KR20220031003A - 온-칩 가스 공급을 위한 원심 미세유체 칩, 키트 및 시스템 - Google Patents

온-칩 가스 공급을 위한 원심 미세유체 칩, 키트 및 시스템 Download PDF

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Abstract

온-칩 챔버가 칩의 다른 챔버에 가습 제어, 또는 더 일반적으로 가스 조성 제어를 제공하게 하는 원심 미세유체 칩이 제공된다. 이는 다중 포트 공압 칩 제어기, 단일 또는 다중 포트 공압 슬립 링, 및 공압 슬립 링이 있는 관절식 원심 블레이드와 같은 저렴하고 효율적인 원심 장치를 사용하여 미세 유체 배양을 허용한다. 상기 장치는 세포 배양, 미생물 테스트 또는 제어된 미세 환경에서 생물학적 샘플로부터 화학 종의 생산에 사용될 수 있다.

Description

온-칩 가스 공급을 위한 원심 미세유체 칩, 키트 및 시스템
본 발명은 일반적으로 원심 미세유체 칩의 챔버에 대한 제어된 가스 공급에 관한 것이며, 특히 조절된 챔버를 갖는 칩 및 챔버에 커플링된 3 개의 저장소를 갖는 칩에 관한 것이며, 3 개의 저장소는 제 1 저장소가 조절된 챔버에 가스를 공급하게 하고 제 2 저장소가 액체를 공급하게 하고, 제 3 저장소가 조절된 챔버로부터의 출력물을 수용하게 하는 레이아웃으로 챔버에 커플링된다.
미세유체 처리에는 많은 진부한 장점이 있다. 샘플와 시약의 아낌없는 사용, 및 아주 작은 공간에서의 시험/반응/배양 등이 있다. 많은 용례에서는 조절된 챔버의 액상 및 고상 모두의 조성 및 가능하면 온도 및/또는 압력에 관한 제어가 필요하다. 예를 들어, 미생물 테스트, 생산 또는 반응기 챔버에서, 조절된 챔버 내에 위의 어느 하나를 잠재적으로 포함하는 미생물(세포, 소기관, 박테리아, 바이러스, 고세균, 진균, 원생동물, 오르가노이드(organoid) 또는 소조직 생검(small tissue biopsy)), 또는 식품이나 수성 샘플에는 미생물을 처리, 시험, 가공 또는 배양하기 위해 가스의 조성, 온도 및 압력을 또한 제어하면서 액체(영양소, 촉매 또는 반응물)가 공급될 수 있다.
그 때문에, 조절된 챔버는 기초 연구(세포 생물학, 생화학, 생리학, 생태학, 진화)뿐만 아니라, 미생물에 의해 종을 합성하는 것이 어려운 세포 생산에 필요하다. 특히 약물 스크리닝(screening), 임상 진단 및 세포-기반 치료를 위해서 세포-기반 분석을 자동화하고 통합하는 것이 필요하다.
전통적인 마이크로타이터 플레이트 방법(microtiter plate method)은 노동 집약적이며 크고 고가의 로봇 액체 처리 시스템을 사용하지 않고는 자동화하는 것이 어렵다. 매우 낮은 유체 체적의 조작을 용이하게 하여 세포 배양 분석을 성공적으로 소형화하기 위해서 다양한 랩 온-칩 미세유체 시스템(lab on chip microfluidic system)이 개발되었다.
전술한 문제 중 일부를 극복하고 세포 트래핑(trapping), 세포-기반 분석 및 검출을 통합하면서 지속적인 세포 배양 및 부화를 허용하기 위해서 지난 20년 동안 많은 미세유체 시스템이 개발되었다[Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sj
Figure pct00001
berg, R. & Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens. Bioelectron. 63, 218-231 (2015)]. 미세유체 시스템은 세포 배양을 소형화하고 시약 소비를 감소시켜 전체 분석 비용을 감소시킨다. 이들은 또한, 세포외액 체적에 대한 세포내액 체적의 비율을 감소시켜 세포 미세환경을 정밀하게 조작하여 외부 자극에 대한 세포 반응의 지연을 감소시킴으로써 분석 시간을 감소시키는 능력을 가진다[Kane, K. I. W. 등의 Automated microfluidic cell culture of stem cell derived dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. bioRxiv 209957 (2017)]. 또한, 소형화된 세포 배양은 기하학적으로 제한된 공간 내에서 다중화를 허용하여 병렬로 여러 조건의 실험 복제 또는 스크리닝을 허용한다[Reichen, M., Veraitch, F. S. & Szita, N. Development of a Multiplexed Microfluidic Platform for the Automated Cultivation of Embryonic Stem Cells. J. Lab. Autom. 18, 519-529 (2013)]. 마지막으로, 미세유체 장치는 유체 조작을 위해 본질적으로 폐쇄된 채널과 챔버를 소유하기 때문에, 이들은 세포 배양 배지와 영양소 및 자극제 전달의 지속적인 관류를 허용하면서 증발의 영향을 최소화할 수 있다[Nakatani, E. 등의 Compartmentalized microfluidic perfusion system to culture human induced pluripotent stem cell aggregates. J. Biosci. Bioeng. 124, 234-241 (2017); Khoury, M. 등의 A microfluidic traps system supporting prolonged culture of human embryonic stem cells aggregates. Biomed. Microdevices 12, 1001-1008 (2010)].
이들 발전에도 불구하고, 종래 기술의 미세유체 장치를 사용하는 기상 조절이 칩의 분위기와 쉽게 가스를 교환하는 투과성 미세유체 칩을 사용하는 것을 포함하기 때문에 미세유체의 장점 중 일부는 아직 실현되지 않았다. 이는 이들 칩을 대형 보조 장비(인큐베이터, 주사기 펌프 등)에 배치할 것을 직접적으로 요구한다. 실제로, 문헌에 설명된 대부분의 미세유체 시스템은 외부 주사기 펌프를 사용하여 CO2 완충 배지를 배양 챔버에 공급함으로써, 장치 작동의 전반적인 복잡성을 추가하고 실제 적용을 제한한다[Kyu Byun, C., Abi-Samra, K., Cho, Y.-K. & Takayama, S. Pumps for microfluidic cell culture. Electrophoresis 35, 245-257 (2014); Takano, A., Tanaka, M. & Futai, N. On-chip CO2 incubation for pocket-sized microfluidic cell culture. Microfluid. Nanofluidics 12, 907-915 (2012)]. 또한, 이들 장치는 가스 미세환경을 제어할 수 있는 투명성, 생체 적합성 및 가스 투과성으로 인해 PDMS를 사용하여 제작된다[Torino, S. 등의 PDMS-Based Microfluidic Devices for Cell Culture. Inventions 3, 65 (2018)]. PDMS 장치는 학술 연구에서 풍부하지만, 재료는 확장 가능한 제작과 호환되지 않고 PS 및 COC 우세(prevail)와 같은 생체 적합성 경질 열가소성 수지가 널리 사용되는 제약 및 임상 연구를 포함한 산업계에서는 거의 사용되지 않는다. 경질 열가소성 플라스틱은 PDMS보다 10배 낮은 가스 투과율을 가진다. 또한, PDMS는 단백질과 소 분자를 흡수하여 일부 분석 결과를 편향시킬 수 있다. 칩이 가습기 챔버 내에 있지 않은 한, PDMS의 가스 투과성은 시간이 지남에 따라 샘플 증발로 이어질 수 있다. 장기간 세포 배양이 필요한 용례에는 항상 습도 조절이 필요하다. 실제로, 문헌에 있는 대부분의 실험은 가습 세포 배양 인큐베이터 내에서 PDMS 칩을 사용하여 "랩 온 칩(lab on chip)"을 "칩 인 랩(chip in lab)"으로 줄인다.
이러한 정확한 문제, 예를 들어 "Bunge, F., van den Driesche, S. & Vellekoop, M. J. PDMS-free microfluidic cell culture with integrated gas supply through a porous membrane of anodized aluminum oxide. Biomed. Microdevices 20, 98 (2018)"와 씨름하고 있는 종래 기술 연구원은 세포 성장을 위해 인큐베이터에서 칩을 지지하기 위한 개선된 가스 투과성 배지를 제공하도록 동기를 부여했다.
원심 미세유체 칩이 아닐 수 있지만, 본 청구범위와 공통된 일부 또는 여러 구조적 특징을 가질 수 있는 종래 기술 칩은: US　2009/246082, WO 2018/215777, US 2018/364270, US 2017/173589, US　2016/214105, US 2008/226504, US 2018/313765, JP 2003344421, EP 2332653, CN　107460122, US 7,452,726, 및 US 10,252,267이다.
따라서, 바람직하게 칩의 재료 조성에 관해 몇몇 제한이 있는(예를 들어, 대량 제작과 호환, 불활성, 저비용 형성 및 밀봉 등), 소형이고 조절된 챔버 내에서 액체 영양(liquid alimentation) 및 가스 공급 제어를 허용하도록 설계된 원심 미세유체 칩이 필요하다. 특히, 투과성 막을 통과하지 않고 원심 미세유체 칩의 조절된 챔버로 가스 공급을 직접 제어할 수 있으므로 다른 휘발성 물질의 흡착 및 탈착을 허용하는 칩이 필요하다.
모든 유형의 미세유체 칩에 챔버를 제공하는 것은 매우 일반적이지만, 챔버에 세포 또는 미생물 지지 구조가 있을 수 있으며, 이는 챔버에 영양을 공급하거나 관류하기 위한 하나 이상의 액체 공급 저장소; 및 폐기물 저장소로부터 유체를 수용하기 위한 하나 이상의 폐기물 저장소, 특히 공압이 제어되는 원심 미세유체학적 맥락에서 조절된 챔버에 가스를 공급하기 위해 온-칩 제어기 역할을 하도록 미세유체 저장소를 적용하는 아이디어는 공지되어 있지 않다. 이는 막을 통한 통과를 막는 H2O, CO2, O2, N2, CH2, CO, CH3 등을 제어하는 방법의 문제에 대해 놀랍도록 우아한 해결책이다.
