KR20220035842A

KR20220035842A - SARS-CoV-2 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20220035842A
Application number: KR1020210119111A
Authority: KR
Inventors: 박천권; 이원화
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2020-09-14
Filing date: 2021-09-07
Publication date: 2022-03-22
Also published as: KR102641224B1

Abstract

본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자가 뛰어난 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 치료 효과를 발휘하는 것을 확인하여 완성된 것이다. 중증 COVID-19 환자의 혈장에 본 발명에 따른 나노입자를 처리한 결과 DNase-I의 활성이 증가하고, 호중구의 NETosis, 세포외 DNA 수준, 및 다양한 염증성 사이토카인 수준이 감소하는 것을 확인하였으며, 상기 나노입자를 투여한 COVID-19 유사 동물모델 또한 다양한 염증인자의 생성 및 조직 손상이 감소할 뿐만 아니라 생존율이 증가하는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 DNase-I 나노입자는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 과도한 염증 반응을 완화하고 DNase-I 활성을 증가시킴으로써 SARS-CoV-2 바이러스 감염증을 효과적으로 치료할 수 있으므로, 새로운 코로나바이러스 치료 전략으로 활용될 것으로 기대된다.

Description

SARS-CoV-2 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical compositions for preventing or treating SARS-CoV-2 infection}

본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 감염증 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)는 2019년에 발생한 신종 코로나바이러스 (coronavirus)로서, 이의 감염으로 인한 코로나바이러스 질환-2019 (COVID-19)의 대유행은 전세계적으로 공중 보건에 심각한 위협이 되고 있다. 최근 통계에 따르면, 전세계 180개국에서 10만명 이상의 사망자와 약 2,000,000명 이상의 확진자가 발생했다. 확진자 수는 계속해서 증가하고 있으며, 전문가들은 전세계적으로 수십만명의 사망자가 발생할 것으로 예측하고 있다.

SARS-CoV-2 감염은 비정상적인 적응성 면역 반응 (adaptive immune responses) 및 염증성의 선천성 면역 반응을 일으킨다. 급격한 면역 반응은 패혈성 쇼크 (septic shock)를 유발하여 환자의 사망 가능성을 높일 수 있다. 따라서, SARS-CoV-2의 감염으로 인한 패혈증의 진행을 억제할 수 있는, 새로운 치료 전략의 개발이 시급하다.

수많은 연구팀 및 글로벌 제약 회사가 SARS-CoV-2 치료 후보제에 대해 임상 시험을 수행하고 있다. 그러나, 이들 약물의 대부분은 SARS-CoV-2 감염의 치료를 위해 개발된 것이 아니라, 에볼라 바이러스 (Ebola virus), 인체 면역 결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus, HIV), 중증 급성 호흡기 증후군 (severe acute respiratory syndrome, SARS) 바이러스, 중동 호흡기 증후군 (Middle East respiratory syndrome, MERS) 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스 (Influenza A virus), 및 ZIKA 바이러스 등 종래의 바이러스 치료를 위해 개발된 것에 불과하다.

다양한 임상 연구에 따르면 COVID-19 환자는 특히 사이토카인 방출 증후군 (cytokine release syndrome, CRS) 및 심각한 호흡기 손상을 극복하는 것이 상당히 어려운 것으로 알려져 있다. 최근 미국의 생명공학 기업 Genentech가 중증 SARS-CoV-2 폐렴으로 입원한 환자를 치료하기 위한 Tocilizumab (Actemra)의 3상 임상 시험에 대한 FDA의 승인을 발표했다. 그러나, 바이러스의 감염이 해결되더라도 환자의 조직 손상은 완전히 회복되지 않을 뿐만 아니라, 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome, ARDS) 또는 패혈증(sepsis)과 같은 더 심각한 질병이 발생할 수 있고, 심각한 경우 사망에 이를 수 있다.

현재 세계 보건 기구(World Health Organization, WHO)는 COVID-19 환자의 치료에 코르티코스테로이드(corticosteroid)의 사용을 권장하지 않는데, 이는 코르티코스테로이드가 SARS-CoV-2-관련 급성 호흡기 감염을 악화시킬 수 있기 때문이다. SARS-CoV-2는 다양한 급성 합병증 및 사망을 유발할 수 있기 때문에, 급격한 호흡-관련 염증 반응을 신속하게 해결하기 위한 새로운 전략이 시급한 실정이다.

대한민국 등록특허공보 제10-1421343호

본 발명은 상기 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 표면에 DNase-I이 결합된 멜라닌 나노입자가 뛰어난 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 치료 효과를 발휘하는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 생체고분는 멜라닌 (melanin), 키토산 (chitosan), 알지네이트 (alginate), 헤파린 (heparin), 셀룰로오스 (cellulose), 젤라틴 (gelatin), 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol), 폴리비닐피로리돈 (polyvinylpyrrolidione), 콜라겐 (collagen), 젤라틴 (gelatin), 폴리카포로락톤 (polycaprolactone), 폴리락틱코글라이코라이드 (Poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리락타이드 (polylactide), 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 생체고분자 나노입자는 표면이 폴리에틸렌글라이콜 (polyethylene glycol)로 코팅된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자는 하기 특징 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:

(a) 상기 나노입자의 평균 직경은 100 내지 300 nm임;

(b) 상기 나노입자의 표면 전하는 -20 mV 내지 -0.1 mV임;

(c) 상기 나노입자의 다분산도는 0.02 내지 0.15임; 또는

(d) 상기 나노입자는 구형임.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 생체고분자 나노입자에 대한 DNase-I 단백질의 결합 비율은 10 내지 70 중량% 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 SARS-CoV-2 바이러스 감염증은 코로나바이러스감염증-19, 패혈증, 급성 호흡기 증후군, 폐렴, 사이토카인 폭풍 (cytokine storm), 사이토카인 방출 증후군, 전신 염증반응 증후군, 및 다발성 장기부전으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 정상인과 비교하여 혈중 세포외 DNA (extracellular DNA) 수준 및 시트룰린화 히스톤 H3 (citrullinated histone H3) 수준으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 증가한 개체의 치료를 위한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 정상인과 비교하여 DNase-I의 활성 또는 수준이 감소한 개체의 치료를 위한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 혈중 DNase-I의 활성 또는 수준을 증가시킬 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 호중구 증식, 골수세포형 과산화효소의 활성, 호중구 엘라스테이즈의 활성, 호중구의 세포외 트랩 형성 (NETosis), 및 호중구 NF-κB의 활성으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 억제할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 염증성 사이토카인의 생성을 억제할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 염증성 사이토카인은 IL-1β, IL-6, IL-8, CCL2, IFN-γ, 및 TNF-α으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스 감염증의 치료용 약제 제조를 위한 상기 DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자의 SARS-CoV-2 바이러스 감염증의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다. 뿐만 아니라, 본 발명은 상기 의약외품 조성물을 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 개선용 의약외품을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자의 제조방법을 제공한다:

(S1) 생체고분자 용액에 알칼리 용액을 첨가하여 나노입자를 제조하는 단계; 및

(S2) 상기 (S1) 단계에서 수득한 나노입자를 DNase-I를 포함하는 완충액에 첨가하는 단계.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 (S2) 단계의 DNase-I를 포함하는 완충액은 폴리에틸렌글라이콜을 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 (S2) 단계에서 상기 나노입자 및 DNase-I은 1 : 0.2 내지 2의 중량비 (나노입자 : DNase-I)로 혼합될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

