KR20220029249A

KR20220029249A - 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치

Info

Publication number: KR20220029249A
Application number: KR1020200111332A
Authority: KR
Inventors: 조승우; 최수정; 전은제; 이종승
Original assignee: 주식회사 세라트젠
Priority date: 2020-09-01
Filing date: 2020-09-01
Publication date: 2022-03-08
Also published as: US20230201109A1; EP4190316A1; WO2022050694A9; CN116113403A; WO2022050694A1; KR102483403B1

Abstract

본 발명은 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치; 및 상기 하이드로젤 패치에 담지된 연골 또는 골 질환 치료용 약물을 포함하는 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 하이드로젤 패치에 관한 것이다.

Description

연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치{BIO-INSPIRED TISSUE-ADHESIVE HYDROGEL PATCH FOR PREVENTING OR TREATING CARTILAGE OR BONE DISEASE}

본 발명은 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치(특히, 페놀기 수식 생체 적합성 고분자 하이드로젤 패치)의 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

뼈는 생체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한, 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질, 즉, 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 생체의 중요한 부분 중 하나이다.

생체를 구성하는 뼈 사이에는 관절이 존재한다. 관절은 두개골이나 이의 치근처럼 서로 접하는 두 개의 뼈나 연골 사이에 가동성이 거의 또는 전혀 없는 부동성관절과 동물의 팔 다리의 뼈나 턱뼈처럼 양쪽 뼈 사이에 결합 조직이 많고 가동성이 큰 가동관절, 연합관절 및 반관절로 나뉜다. 일반적으로 관절이라 하는 것은 가동관절을 말하며, 이 가동관절은 양쪽의 뼈가 인대만으로 결합되어 있는 인대결합과 활액막성 결합으로 나뉜다. 활액막성 결합은 관절이 결합조직성의 주머니(관절낭)으로 쌓여 있는 것으로, 관절낭의 안쪽은 윤활유의 성격을 하는 활액을 분비하고 외부에는 많은 인대가 부착되어 있어 관절을 보강한다.

이러한 뼈 및 관절과 관련한 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료를 위해, 기존에는 항염증제 등을 생체 내 전달하기 위한 전달체로서 하이드로젤을 이용한 연구가 진행되었다. 이러한 연구 대부분은 하이드로젤 용액에 항염증제 등을 탑재하고 가교시켜 젤 형성을 유도하는 방식에 관한 연구였다. 그러나, 이러한 방식은 하이드로젤을 생체에 주입하는 형태로 적용되기 때문에 하이드로젤을 다루는 사용자의 숙련도에 따라 결과가 달라질 가능성이 많고 사용자의 편의성이 크게 떨어지는 문제가 있다. 또한, 주사를 통하여 생체 내로 주입되기 때문에 조직 손상 및 출혈의 위험성이 여전히 존재하고, 기존의 하이드로젤은 물성 및 접착력이 생체 내에서 장기간 유지되기에는 부족한 경우가 많았다.

본 발명은 기계적 물성, 조직 접착력, 생체적합성 및 사용편의성이 우수하면서, 연골 또는 골 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치를 제조하기 위한 것으로, 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치; 및 상기 하이드로젤 패치에 담지된 연골 또는 골 질환 치료용 약물을 포함하는 하이드로젤 패치 등을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치; 및 상기 하이드로젤 패치에 담지된 연골 또는 골 질환 치료용 약물을 포함하는 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 하이드로젤 패치를 제공한다.