해결책은 원심 미세유체 장치에 고유한 방식으로 조절된 챔버(CC)에 커플링된 가스 공급(GS) 저장소를 제공하는 것을 포함한다. 커플링은 채널을 통해 이루어지며, 여기서 채널은 GS 저장소 또는 CC보다 칩의 기준 축에 더 가깝게 통과한다. 이는 채널을 일반적으로 그 사이의 액체 전도에 부적합하게 하고 불필요하게 문제가 되게 한다. 그러나, 액체에 대한 우수한 장벽이 되고 가스에 대한 장벽은 거의 존재하지 않는다. 따라서 반응성 액체 또는 고체 전구체 또는 GS 저장소의 휘발성 액체 자체는 CC로 이동할 수 없지만, 가스 제품은 이동할 수 있다. 가스 발생은 GS 저장소의 온도를 제어함으로써 외부적으로 제어될 수 있다. GS 저장소의 포트로부터 채널을 통해 CC로, 그리고 CC 포트를 통해 칩 밖으로 제어된 유량으로 이러한 생성을 조정하면 CC 가스 농도가 제어된다.
유속을 제어하기 위해서, GS 포트와 채널로의 개구는 둘 다 GS 저장소의 충전 라인 위에 있는데, 이는 채널 내로 액체의 동반을 방지하기 때문이다. 여기에서 충전 라인은 유체의 메니스커스(meniscus)를 "충전하거나" 취할 때 챔버/저장소의 액체 내용물의 자유 표면으로 이해된다. 물론 챔버는 과도하게 충전되어 특정 프로토콜이나 작동에 적합하지 않거나 완전히 사용할 수 없게 만들 수 있다. 충전 라인은 일반적으로 미충전 칩의 지워지지 않는 표시가 아니지만, 1 - 이는 실제로 구분될 수 있거나; 2 - 칩 벤더(chip vendor)가 제공한 지침에서 칩 챔버에 대해 명시된 볼륨으로 제품에서 식별될 수 있거나; 3 - 다음 단서: a) GS 포트의 위치 및 수로 개방; b) 입구, 출구 및 포트에 대한 기능적으로 연결된 다른 모든 저장소의 위치; c) 충전 라인 또는 그 아래에서 재료를 지지하는 것으로 자연스럽게 가정되는 세포 지지체와 같은 CC 내의 재료를 지지하는 장치의 위치를 고려한 검사에 의해 분명해질 수 있다. 충전 라인은 기하학적으로 선이 아니지만, 칩의 회전 축에서 방사되는 원심 필드에 의해 정의된다. 칩이 "에지에서" 회전하도록 설계된 경우, 즉 칩의 상단 에지가 원심분리기의 축과 평행한 경우, 제 1 원호는 챔버의 두께 방향이며 본질적으로 무시할 수 있어서, 결과적으로 모든 챔버는 충전 라인으로서 본질적으로 평행한 기하학적 라인을 가지게 된다. 칩의 다른 가능한 방위는 축이 수직이고 칩 표면의 법선에서 오프셋되며, 이 경우 모든 챔버의 충전 라인은 본질적으로 동일한 축에서 각각의 원호이다.
회전축이 정의될 수 있거나 정의되지 않을 수도 있지만, 칩만 보면 채널 상호 연결 및 챔버에 대한 채널의 위치가 주어지는 경우 해당 챔버의 기능 보기와 일치하는 축에 대해 작동 가능한 위치 범위를 제공하는 신호가 있다. 따라서 기능적 결과를 위해 배열되고 상호 연결된 4 개 이상의 챔버가 있는 거의 모든 경우에 칩에 대한 총체적이고 목적적인 관점은 가능한 회전 축의 좁은 범위를 제공하고 좁은 밴드 내에서 각각의 챔버에 대한 충전 라인을 정의한다. 추가의 합리적인 제한은 예컨대, 칩의 축이 칩에 적용되는 원심력 구배를 크게 감소시키고 원심분리기의 모멘트를 증가시켜 작은 구배를 달성하기 위해 더 높은 토크가 요구될 정도로 칩 자체에서 결코 멀리 떨어져 있지 않다는 사실이다. 그 때문에, 칩의 축은 일반적으로 칩 길이의 두 배 미만으로 칩으로부터 분리될 것으로 예상된다.
본 발명은 또한, 출원인의 공동-계류 중인 WO 2015/181725호 또는 그 배경에서(이의 내용은 법률 및 관행이 허용하고 기타 모든 관할권에서 공지된 것으로 간주되는 원용에 의해 포함됨) 교시된 바와 같이 회전 축에 평행한 축에서 기울어지도록 칩이 설계될 가능성을 포함한다. 만일 그렇다면, 챔버의 충전 라인은 칩의 기준선 포즈(baseline pose), 있다면 또는 중간 작동 범위에서 균형 잡힌 포즈를 나타낸다. 그러한 칩은 기울기 각도에 따라서 유체를 보유하거나 분배하는 비-모세관 구동식 사형 채널을 사용하여 식별할 수 있다.
채널은 CC의 충전 라인 위 또는 아래에서 GS 저장소를 CC에 연결할 수 있다. 충전 라인 아래에 가스를 공급함으로써, 가스가 CC의 액체 내용물에 더 효율적으로 용해되고, 가스가 충전 라인 위의 CC에 전달되는 것과 비교하여 CC로 가스를 "버블링"하는데 더 높은 압력이 필요하다. 버블링(Bubbling)은 유리하게, CC 함량을 혼합하거나 일부 세포의 배양에서 원하는 대로 세포 부착 또는 침전을 방해할 수 있다. 버블링은 출원인의 공동 계류 중인 WO 2015/132743호 및 이의 종래 기술 섹션에서 교시되며, 이는 또한 원심 미세유체를 위한 바람직한 다중 채널 공압 제어 구조를 교시한다(그 내용은 법률 및 관행이 허용하고 기타 모든 관할의 기술 분야에 공지된 원용에 의해 본 발명에 포함된다).
GS 저장소의 스트림으로 또는 스트림에서 CC의 내용물로 가스의 확산을 촉진하기 위해서(특히 버블링이 사용되지 않는 경우), 가스(충전 라인)와 접촉하는 표면적이 확대될 수 있다. CC 또는 GS 저장소의 폭은 각각의 충전 라인 또는 그 근처에서 가장 클 수 있다. 더 큰 효과를 위해서, CC 및/또는 GS 저장소의 에칭 깊이는 칩의 채널 및 일부 다른 저장소의 에칭 깊이보다 실질적으로 더 클 수 있다. 후보 기준 축 위치는 다른 후보에 비해서 CC 및 GS 저장소의 충전 라인 표면적에 따라 다소 다를 수 있다.
칩의 충전 라인이 검사에 의해 확인될 수 있다고 합리적으로 예상하기 위해서 그리고 다양한 용례에서 기능을 하는 칩을 만들기 위해서, 칩은 적어도 제 1 완충제 또는 시약 공급(SUP) 저장소, 및 제 1 출력(OUT) 저장소, 예컨대 종래의 폐기물 저장소, 상청액 또는 CC의 원심 분리된 분획에 커플링된 CC로 제한된다. 대부분의 실시예에서, 2개 이상의 SUP 및 OUT 저장소가 선호된다. SUP 저장소는 그 충전 라인 아래, 바람직하게 축에 대해 SUP 저장소의 원위 표면에서 SUP 저장소와 만나는 SUP 채널을 통해 CC에 연결된다. SUP 채널은 CC 충전 라인 위의 아무 곳에서나 CC에 커플링될 수 있다. OUT 저장소는 수집된 샘플에 우선하여 충전 라인 위의 OUT 저장소와 충전 라인 아래의 CC를 만나는 OUT 채널에 의해 CC에 커플링된다. 예를 들어, OUT 저장소가 CC의 충전 체적에 비해 작은 체적을 가지고 있는 경우, 일정량의 원심분리 후/중에 충전 체적의 상단 표면을 걷어내거나 그렇지 않으면 CC의 말단 벽과 충전 라인 중간의 해당 지점으로부터 상이한 분획을 추출하도록 설계될 수 있다.
일부 용례에서 상당한 양의 가스 전달을 필요로 하거나 가스 전달이 비효율적일 수 있으며 장기간에 걸쳐 전달될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 연구는 몇 시간 또는 며칠이 걸릴 수 있다. 그렇다면, GS 저장소의 충전 라인 아래에 있는 재료로 많은 가스가 생성되어야 하며 GS 저장소의 더 높은 충전 체적이 바람직하다. 원심 미세유체 칩 설계에 대한 공간적 제약은 일반적으로 충전 라인에 적절한 표면적을 제공하는 동시에 충전 체적 사이의 절충을 필요로 하며, 또한 GS 저장소가 비워짐에 따라서 자유 표면적의 점진적 손실을 허용하여 사용 중 스트림에서 농도 감소가 극단적이지 않다.
그 때문에, 칩은 원심분리기에 장착하고 제어된 유량을 GS 포트로 공급하고 CC 포트를 통해 칩 외부로 공급하도록 구성된 시스템과 커플링하여 사용되며, 예컨대 그러한 시스템은 단일 채널 공압 슬립 링을 포함하는 출원인의 WO 2015/132743호 및 거기에서 확인된 종래 기술에 교시된다.
WO 2015/132743호는 공압 인터페이스를 통해 칩의 전용 압력 포트에 조절된 공기 압력을 가하는 것을 가능하게 하는 회전 단계에 프로그래밍 가능한 전자 기계 밸브를 갖는 원심 칩 제어기, 및 밸브의 작동을 지시하기 위한 밸브의 전자 제어기를 교시한다. 각각의 압력 포트는 펌프의 양압 또는 음압 또는 정상 대기압(통풍)을 적용하도록 프로그래밍될 수 있다. 펌프는 세포 배양에 필요한 CO2와 같은 특정 가스 환경을 카트리지에 제공하기 위해서 가스 실린더와 같은 가스 공급 장치에 연결하거나 공기를 공급하는 펌프에 연결될 수 있다. 원심 칩 제어기를 사용하여 생성된 압력 차이는 카트리지에 임의의 활성 요소를 통합할 필요 없이 밸브 조작, 흐름 전환, 역 펌핑(원심력에 대해 유체 이동), 또는 주문형 기포 기반 혼합과 같은 다양한 유체 기능의 성능을 허용한다.
청구범위의 사본이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 추가 특징은 다음의 상세한 설명 과정에서 기술되거나 자명해질 것이다.
본 발명이 더욱 명확하게 이해될 수 있도록, 첨부된 도면을 참조하여 예로서 본 발명의 실시예가 이제 상세하게 설명될 것이다.
도 1은 다중 포트 공압 제어 미세유체 칩 제어기와 함께 사용하도록 구성된 본 발명의 실시예로서 제공되는 원심 미세유체 칩의 개략도이다.