도 1은 경증 또는 중증 COVID-19 환자의 폐 CT 촬영 결과를 나타낸다.
도 2는 DNase-I pMNS를 제조하기 위한 one-pot 공정을 나타낸 그림이다.
도 3은 bMNS, pMNS, 및 DNase-I pMNS의 입자 크기 분포를 나타낸 그래프이다 (bMNS, 표면이 코팅되지 않은 (bare) 멜라닌-유사 나노입자; pMNS, PEG-코팅된 멜라닌-유사 나노입자; DNase-I pMNS, 표면이 DNase-I으로 코팅된 pMNS; 이하 동일).
도 4는 bMNS, pMNS, 및 DNase-I pMNS의 제타 전위 (zeta potential)를 그래프이다.
도 5는 bMNS, pMNS, 및 DNase-I pMNS의 SEM 이미지이다. 스케일 바: 500 nm.
도 6은 유리 DNase-I, bMNS, pMNS, 또는 다양한 농도의 DNase-I pMNS를 처리한 후 DNA의 이동 프로파일을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7a는 10% FBS를 함유한 PBS에서 지속형 (long-acting) DNase-I pMNS (1 μg)을 인큐베이션한 후 시간에 따른 DNA 분해 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7b는 단순 PBS에서 지속형 DNase-I pMNS (1 μg)을 인큐베이션한 후 시간에 따른 DNA 분해 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 중증 COVID-19 환자의 혈장에 pMNS, 유리 DNase-I, 또는 DNase-I pMNS를 처리한 후 eDNA 수준 및 DNase-I 활성의 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 중증 COVID-19 환자의 혈장에 pMNS, 유리 DNase-I, 또는 DNase-I pMNS를 처리한 후 중증 COVID-19 환자로부터 분리한 호중구의 NET 수준, MPO 활성, 및 NE 수준의 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 중증 COVID-19 환자의 혈장에 pMNS, 유리 DNase-I, 또는 DNase-I pMNS를 처리한 후, 중증 COVID-19 환자의 PBMC에서의 NF-κB 활성 변화; 및 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, IFN-γ, 및 TNF-α의 수준 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 11은 CLP 마우스에 PBS, PEG-Nano, 유리 DNase-I, 또는 DNase-I pMNS를 처리한 후 시간에 따른 생존율 (Kaplan-Meier 커브)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 마우스에 CLP 수술 후 3 시간이 경과했을 때 대조군 및 DNase-I 또는 DNase-I pMNS 투여군의 폐조직 변화를 확인한 결과를 나타낸다. 스케일 바: 100 μm.
도 13은 CLP 수술 후 PBS, pMNS, 유리 DNase-I, 또는 DNase-I pMNS의 투여에 따른 마우스 복강 내 호중구, NET, eDNA, DNase 활성, NE 활성, 및 MPO 활성 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 14는 CLP 수술 후 PBS, pMNS, 유리 DNase-I, 또는 DNase-I pMNS의 투여에 따른 마우스의 패혈증 마커 (ALT, AST, BUN, 크레아틴, LDH, 및 CRP)의 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 CLP 수술 후 PBS, pMNS, 유리 DNase-I, 또는 DNase-I pMNS의 투여에 따른 마우스의 절대 호중구 수, 절대 백혈구 수 및 총 백혈구 수를 측정한 결과 나타낸다.
도 16은 마우스에서 CLP 수술 후 DNase-I pMNS의 투여 여부에 따른 폐조직의 염증-관련 유전자들의 mRNA 분석 결과를 히트맵으로 나타낸 것이다.
도 17은 CLP 수술 후 PBS, pMNS, 유리 DNase-I, 또는 DNase-I pMNS의 투여에 따른 마우스의 혈관 장벽 완정성 (integrity)의 회복 정도를 비교한 결과를 나타낸다.
도 18은 CLP 마우스에 DNase-I pMNS를 다양한 농도로 처리한 후 시간에 따른 생존율 (Kaplan-Meier 커브)을 확인한 결과를 나타낸다.

본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자가 뛰어난 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 치료 효과를 발휘하는 것을 확인하여 완성된 것이다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 COVID-19 환자의 혈액 시료를 분석하고 CT 촬영을 진행한 결과 중증 COVID-19 환자에서 중증 패혈증이 나타나고 호중구 수가 유의하게 증가한 것을 확인하였다 (실시예 1).

본 발명의 다른 실시예에서는 정상인, 경증 COVID-19 환자, 및 중증 COVID-19 환자의 혈액 시료를 분석한 결과 정상인에 비해 COVID-19 환자에서 NETosis 마커인 eDNA (Extracellular DNA) 및 시트룰린화 히스톤 H3 (Citrullinated histone H3)의 수준이 증가한 것을 확인하였으며, 특히 중증 COVID-19 환자는 DNase-I 수준이 현저하게 감소된 것을 확인하였다 (실시예 2).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 생체고분자인 멜라닌으로 이루어진 나노입자를 제조하고, 이를 폴리에틸렌글라이콜로 코팅한 후 DNase-I을 결합시켜, 표면에 DNase-I이 결합된 생체고분자 나노입자 (DNase pMNS)를 제조하였으며, 상기 나노입자의 크기 및 표면 전하 등을 확인하였다 (실시예 3).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 중증 COVID-19 환자의 혈장에 DNase pMNS를 처리했을 때 혈장 내 eDNA 수준은 감소하고 DNase-I 활성은 증가한 것을 확인하였으며, NF-κB의 활성 및 다양한 염증성 사이토카인의 수준이 감소한 것을 확인하였다 (실시예 4).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 맹장 결찰-천공 수술을 이용해 COVID-19 유사 동물 모델을 제작하고 DNase pMNS의 in vivo 효과를 확인한 결과, DNase pMNS를 투여 받은 마우스는 대조군은 물론 유리 DNase-I을 투여 받은 마우스에 비해 생존율 및 DNase-I 활성이 증가하고, 조직 손상이 감소하였으며, 다양한 염증성 사이토카인의 수준이 감소한 것을 확인하였다 (실시예 5).

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명의 목적은 DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 있어서, “SARS-CoV-2 바이러스”는 2019년 12월에 발생한 신종 코로나바이러스 (coronavirus)인 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)를 지칭한다. 이는 전도 기능 단일가닥 RNA 바이러스 (positive-sense single-stranded RNA virus)이며 유전체 서열은 대략 3만 개의 염기로 이루어져있다. 상기 바이러스는 인간에 높은 감염력을 보이며 전염성이 높고 변이율 또한 상당한 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, “DNase-I (deoxyribonuclease-I)”는 DNA 분자 사슬 내부의 인산디에스테르 결합 (phosphodiester bond)을 가수분해하는 엔도뉴클레아제 (endonuclease)를 지칭한다. 특히, 본 발명에 따른 약학적 조성물을 제조하기 위한 DNase-I으로 Roche 사의 DNase-I을 사용하였으나, 이는 DNase-I 효소의 대표예로 사용된 것일 뿐 이에 한정되는 것은 아니며, 기타 상용화된 DNase-I은 물론, 천연 (native) DNase-I, 유전공학적 방법으로 제조된 재조합 DNA로부터 발현시킨 DNase-I, 또는 화학 합성 DNase-I 등이 본 발명에 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 DNase-I 효소는 isoform 1 또는 isoform 2일 수 있다. DNase-I에 관한 구체적인 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 확인할 수 있다(Gene ID: 1773).

상술한 바와 같이 본 발명에 따른 DNase-I는 DNA 분자 사슬을 분해하는 활성이 있는 단백질이라면 제한이 없으나, 일예로 상기 DNase-I은 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있고, 나아가 상기 아미노산 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 즉, 본 발명의 아미노산 서열은 이를 구성하는 펩티드 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 펩티드 분자의 일부 아미노산 서열이 결실 (deletion), 치환 (substitution) 또는 삽입 (insertion)에 의해 변형되었지만, 펩티드 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 DNase-I 단백질은 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 아미노산 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 그러나 상술한 바와 같이, 이는 DNase-I의 대표적 예시일 뿐이며, 상기 서열에 의해 DNase-I의 종류가 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 상기 DNase-I 단백질은 본 발명에 따른 생체고분자 나노입자의 표면에 결합, 포집, 연결, 또는 고정화 (immobilized) 되어 있는 것을 특징으로 한다. 즉 본 발명에 따른 DNase-I 나노입자 (DNase-I pMNS)는 DNase-I가 생체고분자 나노입자에 담지 내지 결합되어 있는 서방형의 DNase-I으로서 유리 DNase-I에 비해 혈중 반감기 (half-life)가 더 길고 안정성이 높은 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, “생체고분자 나노입자 (biopolymer nanoparticles)”는 생체고분자 기반의 나노입자를 의미한다. “생체고분자 (biopolymer)”란 살아있는 유기체의 세포에 의해 생성될 수 있는 고분자 혹은 이의 변이체 내지 유도체를 의미한다. 생체고분자는 생체적합성, 생분해성, 낮은 면역원성 등을 특징으로 하므로 임상 적용을 위한 나노입자에 적합하다. 본 발명에 있어서 생체고분자는 멜라닌 (melanin), 키토산 (chitosan), 알지네이트 (alginate), 헤파린 (heparin), 셀룰로오스 (cellulose), 젤라틴 (gelatin), 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol), 폴리비닐피로리돈 (polyvinylpyrrolidione), 콜라겐 (collagen), 젤라틴 (gelatin), 폴리카포로락톤 (polycaprolactone), 폴리락틱코글라이코라이드 (Poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리락타이드 (polylactide), 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에 있어서 생체고분자는 멜라닌 또는 도파민이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 생체고분자 나노입자는 도파민에 염기를 중합반응시켜 얻은 것이다.

본 발명에 있어서 상기 생체고분자 나노입자는 표면이 폴리에틸렌글라이콜 (polyethylene glycol)로 코팅된 것일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 생체고분자 나노입자는 페길화 (PEGylation)된 것을 특징으로 하며, 이는 나노입자의 생체 내 전달 효율을 증가시키는 역할을 한다.

