KR20220035109A - Rna와 같은 핵산 및 선택적으로 입자를 포함하는 샘플 조성물의 적어도 하나의 파라미터를 결정하기 위한 방법 - Google Patents

Rna와 같은 핵산 및 선택적으로 입자를 포함하는 샘플 조성물의 적어도 하나의 파라미터를 결정하기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 일반적으로 RNA와 같은 핵산을 분석하는 분야, 특히 핵산, 특히 RNA, 및 선택적으로 입자를 포함하는 샘플 조성물의 적어도 하나의 파라미터의 결정에 관한 것이다.

Description

RNA와 같은 핵산 및 선택적으로 입자를 포함하는 샘플 조성물의 적어도 하나의 파라미터를 결정하기 위한 방법
본 개시내용은 일반적으로 RNA와 같은 핵산을 분석하는 분야, 특히 핵산, 특히 RNA, 및 선택적으로 입자를 포함하는 샘플 조성물의 적어도 하나의 파라미터의 결정에 관한 것이다.
외래 유전 정보를 표적 세포로 전달하기 위한 재조합 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 사용은 잘 알려져 있다. RNA 사용의 장점은 일시적인 발현과 형질전환되지 않는 특성을 포함한다. RNA는 발현되기 위해 핵에 들어갈 필요가 없고, 또한 숙주 게놈에 통합될 수 없기 때문에 종양형성과 같은 다양한 위험을 제거한다.
재조합 핵산은 필요로 하는 대상에게 네이키드(naked) 형태로 투여될 수 있고; 그러나 일반적으로 재조합 핵산은 약제학적 조성물을 사용하여 투여된다. 예를 들어, RNA는 RNA 및 나노입자 형성 비히클, 예를 들어 양이온성 지질, 양이온성 지질과 보조 지질의 혼합물, 또는 양이온성 중합체를 함유하는 소위 나노입자 제형에 의해 전달될 수 있다.
이러한 나노입자 제형의 운명은 다양한 핵심 요소(예를 들어, 나노입자 내 핵산의 무결성 및 농도, 유리 핵산의 양, 크기, 크기 분포, 정량적 크기 분포 및 나노입자의 형태 등)에 의해 제어된다. 이러한 인자는 예를 들어 2018년 FDA "리포솜 의약품 지침"에서 분석 및 지정해야 하는 특정 속성으로 언급된다. 현재 나노입자 제형의 임상적 적용에 대한 한계는 균질하고 순수하며 잘 특성화된 나노입자 제형의 부족에 있을 수 있다. 이것은 또한 이러한 인자를 결정하기 위한 종래의 모든 기술에 몇 가지 단점이 있다는 사실 때문이기도 한다.
예를 들어, 나노입자(염료, 겔 전기영동, 마이크로채널 전기영동 또는 모세관 전기영동(CE)를 기반으로 하는 방법)에서 핵산의 무결성 및/또는 농도를 결정하기 위한 현재 기술은 노동 집약적이며 비용이 많이 들고 샘플 준비 단계에서 인공물은 발생하고 적절한 정보를 제공할 수 없거나 많은 수의 샘플을 분석할 수 없다. 염료(형광 염료와 같은)를 사용하는 현재 기술에서 염료 자체가 차이를 유발할 수 있으며, 이는 측정 결과의 신뢰성에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 기반으로 하는 대부분의 기술은 여러 단계의 세척, 절차의 길이를 증가시키는 특수 작동 완충액의 사용, 독성 시약의 사용으로 인한 특별한 예방 조치가 필요하다. 예를 들어, 아가로스 겔 기술은 여러 파라미터(예를 들어, 아가로스의 품질, 겔의 주조, 염료/민감도(더 많은 양의 샘플이 필요함), 노출 시간, 원시 데이터 처리 및 밀도측정 소프트웨어에 의한 표준화된 평가의 영향 (28S/18S 방법))에 의해 영향을 받고, 이 기술을 신뢰할 수 없게 만든다. 마이크로채널, 칩 기반 전기영동 또는 모세관 전기영동을 기반으로 하는 기술은 아가로스 겔 전기영동에 비해 더 빠른 실시 시간과 향상된 데이터 품질을 제공하지만 시스템에 겔, 마커 및 샘플의 프라이밍 및 로딩을 위한 실습 처리가 필요하다. CE 기기는 적절한 RNA 품질/양 분석에 필요한 감도, 동적 범위 및 분리 품질이 부족하다.
또한, 나노입자 제형을 특성화하기 위한 한 가지 핵심 과제는 제형에 함유된 입자의 크기 분포를 정량적으로 결정하는 데 있다. 이것은 특히 직경이 약 500 nm 미만인 입자의 경우, 즉 대부분의 의약품과 관련된 범위이다. 추가의 미충족 요구는 크기 분포는 넓거나 복잡한(특히 비대칭) 나노입자 제형의 크기 분포를 결정하는 데 있다. 나노입자 제형의 특성화에 사용할 수 있는 종래의 모든 기술에는 다음과 같은 특정 단점이 있다: 예를 들어 이들은 크기에 대한 직접적인 정량적 정보를 제공하지 않거나, 또는 샘플의 작은, 임의로 대표적이지 않은 하위세트만을 측정하거나, 또는 상이한 크기 (또는 다른 파라미터, 예를 들어 벌크 상에 대한 굴절률 구배)를 갖는 입자에 대한 감도가 매우 상이하며, 이는 수득된 크기 분포에 강하게 영향을 미친다.
더 낮은 서브미크론 범위(약 100 nm)의 입자 크기 측정과 관련하여, 동적 광산란(DLS), 나노입자 추적 분석(NTA), 전자 현미경(EM) 및 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)-UV와 같은 여러 기술이 존재한다.
DLS는 유체역학적 반경 Rh가 스톡스-아인슈타인(Stokes-Einstein) 방정식을 사용하여 계산되는 나노입자의 확산 상수에 대한 정보를 제공한다. 그러나 DLS는 특정 알고리즘을 사용하여 입자 크기를 수치적으로 계산한 평균 데이터만 제공한다. 정량적으로 신뢰할 수 있는 수치를 얻으려면, 나노입자 제제는 단봉 및 단분산이어야 하고, 이는 나노미립자 약제학적 제형을 비롯한 많은 제품의 경우가 아니다. DLS에서 가장 널리 사용되는 알고리즘은 소위 누적 분석(D.E. Koppel, J. Chem. Phys. 57 (1972) 4814-4820)이며, 이는 전제로서 단지 단봉 크기 분포를 가정하고 다분산도가 특정 역치 미만인 경우에만 물리적으로 의미 있는 수를 제공한다. DLS용 기타 알고리즘(예를 들어, 문헌[Provencher, S.W., Comput. Phys. Commun. 1982, 27, 229-242]를 참조함)는 적합화 파라미터에 크게 의존하는 크기 곡선을 제공하고 매우 상이한 여러 프로파일이 동일한 데이터 세트에 대응할 수 있다. 이러한 분석은, 큰 입자의 광산란 강도가 작은 입자보다 훨씬 높기 때문에 훨씬 더 큰 입자가 있는 경우 작은 입자의 분율을 결정하기 어렵다는 사실에 의해 방해된다.
NTA는 시간이 지남에 따라 샘플의 매우 작은(희석된) 하위세트에서 산란광을 현미경으로 관찰하여 확산 상수에서 입자의 크기를 결정하는 방법이다. 원칙적으로, NTA는 정량적인 크기 분포 프로파일을 제공할 수 있지만; 매우 희석된 샘플만이 측정될 수 있고, 입자는 비교적 작은 크기 범위로 존재해야 하며, 즉 극소 입자는 훨씬 더 높은 산란 강도로 인해 훨씬 더 큰 입자의 배경에서 결정될 수 없다. 따라서 NTA는 약제학적 제형의 정량적 크기 분포를 결정하기 위해 정기적으로 적용할 수 있는 방법으로 적합하지 않다. 또한, NTA의 통계 표준 편차는 다른 기술(예를 들어, DLS)에 비해 높다. 이것은 NTA에 의해 분석된 입자의 양은 10 내지 300배 적은 직접적인 결과이다. 특히, 생물학적 영향을 미치는 한계량의 입자(예를 들어, 응집체)는 과소 평가되거나 NTA에서 검출조차 할 수 없다. NTA는 정확한 측정을 위한 적합한 설정을 확인하기 위해 여러 시간-소모 최적화 단계(예를 들어, 비디오 포획 설정, 상이한 샘플 희석 등)를 필요로 한다. 일반적으로 NTA 측정을 위한 샘플은 10 내지 1000배 희석해야 하며, 이는 특히 농도에 따른 입자의 응집 또는 분해에 문제를 일으킬 수 있다. 이러한 모든 단점으로 인해 NTA를 품질 관리 방법으로 확립하기가 어렵다.
EM은 개별 입자의 크기, 형상 및 형태에 대한 정량적 정보를 제공하지만 분석할 수 있는 입자의 수는 NTA보다 훨씬 적다. 따라서 EM은 측정된 입자가 전체 샘플을 대표할 수 없다는 점에서 NTA와 유사하거나 동일한 단점이 있다. 이 기술의 또 다른 주요 단점은 높은 비용, 복잡한 샘플 준비 및 샘플 분석을 위한 긴 소요 시간이다. 이것은, EM이 GMP 방법으로 일반적으로 사용되지 않는 이유이다. EM의 또 다른 문제는 샘플의 고정으로 인해 인공물(예를 들어, 축소, 응집 등)이 발생할 수 있다는 것이다. 샘플이 고정되어 있지 않으면(예를 들어, Cryo-EM에서), 샘플의 대비가 낮아 분석할 수 없다.
SEC-UV와 같은 다른 분리 기술이 적용할 수 없는 것은, 컬럼 매트릭스와의 상호작용으로 인해 문제(예를 들어, 용리의 흡수 또는 지연)가 발생할 수 있기 때문이다. SEC 컬럼의 제한된 크기 범위로 인해 나노 입자가 적절하게 분산되지 않거나 나노 입자가 응집체에서 분리되지 않는다. 또한 SEC-UV는 질량 또는 입자 수가 입자 크기와 직접적인 상관관계가 있다는 점에서 정량적 크기 분포를 제공하지 않는다. 다른 분산성 방법, 예컨대 분석 초원심분리 (AUC)은 크기 프로파일을 계산하기 위해 몇 가지 가정을 해야 하는 침강 계수를 기반으로 하는 것과 같이 간접적인 크기 측정만 허용한다. 또한 AUC는 비용과 시간이 많이 소요되며 정기적인 품질 관리에서 일반적인 방법이 아니다. 따라서 AUC도 정규 품질 관리 방법으로 정량적 크기 프로파일을 결정하는 데 적합하지 않다.
위의 관점에서, 나노 입자 제형의 재현 가능한 품질을 보장하려면 심층 입자 특성화를 위한 고급 분석 방법이 필요하다. 특히, 핵산(특히 RNA)을 함유하는 나노입자 제형을 분석하는 개선된 방법에 대한 필요성이 존재하고, 상기 방법은 바람직하게는 (i) 제형의 특성(예를 들어, (특히 500 nm 미만의 직경을 갖는 입자와 관련하여) 제형에 함유된 입자의 정량적 크기 분포)에 대한 정보를 제공하고; (ii) 입자 조성물의 특성 (예를 들어, 특히 입자 크기의 함수로서 입자 내에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 양, 예컨대 입자 형성 화합물의 양 (특히 지질 및/또는 중합체, 예를 들어 양이온성 지질 대 양이온성 중합체)에 대한 입자 내에 포함된 핵산 (특별히 RNA) 양의 비, 특히 입도의 함수로서의 양)에 관한 정보를 제공하고; (iii) GMP 호환 가능하고; (iv) 염료 사용에 의존하지 않고; (v) 반자동 및/또는 (vi) 핵산 (예컨대 RNA) 및 임의로 입자를 포함하는 조성물을 제조 및/또는 저장하는 경우, 하나 이상의 반응 조건 (예를 들어, 염 농도; 온도; pH 또는 완충액 농도; 광/방사선; 산소; 전단력; 압력; 동결/해동 주기; 건조/재구성 주기; 부형제(들) (예를 들어, 안정화제 및/또는 킬레이트화제)의 첨가; 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 유형 및/또는 공급원; 전하 비율; 및/또는 핵산 (예컨대 RNA) 대 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 비)를 변경하는 효과를 분석하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 다음 파라미터 중 하나 이상에에 관한 데이터를 제공한다: 핵산 (예컨대 RNA) 무결성, 핵산 (예컨대 RNA)의 총량, 유리 핵산 (예컨대 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기 (특히, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함), 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함); 핵산 (예컨대 RNA)의 분자량; 및/또는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 형상 (예를 들어, 형상 및/또는 형태 계수). 선택적으로, 추가 파라미터는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 표면 핵산의 양 (예컨대 표면 RNA의 양), 캡슐화된 핵산의 양 (예컨대 캡슐화된 RNA의 양), 접근 가능한 핵산의 양 (예컨대 접근 가능한 RNA의 양), 핵산 (특히 RNA)의 크기 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 캡슐화 효율, 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양 대 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 총량의 비, 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양의 비, 및 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 음으로 하전된 모이어티의 양의 전하 비율 (N/P 비).
본 발명자들은 놀랍게도 본 명세서에 기재된 방법 및 용도가 상기 언급된 요건을 충족한다는 것을 발견하였다.
제1 양태에서, 본 개시내용은 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 샘플 조성물은 핵산(예를 들어, RNA) 및 선택적으로 입자를 포함하고, 상기 방법은,
(a) 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화(field-flow fractionation)에 적용하여, 샘플 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 샘플 분획을 생성하는 단계;
(b) UV 신호, 형광 신호 및 굴절률(RI) 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하고, 선택적으로 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 광산란 (LS) 신호를 측정하는 단계; 및
(c) UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호로부터, 그리고 선택적으로 LS 신호로부터, 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계를 포함하고,
상기 1개 이상의 파라미터는 핵산 (예컨대 RNA) 무결성, 핵산 (예컨대 RNA)의 총량, 유리 핵산 (예컨대 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기 (특히, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함), 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함)을 포함한다. 일반적으로, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포는 각각 그의 크기의 함수로서 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 수, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 몰량, 또는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 질량으로서 주어질 수 있다. 추가적인 선택적 파라미터는 핵산 (특히 RNA)의 분자량, 표면 핵산의 양 (예컨대 표면 RNA의 양), 캡슐화된 핵산의 양 (예컨대 캡슐화된 RNA의 양), 접근 가능한 핵산의 양 (예컨대 접근 가능한 RNA의 양), 핵산 (특히 RNA)의 크기 (특히, 핵산 (특히 RNA)의 Rg 및/또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA)의 Rg 및/또는 Rh 값을 기준으로 함), 정량적 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA)의 Rg 및/또는 Rh 값을 기준으로 함), 형상 계수, 형태 계수, 및 핵산 (특히 RNA) 캡슐화 효율을 포함한다. 일반적으로, 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포는 각각 그의 크기의 함수로서 핵산 (특히 RNA) 분자의 수, 핵산 (특히 RNA)의 몰량, 또는 핵산 (특히 RNA)의 질량으로서 주어질 수 있다. 또한, 추가의 선택적 파라미터는 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양 대 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 총량의 비율을 포함하고, 상기 비율은 입자 크기의 함수; 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양의 비로서 주어질 수 있고, 상기 비율은 입자 크기의 함수; 및 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 음으로 하전된 모이어티의 양의 전하 비율로서 주어질 수 있고, 상기 전하 비율은 통상적으로 N/P 비로 나타내고 입자 크기의 함수로서 주어질 수 있다.
제1 양태의 제1 하위군에서, 본 방법은 다음을 포함한다:
(a) 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여, 샘플 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 샘플 분획을 생성하는 단계;
(b) 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 적어도 하나의 UV 신호, 및 선택적으로 광산란(LS) 신호를 측정하는 단계; 및
(c) UV 신호 및 선택적으로 LS 신호로부터 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계.
제1 양태의 제2 및 바람직한 하위군에서, 본 방법은 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하기 위한 것이고, 샘플 조성물은 RNA 및 선택적으로 입자를 포함하고, 본 방법은 다음을 포함한다:
(a) 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여, 샘플 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 샘플 분획을 생성하는 단계;
(b) UV 신호, 형광 신호 및 굴절률(RI) 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하고, 선택적으로 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 광산란 (LS) 신호를 측정하는 단계; 및
(c) UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호로부터, 그리고 선택적으로 LS 신호로부터, 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계.
제1 양태의 제3 및 바람직한 하위군에서, 본 방법은 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하기 위한 것이고, 샘플 조성물은 RNA 및 선택적으로 입자를 포함하고, 본 방법은 다음을 포함한다:
(a) 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여, 샘플 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 샘플 분획을 생성하는 단계;
(b) 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 적어도 하나의 UV 신호, 및 선택적으로 광산란(LS) 신호를 측정하는 단계; 및
(c) UV 신호 및 선택적으로 LS 신호로부터 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 값을 기준으로 계산된다. 제1 양태의 또 다른 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 또 다른 구현예에서), 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rh 값을 기준으로 계산된다. 제1 양태의 또 다른 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 또 다른 구현예에서), 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 값을 기준으로 하고 별도로 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rh 값을 기준으로 계산된다 (즉, 이 구현예는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포에 대한 2개의 데이터 세트를 생성하고, 하나는 Rg 값을 기준으로 하고 하나는 Rh 값을 기준으로 함).
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포를 포함하고, 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA)의 Rg 값을 기준으로 계산된다. 제1 양태의 또 다른 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 또 다른 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포를 포함하고, 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA)의 Rh 값을 기준으로 계산된다. 제1 양태의 또 다른 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 또 다른 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포를 포함하고, 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA)의 Rg 값을 기준으로 하고 별도로 핵산 (예컨대 RNA)의 Rh 값을 기준으로 계산된다 (즉, 이 구현예는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포에 대한 2개의 데이터 세트를 생성하고, 하나는 Rg 값을 기준으로 하고 하나는 Rh 값의 값을 기준으로 함).
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 필드-유동 분획화는 바람직하게는 유동 필드-필드 분획화, 예컨대 비대칭 유동 필드-필드 분획화 (AF4) 또는 중공 섬유 유동 필드-필드 분획화 (HF5)이다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(a)는 핵산 (특히 RNA)이 멤브레인을 투과하는 것을 방지하는 데 적합한 분자량 (MW) 컷-오프를 갖는 멤브레인, 바람직하게는 2 kDa 내지 30 kDa 범위의 MW 컷-오프, 예컨대 10 kDa의 MW 컷-오프를 갖는 멤브레인을 사용하여 수행된다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(a)는 폴리에테르설폰(PES) 또는 재생 셀룰로오스 멤브레인을 사용하여 수행된다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(a)는 (I) 최대 8 mL/분, 바람직하게는 최대 4 mL/분, 더 바람직하게는 최대 2 mL/분의 교차 유량, 예를 들어, 교차 유량 프로파일; 및/또는 (II) 0.05 내지 0.35 mL/분 범위, 바람직하게는 0.10 내지 0.30 mL/분 범위, 더 바람직하게는 0.15 내지 0.25 mL/분 범위의 주입 흐름; 및/또는 (III) 0.30 내지 0.70 mL/분 범위, 바람직하게는 0.40 내지 0.60 mL/분 범위, 더 바람직하게는 0.45 내지 0.55 mL/분 범위의 검출기 유동을 사용하여 수행된다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 교차 유량 프로파일은 바람직하게는 대조군 또는 샘플 조성물에 함유된 성분이 하나 이상의 샘플 분획을 생성하기 위해 크기 별로 분획/분리되도록 하는 분획화 단계를 포함한다. 바람직하게는, 교차 유량은 이러한 분획화 단계 동안 변화하고 (예를 들어, 하나의 값 (예컨대 약 1 내지 약 4 mL/분)으로부터 시작하고, 이어서 더 낮은 값(예컨대 약 0 내지 약 0.1 mL/min)으로 감소하거나, 또는 하나의 값(예를 들어 약 O 내지 약 O.1 mL/ 분)으로부터 시작하여 더 높은 값(예, 약 1 또는 약 4 mL/분으로 증가함); 여기서 변화는 임의의 수단, 예를 들어 연속 (예컨대 선형 또는 지수) 변화 또는 단계적 변화에 의해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 교차 유량 프로파일은 분획화 단계를 포함하며, 여기서 교차 유량은 하나의 값(예를 들어, 약 1 내지 약 4 mL/분)으로부터 시작하여 연속적으로(바람직하게는 기하급수적으로) 변화하고, 이어서 더 낮은 값 (예컨대 약 0 내지 약 0.1 mL/분)으로 감소한다. 분획화 단계는 예를 들어, 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 30분 동안 샘플 조성물에 함유된 성분을 그의 크기로 분획/분리하기에 적합한 임의의 길이를 가질 수 있다. 교차 유량 프로파일은 분획화 단계 전 및/또는 후에 있을 수 있고(예를 들어, 분획화 단계 전에 1개 및 분획화 단계 후에 1개, 2개, 또는 3개), 샘플 조성물에 함유된 비-핵산(특히 비-RNA) 성분(예를 들면, 단백질, 폴리펩타이드, 모노뉴클레오타이드 등)을 샘플 조성물 중에 함유된 핵산(특히 RNA)으로부터 분리하고, 샘플 조성물에 포함된 핵산(특별히 RNA)에 초점을 맞추고/거나 필드-유동 분획화 디바이스를 재생하도록(예컨대, 디바이스의 멤브레인에 결합된 모든 성분을 제거하기 위해) 작용할 수 있는 추가의 단계(예를 들면, 1개 또는 2개)을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 이들 추가 단계의 교차 유량은 각각의 추가 단계에 대해 일정하고, 각각의 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분 (예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 30분)의 범위에서 추가 단계에 대해 서로 독립적이다. 예를 들어, 교차 유량 프로파일은 (i) 분획화 단계 이전에 있는 제1 추가 단계로서, 상기 제1 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 시작되는 동일한 교차 낮은 비율인 단계(제1 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 10분 또는 약 20분 또는 약 30분의 범위일 수 있음); (ii) 분획화 단계 이후의 제2 추가 단계로서, 상기 제2 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 끝나는 동일한 교차 낮은 속도인 단계(제2 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 10분 또는 약 20분 또는 약 30분의 범위일 수 있음); 및 선택적으로 (iii) 제2 추가 단계 이후의 제3 추가 단계로서, 상기 제3 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 제2 추가 단계의 교차 유량과 다른 단계(제3 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 10분 또는 약 20분 또는 약 30분의 범위일 수 있음)을 포함할 수 있다. 교차 유량 프로파일이 분획화 단계를 포함하는 구현예에서, 교차 유량은 하나의 값(예를 들어, 약 1 내지 약 4 mL/분)으로부터 시작하여 연속적으로(바람직하게는 기하급수적으로) 변화하고, 이어서 더 낮은 값 (예컨대 약 0 내지 약 0.1 mL/분)으로 감소하고, 바람직하게는 교차 유량 프로파일은 (i) 분획화 단계 이전에 있는 제1 추가 단계로서, 상기 제1 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 시작되는 동일한 교차 낮은 속도(예컨대 약 1 내지 약 4 mL/분)인 단계(제1 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 30분, 예컨대 약 6분 내지 약 25분, 약 7분 내지 약 20분, 또는 약 8분 내지 약 15분, 또는 약 10분 내지 약 12분, 또는 약 5분 또는 약 10분 또는 약 12분의 범위일 수 있음); (ii) 분획화 단계 이후의 제2 추가 단계로서, 상기 제2 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 끝나는 동일한 교차 낮은 속도(예컨대 약 0.01 내지 0.1 mL/분)인 단계(제2 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 30분의 범위일 수 있음); 및 선택적으로 (iii) 제2 추가 단계 이후의 제3 추가 단계로서, 상기 제3 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 제2 추가 단계(예를 들어, 제3 추가 단계의 교차 유량은 0임)의 교차 유량과 다른 단계(제3 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 30분, 예컨대 약 6분 내지 약 25분, 약 7분 내지 약 20분, 또는 약 8분 내지 약 15분, 또는 약 10분 내지 약 12분, 또는 약 5분 또는 약 10분 또는 약 12분의 범위일 수 있음)을 포함할 수 있다. 이러한 교차 유량 프로파일의 바람직한 예는 다음과 같다: 10분 동안 1.0 내지 2.0 mL/분, 30분 이내에 1.0 내지 2.0 mL/분에서 0.01 내지 0.07 mL/분의 지수 구배; 30분 동안 0.01 내지 0.07 mL/분; 및 10분 동안 0 mL/분.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 샘플 조성물에 포함된 핵산(특히 RNA)의 무결성은 대조 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 사용하여 계산된다.
제1 양태의 이러한 구현예의 제1 특정 예에서, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 핵산 (특히 RNA)를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호, 형광 신호 및 굴절률(RI) 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하는 단계;
(c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 하나의 하나의 UV, 형광, 또는 RI 피크의 최대 높이로부터 UV, 형광, 또는 RI 피크의 말단까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)을 수득하는 단계.
(c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 상기 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
(c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 핵산 (특히 RNA) (I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제1 예에서, 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1) 단계(b)에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV, 형광, 또는 RI 피크에 상응하는 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 마지막까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
(c2) 단계(b)에서 수득한 UV, 형광 또는 RI 신호를 상기 단계(c1)에서 사용된 UV, 형광 또는 RI 피크의 총 면적으로 계산하여 A100%(샘플)를 수득하는 단계;
(c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
(c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
제2 양태의 이러한 구현예의 제1 특정 예에서, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 핵산 (특히 RNA)를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b") 단계(a")에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하는 단계; 및
(c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 하나의 UV, 형광, 또는 RI 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제2 예에서, 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1') 단계(b)에서 얻어진 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV, 형광, 또는 RI 피크에 상응하는 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 높이 (H(샘플))를 결정하는 단계; 및
(c2') H(샘플)과 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
제1 양태의 이 구현예의 제3 특정 예(제1 양태의 제1 하위군과 관련됨)에서, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 핵산 (특히 RNA)를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계;
(c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 최대 높이에서 UV 피크 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)를 수득하는 단계;
(c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
(c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 핵산 (특히 RNA) (I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제3 예에서, 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1) 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV 피크의 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
(c2) 단계(b)에서 수득한 샘플 UV 신호로부터 단계(c1)에서 사용된 샘플 UV 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(샘플)를 수득하는 단계;
(c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
(c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
제1 양태의 이 구현예의 제4 특정 예(제1 양태의 제1 하위군과 관련됨)에서, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 핵산 (특히 RNA)를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b") 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계; 및
(c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제4 예에서, 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1') 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 높이(H(샘플))를 결정하는 단계; 및
(c2') H(샘플)과 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
제1 양태의 이 구현예의 제5 특정 예(제1 양태의 제2 하위군과 관련됨)에서, 대조 RNA의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a') 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하는 단계;
(c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 하나의 하나의 UV, 형광, 또는 RI 피크의 최대 높이로부터 UV, 형광, 또는 RI 피크의 말단까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)을 수득하는 단계.
(c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 상기 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
(c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 RNA(I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제5 예에서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1) 단계(b)에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV, 형광, 또는 RI 피크에 상응하는 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 마지막까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
(c2) 단계(b)에서 수득한 UV, 형광 또는 RI 신호를 상기 단계(c1)에서 사용된 UV, 형광 또는 RI 피크의 총 면적으로 계산하여 A100%(샘플)를 수득하는 단계;
(c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
(c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
제1 양태의 이 구현예의 제6 특정 예(제1 양태의 제2 하위군과 관련됨)에서, 대조 RNA의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b") 단계(a")에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하는 단계; 및
(c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 하나의 UV, 형광, 또는 RI 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제6 예에서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1') 단계(b)에서 얻어진 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV, 형광, 또는 RI 피크에 상응하는 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 높이 (H(샘플))를 결정하는 단계; 및
(c2') H(샘플) 및 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
제1 양태의 이 구현예의 제7 특정 예(제1 양태의 제3 하위군과 관련됨)에서, 대조 RNA의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a') 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계;
(c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 최대 높이에서 UV 피크 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)를 수득하는 단계;
(c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
(c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 RNA(I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제7 예에서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1) 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV 피크의 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
(c2) 단계(b)에서 수득한 샘플 UV 신호로부터 단계(c1)에서 사용된 샘플 UV 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(샘플)를 수득하는 단계;
(c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
(c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
제1 양태의 이 구현예의 제8 특정 예(제1 양태의 제3 하위군과 관련됨)에서, 대조 RNA의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b") 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계; 및
(c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제8 예에서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1') 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 높이(H(샘플))를 결정하는 단계; 및
(c2') H(샘플) 및 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산(특히 RNA)의 양은 (i) 핵산 소광 계수(특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선(특히 RNA 보정 곡선)를 사용하여 결정된다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 샘플 조성물은 핵산 (특히 RNA) 및 입자, 예컨대 리포플렉스 입자 및/또는 지질 나노입자 및/또는 폴리플렉스 입자 및/또는 리포폴리플렉스 입자 및/또는 바이러스 유사 입자를 포함하고, 이에 핵산 (특히 RNA)이 결합된다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 총 핵산의 양(특히 총 RNA의 양)은 (i) 샘플 조성물의 적어도 일부를 방출제로 처리하고; (ii) 단계(i)에서 수득한 적어도 일부로 단계(a) 내지 (c)를 수행하고; 그리고 (iii) (i) 핵산 소광 계수(특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) (예를 들어, (i) 핵산 소광 계수 (특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선 (특히 RNA 보정 곡선)을 사용하여) 본 명세서에 명시된 핵산 (특히 RNA)의 양을 결정함으로써 결정된다. 이 구현예에서, 제1 양태의 방법의 단계(a)에서, 필드-유동-분획화는 바람직하게는 방출제를 함유하는 액상을 사용하여 수행된다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 방출제는 (i) 계면활성제, 예컨대 음이온성 계면활성제 (예를 들어, 나트륨 도데실설페이트), 쯔비터이온성 계면활성제 (예를 들어, n-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트 (Zwittergent® 3-14)), 양이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, 또는 그의 혼합물; (ii) 알코올, 예컨대 지방족 알코올 (예를 들어, 에탄올), 또는 알코올의 혼합물; 또는 (iii) (i)과 (ii)의 조합이다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 유리 핵산(특히 RNA)의 양은 결정된 특히 임의의 방출제의 부재에서 방출제의 첨가 없이 단계들 (a) 내지 (c)을 수행하고; 및 (예를 들어, (i) 핵산 소광 계수 (특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선 (특히 RNA 보정 곡선)을 사용하여) 본 명세서에 명시된 핵산 (특히 RNA)의 양을 결정함으로써 결정된다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 입자에 결합된 핵산(특히 RNA)의 양은 본 (예를 들어, (i) 샘플 조성물의 적어도 일부를 방출제로 처리하고; (ii) 단계들 (a) 내지 (c)를 단계(i)로부터 수득된 적어도 일부로 수행하고; 그리고 (iii) (예를 들어, (i) 핵산 소광 계수 (특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선 (특히 RNA 보정 곡선)을 사용하여) 본 명세서에 명시된 핵산 (특히 RNA)의 양을 결정함으로써) 명세서에서 결정된 총 핵산 (특히 RNA)의 양으로부터 (예를 들어, 특히 임의의 방출제의 부재에서 방출제의 첨가 없이 단계들 (a) 내지 (c)을 수행하고; 그리고 (예를 들어, (i) 핵산 소광 계수 (특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선 (특히 RNA 보정 곡선)을 사용하여) 본 명세서에 명시된 핵산 (특히 RNA)의 양을 결정함으로써) 본 명세서에서 결정된 유리 핵산 (특히 RNA)의 양을 빼서 결정된다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 LS 신호, 예컨대 동적 광산란 (DLS) 신호 및/또는 정적 광산란 (SLS), 예를 들어, 다중각 광산란 (MALS), 신호를 측정하는 것을 추가로 포함한다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기는 단계(b)에서 수득한 LS 신호로부터 회전 반경 (Rg) 값 및/또는 유체역학적 반경 (Rh) 값을 계산함으로써 결정된다. 제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 동적 광산란 (DLS) 신호를 측정하는 것을 포함하고, 그리고 단계(c)는 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산하는 것을 포함한다. 제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 정적 광산란 (SLS), 예를 들어, MALS, 신호를 측정하는 것을 포함하고, 그리고 단계(c)는 단계(c)는 SLS 신호로부터 Rh 값을 계산하는 것을 포함한다. 제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 동적 광산란 (DLS) 신호 및 정적 광산란 (SLS), 예를 들어, MALS, 신호를 측정하는 것을 포함하고, 그리고 단계(c)는 단계(c)는 Rg 및 Rh 값을 계산하는 것을 포함한다. 이 후자의 구현예는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기에 대한 2개의 데이터 세트에 대한 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 하나 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나를 생성한다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포는 (예를 들어, 단계(b)로부터 수득한 SLS 신호로부터 Rg 값을 계산함으로써 또는 단계(b)로부터 수득한 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산함으로써) 본 명세서에 명시된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 플롯팅함으로써 결정된다. (제1 양태의 제1 하위군과 관련된) 이 구현예의 제1 예에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포는 (예를 들어, 단계(b)로부터 수득한 SLS 신호로부터 Rg 값을 계산함으로써 또는 단계(b)로부터 수득한 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산함으로써) 본 명세서에 명시된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)로부터 수득한 UV 신호를 플롯팅함으로써 결정된다. (제1 양태의 제2 하위군과 관련된) 이 구현예의 제2 예에서, RNA 함유 입자의 크기 분포는 (예를 들어, 단계(b)로부터 수득한 SLS 신호로부터 Rg 값을 계산함으로써 또는 단계(b)로부터 수득한 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산함으로써) 본 명세서에 명시된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 플롯팅함으로써 결정된다. (제1 양태의 제3 하위군과 관련된) 이 구현예의 제3 예에서, RNA 함유 입자의 크기 분포는 (예를 들어, 단계(b)로부터 수득한 SLS 신호로부터 Rg 값을 계산함으로써 또는 단계(b)로부터 수득한 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산함으로써) 본 명세서에 명시된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)로부터 수득한 UV 신호를 플롯팅함으로써 결정된다. 상기 제1, 제2 및 제3 예 각각에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포는 Rg 값, Rh 값 또는 둘 모두에 기초하여 결정될 수 있다. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 하나의 크기 분포 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나의 크기 분포를 생성한다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 Rg 또는 Rh 값에 대해 UV, 형광, 또는 RI 신호를 누적 중량 분율 및 플롯팅 누적 중량 분율로 변환함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV, 형광, 또는 RI 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산된다. (제1 양태의 제1 하위군과 관련된) 이 구현예의 제1 예에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV, 형광, 또는 RI 신호를 누적 중량 분율로 변환시키고, Rg 또는 Rh 값에 대해 누적 중량 분획을 플롯팅함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산된다. (제1 양태의 제2 하위군과 관련된) 이 구현예의 제2 예에서, RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 Rg 또는 Rh 값에 대해 UV, 형광, 또는 RI 신호를 누적 중량 분율 및 플롯팅 누적 중량 분율로 변환함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV, 형광, 또는 RI 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산된다. (제1 양태의 제3 하위군과 관련된) 이 구현예의 제3 예에서, RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV, 형광, 또는 RI 신호를 누적 중량 분율로 변환시키고, Rg 또는 Rh 값에 대해 누적 중량 분획을 플롯팅함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산된다. 상기 제1, 제2 및 제3 예 각각에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 Rg 값, Rh 값 또는 둘 모두에 기초하여 결정될 수 있다. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 정량적 하나의 크기 분포 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나의 정량적 크기 분포를 생성한다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 정량적 크기 분포는 (예를 들어, Rg 또는 Rh를 기초로 하는) D10, D50, 및/또는 D90 값을 포함한다. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 D10, D50, 및/또는 D90 값의 하나의 세트 및 Rh 값을 기준으로 하는 D10, D50, 및 또는 D90 값의 하나의 세트를 생성한다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 본 명세서에 명시된 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3개의 파라미터 (추가의 선택적 파라미터 포함), 특히 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3개의 파라미터를 포함하거나 그 파라미터이다: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (특히, 이는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함), 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함). 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 하나 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나를 생성한다. 그러나, 본 발명에 따르면, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포에 대한 이들 2개의 데이터 세트는 (2개의 파라미터가 아닌) 하나의 파라미터로만 간주된다. 또한, 필드-유동 분획화에 의해 수득된 프락토그램이 하나 이상의 입자 피크를 나타내는 경우, 각 입자 피크에 대한 크기 분포의 결정은 하나의 파라미터로만 간주된다 (각 입자 피크에 대한 하나의 파라미터가 아님). Rg 값과 Rh 값을 기준으로 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포를 결정하는 경우에도 마찬가지이다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서, 특히 제1 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함) 및 선택적으로 본 명세서에 명시된 나머지 파라미터 중 적어도 1개의 파라미터, 예컨대 적어도 2개의 파라미터 (추가의 선택적 파라미터 포함); 바람직하게는 이들 남아 있는 파라미터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함). 제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서, 특히 제1 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함) 및 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 파라미터, 예컨대 적어도 2개의 파라미터: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함)를 포함한다. 제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서, 특히 제1 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 및 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양을 포함한다. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 하나 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나를 생성한다. 그러나, 본 발명에 따르면, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포에 대한 이들 2개의 데이터 세트는 (2개의 파라미터가 아닌) 하나의 파라미터로만 간주된다. 또한, 필드-유동 분획화에 의해 수득된 프락토그램이 하나 이상의 입자 피크를 나타내는 경우, 각 입자 피크에 대한 정량적 크기 분포의 결정은 하나의 파라미터로만 간주된다 (각 입자 피크에 대한 하나의 파라미터가 아님). Rg 값과 Rh 값을 기준으로 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포를 결정하는 경우에도 마찬가지이다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산(특히 RNA), 특히 유리 핵산(특히 RNA)의 양은 예를 들어, 260 nm 내지 280 nm 범위의 파장에서, 예컨대 260 nm 또는 280 nm의 파장에서 UV 신호를 측정하고 상응하는 파장 (예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)에서 핵산 (특히 RNA) 소광 계수를 사용함으로써 결정된다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서, 특히 제1 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함) 및/또는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함)는 10 내지 2000 nm의 범위, 바람직하게는 20 내지 1500 nm, 예컨대 30 내지 1200 nm, 40 내지 1100 nm, 50 내지 1000, 60 내지 900 nm, 70 내지 800 nm, 80 내지 700 nm, 90 내지 600 nm, 또는 100 내지 500 nm의 범위, 또는 예컨대 10 내지 1000 nm, 15 내지 500 nm, 20 내지 450 nm, 25 내지 400 nm, 30 내지 350 nm, 40 내지 300 nm, 또는 50 내지 250 nm의 범위 내이다. 제1 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서, (정량적) RNA 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함)는 10 내지 1000 nm의 범위, 예컨대 15 내지 500 nm, 20 내지 450 nm, 25 내지 400 nm, 30 내지 350 nm, 40 내지 300 nm, 또는 50 내지 250 nm의 범위 내이다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산(특히 RNA)은 10 내지 15,000개의 뉴클레오타이드, 예컨대 40 내지 15,000개의 뉴클레오타이드, 100 내지 12,000개의 뉴클레오타이드 또는 200 내지 10,000개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1 하위군의 일 구현예에서), 핵산은 RNA이다. 이 구현예 및 제1 양태의 제2 또는 제3 하위군의 구현예에서, RNA는 바람직하게는 mRNA 또는 시험관내 전사된 RNA, 특히 시험관내 전사된 mRNA이다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호, 선택적으로 LS 신호, 예컨대 SLS, 예를 들어, MALS, 신호 및/또는 DLS 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호의 측정은, 온라인으로 수행되고/거나 단계(c)는 온라인으로 수행된다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 단계(a) 내지 (c)의 한 주기에서 결정된다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 샘플 조성물의 적어도 일부에 대해 필드-유동 분획화를 수행하기 전에, 샘플 조성물의 적어도 일부는 용매 또는 용매 혼합물로 희석되며, 상기 용매 또는 용매 혼합물은 입자의 응집체 형성을 방지할 수 있다. 일 구현예에서, 용매 혼합물은 물과 유기 용매, 예를 들어 포름아미드의 혼합물이다.
제1 양태의 일 구현예에서 (특히, 제1 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), UV 신호의 측정은 원형 2색성(CD) 분광법을 사용하여 수행된다.
제2 양태에서, 본 개시내용은 핵산 (예컨대 RNA) 및 선택적으로 입자를 포함하는 조성물을 제공할 때, 하나 이상의 반응 조건을 변경하는 효과를 분석하는 방법을 제공하고 상기 다음의 단계들을 포함한다:
(A) 핵산 (예컨대 RNA) 및 선택적으로 입자를 포함하는 제1 조성물을 제공하는 단계;
(B) 핵산 (예컨대 RNA) 및 선택적으로 입자를 포함하는 제2 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 제2 조성물의 제공은 하나 이상의 반응 조건에서만 제1 조성물의 제공과 상이한 것인 단계;
(C) 제1 조성물의 일부를 제1 양태의 방법에 적용하여, 제1 조성물의 하나 이상의 파라미터를 결정하는 단계;
(D) 제2 조성물의 상응하는 부분을 단계(C)에서 사용된 방법에 적용하여, 제2 조성물의 하나 이상의 파라미터를 결정하는 단계; 및
(E) 단계(C)에서 수득한 제1 조성물의 하나 이상의 파라미터를 단계(D)에서 수득한 제2 조성물의 상응하는 하나 이상의 파라미터와 비교하는 단계.
제2 양태의 일 구현예에서, 1개 이상의 파라미터는 핵산 (예컨대 RNA) 무결성, 핵산 (예컨대 RNA)의 총량, 유리 핵산 (예컨대 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기 (특히, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함), 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함)을 포함한다. 일반적으로, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포는 각각 그의 크기의 함수로서 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 수, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 몰량, 또는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 질량으로서 주어질 수 있다. 추가적인 선택적 파라미터는 핵산 (특히 RNA)의 분자량, 표면 핵산의 양 (예컨대 표면 RNA의 양), 캡슐화된 핵산의 양 (예컨대 캡슐화된 RNA의 양), 접근 가능한 핵산의 양 (예컨대 접근 가능한 RNA의 양), 핵산 (특히 RNA)의 크기 (특히, 핵산 (특히 RNA)의 Rg 및/또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA)의 Rg 및/또는 Rh 값을 기준으로 함), 정량적 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA)의 Rg 및/또는 Rh 값을 기준으로 함), 형상 계수, 형태 계수, 및 핵산 (예컨대 RNA) 캡슐화 효율을 포함한다. 일반적으로, 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포는 각각 그의 크기의 함수로서 핵산 (특히 RNA) 분자의 수, 핵산 (특히 RNA)의 몰량, 또는 핵산 (특히 RNA)의 질량으로서 주어질 수 있다. 또한, 추가의 선택적 파라미터는 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양 대 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 총량의 비율을 포함하고, 상기 비율은 입자 크기의 함수; 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양의 비로서 주어질 수 있고, 상기 비율은 입자 크기의 함수; 및 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 음으로 하전된 모이어티의 양의 전하 비율로서 주어질 수 있고, 상기 전하 비율은 통상적으로 N/P 비로 나타내고 입자 크기의 함수로서 주어질 수 있다.
제2 양태의 일 구현예에서, 1개 이상의 파라미터는 본 명세서에 명시된 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3개의 파라미터 (추가의 선택적 파라미터 포함), 특히 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3개의 파라미터를 포함하거나 그 파라미터이다: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자)의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자)의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (특히 RNA)의 분자량. 제2 양태의 일 구현예에서, 1개 이상의 파라미터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3개의 파라미터를 포함하거나 그 파라미터이다: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA)의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA)의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함).
제2 양태의 일 구현예에서, 단계(C) 및 (D)에서 사용되는 제1 양태의 방법은 다음을 포함하는 방법이다:
(a) 조성물의 적어도 일부(예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)를 필드-유동 분획화에 적용함으로써, 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 조성물 분획을 생성하는 단계;
(b) UV 신호, 형광 신호 및 굴절률(RI) 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하고, 선택적으로 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 조성물 분획 중 적어도 하나의 광산란 (LS) 신호를 측정하는 단계; 및
(c) UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호로부터, 그리고 선택적으로 LS 신호로부터, 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계.
제2 양태의 제1 하위군에서, 단계(C) 및 (D)에서 사용되는 제1 양태의 방법은 다음을 포함하는 방법이다:
(a) 조성물의 적어도 일부(예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)를 필드-유동 분획화에 적용함으로써, 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 분획을 생성하는 단계;
(b) 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 분획 중 적어도 하나의 적어도 하나의 UV 신호, 및 선택적으로 광산란(LS) 신호를 측정하는 단계; 및
(c) UV 신호 및 선택적으로 LS 신호로부터 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계.
제2 양태의 제2 및 바람직한 하위군에서, 단계(C) 및 (D)에서 사용된 제1 양태의 방법은 샘플 조성물 (예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)의 1개 이상의 파라미터를 결정하기 위한 방법이고 상기 샘플 조성물은 RNA 및 선택적으로 입자를 포함하고, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여, 샘플 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 샘플 분획을 생성하는 단계;
(b) UV 신호, 형광 신호 및 굴절률(RI) 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하고, 선택적으로 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 광산란 (LS) 신호를 측정하는 단계; 및
(c) UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호로부터, 그리고 선택적으로 LS 신호로부터, 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계.
제2 양태의 제3 및 더 바람직한 하위군에서, 단계(C) 및 (D)에서 사용된 제1 양태의 방법은 샘플 조성물 (예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)의 1개 이상의 파라미터를 결정하기 위한 방법이고 상기 샘플 조성물은 RNA 및 선택적으로 입자를 포함하고, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여, 샘플 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 샘플 분획을 생성하는 단계;
(b) 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 적어도 하나의 UV 신호, 및 선택적으로 광산란(LS) 신호를 측정하는 단계; 및
(c) UV 신호 및 선택적으로 LS 신호로부터 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 값을 기준으로 계산된다. 제2 양태의 또 다른 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 또 다른 구현예에서), 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rh 값을 기준으로 계산된다. 제2 양태의 또 다른 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 또 다른 구현예에서), 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 값을 기준으로 하고 별도로 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rh 값을 기준으로 계산된다 (즉, 이 구현예는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포에 대한 2개의 데이터 세트를 생성하고, 하나는 Rg 값을 기준으로 하고 하나는 Rh 값을 기준으로 함).
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포를 포함하고, 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA)의 Rg 값을 기준으로 계산된다. 제2 양태의 또 다른 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 또 다른 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포를 포함하고, 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA)의 Rh 값을 기준으로 계산된다. 제2 양태의 또 다른 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 또 다른 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포를 포함하고, 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA)의 Rg 값을 기준으로 하고 별도로 핵산 (예컨대 RNA)의 Rh 값을 기준으로 계산된다 (즉, 이 구현예는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포에 대한 2개의 데이터 세트를 생성하고, 하나는 Rg 값을 기준으로 하고 하나는 Rh 값의 값을 기준으로 함).
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (특히 RNA) 무결성, 핵산 (특히 RNA)의 총량, 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 (특히, 이는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 선택적으로 핵산 (특히 RNA)의 분자량을 포함한다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3개의 파라미터를 포함하거나 그 파라미터이다: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (특히 RNA)의 분자량 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서, 1개 이상의 파라미터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3개의 파라미터를 포함하거나 그 파라미터이다: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함) 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 하나 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나를 생성한다. 그러나, 본 발명에 따르면, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포에 대한 이들 2개의 데이터 세트는 (2개의 파라미터가 아닌) 하나의 파라미터로만 간주된다. 또한, 필드-유동 분획화에 의해 수득된 프락토그램이 하나 이상의 입자 피크를 나타내는 경우, 각 입자 피크에 대한 크기 분포의 결정은 하나의 파라미터로만 간주된다 (각 입자 피크에 대한 하나의 파라미터가 아님). Rg 값과 Rh 값을 기준으로 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포를 결정하는 경우에도 마찬가지이다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서, 특히 제2 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함) 및 선택적으로 본 명세서에 명시된 나머지 파라미터 중 적어도 1개의 파라미터, 예컨대 적어도 2개의 파라미터 (추가의 선택적 파라미터 포함); 바람직하게는 이들 남아 있는 파라미터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함). 제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서, 특히 제2 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함) 및 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 파라미터, 예컨대 적어도 2개의 파라미터: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함)를 포함한다. 제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서, 특히 제2 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 및 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양을 포함한다. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 하나 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나를 생성한다. 그러나, 본 발명에 따르면, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포에 대한 이들 2개의 데이터 세트는 (2개의 파라미터가 아닌) 하나의 파라미터로만 간주된다. 또한, 필드-유동 분획화에 의해 수득된 프락토그램이 하나 이상의 입자 피크를 나타내는 경우, 각 입자 피크에 대한 정량적 크기 분포의 결정은 하나의 파라미터로만 간주된다 (각 입자 피크에 대한 하나의 파라미터가 아님). Rg 값과 Rh 값을 기준으로 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포를 결정하는 경우에도 마찬가지이다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 단계(a) 내지 (c)의 한 주기에서 결정된다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2, 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 하나 이상의 반응 조건은 다음 중 임의의 것을 포함한다: 염 농도/이온 강도; 온도; pH 또는 완충액 농도; 광/방사선; 산소; 전단력; 압력; 동결/해동 주기; 건조/재구성 주기; 부형제(들) (예를 들어, 안정화제 및/또는 킬레이트화제)의 첨가; 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 유형 및/또는 공급원; 전하 비율; 물리적 상태; 및 핵산 (특히 RNA) 대 입자 형성 화합물 (특히 입자를 구성하는 지질 및/또는 중합체)의 비. 예시적인 염 농도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mM의 염, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mM의 NaCl을 포함한다. 예시적인 온도 조건은 저온 (예를 들어, -20℃), 주위 또는 실온, 중간 온도(예를 들어, 30℃) 또는 고온(예를 들어, 50℃)을 포함한다. 입자 형성 화합물의 유형 및/또는 공급원에 관한 예시적인 조건은 양이온성 지질 대 양이온성 중합체, 양이온성 지질 대 쯔비터이온성 지질, 또는 페길화된 지질 대 비페길화된 지질이다. 핵산(특히 RNA) 입자에서 양전하 대 음전하의 예시적인 전하 비율은 약 6:1 내지 약 1:2, 예컨대 약 5:1 내지 약 1.2:2, 약 4:1 내지 약 1.4:2, 약 3:1 내지 약 1.6:2, 약 2:1 내지 약 1.8:2, 또는 약 1.6:1 내지 약 1:1이다. 핵산(특히 RNA) 대 입자 형성 화합물(특히 입자를 구성하는 지질 및/또는 중합체)의 예시적인 비율은 약 1:100 내지 약 10:1 (w/w) 범위의 핵산 (특히 RNA) 대 총 지질의 비율을 포함한다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 필드-유동 분획화는 바람직하게는 유동 필드-필드 분획화, 예컨대 비대칭 유동 필드-필드 분획화 (AF4) 또는 중공 섬유 유동 필드-필드 분획화 (HF5)이다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(a)는 핵산 (특히 RNA)이 멤브레인을 투과하는 것을 방지하는 데 적합한 분자량 (MW) 컷-오프를 갖는 멤브레인, 바람직하게는 2 kDa 내지 30 kDa 범위의 MW 컷-오프, 예컨대 10 kDa의 MW 컷-오프를 갖는 멤브레인을 사용하여 수행된다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(a)는 폴리에테르설폰(PES) 또는 재생 셀룰로오스 멤브레인을 사용하여 수행된다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(a)는 (I) 최대 8 mL/분, 바람직하게는 최대 4 mL/분, 더 바람직하게는 최대 2 mL/분의 교차 유량, 예를 들어, 교차 유량 프로파일; 및/또는 (II) 0.05 내지 0.35 mL/분 범위, 바람직하게는 0.10 내지 0.30 mL/분 범위, 더 바람직하게는 0.15 내지 0.25 mL/분 범위의 주입 흐름; 및/또는 (III) 0.30 내지 0.70 mL/분 범위, 바람직하게는 0.40 내지 0.60 mL/분 범위, 더 바람직하게는 0.45 내지 0.55 mL/분 범위의 검출기 유동을 사용하여 수행된다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 교차 유량 프로파일은 바람직하게는 조성물 (예컨대 대조 또는 샘플 조성물, 특히 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)에 함유된 성분을 이들의 크기별로 분획/분리하여 하나 이상의 조성물 분획을 생성하는 분획화 단계를 함유한다. 바람직하게는, 교차 유량은 이러한 분획화 단계 동안 변화하고 (예를 들어, 하나의 값 (예컨대 약 1 내지 약 4 mL/분)으로부터 시작하고, 이어서 더 낮은 값(예컨대 약 0 내지 약 0.1 mL/min)으로 감소하거나, 또는 하나의 값(예를 들어 약 O 내지 약 O.1 mL/ 분)으로부터 시작하여 더 높은 값(예, 약 1 또는 약 4 mL/분으로 증가함); 여기서 변화는 임의의 수단, 예를 들어 연속 (예컨대 선형 또는 지수) 변화 또는 단계적 변화에 의해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 교차 유량 프로파일은 분획화 단계를 포함하며, 여기서 교차 유량은 하나의 값(예를 들어, 약 1 내지 약 4 mL/분)으로부터 시작하여 연속적으로(바람직하게는 기하급수적으로) 변화하고, 이어서 더 낮은 값 (예컨대 약 0 내지 약 0.1 mL/분)으로 감소한다. 분획화 단계는 예를 들어, 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 30분 동안 조성물에 함유된 성분을 그의 크기로 분획/분리하기에 적합한 임의의 길이를 가질 수 있다. 교차 유량 프로파일은 분획화 단계 전 및/또는 후에 있을 수 있고(예를 들어, 분획화 단계 전에 1개 및 분획화 단계 후에 1개, 2개, 또는 3개), 조성물에 함유된 비-핵산(특히 비-RNA) 성분(예를 들면, 단백질, 폴리펩타이드, 모노뉴클레오타이드 등)을 조성물 중에 함유된 핵산(특히 RNA)으로부터 분리하고, 조성물에 포함된 핵산(특별히 RNA)에 초점을 맞추고/거나 필드-유동 분획화 디바이스를 재생하도록(예컨대, 디바이스의 멤브레인에 결합된 모든 성분을 제거하기 위해) 작용할 수 있는 추가의 단계(예를 들면, 1개 또는 2개)을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 이들 추가 단계의 교차 유량은 각각의 추가 단계에 대해 일정하고, 각각의 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분 (예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 30분)의 범위에서 추가 단계에 대해 서로 독립적이다. 예를 들어, 교차 유량 프로파일은 (i) 분획화 단계 이전에 있는 제1 추가 단계로서, 상기 제1 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 시작되는 동일한 교차 낮은 비율인 단계(제1 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 10분 또는 약 20분 또는 약 30분의 범위일 수 있음); (ii) 분획화 단계 이후의 제2 추가 단계로서, 상기 제2 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 끝나는 동일한 교차 낮은 속도인 단계(제2 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 10분 또는 약 20분 또는 약 30분의 범위일 수 있음); 및 선택적으로 (iii) 제2 추가 단계 이후의 제3 추가 단계로서, 상기 제3 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 제2 추가 단계의 교차 유량과 다른 단계(제3 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 10분 또는 약 20분 또는 약 30분의 범위일 수 있음)을 포함할 수 있다. 교차 유량 프로파일이 분획화 단계를 포함하는 구현예에서, 교차 유량은 하나의 값(예를 들어, 약 1 내지 약 4 mL/분)으로부터 시작하여 연속적으로(바람직하게는 기하급수적으로) 변화하고, 이어서 더 낮은 값 (예컨대 약 0 내지 약 0.1 mL/분)으로 감소하고, 바람직하게는 교차 유량 프로파일은 (i) 분획화 단계 이전에 있는 제1 추가 단계로서, 상기 제1 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 시작되는 동일한 교차 낮은 속도(예컨대 약 1 내지 약 4 mL/분)인 단계(제1 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 30분, 예컨대 약 6분 내지 약 25분, 약 7분 내지 약 20분, 또는 약 8분 내지 약 15분, 또는 약 10분 내지 약 12분, 또는 약 5분 또는 약 10분 또는 약 12분의 범위일 수 있음); (ii) 분획화 단계 이후의 제2 추가 단계로서, 상기 제2 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 끝나는 동일한 교차 낮은 속도(예컨대 약 0.01 내지 0.1 mL/분)인 단계(제2 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 30분의 범위일 수 있음); 및 선택적으로 (iii) 제2 추가 단계 이후의 제3 추가 단계로서, 상기 제3 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 제2 추가 단계(예를 들어, 제3 추가 단계의 교차 유량은 0임)의 교차 유량과 다른 단계(제3 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 30분, 예컨대 약 6분 내지 약 25분, 약 7분 내지 약 20분, 또는 약 8분 내지 약 15분, 또는 약 10분 내지 약 12분, 또는 약 5분 또는 약 10분 또는 약 12분의 범위일 수 있음)을 포함할 수 있다. 이러한 교차 유량 프로파일의 바람직한 예는 다음과 같다: 10분 동안 1.0 내지 2.0 mL/분, 30분 이내에 1.0 내지 2.0 mL/분에서 0.01 내지 0.07 mL/분의 지수 구배; 30분 동안 0.01 내지 0.07 mL/분; 및 10분 동안 0 mL/분.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 샘플 조성물 (예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성은 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성을 사용하여 계산된다.
제2 양태의 이러한 구현예의 제3 특정 예에서, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 핵산 (특히 RNA)를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호, 형광 신호 및 굴절률(RI) 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하는 단계;
(c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 하나의 하나의 UV, 형광, 또는 RI 피크의 최대 높이로부터 UV, 형광, 또는 RI 피크의 말단까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)을 수득하는 단계.
(c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 상기 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
(c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 핵산 (특히 RNA) (I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
이 제1 예에서, 샘플 조성물 (예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산될 수 있다:
(c1) 단계(b)에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV, 형광, 또는 RI 피크에 상응하는 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 마지막까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
(c2) 단계(b)에서 수득한 UV, 형광 또는 RI 신호를 상기 단계(c1)에서 사용된 UV, 형광 또는 RI 피크의 총 면적으로 계산하여 A100%(샘플)를 수득하는 단계;
(c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
(c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
제2 양태의 이러한 구현예의 제3 특정 예에서, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 핵산 (특히 RNA)를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b") 단계(a")에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하는 단계; 및
(c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 하나의 UV, 형광, 또는 RI 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
이 제2 예에서, 샘플 조성물 (예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산될 수 있다:
(c1') 단계(b)에서 얻어진 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV, 형광, 또는 RI 피크에 상응하는 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 높이 (H(샘플))를 결정하는 단계; 및
(c2') H(샘플)과 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
제2 양태의 이 구현예의 제3 특정 예(제2 양태의 제1 하위군과 관련됨)에서, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 핵산 (특히 RNA)를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계;
(c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 최대 높이에서 UV 피크 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)를 수득하는 단계;
(c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
(c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 핵산 (특히 RNA) (I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
이 제3 예에서, 샘플 조성물 (예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산될 수 있다:
(c1) 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV 피크의 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
(c2) 단계(b)에서 수득한 샘플 UV 신호로부터 단계(c1)에서 사용된 샘플 UV 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(샘플)를 수득하는 단계;
(c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
(c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
제2 양태의 이 구현예의 제4 특정 예(제2 양태의 제1 하위군과 관련됨)에서, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 핵산 (특히 RNA)를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b") 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계; 및
(c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
이 제4 예에서, 샘플 조성물 (예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산될 수 있다:
(c1') 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 높이(H(샘플))를 결정하는 단계; 및
(c2') H(샘플)과 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
제2 양태의 이 구현예의 제5 특정 예(제2 양태의 제2 하위군과 관련됨)에서, 대조 RNA의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a') 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하는 단계;
(c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 하나의 하나의 UV, 형광, 또는 RI 피크의 최대 높이로부터 UV, 형광, 또는 RI 피크의 말단까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)을 수득하는 단계.
