KR20220044552A - T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하여 알츠하이머병을 치료하는 방법 - Google Patents

T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하여 알츠하이머병을 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

대상체의 알츠하이머병을 치료하기 위한 약물의 제조에서 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하기 위한 시약의 용도를 제공한다.

Description

T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하여 알츠하이머병을 치료하는 방법
본 발명은 알츠하이머병(AD)의 치료에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 알츠하이머병의 진행을 억제하기 위한 뇌-소화관 축 연관의 용도에 관한 것이다.
알츠하이머병(AD)은 서서히 발병하는 진행성 신경퇴행성 질환이다. 임상에서는 기억력 손상, 언어상실증, 행위상실증, 인식불능증, 시공간 능력 손상, 실행 기능장애, 인격 및 행동 변화와 같은 일반적인 치매를 특징으로 한다. 알츠하이머병의 2개의 병리학적 특징은 세포외 β-아밀로이드 침착물(노인성 플라크) 및 세포내 신경원섬유성 엉킴 (쌍 형성된 나선 필라멘트)이다. β-아밀로이드 침착물과 신경원섬유 엉킴은 시냅스와 뉴런의 손실을 초래하며, 이는 일반적으로 측두엽에서 시작하여 뇌의 손상된 부위에서 심각한 위축을 유발한다. β-아밀로이드 펩티드와 신경원섬유성 엉킴으로 인한 이러한 손상의 메커니즘은 완전히 이해되지 않았다.
Institute of Pharmaceutical Innovation of the Chinese Academy of Sciences/Shanghai Institute of Materia Medica의 연구원 Geng Meiyu가 이끄는 연구팀이 개발한 만누론산 올리고당은 독립적 지적 재산권를 갖는 새로운 경구용 항알츠하이머병(AD) 획기적인 약물이다. 2018년 7월 17일에, 임상 III상 맹검 시험 결과는 만누론산 올리고당이 인지 기능 개선에 대한 주요 효능 지표의 관점에서 기대에 도달하였음을 보여주었고, 이는 매우 유의한 통계적 및 임상 유의성을 갖는다. 또한, 유해 사례의 발생률이 위약군과 유사하며, 안전성이 우수하여 장기간 사용하기에 적합하다. 만누론산 올리고당은 글로벌 AD 치료제 분야에서 16년 만에 3상 임상 시험에 성공한 첫 번째 약물이 되었다.
만누론산 올리고당와 관련하여 많은 관련 중국 특허가 제출되었다. CN2017114675966은 만누론산 이산의 조성물을 설명한다. CN2016100697039는 올리고만누론산 이산의 제조 방법을 설명한다. CN2018107134113은 파킨슨병 치료에서 만누론산 이산 조성물의 용도를 설명한다. CN2015104243401은 환원 말단의 위치 1에 카복실기를 갖는 만누론산 올리고당 및 이의 유도체를 파킨슨병 치료에 사용하는 것을 설명하고 있다. 이러한 특허는 참조로 전체가 본 명세서에 포함된다.
Figure pct00001
(만누론산 올리고당)
알츠하이머병을 치료하는 데 사용할 수 있는 더 많은 약물이 상응하는 분야에서 필요하다.
본 발명에서, 본 발명자들은 AD의 진행에 있어서 소화관 미생물총(gut microbiota) 세균불균형(dysbiosis)과 신경염증 사이의 인과관계를 제공한다. 특히, 소화관 미생물총의 조성의 변화는 페닐알라닌 및 이소류신과 같은 균무리의 대사산물의 말초 축적으로 이어질 수 있다. 이는 AD의 진행에서 말초 염증유발(pro-inflammatory)-유형 1 T 헬퍼(Th1) 세포의 증식 및 분화를 촉진한다. 말초 면역 세포가 뇌에 침투하여 신경염증을 강화한다. 중요하게는, 말초 혈액에서 페닐알라닌 및 이소류신과 같은 상승이 AD으로 인한 경도 인지 손상(MCI) 환자의 두 독립적인 코호트에서 확인되었다. 본 발명자들은 또한 중국의 3상 임상 시험에서 신뢰할 수 있고 일관된 인지 개선을 나타낸 만누론산 올리고당이 소화관 세균총의 균형을 재구성하고 혈액 내 세균총의 아미노산 대사산물 축적을 감소시키며 신경염증을 억제한다는 것을 보여주었다. 일반적으로, 본 발명자의 발견은 장내 세균불균형에 의해 촉진되는 신경염증이 AD의 진행에 미치는 역할을 강조하고, 뇌-소화관 축에 개입하여 AD 치료를 위한 새로운 전략을 제안한다.
한 양태에서, 본 발명은 대상체의 알츠하이머병을 치료하기 위한 약제의 제조에서 포유동물 말초 혈액의 나이브(naive) T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하기 위한 제제(agent)의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 알츠하이머병을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 포유동물 말초 혈액에서 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하기 위한 제제를 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 알츠하이머병 치료에 사용할 수 있는 약물 후보를 스크리닝하는 방법을 제공한다:
a) 수송체 SLC7A5이 있는 생체내 또는 시험관내 모델에 시험 제제를 투여하는 단계, 및
b) 알츠하이머병 치료에 사용될 수 있는 약물 후보로서 수송체 SLC7A5를 억제하는 시험 제제를 선택하는 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 알츠하이머병 환자의 치료 방법을 제공한다:
포유동물 말초 혈액의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하기 위한 제제를 환자에게 투여하는 단계로서, 환자의 CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 비율이 상응하는 정상적인 집단에서 CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 상응하는 비율에 근접하거나 도달하도록 조절되는, 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 알츠하이머병 환자의 치료 방법을 제공한다:
포유동물 말초 혈액의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하기 위한 제제를 환자에게 투여하는 단계로서, 환자의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수 수준이 상응하는 정상적인 집단에서 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상응하는 상대적 흡수 수준에 근접하거나 도달하도록 조절되는 단계.
도 1 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스에서 질환 진행 동안 소화관 세균불균형 및 면역 세포 변화.
(a) 2, 3, 5, 7 및 9개월에 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스의 해마와 2개월에 야생형(WT) 마우스의 해마에서 시냅토파이신의 상대적인 RNA 발현 수준의 변화 (n = 5- 12). 데이터는 액틴의 발현 수준에 대한 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. *P < 0.05, **P < 0.01 원-웨이 ANOVA (F (5, 43) = 2.952).
(b) 2, 3, 5, 7 및 9개월에 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스 및 2개월에 야생형(WT) 마우스의 식별 학습 능력을 평가하기 위한 테스트에서 80% 성공(방법 참조)을 달성하는 데 걸린 104 중 시간의 변화 (n = 4-8). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. 스튜던트 t-테스트에 의한 *P < 0.05 스튜던트 t-테스트. s (초).
(c) 상이한 시점에서 조작상 분류 단위(OTU) 수준에 대한 WT 및 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스의 소화관 미생물군집 조성의 주성분 분석(PCA) (n = 4-10). 포인트의 모양과 색상은 다양한 달의 각 개체로부터의 샘플을 나타낸다. 유색 타원은 각 테스트 그룹 내에서 0.95 신뢰 구간(CI) 범위를 나타낸다. M (개월).
(d) 스트림 그래프의 문(phylum) 수준에서 채색된 다양한 개월에 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스의 소화관 미생물군집에서 전체 집단에서 조작상 분류 단위(OTU)의 상대 존재비 변화 (n = 4-10). 가장 풍부한 두 문(phyla), 박테로이데테스와 피르미쿠테스가 그래프에 표지되어 있다. 색상은 소화관 미생물총의 다른 문을 나타낸다.
(e) 2-월령 야생형 (WT) 마우스 (n=2-7)의 값에 비해 2, 3, 5, 7 및 9개월에 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스의 해마에서 소교세포(microglial)의 활성화를 반영하는 IBA1 면역형광 염색의 양성 밀도 변화. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시되고; 라인에는 삼차 스플라인이 구비되어 있다. Y축의 IBA1 값은 동일한 시점의 야생형 동물의 형광 염색 발현에 대한 각 시점에서의 형질전환 동물의 형광 염색 발현의 상대적인 값이다.
(f) 2, 3, 5, 7 및 9개월(n = 4-8)에 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스의 전뇌 균질물에서 검출된 활성화된 M1 및 M2 유형 소교세포의 변화 (n=4-8). M1형 소교세포(CD45lowCD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD86+) 및 M2형 소교세포(CD45lowCD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD206+)가 유동 세포측정에 의해 검출되었으며, 이들의 세포 수는 CD45lowCD11b+ 세포의 빈도에 대해 제시된다. 적색 점 및 선: M1 소교세포. 녹색 점 및 선: M2 소교세포. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시되고; 라인에는 삼차 스플라인 알로리즘이 구비되어 있다.
(g) 유동 세포측정에 의한 검출 시, 상이한 시점에서 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스(적색 점 및 선) 및 WT 마우스(흑색 점 및 선)의 전뇌 균질물에서 검출된 침윤 세포(CD45높은)의 변화 (Tg 마우스: 2 월령, n=5; 3 월령, n=4; 5 월령, n=4; 7 월령, n=7; 9 월령, n=3. WT 마우스: n=6.). 세포 수는 CD45+ 세포의 빈도에 대해 제시되며 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 형식화된다. 선에는 삼차 스플라인 알고리즘이 구비되어 있다.
(h) 다른 시점에서 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스에서 CD45높은 세포의 변화 (n = 4-8). 막대그래프(barplot)에서, 세포 수는 CD45높은 세포의 빈도에 대해 제시된다. 색상은 CD45높은 세포의 다른 하위 유형을 나타낸다. Neu, 호중구; DC, 수지상 세포; NK, 자연 살해 세포; Mo/Mπ: 단핵구 및 대식세포; B, B 세포; 기타, 미분류된 세포.
(i) 유동 세포측정에 의한 검출 시, 2, 3, 5, 7 및 9개월에 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스(적색 점 및 선)의 전뇌 균질물에서 검출된 침윤성 CD4 T 세포(CD45높은CD4+)의 변화 (n = 4-8). 세포 수는 CD45높은 세포의 빈도에 대해 제시되며 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 형식화된다. 선에는 삼차 스플라인이 구비되어 있다.
(j) 2, 3, 5, 7 및 9개월에 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스의 전뇌 균질물에서 검출된 침윤성 말초 Th1 및 Th2 세포의 변화 (n = 4-8). Th1 세포(CD45높은CD4+CXCR3+CCR6-) 및 Th2 세포 (CD45높은CD4+CXCR3+CCR6-CCR4+)를 유동 세포측정에 의해 검출하고, CD45높은CD4+ T 세포의 빈도에 대해 제시하였다. 적색 점 및 선: Th1 세포. 녹색 점 및 선: Th2 세포. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. 선에는 삼차 스플라인이 구비되어 있다.
(k) 초기(2-3개월) 및 후기(7-9개월)의 Th2/M2 관련 단계 및 Th1/M1 관련 단계 동안 속 수준에서 제시되는 뇌 림프구와 소화관 미생물총의 상관관계 (왼쪽 패널, n = 4-8). 5XFAD 마우스에서 뇌 림프구 수와 유의하게 상관관계가 있는 모든 박테리아가 오른쪽 패널에 열거되어 있다. 황색 별표(*)가 있는 적색(양의 상관관계) 또는 청색(음의 상관관계)의 사각형은 피어슨(Pearson) 파라미터 상관관계 테스트로 측정 시, P-값 < 0.05과의 유의한 상관관계를 나타낸다.
도 2. 소화관 미생물총은 면역 세포 침윤 및 소교세포 활성화에 필요하다.
(a) 7-월령 5XFAD 형질전환 (Tg) 마우스에서 소화관 미생물의 상대적 존재비에 대한 항생제의 3개월 경구 위관영양법의 효과 (n=6-7). ABX는 암피실린 (0.1mg/mL), 스트렙토마이신 (0.5mg/mL) 및 콜리스틴 (0.1mg/mL)으로 구성된 혼합 항생제의 칵테일이다. 소화관 미생물의 다른 속은 다르게 색상이 지정되고 상대 존재비의 변화는 막대 그래프 상에 제시된다.
(b-c) 7-월령 5XFAD 형질전환 (Tg) 마우스의 뇌 균질물에서 Th1 세포(b) 및 M1형 소교세포(c)의 빈도에 대한 항생제의 3개월 경구 위관 영양의 효과. Th1 세포(CD45높은CD4+CXCR3+CCR6-)의 세포 수는 CD45높은CD4+세포 (b)의 빈도에 대해 제시되는 반면, M1-유형 소교세포 (CD45낮은CD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD86+)의 세포 수는 CD45낮은CD11b+세포 (c)의 빈도에 대해 제시된다. 둘 다 유동 세포측정에 의해 검출된다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다.
(d) WT, 공동 수용 WT 및 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스의 속 수준에서 소화관 미생물의 상대 존재비 (n = 6-7). 세 그룹의 마우스는 모두 7월령이었다. 다른 색상은 다른 속을 나타낸다. 공동 수용 WT: Tg 마우스와 함께 수용된 WT 마우스.
(e-f) 7월령 공동 수용 WT, WT 및 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스의 뇌 균질물에서 Th1 세포 (e) 및 M1 유형 소교세포 (f)의 빈도 변화 (n = 6-7). Th1 세포(CD45높은CD4+CXCR3+CCR6-)는 CD45높은CD4+세포 (e)의 빈도에 대해 제시되는 반면, M1-유형 소교세포(CD45낮은CD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD86+)의 빈도는 CD45낮은CD11b+세포 (f)의 빈도에 대해 제시된다. 둘 다 유동 세포측정에 의해 검출된다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균±sem)로 표시된다. 스튜던트 t-테스트에 의한 *P<0.05, **P<0.01.
(g) 사이토카인 항체 어레이(n = 6-7)에 의해 검출 시 7월령의 WT, 공동 수용된 WT 및 5XFAD 형질전환 (Tg) 마우스의 뇌 균질물에서 사이토카인 단백질의 수준 (n=6-7). 세 그룹의 마우스는 모두 7월령이었다. 히트 맵의 색상은 Z-Score 행에 의해 정규화된 상대 사이토카인 수준을 나타내고; 적색은 상향조절된 사이토카인을 나타내고, 그리고 청색은 하향조절된 사이토카인을 나타낸다.
도 3. APP/PS1 마우스 모델의 행동 변화에 대한 OM1의 효과.
(a) OM1의 구조. OM1은 평균 분자량이 약 1kDa인 이량체에서 십량체까지 범위의 중합도를 갖는 산성 선형 올리고당의 혼합물이다.
(b) APP/PS1 마우스의 공간 학습 및 기억 측정으로서 Morris Water Maze(MWM) 테스트의 탈출 잠복 시간 결과. 9월령 APP/PS1 마우스는 12월령까지 3개월 동안 50 mpk 및 100 mpk의 OM1로 처리되었다. 그 후 추가 6일 동안 공간 학습 및 기억 능력에 대한 MWM 테스트를 수행하였다. 테스트 동안, OM1은 지속적으로 투여되었다. 탈출 잠복 시간 시작(초)은 테스트의 최종 판독값 중 하나로서 측정되었다(방법 참조). 탈출 잠복 시간이 높을수록 이러한 마우스가 목표에 도달하는 데 더 많은 시간을 할애할 수 있음을 보여주며, 이는 공간 학습 및 기억 능력이 심각하게 손상되었음을 나타낸다 (n = 11-14). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. 검은색 별표는 WT와 APP/PS1 그룹 간의 비교를 나타낸다. 청색 별표는 OM1(100 mpk) 처리와 APP/PS1 그룹 간의 비교를 나타낸다. 2-웨이 ANOVA에 의한 *P<0.05, ***P<0.001.
(c) APP/PS1 마우스의 공간 학습 및 기억 측정으로서 MWM 테스트의 플랫폼-사이트 교차의 수. 9월령 APP/PS1 마우스는 12월령까지 3개월 동안 50 mpk 및 100 mpk의 OM1로 처리되었다. 그 후 추가 6일 동안 공간 학습 및 기억 능력에 대한 MWM 테스트를 수행하였다. 테스트 동안, OM1은 지속적으로 투여되었다. 플랫폼-사이트 교차의 수는 테스트의 다른 판독값으로 측정되었다(방법 참조). 플랫폼-사이트 교차 수가 많을수록 공간 학습 및 기억 능력이 덜 심각하게 손상되었음을 나타낸다(n = 11-17). 원-웨이 ANOVA 에 의한 *P < 0.05, ***P < 0.001 (F (3, 55)=6.542).
(d) APP/PS1 마우스에서 Y 미로를 사용하여 테스트한 공간 작업 기억의 정확도. 9월령 APP/PS1 마우스는 12월령까지 3개월 동안 50 mpk 및 100 mpk의 OM1로 처리되었다. 그런 다음 Y 미로 테스트가 수행되었다. 테스트 동안, OM1은 지속적으로 투여되었다. Y 미로의 정확도는 올바른 교번와 전체 교번 사이의 비율이었다 ("재료 및 방법" 참조). 정확도가 높을수록 작업 기억 능력이 덜 심각하게 손상되었음을 나타낸다. (n = 17-20). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. 원-웨이 ANOVA에 의한 **P<0.01, ***P<0.001 (F (3, 71)=12.39).
도 4. OM1은 소화관 미생물총을 재조정하여 신경염증을 완화한다.
(a) 7월령에서 5XFAD(Tg) 마우스 및 OM1 처리된 Tg 마우스에 대한 Bray-Curtis 거리에 기초한 조작 분류 단위(OTU) 수준에 대한 소환관 미생물군집 조성의 주요 좌표 분석(PBA) (n=7). 포인트의 모양과 색상은 각 개체로부터의 샘플을 나타낸다. 유색 타원은 각 테스트 그룹 내에서 0.95 신뢰 구간(CI) 범위를 나타낸다. PC 주요 성분.
(b) 7월령 5XFAD (Tg) 마우스와 OM1 처리 Tg 마우스 사이의 속 수준에서 제시된 상당한 소화관 미생물 변화의 히트 맵 (n=17). 히트맵의 색상은 소화관 미생물총의 상대 존재비를 나타내고; 적색은 상향조절된 박테리아를 나타내고, 그리고 청색은 하향조절된 박테리아를 나타낸다.
(c) 7월령 5XFAD(Tg) 마우스에서 OM1의 경구 위관영양법 전(왼쪽)과 후(오른쪽) 소화관 미생물군집(청색 원 근처에 숫자로 지정)와 뇌 림프구(유색의 원) 사이의 상관관계 연관성의 변화. 오른쪽에는 각 소화관 미생물군집의 이름이 열거되어 있다.
(d) 7월령 5XFAD(Tg) 마우스에서 뇌 Th1 세포의 빈도에 대한 OM1 처리의 효과 (n = 5-7). Th1 세포 수(CD45높은CD4+CXCR3+CCR6-)는 유동 세포측정에 의한 검출 시, CD45높은CD4+ T 세포 수와 관련하여 제시된다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. 스튜던트 t-테스트에 의한 *P<0.05, ***P<0.001.
(e) 7 월령 5XFAD (Tg) 마우스로부터의 해마 조각에서 검출된 IBA1 면역형광 염색의 양성 신호 밀도에 대한 OM1 처리의 효과는 소교세포의 활성화를 반영한다 (n = 4-6). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. 원-웨이 ANOVA에 의한 *P<0.05 (F (2, 15)=21.94).
(f) 사이토카인 항체 어레이에 의한 검출 시, 7월령 5XFAD(Tg) 마우스의 뇌 균질물에서 사이토카인 단백질 수준에 대한 OM1 처리의 효과 (n = 5-6). 히트 맵의 색상은 Z-Score 행에 의해 정규화된 상대 사이토카인 수준을 나타내고; 적색은 상향조절된 사이토카인을 나타내고, 그리고 청색은 하향조절된 사이토카인을 나타낸다.
(g-h) 7월령에서 5XFAD(Tg) 마우스의 해마에서 Aβ-양성 영역(g) 및 타우-양성 영역(h)에 대한 OM1의 효과, 뇌 조각에서 평가됨 (n = 4-7). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. Aβ 분석의 경우: *P<0.05, **P<0.01 (F (2, 14)=22.78). 타우 분석의 경우: 원-웨이 ANOVA에 의한 *P<0.05, ***P<0.001 (F (2, 15)=13.06).
(i) 7월령에서 5XFAD(Tg) 마우스의 식별 학습 능력을 평가하기 위한 테스트에서 80% 성공(방법 참조)을 달성하는 데 걸린 104초(s)의 시간에 대한 OM1의 효과 (n=10-13). 시간은 80% 성능 수준에 도달하는 시간(초)을 의미하고; 시간이 오래 걸릴수록 인지 장애가 더 심해진다(방법 참조). 원-웨이 ANOVA에 의한 *P<0.05, ***P<0.001 (F (2,31) = 9.751).
도 5. OM1은 아미노산 대사를 활용하여 신경염증을 억제한다.
(a) MBROLE를 사용한 OM1 처리 유무에 관계없이 7월령 5XFAD(Tg) 마우스에서 31가지 종류의 대변 대사산물의 경로 풍부화(enrichment) 분석 (n = 6-8). 풍부화 결과 목록은 P-값 < 0.05의 기준을 사용하여 스크리닝된 KEGG 모듈 및 KEGG 효소 상호작용과 함께 제공된다.
(b) WT(n=30) 그룹과 Tg(n=26) 그룹 사이의 혈액 아미노산 목록은 무작위 포레스트 모델(나무 수: 500, 예측변수 수: 7; 무작위성: On; 방법 참조)을 사용하여 질병 진행 기간에서 구별될 수 있다.
(c) WT, Tg 및 OM1 처리된 Tg 마우스의 대변에서 히스티딘, 페닐알라닌 및 이소류신 수준의 변화 (n = 6-11). 적색, 상향조절됨; 청색, 하향조절됨.
(d) WT, Tg 및 OM1 처리된 Tg 마우스의 혈액에서 히스티딘, 페닐알라닌 및 이소류신 수준의 변화 (n = 6-7). 적색, 상향조절됨; 청색, 하향조절됨.
(e) 페닐알라닌 및 이소류신에 의해 유도된 나이브 CD4+ T 세포(Th0 세포)의 Th1 세포로의 분화에 대한 OM1의 효과. 나이브 CD4+ T 세포를 페닐알라닌(1 mM) 또는 이소류신(1 mM)의 존재 하에 OM1의 유무에 관계없이 3일 동안 배양하였다. Th1(CD4+IFN-γ+) 세포의 빈도는 유동 세포측정에 의해 테스트되었다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. n = 그룹당 3번의 복제. 왼쪽, 원-웨이 ANOVA에 의한 *P<0.05, **P<0.01 (F (2, 6)=15.64). 오른쪽, 원-웨이 ANOVA에 의한 *P<0.05, **P<0.01 (F (2, 6)=10.35).
(f) 페닐알라닌 및 이소류신에 의해 유도된 Th1 세포의 증식에 대한 OM1의 효과. 나이브 CD4+ T 세포를 CellTrace로 염색하고 페닐알라닌(1 mM) 및 이소류신(1 mM)의 존재 하에 OM1의 유무에 관계없이 3일 동안 배양하였다. Th1(CD4+IFN-γ+) 세포에서 CellTrace 형광의 밀도는 유동 세포측정에 의해 테스트되었다(방법 참조). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. 원-웨이 ANOVA에 의한 *P<0.05, ***P<0.001 (F (4, 9)=28.34).
(g) 페닐알라닌과 이소류신의 4일 복강내(i.p.) 주사 후 혈액 Th1 세포 변화 (n = 6). 원-웨이 ANOVA에 의한 ***P<0.001 (F (2, 21)=101.8).
(h) AD 환자로 인한 건강한 대조군(HC) 및 경도 인지 장애(MCI)의 아미노산 변화에 대한 랜덤 포레스트 분류. (첫 번째 코호트, AD로 인한 MCI의 경우 n = 9, HC의 경우 n = 18).
