema3G) 리간드와 결합한다. 뉴로필린은 기능성 세포내 도메인이 없어 리간드가 결합하더러도 단독으로 활성이 없고, 공수용체인 VEGF 수용체 또는 플렉신의 공동수용체를 통해 신호가 전달된다고 알려져 있다. Sema3는 뉴로필린, 플렉신 수용체와 2:2:2로 결합하여 작용한다. 하지만, 많은 연구결과들이 뉴로필린 단백질이 VEGF 수용체 또는 플렉신의 공동수용체와의 상호작용 없이도 단독적인 신호전달을 할 수 있음을 보여주고 있다. 최근에 VEGF165A에 의해 뉴로필린1 단독으로 혈관투과성을 활성화시킬 수 있다는 보고가 있지만, 이에 대한 정확한 분자기전은 아직 불명확하다(Lise Roth et al. 2016).
뉴로필린과 공수용체의 작용이 뉴로필린만 타겟팅 하였을 때에도 억제되는 사례들이 보고 되어 있다. 예를 들어, 항-뉴로필린1 항체의 경우, VEGFR2와 뉴로필린1에 결합한다고 알려진 VEGA-A와 뉴로필린1에만 경쟁적으로 결합하며, VEGFR2의 작용인 신혈관생성(angiogenesis), 세포 생존, 이동/부착(migration & adhesion) 및 침윤(invasion)의 억제 기능을 가진다고 보고되어 있다(Pan Q et al. 2007). 항-뉴로필린2 항체의 경우, VEGFR3와 뉴로필린2에 동시에 결합한다고 알려진 VEGA-C와 뉴로필린2에 경쟁적으로 결합하며, VEGFR3의 작용인 림프관 형성(lymphangiogenesis) 및 세포부착(adhesion)의 억제 기능을 가진다고 보고되어 있다(Caunt M et al. 2008).
뉴로필린에 결합하는 VEGF 리간드 패밀리 및 Sema3 계열 리간드의 C-말단 부위는 뉴로필린의 b1 도메인에 있는 소위 아르지닌 결합포켓(Arginine-binding pocket)에 결합한다(MW Parker et al. 2012). 이 결합은 리간드의 C-말단 부위에 공통적으로 -R/K-x-x-R/K (R=Arginine, K=lysine, x=any amino acids) 모티프에 의해서 일어난다. 상기 모티프에서 벗어나는 아미노산 서열으로 돌연변이를 유도하면 리간드들은 뉴로필린과의 결합이 감소하거나 결합을 못하여, 생물학적 활성이 없어진다. 특히 C-말단 잔기에 양이온성 아르지닌(Arg) 또는 라이신(Lys)은 결합에 매우 필수적이어서, 이를 다른 아미노산 잔기로 치환하면, 뉴로필린과의 결합이 상실되고, 생물학적 활성이 없어진다. 따라서, 이러한 뉴로필린 리간드들의 C-말단 부위 -R/K-x-x-R/K 모티프의 필수성을 C-말단 규칙(C-end rule/CendR)이라 칭한다(Teesalu et al. 2009). C-말단 규칙 서열을 지닌 단백질 혹은 펩타이드는 C-말단의 아르지닌(Arg) 혹은 라이신(Lys) 잔기로 뉴로필린과 결합할 수 있다(Zanuy et al, 2013).
뉴로필린의 리간드들 외에도, 뉴로필린의 b1 도메인의 아르지닌 결합포켓(Arginine-binding pocket)에 결합하는 펩타이드들은 거의 모두 상기 -R/K-x-x-R/K 모티프를 갖는 아미노산 서열을 가진다(Teesalu et al. 2009). 뉴로필린에 결합하여 병용투여한 약물의 종양조직 침투성을 증가시키는 iRGD 펩타이드와 항체의 중쇄 말단에 융합되어 융합항체의 종양조직 침투성을 증가시키는 A22p 펩타이드도 상기 C-말단 규칙을 따르는 아미노산 서열을 가진다(Sugahara et al. 2010 ; Shin et al. 2014).
따라서 본 발명자는 C-말단 규칙을 따르지 않으면서 뉴로필린1의 b1 도메인 아르지닌 결합포켓(Arginine-binding pocket)에 결합하고, 종양조직 침투성을 갖는 신규한 펩타이드를 발굴하고자 하였다.
*이를 위해 C-말단을 아르지닌(Arg) 혹은 라이신(Lys)이 아닌 아미노산이 도입될 수 있도록 항체 중쇄불변부위(Fc) 단편과 융합된 펩타이드 라이브러리를 디자인하고, 이를 효모세포표면에 발현시켜 Fc-융합 펩타이드 라이브러리를 구축한 후, 뉴로필린1 b1도메인에 결합하는 CendR모티프를 벗어난 펩타이드를 선별하고자 하였다.
선별된 펩타이드를 항체의 Fc의 C-말단에 융합시켜 동일 형태로 동물세포로부터 발현 및 정제를 한 후 생화학 및 생물학적 동정을 하였을 때, 정제된 Fc-펩타이드는 뉴로필린1에 선택적으로 결합하고 뉴로필린1에 의한 혈관투과성(Vascular permeability)을 유도시키는지를 확인하고, 기존의 뉴로필린1의 b1 도메인 아르지닌 결합포켓에 결합한다고 알려진 야생형 리간드인 VEGF165A와 경쟁적으로 아르지닌 결합포켓에 결합하는 것을 확인하여 선별된 Fc-펩타이드가 뉴로필린1의 아르지닌 결합포켓에 결합한다는 것을 확인하고자 하였다.
추가적으로, Fc-펩타이드는 뉴로필린1을 과발현하는 종양조직에 선택적으로 축적되고 종양조직 내부로의 침투능이 증진시키는지, 또한 상기 C-말단 규칙을 벗어난 펩타이드의 뉴로필린1에 대한 친화도를 향상시켰을 때 뉴로필린1에 의한 혈관투과성이 더욱 증진된다는 점을 확인하고, 기존의 CendR 모티프를 가지는 펩타이드와 유사한지를 확인함으로써, C-말단 규칙을 벗어난 펩타이드를 이용하여 뉴로필린1에 의한 생물학적 활성을 통해 종양조직에 선택적으로 축적되고 종양조직 내부로의 침투능이 증진된 본 발명에 따른 펩타이드 및 이러한 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 항체, 소분자 약물, 나노입자, 리포좀, 또는 핵산을 포함하는 융합 단백질, 항체, 나노입자, 리포좀, 항체 기술을 개발하고자 하였다.
본 발명의 한 측면에서, 뉴로필린1에 특이적으로 결합하는 펩타이드로서, 기존의 NRP1에 결합하는 기존의 리간드 및 펩타이드에 요구되는 -R/K-x-x-R/K 모티프(소위, C-말단 규칙(C-end rule/CendR))을 가지지 않고도 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 항체, 소분자 약물, 나노입자, 리포좀 또는 핵산을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 또는 이 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 항체, 소분자 약물, 나노입자, 리포좀, 또는 핵산을 포함하는 암 또는 신생혈관 관련 진환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 이 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 항체, 소분자 약물, 나노입자, 리포좀, 또는 핵산을 포함하는 암 또는 신생혈관 관련 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 C-말단 규칙(C-end rule/CendR))을 가지지 않으면서, NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 뉴로필린1(NRP1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드로서,
상기 펩타이드는 C-말단에 하기의 아미노산을 포함하고,
X1-X2-X3-X4-X5
상기 식에서 X1 내지 X4는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 서열이고, 상기 X5는 아르지닌 또는 라이신 이외의 임의의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 항체, 소분자 약물, 나노입자, 리포좀 또는 핵산에 대한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드, 상기 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 상기 펩타이드가 융합된 나노입자, 상기 펩타이드가 융합된 리포좀, 상기 펩타이드가 융합된 소분자 약물 또는 상기 펩타이드가 융합된 핵산을 포함하는 암 또는 신생혈관 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드, 상기 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 상기 펩타이드가 융합된 나노입자, 상기 펩타이드가 융합된 리포좀, 상기 펩타이드가 융합된 소분자 약물 또는 상기 펩타이드가 융합된 핵산을 포함하는 암 또는 신생혈관 관련 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이, 다음을 포함하는 상기 펩타이드를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다: (1) NRP1-b1 아르지닌 결합부위 (Arginine-binding pocket)와 상호 작용할 수 있는 라이브러리를 디자인하는 단계; (2) 상기 단계 (1)의 라이브러리를 항체 중쇄 불변부위에 융합시키는 단계; (3) 상기 단계 (2)의 항체 중쇄 불변부위에 융합된 라이브러리를 NRP1-b1b2와 결합시키는 단계; 및 (4) 상기 단계 (3)의 결합력을 측정하는 단계.
본 발명에 따른, NRP1 결합하는 펩타이드는 C-말단 규칙을 따르지 않는 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명에 따른 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이 펩타이드가 융합된 단백질은 NRP1과 결합하는 특성을 갖게 되어, 종양조직에 특이적으로 축적되고, 종양혈관내피세포의 세포간격을 넓혀 혈관밖 유출을 증진시키고, 종양조직내부에서도 세포간극을 조절하여 종양 조직 내부로의 침투가 현저히 증가한다. 또한 NRP1에 결합하는 펩타이드가 항체 또는 항체의 단편에 융합된 융합 항체는, 펩타이드가 융합되지 않은 대조군 항체 또는 항체의 단편에 비해, 같은 용량으로 투여됐을 때 종양조직에 특이적으로 축적되고 종양 조직 내부로의 침투가 증가하여, 생체내에서 현저히 증가된 종양억제 활성을 보인다.
본 발명에 따른 NRP1에 결합하는 펩타이드가 융합된 항체 또는 그의 단편은 원래 항체고유의 항원결합능을 유지하면서, 고효율로 융합항체를 종양 조직에 축적되고 종양조직 내부로의 침투를 촉진시키는 특성을 가짐으로써, 종양 치료 및 진단에 높은 효과를 기대할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 NRP1에 결합하는 펩타이드가 융합된 항체의 단편은 VEGF165A의 NRP1과의 결합을 억제하여 VEGF165A에 의한 신생혈관형성을 억제하는 특성을 가질 수 있을 것으로 기대하며, 종양의 성장과 전이, NRP1과 관련한 면역질환 및 면역세포조절, 연령관련 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 류마티스성 관절염 등과 같은 질병 등의 다양한 질병의 치료 및 진단에도 활용을 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드가 융합된 항체 또는 그의 단편은 펩타이드가 융합되지 않은 야생형 항체와 유사한 생산 수율을 나타내며 융합 항체 또는 이의 단편은 원래 야생형 항체가 지니는 항원 결합능, 중쇄불변부위(Fc)의 고유기능인 protein A 및 protein G에 대한 결합능이 보존되어 생산에 있어서 기존항체에 비해 추가되는 비용이 없고 항체의 항암 활성을 유지하는 특성을 지닌다.