(c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 상기 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
(c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 RNA(I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
이 제5 예에서, 샘플 조성물 (예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)에 함유된 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산될 수 있다:
(c1) 단계(b)에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV, 형광, 또는 RI 피크에 상응하는 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 마지막까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
(c2) 단계(b)에서 수득한 UV, 형광 또는 RI 신호를 상기 단계(c1)에서 사용된 UV, 형광 또는 RI 피크의 총 면적으로 계산하여 A100%(샘플)를 수득하는 단계;
(c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
(c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
제2 양태의 이 구현예의 제6 특정 예(제2 양태의 제2 하위군과 관련됨)에서, 대조 RNA의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b") 단계(a")에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하는 단계; 및
(c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 하나의 UV, 형광, 또는 RI 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
이 제6 예에서, 샘플 조성물 (예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)에 함유된 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산될 수 있다:
(c1') 단계(b)에서 얻어진 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV, 형광, 또는 RI 피크에 상응하는 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 높이 (H(샘플))를 결정하는 단계; 및
(c2') H(샘플) 및 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
제2 양태의 이 구현예의 제7 특정 예(제2 양태의 제3 하위군과 관련됨)에서, 대조 RNA의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a') 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계;
(c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 최대 높이에서 UV 피크 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)를 수득하는 단계;
(c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
(c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 RNA(I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
이 제7 예에서, 샘플 조성물 (예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)에 함유된 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산될 수 있다:
(c1) 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV 피크의 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
(c2) 단계(b)에서 수득한 샘플 UV 신호로부터 단계(c1)에서 사용된 샘플 UV 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(샘플)를 수득하는 단계;
(c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
(c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
제2 양태의 이 구현예의 제8 특정 예(제2 양태의 제3 하위군과 관련됨)에서, 대조 RNA의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b") 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계; 및
(c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
이 제8 예에서, 샘플 조성물 (예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)에 함유된 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산될 수 있다:
(c1') 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 높이(H(샘플))를 결정하는 단계; 및
(c2') H(샘플) 및 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산(특히 RNA)의 양은 (i) 핵산 소광 계수(특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선(특히 RNA 보정 곡선)를 사용하여 결정된다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 샘플 조성물 (예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)는 핵산 (특히 RNA) 및 입자, 예컨대 리포플렉스 입자 및/또는 지질 나노입자 및/또는 폴리플렉스 입자 및/또는 리포폴리플렉스 입자 및/또는 바이러스 유사 입자를 포함하고, 이에 핵산 (특히 RNA)이 결합된다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 총 핵산의 양(특히 총 RNA의 양)은 (i) 샘플 조성물의 적어도 일부 (예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)를 방출제로 처리하고; (ii) 단계들 (a) 내지 (c)를 단계(i)로부터 수득된 적어도 일부로 수행하고; 그리고 (iii) (예를 들어, (i) 핵산 소광 계수 (특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선 (특히 RNA 보정 곡선)을 사용하여) 본 명세서에 명시된 핵산 (특히 RNA)의 양을 결정함으로써 결정된다. 이 구현예에서, 제2 양태의 방법의 단계(a)에서, 필드-유동-분획화는 바람직하게는 방출제를 함유하는 액상을 사용하여 수행된다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 방출제는 (i) 계면활성제, 예컨대 음이온성 계면활성제 (예를 들어, 나트륨 도데실설페이트), 쯔비터이온성 계면활성제 (예를 들어, n-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트 (Zwittergent® 3-14)), 양이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, 또는 그의 혼합물; (ii) 알코올, 예컨대 지방족 알코올 (예를 들어, 에탄올), 또는 알코올의 혼합물; 또는 (iii) (i)과 (ii)의 조합이다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 유리 핵산(특히 RNA)의 양은 결정된 특히 임의의 방출제의 부재에서 방출제의 첨가 없이 단계들 (a) 내지 (c)을 수행하고; 및 (예를 들어, (i) 핵산 소광 계수 (특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선 (특히 RNA 보정 곡선)을 사용하여) 본 명세서에 명시된 핵산 (특히 RNA)의 양을 결정함으로써 결정된다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 입자에 결합된 핵산(특히 RNA)의 양은 본 (예를 들어, (i) 샘플 조성물(예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)의 적어도 일부를 방출제로 처리하고; (ii) 단계들 (a) 내지 (c)를 단계(i)로부터 수득된 적어도 일부로 수행하고; 그리고 (iii) (예를 들어, (i) 핵산 소광 계수 (특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선 (특히 RNA 보정 곡선)을 사용하여) 본 명세서에 명시된 핵산 (특히 RNA)의 양을 결정함으로써) 명세서에서 결정된 총 핵산 (특히 RNA)의 양으로부터 (예를 들어, 특히 임의의 방출제의 부재에서 방출제의 첨가 없이 단계들 (a) 내지 (c)을 수행하고; 그리고 (예를 들어, (i) 핵산 소광 계수 (특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선 (특히 RNA 보정 곡선)을 사용하여) 본 명세서에 명시된 핵산 (특히 RNA)의 양을 결정함으로써) 본 명세서에서 결정된 유리 핵산 (특히 RNA)의 양을 빼서 결정된다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 LS 신호, 예컨대 동적 광산란 (DLS) 및/또는 정적 광산란 (SLS), 예를 들어, 다중각 광산란 (MALS), 신호를 측정하는 것을 추가로 포함한다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기는 단계(b)에서 수득한 LS 신호로부터 회전 반경 (Rg) 값 및/또는 유체역학적 반경 (Rh) 값을 계산함으로써 결정된다. 제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 동적 광산란 (DLS) 신호를 측정하는 것을 포함하고, 그리고 단계(c)는 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산하는 것을 포함한다. 제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(b)는 정적 광산란(SLS), 예를 들어 MALS, 적어도 하나의 신호를 측정하는 것을 포함한다. 단계(a)로부터 획득된 하나 이상의 샘플 분획 중 하나이고, 단계(c)는 SLS 신호로부터 Rg 값을 계산하는 단계를 포함한다. 제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 동적 광산란 (DLS) 신호 및 정적 광산란 (SLS), 예를 들어, MALS, 신호를 측정하는 것을 포함하고, 그리고 단계(c)는 단계(c)는 Rg 및 Rh 값을 계산하는 것을 포함한다. 이 후자의 구현예는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기에 대한 2개의 데이터 세트에 대한 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 하나 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나를 생성한다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포는 (예를 들어, 단계(b)로부터 수득한 SLS 신호로부터 Rg 값을 계산함으로써 또는 단계(b)로부터 수득한 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산함으로써) 본 명세서에 명시된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 플롯팅함으로써 결정된다. (제2 양태의 제1 하위군과 관련된) 이 구현예의 제1 예에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포는 (예를 들어, 단계(b)로부터 수득한 SLS 신호로부터 Rg 값을 계산함으로써 또는 단계(b)로부터 수득한 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산함으로써) 본 명세서에 명시된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)로부터 수득한 UV 신호를 플롯팅함으로써 결정된다. (제2 양태의 제2 하위군과 관련된) 이 구현예의 제2 예에서, RNA 함유 입자의 크기 분포는 (예를 들어, 단계(b)로부터 수득한 SLS 신호로부터 Rg 값을 계산함으로써 또는 단계(b)로부터 수득한 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산함으로써) 본 명세서에 명시된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 플롯팅함으로써 결정된다. (제2 양태의 제3 하위군과 관련된) 이 구현예의 제3 예에서, RNA 함유 입자의 크기 분포는 (예를 들어, 단계(b)로부터 수득한 SLS 신호로부터 Rg 값을 계산함으로써 또는 단계(b)로부터 수득한 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산함으로써) 본 명세서에 명시된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)로부터 수득한 UV 신호를 플롯팅함으로써 결정된다. 상기 제1, 제2 및 제3 예 각각에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포는 Rg 값, Rh 값 또는 둘 모두에 기초하여 결정될 수 있다. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 하나의 크기 분포 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나의 크기 분포를 생성한다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 Rg 또는 Rh 값에 대해 UV, 형광, 또는 RI 신호를 누적 중량 분율 및 플롯팅 누적 중량 분율로 변환함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV, 형광, 또는 RI 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산된다. (제2 양태의 제1 하위군과 관련된) 이 구현예의 제1 예에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV, 형광, 또는 RI 신호를 누적 중량 분율로 변환시키고, Rg 또는 Rh 값에 대해 누적 중량 분획을 플롯팅함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산된다. (제2 양태의 제2 하위군과 관련된) 이 구현예의 제2 예에서, RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 Rg 또는 Rh 값에 대해 UV, 형광, 또는 RI 신호를 누적 중량 분율 및 플롯팅 누적 중량 분율로 변환함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV, 형광, 또는 RI 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산된다. (제2 양태의 제3 하위군과 관련된) 이 구현예의 제3 예에서, RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV, 형광, 또는 RI 신호를 누적 중량 분율로 변환시키고, Rg 또는 Rh 값에 대해 누적 중량 분획을 플롯팅함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산된다. 상기 제1, 제2 및 제3 예 각각에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 Rg 값, Rh 값 또는 둘 모두에 기초하여 결정될 수 있다. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 정량적 하나의 크기 분포 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나의 정량적 크기 분포를 생성한다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 정량적 크기 분포는 D10, D50, 및/또는 D90 값을 포함한다. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 D10, D50, 및/또는 D90 값의 하나의 세트 및 Rh 값을 기준으로 하는 D10, D50, 및 또는 D90 값의 하나의 세트를 생성한다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산(특히 RNA), 특히 유리 핵산(특히 RNA)의 양은 예를 들어, 260 nm 내지 280 nm 범위의 파장에서, 예컨대 260 nm 또는 280 nm의 파장에서 UV 신호를 측정하고 상응하는 파장 (예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)에서 핵산 (특히 RNA) 소광 계수를 사용함으로써 결정된다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서, 특히 제2 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함) 및/또는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함)는 10 내지 2000 nm의 범위, 바람직하게는 20 내지 1500 nm, 예컨대 30 내지 1200 nm, 40 내지 1100 nm, 50 내지 1000, 60 내지 900 nm, 70 내지 800 nm, 80 내지 700 nm, 90 내지 600 nm, 또는 100 내지 500 nm의 범위, 또는 예컨대 10 내지 1000 nm, 15 내지 500 nm, 20 내지 450 nm, 25 내지 400 nm, 30 내지 350 nm, 40 내지 300 nm, 또는 50 내지 250 nm의 범위 내이다. 제2 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서, (정량적) RNA 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함)는 10 내지 1000 nm의 범위, 예컨대 15 내지 500 nm, 20 내지 450 nm, 25 내지 400 nm, 30 내지 350 nm, 40 내지 300 nm, 또는 50 내지 250 nm의 범위 내이다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산(특히 RNA)은 10 내지 15,000개의 뉴클레오타이드, 예컨대 40 내지 15,000개의 뉴클레오타이드, 100 내지 12,000개의 뉴클레오타이드 또는 200 내지 10,000개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1 하위군의 일 구현예에서), 핵산은 RNA이다. 이 구현예 및 제2 양태의 제2 또는 제3 하위군의 구현예에서, RNA는 바람직하게는 mRNA 또는 시험관내 전사된 RNA, 특히 시험관내 전사된 mRNA이다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호, 선택적으로 LS 신호, 예컨대 SLS, 예를 들어, MALS, 신호 및/또는 DLS 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호의 측정은, 온라인으로 수행되고/거나 단계(c)는 온라인으로 수행된다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 샘플 조성물(예를 들어, 단계(C)를 위한 제1 조성물 또는 단계(D)를 위한 제2 조성물)의 적어도 일부에 대해 필드-유동 분획화를 수행하기 전에, 샘플 조성물의 적어도 일부는 용매 또는 용매 혼합물로 희석되며, 상기 용매 또는 용매 혼합물은 입자의 응집체 형성을 방지할 수 있다. 일 구현예에서, 용매 혼합물은 물과 유기 용매, 예를 들어 포름아미드의 혼합물이다.
제2 양태의 일 구현예에서 (특히, 제2 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), UV 신호의 측정은 원형 2색성(CD) 분광법을 사용하여 수행된다.
제1 양태의 맥락에서 본 명세서에 기재된 임의의 구현예는 또한 제2 양태의 임의의 구현예에 적용될 수 있음이 이해된다.
제3 양태에서, 본 개시내용은 핵산 (예컨대 RNA) 및 선택적으로 입자를 포함하는 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하기 위한 필드-유동-분획화의 용도를 제공하고, 1개 이상의 파라미터는 핵산 (예컨대 RNA) 무결성, 핵산 (예컨대 RNA)의 총량, 유리 핵산 (예컨대 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기 (특히, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함), 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함)을 포함한다. 일반적으로, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포는 각각 그의 크기의 함수로서 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 수, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 몰량, 또는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 질량으로서 주어질 수 있다. 추가적인 선택적 파라미터는 핵산 (예컨대 RNA)의 분자량, 표면 핵산의 양 (예컨대 표면 RNA의 양), 캡슐화된 핵산의 양 (예컨대 캡슐화된 RNA의 양), 접근 가능한 핵산의 양 (예컨대 접근 가능한 RNA의 양), 핵산 (특히 RNA)의 크기 (특히, 핵산 (특히 RNA)의 Rg 및/또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 및/또는 Rh 값을 기준으로 함), 정량적 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA)의 Rg 및/또는 Rh 값을 기준으로 함), 형상 계수, 형태 계수, 및 핵산 (예컨대 RNA) 캡슐화 효율을 포함한다. 일반적으로, 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포는 각각 그의 크기의 함수로서 핵산 (특히 RNA) 분자의 수, 핵산 (특히 RNA)의 몰량, 또는 핵산 (특히 RNA)의 질량으로서 주어질 수 있다. 또한, 추가의 선택적 파라미터는 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양 대 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 총량의 비율을 포함하고, 상기 비율은 입자 크기의 함수; 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양의 비로서 주어질 수 있고, 상기 비율은 입자 크기의 함수; 및 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 음으로 하전된 모이어티의 양의 전하 비율로서 주어질 수 있고, 상기 전하 비율은 통상적으로 N/P 비로 나타내고 입자 크기의 함수로서 주어질 수 있다.
제3 양태의 일 구현예에서, 필드-유동 분획화는 다음을 포함한다:
(a) 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여, 샘플 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 샘플 분획을 생성하는 단계;
(b) UV 신호, 형광 신호 및 굴절률(RI) 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호, 및 선택적으로 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 광산란 (LS) 신호를 측정하는 단계; 및
(c) UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호로부터, 그리고 선택적으로 LS 신호로부터, 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계.
제3 양태의 제1 하위군에서 필드-유동 분획화는 다음을 포함한다.
(a) 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여, 샘플 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 샘플 분획을 생성하는 단계;
(b) 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 적어도 하나의 UV 신호, 및 선택적으로 광산란(LS) 신호를 측정하는 단계; 및
(c) UV 신호 및 선택적으로 LS 신호로부터 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계.
제3 양태의 제2 및 바람직한 하위군에서, 용도는 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하기 위한 것이고, 샘플 조성물은 RNA 및 선택적으로 입자를 포함하고, 필드-유동 분획화는 다음을 포함한다:
(a) 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여, 샘플 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 샘플 분획을 생성하는 단계;
(b) UV 신호, 형광 신호 및 굴절률(RI) 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하고, 선택적으로 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 광산란 (LS) 신호를 측정하는 단계; 및
(c) UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호로부터, 그리고 선택적으로 LS 신호로부터, 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계.
제3 양태의 보다 바람직한 제3 하위군에서, 용도는 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하기 위한 것이고, 샘플 조성물은 RNA 및 선택적으로 입자를 포함하고, 필드-유동 분획화는 다음을 포함한다:
(a) 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여, 샘플 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 샘플 분획을 생성하는 단계;
(b) 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 적어도 하나의 UV 신호, 및 선택적으로 광산란(LS) 신호를 측정하는 단계; 및
(c) UV 신호 및 선택적으로 LS 신호로부터 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 값을 기준으로 계산된다. 제3 양태의 또 다른 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 또 다른 구현예에서), 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rh 값을 기준으로 계산된다. 제3 양태의 또 다른 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 또 다른 구현예에서), 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 값을 기준으로 하고 별도로 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rh 값을 기준으로 계산된다 (즉, 이 구현예는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포에 대한 2개의 데이터 세트를 생성하고, 하나는 Rg 값을 기준으로 하고 하나는 Rh 값을 기준으로 함).
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포를 포함하고, 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA)의 Rg 값을 기준으로 계산된다. 제3 양태의 또 다른 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 또 다른 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포를 포함하고, 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA)의 Rh 값을 기준으로 계산된다. 제3 양태의 또 다른 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 또 다른 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포를 포함하고, 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA)의 Rg 값을 기준으로 하고 별도로 핵산 (예컨대 RNA)의 Rh 값을 기준으로 계산된다 (즉, 이 구현예는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포에 대한 2개의 데이터 세트를 생성하고, 하나는 Rg 값을 기준으로 하고 하나는 Rh 값의 값을 기준으로 함).
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 필드-유동 분획화는 유동 필드-필드 분획화, 예컨대 비대칭 유동 필드-필드 분획화 (AF4) 또는 중공 섬유 유동 필드-필드 분획화 (HF5)이다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 필드-유동 분획화는 핵산 (특히 RNA)이 멤브레인을 투과하는 것을 방지하는 데 적합한 분자량 (MW) 컷-오프를 갖는 멤브레인, 바람직하게는 2 kDa 내지 30 kDa 범위의 MW 컷-오프, 예컨대 10 kDa의 MW 컷-오프를 갖는 멤브레인을 사용한다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 필드-유동 분획화는 폴리에테르설폰(PES) 또는 재생 셀룰로오스 멤브레인을 사용한다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(a)는 (I) 최대 8 mL/분, 바람직하게는 최대 4 mL/분, 더 바람직하게는 최대 2 mL/분의 교차 유량, 예를 들어, 교차 유량 프로파일; 및/또는 (II) 0.05 내지 0.35 mL/분 범위, 바람직하게는 0.10 내지 0.30 mL/분 범위, 더 바람직하게는 0.15 내지 0.25 mL/분 범위의 주입 흐름; 및/또는 (III) 0.30 내지 0.70 mL/분 범위, 바람직하게는 0.40 내지 0.60 mL/분 범위, 더 바람직하게는 0.45 내지 0.55 mL/분 범위의 검출기 유동을 사용하여 수행된다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 교차 유량 프로파일은 바람직하게는 대조군 또는 샘플 조성물에 함유된 성분이 하나 이상의 샘플 분획을 생성하기 위해 크기 별로 분획/분리되도록 하는 분획화 단계를 포함한다. 바람직하게는, 교차 유량은 이러한 분획화 단계 동안 변화하고 (예를 들어, 하나의 값 (예컨대 약 1 내지 약 4 mL/분)으로부터 시작하고, 이어서 더 낮은 값(예컨대 약 0 내지 약 0.1 mL/min)으로 감소하거나, 또는 하나의 값(예를 들어 약 O 내지 약 O.1 mL/ 분)으로부터 시작하여 더 높은 값(예, 약 1 또는 약 4 mL/분으로 증가함); 여기서 변화는 임의의 수단, 예를 들어 연속 (예컨대 선형 또는 지수) 변화 또는 단계적 변화에 의해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 교차 유량 프로파일은 분획화 단계를 포함하며, 여기서 교차 유량은 하나의 값(예를 들어, 약 1 내지 약 4 mL/분)으로부터 시작하여 연속적으로(바람직하게는 기하급수적으로) 변화하고, 이어서 더 낮은 값 (예컨대 약 0 내지 약 0.1 mL/분)으로 감소한다. 분획화 단계는 예를 들어, 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 30분 동안 샘플 조성물에 함유된 성분을 그의 크기로 분획/분리하기에 적합한 임의의 길이를 가질 수 있다. 교차 유량 프로파일은 분획화 단계 전 및/또는 후에 있을 수 있고(예를 들어, 분획화 단계 전에 1개 및 분획화 단계 후에 1개, 2개, 또는 3개), 샘플 조성물에 함유된 비-핵산(특히 비-RNA) 성분(예를 들면, 단백질, 폴리펩타이드, 모노뉴클레오타이드 등)을 샘플 조성물 중에 함유된 핵산(특히 RNA)으로부터 분리하고, 샘플 조성물에 포함된 핵산(특별히 RNA)에 초점을 맞추고/거나 필드-유동 분획화 디바이스를 재생하도록(예컨대, 디바이스의 멤브레인에 결합된 모든 성분을 제거하기 위해) 작용할 수 있는 추가의 단계(예를 들면, 1개 또는 2개)을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 이들 추가 단계의 교차 유량은 각각의 추가 단계에 대해 일정하고, 각각의 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분 (예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 30분)의 범위에서 추가 단계에 대해 서로 독립적이다. 예를 들어, 교차 유량 프로파일은 (i) 분획화 단계 이전에 있는 제1 추가 단계로서, 상기 제1 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 시작되는 동일한 교차 낮은 비율인 단계(제1 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 10분 또는 약 20분 또는 약 30분의 범위일 수 있음); (ii) 분획화 단계 이후의 제2 추가 단계로서, 상기 제2 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 끝나는 동일한 교차 낮은 속도인 단계(제2 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 10분 또는 약 20분 또는 약 30분의 범위일 수 있음); 및 선택적으로 (iii) 제2 추가 단계 이후의 제3 추가 단계로서, 상기 제3 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 제2 추가 단계의 교차 유량과 다른 단계(제3 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 10분 또는 약 20분 또는 약 30분의 범위일 수 있음)을 포함할 수 있다. 교차 유량 프로파일이 분획화 단계를 포함하는 구현예에서, 교차 유량은 하나의 값(예를 들어, 약 1 내지 약 4 mL/분)으로부터 시작하여 연속적으로(바람직하게는 기하급수적으로) 변화하고, 이어서 더 낮은 값 (예컨대 약 0 내지 약 0.1 mL/분)으로 감소하고, 바람직하게는 교차 유량 프로파일은 (i) 분획화 단계 이전에 있는 제1 추가 단계로서, 상기 제1 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 시작되는 동일한 교차 낮은 속도(예컨대 약 1 내지 약 4 mL/분)인 단계(제1 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 30분, 예컨대 약 6분 내지 약 25분, 약 7분 내지 약 20분, 또는 약 8분 내지 약 15분, 또는 약 10분 내지 약 12분, 또는 약 5분 또는 약 10분 또는 약 12분의 범위일 수 있음); (ii) 분획화 단계 이후의 제2 추가 단계로서, 상기 제2 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 끝나는 동일한 교차 낮은 속도(예컨대 약 0.01 내지 0.1 mL/분)인 단계(제2 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 30분의 범위일 수 있음); 및 선택적으로 (iii) 제2 추가 단계 이후의 제3 추가 단계로서, 상기 제3 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 제2 추가 단계(예를 들어, 제3 추가 단계의 교차 유량은 0임)의 교차 유량과 다른 단계(제3 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 30분, 예컨대 약 6분 내지 약 25분, 약 7분 내지 약 20분, 또는 약 8분 내지 약 15분, 또는 약 10분 내지 약 12분, 또는 약 5분 또는 약 10분 또는 약 12분의 범위일 수 있음)을 포함할 수 있다. 이러한 교차 유량 프로파일의 바람직한 예는 다음과 같다: 10분 동안 1.0 내지 2.0 mL/분, 30분 이내에 1.0 내지 2.0 mL/분에서 0.01 내지 0.07 mL/분의 지수 구배; 30분 동안 0.01 내지 0.07 mL/분; 및 10분 동안 0 mL/분.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 샘플 조성물에 포함된 핵산(특히 RNA)의 무결성은 대조 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 사용하여 결정된다.
제1 양태의 이러한 구현예의 제3 특정 예에서, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 핵산 (특히 RNA)를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호, 형광 신호 및 굴절률(RI) 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하는 단계;
(c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 하나의 하나의 UV, 형광, 또는 RI 피크의 최대 높이로부터 UV, 형광, 또는 RI 피크의 말단까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)을 수득하는 단계.
(c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 상기 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
(c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 핵산 (특히 RNA) (I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제1 예에서, 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1) 단계(b)에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV, 형광, 또는 RI 피크에 상응하는 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 마지막까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
(c2) 단계(b)에서 수득한 UV, 형광 또는 RI 신호를 상기 단계(c1)에서 사용된 UV, 형광 또는 RI 피크의 총 면적으로 계산하여 A100%(샘플)를 수득하는 단계;
(c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
(c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
제2 양태의 이러한 구현예의 제3 특정 예에서, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 핵산 (특히 RNA)를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b") 단계(a")에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하는 단계; 및
(c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 하나의 UV, 형광, 또는 RI 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제2 예에서, 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1') 단계(b)에서 얻어진 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV, 형광, 또는 RI 피크에 상응하는 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 높이 (H(샘플))를 결정하는 단계; 및
(c2') H(샘플)과 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
제3 양태의 이 구현예의 제3 특정 예(제3 양태의 제1 하위군과 관련됨)에서, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 핵산 (특히 RNA)를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계;
(c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 최대 높이에서 UV 피크 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)를 수득하는 단계;
(c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
(c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 핵산 (특히 RNA) (I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제3 예에서, 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1) 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV 피크의 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
(c2) 단계(b)에서 수득한 샘플 UV 신호로부터 단계(c1)에서 사용된 샘플 UV 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(샘플)를 수득하는 단계;
(c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
(c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
제3 양태의 이 구현예의 제4 특정 예(제3 양태의 제1 하위군과 관련됨)에서, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 핵산 (특히 RNA)를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b") 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계; 및
(c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 핵산(특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제4 예에서, 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1') 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 높이(H(샘플))를 결정하는 단계; 및
(c2') H(샘플)과 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 샘플 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 무결성을 수득하는 단계.
제3 양태의 이 구현예의 제5 특정 예(제3 양태의 제2 하위군과 관련됨)에서, 대조 RNA의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a') 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하는 단계;
(c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 하나의 하나의 UV, 형광, 또는 RI 피크의 최대 높이로부터 UV, 형광, 또는 RI 피크의 말단까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)을 수득하는 단계.
(c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 상기 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
(c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 RNA(I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제5 예에서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1) 단계(b)에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV, 형광, 또는 RI 피크에 상응하는 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 마지막까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
(c2) 단계(b)에서 수득한 UV, 형광 또는 RI 신호를 상기 단계(c1)에서 사용된 UV, 형광 또는 RI 피크의 총 면적으로 계산하여 A100%(샘플)를 수득하는 단계;
(c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
(c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
제3 양태의 이 구현예의 제6 특정 예(제3 양태의 제2 하위군과 관련됨)에서, 대조 RNA의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b") 단계(a")에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하는 단계; 및
(c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호로부터 하나의 UV, 형광, 또는 RI 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제6 예에서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1') 단계(b)에서 얻어진 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV, 형광, 또는 RI 피크에 상응하는 샘플 UV, 형광, 또는 RI 피크의 높이 (H(샘플))를 결정하는 단계; 및
(c2') H(샘플) 및 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
제3 양태의 이 구현예의 제7 특정 예(제3 양태의 제3 하위군과 관련됨)에서, 대조 RNA의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a') 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계;
(c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 최대 높이에서 UV 피크 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)를 수득하는 단계;
(c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
(c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 RNA(I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제7 예에서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1) 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV 피크의 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
(c2) 단계(b)에서 수득한 샘플 UV 신호로부터 단계(c1)에서 사용된 샘플 UV 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(샘플)를 수득하는 단계;
(c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
(c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
제3 양태의 이 구현예의 제8 특정 예(제3 양태의 제3 하위군과 관련됨)에서, 대조 RNA의 무결성은 다음 단계에 의해 결정된다:
(a") 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b") 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계; 및
(c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
이러한 제8 예에서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음 단계에 따라 계산될 수 있다:
(c1') 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 높이(H(샘플))를 결정하는 단계; 및
(c2') H(샘플) 및 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산(특히 RNA)의 양은 (i) 핵산 소광 계수(특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선(특히 RNA 보정 곡선)를 사용하여 결정된다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 샘플 조성물은 핵산 (특히 RNA) 및 입자, 예컨대 리포플렉스 입자 및/또는 지질 나노입자 및/또는 폴리플렉스 입자 및/또는 리포폴리플렉스 입자 및/또는 바이러스 유사 입자를 포함하고, 이에 핵산 (특히 RNA)이 결합된다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 총 핵산(특히 RNA)의 양은 (i) 샘플 조성물의 적어도 일부를 방출제로 처리하고; (ii) 단계(i)에서 수득한 적어도 일부로 단계(a) 내지 (c)를 수행하고; 그리고 (iii) (i) 핵산 소광 계수(특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) (예를 들어, (i) 핵산 소광 계수 (특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선 (특히 RNA 보정 곡선)을 사용하여) 본 명세서에 명시된 핵산 (특히 RNA)의 양을 결정함으로써 결정된다. 이 구현예에서, 제1 양태의 방법의 단계(a)에서, 필드-유동-분획화는 바람직하게는 방출제를 함유하는 액상을 사용하여 수행된다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 방출제는 (i) 계면활성제, 예컨대 음이온성 계면활성제 (예를 들어, 나트륨 도데실설페이트), 쯔비터이온성 계면활성제 (예를 들어, n-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트 (Zwittergent® 3-14)), 양이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, 또는 그의 혼합물; (ii) 알코올, 예컨대 지방족 알코올 (예를 들어, 에탄올), 또는 알코올의 혼합물; 또는 (iii) (i)과 (ii)의 조합이다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 유리 핵산(특히 RNA)의 양은 결정된 특히 임의의 방출제의 부재에서 방출제의 첨가 없이 단계들 (a) 내지 (c)을 수행하고; 및 (예를 들어, (i) 핵산 소광 계수 (특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선 (특히 RNA 보정 곡선)을 사용하여) 본 명세서에 명시된 핵산 (특히 RNA)의 양을 결정함으로써 결정된다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 입자에 결합된 핵산(특히 RNA)의 양은 본 (예를 들어, (i) 샘플 조성물의 적어도 일부를 방출제로 처리하고; (ii) 단계들 (a) 내지 (c)를 단계(i)로부터 수득된 적어도 일부로 수행하고; 그리고 (iii) (예를 들어, (i) 핵산 소광 계수 (특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선 (특히 RNA 보정 곡선)을 사용하여) 본 명세서에 명시된 핵산 (특히 RNA)의 양을 결정함으로써) 명세서에서 결정된 총 핵산 (특히 RNA)의 양으로부터 (예를 들어, 특히 임의의 방출제의 부재에서 방출제의 첨가 없이 단계들 (a) 내지 (c)을 수행하고; 그리고 (예를 들어, (i) 핵산 소광 계수 (특히 RNA 소광 계수) 또는 (ii) 핵산 보정 곡선 (특히 RNA 보정 곡선)을 사용하여) 본 명세서에 명시된 핵산 (특히 RNA)의 양을 결정함으로써) 본 명세서에서 결정된 유리 핵산 (특히 RNA)의 양을 빼서 결정된다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 LS 신호, 예컨대 동적 광산란 (DLS) 신호 및/또는 정적 광산란 (SLS), 예를 들어, 다중각 광산란 (MALS), 신호를 측정하는 것을 추가로 포함한다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기는 단계(b)에서 수득한 LS 신호로부터 회전 반경 (Rg) 값 및/또는 유체역학적 반경 (Rh) 값을 계산함으로써 결정된다. 제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 동적 광산란 (DLS) 신호를 측정하는 것을 포함하고, 그리고 단계(c)는 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산하는 것을 포함한다. 제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 정적 광산란 (SLS), 예를 들어, MALS, 신호를 측정하는 것을 포함하고, 그리고 단계(c)는 단계(c)는 SLS 신호로부터 Rh 값을 계산하는 것을 포함한다. 제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 동적 광산란 (DLS) 신호 및 정적 광산란 (SLS), 예를 들어, MALS, 신호를 측정하는 것을 포함하고, 그리고 단계(c)는 단계(c)는 Rg 및 Rh 값을 계산하는 것을 포함한다. 이 후자의 구현예는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기에 대한 2개의 데이터 세트에 대한 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 하나 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나를 생성한다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포는 (예를 들어, 단계(b)로부터 수득한 SLS 신호로부터 Rg 값을 계산함으로써 또는 단계(b)로부터 수득한 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산함으로써) 본 명세서에 명시된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)에서 수득한 UV 신호, 형광 신호 및 RI 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 플롯팅함으로써 결정된다. (제3 양태의 제1 하위군과 관련된) 이 구현예의 제1 예에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포는 (예를 들어, 단계(b)로부터 수득한 SLS 신호로부터 Rg 값을 계산함으로써 또는 단계(b)로부터 수득한 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산함으로써) 본 명세서에 명시된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)로부터 수득한 UV 신호를 플롯팅함으로써 결정된다. (제3 양태의 제2 하위군과 관련된) 이 구현예의 제2 예에서, RNA 함유 입자의 크기 분포는 UV 신호, 형광 신호 및 단계(b)에서 수득한 RI 신호와 여기에 명시된 대로 결정된 Rg 또는 Rh 값(예를 들어, 단계(b)에서 수득한 SLS 신호에서 Rg 값을 계산하거나 단계에서 수득한 DLS 신호에서 Rh 값을 계산하여) (NS)). (제3 양태의 제3 하위군과 관련된) 이 구현예의 제3 예에서, RNA 함유 입자의 크기 분포는 (예를 들어, 단계(b)로부터 수득한 SLS 신호로부터 Rg 값을 계산함으로써 또는 단계(b)로부터 수득한 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산함으로써) 본 명세서에 명시된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)로부터 수득한 UV 신호를 플롯팅함으로써 결정된다. 상기 제1, 제2 및 제3 예 각각에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포는 Rg 값, Rh 값 또는 둘 모두에 기초하여 결정될 수 있다. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 하나의 크기 분포 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나의 크기 분포를 생성한다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 Rg 또는 Rh 값에 대해 UV, 형광, 또는 RI 신호를 누적 중량 분율 및 플롯팅 누적 중량 분율로 변환함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV, 형광, 또는 RI 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산된다. (제3 양태의 제1 하위군과 관련된) 이 구현예의 제1 예에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV, 형광, 또는 RI 신호를 누적 중량 분율로 변환시키고, Rg 또는 Rh 값에 대해 누적 중량 분획을 플롯팅함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산된다. (제3 양태의 제2 하위군과 관련된) 이 구현예의 제2 예에서, RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 Rg 또는 Rh 값에 대해 UV, 형광, 또는 RI 신호를 누적 중량 분율 및 플롯팅 누적 중량 분율로 변환함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV, 형광, 또는 RI 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산된다. (제3 양태의 제3 하위군과 관련된) 이 구현예의 제3 예에서, RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV, 형광, 또는 RI 신호를 누적 중량 분율로 변환시키고, Rg 또는 Rh 값에 대해 누적 중량 분획을 플롯팅함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산된다. 상기 제1, 제2 및 제3 예 각각에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 Rg 값, Rh 값 또는 둘 모두에 기초하여 결정될 수 있다. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 정량적 하나의 크기 분포 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나의 정량적 크기 분포를 생성한다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 정량적 크기 분포는 D10, D50, 및/또는 D90 값을 포함한다. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 D10, D50, 및/또는 D90 값의 하나의 세트 및 Rh 값을 기준으로 하는 D10, D50, 및 또는 D90 값의 하나의 세트를 생성한다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 본 명세서에 명시된 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3개의 파라미터 (추가의 선택적 파라미터 포함), 특히 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3개의 파라미터를 포함하거나 그 파라미터이다: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (특히, 이는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함), 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함). 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 하나 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나를 생성한다. 그러나, 본 발명에 따르면, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포에 대한 이들 2개의 데이터 세트는 (2개의 파라미터가 아닌) 하나의 파라미터로만 간주된다. 또한, 필드-유동 분획화에 의해 수득된 프락토그램이 하나 이상의 입자 피크를 나타내는 경우, 각 입자 피크에 대한 크기 분포의 결정은 하나의 파라미터로만 간주된다 (각 입자 피크에 대한 하나의 파라미터가 아님). Rg 값과 Rh 값을 기준으로 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포를 결정하는 경우에도 마찬가지이다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서, 특히 제3 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함) 및 선택적으로 본 명세서에 명시된 나머지 파라미터 중 적어도 1개의 파라미터, 예컨대 적어도 2개의 파라미터 (추가의 선택적 파라미터 포함); 바람직하게는 이들 남아 있는 파라미터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함). 제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서, 특히 제3 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함) 및 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 파라미터, 예컨대 적어도 2개의 파라미터: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함)를 포함한다. 제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서, 특히 제3 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 및 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양을 포함한다. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 하나 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나를 생성한다. 그러나, 본 발명에 따르면, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포에 대한 이들 2개의 데이터 세트는 (2개의 파라미터가 아닌) 하나의 파라미터로만 간주된다. 또한, 필드-유동 분획화에 의해 수득된 프락토그램이 하나 이상의 입자 피크를 나타내는 경우, 각 입자 피크에 대한 정량적 크기 분포의 결정은 하나의 파라미터로만 간주된다 (각 입자 피크에 대한 하나의 파라미터가 아님). Rg 값과 Rh 값을 기준으로 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포를 결정하는 경우에도 마찬가지이다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 1개 이상의 파라미터는 단계(a) 내지 (c)의 한 주기에서 결정된다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산(특히 RNA), 특히 유리 핵산(특히 RNA)의 양은 예를 들어, 260 nm 내지 280 nm 범위의 파장에서, 예컨대 260 nm 또는 280 nm의 파장에서 UV 신호를 측정하고 상응하는 파장 (예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)에서 핵산 (특히 RNA) 소광 계수를 사용함으로써 결정된다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서, 특히 제3 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함) 및/또는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함)는 10 내지 2000 nm의 범위, 바람직하게는 20 내지 1500 nm, 예컨대 30 내지 1200 nm, 40 내지 1100 nm, 50 내지 1000, 60 내지 900 nm, 70 내지 800 nm, 80 내지 700 nm, 90 내지 600 nm, 또는 100 내지 500 nm의 범위, 또는 예컨대 10 내지 1000 nm, 15 내지 500 nm, 20 내지 450 nm, 25 내지 400 nm, 30 내지 350 nm, 40 내지 300 nm, 또는 50 내지 250 nm의 범위 내이다. 제3 양태의 제3 하위군의 바람직한 구현예에서, (정량적) RNA 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함)는 10 내지 1000 nm의 범위, 예컨대 15 내지 500 nm, 20 내지 450 nm, 25 내지 400 nm, 30 내지 350 nm, 40 내지 300 nm, 또는 50 내지 250 nm의 범위 내이다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 핵산(특히 RNA)은 10 내지 15,000개의 뉴클레오타이드, 예컨대 40 내지 15,000개의 뉴클레오타이드, 100 내지 12,000개의 뉴클레오타이드 또는 200 내지 10,000개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1 하위군의 일 구현예에서), 핵산은 RNA이다. 이 구현예 및 제3 양태의 제2 또는 제3 하위군의 구현예에서, RNA는 바람직하게는 mRNA 또는 시험관내 전사된 RNA, 특히 시험관내 전사된 mRNA이다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호, 선택적으로 LS 신호, 예컨대 SLS, 예를 들어, MALS, 신호 및/또는 DLS 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호의 측정은, 온라인으로 수행되고/거나 단계(c)는 온라인으로 수행된다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), 샘플 조성물의 적어도 일부에 대해 필드-유동 분획화를 수행하기 전에, 샘플 조성물의 적어도 일부는 용매 또는 용매 혼합물로 희석되며, 상기 용매 또는 용매 혼합물은 입자의 응집체 형성을 방지할 수 있다. 일 구현예에서, 용매 혼합물은 물과 유기 용매, 예를 들어 포름아미드의 혼합물이다.
제3 양태의 일 구현예에서 (특히, 제3 양태의 제1, 제2 또는 제3 하위군의 일 구현예에서), UV 신호의 측정은 원형 2색성(CD) 분광법을 사용하여 수행된다.
제1 또는 제2 양태의 맥락에서 본 명세서에 기재된 임의의 구현예는 또한 제3 양태의 임의의 구현예에 적용될 수 있음이 이해된다.
추가 구현예는 다음과 같다.
1. 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하는 방법으로서, 샘플 조성물은 RNA 및 선택적으로 입자를 포함하고,
(a) 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여, 샘플 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 샘플 분획을 생성하는 단계;
(b) 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 적어도 하나의 UV 신호, 및 선택적으로 광산란(LS) 신호를 측정하는 단계; 및
(c) UV 신호 및 선택적으로 LS 신호로부터 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계를 포함하고,
상기 1개 이상의 파라미터는 RNA 무결성, RNA의 총량, 유리 RNA의 양, 입자에 결합 RNA의 양, RNA 함유 입자의 크기, RNA 함유 입자의 크기 분포, 및 RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포를 포함하는, 방법.
2. 항목 1에 있어서, 상기 필드-유동 분획화는 비대칭 유동 필드-유동 분획화(AF4) 또는 중공 섬유 유동 필드-유동 분획화(HF5)과 같은 유동 필드-유동 분획화인, 방법.
3. 항목 1 또는 항목 2에 있어서, 단계(a)는 RNA가 멤브레인을 투과하는 것을 방지하는 데 적합한 분자량(MW) 컷-오프를 갖는 멤브레인, 바람직하게는 바람직하게는 2 kDa 내지 30 kDa 범위의 MW 컷-오프, 예컨대 10 kDa의 MW 컷-오프를 갖는 멤브레인을 사용하여 수행되는, 방법.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 단계(a)는 폴리에테르설폰(PES) 또는 재생 셀룰로오스 멤브레인을 사용하여 수행되는, 방법.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 단계(a)는 최대 8 mL/분, 바람직하게는 최대 4 mL/분, 더 바람직하게는 최대 2 mL/분의 교차 유량을 사용하여 수행되는, 방법.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 단계(a)는 하기 교차 유량 프로파일을 사용하여 수행되는, 방법: 10분 동안 1.0 내지 2.0 mL/분, 30분 이내에 1.0 내지 2.0 mL/분에서 0.01 내지 0.07 mL/분의 지수 구배; 30분 동안 0.01 내지 0.07 mL/분; 및 10분 동안 0 mL/분.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 단계(a)는 0.05 내지 0.35 mL/분 범위, 바람직하게는 0.10 내지 0.30 mL/분 범위, 더욱 바람직하게는 0.15 내지 0.25 mL/분 범위의 주입 흐름을 사용하여 수행되는, 방법.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 단계(a)는 0.30 내지 0.70 mL/분 범위, 바람직하게는 0.40 내지 0.60 mL/분 범위, 더욱 바람직하게는 0.45 내지 0.55 mL/분 범위의 검출기 유동을 사용하여 수행되는, 방법.
9. 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 대조 RNA의 무결성을 사용하여 계산되는, 방법.
10. 항목 9에 있어서, 대조 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 결정되는, 방법:
(a') 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계;
(c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 최대 높이에서 UV 피크 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)를 수득하는 단계;
(c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
(c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 RNA(I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
11. 항목 10에 있어서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산되는, 방법:
(c1) 단계(b)에서 수득한 샘플 UV 신호로부터 단계 (c'1)에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV 피크의 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
(c2) 단계(b)에서 수득한 샘플 UV 신호로부터 단계(c1)에서 사용된 샘플 UV 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(샘플)를 수득하는 단계;
(c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
(c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
12. 항목 9에 있어서, 대조 RNA의 무결성을 계산하는 단계는 다음의 단계들에 의해 결정되는, 방법:
(a") 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b") 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계; 및
(c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
13. 항목 12에 있어서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산되는, 방법:
(c1') 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 높이(H(샘플))를 결정하는 단계; 및
(c2') H(샘플) 및 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
14. 항목 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, RNA의 양은 (i) RNA 소광 계수 또는 (ii) RNA 보정 곡선을 사용하여 결정되는, 방법.
15. 항목 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 샘플 조성물은 RNA 및 입자, 예컨대 리포플렉스 입자 및/또는 지질 나노입자 및/또는 폴리플렉스 입자 및/또는 리포폴리플렉스 입자 및/또는 바이러스 유사 입자를 포함하고, 이에 RNA가 결합되는, 방법.
16. 항목 15에 있어서, 총 RNA의 양은 (i) 샘플 조성물의 적어도 일부를 방출제로 처리하고; (ii) 단계(i)에서 수득한 적어도 일부로 단계(a) 내지 (c)를 수행하고; 그리고 (iii) 항목 14에 명시된 RNA의 양을 결정함으로써 결정되는, 방법.
17. 항목 16에 있어서, 단계(a)에서 필드-유동-분획화는 방출제를 함유하는 액상을 사용하여 수행되는, 방법.
18. 항목 16 또는 17에 있어서, 방출제는 (i) 계면활성제, 예컨대 음이온성 계면활성제 (예를 들어, 나트륨 도데실설페이트), 쯔비터이온성 계면활성제 (예를 들어, n-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트 (Zwittergent® 3-14)), 양이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, 또는 그의 혼합물; (ii) 알코올, 예컨대 지방족 알코올 (예를 들어, 에탄올), 또는 알코올의 혼합물; 또는 (iii) (i)과 (ii)의 조합인, 방법.
19. 항목 15 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 유리 RNA의 양은 방출제의 첨가 없이, 특히 임의의 방출제의 부재 하에 단계(a) 내지 (c)를 수행하고; 그리고 항목 14에 명시된 RNA의 양을 결정함으로써 결정되는, 방법.
20. 항목 15 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 입자에 결합 RNA의 양은 항목 16 내지 18 중 어느 하나에 의해 결정된 총 RNA의 양에서 항목 19에 의해 결정된 유리 RNA의 양을 빼서 결정되는, 방법.
21. 항목 15 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 LS 신호, 예컨대 동적 광산란 (DLS) 신호 및/또는 정적 광산란 (SLS), 예를 들어, 다중각 광산란 (MALS), 신호를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
22. 항목 21에 있어서, RNA 함유 입자의 크기는 단계(b)에서 수득한 LS 신호로부터 회전 반경(Rg) 값 및/또는 유체역학적 반경(Rh) 값을 계산함으로써 결정되는, 방법.
23. 항목 21에 있어서, 실험적으로 결정된 Rg 및/또는 Rh 값은 바람직하게는 실험적으로 결정된 또는 계산된 Rg 또는 Rh 값을 다항식 또는 선형 함수로 적합화하고 다항식 또는 선형 적합에 기초하여 Rg 또는 Rh 값을 계산함으로써 평활화되는, 방법.
24. 항목 21 내지 23 중 어느 하나에 있어서, RNA 함유 입자의 크기 분포는 항목 22에 명시된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)에서 수득한 UV 신호를 플롯팅함으로써 결정되는, 방법.
25. 항목 21 내지 24 중 어느 하나에 있어서, RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV 신호를 누적 중량 분율로 변환하고 Rg 또는 Rh 값에 대한 누적 중량 분율을 플롯팅함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산되는, 방법.
26. 항목 25에 있어서, 상기 정량적 크기 분포는 D10, D50, 및/또는 D90 값을 포함하는, 방법.
27. 항목 22 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 동적 광산란(DLS) 신호를 측정하는 단계를 포함하고, 그리고 단계(c)는 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
28. 항목 15 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 파라미터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3개의 파라미터를 포함하거나 그 파라미터인, 방법: 유리 RNA의 양, 입자에 결합 RNA의 양, RNA 함유 입자의 크기 분포, 및 RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포.
29. 항목 15 내지 28 중 어느 하나에 있어서, RNA, 특히 유리 RNA의 양은 260 nm에서 UV 신호를 측정하고 260 nm에서 RNA 소광 계수를 사용하거나, 또는 280 nm에서 UV 신호를 측정하고 280 nm에서 RNA 소광 계수를 사용함으로써 결정되는, 방법.
30. 항목 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, RNA 함유 입자의 크기 분포 및/또는 RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 바람직하게는 20 내지 1500 nm, 예컨대 30 내지 1200 nm, 40 내지 1100 nm, 50 내지 1000, 60 내지 900 nm, 70 내지 800 nm, 80 내지 700 nm, 90 내지 600 nm, 또는 100 내지 500 nm의 범위 내, 예컨대 10 내지 1000 nm, 15 내지 500 nm, 20 내지 450 nm, 25 내지 400 nm, 30 내지 350 nm, 40 내지 300 nm, 또는 50 내지 250 nm의 범위 내인, 방법.
31. 항목 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, RNA는 10 내지 15,000개의 뉴클레오타이드, 예컨대 40 내지 15,000개의 뉴클레오타이드, 100 내지 12,000개의 뉴클레오타이드 또는 200 내지 10,000개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 방법.
32. 항목 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, RNA는 시험관내 전사된 RNA, 특히 시험관내 전사된 mRNA인, 방법.
33. 항목 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, UV 신호, 선택적으로 LS 신호, 예컨대 SLS, 예를 들어, MALS, 신호 및/또는 DLS 신호는, 온라인으로 수행되고/되거나 단계(c)의 측정은 온라인으로 수행되는, 방법.
34. 항목 15 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 샘플 조성물의 적어도 일부에 대해 필드-유동 분획화를 수행하기 전에, 샘플 조성물의 적어도 일부는 용매 또는 용매 혼합물로 희석되고, 상기 용매 또는 용매 혼합물은 입자의 응집체 형성을 방지할 수 있는, 방법.
35. 항목 34에 있어서, 용매 혼합물은 물과 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 혼합물인, 방법.
35a. 항목 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 UV 신호의 측정은 원형 2색성 (CD) 분광법을 사용하여 수행되는, 방법.
36. RNA 및 선택적으로 입자를 포함하는 조성물을 제공할 때, 하나 이상의 반응 조건을 변경하는 효과를 분석하는 방법으로서, 다음의 단계들을 포함하는, 방법:
(A) RNA 및 선택적으로 입자를 포함하는 제1 조성물을 제공하는 단계;
(B) RNA 및 선택적으로 입자를 포함하는 제2 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 제2 조성물의 제공은 하나 이상의 반응 조건에서만 제1 조성물의 제공과 상이한 것인 단계;
(C) 제1 조성물의 일부를 항목 1 내지 35 및 35a 중 어느 하나의 방법에 적용하여, 제1 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하는 단계;
(D) 제2 조성물의 상응하는 부분을 단계(C)에서 사용된 방법에 적용하여, 제2 조성물의 하나 이상의 파라미터를 결정하는 단계; 및
(E) 단계(C)에서 수득한 제1 조성물의 하나 이상의 파라미터를 단계(D)에서 수득한 제2 조성물의 상응하는 하나 이상의 파라미터와 비교하는 단계.
37. 항목 36에 있어서, 하나 이상의 반응 조건이 다음 중 임의의 것을 포함하는, 방법: 염 농도/이온 강도 (예를 들어, 2 mM의 NaCl 또는 100 mM의 NaCl); 온도 (예를 들어, 저온 (예컨대 -20℃) 또는 고온 (예컨대 50℃)); pH 또는 완충액 농도; 광/방사선; 산소; 전단력; 압력; 동결/해동 주기; 건조/재구성 주기; 부형제(들) (예를 들어, 안정화제 및/또는 킬레이트화제)의 첨가; 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체, 예를 들어, 양이온성 지질 대 양이온성 중합체, 양이온성 지질 대 쯔비터이온성 지질, 또는 페길화된 지질 대 비페길화된 지질)의 유형 및/또는 공급원; 전하 비율; 물리적 상태; 및 RNA 대 입자 형성 화합물의 비 (특히 지질 및/또는 중합체).
38. RNA 및 선택적으로 입자를 포함하는 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하기 위한 필드-유동-분획화의 용도로서, 상기 1개 이상의 파라미터는 RNA 무결성, RNA의 총량, 유리 RNA의 양, 입자에 결합 RNA의 양, RNA 함유 입자의 크기(예컨대 RNA 함유 입자의 유체역학적 반경), RNA 함유 입자의 크기 분포, 및 RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포를 포함하는, 용도.
39. 항목 38에 있어서, 필드-유동 분획화는 다음을 포함하는, 용도:
(a) 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여, 샘플 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 샘플 분획을 생성하는 단계;
(b) 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 적어도 하나의 UV 신호, 및 선택적으로 광산란(LS) 신호를 측정하는 단계; 및
(c) UV 신호 및 선택적으로 LS 신호로부터 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계.
40. 항목 38 또는 39에 있어서, 상기 필드-유동 분획화는 비대칭 유동 필드-유동 분획화(AF4) 또는 중공 섬유 유동 필드-유동 분획화(HF5)과 같은 유동 필드-유동 분획화인, 용도.
41. 항목 38 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 필드-유동-분획화는 RNA가 멤브레인을 투과하는 것을 방지하는 데 적합한 분자량(MW) 컷-오프를 갖는 멤브레인, 바람직하게는 바람직하게는 2 kDa 내지 30 kDa 범위의 MW 컷-오프, 예컨대 10 kDa의 MW 컷-오프를 갖는 멤브레인을 사용하는, 용도.
42. 항목 38 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 필드-유동-분획화는 폴리에테르설폰 (PES) 또는 재생 셀룰로스 멤브레인을 사용하는, 용도.
43. 항목 39 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 단계(a)는 하기를 사용하여 수행되는, 용도:
(I) 최대 8 mL/분, 바람직하게는 최대 4 mL/분, 더 바람직하게는 최대 2 mL/분의 교차 유량, 예컨대 다음의 교차 유량 프로파일: 10분 동안 1.0 내지 2.0 mL/분, 30분 이내에 1.0 내지 2.0 mL/분에서 0.01 내지 0.07 mL/분의 지수 구배; 30분 동안 0.01 내지 0.07 mL/분; 및 10분 동안 0 mL/분; 및/또는
(II) 0.05 내지 0.35 mL/분 범위, 바람직하게는 0.10 내지 0.30 mL/분 범위, 더욱 바람직하게는 0.15 내지 0.25 mL/분 범위의 주입 흐름; 및/또는
(III) 0.30 내지 0.70 mL/분 범위, 바람직하게는 0.40 내지 0.60 mL/분 범위, 더 바람직하게는 0.45 내지 0.55 mL/분 범위의 검출기 유동.
44. 항목 38 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 대조 RNA의 무결성을 사용하여 결정되는, 용도.
45. 항목 44에 있어서, 대조 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 결정되는, 용도:
(a') 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계;
(c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 최대 높이에서 UV 피크 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)를 수득하는 단계;
(c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
(c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 RNA(I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
46. 항목 45에 있어서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산되는, 용도:
(c1) 단계(b)에서 수득한 샘플 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV 피크의 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
(c2) 단계(b)에서 수득한 샘플 UV 신호로부터 단계(c1)에서 사용된 샘플 UV 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(샘플)를 수득하는 단계;
(c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
(c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
47. 항목 44에 있어서, 대조 RNA의 무결성을 계산하는 단계는 다음의 단계들에 의해 결정되는, 용도:
(a") 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
(b") 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계; 및
(c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
48. 항목 47에 있어서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산되는, 용도:
(c1') 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 높이(H(샘플))를 결정하는 단계; 및
(c2') H(샘플) 및 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
49. 항목 38 내지 48 중 어느 하나에 있어서, RNA의 양은 (i) RNA 소광 계수 또는 (ii) RNA 보정 곡선을 사용하여 결정되는, 용도.
50. 항목 39 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 샘플 조성물은 RNA 및 입자, 예컨대 리포플렉스 입자 및/또는 지질 나노입자 및/또는 폴리플렉스 입자 및/또는 리포폴리플렉스 입자 및/또는 바이러스 유사 입자를 포함하고, 이에 RNA가 결합되고/거나, 그 안에 RNA가 함유되는, 용도.
51. 항목 50에 있어서, 총 RNA의 양은 (i) 샘플 조성물의 적어도 일부를 방출제로 처리하고; (ii) 단계(i)에서 수득한 적어도 일부로 단계(a) 내지 (c)를 수행하고; 그리고 (iii) 항목 49에 명시된 RNA의 양을 결정함으로써 결정되는, 용도.
52. 항목 51에 있어서, 단계(a)에서 필드-유동-분획화는 방출제를 함유하는 액상을 사용하여 수행되는, 용도.
53. 항목 51 또는 52에 있어서, 방출제는 (i) 계면활성제, 예컨대 음이온성 계면활성제 (예를 들어, 나트륨 도데실설페이트), 쯔비터이온성 계면활성제 (예를 들어, n-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트 (Zwittergent® 3-14)), 양이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, 또는 그의 혼합물; (ii) 알코올, 예컨대 지방족 알코올 (예를 들어, 에탄올), 또는 알코올의 혼합물; 또는 (iii) (i)과 (ii)의 조합인, 용도.
54. 항목 50 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 유리 RNA의 양은 방출제의 첨가 없이, 특히 임의의 방출제의 부재 하에 단계(a) 내지 (c)를 수행하고; 그리고 항목 49에 명시된 RNA의 양을 결정함으로써 결정되는, 용도.
55. 항목 50 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 입자에 결합 RNA의 양은 항목 51 내지 53 중 어느 하나에 의해 결정된 총 RNA의 양에서 항목 53에 의해 결정된 유리 RNA의 양을 빼서 결정되는, 용도.
56. 항목 50 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 LS 신호, 예컨대 동적 광산란 (DLS) 신호 및/또는 정적 광산란 (SLS), 예를 들어, 다중각 광산란 (MALS), 신호를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 용도.
57. 항목 57에 있어서, RNA 함유 입자의 크기는 단계(b)에서 수득한 LS 신호로부터 회전 반경(Rg) 값 및/또는 유체역학적 반경(Rh) 값을 계산함으로써 결정되는, 용도.
58. 항목 57에 있어서, 실험적으로 결정된 Rg 및/또는 Rh 값은 바람직하게는 실험적으로 결정된 또는 계산된 Rg 또는 Rh 값을 다항식 또는 선형 함수로 적합화하고 다항식 또는 선형 적합에 기초하여 Rg 또는 Rh 값을 계산함으로써 평활화되는, 용도.
59. 항목 56 내지 58 중 어느 하나에 있어서 RNA 함유 입자의 크기 분포는 항목 57에 명시된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)에서 수득한 UV 신호를 플롯팅함으로써 결정되는, 용도.
60. 항목 56 내지 59 중 어느 하나에 있어서, RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV 신호를 누적 중량 분율로 변환하고 Rg 또는 Rh 값에 대한 누적 중량 분율을 플롯팅함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산되는, 용도.
61. 항목 60에 있어서, 상기 정량적 크기 분포는 D10, D50, 및/또는 D90 값을 포함하는, 용도.
62. 항목 57 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 동적 광산란(DLS) 신호를 측정하는 단계를 포함하고, 그리고 단계(c)는 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산하는 단계를 추가로 포함하는, 용도.
63. 항목 50 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 파라미터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3개의 파라미터를 포함하거나 그 파라미터인, 용도: 유리 RNA의 양, 입자에 결합 RNA의 양, RNA 함유 입자의 크기 분포, 및 RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포.
64. 항목 50 내지 63 중 어느 하나에 있어서, RNA, 특히 유리 RNA의 양은 260 nm에서 UV 신호를 측정하고 260 nm에서 RNA 소광 계수를 사용하거나, 또는 280 nm에서 UV 신호를 측정하고 280 nm에서 RNA 소광 계수를 사용함으로써 결정되는, 용도.
65. 항목 38 내지 64 중 어느 하나에 있어서, RNA 함유 입자의 크기 분포 및/또는 RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 바람직하게는 20 내지 1500 nm, 예컨대 30 내지 1200 nm, 40 내지 1100 nm, 50 내지 1000, 60 내지 900 nm, 70 내지 800 nm, 80 내지 700 nm, 90 내지 600 nm, 또는 100 내지 500 nm의 범위 내, 예컨대 10 내지 1000 nm, 15 내지 500 nm, 20 내지 450 nm, 25 내지 400 nm, 30 내지 350 nm, 40 내지 300 nm, 또는 50 내지 250 nm의 범위 내인, 방법.
66. 항목 38 내지 64 중 어느 하나에 있어서, RNA는 10 내지 15,000개의 뉴클레오타이드, 예컨대 40 내지 15,000개의 뉴클레오타이드, 100 내지 12,000개의 뉴클레오타이드 또는 200 내지 10,000개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 용도.
67. 항목 39 내지 67 중 어느 하나에 있어서, RNA는 시험관내 전사된 RNA, 특히 시험관내 전사된 mRNA인, 용도.
68. 항목 39 내지 67 중 어느 하나에 있어서, UV 신호, 선택적으로 LS 신호, 예컨대 SLS, 예를 들어, MALS, 신호 및/또는 DLS 신호는, 온라인으로 수행되고/되거나 단계(c)의 측정은 온라인으로 수행되는, 용도.
69. 항목 39 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 샘플 조성물의 적어도 일부에 대해 필드-유동 분획화를 수행하기 전에, 샘플 조성물의 적어도 일부는 용매 또는 용매 혼합물로 희석되고, 상기 용매 또는 용매 혼합물은 입자의 응집체 형성을 방지할 수 있는, 용도.
70. 항목 70에 있어서, 용매 혼합물은 물과 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 혼합물인, 용도.
70a. 항목 39 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 UV 신호의 측정은 원형 2색성 (CD) 분광법을 사용하여 수행되는, 용도.
제4 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법 중 임의의 것, 특히 제1 양태의 방법 (예를 들어, 항목 1 내지 35 및 35a 중 임의의 하나에서 정의된 방법) 및/또는 제2 양태의 방법 (예를 들어, 항목 36 또는 37에 정의된 방법)을 수행하는 수단을 포함하는 데이터-프로세싱 장치/시스템을 제공한다.
제5 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법 중 임의의 것, 특히 제1 양태의 방법 (예를 들어, 항목 1 내지 35 및 35a 중 임의의 하나에서 정의된 방법) 및/또는 제2 양태의 방법 (예를 들어, 항목 36 또는 37에 정의된 방법)을 수행하는 데 적합화된 컴퓨터 프로그램을 제공한다.
제6 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 제5 양태의 프로그램을 포함하는 컴퓨터 판독가능 저장 매체 또는 데이터 캐리어를 제공한다.