(i) AD 환자로 인한 건강한 대조군(HC) 및 경도 인지 장애(MCI)의 혈액 내 Th1 세포의 빈도 (첫 번째 코호트, AD로 인한 MCI의 경우 n = 8, HC의 경우 n = 9). 스튜던트 t-테스트에 의한 *P < 0.05. 세로축은 Th1 세포/CD4+ T 세포의 백분율이다.
(j) AD 환자로 인한 건강한 대조군(HC) 및 경도 인지 장애(MCI)의 혈액 내 페닐알라닌 및 이소류신 수준(두 번째 코호트, 두 그룹 모두 n = 22). 스튜던트 t-테스트에 의한 *P < 0.05.
도 6 AD 진행과 개입 전략에서 신경염증의 개략도
AD 진행 동안 소화관 미생물총의 변경은 무질서한 아미노산 대사 장애를 유발한다. 그것은 나이브 CD4 T 세포가 혈액에서 Th1 세포로 분화하는 것을 촉진한다. 한편, 아미노산과 Th1 세포는 혈액 순환을 통해 뇌로 침윤할 수 있다. 말초 면역 세포 침윤 및 소교세포 활성화는 뇌의 병리학적 신경염증을 유발하여 인지 장애를 유발한다. OM1의 경구 투여는 소화관 미생물총을 복구하고, 아미노산의 비정상적인 생성을 억제하고, 말초 면역 세포가 뇌로 침윤하는 것을 감소시켜 궁극적으로 신경염증을 해결할 수 있다.
도 7
(a-b) 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스(2-, 3-, 5-, 7-, 및 9-월령)로부터의 해마 조각에서 Aβ 양성 영역(a) 및 인산화된 타우(p-TAU) 양성 영역(b)의 변화 (n = 2-7). 대표적인 형광 이미지가 제시되고; 스케일 바는 100 μm를 나타낸다. 라인 차트는 WT 마우스와 관련된 모든 개별 지점의 결과를 요약하고 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. 선에는 삼차 스플라인 알고리즘이 구비되어 있다. M (개월).
(c) WT 및 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스(2-, 3-, 5-, 7-, 및 9-월령)에서 조작상 분류 단위(OTU) 수준에서 소화관 미생물군집 조성의 주성분 분석(PCA)으로부터의 주성분(PC) 1 (n=4-10). 적색 점 및 선, Tg 마우스; 청색 점 및 선, WT 마우스. 피팅 없이 자연스럽게 라인으로 연결된다. 2-테일드 Wilcoxon 순위 합계(순위 합계) 테스트를 사용한다. *는 동일한 그룹의 2월령과 비교하여 유의미한 차이를 나타낸다. *P<0.05, **P<0.01. #는 연령 매칭 WT 마우스와 비교하여 유의미한 차이를 나타낸다. #P<0.05; ##P<0.01; ###P<0.001.
(d) 5XFAD 유전자 변형(Tg) 마우스(2-, 3-, 5-, 7-, 및 9-월령)의 과(family) 수준에서 소화관 미생물의 상대 존재비의 변화 (n=4-10). 다른 색상은 다른 계열을 나타낸다.
(e) 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스(2-, 3-, 5-, 7-, 및 9-월령)의 소화관 미생물군집 조성에 대한 선형 판별 분석 효과 크기(LEfSe) 분석의 분기도 (n=4 -10). 가장 높은 판별력을 가진 박테리아가 매월 그래프 상에 표지된다. 색상은 매월 풍부한 박테리아 분류군을 나타낸다. 내부에서 외부로의 원은 서로 다른 분류학적 수준을 나타낸다(내부에서 외부: 문, 강, 목, 과 및 속). M (개월). 베루코마이크로비아 ; 알파프로테오박테리아 ; 박테로이데테스 ; 프레보텔라세아에 ; 에리시펠로트리치아; 피르미쿠테스 ; 라크노클로스트리듐 .
(f) 3-, 6-, 8-, 9-, 12- 및 14-월령의 APP/PS1 형질전환 마우스의 OTU 수준에서 소화관 미생물군집의 PCA 분석 (n=4-12). 색상과 형상은 상이한 개월의 데이터를 나타낸다. 유색 타원은 각 테스트 그룹 내에서 0.95 신뢰 구간(CI) 범위를 나타낸다. PC 주요 성분.
(g) 3-, 6-, 8-, 9-, 12- 및 14-월령에서 APP/PS1 형질전환 마우스의 문(phylum) 수준에서 소화관 미생물의 상대 존재비의 변화 (n=4-12). 색상은 상이한 문을 나타낸다. M (개월).
(h) IBA1 양성의 변화의 대표적인 형광 이미지는 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스(2-, 3-, 5-, 7-, 및 9-월령) 대 2-월령 야생형 (WT) 마우스로부터의 해마 조각에 있다 (n=2-7). 스케일 바는 작은 브래킷(위쪽)에서 500 μm, 큰 브래킷(아래쪽)에서 250μm를 나타낸다. M (개월).
(i) 유동 세포측정에 의한 검출 시, 3-, 6-, 9- 및 14-월령에서 APP/PS1 마우스의 전뇌 균질물에서 검출된 침윤 세포 (CD45high)의 빈도의 변화 (n = 4-8). 세포 수는 CD45+ 세포의 빈도에 대해 제시되며 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 형식화된다. 선에는 삼차 스플라인 알고리즘이 구비되어 있다.
(j) 유동 세포측정에 의한 검출 시, 3-, 6-, 9- 및 14-월령의 APP/PS1 마우스의 전뇌 균질액에서 침윤 말초 Th1 세포의 빈도의 변화 (n = 3-8). Th1 세포(CD45높은CD4+CXCR3+CCR6-)는 CD45높은CD4+ T 세포의 빈도에 대해 제시된다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. 선에는 삼차 스플라인 알고리즘이 구비되어 있다.
도 8 Mouseac 데이터베이스에서 2-, 4-, 8- 및 18-월령의 5가지 동물 모델 및 야생형(WT) 마우스에서 AD의 특징 변화.
(a) Aβ 플라크 또는 타우 신경원섬유성 엉킴의 상대 밀도 변화 (각 그룹에 대해 n = 4). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. 색상은 상이한 모델을 나타내고; 선은 다항식 알고리즘을 사용하여 적합화된다.
(b) 시냅토파이신의 log2 정규화된 발현 수준의 변화 (각 그룹에 대해 n = 4). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. 색상은 상이한 모델을 나타내고; 선은 다항식 알고리즘을 사용하여 적합화된다.
(c-d) M1 및 M2 세포 수의 변화를 나타내는 CD86 및 ARG1의 log2 정규화 발현 수준의 변화 (각 그룹에 대해 n = 4). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. 색상은 상이한 모델을 나타내고; 선은 다항식 알고리즘을 사용하여 적합화된다.
(e-h) Th1 및 Th2 수의 변화를 나타내는 TIPM, CCL3, GATA-3 및 MIF의 log2 정규화 발현 수준의 변화 (각 그룹에 대해 n = 4). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. 색상은 상이한 모델을 나타내고; 선은 다항식 알고리즘을 사용하여 적합화된다.
도 9
(a) 7월령에서 WT, 공동 수용 WT 및 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스의 식별 학습 능력을 평가하는 테스트에서 80% 성공을 달성하는 데 걸린 104초 중 시간에 대한 공동 수용의 효과 (n = 5-8). 소요 시간은 80% 성능 수준에 도달하는 데 걸리는 시간(초)을 의미하고; 소요 시간이 길수록 인지 장애가 더 심하다(방법 참조).
(b) WT 또는 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스의 대변을 사용하여 Aβ(방법 참조)를 주사한 WT 수령체 마우스의 뇌 면역 세포(Th1 및 Th2) 수에 대한 대변 미생물총 이식(FMT)의 효과. Th1 세포 (CD45높은CD4+CXCR3+CCR6-) 및 Th2 세포(CD45높은CD4+CXCR3-CCR6-CCR4+)는 CD45높은CD4+ T 세포(n = 6-8)와 관련하여 표시되고; 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. *P<0.05, 스튜던트 t 테스트.
(c) 2월령 WT 마우스의 FMT가 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스의 뇌 Th1 세포에 미치는 영향. (n = 6-7). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. *P<0.05, 스튜던트 t 테스트.
도 10
(a) OM1으로 경구 처리된 7월령 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스의 소화관 미생물군집 조성의 선형 판별 분석 효과 크기(LEfSe) 분석의 분기도 (n=5-7). 가장 높은 판별력을 가진 박테리아의 문 수준은 그래프 상에 표지된다. 청색, 7월령 Tg 마우스에 풍부한 박테리아. 적색, OM1을 받은 7월령 Tg 마우스에 풍부한 박테리아. 내부에서 외부로의 원은 서로 다른 분류학적 수준을 나타낸다(내부에서 외부: 문, 강, 목, 과 및 속). M (개월).
(b-c) OM1에 의해 유발된 상향조절 및 하향조절된 미생물을 갖는 미생물총과 7월령의 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스에서 뇌 면역 세포 하위유형의 빈도 사이의 상관관계. 황색 별표(*)가 있는 적색(양의 상관관계) 또는 청색(음의 상관관계)의 사각형은 Pearson 파라미터 상관관계 테스트로 측정한 P < 0.05이며, 각 사각형의 숫자는 상관 계수이다.
(d) WT, Tg 및 OM1 처리 Tg의 뇌 해마에서 IBA1 염색, Aβ 침착 및 타우 인산화의 대표적인 이미지. 스케일 바는 250 μm를 나타낸다. 암갈색으로 표시된 기질 3,3' 디아미노벤지딘(DAB)을 사용하여 양성 신호를 시각화하였다.
(e) Aβ 해마 주사가 있는 수령체 C57 마우스의 뇌 Th1 세포에 대한 WT, Tg 및 OM1 처리 Tg 마우스로부터의 FMT의 효과 (n = 4-5). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다.
(f) OM1으로 경구 처리된 6-월령 APP/PS1 형질전환 모델 마우스에서 속 수준에 대한 소화관 총미생물의 상대 존재비에 대한 항생제 치료 (암피실린 (0.1 mg/mL), 스트렙토마이신 (0.5 mg/mL), 및 콜리스틴 (0.1 mg/mL)의 효과 (n = 6-8). 색상은 상이한 속을 나타낸다.
(g) 항생제 처리된 6월령 APP/PS1 마우스의 뇌 Th1 세포 빈도에 대한 OM1의 효과 (방법 참조). Th1 세포 (CD45높은CD4+CXCR3+CCR6-)는 CD45높은CD4+ T 세포(n = 6-8)와 관련하여 표시되고; 그리고 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. 왼쪽에서 오른쪽으로: *P<0.05, 스튜던트 t 테스트. NS, 유의성 없음.
(h) 항생제 처리된 6월령 APP/PS1 마우스로부터의 해마 조각에서 검출된 IBA1 양성 면역 형광 염색의 상대 밀도에 대한 OM1의 효과 (n = 4-6, 방법 참조). IBA1 양성 영역은 소교 세포의 활성화를 반영한다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. *P<0.0001, 스튜던트 t-테스트. NS, 유의성 없음.
(i) 항생제 여부에 관계없이 APP/PS1 및 OM1 처리된 APP/PS1 마우스의 뇌에서 IBA1의 대표적인 면역형광 염색. IBA1은 녹색으로 표시된 FITC 접합 이차 항체를 사용하여 시각화되었다. 핵은 청색으로 표시된 DAPI로 염색되었다. 스케일 바는 250 μm를 나타낸다.
(j) 사이토카인 항체 어레이에 의해 검출된 7월령 APP/PS1 마우스의 뇌 균질물에서 사이토카인 수준에 대한 OM1의 효과 (n = 5-6). 히트 맵의 색상은 Z-Score 행에 의해 정규화된 상대 사이토카인 수준을 나타내고; 적색은 상향조절된 사이토카인을 나타내고, 그리고 청색은 하향조절된 사이토카인을 나타낸다.
도 11
(a) 나이브 CD4+ T 세포로 처리된 박테리아 상청액을 Th1 및 Th2 세포로 분화시키는 데 대한 OM1의 효과. 나이브 CD4 T 세포를 배양하고 OM1의 존재/부재 하에 5XFAD 마우스의 미생물총으로부터의 상청액을 3일 동안 첨가하였다. Th1 (CD4+IFN-γ+) 세포 및 Th2(CD4+IL-4+) 세포는 유동 세포측정에 의해 게이팅되었다(gated). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± sem)로 표시된다. n = 그룹당 3번의 복제.
(b-c) 화산 플롯은 7-월령 WT 및 5XFAD (Tg) 마우스 (n=6-8) (b) 및 OM1로 처리되거나 처리되지 않은 7-월령 Tg 마우스 (n=6) (c)의 소화관 대변 대사체학의 원시 데이터로부터의 대사산물의 분포를 도시한다. 적색 점은 크게 변화하는 대사산물을 나타낸다. 유의성은 스튜던트 t-테스트의 P-값 < 0.05 및 (T)와 야생형(WT)의 배수 변화 (FC) 사이의 < 0.83 또는 > 1.2의 배수 변화 (FC)로 정의된다. x축은 log2FC를 표시하고 y축은 -log10 P를 표시한다.
(d-e) Tg와 WT 마우스(d) 사이에 차등적으로 조절된 786개 대사산물 및 OM1 처리와 미처리 Tg 마우스(e) 사이의 149개 대사산물의 히트맵 (n=6-8). 주요 피크의 분자 질량 데이터(m/z)를 온라인 METLIN 데이터베이스와 정렬하여 이러한 대사산물을 확인하고 주석을 달았다.
(f) 벤(Venn) 다이어그램은 Tg와 WT 마우스(T_W) 사이 및 OM1 처리와 미처리 Tg 마우스(Ttreat_T)(n=6-8) 사이에서 일반적으로 조절되지 않는 소화관 대변 대사산물을 보여준다 (n=6-8). 124개의 대사산물은 2개의 비교에서 반대 패턴, 즉, 대사산물은 T_W가 높고 Ttreat_T가 낮거나 둘 모두 및 T_W가 낮고 Ttreat_T가 높은 둘 모두이다.
(g) 히트맵은 모든 3개의 데이터베이스에 매칭될 수 있는 WT, Tg 및 OM1 처리된 Tg 군 (n=6-8) 사이에서 차별적으로 조절된 31개의 확인된 대사산물을 나타낸다 (인간 대사산물 데이터베이스 (HMDB), METLIN, Kyoto Encyclopedia of Genes 및 Genomes (KEGG)). 적색, 상향조절됨; 청색, 하향조절됨.
(h) 질환 진행 동안 모든 아미노산의 수용체 작동 특성(ROC) 곡선 및 곡선 아래 면적(AUC) 값은 랜덤 포레스트 알고리즘을 사용하여 계산된다.
(i) 혈액 페닐알라닌 및 이소류신 수준에 대한 대변 미생물군집 이식(FMT)의 효과. 2월령 WT 마우스의 대변을 7월령 Tg 마우스에 이식하였다 (n = 6-7). 페닐알라닌의 경우, ***P < 0.001((F(2,17) = 26.59)). 이소류신의 경우, 원-웨이 ANOVA에 의한 **P <0.01 (Tg 대 WT), **P <0.01 (Tg + FMT 대 Tg) (F (2, 17) = 8.181).
(j) 다양한 개월(M)의 WT, 공동 수용 WT 및 Tg의 혈액 샘플에서 아미노산 수준. 적색, 상향조절됨; 청색, 하향조절됨.
(k) 나이브 CD4 T 세포에 의한 페닐알라닌의 흡수. 나이브 CD4 T 세포를 0.5시간 동안 13C로 표지된 페닐알라닌의 유무에 따라 배양하였다. 페닐알라닌 관련 화합물의 질량 분광분석을 테스트하였다. 13C-페닐알라닌은 5 mmol/L의 농도로 투여되며 L형 아미노산의 수송체에 의해 흡수된다.
도 12. JPH203 50 mg/kg은 뇌에서 Th1 세포의 비율을 효과적으로 억제한다.
도 13. 대조군과 비교한 OM1 투여 후 엔테로박테리아의 OTU 수준 변화 추세 - 이식 1주 후 대변의 페닐알라닌 함량에 대한 페닐알라닌 분해 박테리아의 효과의 PCoA 분석.
도 14. 대조군과 비교하여 OM1 투여 후 엔테로박테리아의 상대적 존재비의 변화 경향. 이식 1주일 후 혈액 내 Th1 세포 비율에 대한 페닐알라닌 분해 박테리아의 영향.
도 15. OM1 투여 후 대조군과 비교한 뇌 사이토카인 함량의 변화 경향.
도 16. 소화관 미생물의 상대 존재비를 조절하는 데 사용되는 제제의 적용 전후에 소화관 미생물 분포의 변화: OM1 또는 대변 박테리아(소화관 미생물 복합체).
도 17. AD 및 HC의 문 수준과 속 수준의 차이, 부분적으로 자세히 나열됨. AD: AD 환자; HC: 건강한 대조군 건강한 대조군.
도 18. 일부 AD 및 HC는 세균총(속 및 종 수준)을 크게 변경하였다. AD: AD 환자; HC: 건강한 대조군 건강한 대조군.
도 19. AD와 관련된 아미노산 목록. 다변량 ROC 곡선 기반 탐색적 분석 (Explorer)을 사용하여 야생형 마우스 및 상이한 월령의 5XFAD 마우스의 혈액 아미노산을 분석하고, 야생형 마우스를 5XAFD 마우스와 구별하는 마커로서 잠재적 아미노산 조합을 확인하였다. 다음은 선택 빈도 및 모든 종류별로 분류된 상위 15개 아미노산 목록이다.
도 20. 6.5월령 5XFAD 마우스는, 1개월 동안 100 mpk OM1을 받은 후 야생형 마우스의 혈액 아미노산으로 회복되는 경향이 있는 혈액 아미노산을 갖는다.
도 21. 6.5월령 5XFAD 마우스는, 1개월 동안 100 mpk OM1을 받은 후 야생형 마우스의 대변 아미노산으로 회복되는 경향이 있는 대변 아미노산을 갖는다.
도 22. OM1 투여 후 역전된 사이토카인의 목록. 6.5월령 5XFAD 마우스는, 1개월 동안 100mpk OM1 처리를 받았고, 야생형 마우스로 회복되는 경향이 있는 뇌 사이토카인을 갖는다.
도 23. 상이한 월령의 APP/PS1 마우스에서 뇌 M1 세포의 변화 경향.
이제, 본 명세서에 개시된 생성물, 방법 및 용도의 구조, 기능, 제조 및 적용 원리의 포괄적인 이해를 제공하기 위해 특정 예시적인 구현예가 기재될 것이다. 이러한 구현의 하나 이상의 예는 나중에 예시될 것이다. 당업자는 본원에 구체적으로 기재되고 첨부된 도면에 구체적으로 예시된 생성물, 방법 및 용도가 비제한적인 예시적인 구현예이고, 본 발명의 범주는 단지 청구범위에 의해서만 제한된다는 것을 이해할 것이다. 하나의 예시적인 구현예와 함께 예시되거나 설명된 특징들은 다른 구현예들의 특징들과 조합될 수 있다. 이러한 수정 및 변경은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 의도된다. 여기에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 발명을 기재하는 문맥에서 (특히 하기 청구범위의 문맥에서) 본원에 달리 언급되거나 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 용어 "하나" 및 "그" 및 유사한 표현의 사용은 단수 및 복수 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 달리 명시되지 않는 한 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)" 및 "함유하는(containing)"이라는 용어는 개방형 용어 (즉, "포함하나, 이에 제한되지는 않음")로서 해석되어야 하지만, 이들은 또한 "실질적으로 이루어지는" 또는 "이루어지는"의 부분적으로 폐쇄형 또는 폐쇄형 용어를 포함한다. 본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 수치 범위의 설명은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 독립적으로 언급하기 위한 속기 방법으로서 사용되도록 의도되고, 각각의 개별 값은 본 명세서에 독립적으로 인용된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 기술된 모든 방법은 본 명세서에 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 본 명세서에서 어떠한 언어도 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실시에 필요하다는 것을 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다. 모든 백분율은 중량 백분율이고 모든 중량 백분율은 조성물의 총 중량을 기준으로 한다(임의의 농도 및/또는 희석 없음). "하나 이상"이라는 표현은 "둘 이상" 및 "셋 이상" 등을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예가 본 명세서에 기재되어 있다. 상기 설명을 읽은 후, 이들 바람직한 구현예에 대한 변화는 당업자에게 자명해질 수 있다. 본 발명자는 당업자로 하여금 이러한 변화를 적절하게 채택할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본 발명이 본 명세서에 구체적으로 기재된 것과 상이한 방식으로 구현될 것으로 예상한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용 가능한 첨부된 특허청구범위에 기재된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 본원에 달리 언급되거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 본 발명은 상기 언급된 요소의 모든 가능한 변형의 임의의 조합을 포함한다.
본 출원에서 언급된 일련의 값들인 경우, 임의의 언급된 값은 수치 범위의 상한 또는 하한일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명은 이러한 모든 수치 범위, 즉 상한과 하한의 조합을 갖는 범위를 포함하며, 여기서 상한 및 하한의 각각의 값은 본 발명에 열거된 임의의 수치 값일 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명이 제공하는 범위는 그 범위 내의 모든 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 1-10은 값 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10 모두를 포함하는 것으로 이해되어야 하고, 적절한 경우 분수 값을 포함한다. 특정 값(예를 들어, 최대 5)을 "최대"로 표현되는 범위는 모든 값(범위의 상한을 포함함), 예컨대 0, 1, 2, 3, 4 및 5로서 이해되어야 하고, 적절한 경우 분수 값을 포함한다. 최대 1주 또는 1주 내에 는 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 유사하게, "적어도"로 정의된 범위는 제공된 더 낮은 값과 모든 더 높은 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
달리 명시되지 않는 한, 모든 백분율은 중량/중량이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "약/대략"은 특정 분야에서 평균 값의 3개의 표준 편차 내에 또는 표준 허용 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 특정 구현예에서, 약은 0.5 이하의 변동으로서 이해되어야 한다. 약/대략은 그 후에 열거된 모든 값을 변형시킨다. 예를 들어, "약 1, 2, 3"은 "약 1", "약 2", "약 3"을 의미한다.
문맥상 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 용어 "또는" 은 용어 "및/또는" 을 지칭하기 위해 본 발명에서 포괄적으로 사용되고, 이와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "예컨대/예를 들어(for example)/예를 들어(e.g.)"는 본 발명에서 어구 "예컨대/예를 들어/예를 들어(e.g.) 이에 제한되지 않지만"를 지칭하기 위해 사용되며, 그와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
당업자는 상기 다양한 구현예에 기재된 기술적 특징이 단독으로 또는 본 발명의 다양한 측면의 기술적 해결책과 조합되어 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명자들은 중증 및 가속화된 인지 장애로 인해 AD 연구에서 널리 사용되는 5XFAD 형질전환 (Tg) 마우스 모델을 사용하였다. AD 진행의 다른 단계에서 Tg 마우스와 WT 마우스의 장관형을 분석함으로써 Tg 마우스의 소화관 미생물총이 매우 동적인 것으로 밝혀졌다(도 1d). 2 내지 3월령에, 박테로이데테스 , 피르미쿠테스 및 베루코마이크로비아가 가장 풍부한 세 가지 박테리아 문(각각 46.8%, 32.3% 및 12.6%)인 반면, 7-9월령에는 피르미쿠테스가 우세한 박테리아가 되었으며, 박테로이데테스 및 베루코마이크로비아의 존재비는 현저하게 감소하였다. 이것은 WT 마우스의 소화관 미생물총과 뚜렷한 대조를 이룬다.