본 발명에 있어서 상기 생체고분자 나노입자의 평균 직경은 100 내지 300 nm, 100 내지 250 nm, 100 내지 200 nm, 100 내지 180 nm, 120 내지 300 nm, 140 내지 300 nm, 160 내지 300 nm, 120 내지 250 nm, 140 내지 220 nm, 또는 150 내지 200 nm 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 생체고분자 나노입자의 구체적인 형태는 제한이 없으나 바람직하게는 구형 (sphere)일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 생체고분자 나노입자의 다분산도 (polydispersity index, PDI)는 0.01 내지 0.15, 0.01 내지 0.12, 0.02 내지 0.15, 0.04 내지 0.15, 0.06 내지 0.15, 0.08 내지 0.15, 0.08 내지 0.12, 또는 0.08 내지 0.1일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서 상기 생체고분자 나노입자의 표면 전하는 -20 mV 내지 -0.1 mV, -18 mV 내지 -0.1 mV, -16 mV 내지 -0.1 mV, -14 mV 내지 -0.1 mV, -12 mV 내지 -0.1 mV, -20 mV 내지 -0.2 mV, -20 mV 내지 -1 mV, -20 mV 내지 -2 mV, -20 mV 내지 -4 mV, -20 mV 내지 -6 mV, -20 mV 내지 -8 mV, -15 mV 내지 -8 mV, 또는 -12 mV 내지 -9 mV 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서 상기 생체고분자 나노입자에 대한 DNase-I 단백질의 결합 비율은 10 내지 70 중량%, 20 내지 70 중량%, 30 내지 70 중량%, 40 내지 70 중량%, 50 내지 70 중량%, 60 내지 70 중량%, 10 내지 60 중량%, 20 내지 50 중량%, 30 내지 50 중량%, 35 내지 50 중량%, 또는 40 내지 50 중량% 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 DNase-I 나노입자는 SARS-CoV-2 바이러스 감염증에 대해 예방 및/또는 치료 효과를 갖는다. 상기 “SARS-CoV-2 바이러스 감염증”은 SARS-CoV-2 바이러스의 감염으로 발생하는 질환을 의미한다. 상기 SARS-CoV-2 바이러스 감염증의 구체적인 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 중증 염증질환일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 SARS-CoV-2 바이러스 감염증은 코로나바이러스감염증-19 (COVID-19), 패혈증, 급성 호흡기 증후군, 폐렴, 사이토카인 폭풍 (cytokine storm), 사이토카인 방출 증후군 (cytokine release syndrome), 전신 염증반응 증후군, 및 다발성 장기부전으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명자들은 중증 COVID-19 환자의 혈액을 분석한 결과 정상인 및 경증 COVID-19 환자와 비교하여 DNase-I 수준은 감소하고, NETosis 마커 (혈중 세포외 DNA, Cit-His H3)는 증가한 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 DNase-I 나노입자는 특히 정상인과 비교하여 혈중 세포외 DNA (extracellular DNA) 수준 및/또는 시트룰린화 히스톤 H3 (citrullinated histone H3) 수준이 증가한 개체에서 뛰어난 치료 효과를 보일 수 있으며, 정상인과 비교하여 DNase-I의 활성 또는 수준이 감소한 개체에서 뛰어난 치료 효과를 보일 수 있다.

본 발명에 있어서 “호중구 세포외 트랩 (Neutrophil Extracellular Trap, NET)”은 세포 밖에 존재하는 큰 망상 구조로서 탈응축된 크로마틴을 중심으로 세포질, 과립 단백질 등으로 구성된 것을 의미한다. NET은 바이러스를 포함한 병원성 미생물을 포획하고 이들의 확산을 방지하며, 병원성 요인을 비활성화함으로써 항-감염 효과를 발휘한다. 그러나 과도한 면역 반응에 의한 NET의 증가는 면역 관련 질환 발생에 기여할 수 있다.

상기 NET은 NETosis라고 하는 세포사멸 과정을 통해 생성된다. 염증, 감염, 저산소증 등으로 인해 호중구에서 NETosis가 진행되면 핵의 탈분엽화 및 핵막 해체가 일어나고, 세포의 탈극화 및 크로마틴 탈응축 과정을 거쳐 NET이 분비된다. 과도한 NETosis 및 이에 따른 NET 증가는 과도한 면역 반응 및 조직 손상을 유발할 수 있다. NETosis의 증가는 골수세포형 과산화효소 (Myeloperoxidase, MPO) 활성 증가, 호중구 엘라스타아제 (Neutrophil elastase, NE) 활성 증가, 시트룰린화 히스톤 H3 단백질의 수준 증가 등을 특징으로 한다. 상기 “시트룰린화 히스톤 H3 (citrullinated histone H3, Cit-His H3)”은 시트룰린화된 히스톤 단백질 H3 패밀리(histone H3 family)를 지칭하며, 상기 단백질은 호중구의 NET 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서 용어 “세포외 DNA (extracellular DNA, eDNA)”는 용어 “cell-free DNA”와 상호교환적으로 사용되며, 이는 세포 안에 존재하지 않고 혈류를 자유롭게 순환하는 다양한 형태의 DNA 조각을 의미한다. eDNA의 종류에는 cell-free fetal DNA, cell-free tumour DNA, 및 cell-free circulating mitochondrial DNA 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. eDNA는 체액 내에 단독으로 존재할 수 있으며, 세포외 소포체 (exosome)에 존재할 수도 있다.

또한, 본 발명에 있어서 eDNA의 길이 (base pairs)에는 제한이 없으나, 약 50 내지 60bp, 60 내지 70bp, 70 내지 80bp, 80 내지 90bp, 90 내지 100 bp, 100 내지 110bp, 110 내지 120bp, 120 내지 130bp, 130 내지 140bp, 140 내지 150bp, 150 내지 160bp, 160 내지 170bp, 170 내지 180bp, 180 내지 190bp, 190 내지 200bp, 200 내지 210 bp, 210 내지 220bp, 220 내지 230bp, 230 내지 240bp, 240 내지 250bp일 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 eDNA는 단일-가닥 DNA 또는 이중-가닥 DNA일 수 있다. 세포외 DNA는 상처 또는 조직 네크로시스 (necrosis) 등에 의해 생성되며, NETosis에 의해서도 방출될 수 있는데, 세포외 DNA의 지나친 증가는 염증 반응을 유도할 수 있다.

본 발명에 따른 DNase-I 나노입자는 호중구 증식, 골수세포형 과산화효소의 활성, 호중구 엘라스테이즈의 활성, 호중구의 세포외 트랩 형성 (NETosis), 및 호중구 NF-κB의 활성으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 억제하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 DNase-I 나노입자는 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 특징으로하며, 상기 염증성 사이토카인의 구체적인 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 IL-1β, IL-6, IL-8, CCL2, IFN-γ, 및 TNF-α으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 조성물 내의 상기 DNase-I 나노입자 (DNase-I pMNS)의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다. 달리 표현하면, 본 발명의 조성물 내의 상기 DNase-I 나노입자 (DNase-I pMNS)의 함량은 1 내지 200 유닛 (unit), 20 내지 200 유닛, 40 내지 200 유닛, 60 내지 200 유닛, 80 내지 200 유닛, 20 내지 180 유닛, 40 내지 160 유닛, 60 내지 140 유닛, 80 내지 120, 또는 90 내지 110 유닛일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 유닛 (unit)은 효소의 활성이 나타나는 효소의 농도를 의미하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

아울러, 본 발명은 DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 의약외품 조성물을 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 개선용 의약외품을 제공한다.

본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과에 영향을 미치지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 의약외품 조성물에 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 대표적인 예로는, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 글리세린, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 주사가능한 에스테르, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우리지 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물이 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 액제, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 의약외품은 치약, 양치액, 및 마우스 스프레이를 포함하는 구강관리 제품, 연고제, 마스크, 습포제, 첩부제 및 경피흡수제 등을 포함할 수 있다. 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술 분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 제조방법은 상기 (S1) 단계 및/또는 (S2) 단계 후에 나노입자를 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 정제는 바람직하게는 원심분리를 통해 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 원심분리는 10,000 내지 20,000 rpm, 12,000 내지 20,000 rpm, 14,000 내지 20,000 rpm, 16,000 내지 20,000 rpm, 17,000 내지 20,000 rpm, 12,000 내지 19,000 rpm, 14,000 내지 18,000 rpm, 또는 16,000 내지 18,000 rpm에서 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 알칼리 용액의 구체적인 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 NaOH 용액일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 완충액의 구체적인 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 Tris 버퍼일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (S2) 단계에서 상기 나노입자 및 DNase-I은 1 : 0.2 내지 2의 중량비, 1 : 0.4 내지 2의 중량비, 1 : 0.6 내지 2의 중량비, 1 : 0.8 내지 2의 중량비, 1 : 1 내지 2의 중량비, 1 : 1.2 내지 2의 중량비, 1 : 1.5 내지 2의 중량비, 1 : 0.2 내지 1.8의 중량비, 1 : 0.4 내지 1.6의 중량비, 1 : 0.6 내지 1.4의 중량비, 1 : 0.8 내지 1.2의 중량비, 1 : 0.9 내지 1.1의 중량비 (나노입자 : DNase-I)로 혼합되는 것일 수 있다.