도 2는 도 1의 칩의 변형예로서, 하나의 채널에 대안적인 공압 밸브 장치가 있고 칩의 기준 축 위치에 대한 제한을 예시한다.
도 3은 도 1의 칩의 변형예로서, 단일 포트 공압 제어 미세유체 칩 제어기 또는 칩 표면에 수직인 축에서 칩의 피봇을 제공하는 관절식 블레이드 홀더가 있는 공압 슬립 링과 함께 사용하도록 구성된다.
도 4는 도 1의 칩의 변형예로서, 단일 포트 공압 제어 미세유체 칩 제어기 또는 유체 역학적 제어 계량 및 분배 시스템이 있는 공압 슬립 링과 함께 사용하도록 구성된다.
도 5는 미생물 지지 구조가 조절된 챔버의 충전 라인 아래에 제공되는, 본 발명의 실시예로서 제공되는 칩 또는 변형예의 조절된 챔버의 개략도이다.
도 6은 도 5의 실시예의 변형로서, 조절된 챔버로 전달되는 가스의 확산 효율을 증가시키기 위해 가스 트랩이 제공된다.
도 7a 내지 도 7e는 본 발명을 설명하는데 사용된 프로토타입 칩을 도시하는 사진으로서, 본 발명을 설명하기 위해 사용된 2 개의 조각의 카트리지의 3 개의 패턴화된 칩 표면 및 배양 공정 전후에 충전된 카트리지의 레이아웃을 각각 도시한다.
여기에서 가능한 압력 및 온도뿐만 아니라 주어진 농도의 가스 공급으로 챔버의 조절을 요구하는 공정에서 사용하기 위한 특정 가치를 갖는 원심 미세유체 칩이 설명된다. 가능한 오염 문제 또는 오프-칩 공급에 관한 요건을 피하고 미세유체 시스템을 단순화하기 위해서, 가스 공급은 충전 라인 아래의 휘발성 또는 기타 가스-생성 액체 체적을 포함하도록 구성된 칩의 단일 저장소로부터 제공되도록 구성된다. 액체 체적을 국부적으로 가열함으로써, 가스의 직접적인 공급이 칩에 제공될 수 있으며 가스가 공압 슬립 링 또는 상당한 온도 구배를 가로지르는 기타 경로를 통해 직접 공급되는 경우 발생할 수 있는 응축 또는 분리 문제를 피할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 원심형 미세유체 칩(10)의 제1 실시예를 예시한다. 이러한 실시예는 출원인의 공동 계류 중인 WO 2015/132743호의 교시에 따라 제공된 것과 같은, 독립적으로(즉, 임의의 포트 세트가 언제든지 제어될 수 있음) 또는 선택적으로(즉, 어느 하나는 제어될 수 있지만 한 번에 하나만) 제어되는 칩(10)의 다중(5 또는 6) 포트를 갖는 원심분리 시스템과 함께 사용하는데 특히 적합하다. 포트가 각각의 챔버에 대해 국부적으로 도시되어 있지만, 일반적으로 용이한 정렬을 위해 칩(10)의 공통 에지를 따라 모든 포트를 배열하는데 거의 단점이 없으며 개별 튜브의 수동 커플링을 배제하기 위해서 칩에 대한 공통 인터페이스 설계의 일부일 수 있다.
칩(10)은 세포 배양 또는 조직 성장에 요구될 수 있거나 살아있는 조직, 소기관, 미생물 또는 샘플의 성장 또는 테스트에 요구될 수 있는 조절된 챔버(CC)(13)를 가진다. CC(13)는 공급(SUP) 저장소(12), 출구(OUT) 저장소(14/15), 및 가스 공급(GS) 저장소(11)를 포함한, 그에 유체적으로 커플링된 다수의 저장소를 가진다. 각각의 저장소(12, 14/15, 11)에는 CC(13)에 커플링하기 위한 각각의 채널(SUP(17), OUT(18/19), GS(16))을 가진다. 각각의 저장소는 CC(13)(P3)와 같이, 액체 로딩을 위한 개별 포트(P2, P4/P5, P1)를 가진다. 동일한 포트는 또한, 분석 프로토콜 또는 미세유체 공정에서 요구하는 대로 양압 또는 음압을 적용하기 위해 공압 소스로 각각의 챔버를 통풍하거나 개별적으로 처리하는데 사용될 수 있다. GS 저장소(11)는 가습을 중단하지 않고 지속적으로 보충할 수 있도록 공압 소스에 연결하기 위한 포트(P1)뿐만 아니라 휘발성 액체를 공급하기 위한 별도의 포트(P6)를 가질 수 있다. 이는 WO 2015/132743호에 교시된 바와 같이 오프-칩 로딩에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게, 포트(P6)는 사용 중인 휘발성 액체로 막혀서 GS 저장소(11)로부터의 배출을 제공하지 않는다.
포트(P6) 또는 선택적으로 SUP 저장소(12)는 또한, 출원인의 공동 계류 중인 US 62/760,256호의 WORLD-TO-CHIP AUTOMATED INTERFACE FOR CENTRIFUGAL MICROFLUIDIC PLATFORMS에 교시된 바와 같은 고정된 비-접촉 드립 전달 시스템에 의해 공급될 수 있다. GS 저장소(11)는 가압 챔버이므로 P1의 운반 가스와 P7의 액체 모두의 유속과 P1을 통한 증발 손실에 대한 독립적인 제어에 약간의 주의가 필요하다. 특히, 이는 액체 플러그로 P7을 차단하고 P7의 개구에 상당한 유체역학적 저항 또는 밸브를 제공함으로써 달성될 수 있다. SUP 저장소(12)의 경우 이중 흐름 문제를 완화하거나 가압을 유지할 필요 없이 P2를 사용할 수 있다.
GS 저장소(11)는 CC(13)에 가스를 공급하여, 예를 들어 세포 배양 또는 성장 공정 전반에 걸쳐 CC(13)의 습도를 유지하거나, 그렇지 않으면 충전 라인 위의 CC(13) 내의 가스 조성을 제어한다. GS 저장소(11)는 GS 채널(16)을 통해 CC(13)의 충전 라인(20) 아래 또는 위에서 CC(13)에 연결된다. 충전 라인 아래에 있는 경우 CC(13)의 액체 내용물을 통해 가스를 밀어내기 위해 포트(P1)에 더 높은 압력을 공급해야 한다("가스 버블링(gas bubbling)"을 초래한다). 이의 장점은 액체 내에서 가스의 더 높은 용해를 유도하는 기포의 높은 표면적이다. GS 저장소(11)로부터 출력된 가스가 P1으로부터 P3로의 가압 흐름을 제공하는 캐리어 가스보다 더 높은 용해율을 갖는다면, 가스의 더 높은 효율의 전달이 달성될 수 있다. 버블링은 혼합을 촉진하고 미생물 또는 세포의 침전 또는 부착을 방지할 수 있다. 소용돌이를 혼합하는 것은 일부 세포 배양에 불리할 수 있으며, 이는 기포로부터 세포 스케폴드(cell scaffold)/지지체를 보호하고 기포를 세포로부터 멀어지게 하는 장벽으로 피할 수 있다. 대안적으로, 도시된 바와 같이, CC(13)의 액체 내용물의 자유 표면(충전 라인(20) 또는 그 아래) 사이의 확산은 액체 내용물을 가스에 공급하기 위해 의존할 수 있다.
채널(16)은 상부 또는 측면에서 GS 저장소(11)의 충전 라인(20) 위의 임의의 위치에서 GS 저장소(11)와 만날 수 있다. 원칙적으로, 채널(15)은 효율적인 가스 동반 측면에서 유사한 장점을 달성하기 위해 충전 라인(20) 아래의 GS 저장소(11)를 만날 수 있지만, 이러한 경로의 방해물이 불편하고 수성 액체와 같은 대부분의 액체의 기포 발생이 이들 방해물을 생성할 가능성이 있기 때문에 기포 발생 동안 채널(16)의 액체 폐색을 방지하기 위한 보호 장치가 필요할 수 있다. GS 채널(16)은 사형 채널이며, 채널(16)이 액체를 전도하도록 의도되지 않았지만 가스 수송에 대한 최소 저항을 제공하기 때문에 높은 유체 역학적 저항을 가지거나 실질적으로 전혀 저항이 없을 수 있다. 높은 유체역학적 저항이 제공되면 원심분리 전에 수행될 수 있는 로딩 동안 채널(16)에 액체가 들어가는 위험을 방지하거나 줄일 수 있다. 유체역학적 저항이 낮으면 채널(16)의 일시적인 막힘이 더 적은 압력과 시간으로 제거될 수 있다. 따라서, GS 채널(16)은 GS 저장소(11)에 대한 개구 부근을 제외하면 더 낮은 유체역학적 저항을 가질 수 있다.
GS 채널(16)은 당업계에 주지된 사이펀 밸브(syphon valve)와 유사한 사형 구조를 한정하지만, 반드시 사이펀 밸브와 관련된 대부분의 문제를 갖는 것은 아니다. 즉, 채널(16)은 필수적인 임의의 특정 친수성, 또는 사이펀 밸브의 신뢰성 있는 작동에 필수적인 유체역학적 저항을 가지지 않는다. 그 때문에, 정확한 치수 제어 및 표면 기능화가 필요하지 않다. 그러나 사형 경로는 GS 저장소(11) 또는 CC(13)보다 칩의 회전 축 또는 그 기준에 더 가까운 세그먼트(16a)를 포함한다. 평행선인 GS 저장소(11) 및 CC(13)에 도시된 충전 라인(20)과 관련하여, 축은 추론할 수 있을 정도로 칩(10)의 상단 에지에 평행하지만, 도 2를 참조하여 도시되고 설명되는 바와 같이, 칩(10)은 충전 라인의 형상에 영향을 미칠 위치 범위에 위치된 축을 중심으로 회전하도록 동일하게 배치될 수 있다. 이는 포트(P1) 및 채널(16)에 대한 개구의 위치와 함께 원심력하에서 CC(13)로 구동되는 GS 저장소(11)의 액체로부터 보호한다.
SUP 채널(17)은 SUP 저장소(12)의 축-원위 지점으로부터 충전 라인(20) 위의 CC(13)까지 연장한다. 포트(P2)는 SUP 저장소(12)의 축-근위 지점으로부터 연장한다. 그 때문에 저장소(12)의 충전 라인은 저장소의 상부 에지일 수 있다. 이는 SUP 저장소(12)를 과도하게 충전할 위험이 없다. SUP 채널(17)은 바람직하게, 유체역학적 저항이 낮은 채널이며, 일단 프라이밍되면(primed) 원심분리 하에서 액체 내용물의 빠른 분배를 피하기 위해 (CC 13에 비해)음압을 지속적으로 받는다.