본 개시내용의 추가 양태가 본 명세서에 개시된다.
도 1은 비대칭 유동 필드-유동 분획화(AF4) 분리의 시간-유동 프로파일을 보여주고, 여기서 검출기 유동(Vd)은 0.5 mL/분이고 교차 유동(Vx) 시작점은 1.5 mL/분이며 0.04 mL/분로 기하급수적으로 감소하였다.
도 2는 상대적인 RNA 무결성의 추정을 위한 바람직한 계산 절차의 개요를 보여준다. AF4 프락토그램의 예는 RNA를 분리한 후 260 nm에서 UV 신호로 표시된다. A) 대조 RNA의 계산에 대한 한계. B) 총 RNA 피크 면적의 계산에 대한 한계. C) 약간 분해된 RNA의 계산에 대한 한계. D) 약간 분해된 총 RNA 피크 면적의 계산에 대한 한계.
도 3은 표준을 사용하지 않고 RNA의 정량화를 보여준다: A) RNA 스톡 용액의 다른 주입 부피는 AF4-UV-RI에 의해 분석되었다. 곡선 아래의 피크 면적(UV 실선; RI 파선)은 주입된 부피에 대해 플롯팅되었고 선형 회귀가 적합화되었다. B) RNA의 연속 희석액은 AF4-UV-RI에 의해 동일한 주입 부피로 측정되었고 A)에서와 같이 분석되었다.
도 4는 AF4-UV-RI를 사용하고 표준을 사용하지 않고 분해된 RNA의 정량화를 보여준다. A) 상이한 열분해 RNA 및 미처리 RNA의 대표적인 AF4 프락토그램이 도시된다 (곡선은 260 nm에서 UV 신호를 나타냄). B) 상이한 분해된 RNA의 UV 신호는 람베르트-베르(Lambert-Beer) 법칙을 적용하여 농도와 직접적인 상관관계가 있다.
도 5는 본 명세서에 개시된 AF4 방법에 의해 분리된 샘플 입자 조성물(1.3/2의 몰비로 지질 및 RNA 함유)로부터 수득된 대표적인 프락토그램을 보여준다. 실선은 90°각도에서 광산란(LS) 신호를 나타내고 입자 피크(t = 내지 35분)를 나타내는 반면, 파선은 UV 신호(260 nm에서 기록됨)를 나타내고 결합 RNA (t = 내지 38분) 및 미결합 RNA(t = 내지 20분)를 반영한다.
도 6은 비-제형화된 RNA의 정량적 RNA 무결성 측정을 보여준다: A) 상이한 열분해 RNA의 대표적인 AF4 프락토그램(n=3, 곡선은 260 nm에서 UV 신호를 나타냄). B) 길이가 다른 4개의 열분해 RNA(RNA #1-4, 크기: 986 내지 1688 nt)의 평균 계산된 상대적 무결성의 개요. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다(n=3). C) 상이한 비율을 사용하여 RNA #2에서 수득한 대표적인 AF4 프락토그램(미처리, 완전 열분해 및 미처리와 완전 열분해의 50:50 혼합물). D) 검증 실험: 상이한 RNA(RNA #1-3, 986 내지 1688 nt)를 열분해하고 정의된 방식으로 혼합하고(혼합물 4의 AF4 프락토그램의 경우, 도 6c 참조), AF4-UV 측정으로 분석하였다. 막대 다이어그램은 이론적으로 계산된 값(검은색 막대)과 비교하여 본 명세서에 개시된 AF4 방법으로 결정된 상대적 RNA 무결성(어두운, 중간 및 밝은 회색 막대)을 나타낸다.
도 7은 형광 염료를 사용한 RNA 정량화와 비교하여 RNA 정량화(개념 증명)를 위한 UV 신호의 적합성을 보여준다. A) 샘플 조성물(RNA 및 형광 표지된 입자 포함)의 UV 피크 및 형광(FS) 적분은 샘플 조성물에서 상응하는 총 RNA 양과 상관관계가 있었다. B) 샘플 조성물의 FS 피크 면적에 대한 UV의 계산된 비율은 넓은 질량 범위(샘플 조성물에서 1-15 μg 총 RNA)에 걸쳐 일정한 것으로 밝혀졌다.
도 8은 RNA 샘플 조성물에 대한 파라미터로 UV 비율을 보여준다. A) 유리 RNA의 UV 피크 적분 및 입자에 결합 RNA는 샘플 조성물에 함유된 해당 명목 총 RNA 양과 상관관계가 있다. B) 결합 RNA(피크)에 대한 유리 RNA(피크)의 UV 비율의 계산.
도 9는 AF4-UV-MALS에 의한 입자 크기 분포의 정량화에 대한 개념 증명을 보여준다. A) 샘플 조성물(RNA 및 Atto594 표지 입자)의 대표적인 AF4 프락토그램: 파선은 260 nm에서 기록된 UV 자취를 나타내고 실선은 624 nm에서 방출된 형광 신호(FS)를 나타낸다. B) UV/FS 비율(파선)은 회전 반경(Rg) 및 입자 피크 분율(용리 시간: 22-60분)로부터 기록된 UV 신호(강조 표시된 회색 피크)에 대해 계산되고 플롯팅된다. UV/FS 비율의 50% 미만 변화가 있는 Rg 영역이 강조 표시된다 (박스). 50 내지 300 nm의 Rg 범위에서, UV/FS 비율의 변화는 작고 신뢰할 수 있는 크기 값을 제공한다. 더 작은 Rg 값은 RNA 신호의 영향을 받는다. 더 큰 Rg 값은 산란의 영향을 받는다. 전체적으로 이러한 영향을 받는 Rg 값은 총 신호량의 10% 미만이다. C) 624 nm에서의 형광 방출 및 260 nm에서의 UV 신호를 사용한 누적 중량 분율 분석을 기반으로 하는 정량적 품질 파라미터(D10, D50, D90)의 계산.
도 10은 90°에서 LS 신호 및 260 nm에서 UV 검출을 포함하는 샘플 조성물(RNA 및 입자)의 대표적인 AF4 프락토그램을 보여준다. 계산된 회전 반경(Rg) 값(회색 정사각형)은 베리(Berry) 플롯을 사용하는 다중각 광산란(MALS)에서 파생되고 유체역학적 반경(Rh) 값은 온라인 동적 광산란(DLS, 회색 원)에서 파생된다.
도 11은 AF4-UV-MALS를 사용하여 복잡한 샘플 조성물에서 입자 크기 분포의 정량화를 보여준다. A) 샘플 조성물(RNA 및 입자)의 AF4-UV-MALS 용리 프로파일, RNA 검출을 위한 260 nm에서의 UV 신호(파선) 및 90°에서의 광산란 신호(실선)가 도시되어 있다. MALS 신호의 해당 회전 반경(Rg) 값은 검은색 점으로 표시된다. B) 입자 피크의 실험적으로 결정된 RMS 값(용리 시간: 26-55분)을 다항 방정식(밝은 회색 선)에 맞춘다. C) UV 신호(실선)는 다항식 적합 Rg 값의 함수로 표시되고(도 11b 참조), 해당 누적 중량 분율은 UV 신호(파선)의 함수로 플롯팅된다.
도 12는 본 명세서에 개시된 AF4 방법을 사용하여 (상이한 지질/RNA 비 (0.1 내지 0.9)의 지질 및 RNA를 100 mM의 NaCl과 혼합하여 제조된) 상이한 샘플 조성물의 분리 및 정성 분석을 보여준다. A) 상이한 샘플 조성물 각각에 대해, 베리 플롯을 사용하여 계산된 UV 신호(260 nm에서), 광산란 신호(90°에서) 및 해당 회전 반경(Rg) 값이 중첩되어 표시된다. B) MALS 신호로부터 계산된 Rg 값은 적절한 누적 중량 분율 분석에 대해 플롯팅된 후 해당 D90 값의 계산이 뒤따른다. C) 누적 중량 분율 분석에서 파생된 Rg(D90) 값은 100 mM의 NaCl(검은색 점)이 있거나 NaCl(열린 점)이 없는 지질/RNA 비율의 함수로서 플롯팅된다.
도 13은 Rg 값에 대한 유체역학적 반경(Rh) 값의 상관관계를 통해 "형상 계수"를 추정한 것을 보여준다. 값은 선형 회귀에 적합하고 결과 구배는 입자 형상에 대한 정보를 제공한다.
도 14는 본 명세서에 개시된 AF4 방법에 의한 다양한 입자 조성물(LPX, LNP, 폴리플렉스 입자(PLX), 리포솜, VLPs+LPX)의 분리 및 특성화를 보여준다. AF4-UV-MALS-DLS 분리/검출이 표시된다. 90°각도에서 LS는 실선으로 표시되며 입자 피크를 나타낸다. 파선은 260 nm에서 기록된 UV 신호(RNA 검출용)를 나타낸다. 회전 반경(Rg) 값(어두운 점)은 Zimm 플롯을 사용하여 다중각 광산란(MALS) 신호에서 파생된다. 동적 광산란(DLS, 회색 점)은 유체역학적 반경(Rh)을 제공한다. 개별 입자 피크 분율은 회색 막대로 강조 표시된다. A) AF4-UV-MALS-DLS 분리/검출 후 1.3/2의 몰비로 지질 및 RNA를 함유하는 LPX 샘플의 대표적인 프락토그램. B) 두 가지 유형(짧은 RNA-LPX:VLP, 1:1 혼합물)의 입자를 포함하는 조성물의 대표적인 프락토그램. C) 리포솜 샘플(2/1의 몰비로 DOTMA 및 DOPE로 구성된 양으로 하전된 리포솜)의 대표적인 프락토그램. D) LPX 샘플의 대표적인 프락토그램(4/1의 몰비로 DOTMA 및 콜레스테롤 및 RNA를 함유하는 양으로 하전된 LPX). E) DODMA, 콜레스테롤, DOPE, PEG(1.2/1.44/0.3/0.06의 몰비) 및 3/1의 몰비의 RNA로 구성된 지질 나노입자(LNP) 샘플의 대표적인 프락토그램. F) JetPEI 중합체 및 IVT-RNA 또는 saRNA를 12/1의 입자 대 RNA 비율로 함유하는 입자의 대표적인 프락토그램.
도 15는 이온(염화나트륨)의 존재하에서 RNA 거동의 분석을 보여준다. 상이한 염화나트륨 농도(0 내지 50 mM)에서 미제형화된 RNA로부터의 예시적인 AF4 프락토그램(90°에서의 광산란 신호가 보여짐)이 도시된다. 회전 반경(Rg) 값은 Zimm 플롯을 사용하여 다중각 광산란(MALS)에서 파생된다.
도 16은 염화나트륨 처리 후 RNA의 특성화를 보여준다. A) 다양한 염화나트륨 농도(0 내지 50 mM)에 대한 누적 중량 분율 분석에서 파생된 Rg(D50) 값이 표시된다. B) RNA Rg(D50) 값(도 16a)은 염화나트륨 농도에 대해 플롯팅되었고 비율(mM 염화나트륨 대 nm Rg)이 계산되었다. 0 내지 10 mM의 NaCl 값의 비율 선형 적합은 굵은 선으로 표시되는 반면, 점선은 10 내지 50 mM의 NaCl의 피팅을 나타낸다. 회색과 검은색 선은 두 가지 상이한 RNA 농도를 사용한 측정의 예를 나타낸다.
도 17은 복합 샘플 조성물에서 유리/미결합 RNA의 정량화를 보여준다. A) 본 명세서에 개시된 AF4 방법을 사용하여, 입자가 없는 조성물에서 260 nm에서의 UV 흡수에 의해 상이한 양의 유리 RNA(1 내지 15 μg)를 검출하였다. 선형 보정 곡선을 생성하기 위해 곡선 아래 각각의 UV 피크 면적(AUC*min)에 대해 RNA 양을 플롯팅하였다. B) 상이한 양의 입자 조성물(1 내지 15 μg의 총 RNA 함유)을 AF4 방법으로 분석하였다. 중첩된 AF4 프락토그램은 260 nm에서 UV 신호를 보여준다. 제1 피크(용리 시간: 내지 20분)는 유리 RNA에 해당하는 반면, 제2 피크(용리 시간: 내지 38분)는 입자(결합 RNA)에 해당한다. 입자 조성물에서 유리 미결합 RNA의 양은 참조 RNA(=100%)와 관련하여 계산될 수 있다(도 17a 참조). C) 방법의 선형성을 나타내기 위해, 유리 RNA (도 17b 참조) 뿐만 아니라 참조 네이키드 RNA (도 17a 참조)의 UV 피크 적분을 상이한 RNA 양(1 내지 15 μg)의 함수로 플롯팅한다. D) 유리 RNA의 정량화를 위한 제2로 선호되는 절차(직접 방법)로, 미결합 RNA 피크가 정의되고 RNA의 특정 소광 계수를 사용하여 RNA 양을 직접 계산할 수 있다.
도 18은 상이한 물리화학적 거동을 갖는 샘플 조성물에서 유리 RNA 양의 분석을 보여준다. A) NaCl 없는 입자 조성물 (가변 전하 비율 (0.1 내지 0.9)로 혼합된 (DOTMA/DOPE 2/1)/RNA 복합체)의 AF4-UV 프락토그램 또는 B) 입자 조성물이 도시된다. C) 260 nm에서 AF4-UV-검출을 사용하여 100 mM의 NaCl(검은색 원)이 있고 NaCl이 없는(열린 원) 계산된 미결합 RNA의 백분율(mol/mol) 플롯. 모든 혼합물을 이중으로 제조하고 적어도 이중으로 측정하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. D) 260 nm에서 RNA의 소광 계수를 사용하여 계산된, 100 mM NaCl (검은색 원)이 있고 NaCl (개방된 원)이 없는 미결합 RNA 농도(μg/mL)의 플롯.
도 19는 입자 조성에서 총 RNA의 정량화를 보여준다. A) 본 명세서에 개시된 AF4 방법에 의해 분리된 쯔비터젠트(Zwittergent) 처리된 네이키드 RNA의 AF4 프락토그램. 260 nm의 UV 신호는 검은색 선으로 표시되고 90°의 LS 신호는 파선으로 표시된다. B) 유리 RNA(회색으로 강조 표시) 및 결합 RNA(제2 피크), 90°각도에서 LS 신호(파선)가 있는 UV 검출(실선)이 있는 입자 조성물의 대표적인 프락토그램. C) 입자가 방출제(액상에는 0.1% 쯔비터젠트를 함유함)를 사용하여 용해된 RNA 조성물의 해당 AF4 프락토그램, UV 검출(실선) 및 90°에서의 광산란(점선). D) 방출제(Zwittergent)로 처리한 후 네이키드 RNA 및 총 RNA의 직접 정량화.
도 20은 RNA 및 입자를 함유하는 샘플 조성물에서 유리 RNA 및 총 RNA의 무결성을 보여준다. A) 본 명세서에 개시된 AF4 방법을 사용하여 RNA 무결성이 상이한 RNA를 갖는 분리된 입자의 UV 자취(미처리 RNA: 검은색 실선, 부분적으로 열분해된 RNA: 점선; 혼합물(정의된 방식으로 혼합, 미처리 50% 및 완전 분해 50%) 완전히 분해된 비율(%): 파선, 입자에서 완전히 분해된 RNA: 회색 실선). B) 온전한 유리 RNA(어두운 회색) 및 입자에서 전체(검은색) 및 완전히 분해된(밝은 회색) 유리 RNA의 정량화. C) AF4 분리 후 용해된 입자의 UV 흔적(액상에서 방출제 사용). D) 입자 내 유리 및 총 RNA의 AF4-UV 측정에 의해 분석된 결정된 무결성. 막대 다이어그램은 입자(검은색 막대)에서 결정된 총 RNA 값의 무결성과 비교하여 유리 RNA(회색 막대)의 상대적 RNA 무결성을 나타낸다.
도 21은 RNA의 상이한 분획(전체, 결합, 캡슐화, 접근 가능, 표면 및 미결합 RNA)이 본 명세서에 개시된 AF4 방법에 의해 어떻게 결정될 수 있는지의 도식을 보여준다. 예를 들어, AF4 방법은 삽입작용 염료(예를 들어, GelRED)의 형광 방출 신호를 사용하여 접근 가능한 RNA 및/또는 표면 RNA의 정량화에 사용할 수 있다. 유리(미결합), 전체 및 접근 가능한 RNA의 정량화 조합을 사용하여 캡슐화, 결합 및 표면 RNA를 계산할 수 있다. 600 nm에서 GelRED의 형광 방출은 RNA에 삽입되어 향상된다.
도 22는 (A) 본 명세서에 개시된 AF4 방법을 사용한 형광 검출의 선형성; (B) 접근 가능한(검은색 막대) 및 캡슐화된(회색 막대) RNA의 상대적인 양을 보여주는 막대 다이어그램; 및 (C) 입자 조성물에서 유리 RNA의 상대적인 양의 비교를 보여주고, 상기 양은 상이한 RNA 검출을 사용하여 결정되었다: 260 nm에서 UV 흡수(검은색 막대) 및 600 nm에서 형광 방출 신호(FS)(회색 막대).
도 23은 참조 RNA를 사용하지 않고 본 명세서에 개시된 AF4 방법으로 RNA 무결성의 분석을 보여준다. A) 90°에서 LS 신호(점선) 및 260 nm에서 UV 신호(실선)를 갖는 긴 saRNA의 예시적인 AF4 프락토그램이 표시된다. 굵은 어두운 선은 MALS 신호에서 파생된 분자량 곡선을 나타낸다. B) 더 나은 개요를 위해, (A)의 분자량 곡선만 도 23b의 상부 패널에 실선으로 표시된다. 총 RNA 피크(피크 1)에 대한 한계는 총 UV 피크 신호를 기반으로 설정된다 (즉, t = 10분에서 t = 40분까지). 여기에서 "온전한" RNA 피크(피크 2)에 대한 한계는 다음과 같이 분자량 곡선(MALS에서 파생됨)의 1차 도함수에 의해 설정된다. 분자량 곡선으로부터의 1차 도함수가 계산된다 (도 23b의 하부 패널에서 점선). 분자량 곡선의 수평 부분은 미분해 RNA의 분획이 존재하는 체류 시간을 반영한다. 이를 기반으로, 통합 한계를 선택할 수 있으며 샘플에서 미분해 RNA의 양을 계산할 수 있다.
도 24는 입자 크기 분포, 특히 누적 RNA 중량 분율, RNA 리포플렉스(LPX) 분획의 RNA 질량, 및 LPX 분획당 RNA 카피의 결정을 위해 UV를 사용한 유리 및 결합 RNA의 정량 분석을 보여준다. A) 90°에서 LS 신호(실선) 및 260 nm에서 UV 신호(점선)를 갖는 RNA LPX 샘플 조성물에 대한 대표적인 AF4 프락토그램이 표시된다. UV 신호는 2개의 피크를 나타내며, 여기서 제1 피크는 미결합 유리 RNA의 양을 나타내고 제2 피크는 RNA를 포함하는 LPX 나노입자의 결과이다. UV 신호는 용리 시간의 함수로서 상이한 분획의 RNA 양을 직접적으로 나타낸다. 회전 반경(Rg, 굵은 선)은 MALS 신호에서 파생된다. B) 도 24a의 260 nm에서의 UV 신호(점선)와 실선으로 UV 신호 아래의 면적을 기반으로 한 누적 중량 분율이 표시된다. C) 특정 크기의 입자를 포함하는 상이한 Rg 분획(Δt = 1분)에서 260 nm에서의 흡수를 사용하여 RNA LPX 샘플 조성물에 결합 RNA 양이 표시된다. 상이한 Rg 분획의 RNA 양의 계산을 위해, LPX 피크(즉, t = 내지 24분에서 시작하여 t = 내지 60분에서 끝나는 도 24a 및 24b의 제2 피크)만 사용되었다. D) 도 24c에 제시된 결과로부터 계산된 Rg 분획(막대, 왼쪽 y축)당 계산된 RNA 카피의 수가 표시된다. Rg 분획당 계산된 입자 수는 해당 점선 곡선(오른쪽 제2 y축)으로 표시된다.
도 25는 본 명세서에 개시된 AF4 방법에서 원형 2색성(CD) 분광법을 사용하는 실현성을 보여준다. A) 90°각도에서 LS 신호(실선) 및 260 nm에서 기록된 CD 신호(점선)를 갖는 RNA 리포플렉스(LPX) 제형에 대한 대표적인 AF4 프락토그램이 표시되며, 여기서 후자는 미결합 RNA(제1 피크, t = 18분) 및 결합 RNA(제2 피크, t = 35분)를 나타낸다. B) 260 nm에서의 UV 검출 및 260 nm에서의 CD 검출을 병렬로 사용하여 네이키드 RNA의 보정 곡선을 생성하였다. 곡선 아래의 피크 영역(CD: 채워진 정사각형 및 실선, UV: 채워진 삼각형 및 점선)은 주입된 RNA 양에 대해 플롯팅된다. CD 및 UV 신호의 피크 면적 비율은 점(제2 오른쪽 y축)으로 표시된다. C) AF4 방법을 사용하여 상이한 양의 RNA LPX 샘플(2 내지 15 μg)을 분석하였다. 적절한 네이키드 RNA로부터의 CD 신호의 곡선 아래 면적(AUC)은 적절한 총 AUC CD 신호와 상관관계가 있으며, 여기서 각각의 CD 피크 AUC 값은 RNA의 양에 대해 플롯팅되어 선형 적합(R2 = 0.998)을 초래한다. RNA LPX 샘플 조성물에서 미결합 RNA(채워지지 않은 정사각형) 및 결합 RNA(채워지지 않은 원)의 상대적인 양(%)은 전체 RNA 양에 대한 미결합 RNA 및 결합 RNA의 양을 상관시켜 결정하였다.
본 개시내용이 하기에 더 상세히 기재되어 있지만, 본 개시내용은 달라질 수 있으므로 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 개시내용의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
이하, 본 발명의 요소에 대해 보다 구체적으로 설명한다. 이러한 요소는 특정 구현예와 함께 나열되지만, 추가 구현예를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 다양하게 기재된 구현예 및 바람직한 구현예는 본 개시내용을 단지 명시적으로 기재된 구현예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이 설명은 명시적으로 기재된 구현예를 임의의 수의 개시된 및/또는 바람직한 요소와 결합하는 구현예를 지원하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 더욱이, 본 출원에서 모든 기재된 요소의 임의의 순열 및 조합은 문맥상 달리 나타내지 않는 한 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 본 개시내용의 방법의 바람직한 구현예에서 AF4가 필드-유동 분획화로서 사용되고 본 개시내용의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서 핵산(예를 들어, RNA)이 시험관내 전사된 RNA인 경우, 본 개시내용의 방법의 추가의 바람직한 구현예에서, AF4는 필드-유동 분획화로서 사용되고 핵산(예를 들어, RNA)은 시험관내 전사된 RNA이다.
바람직하게는, 본 명세서에서 사용되는 용어는 문헌["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. K
Figure pct00001
lbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)]에 기재된 바와 같이 정의된다.
본 개시내용의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 해당 분야의 문헌에 기재된 통상적인 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술을 사용할 것이다(예를 들어 문헌[Organikum, Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin 1990; Streitwieser/Heathcook, "Organische Chemie", VCH, 1990; Beyer/Walter, "Lehrbuch der Organischen Chemie", S. Hirzel Verlag Stuttgart, 1988; Carey/Sundberg, "Organische Chemie", VCH, 1995; March, "Advanced Organic Chemistry", John Wiley & Sons, 1985; Rφmpp Chemie Lexikon, Falbe/Regitz (Hrsg.), Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1989; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook 등 eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989]를 참조한다).
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 뒤따르는 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다(comprise)", 및 "포함한다(comprise)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원들, 정수들 또는 단계들의 군의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 구성원, 정수를 의미하거나 또는 구성원들의 군, 정수를 의미하는 것이 아님을 이해할 것이다. "로 본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"이라는 용어는 본질적으로 중요한 다른 구성원, 정수 또는 단계를 제외하는 것을 의미한다. "포함하는(comprising)"이라는 용어는 "로 본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"이라는 용어를 포함하고, 차례로 "로 이루어진(consisting of)"이라는 용어를 포함한다. 따라서, 본 출원의 각각의 경우에, "포함하는"이라는 용어는 "로 본질적으로 이루어진" 또는 "로 이루어진"이라는 용어로 대체될 수 있다. 마찬가지로, 본 출원에서 각각의 경우에 "로 본질적으로 이루어진"이라는 용어는 "로 이루어진"이라는 용어로 대체될 수 있다.
용어 "a", "an" 및 "the" 및 본 개시내용을 기재하는 문맥에서 (특히 청구항의 문맥에서) 사용된 유사한 참조는 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위의 인용은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로서의 역할을 하도록 의도된다. 본 명세서에 달리 표시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 본 명세서에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 본 명세서에 기재된 모든 방법은 본 명세서에 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 개시내용을 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구된 본 개시내용의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 본 개시내용의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에서 사용된 "및/또는"은 다른 두 가지가 있거나 없는 2개의 지정된 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 마치 각각이 본 명세서에서 개별적으로 기재된 것처럼 (i) X, (ii) Y, (iii) X 및 Y 각각의 특정 개시내용으로 간주되어야 한다.
본 개시내용의 맥락에서, 용어 "약"은 해당 특징의 기술적 효과를 여전히 보장하기 위해 당업자가 이해할 수 있는 정확도의 간격을 나타낸다. 이 용어는 일반적으로 표시된 수치 값에서 ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, ±1%, ±0.9%, ±0.8%, ±0.7%, ±0.6%, ±0.5%, ±0.4%, ±0.3%, ±0.2%, ±0.1%, ±0.05%, 및 예를 들어 ±0.01%의 편차를 나타낸다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 주어진 기술적 효과에 대한 수치 값에 대한 그러한 특정 편차는 기술적 효과의 특성에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 연적 또는 생물학적 기술적 효과는 일반적으로 인공적 또는 조작적 기술적 효과보다 큰 이러한 편차를 가질 수 있다.
본원에서 값의 범위의 인용은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로서의 역할을 하도록 의도된다. 본 명세서에 달리 표시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 본 명세서에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다.
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정의
하기에서, 본 개시내용의 모든 양태에 적용되는 정의가 제공될 것이다. 다음 용어는 달리 명시되지 않는 한 다음과 같은 의미를 갖는다. 임의의 정의되지 않은 용어는 당업계에 인지된 의미를 갖는다.
본 명세서에 사용된 "감소한다" 또는 "억제한다"와 같은 용어는 수준에서 예를 들어, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 또는 약 75% 이상의 전체 반소를 유발하는 능력을 의미한다. "억제한다" 또는 유사한 문구라는 용어는 완전한 또는 본질적으로 완전한 억제, 즉 0으로의 감소 또는 본질적으로 0으로의 감소를 포함한다.
일 구현예에서 "증가한다" 또는 "향상시키다"와 같은 용어는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 100%까지의 증가 향상과 관련된다.
본 명세서에 사용된 "생리적 중성 pH"는 약 7.5의 pH를 지칭한다.
본 개시내용에서 사용된 바와 같이, "% w/v"는 밀리리터(mL) 단위의 용액의 총 부피의 퍼센트로 표현되는 그램(g) 단위의 용질의 양을 측정하는 농도 단위인 부피 퍼센트로 중량을 지칭한다.
"이온 강도"라는 용어는 특정 용액에 있는 상이한 종류의 이온 종의 수와 각각의 전하 사이의 수학적 관계를 지칭한다. 따라서 이온 강도 IS는 수학적으로 다음 공식으로 표시된다:
Figure pct00002
여기서 c는 특정 이온 종의 몰 농도이고 z는 전하의 절대값이다. 합계 Δ는 용액 중의 모든 상이한 종류의 이온(i)에 대해 취한다.
본 개시내용에 따르면, 한 구현예에서 용어 "이온 강도"는 1가 이온의 존재와 관련이 있다. 2가 이온, 특히 2가 양이온의 존재와 관련하여, 일 구현예에서 킬레이트화제의 존재로 인한 이들의 농도 또는 유효 농도(유리 이온의 존재)는 RNA의 분해를 방지하기에 충분히 낮다. 일 구현예에서, 2가 이온의 농도 또는 유효 농도는 RNA 뉴클레오티드 간의 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 위한 촉매 수준 미만이다. 일 구현예에서, 유리 2가 이온의 농도는 20 μM 이하이다. 일 구현예에서, 유리 2가 이온이 존재하지 않거나 본질적으로 존재하지 않는다.
"삼투질농도"는 용매 킬로그램당 용질의 삼투몰 수로 표현되는 특정 용질의 농도를 지칭한다.
"동결"이라는 용어는 일반적으로 열을 제거하여 액체를 고화시키는 것과 관련이 있다.
"동결건조시키는" 또는 "동결건조"라는 용어는 물질을 냉동시킨 다음, 주위 압력을 감소시켜 물질 내의 냉동된 매질이 고체상에서 기체상으로 직접 승화되도록 하는 물질의 냉동-건조를 지칭한다.
"분무 건조"라는 용어는 용기(분무 건조기) 내에서 분무된(atomized)(분무된(sprayed)) 유체와 (가열된) 가스를 혼합하여 물질을 분무 건조하는 것을 말하며, 여기서 형성된 액적의 용매가 증발하여 건조 분말로 이어진다.
"재구성한다"라는 용어는 건조된 생성물에 물과 같은 용매를 첨가하여 원래의 핵상태와 같은 핵상태로 되돌리는 것과 관련된다.
본 개시내용의 맥락에서 용어 "재조합"은 "유전 공학을 통해 만들어진"을 의미한다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 맥락에서 "재조합 대상체"는 자연적으로 생성하지 않는다.
본 명세서에서 "자연적으로 발생하는"이라는 용어는 대상체가가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 유기체(바이러스 포함)에 존재하고 자연에서 분리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 펩타이드 또는 핵산은 자연적으로 발생한다. "자연에서 발견된"이라는 용어는 "자연에 존재하는"을 의미하며, 아직 발견되지 않았거나 자연에서 분리되지 않았지만 자연에서 향우 발견 및/또는 분리될 수 있는 알려진 물체 및 물체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "실온" 및 "주위 온도"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며 적어도 약 15℃, 바람직하게는 약 15℃ 내지 약 35℃, 약 15℃ 내지 약 30℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 또는 약 17℃ 내지 약 22℃의 농도를 지칭한다. 이러한 온도에는 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃ 및 22℃가 포함된다.
"에탄올 주입 기술"이라는 용어는 지질을 포함하는 에탄올 용액을 바늘을 통해 수용액에 빠르게 주입하는 공정을 의미한다. 이 작용은 용액 전체에 지질을 분산시키고 지질 구조 형성, 예를 들어 리포솜 형성과 같은 지질 소포 형성을 촉진한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 핵산(특히 RNA) 리포플렉스 입자는 핵산(특히 RNA)을 콜로이드성 리포솜 분산액에 첨가함으로써 얻을 수 있다. 에탄올 주입 기술을 사용하여, 이러한 콜로이드성 리포솜 분산액은 한 구현예에서 다음과 같이 형성된다: DOTMA와 같은 양이온성 지질 및 추가 지질과 같은 지질을 포함하는 에탄올 용액을 교반 하에 수용액에 주입한다. 일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산(특히 RNA) 리포플렉스 입자는 압출 단계 없이 수득가능하다.
EDTA라는 용어는 에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨 염을 나타낸다. 모든 농도는 EDTA 이나트륨 염과 관련하여 제공된다.
용어 "알킬"은 포화 선형 또는 분지형 탄화수소의 모노라디칼을 지칭한다. 바람직하게는, 알킬 기는 1 내지 12 (예컨대 1 내지 10개의) 탄소 원자, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 탄소 원자 (예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 탄소 원자), 더 바람직하게는 1 내지 8개의 탄소 원자, 예컨대 1 내지 6 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다. 예시적인 알킬 기는 메틸, 에틸, 프로파일, 이소-프로필 (또한 소위 2-프로필 또는 1-메틸에틸), 부틸, 이소-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소-펜틸, sec-펜틸, 네오-펜틸, 1,2-디메틸-프로필, 이소-아밀, n-헥실, 이소-헥실, sec-헥실, n-헵틸, 이소-헵틸, n-옥틸, 2-에틸-헥실, n-노닐, n-데실, n-운데실, n-도데실, 등을 포함한다.
본 개시내용에 따르면, 용어 "펩타이드"는 올리고- 및 폴리펩타이드를 포함하고 펩타이드 결합을 통해 서로 연결된 약 2개의 이상, 약 3 이상, 약 4 이상, 약 6 이상, 약 8 이상, 약 10 이상, 약 13 이상, 약 16 이상, 약 20 이상, 및 최대 약 50, 약 100 또는 약 150개의 연속적인 아미노산을 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질"은 큰 펩타이드, 특히 약 151개 이상의 아미노산을 갖는 펩타이드를 지칭하지만, 용어 "펩타이드" 및 "단백질"은 일반적으로 본 명세서에서 동의어로 사용된다.
본 개시내용에 따르면, 일단 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 RNA (바람직하게는 mRNA)와 같은 핵산이 세포에 의해 흡수되거나 도입, 즉 트랜스펙션되거나 형질도입되면, 세포가 시험관내 또는 대상체에 존재할 수 있는 세포가 상기 펩타이드 또는 단백질의 발현을 야기하는 것이 바람직하다. 세포는 인코딩된 펩타이드 또는 단백질을 세포내(예를 들어, 세포질 및/또는 핵에서) 발현할 수 있고, 인코딩된 펩타이드 또는 단백질을 분비하거나 표면에서 발현할 수 있다.
본 개시내용에 따르면, "핵산 발현" 및 "핵산 인코딩" 또는 유사한 용어와 같은 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며 특정 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 관련하여, 핵산이 적절한 환경에 존재하는 경우, 바람직하게는 세포 내에서 발현되어 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 생성할 수 있다는 것을 의미한다.
본 개시내용에 따르면, 펩타이드 또는 단백질의 부분 또는 단편은 바람직하게는 그것이 유래된 펩타이드 또는 단백질의 적어도 하나의 기능적 특성을 갖는다. 이러한 기능적 특성은 약리학적 활성, 다른 펩타이드 또는 단백질과의 상호작용, 효소 활성, 항체와의 상호작용, 및 핵산의 선택적 결합을 포함한다. 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질의 약리학적 활성 단편은 단편이 유래된 펩타이드 또는 단백질의 약리학적 활성 중 적어도 하나를 갖는다. 펩타이드 또는 단백질의 부분 또는 단편은 바람직하게는 펩타이드 또는 단백질의 적어도 6, 특히 적어도 8, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30 또는 적어도 50개의 연속적인 아미노산의 서열을 포함한다. 펩타이드 또는 단백질의 부분 또는 단편은 바람직하게는 펩타이드 또는 단백질의 최대 8, 특히 최대 10, 최대 12, 최대 15, 최대 20, 최대 30 또는 최대 55개의 연속적인 아미노산의 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따르면, 펩타이드 또는 단백질의 유사체는 그것이 유래된 상기 펩타이드 또는 단백질의 변형된 형태이고 상기 펩타이드 또는 단백질의 적어도 하나의 기능적 특성을 갖는다. 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질의 약리학적 활성 유사체은 유사체가 유래된 펩타이드 또는 단백질의 약리학적 활성 중 적어도 하나를 갖는다. 이러한 변형은 임의의 화학적 변형을 포함하고 탄수화물, 지질 및/또는 단백질 또는 펩타이드와 같은 단백질 또는 펩타이드와 연관된 임의의 분자의 단일 또는 다중 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함한다. 일 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드의 "유사체"는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 팔미토일화, 미리스토일화, 이소프레닐화, 지질화, 알킬화, 유도체화, 보호/차단 기의 도입, 단백분해 절단 또는 항체에 대한 또는 또 다른 세포 리간드에 대한 결합으로부터 생성된 변형된 형태들을 포함한다. "유사체"라는 용어는 또한 상기 단백질 및 펩타이드의 모든 기능적 화학적 등가물로 확장된다.
본 개시내용에 따른 "항원"은 면역 반응을 유도할 임의의 물질 및/또는 면역 반응 또는 세포성 반응과 같은 면역 기전이 지시되는 임의의 물질을 포괄한다. 이것은 또한 항원이 항원 펩타이드로 처리되고 면역 반응 또는 면역 기전이 특히 MHC 분자와 관련하여 제시되는 경우 하나 이상의 항원 펩타이드에 대해 지시되는 상황을 포함한다. 특히, "항원"은 항체 또는 T-림프구(T-세포)와 특이적으로 반응하는 임의의 물질, 바람직하게는 펩타이드 또는 단백질과 관련이 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "항원"은 T 세포 에피토프와 같은 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 바람직하게는, 본 개시내용의 맥락에서 항원은 선택적으로 프로세싱 후에 면역 반응을 유도하는 분자이고, 이는 바람직하게는 항원(항원을 발현하는 세포 포함)에 특이적이다. 일 구현예에서, 항원은 질환 연관 항원, 예컨대 종양 항원, 바이러스 항원, 또는 박테리아 항원, 또는 이러한 항원으로부터 유래된 에피토프이다.
본 개시내용에 따르면, 면역 반응에 대한 후보인 임의의 적합한 항원이 사용될 수 있으며, 여기서 면역 반응은 체액성 및 세포성 면역 반응 모두일 수 있다. 본 개시내용의 일부 구현예의 맥락에서, 항원은 항원에 대한 면역 반응을 초래하는 MHC 분자의 맥락에서 바람직하게는 세포, 바람직하게는 항원 제시 세포에 의해 제시된다. 항원은 바람직하게는 자연 발생 항원에 상응하거나 그로부터 유도된 생성물이다. 이러한 자연 발생 항원은 알러지항원, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 및 기타 감염원 및 병원체를 포함하거나 이들로부터 유래될 수 있거나 항원은 또한 종양 항원일 수 있다. 본 발명에 따르면, 항원은 자연 발생 생성물, 예를 들어 바이러스 단백질 또는 이의 일부에 해당할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항원은 종양 항원, 즉 종양 세포의 일부, 특히 주로 세포내에서 또는 종양 세포의 표면 항원으로서 발생하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 항원은 병원체 연관 항원, 즉 병원체, 예를 들어 병원체, 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 단세포 유기체, 또는 기생충, 예를 들어 바이러스 항원 예컨대 바이러스 리보핵단백질 또는 코트 단백질로부터 유래된 항원이다. 특히, 항원은 특히 T-세포 수용체의 활성의 조절을 통해 조절, 특히 면역계의 세포, 바람직하게는 CD4+ 및 CD8+ 림프구의 활성화를 초래하는 MHC 분자에 의해 제시되어야 한다.
"질환 연관 항원"이라는 용어는 질환과 연관된 모든 항원을 지칭하기 위해 가장 넓은 의미로 사용된다. 질환 연관 항원은 숙주의 면역계를 자극하여 질환에 대한 세포 항원 특이적 면역 반응 및/또는 체액성 항체 반응을 일으키는 에피토프를 포함하는 분자이다. 질환 연관 항원은 병원체 연관 항원, 즉 미생물에 의한 감염과 관련된 항원, 일반적으로 미생물 항원(예를 들어, 박테리아 또는 바이러스 항원), 또는 암, 일반적으로 종양, 예를 들어 종양 항원과 관련된 항원을 포함한다.
용어 "종양 항원"은 세포질, 세포 표면 또는 세포 핵으로부터 유래될 수 있는 암 세포의 구성성분을 지칭한다. 특히, 세포 내에서 또는 종양 세포의 표면 항원으로 생성되는 항원을 지칭한다. 예를 들어, 종양 항원은 암배아성 항원, α1-태아단백, 이소페리딘, 및 태아 설포당단백질, α2-H-페로단백질 및 γ-태아단백, 뿐만 아니라 다양한 바이러스 종양 항원을 포함한다. 본 개시내용에 따르면, 종양 항원은 바람직하게는 유형 및/또는 발현 수준과 관련하여 종양 또는 암 뿐만 아니라 종양 또는 암 세포에 대해 특징적인 임의의 항원을 포함한다.
용어 "바이러스 항원"은 항원 특성, 즉 개체에서 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 바이러스 구성요소를 지칭한다. 바이러스 항원은 바이러스 리보핵단백질 또는 외피 단백질일 수 있다.
용어 "박테리아 항원"은 항원 특성, 즉 개체에서 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 박테리아 구성요소를 지칭한다. 박테리아 항원은 박테리아의 세포벽 또는 세포질 멤브레인에서 유래할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항원과 같은 분자 내의 항원 결정인자, 즉 면역계에 의해 인식되는, 예를 들어 특히 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 항체 T 세포 또는 B 세포에 의해 인식되는 분자의 부분 또는 단편을 지칭한다. 단백질의 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 연속 또는 불연속 부분을 포함하고 바람직하게는 약 5 내지 약 100, 바람직하게는 약 5 내지 약 50, 더 바람직하게는 약 8 내지 약 0, 가장 바람직하게는 약 10 내지 약 25 개 길이의 아미노산이고, 예를 들어, 에피토프는 바람직하게는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 개 길이의 아미노산일 수 있다. 본 발명의 맥락에서 에피토프는 T 세포 에피토프인 것이 특히 바람직하다.
용어들 예컨대 "에피토프", " 항원의 단편", "면역원성 펩타이드" 및 "항원 펩타이드"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 바람직하게는 바람직하게는 항원 또는 항원을 발현하거나 포함하고 바람직하게는 제시하는 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 불완전한 표시와 관련이 있다. 바람직하게는, 용어는 항원의 면역원성 부분과 관련이 있다. 바람직하게는, 특히 MHC 분자와 관련하여 제시되는 경우 T 세포 수용체에 의해 인식되는(즉, 특이적으로 결합되는) 항원의 일부이다. 특정 바람직한 면역원성 부분은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합한다.
용어 "T 세포 에피토프"는 MHC 분자와 관련하여 제시될 때 T 세포에 의해 인식되는 단백질의 부분 또는 단편을 지칭한다. 용어 "주요 조직적합성 복합체" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하며 모든 척추동물에 존재하는 유전자 복합체와 관련이 있다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 병든 세포 사이의 신호 전달에 중요하며, 여기서 MHC 단백질 또는 분자는 펩타이드 에피토프에 결합하고 T 세포 상의 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 제시한다. MHC에 의해 인코딩된 단백질은 세포 표면에 발현되며, T 세포에 자가 항원(세포 자체의 펩타이드 단편)과 비자가 항원(예를 들어, 침입 미생물의 단편)을 모두 표시한다. 클래스 I MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합 펩타이드는 일반적으로 길이가 약 8 내지 약 10개 아미노산이지만 더 길거나 더 짧은 펩타이드가 효과적일 수 있다. 클래스 II MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합 펩타이드는 일반적으로 길이가 약 10 내지 약 25개 아미노산이고 특히 약 13개 내지 약 18개 아미노산 길이인 반면, 더 길고 더 짧은 펩타이드가 효과적일 수 있다.
용어 "표적"은 세포성 면역 반응과 같은 면역 반응의 표적이 되는 세포 또는 조직과 같은 제제를 의미한다. 표적은 항원 또는 항원 에피토프, 즉 항원에서 유래된 펩타이드 단편을 제시하는 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 표적 세포는 항원을 발현하고 바람직하게는 클래스 I MHC와 함께 상기 항원을 제시하는 세포이다.
"일부"라는 용어는 분획을 나타낸다. 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 특정 구조와 관련하여, 그의 용어 "일부"는 상기 구조의 연속적 또는 불연속적 분획을 지정할 수 있다.
"일부" 및 "단편"이라는 용어는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며 연속적인 요소를 지칭한다. 예를 들어, 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 구조의 일부는 상기 구조의 연속 요소를 지칭한다. 조성물의 맥락에서 사용될 때, 용어 "일부"는 조성물의 부분을 의미한다. 예를 들어, 조성물의 일부는 상기 조성물의 0.1% 내지 99.9%(예를 들어, 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 50%, 90%, 또는 99%)의 임의의 부분일 수 있다.
"항원 프로세싱"은 항원의 단편인 프로세싱 생성물로의 항원의 분해 (예를 들어, 펩타이드로의 단백질의 분해), 및 세포, 바람직하게는 항원-제시 세포에 의한 특이적 T-세포로의 제시를 위한 MHC 분자와 이들 단편 중 하나 이상의 회합 (예컨대, 결합을 통해)을 지칭한다.
"항원-반응성 CTL"은 항원 제시 세포의 표면에 클래스 I MHC로 제시되는 항원 또는 상기 항원으로부터 유래된 펩타이드에 반응성인 CD8+ T-세포를 의미한다.
본 발명에 따르면, CTL 반응성은 지속적인 칼슘 플럭스, 세포 분열, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생성, CD44 및 CD69와 같은 활성화 마커의 상향 조절, 및 표적 세포를 발현하는 종양 항원의 특이적 세포용해 사멸을 포함할 수 있다. CTL 반응성은 CTL 반응성을 정확하게 나타내는 인공 리포터를 사용하여 결정될 수도 있다.
용어 "면역 반응(immune response)" 및 "면역 반응(immune reaction)"은 본 명세서에서 그들의 통상적인 의미로 상호교환가능하게 사용되며 항원에 대한 통합된 신체 반응을 지칭하고 바람직하게는 세포성 면역 반응, 체액성 면역 반응, 또는 둘 모두를 지칭한다. 본 발명에 따르면, 항원, 세포 또는 조직과 같은 제제에 대한 "에 대한 면역 반응" 또는 "에 대항하는 대한 면역 반응"이라는 용어는 제제에 대항하는 세포성 반응과 같은 면역 반응과 관련이 있다. 면역 반응은 하나 이상의 항원에 대한 항체의 발달 및 항원 특이적 T-림프구, 바람직하게는 CD4+ 및 CD8+ T-림프구, 보다 바람직하게는 CD8+ T-림프구의 확장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 반응을 포함할 수 있으며, 이는 시험관 내 다양한 증식 또는 사이토카인 생산 테스트에서 검출될 수 있다.
용어 "면역 반응 유도(inducing an immune response)" 및 "면역 반응 유도(eliciting an immune response)" 및 본 발명의 맥락에서 유사한 용어는 면역 반응의 유도, 바람직하게는 세포성 면역 반응, 체액성 면역 반응, 또는 둘 모두의 유도를 지칭한다. 면역 반응은 보호적/방지적/예방적 및/또는 치료적일 수 있다. 면역 반응은 임의의 면역원 또는 항원 또는 항원 펩타이드, 바람직하게는 종양 연관 항원 또는 병원체 연관 항원(예를 들어, 바이러스 (예컨대 인플루엔자 바이러스 (A, B, 또는 C), CMV 또는 RSV)의 항원)에 대해 유도될 수 있다. 이 맥락에서 "유도하는(Inducing)"는 유도 전에 특정 항원 또는 병원체에 대한 면역 반응이 없었다는 것을 의미할 수 있지만, 또한 상기 면역 반응이 향상되지 전후에 특정 항원 또는 병원체에 대한 특정 수준의 면역 반응이 있었음을 의미할 수도 있다. 따라서, 이 맥락에서 "면역 반응을 유도하는 것"은 또한 "면역 반응을 향상시키는 것"을 포함한다. 바람직하게는, 개체에서 면역 반응을 유도한 후, 상기 개체는 감염성 질환 또는 암성 질환과 같은 질환의 발병으로부터 보호되거나 면역 반응을 유도함으로써 질환 상태가 개선된다.
용어 "세포성 면역 반응", "세포성 반응", "세포 매개 면역성" 또는 유사한 용어는 항원의 발현 및/또는 클래스 I 또는 클래스 II MHC를 갖는 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 세포성 반응을 포함함을 의미한다. 세포성 반응은 "헬퍼(helper)" 또는 "킬러(killer)"로 작용하는 T 세포 또는 T 림프구라고 하는 세포와 관련된다. 헬퍼 T 세포(CD4+ T 세포라고도 함)는 면역 반응을 조절함으로써 중심 역할을 하고 킬러 세포(세포독성 T 세포, 세포용해성 T 세포, CD8+ T 세포 또는 CTL이라고도 함)는 병든 세포와 같은 세포를 사멸시킨다.
"체액성 면역 반응"이라는 용어는 항체가 궁극적으로 중화 및/또는 제거하는 제제 및 유기체에 대한 반응으로 생성되는 살아있는 유기체의 과정을 의미한다. 항체 반응의 특이성은 단일 특이성의 항원에 결합하는 멤브레인 연관 수용체를 통해 T 및/또는 B 세포에 의해 매개된다. 적절한 항원이 결합하고 다양한 다른 활성화 신호를 받은 후, B 림프구는 분열하여 기억 B 세포와 항체 분비 형질 세포 클론을 생성하며, 각각은 항원 수용체에 의해 인식되는 동일한 항원 에피토프를 인식하는 항체를 생성한다. 기억 B 림프구는 나중에 특정 항원에 의해 활성화될 때까지 휴면 상태를 유지한다. 이 림프구는 기억의 세포 기반을 제공하고 특정 항원에 재노출될 때 항체 반응의 단계적 확대를 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 항원 상의 특정 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 특히, 용어 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 용어 "항체"는 단클론성 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및 이들 중 임의의 것의 조합을 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH)과 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 가변 영역 및 불변 영역은 또한 본원에서 각각 가변 도메인 및 불변 도메인으로 지칭된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다. FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. VH의 CDR을 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3이라고 하고, VL의 CDR을 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3이라고 한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역(CH) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하며, 여기서 CH는 불변 도메인 CH1, 힌지 영역, 및 불변 도메인 CH2 및 CH3(아미노말단에서 카복시 말단으로 다음 순서로 배열됨: CH1, CH2, CH3)로 더 세분될 수 있다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 전통적 보체계의 제1 성분(C1q)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린일 수 있고 온전한 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 일반적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다. 항체는 예를 들어 다클론 항체, 단클론 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2뿐만 아니라 단일 사슬 항체 및 인간화 항체를 비롯한 다양한 형태로 존재할 수 있다.
용어 "면역글로불린"은 면역글로불린 슈퍼패밀리의 단백질, 바람직하게는 항체 또는 B 세포 수용체(BCR)와 같은 항원 수용체와 관련이 있다. 면역글로불린은 구조적 도메인, 즉 특징적인 면역글로불린(Ig) 접힘을 갖는 면역글로불린 도메인을 특징으로 한다. 상기 용어는 멤브레인 결합된 면역글로불린 및 가용성 면역글로불린을 포괄한다. 막 결합 면역글로불린은 일반적으로 BCR의 일부인 표면 면역글로불린 또는 멤브레인 면역글로불린이라고도 한다. 가용성 면역글로불린은 일반적으로 항체라고 한다. 면역글로불린은 일반적으로 디설파이드 결합을 통해 연결된 여러 개의 사슬, 일반적으로 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함한다. 이들 사슬은 주로 면역글로불린 도메인, 예컨대 VL (가변 경쇄) 도메인, CL (불변 경쇄) 도메인, VH (가변 중쇄) 도메인, 및 CH (불변 중쇄) 도메인CH1, CH2, CH3, 및 CH4으로 구성된다. 5개 유형의 포유동물 면역글로불린, 즉, α, δ, ε, γ, 및 μ가 있고, 이는 상이한 클래스 항체, 즉, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM을 포함한다. 가용성 면역글로불린의 중쇄와 대조적으로, 멤브레인 또는 표면 면역글로불린의 중쇄는 카복시 말단에 막횡단 도메인 및 짧은 세포질 도메인을 포함한다. 포유동물에는 두 가지 유형의 경쇄, 즉 람다와 카파가 있다. 면역글로불린 사슬은 가변 영역과 불변 영역을 포함한다. 불변 영역은 면역글로불린의 다른 이소타입 내에서 본질적으로 보존되며, 여기서 가변 부분은 매우 다양하고 항원 인식을 설명한다.
"백신접종" 및 "면역화"라는 용어는 치료 또는 예방 목적으로 개체를 치료하는 과정을 설명하고 특히, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이를 코딩하는 RNA 형태에서 하나 이상의 면역원(들) 또는 항원(들) 또는 그의 유도체를 개체에게 투여하고, 상기 하나 이상의 면역원(들) 또는 항원(들)의 제시를 특징으로하는 상기 하나 이상의 면역원(들) 또는 항원(들) 또는 세포에 대한 면역 반응을 자극하는 절차와 관련이 있다.
"항원의 제시를 특징으로 하는 세포" 또는 "항원을 제시하는 세포" 또는 "항원 제시 세포의 표면에 항원을 제시하는 MHC 분자" 또는 유사한 표현은 MHC 분자, 바람직하게는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자, 가장 바람직하게는 MHC 부류 I 분자와 관련하여, 직접적으로 또는 프로세싱 후에, 병든 세포, 특히 종양 세포, 또는 항원 또는 항원 펩타이드를 제시하는 항원 제시 세포와 같은 세포를 의미한다.
본 개시내용의 맥락에서, 용어 "전사"는 DNA 서열의 유전자 코드가 RNA로 전사되는 과정과 관련이 있다. 이어서, RNA는 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있다.
RNA와 관련하여 "발현" 또는 "번역"이라는 용어는 mRNA 가닥이 펩타이드 또는 단백질을 만들기 위해 아미노산 서열의 조립을 지시하는 세포의 리보솜에서의 과정과 관련이 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "선택적" 또는 "선택적으로"는 후속적으로 기재된 사건, 상황 또는 상태가 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수 있고, 상기 기재가 상기 사건, 환경 또는 상태가 발생하는 경우, 및 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
회전축에 대한 입자의 "회전 반경"(본 명세서에서 Rg로 약칭함)은 회전축으로부터 한 점의 방사상 거리이며, 입자의 전체 질량이 포커싱되어 있다고 가정할 경우, 주어진 축에 대한 관성 모멘트는 실제 질량 분포와 동일하다. 수학적으로, Rg는 질량 중심 또는 주어진 축에서 입자 구성요소의 제곱 평균 제곱근 거리이다. 예를 들어, 질량 중심에서 고정 거리 s i 에 위치한 질량 m i (i = 1, 2, 3, ??, n)의 n개의 질량 요소로 구성된 거대분자의 경우, Rg는 모든 질량 요소에 대한 si2의 질량 평균의 제곱근이고 다음과 같이 계산할 수 있다:
Figure pct00003
회전 반경은 예를 들어 광산란을 사용하여 실험적으로 결정되거나 계산될 수 있다. 특히, 작은 산란 벡터의 경우, 구조 함수 S는 다음과 같이 정의된다:
Figure pct00004
여기서 N은 구성요소의 수이다(Guinier의 법칙).
특히 입자의 정량적 크기 분포와 관련하여 "D10 값"은 입자의 10%가 이 값보다 작은 직경을 갖는 직경이다. D10 값은 입자 집단 내에서 가장 작은 입자의 비율을 설명하는 수단이다(예를 들어, 필드-유동 분획에서 수득한 입자 피크 내).
특히 입자의 정량적 크기 분포와 관련하여 "D50 값"은 입자의 50%가 이 값보다 작은 직경을 갖는 직경이다. D50 값은 입자 집단의 평균 입자 크기를 설명하는 수단이다(예를 들어, 필드-유동 분획화에서 수득한 입자 피크 내).
특히 입자의 정량적 크기 분포와 관련하여 "D90" 값은 입자의 90%가 이 값보다 작은 직경을 갖는 직경이다. "D95", "D99" 및 "D100" 값은 해당 의미를 갖는다. D90, D95, D99 및 D100 값은 입자 집단 내에서 더 큰 입자의 비율을 설명하는 수단이다(예를 들어, 필드-유동 분획에서 수득한 입자 피크 내).
입자의 "유체역학적 반경"(때때로 "스톡스 반경" 또는 "스톡스-아인슈타인 반경"이라고도 함)은 상기 입자와 동일한 속도로 확산되는 가상의 단단한 구형체의 반경이다. 유체역학적 반경은 크기뿐만 아니라 용매 효과를 고려하여 입자의 이동성과 관련이 있다. 예를 들어, 더 강한 수화를 갖는 더 작은 하전 입자는 더 약한 수화를 갖는 더 큰 하전 입자보다 더 큰 유체역학적 반경을 가질 수 있다. 이것은, 더 작은 입자가 용액을 통해 이동할 때, 더 많은 수의 물 분자를 끌기 때문이다. 용매 중의 입자의 실제 치수는 직접 측정할 수 없기 때문에 유체역학적 반경은 스톡스-아인슈타인 방정식으로 정의할 수 있다:
Figure pct00005
여기서 k B 는 볼츠만 상수이고; T는 온도이다. η는 용매의 점도이다. D는 확산 계수이다. 확산 계수는 예를 들어 동적 광산란(DLS)을 사용하여 실험적으로 결정할 수 있다. 따라서, 입자 또는 입자 집단의 유체역학적 반경(예를 들어, 본 명세서에 개시된 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 입자의 유체역학적 반경 또는 샘플 또는 대조 조성물에 필드-유동 분획을 적용하여 수득된 입자 피크의 유체역학적 반경)은 상기 입자 또는 입자 집단의 DLS 신호(예를 들어, 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 입자의 DLS 신호 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 대조 조성물의 DLS 신호 샘플 또는 대조 조성물에 필드-유동 분획을 적용하여 수득된 입자 피크의 DLS 신호)를 측정하는 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "형상 계수"는 유체역학적 반경(Rh) 값에 대한 Rg 값(예를 들어, 재계산된 Rg 값)의 비율을 의미한다. 이는 유체역학적 반경(Rh) 값에 대해 Rg 값(예를 들어, 재계산된 Rg 값)을 플롯팅하고 데이터 포인트를 함수(예를 들어, 선형 함수)에 피팅하여 결정하거나 계산할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "형태 계수"는 (재계산된 Rg 값과 같은) Rg 값에 대한 유체역학적 반경(Rh) 값의 비율을 의미한다. Rg 값(예를 들어, 재계산된 Rg 값)에 대해 유체역학적 반경(Rh) 값을 플롯팅하고 데이터 포인트를 함수(예를 들어, 선형 함수)에 피팅하여 결정하거나 계산할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "핵산 캡슐화 효율"이라는 표현은 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 핵산의 총량에 대한 핵산 및 입자를 포함하는 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 캡슐화된 핵산의 양의 비율을 의미한다. 예를 들어, 핵산이 RNA인 경우, 본 명세서에서 사용된 "RNA 캡슐화 효율"이라는 표현은 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 RNA의 총량에 대한 RNA 및 입자를 포함하는 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 캡슐화된 RNA의 양의 비율을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "멤브레인(membrane)"은 "컷-오프"(예를 들어, 분자량(MW) 컷-오프)라고 하는 특정 크기 미만의 분자가 통과하지만, 상기 특정 크기 (즉, 컷-오프, 예컨대 MW 컷-오프) 초과의 분자를 차단하는 것을 허용하는 크기 선택적 장벽을 지칭한다. 바람직하게는, 멤브레인은 합성이다. 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 적합한 막의 예는 한외여과 멤브레인, 폴리에테르설폰 (PES) 멤브레인, 재생 셀룰로스 멤브레인, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 멤브레인, 및 다른 한외여과 멤브레인을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "응집체"는 입자 클러스터에 관한 것으로, 입자는 동일하거나 매우 유사하고 (예를 들어, 이온성 상호작용, H 브릿지 상호작용, 쌍극자 상호작용, 및/또는 반데르발스 상호작용을 통해) 비공유 방식으로 서로 부착된다.
본 명세서에 사용된 표현 "광산란"은 광이 통과하는 매질에서의 국소화된 불균일성으로 인해 광이 직선 궤적으로부터 하나 이상의 경로에 의해 벗어나도록 강제되는 물리적 과정을 지칭한다.
용어 "UV"는 자외선을 의미하고, 10 nm 내지 400 nm의 파장을 갖는 전자기 스펙트럼의 밴드, 즉 가시광선의 밴드보다 짧지만 X-선보다 긴 밴드를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "원형 2색성 분광법" 또는 "CD 분광법"은 원편광을 사용하는 분광법을 지칭한다. 바람직하게는 CD 분광법은 왼쪽 및 오른쪽 빛의 차등 흡수를 수반한다.