또한, 상기 (S2) 단계의 DNase-I를 포함하는 완충액은 폴리에틸렌글라이콜을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 나노입자 및 폴리에틸렌글라이콜은 1 : 0.1 내지 1.5의 중량비, 1 : 0.4 내지 1.5의 중량비, 1 : 0.6 내지 1.5의 중량비, 1 : 0.8 내지 1.5의 중량비, 1 : 0.8 내지 1.3의 중량비, 1 : 0.8 내지 1.2의 중량비, 또는 1 : 0.9 내지 1.1의 중량비 (나노입자 : 폴리에틸렌글라이콜)로 혼합되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 상기 (S2) 단계의 나노입자, DNase-I, 및/또는 폴리에틸렌글라이콜의 혼합용액을 1 내지 6시간, 1 내지 5시간, 1 내지 4시간, 1 내지 3시간, 2 내지 5시간, 또는 2.5 내지 4.5시간 동안 교반하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한 상기 교반은 2 내지 10 ℃, 2 내지 6 ℃, 2 내지 5 ℃, 3 내지 6 ℃, 또는 3 내지 5 ℃에서 이루어질 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실험 재료 및 방법]

실험재료

도파민 염산염 (Dopamine hydrochloride) 및 폴리(에틸렌글리콜) (poly(ethylene glycol); PEG, 4개의 아암-아민 말단 (arm-amine termini), HCL 염)은 각각 Sigma사 (USA, PA) 및 JenKem (USA, TX)에서 구입했다. NaOH (1 N) 용액 및 Tris 버퍼 (10 mM, pH 8.5)는 각각 대정 (한국, 수원) 및 바이오세상 (한국, 서울)에서 구입했다. 재조합 DNase-I은 Roche (스위스, 바젤)에서 구입했다. Pierce BCA 단백질 분석 키트는 Thermo Scientific (USA, MA)에서 구입했다. Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) 및 소태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)은 각각 Welgene (한국, 경산) 및 Gibco (USA, CA)에서 구입했다.

혈장 시료

영남대학교 의료원에서, 대한민국 대구 소재의 보건소에서 SARS-CoV-2 감염을 진단받은 환자로부터 전혈 시료를 확보했다. COVID-19 패혈증 환자는 패혈증 컨센서스 컨퍼런스 위원회 (Sepsis Consensus Conference Committee)에서 정해진 기준 (JAMA 2016, 315, 801)에 따라 정의하였다. 인체 연구 프로토콜은 대한민국 대구 소재의 영남대학교 병원 기관심의의원회의 승인을 받았다 (YUH 2020-03-057, 2020-05-031-001).

COVID19 환자의 호중구 수 측정

전체 혈구 수 (complete blood counts)는 환자가 병원에 입원한 후 24시간 이내에 정맥혈 시료에서 분석했다. 호중구 수는 Sysmex XE-2100 자동화 혈액학 (hematology) 시스템 (TOA Medical Electronics; 일본, 고베)을 이용해 측정했다.

효소면역측정법 (NET enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)

NET (호중구 세포외 트랩; Neutrophil Extracellular Trap)은 phorbol-myristate acetate (PMA; 25 nM) (Sigma-Aldrich; USA, MO) 또는 대조군 배지 (글루타민, 페니실린, 및 스트렙토마이신을 함유한 RPMI1640)으로 세포를 자극하는 방법을 이용해 새롭게 분리된 호중구 (1×10⁵개 세포)로부터 생성된 것으로서, [Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2017, 14]를 참고하여 형광 측정 기술을 이용해 분석했다. NET 생성은 임의 형광 단위 (arbitrary fluorescent units, AFUs)로 측정했다.

MPO ELISA 및 Cit-His H3 ELISA

SARS-CoV-2-감염된 환자 및 마우스의 말초혈액단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)의 탈과립에 따른 과립기질단백질 (granule matrix proteins)의 방출량을 측정하기 위해 혈장 시료를 분석했다. 인간 시료는 MPO ELISA 키트 (Invitrogen; USA)를 사용했으며, 마우스 시료는 mouse myeloperoxidase ELISA 키트 (MyBioSource; USA)를 이용했다.

세포 배양 배지 또는 SARS-CoV-2 환자 혈청 내의 Cit-His H3 농도는 인간 시트룰린화 히스톤 H3 ELISA 키트 (MyBioSource)를 이용해 측정했다.

혈장 세포외 DNA (extracellular DNA; eDNA)의 정량화

SARS-CoV-2-감염된 환자 또는 마우스 혈장의 eDNA (즉, cell-free DNA)를 측정하기 위해, 혈장 시료를 16,800×g에서 10분 동안 원심분리하였으며, Qiagen QIAamp DNA Mini Blood Mini Kit (Qiagen; USA, CA)를 제조사의 설명에 따라 사용하여 DNA를 추출했다. 정제를 마친 eDNA는 NanoDrop 분광광도계를 이용해 정량화했다.

DNase-I 활성 측정을 위한 ELISA

혈장 시료를 1:50으로 희석한 후 이중-가닥 DNA (1 μg/ml)이 첨가된 (spiked) 소화 버퍼 (digestion buffer)를 이용해 분석했다. 시료는 PicoGreen (Invitrogen)을 제조사의 설명에 따라 사용하여 염색하였다. 37 ℃에서 5시간 동안 인큐베이션한 후, PicoGreen 염색의 감소 정도 (형광 방출 (fluorescence emission), Em)를 플루오로미터 (fluorometer)를 이용해 측정했다.

호중구 분리

PBMC의 밀도구배분리 (density gradient isolation)를 위해 [Blood 2014, 123, 239]를 참고하여 Percoll (pH 8.5-9.5; Sigma-Aldrich, UK)을 사용했다. PBMC (트리판블루 배제법에 따라 95 %의 순도 및 97 %의 생존율을 가짐)를 RPMI1640 배지 (Sigma-Aldrich)에 현탁시켰다. 호중구의 불연속 밀도구배원심분리를 위해, 1-단계 폴리모프 (polymorphs) (Axis-Shield; 노르웨이, 오슬로)를 사용했다. 순도를 증가시키기 위해, CD45 항체-결합 자석 비즈 및 magnetic-activated cell sorting (MACS)를 이용해 호중구를 정제했다. 트리판 블루 염색 배제법 결과 호중구의 일반적인 생존율이 95 % 보다 높은 것을 확인했다. 사이토카인 생성에 대한 DNase-I의 효과를 확인하기 위해, COVID-19 환자로부터 호중구를 분리한 후 DNase-I MNS를 처리했다. DNase-I MNS를 또한 CLP-작동 패혈증 마우스에 투여했다. 상층액은 ELISA를 이용한 사이토카인 분석에 사용했으며, 세포 용해물 (cell lysates)는 NF-κb 활성 측정에 사용했다.

NF-κb 활성 측정

세포로부터 핵을 추출한 후, [J Mol Med 2014, 92, 77]에 따라 TransAM 분석을 수행했다. 각 NF-κb 서브유닛의 활성은 NF-κb 패밀리 전사인자 분석 키트 (Active Motif; 미국, CA)를 사용하여 ELISA로 측정했다. 간략히 설명하면, 핵 추출물 (2 μg)을 NF-κb 콘센서스 올리고뉴클레오티드-코딩된 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 플레이트를 NF-κb 1차 항체와 인큐베이션한 후, HRP-결합된 2차 항체와 인큐베이션하여 항체 결합을 관측했다. 분석을 위해 Tecan Spark 마이크로플레이트 리더기 (Tecan; 오스트리아)를 사용해 450 nm에서 광학 밀도 (optical density, OD)를 측정했다.

사이토카인 ELISA

상층액 중의 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, IFN-γ, 및 TNF-α의 수준은 PBMC를 pMNSs, Free-DNase-I, 및 pMNSs-DNase-I (100 유닛)로 처리한 후 인간 ELISA 키트 (R&D Systems; 미국, MN)를 제조사의 설명에 따라 사용하여 측정했다.

동물실험

동물실험은 한국생명공학 연구원 (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) (IACUC no. 1305021) 및 성균관대학교 의과대학 (IACUC No. SKKU IACUC2020-06-29-2)의 기관 동물 관리 및 이용 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행했다. 6 내지 7주량의 C57BL/6 수컷 마우스 (18-20 g)를 Orient Bio (한국, 성남)에서 구입했다. 마우스는 12일의 적응기간 후 사용했다. 케이지당 5마리의 마우스를 20-25 ℃의 제어된 온도 및 40-45%의 습도에서 12:12 h 명/암 주기로 관리했다. 마우스에게 일반적인 설치류 펠렛 (pellet) 식이를 공급하고, 물을 임의로 (ad libitum) 공급했다.

맹장 결찰 및 천공

맹장 결찰 및 천공 (cecal ligation and puncture, CLP)을 수행한 마우스 모델을 [Nat Protoc 2009, 4, 31]을 참고하여 제작했다. 간략히 서술하면, 맹장 및 근접한 장 (intestine)을 노출시키기 위해 2 cm의 중앙선 절개를 만들었다. 이어서 맹장 끝에서 5.0 mm 떨어진 부위를 3.0-실크 봉합사를 사용해 단단히 결찰시키고, 22-게이지 바늘로 천공을 낸 후 부드럽게 짜내서 천공부위로부터 대변을 밀어냈다. 이어서 맹장을 복강으로 되돌리고 4.0-실크를 사용해 개복 부위를 봉합했다. 모의 수술 (sham operation)의 경우 맹장을 외과적으로 노출시킨 뒤 결찰 또는 천공을 일으키지 않고 복강에 다시 넣었다.

In vivo 호중구 이동 분석 (migration assay)

호중구의 이동 정도를 평가하기 위해, 마우스에 CLP 수술을 수행한 뒤 6 시간이 경과했을 때 CLP-수행된 마우스에 pMNS, free DNase-I, 및 pMNS-DNase-I (100 유닛)을 처리하였다. 그 후 마우스를 안락사시키고 복강을 5 mL의 생리식염수로 세척했다. 호중구 수는 자동 혈액학 분석기 (Mindray, BC-5000 Vet)을 사용해 측정했다. 결과는 복강당 호중구×10⁶으로 나타냈다.