본 발명자들은 또한 말초 면역 세포 Th1 및 Th1 및 소교세포 M1 및 M2를 분석하였고, CD4+ 세포의 2개의 주요 하위유형(침윤성 Th1 및 Th2 세포)이 소교세포의 2개의 주요 하위유형(M1 및 M2 소교세포)과 유사한 역학을 보인다는 것을 발견하였다 (도 1f 및 도 1j). 초기 단계에서, 주로 Th2 세포와 신경보호성 M2 소교세포이며, 후기 단계에서, 주로 Th1 세포와 전염정성 M1 소교세포이다. 본 발명자들은 소화관 미생물총 패턴이 변화함에 따라 면역 세포 집단이 Th1 및 M1이 지배하는 상태에 도달하는 경향이 있다고 믿는다.
본 발명자들은 또한 Tg 마우스에서 소화관 미생물총과 뇌 면역 세포의 존재비 사이의 상관관계를 분석했으며, 또한 초기 단계(2-3개월)의 박테리아 조성이 M2 및 Th2 세포의 수와 높은 상관관계가 있다는 점에 주목하였고 (도 1k, 위쪽), 한편 후기 단계(7-9개월)에서, 박테리아 패턴의 변화는 M1 및 Th1 세포와 높은 상관관계가 있다(도 1k, 아래쪽). 전반적으로 이러한 결과는, AD의 진행 동안 장내 박테리아가 말초 면역 세포 침윤 및 신경염증과 관련이 있음을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은, 소화관 미생물총 세균불균형이 다양한 말초 면역 세포 (CD4+ 및 CD8+ T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 호중구, 수지상 세포 (DC) 및 단핵구 포함)의 뇌로의 침윤에 필요하다는 것을 밝혔다. 이들 중에서, Th1 세포는 AD의 진행 동안 M1 소교세포의 활성화와 밀접한 관련이 있기 때문에 특히 주목할 만하다. 뇌에서 Th1과 M1 소교세포 사이의 인식된 기능적 누화(crosstalk)의 관점에서, 본 발명자들은 장내 세균불균형이 Th1 세포 침윤을 촉진하여 M1 소교세포와의 국소 누화를 허용함으로써 소교세포를 전염정성 상태로 분화시키는 것을 촉발한다고 제안한다. 이 연구에서 얻은 일련의 발견을 통해, 이러한 메커니즘 통찰력이 강화되었다. 첫째, AD의 진행 동안 소화관 미생물총의 구성의 동적 변화는 Th1 세포 침윤의 증가와 유의하게 관련이 있다. 둘째, 항생제 치료에 의한 소화관 미생물총의 절제는 AD 마우스에서 Th1 세포 침윤 및 M1 소교세포의 후속 활성화를 차단하였다(도 2a 내지 c). 셋째, 장기간의 대변 박테리아 노출(동거 실험) 및 AD 마우스로부터의 대변 박테리아의 대변 미생물총 이식은 모두 WT 마우스에서 Th1 세포 침윤(도 2e) 및 M1 소교세포 활성화를 크게 향상시킨 반면, WT 마우스 대변 미생물총의 Tg 마우스로의 이식은 수령체 Tg 마우스의 Th1 세포를 감소시켰다(도 9c). 본 발명가의 연구 결과는 전반적으로 소화관 미생물총이 AD의 진행에서 Th1/M1 소교세포 주도 신경염증을 촉진하는 추진 요인으로 강조한다.
AD에서 소화관 미생물총 세균불균형과 신경염증 사이의 인과관계는 아직 명확하지 않다. 이 연구에서, 본 발명자들은 WT 마우스와 비교하여 AD 마우스에서 100개 초과의 대사산물이 유의하게 변화되었음을 검출하였다. 이들 중에서, 아미노산, 특히 페닐알라닌 관련 경로에서 가장 큰 변화가 나타났다. 본 발명자들은 WT 마우스에 비해 AD 마우스의 대변 및 혈액에서 페닐알라닌 및 이소류신의 존재비가 증가함을 확인할 수 있었다. 시험관 내 및 생체 내 기능 평가 둘 다 말초 염증성 Th1 세포의 분화 및 증식을 촉진하는 데 페닐알라닌과 이소류신의 역할이 밝혀졌다. 소화관 미생물총을 제거하기 위해 항생제를 사용하면 혈액 페닐알라닌과 이소류신, Th1 세포 침윤 및 M1 세포 활성화가 동시에 감소하였다. 이러한 발견은 Th1 세포가 지배하는 신경염증을 자극하는데 있어 소화관 미생물총에서 페닐알라닌과 이소류신의 비정상적인 생산의 역할을 강조한다. 이러한 관점과 일치하게, 본 발명자들은 AD으로 인한 MCI 환자의 혈액 내 페닐알라닌/이소류신 농도 및 Th1 세포 수가 건강한 대조군보다 더 높다는 것을 발견하였다.
새로 나온 데이터는 다당류 또는 올리고당류가 소화관 미생물총을 조절하는 이점이 있음을 보여준다. 만누론산 올리고당은 탄수화물 기반 항-AD 약물이다. 최근 중국에서 완료된 3상 임상 시험에서, 경도 에서 중간 정도의 AD 환자의 인지 장애를 개선하는 것으로 입증되었다. 만누론산 올리고당은 잘 용인되고 위약 대조군과 유사한 안전성을 가지고 있다. 이 연구에서, 본 발명자들은, OM1이 소화관 미생물총을 효과적으로 재조정하고(도 4a-b; 도 10a), 대변과 혈액에서 페닐알라닌과 이소류신의 양을 감소시키고(도 5c-d), 그리고 Th1 관련 신경염증을 감소시킨다(도 4g-i)는 것을 발견하였다. OM1으로 치료된 Tg 대변은 OM1 치료 자체의 치료 효과를 크게 모방할 수 있으며 항생제 치료는 치료 효과를 제거한다는 점은 주목할 가치가 있다. 이러한 발견은, OM1의 치료 효과가 주로 소화관 미생물군집의 회복을 통한 것이라는 중요한 증거를 제공한다. 따라서 OM1은 미생물총에 중점을 둔 AD 치료 전략에 대한 매력적인 접근 방식을 제공할 수 있으며, 이는 추가 연구 가치가 있다.
이러한 모든 발견을 통해 본 발명자들은 AD의 병인을 이해하는 데 있어 개념적 발전을 제안할 수 있다. AD는 국소 Aβ에 의해 유발되는 뇌 질환일 뿐만 아니라 그 발달에는 장, 뇌 및 중간 염증 인자 사이의 전신적 상호작용이 필요하다(도 6). Aβ 침착의 경우, AD의 진행 동안 변경된 소화관 미생물총 조성은 아미노산(특히 페닐알라닌 및 이소류신)의 비정상적 증가를 유발한다. 이들 아미노산은 혈액 순환을 통해 말초 Th1 세포가 뇌로 침윤하는 것을 촉진한다. 말초 Th1 세포에 침윤하면 뇌의 M1 소교세포와 국소적으로 누화하여 병리학적 신경염증 및 인지 장애를 유발할 수 있다. AD의 병인에 대한 이러한 통찰력은 항신경염증 반응을 촉진하고 새로운 치료 해결책을 제공하기 위해 소화관 미생물총을 재조정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명자의 연구 결과는 AD의 진단 및 치료에 변환적 중요성을 가질 수 있다. 특정 박테리아 (예를 들어, Th1/M1 관련된 박테리아), 아미노산 (예를 들어, 페닐알라닌 및 이소류신) 및 뇌 침윤 면역 세포 (예를 들어, Th1 세포 우세) 또는 이들 중 하나 이상의 조합의 조성은 AD으로 인한 MCI 환자의 조기 진단 바이오마커로 사용되며 대규모 AD 환자 코호트에서 추가로 검증할 가치가 있다.
더 중요하게는, 미생물총을 중심으로 한 OM1의 확립된 항-AD 효과는 소화관 미생물총을 재형성함으로써 AD 치료를 위한 새로운 치료적 접근을 열고, 매우 미발견된 당 화학을 탐구함으로써 미래에 효과적인 요법의 개발을 안내할 것이다.
뇌-소화관 축과 관련하여 본 발명자들에 의해 확인된 수많은 특징적인 소화관 미생물, 아미노산, 면역 세포 및 사이토카인은 각각 소화관 미생물 프로파일, 아미노산 프로파일, 면역 세포 프로파일 및 사이토카인 프로파일을 구성한다. 이러한 프로파일 중 하나 이상(예를 들어, 소화관 미생물 프로파일)은 정상적인 개체와 병든 개체 간의 차이를 보여준다. 본 발명은 이들 프로파일 (예컨대 소화관 미생물 프로파일) 중 하나 이상을 검출하거나 조절함으로써 개체의 상태를 검출하거나 조절하는 것을 목적으로 한다. 일부 구현예에서, 진단 목적을 위해, 개체의 프로파일 (예를 들어, 소화관 미생물 프로파일)은, 개체가 정상적인 상태 또는 병든 상태에 있는지의 여부를 결정하기 위해, 상응하는 정상적인 개체의 정상적인 특징을 갖는 프로파일 (예를 들어, 소화관 미생물 프로파일) 및/또는 상응하는 병든 개체의 질환 특징을 갖는 프로필 (예를 들어, 소화관 미생물 프로파일)과 비교하기 위해 검출될 수 있고, 이에 의해 개체를 진단한다. 일부 구현예에서, 치료 목적을 위해, 질환 특징을 갖는 개체의 프로파일이 상응하는 정상적인 개체의 프로파일로 조절될 수 있으므로, 개체의 질환 상태가 정상적인 상태로 조절되어 개체를 치료할 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 대상체의 알츠하이머병을 치료하기 위한 약제의 제조에서 포유동물 말초 혈액의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하기 위한 제제의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 알츠하이머병을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 포유동물 말초 혈액에서 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하기 위한 제제를 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 아미노산은 다음으로부터 선택된 하나 이상이다: 4-OH 프롤린, 아세틸오르니틴, 알라닌, 알파-아미노아디프산, 아스파라긴, 아스파르트산, 비대칭 디메틸아르기닌, 베타-알라닌, 카르노신, 시트룰린, 크레아티닌, GABA, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 하이포타우린, 이소류신, 카이뉴레닌, 류신, 라이신, 메티오닌, 메티오닌 설폭사이드, 오르니틴, 페닐알라닌, 피페콜산, 프롤린, 푸트레신, 파이로글루탐산, 세린, 세로토닌, 타우린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린; 바람직하게는 페닐알라닌, 이소류신, 세로토닌, 히스티딘 및 아세틸오르니틴으로부터 선택된 하나 이상; 더 바람직하게는 페닐알라닌 및/또는 이소류신; 가장 바람직하게는 페닐알라닌.
일부 구현예에서, 제제는 수송체에 의해 나이브 T 세포로의 아미노산의 수송을 억제함으로써 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제한다.
일부 구현예에서, 수송체는 SLC7A5이다.
일부 구현예에서, 제제는 JPH 203, BCH 및 KMH-233으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 대상체로부터의 샘플에서 CD4+ T 세포 내의 염증유발 Th1 세포의 비율을 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 초과까지 감소시키고/감소시키거나; CD4+ T 세포에서 염증유발 Th1 세포의 비율이 상응하는 정상적인 대상체의 CD4+ T 세포에서 염증유발 Th1 세포의 상응하는 비율에 근접하거나 도달하도록 한다.
일부 구현예에서, 제제는 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수 수준을 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 또는 그 초과까지 감소시키고/감소시키거나; 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수 수준이 상응하는 정상적인 대상체의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상응하는 상대적 흡수 수준에 근접하거나 도달하도록 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 알츠하이머병 치료에 사용할 수 있는 약물 후보를 스크리닝하는 방법을 제공한다:
a) 수송체 SLC7A5이 있는 생체내 또는 시험관내 모델에 시험 제제를 투여하는 단계, 및
b) 알츠하이머병 치료에 사용될 수 있는 약물 후보로서 수송체 SLC7A5를 억제하는 시험 제제를 선택하는 단계.
일부 구현예에서, 방법은 JPH 203을 양성 대조군으로서 수송체 SLC7A5가 있는 생체내 또는 시험관내 모델에 투여하는 단계, 바람직하게는 JPH 203과 실질적으로 일관되게 수송체 SLC7A5를 억제하는 시험 제제를 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 모델은 생체내 모델이다.
일부 구현예에서, 방법은 검증을 위해 선택된 시험 제제를 수송체 SLC7A5가 있는 생체내 모델에 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 선택된 시험 제제는 생체내 모델로부터의 샘플에서 CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 비율을 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 초과까지 감소시키고/감소시키거나; CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 비율이 상응하는 정상적인 생체내 모델에서 CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 상응하는 비율에 근접하거나 도달하도록 한다.
일부 구현예에서, 방법은 검증을 위해 수송체 SLC7A5가 있는 생체내 또는 시험관내 모델에 선택된 시험 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 선택된 시험 제제는 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수 수준을 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 또는 그 초과까지 감소시키고/거나; 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수 수준이 상응하는 정상적인 생체내 또는 시험관내 모델의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상응하는 상대적 흡수 수준에 근접하거나 도달하도록 한다.
일부 구현예에서, 아미노산은 다음으로부터 선택된 하나 이상이다: 4-OH 프롤린, 아세틸오르니틴, 알라닌, 알파-아미노아디프산, 아스파라긴, 아스파르트산, 비대칭 디메틸아르기닌, 베타-알라닌, 카르노신, 시트룰린, 크레아티닌, GABA, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 하이포타우린, 이소류신, 카이뉴레닌, 류신, 라이신, 메티오닌, 메티오닌 설폭사이드, 오르니틴, 페닐알라닌, 피페콜산, 프롤린, 푸트레신, 파이로글루탐산, 세린, 세로토닌, 타우린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린; 바람직하게는 페닐알라닌, 이소류신, 세로토닌, 히스티딘 및 아세틸오르니틴으로부터 선택된 하나 이상; 더 바람직하게는 페닐알라닌 및/또는 이소류신; 가장 바람직하게는 페닐알라닌.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 알츠하이머병 환자의 치료 방법을 제공한다:
포유동물 말초 혈액의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하기 위한 제제를 환자에게 투여하는 단계로서, 환자의 CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 비율이 상응하는 정상적인 집단에서 CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 상응하는 비율에 근접하거나 도달하도록 조절되는, 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 알츠하이머병 환자의 치료 방법을 제공한다:
포유동물 말초 혈액의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하기 위한 제제를 환자에게 투여하는 단계로서, 환자의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수 수준이 상응하는 정상적인 집단에서 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상응하는 상대적 흡수 수준에 근접하거나 도달하도록 조절되는 단계.
일부 구현예에서, 탄수화물 약물은 OM1이다.
일부 구현예에서, 탄수화물 약물은 OM1이 아니다.
일부 구현예에서, 만누론산 올리고당은 OM1이다.
일부 구현예에서, 만누론산 올리고당은 OM1이 아니다.
만누론산 올리고당의 구조 및 제조 방법은 많은 선행 기술 문헌에 기재되어 있다. 선행 기술 특허 CN2016100697039는 올리고만누론산의 제조 방법을 개시하고, 선행 기술 특허 CN2017107964853은 만누론산의 중량 평균 분자량 및 양을 결정하는 방법을 개시하고, 선행 기술 특허 CN2017114675966은 만누론산의 조성물 및 그것의 제조를 개시하고. 그들 모두는 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 사용된 OM1은 CN2018107213276("알긴산 올리고사카린산 조성물")에 따른 조성물 A이며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다.
미생물총
대상체의 장관 내 미생물총을 변경하는 것을 포함하는 방법 및 조성물이 본 명세서에 개시된다. "미생물총"이라는 용어는 유기체의 장관에서 발견되거나 존재(집락화)할 수 있는 하나 이상의 박테리아 공동체를 지칭하는 데 사용된다. 본 명세서에서 "미생물(microbes)/미생물(microorganism)" 또는 "소화관 미생물(gut microbes)/미생물(microorganism)"과 상호교환 가능하게 사용할 수 있다. 하나 이상의 미생물총을 언급할 때, 미생물총은 동일한 유형(균주)일 수 있거나 그룹, 예컨대 박테로이데테스, 프로테오박테리아, 및/또는 피르미쿠테스, 또는 그것의 하위-그룹 (클래스, 목, 과, 속, 종)의 혼합물일 수 있다. 미생물총은 동일한 수준의 미생물, 예컨대 박테로이데테스, 프로테오박테리아 및/또는 피르미쿠테스의 혼합물일 수 있고, 그것은 또한 상이한 수준의 미생물, 예컨대 박테로이데테스 및 프로테오박테리아의 혼합물일 수 있다.
일부 구현예에서, 소화관 미생물은 표 1의 문, 강, 목, 과, 속 또는 종, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 소화관 미생물은 표 2의 문, 강, 목, 과, 속 또는 종, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 소화관 미생물은 피르미쿠테스 , 박테로이데테스 , 프로테오박테리아 , 악티노박테리아 , 푸소박테리아 , 시아노박테리아, 베루코마이크로비아, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 소화관 미생물은 하기 표의 문 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상이다:
Figure pct00002
일부 구현예에서, 소화관 미생물은 하기 표의 강 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상이다:
Figure pct00003
일부 구현예에서, 소화관 미생물은 하기 표의 목 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상이다:
Figure pct00004
일부 구현예에서, 소화관 미생물은 하기 표의 과 또는 그의 조합으로부터 선택된 하나 이상이다:
Figure pct00005
일부 구현예에서, 소화관 미생물은 하기 표의 속 또는 그의 조합으로부터 선택된 하나 이상이다:
Figure pct00006
일부 구현예에서, 소화관 미생물은 하기 종 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상이다:
Figure pct00007
Figure pct00008
본 발명자들은, 다양한 소화관 미생물이 본 발명에 따른 뇌-소화관 축에 관여함을 발견하였다. 실시예에 나타난 바와 같이, WT 마우스와 TG 마우스 사이에서, 일부 소화관 미생물의 수준이 변화하였고, 예를 들어 OM1의 투여 후에, 이러한 소화관 미생물의 수준이 WT 마우스를 향해 회복되었다. 이러한 소화관 미생물은 소화관 미생물의 프로파일을 구성한다. 상기 언급된 바와 같이, 이러한 프로파일은 진단 및/또는 치료 목적으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 소화관 미생물의 수준에 대한 대상체의 상기 표로부터의 문, 강, 목, 과, 속, 및 종으로부터의 소화관 미생물의 1 이상 (즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 또는 67)의 수준의 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)은, 대상체가 AD를 가질 위험에 있거나 AD를 가지고 있음을 나타낸다. 한 구현예에서, 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 소화관 미생물의 수준에 대한 대상체에서 상기 표의 문, 강, 목, 과, 속, 및 종의 소화관 미생물로 이루어진 소화관 미생물 프로파일에서의 소화관 미생물의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 수준의 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)은, 대상체가 AD를 가질 위험에 있거나 AD를 가지고 있음을 나타낸다.
일부 구현예에서, 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 소화관 미생물의 수준에 대한 상응하는 정상적인 대상체에서의 상응하는 소화관 미생물 수준에 대한 AD를 갖는 대상체의 상기 표로부터의 문, 강, 목, 과, 속, 및 종으로부터 선택된 소화관 미생물의 1 이상 (즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 또는 67)의 수준의 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)는, 대상체가 적절한 치료를 받고 있음을 나타낸다. 한 구현예에서, 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 소화관 미생물의 수준에 대한 상응하는 정상적인 대상체에서의 상응하는 소화관 미생물 수준에 대한 AD를 가지고 있는 대상체에서 상기 표의 문, 강, 목, 과, 속, 및 종의 소화관 미생물로 이루어진 소화관 미생물 프로파일에서의 소화관 미생물의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 수준의 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)는, 대상체가 적절한 치료를 받고 있음을 나타낸다.
소화관 미생물의 상대 존재비(relative abundance)는 다음의 방식으로 본 발명의 조성물 또는 방법을 사용하여 변할 수 있다: 관련된 미생물총을 포함하는 조성물을 투여하거나, 또는 관련된 소화관 미생물의 상대 존재비를 상당히 증가시키고/시키거나 감소시키는 하나 이상의 화합’P을 포함하는 조성물을 투여한다.
박테로이데테스는 세 가지 주요 강의 박테리아로 구성된다: 박테로이디아 , 플라보박테리아 및 스핑고박테리아. 토양, 침강물, 해수, 동물의 장과 피부를 포함한 환경에 분포한다.
프로테오박테리아는 최대 박테리아 문이다. 이 유기체는 매우 높은 대사 다양성을 나타내며 대부분의 알려진 박테리아의 의학적, 산업적 및 농업적 중요성을 나타낸다. 이것은 진화적으로, 지질학적으로, 환경적으로 중요한다. 모든 프로테오박테리아 박테리아는 그람 음성이며 외벽은 지질다당류로 구성되어 있다. 많은 사람들이 기포, 편모를 가지고 있거나 슬라이딩하여 움직일 수 있고; 줄기, 다른 부속물을 가질 수 있거나 다세포 자실체를 형성하는 능력을 가질 수 있다. 대부분은 조건적 또는 절대 혐기성, 독립 영양 및 종속 영양이지만 예외가 있다. 일부 종은 광합성이 가능하고 다른 종은 세포 내부 또는 외부에 황을 저장한다.
피르미쿠테스는 주로 그람 양성 박테리아의 문이다. 그러나 일부는 다공성 가외막을 가지고 있어 그람 음성이 된다. 과학자들은 한때 피르미쿠테스를 모든 그람 양성 박테리아를 포함하는 것으로 분류했지만 최근에는 이들을 low-G+C라는 관련 형태를 가진 핵심 그룹으로 정의하였다. 그들은 주로 구균(단일 구균) 또는 막대 모양(간균)이라고 하는 원형 세포이다. 많은 피르미쿠테스는 건조에 저항력이 있고 극한 조건에서 생존할 수 있는 내생포자를 생성하여 다양한 환경에서 생존할 수 있다.
미생물총을 변경하는 방법은 또한 대상체로부터의 샘플에서 하나 이상의 소화관 미생물의 상대 존재비를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 차세대 서열분석에서는 각 샘플에 대해 많은 서열이 측정된다. 전처리 후, 서열 클러스터링 알고리즘을 사용하여 유사도가 97% 초과인 서열을 조합하여 OTU를 형성한다. 이어서, OTU_표가 수득될 수 있고, 이는 각각의 OTU가 각각의 샘플 내에 얼마나 많은 판독체를 함유하는지를 제공하는 매트릭스이며, 즉, 각각의 샘플은 각각의 0TU 내의 서열 판독체의 수에 상응한다. 상대 존재비는 각 샘플(각 행)에 대해 100%이고 샘플의 모든 판독 수에 대한 각 OTU의 판독 수의 백분율이 계산된다. 따라서 상대 존재비는 샘플에서 각 미생물의 서열 번호의 상대 백분율을 지칭한다. 상대 존재비는 본 발명에 기재된 방법 또는 16S rRNA 유전자의 검출과 같이 이를 검출하는데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 방법에 의해 검출될 수 있다.
소화관 미생물의 상대 존재비는 대상체로부터 샘플을 얻어 측정할 수 있다. 샘플은 타액, 대변 및 위, 장 및/또는 직장 내용물; 소화관 조직(예컨대 구강 조직, 식도, 위, 소장, 회장, 맹장, 결장 및/또는 직장)의 조직 샘플; 위장 조직의 복수; 및 미생물총 검정에 익숙한 사람이 사용할 수 있는 기타 샘플일 수 있다.
하나 이상의 소화관 미생물의 상대 존재비는 상응하는 소화관 미생물의 정상적인 상대 존재비와 비교할 수 있다. 정상 상대 존재비는 비슷한 연령, 성별, 인종 등을 가진 하나 이상의 대상체로부터의 것일 수 있다. 정상 상대 존재비는 치료 또는 치료적 개입에 반응하거나 유익한 결과를 보인 유사한 연령, 성별, 인종 등의 건강한 대상체로부터 유래할 수 있다. 특정 구현예에서, 정상적인 상대 존재비는 건강한 대상체에서 소화관 미생물의 상대 존재비이다.