상기 페놀기는 카테콜(catechol), 4-tert-부틸카테콜(4-tert-butylcatechol; TBC), 우루시올(urushiol), 알리자린(alizarin), 도파민(dopamine), 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride), 3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine; DOPA), 카페익산(caffeic acid), 노르에피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrine), 3,4-디하이드록시페닐아세트산(3,4-dihydroxyphenylacetic acid; DOPAC), 이소프레날린(isoprenaline), 이소프로 테레놀(isoproterenol) 및 3,4-디하이드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 카테콜계 화합물 유래 카테콜기; 또는 파이로갈롤(pyrogallol), 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine), 타닌산 (tannic acid), 갈산 (gallic acid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate), 2,3,4-트리하이드록시벤즈알데하이드(2,3,4-trihydroxybenzaldehyde), 2,3,4-트리하이드록시벤조산(2,3,4-Trihydroxybenzoic acid), 3,4,5-트리하이드록시벤즈알데하이드(3,4,5-Trihydroxybenzaldehyde), 3,4,5-트리하이드록시벤즈아마이드(3,4,5-Trihydroxybenzamide), 5-tert-부틸파이로갈롤(5-tert-Butylpyrogallol) 및 5-메틸파이로갈롤(5-Methylpyrogallol)로 이루어진 군으로부터 선택된 파이로갈롤계 화합물 유래 파이로갈롤기일 수 있다.

상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 알지네이트, 키토산, 키틴, 콜라겐, 젤라틴, 콘드로이틴황산, 펙틴, 케라틴 및 피브린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 하이드로젤 패치는 ⅰ) 두께가 0.05 내지 10.0 ㎜이고, ⅱ) 0.1 Hz 내지 10 Hz의 주파수 범위에서, 1×10³ Pa 내지 1×10⁶ Pa의 저장 탄성률(G’)을 가지며, ⅲ) 5N의 수직항력 하에 0.01 m/s의 속도에서 측정된 마찰계수가 0.2 내지 0.4일 수 있다.

상기 하이드로젤 패치에 무기 미네랄 입자를 추가로 포함할 수 있다.

상기 무기 미네랄 입자는 칼슘, 마그네슘 및 인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 무기 이온을 포함할 수 있다.

상기 무기 이온은 상기 페놀기와 상호 작용을 하여 배위 결합을 통한 착화합물을 형성할 수 있고, 상기 무기 이온은 상기 약물과 이온성 상호 작용을 할 수 있다.

상기 약물은 덱사메타손(dexamethasone), 코르티코손(cortisone), 프레드니솔론(prednisolone), 하이드로코르티코손(hydrocortisone), 트리암시놀론(triamcinolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 프레드니손(prednisone) 및 베타메타손(betamethasone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 항염증제; 또는 BMP-2(BMP-2a), BMP-3(Osteogenin), BMP-4(BMP-2b), BMP-6(human homologue of the murine, Vgr-1), BMP-7(Osteogenic protein-1) 및 BMP-9(Growth differentiation factor 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 골형성단백질을 포함할 수 있다.

상기 연골 질환은 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 퇴행성 관절염(degenerative arthritis), 골연골종증(osteochondromatosis), 염좌(distortion), 윤활낭염(bursitis), 반월상 연골 손상(menstruation), 원판형 반월상 연골파열 (meniscal tear), 반월상 연골 낭포(meniscus cyst), 측부 인대 손상(collateral ligament rupture), 전방십자인대 손상(anterior cruciate ligament injury), 후방 뒤십자인대 손상(posterior cruciate ligament injury), 관절 내 유리체 (intra-articular vitreous), 박리성 뼈연골염(exfoliation osteochondritis), 추벽 증후군(plica syndrome), 내반슬(genu varum), 외반슬(knock-knee) 및 발음성 슬관절(snapping knee)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 골 질환은 성장기 발육부진, 골감소증, 골 취약증, 골 괴사, 골절, 과 도한 파골세포의 골 흡수에 의한 골다공증(osteoporosis), 골형성부전증, 뼈의 손 상, 외상에 의한 관절손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사 성 골질환, 신성골이영양증(renal osteodystrophy), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease) 및 전이성 골암(metastatic bone cancers)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 연골 또는 골 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치(특히, 페놀기 수식 생체 적합성 고분자 하이드로젤 패치)는 용액 기반의 벌크 하이드로젤과 비교하여 기계적 물성, 조직 접착력, 생체적합성 및 사용편의성이 우수할 뿐만 아니라, 생체 내에서 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물을 효과적으로 서방출시킬 수 있어 지속적인 치료 효과를 유도할 수 있다.