"UV CD 광" 또는 "UV CD 신호"라는 용어는 10 nm 내지 400 nm의 파장을 갖는 원편광, 즉 가시광보다 짧지만 X선보다 긴 원편광을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "다중각 광산란" 또는 "MALS"라는 표현은 샘플에 의해 산란된 광을 복수의 각도로 측정하는 기술과 관련이 있다. 이와 관련하여 "다중각"은, 예를 들어 선택된 특정 각을 포함하는 범위에 걸쳐 이동된 단일 검출기 또는 특정 각 위치에 고정된 검출기의 어레이에 의해 측정된 바와 같이 상이한 불연속 각에서 산란광을 검출할 수 있음을 의미한다. 바람직한 일 구현예에서, MALS에 사용되는 광원은 레이저 소스(MALLS: 다중각 레이저 광산란)이다. 입자를 포함하는 조성물의 MALS 신호에 기초하고 적절한 형식(예를 들어, Zimm 플롯, 베리 플롯 또는 Debye 플롯)을 사용하여, 회전 반경(Rg) 및 따라서 상기 입자의 크기를 결정할 수 있다. 바람직하게는, Zimm 플롯은 다음 방정식을 사용하는 그래픽 표현이다:
Figure pct00006
여기서 c는 용매 중 입자의 질량 농도(g/mL)이고; A 2 는 제2 비리얼 계수(mol·mL/g2); P(θ)는 각도에 대한 산란광 강도의 각도 의존성과 관련된 형태 계수이고; R θ 는 초과 레일리 비율(cm-1)이고; 그리고 K*는 4π2ηo ( dn /dc) 2 λ 0 - 4 N A -1과 같은 광학 상수이고, 여기서 ηo는 입사 복사(진공) 파장에서 용매의 굴절률이고, λ0는 입사 복사(진공) 파장(nm)이고, N A 는 아보가드로 수(mol- 1)이고 그리고 dn /dc는 시차 굴절률 증분(mL/g)이다(예를 들어, 문헌[Buchholz 등 (Electrophoresis 22 (2001), 4118-4128); B.H. Zimm (J. Chem. Phys. 13 (1945), 141; P. Debye (J. Appl. Phys. 15 (1944): 338; 및 W. Burchard (Anal. Chem. 75 (2003), 4279-4291]을 참조한다). 바람직하게는 베리 플롯은 다음 항으로 계산한다:
Figure pct00007
여기서 c, R θ 및K *는 상기에서 정의한 바와 같다. 바람직하게는 Debye 플롯은 다음 항으로 계산된다:
Figure pct00008
여기서 c, R θ 및K *는 상기에서 정의한 바와 같다. 핵산 (특히 RNA) 이 그 자체로 상기 제공된 정의의 의미에서 입자가 아니지만, 핵산 (특별히 RNA)의 크기는 또한 임의의 상기 형식학 (예를 들어, Zimm 플롯, 베리 플롯, 또는 Debye 플롯)을 사용하여 결정될 수 있는데, 이는 핵산 (각종 RNA)은 랜덤 코일의 형태로 존재한다고 가정한다. 따라서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도의 일 구현예에서, 핵산(예를 들어, RNA)의 크기, 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA)의 Rg 값을 기초로 계산된다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도의 일 구현예에서, 핵산(예를 들어, RNA)의 크기, 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA)의 Rh 값을 기초로 계산된다. 본 개시내용의 방법 및/또는 용도의 또 다른 구현예에서, 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 핵산 (예컨대 RNA)의 Rg 값을 기준으로 하고 별도로 핵산 (예컨대 RNA)의 Rh 값을 기준으로 계산된다 (즉, 이 구현예는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포에 대한 2개의 데이터 세트를 생성하고, 하나는 Rg 값을 기준으로 하고 하나는 Rh 값을 기준으로 함).
본 명세서에 사용된 "동적 광산란" 또는 "DLS"라는 표현은 특히 입자의 유체역학적 반경과 관련하여 입자의 크기 및 크기 분포 프로파일을 결정하는 기술을 지칭한다. 일반적으로 레이저와 같은 단색 광원이 편광자를 통해 샘플로 발사된다. 이어서, 산란된 광은 제2 편광자를 통과하여 검출되고, 생성된 이미지는 스크린 상에 투사된다. 용액의 입자는 빛과 부딪치고 모든 방향으로 광을 회절시킨다. 입자에서 회절된 빛은 구조상으로(밝은 영역) 간섭하거나 파괴적으로(어두운 영역) 간섭할 수 있다. 이 프로세스는 짧은 시간 간격으로 반복되며 결과적인 반점 패턴의 세트는 시간 경과에 따라 각 지점의 빛 강도를 비교하는 자동 상관기에 의해 분석된다.
본 명세서에 사용된 표현 "정적 광산란" 또는 "SLS"는, 특히 입자의 회전 반경 및/또는 입자의 몰 질량과 관련하여, 입자의 크기 및 크기 분포 프로파일을 결정하기 위한 기술을 지칭한다. 일반적으로 레이저와 같은 고강도 단색광이 입자를 포함하는 용액에서 발사된다. 하나 이상의 검출기는 하나 이상의 각도에서 산란 강도를 측정하는 데 사용된다. 반경의 모든 거대 분자에 대한 몰 질량과 크기의 정확한 측정을 얻으려면 각도 의존성이 필요하다. 따라서 다중각 광산란(MALS) 또는 다중각 레이저 광산란(MALLS)으로 알려진 입사광의 방향에 대해 여러 각도에서 동시 측정은 일반적으로 정적 광산란의 표준 구현으로 간주된다.
표현 "용리 시간" 및 "체류 시간"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 설정된 조건 하에서 특정 피분석물이 (예를 들어, 필드-유동 분획 장치의 주입 지점으로부터 검출기로) 시스템을 통과하는 데 걸리는 시간과 관련이 있다.
"연속 변화"라는 표현은 한 값에서 다른 값으로의 변경이 점프 없이 꾸준히 수행됨을 의미한다. 연속 변화의 예로는 선형 변화 또는 지수 변화(예를 들어, 선형 구배 또는 지수 구배)가 있다.
"단계적 변경"이라는 표현은 한 값에서 다른 값으로의 변화가 연속적이지 않고 제1 특정 값에서 제2 특정 값으로 점프하여 제1 값과 제2 값 사이의 값 중 적어도 하나를 제외하는 것을 의미한다. 단계적 변화의 예는 제1 값(예를 들어, 10 mL/분)에서 시작하여 제2 값(예를 들어, 0 mL/분)에서 끝나는 유량 프로파일이며, 여기서 이 프로파일 동안 유량은 정수(예를 들어, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0 mL/분)를 사용하여 이러한 정수 사이의 값을 남긴다.
본 명세서에 사용된 "핵산(예를 들어, RNA) 및 선택적으로 입자를 포함하는 조성물을 제공하는"이라는 표현은, 이러한 조성물이 임의의 수단에 의해 제공되고, 예를 들어, 이는 제조, 처리(예를 들어, 정제 및/또는 건조) 및/또는 저장될 수 있음을 의미한다.
핵산
본 명세서에 따르면, "핵산"이라는 용어는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 이들의 조합, 및 이들의 변형된 형태를 포함한다. 이 용어는 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합으로 생성되고 화학적으로 합성된 분자를 포함한다. 본 개시내용에 따르면, 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 및 선형 또는 공유적으로 원형으로 닫힌 분자로서 존재할 수 있다. 핵산은 본 개시내용에 따라 단리될 수 있다. 용어 "단리된 핵산"은 본 개시내용에 따라, 핵산이 (i) 예를 들어 DNA에 대한 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 RNA에 대한 시험관내 전사 (예를 들어 RNA 중합효소를 사용함)를 통해 시험관내에서 증폭되었고, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생산되었고, 그리고 (iii) 예를 들어 절단 및 겔 전기영동에 의한 분리에 의해 정제되었거나, 또는 (iv) 예를 들면 화학적 합성에 의해 합성되었음을 의미한다.
용어 "뉴클레오사이드"(본원에서 "N"으로 약칭됨)는 포스페이트 기가 없는 뉴클레오티드로 생각될 수 있는 화합물과 관련이 있다. 뉴클레오사이드가 당(예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스)에 연결된 핵염기인 반면, 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드와 하나 이상의 포스페이트 기로 구성된다. 뉴클레오사이드의 예는 시티딘, 우리딘, 슈도우리딘, 아데노신 및 구아노신을 포함한다.
일반적으로 자연적으로 발생하는 핵산을 구성하는 5가지 표준 뉴클레오사이드는 우리딘, 아데노신, 티미딘, 시티딘 및 구아노신이다. 5개의 뉴클레오사이드는 일반적으로 각각 U, A, T, C 및 G의 하나의 문자 코드로 축약된다. 그러나 티미딘은 우리딘에서 발견되는 리보푸라노스 고리보다 2'-데옥시리보푸라노스 부분을 포함하기 때문에 "dT"("d"는 "데옥시"를 나타냄)로 더 일반적으로 표기된다. 이는 티미딘이 리보핵산(RNA)이 아닌 데옥시리보핵산(DNA)에서 발견되기 때문이다. 반대로 우리딘은 DNA가 아닌 RNA에서 발견된다. 나머지 3개의 뉴클레오사이드는 RNA와 DNA에서 모두 발견될 수 있다. RNA에서는 A, C 및 G로 표시되지만 DNA에서는 dA, dC 및 dG로 표시된다.
변형된 퓨린(A 또는 G) 또는 피리미딘(C, T, 또는 U) 염기 모이어티는 바람직하게는 하나 이상의 알킬 기, 보다 바람직하게는 하나 이상의 C1-4 알킬 기, 훨씬 더 바람직하게는 하나 이상의 메틸기에 의해 변형된다. 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 모이어티의 특정 예는 N7-알킬-구아닌, N6-알킬-아데닌, 5-알킬-시토신, 5-알킬-우라실, 및 N(1)-알킬-우라실, 예컨대 N7-C1-4 알킬-구아닌, N6-C1-4 알킬-아데닌, 5-C1-4 알킬-시토신, 5-C1-4 알킬-우라실, 및 N(1)-C1-4 알킬-우라실, 바람직하게는 N7-메틸-구아닌, N6-메틸-아데닌, 5-메틸-시토신, 5-메틸-우라실, 및 N(1)-메틸-우라실을 포함한다.
본 명세서에서 "DNA"라는 용어는 데옥시리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 핵산 분자와 관련이 있다. 바람직한 구현예에서, DNA는 데옥시리보뉴클레오티드 잔기의 전부 또는 대부분을 함유한다. 본 명세서에서 "데옥시리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실기의 2' 위치에 하이드록실 기가 없는 뉴클레오티드를 지칭한다. DNA는 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, 단리된 DNA 예컨대 부분적으로 정제된 DNA, 본질적으로 순수한 DNA, 합성 DNA, 재조합으로 생산된 DNA 뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 추가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생 DNA와 다른 변형된 DNA를 비제한적으로 포괄한다. 이러한 변경은 내부 DNA 뉴클레오티드 또는 DNA의 말단(들)에 비-뉴클레오티드 물질을 추가하는 것을 의미할 수 있다. 또한, DNA의 뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드와 같은 비표준 뉴클레오티드일 수 있음이 본 명세서에서 고려된다. 본 개시내용의 경우, 이들 변경된 DNA는 자연 발생 DNA의 유사체로 간주된다. 분자 내 데옥시리보뉴클레오티드 잔기의 함량이 분자 내의 뉴클레오타이드 잔기의 총 수를 기준으로 50% 초과 (예컨대 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%)인 경우, 분자는 "대다수의 데옥시리보뉴클레오타이드 잔기"를 함유한다. 분자 내 뉴클레오티드 잔기의 총 수는 모든 뉴클레오티드 잔기의 합계이다(뉴클레오티드 잔기가 표준(즉, 자연 발생) 뉴클레오티드 잔기 또는 이의 유사체인지 여부에 관계없이).
일 구현예에서, DNA는 재조합 DNA이고 핵산, 특히 cDNA의 클로닝에 의해 수득될 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 얻어질 수 있다.
본 명세서에서 "RNA"라는 용어는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 핵산 분자와 관련이 있다. 바람직한 구현예에서, RNA는 리보뉴클레오티드 잔기의 전부 또는 대부분을 함유한다. 본 명세서에서 "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 하이드록실 기를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. RNA는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합으로 생산된 RNA 뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 추가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생 RNA와 다른 변형된 RNA를 비제한적으로 포괄한다. 이러한 변경은 내부 RNA 뉴클레오티드 또는 RNA의 말단(들)에 비-뉴클레오티드 물질을 추가하는 것을 의미할 수 있다. 또한, RNA의 뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드와 같은 비표준 뉴클레오티드일 수 있음이 본 명세서에서 고려된다. 본 개시내용을 위해, 이러한 변경된/변형된 뉴클레오티드는 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로 지칭될 수 있고, 이러한 변경/변형된 뉴클레오티드를 함유하는 상응하는 RNA(즉, 변경된/변형된 RNA)는 천연 발생 RNA의 유사체로 지칭될 수 있다. 분자 내 리보뉴클레오티드 잔기의 함량이 분자 내의 뉴클레오타이드 잔기의 총 수를 기준으로 50% 초과 (예컨대 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%)인 경우, 분자는 "대다수의 리보뉴클레오타이드 잔기"를 함유한다. 분자 내 뉴클레오티드 잔기의 총 수는 모든 뉴클레오티드 잔기의 합계이다(뉴클레오티드 잔기가 표준(즉, 자연 발생) 뉴클레오티드 잔기 또는 이의 유사체인지 여부에 관계없이).
본 개시내용에 따르면, "RNA"는 mRNA, tRNA, 리보솜 RNA (rRNA), 작은 핵 RNA (snRNA), 자가 증폭 RNA (saRNA), 단일-가닥 RNA (ssRNA), dsRNA, 억제 RNA (예컨대 안티센스 ssRNA, 작은 간섭 RNA (siRNA), 또는 microRNA (miRNA)), 활성화 RNA (예컨대 작은 활성화 RNA) 및 면역자극성 RNA (isRNA)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "시험관내 전사" 또는 "IVT"는 전사(즉, RNA의 생성)가 무세포 방식으로 수행됨을 의미한다. 즉, IVT는 살아있는/배양된 세포를 사용하지 않고 오히려 세포에서 추출된 전사 기구(예를 들어, RNA 중합효소(바람직하게는 T7, T3 또는 SP6 중합효소)를 포함하는 세포 용해물 또는 이의 분리된 성분)를 사용한다.
본 개시내용에 따르면, "mRNA"라는 용어는 "메신저-RNA"를 의미하며, DNA 주형을 이용하여 생성될 수 있고, 펩타이드 또는 단백질을 인코딩할 수 있는 "전사체"와 관련이 있다. 전형적으로, mRNA는 5'-UTR, 펩타이드/단백질 코딩 영역, 및 3'-UTR을 포함한다. 본 개시내용의 맥락에서, mRNA는 바람직하게는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사(IVT)에 의해 생성된다. 상기 기재된 바와 같이, 시험관내 전사 방법론은 당업자에게 공지되어 있으며, 다양한 시험관내 전사 키트가 상업적으로 입수가능하다.
mRNA는 단일 가닥이지만 mRNA의 일부가 접혀 이중 나선을 형성하기 위해 자체적으로 쌍을 이루는 자가 상보적 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따르면, "dsRNA"는 이중 가닥 RNA를 의미하며, 부분적으로 또는 완전히 상보적인 2개의 가닥을 갖는 RNA이다.
RNA의 길이는 10개 뉴클레오티드 내지 15,000개, 예컨대 40개 내지 15,000개, 100개 내지 12,000개 또는 200개 내지 10,000개 뉴클레오티드로 다양할 수 있다. 일 구현예에서, RNA는 억제성 RNA이고 10 100개의 뉴클레오티드 (예컨대 많아야 90개의 뉴클레오티드, 많아야 80개의 뉴클레오티드, 많아야 70개의 뉴클레오티드, 많아야 60개의 뉴클레오티드, 많아야 50개의 뉴클레오티드, 많아야 45 뉴클레오티드, 많아야 40개의 뉴클레오티드, 많아야 35 뉴클레오티드, 많아야 30개의 뉴클레오티드, 많아야 25 뉴클레오티드, 또는 많아야 20개의 뉴클레오티드)의 길이를 갖는다. 일 구현예에서, RNA는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하고 적어도 45 뉴클레오티드 (예컨대 적어도 60, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1,000, 적어도 1,500, 적어도 2,000, 적어도 2,500, 적어도 3,000, 적어도 3,500, 적어도 4,000, 적어도 4,500, 적어도 5,000, 적어도 6,000, 적어도 7,000, 적어도 8,000, 적어도 9,000개의 뉴클레오티드), 바람직하게는 최대 15,000, 예컨대 최대 14,000, 최대 13,000, 최대 12,000개의 뉴클레오티드, 최대 11,000개의 뉴클레오티드 또는 최대 10,000개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
본 개시내용의 특정 구현예에서, RNA는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA 전사체와 관련된 mRNA이다. 당업계에 확립된 바와 같이, mRNA는 일반적으로 5' 미번역 영역(5'-UTR), 펩타이드 인코딩 영역 및 3' 미번역 영역(3'-UTR)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 시험관내 전사 또는 화학적 합성에 의해 생성된다. 일 구현예에서, mRNA는 DNA 주형을 사용하는 시험관내 전사에 의해 생성된다. 시험관내 전사 방법론은 당업자에게 알려져 있으며; 예를 들어, [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook 등 eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989]을 참조한다. 또한, 다양한 시험관내 전사 키트는 Thermo Fisher Scientific (예컨대 TranscriptAidTM T7 키트, MEGAscript® T7 키트, MAXIscript®), New England BioLabs Inc. (예컨대 HiScribeTM T7 키트, HiScribeTM T7 ARCA mRNA 키트), Promega (예컨대 RiboMAXTM, HeLaScribe®, Riboprobe® systems), Jena Bioscience (예컨대 SP6 또는 T7 전사 키트), 및 Epicentre (예컨대 AmpliScribeTM)에서 상업적으로 입수할 수 있다. 변형된 RNA를 제공하기 위해, 변형된 천연 발생 뉴클레오티드, 비-천연 발생 뉴클레오티드 및/또는 변형된 비-자연 발생 뉴클레오티드와 같은 상응하게 변형된 뉴클레오티드가 합성(바람직하게는 시험관내 전사) 동안 통합될 수 있거나 변형이 전사 후 RNA에 영향을 받을 수 있고/거나 그에 첨가될 수 있다.
일 구현예에서, RNA는 시험관내 전사된 RNA(IVT-RNA)이고 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있다. 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의 RNA 중합효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. 시험관내 전사용 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝하고 시험관내 전사를 위한 적절한 벡터에 도입함으로써 얻을 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 얻어질 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, RNA, 바람직하게는 mRNA는, 예를 들어 그의 안정성을 증가시키고/거나 번역 효율을 증가시키고/시키거나 면역원성을 감소시키고/시키거나 세포독성을 감소시키기 위해 하나 이상의 변형을 함유한다. 예를 들어, RNA(특히 mRNA)의 발현을 증가시키기 위해, 바람직하게는 발현된 펩타이드 또는 단백질의 서열을 변경하지 않고 코딩 영역, 즉 발현된 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 서열 내에서 변형될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 WO 2007/036366 및 PCT/EP2019/056502에 기재되어 있으며 다음을 포함한다: 5'-캡 구조; 자연 발생 폴리(A) 테일의 확장 또는 말단절단; 상기 RNA의 코딩 영역과 관련되지 않은 UTR의 도입과 같은 5'- 및/또는 3'-미번역 영역(UTR)의 변경; 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드를 합성 뉴클레오티드로 대체; 및 코돈 최적화(예를 들어, RNA의 GC 함량을 변경, 바람직하게는 증가). 본 개시내용에 따른 변형된 RNA(바람직하게는 mRNA)의 맥락에서 용어 "변형"은 바람직하게는 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA(바람직하게는 mRNA)의 임의의 변형과 관련이 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 RNA(바람직하게는 mRNA)는 5'-캡 구조를 포함한다. 일 구현예에서, RNA(바람직하게는 mRNA)는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 일 구현예에서, RNA(바람직하게는 mRNA)는 통상적인 5'-캡 및/또는 5'-캡 유사체를 포함할 수 있다. "종래의 5'-캡"이라는 용어는 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조를 지칭하고, 일반적으로 트리포스메이트 모이어티를 통해 mRNA의 다음 뉴클레오티드의 5'-말단에 연결된 구아노신 5'-트리포스메이트(Gppp)으로 구성된다 (즉, 구아노신은 5'에서 5'로의 트리포스메이트 결합을 통해 나머지 mRNA에 연결됨). 구아노신은 위치 N7에서 메틸화될 수 있다(캡 구조 m7Gppp에서 생성됨). 용어 "5'-캡 유사체"는 종래의 5'-캡을 기반으로 하지만 역방향으로 5'-캡 유사체의 통합을 피하기 위해 m7구아노신 구조의 2'- 또는 3'-위치에서 변형된 5'-캡을 의미한다(이러한 5'-캡 유사체는 또한 소위 항-가역적 캡 유사체 (ARCA)임). 특히 바람직한 5'-캡 유사체는 전체 내용이 본 명세서에 포함되어 있는 PCT/EP2019/056502에 기재된 바와 같이 β-포스페이트 (예컨대 m2 7,2'OG(5')ppSp(5')G (베타-S-ARCA 또는 β-S-ARCA로 지칭함))에서 포스페이트 브릿지, 예컨대 포스포로티오에이트 변형된 5'-캡 유사체에서 브릿징 및 비-브릿징 산소에서 하나 이상의 치환을 갖는 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 5'-캡 구조를 갖는 RNA(바람직하게는 mRNA)를 제공하는 것은 상응하는 5'-캡 화합물의 존재 하에 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 상기 5'-캡 구조는 생성된 RNA 가닥 내로 동시-전사적으로 혼입되거나, 또는 RNA (바람직하게는 mRNA)는 예를 들어 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있고, 5'-캡 구조는 캡핑 효소, 예를 들어 백시니아 바이러스의 캡핑 효소를 사용하여 전사후 RNA에 부착될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 RNA(바람직하게는 mRNA)는 m2 7,2'OG(5')ppSp(5')G (특히 그것의 D1 부분입체이성질체), m2 7, 3'OG(5')ppp(5')G, 및 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG로 이루어진 군으로부터 선택된 5'-캡 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA(바람직하게는 mRNA)는 cap0, cap1 또는 cap2, 바람직하게는 cap1 또는 cap2를 포함한다.
본 개시내용에 따르면, 용어 "cap0"은 구조 "m7GpppN"을 의미하며, 여기서 N은 위치 2'에서 OH 모이어티를 보유하는 임의의 뉴클레오시드이다. 본 개시내용에 따르면, 용어 "cap1"은 구조 "m7GpppNm"을 의미하며, 여기서 Nm은 위치 2'에서 OCH3 모이어티를 보유하는 임의의 뉴클레오시드이다. 본 개시내용에 따르면, 용어 "cap2"는 구조 "m7GpppNmNm"을 의미하며, 여기서 각각의 Nm은 독립적으로 위치 2'에서 OCH3 모이어티를 보유하는 임의의 뉴클레오시드이다.
베타-S-ARCA(β-S-ARCA)의 D1 부분입체이성질체는 다음과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00009
"베타-S-ARCA의 D1 부분입체 이성질체" 또는 "베타-S-ARCA(D1)"는 베타-S-ARCA의 D2 부분입체 이성질체(베타-S-ARCA(D2))이고, 따라서 더 짧은 체류 시간을 나타낸다. HPLC는 바람직하게는 분석용 HPLC이다. 일 구현예에서, 바람직하게는 다음 형식의 Supelcosil LC-18-T RP 컬럼: 5 μm, 4.6 x 250 mm는 분리에 사용되어 1.3 mL/분의 유량을 적용할 수 있다. 일 구현예에서, 암모늄 아세테이트 중 메탄올의 구배, 예를 들어 15분 이내 0.05 M 암모늄 아세테이트 중 메탄올의 0-25% 선형 구배, pH = 5.9가 사용된다. UV 검출(VWD)은 260 nm에서 수행할 수 있고 형광 검출(FLD)은 280 nm에서 여기 및 337 nm에서 검출에서 수행될 수 있다.
cap1의 빌딩 블록인 5'-캡 유사체 m2 7,3'- OGppp(m1 2'-O)ApG (m2 7, 3'OG(5')ppp(5')m2 '- OApG라고도 함)는 다음의 구조를 갖는다:
Figure pct00010
β-S-ARCA 및 RNA를 포함하는 예시적인 cap0 RNA는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00011
m2 7,3'OG(5')ppp(5')G 및 RNA를 포함하는 예시적인 cap0 RNA는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00012
m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 및 RNA를 포함하는 예시적인 cap1 RNA는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00013
본 명세서에 사용된 용어 "폴리-A 테일" 또는 "폴리-A 서열"은 RNA 분자의 3'-말단에 전형적으로 위치하는 아데닐레이트 잔기의 중단되지 않거나 중단된 서열을 지칭한다. 폴리-A 테일 또는 폴리-A 서열은 당업자에게 공지되어 있고 본 명세서에 기재된 RNA에서 3'-UTR을 따를 수 있다. 중단되지 않은 폴리-A 테일은 연속적인 아데닐레이트 잔기가 특징이다. 본질적으로, 중단되지 않은 폴리 A 테일이 일반적이다. 본원에 개시된 RNA는 전사 후 주형-독립적 RNA 중합효소에 의해 RNA의 유리 3'-말단에 부착된 폴리-A 테일 또는 DNA에 의해 코딩되고 주형-의존적 RNA 중합효소로 전사된 폴리-A 테일을 가질 수 있다.
약 120A 뉴클레오티드의 폴리-A 테일이 형질감염된 진핵 세포 내의 RNA 수준 및 폴리-A 테일의 업스트림에 존재하는 열린 해독틀에서 번역되는 단백질 수준에 유익한 영향을 미친다는 것이 입증되었다(Holtkamp 등, 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017).
폴리 A 테일은 임의의 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리-A 테일은 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 80, 또는 적어도 100 및 최대 500, 최대 400, 최대 300, 최대 200, 또는 최대 150 A 뉴클레오티드, 및, 특히, 약 120 A 뉴클레오티드를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 이루어진다. 이러한 맥락에서, "로 본질적으로 이루어진다"는, 폴리-A 테일 내의 대부분의 뉴클레오티드, 전형적으로 폴리-A 테일 내의 뉴클레오타이드의 수로 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%은 A 뉴클레오티드임을 의미하지만, 남아 있는 뉴클레오티드가 A 뉴클레오티드 외의 뉴클레오티드, 예컨대 U 뉴클레오티드 (우리딜레이트), G 뉴클레오티드 (구아닐레이트), 또는 C 뉴클레오티드 (사이티딜레이트)임을 허용한다. 이러한 맥락에서, "로 이루어진다"는 폴리-A 테일 내의 모든 뉴클레오티드, 즉 폴리-A 테일 내의 뉴클레오타이드의 수로 100%가 A 뉴클레오티드임을 의미한다. 용어 "A 뉴클레오티드" 또는 "A"는 아데닐레이트를 지칭한다.
일부 구현예에서, 폴리-A 테일은 코딩 가닥에 상보적인 가닥에 반복된 dT 뉴클레오티드(데옥시티미딜레이트)를 포함하는 DNA 주형에 기초하여 RNA 전사 동안, 예를 들어 시험관내 전사된 RNA의 제조 동안 부착된다. 폴리-A 테일(코딩 가닥)를 인코딩하는 DNA 서열은 폴리(A) 카세트로 지칭된다.
일부 구현예에서, DNA의 코딩 가닥에 존재하는 폴리(A) 카세트는 본질적으로 dA 뉴클레오티드로 이루어지지만, 4개의 뉴클레오티드(dA, dC, dG 및 dT)의 랜덤 서열에 의해 중단된다. 이러한 랜덤 서열은 길이가 5 내지 50, 10 내지 30, 또는 10 내지 20개의 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 카세트는 WO 2016/005324 A1에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. WO 2016/005324 A1에 개시된 임의의 폴리(A) 카세트가 본 발명에서 사용될 수 있다. dA 뉴클레오티드로 본질적으로 이루어지지만 4개의 뉴클레오티드(dA, dC, dG, dT)가 균등하게 분포되어 있고 길이가 예를 들어 5 내지 50개 뉴클레오티드인 랜덤 서열에 의해 중단된 폴리(A) 카세트는, DNA 수준에서, E. 콜라이에서 플라스미드 DNA의 일정한 전파 및 여전히 RNA 수준에서, 지지 RNA 안정성 및 번역 효율과 관련하여 유익한 특성과 관련되어 있다. 결과적으로, 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 RNA 분자에 함유된 폴리-A 테일은 본질적으로 A 뉴클레오티드로 이루어지지만, 4개의 뉴클레오티드(A, C, G, U)의 랜덤 서열에 의해 중단된다. 이러한 랜덤 서열은 길이가 5 내지 50, 10 내지 30, 또는 10 내지 20개의 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 구현예에서, A 뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드는 그의 3'-말단에서 폴리-A 테일에 측접하지 않고, 즉, 폴리-A 테일은 마스킹되지 않거나 A 이외의 뉴클레오티드가 그의 3'-말단에서 뒤따른다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 RNA는 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다. 용어 "미번역 영역" 또는 "UTR"은 전사되지만 아미노산 서열로 번역되지 않는 DNA 분자의 영역, 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자의 상응하는 영역과 관련이 있다. 미번역 영역(UTR)은 열린 해독틀(5'-UTR)의 5'(업스트림) 및/또는 열린 해독틀(3'-UTR)의 3'(다운스트림)에 존재할 수 있다. 존재하는 경우, 5'-UTR은 단백질 인코딩 영역의 시작 코돈 업스트림인 5'-말단에 위치한다. 5'-UTR은 5'-캡(존재하는 경우)의 다운스트림, 예를 들어 5'-캡에 직접 인접한다. 3'-UTR은, 존재하는 경우, 단백질-인코딩 영역의 종결 코돈의 다운스트림인 3'-말단에 위치하지만, 용어 "3'-UTR"은 바람직하게는 폴리-A 서열을 포함하지 않는다. 따라서, 3'-UTR은 폴리-A 서열(존재하는 경우)의 업스트림, 예를 들어 폴리-A 서열에 직접 인접한다. 3'-UTR을 RNA(바람직하게는 mRNA) 분자의 3'-미번역 영역에 통합하면 번역 효율이 향상될 수 있다. 상승작용 효과는 이러한 3'-UTR 중 2개 이상을 통합하여 달성할 수 있다(바람직하게는 수미식으로 배열됨, 예를 들어 문헌[Holtkamp 등, Blood 108, 4009-4017 (2006)]을 참조함). 3'-UTR은 이들이 도입되는 RNA(바람직하게는 mRNA)에 대해 자가 또는 이종일 수 있다. 한 특정 구현예에서, 3'-UTR은 alpha2-글로빈, alpha1-글로빈, 또는 베타-글로빈, 바람직하게는 베타-글로빈, 더 바람직하게는 인간 베타-글로빈의 유전자 또는 mRNA와 같은 글로빈 유전자 또는 mRNA로부터 유래한다. 예를 들어, RNA(바람직하게는 mRNA)는 alpha2-글로빈, alpha1-글로빈, 베타-글로빈, 바람직하게는 베타-글로빈, 더 바람직하게는 인간 베타-글로빈와 같은 글로빈 유전자로부터 유래된 3'-UTR의 1개의 이상, 바람직하게는 2개의 카피로 기존의 3'-UTR로 대체하거나 상기 카피의 삽입으로 변형될 수 있다.
RNA(바람직하게는 mRNA)는 그의 안정성을 증가시키고/시키거나 면역원성을 감소시키고/시키거나 세포독성을 감소시키기 위해 변형된 리보뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 RNA 내의 우리딘은 변형된 뉴클레오시드에 의해 (부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히) 대체된다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 변형된 우리딘이다.
일부 구현예에서, 우리딘을 대체하는 변형된 우리딘은 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸-우리딘(m5U), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, RNA 내의 우리딘을 (부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히) 대체하는 변형된 뉴클레오시드는 3-메틸-우리딘 (m3U), 5-메톡시-우리딘 (mo5U), 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘 (s2U), 4-티오-우리딘 (s4U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘 (ho5U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘 (예를 들어, 5-아이오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 우리딘 5-옥시아세트산 (cmo5U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르 (mcmo5U), 5-카복시메틸-우리딘 (cm5U), 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-카복시하이드록시메틸-우리딘 (chm5U), 5-카복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스테르 (mchm5U), 5-메톡시카보닐메틸-우리딘 (mcm5U), 5-메톡시카보닐메틸-2-티오-우리딘 (mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘 (nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-우리딘 (mnm5U), 1-에틸-슈도우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘 (mnm5se2U), 5-카바모일메틸-우리딘 (ncm5U), 5-카복시메틸아미노메틸-우리딘 (cmnm5U), 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (cmnm5s2U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-우리딘 (
Figure pct00014
m5U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘(
Figure pct00015
m5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘), 5-메틸-2-티오-우리딘 (m5s2U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘 (m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘 (m3ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘 (D), 디하이드로슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 5-메틸-디하이드로우리딘 (m5D), 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘 (acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필)슈도우리딘 (acp3 ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘 (inm5U), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘 (inm5s2U), α-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘 (Um), 5,2'-O-디메틸-우리딘 (m5Um), 2'-O-메틸-슈도우리딘 (ψm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘 (s2Um), 5-메톡시카보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘 (mcm5Um), 5-카바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘 (ncm5Um), 5-카복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘 (cmnm5Um), 3,2'-O-디메틸-우리딘 (m3Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘 (inm5Um), 1-티오-우리딘, 데옥시티미딘, 2'-F-아라-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-아라-우리딘, 5-(2-카보메톡시비닐) 우리딘, 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)우리딘, 또는 당업계에서 알려진 임의의 다른 변형된 우리딘 중 임의의 하나 이상일 수 있다
(우리딘을 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 대체하는) 슈도우리딘에 의해 변형된 RNA (바람직하게는 mRNA)은 본원에서 "ψ-변형된"으로 지칭되는 반면, 용어 "m1ψ-변형된"은, RNA (바람직하게는 mRNA)가 N(1)-메틸슈도우리딘 (이는 우리딘을 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 대체함)을 함유함을 의미한다. 또한, "m5U-변형된"이라는 용어는 RNA(바람직하게는 mRNA)가 5-메틸우리딘 (이는 우리딘을 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 대체함)을 함유함을 의미한다. 이러한 ψ- 또는 m1ψ- 또는 m5U-변형 RNA는 일반적으로 변형되지 않은 형태와 비교하여 감소된 면역원성을 나타내므로 면역 반응의 유도를 피하거나 최소화해야 하는 응용 분야에서 선호된다.
본 개시내용의 RNA (바람직하게는 mRNA)의 코돈은, 예를 들어 RNA의 GC 함량을 증가시키고/거나 관심 펩타이드 또는 단백질이 상기 세포 (또는 대상체)에서 동의어의 빈번한 코돈인 코돈에 의해 발현되어야 하는 세포 (또는 대상체)에서의 희귀한 코돈을 대체하기 위해 추가로 최적화될 수 있다.
하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드를 합성 뉴클레오티드 (예를 들어, 시티딘 및/또는 슈도우리딘 (ψ) 또는 N(1)-메틸슈도우리딘 (m1ψ)의 경우 5-메틸시티딘 또는 우리딘의 경우 5-메틸우리딘 (m5U))로 대체하는 전술한 변형의 조합, 즉 5'-캡 구조의 통합, 폴리-A 서열의 통합, 폴리-A 서열의 마스킹 해제, 5'- 및/또는 3'-UTR의 변경(예를 들어, 하나 이상의 3'-UTR의 혼입), 및 코돈 최적화는 RNA(바람직하게는 mRNA)의 안정성과 번역 효율의 증가에 상승작용 영향을 미친다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 RNA (바람직하게는 mRNA)는 전술한 변형 중 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4 또는 5개 모두의 조합, 즉 (i) 5'-캡 구조의 통합, (ii) 폴리-A 서열의 통합, (iii) 폴리-A 서열의 마스킹 해제, (iv) 5'- 및/또는 3'-UTR의 변경(예를 들어, 하나 이상의 3'-UTR의 혼입), 및 (iv) 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드를 합성 뉴클레오티드 (예를 들어, 시티딘 및/또는 슈도우리딘 (ψ) 또는 N(1)-메틸슈도우리딘 (m1ψ)의 경우5-메틸시티딘 또는 우리딘의 경우 5-메틸우리딘 (m5U))로 대체, 및 (v) 코돈 최적화를 함유한다.
일 구현예에서, 본 개시내용에 따른 RNA는 펩타이드 또는 단백질, 바람직하게는 약제학적 활성 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 RNA는 펩타이드 또는 단백질, 바람직하게는 약제학적 활성 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 특히 세포 또는 대상체로 전달되는 경우 상기 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 RNA는 바람직하게는 펩타이드 또는 단백질, 바람직하게는 약제학적 활성 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 코딩 영역(열린 해독틀(ORF))을 포함한다. 이와 관련하여 "열린 해독틀" 또는 "ORF"는 시작 코돈으로 시작하여 정지 코돈으로 끝나는 코돈의 연속적인 스트레치이다.
본 개시내용에 따르면, 용어 "약제학적 활성 펩타이드 또는 단백질"은 펩타이드 또는 단백질의 발현이 예를 들어, 질환 또는 장애의 증상을 개선하는데 유익할 개체의 치료에 사용될 수 있는 펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 바람직하게는, 약제학적 활성 펩타이드 또는 단백질은 치유적 또는 완화적 특성을 가지며 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 개선, 경감, 완화, 역전시키고, 그 발병을 지연시키거나 그 중증도를 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 약제학적 활성 펩타이드 또는 단백질은 치료적 유효량으로 개체에게 투여될 때 개체의 병태 또는 질환 상태에 긍정적이거나 유리한 효과를 갖는다. 약제학적 활성 펩타이드 또는 단백질은 예방적 특성을 가질 수 있고 질환 또는 장애의 발병을 지연시키거나 그러한 질환 또는 장애의 중증도를 감소시키는 데 사용될 수 있다. "약제학적 활성 펩타이드 또는 단백질"이라는 용어는 전체 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하며, 또한 이의 약제학적 활성 단편을 지칭할 수 있다. 이것은 또한 펩타이드 또는 단백질의 약제학적 활성 유사체를 포함할 수 있다.
약제학적 활성 펩타이드 및 단백질의 특정 예는 사이토카인, 호르몬, 부착 분자, 면역글로불린, 면역학적으로 활성 화합물, 성장 인자, 프로테아제 억제제, 효소, 수용체, 세포자멸사 조절인자, 전사 인자, 종양 억제인자 단백질, 구조 단백질, 재프로그래밍 인자, 게놈 엔지니어링 단백질, 및 혈액 단백질을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
용어 "사이토카인"은 약 5 내지 20 kDa의 분자량을 갖고 세포 신호전달(예를 들어, 주변분비, 내분비, 및/또는 자가분비 신호전달)에 참여하는 단백질과 관련이 있다. 특히, 사이토카인이 방출되면 방출 장소 주변의 세포 행동에 영향을 미친다. 사이토카인의 예는 림포카인, 인터루킨, 케모카인, 인터페론 및 종양 괴사 인자(TNF)를 포함한다. 본 개시내용에 따르면, 사이토카인은 호르몬 또는 성장 인자를 포함하지 않는다. 사이토카인은 (i) 일반적으로 호르몬보다 훨씬 더 다양한 농도에서 작용하고 (ii) 일반적으로 광범위한 세포에서 생성된다는 점에서 호르몬과 다르다(거의 모든 유핵 세포가 사이토카인을 생성할 수 있음). 인터페론은 일반적으로 항바이러스, 항증식 및 면역조절 활성을 특징으로 한다. 인터페론은 조절된 세포 표면의 인터페론 수용체에 결합하여 세포 내에서 바이러스 복제를 방지함으로써 세포 내 유전자의 전사를 변경하고 조절하는 단백질이다. 인터페론은 두 가지 유형으로 분류할 수 있다. IFN-감마는 유일한 II형 인터페론이고; 나머지는 모두 I형 인터페론이다. 사이토카인의 특정 예는 에리트로포이에틴 (EPO), 콜로니 자극 인자 (CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF), 뼈 골 형태형성 단백질 (BMP), 인터페론 알파 (IFNα), 인터페론 베타 (IFNβ), 인터페론 감마 (INFγ), 인터류킨 2 (IL-2), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 10 (IL-10), 및 인터류킨 11 (IL-11)을 포함한다.
"호르몬"이라는 용어는 땀샘에 의해 생성되는 신호전달 분자의 부류에 관한 것으로, 신호전달은 일반적으로 다음 단계를 포함한다: (i) 특정 조직에서 호르몬 합성; (ii) 저장 및 분비; (iii) 호르몬의 표적으로의 수송; (iv) 수용체에 의한 호르몬의 결합; (v) 신호의 중계 및 증폭 및 (vi) 호르몬의 파괴. 호르몬은 (1) 호르몬은 일반적으로 덜 가변적인 농도로 작용하고 (2) 일반적으로 특정 종류의 세포에 의해 생성된다는 점에서 사이토카인과 다르다. 일 구현예에서, "호르몬"은 펩타이드 또는 단백질 호르몬, 예컨대 인슐린, 바소프레신, 프로락틴, 부신피질자극 호르몬 (ACTH), 갑상선 호르몬, 성장 호르몬 (예컨대 인간 성장된 호르몬 또는 소 소마토트로핀), 옥시토신, 심방-나트륨이뇨 펩타이드 (ANP), 글루카곤, 소마토스타틴, 콜레시스토키닌, 가스트린, 및 렙틴이다.
"부착 분자"라는 용어는 세포 표면에 위치하며 세포가 다른 세포 또는 세포외 기질(ECM)과 결합하는 데 관여하는 단백질과 관련이 있다. 부착 분자는 일반적으로 막관통 수용체이며 칼슘-독립적 (예를 들어, 인테그린, 면역글로불린 슈퍼패밀리, 림프구 귀소 수용체) 및 칼슘-의존적 (카드헤린 및 셀렉틴)으로서 분류될 수 있다. 부착 분자의 특정 예는 인테그린, 림프구 귀소 수용체, 셀렉틴(예를 들어, P-셀렉틴) 및 어드레신이다.
인테그린은 신호 전달에도 관여한다. 특히, 리간드 결합 시, 인테그린은 세포 신호전달 경로, 예를 들어 수용체 티로신 키나제(RTK)와 같은 막횡단 단백질 키나제의 경로를 조절한다. 이러한 조절은 세포 성장, 분열, 생존 또는 분화 또는 세포자멸사로 이어질 수 있다. 인테그린의 특정 예는 다음을 포함한다: α1β1, α2β1, α3β1, α4β1, α5β1, α6β1, α7β1, αLβ2, αMβ2, αIIbβ3, αVβ1, αVβ3, αVβ5, αVβ6, αVβ8, 및 α6β4.
"면역글로불린" 또는 "면역글로불린 슈퍼패밀리"라는 용어는 세포의 인식, 결합 및/또는 부착 과정에 관여하는 분자를 의미한다. 이 슈퍼패밀리에 속하는 분자는 면역글로불린 도메인 또는 접힘으로 알려진 영역을 포함하는 특징을 공유한다. 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원은 항체 (예를 들어, IgG), T 세포 수용체 (TCR), 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자, 공동 수용체 (예를 들어, CD4, CD8, CD19), 항원 수용체 부속품 분자 (예를 들어, CD-3γ, CD3-δ, CD-3ε, CD79a, CD79b), 공동자극 또는 억제 분자 (예를 들어, CD28, CD80, CD86), 및 기타를 포함한다.
용어 "면역학적 활성 화합물"은 바람직하게는 면역 세포의 성숙을 유도 및/또는 억제하고, 사이토카인 생합성을 유도 및/또는 억제하고/거나 B 세포에 의한 항체 생산을 자극함으로써 체액성 면역을 변경함으로써 면역 반응을 변경하는 임의의 화합물과 관련이 있다. 면역학적 활성 화합물은 항바이러스 및 항종양 활성을 포함하지만 이에 국한되지 않는 강력한 면역자극 활성을 가지며, 또한 면역 반응의 다른 측면을 하향-조절할 수 있고, 예를 들어 광범위한 TH2 매개 질환을 치료하는데 유용한 TH2-면역 반응으로부터 면역 반응을 이동시킬 수 있다. 면역학적 활성 화합물은 백신 보조제(adjuvant)로서 유용할 수 있다. 면역학적 활성 화합물의 특정 예는 인터류킨, 콜로니 자극 인자 (CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 에리트로포이에틴, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론, 인테그린, 어드레신, 셀렉틴, 귀소 수용체, 및 항원, 특히 종양 연관된 항원, 병원체 연관된 항원 (예컨대 박테리아, 기생, 또는 바이러스 항원), 알러지항원, 및 자가항원을 포함한다.
"자가항원" 또는 "자가-항원"이라는 용어는 대상체의 신체 내에서 기원하고 (즉, 자가항원은 또한 "자가 항원"으로 불릴 수 있음) 신체의 이러한 정상 부분에 대해 비정상적으로 격렬한 면역 반응을 생성하는 항원을 지칭한다. 자가항원에 대한 이러한 격렬한 면역 반응은 "자가면역 질환"의 원인이 될 수 있다.
"알러지항원"이라는 용어는 대상체의 신체 외부에서 유래하고(즉, 알러지항원은 "이종 항원"으로도 불릴 수 있음), 대상체의 면역계가 달리 대상체에게 무해할 인지되는 위협과 싸우는 비정상적으로 격렬한 면역 반응을 생성하는 일종의 항원을 지칭한다. "알러지"는 알러지항원에 대한 이러한 격렬한 면역 반응으로 인해 발생하는 질환이다. 알러지항원은 일반적으로 면역글로불린 E(IgE) 반응을 통해 아토피 개체의 I형 과민 반응을 자극할 수 있는 항원이다. 알러지항원의 특정 예에는 땅콩 단백질(예를 들어, Ara h 2.02), 오브알부민, 잔디 꽃가루 단백질(예를 들어, Phl p 5) 및 집먼지 진드기의 단백질(예를 들어, Der p 2)에서 유래된 알러지항원이 포함된다.
용어 "성장 인자"는 세포 성장, 증식, 치유 및/또는 세포 분화를 자극할 수 있는 분자를 지칭한다. 일반적으로 성장 인자는 세포 사이의 신호전달 분자 역할을 한다. "성장 인자"라는 용어는 표적 세포 표면의 특정 수용체에 결합하는 특정 사이토카인 및 호르몬을 포함한다. 성장 인자의 예로는 골 형태형성 단백질 (BMP), 섬유아세포 성장 인자 (FGFs), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 예컨대 VEGFA, 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린 유사 성장 인자, 에프린, 대식세포 콜로니-자극 인자, 과립구 콜로니-자극 인자, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자, 뉴레굴린, 뉴로트로핀 (예를 들어, 뇌-유래된 신경친화성 인자 (BDNF), 신경 성장 인자 (NGF)), 태반 성장 인자 (PGF), 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF), 레날라제 (RNLS) (항-세포자멸적 생존 인자), T-세포 성장 인자 (TCGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 형질전환 성장 인자 (형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β)), 및 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α)를 포함한다. 일 구현예에서, "성장 인자"는 펩타이드 또는 단백질 성장 인자이다.
"프로테아제 억제제"라는 용어는 프로테아제의 기능을 억제하는 분자, 특히 펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 프로테아제 억제제는 억제되는 프로테아제(예를 들어, 아스파르트산 프로테아제 억제제) 또는 작용 기전(예를 들어, 세르핀과 같은 자살 억제제)에 의해 분류될 수 있다. 프로테아제 억제제의 특정 예에는 알파 1-항트립신, 아프로티닌 및 베스타틴과 같은 세르핀이 포함된다.
"효소"라는 용어는 화학 반응을 가속화하는 거대분자 생물학적 촉매를 의미한다. 임의의 촉매와 마찬가지로, 효소는 촉매 작용을 하는 반응에서 소모되지 않으며 상기 반응의 평형을 변경하지 않는다. 다른 많은 촉매와 달리, 효소는 훨씬 더 특이적이다. 일 구현예에서, 효소는 대상체의 항상성에 필수적이며, 예를 들어 효소의 임의의 기능이상(특히, 돌연변이, 결실 또는 감소된 생산에 의해 야기될 수 있는 감소된 활성)은 질환을 초래한다. 효소의 예는 단순 포진 바이러스 1형 티미딘 키나제 (HSV1-TK), 헥소사미니다제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 슈도콜린에스테라아제, 및 락타제를 포함한다.
"수용체"라는 용어는 세포 외부로부터 신호(특히 리간드라고 하는 화학적 신호)를 수신하는 단백질 분자를 의미한다. 수용체에 대한 신호(예를 들어, 리간드)의 결합은 세포의 일종의 반응, 예를 들어 키나제의 세포내 활성화를 유발한다. 수용체에는 막횡단 수용체 (예컨대 이온 통로-연결된 (이온요구성) 수용체, G 단백질-연결된 (대사지향성) 수용체, 및 효소-결합 수용체) 및 세포내 수용체 (예컨대 세포질 수용체 및 핵 수용체)를 포함한다. 수용체의 특정 예는 스테로이드 호르몬 수용체, 성장 인자 수용체, 및 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)과 같은 펩타이드 수용체(즉, 리간드가 펩타이드인 수용체)를 포함한다. "성장 인자 수용체"라는 용어는 성장 인자에 결합하는 수용체를 지칭한다.
용어 "세포자멸사 조절자"는 세포자멸사를 조절하는, 즉, 세포자멸사를 활성화하거나 억제하는 분자, 특히 펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 세포자멸사 조절자는 미토콘드리아 기능을 조절하는 것과 카스파제를 조절하는 것의 두 가지 광범위한 부류로 그룹화할 수 있다. 제1 부류에는 미토콘드리아 막 전위의 손실 및/또는 사이토크롬 C와 같은 세포자멸사 단백질이 사이토졸로 방출되는 것을 방지함으로써 미토콘드리아 무결성을 보존하는 역할을 하는 단백질(예를 들어, BCL-2, BCL-xL)이 포함된다. 또한 이 제1 부류에는 시토크롬 C의 방출을 촉진하는 세포자멸유도 촉진 단백질(예를 들어, BAX, BAK, BIM)이 포함된다. 제2 부류에는 카스파제의 활성화를 차단하는 세포자멸사 단백질(예를 들어, XIAP) 또는 FLIP 억제제와 같은 단백질이 포함된다.
"전사 인자"라는 용어는 특히 특정 DNA 서열에 결합함으로써 DNA에서 메신저 RNA로의 유전 정보의 전사 속도를 조절하는 단백질과 관련이 있다. 전사 인자는 삶 전체에 걸쳐 세포 분열, 세포 성장 및 세포 사멸; 배아 발생 동안 세포 이동 및 조직화; 및/또는 호르몬과 같은 세포 외부로부터의 신호에 반응하여 조절할 수 있다. 전사 인자는 일반적으로 전사 인자에 의해 조절되는 유전자에 인접한 특정 DNA 서열에 결합하는 적어도 하나의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 전사 인자의 특정 예는 MECP2, FOXP2, FOXP3, STAT 단백질 계열 및 HOX 단백질 계열를 포함한다.
"종양 억제인자 단백질"이라는 용어는 암으로 가는 경로의 한 단계에서 세포를 보호하는 분자, 특히 펩타이드 또는 단백질과 관련이 있다. 종양 억제인자 단백질(일반적으로 상응하는 종양 억제인자 유전자에 의해 인코딩됨)은 세포 주기의 조절에 대한 약화 또는 억제 효과를 나타내고/거나 세포자멸사를 촉진한다. 그들의 기능은 다음 중 적어도 하나일 수 있다: 세포 주기의 지속에 필수적인 유전자 억제; 세포 주기를 DNA 손상에 커플링(손상된 DNA가 세포에 존재하는 한 세포 분열이 일어나지 않아야 함); 손상된 DNA를 복구할 수 없는 경우 세포자멸사 시작; 전이 억제(예를 들어, 종양 세포의 분산 방지, 접촉 억제 손실 차단 및 전이 억제); 및 DNA 복구. 종양 억제인자 단백질의 특정 예는 p53, 포스파타제 및 텐신 동족체(PTEN), SWI/SNF(SWItch/Sucrose Non-Fermentable), von Hippel-Lindau 종양 억제인자(pVHL), 선종성 결장 폴립증(APC), CD95, 종양원성 5(ST5)의 억제, 종양원성 5(ST5)의 억제, 종양원성 14(ST14) 및 위피(Yippee) 유사 3(YPEL3)의 억제를 포함한다.
"구조 단백질"이라는 용어는 유체가 아닌 생물학적 성분에 경직성과 강성을 부여하는 단백질을 의미한다. 구조 단백질은 대부분 섬유질(예를 들어, 콜라겐 및 엘라스틴)이지만 구상(예를 들어, 액틴 및 튜불린)일 수도 있다. 일반적으로 구상 단백질은 단량체로 용해되지만 중합하여 긴 섬유를 형성하여 예를 들어 세포골격을 구성할 수 있다. 다른 구조 단백질은 기계적 힘을 생성할 수 있는 운동 단백질(미오신, 키네신, 다이네인 등) 및 계면활성제 단백질이다. 구조 단백질의 특정 예는 콜라겐, 계면활성제 단백질 A, 계면활성제 단백질 B, 계면활성제 단백질 C, 계면활성제 단백질 D, 엘라스틴, 튜불린, 액틴, 및 미오신을 포함한다.
용어 "재프로그래밍 인자" 또는 "재프로그래밍 전사 인자"는 분자, 특히 펩타이드 또는 단백질과 관련이 있고, 이는 체세포에서 임의로 추가의 제제, 예컨대 추가의 재프로그래밍 인자와 함께 발현되는 경우, 줄기 세포 특성, 특히 다능성을 갖는 세포로의 상기 체세포의 재프로그래밍 또는 탈분화를 초래한다. 재프로그래밍 인자의 특정 예는 OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, LIN28 및 NANOG를 포함한다.
용어 "게놈 공학 단백질"은 대상체의 게놈에서 DNA를 삽입, 삭제 또는 대체할 수 있는 단백질과 관련이 있다. 게놈 공학 단백질의 특정 예는 메가뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFNs), 전사 활성화제 유사 효과기 뉴클레아제 (TALENs), 및 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문 반복-CRISPR 연관된 단백질 9 (CRISPR-Cas9)을 포함한다.
용어 "혈액 단백질"은 대상체의 혈장, 특히 건강한 대상체의 혈장에 존재하는 펩타이드 또는 단백질과 관련이 있다. 혈액 단백질은 다양한 기능 예컨대 수송 (예를 들어, 알부민, 트랜스페린), 효소적 활성 (예를 들어, 트롬빈 또는 세룰로플라스민), 응혈 (예를 들어, 피브리노겐), 병원체에 대한 방법 (예를 들어, 보체 구성요소 및 면역글로불린), 프로테아제 억제제 (예를 들어, 알파 1-항트립신) 등을 갖는다. 혈액 단백질의 특정 예는 트롬빈, 혈청 알부민, 인자 VII, 인자 VIII, 인슐린, 인자 IX, 인자 X, 조직 플라스미노겐 활성화제, 단백질 C, 폰빌레브란트 인자, 항트롬빈 III, 글루코세레브로시다제, 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 변형된 인자 VIII, 및 항응고제를 포함한다.
따라서, 일 구현예에서, 약제학적 활성 펩타이드 또는 단백질은 (i) 바람직하게는 에리트로포이에틴 (EPO), 인터류킨 4 (IL-2), 및 인터류킨 10 (IL-11)로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 더 바람직하게는 EPO; (ii) 부착 분자, 특히 인테그린; (iii) 면역글로불린, 특히 항체; (iv) 면역학적으로 활성 화합물, 특히 항원; (v) 호르몬, 특히 바소프레신, 인슐린 또는 성장 호르몬; (vi) 성장 인자, 특히 VEGFA; (vii) 프로테아제 억제제, 특히 알파 1-항트립신; (viii) 바람직하게는 단순 포진 바이러스 1형 티미딘 키나제 (HSV1-TK), 헥소사미니다제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 슈도콜린에스테라아제, 췌장 효소, 및 락타제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소; (ix) 수용체, 특히 성장 인자 수용체; (x) 세포자멸사 조절인자, 특히 BAX; (xi) 전사 인자, 특히 FOXP3; (xii) 종양 억제인자 단백질, 특히 p53; (xiii) 구조 단백질, 특히 계면활성제 단백질 B; (xiv) 예를 들어, OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, LIN28 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택된 재프로그래밍 인자; (xv) 게놈 엔지니어링 단백질, 특히 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문 반복-CRISPR 연관된 단백질 9 (CRISPR-Cas9); 및 (xvi) 혈액 단백질, 특히 피브리노겐이다.
일 구현예에서, 약제학적 활성 펩타이드 또는 단백질은 하나 이상의 항원 또는 적어도 하나의 에피토프를 포함하며, 즉, 대상체에 대한 펩타이드 또는 단백질의 투여는 대상체에서 하나 이상의 항원 또는 적어도 하나의 에피토프에 대한 면역 반응을 유도하고, 이는 치료적이거나 부분적으로 또는 완전히 보호할 수 있다.
특정 구현예에서, RNA는 적어도 하나의 에피토프를 인코딩한다. 특정 구현예에서, 에피토프는 종양 항원으로부터 유래된다. 종양 항원은 다양한 암에서 일반적으로 발현되는 것으로 알려진 "표준" 항원일 수 있다. 종양 항원은 또한 개체의 종양에 특이적이고 이전에 면역계에 의해 인식되지 않은 "신생 항원"일 수 있다. 신생 항원 또는 신생 에피토프는 아미노산 변화를 초래하는 암 세포 게놈의 하나 이상의 암 특이적 돌연변이로 인해 발생할 수 있다. 종양 항원의 예는 비제한적으로, p53, ART-4, BAGE, 베타-카테닌/m, Bcr-abL 낙타, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, the 크라우딘 계열의 세포 표면 단백질, 예컨대 CLAUD Γ
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-6, 크라우딘-18.2 및 크라우딘-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap 100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, 바람직하게는 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A 10, MAGE-A 1 1, 또는 MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART- 1 /Melan-A, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, pl90 마이너 BCR-abL, Pml/RARa, PRAME, 프로테이나제 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, 서바이빈, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE, WT, 및 WT-1을 포함한다.
암 돌연변이는 각 개체에 따라 달라진다. 따라서, 신규 에피토프(신생 에피토프)를 인코딩하는 암 돌연변이는 백신 조성물 및 면역요법의 개발에서 매력적인 표적을 나타낸다. 종양 면역요법의 효능은 숙주 내에서 강력한 면역 반응을 유도할 수 있는 암 특이적 항원 및 에피토프의 선택에 의존한다. RNA는 환자에게 환자 특이적 종양 에피토프를 전달하는 데 사용될 수 있다. 비장에 있는 수지상 세포(DC)는 면역원성 에피토프 또는 항원, 예를 들어 종양 에피토프의 RNA 발현에 특히 관심이 있는 항원 제시 세포를 나타낸다. 다중 에피토프의 사용은 종양 백신 조성물에서 치료 효능을 촉진하는 것으로 나타났다. 종양 돌연변이체의 신속한 서열분석은 예를 들어 에피토프가 링커에 의해 선택적으로 분리되는 단일 폴리펩타이드로서 본 명세서에 기재된 RNA에 의해 인코딩될 수 있는 개별화된 백신을 위한 다중 에피토프를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 특정 구현예에서, RNA는 적어도 하나의 에피토프, 적어도 2개의 에피토프, 적어도 3개의 에피토프, 적어도 4개의 에피토프, 적어도 5개의 에피토프, 적어도 6개의 에피토프, 적어도 7개의 에피토프, 적어도 8개의 에피토프, 적어도 9개의 에피토프, 또는 적어도 10개의 에피토프를 인코딩한다. 예시적인 구현예는 적어도 5개의 에피토프를 인코딩하는 RNA("펜타토프"로 지칭됨) 및 적어도 10개의 에피토프를 인코딩하는 RNA("데카토프"로 지칭됨)를 포함한다.
입자
본 개시내용의 맥락에서, 용어 "입자"는 분자 또는 분자 복합체, 특히 입자 형성 화합물에 의해 형성된 구조화된 독립체와 관련이 있다. 바람직하게는, 입자는 하나 이상의 유형의 양친매성 물질(예를 들어, 양친매성 지질, 양친매성 중합체, 및/또는 양친매성 단백질/폴리펩타이드)으로 이루어진 외피(예를 들어, 하나 이상의 층 또는 라멜라)를 함유한다. 이 맥락에서, "양친매성 물질"이라는 표현은 물질이 친수성과 친유성을 모두 가지고 있음을 의미한다. 외피는 또한 양친매성일 필요가 없는 추가 물질(예를 들어, 추가 지질 및/또는 추가 중합체)을 포함할 수 있다. 따라서, 한 구현예에서 입자는 단일라멜라 또는 다중라멜라 구조이고, 상기 하나 이상의 층 또는 라멜라를 구성하는 물질은 선택적으로 양친매성일 필요가 없는 추가 물질(예를 들어, 추가 지질 및/또는 추가 중합체)과 조합하여 하나 이상의 유형의 양친매성 물질 (특히 양친매성 지질, 양친매성 중합체, 및/또는 양친매성 단백질/폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택됨)을 포함한다. 일 구현예에서, 용어 "입자"는 마이크로 또는 나노 크기의 조밀한 구조와 같은 마이크로 또는 나노 크기의 구조와 관련이 있다. 이와 관련하여 "마이크로 크기"라는 용어는 입자의 세 가지 외부 치수가 모두 마이크로규모, 즉 1 내지 5 μm임을 의미한다. 본 개시내용에 따르면, 용어 "입자"는 리포플렉스 입자(LPX), 지질 나노입자(LNP), 폴리플렉스 입자, 리포폴리플렉스 입자, 바이러스 유사 입자(VLP) 및 이들의 혼합물(예를 들어, LPX와 VLP의 혼합물 또는 LNP와 VLP의 혼합물과 같은 입자 유형 중 둘 이상의 혼합물)을 포함한다.