본 발명의 방법 및 조성물은 하나 이상의 소화관 미생물의 상대 존재비를 변경하는 것을 수반할 수 있다. 예시적인 구현예는 대상체에게 소화관 미생물을 투여함으로써 소화관 미생물의 상대 존재비를 변화시키기 위한 방법 또는 조성물을 수반할 수 있다. 원하는 결과(예를 들어, 대사물 감소, 뇌로의 림프구 침윤 감소, 소교세포 활성화 감소, 신경염증 감소, 인지 개선, 알츠하이머병 증상 완화) 및 개별 대상체에 따라 대상체에서 소화관 미생물의 상대 존재비는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 내지 100% 이상, 또는 상기 언급된 값 또는 그 안의 임의의 값의 종점으로 구성되는 범위, 예컨대 약 7% 내지 약 28%, 등 이다. 또는 약 7%, 14%, 21%, 28%, 등으로 조절될 수 있고/거나; 대상체의 소화관 미생물의 상대 존재비를 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 소화관 미생물의 상대 존재비에 근접하게 하거나 도달하도록 한다.
본 발명 전반에 걸쳐 설명된 바와 같이, 본 발명은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 지표와 상이한 지표를 상응하는 정상적인 개체의 상응하는 지표 쪽으로 조절하여, 조절된 지표는 상응하는 정상적인 개체의 상응하는 지표에 근접하거나 이에 도달하는 것을 목적으로 한다. 이러한 조절은 본 명세서에 기재된 바와 같이 조절되거나 조절되는 다양한 지표에 적용가능하다. 당연히 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 지표에 도달하는 것이 이상적이지만 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 지표에 근접하는 것도 바람직하다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 지표를 조절하고자 하는 개체의 하나 이상의 지표를 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 지표에 근접하거나 도달하도록 하는 것을 목적으로 한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "근접하거나 도달하다"는, 조절 전 지표와 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 지표 사이의 차이가 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 이상 또는 상기 언급된 값 또는 그 안의 임의의 값의 종점으로 구성되는 범위, 예컨대 약 7% 내지 약 28%, 등. 또는 약 7%, 14%, 21%, 28%, 등까지 감소되는 것을 의미한다. 조절 전 지표와 상응하는 정상적인 개체의 상응하는 지표 사이의 차이가 조절 후 차이에 비해 약 100%만큼 감소되는 경우, 조절된 지표는 상응하는 정상적인 개체에 상응하는 지표에 도달한다. 당업자는 특정 차이 값이 예를 들어 조절 대상체, 지표 유형, 측정 방법 등에 따라 달라질 수 있음을 이해한다.
하나 이상의 지표가 폐쇄되거나 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 지표에 도달하도록 조절되는 개체의 하나 이상의 지표를 만들 수 있는 제제는 치료학적으로 바람직하다. 이러한 제제의 선택은 예를 들어 양성 대조군으로 작용하는 제제(예컨대 OM1)와의 비교를 기반으로 할 수 있다. 바람직하게는, 양성 대조군으로 사용된 제제(예를 들어, OM1)와 실질적으로 일치하는 관련 지표를 조절하는 시험 제제는 선택된다.
한편, 하나 이상의 지표가 조절될 필요가 있는 개체의 하나 이상의 지표는 기준 지표 (예를 들어, 알츠하이머병을 진단하거나 알츠하이머병 환자에서 탄수화물 약물-민감성 환자를 확인하기 위한 기준 지표)와 실질적으로 일치하며, 이는 개체가 알츠하이머병을 가질 위험이 있거나 알츠하이머병을 갖는다는 것을 나타낼 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한"은 시험 지표를 참조 지표로 표준화하는 것을 의미하며(즉, 참조 지표는 100%로 취함), 시험 지표와 참조 지표의 차이는 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 이하, 또는 임의의 상기 언급된 값 또는 그 안의 임의의 값의 종점으로 구성된 범위, 예를 들어, 약 7% 내지 약 28%, 등, 또는 약 7%, 14%, 21%, 28%, 등이다. 당업자는 특정 차이 값이 예를 들어 조절 대상체, 지표의 유형, 측정 방법 등에 따라 달라질 것임을 이해한다.
일부 구현예에서, 소화관 미생물의 상대 존재비를 조절하는 제제는 소화관 미생물 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 소화관 미생물 복합체는 대변 물질 또는 박테리아 라이브러리로부터 유래된 미생물을 포함한다. 일부 구현예에서, 대변 물질은 정상적인 대상체 또는 알츠하이머병 환자로부터 유래된다.
박테리아 라이브러리의 정의: 각 OTU에 해당하는 종 분류 정보를 얻기 위해, RDP 분류기 베이지안 알고리즘을 사용하여 97% 유사 수준의 OTU 대표 서열에 대한 분류학적 분석을 수행하고, 각 분류 수준(도메인, 계, 문, 강, 목, 과, 속, 종)에서 각 샘플의 공동체 조성물을 계수한다. 세균총의 16S 분석에 사용된 종 분류 데이터베이스 비교 데이터베이스는 silva132/16S:silva132/16S(http://www.arb-silva.de)이다.
관여된 대사산물
본 발명자는 아미노산과 같은 소화관 미생물의 일부 대사산물이 본 발명에서 연구된 AD 뇌-소화관 축에 관여한다는 것을 발견하였다. 이러한 아미노산은 예를 들어 다음 표에서 선택되는 하나 이상; 바람직하게는 페닐알라닌, 이소류신, 세로토닌, 히스티딘 및 아세틸오르니틴으로부터 선택된 하나 이상; 더 바람직하게는 페닐알라닌 및/또는 이소류신; 가장 바람직하게는 페닐알라닌일 수 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
본 발명자들은 본 발명에 따른 뇌-소화관 축에 다양한 아미노산이 관여함을 발견하였다. 실시예에 나타낸 바와 같이, WT 마우스와 TG 마우스 사이에, 일부 아미노산의 수준이 변화하고, 예를 들어 OM1 투여 후 이들 아미노산의 수준이 WT 마우스 방향으로 회복되었다. 이러한 아미노산은 아미노산 프로파일을 구성한다. 상기 언급된 바와 같이, 이러한 프로파일은 진단 및/또는 치료 목적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상응하는 정상적인 대상체에서 상응하는 아미노산의 수준에 대한 대상체의 상기 표로부터의 아미노산 1 이상 (즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36)의 수준의 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)는, 대상체가 AD를 가질 위험에 있거나 AD를 가지고 있음을 나타낸다. 한 구현예에서, 상응하는 정상적인 대상체에서 상응하는 아미노산의 수준에 대한 대상체의 상기 표로부터의 아미노산으로 구성된 아미노산 프로파일 중의 아미노산의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 수준의 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)는, 대상체가 AD를 가질 위험에 있거나 AD를 가지고 있음을 나타낸다.
일부 구현예에서, 상응하는 정상 대상체의 상응하는 아미노산의 수준에 대한 상응하는 정상 대상체로부터의 상응하는 아미노산 수준에 대한 AD를 갖는 대상체에서의 상기 표로부터 선택된 아미노산의 1 이상 (즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36)의 수준의 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)은, 적절한 치료를 받고 있음을 나타낸다. 한 구현예에서, 상응하는 정상 대상체의 상응하는 아미노산의 수준에 대한 상응하는 정상 대상체 내의 상응하는 아미노산의 수준과 비교하여 AD를 갖는 대상체의 상기 표 내의 아미노산으로 구성된 아미노산 프로파일 내의 아미노산의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 수준의 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)는, 대상체가 적절한 치료를 받고 있음을 나타낸다.
본 발명자들은 대상체에서 상기 표에 있는 하나 이상의 아미노산 수준이 대상체의 질환 상태에 기인할 수 있는 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준과 일치하지 않는다는 것을 발견하였다. 대상체의 아미노산 수준이 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 낮을 때, 아미노산 수준은 상향조절되도록 의도된다. 대상체의 아미노산 수준이 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 높을 때, 아미노산 수준은 하향조절되도록 의도된다.
일부 구현예에서, 상기 표의 하나 이상의 아미노산은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 표의 하나 이상의 아미노산은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 높다. 일부 구현예에서, 상기 표의 하나 이상의 아미노산은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 낮은 반면, 다른 하나 이상의 아미노산은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 높다. 상향조절 또는 하향조절은, 예를 들어 조절될 대상체, 지표의 유형, 측정 방법 등에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 글루타민 수준은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 낮다. 일부 구현예에서, 메티오닌 수준은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 낮다. 일부 구현예에서, 글루타민 및 메티오닌 둘 다의 수준은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 낮다.
일부 구현예에서, 글루타민 수준은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 높다. 일부 구현예에서, 메티오닌 수준은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 높다. 일부 구현예에서, 글루타민 및 메티오닌 둘 다의 수준은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 높다.
일부 구현예에서, 페닐알라닌, 이소류신, 세로토닌, 히스티딘 및 아세틸오르니틴 중 1, 2, 3, 4 또는 5개의 수준은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 높다. 일부 구현예에서, 페닐알라닌 및/또는 이소류신의 수준은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 높다. 일부 구현예에서, 페닐알라닌의 수준은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 높다.
일부 구현예에서, 글루타민 및 메티오닌 둘 모두의 수준은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 낮은 반면, 4-OH 프롤린, 아세틸오르니틴, 알라닌, 알파-아미노아디페이트, 아스파라긴, 아스파르트산, 비대칭 디메틸아르기닌, 베타-알라닌, 카르노신, 시트룰린, 크레아티닌, Gaba, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 하이포타우린, 이소류신, 카이뉴레닌, 류신, 라이신, 메티오닌 설폭사이드, 오르니틴, 페닐알라닌, 피페콜산, 프롤린, 푸트레신, 파이로글루탐산, 세린, 세로토닌, 타우린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린 중 하나 이상의 수준은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 높다.
일부 구현예에서, 4-OH 프롤린, 아세틸오르니틴, 알라닌, 알파-아미노아디페이트, 아스파라긴, 아스파르트산, 비대칭 디메틸아르기닌, 베타-알라닌, 카르노신, 시트룰린, 크레아티닌, Gaba, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 하이포타우린, 이소류신, 카이뉴레닌, 류신, 라이신, 메티오닌, 메티오닌 설폭사이드, 오르니틴, 페닐알라닌, 피페콜산, 프롤린, 푸트레신, 파이로글루탐산, 세린, 세로토닌, 타우린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린 중 하나 이상의 수준은 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준보다 더 높다.
일부 구현예에서, 상기 표의 아미노산 중 하나 이상이 상향조절된다. 일부 구현예에서, 상기 표의 아미노산 중 하나 이상이 하향조절된다. 일부 구현예에서, 상기 표의 하나 이상의 아미노산은 상향조절되는 반면, 다른 하나 이상의 아미노산은 하향조절된다. 일부 경우에, 상향조절 또는 하향조절은, 예를 들어 조절될 대상체, 지표의 유형, 측정 방법 등에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 글루타민은 상향조절된다. 일부 구현예에서, 메티오닌은 상향조절된다. 일부 구현예에서, 글루타민 및 메티오닌 모두 상향조절된다.
일부 구현예에서, 글루타민은 하향조절된다. 일부 구현예에서, 메티오닌은 하향조절된다. 일부 구현예에서, 글루타민 및 메티오닌 모두 하향조절된다.
일부 구현예에서, 페닐알라닌, 이소류신, 세로토닌, 히스티딘 및 아세틸오르니틴 중 1, 2, 3, 4 또는 5개가 하향조절된다. 일부 구현예에서, 페닐알라닌 및/또는 이소류신은 하향조절된다. 일부 구현예에서, 페닐알라닌은 하향조절된다.
일부 구현예에서, 글루타민 및 메티오닌 모두 상향조절되는 반면, 4-OH 프롤린, 아세틸오르니틴, 알라닌, 알파-아미노아디페이트, 아스파라긴, 아스파르트산, 비대칭 디메틸아르기닌, 베타-알라닌, 카르노신, 시트룰린, 크레아티닌, Gaba, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 하이포타우린, 이소류신, 카이뉴레닌, 류신, 라이신, 메티오닌 설폭사이드, 오르니틴, 페닐알라닌, 피페콜산, 프롤린, 푸트레신, 파이로글루탐산, 세린, 세로토닌, 타우린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린 중 하나 이상은 하향조절된다.
일부 구현예에서, 4-OH 프롤린, 아세틸오르니틴, 알라닌, 알파-아미노아디페이트, 아스파라긴, 아스파르트산, 비대칭 디메틸아르기닌, 베타-알라닌, 카르노신, 시트룰린, 크레아티닌, Gaba, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 하이포타우린, 이소류신, 카이뉴레닌, 류신, 라이신, 메티오닌, 메티오닌 설폭사이드, 오르니틴, 페닐알라닌, 피페콜산, 프롤린, 푸트레신, 파이로글루탐산, 세린, 세로토닌, 타우린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린 중 하나 이상은 하향조절된다. 본 발명자는 나이브 T 세포 또는 미분화 T 세포와 같은 면역 세포가 일부 경우에 아미노산(예시된 페닐알라닌 및 이소류신)을 취하고, 예를 들어 예시된 특정 수송체, 예컨대 SLC7A5에 의해 Th1 세포와 같은 특정 유형의 T 세포로 분화한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 다양한 수단을 통해 Th1 우세 상태로 이어지는 Th1 세포로의 분화를 방지함으로써 Th1 우세(dominance) 관련 질환을 치료할 수 있음을 발견하였다. 이러한 조치에는 관련 아미노산 수준 감소, 면역 세포가 관련 아미노산 흡수 방지 등이 포함되지만 이에 국한되지 않다.
SLC7A5는 L형 아미노산의 수송체 1(LAT1)이라고 하며 APC 슈퍼패밀리에 속한다. 이것은 보존적 이황화물 결합을 통해 당단백질 CD98(SLC3A2)과 상호작용하는 이종이량체 아미노산의 수송체를 형성한다. CD98(4F2hc, SLC3A2)은 II형 당단백질로, LAT1의 샤페론 단백질로 작용하여 원형질 막으로의 전위를 안정화하고 촉진한다. 이 복합체는 태반 및 혈액-뇌 장벽과 같은 주요 신체 부위에서 필수 아미노산의 흡수를 담당한다. 기질에는 티로신, 류신, 이소류신, 발린 및 페닐알라닌과 같은 일련의 큰 중성 아미노산과 L-DOPA 및 가바펜틴을 포함한 약물이 포함된다.
다양한 제제(예컨대 효소)를 사용하여 아미노산을 분해하여 관련 아미노산 수준을 감소시킬 수 있으며, 이에 따라 나이브 T 세포가 Th1 세포로 분화되는 것을 감소시킬 수 있다. 아래 표에 표시된 효소는 페닐알라닌 및 이소류신과 같은 관련 아미노산을 분해하는 데 사용할 수 있다. 표시된 효소는 아미노산을 분해하기 위해 장 또는 말초 순환(말초 혈액과 같은)과 같은 다양한 수단에 의해 대상체의 관련 부분에 전달될 수 있다. 예를 들어, 효소를 발현하는 미생물(예를 들어, 에스케리치아 콜라이)을 관련 부위에 전달하여 효소를 관련 부위에 전달하여 효소를 관련 부위에서 발현시킬 수 있다. 미생물은 표시된 효소 중 하나 이상을 발현할 수 있다. 관련 부위에서 효소를 발현하는 능력을 잃지 않으면서 다양한 전달 경로(예를 들어, 경구)를 통해 관련 부위로 전달될 수 있는 어떠한 미생물이 효소를 전달기 위해 사용될 수 있음을 당업자는 이해한다. 예를 들어, 페닐알라닌을 분해하는 효소를 발현하도록 조작된 에스케리치아 콜라이를 페닐알라닌 분해 박테리아로 사용하여, 마우스에 경구 투여하여 마우스의 페닐알라닌 함량을 감소시키고(대변의 페닐알라닌 함량을 검출하여 표시됨), Th1 세포의 비율(말초 혈액에서 Th1 세포의 비율을 검출하여 표시됨)을 감소시킨다.
페닐알라닌을 분해하는 데 사용할 수 있는 효소
Figure pct00011
이소류신을 분해하는 데 사용할 수 있는 효소
Figure pct00012
수송체 억제제는 나이브 T 세포가 수송체(예를 들어, 페닐알라닌 및 이소류신에 대한 공통 수송체 SLC7A5)를 억제하고, 이에 따라 Th1 세포로의 나이브 T 세포의 분화를 감소시킴으로써 관련 아미노산을 흡수하는 것을 억제함으로써 면역 세포가 관련 아미노산을 흡수하는 것을 방지하는 데 사용될 수 있다. 수송체 SLC7A5를 억제하기 위해 사용될 수 있는 억제제는 당업계에 공지된 JPH 203, BCH, 및 KMH-233을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 실시예 4에 나타낸 바와 같이, SLC7A5 억제제 JPH 203을 마우스에 투여하면 마우스 뇌에서 Th1 세포의 비율이 유의하게 감소된다.
JPH203은 일본의 J-Pharma로부터 이용가능한 화학적으로 합성된 저분자량 화합물 (http://www.j-pharma.com/b3_e.html)이고, 이는 CaS 번호 1037592-40-7 (https: //www.medkoo.com/products/9544)를 갖는 LAT1을 선택적으로 억제한다.
BCH는 CAS 번호가 20448-79-7 (https://www.tocris.com/cn/products/bch_5027)인 알려진 LAT1 억제제이다.
KMH-233은 CAS 번호가 1941174-13-5(https://www.medkoo.com/products/9545)인 알려진 LAT1 억제제이다.
당업자는 나이브 T 세포의 Th1 세포로의 분화를 방지하기 위해 사용될 수 있는 수단이 이에 제한되지 않는다는 것을 이해한다. 나이브 T 세포가 소화관 미생물 및/또는 이들의 대사산물에 의해 영향을 받아 Th1 세포로 분화되는 것을 방지하기 위해 사용될 수 있는 임의의 수단은 Th1의 비율을 감소시키고 본 명세서에 기재된 바와 같이 Th1 우세 상태를 완화 또는 역전시키는데 사용될 수 있다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 뇌-소화관 축에 다양한 사이토카인이 관여함을 발견하였다. 실시예에 나타난 바와 같이, WT 마우스와 TG 마우스 사이에서, 일부 사이토카인의 수준이 변화하였고, 예를 들어 OM1의 투여 후에, 이러한 사이토카인의 수준이 WT 마우스를 향해 회복되었다. 이러한 사이토카인은 사이토카인의 프로파일을 구성한다. 상기 언급된 바와 같이, 이러한 프로파일은 진단 및/또는 치료 목적으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상응하는 정상적인 대상체에서 상응하는 사이토카인의 수준에 대한 대상체에서 다음: OPG, 레지스틴, TARC, VEGF, 케메린, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, 그란자임 B, LIX, CT-1, CD27L, 엔도글린, TRANCE, MCSF, 4-1BB, 렙틴 R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60로부터 선택된1 이상 (즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31) 사이토카인의 수준의 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)는, 대상체가 AD를 가질 위험에 있거나 AD를 가지고 있음을 나타낸다. 한 구현예에서, 상응하는 정상적인 대상체에서 상응하는 사이토카인의 수준에 대한 대상체 다음: OPG, 레지스틴, TARC, VEGF, 케메린, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, 그란자임 B, LIX, CT-1, CD27L, 엔도글린, TRANCE, MCSF, 4-1BB, 렙틴 R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60으로부터 선택된 사이토카인으로 구성된 사이토카인 프로파일 중 사이토카인의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 수준의 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)는, 대상체가 AD를 가질 위험에 있거나 AD를 가지고 있음을 나타낸다.
일부 구현예에서, 상응하는 정상 대상체의 상응하는 사이토카인의 수준에 대한 상응하는 정상 대상체에서의 상응하는 사이토카인 수준에 대한 AD를 갖는 대상체에서 다음: OPG, 레지스틴, TARC, VEGF, 케메린, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, 그란자임 B, LIX, CT-1, CD27L, 엔도글린, TRANCE, MCSF, 4-1BB, 렙틴 R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60로부터 선택된 사이토카인의 1 이상 (즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31)의 수준의 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)는, 적절한 치료를 받고 있음을 나타낸다. 한 구현예에서, 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 사이토카인의 수준에 대한 상응하는 정상적인 대상체에서 상응하는 소화관 미생물의 수준에 대한D를 갖는 대상체에서 다음: OPG, 레지스틴, TARC, VEGF, 케메린, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, 그란자임 B, LIX, CT-1, CD27L, 엔도글린, TRANCE, MCSF, 4-1BB, 렙틴 R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60로부터 선택된 사이토카인으 구성된 소화관 미생물 프로파일 중의 사이토카인의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 수준의 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)는, 적절한 치료를 받고 있음을 나타낸다.
본 발명은 미리 결정된 시간 동안(예를 들어, 다음 용량이 사용될 때까지) 미리 결정된 수준(예컨대 치료 수준)으로 소화관 미생물의 상대 존재비를 직접 또는 간접적으로 변경할 수 있는 조성물을 제공한다. 미리 결정된 수준은 치료적 반응(예를 들어, 대사산물 감소, 뇌로의 림프구 침윤 감소, 소교세포 활성화 감소, 신경염증 감소, 인지 개선, 알츠하이머병 증상 완화)을 초래한 미생물총의 측정된 상대적 존재비로부터 얻을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법, 제제 또는 조성물은, 제제 또는 조성물이 제제 또는 조성물의 중량을 기준으로 적어도 약 5 wt%, 10 wt%, 20 wt%, 30 wt%, 40 wt%, 50 wt%, 60 wt%, 70 wt%, 80 wt%, 85 wt%, 90 wt%, 95 wt%, 99 wt%, 또는 그 초과의 원하는 소화관 미생물, 및/또는 제제 또는 조성물의 중량을 기준으로 약 40 wt%, 30 wt%, 20 wt%, 15 wt%, 14 wt%, 13 wt%, 12 wt%, 11 wt%, 10 wt%, 9 wt%, 8 wt%, 7 wt%, 6 wt%, 5 wt%, 4 wt%, 3 wt%, 2 wt%, 1 wt% 또는 그 미만의 바람직하지 않은 소화관 미생물을 포함할 수 있도록 충분히 정제되거나 풍부한 소화관 미생물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 소화관 미생물의 상대 존재비를 조절하는 제제 및 조성물은 변경된 대사 기능을 유발할 수 있다. 예를 들어 변경된 대사 기능에는 미생물 대사산물의 아미노산 수준 조절이 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체로부터의 말초 혈액 샘플을 검출함으로써, 본 발명의 방법, 제제 및 조성물은 아미노산 수준을 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 μM 이상, 또는 상기 언급된 값 또는 그 안의 임의의 값의 종점으로 구성되는 범위까지 조절할 수 있고/거나; 아미노산 수준을 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준에 근접하게 하거나 도달하도록 할 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체로부터의 대변 샘플을 검출함으로써, 본 발명의 방법, 제제 및 조성물은 아미노산 수준을 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000 μmol/g 이상, 또는 상기 언급된 값 또는 그 안의 임의의 값의 종점으로 구성되는 범위까지 조절할 수 있고/거나; 아미노산 수준을 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 아미노산 수준에 근접하게 하거나 도달하도록 할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법, 제제, 및 조성물은 뇌로의 변경된 면역 세포 침윤을 유발할 수 있다. 예를 들어, CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 비율이 감소한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 제제 및 조성물은 대상체로부터의 샘플에서 염증유발 Th1 세포 대 CD4+ T 세포의 비율을 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 초과까지 조절하고/거나; 상응하는 정상적인 대상체 염증유발 Th1 세포 대 CD4+ T 세포의 비율이 상응하는 염증유발 Th1 세포 대 CD4+ T 세포의 비율에 근접하거나 도달하도록 할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법, 제제, 및 조성물은 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 제제 및 조성물은 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수를 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 또는 그 초과까지 감소시킬 수 있고/거나; 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수 수준이 상응하는 정상적인 대상체의 상응하는 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수 수준에 근접하거나 도달하도록 한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법, 제제, 및 조성물은 뇌에서 소교세포의 변경된 활성화를 초래할 수 있다. 예를 들어, 뇌에서 소교세포의 변경된 활성화는 뇌에서 소교세포 활성화의 증가 또는 감소를 포함할 수 있다. 뇌에서 소교세포의 활성화는 약 1 내지 100%, 예를 들어, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 100%, 또는 상기 언급된 값 또는 그 안의 임의의 값의 종점으로 구성되는 범위, 예를 들어, 약 7% 내지 약 28%, 등, 또는 약 7%, 14%, 21%, 28%, 등까지 증가되거나 감소될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법, 제제 및 조성물은 IBA1 수준을 변경할 수 있다. 예를 들어, IBA1의 수준을 변경하는 것은 IBA1의 수준을 증가시키거나 감소시키는 것을 포함할 수 있다. IBA1 수준은 약 0 내지 약 3000의 상대적인 수준, 예를 들어, 약 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000의 상대적인 수준, 또는 상기 언급된 값 또는 그 안의 임의의 값의 종점으로 구성되는 범위, 예를 들어, 약 500 내지 약 3000, 또는 약 500, 1000, 1500, 등의 상대적인 수준까지 증가되거나 감소될 수 있다.