OUT 채널(18, 19)은 모두 CC(13)로부터 충전 라인(20) 아래로 각각의 OUT 저장소로 연장하는 것으로 도시된다. OUT 저장소(14)는 상청액(supernatant)을 위한 것이며, 원하는 원심분리 특성과 관련된 충전 라인에 대한 특정 위치(전형적으로 고속 원심분리 동안 세포 찌꺼기와 미립자가 수집될 수 있는 위치 위)를 갖지만, 원하는 양의 상청액을 수집할 만큼 충분히 낮다. OUT 채널(18)은 그의 충전 라인(20)에서 저장소(14)와 만난다. OUT 저장소(14)가 CC(13)의 충전 라인에 축에 인접해 있기 때문에 상청액을 그 안으로 끌어들이는 유일한 방법은 상청액의 관성을 극복하기 위해 CC(13)에 대해 충분히 음압인 압력을 P4에 적용하는 역 펌핑을 사용하는 것이다. 상청액 챔버가 과충전된 경우 원심분리 중에 P4에서 압력을 간단히 해제하면 초과 액체가 CC(13)로 되돌아갈 수 있다. 그 때문에 채널(18)은 바람직하게 낮은 유체역학적 채널이다.
OUT 채널(19)은 폐기물 저장소(15)의 축-근위 지점으로 이어진다. OUT 저장소(15)가 CC(13)의 축-원위에 있고 채널(19)이 유체역학적 저항이 낮기 때문에, 과도한 액체 내용물은 예를 들어, 채널(19)이 프라이밍될 때까지 (CC 13에 비해)P5에서 압력을 감소시키고 나서 CC가 비워지는 것을 방지하기 위해 과잉 액체가 추출되면 압력을 증가시킴으로써 새로운 완충제를 위한 공간을 만들도록 추출될 수 있다. OUT 채널(19)의 액체가 사이펀 위로 수축되면, P5의 압력이 해제될 수 있으며 액체는 CC(13)로 다시 떨어질 것이다.
도 1은 또한, GS 저장소(11)에 선택적으로 통합되는 배수로(spillway)(11b)를 도시하며, 모든 특징에서 본 발명에 필수적인 것은 아니다. 배수로(11b)는 챔버의 충전 레벨을 쉽게 식별할 수 있는 마커이다. 배수로는 과충전을 피하기 위해서 CC(13)에 추가로 또는 대안적으로 포함될 수 있다. 배수로는 관절식 원심 블레이드의 작동이 챔버의 충전 레벨에 특히 민감할 수 있기 때문에 도 3과 관련하여 아래에 설명된 바와 같이, 관절식 원심 블레이드에 사용하도록 설계된 실시예에서 특히 바람직할 수 있다.
배수로(11b)의 주요 장점은 GS 저장소(11)의 과충전이 칩(10)의 기능에 영향을 미치는 것을 방지한다는 점이다. 휘발성 유체가 원심분리 전에 GS 저장소(11)로 공급되고 휘발성 유체의 고정밀 계량을 제공하는 것이 바람직하지 않거나 편리하지 않거나 추가로 휘발성 유체가 충분한 정확도로 제어되지 않는 속도로 지속적으로 공급되는 경우, 증발 속도에 비해 배수로(11b)는 원심분리가 적용되는 즉시/그와 동시에 과도한 유체를 인접한 저장소로 끌어올 것이다. 따라서 GS 채널(16)을 막을 위험 없이 충전 체적의 사소한 오류가 수용될 수 있다. 따라서 배수로(11b)의 사용은 폐색의 위험을 증가시키지 않거나 휘발성 액체(25)의 주의 깊은 계량을 요구하지 않고 사용될 수 있는 휘발성 액체의 체적을 증가시킨다.
임의로 표현되는 칩의 몇 가지 특성이 있다. 각각의 저장소/챔버의 크기, 모양, 방향 및 레이아웃(상대적 위치)은 도시된 대로 요구되지 않는다. 일반적으로, GS 저장소(11)의 형상은 바람직하게, 액체가 충전 라인(20) 아래 체적의 20% 내지 100%를 차지할 때 액체 내용물의 자유 표면의 표면적의 낮은 변화를 제공한다. 이는 GS 저장소(11)의 체적이 CC(13)로 끌어들이는 가스 생산으로부터 떨어질 때 가스 생산 및 동반의 비율이 눈에 띄게 변하지 않는다는 것을 보장한다. 또한, GS 저장소(11)가 칩(10)의 딥-에칭된(deep-etched) 구조일 수 있고 다른 챔버보다 더 큰 표면적을 차지할 수 있도록 비교적 높은 자유 표면적이 바람직할 수 있다. GS 저장소(11)는 축-근위 CC(13)로 도시되지만, 이는 반전될 수 있거나 축으로부터 균등하게 이격될 수 있다.
CC(13)는 액체 내용물의 높은 자유 표면적을 제공하기 위해서 비교적 크고 또한 바람직하게 깊은 것으로 도시된다. 그러나 GS 채널(16)이 충전 레벨 아래에서 CC(13)를 충족하면 CC는 충전 라인 위의 훨씬 적은 체적을 필요로 하므로 자유 표면적 제약을 피할 수 있다. CC(13)가 설계된 공정에 따라서 다양한 기능이 있을 수 있다. 이는 세포, 미생물 또는 조직 트랩, 스캐폴드 또는 지지체를 완전히 충전 라인 아래에 가질 수 있거나 자유 표면에서 세포 배양을 제공할 수 있다.
칩 작동 동안, CC(13) 내의 압력 및 온도를 독립적으로 제어하는 것이 바람직할 수 있다. 온도 제어는 당업계에 주지된 다양한 온-칩(on-chip) 및 오프-칩(off-chip) 가열 시스템으로 달성될 수 있다. 미세유체 장치의 가열을 위한 많은 기술이 문헌[V. Miralles, A. Huerre, F. Malloggi 및 M.-C. Jullien, A Review of Heating and Temperature Control in Microfluidic Systems: Techniques and Applications, 2013, vol. 3.]에 설명되어 있다. 오프-칩 가열 기술은 펠티에 소자(Peltier element), 저항 소자, 레이저 다이오드(아르곤 이온 레이저, 적외선 레이저) 등을 포함한다. 온-칩 기술은 얇은 금속 층(금, 백금, 구리, 크롬)을 사용하는 통합 마이크로히터, 저항 소자로서 마이크로 채널에 내장된 액체 금속, 및 소형화된 마이크로파 가열 소자를 포함한다. 이러한 요구에 따라서, 금속과 같은 코팅 또는 내장된 재료가 CC(13)(및 선택적으로 또한 저장소(12, 14)) 내에 도포되어 가열될 체적에 걸쳐 열 흡수, 보유 및 분포를 지원할 수 있다. 이러한 체적은 CC(13), 또는 충전 라인 아래의 CC(13)와 적어도 60% 정렬될 수 있거나, 이에 추가하여 하나 이상의 SUP 저장소와 정렬될 수 있으며, 바람직하게 GS 저장소(11)의 임의의 부분을 배제하여 GS 저장소(11) 및 CC(13)의 독립적인 열 제어를 허용한다. 칩 내부에서 가열을 적용하는 대신 흡수 및 전도성 재료를 칩 뒷면에 적용하거나 칩 재료와 통합할 수 있다. 후자의 경우, 재료는 바람직하게, 칩 상의 다른 곳(GS 저장소(11)에서 떨어져 있음)에 있는 것보다 체적 주위에서 적어도 10배 더 많이 흡수하여, 칩(10)의 환형 스트립을 가로지르는 레이저, 다이오드, 와전류 또는 유사한 소스에 의한 열의 인가가 독립적으로 제어되는 이들 열 영역 중 하나를 선택적으로 가열한다. 마지막으로 재료는 칩에 대한 의도된 장착 위치에 따라서 칩에 대한 지지체에 제공될 수 있다. 더 높은 정확도의 온도 제어를 제공하려면, 예를 들어 열 커플링 유체 또는 클램프를 통해 재료와 칩 사이의 간격에 대한 약간의 주의를 기울여야 한다.
동시에 모든 포트에서 압력을 제어하고 칩의 압력 한계 내로 자유 배출된 칩 포트를 제공하지 않음으로써 압력 제어뿐만 아니라 가스의 처리가 수행될 수 있다. 마찬가지로, 압력 변화는 포트에서 공급되는 펄스 압력에 의해 CC(13)에 공급될 수 있다.
세포 배양 또는 여러 다른 생물학적 공정의 경우, 35 내지 40 ℃, 더 바람직하게 36 내지 39 ℃, 37 내지 38 ℃ 또는 약 37.5 ℃에서 가열하는 것이 CC(13)에 이상적이다. CO2 또는 GS 저장소(11)를 통한 기류의 습도에 대한 제어는 실온과 35 내지 40 ℃ 사이의 온도 제어를 편리하게 포함할 수 있다. 본 발명의 용례 중 하나는 CC(13)를 통과하는 공기를 가습하여 많은 생물학적 샘플 연구에서 필요한 것처럼 가스 교환이 필요한 수성 액체를 포함하는 따뜻한 챔버에서 증발 손실을 방지하는 것이다. GS 저장소(11)에서 물을 가열하고 캐리어 가스 유량을 제한함으로써, 충전 라인(20) 위의 CC(13)를 통과하는 스트림은 증발 손실을 크게 감소시키는데 충분히 높은 습도를 가진다.
적절한 원심 미세유체 제어기에 의해 원심분리기에 장착된 칩(10)은 원심분리가 연속적이면서 다양한 기능을 수행할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플이 CC(13)에 로딩되고 GS 저장소(11) 및 SUP 저장소(들)(12)가 로딩되면 원심분리가 시작될 수 있다. 원심분리 속도가 임계값을 초과하는 동안 각각의 저장소의 액체는 각각의 충전 라인 또는 그 아래에 있게 된다. 요청 시 또는 예정된 프로토콜에 따라서, SUP 저장소(12)에서 CC(13)로 일부 유체를 전송하기 위해서 포트(P2)에서 공압으로 작동되는 (CC(13)에 비해서)양압이 공급될 수 있다. CC(13)로 전달된 배지의 드립-기반 계량(drip-based metering)은 미리 결정된 간격으로 P2에서 짧은 양압 펄스 중간 음압을 적용하여 달성할 수 있다. 대안적으로, 분석 요구사항에 따라서 모든 배지를 한 번에 전송할 수 있다.