도 1은 뉴로필린1(NRP1) 및 2(NRP2)의 구조를 도식화 한 것이다.
도 2는 C-말단 규칙(C-end rule/CendR)을 따르고 NRP1의 b1도메인에 위치한 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 결합하는 리간드(VEGF-A 패밀리, Sema3)와 뉴로필린의 결합을 도식화한 것과 각 리간드들의 C-말단 서열을 분석한 것이다. 리간드들의 C-말단 부위 서열이 모두 C-말단 규칙 -R/K-X-X-R/K에 해당된다.
도 3은 NRP1과 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질 및 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질과 뉴로필린1의 결합 복합체를 도식화한 것이다.
도 4은 SEMA3A의 C-말단의 12개의 잔기가 해당되는 부분으로부터 8개이 잔기가 해당하는 부분에 동의코돈(degenerate codon)인 VVM(ACG/ACG/AC) 및 NHC(ACGT/ACT/C)를 넣어 라이브러리를 구축하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 5는 C-말단 규칙을 따르지 않고 NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 골라내기 위한 선별 전략을 나타낸 모식도이다.
도 6은 선별된 단일 클론인 Fc-V12가 세포 표면에 발현되어 있을 때, 바이오틴화된 NRP1-b1b2 및 NRP1-b1b2 돌연변이 단백질에 대한 결합을 유세포분석(Flow cytometry)로 동정한 결과이다.
도 7은 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질을 발현하기 위한 벡터의 개열지도의 예이다.
도 8은 동물세포에서 발현 정제된 Fc-V12의 NRP1 및 NRP2 대한 결합능과 결합부위를 확인한 실험 결과이다.
도 8a는 Fc-V12의 NRP1-b1b2, NRP2-b1b2 및 각 단백질의 아르지닌 결합 포켓이 붕괴된 돌연변이 단백질에 대한 결합력을 측정한 ELISA 실험 결과이다.
도 8b는 Fc-V12가 VEGF165A와 NRP1에 경쟁하여 결합하는 지 확인하여 NRP1의 b1도메인에 위치한 아르지닌 결합 포켓에 특이적으로 결합하는지 알아보기 위한 경쟁적 ELISA(Competitive ELISA) 실험 결과이다.
도 9은 Fc-V12의 혈관 내피세포주인 HUVEC 세포에 발현된 NRP1 및 NRP2 대한 결합능 확인과 공초점 현미경(confocal microscopy)분석을 통해 NRP1과의 중첩(Co-localization) 및 세포내 유입능(Endocytosis)을 확인한 실험결과이다.
도 9a는 Fc-V12가 혈관 내피세포(HUVEC)에 발현된 NRP1에 선택적으로 결합함을 NRP1과 NRP2의 siRNA를 이용해서 확인한 유세포 분석 실험 결과이다.
도 9b는 Fc-V12가 세포 표면에 발현된 NRP1에 결합하는 지 확인하기 위해, 혈관 내피세포(HUVEC)를 이용한 공초점 현미경 분석을 통해 Fc-V12와 세포 표면의 NRP1과의 중첩(co-localization)을 관찰한 결과이며 NRP1에 의한 세포내 유입능(endocytosis)을 확인하기 위해 섭씨 4도와 37도에 각각 관찰한 결과이다.
도 10은 Fc-V12가 혈관 내피세포(HUVEC)의 투과능을 향상시키는지 확인하기 위하여, 트렌스웰 어세이(Transwell assay)를 수행한 결과이다.
도 11은 Fc-V12의 실제 종양 조직 내의 침투능을 확인하기 위한 면역조직화학(Immunohistochemistry) 결과이다.
도 12는 Fc-V12와 병용 투여한 독소루비신(doxorubicin)의 종양조직 내 침투능을 확인하기 위하여, 면역조직화학(Immunohistochemisty) 실험을 수행한 결과이다.
도 13은 Fc-V12의 C-말단 서열을 발린이 아닌 다른 아미노산으로 치환했을 때 NRP1의 결합능을 HUVEC세포를 이용한 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 13a는 Fc-V12의 C-말단 서열을 발린이 아닌 다른 아미노산으로 치환한 돌연변이 단백질들을 동물세포로부터 정제한 후 비환원조건에서 SDS-PAGE분석을 한 결과이다.
도 13b는 Fc-V12의 C-말단 서열을 발린이 아닌 다른 아미노산으로 치환한 돌연변이 단백질들의 NRP1 결합능을 확인하기 위해 HUVEC세포를 이용한 유세포 분석 실험의 결과이다.
도 14는 Fc-V12의 5개의 C-말단 서열(8-12)를 고정하고, N-말단 서열(1-7)을 글라이신 또는 세린으로 치환한 돌연변이 단백질과 Fc-V12의 NRP1에 대한 결합능을 확인하기 위한 ELISA실험의 결과이다.
도 15는 V12 펩타이드의 NRP1에 대한 친화도 향상을 위한 라이브러리 구축을 나타낸 모식도이다.
도 16은 V12 펩타이드 유래의 NRP1에 대한 친화도가 향상된 NRP1 결합 펩타이드들의 생화학적 생물학적 동정을 수행한 결과이다.
도 16a는 항체 중쇄불변부위와 NRP1에 대한 친화도가 향상된 V12 펩타이드 유래의 펩타이드들이 융합된 단백질들인 Fc-V12-14, Fc-V12-15, Fc-V12-33 및 Fc-V12-44가 혈관 내피세포(HUVEC)에 발현된 NRP1에 선택적으로 결합함을 NRP1과 NRP2의 siRNA를 이용해서 확인한 유세포 분석 실험 결과이다.
도 16b는 Fc-V12보다 NRP1에 대한 친화도가 향상된 Fc-V12-33이 NRP1에 의존적으로 혈관 내피세포(HUVEC)의 투과능을 향상시키는지 확인하기 위하여 수행한 트렌스웰 어세이(Transwell assay)를 결과이다.
도 16c는 Fc-V12-33이 VEGF165A와 NRP1에 경쟁하여 결합하는 지 확인하여 NRP1의 b1도메인에 위치한 아르지닌 결합 포켓에 특이적으로 결합하는지 알아보기 위한 경쟁적 ELISA(Competitive ELISA) 실험 결과이다.
도 17은 Fc-V12-33에서 항체 Fc절편과 V12-33 펩타이드를 연결할 때 사용되는 링커에 따른 NRP1에 대한 결합능의 변화를 확인하기 실험이다.
도 17a는 Fc-V12-33의 링커 길이 및 종류, 유무에 따른 클론들의 명칭과 이를 동물세포로부터 정제 후 SDS-PAGE를 통해 분석한 결과이다.
도 17b는 Fc-V12-33의 링커 길이 및 종류, 유무에 따른 클론들의 NRP1에 대한 결합능을 확인한 ELISA 실험을 통해 분석한 결과이다.
도 18은 C-말단 규칙을 벗어나면서 NRP1에 결합할 수 있는 펩타이드를 이용한 융합단백질인 Fc-V12 및 Fc-V12-33의 생물학적 효능을 종합적으로 나타낸 모식도이다.
본 발명의 일 양상은 C-말단 규칙(C-end rule/CendR))을 가지지 않고도 뉴로필린1에 특이적으로 결합하는 펩타이드로서, 기존의 NRP1에 결합하는 기존의 리간드 및 펩타이드에 요구되는 -R/K-x-x-R/K 모티프(소위, C-말단 규칙(C-end rule/CendR))와 상이한 모티프를 포함하는 NRP1에 특이적으로 결합하는 특정 아미노산 말단을 포함하는, 펩타이드를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 일 관점에서 뉴로필린1(NRP1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드로서,
상기 펩타이드는 C-말단에 하기의 아미노산을 포함하고,
X1-X2-X3-X4-X5
상기 식에서 X1 내지 X4는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 서열이고, 상기 X5는 아르지닌 또는 라이신 이외의 임의의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 펩타이드에 관한 것이다.
상기 펩타이드에서 C-말단 X5의 아미노산이 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 및 티로신으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 구체예에서, 상기 C-말단 X5의 아미노산은 발린일 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 1)V12 및 V12-33라고 명명된 서열은 현재까지 C말단 (즉, X5 위치)에 발린 이외에 다른 아미노산을 추가하였을 때 뉴로필린1에 대한 결합능이 현저히 감소한 반면에 V12 및 V12-33의 경우에는 C 말단 (X5 위치)에 발린을 가질 경우 뉴로필린1에 대해 기존의 CendR 모티프를 가지는 펩타이드 만큼의 친화력을 보였다.
상기 펩타이드는 CendR 모티프와는 연관성이 없는 펩타이드로, R-x-x-R이 아닌, x-x-x-V 에 관한 것이다 (X는 임의의 아미노산). CendR 모티프와는 무관하지만 CendR 과 유사한 NRP1 결합능과 생물학적 활성을 보인다. CendR 모티프를 따르는 펩타이드의 경우에는 동물 세포에서 펩타이드 또는 펩타이드가 융합된 단백질을 발현할 시에 C말단에 존재하는 아르지닌 또는 라이신이 절단될 수 있고, 이에 따라 뉴로필린1에 대한 결합능이 현저히 낮아질 가능성들이 제시되고 있다. 이러한 가설을 지지하는 예로, 동물세포에서 이뮤노글로불린 이소타입 1 (IgG1) 항체를 발현할 시에 C말단의 라이신 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase)에 의해 제거되는 현상이다. IgG1 항체의 C말단 서열은 염기 서열상으로 -SPGK를 포함하는 서열을 지니고 있으나, 동물세포에서 IgG1 항체를 발현하고 정제한 후에 아미노산 서열을 분석하였을 때 C말단의 라이신이 제거된 형태인 -SPG 또는 SPGK 서열을 포함하는 것으로 밝혀졌으며 전체 중 약 80% 이상의 IgG 항체가 C말단의 라이신이 제거된 -SPG 서열을 지니고 있는 것으로 보고된바 있다.
이러한 현상의 이유로써 동물세포내의 세포소기관인 소포체 또는 골지체에 존재하는 카르복시펩티다아제의 효소활성에 의한 것으로 최근에 밝혀졌고, 여러 종류의 카르복시펩티다아제의 종류 중에 CpB, CpE, CpM, CpN, CpD에 의해 단백질들의 C말단에 존재하는 아르지닌 또는 라이신과 같은 아미노산이 효소의 기질로 이용되어 단백질로부터 제거되는 현상이 보고 되었으며, 심지어 혈액내에 존재하는 카르복시펩티다아제들에 의해서도 IgG1 항체의 C말단에 존재하는 라이신이 제거될 수 있음이 밝혀졌다.