제형
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 대상체에서 소화관 미생물의 상대 존재비를 조절할 수 있는 소화관 미생물을 함유할 수 있다. 소화관 미생물은 생존(살아 있음), 휴면, 비활성 또는 죽은 박테리아일 수 있다. 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 대상체에서 소화관 미생물의 상대 존재비를 조절할 수 있는 화합물 또는 제제를 함유할 수 있다. 하나 이상의 화합물 또는 제제를 사용하여 대상체의 미생물총을 변경할 수 있다. 이러한 화합물 또는 제제는 항생제 치료 및/또는 항균제, 프리바이오틱스, 예컨대 박테리아 세포 벽 구성요소, 박테리아 핵산 (예컨대 DNA 및 RNA), 박테리아 막 구성요소, 및 박테리아 구조 구성요소 (예컨대 단백질, 탄수화물, 지질 및 그것의 조합, 예컨대 지질단백질, 당 에스테르 및 당단백질), 유기 산, 무기 산, 알칼리, 단백질 및 펩티드, 효소 및 조효소, 아미노산 및 핵산, 당, 지질, 당단백질, 지질단백질, 당 에스테르, 비타민, 생물학적으로 활성 화합물, 무기 성분, 소분자 예컨대 질소 함유 분자 또는 아황산 함유 분자를 포함하는 대사산물, 저항성 전분, 감자 전분 또는 높은 아밀로스 전분, 변성 전분 (카복실화 전분, 아세틸화 전분, 프로피오네이트화 전분 및 부틸화 전분 포함), 소화불가능한 올리고당류, 예컨대 프룩토-올리고당류, 올리고덱스트로스, 자일로-올리고당류, 갈락토-올리고당류, 아라비노자일란, 아라비노갈탁탄, 갈락토만난 다당류, 폴리덱스트로스, 올리고푸룩토스, 이눌린 및 그것의 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않지만, 프리바이오틱 역할을 할 수 있는 다른 올리고당류, 다른 가용성 섬유 및 이들의 조합이 베제되지 않는다. 당은 단당류, 이당류, 올리고당류, 다당류, 또는 이의 유도체, 또는 이들의 조합 및/또는 그의 유도체 로부터 선택될 수 있다; 바람직하게는 올리고당류 및 다당류일 수 있고; 더 바람직하게는 만누론산 올리고당일 수 있다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 또한 예를 들어, 아미노산, 아미노 당, 당 알코올, 단백질, 탄수화물, 단당류, 이당류, 올리고당류, 다당류, 핵산, 완충액, 계면활성제, 지질, 리포솜, 다른 부형제, 및 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 다른 유용한 성분은 스테로이드, 항-염증제, 비-스테로이드 항-염증제, 진통제, 세포, 항-염증제, 성장 인자, 성장 인자 단편, 소분자 상처 치유 자극제, 호르몬, 사이토카인, 펩티드, 항체, 효소, 단리된 세포, 혈소판, 면역억제제, 핵산, 세포 유형, 바이러스, 바이러스 입자, 필수 영양소, 미네랄, 금속, 또는 비타민, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 제제 및 조성물은 물, 염수 또는 완충액과 같은 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 및 모든 생리적으로 양립가능한 용매, 분산매, 코팅물, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 대상체에게 전달하기에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 및 모든 생리적으로 양립가능한 용매, 분산매, 코팅물, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체의 예는 물, 염수, 포스페이트 완충 식염수, 글루코스, 글리세롤, 에탄올, 등, 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 많은 경우에, 조성물 중 등장제 예컨대 당, 폴리알코올 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다.
약제학적 조성물은 다양한 형태로 제형화될 수 있다. 이들은 예를 들어, 액체, 반-고체, 및 고형 제제 형태 예컨대 액체 용액 (예컨대 주사가능 및 불용성 용액), 분산물 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 리포솜, 좌약, 및 다른 제형을 포함한다. 약제학적 조성물은 높은 약물 농도를 위해 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 취급 및 저장 조건 하에서 추가로 멸균되고 안정적일 수 있다. 멸균 주사 용액은 필요한 양의 적절한 용매에 위에 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합(필요에 따라)을 혼합한 후 여과 및 멸균하여 제조될 수 있다.
약제학적 조성물의 예시적인 형태는 의도된 전달 방식 및 치료적 적용에 의존할 수 있다. 한 구현예에서, 약제학적 조성물은 경구 전달을 위해 제형화된다. 일부 조성물은 알약 기반 전달(2010년 10월 22일에 출원된 "알약 캐처(pill catchers)"라는 명칭의 미국 특허 출원 제12/976,648호에 개시됨) 및 연장 방출 방법의 형태일 수 있다. 한 구현예에서, 알약 기반 전달은 장관 내의 정확한 위치에서 전달이 발생하도록 하는 시스템의 일부일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 연장 방출 제제로서 제형화될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 환자의 위를 떠날 때까지 분해를 시작하지 않는 코팅으로 캡슐화될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 서방성 또는 제어 방출 제제와 같은 급속 방출로부터 조성물을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될수 있다. 이러한 제형을 제조하는 많은 방법이 특허권을 부여받았거나 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조. "서방성"은 조성물의 통상적인 제형의 전달에 의해 달성되는 방출에 비해 장기간에 걸친 조성물 또는 그의 활성 화합물의 방출을 지칭한다.
다른 유형의 약제학적 조성물은 휴면 또는 불활성 상태(예를 들어, 동결건조 상태)의 미생물총을 갖는 조성물을 제형화하는 것과 같은 활성화 가능한 형태를 포함한다. 조합된 조성물에서, 미생물총은 휴면 또는 불활성 상태일 수 있거나, 미생물총을 배양하는 화합물 또는 제제는 불활성일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 휴면 또는 불활성 미생물총 및 미생물총을 배양하는 불활성 화합물 또는 제제를 포함하도록 제형화될 수 있다.
개시된 약제학적 조성물 및 조합된 약제학적 조성물은 또한 식품, 음료, 식이 보충물 및/또는 첨가제로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 인간 및/또는 동물 소비에 적합한 것이다. 당업자는 경구 또는 섭취 가능한 제형에 사용될 수 있고 인간 및/또는 동물 투여에 적합한 것으로 간주되는 미생물총의 특정 제형을 쉽게 알 수 있다. 많은 조성물이 식품 또는 식품 첨가물/보충물의 제조에 사용되고; 따라서, 또 다른 중요한 양태는 대상체의 소화관 미생물을 조절하기 위해 미생물총을 포함하는 인간 또는 동물 식품 또는 식품 첨가물/보충물을 제공하는 것이다.
소비성 조성물은 감미제, 안정화제 또는 결합제, 보습제, 및/또는 천연 및/또는 인공 풍미제를 포함하도록 제형화될 수 있다. 조성물은 또한 천연 및/또는 인공 착색제 및 보존제를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 수크로스 (당), 덱스트로스, 말토스, 덱스트린, 자일로스, 리보스, 글루코스, 만노스, 갈락토스, 수크로말트, 푸룩토스 (레보스), 전화당, 옥수수 시럽, 말토덱스트린, 올리고푸룩토스 시럽, 부분적으로 가수분해된 전분, 옥수수 시럽 고체, 폴리덱스트로스, 가용성 섬유, 불용성 섬유, 천연 사당수수즙, 젤라틴, 시트르산, 락트산, 천연 색상, 천연 풍미제, 분별화 코코넛 오일, 카르나우바 왁스, 또는 이들의 조합으로 제한되지 않는 것과 같은 단당류, 이당류 및 다당류를 포함할 수 있다.
복용량
본 발명의 제제 또는 조성물은 성분의 "치료적 유효량" 또는 "유효량"을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 요구되는 용량에서 일정 기간 내에 원하는 치료 결과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 제제 또는 약제학적 조성물의 치료적 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 뇌 및 개체에게 원하는 반응을 일으키는 조성물의 능력과 같은 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 제제 또는 약제학적 조성물의 치료학적으로 유익한 효과가 제제 또는 약제학적 조성물의 독성 또는 유해한 효과를 초과하는 양이다. 예시적인 구현예에서, 제제 또는 약제학적 조성물의 치료적 유효량은 하나 이상의 소화관 미생물의 상대 존재비가 증가되는 양이다. 예를 들어, 소화관 미생물의 상대 존재비를 조절하기 위한 약제의 치료학적 유효량은 대상체에서 하나 이상의 소화관 미생물의 상대 존재비를 증가시킨다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 그 효과는 질환이나 그 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적일 수 있고/거나; 질환 및/또는 질환으로 인한 부작용을 부분적으로 또는 완전히 안정화 또는 치유한다는 점에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "치료"는 다음을 포함하여 환자의 질환의 임의의 치료를 포함한다: (a) 질환 또는 증상에 민감하지만 아직 질환으로 진단되지 않은 환자에서 발생하는 질환 또는 증상의 예방; (b) 질환의 진행을 억제하고 질환의 발달을 예방하는 것과 같은 질환의 증상을 억제하는 것; 또는 (c) 질환의 증상을 완화시키는 것, 즉 질환 또는 증상을 퇴화시키는 것.
징후
본 발명의 연구를 통해, 본 발명자들은 비정상적인 소화관 미생물 패턴으로 인해 나이브 T 세포가 Th1 세포로 과분화되고, 말초 혈액 내 Th1 세포의 수준이 비정상적으로 증가함을 발견하였다. 말초 Th1 세포의 수치가 증가하면 더 많은 Th1 세포가 뇌에 침투하여 알츠하이머 병과 같은 질환을 유발한다. 소화관 미생물총을 회복함으로써, Th1 세포로의 나이브 T 세포의 분화를 감소시킬 수 있고, 말초 혈액 내 Th1 세포의 비정상적으로 상승된 수준을 감소시켜 질환을 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명은 대상체에서 높은 말초 혈액 Th1 세포 수준과 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본원에 기술된 바와 같이 대상체에서 소화관 미생물의 상대 존재비를 조절하고, 본 명세서에 기재된 바와 같이 말초 혈액에서 아미노산 수준을 감소시키고, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 나이브 T 세포가 말초 혈액에서 아미노산을 흡수하는 것을 억제하는 것을 포함한다.
용어 "Th1 우세" 및 "Th1 세포 우세"는 본 명세서에 기재된 바와 같이 상호교환적으로 사용된다. 어떤 경우에는 Th1 우세는 높은 말초 혈액 Th1 세포 수준으로 제시될 수 있다. 높은 말초 혈액 Th1 세포 수준은 대상체에서 말초 혈액 Th1 세포 수준을 지칭할 수 있고, 상기 수준은 적합한 대조군 (예를 들어, 정상적인 대조군, 예컨대 정상적인 인간 집단)보다1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000% 또는 그 초과, 또는 상기 언급된 값 또는 그 안의 임의의 값의 종점으로 구성되는 범위, 예컨대 약 7 % 내지 약 28%, 등, 또는 약 7%, 14%, 21%, 28%, 등 이다. 이러한 질환에는 다발성 경화증, 크론병, 1형 당뇨병, 류마티스성 관절염, 하시모토 갑상선염, 백반증, 쇼그렌 증후군, 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 셀리악병, 및 그레이브스 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간, 비-인간 영장류 예컨대 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이, 농업 동물 예컨대 소, 양, 돼지, 염소, 및 말, 사육된 포유동물 예컨대 개 및 고양이, 설치류 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 기니아 피그 등을 포함하는 실험실 동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 살아있는 유기체를 지칭한다. 이 용어는 특정 연령과 성별을 나타내지 않는다. 일 구현예에서, 대상체는 인간이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다.
한 구현예에서, 대상체에서 하나 이상의 소화관 미생물의 상대 존재비는 정상적인 대상체의 것보다 더 높다. 한 구현예에서, 대상체에서 하나 이상의 소화관 미생물의 상대 존재비는 정상적인 대상체의 것보다 더 낮다. 한 구현예에서, 대상체에서 하나 이상의 소화관 미생물의 상대 존재비는 정상적인 대상체의 것보다 더 높고, 다른 하나 이상의 상대 존재비는 대상체의 것보다 더 낮다.
복용량은 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물에 존재하는 미생물총의 유형에 따라 달라질 수 있다. 복용량은 또한 대상체에 존재하는 하나 이상의 미생물총의 상대 존재비에 기초하여 결정될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 하나 이상의 미생물총의 상대 존재비를 효과적으로 변화시킬 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제제 또는 약제학적 조성물은 대상체에서 미생물총의 상대 존재비를 효과적으로 증가 또는 감소시킬 수 있다. 한 구현예에서, 제제 또는 약제학적 조성물은 대상체에서 미생물총의 특정 미생물의 상대 존재비를 증가 또는 감소시킬 수 있고, 대상체 내의 미생물총의 다른 특정 미생물의 상대 존재비를 감소시킬 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 또한 대상체의 미생물총을 효과적으로 변화시켜, 제제 또는 약제학적 조성물의 투여 후, 대상체의 미생물총이 알츠하이머병의 치료 과정에 반응하는 대상체에 존재하는 미생물총을 모방하도록 할 수 있다. 제제 또는 약제학적 조성물은 유사한 뇌, 연령, 성별, 인종 등을 갖는 정상적인 및 건강한 대상체의 미생물총을 시뮬레이션하기 위해 미생물총을 효과적으로 변화시킬 수 있다.
복용 요법(regimen)은 가장 적합한 원하는 반응(예컨대 치료적 반응 또는 예방적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼러스가 전달될 수 있고, 시간이 지남에 따라 다중 분할 용량이 전달될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 긴급성에 따라 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 복용량의 전달 및 균일성을 촉진하기 위해 단위 복용 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용된 단위 복용 형태는 치료될 포유동물 대상체에 대한 단일 용량으로 적합한 물리적 별도의 단위를 지칭하고; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 조합하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 포함한다. 본 발명에 사용되는 단위 복용 형태의 사양은 다음에 의해 정의되거나 직접적으로 의존한다: (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성될 특정 치료 또는 예방 효과; 및 (b) 개별 요법을 위해 이 활성 화합물을 조합하는 분야에 내재된 한계.
본 발명에 의해 제공된 방법에 적용될 때, 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물의 예시적인 투여량 범위는 1일당 약 0.001 내지 약 100 mg/kg 체중, 1일당 약 0.01 내지 약 50 mg/kg 체중, 예컨대 1일당 약 0.05 내지 약 10 mg/kg 체중일 수 있고, 1회 이상의 용량, 예컨대 1-3회 용량으로 전달될 수 있다. 정확한 복용량은 전달 빈도 및 방식, 치료되는 대상체의 성별, 연령, 체중 및 일반적인 상태, 치료되는 병태의 특성 및 중증도, 치료될 모든 동반이환 및 당업자에게 알려진 기타 요인에 따라 달라질 것이다.
한 구현예에서, 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 약 0.001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg 범위의 총 농도를 갖는 미생물총, 예컨대 베루코마이크로비아를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제제 또는 약제학적 조성물은 약 0.001 mg/kg 내지 약 50 mg/kg 범위의 총 농도를 갖는 미생물총, 예컨대 베루코마이크로비아를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제제 또는 약제학적 조성물은 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위의 총 농도를 갖는 미생물총, 예컨대 베루코마이크로비아를 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 제제, 조성물, 또는 키트는 대상체의 체중을 기준으로 하는 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 제제, 조성물 또는 키트는 본 명세서에 기재된 1종 이상의 제제를 대상체의 체중을 기준으로 하는 양으로 포함한다
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 제제, 조성물 또는 키트에서 본원에 언급된 제제 중 하나 이상의 양은 대상체의 체중을 기준으로 약 1.0 내지 약 50.0 mg/kg 이상, 바람직하게는 약 5.0 내지 40.0 mg/kg, 더 바람직하게는 약 10.0 내지 30.0 mg/kg의 범위이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 제제, 조성물 또는 키트에서 본 명세서에 언급된 제제 중 하나 이상의 양은 대상체의 체중을 기준으로 약 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 15.5, 16.0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0, 19.5, 20.0, 20.5, 21.0, 21.5, 22.0, 22.5, 23.0, 23.5, 24.0, 24.5, 25.0, 25.5, 26.0, 26.5, 27.0, 27.5, 28.0, 28.5, 29.0, 29.5, 30.0, 30.5, 31.0, 31.5, 32.0, 32.5, 33.0, 33.5, 34.0, 34.5, 35.0, 35.5, 36.0, 36.5, 37.0, 37.5, 38.0, 38.5, 39.0, 39.5, 40.0, 40.5, 41.0, 41.5, 42.0, 42.5, 43.0, 43.5, 44.0, 44.5, 45.0, 45.5, 46.0, 46.5, 47.0, 47.5, 48.0, 48.5, 49.0, 49.5, 50.0 mg/kg 또는 그 초과 또는 상기 언급된 값 또는 그 안의 임의의 값의 종점으로 구성되는 범위, 예컨대 약 1.1 내지 1.4 mg/kg 등 또는 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 mg/kg, 등이다.
다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 제제, 조성물 또는 키트는 고정 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 제제, 조성물 또는 키트는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 제제를 고정량으로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 제제, 조성물 또는 키트에서 본 명세서에 언급된 제제 중 하나 이상의 양은 각각 독립적으로 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 mg 이상, 또는 상기 언급된 값 또는 그 안의 임의의 값의 종점으로 구성되는 범위, 예를 들어, 약 1.1 내지 1.4 mg 등 또는 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 등이다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 제제, 조성물 또는 키트의 성분 중 일부는 상기 기재된 바와 같은 대상체의 체중 기준 용량으로 투여되는 반면, 다른 성분은 상기 기재된 바와 같은 고정 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 제제, 조성물 또는 키트 중 일부 성분의 양은 상기 기재된 바와 같은 대상체의 체중을 기준으로 한 양이고, 다른 성분은 상기 기재된 바와 같은 고정된 양이다.
전달
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 전달 또는 투여될 수 있다. "전달", "에 전달한다", "투여한다" 및 "에 적용하다"라는 용어는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 전달의 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 변할 것이다. 한 구현예에서, 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 경구로 전달된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 경구로 전달된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 비강으로 전달된다. 또 다른 전달 방식은 장으로 전달하는 방법 및 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 대상체의 표적 영역 및/또는 구조에 전달될 수 있다. 장에서 표적화될 수 있는 영역은 위, 담도 췌장 분지(사지), 루(Roux) 분지, 공통 분지, 회장, 맹장 또는 결장을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않을 수 있다. 특정 pH 범위, 온도, 습도 및 대사산물 함량으로 차별화된 생태학적 위치를 구성하는 구조를 표적으로 할 수 있다. 변경된 미생물총 계보와 관련된 질환이나 병태는 새로운 미생물의 존재, 정상적인 미생물의 부족 또는 미생물 비율의 변화를 나타낼 수 있다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물의 전달은 대상체의 하나 이상의 영역으로 표적화될 수 있다. 영역은 장의 영역을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않을 수 있다. 예시적인 구현예에서, 전달은 구강, 위, 담도 췌장 분지, 루 분지, 공통 분지, 소장, 회장, 맹장, 대장, 또는 장의 결장을 표적으로 한다. 전달은 또한 대상체의 하나 이상의 조직을 표적으로 할 수 있다. 조직은 위, 담도 췌장 분지, 루 분지, 공통 분지, 소장, 회장, 맹장, 대장 또는 결장과 같은 장의 임의의 조직을 포함할 수 있다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물의 성분은 별도로 제형화될 수 있거나, 또는 이들의 일부 또는 전부가 함께 제형화될 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 단일 또는 다중 투여에 적합한 제제 또는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물의 성분은 별도로 투여될 수 있거나, 또는 이들의 일부 또는 전부가 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제제 또는 성분은 실질적으로 상이한 시간에 투여될 수 있거나, 또는 이들의 일부 또는 전부는 실질적으로 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제제 또는 성분은 경구 또는 비경구(정맥내, 근육내, 국소 또는 피하 경로에 의해)를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 적합한 경로에 의해 각각 독립적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물의 성분은 각각 독립적으로 경구로 또는 주사, 예컨대 정맥내 주사 또는 복강내 주사로 투여될 수 있다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물의 성분은 각각 정제, 트로키, 환제, 캡슐 (예를 들어 경질 캡슐, 연질 캡슐, 장용 코팅된 캡슐, 마이크로캡슐), 엘릭시르, 과립, 시럽, 주사 (근육내, 정맥내, 복강내), 과립, 에멀젼, 현탁액, 용액, 분산물, 및 경구 또는 비경구 투여를 위한 서방성 제제의 복용 형태를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적합한 복용 형태일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제제 또는 성분은 각각 독립적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물의 성분은 독립적으로 1일마다, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 매주, 2주마다, 3주마다, 또는 매월 또는 더 낮은 빈도로 투여될 수 있다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물의 성분은 독립적으로 1일당, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 또는 그 초과로 투여될 수 있다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물의 성분은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 연속 일 또는 그 초과 동안 투여될 수 있다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물의 성분 중 하나는 다른 성분의 투여 전 또는 후에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 또는 그 초과 일 동안 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 제제 또는 성분 1은 1일차에 투여되고, 본 발명의 약제학적 조성물의 제제 또는 성분 2는 2일 후(즉, 3일차) 투여되고, 그리고 본 발명의 약제학적 조성물의 제제 또는 성분 1은 추가 3일 후(즉, 6일차) 투여된다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물의 전달은 또한 1회 이상 반복될 수 있다. 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물의 반복 전달은 질환의 치료 전 및/또는 후에 1회 이상일 수 있다. 반복 전달은 초기 전달과 유사한 방식으로 할 수 있다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 또한 치료제, 예방제 또는 진단제를 포함할 수 있는 제제와 함께 투여될 수 있다. 치료제, 예방제 또는 진단제는 소분자, 핵산, 단백질, 예컨대 박테리아 성분 (예컨대 박테리아 세포 벽 구성요소 (예컨대 펩티도글리칸), 박테리아 핵산 (예컨대 DNA 및 RNA), 박테리아 막 구성요소, 및 박테리아 구조 구성요소 (예컨대 단백질, 탄수화물, 지질 및 이들의 조합, 예컨대 지질단백질, 당 에스테르 및 당단백질))을 포함하는 폴리펩티드 프리바이오틱스, 박테리아 대사산물, 유기 산, 무기 산, 염기, 단백질 및 펩티드, 효소 및 조효소, 아미노산 및 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지질단백질, 당 에스테르, 비타민, 생물학적으로 활성 화합물, 무기 성분을 포함하는 대사산물, 소분자 (예를 들어, 질소 함유 분자 또는 아황산 함유 분자), 저항성 전분, 감자 전분 또는 높은 아밀로스 전분, 변성 전분 (카복실화 전분, 아세틸화 전분, 프로피오네이트화 전분 및 부틸화 전분 포함), 소화불가능한 올리고당류 예컨대 프룩토올리고당류, 덱스트로스, 자일로-올리고당류, 갈락토-올리고당류, 아라비노자일란, 아라비노갈탁탄, 갈락토만난, 폴리덱스트란, 올리고푸룩토스, 이눌린 및 그것의 유도체 (그러나 프리바이오틱 역할을 할 수 있는 다른 올리고당은 배제되지 않음) 다른 가용성 섬유 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 전달된 제제는 낮은 경구 생체이용률을 갖고 숙주의 장의 미생물 위치에 작용하는 전달된 소분자이다. 장 흡수가 대부분의 경구 치료의 목표이기 때문에 낮은 경구 생체 이용률은 일반적으로 의학에서 바람직하지 않다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 또한 상기 언급된 제제와 동일한 조성물로 투여될 수 있거나, 또는 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물 전에, 동시에 및/또는 후에 투여되는 제제와 별도로 투여될 수 있다. 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 제제의 투여 전 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 그 초과 일에 투여될 수 있다. 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 또한 제제의 투여 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 그 초과 일에 투여될 수 있다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 또한 적어도 부분적으로 이식가능한 시스템에 의해 전달될 수 있다. 이식가능한 시스템은 당업계에 공지되고 사용되는 임의의 시스템일 수 있다. 시스템에는 프로그래밍 가능한 펌프(예컨대 당뇨병 환자에게 인슐린을 전달하는 데 일반적으로 사용되는 펌프)가 포함될 수 있다. 이러한 구성요소 중 하나 이상은 모듈식일 수 있고 포트, 바늘, 패치 등을 포함할 수 있는 경피 전달 시스템에 연결될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 이식가능한 시스템은 저장소 및 포트를 포함한다. 저장소는 조성물을 보유하기 위한 재충전가능하거나 재적재가능한 용기를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 시스템은 카테터를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 이식 가능한 시스템은 경혈관 카테터이다. 시스템은 또한 처방된 용량 및/또는 처방된 간격으로 조성물을 전달하도록 구성될 수 있다. 처방된 용량 및/또는 처방된 간격은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예는 하기 비제한적 실시예에 의해 예시된다.