특히, 연골 질환 예방 또는 치료를 위해, 덱사메타손 등 항염증제를 담지한 경우, 우수한 염증성 관절염 치료 효능을 가질 뿐만 아니라, 보행 기능을 증진시킬 수 있으며, 연골 손상을 감소시키고 연골조직 재생을 증진시킬 수 있다. 한편, 골 질환 예방 또는 치료를 위해, 골형성단백질을 담지한 경우, 골 분화 증진 효과를 가질 뿐만 아니라, 골 재생을 증진시킬 수 있다.

더욱이, 상기 하이드로젤 패치에, 무기 미네랄 입자(특히, 휘틀록석(Whitlockite))를 첨가한 경우, 무기 미네랄 입자에서 방출되는 무기 이온이 페놀기 또는 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물과 이온성 상호 작용할 수 있어 기계적 물성뿐만 아니라, 해당 효능을 더욱 증진시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 페놀기 수식 생체 적합성 고분자 하이드로젤 패치의 적용 부위 및 과정을 나타낸 그림이다.
도 2는 HA-CA의 구조식(a)과, HA-CA 하이드로젤 패치의 팽윤도(b) 및 효소에 의한 분해 속도(c)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 HA-CA 하이드로젤 패치의 저장탄성률 및 손실탄성률(a)과 평균 저장탄성률(b)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HA-CA 하이드로젤 패치의 마찰계수(a), 마모도 여부(b) 및 마모도 면적(c)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 덱사메타손이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치의 약물 서방출 양상 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 덱사메타손이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치의 염증성 관절염 치료 효능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 덱사메타손이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치의 보행 기능 증진 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 덱사메타손이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치의 연골 손상 감소/연골 조직 재생 증진 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 HA-PG의 구조식(a)과, HA-PG 하이드로젤 패치의 팽윤도(b) 및 효소에 의한 분해 속도(c)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 HA-PG 하이드로젤 패치의 저장탄성률 및 손실탄성률(a)과 평균 저장탄성률(b)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 HA-PG 하이드로젤 패치의 마찰계수(a), 마모도 면적(b) 및 마모도 여부(c)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 덱사메타손이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치의 약물 서방출 양상 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 덱사메타손이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치의 염증성 관절염 치료 효능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 덱사메타손이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치의 보행 기능 증진 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 덱사메타손이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치의 연골 손상 감소/연골 조직 재생 증진 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 구현예에 따른 페놀기 수식 생체 적합성 고분자 하이드로젤 패치에, 무기 미네랄 입자를 첨가한 경우, 적용 부위 및 과정을 나타낸 그림이다.
도 17은 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 팽윤도(a) 및 효소에 의한 분해 속도(b)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 내부 구조를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 내 무기 미네랄 입자의 분포도를 나타낸 것이다.
도 20은 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 가교 기전을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 화학적 조성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 무기 이온 방출 양상 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 저장탄성률 및 손실탄성률(a)과 평균 저장탄성률(b)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 압축 강도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 조직 접착력을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 생체적합성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 BMP-2가 담지된 무기 미네랄 입자 첨가 HA-CA 하이드로젤 패치의 약물 서방출 양상(a)을 평가한 결과를 나타낸 것이고, 무기 미네랄 입자 및 BMP-2 간의 이온성 상호 작용(b)을 확인한 결과를 나타낸 것이며, 무기 미네랄 입자, BMP-2 및 페놀기 간의 다양한 상호 작용(c)을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 28 및 도 30은 BMP-2가 담지된 무기 미네랄 입자 첨가 HA-CA 하이드로젤 패치의 골 분화 증진 효과를 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 31 및 도 32는 BMP-2가 담지된 무기 미네랄 입자 첨가 HA-CA 하이드로젤 패치의 골 결손 모델 치료 효능을 평가한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치(특히, 페놀기 수식 생체 적합성 고분자 하이드로젤 패치)가 기계적 물성, 조직 접착력, 생체적합성 및 사용편의성이 우수할 뿐만, 생체 내에서 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물을 효과적으로 서방출시킬 수 있어 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료에 효과적임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 내 “연골 질환”이라 함은 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 퇴행성 관절염(degenerative arthritis), 골연골종증(osteochondromatosis), 염좌(distortion), 윤활낭염(bursitis), 반월상 연골 손상(menstruation), 원판형 반월상 연골파열 (meniscal tear), 반월상 연골 낭포(meniscus cyst), 측부 인대 손상(collateral ligament rupture), 전방십자인대 손상(anterior cruciate ligament injury), 후방 뒤십자인대 손상(posterior cruciate ligament injury), 관절 내 유리체 (intra-articular vitreous), 박리성 뼈연골염(exfoliation osteochondritis), 추벽 증후군(plica syndrome), 내반슬(genu varum), 외반슬(knock-knee) 및 발음성 슬관절(snapping knee)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 염증성 관절염(inflammatory arthritis)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 연골 질환의 예방 또는 치료 효능은 염증성 관절염 치료 효능 평가, 보행 기능 증진 평가 또는 연골 손상 감소/연골 조직 재생 증진 평가를 통해 확인될 수 있다.