위와 같이, CendR 모티프를 지닌 펩타이드를 동물세포에서 발현할 시에 카르복시펩티다아제들에 의해 C말단에 존재하는 아르지닌 또는 라이신이 제거될 가능성이 있으며, 이는 뉴로필린1에 대한 결합능 감소 및 생물학적 활성 감소를 야기할 수 있다. 또한, 동물세포주 또는 단백질 생산배치에 따른 C말단의 아미노산 서열의 비균질성(heterogeneity)문제로 인하여 동물세포로부터 생산된 펩타이드 또는 펩타이드가 융합된 단백질의 생물학적 동등성의 일관성에 문제가 있을 수 있다. 이를 해결하기 위한 수단으로 뉴로필린1과 결합할 수 있는 새로운 모티프의 개발을 고려할 필요가 있다.
그러나, 현재까지 C말단에 아르지닌 또는 라이신을 포함하지 않는 뉴로필린1 결합 펩타이드는 보고된 바가 없으며, 최근 연구에서는 CendR 모티프를 포함한 뉴로필린1 결합 펩타이드로 알려진 RPARPAR, VEGF-A 유래 펩타이드인 VEGF-C7(RCDKPRR) 및 Sema3F 유래 펩타이드(KPPRNRR)의 C-말단에 알라닌(Ala)과 같은 다른 아미노산으로 치환 또는 추가하였을 때 본래의 뉴로필린1 결합능을 상실하는 사례들만 보고되어 근본적인 해결책이 제시되지 않고 있다.
하나의 실시예에서, 상기 펩타이드는 C 말단에 하기의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
X1-X2-X3-X4-X5
상기 식에서 X1 내지 X4는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 서열이고, 상기 X5는 아르지닌 또는 라이신이 이외의 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 바람직하게는 C-말단의 X5는 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 및 티로신으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 발린일 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드는 신규한 모티프 즉, x-x-x-x-V 모티프를 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 펩타이드는 5 내지 50개의 아미노산으로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 12개 이하, 더욱 바람직하게는 5개의 아미노산으로 구성될 수 있다.
구체예에서, 상기 펩타이드는 서열번호 7 (KPPRV)의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 1 (HLQESPGKPPRV), 서열번호 3 (RHKGPGQKPPRV), 서열번호 4 (RGRPRRTKPPRV), 서열번호 5 (RPRPPRQKPPRV) 및 서열번호 6 (APRAQSDKPPRV)으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 7 (KPPRV)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용한 링커는 그 종류나 유무를 제한하지 아니하고, 링커를 포함하지 않거나, 경우에 따라서 상기 펩타이드에 링커 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 링커 펩타이드는 글리신 및 세린, 또는 글리신, 알라닌 및 프롤린 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 (GGGGS)n 또는 G(APAPA)n를 포함하고, n은 1 내지 20의 정수일 수 있으나, 이러한 종류에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 펩타이드가 융합된 융합 단백질에 관한 것이다.
상기 융합 단백질은 예를 들어, 항체, 항체의 단편, 면역 글로불린, 펩타이드, 효소, 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 및 화학적으로 개질된 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 단백질에 펩타이드가 융합된 형태일 수 있다.
상기 항체의 단편은 항체의 중쇄불변영역 절편(Fc), 중쇄불변영역 도메인 (CH1, CH2, 또는 CH3)절편, 항원결합절편(antigen binding fragment(Fab)), 단일사슬항체절편(single chain variable fragment(scFv)), 중쇄가변영역 절편(VH), 경쇄불변영역 절편(CL) 또는 경쇄가변영역 절편(VL)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체예에서는 항체 중쇄불변부위(Fc)의 C-말단(Carboxy-terminus)에 융합된 펩타이드 라이브러리를 디자인하여, 이를 효모세포표면에 발현시켜 Fc-융합 펩타이드 라이브러리를 구축한 후, 뉴로필린1의 b1 도메인에 아르지닌 결합 포켓에 선택적으로 결합하는 클론을 선별하여 도출된 펩타이드를 분리, 동정하였다.
상기 Fc-펩타이드 라이브러리에서 뉴로필린1에 특이적이며, 특히 아르지닌 결합 포켓에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 분리하기 위해, 뉴로필린1의 b1b2 도메인 단백질을 이용하여 선별함과 동시에 뉴로필린1의 b1 도메인의 아르지닌 결합 포켓이 점돌연변이(point mutation)에 의해 붕괴된 뉴로필린1의 b1b2 돌연변이 단백질을 경쟁자(competitor)로 이용하여, 선별과정을 진행하였다.
또한, 본 발명의 일 구체예에서는 뉴로필린1에만 고특이적/고친화도로 결합하는 펩타이드가 2가 형태로 뉴로필린1과 결합하여 생물학적 활성을 갖도록, 항체 중쇄불변부위(Fc)의 C-말단(Carboxy-terminus))에 15개의 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)X3 아미노산 서열로 이루어진 링커로 융합된 Fc-융합 펩타이드를 구축하여, 뉴로필린1에 의존적인 혈관투과성을 유도하고 종양 침투성 활성을 동시에 지닌 것을 펩타이드를 분리, 동정하였다. 그러나 본 발명에서 사용한 링커는 그 종류나 유무를 제한하지 아니한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "종양 침투성"이란 예를 들면 1) 종양 특이 혈관내피세포, 종양세포 또는 조직을 특이적으로 인식하여 축적되고, 2) 종양혈관내피세포의 세포간극을 넓혀 혈관밖 유출(Extravasation)을 촉진시키고, 3) 종양내부에서 종양세포간극을 조절하여 종양내부로 깊숙이 침투를 촉진하는 특성 중 어느 하나의 특성을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 펩타이드는 종양 침투성 펩타이드로, 상기 종양 침투성 펩타이드는 펩타이드의 C-말단이 종래의 C-말단 규칙 C-end rule/CendR)에서 벗어난, 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 또는 티로신으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 발린(Val)일 수 있으나 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 펩타이드는 5 내지 50개의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 12개 이하, 더욱 바람직하게는 5개의 아미노산으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 구체예에서 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 서열번호 1 내지 7의 구체적인 서열정보는 하기와 같다.
Figure pat00001
본 발명에 따른 상기 펩타이드의 가장 바람직한 예는 펩타이드의 C말단의 서열이, 서열 번호 1 내지 7과 같이 공통적인 아미노산 서열인 라이신-프롤린-프롤린-아르지닌-발린(K-P-P-R-V)으로 구성된 펩타이드이다.
본 명세서에서 '융합'은 "융합"은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 비제한적인 생물학적 활성물질 예를 들어, 상기 항체, 항체 단편, 단백질, 소분자 약물, 나노입자, 리포좀, 또는 핵산에 본 발명에 따른 상기 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합을 포함하는 의미이다.
예시적으로 본 발명에 따른 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 비제한적인 생물학적 활성물질 예를 들어, 융합 단백질, 항체, 소분자 약물, 나노입자 또는 리포좀의 연결 (link), 결합 (binding) 또는 접합 (conjugate) 형태를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 세포 융합, 화학적 접합, 재조합 DNA 기술을 통해 융합이 수행될 수 있다.
상기 융합은 공유결합 또는 비공유결합에 의해 형성이 유도될 수 있다. 상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합일 수 있다. 상기 비분해성 결합으로는 아미드 결합 또는 인산화 결합이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 융합은 링커 펩타이드(linker peptide)에 의할 수 있으며, 예를 들어 링커 펩타이드는 예를 들면 항체 중쇄불변부위(Fc) 단편의 C-말단에 결합할 수 있다.
상기 비공유결합은 원자 또는 분자가 공유결합 이외의 상호작용에 의해 집합체를 형성할 때 결합력이 약한 상호작용을 의미하는 것으로, 정전기적 결합 (electrostatic interaction), 소수성 결합 (hydrophobic interaction), 수소 결합 (hydrogen bonding), 양이온-π 결합 (cation-π interaction), 반데르발스 결합(Van Der Waals interaction)에 의한 상호작용을 포함한다.경우에 따라서, 상기 일 양상의 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 링커 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 5 내지 50개의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 20개, 더욱 바람직하게는 5 내지 12개의 아미노산으로 이루어질 수 있다.
또한, 상기 링커링커 펩타이드는 글라이신(glycine), 또는 세린(serine)으로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 상기 링커링커 펩타이드의 서열은 (GGGGS)n의 아미노산 서열로 이루어진 것(단, 상기 n은 각각 독립적으로 정수 1 내지 20이다)일 수 있고, 더욱 바람직하게는(GGGGS)3의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 그러나 본 발명에서 사용한 링커는 그 종류나 유무를 제한하지 아니하며 본 발명의 구체예에서 상기 (GGGGS)n을 포함한 링커만 아니라 G(APAPA)n의 아미노산 서열로 이루어진 것(단, 상기 n은 각각 독립적으로 정수 1 내지 20이다), 또는 링커를 포함하지 않아도 된다.
본 발명의 구체예에서, 링커 펩타이드가 결합한 상태 또는 결합하지 않은 상태의 펩타이드 서열은 서열번호 8 내지 14의 아미노산 서열로 이루진 것일 수 있으나 이에 한정되지는 아니한다.
Figure pat00002
본 발명의 다른 양상은 상기의 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 소분자 약물, 나노입자 또는 리포좀을 제공한다.
본 발명에 있어서 소분자 약물은 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니며 질병의 치료제로서 활성도를 지니는 유기 화합물, 무기 화합물 또는 유기금속 화합물을 나타내는 것으로 본원에서 광범위하게 사용된다. 본원에서 소분자 약물은 올리고펩티드 및 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니는 그 밖의 바이오분자(biomolecule)를 포함한다.
본 발명에 있어서, 나노입자(nanoparticle)는 직경 1 내지 1000 nm 크기를 갖는 물질들로 이루어진 입자를 의미하며, 상기 나노 입자는 금속 나노 입자, 금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 금속/금속 코어쉘 복합체, 금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 비금속 쉘로 구성되는 금속/비금속 코어쉘 또는 비금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 비금속/금속 코어쉘 복합체일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 금속은 금, 은, 구리, 알루미늄, 니켈, 팔라듐, 백금, 자성철 및 그의 산화물로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않으며, 상기 비금속은 실리카, 폴리스티렌, 라텍스 및 아크릴레이트 계열의 물질로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명에 있어서, 리포좀은 자기 스스로 회합할 수 있는, 수성 내부 구획을 둘러싸는 하나 이상의 지질 이중층 막으로 구성된다. 리포좀은 막 타입 및 그 크기에 의하여 특정 수 있다. 작은 유니라멜라 소포(SUV)는 단일막을 갖고 20nm 내지 50nm의 직경을 가질 수 있다. 큰 유니라멜라 소포(LUV)는 50nm이상의 직경을 가질 수 있다. 올리고라멜라 큰 소포 및 멀티라멜라 큰 소포는 다중, 일반적으로 동심원, 막 층을 가지고 직경이 100nm 이상일 수 있다. 여러 비동심원 막을 가진 리포좀, 즉 더 큰 소포 내에서 포함된 여러 작은 소포는 멀티소포성 소포(multivesicular vesicle)라고 한다.