실시예
재료 및 방법
동물. Tg 마우스와 공동 수용된 WT 마우스(Tg 마우스와 C57 마우스를 교배하여 생성된 상응하는 WT 마우스)는 출생 후 동일한 케이지에 수용되었다. WT 마우스(C57)는 미생물총의 교차 전달을 피하기 위해 별도의 케이지에 수용되었다. 모든 마우스는 12시간(h) 명암 주기로 23℃ 방에 보관되었다. 마우스는 처리 전에 무작위로 상이한 그룹에 할당되었다. Tg 마우스의 시간 경과 분석을 위해, 수컷 및 암컷 Tg 마우스를 2, 3, 5, 7 및 9월령에 희생시켰다. 마우스 뇌를 수집하고 면역 세포 분석 및 사이토카인 분석을 위해 염색하였다. 마우스를 희생시키기 전에 소화관 미생물총 분석을 위해 대변을 수집하였다. OM1 처리를 위해, 6.5월령에, III상 시험에서 450 mg b.i.d. (1일 2회)를 기초로 하여, Tg 마우스에 100 mg/kg OM1을 1일 1회 경구 투여하여 1개월 동안 처리하였다. 마지막 처리 후 인지 활동을 모니터링하기 위해 행동 테스트를 수행하였다. 그런 다음 마우스의 뇌와 대변을 다양한 분석에 사용하였다. 행동 테스트를 위해, 이전에 보고된 바와 같이 상이한 개월의 Tg 마우스 및 WT 마우스 및 처리된 마우스를 식별 학습에 의해 테스트하였다. PhenoTyper(HomeCage)에서 발생하는 모든 마우스 움직임은 성능 표준(Noldus, Ethovision)의 80%에 도달하는 데 필요한 시간과 입구 수를 계산하는 컴퓨터 추적 시스템에 의해 기록된다. 페닐알라닌과 이소류신의 복강내 주사를 위해 4월령 C57 마우스를 50 mg/kg의 페닐알라닌 또는 이소류신으로 4일 동안 처리하였다. 페닐알라닌 및 이소류신의 해마 주사를 위해, 4월령 C57 마우스에 120 mmol/L으로 3 μL의 페닐알라닌 또는 이소류신을 주사하였다. 10일 후, 이 마우스는 FACS를 사용하여 혈액 샘플 분석 및 행동 테스트를 받았다.
APP/PS1 마우스 시점 분석을 위해, 생후 3, 9, 14월령에 마우스 및 연령 일치 야생형 마우스를 희생시켰다. 다양한 분석을 위해, 마우스 뇌와 혈액을 수집하였다. 희생하기 전에, 미생물총 분석을 위해, 마우스 대변을 수집하였다. APP/PS1 마우스 처리를 위해, 3개월 동안 항생제 여부에 관계없이 처리된 6월령 마우스를 1일 1회 경구 위관영양법으로 50 mg/kg의 OM1으로 처리하였다. 마지막 처리 후 인지 활동을 모니터링하기 위해 행동 테스트를 수행하였다. 동물 실험은 Shanghai SIPPR-Bk Lab Animal Co., Ltd(번호: 2016002) 윤리위원회의 승인을 받았다.
대변 샘플 DNA 추출 및 PCR 증폭. 모든 대변 샘플은 DNA 추출 및 분석 전에 -80℃에서 냉동되었다. E.Z.N.A.® Soil DNA Kit(Omega Bio-Tek, Norcross, GA, U.S.)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 대변 샘플에서 미생물 DNA를 추출하였다. 최종 DNA 농도 및 정제는 NanoDrop 2000 UV-vis 분광 광도계(Thermo Scientific, Wilmington, USA)에 의해 결정되었고, DNA 품질은 1% 아가로스 겔 전기영동으로 확인되었다. 박테리아 16S rRNA 유전자의 V3-V4 초가변 영역은 열순환기 PCR 시스템(GeneAmp 9700, ABI, USA)에 의해 프라이머 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 및 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)로 증폭되었다. PCR 반응은 다음 프로그램을 사용하여 수행되었다: 95℃에서의 변성 3분 (min), 95℃에서 30초 (s), 55℃에서 어닐링을 위해 30s, 및 72℃에서 신장을 위해 45s의 27 주기, 및 72℃에서 10분 동안 최종 확장. PCR 반응을 4μL의 5×FastPfu 완충액, 2μL의 2.5mmol/L dNTPs, 0.8μL의 각각의 프라이머 (5μmol/L), 0.4μL의 FastPfu 중합효소 및 10n g의 주형 DNA를 함유하는 20 μL의 혼합물에서 삼중으로 수행하였다. 생성된 PCR 산물을 2% 아가로스 겔에서 추출하고 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)를 사용하여 추가 정제하고 제조업체의 프로토콜에 따라 QuantiFluorTM-ST(Promega, USA)를 사용하여 정량화하였다. 축퇴 프라이머는 단일 아미노산을 인코딩하기 위한 모든 상이한 염기 가능성을 나타내는 상이한 서열의 혼합물을 나타낸다. 특이성을 증가시키기 위해, 상이한 유기체의 염기 용법 선호에 따라 축퇴를 줄이기 위해 코돈 용버 표를 참조할 수 있다. A, T, G 및 C의 일반적인 4개의 염기 기호 외에도, R, Y, M, K 등과 같은 다른 문자가 뉴클레오티드 사슬에 나타나고, 여기서 R=A/G, Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, W= A/T, H= A/C/T, B= C/G /T, V=A/C/G, D=A/G /T, N=A/C/G/T.
일루미나 ( Illumina ) MiSeq 서열분석. Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd.(Shanghai, China)의 표준 프로토콜에 따라, 정제된 앰플리콘을 등몰로 풀링하고 Illumina MiSeq 플랫폼(Illumina, San Diego, USA)에서 쌍 형성 말단 서열분석(2 × 300)하였다.
서열분석 데이터의 처리. 미가공 fastq 파일을 역다중화하고, 트리모마틱(Trimmomatic)에 의해 품질을 필터링하고, 하기 기준에 기초하여 FLASH에 의해 병합하였다: (i) 판독물을 50 bp 슬라이딩 윈도우에 걸쳐 20 미만의 평균 품질 점수를 받은 임의의 부위에서 말단절단하였다. (ii) 프라이머를 정확하게 매칭시켜 2-뉴클레오티드 미스매치를 허용하고, 모호한 염기를 함유하는 판독물을 제거하였다. (iii) 10 bp보다 긴 중첩 서열을 그들의 중첩 서열에 따라 병합하였다. 조작 분류 단위(OTU)는 UPARSE(버전 7.1 http://drive5.com/uparse/)를 사용하여 97% 유사성 컷오프로 클러스터링되었으며 UCHIME를 사용하여 키메라 서열을 확인하고 제거하였다. 각 16S rRNA 유전자 서열의 분류는 70%의 신뢰 역치를 사용하여 Silva (SSU123) 16S rRNA 데이터베이스에 대해 RDP 분류기 알고리즘(http://rdp.cme.msu.edu/)으로 분석되었다.
대사산물 샘플 준비. -80℃에 보관된 샘플을 꺼내 실온에서 해동하였다. 실험에서, 50 mg의 샘플을 사용하였고, 400 L의 메탄올-물(4:1, v/v)도 첨가하여 균질화기를 이용하여 10 초 동안 샘플을 균질화하였다. 용액을 얼음 위에서 10분 동안 초음파 추출하고 -20℃에서 30분 동안 보관한 다음, 4℃에서 13000 rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. LC-MS 분석을 위해, 200 μL의 상청액을 사용하였다.
LC/MS 분석 파라미터. LC-MS는 AB Sciex TripleTOF 5600TM 질량분광계 시스템(AB SCIEX, USA)에서 수행되었다. LC 조건: 컬럼: Acquity BEH C18 컬럼(100 mm × 2.1 mm i.d., 1.7 μm; Waters, Milford, USA). 용매: 컬럼을 40℃로 유지하고 다음 구배를 사용하여 분리하였다: 0-3분에 걸쳐 5% B-30% B, 3-9분에 걸쳐 30% B-95% B, 9-13.0분에 걸쳐 95% B-95% B; 13.0-13.1 분에 걸쳐 95% B-5% B, 및 5% B에서 13.1-16 분 유지; 유속은 0.40 mL/분, 여기서 B는 아세토니트릴: 이소프로판올 1:1 (0.1% (v/v) 포름산)이고, 그리고 A는 수성 포름산 (0.1% (v/v) 포름산)이다. 주입 부피는 20μL였다. 질량 분광분석 데이터는 모세관 전압 1.0 kV, 샘플 콘, 40 V, 충돌 에너지 6 eV로 양이온 또는 음이온 모드에서 작동하는 전자분무 이온화(ESI) 공급원이 장착된 AB Sciex TripleTOF 5600TM 질량 분석계 시스템을 사용하여 수집되었다. 공급원 온도는 45 L/h의 탈용매 가스 흐름과 함께 120℃로 설정되었다. 중심 데이터는 30000 분해능으로 50에서 1000 m/z까지 수집되었다.
대사산물 QC 샘플 제조. QC 샘플은 모든 샘플의 분취량을 혼합하여 풀링 샘플로 만든 다음, 분석 샘플과 동일한 방법으로 분석하였다. 반복성을 평가할 수 있는 데이터 세트를 제공하기 위해 분석 실행 전반에 걸쳐 정기적인 간격(샘플 10개마다)으로 QC를 주입하였다.
마우스 대변의 상층액에 의해 유도된 Th1 및 Th2로의 나이브 CD4의 시험관내 분화. 나이브 CD4+ T 세포를 나이브 CD4+ T 세포 단리 키트(줄기 세포, #19765)를 사용하여 8월령 C57BL/6 암컷 마우스의 비장세포에서 분리하였다. 상기와 같이, 7월령 마우스의 대변 상청액을 준비하였다. 0.5 mL의 RPMI-1640 배지에 총 0.5×106 세포/웰을 48-웰 항-CD3 및 항-CD28 사전 코팅된 플레이트에서 플레이팅하고, 배양 배지에 사이토카인 및 차단 항체를 보충하였다. Th0: 20ng/mL mIL-2; Th1: 20ng/mL mIL-2, 10μL 상청액, 5000ng/mL 11B11; Th2: 20ng/mL mIL-2, 10μL 상청액, 5000ng/mL XMG1.2. OM1을 100 μg/mL의 최종 농도로 지정된 웰에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 5일 동안 배양한 후, BD Aria III 세포측정기에서 세포를 획득하고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
면역조직화학. 3,30-디아미노벤지딘(DAB) 개발 염색의 경우, 제조업체의 IHC 프로토콜에 따라 Leica BOND-RX Autostainer(Leica Microsystems) 및 Coverslipper CV5030(Leica Microsystems)을 사용하여 절편을 면역염색하였다. 간단히 말해서, 절편을 20분 동안 Epitope Retrieval solution 2(ER2, AR9640, Leica Biosystems)를 사용한 열 유도 에피토프 검색에 제출하였다. 내인성 과산화효소 활성은 3%-4%(v/v) 과산화수소(DS9800의 일부, Leica Biosystems)로 10분 동안 차단되었다. 그런 다음, 절편을 60분 동안 차단 완충액(0.3% Triton x-100이 포함된 PBS 중 10% NGS)과 함께 인큐베이션하였다. 마지막으로 제조업체의 프로토콜에 따라 Bond Polymer Refine Detection System(DS9800, Leica Biosystems)을 사용하여 염색을 수행하였다. 일차 항체 배양 시간은 30분이었다. 토끼 항-IBA1 항체(1:1,000, cat# 019-19741, Wako)를 사용하여 활성화된 소교세포에 대해 절편을 염색하고, 마우스 항-Aβ42 항체(1:1,000; cat# 803003, Biolegend)를 사용하여 아밀로이드 침착 및 마우스 항-PHF-Tau & 엉킴-Thr231 항체(1:300, cat# MN1040, Thermo Fisher)를 사용하여 타우 인산화를 수행하였다. 염색된 슬라이스는 고처리량 명시야 스캐너(NanoZoomer 2.0HT, Hamamatsu)에 의해 자동으로 스캔되었고 이미지는 NDP.scan 3.2 소프트웨어(Hamamatsu)로 얻었다. 형광 염색을 위해 실온에서 1시간 동안 차단 완충액(0.3% Triton x-100이 포함된 PBS 중 10% NGS)로 슬라이드를 차단한 다음, 4℃에서 밤새 일차 항체 용액 (Iba-1 1:1,000, Aβ42 1:1,000, 타우 1:300)에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 슬라이드를 형광 항토끼 또는 항마우스 이차 항체(1:1000, Invitrogen)와 함께 실온에서 60분 동안 인큐베이션하고 PBS에서 3회 더 세척하였다. 마지막으로, 슬라이드를 실온에서 5분 동안 DAPI(PBS, Sigma 중 1:10000)로 대조염색하고, 세척하고, 밀봉하고, 이미지 획득을 위해 4℃에서 보관하였다. 대표적인 형광 이미지는 Zen 소프트웨어(Zeiss)를 사용하여 10배 대물렌즈 하에서 직립 형광 현미경 Zmager-m2(Zeiss, Germany)로 획득하였다.
신경독성 테스트. SH-SY5Y 세포(ATCC, USA)를 백색 폴리스티렌 96-웰 플레이트(Corning Inc., USA)에 5000 세포/웰의 밀도로 씨딩하고 10% 우태 혈청 (FBS), 100 단위/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (Corning Inc., USA)에서 37℃ 및 5% CO2 가습된 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 후, 세포를 각각 10mM, 1mM 및 0.1mM의 최종 농도에서 L-페닐알라닌 또는 L-이소류신(Sigma)으로 처리하였다. CellTiter-Glo(Promega Inc., USA)를 사용하여 24시간 후 세포 생존력을 검출하였다. Cytation5 기구(BioTek)를 사용하여 발광 신호를 기록하였다.
아미노산 검출. 아미노산 표준 혼합물 용액의 세트는 100-2000 μmol/L의 농도 범위에서 준비되었다. 10μL의 각 표준 혼합물 용액 또는 혈장 샘플의 일부를 튜브의 바닥에 피펫팅한 다음, 70 μL의 붕산나트륨 완충액(pH 8.8에서 200 mmol/L)을 첨가하였다. 20 μL의 6-아미노퀴놀릴-N-하이드록시석신이미딜 카바메이트(AQC)(아세토니트릴 중 4mg/mL)를 첨가한 후, 튜브를 닫고 55℃에서 10분 동안 가열하여 AQC-아미노산을 형성하였다. 그런 다음 용액을 실온으로 냉각하고 각 용액의 2 L 부분을 추가 정제 없이 아미노산 분석을 위해, UPLC-ESI-MS 시스템에 주입하였다.
인간 대상체 .
AD 환자 및 건강한 대조군으로 인한 MCI의 혈액은 파일럿 연구에서 수집되었다. AD로 인한 MCI는 AD로 인한 MCI에 대한 NIA-AA 2011 임상 및 연구 진단 기준에 정의되어 있다. 본 연구에서 AD로 인한 MCI가 있는 환자는 다음 기준을 충족해야 한다. 첫째, 인지의 변화에 대한 우려. 둘째, 하나 이상의 인지 영역의 손상. 셋째, 기능적 능력의 독립성 유지. 넷째, 치매 아님(AD로 인한 MCI에 대한 NIA-AA 2011 임상 진단 기준). 모든 참가자는 병력 검토, 신체 및 신경학적 검사, 실험실 테스트 및 MRI 스캔을 포함하는 선별 과정을 거쳤다. 경증 인지 장애 또는 치매에 대한 임상 평가에는 신경심리학적 테스트뿐만 아니라 정신과 의사가 참여하는 행동 및 정신과 인터뷰가 포함되었다. AD 환자는 Hachinski Ischemia Scale에서 < 4의 점수를 기록했으며 중대한 전신적 또는 정신적 상태 또는 뇌 기능을 손상시킬 수 있는 외상성 뇌 손상의 병력이 없었다. 임상 치매 등급(CDR) 및 몬트리올 인지 평가(MoCA)는 모든 참가자에 대해 평가되었다. 평가에 기초하여, 발명자들은 AD 대상체로 인해 MCI를 유지하였고, 단일 비기억 도메인(단일, 비기억 도메인 MCI 하위유형)에 손상이 있는 사람 및 둘 이상의 도메인(다중 도메인, 약간 손상된 MCI 하위유형)에 손상이 있는 사람과 같은 다른 사람은 제외되었다. 정상 대조군은 인지 기능 저하, 신경 장애 또는 조절되지 않는 전신 의학적 장애의 병력이 없었다. 이 연구에 포함된 모든 대상체는 MRI 유체 감쇠 역전 회복(FLAIR) 서열에 의해 밝혀진 바와 같이 2개 이하의 소강 허혈(직경 < 1 cm)을 가졌다.
제1 코호트(도 5h, i)의 샘플 크기는 AD 환자와 18명의 건강한 대상으로 인해 9 MCI이다. 제2 코호트(도 5j)의 샘플 크기는 AD 환자와 22명의 건강한 대상으로 인해 22 MCI이다. MCI 진단은 페터슨(Petersen)의 MCI 진단 기준으로부터 적합화된 다음 기준을 기반으로 하였다. (1) 배우자나 친척이 확인하는 기억력 불만; (2) 객관적인 기억력 손상; (3) 정상적인 일반 인지 기능; (4) 일상 생활의 온전한 활동; 및 (5) 치매의 부재. Ethics Committee of the Shanghai Mental Health Centre Institutional Review Board는 연구를 승인하였다(번호: 2016-22R1). 대상체와 대상체의 후견인으로부터 사전 동의를 얻었다. 성별, 연령 등의 정보는 아래와 제공된다.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
페닐알라닌 및 이소류신에 의해 유도된 시험관 내 분화 및 증식. 8월령 C57BL/6 암컷 마우스의 비장세포에서 나이브 CD4+ T 세포 단리 키트 (줄기 세포, #19765)를 사용하여 나이브 CD4+ T 세포를 분리하고 세포를 CellTrace(Thermo Fisher, #C34557)로 염색하였다. 0.2 mL의 RPMI-1640 배지에 총 1 × 105 세포/웰을 96-웰 플레이트에서 플레이팅하고, 배양 배지에 사이토카인 또는 차단 항체를 보충하였다. Th0: 10 ng/mL mIL-2; Th1:10 ng/mL mIL-2, 5000 ng/mL 11B11. 페닐알라닌(최종 농도, 2 mmol/L), 이소류신(최종 농도, 2 mmol/L) 및 OM1(최종 농도, 100 μg/mL)을 표시된 웰에 각각 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 5일 동안 배양한 후, BD Fortessa 세포측정기에서 세포를 획득하고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
페닐알라닌의 흡수. 8월령 C57BL/6 암컷 마우스의 비장세포에서 나이브 CD4+ T 세포 단리 키트 (줄기 세포, Cat No. 19765)를 사용하여 나이브 CD4+ T 세포를 분리하고 20 ng/mL IL-12에 의해 Th1 분화를 유도하였다. 3일 후, RPMI-1640 배지 0.5 mL에서총 5 × 105 세포/웰 Th1 세포 및 Th0 세포를 48웰 플레이트에서 플레이팅하였다. 13C 지된 페닐알라닌 및 5 mM의아미노 수송체 억제제 BCH를 표시된 웰에 첨가하였다. 0.5시간 후, 세포를 수집하고 빙랭 D-PBS로 2회 세척하였다. 50 μL의 탈이온수를 첨가하고 -80℃에서 2회 동결 및 해동을 통해 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 12000 × g에서 10분 동안 원심분리하고 상청액의 13C 표지 페닐알라닌을 질량분석으로 분석하였다.
항생제 치료. 암피실린(0.1 mg/mL, 음용수 최종 농도), 스트렙토마이신(0.5 mg/mL, 음용수 최종 농도) 및 콜리스틴(0.1 mg/mL, 음용수 최종 농도) (Sigma-Aldrich)을 함유하는 항생제 용액(ATB)을 멸균 음용수에 첨가하여 마우스를 처리하였다. 용액과 병은 각각 3회 및 1주일에 1회 교체하였다. 항생제 활성은 16S rRNA 유전자 서열분석으로 확인하였다. 상대 존재비가 0.01 미만인 박테리아 유형은 Tg 그룹에서 삭제된다. ABX 치료 기간은 실험 환경에 따라 약간 상이하다. 대변 미생물총 이식 실험의 맥락에서, 마우스는 동물 먹이 바늘을 사용하여 경구 위관영양법에 의해 다음날 대변 미생물총 이식을 받기 전에 3일 동안 ATB를 받았다.
대변 미생물총 이식( FMT ) 실험. FMT는 대변 물질을 해동하여 수행되었다. 그런 다음, 200 μL의 현탁액을 경구위관 영양법으로 ATB 전처리된 각 수령체에게 옮겼다. FMT는 5일 동안 3회 수행되었다. 12월령 C57 마우스를 먼저 3일 동안 음용수 중 항생제 칵테일로 처리한 다음, PBS에 현탁된 혼합 대변 40 mg을 각 마우스에 2일 휴식을 두고 3회 위관영양법으로 삽입하였다. 3일 후, 4.2 μg의 Aβ 1-40 올리고머를 해마 양쪽에 주사하였다. 마우스는 3일 후에 희생되었고 다른 분석에 사용되었다.