칩(10)은 상이한 시점에서 상이한 속도로 원심분리될 수 있다. 예를 들어, 세포를 CC(13)의 바닥 또는 이에 대한 지지체로 침전시키거나, 상이한 구조를 분리하기 위해서 용해 후에 높은 속도를 사용할 수 있으며; 잠복기 동안 더 낮은 비율을 사용할 수 있다. CC(13)의 액체 내용물은 포트(P5)에 음압을 적용하여 사이펀 채널(19)을 통해 폐기물(15)로 이동할 수 있거나 채널(18)을 통해 상청액 챔버(14)로(포트 P4에서 음압으로) 이동할 수 있다.
칩(10)은 다음 중 하나 이상과 함께 키트의 일부로 공급될 수 있다: GS 저장소(11)용 휘발성 액체 내용물(25), CC(13)용 생물학적 샘플(26)를 포함하거나 잠재적으로 포함하는 액체, 하나 이상의 시약, 완충제, SUP 저장소(들)용 용액과 같은 유체 공급물; 칩 제어기에, 원심분리기 블레이드에 직접, 관절식 블레이드에 또는 공압 슬립 링이 있는 원심분리기에 쉽게 커플링되는 카트리지를 형성하는 칩(10)과 조합된 하나 이상의 카트리지 형성 요소; 및 카트리지, 칩 또는 칩 지지체에 적용하기 위한 재료로서, GS 저장소(11), CC(13) 또는 충전 라인 아래에 있는 이들 중 하나의 일부분 중 하나에 대한 열 제어를 제공하도록 치수가 지정된 재료. 구체적으로 유체를 포함하는 칩(10)은 도 1에 또한 예시된 미세유체 시스템이다. 이러한 칩(10)은 칩 제어기 또는 공압 슬립 링의 압력 공급 라인에 대한 포트(P1 내지 P7)의 커플링을 용이하게 하기 위한 커버 리드(cover lid), 카트리지, 또는 다른 구조적 요소를 가질 수 있다.
도 2는 도 1의 칩의 변형예의 개략도로서, 칩의 회전 축이 예상되는 3개의 선호 영역과 축 선택으로 인한 5 개의 특정 충전 라인을 도시한다. 여기에서 본 발명의 다른 변형예 및 실시예의 특징과 관련된 유사한 참조 부호는 차이점을 언급하지 않는 한 유사한 특징 및 그들의 설명을 반복하지 않는다.
도 2의 변형예는 포트(P7)가 P2 대신에, 공압 밸브(21)를 통한 전달을 제어하기 위해 제공된다는 점만이 D1의 것과 상이한 것으로 도시된다. 따라서 P2는 칩(P6과 유사)을 위한 통풍구 또는 로딩 경로이지만, SUP 저장소(12)로부터 CC(13)로 액체를 계량하거나 선택적으로 이동하는데 필요하지 않다. 전형적으로 공압 밸브는 TPE 또는 기타 탄성 재료로 구성된 칩에 내장될 수 있다. TPE는 열가소성 수지보다 더 높은 가스 투과성을 가질 수 있지만, 특히 얇은 경우 투과성은 전형적으로 PDMS보다 훨씬 낮고 전형적으로 생산된 대로 만족스러운 가스 장벽을 제공한다. 이들 칩이 본 발명에서 사용될 수 있도록 하기 위해서 미세유체 챔버(적어도 11 및 13) 내부 또는 후면 위에 수증기 장벽으로 코팅하는 것이 유용할 수 있다. 도 1의 칩(10)이 비-다공성 또는 낮은 가스 투과성의 패턴화된 필름으로 구성될 수 있지만, 밸브(21)가 있는 도 2의 칩은 더 부드럽다. 장치를 형성하기 위해서 칩을 형성하고 접합하는데 유리한 TPE는 출원인의 US 9,238,346호에 설명되며, 내장형 TPE 밸브의 장점은 이송 및 계량을 제어하는데 더 간단한 공정을 포함한다.
P7은 밸브(21)를 작동시키는데 적합한 능동 압력 소스를 필요로 한다. 밸브(21)는 상시 폐쇄 밸브, 상시 개방 밸브, 또는 개방, 폐쇄 및 반영구 폐쇄 상태를 갖는 3상 밸브일 수 있다. 공압 밸브는 출원인의 US 9,435,490, PCT/IB2019/051731, US 9,238,346호에 교시된 바와 같을 수 있다. 밸브(21)의 압력 매니폴드의 분리가 다소 개략적으로 도시되며, 이는 채널(16)보다 채널(17)에 훨씬 더 가깝기 때문에 채널(16)에는 밸브가 없고 이러한 매니폴드의 가압에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다.
채널(17)만이 도 2에서 밸브에 의해 제어되는 것으로 도시되지만, 대안적인 변형예에서 채널(18 및 19)은 밸브가 있다. 다수의 밸브가 사용되는 경우, 종래 기술과 같이 병렬 공압 제어 층을 제공함으로써 레이아웃이 단순화될 수 있다.
바람직하게, 칩(10)의 기준 축 위치는 칩(10)의 상부 에지 밴드(22) 내부 또는 위에 위치되며, 이는 상부 에지로부터 상부 에지에 근접한 챔버까지 직사각형으로 연장한다. 전형적으로, 원심 미세유체의 칩은 길이(L)가 3 내지 20 cm(가장 일반적으로 4 내지 18 cm, 4 내지 8 cm 또는 12 내지 18 cm, 또는 약 5 cm, 10 cm 또는 15 cm)이고 기준 축 위치는 상단 에지에서 1 내지 5 cm 이내 이다. 그러나 칩이 원심에 장착된 제어기를 가질 경우, 이러한 축으로부터 칩을 이동시키는 기계가 있을 수 있으며, 결과적으로 칩에 대해 중심에 있는 칩(10)의 상단 에지에서 높이 2L X 폭 1.3L인 상단 에지 밴드 또는 제 1 박스 내에 있을 수 있다. 더 바람직하게, 축은 중심에 있는 상단 에지에서 높이 1.5L x 폭 L인 밴드(22) 또는 제 2 박스(b) 내에 위치한다. 가장 바람직하게, 축은 밴드(22) 또는 제 3 박스(c) 내에 놓이며, 이는 칩(10)의 이동에 의해 커버되어 이동의 하단 에지가 원래 칩 위치의 상단 에지를 만난다. 박스의 크기는 보기 쉽도록 세로로 압축된다.
박스(a, b, c)는 축이 위치하는 공간을 구분하지만, 칩(10)은 구체적으로 축 기준 위치에 대한 신호를 가진다. 제 1 신호는 포트(P1) 및 채널(16)에 대한 GS 저장소(10)의 개구에서 발견된다. 이들 두 지점은 기하학적 수직 이등분선(l1)을 가지며 축 기준 위치의 최적 위치는 l1이다. 이러한 최적의 위치는 개구를 막지 않는 가장 높은 충전 체적에 대응한다. 예를 들어, 연장된 배양 기간이 필요하고 GS 저장소(10)에서 휘발성 액체의 지속적인 보충(예를 들어, P6을 통한)이 방지되어야 하는 경우 일반적으로 가장 높은 체적이 바람직하다. 다른 상황에서는 가스 전달의 효율성이 주요 관심사일 수 있다. 일부 용례의 경우, 각각의 박스(a, b, c) 또는 스트립(22)의 하위 집합에 대한 선호도는 l1로부터 ± 45°, 더 바람직하게 ± 30°, ± 20°, ± 15°, ± 12° 및 ± 10°의 각도에서 두 지점의 중간점을 통과하는 선으로 경계가 지정된다.
충전 라인에 대한 기준 축 위치의 효과는 충전 라인(20a-f)의 샘플링과 함께 도시된다. l1의 굴절은 박스 크기 조정의 인공물이며, 여기에 표시된 각각의 충전 라인은 메니스커스로 인한 수정 없이 기준 축에서 원호로 표시된다 - 그 때문에 액체의 자유 표면은 그려진 대로의 충전 라인과 정확히 일치하지 않는다. 충전 라인(20a)은 칩의 상단 에지(라인(l1)이 굴절하는 곳)의 중앙에 있는 최적의 선호되는 기준 축 위치에서 충전 라인을 도시한다. 형식적으로, 축까지의 거리가 멀어질수록 미세하게 더 많은 충전 체적을 얻을 수 있지만, 칩이 축에 가까울수록 원심장이 더 높고 원심 분리기 블레이드의 모멘트가 더 낮기 때문에 20a가 라인에서 선호되는 지점이다. 충전 라인(20a)이 이상적이지만, 각각의 충전 라인(20b-e)은 충전 라인 아래에 합리적으로 높은 체적을 제공하는 대안을 보여준다. 각각의 충전 라인의 두 가지 기능은 충전 라인과 연결된 기준 축 위치의 두 개의 매개변수에 대응하며: 충전 라인의 곡률은 충전 라인으로부터 축까지의 거리를 결정하며(예를 들어, 20e는 중앙에 있는 상단 에지 위의 기준 축 위치(2L)를 가지는 반면에, 20d의 기준 축 위치는 상단 에지에 있으며); 충전 라인에 있는 두 지점의 수직 이등분선은 축을 통과한다(따라서 20b의 기준 축은 칩의 오른쪽에 있고 20d는 칩의 왼쪽에 있다).