또한, 상기 펩타이드는 뉴로필린1에 2가 (bivalent) 또는 그 이상으로 결합할 수 있다.
본 발명의 상기 융합단백질은 상기 펩타이드가 결합한 완전한 형태의 항체일 수 있다.
본 발명에서 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합(disulfide bond, SS-bond) 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
"중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명에 있어서, 항체의 단편은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 각각의 도메인 또는 이의 단편을 의미하며, 예를 들면, 항체의 중쇄불변영역 절편(Fc), 중쇄불변영역 도메인 (CH1, CH2, 또는 CH3) 절편, 항원결합 절편(antigen binding fragment(Fab)), 단일사슬항체 절편(single chain variable fragment(scFv)), 중쇄가변영역 절편(VH), 경쇄불변영역 절편(CL) 또는 경쇄가변영역 절편(VL) 또는 이들의 단편일 수 있다. 바람직하게는 상기 항체의 단편은 항체의 중쇄불변영역 절편(Fc)일 수 있다.
또한, 상기 항체의 단편은 단량체(monomer), 이량체(dimer) 또는 다량체일 수 있다.
상기 항체는 단일클론 항체, 비특이적 항체, 비-인간 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단일클론 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE일 수 있으며, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, 또는 IgD 타입일 수 있으며, IgG1 타입일 수 있다. 또한, 상기 항체의 경쇄 불변 영역은 λ 또는 κ 형일 수 있다.
상기 펩타이드는 항체 중쇄불변부위(Fc) 단편에 결합될 수 있다. 바람직하게는 Fc의 C-말단에 결합할 수 있으며, 상기 결합은 링커 펩타이드에 의한 것일 수 있으나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드가 융합된 핵산이다. 상기 핵산은 예를 들어, 단일가닥 또는 이중가닥 DNA , RNA , 소간섭 RNA (siRNA) , shRNA 또는 마이크로 RNA (miRNAs)일 수 있으며, 5 내지 50mer, 10 내지 40mer , 15 내지 30mer, 또는 15 내지 25mer의 길이를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 펩타이드, 종양침투성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 서열번호 1 내지 7 및 서열번호 8 내지 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
상기 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩타이드, 종양침투성 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다. 이는 당업계에 공지된 가혹 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 서열번호 1 내지 7 및 서열번호 8 내지 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
또한 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 서열번호 1 내지 7 및 서열번호 8 내지 14 중 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
한편, 상기 벡터는 본 발명의 NRP1에 특이적으로 결합하는 종양 침투성 펩타이드 뿐만 아니라 상기 펩타이드가 융합된 항체의 단편 또는 항체를 발현할 수 있다. 펩타이드가 융합된 항체 또는 항체의 단편의 경우, 벡터는 펩타이드와 항체 또는 이의 단편이 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 예를 들면, 도 7에 기재된 개열지도를 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 삽입은, 당업계에 널리 알려진 삽입 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.
상기 형질전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
상기 제조방법은 NRP1에 특이적으로 결합하는 종양 침투성 펩타이드(NRP1 specific binding tumor-penetrating peptide, TPP) 뿐만 아니라, 상기 펩타이드가 융합된 항체 또는 이의 단편의 제조를 포함하는 개념이다.
NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 즉 종양 침투성 펩타이드(TPP)가 융합된 항체 중쇄불변부위(Fc) 단편을 제조하는 방법에 대한 예는 아래와 같다.
1) 상기 제조된 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드(TPP)가 융합된 단백질을 항체의 중쇄불변부위 경첩(hinge)-CH2-CH3-linker-TPP의 핵산(nucleic acids) 순서로 클로닝한 재조합 TPP 융합 중쇄불변부위 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 제조된 발현벡터를 세포에 형질전환하여 재조합 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질을 발현하는 단계; 및
3) 상기 발현된 재조합 항체 중쇄불변부위와 선별된 펩타이드가 융합된 단백질을 정제, 회수하는 단계.
또한, 종양 침투성 펩타이드가 융합된 항체의 제조방법에 대한 예는 아래와 같다.
1) VH-CH1-경첩(hinge)-CH2-CH3-linker-TPP의 핵산(nucleic acids)을 클로닝한 재조합 TPP 융합 IgG의 중쇄 부위 및 VL-CL의 핵산(nucleic acids)을 클로닝한 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 제조된 중쇄, 경쇄 발현벡터를 세포에 공동형질전환하여 재조합 IgG-TPP 단백질을 발현하는 단계; 및
3) 상기 발현된 재조합 IgG-TPP 단백질을 정제, 회수하는 단계.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 펩타이드 또는 상기 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 소분자 약물, 나노입자, 리포좀 또는 핵산을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 NRP1과 특이적으로 결합함으로써, 종양에 특이적으로 분포하고 종양 내부로 침투되는 효능을 나타낸다.
또한, 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 뉴로필린1과 특이적으로 결합함으로써, VEGF165A가 뉴로필린1에 결합하는 것과 경쟁한다. 이에 따라 VEGF165A가 뉴로필린1에 결합하여 지니는 신생혈관형성(angiogenesis) 기능을 억제함으로써, 암 치료뿐 만 아니라, 혈관신생 관련 질병에 대한 치료효과를 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 항체는 야생형 항체와 유사한 생산 수율을 나타내며, 항체가 결합하는 항원 및 펩타이드가 결합하는 뉴로필린1의 2종 항원을 동시에 표적할 수 있는 이중특이성 항체의 특성을 지니며 이에 따라 고효율로 항체를 종양 조직으로 도달할 수 있는 특성을 가짐으로써, 암 치료에 높은 효과를 기대할 수 있다.
상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 혈관신생 관련 질병으로는 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막이식 거부, 신생혈관성 녹내장 및 후수정체 섬유증식증, 유행성 각결막염, 비타민 A 결핍, 콘택트 렌즈 과도착용, 아토피성 각막염, 상각막윤부 각막염, 익상편 건선 각막염, 쇼그렌 증후군, 홍반성 여드름, 플릭텐성 각결막염, 매독, 마이코박테리아 감염, 지방 변성증, 화학적 화상, 세균성 궤양, 진균성 궤양, 허피스 단순포진 감염, 대상포진 감염, 원충 감염, 카포시 육종, 무렌 궤양, 테리엔 변연성 각막변성증주변성 각질용해증, 정신적 외상, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반, 다발성 동맥염, 베게너 유육종증, 공막염, 스티브 존슨병, 주변반흔성 방사상 각막절개술 및 각막 이식 거부 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 조성물이 암 또는 신생혈관 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 제조되는 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 암 또는 신생혈관 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 암 또는 신생혈관 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데, 또는 신생혈관 관련 질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 한편, 상기 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 융합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 NRP1에 결합하는 펩타이드 또는 이 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 소분자 약물, 나노입자, 리포좀 또는 핵산을 포함하는 암 또는 신생혈관 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 암 또는 신생혈관 관련 질환의 발병 여부 및 경과를 확인하는 것이다.
상기 NRP1에 결합하는 펩타이드는 영상을 통하여 암을 진단하기 위하여 분자 영상용 형광체와 결합할 수 있다.
상기 분자 영상용 형광체는 형광을 발생시키는 모든 물질을 말하며, 적색이나 근적외선(near-infrared)의 형광을 발광하는 것이 바람직하며, 양자 수득량(quantaum yield)이 높은 형광체가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 분자 영상용 형광체는 상기 NRP1에 결합하는 펩타이드와 결합할 수 있는 형광체, 형광 단백질 또는 기타 영상용 물질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 형광체는 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODYPY), 테트라메틸로드아민(Trtramethylrhodamine), 알렉사(Alexa), 시아닌(Cyanine), 알로피코시아닌(allopicocyanine) 또는 이들의 유도체가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
형광 단백질은 Dronpa 단백질, 형광 발색 유전자(EGFP), 적색 형광 프로테인(red fluorescent protein, DsRFP), 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5 또는 기타 형광 단백질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
기타 영상용 물질은 산화철, 방사성 동위원소 등이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, MR, PET과 같은 영상 장비에 응용될 수 있다.
또한 본 발명은 상기와 같은 펩타이드를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 (1) NRP1-b1 아르지닌 결합부위 (Arginine-binding pocket)와 상호 작용할 수 있는 라이브러리를 디자인하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 라이브러리를 항체 중쇄 불변부위에 융합시키는 단계;
(3) 상기 단계 (2)의 항체 중쇄 불변부위에 융합된 라이브러리를 NRP1-b1b2와 결합시키는 단계; 및
(4) 상기 단계 (3)의 결합력을 측정하는 단계를 포함하는, 상기의 펩타이드를 스크리닝 하는 방법이다.
본 발명의 구체예에서, (1) 단계의 라이브러리 제작은 기존의 항체 중쇄불변부위(Fc) 단편 및 세마포린3A 유래 서열을 주형으로 한 프라이머를 사용하여 PCR를 수행하여, 자연계에 존재하지 않는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 라이브러리를 디자인 하는 것이다.
또한, 본 발명의 구체예에서, 상기 (2) 단계에서는 (1) 단계에서 제작한 라이브러리를 항체 중쇄 불변부위에 융합시킨다. 또한 상기 (3) 단계에서는 상기 중쇄 불변부위에 융합된 라이브러리를 효모 세포 표면에 발현시킨 후, 표적분자인 NRP1-b1b2와 결합시킨다. 이때, 동시에, 뉴로필린1의 b1 도메인의 아르지닌 결합 포켓이 점돌연변이(point mutation)에 의해 붕괴된 뉴로필린1의 b1b2 돌연변이 단백질을 경쟁자(competitor)로 이용하여 뉴로필린1의 b1 도메인의 아르지닌 결합 포켓에 높은 친화도로 결합하는 펩타이드를 선별한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: C-말단 규칙(C-end rule/CendR)을 따르지 않고 NRP1 b1 도메인의 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 특이적으로 결합하는 펩타이드 라이브러리 디자인 및 구축
도 1의 (A) 및 (B)에서 나타난 바와 같이, 뉴로필린은 크게 5가지 도메인으로 구성되어 있는데, N-말단에서부터, a1, a2 도메인은 CUB 도메인으로 분류되며, 세마포린의 Ig-like C2 type 부분이 결합하는 부분이다. 특히 이 부위는 플렉신과 복합체를 형성해 세마포린-플렉신과의 결합력을 증가시키는 역할을 한다. b1, b2 도메인은 FV/VIII 도메인으로 분류되며, VEGF나 세마포린 3 계열의 리간드들의 C-말단 부위가 결합한다. 특히 이 부분에는 헤파린이 결합할 수 있는 부위가 존재하며, (+)를 띄는 잔기가 많은 리간드의 결합을 용이하게 한다. 또한, MAM 은 올리고머화(oligomerization)을 유도하며, TM(trans-membrane domain)은 뉴로필린이 세포 표면에 고정될 수 있게 하고, 세포 내 도메인(cytosolic domain)에는 PDZ(Postsynaptic density 95, Disk large, Zona occludens 1) 도메인과 결합할 수 있는 부위가 존재한다. 이 도메인들 중 특히 b1 도메인은 C-말단 규칙(C-end rule/CendR)가 결합할 수 있는 주머니 모양의 구조를 지니고 있고, 실제로 도 2의 뉴로필린 b1 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 결합하는 리간드인 Sema3s 및 VEGF 패밀리의 C-말단 서열을 분석하였을 때, 모두 C-말단 규칙인 -R/K-X-X-R/K 해당하는 서열이 있다.