본 개시내용에서 사용된 바와 같이, "나노입자"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산(특히 RNA) 및 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함하는 입자를 지칭하며, 여기서 입자의 3개의 외부 치수는 모두 나노규모, 즉, 적어도 약 1 nm 및 약 1000 nm 미만(바람직하게는 10 내지 990 nm, 예컨대 15 내지 900 nm, 20 내지 800 nm, 30 내지 700 nm, 40 내지 600 nm, 또는 50 내지 500 nm)이다. 바람직하게는, 가장 긴 축과 가장 짧은 축은 크게 다르지 않다. 바람직하게는, 입자의 크기는 직경이다.
본 개시내용의 맥락에서, 용어 "리포플렉스 입자"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 양친매성 지질, 특히 양이온성 양친매성 지질, 및 핵산(특히 RNA)을 함유하는 입자와 관련이 있다. 양으로 하전된 리포솜(하나 이상의 양친매성 지질, 특히 양이온성 양친매성 지질로 만들어짐)과 음으로 하전된 핵산(특히 RNA) 사이의 정전기적 상호작용은 핵산 리포플렉스 입자의 복합화 및 자발적 형성을 초래한다. 양으로 하전된 리포솜은 일반적으로 DOTMA와 같은 양이온성 양친매성 지질 및 DOPE와 같은 추가 지질을 사용하여 합성될 수 있다. 일 구현예에서, 핵산(특히 RNA) 리포플렉스 입자는 나노입자이다.
용어 "지질 나노입자"는 나노 크기의 리포플렉스 입자와 관련이 있다.
본 개시내용의 맥락에서, 용어 "폴리플렉스 입자"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 양친매성 중합체, 특히 양이온성 양친매성 중합체, 및 핵산(특히 RNA)을 함유하는 입자와 관련이 있다. 양으로 하전된 양이온성 양친매성 고분자와 음으로 하전된 핵산(특히 RNA) 사이의 정전기적 상호작용은 핵산 폴리플렉스 입자의 복합화 및 자발적인 형성을 초래한다. 폴리플렉스 입자의 제조에 적합한 양으로 하전된 양친매성 중합체는 프로타민, 폴리에틸렌이민, 폴리-L-리신, 폴리-L-아르기닌 및 히스톤을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산(특히 RNA) 폴리플렉스 입자는 나노입자이다.
용어 "리포폴리플렉스 입자"는 본 명세서에 기재된 양친매성 지질(특히 양이온성 양친매성 지질), 본 명세서에 기재된 양친매성 중합체(특히 양이온성 양친매성 중합체), 및 본 명세서에 기재된 핵산(특히 RNA)을 함유하는 입자와 관련이 있다. 일 구현예에서, 핵산(특히 RNA) 리포폴리플렉스 입자는 나노입자이다.
용어 "바이러스 유사 입자"(본 명세서에서 VLP로 약칭됨)는 바이러스와 매우 유사하지만 상기 바이러스의 유전 물질을 포함하지 않고 따라서 비감염성인 분자를 지칭한다. 바람직하게는, VLP는 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산(바람직하게는 RNA)을 함유하고, 상기 핵산(바람직하게는 RNA)은 VLP가 유래된 바이러스(들)에 이종성이다. VLP는 바이러스 구조 단백질의 개별 발현을 통해 합성될 수 있으며, 이는 바이러스 유사 구조로 자가 조립될 수 있다. 일 구현예에서, 상이한 바이러스로부터의 구조적 캡시드 단백질의 조합을 사용하여 재조합 VLP를 생성할 수 있다. VLP는 B형 간염 바이러스 (HBV) (소형 HBV 유래된 표면 항원 (HBsAg)), 파보비리다에 (예를 들어, 아데노 연관된 바이러스), 파필로마비리다에 (예를 들어, HPV), 레트로비리다에 (예를 들어, HIV), 플라비비리다에 (예를 들어, 간염 C 바이러스) 및 박테리오파아지 (예를 들어, Qβ, AP205)를 포함하는 다양한 바이러스 계열의 성분으로부터 생성될 수 있다.
용어 "핵산 함유 입자"는 핵산(특히 RNA)이 결합되는 본 명세서에 기재된 입자와 관련이 있다. 이와 관련하여, 핵산(특히 RNA)은 입자의 외부 표면에 부착될 수 있고/거나(표면 핵산(특히 표면 RNA)), 입자(캡슐화된 핵산(특히 캡슐화된 RNA))에 함유될 수 있다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및 용도에 사용되는 입자는 약 10 내지 약 2000 nm, 예컨대 적어도 약 15 nm (바람직하게는 적어도 약 20 nm, 적어도 약 25 nm, 적어도 약 30 nm, 적어도 약 35 nm, 적어도 약 40 nm, 적어도 약 45 nm, 적어도 약 50 nm, 적어도 약 55 nm, 적어도 약 60 nm, 적어도 약 65 nm, 적어도 약 70 nm, 적어도 약 75 nm, 적어도 약 80 nm, 적어도 약 85 nm, 적어도 약 90 nm, 적어도 약 95 nm, 또는 적어도 약 100 nm) 및/또는 많아야 1900 nm (바람직하게는 많아야 약 1900 nm, 많아야 약 1800 nm, 많아야 약 1700 nm, 많아야 약 1600 nm, 많아야 약 1500 nm, 많아야 약 1400 nm, 많아야 약 1300 nm, 많아야 약 1200 nm, 많아야 약 1100 nm, 많아야 약 1000 nm, 많아야 약 950 nm, 많아야 약 900 nm, 많아야 약 850 nm, 많아야 약 800 nm, 많아야 약 750 nm, 많아야 약 700 nm, 많아야 약 650 nm, 많아야 약 600 nm, 많아야 약 550 nm, 또는 많아야 약 500 nm), 바람직하게는 약 20 내지 약 1500 nm, 예컨대 약 30 내지 약 1200 nm, 약 40 내지 약 1100 nm, 약 50 내지 약 1000, 약 60 내지 약 900 nm, 약 70 내지 800 nm, 약 80 내지 700 nm, 약 90 내지 600 nm, 또는 약 100 내지 500 nm, 예컨대 10 내지 1000 nm, 15 내지 500 nm, 20 내지 450 nm, 25 내지 400 nm, 30 내지 350 nm, 40 내지 300 nm, 또는 50 내지 250 nm 범위의 크기 (바람직하게는 직경, 즉, 회전 반경(Rg) 값의 2배 또는 유체역학적 반경의 2배와 같은 반경 2배)를 갖는다.
일 구현예에서, 핵산 (특히 RNA)은, 유리 형태(즉, 핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 입자에 결합되거나 부착되지 않음) 또는 제형화되지 않은 형태 (즉, 본 명세서에 명시된 바와 같이 입자가 없는, 예컨대 입자 형성 화합물 (예를 들어, 리포솜 (특히 양이온성 지질(들)) 및/또는 바이러스 유사 입자)를 구성하는 성분이 없는 조성물)일 때, 약 10 내지 약 200 nm, 예컨대 약 15 내지 약 190 nm, 약 20 내지 약 180 nm, 약 25 내지 약 170 nm, 또는 약 30 내지 약 160 nm 범위의 크기 (바람직하게는 직경, 즉, 회전 반경(Rg) 값의 2배 또는 유체역학적 반경의 2배와 같은 반경 2배)를 갖는다.
샘플 조성물
본 개시내용에 따르면, 샘플 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산(특히 RNA) 및 선택적으로 본 명세서에 개시된 바와 같은 입자를 포함한다. 일 구현예에서, 샘플 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 RNA를 포함한다. 일 구현예에서, 샘플 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 RNA 및 본 명세서에 개시된 바와 같은 입자를 포함한다. 일 구현예에서, 샘플 조성물은 RNA 및 본 명세서에 개시된 바와 같은 입자의 혼합물, 예를 들어, 입자의 유형 중 둘 이상의 혼합물, 예컨대 LPX와 VLP의 혼합물 또는 LNP와 VLP의 혼합물 또는 LPX와, VLP와, VLP의 혼합물을 포함한다.
샘플 조성물은 당업자에게 알려진 절차를 사용하여 제공(예를 들어, 제조)될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 RNA를 포함하는 샘플 조성물은 당업자에게 공지되거나 본 명세서에 개시된 바와 같이 시험관내 전사 또는 화학적 합성에 의해 제공(예를 들어, 제조)될 수 있다. RNA를 포함하는 이러한 조성물은 RNA 및 입자를 포함하는 샘플 조성물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 샘플 조성물은 하나 이상의 적합한 지질을 함유하는 리포솜 조성물을 제공하고 RNA를 포함하는 조성물을 리포솜 조성물과 혼합함으로써 제조될 수 있다. 리포솜 조성물은 바람직하게는 에탄올 주입 기술을 사용하여 제조된다. 대안적인 구현예에서, 리포솜 조성물은 바람직하게는 미세유체 유체역학적 포커싱(MHF) 또는 (문헌[Zizzari 등, Materials, 10 (2017), 1411]을 참조하고, 이의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함됨) 유사한 절차를 사용하여 제조된다.
샘플 조성물 (예를 들어, 제2 양태의 방법에서 단계(A) 및 (C)에서 언급된 제1 조성물 또는 제2 양태의 방법에서 단계(B) 및 (D)에서 언급된 제2조성물)이 제공 (예를 들어, 제조, 가공 (예컨대 정제 및/또는 건조) 및/또는 보관)되는 몇 개의 반응 조건은 상기 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터에 영향을 미칠 수 있고, 1개 이상의 파라미터는 핵산 무결성 (특히 RNA 무결성), 핵산 (특히 RNA)의 총량, 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 (특히, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함) (추가의 선택적 파라미터는 핵산 (특히 RNA)의 분자량, 표면 핵산의 양 (예컨대 표면 RNA의 양), 캡슐화된 핵산의 양 (예컨대 캡슐화된 RNA의 양), 접근 가능한 핵산의 양 (예컨대 접근 가능한 RNA의 양), 핵산 (특히 RNA)의 크기 (특히, 핵산 (특히 RNA)의 Rg 및/또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA)의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 정량적 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA)의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 형상 계수, 형태 계수, 및 핵산 (특히 RNA) 캡슐화 효율을 포함하고; 또한, 추가의 선택적 파라미터는 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양 대 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 총량의 비 (상기 비율은 입자 크기의 함수임); 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양의 비 (상기 비율은 입자 크기의 함수임); 및 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 음으로 하전된 모이어티의 양의 전하 비율 (상기 전하 비율은 일반적으로 N/P 비율로 표시되며 입자 크기의 함수로 주어질 수 있음)을 포함한다. 이러한 반응 조건은 염 농도/이온 강도; 온도 (예를 들어, 건조 및/또는 보관 동안); pH 또는 완충액 농도; 광/방사선; 산소; 전단력; 압력; 동결/해동 주기; 건조/재구성 주기; 부형제(들) (예를 들어, 안정화제 및/또는 킬레이트화제)의 첨가; 입자 형성 화합물 (특히 지질 (예를 들어, 양이온성 양친매성 지질) 및/또는 중합체 (예를 들어, 양이온성 양친매성 중합체))의 유형 및/또는 공급원; 핵산 (특히 RNA) 대 입자 형성 화합물 (특히 지질 (예를 들어, 양이온성 양친매성 지질) 및/또는 중합체 (예를 들어, 양이온성 양친매성 중합체))의 비; 전하 비율; 및 물리적 상태를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
A) 염 및 이온 강도
본 개시내용에 따르면, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 염화나트륨과 같은 염을 포함할 수 있다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 염화나트륨은 적어도 하나의 양이온성 지질과 혼합하기 전에 핵산(특히 RNA)을 사전 조절하기 위한 이온 삼투질농도 제제로서 기능한다. 특정 구현예는 본 개시내용에서 염화나트륨에 대한 대안적인 유기 또는 무기 염을 고려한다. 대안적인 염은 비제한적으로, 염화칼륨, 인산이칼륨, 인산일칼륨, 아세트산칼륨, 중탄산칼륨, 황산칼륨, 아세트산칼륨, 인산이나트륨, 인산일나트륨, 아세트산나트륨, 중탄산나트륨, 황산나트륨, 아세트산나트륨, 염화리튬, 염화마그네슘, 인산마그네슘, 염화칼슘, 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 (EDTA)의 나트륨 염을 포함한다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 핵산(특히 RNA) 입자를 포함하는 샘플 조성물은 바람직하게는 0 mM 내지 약 500 mM, 약 2 mM 내지 약 400 mM, 약 4 mM 내지 약 300 mM, 약 6 mM 내지 약 200 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 100 mM 범위의 농도로 염화나트륨을 포함할 수 있다. 예시적인 염 농도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mM의 염, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mM의 NaCl을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산(특히 RNA) 입자를 포함하는 조성물은 이러한 염화나트륨 농도에 대응하는 이온 강도를 포함한다.
일반적으로, 핵산(특히 RNA) 및 본 명세서에 기재된 것과 같은 리포솜으로부터 핵산(특히 RNA) 입자를 형성하기 위한 및 그로부터 생성된 샘플 조성물은 높은 염화나트륨 농도를 포함할 수 있거나 높은 이온 강도를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 염화나트륨은 적어도 45 mM, 예컨대 약 45 mM 내지 약 300 mM, 또는 약 50 mM 내지 약 150 mM의 농도이다. 일 구현예에서, 샘플 조성물은 이러한 염화나트륨 농도에 상응하는 이온 강도를 포함한다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 것과 같은 핵산(특히 RNA) 입자의 동결과 같은 핵산(특히 RNA) 입자를 보관하기 위한 조성물은 낮은 염화나트륨 농도를 포함할 수 있거나 낮은 이온 강도를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 염화나트륨은 0 mM 내지 약 50 mM, 2 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 50 mM의 농도이다. 일 구현예에서, 조성물은 이러한 염화나트륨 농도에 상응하는 이온 강도를 포함한다.
일반적으로, 동결된 핵산(특히 RNA) 입자 조성물을 해동하고 선택적으로 수성 액체를 첨가하여 삼투질 농도 및 이온 강도를 조정함으로써 생성된 샘플 조성물은 높은 염화나트륨 농도를 포함할 수 있거나 높은 이온 강도를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 염화나트륨은 약 50 mM 내지 약 300 mM, 또는 약 80 mM 내지 약 150 mM의 농도이다. 일 구현예에서, 조성물은 이러한 염화나트륨 농도에 상응하는 이온 강도를 포함한다.
B) 온도
일반적으로, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 핵산(특히 RNA)의 안정성 및 존재하는 경우, 핵산(특히 RNA) 입자의 안정성에 적합한 온도에서 제조된다. 그러나 예를 들어, 합성하는 동안 저온(예를 들어, 0℃ 미만, 예컨대 -20℃) 또는 고온(예를 들어, 약 50℃ 이상, 예컨대 약 60℃ 또는 약 80℃)을 적용해야 할 수 있다. 또한, 처리(예를 들어, 건조) 및/또는 보관 동안 샘플 조성물은 실온 이외의 온도에 노출될 수 있다. 따라서 실온 이외의 이러한 온도(예를 들어, 응력 온도)가 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 분석해야 할 수 있다. 예시적인 온도 조건은 저온 (예컨대 약 0℃ 미만 (예컨대 약 -5℃ 미만, 예를 들어, 약 -20℃, 또는 5℃ 내지 15℃), 주위 또는 실온, 중간 온도 (예컨대 35℃ 내지 45℃) 또는 고온 (예컨대 45℃ 초과, 예를 들어, 약 50℃ 이상, 약 60℃, 약 80℃, 또는 약 98℃)을 포함한다.
C) pH 및 완충액
본 개시내용에 따르면, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 핵산(특히 RNA)의 안정성 및 존재하는 경우, 핵산(특히 RNA) 입자의 안정성에 적합한 pH를 가질 수 있다. 그러나 예를 들어, 대상체에게 투여하기 위해, pH(예를 들어, 생리학적 pH로) 및/또는 샘플 조성물에 사용된 완충액(들)의 유형 및/또는 양을 핵산(특히 RNA)의 안정성 및 존재하는 경우, 핵산(특히 RNA) 입자의 안정성에 최적이 아닌 완충액(들)의 pH 값 및/또는 유형 및/또는 양으로 조정하는 것이 필요할 수 있다. 따라서 이러한 스트레스 조건(즉, 변경된 pH 및/또는 완충액 조건)이 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 분석하는 것이 필요할 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 약 5.7 내지 약 6.7의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 조성물은 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 또는 약 6.7의 pH를 갖는다.
본 개시내용에 따르면, 완충액를 포함하는 샘플 조성물이 제공된다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 완충액의 사용은 샘플 조성물의 제조, 저장 및 사용 동안 샘플 조성물의 pH를 유지한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 완충액은 중탄산나트륨, 인산일나트륨, 인산이나트륨, 인산일칼륨, 인산이칼륨, [트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]프로판설폰산 (TAPS), 2-(비스(2-하이드록시에틸)아미노)아세트산 (바이신), 2-아미노-2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-디올 (Tris), N-(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)글리신 (트리신), 3-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]-2-하이드록시프로판-1-설폰산 (TAPSO), 2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]에탄설폰산 (HEPES), 2-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]에탄설폰산 (TES), 1,4-피페라진디에탄설폰산 (파이프), 디메틸아르신산, 2-모폴린-4-일에탄설폰산 (MES), 3-모폴리노-2-하이드록시프로판설폰산 (MOPSO), 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)를 포함한다. 다른 적합한 완충액는 염 중 아세트산, 염 중 시트르산, 염 중 붕산 및 염 중 인산일 수 있다.
일부 구현예에서, 완충액은 약 5.7 내지 약 6.7의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 완충액은 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 또는 약 6.의 pH를 갖는다. 일 실시예에서, 완충액은 HEPES이다. 바람직한 구현예에서, HEPES는 약 5.7 내지 약 6.7의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, HEPES는 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 또는 약 6.7의 pH를 갖는다. 예시적인 구현예에서, HEPES는 약 6.2의 pH를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 완충액은 약 2.5 mM 내지 약 10 mM의 농도를 갖는다. HEPES가 완충액인 특정 구현예에서, HEPES의 농도는 약 2.5 mM, 약 2.75 mM, 3.0 mM, 약 3.25 mM, 약 3.5 mM, 약 3.75 mM, 약 4.0 mM, 약 4.25 mM, 약 4.5 mM, 약 4.75 mM, 약 5.0 mM, 약 5.25 mM, 약 5.5 mM, 약 5.75 mM, 약 6.0 mM, 약 6.25 mM, 약 6.5 mM, 약 6.75 mM, 약 7.0 mM, 약 7.25 mM, 약 7.5 mM, 약 7.75 mM, 약 8.0 mM, 약 8.25 mM, 약 8.5 mM, 약 8.75 mM, 약 9.0 mM, 약 9.25 mM, 약 9.5 mM, 약 9.75 mM, 또는 약 10.0 mM이다. 바람직한 구현예에서, HEPES는 약 7.5 mM의 농도이다.
D) 빛, 방사선, 산소, 전단력 및/또는 압력
일반적으로, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 핵산(특히 RNA)의 안정성 및 존재하는 경우, 핵산 (특히 RNA) 입자의 안정성에 적합한 빛, 방사선, 산소, 전단력 및/또는 압력으로부터 선택된 조건에서 제조될 수 있다. 그러나 예를 들어, 샘플 조성물의 합성, 처리 및/또는 보관 중에, 핵산 (특히 RNA)의 안정성 및 존재하는 경우, 핵산(특히 RNA) 입자의 안정성에 최적이 아닌 빛, 방사선, 산소, 전단력 및/또는 압력을 적용해야 할 수도 있다. 따라서 핵산 (특히 RNA)의 안정성, 및 존재할 경우 핵산 (특히 RNA) 입자)의 안정성에 최적이 아닌 이러한 스트레스 조건(즉, 빛, 방사선, 산소, 전단력 및/또는 압력)이 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터에 영향을 미칠 수 있는 지를 분석할 필요가 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 빛의 부재, 즉 암소에서 제조된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 방사선의 부재 하에 제조된다. 대안적인 구현예에서, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 방사선, 예를 들어 마이크로파 방사선을 사용하여 제조된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 주변 공기(즉, 산소를 함유하는 공기)에서 제조된다. 대안적인 구현예에서, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 불활성 기체(예를 들어, 질소 또는 희유 기체) 하에, 즉, 산소 부재 하에 제조된다. 이러한 방식으로 산소의 존재가 핵산(특히 RNA)의 안정성에 영향을 미치는 지, 그리고 존재하는 경우, 핵산(특히 RNA) 입자의 안정성(특히 입자의 성분으로서 지질의 안정성에 대한)에 영향을 미치는 지 분석할 수 있고, 예들 들어, 샘플 조성물을 보관하는 동안 시간이 지남에 따라 안정성 프로파일을 설정할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 고전단력 하에 제조된다 (예를 들어, 에탄올 주입 기술 또는 미세유체 유체역학적 포커싱(MHF)을 사용, (문헌[Zizzari 등, Materials, 10(2017), 1411)]을 참조함). 대안적인 구현예에서, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNA를 포함하는 조성물을 피펫을 사용하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 리포솜 조성물과 혼합함으로써) 낮은 전단력 하에 제조된다. 이러한 방식으로 상이한 전단력의 적용이 핵산(특히 RNA)의 안정성에 영향을 미치는 지, 그리고 존재하는 경우, 핵산(특히 RNA) 입자의 안정성에 영향을 미치는 지 분석할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 주위 압력 하에 제조된다. 대안적인 구현예에서, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 주위 압력보다 낮거나 주위 압력보다 높은 압력 하에 제조된다. 이러한 방식으로 다른 압력의 적용이 핵산(특히 RNA)의 안정성에 영향을 미치는 지 그리고 존재하는 경우, 핵산(특히 RNA) 입자의 안정성에 영향을 미치는 지 분석할 수 있다.
마) 냉동/해동 주기
일 구현예에서, 샘플 조성물은 -10℃ 미만의 온도(예를 들어, 약 -15℃ 내지 약 -40℃에서 보관된 다음, 약 4℃ 내지 약 25℃의 주위 온도)의 온도로 해동될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 샘플 조성물은 다중 동결-해동 주기가 적용된다 (예를 들어, -10℃ 미만의 온도(예를 들어, 약 -15℃ 내지 약 -40℃에서 동결 및 약 4℃ 내지 약 25℃(주위 온도)로 해동). 이러한 방식으로 하나 이상의 동결-해동 주기의 적용이 핵산(특히 RNA)의 안정성에 영향을 미치는 지 그리고 존재하는 경우, 핵산(특히 RNA) 입자의 안정성에 영향을 미치는 지 분석할 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 조성물은 -10℃ 미만(예를 들어, 약 -15℃ 내지 약 -40℃의 온도에서 보관될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 샘플 조성물은 동결 없이 보관될 수 있다. 이러한 방식으로 동결이 핵산(특히 RNA)의 안정성에 영향을 미치는 지 여부와 존재하는 경우, 핵산(특히 RNA) 입자의 안정성에 영향을 미치는 지 여부를 분석할 수 있다.
바) 건조/재구성 주기
일 구현예에서, 샘플 조성물은 건조 형태로 보관된 후 적절한 용매 또는 용매 혼합물(예를 들어, 수성 용매)을 사용하여 재구성될 수 있다. 건조 형태는 샘플 제제를 분무 건조, 동결 건조 또는 냉동하여 얻을 수 있다. 대안적인 구현예에서, 이러한 건조/재구성 주기는 1회 이상 반복될 수 있다. 이러한 방식으로 다수의 건조/재구성 주기의 적용이 핵산(특히 RNA)의 안정성에 영향을 미치는 지 그리고 존재하는 경우, 핵산(특히 RNA) 입자의 안정성에 영향을 미치는 지 분석할 수 있다.
G) 부형제
본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 부형제는 안정화제, 킬레이트화제, 캐리어, 결합제, 희석제, 윤활제, 증점제, 표면 활성제, 보존제, 유화제, 완충액, 풍미제, 또는 착색제를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 대안적인 구현예에서, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 부형제를 포함하지 않는다. 이러한 방식으로 특정 부형제(예를 들어, 안정제 또는 킬레이트화제)의 존재가 핵산(특히 RNA)의 안정성에 영향을 미치는 지, 그리고 존재하는 경우, 핵산(특히 RNA) 입자에 영향을 미치는 지 분석할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 냉동된, 동결건조된 또는 분무 건조된 조성물의 냉동, 동결건조 또는 분무-건조 및 저장 동안 생성물 품질의 실질적인 손실, 특히 핵산(특히 RNA) 활성의 실질적인 손실을 피하기 위해 안정화제를 포함할 수 있다. 전형적으로, 안정제는 냉동, 동결건조 또는 분무-건조 공정 전에 존재하고 생성된 냉동, 동결건조 또는 동결-건조 제제에 지속된다. 이는, 예를 들어 응집, 입자 붕괴, 핵산 (특히 RNA) 분해 및/또는 다른 유형의 손상을 감소 또는 예방하기 위해, 냉동된, 동결건조된 또는 동결건조된 제제의 냉동, 동결건조 또는 분무-건조 및 보관 동안 핵산 (특별히 RNA) 입자를 보호하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 안정화제는 탄수화물이다. 본 명세서에 사용된 용어 "탄수화물"은 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류 및 다당류를 지칭하고 포함한다.
일 구현예에서, 안정화제는 단당류이다. 본 명세서에 사용된 용어 "단당류"는 더 단순한 탄수화물 단위로 가수분해될 수 없는 단일 탄수화물 단위(예를 들어, 단순 당)를 지칭한다. 예시적인 단당류 안정화제는 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 자일로스, 리보스 등을 포함한다.
일 구현예에서, 안정화제는 이당류이다. 본 명세서에 사용된 용어 "이당류"는 글리코시드 결합, 예를 들어 1 내지 4개의 결합 또는 1 내지 6개의 결합을 통해 함께 결합된 2개의 단당류 단위에 의해 형성된 화합물 또는 화학적 모이어티를 지칭한다. 이당류는 2개개의 단당류로 가수분해될 수 있다. 예시적인 이당류 안정화제는 수크로스, 트레할로스, 락토스, 말토스 등을 포함한다.
"삼당류"라는 용어는 3개의 당이 함께 연결되어 하나의 분자를 형성하는 것을 의미한다. 삼당류의 예로는 라피노스 및 멜레지토스가 있다.
일 구현예에서, 안정화제는 올리고당류이다. 본 명세서에 사용된 용어 "올리고당"은 글리코시드 결합, 예를 들어 1-4개 또는 1-6개 결합을 통해 함께 결합되어 선형, 분지형 또는 환형 구조를 형성하는 3 내지 약 15개, 바람직하게는 3 내지 약 10개의 단당류 단위에 의해 형성된 화합물 또는 화학적 모이어티를 지칭한다. 예시적인 올리고당 안정화제는 사이클로덱스트린, 라피노스, 멜레지토스, 말토트리오스, 스타키오스, 아카보스 등을 포함한다. 올리고당은 산화되거나 환원될 수 있다.
일 구현예에서, 안정화제는 환형 올리고당이다. 본 명세서에 사용된 용어 "환형 올리고당"은 글리코시드 결합, 예를 들어 1-4개 또는 1-6개 결합을 통해 함께 결합되어 구조를 형성하는 3 내지 약 15개, 바람직하게는 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 단당류 단위에 의해 형성된 화합물 또는 화학적 모이어티를 지칭한다. 예시적인 환형 올리고당 안정화제는 α 사이클로덱스트린, β 사이클로덱스트린 또는 γ 사이클로덱스트린과 같은 개별 화합물인 환형 올리고당을 포함한다.
다른 예시적인 환형 올리고당 안정화제는 환형 올리고당 모이어티를 함유하는 중합체와 같이 더 큰 분자 구조에 사이클로덱스트린 모이어티를 포함하는 화합물을 포함한다. 환형 올리고당은 산화 또는 환원될 수 있으며, 예를 들어 디카르보닐 형태로 산화될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "시클로덱스트린 모이어티"는 중합체와 같은 더 큰 분자 구조 또는 그 일부에 혼입된 시클로덱스트린(예를 들어, α, β 또는 γ 시클로덱스트린) 라디칼을 지칭한다. 시클로덱스트린 모이어티는 하나 이상의 다른 모이어티에 직접, 또는 선택적인 링커를 통해 결합될 수 있다. 시클로덱스트린 모이어티는 산화 또는 환원될 수 있으며, 예를 들어 디카르보닐 형태로 산화될 수 있다.
탄수화물 안정화제, 예를 들어 환형 올리고당 안정화제는 유도체화된 탄수화물일 수 있다. 예를 들어, 구현예에서, 안정화제는 유도체화된 환형 올리고당, 예를 들어, 유도체화된 사이클로덱스트린, 예를 들어, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 예를 들어, 부분적으로 에테르화된 사이클로덱스트린 (예를 들어, 부분적으로 에테르화된 β 사이클로덱스트린)이다.
예시적인 안정화제는 다당류이다. 본 명세서에 사용된 용어 "다당류"는 글리코시드 연결, 예를 들어 1-4 연결 또는 1-6 연결을 통해 함께 결합되어 선형, 분지형 또는 환형 구조를 형성하는 16개 이상의 단당류 단위에 의해 형성된 화합물 또는 화학적 모이어티를 지칭하며, 골격 구조의 일부로 다당류를 포함하는 중합체를 포함한다. 백본에서 다당류는 선형 또는 환형일 수 있다. 예시적인 다당류 안정화제는 글리코겐, 아밀라아제, 셀룰로스, 덱스트란, 말토덱스트린 등을 포함한다.
일 구현예에서, 안정화제는 당 알코올이다. 본 명세서에서 용어 "당 알코올"은 "당"의 환원 생성물을 의미하며, 단순 당 알코올 분자의 모든 산소 원자가 하이드록실 기의 형태로 존재함을 나타낸다. 당 알코올은 "폴리올"이다. 이 용어는 3개 이상의 하이드록실 기를 함유하는 화합물을 지칭하고 다른 관용 용어인 다가 알코올과 동의어이다. 당 알코올의 예는 소르비톨, 만니톨, 말티톨, 락티톨, 에리트리톨, 글리세린, 자일리톨 또는 이노시톨을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
일 구현예에서, 샘플 조성물은 안정제로서 수크로스를 포함할 수 있다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 수크로스는 샘플 조성물의 동결 보호를 촉진하여 핵산(특히 RNA) 입자 응집을 방지하고 조성물의 화학적 및 물리적 안정성을 유지하는 기능을 한다. 특정 구현예는 본 개시내용에서 수크로스에 대한 대안적인 안정화제를 고려한다. 대안적인 안정화제는 트레할로스, 글루코스, 프룩토스, 아르기닌, 글리세린, 만니톨, 프롤린, 소르비톨, 글리신 베타인 및 덱스트란을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 수크로스에 대한 대안적인 안정화제는 트레할로스이다.
일 구현예에서, 안정화제는 약 5% (w/v) 내지 약 35% (w/v), 예컨대 약 10% (w/v) 내지 약 25% (w/v), 약 15% (w/v) 내지 약 25% (w/v), 또는 약 20% (w/v) 내지 약 25% (w/v)의 농도이다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물은 킬레이트화제를 포함한다. 킬레이트화제는 금속 이온과 적어도 2개의 배위 공유 결합을 형성하여 안정적인 수용성 착체를 생성할 수 있는 화합물을 의미한다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 킬레이트화제는 유리 2가 이온의 농도를 감소시키며, 그렇지 않으면 샘플 조성물에서 핵산(특히 RNA)의 가속화된 분해를 유도할 수 있다. 적합한 킬레이트화제의 예는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), EDTA의 염, 데스페리옥사민 B, 데페록사민, 디키오카브 나트륨, 페니실아민, 펜테테이트 칼슘, 펜테트산의 나트륨 염, 석시머, 트리엔틴, 니트릴로트리아세트산, 트랜스-디아미노사이클로헥산테트라아세트산 (DCTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 비스(아미노에틸)글라이콜에테르-N,N,N',N'-테트라아세트산, 이미노디아세트산, 시트르산, 타르타르산, 푸마르산, 또는 그의 염을 비제한적으로 포함한다. 특정 구현예에서, 킬레이트화제는 EDTA 또는 EDTA의 염이다. 예시적인 구현예에서, 킬레이트화제는 EDTA 이나트륨 이수화물이다.
일부 구현예에서, EDTA는 약 0.25 mM 내지 약 5 mM, 예컨대 약 0.3 mM 내지 약 4.5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 4.0 mM, 약 1.0 mM 내지 약 3.5 mM, 또는 약 1.5 mM 내지 약 2.5 mM의 농도로 샘플 조성물에 함유된다. 바람직한 구현예에서, EDTA는 약 2.5 mM의 농도로 샘플 조성물에 함유된다.
H) 입자 형성 화합물
입자 형성 화합물, 즉, 샘플 조성물의 핵산 (특히 RNA) 함유 입자 (특히 지질 (예를 들어, 양이온성 양친매성 지질) 및/또는 중합체 (예를 들어, 양이온성 양친매성 중합체))로 주로 이루어진 화합물의 양 및/또는 유형 및/또는 공급원 (예를 들어, 천연, 세미-합성, 또는 합성 기원)은 상기 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터에 대한 효과를 가질 수 있다. 효과는 상이한 샘플 조성물에 본 개시내용의 방법 및/또는 용도를 적용함으로써 상기 상이한 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하고, 상이한 샘플 조성물의 하나에 대해 결정된 1개 이상의 파라미터를 상이한 샘플 조성물의 또 다른 것에 대해 결정된 1개 이상의 파라미터과 비교함으로써 분석될 수 있다. 이들 상이한 샘플 조성물은 상이한 농도의 핵산 (특히 RNA), 상이한 지질 공급원 및/또는 중합체 (예를 들어, 천연, 반-합성, 또는 합성 기원), 양이온성 양친매성 지질 이외의 지질의 존재 또는 부재, 양이온성 양쪽성 지질 이외의 중합체의 부재 또는 존재, 상이한 농도의 총 지질, 다양한 농도의 총 중합체, 상이한 총 양의 지질 및 중합체, 및 상이한 비의 핵산 (특별히 RNA) 대 입자 형성 화합물 (특히 지질 및(또는) 중합체)을 포함하지만 이에 국한되지 않는 상이한 조건을 사용하여 제공될 수 있다. 핵산 및 입자 형성 화합물은 둘 다 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 성분이지만, 본 개시내용에서 사용되는 표현 "입자 형성 화합물"은 임의의 핵산을 포함하지 않는다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물 중 핵산의 농도는 약 0.01 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 예컨대 약 0.05 mg/mL 내지 약 1 mg/mL 또는 약 0.1 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL일 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물 중 RNA의 농도는 약 0.01 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 예컨대 약 0.05 mg/mL 내지 약 1 mg/mL 또는 약 0.1 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL이다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 지질 용액, 리포솜 및 핵산(특히 RNA) 입자는 양이온성 양친매성 지질을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "양이온성 양친매성 지질"은 순 양전하를 갖는 양친매성 지질을 지칭한다. 양이온성 양친매성 지질은 지질 기질에 대한 정전기적 상호작용에 의해 음으로 하전된 핵산(특히 RNA)에 결합한다. 일반적으로, 양이온성 양친매성 지질은 스테롤, 아실 또는 디아실 사슬과 같은 친유성 모이어티를 가지며, 지질의 헤드 그룹은 일반적으로 양전하를 띤다. 양이온성 양친매성 지질의 예는 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA), 디메틸디옥타데실암모늄 (DDAB); 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (DODAP); 1,2-디아실옥시-3-디메틸암모늄 프로판; 1,2-디알킬옥시-3- 디메틸암모늄 프로판; 디옥타데실디메틸 염화암모늄 (DODAC), 2,3-디(테트라데콕시)프로필-(2-하이드록시에틸)-디메틸아자늄 (DMRIE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DMEPC), l,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DMTAP), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORIE), 및 2,3-디올레오일옥시- N-[2(스페르민 카복사미드)에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아뮴 트리플루오로아세테이트 (DOSPA)을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. DOTMA, DOTAP, DODAC 및 DOSPA가 바람직하다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 양친매성 지질은 DOTMA 및/또는 DOTAP이다. 일 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 양친매성 지질은 DOTMA, 특히 (R)-DOTMA이다.
추가적인 지질은 핵산(특히 RNA) 입자의 전체 양전하 대 음전하 비율 및 물리적 안정성을 조정하기 위해 혼입될 수 있다. 특정 구현예에서, 추가 지질은 중성 지질이다. 본 명세서에 사용된 "중성 지질"은 순 전하가 0인 지질을 지칭한다. 중성 지질의 예는 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 디아실포스파티딜 콜린, 디아실포스파티딜 에탄올 아민, 세라미드, 페길화된 세라미드 (예를 들어, N-옥타노일-스핑고신-1-{석시닐[메톡시(PEG)]} 및 N-팔미토일-스핑고신-1-{석시닐[메톡시(PEG)]}을 포함하지만 이에 국한되지 않고, PEG는 (폴리에틸렌 글라이콜)750, (폴리에틸렌 글라이콜)2000 또는 (폴리에틸렌 글라이콜)5000), 스핑코미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 페길화된 콜레스테롤 (예컨대 콜레스테롤-(폴리에틸렌 글라이콜)600), 페길화된 디아실글리세라이드 (예컨대 디스테아로일-rac-글리세롤-PEG2000, 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글라이콜-2000, 1,3-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글라이콜-2000, 또는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글라이콜-2000 및 1,3-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글라이콜-2000) 및 세레브로시드의 혼합물이다. 특정 구현예에서, 제2 지질은 DOPE, 콜레스테롤 및/또는 DOPC이다.
특정 구현예에서, 핵산(특히 RNA) 입자는 양이온성 양친매성 지질 및 추가 지질 둘 다를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 양이온성 양친매성 지질은 DOTMA이고 추가 지질은 DOPE이다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 적어도 하나의 추가 지질의 양과 비교한 적어도 하나의 양이온성 양친매성 지질의 양은 중요한 핵산 (특히 RNA) 입자 특징, 예컨대 핵산 (특히 RNA)의 전하, 입자 크기, 안정성, 조직 선택성, 및 생체활성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 적어도 하나의 양이온성 양친매성 지질 대 적어도 하나의 추가의 지질의 몰비는 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 또는 약 3:1 내지 약 1:1이다. 특정 구현예에서, 몰비는 약 3:1, 약 2.75:1, 약 2.5:1, 약 2.25:1, 약 2:1, 약 1.75:1, 약 1.5:1, 약 1.25:1, 또는 약 1:1일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 적어도 하나의 양이온성 양친매성 지질 대 적어도 하나의 추가의 지질의 몰비는 약 2:1이다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 샘플 조성물 중 총 지질의 농도는 약 0.1 내지 약 100 mg/ml, 예컨대 약 0.5 내지 약 90 mg/ml, 약 1 내지 약 80 mg/ml, 약 2 내지 약 70 mg/ml, 약 4 내지 약 60 mg/ml, 약 6 내지 약 50 mg/ml, 약 8 내지 약 40 mg/ml, 또는 약 10 내지 약 20 mg/ml일 수 있다.
또한 핵산 (특히 RNA) 대 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 비율은 상기 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터에 영향을 미칠 수 있고, 1개 이상의 파라미터는 핵산 무결성 (특히 RNA 무결성), 핵산 (특히 RNA)의 총량, 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 (특히, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함) (추가의 선택적 파라미터는 핵산 (특히 RNA)의 분자량, 표면 핵산의 양 (예컨대 표면 RNA의 양), 캡슐화된 핵산의 양 (예컨대 캡슐화된 RNA의 양), 접근 가능한 핵산의 양 (예컨대 접근 가능한 RNA의 양), 핵산 (특히 RNA)의 크기 (특히, 핵산 (특히 RNA)의 Rg 및/또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA)의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 정량적 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (특히 RNA)의 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 형상 계수, 형태 계수, 및 핵산 (특히 RNA) 캡슐화 효율; 뿐말 아니가 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양 대 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 총량의 비 (상기 비율은 입자 크기의 함수임); 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양의 비 (상기 비율은 입자 크기의 함수임); 및 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 음으로 하전된 모이어티의 양의 전하 비율 (상기 전하 비율은 일반적으로 N/P 비율로 표시됨)을 포함한다. 예를 들어, 전하 비율(아래 참조)은 이러한 파라미터 중 적어도 하나에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 중성 지질(들) 대 양이온성 양친매성 지질(들)의 비율은 이러한 파라미터 중 적어도 하나에 영향을 미칠 수 있다.
일반적으로, 핵산(특히 RNA) 대 입자 형성 화합물(특히 지질 및/또는 중합체)의 비율은 약 1:100 내지 약 10:1 (w/w), 예컨대 약 1:90 내지 약 5:1 (w/w), 약 1:80 내지 약 1:2 (w/w), 약 1:70 내지 약 1:1 (w/w), 약 1:60 내지 약 1:2 (w/w), 약 1:55 내지 약 1:5, 약 1:50 내지 약 1:10, 약 1:45 내지 약 1:15, 약 1:40 내지 약 1:20, 또는 약 1:35 내지 약 1:25 (w/w)일 수 있다.
I) 전하 비율
본 발명의 핵산(특히 RNA) 입자의 전하는 적어도 하나의 양이온성 지질에 존재하는 전하와 핵산(특히 RNA)에 존재하는 전하의 합이다. 전하 비율은 적어도 하나의 양이온성 양친매성 지질(또는 양이온성 양친매성 중합체)에 존재하는 양전하 대 핵산(특히 RNA)에 존재하는 음전하의 비율이다. 적어도 하나의 양이온성 양친매성 지질(또는 양이온성 양친매성 폴리머)에 존재하는 양전하 대 핵산(특히 RNA)에 존재하는 음전하의 전하 비율은 다음 방정식에 의해 계산된다. 전하 비율=[(양이온성 양친매성 지질 또는 중합체 농도 (mol)) * (양이온성 양친매성 지질 또는 중합체의 양전하의 총수)] / [(핵산(특히 RNA) 농도(mol)) * (핵산(특히 RNA)의 음전하의 총수)]. 핵산(특히 RNA)의 농도 및 적어도 하나의 양이온성 양친매성 지질 또는 중합체 양은 당업자에 의해 일상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
전하 비율은 본 명세서에 기재된 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터에 영향을 미칠 수 있다. 효과는 상이한 전하 비율가 제공된 적어도 2개의 샘플 조성물에 본 개시내용의 방법 및/또는 용도를 적용하여 상기 상이한 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하고, 적어도 2개의 상이한 샘플 조성물의 하나에 대해 결정된 1개 이상의 파라미터를 적어도 2개의 상이한 샘플 조성물의 또 다른 것에 대해 결정된 1개 이상의 파라미터과 비교함으로써 분석될 수 있다.
일반적으로, 핵산 (특히 RNA) 입자 내의 양전하 대 음전하의 생리학적 pH 전하 비율은 약 6:1 내지 약 1:2, 예컨대 약 5:1 내지 약 1.2:2, 약 4:1 내지 약 1.4:2, 약 3:1 내지 약 1.6:2, 약 2:1 내지 약 1.8:2, 또는 약 1.6:1 내지 약 1:1이다.
제1 구현예에서, 핵산 (특히 RNA) 입자 내의 양전하 대 음전하의 생리학적 pH 전하 비율은 약 1.9:2 내지 약 1:2이다. 특정 구현예에서, 생리학적 pH에서 핵산(특히 RNA) 입자의 양전하 대 음전하의 전하 비율은 약 1.9:2.0, 약 1.8:2.0, 약 1.7:2.0, 약 1.6:2.0, 약 1.5:2.0, 약 1.4:2.0, 약 1.3:2.0, 약 1.2:2.0, 약 1.1:2.0, 또는 약 1:2.0이다. 일 구현예에서, 생리학적 pH에서 핵산(특히 RNA) 입자의 양전하 대 음전하의 전하 비율은 1.3:2.0이다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산(특히 RNA) 입자는 생리학적 pH에서 동일한 수의 양전하 및 음전하를 가질 수 있어 순 중성 전하 비율를 갖는 핵산(특히 RNA) 입자를 생성할 수 있다. 제1 구현예에 따른 전하 비율를 갖는 핵산(특히 RNA) 입자는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포와 같은 비장 조직 또는 비장 세포를 우선적으로 표적화한다.
제2 구현예에서, 생리학적 pH에서 핵산(특히 RNA) 입자에서 양전하 대 음전하의 전하 비율은 약 6:1 내지 약 1.5:1이다. 특정 구현예에서, 생리학적 pH에서 핵산(특히 RNA) 입자의 양전하 대 음전하의 전하 비율은 약 6.0:1.0, 약 5.8:1.0, 약 5.6:1.0, 약 5.4:1.0, 약 5.2:1.0, 약 5.0:1.0, 약 4.8:1.0, 약 4.6:1.0, 약 4.4:1.0, 약 4.2:1.0, 약 4.0:1.0, 약 3.8:1.0, 약 3.6:1.0, 약 3.4:1.0, 약 3.2:1.0, 약 3.0:1.0, 약 2.8:1.0, 약 2.6:1.0, 약 2.4:1.0, 약 2.2:1.0, 약 2.0:1.0, 약 1.8:1.0, 약 1.6:1.0, 또는 약 1.5:1.0이다. 제2 구현예에 따른 전하비를 갖는 핵산(특히 RNA) 입자는 폐 조직 또는 폐 세포를 우선적으로 표적화한다.
J) 물리적 상태
본 명세서에 기재된 샘플 조성물의 물리적 상태(즉, 액체 또는 고체)는 상기 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터에 영향을 미칠 수 있다. 고체의 비제한적인 예는 냉동된 형태 또는 동결건조된 형태를 포함한다. 액체 형태의 비제한적인 예는 용액 또는 현탁액을 포함한다. 건조 형태는 샘플 제제를 분무 건조, 동결 건조 또는 냉동하여 얻을 수 있다. 일 구현예에서, 샘플 조성물은 고체 형태일 수 있다. 대안적인 구현예에서, 샘플 조성물은 액체 형태(예를 들어, 용액 또는 현탁액으로서)일 수 있다.
샘플 조성물의 물리적 상태의 효과는 상이한 물리적 상태로 제공된 적어도 2개의 샘플 조성물에 본 개시내용의 방법 및/또는 용도를 적용함으로써, 상기 상이한 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하고, 상이한 샘플 조성물의 하나에 대해 결정된 1개 이상의 파라미터를 상이한 샘플 조성물의 또 다른 것에 대해 결정된 1개 이상의 파라미터과 비교함으로써 분석될 수 있다.
본 개시내용의 샘플 조성물의 파라미터
샘플 또는 대조 조성물이 핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 경우, 핵산(특히 RNA)은 유리 형태 (즉, 입자에 결합/부착되지 않음)로 및/또는 결합된 형태 (즉, 입자에 결합/부착됨)로 샘플 또는 대조 조성물에 함유될 수 있다. 핵산(특히 RNA)의 총량은 유리 핵산 (특히 RNA) (즉, 미결합된 핵산 (예컨대 미결합 RNA)) 및 결합된 핵산 (특히 RNA)의 합계이다. 결합된 핵산(특히 RNA)은 입자의 외부 표면에 결합된/부착된 핵산 (특히 RNA) (또한 본 명세서에서 "표면 핵산" (예컨대 "표면 RNA")로 지정됨) 및 입자 (또한 본 명세서에서 "캡슐화된 핵산" (예컨대 "캡슐화된 RNA")로 지정됨) 내에 함유된/캡슐화된 핵산 (특히 RNA)로 이루어진다. 표면 핵산"(예를 들어, "표면 RNA") 및 유리 핵산(예를 들어, "유리 RNA")의 합은 또한 본원에서 "접근 가능한 핵산(예를 들어, "접근 가능한 RNA"))으로 지칭된다. 따라서, 핵산의 총량 (예컨대 RNA의 총량) 및 유리 핵산의 양 (예컨대 유리 RNA의 양) 외에, 핵산 (특히 RNA) 및 입자를 포함하는 샘플 또는 대조 조성물의 추가 파라미터는 표면 핵산의 양 (예컨대 표면 RNA의 양), 캡슐화된 핵산의 양 (예컨대 캡슐화된 RNA의 양), 및 접근 가능한 핵산의 양 (예컨대 접근 가능한 RNA의 양)이다. 도 21은 핵산이 RNA인 샘플 또는 대조 조성물 핵산 및 입자에 함유된 상기 언급된 형태의 핵산을 예시한다.
또한, 핵산 (특히 RNA)이 유리 형태 (즉, 핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 입자에 결합 또는 부착되지 않음) 또는 미제형화된 형태(즉, 리포솜 (특히 양이온성 양친매성 지질(들) 및/또는 양친매성 중합체(들)) 및/또는 바이러스 유사 입자를 구성하는 성분이 결여된 것과 같은, 본원에 명시된 바와 같은 입자가 결여된 조성물)인 경우, 크기, 크기 분포 및/또는 핵산 (특히 RNA)의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA)의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (예컨대 RNA)의 유체역학적 반경 (Rh)을 기반으로 함)는 또한 결정되거나 분석될 수 있다. 따라서, 유리 또는 미제형화 형태의 핵산 (특히 RNA)을 포함하는 샘플 또는 대조 조성물의 추가 파라미터는 크기, 크기 분포 및/또는 핵산 (특히 RNA)의 정량적 크기 분포이다 (각각은 예를 들어, Rg 또는 Rh 값을 기반으로 함).추가 파라미터는 예를 들어, 형상 계수, 형태 계수, 핵산 (특히 RNA) 캡슐화 효율, 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양 대 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 총량의 비, 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양의 비, 및 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 음으로 하전된 모이어티의 양의 전하 비율 (N/P 비)과 같은 상기 파라미터 중 하나 이상으로부터 유래된 것들을 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석된 1개 이상의 파라미터는 다음 중 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2개 (예컨대 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 6, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 모두)를 포함한다: 핵산 무결성 (특히 RNA 무결성), 핵산 (특히 RNA)의 총량, 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 분자량, 표면 핵산의 양 (예컨대 표면 RNA의 양), 캡슐화된 핵산의 양 (예컨대 캡슐화된 RNA의 양), 접근 가능한 핵산의 양 (예컨대 접근 가능한 RNA의 양), 핵산 (특히 RNA)의 크기 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 형상 계수, 형태 계수, 핵산 (특히 RNA) 캡슐화 효율, 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양 대 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 총량의 비, 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양의 비, 및 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 음으로 하전된 모이어티의 양의 전하 비율 (N/P 비). 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석된 1개 이상의 파라미터는 다음 중 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2개 (예컨대 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 6, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 모두)를 포함한다: 핵산 무결성 (특히 RNA 무결성), 핵산 (특히 RNA)의 총량, 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 표면 핵산의 양 (예컨대 표면 RNA의 양), 캡슐화된 핵산의 양 (예컨대 캡슐화된 RNA의 양), 접근 가능한 핵산의 양 (예컨대 접근 가능한 RNA의 양), 핵산 (특히 RNA)의 크기 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 형상 계수, 형태 계수, 핵산 (특히 RNA) 캡슐화 효율, 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양 대 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 총량의 비, 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양의 비, 및 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 음으로 하전된 모이어티의 양의 전하 비율 (N/P 비). 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석된 1개 이상의 파라미터는 다음 중 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2개 (예컨대 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 6, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 모두)를 포함한다: 핵산 무결성 (특히 RNA 무결성), 핵산 (특히 RNA)의 총량, 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 표면 핵산의 양 (예컨대 표면 RNA의 양), 캡슐화된 핵산의 양 (예컨대 캡슐화된 RNA의 양), 접근 가능한 핵산의 양 (예컨대 접근 가능한 RNA의 양), 핵산 (특히 RNA)의 크기 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 형상 계수, 형태 계수, 및 핵산 (특히 RNA) 캡슐화 효율. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석된 1개 이상의 파라미터는 다음 중 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2개 (예컨대 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 6, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 모두)를 포함한다: 핵산 무결성 (특히 RNA 무결성), 핵산 (특히 RNA)의 총량, 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 표면 핵산의 양 (예컨대 표면 RNA의 양), 캡슐화된 핵산의 양 (예컨대 캡슐화된 RNA의 양), 접근 가능한 핵산의 양 (예컨대 접근 가능한 RNA의 양), 핵산 (특히 RNA)의 크기 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (특히 RNA) 캡슐화 효율. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석된 1개 이상의 파라미터는 다음 중 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2개 (예컨대 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 6, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 모두)를 포함한다: 핵산 무결성 (특히 RNA 무결성), 핵산 (특히 RNA)의 총량, 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 표면 핵산의 양 (예컨대 표면 RNA의 양), 캡슐화된 핵산의 양 (예컨대 캡슐화된 RNA의 양), 접근 가능한 핵산의 양 (예컨대 접근 가능한 RNA의 양), 핵산 (특히 RNA)의 크기 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 핵산 (특히 RNA)의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (특히 RNA) 캡슐화 효율. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석된 1개 이상의 파라미터는 다음 중 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2개 (예컨대 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)를 포함한다: 핵산 무결성 (특히 RNA 무결성), 핵산 (특히 RNA)의 총량, 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함). 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석된 1개 이상의 파라미터는 다음 중 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2개의 (예컨대 적어도 3 또는 적어도 4, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)를 포함한다: 핵산 (특히 RNA)의 총량, 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함). 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석된 1개 이상의 파라미터는 다음 중 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2개 (예컨대 적어도 3, 예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개)를 포함한다: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함).
본 개시내용의 방법 및/또는 용도의 구현예 (특히 조성물 (예컨대 샘플 또는 대조 조성물)이 RNA 및 입자를 포함하는 구현예)에서, 1개 이상의 파라미터는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 유체역학적 반경 (Rh)을 기준으로 함) 및 선택적으로 본 명세서에 명시된 나머지 파라미터 중 적어도 1개의 파라미터, 예컨대 적어도 2개의 파라미터 (추가의 선택적 파라미터 포함)를 포함하고; 바람직하게는 이들 남아 있는 파라미터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함). 본 개시내용의 방법 및/또는 용도의 구현예 (특히 조성물 (예컨대 샘플 또는 대조 조성물)이 RNA 및 입자를 포함하는 구현예)에서, 1개 이상의 파라미터는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함) 및 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 파라미터, 예컨대 적어도 2개의 파라미터: 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양, 및 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함)를 포함한다. 본 개시내용의 방법 및/또는 용도의 구현예 (특히 조성물 (예컨대 샘플 또는 대조 조성물)이 RNA 및 입자를 포함하는 구현예)에서, 1개 이상의 파라미터는 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포 (예를 들어, 이는 Rg 또는 Rh 값을 기준으로 함), 유리 핵산 (특히 RNA)의 양, 및 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양을 포함한다. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포가 Rg 값과 Rh 값을 기준으로 결정되면, 이는 2개의 데이터 세트, 즉, Rg 값을 기준으로 하는 하나 및 Rh 값을 기준으로 하는 하나를 생성한다. 그러나, 본 발명에 따르면, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포에 대한 이들 2개의 데이터 세트는 (2개의 파라미터가 아닌) 하나의 파라미터로만 간주된다. 또한, 필드-유동 분획화에 의해 수득된 프락토그램이 하나 이상의 입자 피크를 나타내는 경우, 각 입자 피크에 대한 정량적 크기 분포의 결정은 하나의 파라미터로만 간주된다 (각 입자 피크에 대한 하나의 파라미터가 아님). Rg 값과 Rh 값을 기준으로 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포를 결정하는 경우에도 마찬가지이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석될 1개 이상의 파라미터는 단계(a) 내지 (c)의 적어도 1 (예를 들어, 1 내지 10개의) 주기에서 결정되거나 분석된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석될 1개 이상의 파라미터는 단계(a) 내지 (c)의 1개의 주기에서 결정되거나 분석된다.
일반적으로, 샘플 조성물의 파라미터(예를 들어, 핵산(특히 RNA)의 양)는 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정 또는 분석되어야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터(예를 들어, 유리 핵산(특히 RNA)의 양)는 본 개시내용의 방법이 수행되거나 본 개시내용의 용도가 적용되기 전에 알려져 있지 않다. 그러나, 일부 구현예에서, 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터(예를 들어, 유리 핵산(특히 RNA)의 양)는 제1 시점에 알려져 있고 본 개시내용의 방법 및/또는 용도는 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터(예를 들어, 유리 핵산(특히 RNA)의 양)를 특정 기간 (예컨대 1시간 이상, 1일 이상, 1주 이상, 1개월 이상, 또는 1년 이상)에 걸쳐 적어도 제2, 나중 시점 (예를 들어, 적어도 1회 (예컨대 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 8회, 적어도 10회) 매시간 (예컨대 매일, 매주, 매월, 또는 매년) 결정하거나 분석하기 위해 이용된다. 따라서, 일 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도는 특정 기간 (예컨대 1시간 이상, 1일 이상, 1주 이상, 1개월 이상, 또는 1년 이상)에 걸쳐, 예를 들어, 샘플 조성물의 보관 동안 모니터 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터를 이용하여, 시간 경과에 따라 1개 이상의 파라미터의 프로파일을 결정할 수 있다.
대안적인 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도는 적어도 2개의 샘플 조성물의 동일한 1개 이상의 파라미터 (예를 들어, 유리 핵산 (특히 RNA)의 양)을 비교하기 위해 이용될 수 있고, 여기서 적어도 2개의 샘플 조성물은 적어도 2개의 샘플 조성물이 제공된 하나 이상의 반응 조건에서만 다르다. 이 구현예에서, 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터에 대한 상이한 반응 조건의 효과를 분석하는 것이 가능하다. 이러한 반응 조건에는 합성 조건, 가공 조건(예를 들어, 정제 및/또는 건조 조건) 및 보관 조건이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
A. 핵산 무결성(특히 RNA 무결성)
본 발명에 따르면, 핵산 무결성(특히 RNA 무결성)은 샘플 조성물에 포함된 핵산(특히 RNA)의 분해 정도를 나타내는 파라미터이다. 예를 들어, 분해되지 않는 핵산(특히 RNA)의 경우, 상기 핵산의 모든 분자는 동일한 길이를 갖는다. 따라서 필드-유동 분획화를 사용하여 크기 또는 유체역학적 이동성(예를 들어, 확산 계수)에 따라 분리할 때, 미분해 핵산(특히 RNA)은 날카로운 피크를 제공해야 한다. 대조적으로, 핵산(특히 RNA)의 분해는 길이가 다른 분자 혼합물을 생성한다. 결과적으로, 필드-유동 분획화를 사용하여 그의 크기 또는 유체역학적 이동성에 따라 분리될 때, 분해된 핵산 (특히 RNA)은 미분해 핵산 (특히 RNA)과 비교하여 상이한 체류 시간, 특히 더 이른 체류 시간에서 검출되고, 분해되지 않는 핵산 (명칭적으로 RNA)에 대한 피크는 미분해 핵산(특히 RNA)만이 존재하는 상황과 비교하여 더 넓고 더 작다. 분해도가 높을수록 분해된 핵산(특히 RNA)의 피크는 넓고 높고, 비분해 핵산(특히 RNA)의 피크는 넓고 작아진다. 당업자는 일상적인 실험실 기술 및 기기를 사용하여 핵산(특히 RNA)을 검출할 수 있을 것이다. 예를 들어, 필드-유동 분획화를 통한 분리 후 핵산(특히 RNA)은 UV 신호, 형광 신호 및 굴절률(RI) 신호로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 신호를 측정하여 검출할 수 있다. 핵산(특히 RNA)은 UV 범위(예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)에서 특징적인 소광 계수를 가지므로, 상기 핵산(특히 RNA)의 검출은 (바람직하게는 260 nm 또는 280 nm의 파장과 같은 260 nm 내지 280 nm 범위의 파장에서) UV 신호를 측정함으로써 수행된다.