각각의 충전 라인(20b-e)은 도면을 명확하게 볼 수 있도록 최대 충전 라인 아래에 양호하게 도시된다(모두가 최대 충전 라인에 표시되면, 라인은 구별하기 어려울 것이다). 따라서 각각의 충전 라인(20a,c,d,e)은 GS 저장소(11) 체적의 60%를 초과하는 충전 체적을 갖는 동심 충전 라인을 분명히 허용한다. 충전 라인(20b)은 오른쪽에 있는 박스(a)의 한계에서 기준 축 위치를 가진다. 이러한 축 위치는 GS 저장소(11)의 거의 40%의 충전 체적을 갖는 충전 라인을 허용할 수 있고 일부 용례에서는 허용되나, 두 지점과 칩(10)의 상단 에지 사이에 각도가 주어지면 칩 중심에서 왼쪽(박스(a)의 하단 왼쪽)으로 동일한 오프셋이 생성되며 모든 면에서 바람직하지 않은 충전 라인(20f)이 생성되며; 이는 매우 빠른 보충이 필요한 매우 적은 양의 휘발성 액체(10% 미만)를 제공하며; 이는 캐리어 가스 흐름과 상호 작용하기 위해서 상대적으로 작은 자유 표면을 제공하여 제한된 동반을 초래하며; 자유 표면은 포함된 액체의 체적 변화에 따라 극적으로 수축한다. 자유 표면은 생성된 가스를 제거하기 위해서 캐리어 가스 스트림에 대해 유리하게 위치되지 않는다. 그 결과, 이러한 기준 축 위치에 대한 이러한 GS 저장소(11)의 기능적 공간 최적화는 빈약하다. 20f의 기준 축 위치는 박스(a)의 왼쪽 하단 코너이다. 곡선(c1)은 충전 라인(20f)과 같은 축 위치를 대략적으로 구분하는 박스(a,b,c) 위에 그려지며, 이러한 축 위치는 수행하는 것으로부터, 저장소(11)의 용량에 비해 최소 40% 충전 체적을 허용하지 않는다.
도 3은 도 3에 도시된, 출원인의 공동 계류 중인 WO 2015/181725호 및 그의 종래 기술에 교시된 것과 같은 관절식 블레이드 플랫폼 상에서 작동하도록 설계된 칩을 개략적으로 예시한다. 도 3의 변형예는 A) 칩이 25°내지 -35°까지 기울어질 때 포트(P1-P5)가 액체 내용물의 배출을 피하기 위해서 각각 챔버의 중심에 있고; B) GS 저장소(11)가 그를 통한 가스 흐름을 위한 개구를 차단하기 위해서 매우 높은 양의 기울기 또는 음의 기울기를 필요로 하는 형상 및 P1과 채널(16)로의 입구를 가지고; C) 공급되는 챔버가 그들의 공급 챔버의 축에서 근위라는 점에서 저장소의 배열이 원심식 표준이고; D) 채널이 경사 각도 선택 분배를 위한 사이펀 세그먼트를 가진다는 점에서 도 3과 상이하다.
B)와 관련하여, GS 저장소(11)로부터의 액체가 P1 또는 채널(16)에 대한 개구를 절대 폐색하지 않도록 보장하기 위해서, GS 저장소(11)의 형상은 이들 2개의 개구에 대해 좁은 상단 단부 및 액체를 위한 더 큰 벨리(belly)를 가진다. 이러한 배열은 두 개의 개구가 서로 더 가까워지게 하여 개구 중 하나가 주어진 체적의 액체에 의해 차단되는 각도 변화를 독립적으로 감소시킨다. 액체 플러그의 이동 거리와 방향(초기에는 원심분리에 대해)이 더 작을 수 있기 때문에 P1에 대한 개구의 폐색 결과는 채널(16)의 폐색 결과보다 더 적으며, P1은 채널(16)보다 가압된 캐리어 가스 공급에 더 가깝다. P1에 대한 개구를 폐쇄하는 것을 피하는 것이 여전히 바람직다.
2개의 개구를 서로 가깝게 하는 것이 많은 가스를 동반하지 않는 이러한 개구 사이에 짧은 경로를 유도하는 배열처럼 보일 수 있지만, 실제로 챔버 내의 가스 순환은 더 많은 수의 순환 경로를 생성하는 다른 설계와 달리 양호한 동반을 생성할 것으로 예상되는 단순한 대류 패턴을 갖는 이러한 설계에 의해 권장된다.
C)와 관련하여, 채널(17, 18, 19)의 축-근위 세그먼트는 경사각 선택적 분배에 필요한 각각의 설계된 양만큼 각각의 연결된 챔버(12 내지 15)의 축-근위 에지보다 축에 더 가깝다. GS 저장소(11) 및 CC(13)에 도시된 충전 라인(20)에서 추론할 수 있는 축은 예시를 위해 칩(10)의 상단 에지와 평행한 것으로 추정된다(칩은 다양한 축 위치와 함께 사용될 수 있다). 축(25)을 중심으로 칩을 기울이는 것은 칩(10)의 오른쪽 상단 코너에 표시되지만, 전형적으로 칩에서 벗어나고 일반적으로 기준 축 위치(도면의 스트립(22) 또는 박스(a,b,c))에 대해 구분되는 것과 동일한 영역에 있으나, 바람직하게는 기준 축 위치에서 떨어져 있거나 도시된 바와 같이 수직이다. 채널의 축-근위 부분과 챔버의 모양, 위치 및 충전 체적을 높이거나 낮추어 유체 전달이 발생하는 기울기 각도를 관절 메커니즘에 대한 제어에 적합하게 변경하고 견고하고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공할 수 있다. 채널의 축-근위 세그먼트를 선택함으로써, 각도 범위 사이의 각도 간격이 제공되어 두 개 이상의 챔버 사이의 중복 및 동시 전송을 방지할 수 있다. 즉, 예를 들어 CC(13)의 과충전을 피하기 위해서 동시 전송이 바람직할 수 있다. 회전 축이 틸트 축(25)에서 평행한(그리고 공간적으로 떨어져 있는) 경우, 칩(10)의 회전 속도를 변경함으로써 틸팅이 제공될 수 있다.
도 3에 도시된 바와 같이, 칩(10)은 경사 축(25)으로부터 화살표로 도시된 바와 같이 충전 라인(20)에 수직으로 지향되는 원심력을 갖는 기준 경사 방위에 있다. 채널(19)을 프라이밍하는데 필요한 기간 동안 약 -30° 내지 -35°(각도 범위(25a))의 기울기 각도는 CC(13) 내용물을 상청액 저장소(14)로 옮기는데 효과적이다. 칩이 이송을 위한 틸트 각도에 있을 때, 저장소(14)로 가는 CC(13)의 개구 또는 그 위에 체적의 약 2/3가 존재하고 이 부분은 완전히 분배된다. 유사하게, 기준 방위로부터 약 20 내지 25°의 경사각 범위(25b)는 CC(13)의 모든 나머지 액체 함량을 폐기물(15)로 이동시킨다. 그 때문에, 채널(18, 19)은 낮은 유체역학적 저항, 비-모세관, 유동 채널이다.
D)에 관해서, 채널(17)은 도 1의 변형예에 대해 수정되어 사이펀 구조물(17a)과 대직경 세그먼트(17b)의 두 부분을 포함한다. SUP 채널(17) 내 유체역학적 직경의 큰 단계를 제공함으로써, 흐름을 이산화하고 SUP 저장소(12)로부터 CC(13)로 부분적인 이동을 용이하게 할 수 있다. 사이펀 세그먼트(17a)를 프라이밍하는데 충분한 기간 동안 5 내지 15°의 최소 각도(저장소(12)의 즉각적인 충전 체적에 따라 상이함)로 기울이면 액체가 분배될 것이다. 사이펀 구조물(17a)을 통한 유속을 제한함으로써, 유속은 점진적으로 만들어질 수 있다. 경사각을 최소 범위(25c) 미만으로 되돌리면 전송이 중지된다. 원하는 간격으로 기울임을 반복하여 추가 완충제, 시약 또는 기타 공급을 원하는 프로토콜에 따라 CC(13)에 공급할 수 있다. 관련 각도 범위에서 CC(13)에 과충진 포트를 배치하면 P3를 방해하거나 OUT 저장소(14)로 이송하는 동안 누출 위험 없이 CC(13)의 과충전을 방지할 수 있다. 이러한 변형 채널(17)은 또한, 도 2에 도시된 밸브(21) 대신에, 공압 포트(P2)에 대한 더 높은 미세 제어 대신에 도 1의 실시예에서 공압 제어와 함께 사용될 수 있음을 주목해야 한다.
그 때문에, 예를 들어, 세포 배양 배지와 함께 사용 시 P2를 통해 SUP 저장소(12), CC(13)내의 생물학적 샘플, 및 GS 저장소(11) 내의 휘발성 액체 내에 로딩되고, 칩은 기준 각도에서 원심분리되고 나서 양수 또는 음수 각도로 원심분리하는 동안 기울어질 수 있다. 틸트 각도가 각도 범위(25c) 이상으로 증가되고 채널 세그먼트(17a)를 프라이밍하는데 충분히 오래 유지될 때마다, 각도가 유지되는 기간에 주로 의존하는 체적이 분배된다. 기울기 각도가 범위(25a) 아래로 낮아질 때마다 최소 수준 이상의 체적이 OUT 저장소(14)에 상청액으로 분배된다. 원심분리는 전형적으로 생물학적 샘플이 최소 수준 이하의 체적으로 침전되는 결과를 초래한다. 마지막으로 CC(13)의 모든 액체는 카트리지를 범위(25b) 이상으로 기울이면 사이펀 채널(18)을 통해 폐기물(15)로 이동할 수 있다.
바람직하게, 오프-칩인 임의의 열 제어 요소는 인큐베이션 또는 다른 열 제어 공정이 유체 전달 단계를 위해 중단될 필요가 없도록 칩 틸트 전체에 걸쳐 각각의 가열 체적와 정렬된 상태로 유지된다. 그 때문에 열 제어를 위한 칩 외부 금속 또는 이와 유사한 재료는 칩과 함께 기울어지는 칩 홀더 또는 카트리지에 제공될 수 있다.
도 4는 원심 플랫폼, 예를 들어 P1에만 압력을 공급하기 위한 공압 슬립 링과 함께 작동하도록 설계된 변형 칩(10)의 개략도이다. 모든 포트(P2-5)는 단순히 로딩 포트와 통풍구로 사용된다. 도 4의 칩(10)은 제 2 OUT 저장소(14)가 제공되지 않고 수동, 유체역학적 계량 및 증분 유체 전달 시스템이 SUP 저장소(12) 대신 사용된다는 점에서 도 4와 다르다. 수동 계량 시스템은 출원인의 특허 공개 WO 2013/003935호에 교시되어 있으며, 유체역학적 저항 채널(17a')을 통해 계량 챔버(12b)에 커플링된 대용량 저장소(12a)를 포함한다. 채널(17a')은 원심분리 속도의 실질적인 변화에도 거의 변화하지 않는 느린 전달을 제공하며 공급되는 유체의 특정 점도, 접촉각 및 밀도에 맞게 설계되었다. 이러한 유체는 고정된 속도로 계량 챔버(12b)에 축적된다. 챔버(12b)가 임계 레벨까지 충전되면 사이펀 채널(17b')이 프라이밍되고 챔버(12b)의 유체가 한 번에 CC(13)로 분출된다. 채널(17b')은 무시할 수 있는 유체 역학적 저항을 가질 수 있고 배출은 매우 빠른 공정이거나 대안적으로 CC(13)에 대한 개구 근처에 유체 역학적 수축이 있을 수 있으므로 액체가 CC(13)로 천천히 도입된다. 이는 예를 들어, 챔버(12b)가 CC(13)와 함께 가열되지 않는 경우 급격한 화학적 또는 온도 변화를 피하기 위해서 바람직할 수 있다. 17b' 및 CC(13)의 개구에 수축이 제공되는 경우, 수축은 채널(17a')보다 실질적으로 더 짧은 전달 지연을 가져야 하거나, 그렇지 않으면 챔버(12b)가 기능을 제공하지 않는다. 대용량 저장소(12a)로부터 CC(13)로 직접 연속적인 드립 공급이 제공될 수 있다.