RNA 분석

RNeasy mini-kit (Qiagen Venlo, 네덜란드)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 폐조직으로부터 RNA를 추출했다. RNA-seq 라이브러리는 TruSeq RNA Sample Prep kit v2 (Illumina)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 생성했다. RNA-seq 라이브러리는 Illumina Hi-seq 3000/4000 SBS kit v3 (MACROGEN Inc.) 상에서 짝-말단 시퀀싱 (pair-end sequencing)했다. 모든 RNA-seq 데이터는 Affymetrix Human Gene 2.0 ST arrays (902136)에 대해 Tophat 패키지를 사용해 매핑했다. 남은 mRNA는 qPCR 분석에 사용했다. 배수-변화 (fold-change)는 R package limma를 사용해 측정했으며, P-값은 Benjamini-Hochberg (BH)로 조정했다. 분석 결과는 NCBI의 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스에서 확인할 수 있다 (수탁번호: GSE101126).

Hematoxylin & eosin (H&E) 염색법 및 조직병리학 분석

수컷 C57BL/6 마우스에 CLP를 수행한 후 12 시간 또는 24 시간이 경과했을 때 pMNS, free DNase-I, 및 pMNS-DNase-I (100 유닛)을 정맥내 투여했다. CLP 수술 후 72 시간이 경과했을 때 마우스를 안락사시켰다. 폐조직을 마우스로부터 분리하고 형질변화를 분석했다. 통상적인 프로토콜에 따라 H&E 염색법을 수행했다.

패혈증 마우스의 혈장 내 사이토카인 수준 측정

생화학 키트 (MyBioSource)를 이용해 마우스 혈청 내의 AST, ALT, BUN, 크레아틴 (creatinine), 및 LDH의 수준을 측정했다. ELISA 플레이트 리더기 (Tecan; 오스트리아)를 이용하여 정확한 수치를 확인했다.

통계 분석

모든 in vitro 및 in vivo 데이터는 Graphpad prism 7 소프트웨어를 이용해 two-tailed unpaired t-test로 분석했으며, 표본 크기는 n>=3이었으며, P<0.05 일 때 통계학적으로 유의한 것으로 보았다. 모든 데이터 정규화 과정은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행했다.

[실시예]

실시예 1. 중증 COVID-19 환자의 호중구 수 증가 및 림프구 수 감소 확인

전산화단층촬영 (computed tomography, CT)을 진행한 후, COVID-19 환자의 입원 당시 혈액 시료를 분석했다. 경증 또는 중증 COVID-19 환자의 CT 촬영 결과는 도 1에 나타냈으며, COVID-19 환자의 특성은 하기 표 1에 정리했다.

	전체 환자 (n=60)	경증 환자 (n=40)	중증 환자 (n=20)	P-값
특성
연령 (y)	33.7 ± 16.4	55.4 ± 17.1	72.2 ± 13.1	0.014
ARDS	11 (18.3)	0 (0)	11 (55)	<0.001
패혈증	13 (21.7)	0 (0)	13 (65)	<0.001
퇴원	40	40 (100)	0 (0)	<0.001
사망	16	0 (0)	16 (80%)	<0.001
전체 혈액 수
백혈구 수, ×10⁹/L [정상 범위 4-10]	6.5 ± 3.4	5.9 ± 3.6	9.1 ± 2.6	0.005
호중구 수, ×10⁹/L [정상 범위 3-7]	4.6 ± 3.4	4.1 ± 3.2	7.7 ± 3.3	<0.001
림프구 수, ×10⁹/L [정상 범위 1.5-4]	1.4 ± 0.7	1.5 ± 0.7	0.8 ± 0.3	<0.001
헤모글로빈, g/Dl [정상 범위 12-17]	13.0 ± 1.6	13.5 ± 1.7	13.0 ± 1.6	0.253
혈소판, ×10⁹/L[정상 범위 140-400]	237.3 ± 104.9	245.0 ± 107.9	186.7 ± 64.9	0.061
데이터는 평균± SD (범위) 또는 수 (백분율)로 나타냄. 경증 환자: 비-ICU, 증상 없음; 중증 환자: ICU, 산소호흡기, 산소 치료, ARDS, 및 패혈증

CT 촬영 결과, 심각한 임상 증상을 보이는 환자는 패혈증의 중증도가 증가하였음을 의미하는 중증 폐조직 손상을 가진 것으로 나타났다. ARDS (급성 호흡곤란 증후군; Acute respiratory distress syndrome) 및 패혈증과 같은 중증의 임상 증상은 대부분 고령의 환자 (평균 연령 72.2±13.1세)에서 나타났는데, 이들은 경증인 환자와 비교하여 호중구 수는 증가하고 림프구 수는 감소한 것으로 나타났다 (표 1).

실시예 2. 중증 COVID-19 환자의 NETosis 마커 수준의 증가 확인

20명의 건강한 대조군 환자 (정상 그룹), 및 60명의 COVID19 환자 (경증 및 중증 환자 포함)의 혈액 시료에서 세포외 DNA (extracellular DNA, eDNA), DNase-I, 및 시트룰린화 히스톤 H3 (citrullinated histone H3, Cit-His H3)의 수준을 측정하였으며, 결과는 하기 표 2에 나타냈다.

	정상인 (n=20)	경증 환자 (n=40)	중증 환자 (n=20)
NETosis
eDNA [mg/mL]	0.41 ± 0.12	0.85 ± 0.27	2.83 ± 0.37***
DNase-I [mg/mL]	2.11 ± 0.38	3.11 ± 1.07	0.97 ± 0.30***
Cit-His H3 [mg/mL]	0.05 ± 0.01	0.30 ± 0.32	17.74 ± 2.91***
데이터는 평균± SD (범위)로 나타냄. ^***P < 0.001. eDNA, 세포외 DNA; NE, 호중구 엘라스테이스 (Neutrophil Elastase); MPO, 골수세포형과산화효소 (Myeloperoxidase); Cit-His H3, 시트룰린화 히스톤 H3.

먼저, 정상 그룹의 혈청 eDNA 수준의 중앙값은 0.41 (0.29-0.53) μg/mL 이었다. 이와 비교하여, 40명의 경증 COVID-19 환자의 혈청 eDNA 수준은 0.85 (0.58-1.12 μg/mL)으로 증가하였으며, 20명의 중증 COVID-19 환자의 혈청 eDNA 수준은 2.83 (2.46-3.20) μg/mL로 더욱 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다. Cit-His H3 (시트룰린화 히스톤 H3) 수준의 경우 더욱 큰 차이를 보였다. 정상 그룹의 혈청 Cit-His H3 중앙값은 0.05 (0.04-0.06) μg/mL에 불과했으나 경증 COVID-19 환자에서 0.30 (0.02-0.62) μg/mL로 증가하였으며, 중증 COVID-19 환자의 경우 혈청 Cit-His H3 중앙값은 17.74 (14.83-20.65) μg/mL으로 매우 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 반면, DNase-I의 경우 다소 다른 결과가 나타났다. 정상 그룹에서 DNase-I 수준은 2.11 (1.73-2.49) μg/mL 였고, 경증 COVID-19 환자에서 3.11 (2.04-4.18) μg/mL로 다소 증가한 것으로 나타났으나, 중증 COVID-19 환자의 경우 혈중 DNase-I 수준이 0.97 (0.67-1.27) μg/mL로 현저하게 감소한 것으로 나타났다.

상기 결과는 COVID-19 환자, 특히 중증의 COVID-19 환자의 경우 NETosis 마커인 eDNA 및 Cit-His H3의 수준은 증가하고, DNase-I 수준은 감소한다는 것을 보여준다.

실시예 3. DNase-I pMNS의 제조 및 특성 확인

실시예 2에서 확인한 바와 같이, 중증 COVID-19 환자는 NETosis-관련 인자들은 증가하고 DNase-I의 수준은 감소하므로, 중증 COVID-19 환자에서 내인성 DNase-I의 손실을 보완할 필요성이 있다. 그러나, 개체에 DNase-I을 주입하더라도 혈액 내 DNase-I의 반감기가 매우 짧다. 이에, 본 발명자들은 멜라닌을 이용하여 체내 장시간 순환이 가능한 나노입자 (즉, 지속형 DNase-I (long-acting DNase-I))를 제작하고, 상기 멜라닌 나노입자에 폴리에틸렌글라이콜 (polyethylene glycol)을 코팅한 후 이에 DNase-I을 흡착시켜 혈중에서 장시간 유지 및 순환이 가능한 DNase-I 멜라닌 나노입자 (DNase-I pMNS)를 제조하였다.