예를 들어, 도 6c는 미처리 RNA, 완전히 분해된 RNA 또는 미처리 RNA와 분해된 RNA의 혼합물을 포함하는 3가지 샘플 조성물에 대한 UV 신호를 보여준다. 도 6c에서 볼 수 있는 바와 같이, 처리되지 않은(즉, 분해되지 않은) RNA는 약 17분의 체류 시간에서 단일 피크를 제공하고, 완전히 분해된 RNA는 약 4분의 체류 시간에서 피크를 제공하고, 미분해된 RNA와 분해된 RNA는 완전히 미분해 RNA에 대해 수득한 피크 또는 완전히 분해된 RNA에 대해 수득한 피크보다 작은 2개의 피크(각각 약 4분 및 약 17분의 체류 시간)를 제공한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 샘플 조성물의 핵산 무결성(특히 RNA 무결성)은 대조 핵산(특히 대조 RNA)의 무결성을 사용하여 결정되거나 계산되는 것이 바람직하다. 이러한 대조 핵산 (특히 대조 RNA)은 통상적으로 대조 조성물에 함유되고, 여기서 대조 조성물 및 샘플 조성물은 (i) 샘플의 하나 이상의 파라미터에 대한 효과가 결정 또는 분석되어야 하는 샘플 조성물에 적용되는 조건 및/또는 (ii) 샘플 조성물의 하나 이상의 파라미터들에 대한 효과가 측정 또는 분석되는 샘플 조성물 중 성분의 존재 또는 부재를 제외하고는 동일하다. 예를 들어, 샘플 조성물에 적용되는 조건이, 예를 들어, 약 98℃의 고온(특정 기간(예를 들어, 2, 4 또는 10분) 동안 적용됨)인 경우, 각각의 대조 조성물은 샘플 조성물 (즉, 샘플 조성물과 동일한 양의 동일한 성분(특히 동일한 핵산(특히 RNA) 등)을 가짐)과 동일하지만, 고온에 노출되지 않았다. 또한, 예를 들어 샘플 조성물은 부형제(예를 들어, 안정화제 또는 킬레이트화제)를 추가로 포함하는 경우, 각각의 대조 조성물은 샘플 조성물과 동일하고, 샘플 조성물과 동일한 조건을 거치고, 단, 대조 조성물은 부형제를 함유하지 않는다. 또한, 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터가 일정 기간 동안 모니터링되어야 하는 경우(예를 들어, 보관 시 안정성 프로파일을 얻기 위해), 대조 조성물은 초기 샘플 조성물, 즉 모니터링 시작 시의 샘플 조성물일 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 개시된 샘플 조성물의 핵산 무결성(특히 RNA 무결성)이 대조 핵산(특히 대조 RNA)의 무결성을 사용하여 결정되거나 계산되는 경우, 바람직하게는, 샘플 조성물에 대해 측정 또는 계산된 무결성 값은 대조 조성물에 대해 결정 또는 계산된 무결성 값과 상관관계가 있다. 따라서, 일반적으로 샘플 조성물에 대해 결정되거나 계산된 무결성 값(IV)은 대조 조성물에 대해 결정되거나 계산된 무결성 값으로 정규화되고, 예를 들어 샘플 조성물에 대해 결정되거나 계산된 무결성 값(IVS)은 대조 조성물에 대해 결정되거나 계산된 무결성 값 (IVC)으로 나누고, 다음 방정식:
Figure pct00017
에 따라 샘플 조성물(IS norm.)의 정규화된 무결성을 초래하고, 여기서 결과는 백분율로 표시된다 (따라서 대조 조성물에 대해 결정되거나 계산된 무결성은 100%임).
이와 관련하여, 무결성 값은, 예를 들어, 대조 또는 샘플 조성물의 필드-유동 분획화로부터 수득된 프락토그램에서 미분해 핵산 (특히, 미분해 RNA)을 나타내는 피크의 면적 및/또는 높이를 사용하여, 당업자에게 공지된 바와 같이 결정 또는 계산될 수 있다.
하나의 바람직한 구현예에서, 무결성 값은 미분해 핵산(특히 미분해 RNA)을 나타내는 피크(UV, 형광 또는 RI 피크)의 면적에 기초하여 결정되거나 계산된다. 특히, 무결성 값은 (i) 상기 피크의 최대 높이에서 상기 피크의 끝까지의 면적(A50%) 및 (ii) 상기 피크의 총 면적(A100%)의 비율로 결정되거나 계산된다. 예를 들어, 도 2는 A50% 및 A100% 값의 결정 또는 계산을 도시한다. 특히, 도 2a는 대조 RNA 조성물에 대한 A50% 값의 결정 또는 계산을 보여주는 반면(A50% 값의 결정 또는 계산에 대한 한계는 수치 "1"로 표시됨), 도 2b는 대조 RNA 구성에 대한 A100% 값의 값의 결정 또는 계산을 보여준다(A100% 값의 결정 또는 계산에 대한 한계는 수치 "2"로 표시됨). 도 2c 및 2d는 열처리를 받은 샘플 RNA 조성물에 대한 A50%(도 2c) 및 A100%(도 2d) 값의 결정 또는 계산을 보여준다(따라서 도 2c 및 2d의 피크는 분해된 RNA의 존재로 인해 더 넓다).
대안적인 바람직한 실시예에서, 무결성 값은 참조 샘플 없이 결정되거나 계산된다. 이 구현예에서, 샘플 조성물에 대한 무결성 값은 바람직하게는 (i) 2·A50%의 비율, 즉, 상기 피크의 최대 높이에서 상기 피크의 끝까지 피크 면적의 2배 값 및 (ii) A100%, 즉, 상기 피크의 총 면적이다. 따라서 샘플 조성물에서 핵산(특히 RNA)의 무결성은 다음 방정식:
Figure pct00018
에 따라 결정되거나 계산된다. 핵산(특히 RNA) 무결성을 결정하기 위한 다른 루틴이 가능하다(예를 들어, 피크의 한계는 피크의 구배로 정의될 수 있음). 피크 최대값이 "온전한"/미분해 핵산(특히 RNA)을 함유하는지 확인하기 위해, 핵산(특히 RNA)의 분자량을 LS 데이터에서 결정하거나 계산할 수 있으며, (핵산 서열 및 핵산에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착된 선택적 추가의 물질 (예를 들어, 하나 이상의 염료)를 기반으로) 샘플의 이론적인 계산된 분자량과 비교된다. 핵산(특히 RNA)의 고분자 구조를 피하기 위해, 샘플은 입자의 응집체 형성을 방지할 수 있는 용매 또는 용매 혼합물로 희석해야 한다. 예를 들어, 용매 혼합물은 물과 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 혼합물 (예컨대 60% (v/v))일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 희석은 분석 직전(예를 들어, 분석 5분 전) 및/또는 승온에서 (예를 들어, 40℃ 내지 80℃, 예컨대 50℃ 내지 70℃ 또는 55℃ 내지 65℃의 범위에서, 또는 약 60℃에서) 수행된다. 고분자 구조를 형성하는 경향이 낮은 샘플은 입자의 응집체 형성을 방지할 수 있는 용매 또는 용매 혼합물로 희석하지 않고 분석될 수 있다.
추가의 대안적인 구현예에서, 무결성 값은 미분해 핵산(특히 미분해 RNA)을 나타내는 피크(UV, 형광 또는 RI 피크)의 높이에 기초하여 결정되거나 계산된다. 이 구현예에서, 샘플 조성물에 대한 무결성 값은 샘플 조성물에 대해 얻어진 프락토그램에서 상기 피크의 높이(HS)이고 대조 조성물에 대한 무결성 값은 대조 조성물에 대해 얻어진 프락토그램에서 상기 피크의 높이(HC)이다. 따라서 샘플 조성물에서 핵산(특히 RNA)의 정규화된 무결성은 다음 방정식:
Figure pct00019
에 따라 결정되거나 계산된다. 샘플 조성물에서 핵산(특히 RNA)의 정규화된 무결성에 대한 이러한 종류의 결정 또는 계산은 (면적, 특히 A50% 대 A100%의 비에 기초한 상기 확인된 구현예와 비교하여) 덜 민감하다. 따라서, 미분해 핵산(특히, 미분해 RNA)을 나타내는 피크의 높이를 기반으로 하는 샘플 조성물에서 핵산(특히 RNA)의 정규화된 무결성의 결정 또는 계산을 위한 이 대안적인 구현예는 덜 바람직하다.
추가의 대안적인 구현예에서, 특히 핵산 (특히 RNA)이 10,000개 초과의 뉴클레오티드 (예컨대 최대 15,000개의 뉴클레오티드, 또는 최대 12,000개의 뉴클레오티드)의 길이를 갖는 경우, 샘플 조성물에 대한 무결성 값은 (a) UV 신호, 형광 신호, 및 굴절률 (RI) 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호, 및 (b) LS 신호 (예를 들어, MALS 신호) 둘 다를 기반으로 결정되거나 계산될 수 있다. 이 추가의 대안적인 구현예는 참조 핵산(특히 RNA)에 의존하지 않고 사용될 수 있다. 위에서 지적한 바와 같이, 미분해 핵산(특히 RNA)은 날카로운 피크를 나타내야 하는 반면, 핵산(특히 RNA)의 분해는 길이가 다른 분자 혼합물을 초래한다. 결과적으로, 미분해 핵산(특히 RNA)을 나타내는 LS 신호(예를 들어, MALS 신호)로부터 계산된 분자량 곡선은 (거의) 수평선, 즉 약 0의 구배를 갖는 연속 곡선 섹션이어야 한다. 대조적으로, 부분적으로 분해된 핵산(특히 RNA)의 혼합물(즉, 상이한 (바람직하게는 감소하는) 분자량을 갖는 핵산 (특히 RNA)의 혼합물)을 나타내는 LS 신호(예를 들어, MALS 신호)로부터 계산된 분자량 곡선은 상이한 구배를 갖는 상이한 섹션을 가지며, 거의 0의 구배를 갖는 (바람직하게 연속적인) 섹션은 이상적으로는 온전한/미분해 핵산(특히 RNA)의 부분을 나타낸다. 따라서 분자량 곡선의 (거의) 수평 단면이 각각 시작되고 끝나는(즉, tb 및 te) 체류 시간은 "온전한"/미분해 핵산(특히 RNA)을 나타내는 피크(UV, 형광 또는 RI 피크)에 대한 제한으로 간주될 수 있다. 분자량 곡선의 (거의) 수평 단면이 각각 시작하고 끝나는 이러한 체류 시간을 결정하기 위해 분자량 곡선의 1차 도함수을 계산할 수 있다. 그런 다음 1차 도함수가 약 0인 (바람직하게는 연속적인) 단면의 시작점 및 종점은 원하는 체류 시간을 나타낸다. 결과적으로, 이 추가의 대안적인 구현예에서, 샘플 조성물에 대한 무결성 값은 바람직하게는 (i) 이러한 체류 시간 사이의 피크(UV, 형광 또는 RI 피크)의 면적과 (ii) 상기 피크의 총 면적으로서 결정되거나 계산된다. 따라서, 이러한 추가의 대안적 구현예에서, 샘플 조성물 내의 핵산(특히 RNA)의 무결성(I)은 하기 방정식:
Figure pct00020
Figure pct00021
을 사용하여 계산될 수 있고, 여기서 APeak1은 총 피크(UV, 형광 또는 RI 피크)의 면적이고, APeak2는 tb와 te 사이의 피크(UV, 형광 또는 RI 피크)의 면적이다. 피크 최대값이 "온전한"/미분해 핵산(특히 RNA)을 함유하는지 확인하기 위해, 핵산(특히 RNA)의 분자량을 LS 데이터(예컨대 MALS 데이터)에서 결정하거나 계산할 수 있으며, (핵산 서열 및 핵산에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착된 선택적 추가의 물질 (예를 들어, 하나 이상의 염료)를 기반으로) 샘플의 이론적인 계산된 분자량과 비교된다. 핵산(특히 RNA)의 고분자 구조를 피하기 위해, 샘플은 입자의 응집체 형성을 방지할 수 있는 용매 또는 용매 혼합물로 희석해야 한다. 예를 들어, 용매 혼합물은 물과 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 혼합물 (예컨대 60% (v/v))일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 희석은 분석 직전(예를 들어, 분석 5분 전) 및/또는 승온에서 (예를 들어, 40℃ 내지 80℃, 예컨대 50℃ 내지 70℃ 또는 55℃ 내지 65℃의 범위에서, 또는 약 60℃에서) 수행된다. 고분자 구조를 형성하는 경향이 낮은 샘플은 입자의 응집체 형성을 방지할 수 있는 용매 또는 용매 혼합물로 희석하지 않고 분석될 수 있다. 예를 들어, 도 23은 참조 핵산을 사용하지 않고 핵산 무결성의 결정 또는 계산을 위한 상기 추가의 대안적 구현예를 예시한다. 특히, 도 23a는 90°에서 LS 신호(점선) 및 260 nm에서 UV 신호(실선)를 갖는 saRNA(11,917 뉴클레오티드의 길이를 가짐)의 AF4 프락토그램을 보여준다. 굵은 어두운 선은 MALS 신호에서 파생된 분자량을 나타낸다. 분해되지 않은/온전한 RNA 피크(피크 2)에 대한 한계를 결정하기 위해, MALS 신호에서 파생된 분자량 곡선(도 23b의 상부 패널에도 표시됨)을 미분하여 이의 1차 도함수(도 23b의 하부 패널에 표시됨)를 계산한다. 도 23b에 제시된 데이터에 따르면, 약 0인 1차 도함수의 연속 섹션은 t = 내지 15분(= tb)에서 시작하여 t = 내지 31.8분(= te)에서 끝난다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도의 단계(b)에서, 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 형광 신호, 및 굴절률 (RI) 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호가 측정되고, 이로부터 (샘플) 조성물 내에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 양이 결정될 수 있다. 핵산(특히 RNA)이 UV 범위(예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)에서 특징적인 소광 계수를 가지므로, 상기 핵산(특히 RNA)의 양은 UV 신호를 측정하여 결정할 수 있다. 핵산 (특히 RNA)이 형광이거나 (예를 들어, 핵산이 형광 염료로 공유적으로 또는 비공유적으로 표지되기 때문에) 또는 형광이 되거나 (예컨대, (특히 특이적으로) 핵산에 부착되는 형광 염료, 예컨대 형광 삽입 염료를 첨가함으로써), 핵산 (특별히 RNA)의 양은 또한 형광 (FS) 신호를 측정함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로, 입자에 결합된 핵산(특히 RNA)의 양은 형광 염료로 표지된 입자를 사용하여 결정할 수 있다. 임의의 형광 염료는 상기 접근법에서 사용될 수 있다. 형광 염료를 핵산 (특히 RNA) 또는 또 다른 물질 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 입자를 구성하는 물질, 예컨대 지질 및/또는 중합체)에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착시키는 형광 염료 및 절차는 당업자에게 공지되어 있고; 예를 들허 문헌["The Molecular Probes Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies", 11th edt. (2010), I. Johnson and M.T.Z. Spence (편집자)]를 참조하고, 이는 본 명세서에 포함된다. 또한, 핵산(특히 RNA)의 양은 굴절률(RI) 신호를 측정하여 결정될 수도 있다.
B. 핵산(특히 RNA)의 총량
일반적으로, 핵산(특히 RNA)의 양은 UV 신호, 형광 신호, 및 굴절률 (RI) 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호에 기초하여 결정되거나 계산될 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 목적을 위해, 보정 곡선이 사용되며, 상기 보정 곡선은 상이한 공지된 양의 대조군 핵산 (특히 RNA), 및 상기 대조군 핵산으로부터 수득된 UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호 (특별히 RNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호를 함유하는 여러 대조군 조성물에 기초하여 확립된다.
핵산(특히 RNA)은 UV 범위(예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)에서 특징적인 소광 계수를 가지고 있다. 따라서, 대안적이고 바람직한 구현예에서, 핵산(특히 RNA)의 양은 UV 신호(바람직하게는 260 nm 내지 280 nm 범위의 파장, 예를 들어 260 nm 또는 280 nm의 파장에서)를 측정하고 람베르트-베르의 법칙을 사용하여 결정되거나 계산된다. 예를 들어, 샘플 또는 대조 조성물의 핵산(특히 RNA) 농도는 다음 방정식을 사용하여 계산할 수 있다:
Figure pct00022
여기서 c는 핵산(특히 RNA) 농도(mg/mL)이고; A는 UV 피크 면적(AU 분)이고; F는 필드-유동 분획화에 사용된 유량(mL/분)이고; ε은 핵산의 특정 소광 계수이고(예를 들어, 단일 가닥 RNA의 경우 0.025 (mg/mL)-1 cm-1); d는 세포 길이(cm)이고; 그리고 V는 샘플 또는 대조 조성물 또는 이의 일부의 주입된 부피이다.
UV 범위(예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)에서 소광 계수를 사용하여 핵산(특히 RNA)을 결정하거나 계산하는 것은 보정 곡선을 설정할 필요가 없기 때문에 유리하다.
위에서 지적한 바와 같이, 샘플 또는 대조 조성물이 핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 경우, 핵산(특히 RNA)은 유리 형태 (즉, 입자에 결합/부착되지 않음)로 및/또는 결합된 형태 (즉, 입자에 결합/부착됨)로 조성물에 함유될 수 있다. 핵산(특히 RNA)의 총량은 유리 핵산 (특히 RNA) (즉, 미결합된 핵산 (예컨대 미결합 RNA)) 및 결합된 핵산 (특히 RNA)의 합계이다.
따라서, 핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 본 개시내용의 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 핵산(특히 RNA)의 총량을 결정하거나 계산하기 위해, (a) 상기 샘플 또는 대조군 조성물에 대한 유리 핵산 (특히 RNA)의 양 및 결합된 핵산 (특별히 RNA)의 양 모두를 결정 또는 계산해야 하거나, 또는 (b) 한 형태의 핵산 (특히, RNA) (예를 들어, 결합된 핵산(특히, 결합된 RNA))을 다른 형태 (예를 들면, 유리 핵산(특별히 유리 RNA) )로 (바람직하게는 완전히) 전달하고, 후자의 형태의 양을 결정 또는 계산해야 한다. 이러한 전달은 예를 들어 샘플 또는 대조 조성물 또는 이의 일부에 방출제를 첨가하여 달성할 수 있다. 방출제는 입자로부터 입자에 결합된 핵산 (특히 RNA)을 방출할 수 있다 (이에 의해 결합된 핵산(특히 결합된 RNA)의 양을 0으로 감소시키고, 유리 핵산 (특별히 유리 RNA)의 양을 그의 최대치로 증가시킨다). 방출제는 (i) 계면활성제, 예컨대 음이온성 계면활성제 (예를 들어, 나트륨 도데실설페이트), 쯔비터이온성 계면활성제 (예를 들어, n-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트 (Zwittergent® 3-14)), 양이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, 또는 그의 혼합물; (ii) 알코올, 예컨대 지방족 알코올 (예를 들어, 에탄올), 또는 알코올의 혼합물; 또는 (iii) (i)과 (ii)의 조합을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 바람직한 방출제는 음이온성 계면활성제 (예를 들어, 나트륨 도데실설페이트), 쯔비터이온성 계면활성제 (예를 들어, n-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트 (Zwittergent® 3-14)), 또는 그의 조합이다. 핵산(특히 RNA)이 필드-유동-분획화 동안 입자로 재흡수되지 않도록 하기 위해, 일 구현예에서, 그 안에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 총량이 결정 또는 계산되어야 하거나 상기 샘플 또는 대조 조성물의 일부는 방출제를 함유하는 액상을 사용하여 필드-유동-분획화를 거친다. 다만, 방출제로 Zwittergent® 3-14를 사용하는 경우에는, 방출제가 포함된 액상을 사용할 필요는 없다.
C. 유리 핵산(특히 RNA)의 양
유리 핵산(특히 RNA)은 본 명세서에 개시된 입자에 비해 크기가 훨씬 작거나 적어도 본 명세서에 개시된 입자와 비교하여 필드-유동-분획화에서 훨씬 더 높은 유체역학적 이동성을 갖는다. 따라서 필드-유동-분획화을 사용하여 입자에 결합된 핵산(특히 RNA)에서 유리 핵산(특히 RNA)을 2개의(바람직하게는 기준선 분리된) 피크로 분리할 수 있으며, 상기 하나의 피크는 유리 핵산(특히 RNA)를 나타내고, 다른 피크는 입자에 결합된 핵산(특히 RNA)을 나타낸다. 예를 들어, 필드-유동 분획화가 하나의 값(예를 들어, 약 1 내지 약 4 mL/분)에서 시작하여 더 낮은 값(예를 들어, 약 0 내지 약 0.1 mL/분)으로 감소하는 교차 유량 프로파일을 사용하여 수행되는 경우, 초기 체류 시간의 피크는 유리 핵산(특히 RNA)을 나타내고 나중 체류 시간의 피크는 입자에 결합된 핵산(특히 RNA)을 나타낸다. 예를 들어, 도 5는 RNA 및 입자를 포함하는 샘플 조성물을 필드-유동-분획화에 적용하여 수득한 대표적인 프락토그램을 예시하며, 여기서 UV 신호(260 nm에서 기록됨; 파선) 및 광산란(LS) 신호(실선) 시간이 지남에 따라 기록된다. 밝은 회색 상자는 유리 RNA의 피크를 나타내는 반면, 어두운 회색 상자는 입자(파선) 및 입자(실선)에 결합 RNA를 나타낸다.
따라서, 핵산 (특히 RNA) 및 입자를 포함하는 본 개시내용의 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 유리 핵산 (특히 RNA)의 양은 핵산 (특히 RNA) 및 입자를 포함하는 본 개시내용의 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 총량의 결정 또는 계산 에 대해 상기에 명시된 것과 동일한 방식으로 결정되거나 계산될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 핵산 (특히 RNA) 및 입자를 포함하는 본 개시내용의 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 유리 핵산 (특히 RNA)의 양은 UV 신호, 형광 신호, 및 굴절률 (RI) 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호에 기초하여 결정되거나 계산되고, 보정 곡선이 사용된다. 바람직한 구현예에서, 유리 핵산 (특히 RNA)의 양은 UV 범위(예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)에서 핵산(특히 RNA)의 소광 계수를 사용하여 결정되거나 계산된다.
D. 입자에 결합된 핵산(특히 RNA)의 양
위에서 지적한 바와 같이, 샘플 또는 대조 조성물이 핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 경우, 핵산(특히 RNA)은 유리 형태 (즉, 입자에 결합/부착되지 않음)로 및/또는 결합된 형태 (즉, 입자에 결합/부착됨)로 조성물에 함유될 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 본 개시내용의 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 결합된 핵산(특히 RNA)의 양은 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 총량 및 조성물에 함유된 유리 핵산 (특히 유리 RNA)의 양으로부터, 특히 핵산 (특히 RNA)의 총량에서 유리 핵산 (특히 유리 RNA)의 양을 빼서 결정되거나 계산될 수 있다. 둘 다, 조성물에 함유된 결합 및 유리 핵산(특히 RNA)의 양은 예를 들어, UV 신호, 형광 신호, 및 굴절률 (RI) 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호를 기반으로 하는 보정 곡선을 사용하여, 또는 UV 범위(예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)에서 핵산(특히 RNA)의 소광 계수를 사용하여 상기에 명시된 바와 같이 결정되거나 계산될 수 있다.
E. 표면 핵산의 양(예를 들어, 표면 RNA의 양)
위에서 지적한 바와 같이, 샘플 또는 대조 조성물이 핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 경우, 핵산(특히 RNA)은 입자 ("표면 핵산" (예컨대 "표면 RNA"))의 외부 표면에 결합되고/부착될 수 있다. 이러한 표면 핵산 (예컨대 표면 RNA)은 염료, 특히 형광 염료를 샘플 또는 대조군 조성물에 첨가함으로써 검출될 수 있고, 여기서 염료는 (특히 특이적으로) 핵산 (특히 RNA), 특히 입자의 외부 표면에 결합/부착된 핵산에 결합한다 (즉, 염료는 바람직하게는 입자에 의해 캡슐화된 핵산에 결합할 수 없다). 이러한 목적에 적합한 염료, 특히 형광 염료는 당업자에게 공지되어 있으며; 예를 들어, 문헌["The Molecular Probes Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies", 11th edt. (2010)]를 참조한다. 핵산(특히 RNA), 특히 입자의 외부 표면에 결합/부착된 핵산에 (특히 특이적으로) 결합하는 이러한 염료의 특정 예는 삽입작용 염료, 예를 들어, GelRED (5,5'-(6,22-디옥소-11,14,17-트리옥사-7,21-디아자헵타코산-1,27-디일)비스(3,8-디아미노-6-페닐페난트리딘-5-이움) 아이오다이드), GelGreen (10,10'-(6,22-디옥소-11,14,17-트리옥사-7,21-디아자헵타코산-1,27-디일)비스(3,6-비스(디메틸아미노)아크리딘-10-이움) 아이오다이드), 베르베린, 에티듐 (예컨대 에티듐 브로마이드), 메틸렌 블루, 또는 프로플라빈, 바람직하게는 GelRED를 포함한다.
따라서, 일 구현예에서, 핵산 (특히 RNA) 및 입자를 포함하는 본 개시내용의 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 표면 핵산 (특히 표면 RNA)의 양은 샘플 또는 대조 조성물에 첨가된 염료의 신호, 특히 형광 염료, 예컨대 삽입작용 염료 (예를 들어, GelRED (5,5'-(6,22-디옥소-11,14,17-트리옥사-7,21-디아자헵타코산-1,27-디일)비스(3,8-디아미노-6-페닐페난트리딘-5-이움) 아이오다이드), GelGreen (10,10'-(6,22-디옥소-11,14,17-트리옥사-7,21-디아자헵타코산-1,27-디일)비스(3,6-비스(디메틸아미노)아크리딘-10-이움) 아이오다이드), 베르베린, 에티듐 (예컨대 에티듐 브로마이드), 메틸렌 블루, 또는 프로플라빈, 바람직하게는 GelRED)의 형광 신호로부터 결정되거나 계산될 수 있고, 염료 (특히 구체적으로)는 핵산 (특히 RNA), 특히 입자의 외부 표면에 결합된/부착된 핵산 (특히 RNA)에 결합한다. 바람직하게는, 염료의 발광(예를 들어, 형발광)은 표면 핵산(특히 표면 RNA)에 대한 결합(예를 들어, 삽입)에 의해 향상된다.
일 구현예에서, 이러한 목적을 위해 보정 곡선이 사용되며, 상기 보정 곡선은 염료 (예를 들어, 형광 염료, 예컨대 삽입작용 염료, 예를 들어, GelRED, GelGreen, 베르베린, 에티듐 (예컨대 에티듐 브로마이드), 메틸렌 블루, 또는 프로플라빈, 바람직하게는 GelRED)를 함유하는 몇 개의 대조 조성물 및 상이한 공지된 양의 대조 핵산(특히 RNA) 및 염료로부터의 발광 신호(예를 들어, 형광 염료로부터의 형광 신호)을 기초로 확립된다.
F. 캡슐화된 핵산의 양(예를 들어, 캡슐화된 RNA의 양)
상기 표시된 바와 같이, 샘플 또는 대조 조성물은 핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 경우, 핵산(특히 RNA)은 결합된 형태(즉, 입자에 결합/부착됨)로 조성물에 포함될 수 있으며, 여기서 결합된 핵산(특히 RNA)은 입자의 외부 표면에 결합된/부착된 핵산 (특히 RNA) (즉, 표면 핵산 (예컨대 표면 RNA)) 및 입자 (즉, 캡슐화된 핵산 (예컨대 캡슐화된 RNA)) 내에 함유된/캡슐화된 핵산 (특히 RNA)로 구성된다.
따라서, 일 구현예에서, 핵산 (특히 RNA) 및 입자를 포함하는 본 개시내용의 샘플 또는 대조 조성물 내에 함유된 캡슐화된 핵산 (특히 캡슐화된 RNA)의 양은 특히 결합된 핵산 (특히 결합된 RNA)의 양으로부터 표면 핵산 (특히 표면 RNA)의 양을 빼서 조성물에 함유된 결합된 핵산 (특히 결합된 RNA)의 양 및 조성물에 함유된 표면 핵산 (특히 표면 RNA)의 양로부터 결정되거나 계산될 수 있다. 둘 다, 조성물에 함유된 결합 및 표면 핵산 (특히 RNA)의 양은 상기에 명시된 바와 같이 결정되거나 계산될 수 있다. 예를 들어, 조성물에 함유된 결합된 핵산 (특히 RNA)의 양은 상기에 명시된 바와 같이 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 총량 및 조성물에 함유된 유리 핵산 (특히 유리 RNA)의 양으로부터 결정되거나 계산될 수 있다 (특히 핵산 (특히 RNA)의 총량으로부터 유리 핵산 (특히 유리 RNA)의 양을 빼서, 둘 모두, 조성물에 함유된 결합된 유리 핵산 (특히 RNA)의 양은 예를 들어, UV 신호, 형광 신호, 및 굴절률 (RI) 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호를 기반으로 하는 보정 곡선을 사용하여, 또는 UV 범위(예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)에서 핵산(특히 RNA)의 소광 계수를 사용하여 상기에 명시된 바와 같이 결정되거나 계산될 수 있다). 또한, 조성물에 함유된 표면 핵산 (특히 RNA)의 양은 예를 들어, 조성물에 첨가된 염료의 발광 신호 (예를 들어, 형광 염료, 예컨대 삽입작용 염료 (예를 들어, GelRED (5,5'-(6,22-디옥소-11,14,17-트리옥사-7,21-디아자헵타코산-1,27-디일)비스(3,8-디아미노-6-페닐페난트리딘-5-이움) 아이오다이드), GelGreen (10,10'-(6,22-디옥소-11,14,17-트리옥사-7,21-디아자헵타코산-1,27-디일)비스(3,6-비스(디메틸아미노)아크리딘-10-이움) 아이오다이드), 베르베린, 에티듐 (예컨대 에티듐 브로마이드), 메틸렌 블루, 또는 프로플라빈, 바람직하게는 GelRED의 형광 신호)로부터 본 명세서에 기재된 바와 같이 결정되거나 계산될 수 있고, 염료 (특히 구체적으로)는 입자의 외부 표면에 결합된/부착된 핵산 (특히 RNA)에 결합한다.
G. 접근 가능한 핵산의 양(예를 들어, 접근 가능한 RNA의 양)
위에 표시된 바와 같이(예를 들어, 도 21 참조), 샘플 또는 대조 조성물은 핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 경우, 접근 가능한 핵산(특히 RNA)은 표면 핵산 (특히 표면 RNA) 및 유리 핵산 (특히 유리 RNA)의 합계이다. 대안적으로, 접근 가능한 핵산(특히 RNA)은 핵산의 총량 (특히 RNA의 총량)으로부터 캡슐화된 핵산 (특히 캡슐화된 RNA)의 양을 빼서 핵산 (특히 RNA) 및 캡슐화된 핵산 (특히 캡슐화된 RNA)의 총량으로부터 결정되거나 계산될 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 핵산 (특히 RNA) 및 입자를 포함하는 본 개시내용의 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 접근 가능한 핵산의 양 (특히 접근 가능한 RNA의 양)은 특히 표면 핵산 (특히 표면 RNA)의 양 및 표면 핵산 (특히 표면 RNA)의 양을 합하여 조성물에 함유된 표면 핵산 (특히 표면 RNA)의 양 및 조성물에 함유된 유리 핵산 (특히 유리 RNA)의 양으로부터 결정되거나 계산될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 핵산 (특히 RNA) 및 입자를 포함하는 본 개시내용의 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 접근 가능한 핵산의 양 (특히 접근 가능한 RNA의 양)은 특히 핵산의 총량 (특히 RNA의 총량)으로부터 캡슐화된 핵산 (특히 캡슐화된 RNA)의 양을 빼서 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA) 및 조성물에 함유된 캡슐화된 핵산 (특히 캡슐화된 RNA)의 총량으로부터 결정되거나 계산될 수 있다. 조성물에 함유된 핵산의 총량 (특히 RNA의 총량), 조성물에 함유된 유리 핵산 (특히 유리 RNA)의 양, 조성물에 함유된 표면 핵산 (특히 표면 RNA)의 양, 및 조성물에 함유된 캡슐화된 핵산 (특히 캡슐화된 RNA)은 각각 B., C., E. 및 F.에 명시된 바와 같이 결정되거나 계산될 수 있다.
H. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포 및 정량적 크기 분포
샘플 또는 대조 조성물은 핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 경우, 입자의 크기 및 상기 입자의 분포는 샘플 또는 대조 조성물 또는 그의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여 수득된 하나 이상의 샘플 또는 대조 분획의 광산란 (LS) 신호로부터 결정되거나 계산될 수 있다. 일 구현예에서, 다중각에서 산란광의 측정 강도가 사용되며, 여기서 각각의 슬라이스는 용리 입자에 의해 산란된 광의 각도 의존성을 설명하는 곡선에 대응한다. 곡선을 적절한 형식(예를 들어, Berry 플롯 또는 Zimm 플롯 또는 Debye 플롯)으로 피팅하고, 0 각도로 외삽함으로써, 회전 반경(Rg) 값 및/또는 유체역학적 반경(RH) 값이 수득될 수 있고, 이로부터 용리된 입자의 크기가 결정되거나 계산될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상이한 입자 크기 표준의 체류 시간에 기초한 외부 보정 및 회귀 분석을 사용하여 용리된 입자의 크기를 결정하거나 계산할 수 있다. 제3 구현예에서, 용리된 입자의 크기는 용리된 종의 체류 시간으로부터 직접 계산(즉, 보정 없이)에 의해 결정된다. 분획 채널의 치수가 알려져 있고 일정한 교차 유동이 있는 경우, 체류 비율은 측정된 공극 시간과 체류 시간의 비율에서 경험적으로 결정할 수 있다. UV 신호, 형광 신호, 및 굴절률 (RI) 신호 (핵산 (특히 RNA)의 양이 본원에 기재된 바와 같이 결정될 수 있는 임의의 신호 및 또한 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 양이 결정될 수 있음)로 이루어진 군으로부터 선택된 신호는 입자 크기 분포 및/또는 정량적 입자 크기 분포의 결정 또는 계산을 위해 사용될 수 있고, 이에 의해 UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호로 이루어진 군으로부터 선택되는 신호는 특정 크기를 갖는 입자의 양으로 직접적으로 해석될 수 있다. 입자 크기 분포 및/또는 정량적 입자 크기 분포는 입자의 수, 입자의 몰량, 또는 크기의 함수로서 각각 입자의 질량으로 주어질 수 있다.
도 11은 샘플 조성물을 AF4-UV-MALS로 처리하여 수득한 프락토그램(도 11a)에 함유된 데이터를 RNA 함유 입자의 크기 분포(도 11c, 실선) 및 정량적 크기 분포 (도 11c, 파선)로 변환하는 것을 도시한다. 회전 반경 (Rg) 값 (도면 11a 및 11b에 흑색 점으로서 나타냄)은 베리 플롯을 사용하여 입자 피크의 MALS 신호로부터 결정되었다 (용리 시간: 26-55분; 도 11a 참조). 실험적으로 결정된 Rg 값은 다항식 함수에 Rg 값을 피팅하고(도 11b 참조, 밝은 회색 선), 다항식 적합도에 기초하여 Rg 값을 재산출하고, 재계산된 Rg 값을 체류 시간의 함수로서 플롯팅함으로써 평활화되었다. UV 신호는 재계산된 Rg 값의 함수로 플롯팅되어 크기 분포 곡선을 생성하였다(도 11c, 실선). UV 신호를 누적 중량 분율로 변환하고 재계산된 Rg 값에 대한 누적 중량 분율을 플롯팅하면 정량적 크기 분포 곡선이 생성된다 (도 11c, 파선). 정량적 크기 분포 곡선으로부터 특성 값(특히 D10, D50 및 D90)을 결정하였다.
따라서, 일 구현예에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기는 LS 신호로부터 회전 반경(Rg) 값을 결정하거나 계산함으로써 LS 신호에 기초하여 결정되거나 계산된다. 바람직하게는, Rg 값은 적어도 하나의 입자 피크에 대해 결정되거나 계산된다. 필드-유동 분획으로 인해 하나 초과의 입자 피크가 발생하는 경우, Rg 값이 각 입자 피크에 대해 별도로 결정되거나 계산되는 것이 바람직하다.
일 실시예에서, 실험적으로 결정되거나 계산된 Rg 값은 예를 들어, 실험적으로 결정되거나 계산된 Rg 값을 다항식 함수(예를 들어, f(t) = a + b1x + b2x2 + b3x3 + b4x4) 또는 선형 함수 (예를 들어, f(t) = a + a1x)에 피팅하고 다항식 또는 선형 적합에 기초하여 Rg 값을 재계산하고, 선택적으로 체류 시간의 함수로서 재계산된 Rg 값을 플롯팅함으로써 평활화된다. 필드-유동 분획화가 하나 초과의 입자 피크를 생성하는 경우, 실험적으로 결정되거나 계산된 Rg 값을 각 입자 피크에 대해 개별적으로 평활화(예를 들어, 상기에서 지정한 대로 재계산)하는 것이 바람직하다.
LS 신호는 임의의 적절한 검출기에 의해 얻어질 수 있고 바람직하게는 동적 광산란(DLS) 및/또는 정적 광산란(SLS), 예를 들어, 다중각 광산란(MALS) 신호이다. 바람직한 MALS 신호는 다중각 레이저 광 산란 (MALLS) 신호이다.
일 구현예에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포는 (선택적으로 재계산된) Rg 값에 대해 UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호(바람직하게는 UV 신호)로 이루어진 군으로부터 선택된 신호를 플롯팅함으로써 결정되거나 계산된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, RNA 함유 입자의 크기 분포는 재계산된 Rg 값에 대해 UV 신호를 플롯팅함으로써 결정되거나 계산된다. 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포는 입자의 수, 입자의 몰량 또는 크기의 함수로서 각각의 입자의 질량으로 주어질 수 있다. 필드-유동 분획화가 하나 이상의 입자 피크를 생성하는 경우, 크기 분포는 각 입자 피크에 대해 별도로 결정되거나 계산되는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호 (바람직하게는 UV 신호)로 이루어진 군으로부터 선택된 신호를 누적 중량 분율로 변환시키고 (선택적으로 재계산된) Rg 값에 대해 누적 중량 분율을 플롯팅함으로써 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 함유 입자로부터 결정되거나 계산된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV 신호를 누적 중량 분율로 변환하고 재계산된 Rg 값에 대한 누적 중량 분율을 플롯팅함으로써 RNA 함유 입자의 크기 분포로부터 결정되거나 계산된다. 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 입자의 수, 입자의 몰량 또는 크기의 함수로서 각각의 입자의 질량으로 주어질 수 있다. 필드-유동 분획화가 하나 이상의 입자 피크를 생성하는 경우, 정량적 크기 분포는 각 입자 피크에 대해 별도로 결정되거나 계산되는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 D10, D50, D90, D95, D99, 및/또는 D100 값(특히 Rg 값에 기초함)을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 D10, D50, 및/또는 D90 값(특히 Rg 값에 기초함)을 포함한다. 필드-유동 분획화가 하나 초과의 입자 피크를 초래하는 경우, D10, D50, D90, D95, D99 및/또는 D100 값(바람직하게는 D10, D50 및/또는 D90 값)(특히 Rg 값에 기초함)은 각 입자 피크에 대해 별도로 결정되거나 계산된다.
도 24는 샘플 조성물을 AF4-UV-MALS로 처리하여 수득한 프락토그램(도 23a)에 포함된 데이터를 상이한 유형의 RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포로 변환하는 것을 예시한다: (a) 누적 중량 분율(도 24b, 실선); (b) 입자 분획당 RNA 질량(
Figure pct00023
t = 1분)(도 24c); 또는 (c) 입자 분획당 RNA 카피 수 또는 입자 수(
Figure pct00024
t = 1분)(도 24d). Berry 플롯을 사용하여 입자 피크의 MALS 신호(용리 시간: 24 내지 55분; 도 24a 참조)로부터 회전 반경(Rg) 값(도 24a에 굵은 선으로 표시)을 결정하였다. 실험적으로 결정된 Rg 값은 다항식 함수에 Rg 값을 피팅하고, 다항식 적합도에 기초하여 Rg 값을 재산출하고, 재계산된 Rg 값을 체류 시간의 함수로서 플롯팅함으로써 평활화되었다. UV 신호를 누적 중량 분율로 변환하고 재계산된 Rg 값에 대한 누적 중량 분율을 플롯팅하면, 도 24b에 실선으로 나타낸 정량적 크기 분포 곡선이 생성된다. 재계산된 Rg 값을 기준으로 입자 피크(Δt = 1분)를 세분화하고(31개의 Rg 분획 생성), 각 Rg 분획에 대한 UV 신호로부터 RNA 질량을 계산하고, 그리고 Rg 분획에 대한 RNA 질량 값을 플롯팅하면, Rg 분획당 RNA 질량을 나타내는 특정 정량적 크기 분포를 생성하고; 도 24c 참조. 또한, RNA 질량 값을 RNA 카피 수로 변환하고 Rg 분획에 대해 후자를 플롯팅하면, Rg 분획당 RNA 카피 수를 보여주는 특정 정량적 크기 분포를 생성하고; 도 24d, 막대 참조. 또한 UV 및 MALS 신호를 입자 수로 변환하고 후자를 Rg 분획에 대해 플롯팅하면, Rg 분획당 입자 수를 보여주는 특정 정량적 크기 분포를 생성하고; 도 24d, 점선 곡선을 참조한다. 위의 계산 및 변환에 대해, 다음 방정식과 정보를 사용할 수 있다.
Figure pct00025
입자의 부피:
Figure pct00026
Figure pct00027
rg의 함수로 단단한 구형체의 부피:
Figure pct00028
Figure pct00029
하나의 카피이 있는 리포플렉스의 부피:
- 사용된 RNA의 길이: 2000개의 뉴클레오티드
- 전체 밀도: 1 g/mL= 1 g /cm3= 10-21 g/nm3
- 뉴클레오티드당 몰 질량(330 Da): 330g/몰
- 몰 질량 RNA리포플렉스/뉴클레오티드(뉴클레오티드 + DOTMA + 1/2 DOPE): 1370 Da
- 몰 질량 RNA리포플렉스/리포플렉스: 1370 x 2000 = 2.74 x 106 Da g/mol
- 부피 RNA리포플렉스/카피: 2.74 x 106 x 1021 / 6 x 1023 = 4.6 x103 nm3
따라서, 일 구현예에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기는 회전 반경(Rg) 값을 결정하거나 계산함으로써 LS 신호에 기초하여 결정되거나 계산되고, Rg 값은 적어도 2개 (예컨대 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10개의) Rg 분획 및/또는 최대 100 (예컨대 최대 90, 최대 80, 최대 70, 최대 60, 최대 50, 최대 40, 최대 30, 또는 최대 20개의) Rg 분획으로 세분되고, 여기서 각각의 Rg 분획은 Rg 범위(이는 임의의 다른 Rg 분획의 Rg 범위와 겹치지 않음)를 갖는다. 바람직하게는, Rg 값 및 Rg 분획은 적어도 하나의 입자 피크에 대해 결정되거나 계산된다. 필드-유동 분획화가 하나 초과의 입자 피크를 생성하는 경우, Rg 값 및 Rg 분획은 각 입자 피크에 대해 별도로 결정되거나 계산되는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 실험적으로 결정되거나 계산된 Rg 값은 예를 들어, 실험적으로 결정되거나 계산된 Rg 값을 다항식 함수(예를 들어, f(t) = a + b1x + b2x2 + b3x3 + b4x4) 또는 선형 함수 (예를 들어, f(t) = a + a1x)에 피팅하고 다항식 또는 선형 적합에 기초하여 Rg 값을 재계산하고, 선택적으로 체류 시간의 함수로서 재계산된 Rg 값을 플롯팅함으로써 Rg 분획으로 세분화되기 전에 평활화된다. 필드-유동 분획화가 하나 초과의 입자 피크를 생성하는 경우, 실험적으로 결정되거나 계산된 Rg 값을 각 입자 피크에 대해 개별적으로 평활화(예를 들어, 상기에서 지정한 대로 재계산)하는 것이 바람직하다.
LS 신호는 임의의 적절한 검출기에 의해 얻어질 수 있고 바람직하게는 동적 광산란(DLS) 및/또는 정적 광산란(SLS), 예를 들어, 다중각 광산란(MALS) 신호이다. 바람직한 MALS 신호는 다중각 레이저 광 산란 (MALLS) 신호이다.
일 구현예에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포는 ((선택적으로 재계산된) Rg 값을 세분하여 수득한) Rg 분획에 대해 UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호(바람직하게는 UV 신호)로 이루어진 군으로부터 선택된 신호를 플롯팅함으로써 결정되거나 계산된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, RNA 함유 입자의 크기 분포는 재계산된 Rg 값을 세분하여 수득한 Rg 분획을 세분함으로써 수득된 Rg 분획에 대해 UV 신호를 플롯팅함으로써 결정되거나 계산된다. 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포는 각각 Rg 분획의 함수로서 핵산 질량(특히 RNA 질량), 핵산 카피 수(특히 RNA 카피 수) 또는 입자 수로 주어질 수 있다. 필드-유동 분획화가 하나 이상의 입자 피크를 생성하는 경우, 크기 분포는 각 입자 피크에 대해 별도로 결정되거나 계산되는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호 (바람직하게는 UV 신호)로 이루어진 군으로부터 선택된 신호를 누적 중량 분율로 변환시키고 ((선택적으로 재계산된) Rg 값을 세분하여 수득한) Rg 분획에 대해 누적 중량 분율을 플롯팅함으로써 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 함유 입자로부터 결정되거나 계산된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV 신호를 누적 중량 분율로 변환하고 (재계산된 Rg 값을 세분하여 수득한) Rg 분획에 대한 누적 중량 분율을 플롯팅함으로써 RNA 함유 입자의 크기 분포로부터 결정되거나 계산된다. 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 Rg 분획당 핵산 질량(특히 RNA 질량), Rg 분획당 핵산 카피 수(특히 RNA 카피 수) 또는 입자 수로 주어질 수 있다. 필드-유동 분획화가 하나 이상의 입자 피크를 생성하는 경우, 정량적 크기 분포는 각 입자 피크에 대해 별도로 결정되거나 계산되는 것이 바람직하다.
위의 변환 접근법(예를 들어, 도 11 및 도 24 참조)은 Rg 값을 사용하여 설명되었다. 그러나 Rh 값을 사용할 때도 동일한 접근법을 사용할 수 있다(도 11 또는 도 24에는 표시되지 않음). 예를 들어, 실험적으로 결정된 Rh 값은 다항식 함수에 Rh 값을 피팅하고, 다항식 적합도에 기초하여 Rh 값을 재산출하고, 재계산된 Rh 값을 체류 시간의 함수로서 플롯팅함으로써 평활화되었다. 선택적으로, Rh 값은 적어도 2개 (예컨대 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10) Rh 분획 및/또는 최대 100 (예컨대 최대 90, 최대 80, 최대 70, 최대 60, 최대 50, 최대 40, 최대 30, 또는 최대 20개의) Rh 분획으로 세분되고, 각각의 Rh 분획은 Rh 범위를 갖는다 (이는 바람직하게는 임의의 다른 Rh 분획의 Rh 범위와 겹치지 않는다). UV 신호는 재계산된 Rh 값(또는 재계산된 Rh 값을 세분화하여 수득한 Rh 분수)의 함수로 플롯팅되어, 크기 분포 곡선(Rh 값 또는 Rh 분획 기반)을 만든다. UV 신호를 누적 중량 분율로 변환하고 재계산된 Rh 값에 대한 누적 중량 분율을 플롯팅하면 정량적 크기 분포 곡선이 생성된다. 정량적 크기 분포 곡선에서 Rh 값을 기준으로 하는 특성 값(특히 D10, D50 및 D90)을 결정할 수 있다. 대안적으로, UV 신호를 누적 중량 분율로 변환하고 Rh 분획에 대한 누적 중량 분율을 플롯팅하면, 대안적인 정량적 크기 분포 곡선이 생성된다. 대안적인 정량적 크기 분포 곡선 특성 파라미터, 특히 Rh 분획당 핵산 질량(특히 RNA 질량)에서 Rh 분획당 핵산 카피 수(특히 RNA 카피 수) 또는 입자 수를 결정할 수 있다.
따라서, 일부 구현예, 특히 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석될 1개 이상의 파라미터가 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포를 포함하는 경우, 방법 및/또는 용도는 필드-유동 분획화로부터 수득된 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 동적 광산란(DLS) 신호를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 유체역학적 반경은 예를 들어 스톡스-아인슈타인 방정식을 사용하여 임의의 통상적인 방식으로 DLS 신호로부터 결정되거나 계산될 수 있다. 바람직하게는, Rh 값은 적어도 하나의 입자 피크에 대해 결정되거나 계산된다. 필드-유동 분획으로 인해 하나 초과의 입자 피크가 발생하는 경우, Rh 값이 각 입자 피크에 대해 별도로 결정되거나 계산되는 것이 바람직하다.
선택적으로, Rh 값은 적어도 2개 (예컨대 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10) Rh 분획 및/또는 최대 100 (예컨대 최대 90, 최대 80, 최대 70, 최대 60, 최대 50, 최대 40, 최대 30, 또는 최대 20개의) Rh 분획으로 세분되고, 각각의 Rh 분획은 Rh 범위를 갖는다 (이는 바람직하게는 임의의 다른 Rh 분획의 Rh 범위와 겹치지 않는다).
일 구현예에서, 실험적으로 결정되거나 계산된 Rh 값은 예를 들어, 실험적으로 결정되거나 계산된 Rh 값을 다항식 함수(예를 들어, f(t) = a + b1x + b2x2 + b3x3 + b4x4) 또는 선형 함수 (예를 들어, f(t) = a + a1x)에 피팅하고 다항식 또는 선형 적합에 기초하여 Rh 값을 재계산하고, 선택적으로 체류 시간의 함수로서 재계산된 Rh 값을 플롯팅함으로써 (바람직하게는 Rh 분획으로 세분화되기 전에) 평활화된다. 필드-유동 분획화가 하나 초과의 입자 피크를 생성하는 경우, 실험적으로 결정되거나 계산된 Rh 값을 각 입자 피크에 대해 별도로 평활화(예를 들어, 상기에서 지정한 대로 재계산)하는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기 분포는(선택적으로 재계산된) Rh 값 (또는 (선택적으로 재계산된) Rh 값을 세분하여 수득한 Rh 분획)에 대해 UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호(바람직하게는 UV 신호)로 이루어진 군으로부터 선택된 신호를 플롯팅함으로써 결정되거나 계산된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, RNA 함유 입자의 크기 분포는 재계산된 Rh 값 (또는 재계산된 Rh 값을 세분하여 수득한 Rh 분획)에 대해 UV 신호를 플롯팅함으로써 결정되거나 계산된다. 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 입자의 수, 입자의 몰량 또는 크기의 함수로서(예를 들어, 재계산된 Rh 값을 세분하여 수득한 Rh 값 또는 Rh 분획의 함수로서) 각각의 입자의 질량으로 주어질 수 있다. 필드-유동 분획화가 하나 이상의 입자 피크를 생성하는 경우, 크기 분포는 각 입자 피크에 대해 별도로 결정되거나 계산되는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호 (바람직하게는 UV 신호)로 이루어진 군으로부터 선택된 신호를 누적 중량 분율로 변환시키고 (선택적으로 재계산된) Rh 값 (또는 (선택적으로 재계산된) Rh 값을 세분하여 수득한 Rh 분획)에 대해 누적 중량 분율을 플롯팅함으로써 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 함유 입자로부터 결정되거나 계산된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV 신호를 누적 중량 분율로 변환하고 재계산된 Rh 값 (또는 재계산된 Rh 값을 세분하여 수득한 Rh 분획)에 대한 누적 중량 분율을 플롯팅함으로써 RNA 함유 입자의 크기 분포로부터 결정되거나 계산된다. 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 입자의 수, 입자의 몰량 또는 크기의 함수로서 각각의 입자의 질량으로 주어질 수 있다. 대안적으로, 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 Rh 분획당 핵산 질량(특히 RNA 질량), Rh 분획당 핵산 카피 수(특히 RNA 카피 수) 또는 입자 수로 주어질 수 있다. 필드-유동 분획화가 하나 이상의 입자 피크를 생성하는 경우, 정량적 크기 분포는 각 입자 피크에 대해 별도로 결정되거나 계산되는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 D10, D50, D90, D95, D99, 및/또는 D100 값(Rh 값에 기초함)을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산(특히 RNA) 함유 입자의 정량적 크기 분포는 D10, D50, 및/또는 D90 값(Rh 값에 기초함)을 포함한다. 필드-유동 분획화가 하나 초과의 입자 피크를 초래하는 경우, D10, D50, D90, D95, D99 및/또는 D100 값(바람직하게는 D10, D50 및/또는 D90 값)(Rh 값에 기초함)은 각 입자 피크에 대해 별도로 결정되거나 계산된다.
일부 구현예에서, 특히 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석될 1개 이상의 파라미터가 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포를 포함하는 경우, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 상기에 기재된 바와 같은 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 값에 기초하고 별도로 상기에 기재된 바와 같은 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rh 값에 기초하여 계산된다 (즉, 이들 구현예는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포에 대한 2개의 데이터 세트를 생성하고, 하나는 Rg 값에 기초하고 하나는 Rh 값에 기초함).
일부 구현예에서, 특히 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석될 1개 이상의 파라미터가 핵산 (특히 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포를 포함하는 경우, Rg 값은 상기에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 Rg 분획으로 세분되고 Rh 값은 상기에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 Rh 분획으로 세분되고, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 상기에 기재된 바와 같은 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 분획에 기초하고 별도로 상기에 기재된 바와 같은 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rh 분획에 기초하여 계산된다 (즉, 이들 구현예는 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포에 대한 2개의 데이터 세트를 생성하고, 하나는 Rg 분획에 기초하고 하나는 Rh 분획에 기초함).
I. 핵산(특히 RNA)의 크기, 크기 분포 및 정량적 크기 분포
핵산 (특히 RNA)이 유리 형태 (즉, 핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 입자에 결합 또는 부착되지 않음) 또는 미제형화된 형태(즉, 리포솜 (특히 양이온성 양친매성 지질(들) 및/또는 양친매성 중합체(들)) 및/또는 바이러스 유사 입자를 구성하는 성분이 결여된 것과 같은, 본원에 명시된 바와 같은 입자가 결여된 조성물)인 경우, 크기, 크기 분포 및/또는 핵산 (특히 RNA)의 정량적 크기 분포 (특히, 핵산 (예컨대 RNA)의 회전 반경 (Rg) 및/또는 핵산 (특히, RNA)의 유체역학적 반경 (Rh)을 기반으로 함)는 또한 결정되거나 분석될 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 특히 샘플 또는 대조 조성물은 유리 또는 미제형화된 형태의 핵산(특히 RNA)을 포함하는 경우, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 분석 또는 결정될 추가 파라미터는 크기, 크기 분포 및/또는 핵산 (특히 RNA)의 정량적 크기 분포 (특히, 이는 핵산 (특히 RNA)의 Rg 및/또는 Rh 값을 핵산 (특히 RNA)의 Rg 및/또는 Rh 분획으로 세분한 후 핵산 (특히 RNA)의 Rg 및/또는 Rh 값 또는 핵산 (특히 RNA)의 Rg 및/또는 Rh 분획에 기초함)를 포함한다. 일반적으로, 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포는 각각 그의 크기의 함수로서 핵산 (특히 RNA) 분자의 수, 핵산 (특히 RNA)의 몰량, 또는 핵산 (특히 RNA)의 질량으로서 주어질 수 있다. 대안적으로, 핵산(특히 RNA)의 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포는 Rg 및/또는 Rh 분획당 핵산 질량(특히 RNA 질량) 또는 Rg 및/또는 Rh 분획당 핵산 카피 수(특히 RNA 카피 수)로 제공될 수 있다.
이러한 파라미터는 핵산(특히 RNA) 함유 입자에 대해 상기에서 지정한 대로 결정하거나 분석할 수 있다.
예를 들어, 일 구현예에서, 핵산(특히 RNA)의 크기는 회전 반경(Rg) 값 및/또는 유체역학적 반경(Rh) 값을 결정하거나 계산함으로써 LS 신호에 기초하여 결정되거나 계산된다. 바람직하게는, Rg (또는 Rh) 값은 적어도 하나의 핵산(특히 RNA) 피크에 대해 결정되거나 계산된다. 필드-유동 분획화가 하나 초과의 핵산(특히 RNA) 피크를 생성하는 경우, Rg (또는 Rh) 값은 각 핵산(특히 RNA) 피크에 대해 별도로 결정되거나 계산되는 것이 바람직하다.
선택적으로, Rg (또는 Rh) 값은 적어도 2개 (예컨대 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10) Rh 분획 및/또는 최대 100 (예컨대 최대 90, 최대 80, 최대 70, 최대 60, 최대 50, 최대 40, 최대 30, 또는 최대 20개의) Rg (또는 Rh) 분획으로 세분되고, 각각의 Rg (또는 Rh) 분획은 Rg (또는 Rh) 범위를 갖는다 (이는 바람직하게는 임의의 다른 Rg (또는 Rh) 분획의 Rg (또는 Rh) 범위와 겹치지 않는다).
일 구현예에서, 실험적으로 결정되거나 계산된 Rg (또는 Rh) 값은 예를 들어, 실험적으로 결정되거나 계산된 Rg (또는 Rh) 값을 다항식 함수(예를 들어, f(t) = a + b1x + b2x2 + b3x3 + b4x4) 또는 선형 함수 (예를 들어, f(t) = a + a1x)에 피팅하고 다항식 또는 선형 적합에 기초하여 Rg (또는 Rh) 값을 재계산하고, 선택적으로 체류 시간의 함수로서 재계산된 Rh 값을 플롯팅함으로써 (바람직하게는 Rg (또는 Rh) 분획으로 세분화되기 전에) 평활화된다. 필드-유동 분획화가 하나 초과의 핵산(특히 RNA) 피크를 생성하는 경우, 실험적으로 결정되거나 계산된 Rg (또는 Rh) 값은 별도로 각각의 핵산 (특히 RNA) 피크에 대해 (예를 들어, 상기에 명시된 바와 같이 재계산된다) 평활화된다.
LS 신호는 임의의 적절한 검출기에 의해 얻어질 수 있고 바람직하게는 동적 광산란(DLS) 및/또는 정적 광산란(SLS), 예를 들어, 다중각 광산란(MALS) 신호이다. 바람직한 MALS 신호는 다중각 레이저 광 산란 (MALLS) 신호이다.
일 구현예에서, 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포는(선택적으로 재계산된) Rg (또는 Rh) 값 (또는 (선택적으로 재계산된) Rg (또는 Rh) 값을 세분하여 수득한 Rg (또는 Rh) 분획)에 대해 UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호(바람직하게는 UV 신호)로 이루어진 군으로부터 선택된 신호를 플롯팅함으로써 결정되거나 계산된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, RNA의 크기 분포는 재계산된 Rg (또는 Rh) 값 (또는 재계산된 Rg (또는 Rh) 값을 세분하여 수득한 Rg (또는 Rh) 분획)에 대해 UV 신호를 플롯팅함으로써 결정되거나 계산된다. 핵산(특히 RNA)의 크기 분포는 각각 크기의 함수로서 핵산 (특히 RNA) 분자의 수, 핵산 (특히 RNA)의 몰량, 또는 입자의 핵산 (특히 RNA)로서 주어질 수 있다. 대안적으로, 핵산(특히 RNA)의 크기 분포는 Rg 및/또는 Rh 분획당 핵산 질량(특히 RNA 질량) 또는 Rg 및/또는 Rh 분획당 핵산 카피 수(특히 RNA 카피 수)로 제공될 수 있다. 필드-유동 분획화가 하나 초과의 핵산(특히 RNA) 피크를 생성하는 경우, 입자 크기는 각 핵산(특히 RNA) 피크에 대해 별도로 결정되거나 계산되는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 핵산(특히 RNA)의 정량적 크기 분포는 UV 신호, 형광 신호, 및 RI 신호 (바람직하게는 UV 신호)로 이루어진 군으로부터 선택된 신호를 누적 중량 분율로 변환시키고 (선택적으로 재계산된) Rg (또는 Rh) 값)을 세분하여 수득된 (선택적으로 재계산된) Rg (또는 Rh) 값 (또는 Rg (또는 Rh) 분획에 대한 누적 중량 분율을 플롯팅함으로써 핵산 (특히 RNA)의 크기 분포로부터 결정되거나 계산된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, RNA의 정량적 크기 분포는 UV 신호를 누적 중량 분율로 변환하고 재계산된 Rg (또는 Rh) 값 (또는 재계산된 Rg (또는 Rh) 값을 세분하여 수득한 Rg (또는 Rh) 분획)에 대한 누적 중량 분율을 플롯팅함으로써 RNA의 크기 분포로부터 결정되거나 계산된다. 핵산(특히 RNA)의 정량적 크기 분포는 각각 크기의 함수로서 핵산 (특히 RNA) 분자의 수, 핵산 (특히 RNA)의 몰량, 또는 입자의 핵산 (특히 RNA)로서 주어질 수 있다. 대안적으로, 핵산(특히 RNA)의 정량적 크기 분포는 Rg 및/또는 Rh 분획당 핵산 질량(특히 RNA 질량) 또는 Rg 및/또는 Rh 분획당 핵산 카피 수(특히 RNA 카피 수)로 제공될 수 있다. 필드-유동 분획화가 하나 초과의 핵산(특히 RNA) 피크를 생성하는 경우, 정량적 입자 크기는 각 핵산(특히 RNA) 피크에 대해 별도로 결정되거나 계산되는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 핵산(특히 RNA)의 정량적 크기 분포는 D10, D50, D90, D95, D99, 및/또는 D100 값(Rg 또는 Rh 값에 기초함)을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산(특히 RNA)의 정량적 크기 분포는 D10, D50, 및/또는 D90 값(Rg 또는 Rh 값에 기초함)을 포함한다. 필드-유동 분획화가 하나 초과의 핵산 (특히 RNA) 피크를 초래하는 경우, D10, D50, D90, D95, D99 및/또는 D100 값(바람직하게는 D10, D50 및/또는 D90 값)(Rg 또는 Rh 값에 기초함)은 별도로 각각의 핵산 (특히 RNA) 피크에 대해 결정되거나 계산된다.