뉴로필린과 상호작용하여 종양 조직 투과능을 증진시킨다는 자연의 리간드들은 VEGF165A 혹은 Sema3A 모두 NRP2보다는 NRP1에 선호되어 상호작용한다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명자는 NRP2보다는 NRP1이 종양 조직 투과능과 더 밀접한 관계가 있다고 예상하였고, NRP1이 더욱 바람직한 타켓으로 예상하였다. 따라서, 도 3에 나타난 바와 같이, NRP2에는 결합하지 않고, NRP1-b1의 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 특이적으로 결합하며 C-말단 규칙을 따르지 않는 종양조직 침투 펩타이드(TPP, tumor tissue-penetrating peptide)를 선별하고자 하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여 도 4에 나타낸 바와 같이 기존 Sema3A의 C말단 서열을 (HLQENKKGRNRR) 주형으로 하여 C말단에서부터 7개 잔기가 해당되는 부분(5-11)을 알라닌, 아스파라긴 산, 글루타민 산, 글라이신, 히스티딘, 라이신, 아스파라진, 프롤린, 글루타민, 아르지닌, 세린, 쓰레오닌으로 구성된 동의 코돈(degenerate codon)인 VVM(ACG/ACG/AC)코돈이 포함되게 하고, 마지막 C말단 부분은 라이신 또는 아르지닌이 포함되지 않으며 알라닌, 아스파라긴 산, 페닐알라닌, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 아스파라진, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 발린, 타이로신으로 구성된 동의 코돈(degenerate codon)인 NHC(ACGT/ACT/C)코돈이 포함된 역방향 시발자를 합성하였다. 상기 이용한 동의 코돈인 VVM 코돈은 싸이미딘(Tymidine) 뉴클레오타이드를 포함하지 않기 때문에, 시발자 합성간의 오류나 중합효소 연쇄 반응 시에 생길 수 있는 오류로 인한 프레임쉬프트(frame shift)에 의한 종결 코돈이 생성될 가능성이 극히 낮다. 따라서, 상기 오류로 인해 생길 수 있는 C말단의 아르지닌 또는 라이신의 생성을 최소화할 수 있기 때문에 C-말단 규칙을 벗어나는 NRP1에 결합하는 펩타이드를 찾기에 용이하다고 판단하였다.
또한, 항체 중쇄불변부위(Fc) 절편의 CH3 부분에 정방향 시발자를 합성하였다. 이 정방향 시발자와 역방향 시발자에는 효모세포에서 상동성 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 50 염기쌍이 이상의 벡터의 서열과 동일한 부분을 포함한다. 항체 중쇄불변부위(FC)에 융합시킨 펩타이드 라이브러리 구축에 사용한 시발자의 염기서열은 하기 표 1과 같다.
[표 1] Fc-융합펩타이드 라이브러리 구축에 사용된 올리고뉴클레오타이드 염기서열
Figure pat00003
라이브러리 DNA는 DNA중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하여 준비되었다. 항체 Fc의 C말단에 (G4S)3 링커로 Sema3A의 C말단의 6개 아미노산(HLQENK)을 포함할 수 있도록 제조한 효모 표면 발현 벡터(pCTCON, Colby et al. 2004)를 주형으로 하여 상기 정방향 및 역방향 시발자를 이용하여 DNA를 증폭하였으며, 증폭된 DNA(총 120 ㎍, 12 ㎍/1회 형질전환)는 Fc 효모 표면 발현 벡터를 NheI과 BamHI 제한효소를 처리하여 준비한 벡터 DNA(총 40 ㎍, 4 ㎍/1회 형질전환)와 함께 효모에 전기천공법(electroporation)을 10번 반복해 라이브러리를 구축하였다. 뒤이어, 도 4와 같이 상동성 접합(Homologous recombination)을 통하여 효모세포 내에서 라이브러리와 벡터를 결합하였다. 항체 중쇄불변부위(Fc)에 융합시킨 펩타이드 라이브러리의 크기는 계단식 희석 한 후, 벡터에 존재하는 선별인자에 따른 선택 배지에 자란 콜로니의 수를 측정해 1.3X109 임을 확인 하였다.
실시예 2: 구축된 항체 중쇄불변부위(Fc)에 융합시킨 Fc-펩타이드 라이브러리에서 C-말단 규칙(C-end rule/CendR)을 따르지 않고 NRP1 b1 도메인의 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 특이적으로 결합하는 펩타이드 선별
타겟 단백질인 야생형 NRP1-b1b2(273-586)단백질과 경쟁 단백질인 NRP1-b1b2 돌연변이 단백질(275-595, T297A, S346A, T353A)의 C말단에 바이오틴화를 위한 avi-tag과 Ni-NTA 레진으로 정제를 하기 위한 His-tag을 융합하고, 기존 보고된 방법을 통해 90 %이상의 순도로 준비하였다 (Li and Sousa et al. 2012). 타겟 단백질인 야생형 NRP1-b1b2 단백질은 준비과정 시 바이오틴화를 위해 바이오틴 단백질 리가아제인 BirA 단백질이 포함된 벡터를 같이 대장균에 같이 형질전환시켜 대장균내에서 바이오틴화가 이루어지도록 하였다.
도 5는 NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별내기 위해 사용된 바이오틴화 된 야생형 NRP1 b1b2 단백질과 바이오틴화되지 않은 NRP1 b1b2 돌연변이 단백질의 구조를 도식화한 것이며, 이를 통한 펩타이드 스크리닝 전략을 도식화 한 것이다.
구축된 효모 세포 표면제시 Fc융합 펩타이드 라이브러리와 상기 준비한 NRP1 단백질을 이용하여 1회의 MACS(magnetic activated cell sorting) 및 3회의 FACS(Fluorescence activated cell sorting)를 수행하였다. 바이오틴화 된 1 μM의 NRP1-b1b2를 효모세포표면에 발현된 항체 중쇄불변부위(Fc)에 융합시킨 펩타이드 라이브러리와 37℃에서 1시간 동안 결합시켰다. 바이오틴화 된 NRP1-b1b2와 결합한 효모세포표면에 발현된 항체 중쇄불변부위(Fc)에 융합시킨 펩타이드 라이브러리를 Streptavidin-Microbead(Miltenyi Biotec Inc., Germany)와 4 ℃에서 10분간 결합시킨 후 MACS 를 통해 바이오틴화 된 NRP1-b1b2에 결합하고 클론들을 선별하였다. 다음과정은 바이오틴화 된 100 nM의 NRP1-b1b2와 바이오틴화 되지 않은 1 μM의 NRP1-b1b2 돌연변이 단백질을 1차 MACS를 통해 선별된 항체 중쇄불변부위(Fc)에 융합시킨 펩타이드 라이브러리와 37℃에서 1시간 동안 결합시킨 후, PE가 접합된 streptavidin(Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate(SA-PE), Invitrogen)과 FITC가 접합된 항-Fc 항체(anti-Fc antibody FITC conjugated, goat, (SIGMA-ALDRICH co., USA))를 4℃에서 20분간 결합시킨 후 FACS를 통해 Fc 발현량이 많고, 바이오틴화 된 NRP1-b1b2에 결합력은 높고, NRP1-b1b2 돌연변이 단백질에는 결합하지 않는 클론을 선별하였다. 이후 추가적으로 진행한 2회 FACS 과정은 상기 과정과 동일하며, 바이오틴화 된 NRP1-b1b2의 양을 50 nM로 사용하였다. 도 6은 스크리닝 이후 선별된 C-말단 규칙을 벗어나고 NRP1에 결합하는 V12 펩타이드의 NRP1-b1b2에 대한 결합능을 유세포분석을 통해 분석한 것이다.
하기 표 2는 NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 특이적으로 결합하고 C-말단 규칙을 벗어난, 선별된 펩타이드의 서열을 나타낸다.
[표 2] 항체 중쇄불변부위(Fc)에 융합시킨 펩타이드 라이브러리로부터 선별된 개별 클론의 아미노산 서열
Figure pat00004
하기 표 3는 선별된 펩타이드를 항체 중쇄불변부위에 융합할 때 사용된 링커까지 포함된 서열을 나타낸다.
[표 3] 링커가 연결된 NRP1 타겟 펩타이드 서열
Figure pat00005
실시예 3: C-말단 규칙(C-end rule/CendR)을 따르지 않고 NRP1 b1 도메인의 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 항체 중쇄불변부위의 구축 및 발현 정제
상기 실시예 2에서 선별된 V12 펩타이드를 동물세포에서 발현하기 위하여 효모세포로부터 회수한 DNA에서 항체의 중쇄불변부위의 CH3와 NRP1과 특이적으로 결합하는 펩타이드 부분을 pcDNA3.4 벡터에 도 7과 같이 클로닝하였다.
HEK293-F 시스템(Invitrogen)을 사용하여 상기 구축된 각각의 항체 중쇄불변부위와 선별된 V12 펩타이드가 융합된 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현시켰다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지(Invitrogen)에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포(Invitrogen)를 플라스미드 및 폴리에틸렌아민(Polyethylenimine, PEI)(Polyscience)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크(Corning)에 200 mL 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 2.0X106 세포/ml의 밀도로 배지 100 ml에 파종하여, 120 rpm, 8 % CO2에서 배양하였다. 그 후, 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 10ml FreeStyle 293 발현 배지(Invitrogen)에 250 ㎍(2.5 ㎍/ml)로 희석하여, PEI 750 ㎍(7.5 ㎍/ml)을 희석한 10ml의 배지와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 100ml로 파종한 세포에 넣어 4시간 동안 120 rpm, 8% CO2에서 배양 후, 나머지 100 ml의 FreeStyle 293 발현 배지를 추가하여 7일동안 배양하였다. 상청액은 7일 후에 채취하였다.
표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상청액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼(Protein A Sepharose column)(GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS(pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액을 이용하여 pH 3.0 에서 항체를 용리한 후 1 M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉각적으로 중화하였다. 용리한 항체 분획은 Pierce Dextran Desalting Column(5K MWCO)를 이용하여PBS(pH7.4)로 완충액을 교환한 후, MILLIPORE Amicon Ultra(10 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축하고, 정제된 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다. 정제된 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질은 환원성 및 비환원성 조건으로 SDS-PAGE 상에서 분석하였다.