도 5는 복수의 세포 지지 구조물(28)이 제공되는 도 1 내지 도 4의 실시예의 CC(13)의 개략도이다. 세포 지지 구조물(28)은 바람직하게, 동일한 칩(10)에 형성된 미세가공된 기둥이고, 다공성일 수 있고, 기능화되거나 당업계에 주지된 방식으로 세포 부착을 촉진하도록 코팅될 수 있다.
도 6은 GS 채널(16)이 CC(13)의 바닥에서 CC(13)와 만나 기포 방식으로 GS 저장소(11)로부터 CC(13)로 캐리어 가스 및 동반 가스를 공급하는 CC(13)의 변형이다. CC(13)는 기포를 수집하고 기포 발생에 의해 생성된 와류로부터 세포 지지 구조물(28)을 보호하기 위한 또는 기포를 CC(13)에 걸쳐 더 균일하게 분포시키기 위한 가스 트랩(gas trap)(29)을 가질 수 있다. 캐리어 가스의 전달 속도가 충분히 낮으면, 가스 트랩(29)에 수집된 가스가 트랩 범람 전에 용해되어 액체 내용물(26)에 고효율 가스 전달을 제공할 수 있다.
예
출원인은 세포 배양 장치에 필요한 모든 기능을 갖춘 "생체적합성" 폴리머 칩을 설계하고 테스트했다. 칩은 기능화 또는 코팅 없이 생체 적합성을 달성한다. 가스 교환은 GS 저장소에 의해 제공되고 세포 배양 조절 챔버에는 제어되고 가습된 분위기(제어된 가스 미세 환경)가 제공된다. 이는 일반적으로 가스 불투과성이며 PDMS 및 TPE에 대한 의존을 피하면서 가스 교환 조건을 생성하는 장치 제작을 위한 열가소성 폴리머의 사용을 보여준다. 본 발명은 칩 설계 및 사용으로 입증된다. 이러한 입증은 액체와 가스를 배양 챔버로 가져와 세포를 방해하지 않으면서 이들을 관류/혼합하는 출원인의 WO 2015/132743호의 능력을 활용한다. 신뢰할 수 있는 마이크로 규모의 인큐베이션 챔버가 효과적으로 생성되어 인큐베이터에 칩을 넣지 않고도 미세유체 칩에서 장기간 세포 배양이 가능하다. 8 포트 미세유체 칩 제어기는 칩에서 세포 배양을 입증하는데 사용되었다. 그러한 제어기는 원심력과 공압력의 조합된 적용을 통해 배양 중 세포에 가해지는 전단 응력의 정확한 제어를 포함한 현재 다른 세포 배양 플랫폼에서 이용할 수 없는 다수의 다른 고유한 기능을 제공하도록 구성될 수 있다. 마지막으로, 배양 칩은 혈액 및 기타 임상 관련 샘플에서 세포 분리와 같은 샘플 준비를 포함한 완전한 분석 통합을 위한 추가 챔버 및 채널로 쉽게 개발될 수 있다.
제안된 플랫폼의 적용은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 자동화된 배양 및 조절(활성화/자극)에 대해 입증되어 세포로부터 방출된 인터페론 감마(IFNγ)가 잠복 결핵감염(LTBI)과 같은 감염성 질병 진단 애플리케이션 맥락 내에서 후속적으로 특성화될 수 있다. 이러한 목적을 위해 원심 미세유체 칩 제어기에 의해 작동되는 미세 유체 칩을 설계, 제작 및 테스트했으며 이는 (1) 두 개의 개별 챔버에서 PBMC를 분리 및 배양하고, (2) 6시간 동안 미토겐과 함께 PBMC를 자극하고 배양하고; (3) 분석에 대한 후속 연결을 위해 조절된 배지를 분리하는 기능을 가진다.
도 7에 도시된 미세유체 카트리지는 5 요소의 패널이다. 도 7a, 도 7b, 및 도 7c는 각각 제작되고 테스트된 칩의 2개 층의 레이아웃이다. 칩의 상단(도 7b) 및 하단(도 7c) 표면이 모두 패터닝되었고, 패턴은 복합 레이아웃 도면(도 7a)에 표시된 것처럼 관통 구멍(비아)에 의해 상호 연결되었다. 칩은 CO2/가습기 챔버(GS 저장소)로부터 6 시간 배양 및 자극 동안 CO2의 지속적인 관류 및 증발(수화에 의한)을 방지하기 위해서 2 개의 세포 배양 챔버(CC)를 제공하도록 작동되었다. 펠티에 가열 요소는 칩 지지체에 통합되었으며 세포 배양 및 CO2 가습기 챔버의 온도를 37 ℃로 유지하는데 사용되었다. 원심분리를 통해 칩 제어기에서 5% CO2 캐리어 가스 스트림이 칩에 공급되었다. CO2 공급 라인은 칩 제어기의 공압 펌프에 연결되었고 CO2는 가열된 가습기 챔버(물을 포함하는 GS 저장소)로 지속적으로 펌핑되어 칩 내의 적절한 배양 챔버로 관류되도록 했다. 카트리지는 또한 각각의 CC에 커플링된 별도의 배양 배지 챔버(SUP 저장소)뿐만 아니라 상청액 및 폐기물 챔버를 포함한다.
미세유체 카트리지는 CNC 미세가공을 사용하여 COC 열가소성 폴리머로 제작되었다. 출원인은 특정 용례의 체적 요구 사항에 따라서 칩이 고온 엠보싱 또는 사출 성형을 사용하여 생체 적합성 열가소성 중합체로 제작될 가능성이 있어서, 배양 챔버 내의 추가 구조물, 예컨대 세포 트랩을 에칭할 수 있다는 점에 주목해야 한다. 챔버와 채널은 칩의 양쪽에 에칭되었고 카트리지를 형성하기 위해서 열 접합(접착제 또는 용매 접합이 고려되었지만)을 통해 평평한 COC 기판을 사용하여 밀봉되었다.
도 7b는 2 개의 세포 배양 CC를 나타내며, 각각은 포트와 CC 사이에 사형 경로가 있는 각각의 포트가 있고 CC 및 그들의 포트 위에 위치된 공통 가습기 챔버(GS 저장소)에 대한 채널(수축부 또는 밸브가 없음)이 있다. 이들 각각의 채널은 CC 또는 GS 저장소보다 칩의 기준 축 위치에 더 가깝게 통과한다. 가습기 챔버는 챔버에 물을 로딩한 다음 캐리어 가스 공급 포트로 사용하는 단일 포트를 가진다. 사진 7c는 각각의 CC에 대한 각각의 상청액(OUT 저장소) 및 배지 배양(SUP 저장소)을 보여준다.
카트리지를 칩 제어기에 장착하여 다음과 같이 작동시켰다. 세포 배양 CC는 먼저 각각의 배지에 현탁된 PBMC로 충전되고, 하나의 배양 배지 챔버(SUP 저장소)는 미토겐(PHA, 50 mM)이 보충된 배지로 충전되고 다른 하나는 세포 배양 배지로만 충전된다. 가습기 챔버(GS 저장소)는 물로 충전되고 카트리지는 세포 배양 및 자극을 위해 칩 제어기에 배치되었다. 플랫폼은 먼저 높은 회전 속도(500 내지 700 RPM)에서 원심분리되어서 모든 세포를 CC의 바닥에 침전시켜 샘플에서 세포를 분리했다. 초기 원심분리 후, 상청액은 폐기물로 제거되고 배지는 제어를 위한 새로운 배지로 교체되고 자극을 위한 미토겐이 있는 배지로 교체된다. (~300 RPM) 속도로 자극 원심분리 및 37 ℃에서 가열은 연속 5% CO2 관류하에 수행된다. 이는 6 시간 동안 지속되었다. 자극 후, 세포는 고주파에서 다시 원심분리되고 자극된 세포 방출 및 대조군을 포함하는 상청액은 후속 분석을 위해 각각의 상청액 챔버에 압력을 가함으로써 이동된다.
상청액은 ELISA 키트를 사용하여 분석되어 방출된 IFNγ의 농도를 측정하고 그 결과를 표준 평판 배양을 사용하여 얻은 결과와 비교하였다. 세포 배지만을 사용한 6 시간 배양은 미세유체 카트리지에 대해 45 pg/ml의 평균 IFNγ 농도를 생성했으며, 이는 표준 평판을 사용하여 얻은 67 pg/ml보다 약간 낮다. 그 차이는 6 시간 실험 동안 일정한 회전으로 인해 억제된 세포 기능 때문일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 얻어진 결과는 추출된 상청액에서 IFNγ 측정을 위한 분석 센서의 잠재적인 다운스트림 통합을 허용하는 자동화된 세포 배양 및 자극 분석의 성공적인 구현을 나타낸다. 세포는 탈수 또는 CO2 관류의 부족에 의해 명확히 영향을 받지 않았다.
구조 상의 고유한 다른 장점은 당업자에게 자명하다. 실시예는 본 명세서에서 예시적으로 설명되며 청구된 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니다. 전술한 실시예의 변형예는 당업자에게 자명할 것이며 발명자에 의해 다음 청구범위에 포함되도록 의도한다.