일부 구현예에서, 특히 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석될 1개 이상의 파라미터가 핵산 (특히 RNA)의 크기, 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포를 포함하는 경우, 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 상기에 기재된 바와 같은 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 Rg 값에 기초하고 별도로 상기에 기재된 바와 같은 핵산 (예컨대 RNA)의 Rh 값에 기초하여 계산된다 (즉, 이들 구현예는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포에 대한 2개의 데이터 세트를 생성하고, 하나는 Rg 값에 기초하고 하나는 Rh 값에 기초함).
일부 구현예에서, 특히 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석될 1개 이상의 파라미터가 핵산 (특히 RNA)의 크기, 크기 분포 및/또는 정량적 크기 분포를 포함하는 경우, Rg 값은 상기에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 Rg 분획으로 세분되고 Rh 값은 상기에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 Rh 분획으로 세분되고, 핵산 (예컨대 RNA) 함유 입자의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포는 상기에 기재된 바와 같은 핵산 (예컨대 RNA)의 Rg 분획에 기초하고 별도로 상기에 기재된 바와 같은 핵산 (예컨대 RNA)의 Rh 분획에 기초하여 계산된다 (즉, 이들 구현예는 핵산 (예컨대 RNA)의 크기, 크기 분포, 및/또는 정량적 크기 분포에 대한 2개의 데이터 세트를 생성하고, 하나는 Rg 분획에 기초하고 하나는 Rh 분획에 기초함).
J. 형상 계수/형태 계수
핵산(특히 RNA) 함유 입자의 일부 적용, 예를 들어 치료 또는 예방 적용의 경우, 입자는 특정 모양(예를 들어, 구형체 유사 형상)이어야 한다. 입자의 모양에 대한 정보를 제공하는 파라미터는 형상 계수 및 형태 계수이다(예를 들어, 도 13 참조).
따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석될 1개 이상의 파라미터는 형상 계수 및/또는 형태 계수를 포함한다. 형상 및 형태 계수는 Rg 값(예를 들어, 재계산된 Rg 값) 및 유체역학적 반경(Rh) 값에 기초하여 결정되거나 계산될 수 있으며, 바람직하게는 상기 섹션 H. 내지 J. 중 어느 하나에서 결정되거나 계산된다. 예를 들어, 형상 계수는 상기에서 결정되거나 계산된 유체역학적 반경(Rh) 값에 대해 상기에서 결정되거나 계산된 Rg 값(예를 들어, 재계산된 Rg 값)을 플롯팅하고 이 플롯의 데이터 포인트를 함수(예를 들어, 선형 함수)에 피팅함으로써 결정되거나 계산될 수 있다. 예를 들어, 선형 회귀에 대한 약 0.774(예를 들어, 0.74)의 구배는 분석된 입자의 구형체 형상화 형태를 나타낸다. 선형 회귀에 대한 약 0.816의 구배는 분석 입자의 코일 형상화 형태를 나타내고 선형 회귀에 대한 약 1.732의 구배는 분석 입자의 막대 모양 형태를 나타낸다. 예를 들어, 문헌[W. Burchard(1990) "Laser Light Scattering in Biochemistry"]를 참조한다. 유사하게, 형태 계수는 상기에서 결정되거나 계산된 Rg 값(재계산된 Rg 값과 같은)에 대해 상기에서 결정되거나 계산된 유체역학적 반경(Rh) 값을 플롯팅하고 이 플롯의 데이터 포인트를 함수(예를 들어, 선형 함수)로 피팅함으로써 결정되거나 계산될 수 있다.
K. 핵산(특히 RNA) 캡슐화 효율
핵산(특히 RNA) 함유 입자의 일부 적용, 예를 들어 치료 또는 예방 적용의 경우, 핵산(특히 RNA)이 입자로 캡슐화되는 방법을 아는 것이 필요하다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석될 1개 이상의 파라미터는 핵산 (특히 RNA) 캡슐화 효율을 포함한다. 핵산(특히 RNA) 캡슐화 효율은 (i) 핵산 및 입자를 포함하는 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 캡슐화된 핵산 (특히 RNA)의 양 및 (ii) 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 총량에 기초하여 결정되거나 계산될 수 있고, 핵산 (특히 RNA)의 총량 및 캡슐화된 핵산 (특히 RNA)의 양은 바람직하게는 섹션 B. 및 F.에 명시된 바와 같이 결정되거나 계산된다. 일 구현예에서, 핵산(특히 RNA) 캡슐화 효율은 캡슐화된 핵산(특히 RNA)의 양을 핵산(특히 RNA)의 총량으로 나눔으로써 결정되거나 계산된다.
L. 핵산(특히 RNA)의 분자량
핵산(특히 RNA)의 분자량은 LS 데이터에서 결정하거나 계산할 수 있으며 이론상 계산된 분자량과 비교될 수 있다. 핵산(특히 RNA)의 이론적 분자량은 핵산에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착된 핵산 (특히 RNA) 서열 및 선택적 추가의 물질 (예를 들어, 하나 이상의 염료, 캡 구조, 등)에 기초하여 결정되거나 계산될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석될 1개 이상의 파라미터는 핵산(특히 RNA)의 분자량을 포함한다. 이들 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도는 수득된 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 LS 신호를 측정하는 단계를 포함하고, 핵산 (특히 RNA)의 분자량은 LS 신호에 기초하여 결정되거나 계산될 수 있다. 선택적으로, LS 신호에 기초하여 결정되거나 계산된 핵산(특히 RNA)의 분자량은 핵산(특히 RNA)의 이론 분자량과 비교되며, 여기서 핵산(특히 RNA)의 이론 분자량은 본 명세서에 기재된 바와 같이 결정되거나 계산되거나 또는 숙련가에게 공지되어 있다(예를 들어, 이는 핵산 (특히 RNA) 서열 및 핵산(특히 RNA)에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착된 선택적 추가의 물질 (예를 들어, 하나 이상의 염료, 캡 구조, 등)을 기초로 계산되거나 결정됨).
M. 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양 대 입자 형성 화합물의 총량의 비율
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석될 1개 이상의 파라미터는 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양 대 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 총량의 비율을 포함하고, 상기 비는 입자 크기의 함수로서 주어질 수 있다.
핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 본 개시내용의 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 결합된 핵산(특히 RNA)의 양은 예를 들어, 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 총량 및 조성물에 함유된 유리 핵산 (특히 유리 RNA)의 양으로부터, 특히 핵산 (특히 RNA)의 총량에서 유리 핵산 (특히 유리 RNA)의 양을 빼서 상기에 기재된 바와 같이 결정되거나 계산될 수 있다. 둘 다, 조성물에 함유된 결합 및 유리 핵산(특히 RNA)의 양은 예를 들어, UV 신호, 형광 신호, 및 굴절률 (RI) 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호를 기반으로 하는 보정 곡선을 사용하여, 또는 UV 범위(예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)에서 핵산(특히 RNA)의 소광 계수를 사용하여 상기에 명시된 바와 같이 결정되거나 계산될 수 있다. 입자 내의 입자 형성 화합물(특히 지질 및/또는 중합체)의 총량은 입자를 제조하는 데 사용된 입자 형성 화합물(특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로부터 결정되거나 계산될 수 있다. 대안적으로, 입자 내의 입자 형성 화합물(특히 지질 및/또는 중합체)의 양은 당업자에게 공지된 방법 및/또는 기술, 예를 들어 HPLC에 기초한 방법 및/또는 기술에 의해 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Roces 등, Pharmaceutics. 8, 29 (2016)]를 참조한다). 입자에 결합된 핵산(예를 들어, RNA)의 양 대 입자 내의 입자 형성 화합물(특히 지질 및/또는 중합체)의 총량의 비율은 결정되거나 계산된 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양을 입자 내의 결정되거나 계산된 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 총량으로 나누어서 결정되거나 계산될 수 있다.
입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양 대 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 총량의 비율이 입자 크기의 함수로서 주어지는 상기 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도는 바람직하게는 샘플 또는 대조 조성물 또는 그의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여 수득된 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 LS 신호를 측정하는 단계를 포함한다. LS 신호에 기초하여, Rg 값 및/또는 Rh 값이 얻어질 수 있으며(바람직하게는 상기에 기재된), 이로부터 용리된 입자의 크기가 (상기에 기재된 바와 같이) 결정되거나 계산될 수 있다.
N. 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양의 비율
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석될 1개 이상의 파라미터는 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양의 비율을 포함하고, 상기 비율은 입자 크기의 함수로서 주어질 수 있다.
입자에서 입자 형성 화합물(특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 부분의 양은 입자를 만들기 위해 사용되는 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로부터 그리고 상기 입자 형성 화합물의 화학 조성물로부터 (예를 들어, 입자 형성 화합물에 함유된 양으로 하전된 모이어티의 수로부터) 결정되거나 계산될 수 있다. 대안적으로, 입자 내의 입자 형성 화합물(특히 지질 및/또는 중합체)의 양은 당업자에게 공지된 방법 및/또는 기술, 예를 들어 HPLC에 기초한 방법 및/또는 기술에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Roces 등, Pharmaceutics. 8, 29 (2016)]을 참조한다). 핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 본 개시내용의 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 결합된 핵산(특히 RNA)의 양은 예를 들어, 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 총량 및 조성물에 함유된 유리 핵산 (특히 유리 RNA)의 양으로부터, 특히 핵산 (특히 RNA)의 총량에서 유리 핵산 (특히 유리 RNA)의 양을 빼서 상기에 기재된 바와 같이 결정되거나 계산될 수 있다. 둘 다, 조성물에 함유된 결합 및 유리 핵산(특히 RNA)의 양은 예를 들어, UV 신호, 형광 신호, 및 굴절률 (RI) 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호를 기반으로 하는 보정 곡선을 사용하여, 또는 UV 범위(예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)에서 핵산(특히 RNA)의 소광 계수를 사용하여 상기에 명시된 바와 같이 결정되거나 계산될 수 있다. 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양의 비율은 결정된 또는 계산된 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양으로 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양을 나누어서 결정되거나 계산될 수 있다.
입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양의 비율이 입자 크기의 함수로서 주어지는 상기 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도는 바람직하게는 샘플 또는 대조 조성물 또는 그의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여 수득된 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 LS 신호를 측정하는 단계를 포함한다. LS 신호에 기초하여, Rg 값 및/또는 Rh 값이 얻어질 수 있으며(바람직하게는 상기에 기재된), 이로부터 용리된 입자의 크기가 (상기에 기재된 바와 같이) 결정되거나 계산될 수 있다.
O. 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 음으로 하전된 모이어티의 양의 전하 비율
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 결정되거나 분석될 1개 이상의 파라미터는 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 음으로 하전된 모이어티의 양의 전하 비율을 포함한다. 상기 전하 비율은 일반적으로 N/P 비율로 표시되며 입자 크기의 함수로 주어질 수 있다.
입자에서 입자 형성 화합물(특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 부분의 양은 입자를 만들기 위해 사용되는 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로부터 그리고 상기 입자 형성 화합물의 화학 조성물로부터 (예를 들어, 입자 형성 화합물에 함유된 양으로 하전된 모이어티의 수로부터) 결정되거나 계산될 수 있다. 대안적으로, 입자 내의 입자 형성 화합물(특히 지질 및/또는 중합체)의 양은 당업자에게 공지된 방법 및/또는 기술, 예를 들어 HPLC에 기초한 방법 및/또는 기술에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Roces 등, Pharmaceutics. 8, 29 (2016)]을 참조한다). 입자에 결합된 핵산(예를 들어, RNA)의 음으로 하전된 부분의 양은 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 양으로부터 그리고 상기 핵산 (예컨대 RNA)의 화학 조성, 예를 들어 핵산에 함유된 음으로 하전된 모이어티 (예를 들어, 포스페이트 기)의 수로부터 결정되거나 계산될 수 있다. 핵산(특히 RNA) 및 입자를 포함하는 본 개시내용의 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 결합된 핵산(특히 RNA)의 양은 예를 들어, 조성물에 함유된 핵산 (특히 RNA)의 총량 및 조성물에 함유된 유리 핵산 (특히 유리 RNA)의 양으로부터, 특히 핵산 (특히 RNA)의 총량에서 유리 핵산 (특히 유리 RNA)의 양을 빼서 상기에 기재된 바와 같이 결정되거나 계산될 수 있다. 둘 다, 조성물에 함유된 결합 및 유리 핵산(특히 RNA)의 양은 예를 들어, UV 신호, 형광 신호, 및 굴절률 (RI) 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 신호를 기반으로 하는 보정 곡선을 사용하여, 또는 UV 범위(예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)에서 핵산(특히 RNA)의 소광 계수를 사용하여 상기에 명시된 바와 같이 결정되거나 계산될 수 있다. 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양 대 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 음으로 하전된 모이어티의 양의 전하 비율은 결정된 또는 계산된 입자에 결합된 핵산 (예컨대 RNA)의 음으로 하전된 모이어티의 양으로 입자 중의 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 모이어티의 양을 나누어서 결정되거나 계산될 수 있다.
결합된 핵산(예를 들어, RNA)의 음으로 하전된 부분의 양에 대한 입자 내 입자 형성 화합물(특히 지질 및/또는 중합체)의 양으로 하전된 부분의 양의 전하 비율이 입자가 입자 크기의 함수로서 주어지는 경우, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도는 바람직하게는 샘플 또는 대조 조성물 또는 그의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여 수득된 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 LS 신호를 측정하는 단계를 포함한다. LS 신호에 기초하여, Rg 값 및/또는 Rh 값이 얻어질 수 있으며(바람직하게는 상기에 기재된), 이로부터 용리된 입자의 크기가 (상기에 기재된 바와 같이) 결정되거나 계산될 수 있다.
필드-유동 분획화
필드-유동 분획화는 수직 역장이 가해지는 매우 얇은 유동를 사용하고 고해상도 분리를 달성하는 크로마토그래피 기술이다. 필드-유동 분획화의 예는 비대칭 유동 필드-유동 분획화(AF4) 및 중공 섬유 유동 필드-유동 분획화(HF5), 예를 들어 Wyatt에 의해 판매되는 EclipseTM 시스템(DualtecTM 또는 AF4TM)을 포함하고 예를 들어 WO 2018/165627에 기재되어 있고, 그 전체 개시내용이 참조로서 본원에 포함된다. 따라서, 일 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 이용되는 필드-유동 분획화는 유동 필드-필드 분획화, 예컨대 비대칭 유동 필드-필드 분획화 (AF4) 또는 중공 섬유 유동 필드-필드 분획화 (HF5)이다.
일반적으로 (AF4 시스템과 같은) 비대칭 유동 필드-유동 분획화 시스템은 스페이서 호일(일반적으로 두께가 100 내지 500 μm임)로 분리된 2개의 플레이트로 구성되고 안에는 흐름과 분리가 일어나는 채널을 포함한다. 상부 플레이트는 불투과성인 반면, 최하부 플레이트는 투과성이다(예를 들어, 다공성 프릿 재료로 만들어짐). 또한, 최하부 플레이트는 핵산(특히 RNA) 및 더 큰 피분석물(예를 들어, 본 명세서에 개시된 입자)이 멤브레인을 투과하는 것을 방지하는 데 적합한 분자량(MW) 컷-오프를 갖는 멤브레인으로 덮여 있다. 일 구현예에서, 멤브레인은 2 kDa 내지 30 kDa 범위의 MW 컷-오프, 예를 들어, 3 kDa 내지 25 kDa (예컨대 4 kDa 내지 20 kDa, 5 kDa 내지 15 kDa 또는 5 kDa 내지 12 kDa)의 범위의 MW 컷-오프, 예컨대 10 kDa의 MW 컷-오프를 갖는다. 상기 목적에 적합한 임의의 멤브레인이 이용될 수 있다. 일 구현예에서, 멤브레인은 폴리에테르설폰 (PES) 멤브레인, 재생 셀룰로스 멤브레인, 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 멤브레인 (예를 들어, 상기 명시된 바와 같은 MW 컷-오프를 갖는 공지된 한외여과 멤브레인 중 임의의 하나)이다.
일반적으로 비대칭 유동 필드-유동 분획화 시스템(AF4 시스템과 유사)은 채널의 일 단부에서의 유입구 포트, 채널의 다른 단부에서의 유출구 포트, 및 유입구 포트와 유출구 포트 사이에, 바람직하게는 유입구 포트에 더 가깝게 위치되는 주입 포트를 포함한다.
유동 채널 내에서, 핵상의 층류로 인해 포물선 유동 프로파일이 생성된다: 핵상은 채널 유동의 중심에서보다 경계 에지에 더 가깝게 더 느리게 이동한다. 수직 역장이 층류에 적용되는 경우, 액체의 성분 (분리될 피분석물, 특히 핵산 (특히 RNA) 및, 존재하는 경우, 입자 포함)은 채널의 경계 층, 바람직하게는 멤브레인 측면을 향해 유도된다. 반작용 운동은 브라운 운동과 관련된 확산에 의해 생성된다. 따라서 더 높은 확산 속도를 가진 더 작은 피분석물은 세로 방향 흐름이 더 빠른 채널에서 더 높은 평형 위치에 도달하는 경향이 있다. 따라서 채널 내의 속도 구배 흐름은 상이한 크기의 피분석물을 분리할 수 있다. 더 작은 피분석물은 더 큰 입자보다 채널을 따라 더 빠르게 수송되기 때문에, 예를 들어 큰 피분석물이 먼저 용리되는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 직교하는 더 작은 피분석물은 더 큰 피분석물보다 먼저 용리된다.
(AF4 시스템과 같은) 비대칭 유동 필드-유동 분획화 시스템에 대해 상기 기재된 원리는 HF5 시스템에도 적용되지만, 단 HF5 시스템은 상부 플레이트를 함유하지 않고, 오히려 하부 플레이트 뿐만 아니라 멤브레인이 튜브로 롤링되었다. 이 구성은 매우 작은 채널 볼륨을 사용할 수 있으므로 감도가 높고 실시 시간이 매우 빠르다.
필드-유동 분획화는 고정상과 분리되는 피분석물의 상호작용에 의존하지 않고 상기 고정상으로 채워진 해당 컬럼이 필요하지 않기 때문에, 채널을 통해 액상을 이동시키기 위해 고압이 필요하지 않으며, 따라서 특히 높은 전단력을 방지한다. 실제로 필드-유동 분획화는 부드럽고 빠르며 비파괴적이다.
일반적으로 필드-유동 분획화는 주입 및 용리/분획의 두 단계를 포함한다. 선택적으로, 주입 단계 후 및 용리/분획화 단계 전에, 필드-유동 분획화는 포커싱(focusing) 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 필드-유동 분획화가 포커싱 단계를 포함하는 경우, 처음 두 단계 동안, 핵상이 분할되어, 양쪽 말단 (유입구 포트 및 유출구 포트)으로부터 채널로 들어가고, 바람직하게는 주입 포트 아래에서 만나도록 균형을 이룬다 (예를 들어, 유입구 및 유출구 포트를 통한 유동 (즉, 주입 포트를 통해 주입된 분석물이 입구 포트 또는 출구 포트를 향해 완두되지 않지만 (바람직하게는 용리되지 않지만) 포커싱되는 방식으로 서로 적합화됨). 이 처음 두 단계 동안 액상은 멤브레인을 통해서만 투과된다. 샘플 또는 대조 조성물 또는 이의 적어도 일부가 주입될 때(바람직하게는 주입 포트를 통해), 상기 샘플 또는 대조 조성물 또는 이의 적어도 일부에 포함된 피분석물은 선택적으로 밴드(가능한 한 얇은 것이 바람직함)에 포커싱되고, 바람직하게는 멤브레인 쪽으로 포커싱된다. 샘플 주입이 완료되면 주입 흐름이 중지된다. 선택적으로, 포커싱은 특정 기간 동안(예를 들어, 약 1분과 같이 약 0.5 내지 약 2분 동안) 계속된다. 그런 다음 흐름은 용리/분획화 모드로 전환되며, 액상은 유입구 포트에서만 들어가고 하나 이상의 검출기 (예를 들어, UV 검출기 (예를 들어, 모니터 바람직하게는 동시에 UV 및 CD 신호를 모니터링할 수 있는 UV 검출기), 형광 검출기, 굴절률 검출기, 하나 이상의 LS 검출기 (예컨대 MALS 검출기 및/또는 DLS 검출기), 및/또는 점도계)에 연결된 유출구 포트에서 나간다. 피분석물은 크기(또는 유체역학적 이동성)에 따라 분리되고 하나 이상의 검출기(예를 들어, 다양한 검출기 어레이)에 의해 검출 및/또는 모니터링된다. 이러한 검출 및/또는 모니터링은 바람직하게는 온라인으로, 즉 즉시 수행되며, 이는 필드-유동 분획화로부터 수득된 분획을 보관할 필요가 없도록 한다. 그러나, 일 구현예에서, 적어도 하나의 분획의 오프라인 분석을 허용하기 위해 온라인 검출 및/또는 모니터링이 완료된 후에 적어도 하나의 분획이 수집된다. 일 구현예에서, 1개 이상의 파라미터의 계산 또는 결정은 온라인으로 수행된다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 명세서에 사용된 "샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용"이라는 표현은 바람직하게는 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화 장치에 주입하는 단계; 선택적으로 필드-유동 분획 장치 내에서 샘플 조성물의 적어도 일부에 함유된 성분(특히 핵산(특히 RNA) 및 존재하는 경우, 입자)을 포커싱하는 단계; 및 성분(특히 핵산(특히 RNA) 및 존재하는 경우, 입자)을 크기 또는 유체역학적 이동성에 따라 분획화하는 단계를 포함한다. 유사하게, 일부 구현예에서, 본 명세서에 사용된 "대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용"이라는 표현은 바람직하게는 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화 장치에 주입하는 단계; 선택적으로 필드-유동 분획 장치 내에서 대조 조성물의 적어도 일부에 함유된 성분(특히 핵산(특히 RNA) 및 존재하는 경우, 입자)을 포커싱하는 단계; 및 성분(특히 핵산(특히 RNA) 및 존재하는 경우, 입자)을 크기 또는 유체역학적 이동성에 따라 분획화하는 단계를 포함한다. 필드-유동 분획화를 거치는 조성물(샘플 조성물, 대조 조성물, 둘 중 적어도 일부 등)의 유형에 관계없이, 분획화 단계는 적어도 하나의 분획을 생성하지만 또한 적어도 2개 (예컨대 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10) 분획 및/또는 최대 100 (예컨대 최대 90, 최대 80, 최대 70, 최대 60, 최대 50, 최대 40, 최대 30, 또는 최대 20개의) 분획을 생성할 수 있다. 각각의 분획은 (1) 약 10 내지 약 400 nm 또는 20 내지 300 nm) 범위의 직경을 갖는 특정 크기 (예컨대 핵산 (특히 RNA)의 핵산 (특히 RNA) 또는 특정 유형의 핵산 (특히 RNA) (예를 들어, 유리 핵산 (특히 유리 RNA) 또는 결합된 핵산 (특히 결합 RNA) 또는 (2) 약 200 내지 1200 nm) 범위의 직경을 갖는 특정 크기의 핵산 (특히 RNA) 함유 입자 (예컨대 핵산 (특히 RNA) 함유 입자 또는 특정 유형의 핵산 (특히 RNA) 함유 입자 (예를 들어, 리포플렉스 입자를 함유하는 핵산 (특히 RNA) 또는 바이러스 유사 입자를 함유하는 핵산 (특히 RNA))를 나타낼 수 있다.
일반적으로, (비대칭 유동 필드-유동 분획화 시스템 (예컨대 AF4 시스템) 또는 중공 섬유 시스템 (예컨대 HF5 시스템)을 갖는 것과 같은) 필드-유동 분획화에 사용되는 교차 유량은 최대 약 10 mL/분일 수 있다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 이용되는 필드-유동 분획화는 최대 8 mL/분, 바람직하게는 최대 4 mL/분, 더 바람직하게는 최대 2 mL/분의 교차 유량으르 사용하여 수행된다. 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에서 이용되는 필드-유동 분획화는 교차 유동 프로파일을 사용하여 수행되며, 즉, 교차 유량은 필드-유동 분획화의 모든 단계(주입, 임의로 포커싱 및 용리/분별) 동안 일정하지 않지만, 상마다 상이하다. 예를 들어, 주입 단계 동안 및 존재하는 경우, 포커싱 단계 동안, 교차 유동은 일정하고 바람직하게는 핵산(특히 RNA) 및 존재하는 경우, 본 명세서에 개시된 입자가 용리되지 않는다. 이러한 목적에 적합한 교차 유량은 본 개시내용의 교시에 기초하여 결정될 수 있다.
제3 양태의 일 구현예에서, 교차 유량 프로파일은 바람직하게는 대조군 또는 샘플 조성물에 함유된 성분이 하나 이상의 샘플 분획을 생성하기 위해 크기 별로 분획/분리되도록 하는 분획화 단계를 포함한다. 바람직하게는, 교차 유량은 이러한 분획화 단계 동안 변화하고 (예를 들어, 하나의 값 (예컨대 약 1 내지 약 4 mL/분)으로부터 시작하고, 이어서 더 낮은 값(예컨대 약 0 내지 약 0.1 mL/min)으로 감소하거나, 또는 하나의 값(예를 들어 약 O 내지 약 O.1 mL/ 분)으로부터 시작하여 더 높은 값(예, 약 1 또는 약 4 mL/분으로 증가함); 여기서 변화는 임의의 수단, 예를 들어 연속 (예컨대 선형 또는 지수) 변화 또는 단계적 변화에 의해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 교차 유량 프로파일은 분획화 단계를 포함하며, 여기서 교차 유량은 하나의 값(예를 들어, 약 1 내지 약 4 mL/분)으로부터 시작하여 연속적으로(바람직하게는 기하급수적으로) 변화하고, 이어서 더 낮은 값 (예컨대 약 0 내지 약 0.1 mL/분)으로 감소한다. 분획화 단계는 예를 들어, 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 30분 동안 샘플 조성물에 함유된 성분을 그의 크기로 분획/분리하기에 적합한 임의의 길이를 가질 수 있다. 교차 유량 프로파일은 분획화 단계 전 및/또는 후에 있을 수 있고(예를 들어, 분획화 단계 전에 1개 및 분획화 단계 후에 1개, 2개, 또는 3개), 샘플 조성물에 함유된 비-핵산(특히 비-RNA) 성분(예를 들면, 단백질, 폴리펩타이드, 모노뉴클레오타이드 등)을 샘플 조성물 중에 함유된 핵산(특히 RNA)으로부터 분리하고, 샘플 조성물에 포함된 핵산(특별히 RNA)에 초점을 맞추고/거나 필드-유동 분획화 디바이스를 재생하도록(예컨대, 디바이스의 멤브레인에 결합된 모든 성분을 제거하기 위해) 작용할 수 있는 추가의 단계(예를 들면, 1개 또는 2개)을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 이들 추가 단계의 교차 유량은 각각의 추가 단계에 대해 일정하고, 각각의 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분 (예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 30분)의 범위에서 추가 단계에 대해 서로 독립적이다. 예를 들어, 교차 유량 프로파일은 (i) 분획화 단계 이전에 있는 제1 추가 단계로서, 상기 제1 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 시작되는 동일한 교차 낮은 비율인 단계(제1 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 10분 또는 약 20분 또는 약 30분의 범위일 수 있음); (ii) 분획화 단계 이후의 제2 추가 단계로서, 상기 제2 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 끝나는 동일한 교차 낮은 속도인 단계(제2 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 10분 또는 약 20분 또는 약 30분의 범위일 수 있음); 및 선택적으로 (iii) 제2 추가 단계 이후의 제3 추가 단계로서, 상기 제3 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 제2 추가 단계의 교차 유량과 다른 단계(제3 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 10분 또는 약 20분 또는 약 30분의 범위일 수 있음)을 포함할 수 있다. 교차 유량 프로파일이 분획화 단계를 포함하는 구현예에서, 교차 유량은 하나의 값(예를 들어, 약 1 내지 약 4 mL/분)으로부터 시작하여 연속적으로(바람직하게는 기하급수적으로) 변화하고, 이어서 더 낮은 값 (예컨대 약 0 내지 약 0.1 mL/분)으로 감소하고, 바람직하게는 교차 유량 프로파일은 (i) 분획화 단계 이전에 있는 제1 추가 단계로서, 상기 제1 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 시작되는 동일한 교차 낮은 속도(예컨대 약 1 내지 약 4 mL/분)인 단계(제1 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 30분, 예컨대 약 6분 내지 약 25분, 약 7분 내지 약 20분, 또는 약 8분 내지 약 15분, 또는 약 10분 내지 약 12분, 또는 약 5분 또는 약 10분 또는 약 12분의 범위일 수 있음); (ii) 분획화 단계 이후의 제2 추가 단계로서, 상기 제2 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 분획화 단계가 끝나는 동일한 교차 낮은 속도(예컨대 약 0.01 내지 0.1 mL/분)인 단계(제2 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 60분, 예컨대 약 10분 내지 약 50분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 30분의 범위일 수 있음); 및 선택적으로 (iii) 제2 추가 단계 이후의 제3 추가 단계로서, 상기 제3 추가 단계의 교차 유량은 일정하고 제2 추가 단계(예를 들어, 제3 추가 단계의 교차 유량은 0임)의 교차 유량과 다른 단계(제3 추가 단계의 길이는 약 5분 내지 약 30분, 예컨대 약 6분 내지 약 25분, 약 7분 내지 약 20분, 또는 약 8분 내지 약 15분, 또는 약 10분 내지 약 12분, 또는 약 5분 또는 약 10분 또는 약 12분의 범위일 수 있음)을 포함할 수 있다. 이러한 교차 유량 프로파일의 바람직한 예는 다음과 같다: 10분 동안 1.0 내지 2.0 mL/분, 30분 이내에 1.0 내지 2.0 mL/분에서 0.01 내지 0.07 mL/분의 지수 구배; 30분 동안 0.01 내지 0.07 mL/분; 및 10분 동안 0 mL/분.
따라서, 일 구현예에서, 주입 단계 및 존재하는 경우, 포커싱 단계 동안의 교차 유량은 일정하고 일정 기간 (예를 들어, 5 내지 15분)에 걸쳐 적어도 약 1.0의 범위 (예컨대 약 1.3 내지 약 3.0 mL/분, 약 1.5 내지 약 2.5 mL/분, 또는 약 1.8 내지 약 2.0 mL/분)이다. 또한, 일 구현예에서, 용리/분획화 단계 동안의 교차 유동은 일정 기간(예를 들어, 20 내지 40분)에 걸쳐 매우 낮은 속도(예를 들어, 0.01 내지 0.07 mL/분)로 점진적으로 감소한다. 선택적으로, 교차 유동가 매우 낮은 속도에 도달한 후, 이 속도는 일정 기간(예를 들어, 20 내지 40분, 예를 들어 교차 낮은 속도를 매우 낮은 속도로 감소시키는 데 사용되는 동일한 기간)에 걸쳐 유지되고/거나 교차 유동은 일정 기간(예를 들어, 5 내지 20분) 동안 0 mL/분으로 설정된다. 주입, 포커싱 및 용리/분획화 단계의 전체 주기에 대한 예시적인 교차 유동 프로파일은 다음과 같다: 10분 동안 1.0 내지 2.0 mL/분, 30분 이내에 1.0 내지 2.0 mL/분에서 0.01 내지 0.07 mL/분의 지수 구배; 30분 동안 0.01 내지 0.07 mL/분; 및 10분 동안 0 mL/분. 본 개시내용 사용된 교차 유동 프로파일의 특정 예가 도 1에 도시되어 있다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 이용되는 필드-유동 분획화는 0.05 내지 0.35 mL/분, 바람직하게는 0.10 내지 0.30 mL/분의 범위, 더 바람직하게는 0.15 내지 0.25 mL/분의 범위의 주입 유량을 사용하여 수행된다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 이용되는 필드-유동 분획화는 0.30 내지 0.70 mL/분 범위, 바람직하게는 0.40 내지 0.60 mL/분 범위, 더 바람직하게는 0.45 내지 0.55 mL/분 범위의 검출기 유량을 사용하여 수행된다. 일 구현예에서, 검출기 유량은 필드-유동 분획화의 모든 단계(주입, 포커싱 및 용리/분획) 동안 일정하다.
주입 흐름을 위한 필드-유동 분획화에 사용되는 액상은 필드-유동 분획화 시스템과 호환되고 핵산(특히 RNA)을 용해하기에 적합한 임의의 액체일 수 있다. 바람직한 액체는 수성 액체, 예를 들어, 물로 주로 구성된 액체 (즉, 액체의 수분 함량은 50% (v/v) 또는 (w/w) 초과 (예컨대 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 또는 95% (v/v) 또는 (w/w) 초과임)이다. 액상은 완충액, 염 및/또는 추가 부형제(예를 들어, 킬레이트화제)를 함유할 수 있다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 이용되는 필드-유동 분획화는 바람직하게는 동시에 UV 및 CD 신호를 모니터링할 수 있는 UV 검출기를 사용하여 수행된다.
본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 분석될 파라미터 중 하나가 핵산(특히 RNA)의 총량인 경우, 상기 필드-유동 분획화에서 사용되는 액상은 입자로부터 입자에 결합된 핵산(특히 RNA)을 방출할 수 있는 방출제를 함유하는 것이 바람직하다(이에 의해 결합된 핵산 (특히 결합된 RNA)의 양을 0으로 감소시키고 유리 핵산 (특별히 유리 RNA)의 양을 최대로 증가시킨다). 대조적으로, 본 개시내용의 방법 및/또는 용도에 의해 분석될 파라미터 중 하나가 유리 핵산(특히 유리 RNA)의 양인 경우, 필드-유동 분획화에 사용되는 액상은 방출제를 함유하지 않는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 샘플 또는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하기 전에, 샘플 또는 대조 조성물의 적어도 일부를 예를 들어 액상 또는 용매 또는 용매 혼합물로 희석하고, 상기 용매 또는 용매 혼합물은 상기 입자의 응집체 형성을 방지할 수 있다. 일 구현예에서, 용매 혼합물은 물과 유기 용매, 예를 들어 포름아미드의 혼합물이다.
실시예
약어
설명 전반에 걸쳐 다음 약어가 사용된다:
ivtRNA 시험관 내 전사 RNA
saRNA 자가 증폭 RNA
NP 나노입자(LPX, LNP, PLX, VLP)
LNP 지질 나노 입자
LPX 리포플렉스 입자
PLX 폴리플렉스 입자
VLP 바이러스 유사 입자
Rg 회전 반경
Rh 유체역학적 반경
MW 분자량
기구
해당 소프트웨어와 함께 수용액용 Eclipse® AF4(Wyatt)를 사용하여 필드-유동 분획화를 수행하였다. 분획화에 사용된 멤브레인은 컷-오프가 10 kDa인 PES 멤브레인(Wyatt Technology Europe, Dernbach Germany)이었다. 인라인 진공 가스제거기가 있는 Agilent 1260 시리즈 4차 펌프는 운반체 흐름을 전달하고 Agilent 1260 시리즈 자동시료주입기는 샘플 또는 대조 조성물(주입된 RNA의 4 μg에 해당)을 프릿-유입구 채널에 전달하였다. Agilent 1260 Multiple Wavelength Detector(260 - 280 nm MWD; Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) 및 다중각 광 산란 (MALS) 검출기 (DAWN HELEOS II, Wyatt Technology Corp. Santa Barbara, CA, USA)를 사용하여 660 nm 파장과 60%의 출력을 갖는 레이저로 피분석물(즉, RNA 및 입자)을 검출하였다. MALS 검출기 번호 16은 유리 섬유를 통해 QELS (DynaPro NanoStar, Wyatt Technology Cor. Santa Barbara, CA, USA)에 연결되었다.
물질
방법
AF4 분획화 방법
주입 흐름, 검출기 흐름 및 교차 유동을 위한 액상은 물 중 5 mM의 NaCl, 10 mM HEPES, 0.1 mM EDTA, pH 7.4이다. 분리는 0.2 mL/분의 주입 유량 Vi, 0.5 mL/분의 검출기 유량 Vd 및 1.5 mL/분의 교차 유량 Vx를 10분 동안 사용한 후, Vx 구배가 구배 3.5를 사용하여 30분 이내에 1.5 mL/분에서 0.04 mL/분으로 기하급수적으로 감소하는 용리 주입 프로그램에 의해 수행된다. 그 후, Vx는 30분에 걸쳐 0.04 mL/분으로 일정하게 유지되고, 10분 동안 교차 유동이 0으로 유지된다 (도 1 참조).
용리된 피분석물은 다중 파장(260-280 nm)에서, 그리고 파장 660 nm 및 60%의 레이저 전력을 갖는 레이저를 갖는 다중 각도 광산란(MALS) 검출기(DAWN HELEOS II, Wyatt Technology Corp. Santa Barbara, CA, USA)를 사용하여 검출되었다. MALS 검출기 번호 16은 유리 섬유를 통해 QELS (DynaPro NanoStar, Wyatt Technology Cor. Santa Barbara, CA, USA)에 연결되었다. CD 실험을 위해, 검출기 CD-4095(Jasco)를 사용하였다.
크기 분포는 산란 검출기에서 수득한 데이터에 대한 1차 적합을 수행하여 베리 플롯을 사용하여 ASTRA 소프트웨어 버전 7.1.3.25(Wyatt Technology Europe, Dernbach Germany)에 의해 계산된다. AF4 MALS 크기 결과는 회전 반경(Rg) 값으로 주어지며 입자 피크 면적에 대해 결정되었다. 커플링된 DLS는 유체역학적 반경(Rh)을 동시에 제공하였다. UV 신호는 샘플 또는 대조 조성물의 미결합(즉, 유리) RNA의 직접적인 정량분석에 사용되며, 방출제(세제)를 이용하여 입자를 용해시킨 후 샘플 또는 대조 조성물의 RNA 총량을 결정한다. MALS 신호에서 수득한 Rg 값에 대한 UV 신호(예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)를 플롯팅하여 수득한 그래프는 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 입자의 크기 분포에 대한 정보를 제공하고, 해당 누적 중량 분율 분석(UV 신호를 누적 중량 분율로 변환하여 얻음)은 샘플 또는 대조 조성물에 함유된 입자의 정량적 크기 분포에 대한 정보를 제공한다.
RNA 무결성의 결정
다수의 상이한 열처리(분해) RNA 표본(986 nt 내지 10000 nt 범위)을 사용하여 RNA 무결성의 결정을 수행하였다. RNA(실행당 주입량 4μg)를 AF4 분획화 방법(상기 참조)으로 분리하고 RNA를 260 nm에서 온라인으로 검출하였다. 동일한 완충액에 미처리(미분해) RNA를 포함하는 대조 조성물을 분리하여, 처리된 RNA 샘플 조성물과 비교하여 분석하였다. RNA 샘플 조성물을 포름아미드(60%(v/v))로 희석하고 측정 직전에 60℃에서 5분 인큐베이션하였다. 더 높은 분자 구조를 형성하는 경향이 낮은 RNA는 포름아미드 없이 분석될 수 있다. RNA 무결성의 계산을 위해 RNA 대조 조성물을 먼저 분석하였다. 최대 피크 높이의 용리 시간을 결정하고 최대 피크 높이에서 실행 종료(기준선)까지의 피크 면적을 계산하여, A50%(대조군)를 수득하였다(도 2a 참조). 둘째, 총 피크 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하였다(도 2b 참조). 셋째, 비율(절반 피크 면적/총 피크 면적 = A50%(대조군)/A100%(대조군))을 결정하고 100%로 설정하여 대조 RNA(I(대조군))의 무결성을 수득하였다. 넷째, 미리 결정된 용리 시점(대조 RNA)부터 실행 종료까지의 피크 면적을 계산하여, 처리된 RNA 샘플 조성물 중 하나를 분석하여 A50%(샘플)를 수득하였다(도 2c 참조). 다섯째, 총 피크 면적을 계산하여, A100%(샘플)를 수득하였다(도 2d 참조). 여섯째, A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 계산하여 I(샘플)를 수득하고, 처리된 RNA 샘플의 무결성 백분율은 I(샘플)를 I(대조군)로 정규화하여 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하였다.
RNA 양의 결정
AF4 프락토그램으로부터 RNA 양의 결정을 위해, 정의된 양(4 μg)의 RNA(0.5 mg/mL)를 포함하는 대조 조성물에 AF4 분획화 방법(상기 참조)을 거치고 260 nm 또는 280 nm에서의 UV 신호를 검출하였다. 다음 방정식에 따라 람베르트-베르(Lambert-Beer)의 법칙을 사용하여 피크 면적에서 직접 RNA 농도를 계산하기 위해 UV 피크 면적을 결정하고 사용하였다:
Figure pct00030
여기서 c는 핵산(특히 RNA) 농도(mg/mL)이고; A는 UV 피크 면적(AU 분)이고; F는 필드-유동 분획화에 사용된 유량(mL/분)이고; ε은 핵산의 특정 소광 계수이고(예를 들어, 단일 가닥 RNA의 경우 0.025 (mg/mL)-1cm-1); d는 세포 길이(cm)이고; 그리고 V는 샘플 또는 대조 조성물 또는 이의 일부의 주입된 부피이다.
RNA에 대한 염의 처리 효과의 분석
상이한 RNA(IVT-RNA 및 saRNA)에 대한 상이한 염화나트륨 농도의 영향은 AF4 분획화 방법(상기 참조)을 사용하고 RNA(Rg, Rh, MW)의 여러 특성을 결정함으로써 체계적으로 조사되었다. 상이한 RNA를 상이한 염화나트륨 농도(예를 들어, 0 내지 50 mM)로 사전 인큐베이션하고 AF4 분획화 방법을 적용했으며, 여기서 실행당 주입된 RNA의 양은 30 내지 100 μg이고 AF4 분획화 방법은 다양한 NaCl 농도(0 내지 50 mM의 NaCl)를 갖는 해당 핵상을 사용하였다. Rg 값은 Zimm 플롯을 사용하여 MALS 신호에 기초하여 상이한 NaCl 농도로 처리된 각각의 RNA에 대해 결정되었고 NaCl 농도의 함수로 플롯되었다. 상이한 NaCl 농도로 처리된 각각의 RNA 조성물에 대한 Rg(D50) 및 Rg(D90) 값은 하기 기재된 바와 같이 260 nm 또는 280 nm에서 UV 신호를 사용하여 누적 중량 분획 분석에 의해 계산되었다.
상이한 입자(LPX, LNP 또는 VLP)를 포함하는 RNA 조성물의 분석
다양한 NP(LPX, LNP, VLP)의 광범위한 세트의 특성화(예를 들어, 크기 분포 결정)를 위해, AF4 분획화 방법(상기 참조)이 적용되었다. 각각의 NP에 대한 주입량을 총 RNA 양(LPX 및 LNP 4 μg; VLP: 20 μg)으로 조정하였다. 입자의 온라인 검출은 (i) AF4 시스템을 UV-검출기(MWD Agilent) 및 MALS 검출기(HELEOS II, Wyatt Technology, Rg 값의 결정용)에 직접 커플링하고, 그리고 (ii) Rh 값의 동시 결정을 위해 유리 섬유를 통해 MALS 검출기(16번)에서 DLS를 한 각도에 외부적으로 연결함으로써 달성되었다. 일부 샘플의 경우, 또한 RI 검출기(Optilab T-rEX, Wyatt)를 사용하여 RI 신호를 동시에 검출하였다.
2 개의 상이한 입자(VLP 및 LPX)를 포함하는 RNA 조성물의 분석
짧은 RNA(40 bp; 단백질 기반 백신의 면역 반응을 향상시키기 위한 보조제로 사용됨) 및 1.3/2의 지질/RNA 비율로 RNA에 접근할 수 있는 F12 리포솜(DOTMA/DOPE 2/1)을 포함하는 리포플렉스 입자를 제조하였다. 생성된 짧은 RNA 리포플렉스 입자를 1/1의 LPX/VLP 비율로 VLP 샘플 조성물과 제2 단계에서 혼합하고, 4 μg의 총 RNA를 AF4 분획화 방법(상기 참조)을 적용하여 상기 짧은 RNA-LPX VLP 샘플 조성물에 함유된 입자의 크기 분포를 결정하였다.
다양한 RNA-NP의 정량적 크기 분포(예를 들어, D90)
RNA-지질 기반 입자(LPX 또는 LNP)를 분석하기 위해, 4 μg의 총 RNA에 AF4 분획화 방법을 적용한 반면(상기 참조), RNA-고분자 기반 나노입자를 분석하기 위해 10 μg의 총 RNA를 AF4 분획화 방법에 적용하였다. 입자의 온라인 검출은 (i) AF4 시스템을 UV-검출기(MWD Agilent) 및 MALS 검출기(HELEOS II, Wyatt Technology, Rg 값의 결정용)에 직접 커플링함으로써 달성되었다 Rh 값의 동시 측정을 위해, DLS를 유리 섬유를 통해 MALS에 외부적으로 연결하였다. RNA(자유 및 결합)에 대한 추가 정보를 제공하기 위해, 260 nm 또는 280 nm에서 온라인 UV 검출을 AF4-MALS-DLS에도 적용하였다. 정량적 크기 분포를 위해, 실험적으로 수득한 Rg 값을 입자 피크 분율의 UV 신호에 대해 직접 플롯팅하였다. 예를 들어, 더 큰 입자에 대한 Rg 값은 체류 시간의 함수로서 플롯팅될 수 있으며, 데이터 포인트는 다항 방정식(예를 들어, f(t) = a + b1x + b2x2 + b3x3 + b4x4) 또는 선형 방정식(예를 들어, f(t) = a + a1x)에 적합화될 수 있고, 그리고 Rg 값은 다항식 또는 선형 적합을 기반으로 재계산될 수 있다. 다음 단계에서 입자 분획의 UV 신호는 재계산된 Rg 값의 함수로서 플롯팅된다. UV 신호는 해당 입자 분획에 결합 RNA 양에 정비례하고 중량 분율과 동일하다. 최종 단계에서, 기록된 UV 신호와 (D10, D50 및 D90 값)을 포함하는 해당 누적 중량 분율 분석의 값을 Rg 값의 함수로서 플롯팅하였다. 입자 크기(Rg 값)에 대한 UV 신호 추적의 플롯은 입자 양에 대한 정량적 정보를 직접 제공한다.
미결합 RNA(유리 RNA)의 양의 결정
RNA-LPX에서 미결합 RNA(유리 RNA)의 측정을 위해, LPX 입자 내의 4 μg의 총 RNA가 상기에 기재된 AF4 분획화 방법을 거쳤다(예를 들어, 도 1 참조). 미결합/유리 RNA의 양은 바람직하게는 260 nm 또는 280 nm에서 UV-흡수를 사용하여 입자(예를 들어, LPX)로부터 미결합/유리 RNA의 기준선 분리를 필요로 한다. 미결합/유리 RNA의 결정을 위해 두 가지 접근법을 적용할 수 있다.
1) 보정 곡선을 사용하여 접근법: RNA-LPX 입자에서 미결합/유리 RNA의 상대적인 양(%)은 미결합/유리 RNA의 UV 피크 면적을 대조 RNA의 UV 피크 면적(보정 곡선)과 상관시켜 결정된다.
2) 직접 접근법: UV 흡수는 상기에 기재된 대로 람베르트-베르의 법칙과 RNA 소광 계수를 사용하여 농도로 직접 번역될 수 있다.
지질 대 RNA의 상이한 비율("NP 비율")에서 미결합/유리 RNA의 정량화는 AF4 분획화 방법을 사용하여 결정되거나 계산될 수도 있다. 샘플 조성물은 지질(DOTMA/DOPE 2/1)과 RNA의 혼합물을 NaCl(100 mM)이 있거나 없는 상이한 전하 비율(0.1 내지 0.9)에서 혼합하여 제조되었으며, 여기서 RNA 농도는 일정하게 유지되었고 지질의 양 변했다. 이러한 샘플 조성물 내의 미결합/유리 RNA의 결정을 위해, 40 μL의 형성된 나노입자(4 μg 총 RNA)에 AF4 분획화 방법을 적용하였다. 상기에 기재된 접근법에 따라 분석을 수행하였다.
RNA-LPX 샘플 조성물 내의 RNA 함량의 총량의 결정
AF4 분획화 방법을 사용하여 RNA의 총량을 정량적으로 결정하기 전에, 방출제(예를 들어, 0.5% SDS 또는 0.1% 쯔비터젠트(ZW))를 첨가하여 나노입자를 파괴하여 입자로부터 RNA를 방출해야 한다. 40 μL의 샘플 조성물(4 μg 총 RNA)은 분리하는 동안 나노 입자의 재형성을 방지하기 위해 액상에 방출제(예를 들어, 0.05%(w/v) SDS)가 함유된 변형과 함께 상기에 기재된 AF4 분획화 방법에 적용되었다. 곡선 아래의 측정된 UV-피크 면적은 람베르트-베르의 법칙 및 RNA 소광 계수를 사용하여 RNA 농도로 (그것으로부터 샘플 조성물에 함유된 RNA의 총량으로) 직접 번역될 수 있다. 또한 NP 파괴의 완성은 MALS 신호로 모니터될 수 있다.
실시예 1 - AF4 분획화 방법을 사용하는 RNA의 결정
UV 검출기와 RI 검출기(AF4-UV-RI)를 사용하여 AF4 분획화 방법으로 RNA 스톡 용액의 상이한 주입 부피를 분석하였다. 곡선 아래의 피크 면적(UV 실선; RI 파선)은 주입된 부피에 대해 플롯팅되었고 선형 회귀가 적합화되었다 (도 3a 참조). RNA의 연속 희석은 AF4-UV-RI에 의해 동일한 주입 부피로 측정되었고 이전과 같이 분석되었다(도 3b 참조).
도3a 및 b에 도시된 데이터는 신호(RI 및 UV)와 RNA 양 사이의 직접적인 선형 상관관계를 입증한다. 따라서 이러한 데이터는 RNA의 직접 결정(즉, 보정 곡선을 사용하지 않음)이 실현 가능하다는 것을 증명한다. 또한 샘플 희석이 필요하지 않다(큐벳에서 RNA 용액의 UV 신호를 측정하여 RNA 양을 결정하는 것과 비교). 따라서 광범위한 농도 범위의 샘플 RNA 조성물을 사용할 수 있다(주입 부피는 적합화될 수 있음). AF4 분획화 방법의 추가 장점은 다음과 같다:
- 낮은 표준편차(<2%);
- 낮은 염도 효과(AF4 분획화 절차 동안 샘플이 "세척"되기 때문에);
- RNA의 소광 계수 변화를 분석하고 결정할 수 있다.
실시예 2 - RNA 무결성의 결정
RNA를 다양한 정도로 분해하기 위해 RNA를 열처리(2분, 4분 또는 10분 동안 98℃ 하였다. 미처리 RNA, 처리된 RNA(98℃에서 2분, 4분 또는 10분) 또는 열분해되고 미처리된 RNA의 정의된 혼합물을 포함하는 샘플 조성물을 표준을 사용하지 않고 AF4 분획화 방법(AF4-UV-RI)으로 분석하였다. 상이한 샘플 조성물(n=3)의 대표적인 AF4 프락토그램이 도 4a에 도시되어 있다. 이러한 프락토그램에서 곡선 아래의 평균 면적은 람베르트-베르의 법칙을 적용한 RNA 농도로 직접 변환되었고 생성된 농도는 RNA의 분해 시간의 함수로서 플롯팅되었다(도 4b 참조).
도 4b에서 볼 수 있는 바와 같이, 상이한 정도의 RNA 분해(0 내지 50% 분해 범위)는 AF4 분획화 방법을 사용하여 RNA의 정량화에 대한 약간의 영향(<2%)을 갖는다. 대조적으로, 다른 정량화 방법(아가로스 겔, 단편 분석기)은 신호 강도 대 분해의 강한 의존성을 보여준다.
실시예 3 - 복합 혼합물의 분리
샘플 입자 조성물(1.3/2의 몰비로 지질 및 RNA 함유)을 제조하고 본 명세서에 개시된 AF4 방법에 적용하였으며, 여기서 UV 및 광산란(LS) 신호가 검출되었다. AF4 방법에서 수득한 대표적인 프락토그램은 도 5에 도시되어 있고, 여기서 실선은 90°각도에서 광산란(LS) 신호를 나타내고 입자 피크(t = ~35분)를 나타내는 반면, 파선은 UV 신호(260 nm에서 기록됨)를 나타내고 결합 RNA (t = ~38분) 및 미결합 RNA(t = ~20분)를 반영한다.
도 5는 AF4 방법이 구성요소(유리 RNA 및 LPX 입자)의 복합 혼합물을 분리할 수 있음을 보여주며, 이로써 구성요소는 유체역학적 반경(Rh)의 함수로 용리되었다. UV 트레이스(파선)는 체류 시간이 18 내지 25분과 25 내지 60분인 2개의 별개의 피크를 보여준다. 제1 피크(밝은 회색 상자)는 제형에서 RNA의 몰 접근으로 인해 용액에서 유리 미결합 RNA를 나타내고 제2 피크는 LPX 입자(어두운 회색 상자)를 나타낸다.
따라서, 도 5에 제시된 데이터에 따르면, AF4 방법은 넓은 크기 범위(nm에서 μm까지)에 걸쳐 샘플 조성물에 적용할 수 있으며 RNA와 나노입자의 복합 혼합물의 상이한 구성요소(RNA 및 NP)을 효율적으로 분리한다. 또한, 이 방법은 SEC와 같은 일반적인 기술로는 달성할 수 없는 더 큰 크기 범위의 다분산 나노입자 분획(LNP, LPX, VLP, RNA)을 분리할 수 있다. 따라서 AF4 방법은 입자의 복합 혼합물을 포함하는 조성물의 크기 분리에 대한 요건을 충족한다.
실시예 4 - RNA 무결성의 결정
길이가 다른 상이한 열분해 RNA를 포함하는 샘플 조성물(RNA #1-4; 크기: 986 내지 1688 nt) 및 미처리 RNA를 포함하는 대조 조성물을 제조하고 AF4 분획화 방법을 적용하였다(도 6a 참조). 유사하게, 상이한 비율을 사용하여 RNA #2를 포함하는 샘플 조성물(미처리(대조군), 완전 열분해 및 미처리와 완전 열분해의 50:50 혼합물)을 제조하고 AF4 분획화 방법을 적용하였다(도 6c 참조). 각각의 샘플 조성물에 대한 RNA 무결성을 상기에서 지정한 UV 신호를 기반으로 결정하고(샘플 및 대조 조성물 모두에 대해 절반 피크 면적/총 피크 면적의 비율 사용; 적어도 3회 측정), 이론상 계산된 값과 비교하였다. 샘플 조성물(어두운, 중간 및 밝은 회색 막대) 및 이론적으로 계산된 값(검은색 막대)의 RNA 무결성 백분율이 도 6b 및 6d에 도시된다.
도 6a 및 c에서 알 수 있듯이, AF4 방법으로 상이한 열분해된 RNA를 분리하여 검출할 수 있다. 계산된 RNA 무결성은 2분 열처리 동안 ~95%, 4분 동안 ~90% 및 10분 ~70%의 무결성을 갖는 열 시간 의존적 분해-역학(도 6b)을 보여주었다. 접근법을 확인하기 위해, 분해된 RNA와 미분해 RNA의 정의된 혼합물을 제어된 방식으로 결합하고 분석하였다(도 6d). 측정된 RNA 무결성 값은 이론적으로 계산된 값과 매우 잘 일치한다(도 6d).
RNA에 대한 하나의 주요 중요한 품질 파라미터는 무결성이다. 본 명세서에 기재된 AF4 방법은 작은 40 nt에서 매우 큰 10000 nt RNA에 이르는 상이한 비제형화된 RNA 표본에서 RNA 무결성을 결정하는 데 적합하다. 이 방법은 RNA 무결성의 매우 작은 변화를 검출할 수 있으며 삽입작용 염료의 정량화 문제와 무관하다.
실시예 5 - AF4 방법을 사용한 RNA 정량과 형광 기반 방법의 비교
RNA 및 형광 표지된 입자를 포함하는 샘플 조성물을 제조하고 본 명세서에 기재된 AF4 방법에 적용하였으며, 여기서 증가된 부피를 주입하고 UV 신호 및 형광(FS) 신호를 검출하였다. 각각의 샘플 조성물에 대한 UV 및 FS 입자 피크 면적을 결정하고 주입된 RNA 양에 대해 플롯팅하였다(도 7a 참조). 또한, 샘플 조성물의 UV 대 FS 입자 피크 면적의 비율을 계산하고 주입된 RNA 양에 대해 플롯팅하였다(도 7b 참조).
도7은 주입된 RNA의 농도가 증가함에 따라 두 검출 시스템의 AUC가 선형적으로 증가했으며 생성된 플롯은 넓은 농도 범위에서 비슷한 결과를 제공했음을 입증한다. 두 신호의 선형 거동은, UV 신호가 리포솜에 결합된 높은 RNA 농도의 우세한 UV 흡수로 인해 산란의 영향을 받지 않고, 즉, 중요한 산란 영향이 없음을 나타낸다. 따라서 도 7은 입자에 결합 RNA를 정량화하기 위한 UV 신호의 적합성을 입증한다.
실시예 6 - 유리 RNA 및 입자에 결합 RNA의 UV 신호의 비율의 결정
상이한 양의 RNA 및 리포플렉스 입자를 포함하는 샘플 조성물을 제조하고 본 명세서에 기재된 AF4 방법에 적용하였으며, 여기서 UV 신호가 검출되었다. UV 신호로부터, 입자에 결합된 유리 RNA 및 RNA 둘 다에 대한 피크 면적을 결정하고 각각의 샘플 조성물에서 RNA의 총량에 대해 플롯팅하였고; 도 8a를 참조한다. 또한, 입자에 결합 RNA의 피크 면적 대 유리 RNA의 피크 면적의 비율을 각 샘플 조성에 대해 결정하고 각각의 샘플 조성물 내의 RNA의 총량에 대해 플롯팅하였고; 도 8b를 참조한다.
도 8a에서 볼 수 있는 바와 같이, 유리 RNA의 피크와 RNA의 넓은 총량에 대한 LPX 피크 사이에는 선형 관계가 있다. 또한, 입자에 결합된 RNA에 대한 피크 면적 대 유리 RNA의 피크 면적의 결정된 비율 및 소광 계수는 넓은 LPX 농도 범위에 걸쳐 일정한 것으로 밝혀졌다(도 8b 참조). 이러한 비율은 입자 제형에 대한 추가 품질 파라미터일 수 있다.
실시예 7 - 입자의 크기 분포의 결정 - UV 또는 형광 신호로 수득한 결과의 비교
RNA 및 Atto594 표지된 입자를 포함하는 샘플 조성물을 제조하고 본 명세서에 기재된 AF4 방법에 적용하였으며, 여기서 UV 신호(260 nm에서), MALS 신호 및 형광 신호(FS)(624 nm에서 방출)가 검출되었다. 대표적인 프락토그램이 도 9a에 도시된다. UV/FS 비율을 계산하고 입자 피크 분율(용리 시간: 22 내지 60분) 및 UV/FS 비율을 Rg 값(MALS 신호에 기초하여 결정됨)에 대해 플롯팅하였고; 도 9b를 참조한다. UV/FS 비율의 50% 미만 변화가 있는 Rg 영역이 도 9b에서 강조 표시된다 (박스). 50 내지 300 nm의 Rg 범위에서, UV/FS 비율의 변화는 작고 신뢰할 수 있는 크기 값을 제공한다. 더 작은 Rg 값은 RNA 신호의 영향을 받는다. 더 큰 Rg 값은 산란의 영향을 받는다. 전체적으로 이러한 영향을 받는 Rg 값은 총 신호량의 10% 미만이다. D10, D50 및 D90 값을 624 nm에서 형광 방출(검은색 막대) 및 260 nm에서 UV 신호(회색 막대)를 사용한 누적 중량 분율 분석을 기반으로 계산하였고; 도 9c를 참조한다.