하기 표 4는 정제된 Fc-V12 융합 단백질의 배양 1L당 생산되는 단백질의 수율을 나타낸다. 3회 수행하여 얻는 결과를 통계처리 하였으며, ㅁ는 표준편차 값을 나타낸다. 얻어진 단백질의 수율은 야생형 Fc 단백질과 통계적으로 유의한 차이가 없었다.
[표 4] Fc-V12 융합 단백질의 HEK293세포에서의 생산수율
Figure pat00006
실시예 4: Fc-V12 융합 단백질의 NRP1 및 2의 b1b2 도메인 대한 결합능의 평가 및 NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 대한 특이성 평가
정제된 Fc-V12 융합 단백질의 NRP1 및 2의 b1b2 도메인과 각각의 아르지닌 결합 포켓이 붕괴된 돌연변이 단백질에 대한 결합능을 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)에서 확인하였다. 먼저 NRP1-b1b2(273-586), NRP2-b1b2(275-595), NRP1-b1b2 AAA(273-586, Y297A, S346A, Y353A), NRP2-b1b2 AAA(275-595, Y299A, S349A, Y356A)를 96 well ELISA 플레이트(COSTAR Corning In., USA)에 각각 200 ng씩 1시간 동안 상온에서 결합시킨 후 0.1 % PBST(0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 10분 간 3회 씻어내었다. 이후, 블락킹 버퍼 (1 % BSA, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)를 2시간 동안 상온에서 처리해주고, 0.1 % PBST(0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co.,USA)로 10분간 3회 씻어내었다. 이후 음성 대조군으로 Fc을 100 nM, 양성 대조군으로 Fc-A22p와 Fc-TPP11를 각각 10 nM, 실험군으로 뉴로필린1에 특이적으로 선별된 Fc-V12를 100 nM농도로 블라킹 버퍼에 희석시킨 후 1시간동안 상온에서 결합시켰다. 이후 0.1 % PBST로 10분 간 3회 씻어내었다. 이후, HRP가 접합된 스트렙토아비딘(Horseradish peroxidase-conjugated straptavidin, Thermo Fisher Scientific, USA)를 블라킹 버퍼에 1:8000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 처리 후 0.1 % PBST로 10분 간 3회 씻어내었다. 이후에 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, Thermo Fisher Scientific, USA)를 처리하여 약 15분간 반응시키고 1N 황산(H2SO4)을 처리하여 반응을 종결하고, 450nm 흡광도를 Multiska GO Microplate 흡광기기(Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 정량하였다.
도 8a에 나타낸바와 같이 음성대조군인 Fc는 달리 양성대조군인 Fc-TPP11, Fc-A22p 유사하게 Fc-V12가 NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 특이적으로 결합함을 보여준다.
또한, NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 대한 특이성을 추가적으로 확인하기 위하여 바이오틴화된 VEGF165A와 경쟁적으로 NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 결합하는지 경쟁적 ELISA (competitive ELISA)를 수행하였다. 먼저 NRP1-b1b2(273-586)단백질을 96 well ELISA 플레이트(COSTAR Corning In., USA)에 200 ng씩 1시간 동안 상온에서 결합시킨 후 0.1 % PBST(0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 10분 간 3회 씻어내었다. 이후, 블락킹 버퍼 (1 % BSA, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)를 2시간 동안 상온에서 처리해주고, 0.1 % PBST(0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co.,USA)로 10분간 3회 씻어내었다. 이후 음성 대조군으로 Fc을, 양성 대조군으로 Fc-TPP11을 사용하고, 실험군으로 뉴로필린1에 특이적으로 선별된 Fc-V12를 바이오틴화된 VEGF165A (R&D systems, USA) 1nM과 도8b에 표시된 여러 농도로 블라킹 버퍼에 희석시킨 후 경쟁적으로 1시간 동안 상온에서 결합시켰다. 이후 0.1 % PBST로 10분 간 3회 씻어내었다. 이후, HRP가 접합된 스트렙트아비딘(Horseradish peroxidase-conjugated straptavidin, Thermo Fisher Scientific, USA)을 블라킹 버퍼에 1:16000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 처리 후 0.1 % PBST로 10분 간 3회 씻어내었다. 이후에 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, Thermo Fisher Scientific, USA)를 처리하여 약 5분간 반응시키고 1N 황산(H2SO4)을 처리하여 반응을 종결하였고 450nm 흡광도를 Multiska GO Microplate 흡광기기(Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 정량하였다.
도 8b과 같이 음성대조군인 Fc와 달리, 양성대조군인 Fc-TPP11 및 Fc-V12가 VEGF165A와 경쟁적으로 NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 결합함을 보여주며, 이는 CendR규칙을 벗어난 V12 펩타이드가 C-말단 규칙을 따르는 펩타이드와 유사하게 NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 결합함을 의미하며 이는 VEGF와의 경쟁적 결합을 통해 신생혈관 억제능도 보일 수 있음을 의미한다.
실시예 5: Fc-V12 융합 단백질의 세포 표면에 발현된 NRP1과의 특이적 결합 및 NRP1을 통한 세포내 유입능 평가
(1) Fc-V12의 인간 혈관 내피 세포주인 HUVEC 세포에 발현된 NRP1에 의존적으로 결합하는지 확인하기 위한 유세포 세포분석(Flow cytometry)
NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 생물학적 동정을 위한 실험에서는 NRP1이 과발현된 HUVEC(인간 혈관내피 세포주)를 사용하였다.
도 9a는 Fc-V12 융합 단백질이 HUVEC 세포에 발현된 NRP1에 의존적으로 결합하는지 확인하기 위해 유세포 분석(flowcytometry)실험의 결과이다.
구체적으로는, NRP1과 NRP2를 동시에 세포표면에 발현하고 있는 HUVEC 세포를 각각 대조군 siRNA, NRP1 siRNA, NRP2 siRNA를 처리하여 NRP1 및 NRP2의 발현을 감소시킨 후, 각 siRNA처리를 한 HUVEC 세포에 Fc, Fc-A22p, Fc-TPP11 및 Fc-V12를 1 μM씩 각각 처리한 후 30분 동안 4℃ 조건에서 배양하였다. 이후 Alexa488 형광이 접합된 항-인간항체 Fc특이적 마우스항체(Alexa488-conjugated anti-human Fc mouse antibody, Thermo Fisher Scientific, USA)를 처리하여 HUVEC 세포에 발현된 NRP1 및 NRP2에 대한 결합능을 유세포분석을 통해 확인하였다.
도 9a에 나타낸바와 같이 Fc와 Fc-A22p와는 달리, Fc-V12는 Fc-TPP11과 유사하게 HUVEC 세포의 NRP1 발현에 의존적으로 결합함을 확인하였다.
(2) Fc-V12의 인간 혈관 내피 세포주인 HUVEC 세포에 발현된 NRP1에 결합한 후 세포내 유입이 일어나는지 확인하기 위한 공초점 현미경 분석 (Confocal microscopic analysis)
도 9b와 나타낸 바와 같이 Fc-V12 융합 단백질이 세포 표면에 발현된 NRP1과도 결합하는지 확인하기 위해 세포표면의 NRP1과의 중첩(co-localization) 여부를 공초점 현미경(confocal microscopy) 으로 관찰하였다.
구체적으로는, 24 웰 플레이트에 각 웰 당 5x104 개의 HUVEC 세포를 EGM2(Endothelial growth medium, Promocell) 배지 0.5 ml로 넣어 24시간 동안 5 % CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화 되면, 각 웰을 PBS 0.5 ml를 이용하여 세척하였고, 그 후 EBM2(Endothelial basal medium, Promocell) 배지로 바꿔서 4시간 배양한 후, EBM2 배지 0.5 ml에 Fc, Fc-TPP11 및 Fc-V12를 1 μM로 희석하여 처리후 30분 동안 4 ℃ 조건에서 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 차가운 PBS로 세척한 후, 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질의 경우, FITC(녹색형광)가 결합되어있는 Fc를 특이적으로 인지하는 항체(Sigma)로 염색하였고, NRP1은 NRP1을 인지하는 1차 항체(abcam)와 TRITC(적색형광)가 결합되어 있는 2차 항체(Sigma)를 이용하여 염색하였다. DAPI를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 분석하였다.
도 9b에 나타난 바와 같이, Fc-TPP11과 Fc-V12의 경우, Fc와는 달리 HUVEC 세포 표면에 있는 NRP1과 결합하는 것을 확인하였다.
또한 다른 뉴로필린 리간드들의 세포 유입능과 같이, Fc-V12도 NRP1에 의해 세포내 유입능을 가지고 있는지 확인하기 위하여, 세포내 유입 여부 및 NRP1과의 중첩(co-localization) 여부를 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 관찰하였다. Fc, Fc-TPP11 및 Fc-V12를 1 μM로 희석하여 10분 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양한 후, 위와 같이 Fc 및 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질과 NRP1을 염색하여 공초점 현미경으로 분석하였다.
도 9b에서 나타난 바와 같이, 대조군인 Fc의 경우, 세포내 유입이 되지 않았고, NRP1에 결합하는 Fc-TPP11과 Fc-V12는 세포내로 유입되어 NRP1과 중첩(co-localization)됨을 확인하였다. 이는, Fc-V12가 NRP1에 의한 유입능을 가짐을 의미한다.
실시예 6: Fc-V12 융합 단백질의 세포투과능 향상 평가
(1) Fc-V12 의 혈관 내피세포 투과능을 확인하기 위한 트렌스웰 어세이(Transwell assay)
상기 실험 결과를 토대로, 혈관 내피세포의 투과능의 향상 여부를 확인하기 위한 실험으로 Fc-V12 를 처리하여 트렌스웰 어세이(Transwell assay)를 수행하였다.
구체적으로는, 혈관 내피세포(HUVEC)를 Transwell plate(Corning)에 웰 당 5x104 개의 세포를 EGM2 배지를 이용하여 상위 챔버(upper chamber)에 시딩(seeding)해 준 후, 3일 동안 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 그 후, EBM 배지로 바꿔 준 후, 대조군으로 VEGF165A는 약 1.3 nM 과 0.13 nM 로 희석하고, Fc, Fc-TPP11 및 Fc-V12는 1 μM 또는 100 nM로 희석하여 30 분 동안 처리하였다. 그 후, Dextran-FITC(Sigma) 50 ㎍을 상위 챔버(upper chamber)에 넣어, 혈관 내피세포의 투과성이 향상되었을 경우, 하위 챔버(lower chamber)에서 형광 물질이 관찰되는 원리를 이용하여, 30분 후, 하위 챔버의 배지를 샘플링 하여 형광을 측정하였다.
도 10은 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 혈관 내피세포(HUVEC)의 투과능을 향상시키는지 확인하기 위하여, Transwell assay를 수행한 결과이다. 도 10에 나타난 바와 같이, 음성대조군인 Fc와는 달리 VEGF165A, Fc-TPP11 및 Fc-V12의 경우 혈관 내피세포 투과능이 향상 된 것을 확인하였다. 또한 Fc-V12가 농도 의존적인 혈관 내피세포 투과능을 보이는 것을 확인하였으나, Fc-TPP11나 VEGF165A에 비해 낮은 농도에서 혈관 내피세포 투과능이 낮음을 확인하였다. 결과를 종합하면, 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 결합하는 C-말단 규칙을 벗어난 펩타이드가 융합된 단백질인 Fc-V12가 NRP1 종양 침투성 펩타이드(TPP)임을 확인하였다.