3-1. DNase-I pMNS의 제조

코팅되지 않은 멜라닌-유사 나노스피어 (bare melanin-like nanospheres, bMNSs)는 [ACS Appl Mater Interfaces 2016, 8, 7739]를 참고하여 도파민 염산염으로 합성했다. 도파민 염산염 (10 mg)을 탈이온수 (deionized water, DW; 50 mL)에 용해시킨 후, NaOH 용액 (50 μL, 1 N)을 도파민 염산염 용액에 첨가했다. 반응물을 24시간 동안 교반하였으며, 반응이 진행됨에 따라 색이 점차 흑색으로 변하는 것을 확인하였다. 정제를 위해, 17,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 제조된 bMNS를 모으고, 탈이온수로 3회 세척했다. 이어서 DNase-I가 코팅된 멜라닌 나노입자를 제조하기 위해, [Science 2018, 361, eaao4227] 및 [Sci Transl Med 2016, 8, 361ra138]를 참고하여 one-pot 공정을 수행함으로써 bMNS 표면에 DNase-I를 코팅했다 (도 2). 수득한 bMNS (10 mg)을 DNase-I (2, 5, 10, 또는 20 mg) 및 폴리에틸렌글라이콜 (10 mg, 4 아암-아민 말단, HCL 염)을 함유한 Tris 버퍼 (5 mL, 10 mM, pH 8.5)에 재분산시키고, 4 ℃에서 3시간 동안 교반함으로써 DNase-I이 표면에 결합된, 폴리에틸렌글라이콜-코팅된 멜라닌 나노입자를 제조했다 (DNase-I pMNS). 제조된 DNase-I pMNS는 상술한 것과 동일한 방법으로 정제한 후 탈이온수로 수회 세척해다. 대조군으로 DNase-I이 표면에 결합되어 있지 않은, PEG-코팅된 MNS (pMNS)를 제조했는데, DNase-I pMNS와 동일한 방법으로 제조하되 DNase-I 첨가는 생략했다.

3-2. DNase-I pMNS의 특성 확인

동적 광산란법 (dynamic light scattering, DLS; Malvern Instruments, 미국, MA)을 이용해 본 발명에 따른 나노입자 (나노스피어)의 입자 크기 및 표면 전하를 측정했다. 하기 표 3 및 도 3에 나타낸 바와 같이, bMNS, pMNS, 및 DNase-I pMNS의 입자 크기 (직경)는 모두 170 nm로 유사했다. 표면 전하 측정 결과는 도 4에 나타냈다. bMNS의 표면 전하는 -12.4 mV로 측정되었으며, PEG를 코팅하여 pMNS를 제조했을 때 표면 전하가 -0.15 mV로 중화된 것으로 나타났다. 그러나, DNase-I pMNS의 경우 음전하를 가진 DNase-I이 코팅됨에 따라 표면 전하가 -10.9 mV인 것으로 나타났다.

구분	bMNS	pMNS	DNase-I pMNS
크기 (nm)	170	172	170
PDI	0.090	0.123	0.091

나노입자의 형태는 필드 방출 스캐닝 전자 현미경 (field emission scanning electron microscopy, FE-SEM) (JEM-7500F; 일본, 아키시마)으로 관측했다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따른 나노입자는 구형이며 상대적으로 단분산된 (monodipersed) 크기를 가진 것으로 나타났다.

다음으로, DNase-I pMNS의 효소 활성, 즉, DNA 분해능은 젤 전기영동으로 중합된 (polymerized) 연어 정자 DNA (Sigma-Aldrich; USA, PA)가 분해되는 정도를 측정하여 확인했다. 이를 위해, bMNS, pMNS, 또는 DNase-I Pmns를 1μg의 연어 정자 DNA와 37 ℃에서 10분 동안 인큐베이션 한 후, 전기영동하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 유리 DNase-I (free DNase-I, 1U)는 1 μg의 DNA를 완전히 분해한 반면, pMNS 및 bMNS는 표면에 DNase-I가 없으므로 DNA를 분해하지 못했다. 그러나, DNase-I이 표면에 코팅된 DNase-I pMNS는 1.0 μg 이상의 나노스피어 농도에서 DNA를 분해한 바, 나노입자의 DNA 분해 효과가 입자 표면에 코팅된 DNase-I에 기인한 것임을 보여주었다.

나아가, pMNS에 결합시킬 수 있는 DNase-I의 양을 확인하기 위해, 다양한 비율의 pMNS 및 DNase-I으로 나노입자를 제조했다. pMNS 상의 DNase-I의 결합량 및 결합 효율은 BCA 분석으로 평가하였으며, 결과는 하기 표 4에 나타냈다.

샘플	처리(Feed) (mg)		DNase-I
샘플	pMNSs^a	DNase-I^b	결합량 (Binding Contents) (wt%)^c	결합 효율(Binding Efficiency) (%)^d
DNase-I pMNSs1	10	2	13.8	80.1
DNase-I pMNSs2	10	5	29.4	83.1
DNase-I pMNSs3	10	10	45.4	83.1
DNase-I pMNSs4	10	20	61.1	78.5
^a제공한 pMNS의 중량 (Weight of feed pMNSs) ^b 제공한 DNase-I의 중량 (Weight of feed DNase-I) ^c결합량 = (DNase-I의 실제 질량(actual mass)/DNase-I pMNSs의 실제 총 중량) × 100, BCA 분석으로 측정하여 계산함. ^d결합 효율 = (DNase-I의 실제 중량/ DNase-I의 처리 중량(feed mass)) × 100, BCA 분석으로 측정하여 계산함.

표 4에 나타낸 바와 같이, DNase-I의 처리량 (feed amount)이 증가할수록, 나노입자에 대한 DNase-I의 실제 결합량 (actual amount of binding)이 증가하였으나, DNase-I의 결합 효율은 83% 정도로 제한되었다. 그러나, ~45%의 DNase-I-을 함유한 DNase-I pMNSs3의 경우 안정성 및 DNA 분해능이 매우 뛰어난 것으로 확인되었다. 따라서, DNase-I pMNSs3을 이후의 실험에 사용하였다.

마지막으로, 10%의 FBS를 함유한 PBS 또는 단순 PBS에서 시간에 따른 나노입자 및 DNase-I의 결합 안정성을 평가했다. 10% FBS를 함유한 PBS에서 지속형 DNase-I을 인큐베이션 한 후 DNase 활성을 측정한 결과, DNase-I pMNS의 활성은 최대 36시간까지 지속된 후, 48시간 후에는 활성이 감소하는 것으로 나타났다 (도 7a). 그러나, PBS에서는 DNase-I pMNS의 활성이 최대 72시간까지 유지되는 것으로 나타났다 (도 7b).

실시예 4. 외인성 DNase-I pMNS의 중증 COVID-19 환자의 혈장 내 NETosis 및 호중구 억제 효과 확인

본 발명자들은 상기 실시예 3에서 제조한 DNase-I-코팅된 나노입자, DNase-I pMNS가 호중구의 NETosis를 억제하는지 확인했다. DNase-I의 DNA 분해 효과를 검증하기 위해, 중증 COVID-19 환자의 혈장에 유리 DNase-I (free DNase-I) 또는 DNase-I pMNS를 처리했다. 그 결과, 두 가지 형태의 DNase-I 모두 eDNA 수준을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났으며, 중증 COVID-19 환자의 혈장에 대한 DNase-I의 노출은 DNase-I의 활성을 증가시키는 것으로 나타났으나, DNase-I pMNS에 의한 eDNA 분해 효과 및 DNase 활성 증가가 더욱 높은 것으로 나타났다 (도 8). 또한, 두 가지 형태 (유리 DNase-I 또는 DNase-I pMNS)를 중증 COVID-19 환자의 혈장에 처리하였을 때 호중구에서의 NET 수준, MPO 활성, 및 NE 수준이 대조군 (PBS 처리)에 비해 유의하게 감소한 것을 확인하였으며, 특히 DNase-I pMNS에 의해 더욱 현저하게 감소하는 것을 확인하였다 (도 9).

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 중증 COVID-19 환자의 50% 이상이 입원 당시 ARDS 및 패혈증을 진단 받았다. 일반적으로, 패혈증은 치명적인 전신 염증성 반응 사이토카인 폭풍 (cytokine storm)을 동반하는데, 이는 면역 이펙터 세포 (immune effector cells)에 의한 전염증성 (pro-inflammatory) 사이토카인의 폭발적 생성 증가에 의한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 DNase-I pMNS가 호중구에 의한 NF-κB 활성화 및 사이토카인 생성을 억제할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 유리-DNase-I을 처리하였을 때 NF-κB의 활성이 감소하고, IL-1β, IL-6, IFN-γ, 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 분비가 감소하였으며, 이와 같은 염증 반응 억제 효과는 DNase-I pMNS를 처리할 때 더욱 뛰어난 것으로 나타났다 (도 10).

상기 결과는 본 발명에 따른 나노입자가 중증 COVID-19 환자의 DNase-I 감소를 보완하여 NETosis 및 염증성 인자들의 증가를 효과적으로 억제할 수 있으며, 따라서 COVID-19로 인한 패혈증, 사이토카인 폭풍 현상 내지 전신성 염증 반응 등을 개선할 수 있음을 보여준다.