형광 검출기로 수득한 프락토그램(도 9a 참조)은 하나의 피크만 보여주었고, 이는 나노입자만 검출할 수 있는 형광 표지된 헬퍼 지질의 사용으로 인해 리포플렉스 입자(LPX)에 기인한다. UV 및 FS의 흔적은 전체 용리 범위에서 매우 유사했으며 더 높은 체류 시간에서 약간의 편차가 있었는데, 이는 크기가 증가함에 따라 산란의 작은 영향을 나타낸다. 입자 크기 분포에 대한 정량적 정보를 얻기 위해 UV를 사용하는 실현성을 추가로 증명하기 위해, FS 신호(620 nm에서 동시에 기록됨)에 대한 LPX의 전체 UV 흡수 값(본 명세서에 기재된 AF4 방법으로 분획화됨)의 비율을 계산하였고 상응하는 Rg 값에 대해 플롯팅하였다(도 9b 참조). 생성된 UV/FU 비율은 더 큰 크기에서 편차가 증가함에 따라 넓은 크기 범위에 걸쳐 일정한 것으로 밝혀졌다. 정량적 D10, D50 및 D90 값을 제공하는 두 신호를 모두 사용하여 누적 중량 분율을 분석하였고; 도 9c를 참조한다. UV 신호를 기반으로 결정된 이러한 D10, D50 및 D90 값을 FS 신호를 기반으로 결정된 값과 비교할 때, 입자 크기 D10 및 D50에 대한 유의차가 관찰되지 않았으며 더 큰 입자 크기(D90)에서 약간의 차이만 감지되었다. 따라서 이들 데이터는, 나노입자가 무시할 수 있는 정도의 광 소멸에 기여하고 UV 신호가 산란에 의해 크게 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다.
따라서 이러한 결과는 산란에 대한 보정 인자의 필요 없이 정량적 크기 측정을 위해 온라인 UV 검출을 사용하는 실현성에 대한 증거를 제공한다. 본 명세서에 기재된 AF4 방법은 확산 계수의 함수로 입자(예를 들어, LPX를 함유하는 RNA의 미결합/유리 RNA)를 분리하고, DLS와 같은 통상적인 방법에 의해 가능하지 않은, 한 실행에서 LPX를 함유하는 RNA의 크기 분포 뿐만 아니라 유리 RNA의 양을 정량적으로 결정하기 위한 기회를 제공한다. NTA(나노입자 추적 분석)와 같은 다른 방법도 입자 크기 분포에 대한 정보를 제공할 수 있지만 다른 단점이 있다(예를 들어, 상기의 "배경" 섹션 참조). 예를 들어, NTA의 경우, 샘플을 10 내지 1000배 희석해야 하며, 이는 특히 입자의 응집 또는 분해에 따른 농도에서 문제를 야기할 수 있고, 이는 입자 크기 분포에 대한 부정확한 정보를 야기할 수 있다.
실시예 8 - 입자의 여러 파라미터 결정
RNA 및 입자를 포함하는 샘플 조성물을 제조하고 본 명세서에 기재된 AF4 방법에 적용하였으며, 여기서 UV 신호(260 nm에서), MALS 신호(90°에서), 및 DLS 신호가 검출되었다. 대표적인 프락토그램이 도 10에 도시되어 있다(DLS 신호는 도 10에 도시되지 않음).
도 10에 도시된 분리 프로파일은 UV 신호(파선)와 90°에서의 MALS 신호(실선)를 포함한다. Rg 값(회색 정사각형)은 베리 플롯을 사용하여 LPX 피크(25 내지 60분 체류 시간)에 대한 MALS 신호를 기반으로 결정되었으며 80 nm 내지 400 nm 범위에 있었다. 유체역학적 반경(Rh) 값(회색 원)은 DLS 신호를 기반으로 결정되었으며 130 nm에서 300 nm 범위에 있었다.
크기와 크기 분포는 약물 전달 비히클의 주요 파라미터 중 2개이다(예를 들어, FDA's "Liposome Drug Products Guidance" 2018). 이 실시예에서 입증된 바와 같이, AF4 방법은 복합 나노입자의 구성요소(나노입자로부터 RNA)을 효율적으로 분리할 수 있을 뿐만 아니라 크기 범위 (nm-μm)에 대한 나노입자의 크기 및 크기 분포의 온라인 결정을 허용한다.
실시예 9 - 입자의 정량적 크기 분포의 결정
상기 실시예 8에서 제조하여 분석한 샘플 조성물로 수득한 실험 데이터를 더 분석하여 입자의 정량적 입도 분포를 결정하였다. 도 10에 도시된 프락토그램은 다시 도 11a에 도시된다. 정량적 크기 분포의 결정을 위한 제1 단계에서, 도 11a에 도시된 프락토그램에 함유된 입자 피크의 실험적으로 결정된 Rg 값 (용출 시간: 26 내지 55분)을 추출하여 다항 방정식(밝은 회색 선)에 적합화하고; 도 11b를 참조한다. 그런 다음 다항식 적합을 기반으로 Rg 값을 재계산하였다. 다음 단계에서 입자 분획의 UV 신호는 재계산된 Rg 값의 함수로서 플롯팅되었다 (도 11c, 실선을 참조함). UV 신호는 입자 양에 정비례하고 중량 분율과 동일하다. 최종 단계에서, 기록된 UV 신호는 해당 누적 중량 분율 값(D10, D50 및 D90 값 포함)으로 변환되었으며 재계산된 Rg 값의 함수로서 플롯팅되었다(도 11c, 파선 참조). 입자 크기(Rg 값)에 대한 UV 신호의 플롯은 입자 양에 대한 정량적 정보를 직접 제공한다.
이 실시예 및 다른 실시예(예를 들어, 실시예 5 및 7 참조)에서 입증된 바와 같이, UV 신호 및 해당 누적 중량 분율 분포는 정량적 입자 크기 분포 프로파일의 결정 및 분석을 가능하게 한다. 본 명세서에 기재된 AF4 방법은 강력하고 재현 가능하며, 분리된 샘플의 심층적인 특성화를 제공하므로 샘플 조성물 내의 변화를 감지할 수 있다. 결과는, AF4 방법이 크기 및 크기 분포, 즉 NP와 같은 입자의 특성화에 대한 정성적 및 정량적 정보에 대한 동시 정보를 제공함을 예시한다.
실시예 10 - 입자의 파라미터에 대한 상이한 지질/RNA 비율의 효과 분석
100 mM의 NaCl이 있거나 없는 상이한 지질/RNA 비율(0.1 내지 0.9)로 지질 및 RNA를 혼합하여 상이한 샘플 조성물을 제조하고 본 명세서에 기재된 AF4 방법을 적용하였다. 상이한 샘플 조성 각각에 대해, UV 신호(260 nm에서), 광산란 신호(90°에서) 및 상응하는 Rg 값(베리 플롯을 사용하여 계산됨)이 결정되었다. 도 12a는 해당 Rg 데이터 포인트와 함께 프락토그램의 오버레이를 보여준다. 누적 중량 분율 값을 결정하고, Rg 값을 누적 중량 분율 값에 대해 플롯팅하고, 9개의 샘플 조성물 각각에 대한 D90 값을 결정하였다(도 12b 참조). 이들 Rg(D90) 값은 100 mM의 NaCl(검은색 점)이 있거나 NaCl(열린 점)이 없는 지질/RNA 비율의 함수로서 플롯팅되었다.
도 12a는, AF4 방법을 사용하여 유리 RNA가 물리화학적 이종 나노입자(LPX)로부터 효율적으로 분리되고 정량될 수 있음을 보여준다. 추가로, 도 12a는 샘플 조성물의 성분(즉, 유리 RNA 및 입자)의 물리화학적 특성/파라미터(예를 들어, Rg)에 대한 샘플 조성물의 합성 동안 상이한 지질/RNA 비율의 효과를 예시한다. 도 12b 및 12c에 따르면, 입자의 크기는 입자에 따라 유의하게 변화하지 않았다(지질/RNA 비율 0.1 내지 0.4). 더 큰 입자는 더 높은 비율(> 0.4)에서 형성되었다. 이온 강도의 영향을 받지 않는 것으로 보이는 LPX 샘플의 경우 리포솜의 양이 증가함에 따라 크기가 선형으로 증가한다. 데이터는, 리포솜의 증가된 접근이 생성된 입자의 크기를 증가시킨다는 것을 나타낸다. 염이 없으면, 표시된 전하 비율에서 크기가 감소한다.
이 실시예는 AF4 방법이 다양한 전하 비율에서 입자의 정량적 크기 분포 및 특성화 결정뿐만 아니라 유리 RNA 및 입자의 분리 및 정량화를 허용한다는 것을 보여준다. 따라서 이 방법은 RNA-LPX 상호작용을 분석하는 데 유용한 분석 도구이며 한 번의 실행으로 상이한 나노입자에 대한 정량적 및 정성적 정보를 제공할 수 있음이 입증되었다.
실시예 11 - 입자 형태의 추정
입자 형상에 대한 추가 정보는 계산된 Rg 값(예를 들어, 실시예 8에서) 대 Rh 값(DLS 신호에 기초하여 결정됨)을 플롯팅하고 데이터를 선형 방정식에 피팅함으로써 받을 수 있다. 선형 회귀의 구배는 입자 형상에 대한 정보를 제공한다. 예를 들어, 0.74의 구배는 분석된 나노입자에 대한 구형체 유사 형상을 나타낸다. Rg 대 Rh 값의 비율은 형상 계수라고도 한다.
실시예 12 - 상이한 유형의 입자의 분리 및 특성화
상이한 유형의 입자(LPX, LNP, PLX, 리포솜, VLP+LPX)를 포함하는 샘플 조성물을 본 명세서에 기재된 AF4 방법을 사용하여 제조하고 분석하였다. 도 14는 AF4-UV-MALS-DLS 분리/검출을 보여준다. 90°각도에서 LS는 실선으로 표시되며 입자 피크를 나타낸다. 파선은 260 nm에서 기록된 UV 신호(RNA 검출용)를 나타낸다. 회전 반경(Rg) 값(어두운 점)은 Zimm 플롯 (RNA 및 VLP) 및 Berry 플롯 (LNP)을 사용하여 다중각 광산란(MALS) 신호에서 파생된다. 동적 광산란(DLS, 회색 점)은 유체역학적 반경(Rh)을 제공한다. 개별 입자 피크 분율은 회색 막대로 강조 표시된다. 도 14a는 AF4-UV-MALS-DLS 분리/검출 후 1.3/2의 몰비로 지질 및 RNA를 함유하는 LPX 샘플의 대표적인 프락토그램을 보여준다. 도 14b는 두 가지 유형(짧은 RNA-LPX:VLP, 1:1 혼합물)의 입자를 포함하는 조성물의 대표적인 프락토그램을 보여준다. 도 14c는 리포솜 샘플(2/1의 몰비로 DOTMA 및 DOPE로 구성된 양으로 하전된 리포솜)의 대표적인 프락토그램을 보여준다. 도 14d는 LPX 샘플의 대표적인 프락토그램(4/1의 몰비로 DOTMA 및 콜레스테롤 및 RNA를 함유하는 양으로 하전된 LPX)을 도시한다. 도 14e는 DODMA, 콜레스테롤, DOPE, PEG(1.2/1.44/0.3/0.06의 몰비) 및 3/1의 몰비의 RNA를 함유하는 지질 나노입자(LNP) 샘플의 대표적인 프락토그램을 보여준다. 도 14f는 JetPEI 중합체 및 IVT-RNA 또는 saRNA를 12/1의 입자 대 RNA 비율로 함유하는 입자의 대표적인 프락토그램을 도시한다.
도 14는, AF4 방법이 광범위한 입자 표본에 적용될 수 있음을 입증한다. 용리 프로파일은 예를 들어 입자의 크기 분포를 결정할 수 있게 한다. 또한, 샘플의 응집체를 검출할 수 있고(예를 들어, 도 14b), 다양한 유형의 입자를 미결합 유리 RNA로부터 효율적으로 분리할 수 있다(도 14a/b/f에서 마킹되지 않은 UV 피크).
실시예 13 - 염 처리 후 제형화되지 않은 RNA의 특성화
AF4 방법을 사용하여 이온(염화나트륨)의 존재하에서 RNA 거동의 분석하였다. 상이한 염화나트륨 농도(0 내지 50 mM)로 상이한 RNA(IVT-RNA)를 사전 인큐베이션함으로써 샘플 조성물을 제조하였다. 상이한 염화나트륨 농도(0 내지 50 mM)에서 비제형화된 RNA로부터의 예시적인 AF4 프락토그램(90°에서의 광산란 신호가 보여짐)이 도 15에 도시된다. Rg 값은 Zimm 플롯을 사용하여 MALS 신호에서 파생되었다.
도 15에서 볼 수 있는 바와 같이, AF4 방법을 이용하여 다르게 처리된 RNA를 분리하여 검출할 수 있다. 매우 적은 양의 고분자량 차수 응집체만이 검출될 수 있었다. 흥미롭게도, RNA Rg 값은 염화나트륨 농도 증가의 함수로 감소하므로 이온 농도와 역 상관관계가 있다(NaCl이 없는 내지 80 nm에서 50 mM의 NaCl이 있는 20 nm까지). 또한, 염 농도가 증가함에 따라 체류 시간이 더 긴 시점으로 이동하였다(NaCl이 없는 15분에서 50 mM의 NaCl가 있는 18분까지). 이 이동은 RNA의 Rh(더 작은 Rh 값에서 더 큰 Rh 값으로)의 변화를 나타낸다. 형태 계수(Rh/Rg)를 계산할 수 있고 염이 존재할 때, RNA의 압축을 나타낼 수 있다.
상기 데이터는 상이한 염화나트륨 농도(0 내지 50 mM)로 처리된 각각의 샘플 조성물에 대한 Rg(D50) 값 뿐만 아니라 정성적 크기 분포를 결정하기 위해 누적 중량 분율 분석을 거쳤고; 도 16a를 참조한다. RNA Rg(D50) 값(도 16a)은 염화나트륨 농도에 대해 플롯팅되었고 비율(mM 염화나트륨 대 nm Rg)이 계산되었다. 0 내지 10 mM의 NaCl 값의 비율 선형 적합은 굵은 선으로 표시되는 반면, 점선은 10 내지 50 mM의 NaCl의 피팅을 나타낸다. 회색과 검은색 선은 두 가지 상이한 RNA 농도를 사용한 측정의 예를 나타낸다.
도 16에서 볼 수 있듯이, 염이 낮은 농도(0 내지 5 mM의 NaCl)로 존재하는 경우, Rg 값( 내지 30%)이 크게 감소한다. 더 높은 염 농도(10 mM의 NaCl)에서는 Rg 감소의 진행이 감소한다. 도 16b에 따르면, 낮은 NaCl 농도(0 내지 10 mM)에서는 선형 상관관계가 있는 반면, 높은 NaCl 농도(50 mM)에서는 비선형 상관관계가 보이다. 이것은 낮은 농도(5 mM의 NaCl로 30% Rg 감소)의 이온 존재 하에서 RNA의 강한 압축으로 설명될 수 있지만, RNA의 추가 압축(~ 30%)은 여전히 어느 정도 발생할 수 있지만, 훨씬 더 높은 이온 농도(50 mM의 NaCl)가 필요하다.
이온은 나노입자의 RNA 로딩 능력에 영향을 미치는 RNA 접힘/압축을 유도하는 핵심 요소 중 하나이다. 본 명세서에 기재된 AF4 프로토콜은 염화나트륨 처리된 RNA(예를 들어, IVT-RNA 및 saRNA)의 Rg 값의 변화를 분석하는 데 적합하다.
실시예 14 - 복합 샘플 조성물에서 유리 RNA의 분리 및 정량화
이 실시예는 복잡한 샘플 조성물에서 유리/미결합 RNA의 정량화를 설명한다. RNA 및 입자를 포함하는 샘플 조성물에서 유리 RNA의 측정을 위한 AF4 방법의 적합성을 보여주기 위해 260 nm에서 UV 검출을 사용하여 네이키드 RNA의 보정 곡선을 수행하였다.
본 명세서에 개시된 AF4 방법을 사용하여, 입자가 없는 조성물에서 260 nm에서의 UV 흡수에 의해 상이한 양의 유리 RNA(1 내지 15 μg)를 검출하였다. 선형 보정 곡선을 생성하기 위해 곡선 아래 각각의 UV 피크 면적(AUC*min)에 대해 RNA 양을 플롯팅하였다 (도 17a 참조). 상이한 양의 샘플 조성물(1 내지 15 μg의 총 RNA 함유)을 AF4 방법으로 분석하였다. 중첩된 AF4 프락토그램은 260 nm에서 UV 신호를 보여준다 (도 17b 참조). 제1 피크(용리 시간: 내지 20분)는 유리 RNA에 해당하는 반면, 제2 피크(용리 시간: 내지 38분)는 입자(결합 RNA)에 해당한다. 입자 조성물에서 유리 미결합 RNA의 양은 참조 RNA(=100%)와 관련하여 계산될 수 있다(도 17a 참조). 방법의 선형성을 나타내기 위해, 유리 RNA (도 17b 참조) 뿐만 아니라 참조 네이키드 RNA (도 17a 참조)의 UV 피크 적분을 상이한 RNA 양(1 내지 15 μg)의 함수로 플롯팅하혔다 (도 17c 참조). 유리 RNA의 정량화를 위한 제2로 선호되는 절차(직접 방법)로, 미결합 RNA 피크가 정의되고 RNA의 특정 소광 계수(람베르트-비어 법칙)를 사용하여 RNA 양을 직접 계산할 수 있다 (도 17d 참조).
도 17에서 알 수 있는 바와 같이, UV 신호 영역은 재현 가능한 방식으로 표시된 범위에서 샘플 농도에 비례하는 것으로 밝혀졌다. 도 17a는 UV 신호를 사용하여 RNA를 정량화하기 위한 선형 거동을 나타내는 상이한 양의 RNA의 함수로서 UV 신호의 AUC를 나타낸다. 또한, 도 17b에 따르면, 미결합 RNA의 용리 거동의 변화는 관찰되지 않았다. 도 17c에서, 나노입자의 유리 RNA 뿐만 아니라 네이키드 RNA의 UV 신호 적분은 상이한 양의 RNA의 함수로서 도시된다. 두 플롯 모두 선형 적합되었으며 직접적인 상관관계를 보여준다. 이것은 네이키드 RNA로 보정 곡선을 수행하지 않고 UV 신호(AUC*분)를 직접 활용하여 NP 샘플의 유리 RNA를 정량화할 수 있다는 실현성을 나타낸다. 따라서, 표시된 선형 범위에서 동일한 양의 적절한 네이키드 RNA에 대해 유리 RNA를 직접 정량화할 수 있다. 결과는 콜로이드 제형에서 유리 RNA의 백분율(%)을 제공한다.
따라서, 이 실시예는 AF4 방법이 참조 샘플 또는 정규화 없이도 입자를 포함하는 샘플 조성물에서 유리 RNA의 직접 정량화를 위한 표준이 없는 방법으로 사용될 수 있음을 보여준다. 또한, NP에 대한 유리 RNA의 비율은 입자를 포함하는 샘플 조성물의 추가 품질 지표로 결정될 수 있다.
실시예 15 - 상이한 샘플 조성물에서 유리 RNA의 분리 및 정량화
이 실시예는 상이한 물리화학적 거동을 갖는 샘플 조성물에서 유리 RNA 양의 분석을 보여준다. 샘플 입자 조성물((DOTMA/DOPE 2/1)/가변 전하비(0.1 내지 0.9)로 혼합된 RNA 복합체)를 NaCl 없이(도 18a 참조) 또는 100 mM의 NaCl(도 18b 참조)과 함께 제조하고 본 명세서에 기재된 AF4 방법을 사용하여 분석하였다. 모든 혼합물을 이중으로 제조하고 적어도 이중으로 측정하였다. 100 mM의 NaCl이 있는(검은색 원) 및 NaCl이 없는(빈 원) 계산된 미결합 RNA의 백분율을 전하 비율에 대해 플롯팅하였다.
도 18a 및 b는, AF4 방법이 물리화학적으로 이질성 NP(LPX) 샘플(지질/RNA 전하 비율)로부터 유리 RNA를 효율적으로 분리하고 정량할 수 있고 다른 LPX가 추가로 분리될 수 있음을 보여준다. 유리 RNA의 상대적인 양은 지질/RNA 전하 비율의 함수로 계산되었으며, 여기서 RNA 농도는 일정하게(0.1 mg/mL) 유지되었고 리포솜 양은 다양하였다. 혼합물의 이온 강도(0 대 100mM NaCl)도 다양하였다. 지질/RNA 비율 및 이온 강도(0 내지 100 mM의 NaCl)에 따라 유리 RNA 양의 명확한 변화를 볼 수 있다. 모든 샘플 조성물에 대한 유리 RNA의 체류 시간은 모든 샘플에 대해 유사하였다(도 18a/b). 유리 RNA의 양은 NaCl이 있거나 없는 LPX 샘플에서 리포솜의 양은 증가함에 따라 선형적으로 감소하였다(도 18c). 염의 존재는 검출 가능한 유리 RNA의 양에서 감소(최대 15%)를 야기하였다. 이 데이터로부터 염의 첨가가 LPX 결합 RNA의 양을 내지 15%까지 증가시킬 수 있다는 결론을 내릴 수 있다. 100 mM의 NaCl이 있는 경우(검은색 원) 및 NaCl이 없는 경우(빈 원)의 미결합 RNA(μg/mL)의 농도를 나타내는 도 18d는 유사한 결과를 보여준다.
이 실시예는, AF4 방법이 미결합 RNA의 분리는 물론 이질성 LPX 샘플에서 유리 약물(RNA)의 온라인 정량화를 허용한다는 것을 보여준다. 이 방법은 RNA-LPX 상호작용을 결정하는 데 유용한 분석 도구이며 한 번의 실시로 입자에 대한 정량적 정보를 제공할 수 있다.
실시예 16 - 샘플 조성물에서 총 RNA의 정량화
이 실시예는 본 명세서에 기재된 AF4 방법을 사용하여 입자 조성물에서 총 RNA의 정량화를 설명한다.
도 19a는 AF4 방법에 의해 분리된 쯔비터젠트(Zwittergent) 처리된 네이키드 RNA의 AF4 프락토그램을 보여준다. 260 nm의 UV 신호는 검은색 선으로 표시되고 90°의 LS 신호는 파선으로 표시된다. 도 19b는 유리 RNA(회색으로 강조 표시) 및 결합 RNA(제2 피크), 90°각도에서 LS 신호(파선)가 있는 UV 검출(실선)이 있는 입자 조성물의 대표적인 프락토그램을 도시한다. 도 19c는, 입자가 방출제(액상에는 0.1% 쯔비터젠트를 함유함)를 사용하여 용해된 RNA 조성물의 해당 프락토그램, UV 검출(실선) 및 90°에서의 광산란(점선)을 보여준다. 도 19d는, 방출제(Zwittergent)로 처리한 후 네이키드 RNA 및 총 RNA의 직접 정량화를 보여준다.
FDA 지침에서 중요한 품질 파라미터로 간주되는 파라미터는 샘플 조성물의 유리, 결합 및 총 RNA 농도이다. 지질 기반 제형에서 총 RNA를 정량화하기 위해 UV 검출을 사용하는 문제는 유리 및 결합 RNA의 소광 계수의 차이에 있다. LPX에서 총 RNA 농도의 정량화를 위해 260 nm에서 UV 검출을 사용하려면 이러한 차이를 제거해야 한다. 이러한 작업을 해결하기 위해 두 가지 다른 접근법을 적용할 수 있다. 제1 접근법은 복합체화된 RNA의 소광 계수의 결정을 기반으로 하며, 이는 결정을 위해 많은 양의 RNA가 필요하기 때문에 더 복잡하다. 제2 접근법은 제형에서 결합 RNA를 방출하는 것을 기반으로 한다. 총 RNA의 정량적 결정에 앞서, 입자로부터 RNA를 방출하기 위해 방출제(예를 들어, 0.5% SDS 또는 0.1% 쯔비터젠트(ZW)와 같은 계면활성제)를 첨가하여 나노입자를 파괴해야 한다. 용해된 LPX의 분리는 분리 동안 나노입자의 재형성을 방지하기 위해 예를 들어 0.05%(w/v) SDS 또는 0.05%(w/v) ZW를 함유하는 액상으로 수행되었다. 용해된 LPX의 분리는 프락토그램에서 UV 신호의 증가와 함께 LS 피크의 감소를 초래하였다(도 19c). 네이키드 대조 RNA의 UV 신호(도 19a)는 입자로부터 방출된 RNA의 기록된 UV 신호(도 19c)와 견줄만하였다.
따라서, 용해된 LPX의 수득한 UV 피크 면적은 입자 제형의 총 RNA 농도(mg/mL)로 직접 번역될 수 있다. 두 RNA 모두에 대해 동일한 소광 계수를 사용하여 mg/mL로 계산된 농도는 네이키드 대조군 및 LPX에서 방출된 RNA에 대해 견줄만한 결과를 보여준다(도 19d).
결과는, AF4 방법이 유리 RNA의 양의 결정뿐만 아니라 RNA 및 입자를 포함하는 조성물 중 RNA의 총량의 정량화를 허용함을 나타낸다.
실시예 17 - 샘플 조성물에서 유리 RNA 및 전체 RNA의 무결성 측정
이 실시예는 본 명세서에 개시된 AF4 방법을 사용하여 RNA 및 입자를 함유하는 샘플 조성물에서 유리 RNA 및 총 RNA의 무결성의 결정을 예시한다.
도 20a는 AF4 방법을 사용하여 RNA 무결성이 상이한 RNA를 갖는 분리된 입자의 UV 자취를 보여준다 (미처리 RNA: 검은색 실선, 부분적으로 열분해된 RNA: 점선; 혼합물(정의된 방식으로 혼합, 미처리 50% 및 완전 분해 50%) 완전히 분해된 비율(%): 파선, 입자에서 완전히 분해된 RNA: 회색 실선). 도 20b는 온전한 유리 RNA(어두운 회색) 및 입자에서 전체(검은색) 및 완전히 분해된(밝은 회색) 유리 RNA의 정량화를 도시한다. 도 20c는 AF4 분리 후 용해된 입자의 UV 흔적(액상에서 방출제 사용)을 보여준다. 도 20d는 입자 내 유리 및 전체 RNA의 AF4-UV 측정에 의해 분석된 결정된 무결성을 도시한다. 막대 다이어그램은 입자(검은색 막대)에서 결정된 총 RNA 값의 무결성과 비교하여 유리 RNA(회색 막대)의 상대적 RNA 무결성을 나타낸다.
RNA 무결성은 상기에서 언급한 중요한 품질 파라미터이다. 이 실시예는 AF4 방법을 사용하여 다른 방법(예를 들어, 모세관 전기영동)으로는 달성할 수 없는 네이키드 RNA 및 총 RNA의 무결성을 결정할 수 있음을 입증한다.
도 20a는 서로 상이한 분해된 RNA(비분해에서 열분해로)로 제조된 LPX의 중첩된 UV 프락토그램을 보여준다. 온전한 미처리 RNA는 13 내지 25분(유리 RNA) 및 25 내지 60분(나노입자)에서 용리되는 2개의 별개의 피크를 제공하였다. 완전히 분해된 RNA(98℃, 16h)는 0 내지 10분(자유 분해 RNA) 및 22 내지 50분에 2개의 별개의 피크가 있는 회색 실선으로 표시된다. 미처리 RNA와 완전히 분해된 RNA의 혼합물(미처리 RNA의 50%와 완전히 분해된 RNA의 50%를 혼합하여 제조됨)은 0 내지 10분(유리 분해 RNA), 13 내지 25분(자유 온전한 RNA) 및 25 내지 55분(나노입자)에서 3개의 별개 피크가 있는 점선으로 표시된다. 추가 샘플 조성물은 부분적으로 분해된 RNA(98℃에서 15분 동안 열처리된 RNA) 및 LPX로 구성되었다. 이들 샘플 조성물은 AF4 방법으로 분리하고 UV 검출을 사용하여 분석되었다. 분리된 LPX의 UV 신호는 검은색 점선으로 표시되며 5 내지 25분(유리 RNA, 부분적으로 분해됨) 및 25 내지 55분(LPX)에서 2개의 별개의 피크로 표시된다. 자유 온전한 RNA의 양의 차이는 RNA의 분해 정도에 상응하는 도 20b에 도시되어 있다. 완전히 분해된 RNA를 포함하는 LPX 조성물의 경우, 온전한 유리 RNA가 검출되지 않은 반면, 혼합물을 포함하는 샘플 조성물은 22%의 유리 온전한 RNA를 함유하고 미처리 RNA를 포함하는 샘플 조성물은 52%의 유리 온전한 RNA를 함유하였다. 유리 RNA의 총량을 살펴보면 거의 비슷한 결과가 관찰되었다. RNA 분해가 증가함에 따라 유리 RNA의 약간의 증가(55 내지 60%)가 관찰되었다. 그러나, 혼합물을 포함하는 샘플 조성물에서 유리 RNA의 무결성은 예상대로 더 낮으며(50%), 이는 완전히 분해된 RNA와 비교하여 온전한 RNA와 양이온성 지질의 바람직한 상호작용을 나타낸다. 완전히 분해된 RNA의 무결성은 제형에서 더 많은 양의 유리 분해된 RNA로 인해 유리 RNA의 무결성에 영향을 미친다(12%, 도 20). 이러한 발견(더 높은 총 RNA 무결성 값, 온전한 RNA와 분해된 RNA의 혼합물에서 낮은 유리 RNA 무결성)은 양이온성 지질에 대한 온전한 RNA의 바람직한 결합을 나타내는 반면, 혼합물은 비슷한 것으로 보이다.
도 20c는 방출제를 포함하는 상응하는 LPX 샘플 조성물의 중첩된 UV 프락토그램을 보여준다. 모든 LPX 입자에 대한 더 높은 용리 시간에서 UV 피크는 사라지고 결합된 RNA의 용리 시간은 유리 RNA의 용리 시간으로 이동하였다.
따라서, 이 실시예는 본 명세서에 기재된 AF4 방법이 LPX에서 RNA의 상이한 분획(유리, 결합, 총)을 분리하고 분획화된 RNA의 무결성을 결정할 수 있음을 입증한다. 또한 AF4 방법을 사용하면 단일 실시에서 입자의 RNA 무결성과 RNA 양(UV 검출 기반)을 동시에 계산할 수 있다. 이러한 파라미터의 동시 분석은 다른 기존 기술로는 달성할 수 없다.
실시예 18 - 샘플 조성물에서 유리되고 접근 가능하며 캡슐화된 RNA의 결정
이 실시예는 본 명세서에 개시된 AF4 방법을 사용하여 샘플 조성물에서 유리되고 접근 가능하며 캡슐화된 RNA의 결정을 설명한다.
AF4 방법의 형광 검출의 선형성이 도 22a에 도시되어 있다: 상이한 양의 RNA(0 mM 대 100 mM의 NaCl)가 본원에 기재된 AF4 방법에 의해 주입 및 분리되었다. 주입 전에 형광 검출(600 nm)을 위해 삽입작용 염료(GelRED)를 RNA에 첨가하였다. 도 22b는 NaCl(100 mM)이 있거나 없는 LPX 조성물에서 접근 가능한(검은색 막대) 및 캡슐화된(회색 막대) RNA의 상대적인 양을 보여주는 막대 다이어그램을 도시한다. 형광 방출 신호의 검출을 위해, LPX 형성 전 또는 후에 삽입작용 염료(GelRED; 600 nm)를 첨가하였다. 도 22c는 본 명세서에 개시된 AF4 방법 및 도 21에 도시된 반응식을 사용하여 입자 조성물(LPX)에서 유리 RNA의 상대적인 양의 비교를 보여주고, 여기서 양은 상이한 RNA 검출을 사용하여 결정되었다: 260 nm에서 UV 흡수(검은색 막대) 및 600 nm에서 형광 방출 신호(FS)(회색 막대).
실시예 19 - 참조 RNA를 사용하지 않고 RNA 무결성의 분석
이 실시예는 참조 RNA를 사용하지 않고 본 명세서에 개시된 AF4 방법을 사용하여 RNA, 특히 긴 saRNA의 (상대적) 무결성을 추정하기 위한 절차의 개요를 제공한다.
11,917 nt의 길이를 갖는 saRNA에 본 명세서에 개시된 AF4 방법을 적용하였다. 도 23a는 90°에서 LS 신호(점선) 및 260 nm에서 UV 신호(실선)를 갖는 saRNA의 예시적인 AF4 프락토그램을 보여준다. 굵은 어두운 선은 MALS 신호에서 파생된 분자량 곡선을 나타낸다. 도 23b에서, 더 나은 개요를 위해, 도 23a의 분자량 곡선만 도 23b의 상부 패널에 실선으로 표시된다. 총 RNA 피크(피크 1)에 대한 한계는 총 UV 피크 신호를 기반으로 설정되었다(즉, t = 10분에서 t = 40분까지). 여기에서 "온전한" RNA 피크(피크 2)에 대한 한계는 다음과 같이 분자량 곡선(MALS에서 파생됨)의 1차 도함수에 의해 설정되었다. 분자량 곡선으로부터의 1차 도함수가 계산되었다(도 23b의 하부 패널에서 점선). 분자량 곡선의 거의 수평 부분은 미분해 RNA의 분획이 존재하는 체류 시간을 반영한다. 이를 기반으로, 통합 한계를 선택하였고 샘플에서 미분해 RNA의 양을 계산하였다.
실시예 20 - 입자 크기 분포, 누적 RNA 중량 분율, LPX 분획의 RNA 질량, 및 LPX 분획당 RNA 카피의 결정을 위해 UV를 사용한 유리 및 결합 RNA의 정량 분석
RNA 리포플렉스(LPX) 샘플 조성물에 본 명세서에 개시된 AF4 방법을 적용하였다. 도 24a는 90°에서 LS 신호(실선) 및 260 nm에서 UV 신호(점선)를 갖는 상기 RNA LPX 샘플 조성물에 대한 대표적인 AF4 프락토그램을 보여준다. UV 신호는 2개의 피크를 나타내며, 여기서 제1 피크는 미결합 유리 RNA의 양을 나타내고 제2 피크는 RNA를 포함하는 LPX 나노입자의 결과이다. UV 신호는 용리 시간의 함수로서 상이한 분획의 RNA 양을 직접적으로 나타낸다. 회전 반경(Rg, 굵은 선)은 MALS 신호에서 파생되었다.
도 24b는 도 24a의 260 nm에서의 UV 신호(점선)와 실선으로 UV 신호 아래의 면적을 기반으로 한 누적 중량 분율을 보여준다. 미결합 RNA의 절대 정량화를 위해, 곡선 아래의 제1 피크 면적을 특정 RNA 소광 계수와 함께 사용하여 미결합 RNA 분획의 양을 계산하였다. 따라서 제1 피크는 미결합 RNA의 절대량으로 정량적으로 번역될 수 있다(본 명세서에서: 1.4 μg; 36 μg/mL). 미결합 RNA 분획의 상대적인 양(36%)은 총 RNA(실선)와 관련하여 RNA LPX 샘플 조성물에서 미결합 RNA의 절대량(μg)을 연관시켜 얻을 수 있다. 이 값의 타당성은 두 가지 추가 직교 방법(아가로스 겔 전기영동 분석 및 원심분리 분석)에 의해 확인되었다. 미결합 RNA 값이 36%임을 확인함으로써, 결과적으로, LPX 분획에 남아있는 RNA(3.66 μg; 64 μg/mL)가 결합되었다. 이는 AF4 프락토그램의 직접적인 UV 데이터가 100%에 가까운 회수율로 입자 내의 RNA와 정량적으로 일치함을 나타낸다. 입자로부터의 더 강한 산란이 역할을 하는 경우, 정량적으로 결정된 유리 RNA와 다른 측정에서 수득한 유리 RNA 분획의 데이터를 사용하여 입자에 대한 UV 피크를 스케일링할 수 있다.
도 24c는 상이한 Rg 분획(Δt = 1분)에서 260 nm에서의 흡수를 사용하여 RNA LPX 샘플 조성물에 결합 RNA 양을 보여준다. 나노 입자는 확산 계수에 따라 분리되었으며 회전 반경(Rg)은 Barry 플롯을 사용하여 MALS에서 파생되었다. 상이한 Rg 분획의 RNA 양의 계산을 위해, LPX 피크(즉, t = 내지 24분에서 시작하여 t = 내지 60분에서 끝나는 도 24a 및 b의 제2 피크)만 사용되었다. 도 24d는 도 24c에 제시된 결과로부터 계산된 Rg 분획(막대, 왼쪽 y축)당 계산된 RNA 카피의 수를 보여준다. Rg 분획당 계산된 입자 수는 해당 점선 곡선으로 표시된다.
이 실시예는, 본 명세서에 기재된 AF4 방법이 단일 실시에서 RNA LPX 샘플 조성물의 누적 RNA 중량 분율(도 24b 참조), LPX 분획의 RNA 질량(도 23c 참조), LPX 분획당 RNA 카피 (도 23d의 막대 참조) 및 LPX 분획당 입자 수 (도 23d의 점선 곡선 참조)를 동시에 결정할 수 있다. 이러한 파라미터의 동시 결정은 다른 기존 기술로는 달성할 수 없다.
실시예 21 - AF4 방법에서 원형 2색성(CD) 분광법의 사용
이 실시예는 또한, CD 분광법이 UV 신호를 측정하기 위해 본 명세서에 개시된 AF4 방법에서 사용될 수 있음을 입증한다.
RNA 리포플렉스(LPX) 샘플 조성물은 UV 신호를 측정하기 위한 수단으로서 CD 분광법을 사용하여 본 명세서에 개시된 AF4 방법에 적용되었다. 도 25a는 90°각도에서의 LS 신호(실선) 및 260 nm에서 기록된 CD 신호(점선)를 갖는 RNA LPX 샘플 조성에 대한 대표적인 AF4 프락토그램을 보여주고, 여기서 후자는 미결합 RNA(제1 피크, t = 18분) 및 결합 RNA(제2 피크, t = 35분)를 나타낸다.
도 25b는 나노입자 제형에서 유리 및 결합 RNA의 정량화를 위해 본 명세서에 개시된 AF4 방법에서 CD 검출의 적합성을 보여준다. UV 및 260 nm에서의 CD 검출을 병렬로 사용하여 네이키드 RNA의 보정 곡선을 생성하였다. 곡선 아래의 피크 영역(CD: 채워진 정사각형 및 실선, UV: 채워진 삼각형 및 파선)은 주입된 RNA 양에 대해 플롯팅되었다. CD 및 UV 신호의 피크 면적 비율은 점(제2 오른쪽 y축)으로 표시된다. CD 신호 영역의 값은 양호한 선형성(R2 = 0.999)에 적합하며 RNA (및 UV 신호)의 양에 정비례하는 것으로 밝혀졌다. CD 및 UV 신호의 피크 면적 비율은 넓은 보정 범위(4 내지 20 μg)에서 일정한 거동을 나타낸다. 따라서 이 실시예는 CD가 나노입자에서 RNA(유리 및 결합)의 양을 정량화하는 데에도 사용될 수 있음을 입증한다.
도 25c는 본 명세서에 개시된 AF4 방법에서 CD 검출을 사용한 유리 및 결합 RNA의 정량화를 보여준다. 적절한 네이키드 RNA로부터의 CD 신호의 곡선 아래 면적(AUC)은 적절한 총 AUC CD 신호와 상관관계가 있었다. 상이한 양의 RNA LPX 샘플 조성물(2 내지 15 μg)에 AF4 방법을 적용하고 각각의 CD 피크 AUC에 대해 플롯팅하고 값을 선형으로 적합화하였다(R2 = 0.998). CD 신호 영역은 결합 RNA 뿐만 아니라 유리된 RNA의 양에 정비례하는 것으로 밝혀졌다. RNA LPX 샘플 조성물에서 미결합 RNA(채워지지 않은 정사각형) 및 결합 RNA(채워지지 않은 원)의 상대적인 양(%)은 전체 RNA 양에 대한 미결합 RNA 및 결합 RNA의 양을 상관시켜 결정하였다. 미결합 RNA 분획에 대한 결합의 상대적 비율은 표시된 보정 범위에서 일정하다.

Claims (72)

  1. 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하는 방법으로서, 샘플 조성물은 RNA 및 선택적으로 입자를 포함하고,
    (a) 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여, 샘플 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 샘플 분획을 생성하는 단계;
    (b) 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 적어도 하나의 UV 신호, 및 선택적으로 광산란(LS) 신호를 측정하는 단계; 및
    (c) UV 신호 및 선택적으로 LS 신호로부터 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계를 포함하고,
    상기 1개 이상의 파라미터는 RNA 무결성, RNA의 총량, 유리 RNA의 양, 입자에 결합 RNA의 양, RNA 함유 입자의 크기, RNA 함유 입자의 크기 분포, 및 RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 필드-유동 분획화는 비대칭 유동 필드-유동 분획화(AF4) 또는 중공 섬유 유동 필드-유동 분획화(HF5)과 같은 유동 필드-유동 분획화인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계(a)는 RNA가 멤브레인을 투과하는 것을 방지하는 데 적합한 분자량(MW) 컷-오프를 갖는 멤브레인, 바람직하게는 바람직하게는 2 kDa 내지 30 kDa 범위의 MW 컷-오프, 예컨대 10 kDa의 MW 컷-오프를 갖는 멤브레인을 사용하여 수행되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(a)는 폴리에테르설폰(PES) 또는 재생 셀룰로오스 멤브레인을 사용하여 수행되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(a)는 최대 8 mL/분, 바람직하게는 최대 4 mL/분, 더 바람직하게는 최대 2 mL/분의 교차 유량을 사용하여 수행되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(a)는 하기 교차 유량 프로파일을 사용하여 수행되는, 방법: 10분 동안 1.0 내지 2.0 mL/분, 30분 이내에 1.0 내지 2.0 mL/분에서 0.01 내지 0.07 mL/분의 지수 구배; 30분 동안 0.01 내지 0.07 mL/분; 및 10분 동안 0 mL/분.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(a)는 0.05 내지 0.35 mL/분 범위, 바람직하게는 0.10 내지 0.30 mL/분 범위, 더욱 바람직하게는 0.15 내지 0.25 mL/분 범위의 주입 흐름을 사용하여 수행되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(a)는 0.30 내지 0.70 mL/분 범위, 바람직하게는 0.40 내지 0.60 mL/분 범위, 더욱 바람직하게는 0.45 내지 0.55 mL/분 범위의 검출기 유동을 사용하여 수행되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 대조 RNA의 무결성을 사용하여 계산되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 대조 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 결정되는, 방법:
    (a') 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
    (b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신-호를 측정하는 단계;
    (c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 최대 높이에서 UV 피크 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)를 수득하는 단계;
    (c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
    (c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 RNA(I(대-조군))의 무결성을 수득하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산되는, 방법:
    (c1) 단계(b)에서 수득한 샘플 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV 피크의 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
    (c2) 단계(b)에서 수득한 샘플 UV 신호로부터 단계(c1)에서 사용된 샘플 UV 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(샘플)를 수득하는 단계;
    (c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
    (c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
  12. 제9항에 있어서, 대조 RNA의 무결성을 계산하는 단계는 다음의 단계들에 의해 결정되는, 방법:
    (a") 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
    (b") 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계; 및
    (c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산되는, 방법:
    (c1') 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 높이(H(샘플))를 결정하는 단계; 및
    (c2') H(샘플) 및 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, RNA의 양은 (i) RNA 소광 계수 또는 (ii) RNA 보정 곡선을 사용하여 결정되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 조성물은 RNA 및 입자, 예컨대 리포플렉스 입자 및/또는 지질 나노입자 및/또는 폴리플렉스 입자 및/또는 리포폴리플렉스 입자 및/또는 바이러스 유사 입자를 포함하고, 이에 RNA가 결합되는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 총 RNA의 양은 (i) 샘플 조성물의 적어도 일부를 방출제로 처리하고; (ii) 단계(i)에서 수득한 적어도 일부로 단계(a) 내지 (c)를 수행하고; 그리고 (iii) 제14항에 명시된 RNA의 양을 결정함으로써 결정되는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 단계(a)에서 필드-유동-분획화는 방출제를 함유하는 액상을 사용하여 수행되는, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 방출제는 (i) 계면활성제, 예컨대 음이온성 계면활성제 (예를 들어, 나트륨 도데실설페이트), 쯔비터이온성 계면활성제 (예를 들어, n-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트 (Zwittergent® 3-14)), 양이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, 또는 그의 혼합물; (ii) 알코올, 예컨대 지방족 알코올 (예를 들어, 에탄올), 또는 알코올의 혼합물; 또는 (iii) (i)과 (ii)의 조합인, 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 유리 RNA의 양은 방출제의 첨가 없이, 특히 임의의 방출제의 부재 하에 단계(a) 내지 (c)를 수행하고; 그리고 제14항에 명시된 RNA의 양을 결정함으로써 결정되는, 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 입자에 결합 RNA의 양은 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 의해 결정된 총 RNA의 양에서 제19항에 의해 결정된 유리 RNA의 양을 빼서 결정되는, 방법.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 LS 신호, 예컨대 동적 광산란 (DLS) 신호 및/또는 정적 광산란 (SLS), 예를 들어, 다중각 광산란 (MALS), 신호를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, RNA 함유 입자의 크기는 단계(b)에서 수득한 LS 신호로부터 회전 반경(Rg) 값 및/또는 유체역학적 반경(Rh) 값을 계산함으로써 결정되는, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 실험적으로 결정된 Rg 및/또는 Rh 값은 바람직하게는 실험적으로 결정된 또는 계산된 Rg 또는 Rh 값을 다항식 또는 선형 함수로 적합화하고 다항식 또는 선형 적합에 기초하여 Rg 또는 Rh 값을 계산함으로써 평활화되는, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 함유 입자의 크기 분포는 제22항에 명시된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)에서 수득한 UV 신호를 플롯팅함으로써 결정되는, 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV 신호를 누적 중량 분율로 변환하고 Rg 또는 Rh 값에 대한 누적 중량 분율을 플롯팅함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산되는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 정량적 크기 분포는 D10, D50, 및/또는 D90 값을 포함하는, 방법.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 동적 광산란(DLS) 신호를 측정하는 단계를 포함하고, 그리고 단계(c)는 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 파라미터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3개의 파라미터를 포함하거나 그 파라미터인, 방법: 유리 RNA의 양, 입자에 결합 RNA의 양, RNA 함유 입자의 크기 분포, 및 RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포.
  29. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, RNA, 특히 유리 RNA의 양은 260 nm에서 UV 신호를 측정하고 260 nm에서 RNA 소광 계수를 사용하거나, 또는 280 nm에서 UV 신호를 측정하고 280 nm에서 RNA 소광 계수를 사용함으로써 결정되는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 함유 입자의 크기 분포 및/또는 RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 10 내지 2000 nm의 범위 내, 바람직하게는 20 내지 1500 nm, 예컨대 30 내지 1200 nm, 40 내지 1100 nm, 50 내지 1000, 60 내지 900 nm, 70 내지 800 nm, 80 내지 700 nm, 90 내지 600 nm, 또는 100 내지 500 nm의 범위 내, 예컨대 10 내지 1000 nm, 15 내지 500 nm, 20 내지 450 nm, 25 내지 400 nm, 30 내지 350 nm, 40 내지 300 nm, 또는 50 내지 250 nm의 범위 내인, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, RNA는 10 내지 15,000개의 뉴클레오타이드, 예컨대 40 내지 15,000개의 뉴클레오타이드, 100 내지 12,000개의 뉴클레오타이드 또는 200 내지 10,000개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, RNA는 시험관내 전사된 RNA, 특히 시험관내 전사된 mRNA인, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, UV 신호, 선택적으로 LS 신호, 예컨대 SLS, 예를 들어, MALS, 신호 및/또는 DLS 신호는, 온라인으로 수행되고/되거나 단계(c)의 측정은 온라인으로 수행되는, 방법.
  34. 제15항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 조성물의 적어도 일부에 대해 필드-유동 분획화를 수행하기 전에, 샘플 조성물의 적어도 일부는 용매 또는 용매 혼합물로 희석되고, 상기 용매 또는 용매 혼합물은 입자의 응집체 형성을 방지할 수 있는, 방법.
  35. 제36항에 있어서, 용매 혼합물은 물과 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 혼합물인, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 UV 신호의 측정은 원형 2색성 (CD) 분광법을 사용하여 수행되는, 방법.
  37. RNA 및 선택적으로 입자를 포함하는 조성물을 제공할 때, 하나 이상의 반응 조건을 변경하는 효과를 분석하는 방법으로서, 다음의 단계들을 포함하는, 방법:
    (A) RNA 및 선택적으로 입자를 포함하는 제1 조성물을 제공하는 단계;
    (B) RNA 및 선택적으로 입자를 포함하는 제2 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 제2 조성물의 제공은 하나 이상의 반응 조건에서만 제1 조성물의 제공과 상이한 것인 단계;
    (C) 제1 조성물의 일부를 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 방법에 적용하여, 제1 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하는 단계;
    (D) 제2 조성물의 상응하는 부분을 단계(C)에서 사용된 방법에 적용하여, 제2 조성물의 하나 이상의 파라미터를 결정하는 단계; 및
    (E) 단계(C)에서 수득한 제1 조성물의 하나 이상의 파라미터를 단계(D)에서 수득한 제2 조성물의 상응하는 하나 이상의 파라미터와 비교하는 단계.
  38. 제37항에 있어서, 하나 이상의 반응 조건은 다음 중 임의의 것을 포함하는, 방법: 염 농도/이온 강도 (예를 들어, 2 mM의 NaCl 또는 100 mM의 NaCl); 온도 (예를 들어, 저온 (예컨대 -20℃) 또는 고온 (예컨대 50℃)); pH 또는 완충액 농도; 광/방사선; 산소; 전단력; 압력; 동결/해동 주기; 건조/재구성 주기; 부형제(들) (예를 들어, 안정화제 및/또는 킬레이트화제)의 첨가; 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체, 예를 들어, 양이온성 지질 대 쯔비터이온성 지질, 또는 페길화된 지질 대 비페길화된 지질)의 유형 및/또는 공급원; 전하 비율; 물리적 상태; 및 RNA 대 입자 형성 화합물 (특히 지질 및/또는 중합체)의 비.
  39. RNA 및 선택적으로 입자를 포함하는 샘플 조성물의 1개 이상의 파라미터를 결정하기 위한 필드-유동-분획화의 용도로서, 상기 1개 이상의 파라미터는 RNA 무결성, RNA의 총량, 유리 RNA의 양, 입자에 결합 RNA의 양, RNA 함유 입자의 크기(예컨대 RNA 함유 입자의 유체역학적 반경), RNA 함유 입자의 크기 분포, 및 RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포를 포함하는, 용도.
  40. 제39항에 있어서, 필드-유동 분획화는 다음을 포함하는, 용도:
    (a) 샘플 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화에 적용하여, 샘플 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 샘플 분획을 생성하는 단계;
    (b) 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 적어도 하나의 UV 신호, 및 선택적으로 광산란(LS) 신호를 측정하는 단계; 및
    (c) UV 신호 및 선택적으로 LS 신호로부터 1개 이상의 파라미터를 계산하는 단계.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 필드-유동 분획화는 비대칭 유동 필드-유동 분획화(AF4) 또는 중공 섬유 유동 필드-유동 분획화(HF5)과 같은 유동 필드-유동 분획화인, 용도.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 필드-유동-분획화는 RNA가 멤브레인을 투과하는 것을 방지하는 데 적합한 분자량(MW) 컷-오프를 갖는 멤브레인, 바람직하게는 바람직하게는 2 kDa 내지 30 kDa 범위의 MW 컷-오프, 예컨대 10 kDa의 MW 컷-오프를 갖는 멤브레인을 사용하는, 용도.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 필드-유동-분획화는 폴리에테르설폰 (PES) 또는 재생 셀룰로스 멤브레인을 사용하는, 용도.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(a)는 하기를 사용하여 수행되는, 용도:
    (I) 최대 0 내지 8 mL/분, 바람직하게는 최대 4 mL/분, 더 바람직하게는 최대 2 mL/분의 교차 유량, 예컨대 다음의 교차 유량 프로파일: 10분 동안 1.0 내지 2.0 mL/분, 30분 이내에 1.0 내지 2.0 mL/분에서 0.01 내지 0.07 mL/분의 지수 구배; 30분 동안 0.01 내지 0.07 mL/분; 및 10분 동안 0 mL/분; 및/또는
    (II) 0.05 내지 0.35 mL/분 범위, 바람직하게는 0.10 내지 0.30 mL/분 범위, 더욱 바람직하게는 0.15 내지 0.25 mL/분 범위의 주입 흐름; 및/또는
    (III) 0.30 내지 0.70 mL/분 범위, 바람직하게는 0.40 내지 0.60 mL/분 범위, 더 바람직하게는 0.45 내지 0.55 mL/분 범위의 검출기 유동.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 대조 RNA의 무결성을 사용하여 결정되는, 용도.
  46. 제45항에 있어서, 대조 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 결정되는, 용도:
    (a') 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
    (b') 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계;
    (c'1) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 최대 높이에서 UV 피크 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(대조군)를 수득하는 단계;
    (c'2) 단계(b')에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 하나의 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(대조군)를 수득하는 단계; 및
    (c'3) A50%(대조군)와 A100%(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 대조 RNA(I(대조군))의 무결성을 수득하는 단계.
  47. 제46항에 있어서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산되는, 용도:
    (c1) 단계(b)에서 수득한 샘플 UV 신호로부터 단계(c'1)에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 최대 높이로부터 샘플 UV 피크의 끝까지의 면적을 계산하여, A50%(샘플)를 수득하는 단계;
    (c2) 단계(b)에서 수득한 샘플 UV 신호로부터 단계(c1)에서 사용된 샘플 UV 피크의 총 면적을 계산하여, A100%(샘플)를 수득하는 단계;
    (c3) A50%(샘플)과 A100%(샘플) 사이의 비율을 결정하여, I(샘플)를 수득하는 단계; 및
    (c4) I(샘플)과 I(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
  48. 제45항에 있어서, 대조 RNA의 무결성을 계산하는 단계는 다음의 단계들에 의해 결정되는, 용도:
    (a") 대조 RNA를 함유하는 대조 조성물의 적어도 일부를 필드-유동 분획화, 특히 AF4 또는 HF5에 적용하여, 대조 조성물에 함유된 성분을 크기별로 분획화하여 하나 이상의 대조 분획을 생성하는 단계;
    (b") 단계(a')에서 수득한 하나 이상의 대조 분획 중 적어도 하나의 UV 신호를 측정하는 단계; 및
    (c") 단계(b")에서 수득한 UV 신호로부터 하나의 UV 피크의 높이(H(대조군))를 결정하여, 대조 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
  49. 제48항에 있어서, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성은 다음의 단계들에 의해 계산되는, 용도:
    (c1') 단계(b)에서 수득한 UV 신호로부터 단계(c")에서 사용된 대조 UV 피크에 상응하는 샘플 UV 피크의 높이(H(샘플))를 결정하는 단계; 및
    (c2') H(샘플) 및 H(대조군) 사이의 비율을 결정하여, 샘플 조성물에 함유된 RNA의 무결성을 수득하는 단계.
  50. 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, RNA의 양은 (i) RNA 소광 계수 또는 (ii) RNA 보정 곡선을 사용하여 결정되는, 용도.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 조성물은 RNA 및 입자, 예컨대 리포플렉스 입자 및/또는 지질 나노입자 및/또는 폴리플렉스 입자 및/또는 리포폴리플렉스 입자 및/또는 바이러스 유사 입자를 포함하고, 이에 RNA가 결합되는, 용도.
  52. 제51항에 있어서, 총 RNA의 양은 (i) 샘플 조성물의 적어도 일부를 방출제로 처리하고; (ii) 단계(i)에서 수득한 적어도 일부로 단계(a) 내지 (c)를 수행하고; 그리고 (iii) 제50항에 명시된 RNA의 양을 결정함으로써 결정되는, 용도.
  53. 제52항에 있어서, 단계(a)에서 필드-유동-분획화는 방출제를 함유하는 액상을 사용하여 수행되는, 용도.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 방출제는 (i) 계면활성제, 예컨대 음이온성 계면활성제 (예를 들어, 나트륨 도데실설페이트), 쯔비터이온성 계면활성제 (예를 들어, n-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트 (Zwittergent® 3-14)), 양이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, 또는 그의 혼합물; (ii) 알코올, 예컨대 지방족 알코올 (예를 들어, 에탄올), 또는 알코올의 혼합물; 또는 (iii) (i)과 (ii)의 조합인, 용도.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 유리 RNA의 양은 방출제의 첨가 없이, 특히 임의의 방출제의 부재 하에 단계(a) 내지 (c)를 수행하고; 그리고 제14항에 명시된 RNA의 양을 결정함으로써 결정되는, 용도.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 입자에 결합 RNA의 양은 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 의해 결정된 총 RNA의 양에서 제55항에 의해 결정된 유리 RNA의 양을 빼서 결정되는, 용도.
  57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 LS 신호, 예컨대 동적 광산란 (DLS) 신호 및/또는 정적 광산란 (SLS), 예를 들어, 다중각 광산란 (MALS), 신호를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 용도.
  58. 제57항에 있어서, RNA 함유 입자의 크기는 단계(b)에서 수득한 LS 신호로부터 회전 반경(Rg) 값 및/또는 유체역학적 반경(Rh) 값을 계산함으로써 결정되는, 용도.
  59. 제58항에 있어서, 실험적으로 결정된 Rg 및/또는 Rh 값은 바람직하게는 실험적으로 결정된 또는 계산된 Rg 또는 Rh 값을 다항식 또는 선형 함수로 적합화하고 다항식 또는 선형 적합에 기초하여 Rg 또는 Rh 값을 계산함으로써 평활화되는, 용도.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 함유 입자의 크기 분포는 제58항에 특정된 바와 같이 결정된 Rg 또는 Rh 값에 대해 단계(b)에서 수득한 UV 신호를 플롯팅함으로써 결정되는 용도.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 UV 신호를 누적 중량 분율로 변환하고 Rg 또는 Rh 값에 대한 누적 중량 분율을 플롯팅함으로써 Rg 또는 Rh 값의 함수로서 UV 신호를 나타내는 플롯으로부터 계산되는, 용도.
  62. 제61항에 있어서, 상기 정량적 크기 분포는 D10, D50, 및/또는 D90 값을 포함하는, 용도.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(b)는 단계(a)에서 수득한 하나 이상의 샘플 분획 중 적어도 하나의 동적 광산란(DLS) 신호를 측정하는 단계를 포함하고, 그리고 단계(c)는 DLS 신호로부터 Rh 값을 계산하는 단계를 포함하는, 용도.
  64. 제51항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 파라미터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3개의 파라미터를 포함하거나 그 파라미터인, 용도: 유리 RNA의 양, 입자에 결합 RNA의 양, RNA 함유 입자의 크기 분포, 및 RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포.
  65. 제51항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, RNA, 특히 유리 RNA의 양은 260 nm에서 UV 신호를 측정하고 260 nm에서 RNA 소광 계수를 사용하거나, 또는 280 nm에서 UV 신호를 측정하고 280 nm에서 RNA 소광 계수를 사용함으로써 결정되는, 용도.
  66. 제39항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 함유 입자의 크기 분포 및/또는 RNA 함유 입자의 정량적 크기 분포는 10 내지 2000 nm의 범위 내, 바람직하게는 20 내지 1500 nm, 예컨대 30 내지 1200 nm, 40 내지 1100 nm, 50 내지 1000, 60 내지 900 nm, 70 내지 800 nm, 80 내지 700 nm, 90 내지 600 nm, 또는 100 내지 500 nm의 범위 내, 예컨대 10 내지 1000 nm, 15 내지 500 nm, 20 내지 450 nm, 25 내지 400 nm, 30 내지 350 nm, 40 내지 300 nm, 또는 50 내지 250 nm의 범위 내인, 용도.
  67. 제39항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, RNA는 10 내지 15,000개의 뉴클레오타이드, 예컨대 40 내지 15,000개의 뉴클레오타이드, 100 내지 12,000개의 뉴클레오타이드 또는 200 내지 10,000개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 용도.
  68. 제39항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, RNA는 시험관내 전사된 RNA, 특히 시험관내 전사된 mRNA인, 용도.
  69. 제40항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, UV 신호, 선택적으로 LS 신호, 예컨대 SLS, 예를 들어, MALS, 신호 및/또는 DLS 신호는, 온라인으로 수행되고/되거나 단계(c)의 측정은 온라인으로 수행되는, 용도.
  70. 제40항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 조성물의 적어도 일부에 대해 필드-유동 분획화를 수행하기 전에, 샘플 조성물의 적어도 일부는 용매 또는 용매 혼합물로 희석되고, 상기 용매 또는 용매 혼합물은 입자의 응집체 형성을 방지할 수 있는, 용도.
  71. 제70항에 있어서, 용매 혼합물은 물과 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 혼합물인, 용도.
  72. 제40항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 UV 신호의 측정은 CD 분광법을 사용하여 수행되는, 용도.
KR1020227000843A 2019-07-18 2020-07-17 Rna와 같은 핵산 및 선택적으로 입자를 포함하는 샘플 조성물의 적어도 하나의 파라미터를 결정하기 위한 방법 KR20220035109A (ko)

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