(2) 마우스 모델에서 Fc-V12 융합 단백질의 투과능 향상을 확인하기 위한 면역조직화학(Immunohistochemistry, IHC) 실험
상기 실시예 6의(1) 에서는 in vitro 상에서 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질이 혈관 내피세포의 투과능을 향상시킴을 확인하였다. 따라서 마우스 모델에서 Fc-V12 융합 단백질의 투과능 향상을 확인 하기 위해 IHC(Immunohistochemistry) 실험을 수행하였다.
Fc-V12의 종양 조직 내 투과능 향상을 확인하기 위한 실험으로, Balb/c 누드 마우스에 뉴로필린1을 발현하고 있는 FaDu cell을 마우스 당 5x106개의 세포를 피하주사로 주입시켰고, 약 9일 후 종양의 부피가 약 300-400 mm3 정도가 되었을 때, 각각 Fc, Fc-TPP11, Fc-V12을 10 mg/kg으로 정맥 주사하였다. 주사 후, 각각 24시간 후 마우스로부터 종양을 적출하여, 면역조직화학(immunohistochemistry) 실험을 수행하였다. 적출한 종양은 동결절편(frozen section) 방법으로 20 μm의 두께로 잘라, 1차 항체인 CD31항체(BD Pharmingen)와 이를 인지하는 TRITC(적색형광)이 결합된 2차 항체로 혈관을 염색하였고, 조직 내에 분포되어 있는 Fc-V12를 관찰하기 위해, Fc를 인지하는 FITC(녹색형광)이 결합된 항체를 사용하였다.
도 11는 실제 종양 조직 내의 Fc-V12의 침투능을 확인하기 위한 면역조직화학 결과이다. 도 11에 나타난 바와 같이, 대조군인 Fc와 달리 C-말단 규칙을 따르는 펩타이드가 융합된 Fc-TPP11 의 경우 종양 조직 선택적으로 도달하였다. 이와 유사하게 Fc-V12도 종양 조직 내로 침투 되었음을 확인하였다. 이를 정량적으로 형광세기를 측정하였을 때도, Fc에 비해 Fc-TPP11과 Fc-V12는 종양조직 침투능이 있기 때문에 종양 조직에서 더 넓은 범위에 존재하는 것을 확인하였다.
실시예 7: Fc-V12의 병용 투여된 소분자 약물의 종양조직 축적 및 투과능 증진 평가
상기 실험에서 구축된 Fc-TPP11를 소분자 약물과 병용 투여 하였을 때 종양 조직 내의 소분자 약물의 침투를 확인하기 위하여, 면역조직화학(Immunohistochemistry)실험을 수행하였다. Balb/c 누드 마우스에 FaDu을 마우스 당 5x106 개의 세포를 피하주사로 주입시켰고, 약 15일 후 종양의 부피가 약 300-400 mm3 정도가 되었을 때, 항암제인 독소루비신 (Doxorubicin) 10 mg/kg과 각각 Fc, Fc-TPP11 및 Fc-V12를 5 mg/kg을 도 12에 나타낸 바와 같이 정맥 주사하였다. 주사 1 시간 후, 마우스의 심장을 통해 PBS로 관류 시키고, 4% 파라포름알데히드로 관류시켜 조직을 고정시켰다. 그 후, 종양 조직을 적출하여, 면역조직화학실험을 수행하였다. 적출한 종양은 동결절편(frozen section) 방법으로 20 μm의 두께로 잘라, 1차 항체인 CD31항체(BD Pharmingen)와 이를 인지하는 FITC(녹색형광)이 결합된 2차 항체로 혈관을 염색하였고, 조직 내에 분포되어 있는 독소루비신은 자체적으로 적색 형광을 띠는 것을 확인하였다.
도 12는 Fc-V12와 병용 투여한 독소루비신의 종양조직 내 침투능을 확인하기 위한 IHC 결과이다. FaDu 암세포 조직에서 독소루비신의 경우 적색 형광이 거의 관찰되지 않는 반면에, Fc-TPP11와 병용 투여한 독소루비신의 경우, 독소루비신 단독과 비교했을 때, 혈관으로부터 좀 더 멀리 조직 내부로 침투되었음이 확인되었다. 대조군으로 Fc와 독소루비신을 병용 투여했을 때는 침투 능에 영향이 없음을 확인하였다.
상기의 결과는 C-말단 규칙을 따르지않고 NRP1과 결합하는 종양 침투성 펩타이드가 다양한 소분자 약물에 대하여 일반적인 적용이 가능함을 나타낸다.
실시예 8 : NRP1과 결합하기 위한 V12 펩타이드 아미노산 서열의 중요성 확인하기 위한 돌연변이 연구
상기 실험에서 선별된 V12 펩타이드가 항체의 Fc와 융합하였을 때, NRP1에 선택적으로 결합하며, 이때 NRP1의 b1 도메인에 위치한 아르지닌 결합 포켓에 결합한다는 것을 확인하였고 NRP1에 의존적인 혈관 내피세포 투과성을 보임에 따라, C-말단 규칙을 따르는 펩타이드와 유사하게 V12 펩타이드도 NRP1의 생물학적 활성을 유도할 수 있다는 것을 확인하였다. 이전 연구에서 C-말단 규칙을 따르는 펩타이드들의 C말단에 존재하는 아르지닌 또는 라이신이 NRP1과의 결합에 중요한 역할을 한다고 알려져있기 때문에, V12 펩타이드의 C말단에 존재하는 발린이 NRP1과의 결합에 중요한 역할을 하는지 확인하였다.
도 13a는 V12 펩타이드의 C말단 서열을 19개의 다른 아미노산으로 치환된 Fc-V12 돌연변이 단백질들과 Fc-V12를 정제하여 SDS-PAGE를 통해 분석한 것이다.
도 13b는, 도 13a에서 정제한 총 20개의 단백질을 실시예 5의 (1)에서 분석했던 것과 동일한 조건에서 분석한 유세포 분석의 결과이다. 음성 대조군인 Fc와는 달리, 양성대조군인 Fc-TPP11과 Fc-A22p처럼 C말단에 발린을 지니고 있는 Fc-V12만이 NRP1을 발현하고 있는 HUVEC세포에 유의미한 결합능을 보였으나, 나머지 19개의 Fc-V12 돌연변이 단백질들은 결합능을 보이지 않았다. 상기 결과는 V12 펩타이드의 C말단의 발린이, V12 펩타이드와 NRP1간의 결합에 있어서 중요한 역할을 하고 있음을 나타낸다.
V12 펩타이드의 C말단의 5개 아미노산서열인 라이신-프롤린-프롤린-아르지닌-발린은 CendR 펩타이드와 서열적 유사성을 띄고 있기 때문에 NRP1과의 결합에 중요한 역할을 할 것으로 가정하고 이를 확인하기 위해 V12 펩타이드의 N말단에 위치한 아미노산 서열을 도 14에 표시한바와 같이 글라이신 및 세린으로 치환하여 Fc-V12 돌연변이 단백질(Fc-GS-V12)을 구축한 후 정제하여 실시예 4와 동일하게 ELISA 를 통해 NRP1과의 결합을 확인하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이 Fc-GS-V12가 Fc-V12와 유사한 NRP1 결합능을 지님을 확인하였으며, 이는 V12 펩타이드의 C말단에 존재하는 5개 아미노산 서열이 NRP1과의 결합에 중요한 역할을 함을 나타낸다.
실시예 9: V12 펩타이드 친화도 향상 및 친화도가 향상된 V12 유래 펩타이드들의 생화학적 동정
상기 실험에서 구축된 V12 펩타이드의 NRP1에 대한 친화도 향상을 위하여, 도 15와 나타낸 바와 같이 V12 펩타이드의 N말단의 7개 아미노산 부위를 실시예 1과 같이 동의 코돈인 VVM 코돈을 이용하여 표 5에 언급한 시발자를 이용하여 친화도 향상을 위한 라이브러리를 구축하고, 1회의 MACS와 3회의 FACS 스크리닝을 통하여 친화도가 향상된 V12 유래의 고친화도로 NRP1과 결합하는 펩타이드를 선별하였다.
[표 5] V12 펩타이드 친화도향상을 위한 라이브러리 구축에 사용된 올리고뉴클레오타이드 염기서열
Figure pat00007
도 15는 V12 펩타이드의 친화도 향상을 위한 라이브러리 구축 전략을 표현한 것이며, 하기 표 6은 선별된 NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 특이적으로 결합하고 C-말단 규칙을 벗어난 펩타이드인 V12의 친화도를 향상시킨 이형들의 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 6] V12 펩타이드 친화도 향상을 위한 항체 중쇄불변부위(Fc)에 융합시킨 펩타이드 라이브러리로부터 선별된 개별 클론의 아미노산 서열
Figure pat00008
하기 표 7는 상기 선별된 펩타이드를 항체 중쇄불변부위에 융합할 때 사용된 링커까지 포함된 서열을 나타낸다.
[표 7] 링커가 연결된 V12 펩타이드 유래의 NRP1 타겟 펩타이드 서열
Figure pat00009
또한, NRP1에 대해 친화도가 향상된 V12 펩타이드 유래의 이형 펩타이드들이, 세포 표면에 발현된 NRP1에 특이적으로 결합하는지 확인하기 위해 실시예 5의 (1)에 언급한바와 같이 NRP1이 발현된 HUVEC(인간 혈관내피 세포주)를 사용하여 동일한 조건으로 유세포 분석(flowcytometry)을 수행하였다.
도 16a는 V12 펩타이드 유래의 이형 펩타이드들을 항체의 Fc절편의 C말단에 링커를 통해 융합한 후 동물세포로부터 발현 및 정제하여, 융합 단백질들이 HUVEC 세포에 발현된 NRP1에 의존적으로 결합하는지 확인하기 위해 유세포 분석(flowcytometry)실험의 결과이다.
구체적으로는, NRP1과 NRP2를 동시에 세포표면에 발현하고 있는 HUVEC 세포를 각각 대조군 siRNA, NRP1 siRNA, NRP2 siRNA를 처리하여 NRP1 및 NRP2의 발현을 감소시킨 후, 각 siRNA처리를 한 HUVEC 세포에 Fc 및 Fc-V12, Fc-V12-14, Fc-V12-15, Fc-V12-33, Fc-V12-44를 100 nM씩 각각 처리한 후 30분 동안 4 ℃ 조건에서 배양하였다. 이후 Alexa488 형광이 접합된 항-인간항체 Fc특이적 마우스항체(Alexa488-conjugated anti-human Fc mouse antibody, Thermo Fisher Scientific, USA)를 처리하여 HUVEC 세포에 발현된 NRP1 및 NRP2에 대한 결합능을 유세포분석을 통해 확인하였다.