실시예 5. DNase-I pMNS에 의한 패혈증 마우스 모델의 NETosis 완화 효과 확인

실시예 4에서 In vitro 실험을 통해 중증 COVID-19 환자의 DNase-I pMNS에 의한 호중구 수 및 호중구-관련 NETosis 인자들의 억제 효과를 확인하였으므로, 다음 단계로서 DNase-I pMNS의 효과를 in vivo에서 확인하였다. 호중구 활성이 대표적인 COVID-19 관련 질환인 패혈증을 예방 내지 억제하고 생존율을 향상시키기 위한 치료 타겟이 될 수 있음을 고려하여, 맹장 결찰 및 천공 (cecal ligation and perforation, CLP)-수행된 패혈증 마우스 모델을 이용하여 DNase-I pMNS 투여에 따른 변화를 확인하였다. CLP 마우스 모델은 패혈증의 복합적인 분자 매커니즘을 확인하는데 가장 자주 이용되는 모델이다. 패혈증은 복강 내에서 미생물 감염 등이 일어난 후, 미생물이 혈액을 통해 이동하여 전신 염증 반응을 일으키는 것을 특징으로 하는데, CLP 모델과 중증 COVID-19 환자에서 유사한 표현형이 관찰된다. 특히, NETosis, 사이토카인 방출 증후군 (cytokine release syndrome, CRS), 및 다발성 장기부전 (multiple organ failure, MOF) 증후군은 CLP 모델에서도 유도될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 SARS-CoV-2에 의한 중증 COVID-19 환자의 in vivo 모델로서 CLP 모델을 사용했다.

DNase-I 나노입자의 효과를 확인하기 위해, 마우스에 CLP 수술을 진행한 후 12 시간 및 24 시간이 경과했을 때에 인산완충식염수 (PBS; 대조군), PEG-Nano (pMNS), 유리 DNase-I (100 유닛), 또는 DNase-I pMNS (100 유닛)를 정맥주사했다. 약물 투여 후 일정 시간이 지난 시점에 DNase-I의 활성, NET 수준 등을 측정했다. NET의 급격한 증가를 억제하기 위해, 약물을 CLP 수술 후 12 시간 및 24 시간이 경과했을 때 투여하였으며, DNase-I pMNS 등의 효과는 약물 투여 후 24 시간이 지난 후에 확인하였다.

먼저, 각 약물 투여에 따른 마우스 모델의 생존율을 확인한 결과, CLP-수행된 마우스 중 PBS, PEG-Nano, 또는 유리-DNase-I를 투여 받은 마우스는 모두 CLP 처리 후 90 시간 내에 사망했다 (도 11). 상기 결과는 CLP에 의한 패혈증이 매우 치명적임을 의미한다. 특히, 유리 DNase-I을 투여 받은 마우스의 사망률도 높은 것은 혈청 내 재조합 인간 DNase-I의 반감기가 매우 짧기 때문인 것으로 추측된다 (Immunol 1998, 113, 289). 반면, DNase-I pMNS를 투여 받은 마우스의 경우 CLP 후 132 시간 이상이 경과했을 때에도 40% 이상의 생존율을 보이며, 완전한 회복으로 이어진 것을 확인하였다 (도 11). 상기 결과는 본 발명에 따른 DNase-I pMNS의 경우 나노입자에 코팅된 DNase-I의 혈장 내 반감기가 증가하여 안정적으로 활성을 유지할 수 있으며, 이에 의해 패혈증 증상이 치료될 수 있음을 보여준다. 또한, 마우스 모델의 폐 조직을 분석한 결과, CLP에 의해 유도된 폐부종, 출혈, 폐포 붕괴 (alveolar collapse), 및 염증세포의 침윤 등의 형태학적 변화 (morphological changes)가 DNase-I pMNS에 의해 현저하게 감소한 것을 확인하였다 (도 12). 상기 결과는 본 발명에 따른 DNase-I pMNS 나노입자가 패혈증에 의한 폐조직 손상을 개선시킬 수 있음을 보여준다.

DNase-I pMNS 나노입자의 투여에 따른 마우스의 복강 내 호중구, NET, eDNA, DNase 활성, NE 활성, 및 MPO 활성의 변화는 도 13에 나타냈다. 중증 COVID-19 환자의 혈장 및 호중구를 이용한 in vitro 실험과 마찬가지로, DNase-I pMNS를 투여 받은 CLP 마우스는 복막 호중구, NET, eDNA, NE 활성, 및 MPO 활성 수준이 급격하게 감소하였으며, PBS 및 pMNS는 물론, 유리 DNase-I을 투여한 경우에 비해 더욱 큰 폭으로 감속한 것으로 나타났다. 또한 DNase 활성 역시 DNase-I pMNS를 투여 받은 CLP 마우스에서 가장 극적으로 증가했다. 상기 결과는 본 발명에 따른 DNase-I pMNS 나노입자가 in vivo에서도 뛰어난 NETosis 억제 효과 및 DNase 활성 촉진 효과를 갖는다는 것을 보여준다.

다음으로, CLP에 의한 패혈증 마우스 모델에서 DNase-I pMNS에 의한 염증 반응 조절 효과를 확인했다. 상술한 바와 같이 패혈증과 관련된 전신 염증 반응은 다발성 장기부전 증후군을 유발할 수 있으며, 특히 신장 및 간에서 다발성 장기부전이 일어나는 것으로 알려져 있다. 실제로, CLP 수술을 받은 마우스는 혈청에서 간 손상 마커인 AST (alanine transferase), 및 AST (aspartate transaminase); 신장 손상 마커인 혈액 요소 질소 (blood urea nitrogen, BUN) 및 크레아틴; 조직 손상 마커인 젖산탈수효소 (lactate dehydrogenase, LDH); 및 폐렴 및 패혈증 마커인 C-반응성 단백질 (C-reactive protein, CRP)의 수준이 급격하게 증가하였다. 그러나, 본 발명에 따른 DNase-I pMNS 나노입자를 투여한 마우스에서는 상기 마커들의 수준이 모두 현저하게 감소하였으며, 특히 유리 DNase-I를 투여 받은 마우스에 비해 더욱 현저하게 감소한 것으로 나타났다 (도 14). 상기 결과는 본 발명에 따른 DNase-I 나노입자가 전신의 염증 반응을 억제하고 다발성 장기부전을 효과적으로 개선할 수 있음을 보여준다.

다음으로, CLP에 의한 패혈증 마우스 모델의 혈액에서 절대 호중구 수, 절대 백혈구 수 및 총 백혈구 (total white blood cells) 수를 평가했다. 앞서 살펴본 복강에서의 변화와 유사하게, DNase-I pMNS는 대조군 및 유리 DNase-I과 비교하여 혈액 중 절대 호중구 수와 총 백혈구 수를 급격히 감소시켰다 (도 15). 그러나, 절대 백혈구 수의 경우 DNase-I pMNS를 처리하더라도 유의미한 변화가 없었다. 상기 결과는 DNase-I pMNS 나노입자가 염증 세포의 과도한 증식을 억제함으로써 염증 반응을 완화한다는 것을 보여준다.

나아가, 패혈증 마우스 모델에서의 DNase-I pMNS의 항-NETosis 효과를 마우스 폐조직의 사이토카인 어레이 분석 (cytokine array analysis)을 통해 평가했다. 도 16에 나타낸 바와 같이, CLP 수술을 받은 마우스 모델은 IL-6, IL-8, IL-1β, 및 CCL2 등의 염증성 사이토카인의 수준이 크게 증가되어 있었다. CLP 마우스 모델의 폐조직 내 사이토카인의 증가는 SARS-CoV-2 감염 후의 사이토카인 폭풍 (cytokine storm)을 포함한 전신 염증 반응의 급격한 상승과 유사하다. 그러나, DNase-I pMNS를 투여한 마우스는 IL-6, IL-8, IL-1β, 및 CCL2 등의 사이토카인 수준이 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 상기 결과는 DNase-I pMNS 나노입자가 다양한 염증성 인자들의 수준을 감소시킴으로써 체내 염증 반응을 억제한다는 것을 시사한다.

다음으로, SARS-CoV-2가 혈관 내피세포를 손상시켜 심각한 폐손상을 유발하므로, 패혈증 마우스 모델에서 내피세포 투과성 (transendothelial permeability)을 관찰하여 본 발명에 따른 DNase-I 나노입자가 혈관 장벽을 보호하는 효과가 있는지 확인하였다. 그 결과, 유리 DNase-I은 투여 초기에는 CLP에 의한 혈관 투과성 증가를 억제하는 효과가 관찰됐지만 투여 후 72 시간 이상 경과했을 때 효과가 급격히 감소하였다. 반면, DNase-I pMNS를 투여한 그룹은 투여 후 72 시간이 경과했을 때에도 높은 혈관 장벽 보호 효과가 유지되는 것으로 나타났다 (도 17). 상기 결과는 본 발명에 따른 DNase-I 나노입자가 유리 DNase-I에 비해 혈중 안정성이 높아 SARS-CoV-2에 의한 혈관 내피세포 손상을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.