생물정보학 분석. 경로 분석 및 생물학적 기능 풍부화 분석은 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene Genotype)을 사용하여 수행되었다. 데이터는 R 패키지 "DOSE", "GO.db", "GSEABase" 및 "ClusterProfiler"를 사용하여 풍부해졌다. 거짓 발견률(FDR) 보정된 p-값이 < 0.05인 경로만 표시되었다. 상관관계 분석에는 R 패키지 "ggcorrplot"이 사용되었다. R 패키지 "igraph"는 상관 서커스 그래프를 생성하는 데 사용되었다. R 패키지 "ggalluvial" 및 "networkD3"을 사용하여 박테리아 흐름도 및 Sankey 다이어그램을 수행하였다. 경향 클러스터 분석에는 R 패키지 "Mfuzz"가 사용되었다. 기타 생물정보학 분석은 Majorbio I-Sanger Cloud(www.i-sanger.com)의 온라인 플랫폼을 이용하여 수행하였다. ROC 바이오마커 분석 및 무작위 포레스트 분류는 MetaboAnalyst 4.0(https://www.metaboanalyst.ca/)으로 수행되었다.
유동 세포측정 샘플 준비 및 분석. 마우스를 마취하고, 혈액 샘플을 EDTA 함유 튜브에 수집하고, 1 × 적혈 용해 완충액을 사용하여 적혈구를 제거하였다. 조직 수집 전에, 순환 혈액 면역 세포의 샘플링을 피하기 위해 빙랭 PBS로 뇌를 관류하고, gentleMACS 해리기 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 성인 뇌 해리 키트 (Miltenyi, Cat No. 130)의 도입에 따라 뇌를 제거하고 조각으로 자르고 절개하였다. 뇌 균질물을 70 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하고 4℃에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 차가운 PBS 완충액에 재현탁하고 4℃에서 5분 동안 300 x g에서 다시 원심분리하였다. 모든 샘플을 계수하고 밀도를 2-3 × 106/100 μL로 조정하고, 30분 동안 Live/Dead 키트로 표지한 다음, 4℃에서 3분 동안 500 × g에서 원심분리하였다. 세포를 100μL의 PBS 완충액에 재현탁하고 항-CD16/32(Biolegend, Cat No. 101320)로 10분 동안 차단하고 제조업체의 프로토콜에 따라 4℃에서 30분 동안 항체와 함께 인큐베이션하였다. FACS 분석에 다음의 항체를 사용하였다: CD45 (30-F11)-APC-Cy7 (103116，Biolegend)，CD11b (M1/70)-FITC (101205，Biolegend)，CX3CR1 (SA011F11)-PE-Dazzle 594 (149014，Biolegend)，F4/80 (BM8)-BV421 (123132，Biolegend)，CD86 (IT2.2)-PE (305438，Biolegend)，CD206 (15-2)-APC (321110，Biolegend)，CD206 (15-2)-BV785 (321142，Biolegend)，CD11c (N418)-PE-Cy7 (117318，Biolegend)，CD8 (53-6.7)-Percp-Cy5.5 (100734，Biolegend)，Ly-6C (HK1.4)-PE-Dazzle 594 (128044，Biolegend)，Gr-1 (RB6-8C5)-Percp-Cy5.5 (108428，Biolegend)，B220 (RA3-6B2)-BV421 (103240，Biolegend)，CD19 (6D5)-PE (115508，Biolegend)，CD49b (DX5)-PE-Cy7 (108922，Biolegend)，CD4 (GK1.5)-PE-Cy7 (100422，Biolegend)，CD4 (GK1.5)-FITC (100406，Biolegend)，CXCR3 (CXCR3-173)-BV421 (126522，Biolegend)，CCR4 (L291H4)-PE-Cy7 (359410，Biolegend)，CCR6 (29-2L17)-APC (129814，Biolegend)，CD127 (A019D5)-PE (351304，Biolegend)，CD25 (3C7)-Percp-Cy5.5 (101912，Biolegend)，Live/Dead (423104，Biolegend). 세포를 500 μL의 PBS 완충액에 첨가하고, 4℃에서 3분 동안 500 × g에서 원심분리하고, 200 μL의 실행 완충액에 재현탁시켰다. 관련 음성 대조군, FMO(Fluorescence Minus One) 대조군 및 각 형광 보정 샘플을 사용하여 형광 보상을 조정하고 관심 집단을 확인하였다. BD Aria III 세포측정기에서 세포를 획득하고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
항체 어레이. 200개의 단백질을 포함하는 유리 슬라이드 기반 항체 사이토카인 어레이(RayBiotech, GSM-CAA-4000-1)를 사용하여 뇌 균질물(20 mg 조직에서 추출)을 분석하였다. 100μL의 샘플 희석제를 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 완충액을 다른 100 μL의 샘플로 교체하고 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 버리고 부드럽게 흔들면서 실온에서 150μL의 1×세척 완충액 I로 5회(각 5 분), 150μL의 1×세척 완충액 II로 2회(각각 5 분) 세척하였다. 80 μL의 검출 항체 칵테일을 각 웰에 첨가하고 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 부드럽게 흔들면서 실온에서 150μL의 1×세척 완충액 I로 5회(각 5 분), 그 다음 150μL의 1×세척 완충액 II로 2회(각각 5 분) 세척하였다. 80 마이크로리터의 Cy3 등가 염료-접합 스트렙타비딘을 각 웰에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 5회 세척(각 5 분) 후, 신호는 레이저 스캐너를 통해 시각화되었다. 그런 다음 데이터를 히트맵 다이어그램(www.metaboanalyst.ca)으로 시각화하였다.
뇌 절편 준비. 펜토바르비탈(100 mg/kg, i.p.)로 깊은 마취 후 마우스를 0.9% NaCl로 경심 관류하였다. 뇌 조직을 신속하게 제거하고 동결하여 -70℃에 보관하였다. 슬라이딩 동결 마이크로톰(Leica Microsystems)을 사용하여 직렬 관상 뇌 절편(12μm 두께)을 생성하고 슬라이드에 장착하고 실온에서 공기 중에서 밤새 건조하였다. 조직 절편은 -70℃에서 보관하거나 즉시 사용하였다.
레이저 현미절개 및 Q- PCR 분석. 냉동된 마우스 뇌 샘플을 절편화하고 PEN 막 슬라이드에서 수집하였다(Leica, 11600288). 해마는 레이저 현미절개 현미경검사(Leica Microsystems, LMD6)에 의해 분리되었다. RNA를 RNeasy Micro Kit(Qiagen, 74004)로 추출하고 cDNA(Takara, PrimeScript RT Master Mix, RR036A)로 역전사하였다. Q-PCR을 SYBR 방법(Takara, SYBR Premix Ex Taq II)을 통해 ABI 7500 시스템을 사용하여 수행하였다. 다음 프라이머가 사용되었다: 스냅토파이신-정방향: CAGTTCCGGGTGGTCAAGG; 스냅토파이신-역방: ACTCTCCGTCTTGTTGGCAC; 액틴-정방향: GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT; 액틴-역방향: AGGTCTTTACGGAT GTCAACG.
통계적 분석. 행동 테스트에서 동물은 무작위로 상이한 그룹으로 분배되었다. 두 그룹 비교를 위해, 쌍을 이루지 않은 2-테일드 스튜던트 t-테스트이 적용되었다. 2개 이상의 그룹 비교를 위해, 1-원 ANOVA 또는 2-웨이 ANOVA에 이어 던넷(Dunnett) 검정이 수행되었다. 오차 막대가 있는 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 대부분의 데이터는 GraphPad Prism에서 분석되었다. 이미지 정량화를 위해, Iba-1-양성, Aβ 42-양성 및 인산화된 타우-양성 세포를 '면적' 판독이 있는 ImageJ v1.8.0으로 분석하였다.
행동 테스트. 다음과 같은 행동 테스트가 수행되었다: 모리스 수중 미로(Morris water maze, MWM), Y 미로 및 상승 플러스 미로(EPM). 모든 추적은 카메라를 사용하여 기록되었으며 소프트웨어(Jiliang)를 사용하여 관련 파라미터를 계산하였다.
MWM 테스트는 이전에 발표된 프로토콜에 따라 공간 학습 및 기억을 측정하는 데 사용된다. 간단히 말해서, 마우스는 6일 획득 실험을 받았고 각 마우스는 매일 3번의 실험을 수행하였다. 동물을 원하는 시작 위치에서 물 속으로 풀어주었고 플랫폼을 발견하기 위한 잠복기를 정기하였다. 7일째에, 플랫폼을 제거하고 마우스를 60 초 동안 수영하도록 허용하였다. 추적 및 플랫폼 사이트 교차 수는 비디오 카메라를 사용하여 기록되었다.
작업 기억은 약간 수정된 문헌에 따라 Y 미로에 의해 평가되었다. Y 미로는 상이한 단서를 가진 3개의 동일한 아암(arm) (A, B, C)로 구성되었다. 마우스를 시작 아암(A)에 배치하고 탐색된 아암의 순서(예: ABCBA)를 기록하였다. 총 아암 항목 수와 교번 행동은 비디오 카메라를 사용하여 기록되었다. Y 미로의 정확도는 올바른 교번와 전체 교번 사이의 비율이었다.
EPM 테스트는 동물 불안을 평가하는 데 널리 사용되며 두 개의 열린 아암(30 cm × 6 cm), 두 개의 닫힌 아암(30 cm × 6 cm × 22 cm) 및 중심 영역(6 cm × 6 cm)으로 구성된다. 각각의 마우스는 닫힌 아암을 향하는 미로의 중앙에 놓고 5분 동안 미로를 탐색하도록 하였다. 추적을 기록하고 열린 아암을 방문하는 빈도를 계산했는데 이는 마우스의 불안과 음의 상관관계가 있다.
실시예
실시예 1: AD 진행은 소화관 미생물총의 변화 및 면역 세포 침윤과 관련이 있다.
AD 병인에서 소화관 미생물총 변경의 역할을 평가하기 위해, 본 발명자들은 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스 모델을 사용했는데, 이는 AD 연구에서 빠르게 발병하고 여러 AD 연관 병리학적 특징 및 임상 표현형을 충실하게 요약하기 위해 널리 사용된다. 이는 출생 후 4개월에 기억력 손상, 7개월에 행동 변화, 및 9개월에 뉴런 상실을 나타낸다. 동일한 조건에서 키운 동일한 균주의 연령 일치 야생형(WT) 마우스를 대조군으로 사용하였다. 이전 보고서와 일관되게, 본 발명자들은 Aβ 플라크 침착, 타우 인산화, 시냅토파이신 발현, 행동 등의 변화를 관찰하였다. 특히, 피질과 해마의 Aβ 플라크 침착은 출생 후 3개월부터 빠르게 축적된다(도 7a). Tg 마우스의 뇌에서 타우 인산화는 5개월째에 처음 발견되었으며 나이가 들면서 점차적으로 증가하였다(도 7b). 해마의 시냅토파이신 발현 수준은 7개월에서 9개월로 유의하게 감소하여 시냅스 퇴행을 나타낸다(도 1a). Tg 마우스의 행동 테스트는 9월령에 식별 학습에서 상당한 감소를 보여주었다(도 1b). 본 발명에서 Tg 마우스의 초기(2-3개월) 및 후기(7-9개월) 단계는 인간 임상 AD의 초기 및 후기 단계와 동일한 개념이 아님에 유의한다. Tg 마우스의 후기 단계는 인간의 AD으로 인한 경도 인지 장애(MCI)와 증상이 비슷하다. 따라서, 본 발명에서는, AD으로 인한 MCI를 가진 환자를 인간 연구 대상으로 사용한다.
Tg 마우스에서 AD 진행 동안 소화관 미생물총 조성의 현저한 변화는 일련의 시점에서 추가 주성분 분석(PCA)으로 밝혀진 반면, 시간이 지남에 따라 WT 마우스에서는 거의 변화가 관찰되지 않았다(도 1c, 도 7c).
OTU를 사용하여 Tg 마우스에서 다양한 박테리아 문의 존재비의 역학을 추적함으로써, 본 발명자들은 질환 진행 동안 Tg 마우스에서 소화관 미생물총 프로파일의 2개의 뚜렷한 변화를 발견하였다. 2-3월령에서, 박테로이데테스 , 피르미쿠테스 및 베루코마이크로비아는 세 가지 가장 풍부한 박테리아 문(각각 46.8%, 32.3% 및 12.6%)이었다. 7-9월령에서, 피르미쿠테스가 우세한 박테리아가 되었으며 박테로이 데테스 및 베루코마이크로비아의 양이 현저히 감소하여 박테리아 유형의 변경을 나타낸다(도 1d). 본 발명자들은 각 시점에서 Tg 마우스의 대표적인 박테리아를 추가로 조사하였다(도 7d, 도 7e). 이러한 결과는 Tg 마우스의 소화관 미생물총이 WT 마우스의 소화관 미생물총과 크게 대조적으로 매우 역동적임을 나타낸다. AD 연구에 널리 사용되는 또 다른 모델인 APP/PS1 이중 형질전환 마우스 모델에서도 유사한 결과가 얻어졌다(도 7f, 도 7g).
본 발명자들은 AD 진행 동안 관찰된 소화관 미생물총 변경이 신경염증과 관련될 수 있다는 가설을 세웠다. 이 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 Tg 마우스의 염증 상태를 평가하였다. AD 마우스 뇌 절편에서 소교세포 활성화의 특징인 IBA1의 면역염색은 각각 3개월 및 7-9개월에 소교세포 활성화의 2개의 분명한 단계를 나타내었다(도 1e). 소교세포 활성화가 2개의 반대 유형, 즉 염증유발 M1 및 신경보호성 M2 하위유형으로 분류될 수 있다는 점을 감안할 때, 본 발명자들은 또한 M1 및 M2 표현형을 주의 깊게 특성화하였다. 2-3월령의 초기 단계에서, M1 및 M2 소교세포가 모두 증가하였다. 다음 달에는, M1 하위유형이 계속 증가하여 7-9개월에 최고조에 달한 반면, M2 유형 소교세포는 3개월에서 5개월로 감소하여 그 후 낮은 수준을 유지하였다(도 1f). Tg 마우스의 AD가 시간이 지남에 따라 진행됨에 따라, 뇌에서 전-염증성 M1 소교세포 하위유형은 신경보호성 M2 소교세포 하위유형 (도 1f, 2-3 개월)에 필적하는 것으로부터 소교세포에서 우성인 것으로 변화하였고 (도1f, 5-9 개월), 소교세포의 전체 활성화의 증가를 유도하였다 (도-1e, 5-9 개월).
소교세포 활성화에 더하여, AD 연관 신경염증은 말초 면역 세포의 침윤을 수반하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명자들은 AD 진행 동안 뇌의 침윤성 말초 면역 세포도 분석하였다. 뇌의 CD45높은 세포는 IBA1 염색 결과와 유사하게 WT 마우스보다 Tg 마우스에서 유의하게 더 높은 것으로 관찰되었다(도 1g). 일련의 시점에서 CD45높은 세포 하위유형은 AD 진행 동안 추가로 분석되었으며, CD45높은 세포의 주요 비율이 IBA1과 유사한 변경 경향을 밀접하게 가짐으로써 CD4+ T 세포의 변경을 나타낸다(도 1h-i). 본 발명자들은 탐색한 기간 동안 CD4+ 세포의 2개의 주요 하위유형인 Th1 및 Th2 세포에 침투하여 M1 및 M2 소교세포와 유사한 역학을 나타냈다(도 1j). 시간이 지남에 따라 Tg 마우스에서 AD의 진행에서, Th1은 Th2에 필적하는 수준(도 1j, 2-3개월)에서 CD4+ T 세포(도 1j, 5-9개월)에서 우세한 것으로 바뀌었고, CD4+ T의 전반적인 증가로 이어진다(도 1i, 5-9개월).
따라서 본 발명자들은, 소화관 미생물총의 패턴이 이동함에 따라 면역 세포 집단이 Th1 및 M1이 우세한 상태로 변화하는 경향이 있으며, 특히 시간에 따른 이러한 변화의 관련성이 현저한 것으로 나타났다(도 1d-j ). 유사한 결과가 APP/PS1 마우스 모델에서도 발견되었다(도 8, 도 7i, 도 7j, 도 23). APP/PS1 마우스 모델과 5XFAD 형질전환(Tg) 마우스 모델은 시간 경과에 따른 AD의 진행이 다르다는 점을 지적해야 한다. Tg 마우스는 5월령에 명백한 Aβ 침착이 있는 반면(도 7a), APP/PS1 마우스는 5월령에 명백한 Aβ 침착이 없다(도 8a). 시간 경과에 따른 두 소화관 미생물의 변화 (도 1d, 도 7g)는 종내 및 개체 간 AD 진행과 소화관 미생물의 차이를 반영하여 완전히 일치하지 않지만, 이들은 모두 장 미생물 패턴의 변화와 시간에 따른 면역 세포의 변화 사이의 상관관계를 나타낸다.
본 발명자들은 또한 소화관 미생물총의 존재비와 뇌 면역 세포 빈도 사이의 상관관계를 분석했으며, 초기(2-3개월) 박테리아 조성은 뇌의 M2 및 Th2 세포 수와 높은 상관관계가 있지만(도 1k, 상단), 박테리아 패턴 변화는 M1 및 Th1 세포와 높은 상관관계가 있었다(도 1k, 하단). 면역 세포와 유의하게 상호 관련된 박테리아는 도 1k의 오른쪽 패널에 열거되어 소화관 미생물총 패턴과 면역 세포, 특히 Th1과 M1 사이의 상관관계를 다시 확인한다.
전반적으로, 이러한 결과는 장내 박테리아가 AD 진행 동안 말초 면역 세포의 침윤 및 신경염증 발생과 관련이 있음을 나타내었으며, 이에 대해서는 아래에서 더 연구될 것이다.
실시예 2: 소화관 미생물총의 변화는 Th1 세포의 과도한 침윤과 뇌의 M1 소교세포의 과도한 활성화로 이어진다.
소화관 미생물총 변화가 AD 진행에서 말초 면역 세포 침윤 및 차례로 신경염증을 유도하는 데 필요한지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 후기 단계의 Tg 마우스(7월령)에서 암피실린 (0.1mg/mL), 스트렙토마이신 (0.5mg/mL), 및 콜리스틴 (0.1mg/mL)을 함유하는 항생제 칵테일을 사용하여 소화관 미생물총을 제거한다. 후기 단계의 Tg 마우스(7월령)에서 항생제 치료는 소화관의 미생물 다양성과 존재비 모두에서 현저한 감소를 가져왔다(도 2a).
이러한 변화와 함께, 본 발명자들은 뇌에서 침윤성 염증유발 Th1 세포(도 2b) 및 M1 세포(도 2c) 모두의 감소를 관찰하였다. 이것은 AD 마우스에서 소화관 미생물의 분포를 방해함으로써 후기 단계 AD 마우스에서 Th1과 M1의 우세한 상태가 변할 수 있다는 것을 예비적으로 증명하여 소화관 미생물의 변화와 면역 세포의 변화 사이의 인과 관계를 나타낸다.
또한, 이러한 발견은 공동 수용 실험에 의해 확인되었다. WT 마우스는 출생 후 7개월 동안 같은 연령의 Tg 마우스와 함께 공동 수용되었다. 공동 수용된 WT 마우스는 Tg 마우스와 유사한 식별 학습의 감소를 나타내었다(도 9a). 그 이유를 알아보기 위해, 이들 7월령 마우스에서 소화관 미생물총 변화의 분석은 소화관 미생물의 조성이 후기 단계(7월령)에서 공동 수용된 WT 마우스와 Tg 마우스 사이에서 매우 유사하였지만, 별개의 수용(도 2d) 하에 동일한 연령의 WT 마우스의 것과 유의하게 상이하다는 것을 나타내었고, 이는 WT 마우스가 Tg 박테리아(즉, Tg 마우스의 AD 소화관 미생물 모델)에 장기간 노출되면 WT 마우스에 대한 소화관 세균총의 조성이 Tg 마우스 방향으로 이동하고, 동시에 인지 장애를 유발하였음을 나타낸다. 이는 WT 모델의 소화관 미생물총 패턴을 AD 모델로 변경하도록 조절함으로써 기존 방식과 다른 AD 모델을 구성하는 전략을 제안한다.
또한, 공동 수용된 WT와 Tg 마우스 사이에 침윤 Th1 세포도 비슷했으며, 이는 별도로 수용된 WT 마우스보다 훨씬 더 높았다(도 2e). 한편, 공동 수용 WT 마우스에서 M1 세포가 증가하였다(도 2f). 면역 세포 변화에 따라, 뇌의 사이토카인 발현은 공동 수용 WT와 Tg 마우스 사이에 현저한 유사성을 나타내었지만 WT 마우스와는 구별된다(도 2g).
따라서 이상의 설명으로부터, WT 마우스의 소화관 미생물총을 Tg 마우스로 바꿈으로써, Tg 마우스의 Th1 및 M1 세포를 Tg 마우스와 동일한 상태로 형질 전환하여, 동일한 인지 장해를 얻음과 함께, 재차 소화관 미생물의 변화와 면역 세포의 변화와 인지의 인과 관계를 검증하였다.
또한, 본 발명자들은 C57BL/6WT 마우스를 사용하여 상기 방법의 치료적 가치를 입증하는 모델을 구축하였다. 본 발명자들은 C57BL/6 WT 마우스를 이용하여 대변 미생물총 이식(FMT) 실험을 수행하였고, 그 결과를 도 16의 6 내지 10열에 나타내었다.
C57BL/6WT 마우스를 항생제로 처리하여 후속 대변 미생물총 이식을 위한 초기 환경을 제공하였다. 응집된 Aβ를 해마에 주입한 후, 7~9월령 Tg 마우스의 대변 박테리아("Receptor_C57_Receive TG Fecal Bacteria") 또는 WT 마우스의 대변 박테리아("Receptor_C57_Receive WT Fecal Bacteria")을 대조군으로 경구 투여하였다. 이는 대조군과 비교하여 뇌에서 Th1 세포의 상당한 증가와 Th2 세포의 현저한 감소를 초래했으며(도 9b), 이는 위의 Tg 마우스의 변화와 일치한다. 이는 Tg 대변 이식이 WT 마우스의 소화관 미생물 패턴의 변화를 유발하여, 또한 면역 세포 패턴의 변화를 초래함을 입증한다.
다른 한편으로는, 반대로, 정상적인 소화관 미생물 분포 패턴을 가진 WT 마우스의 대변 이식은 수령체 Tg 마우스의 뇌에서 Th1 세포를 감소시켰다(도 9c). 이것은 Tg 마우스의 소화관 미생물 패턴이 WT 마우스의 것으로 변경되고 면역 세포 패턴도 변경됨을 입증하였다.
이러한 결과는 AD의 진행에 있어서 소화관 미생물총의 변화와 뇌 면역세포(특히 Th1/M1)의 변화와 인지 사이의 인과관계를 다시 한번 확인시켜주었다. AD를 치료하기 위해 뇌-소화관 축을 사용하는 전략이 제안되고 검증되었다.