도 16a에 나타낸 바와 같이 NRP1에 대해 친화도가 향상된 Fc-V12-14, Fc-V12-15, Fc-V12-33, Fc-V12-44가 HUVEC 세포에 발현된 NRP1에 대한 결합력이 Fc-V12 보다 높아졌지만, Fc-V12-33이 가장 HUVEC 세포의 NRP1 발현에 의존적으로 결합함을 확인하였다. 또한 도 16b에서 나타낸 바와 같이, 실시예 6의 (1)에서 수행한 혈관내피세포 투과성을 볼 수 있는 트랜스웰 에세이이에서 100 nM의 Fc-V12-33이 동일한 농도의 C-말단 규칙을 따르는 펩타이드가 융합된 Fc-TPP11과 유사한 수준의 NRP1에 의존적인 혈과내피세포 투과를 유도함을 확인하였다. 덧붙여, Fc-V12-33의 NRP1에 대한 친화도의 향상이 NRP1의 b1도메인에 위치한 아르지닌 결합 포켓에 대한 친화도 향상인지를 확인하기 위해 실시예 4에서 수행한 것과 동일하게 Fc-V12-33 융합단백질이 바이오틴화된 VEGF165A와 경쟁적으로 NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 결합하는지 경쟁적 ELISA (competitive ELISA)를 수행하였다.
도 16c과 같이 음성대조군인 Fc와 달리, Fc-TPP11 및 Fc-V12-33가 유사한 수준으로 VEGF165A와 경쟁적으로 NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 결합함을 보여주며 Fc-V12보다 현저히 높은 VEGF165A의 NRP1에 대한 결합 억제능을 보였다. 이는 CendR규칙을 벗어난 V12 유래 펩타이드가 C-말단 규칙을 따르는 펩타이드와 유사하게 NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 결합함을 의미하며, NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 결합하고 NRP1에 의한 생물학적 활성이 CendR규칙을 벗어난 펩타이드에 의해서도 충분히 이루어진다는 것을 의미한다.
또한, 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질의 NRP1 및 NRP2 b1b2 단백질에 대한 결합력을 더 정량적으로 분석하기 위하여 SPR(Surface plasmon resonance)을 수행하였다. Biacore2000 기기(GE healthcare)를 이용하였으며, Fc-V12를 비롯한 및 Fc-TPP11, Fc-A22p, Fc-V12-14, Fc-V12-15, Fc-V12-33, Fc-V12-44의 NRP1 및 NRP2 b1b2 도메인에 대한 결합력을 분석하였다.
구체적으로는, 상기 언급한 융합 단백질 각각을 10 mM Na-아세테이트 완충액(pH 4.0)에 희석하여 CM5 센서칩(GE healthcare, USA)에 약 1000 reponse units(RU) 고정화하였다. HBS-EP 완충액[10 mM Hepes, 3 mM ethylenediaminetetraacetic acid, and 0.005% surfactant P20(pH 7.4), GE Healthcare]을 30μl/min 유속으로 분석하였으며, NRP1 및 NRP2 b1b2 단백질을 RU가 100이 넘지 않는 농도에서 처리하여 분석하였다. 결합 및 해리 분석후 CM5칩의 재생(regeneration)은 완충액(20mM NaOH, 1M NaCl, pH10.0)을 30μl/min 유속으로 1분간 흘려주어 시행되었다. 결합 3분, 해리 3분으로 얻어진 각 센서그램(sensorgram)은 공백 칸(Blank cell)과 비교하여 정상화(normalization) 및 절감(Subtraction)하여 친화도를 계산하였다.
표 8는 SPR(Surface plasmon resonance, BIACORE 2000, GE healthcare, USA)를 이용하여 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질의 NRP1-b1b2 및 NRP2-b1b2 단백질에 대한 친화도 분석 결과를 나타낸다.
[표 8] 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질의 NRP1-b1b2 및 NRP2-b1b2에 대한 친화도 및 특이성 분석
Figure pat00010
실시예 10: V12-33 펩타이드와 항체 Fc절편과 융합시 링커에 따른 NRP1 결합능 확인
상기 실험에서 구축된 V12-33 펩타이드의 NRP1에 대한 결합능 및 생물학적 활성 유도가 링커에 의존적인지를 확인하기 위해, 표 9와 나타낸 바와 같이 항체 Fc절편의 C말단에 다양한 링커 또는 링커 없이 V12-33 펩타이드를 융합한 융합단백질을 정제하였다.
[표 9] 링커가 연결된 또는 링커가 없는 형태의 Fc-V12-33 융합 단백질의 항체 Fc절편 C말단 서열
Figure pat00011
도 17a는 항체 Fc절편의 C말단에 다양한 링커 또는 링커 없이 V12-33 펩타이드를 융합하여 실시예 3에과 동일한 과정을 통해 정제하여 SDS-PAGE로 분석한 것이다. 모든 융합 단백질은 다량체 형성이나 절단 없이 정제되었다.
도 17b는 다양한 링커 또는 링커 없이 V12-33 펩타이드를 항체 Fc절편에 융합한 융합단백질들의 NRP1에 대한 결합능을 확인한 것이며 실시예 4에서 언급한 방법과 동일하게 수행되었다. ELISA 결과는 링커의 종류나 유무에 따라 NRP1의 아르지닌 결합 포켓에 대한 결합능의 차이가 있을 수 있으나 링커가 없이도 NRP1에 결합할 수 있음을 보여준다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Neuropilin-1 Specific Binding Non-CendR Peptide, Fusion Protein Comprising the Same Fused Thereto and Use Thereof <130> 053 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V12 <400> 1 His Leu Gln Glu Ser Pro Gly Lys Pro Pro Arg Val 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS-V12 <400> 2 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Pro Pro Arg Val 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V12-14 <400> 3 Arg His Lys Gly Pro Gly Gln Lys Pro Pro Arg Val 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V12-15 <400> 4 Arg Gly Arg Pro Arg Arg Thr Lys Pro Pro Arg Val 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V12-33 <400> 5 Arg Pro Arg Pro Pro Arg Gln Lys Pro Pro Arg Val 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V12-44 <400> 6 Ala Pro Arg Ala Gln Ser Asp Lys Pro Pro Arg Val 1 5 10 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V5 <400> 7 Lys Pro Pro Arg Val 1 5 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-V12-33 <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg 1 5 10 15 Pro Arg Pro Pro Arg Gln Lys Pro Pro Arg Val 20 25 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-(G4S)1-V12-33 <400> 9 Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Arg Pro Pro Arg Gln Lys Pro Pro Arg 1 5 10 15 Val <210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-(G4S)2-V12-33 <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Arg Pro Pro Arg 1 5 10 15 Gln Lys Pro Pro Arg Val 20 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-G(APAPA)1-V12-33 <400> 11 Gly Ala Pro Ala Pro Ala Arg Pro Arg Pro Pro Arg Gln Lys Pro Pro 1 5 10 15 Arg Val <210> 12 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-G(APAPA)2-V12-33 <400> 12 Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Arg Pro Arg Pro Pro 1 5 10 15 Arg Gln Lys Pro Pro Arg Val 20 <210> 13 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-G(APAPA)3-V12-33 <400> 13 Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 15 Arg Pro Arg Pro Pro Arg Gln Lys Pro Pro Arg Val 20 25 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 1 <400> 14 acgacgttcc agactacgct 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 1 <400> 15 ttgcagatgt gatcctccac c 21 <210> 16 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 2 <400> 16 ggtggaggat cacatctgca agaavvmvvm vvmvvmvvmv vmvvmnhcta aggatccgaa 60 caaaagctta tttc 74 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 2 <400> 17 tcgattttgt tacatctaca ctgttgt 27 <210> 18 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V12 w linker <400> 18 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His 1 5 10 15 Leu Gln Glu Ser Pro Gly Lys Pro Pro Arg Val 20 25 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 1 <400> 19 acgacgttcc agactacgct 20 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 1 <400> 20 tgatcctcca cctccac 17 <210> 21 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 2 <400> 21 gtggaggtgg aggatcavvm vvmvvmvvmv vmvvmvvmaa accaccacgc gtctaaggat 60 c 61 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 2 <400> 22 tcgattttgt tacatctaca ctgttgt 27 <210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V12-14 w linker <400> 23 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg 1 5 10 15 His Lys Gly Pro Gly Gln Lys Pro Pro Arg Val 20 25 <210> 24 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V12-15 w linker <400> 24 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg 1 5 10 15 Gly Arg Pro Arg Arg Thr Lys Pro Pro Arg Val 20 25 <210> 25 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V12-33 w linker <400> 25 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg 1 5 10 15 Pro Arg Pro Pro Arg Gln Lys Pro Pro Arg Val 20 25 <210> 26 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V12-44 w linker <400> 26 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 1 5 10 15 Pro Arg Ala Gln Ser Asp Lys Pro Pro Arg Val 20 25

Claims (15)

  1. 뉴로필린1(NRP1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드로서,
    상기 펩타이드는 C-말단에 하기의 아미노산을 포함하고,
    X1-X2-X3-X4-X5의 식에서 X1 내지 X4는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 서열이고, 상기 X5는 발린인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 5-50개의 아미노산으로 구성된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 1 내지 7으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드
  5. 제1항에 있어서, 링커 펩타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 링커 펩타이드는 (GGGGS)n 또는 G(APAPA)n를 포함하고, n은 1 내지 20의 정수인 펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드가 융합된 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 항체, 항체의 단편, 면역 글로불린, 펩타이드, 효소, 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 및 화학적으로 개질된 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 단백질에 펩타이드가 융합된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체의 단편은 항체의 중쇄불변영역 절편(Fc), 중쇄불변영역 도메인 (CH1, CH2, 또는 CH3) 절편, 항원결합 절편(antigen binding fragment(Fab)), 단일사슬항체절편(single chain variable fragment(scFv)), 중쇄가변영역 절편(VH), 경쇄불변영역 절편(CL) 또는 경쇄가변영역 절편(VL)인 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 펩타이드가 융합된 나노입자.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 펩타이드가 융합된 리포좀.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 펩타이드가 융합된 소분자 약물.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 펩타이드가 융합된 핵산.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  15. 다음을 포함하는 제1항의 펩타이드를 스크리닝하는 방법:
    (1) NRP1-b1 아르지닌 결합부위 (Arginine-binding pocket)와 상호 작용할 수 있는 라이브러리를 디자인하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)의 라이브러리를 항체 중쇄 불변부위에 융합시키는 단계;
    (3) 상기 단계 (2)의 항체 중쇄 불변부위에 융합된 라이브러리를 NRP1-b1b2와 결합시키는 단계; 및
    (4) 상기 단계 (3)의 결합력을 측정하는 단계.
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