Claims (32)

  1. 원심 미세유체 칩으로서,
    각각의 체적이 0.1 μL 내지 1 mL이고 기준축 위치에 대해 정의된 공칭 충전 라인을 갖는 복수의 미세유체 챔버;
    각각의 챔버를 상호 연결하는 복수의 미세유체 채널; 및
    각각의 포트가 하나 이상의 챔버와 유체 연통하는 복수의 포트를 포함하며;
    챔버 중 하나는 채널을 통해 챔버(1, 2 및 3) 그리고 적어도 하나의 포트에 연결된 조절된 챔버이며,
    챔버(1)는 그의 충전 라인에 또는 그 위의 포트로부터의 제 1 개구 및 제 1 채널로의 제 2 개구를 가지며, 제 1 채널은 그의 충전 라인 아래의 챔버(1)를 조절된 챔버에 연결하며;
    챔버(2)는 충전 라인에 또는 그 위의 포트로부터의 제 1 개구, 그의 충전 라인에 또는 그 위에 있는 제 2 채널로의 제 2 개구를 가지며, 충전 라인 아래의 임의의 상호 연결 채널 또는 포트로의 개구가 없으며, 제 2 채널은 챔버(2)의 임의의 부분보다 기준 축에 더 가깝게 연장하는 경로 세그먼트를 포함하고 그의 충전 라인 위의 조절된 챔버와 충전 라인 위의 챔버(2)를 연결하며, 제 2 채널은 밸브가 없고 치수 수축된 모세관 흐름이 없으며;
    챔버(3)는 그의 충전 라인 위에 포트로의 제 1 개구 및 제 3 채널로의 제 2 개구를 가지며, 제 3 채널은 챔버(3)를 조절된 챔버의 충전 라인 아래에 있는 조절된 챔버에 연결하는;
    원심 미세유체 칩.
  2. 원심 미세유체 칩으로서,
    각각의 체적이 0.1 μL 내지 1 mL인 복수의 미세유체 챔버;
    각각의 챔버를 상호 연결하는 복수의 미세유체 채널; 및
    각각의 포트가 하나 이상의 챔버와 유체 연통하는 복수의 포트를 포함하며;
    챔버 중 하나는 채널을 통해 챔버(1, 및 2)에 연결되고 적어도 하나의 포트에 직접 연결된 조절된 챔버이며,
    챔버(1)는 챔버(1)의 충전 라인 위의 포트로부터의 제 1 개구 및 제 1 채널로의 제 2 개구를 가지며, 제 1 채널은 그의 충전 라인보다 챔버(1)의 축 원위 지점에 더 가까운 챔버(1)를 조절된 챔버의 충전 라인 위의 조절된 챔버에 연결하며;
    챔버(2)는 챔버(2)를 위한 충전 라인의 경계를 구획하는 배수로 개구, 충전 라인 위의 포트로부터의 제 1 개구, 및 충전 라인 위의 제 2 채널로의 제 2 개구를 가지며 충전 레벨 아래의 임의의 채널에는 개구가 없으며;
    제2 채널은 조절된 챔버 또는 챔버(2)보다 칩에 대한 기준 축 위치에 더 가깝게 연장하고 조절된 챔버에 연결되는 경로 세그먼트를 포함하는;
    원심 미세유체 칩.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    칩의 기준 축 위치는 챔버 위 영역 내에 있고 칩의 상단 에지로부터 2L 미만이고 칩의 중심선으로부터 0.65L 미만이며, L은 칩의 길이인,
    원심 미세유체 칩.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    칩의 기준 축 위치는 챔버 위의 영역 내에 있고 칩의 상단 에지로부터 3/2L 미만이고 칩의 중심선으로부터 0.5L 미만이며, L은 칩의 길이인,
    원심 미세유체 칩.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    칩의 기준 축 위치는 챔버 위의 영역 내에 있고 칩의 상단 에지로부터 L보다 작고 칩의 중심선으로부터 0.5W 미만이며, L은 칩의 길이이고 W는 칩의 폭인,
    원심 미세유체 칩.
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    기준 축 위치는 챔버(2)의 두 개구의 중간점을 통과하는 두 라인 사이에 놓이며, 두 라인은 두 개구의 수직 이등분선에 의해 이등분되고 수직 이등분선과 각각 30° 및 -30°의 각도를 이루는,
    원심 미세유체 칩.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    칩의 기준 축 위치는 P1 및 개구로부터 제 2 채널로 분리되며, 이들 분리는 2배 이하만큼 상이하며 챔버(2)의 충전 라인은 충전 라인 아래에 있는 챔버(2)의 체적의 적어도 33%의 체적을 포함하는,
    원심 미세유체 칩.
  8. 제 7 항에 있어서,
    충전 라인은 바람직하게, 챔버(2)의 체적의 적어도 50% 또는 60% 또는 66% 또는 70% 또는 75%를 포함하는,
    원심 미세유체 칩.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    챔버(2)의 충전 라인의 표면적은 챔버(1)의 표면적보다 적어도 2배, 더 바람직하게 4배, 또는 더 바람직하게 10배 더 큰,
    원심 미세유체 칩.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조절된 챔버 및 챔버(2) 중 적어도 하나는 칩의 임의의 다른 챔버 또는 채널의 에칭 깊이보다 더 큰 에칭 깊이를 가지는,
    원심 미세유체 칩.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    챔버(2)의 형상은 10% 미만의 액체 함량의 자유 표면적 변화를 초래하고 충전 라인으로부터의 액체 함량의 체적은 10% 감소하는,
    원심 미세유체 칩.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조절된 챔버는 상이한 원심 분획물을 추출하기 위해서 충전 라인을 넘어 상이한 축방향 거리에서 출구 채널에 대한 복수의 개구를 포함하는,
    원심 미세유체 칩.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포트의 하위 집합은 어드레스 가능한 공압 작동을 위해 제공되며 이들 포트는 동시 클램핑된 밀봉 연결을 위해 칩의 에지를 따라 정렬되는,
    원심 미세유체 칩.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    챔버(2)의 포트는 밀봉된 공급 튜브에 커플링하는데 적합한 형태를 가지는,
    원심 미세유체 칩.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조절된 챔버는 미생물 또는 세포에 대한 지지체; 및 제 2 채널과 기준 축 위치에 대한 개구와 동일선상에 있는 가스 트랩을 포함하며, 가스 트랩은 기준 축 위치와 개구 사이에 위치되어, 가스가 액체로 확산하는 동안 가스 기포를 유지하는,
    원심 미세유체 칩.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    열 흡수 및 분배 재료는 조절된 챔버와 챔버(2) 중 하나에 인접하게 제공되는,
    원심 미세유체 칩.
  17. 제 16 항에 있어서,
    조절된 챔버와 챔버(2)를 독립적으로 가열하기 위해서 두 개의 별도로 어드레스 가능한 재료 밴드가 제공되는,
    원심 미세유체 칩.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    칩이 덮여 있고 원심분리기의 가압된 캐리어 가스 공급 장치에 커플링된 칩의 적어도 하나의 공압적으로 어드레스 가능한 포트가 있는 원심분리기에 장착하도록 구성된 미세유체 카트리지를 형성하는,
    원심 미세유체 칩.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 채널은 그의 충전 라인 아래의 개구에서 조절된 챔버와 만나는,
    원심 미세유체 칩.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 채널은 무시할 수 있는 모세관 효과와 유체역학적 저항으로 자유 흐름을 받으며 친수성 또는 소수성 코팅을 갖지 않는,
    원심 미세유체 칩.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 챔버(1)는 각각의 조절된 챔버의 축-근위에 위치되며, 임의의 챔버(3)는 각각의 조절된 챔버의 축-원위에 위치되는,
    원심 미세유체 칩.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    칩은 열가소성, 열가소성 엘라스토머 또는 적합한 가스 불투과성 층이 있는 PDMS로 구성되는,
    원심 미세유체 칩.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    칩은 열가소성 엘라스토머로 구성되며, 칩의 하나 이상의 포트는 칩 내의 공압 밸브를 작동하는데 사용되는,
    원심 미세유체 칩.
  24. 제 23 항에 있어서,
    공압 밸브는 평상시 폐쇄 밸브, 평상시 개방 밸브 또는 개방, 폐쇄 및 반영구적 폐쇄 상태의 3 상태 밸브인,
    원심 미세유체 칩.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 채널 이외의 채널 중 3개 이상은 각각의 축-근위 세그먼트를 가지며, 칩의 표면에 수직인 틸트 축에 대한 칩의 틸트 각도가 조절된 챔버와 이들 챔버 중 단지 하나의 챔버 사이에 유체 이동을 허용하도록 선택된 형상, 위치 및 충전 라인을 갖는 각각의 챔버에 조절된 챔버를 연결하는,
    원심 미세유체 칩.
  26. 제 25 항에 있어서,
    45° 미만의 틸드 각도 범위는 조절된 챔버와 3 개의 개별 챔버 사이에서 순차적으로 전달하는데 충분한,
    원심 미세유체 칩.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 채널은 유체역학적 수축부 및 계량 챔버를 포함하는,
    원심 미세유체 칩.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 칩을 포함하는 키트로서,
    칩에 로딩하기 위한 액체;
    원심 미세유체 칩 제어기 중 하나에 커플링되도록 구성된 칩 형태 카트리지, 공압 슬립 링이 있는 원심 분리기 블레이드, 또는 공압 슬립 링이 있는 관절식 원심분리기 블레이드와 조합되는 하나 이상의 카트리지 형성 요소; 및
    카트리지, 칩 또는 칩 지지체에 적용하기 위한 재료로서, 조절된 챔버, 챔버(2), 또는 그들의 충전 라인 아래에 있는 이들 중 하나의 일부분에 대한 열 제어를 제공하기 위한 조성 및 치수를 갖는 재료를 포함하는,
    키트.
  29. 제 28 항에 있어서,
    액체는 챔버(2)를 위한 휘발성 액체 내용물; 조절된 챔버에 대한 생물학적 샘플을 포함하거나 잠재적으로 포함하는 액체; 또는 챔버(1)에 대한 하나 이상의 시약, 완충제 또는 용액 중 하나를 포함하는,
    키트.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
    키트는 원심 미세유체 칩 제어기; 공압 슬립 링이 있는 원심분리기 블레이드; 또는 공압 슬립 링이 있는 관절식 원심 분리기 블레이드에 조립 및 장착되는,
    키트.
  31. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 칩을 포함하는 원심 미세유체 시스템으로서,
    액체는 챔버 중 하나에서 충전 라인까지 포함되어 있는,
    원심 미세유체 시스템.
  32. 제 31 항에 있어서,
    챔버 중 하나에 포함된 액체는 챔버(2)에 대한 휘발성 액체 내용물, 조절된 챔버 내에 생물학적 샘플을 포함하거나 잠재적으로 포함하는 액체, 또는 챔버(1)에 있는 하나 이상의 시약, 완충제 또는 용액인,
    원심 미세유체 시스템.
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