함께, 이러한 발견은 소화관 미생물총 변경이 AD 진행에서 말초 면역 세포 침윤 및 신경염증 활성화를 유도함을 시사한다. 소화관 미생물 분포가 질환 패턴을 나타내는 Tg 마우스에 소화관 미생물의 상대 존재비를 조절하기 위한 제제(예를 들어, 정상적인 소화관 미생물 분포 패턴을 갖는 WT 대변 또는 아래 예시된 OM1)를 투여함으로써, Tg 마우스의 소화관 미생물 분포는 초기 및 정상적인 소화관 미생물 분포로 재조정된다. 이것은 Tg 마우스에서 Th1/M1이 지배하는 면역 세포 패턴을 효과적으로 역전시켜 인지를 개선하고 AD을 치료하였다. 이는 면역 세포 패턴을 역전시키기 위해 인간 AD 환자에서 소화관 미생물의 분포 (예를 들어, 소화관 미생물의 상대 존재비를 조절하기 위한 제제의 사용 전략)를 재조건화함으로써 AD의 인지 및 치료의 추가의 개선에 대한, 뿐만 아니라 AD 진행의 마커로서 소화관 미생물 분포 및/또는 면역 세포 상태 (예를 들면, Th1 상태 (예컨대, 집단에서의 비율), M1 상태(예컨대, 집단을 구성하는 비율))의 사용에 대한 확실한 증거 및 충실한 토대를 제공한다.
실시예 3 OM1은 소화관 미생물총을 조절하여 신경염증을 완화시킨다
본 명세서에서 밝혀진 AD 진행에서 소화관 미생물총의 필수적인 역할은 소화관 미생물총의 개입에 의한 치료적 의미를 시사할 수 있다. 다시 확인하기 위해, 본 발명자들은 갈조류에서 추출한 임상적으로 입증된 항-AD 약물인 OM1을 사용하였다. OM1은 평균 분자량이 약 1kDa인 이량체에서 십량체까지 범위의 중합도를 갖는 산성 선형 올리고당의 혼합물이다(도 3a).
3개월 동안 OM1로 처리된 9월령 내지 12월령의 후기 단계 AD 모델 APP/PS1 마우스에서, OM1은 Morris Water Maze(MWM) 과제에서 훈련 시험(도 3b)과 프로브 시험(도 3c) 모두에서 APP/PS1 마우스의 향상된 공간적 학습 및 기억 성능에 의해 보여진 바와 같이 인지 장애에 상당한 개선 효과를 나타내었다. OM1은 또한 Y 미로에서 마우스 성능을 크게 개선하였다(도 3d). 최근 OM1은 중국에서 36-주 다중-중심, 램덤화된, 이중맹검, 위약 대조된 3기 임상 시험 (임상 시험 코드: CTR20140274)에서 AD 환자의 인지 장애 역전에 대한 치료 효과를 보여주었다. 본 발명자들은 OM1이 AD 환자의 소화관 미생물에 영향을 주어 인지 개선 효과를 발휘하는지 여부를 이해하는 데 관심이 있다.
흥미롭게도 7월령부터 후기 단계 Tg 마우스에서 OM1을 1개월 동안 경구 투여하면 소화관 미생물총의 조성이 현저하게 변경되었으며(도 4a-b, 도 10a), WT 패턴에 더 가깝게 이동하도록 회복되었다(도 13-14; 도 16).
소화관 미생물총 변화에 따라, Tg 마우스에서 OM1 처리는 뇌 림프구 수와 장내 박테리아 변화 사이의 상관관계를 파괴하고(도 4c; 도 10b 및 c), 뇌에서 Th1 세포를 감소시키고(도 4d), 소교세포 활성화를 WT 마우스와 유사한 수준으로 상당히 감소시키고(도 4e), 그리고 뇌 사이토카인 수준을 감소시키고(도 4f), WT 패턴에 더 가깝게 이동하도록 회복되었다(도 15). 동시에, OM1 처리는 Aβ 플라크 침착, 타우 인산화 및 Tg 마우스에서 볼 수 있는 식별 학습의 감소를 유의하게 감소시켰다(도 4g-i). 면역 세포 패턴을 역전시켜 인지를 개선하고 AD를 치료하기 위해 소화관 미생물의 상대 존재비를 조절하는 제제를 사용하는 것과 같이 소화관 미생물 분포를 재조정하는 전략을 다시 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 OM1-처리된 Tg 마우스의 대변을 수령체 C57BL/6 WT 마우스에 이식하고, 응집된 Aβ를 뇌심실로 주사한 대변 미세플로라 이식 (FMT)을 수행하였다. OM1 처리된 Tg 마우스의 대변은 OM1 처리되지 않은 Tg 마우스와 비교하여 수령체 마우스의 뇌에서 Th1 세포를 감소시켰다(도 10e). OM1을 처리한 Tg 마우스의 대변과 실시예 2에서 확인된 WT 마우스의 대변은 소화관 미생물의 분포를 회복하고 Th1을 감소시키는 효과가 유사함을 알 수 있으며, 이는 Tg 마우스의 소화관 미생물에 대한 OM1의 회복 효과를 검증한다. 일관되게, 항생제 치료는 APP/PS1 마우스 모델에서 Th1 세포, IBA1 수준 및 사이토카인 발현에 대한 OM1의 효과를 손상시켰다(도 10f-j). 이러한 모든 데이터는 OM1이 소화관 세균불균형 조절을 통해 신경염증 및 인지력 저하를 완화할 수 있음을 시사하였다.
일반적으로 마우스에서의 상기 생체 내 실험은 장 미생물 및 그의 조절-면역 세포 Th1/M1 우성 추세 및 그의 역전-인지 장애 및 그의 개선, 예컨대 AD 뇌-장축 조절 경로 및 그의 개입 치료를 완전히 확인하였다. 그리고 이러한 조절 경로 및 개입은 다양한 상이한 마우스 모델(5XFAD 형질전환(Tg) 마우스 모델, APP/PS1 마우스 모델 및 C57BL/6 마우스 모델)에서 일관되게 입증되지만, 이들 마우스 중에서 소화관 미생물의 초기 상태 및 과정 전이에서 특정 종내 및 개체간 차이가 존재한다. 따라서 이러한 조절 경로와 다양한 개체에 대한 개입의 공통점이 완전히 확인된다. 따라서, 면역 세포 질환 모드를 역전시키기 위해 소화관 미생물을 정상적이고 건강한 모드로 재조정하기 위해 소화관 미생물을 조절함으로써 인지를 개선하고 AD를 치료하는 전략이 제안된다.
본 발명자들은 조절 표적으로서 표 1-2에 열거되고 도 17-18에 예시된 바와 같이 둘 사이에 상이한 AD 뇌-장축 관련 소화관 미생물을 비교 및 분석하기 위해 인간 AD 환자 및 건강한 대조군의 데이터를 사용하였다. 상기 언급된 AD 뇌-소화관 축 치료 전략을 인간에게 적용할 때, 설치류로 테스트한 마우스와 영장류로 테스트한 인간 간의 종간 소화관 미생물 차이 외에도, AD 환자 간의 종내 및 개체간 소화관 미생물 차이도 충분히 고려해야 한다. 따라서 상기 실험에서 구체적으로 나타낸 마우스 소화관 미생물의 유형은 더 유익하며 인간 AD 환자에게 엄격하고 기계적으로 적용해서는 안 된다.
실시예 4: OM1은 아미노산 대사를 조절하여 신경염증을 억제한다.
본 발명은 또한 소화관 미생물총의 변화와 면역 세포의 변화 및 그 개입 사이의 중간 연결을 탐구한다.
소화관 미생물 대사산물과 나이브 T 세포의 Th1 / Th2로의 분화와 그 개입 사이의 인과관계
면역 조절에서 대사산물의 가능한 관련성을 테스트하기 위해, 7월령 Tg 마우스의 시험관 내 배양 대변의 상청액을 나이브 CD4+ T 세포 배양에 첨가하여 나이브 CD4+ T 세포를 Th1 및 Th2 세포로 분화하도록 자극하였다. 대조적으로, OM1으로 처리된 Tg 마우스의 대변 상층액은 Th2 분화를 촉진하고 Th1 분화를 억제하여(도 11a), 소화관 미생물 대사산물이 나이브 T 세포의 Th1 및 Th2 세포로의 분화에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
소화관 미생물의 대사산물의 아미노산과 나이브 T 세포의 Th1 / Th2로의 분화와 그 개입의 인과관계
다음으로 본 발명자들은 비표적 대사체학 기술을 사용하여 대변 대사체를 특성화하였다. 총 11289개의 대사산물이 WT, Tg 및 OM1 처리된 Tg 마우스의 대변 샘플에서 확인되었다(도 11b-c). 이러한 대사산물 중에서, METLIN 데이터베이스에 의해 주석이 달린 124개의 대사산물이 WT 마우스에 비해 Tg 마우스에서 크게 변경, 하향조절 또는 상향조절되고, 이는 AD와 관련이 있음을 나타낸다. 놀랍게도, 이러한 모든 대사산물 변화는 OM1 치료에 의해 상당 부분 역전될 수 있으며(도 11d-f), 이는 AD 치료가 이러한 AD 관련 대사산물의 비정상적인 상태를 복구했음을 나타낸다. 이러한 변경된 대사산물은 HMDB(Human Metabolome Database)와 KEGG(Kyoto Encyclopaedia of Genomes and Genomes)로 추가 주석을 달았으며, WT, Tg 및 OM1 처리된 Tg 마우스 간에 차등적으로 조절되는 총 31개의 대사산물이 생성되었고, 이는 3개의 데이터베이스(HMDB, METLIN, KEGG) 모두와 일치할 수 있다. MBROLE 또는 MetaboAnalyst를 사용한 이러한 대사산물의 경로 풍부화 분석은 아미노산 관련 대사 경로 및 효소, 특히 페닐알라닌 관련 경로의 상당한 변화를 추가로 밝혔다(도 5a).
따라서 본 발명자들은 추가 연구를 위해 아미노산에 집중하기로 결정하였다. 총 36개 아미노산의 혈장 농도(표 3)는 WT 및 Tg 마우스 둘 모두에서 스크리닝되었다. 랜덤 포레스트 알고리즘은 이러한 아미노산을 분류하는 데 사용되며 그 중 일부는 도 19와 같이 분류되고 표 4에 열거된다. 페닐알라닌이 가장 높은 적중률을 보였고 이소류신, 세로토닌, 히스티딘, 아세틸오르니틴이 그 뒤를 이었다. 이 5가지 아미노산에 대한 다변량 탐색적 분석은 수용체 작동 특성(ROC) 곡선(도 5b, 도 11h)에 따라 WT와 Tg 마우스 사이에 상당한 차이가 있음을 보여주었고, 이는 이들이 질환 진행과 밀접하게 관련되어 있음을 나타낸다. 그런 다음, 본 발명자들은 OM1 처리 또는 처리되지 않은 Tg 마우스의 대변 및 혈액 샘플에서 선택된 아미노산의 농도를 조사하고 이를 WT 마우스의 농도와 비교하였다. 도 20 및 도 21을 참조하면, 본 발명자들은 다양한 아미노산이 OM1에 의해 영향을 받고 Tg 패턴에서 야생형 패턴으로 회복됨을 발견하였다. 특히, 페닐알라닌 및 이소류신의 농도는 WT 마우스의 대변에서보다 Tg 마우스의 대변에서 유의하게 높았고, OM1 처리는 WT 마우스의 농도와 유사한 수준으로 농도를 유의하게 감소시켰다(도 5c). 페닐알라닌과 이소류신의 존재비에서 유사한 변화 모드가 혈액에서 검출되었다(도 5d). 페닐알라닌과 이소류신은 질환 진행에 따라 변하고 OM1에 의해 역전되는 소화관 미생물 대사산물의 대표이다. 또한, 본 발명자들은 OM1을 투여받은 후 마우스의 사이토카인이 야생형 패턴으로 회복되는 경향이 있음을 발견하였다(도 22). 이것은, Tg 마우스와 공동 수용할 때 도 2g에 표시된 것처럼 Tg 마우스 패턴으로 변경되는 경향이 있는 WT 마우스의 사이토카인 상태에 해당한다.
이들 아미노산의 상승이 소화관 미생물총 변화로 인한 것인지 여부를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 FMT 연구에서 아미노산의 농도를 조사하여 소화관 미생물총을 방해함으로써 아미노산의 개입을 가능하게 하였다. 2월령 WT 마우스의 대변은 Tg 마우스에서 페닐알라닌과 이소류신의 수준을 상당히 감소시킬 수 있다(도 11i). 마찬가지로, 도 2에 설명된 공동 수용 WT 마우스에서, 혈액 내 페닐알라닌 및 이소류신 농도도 증가하여 Tg 마우스의 농도와 비슷하였다(도 11j). 따라서 WT 마우스가 Tg 마우스와 공동 수용되어 자신의 WT 소화관 미생물 패턴을 Tg 패턴으로 변형시켰을 때, 페닐알라닌 및 이소류신의 비정상적인 생산이 발생하고 페닐알라닌 및 이소류신의 수준이 증가함을 확인할 수 있다. 이에 반해, 정상적인 WT 소화관 미생물총을 함유하는 WT 마우스 대변을 Tg 마우스에 이식하면, Tg 마우스 소화관 미생물총이 WT 패턴으로 이동하여 페닐알라닌 및 이소류신의 비정상적인 생산이 회복되고 페닐알라닌 및 이소류신 수준이 감소하였다. 이것은, 소화관 미생물 대사산물인 페닐알라닌과 이소류신의 수준이 Tg 마우스의 소화관 미생물총을 회복함으로써 회복될 수 있음을 확인시켜주었다.
페닐알라닌 및 이소류신이 나이브 T 세포의 Th1 / Th2로의 분화 및 이들의 개입에 영향을 미치는지 확인
세포에 대한 페닐알라닌 및 이소류신의 효과를 평가하기 위해, 이 두 화합물을 나이브 CD4+ T 세포 배양물에 직접 추가하였다. Th1 세포로의 Th0 세포 분화(도 5e) 및 Th1 세포 증식(도 5f)이 모두 증가하였다. 반대로, OM1 처리는 페닐알라닌 및 이소류신에 의해 유도된 Th1의 분화 및 자극된 Th1 세포의 증식을 억제할 수 있으며, 이는 OM1이 소화관 미생물에 영향을 미칠 뿐만 아니라 대사산물 아미노산 자체에도 직접적인 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명자들은 페닐알라닌 및 이소류신의 복강내 주사로 WT 마우스를 처리하고 혈액 내 Th1 세포 수가 유의하게 증가함을 발견하였고(도 5g), 아미노산이 생체내에서 Th0의 Th1으로의 분화를 촉진함을 확인하였다. 이러한 결과는 페닐알라닌과 이소류신의 축적이 혈액 내 Th1 세포 수를 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 방해함으로써 나이브 T 세포의 분화에 대한 개입
아미노산은 특정 수송체를 통해 면역 세포에 의해 섭취될 수 있다. 본 발명자들은 나이브 CD4+ T 세포에서 페닐알라닌 및 이소류신의 수송체인 SLC7A5의 발현 수준을 추가로 조사하고 SLC7A5가 CD4+ T 세포에서 발현된다는 것을 발견하였다. 13C로 표지된 페닐알라닌과 함께 CD4+ T 세포를 인큐베이션하면 CD4+ T 세포에 의한 페닐알라닌 흡수가 나타났으며, 이는 SLC7A5, JPH 203의 약리학적 억제제에 의해 차단될 수 있으며(도 11k), 이는 아미노산의 수송체를 억제함으로써 면역 세포에 의한 아미노산 흡수를 억제할 수 있음을 시사한다. 본 발명자들은 Th1 세포 비율의 결과적인 변화를 추가로 테스트하였다. 6월령 5XFAD 마우스에게 매일 50 mg/kg의 JPH 203 또는 비히클 대조군을 복강내 주사로 투여하였다. 투여 1개월 후, 마우스를 안락사시키고, 대조군 및 JPH 203 처리군의 마우스 뇌에서 염증유발 Th1 세포의 비율을 유동 세포측정법으로 분석하였다. 이것은 뇌의 신경염증을 반영하는 대표적인 것이었다. 결과는 도 13에 보여진다. 비히클 대조군과 비교하여, 1개월 동안 JPH203 처리는 마우스 뇌에서 염증유발 Th1 세포의 비율을 유의하게 하향조절하고, 이는 아미노산의 수송체를 억제함으로써 면역 세포에 의한 아미노산 흡수가 억제되어, 아미노산에 의한 면역 세포의 분화 촉진을 예방하고 뇌의 신경염증을 감소시키는 것을 입증하였다.
인간 AD 대상체에서 페닐알라닌 및 이소류신의 비정상적인 수준 확인
마지막으로, 본 발명자는 상기 발견이 AD(이 연구에서 사용된 MCI의 정의에 대해 이 연구에서 사용된 방법 참조) 환자로 인해 MCI에서 재현될 수 있는지 여부를 조사하면서 인간에서 이것을 검증한다. 실제로, AD(n=9)로 인한 MCI 대상체의 혈액 내 페닐알라닌 및 이소류신 농도뿐만 아니라 Th1 세포 수는 연령이 일치하는 건강한 상대방(n=18)보다 유의하게 높았다(도 5h, i). 혈액 내 페닐알라닌과 이소류신 둘 다의 증가된 수준은 AD로 인한 또 다른 소규모 MCI 코호트에서도 확인되었으므로(도 5j), 이를 기반으로 인간 진단 및 치료 전략을 설계할 수 있다.
요약하면, 본 발명자들은 장 미생물 대사물 중의 몇몇 대사물이 면역 세포의 Th1 우성 상태로의 후속 전이에 관여한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 특히 대사물 중의 아미노산, 특히 페닐알라닌 및 이소류신을 조사하였고, 장내 미생물총의 조성 변화, 페닐알라닌 및이소류신의 비정상적 생성, 및 나이브 T 세포의 과도한 Th1 분화 사이의 인과 관계를 확인하였다. 상기에서 확인된 WT 대변 박테리아 및 OM1을 투여하여 Tg 마우스의 비정상 소화관 미생물총을 정상적인 WT 소화관 미생물총으로 회복시켜, 비정상적으로 높은 수준의 페닐알라닌 및 이소류신을 감소시키고 정상적인 수준으로 회복시켰다. 또한 Th0 세포의 Th1 세포로의 분화가 억제되어 Th1이 지배하는 질환 상태를 역전시켜 소화관 미생물 대사산물이 비정상 소화관 미생물총 조성물 및 비정상 면역 세포 상태 사이의 다리이며 AD 뇌-소화관 축 사이의 관계의 일부이다. 본 발명자들은 또한 대사산물의 수준을 감소시키거나 면역 세포에 의한 대사산물의 흡수를 방지하는 것과 같은 대사산물을 방해하는 다른 수단을 시험하여, 소화관 미생물 대사산물에 의해 야기되는 하류의 비정상적인 면역 세포 상태 및 이에 따른 인지 상태에 개입한다.
본 발명의 원리가 선호된 구현예와 관련하여 상기에서 설명되었지만, 설명은 단지 예로서 이루어지며 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님을 명확히 이해해야 한다.
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Claims (16)

  1. 대상체의 알츠하이머병을 치료하기 위한 약제의 제조에서 포유동물 말초 혈액의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하기 위한 제제의 용도.
  2. 대상체의 알츠하이머병을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 포유동물 말초 혈액에서 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하기 위한 제제를 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미노산은 다음으로부터 선택된 하나 이상인, 용도 또는 약제학적 조성물: 4-OH 프롤린, 아세틸오르니틴, 알라닌, 알파-아미노아디프산, 아스파라긴, 아스파르트산, 비대칭 디메틸아르기닌, 베타-알라닌, 카르노신, 시트룰린, 크레아티닌, GABA, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 하이포타우린, 이소류신, 카이뉴레닌, 류신, 라이신, 메티오닌, 메티오닌 설폭사이드, 오르니틴, 페닐알라닌, 피페콜산, 프롤린, 푸트레신, 파이로글루탐산, 세린, 세로토닌, 타우린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린; 바람직하게는 페닐알라닌, 이소류신, 세로토닌, 히스티딘 및 아세틸오르니틴으로부터 선택된 하나 이상; 더 바람직하게는 페닐알라닌 및/또는 이소류신; 가장 바람직하게는 페닐알라닌.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제제는 수송체에 의한 나이브 T 세포로의 아미노산의 수송을 억제함으로써 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하는, 용도 또는 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 수송체는 SLC7A5인, 용도 또는 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 제제는 JPH 203, BCH 및 KMH-233으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 용도 또는 약제학적 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제제는 대상체로부터의 샘플에서 CD4+ T 세포 내의 염증유발 Th1 세포의 비율을 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 초과까지 감소시키고/시키거나; CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 비율이 상응하는 정상적인 대상체의 CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 상응하는 비율에 근접하거나 도달하도록 하는, 용도 또는 약제학적 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제제는 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수 수준을 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 또는 그 초과까지 감소시키고/시키거나; 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수 수준이 상응하는 정상적인 대상체의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상응하는 상대적 흡수 수준에 근접하거나 도달하도록 하는, 용도 또는 약제학적 조성물.
  9. 다음을 포함하는, 알츠하이머병 치료에 사용할 수 있는 약물 후보를 스크리닝하는 방법:
    a) 수송체 SLC7A5이 있는 생체내 또는 시험관내 모델에 시험 제제를 투여하는 단계, 및
    b) 알츠하이머병 치료에 사용될 수 있는 약물 후보로서 수송체 SLC7A5를 억제하는 시험 제제를 선택하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, JPH 203을 양성 대조군으로서 수송체 SLC7A5가 있는 생체내 또는 시험관내 모델에 투여하는 단계, 바람직하게는 JPH 203과 실질적으로 일관되게 수송체 SLC7A5를 억제하는 시험 제제를 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 모델은 생체내 모델인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 검증을 위해 선택된 시험 제제를 수송체 SLC7A5가 있는 생체내 모델에 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 선택된 시험 제제는 생체내 모델로부터의 샘플에서 CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 비율을 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 초과까지 감소시키고/시키거나; CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 비율이 상응하는 정상적인 생체내 모델에서 CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 상응하는 비율에 근접하거나 도달하도록 하는, 방법.
  13. 제9항에 있어서, 검증을 위해 수송체 SLC7A5가 있는 생체내 또는 시험관내 모델에 선택된 시험 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 선택된 시험 제제는 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수 수준을 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 또는 그 초과까지 감소시키고/시키거나; 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수 수준이 상응하는 정상적인 생체내 또는 시험관내 모델의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상응하는 상대적 흡수 수준에 근접하거나 도달하도록 하는, 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산은 다음으로부터 선택된 하나 이상인, 방법: 4-OH 프롤린, 아세틸오르니틴, 알라닌, 알파-아미노아디프산, 아스파라긴, 아스파르트산, 비대칭 디메틸아르기닌, 베타-알라닌, 카르노신, 시트룰린, 크레아티닌, GABA, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 하이포타우린, 이소류신, 카이뉴레닌, 류신, 라이신, 메티오닌, 메티오닌 설폭사이드, 오르니틴, 페닐알라닌, 피페콜산, 프롤린, 푸트레신, 파이로글루탐산, 세린, 세로토닌, 타우린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린; 바람직하게는 페닐알라닌, 이소류신, 세로토닌, 히스티딘 및 아세틸오르니틴으로부터 선택된 하나 이상; 더 바람직하게는 페닐알라닌 및/또는 이소류신; 가장 바람직하게는 페닐알라닌.
  15. 다음을 포함하는 알츠하이머병 환자의 치료 방법:
    포유동물 말초 혈액의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하기 위한 제제를 환자에게 투여하는 단계로서, 환자의 CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 비율이 상응하는 정상적인 집단에서 CD4+ T 세포 중 염증유발 Th1 세포의 상응하는 비율에 근접하거나 도달하도록 조절되는 단계.
  16. 다음을 포함하는 알츠하이머병 환자의 치료 방법:
    포유동물 말초 혈액의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하기 위한 제제를 환자에게 투여하는 단계로서, 환자의 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상대적 흡수 수준이 상응하는 정상적인 집단에서 나이브 T 세포에 의한 아미노산의 상응하는 상대적 흡수 수준에 근접하거나 도달하도록 조절되는 단계.
KR1020227007376A 2019-08-06 2020-08-05 T 세포에 의한 아미노산의 흡수를 억제하여 알츠하이머병을 치료하는 방법 KR20220044552A (ko)

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