마지막으로, DNase-I pMNS의 패혈증 치료 효과가 DNase-I pMNS-농도 의존적인지 확인하기 위해, 마우스에 CLP를 수행한 후 다양한 농도의 DNase-I pMNS를 투여하고 시간에 따른 생존율을 확인하였다 (즉, 나노입자는 일정하며 DNase-I에만 변화를 줌; 25, 50, 및 100 유닛). 그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이 DNase-I pMNS의 처리 농도가 높을수록 CLP 마우스의 생존율이 증가한 것으로 나타난 바, 본 발명에 따른 DNase-I 나노입자의 패혈증 치료 효과는 농도 의존적임을 확인하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 DNase-I을 멜라닌 나노입자에 코팅하여 투여하는 경우 (DNase-I pMNS) COVID-19 환자의 NETosis, 염증 세포, 및 다양한 염증-관련 인자들의 수준이 감소하고, DNase-I의 활성이 증가하여 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 증상이 현저히 개선될 뿐만 아니라 패혈증 마우스 모델의 생존율을 증가시키는 것을 확인하였으며, 이와 같은 DNase-I pMNS의 치료 효과는 DNase-I을 단독으로 투여하는 것에 비해 더욱 뛰어난 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 DNase-I이 코팅된 멜라닌 나노입자는 COVID-19 환자의 악화 요인인 NETosis를 효과적으로 억제하고 전신 염증 반응을 완화함으로써 COVID-19 환자의 급성 호흡기 증후군, 폐렴, 패혈증으로의 진행을 예방하고 COVID-19 증상을 잠재적으로 치료할 수 있는 바, 새로운 코로나 바이러스 치료 전략으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Pharmaceutical compositions for preventing or treating SARS-CoV-2 infection <130> MP20-179P1 <150> KR 10-2020-0117435 <151> 2020-09-14 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DNase-1 isoform 1_amino acid seq_full length <400> 1 Met Arg Gly Met Lys Leu Leu Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Gln Gly Ala Val Ser Leu Lys Ile Ala Ala Phe Asn Ile Gln Thr 20 25 30 Phe Gly Glu Thr Lys Met Ser Asn Ala Thr Leu Val Ser Tyr Ile Val 35 40 45 Gln Ile Leu Ser Arg Tyr Asp Ile Ala Leu Val Gln Glu Val Arg Asp 50 55 60 Ser His Leu Thr Ala Val Gly Lys Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gln Asp 65 70 75 80 Ala Pro Asp Thr Tyr His Tyr Val Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg Asn 85 90 95 Ser Tyr Lys Glu Arg Tyr Leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gln Val Ser 100 105 110 Ala Val Asp Ser Tyr Tyr Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn 115 120 125 Asp Thr Phe Asn Arg Glu Pro Ala Ile Val Arg Phe Phe Ser Arg Phe 130 135 140 Thr Glu Val Arg Glu Phe Ala Ile Val Pro Leu His Ala Ala Pro Gly 145 150 155 160 Asp Ala Val Ala Glu Ile Asp Ala Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Asp Val 165 170 175 Gln Glu Lys Trp Gly Leu Glu Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn 180 185 190 Ala Gly Cys Ser Tyr Val Arg Pro Ser Gln Trp Ser Ser Ile Arg Leu 195 200 205 Trp Thr Ser Pro Thr Phe Gln Trp Leu Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr 210 215 220 Thr Ala Thr Pro Thr His Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly 225 230 235 240 Met Leu Leu Arg Gly Ala Val Val Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asn 245 250 255 Phe Gln Ala Ala Tyr Gly Leu Ser Asp Gln Leu Ala Gln Ala Ile Ser 260 265 270 Asp His Tyr Pro Val Glu Val Met Leu Lys 275 280 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DNase-1 isoform 1_amino acid seq_active site <400> 2 Ile Val Pro Leu His Ala Ala Pro Gly Asp Ala Val Ala Glu Ile Asp 1 5 10 15 Ala Leu Tyr Asp Val 20 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DNase-1 isoform 1_amino acid seq_conserved site <400> 3 Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser 1 5 <210> 4 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DNase-1 isoform 1_amino acid seq_domain <400> 4 Phe Asn Ile Gln Thr Phe Gly Glu Thr Lys Met Ser Asn Ala Thr Leu 1 5 10 15 Val Ser Tyr Ile Val Gln Ile Leu Ser Arg Tyr Asp Ile Ala Leu Val 20 25 30 Gln Glu Val Arg Asp Ser His Leu Thr Ala Val Gly Lys Leu Leu Asp 35 40 45 Asn Leu Asn Gln Asp Ala Pro Asp Thr Tyr His Tyr Val Val Ser Glu 50 55 60 Pro Leu Gly Arg Asn Ser Tyr Lys Glu Arg Tyr Leu Phe Val Tyr Arg 65 70 75 80 Pro Asp Gln Val Ser Ala Val Asp Ser Tyr Tyr Tyr Asp Asp Gly Cys 85 90 95 Glu Pro Cys Gly Asn Asp Thr Phe Asn Arg Glu Pro Ala Ile Val Arg 100 105 110 Phe Phe Ser Arg Phe Thr Glu Val Arg Glu Phe Ala Ile Val Pro Leu 115 120 125 His Ala Ala Pro Gly Asp Ala Val Ala Glu Ile Asp Ala Leu Tyr Asp 130 135 140 Val Tyr Leu Asp Val Gln Glu Lys Trp Gly Leu Glu Asp Val Met Leu 145 150 155 160 Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Val Arg Pro Ser Gln Trp 165 170 175 Ser Ser Ile Arg Leu Trp Thr Ser Pro Thr Phe Gln Trp Leu Ile Pro 180 185 190 Asp Ser Ala Asp Thr Thr Ala Thr Pro Thr His Cys Ala Tyr Asp Arg 195 200 205 Ile Val Val Ala Gly Met Leu Leu Arg Gly Ala Val Val Pro Asp Ser 210 215 220 Ala Leu Pro Phe 225 <210> 5 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DNase-1 isoform 2_amino acid seq_full length <400> 5 Met His Gln Thr Pro Ile Thr Thr Trp Ser Val Ser His Trp Asp Gly 1 5 10 15 Thr Ala Ile Arg Ser Ala Thr Cys Ser Cys Thr Gly Leu Thr Arg Cys 20 25 30 Leu Arg Trp Thr Ala Thr Thr Thr Met Met Ala Ala Ser Pro Ala Gly 35 40 45 Thr Thr Pro Ser Thr Glu Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ser Ser Pro Gly 50 55 60 Ser Gln Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr 65 70 75 80 Val Arg Pro Ser Gln Trp Ser Ser Ile Arg Leu Trp Thr Ser Pro Thr 85 90 95 Phe Gln Trp Leu Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr Thr Ala Thr Pro Thr 100 105 110 His Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly Met Leu Leu Arg Gly 115 120 125 Ala Val Val Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asn Phe Gln Ala Ala Tyr 130 135 140 Gly Leu Ser Asp Gln Leu Phe Ser Val His Thr Cys Ser Gly Ala Gly 145 150 155 160 Leu Gly Glu Arg His Gly Leu Pro Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ser Asn 165 170 175 Thr Cys Arg Ala Gly Thr His Arg Val Ser Thr 180 185

Claims

DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 생체고분자는 멜라닌 (melanin), 키토산 (chitosan), 알지네이트 (alginate), 헤파린 (heparin), 셀룰로오스 (cellulose), 젤라틴 (gelatin), 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol), 폴리비닐피로리돈 (polyvinylpyrrolidione), 콜라겐 (collagen), 젤라틴 (gelatin), 폴리카포로락톤 (polycaprolactone), 폴리락틱코글라이코라이드 (Poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리락타이드 (polylactide), 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 생체고분자 나노입자는 표면이 폴리에틸렌글라이콜 (polyethylene glycol)로 코팅된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자는 하기 특징 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
(a) 상기 나노입자의 평균 직경은 100 내지 300 nm임;
(b) 상기 나노입자의 표면 전하는 -20 mV 내지 -0.1 mV임;
(c) 상기 나노입자의 다분산도는 0.02 내지 0.15임; 또는
(d) 상기 나노입자는 구형임.
제1항에 있어서,
상기 생체고분자 나노입자에 대한 DNase-I 단백질의 결합 비율은 10 내지 70 중량% 인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2 바이러스 감염증은 코로나바이러스감염증-19, 패혈증, 급성 호흡기 증후군, 폐렴, 사이토카인 폭풍 (cytokine storm), 사이토카인 방출 증후군, 전신 염증반응 증후군, 및 다발성 장기부전으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 정상인과 비교하여 혈중 세포외 DNA (extracellular DNA) 수준 및 시트룰린화 히스톤 H3 (citrullinated histone H3) 수준으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 증가한 개체의 치료를 위한 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 정상인과 비교하여 DNase-I의 활성 또는 수준이 감소한 개체의 치료를 위한 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 혈중 DNase-I의 활성 또는 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 호중구 증식, 골수세포형 과산화효소의 활성, 호중구 엘라스테이즈의 활성, 호중구의 세포외 트랩 형성 (NETosis), 및 호중구 NF-κB의 활성으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제11항에 있어서,
상기 염증성 사이토카인은 IL-1β, IL-6, IL-8, CCL2, IFN-γ, 및 TNF-α으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 키트.
DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염증 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
하기 단계를 포함하는 DNase-I 단백질이 표면에 결합된 생체고분자 나노입자의 제조방법:
(S1) 생체고분자 용액에 알칼리 용액을 첨가하여 나노입자를 제조하는 단계; 및
(S2) 상기 (S1) 단계에서 수득한 나노입자를 DNase-I를 포함하는 완충액에 첨가하는 단계.
제15항에 있어서,
상기 (S2) 단계의 DNase-I를 포함하는 완충액은 폴리에틸렌글라이콜을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 (S2) 단계에서 상기 나노입자 및 DNase-I은 1 : 0.2 내지 2의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.