본 명세서 내 “골 질환”이라 함은 성장기 발육부진, 골감소증, 골 취약증, 골 괴사, 골절, 과 도한 파골세포의 골 흡수에 의한 골다공증(osteoporosis), 골형성부전증, 뼈의 손 상, 외상에 의한 관절손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사 성 골질환, 신성골이영양증(renal osteodystrophy), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease) 및 전이성 골암(metastatic bone cancers)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 골 질환의 예방 또는 치료 효능은 골 분화 증진 효과 검증 또는 골 결손 모델 치료 효능 평가를 통해 확인할 수 있다. 이때, 상기 골 분화 증진 효과는 collagen type 1 (Col1), runt-related transcription factor 2 (RUNX2), osteopontin (OPN), osteocalcin (OCN) 등 골 분화 마커의 발현 증가 여부를 확인하거나, 줄기세포 골 분화에 따른 칼슘 침착 정도를 확인함으로써 이루어질 수 있다.

먼저, 본 발명에 따른 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 하이드로젤 패치는 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치를 포함한다.

본 명세서 내 “페놀기”라 함은 말단에 페놀계 화합물 유래 작용기, 바람직하게, 하이드록시기(-OH) 두개가 인접 위치한 1,2-디하이드록시벤젠(dihydroxybenzene)을 포함하는 카테콜계 화합물 유래 작용기 또는 히드록시기(-OH) 세개가 인접 위치한 1,2,3-트리하이드록시벤젠(trihydroxybenzene)을 포함하는 파이로갈롤계 화합물 유래 작용기로서, 상기 페놀기는 산화반응에 의해서 여러가지 작용기(functional group)와 공유 가교(cross-linking)를 형성하고, 선택적으로, 상기 페놀기는 산화된 상태에서 후술하는 무기 이온과 상호 작용을 할 수 있고, 구체적으로, 상기 인접 위치한 두개의 하이드록시기(-OH)는 산화된 상태에서 후술하는 무기 이온 간의 배위 결합(예컨대, 무기 이온(Ca²⁺, Mg²⁺ 등) - 옥사이드 배위 결합)을 통한 착화합물을 형성할 수 있고, 보다 구체적으로, 하나의 생체적합성 고분자에 수식된 인접 위치한 두개의 하이드록시기(-OH)와 다른 생체적합성 고분자에 수식된 인접 위치한 두개의 하이드록시기(-OH)는 모두 산화된 상태에서 총 4개의 리간드로 작용하여, 후술하는 무기 이온 간의 배위 결합을 통한 착화합물을 형성할 수 있다. 결과적으로, 서로 다른 생체적합성 고분자에 수식된 페놀기들은 후술하는 무기 이온을 통해 가교될 수 있다. 상기 페놀기 외에 상기 생체적합성 고분자와 반응하기 위한 말단 작용기를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

구체적으로, 상기 카테콜계 화합물은 카테콜(catechol), 4-tert-부틸카테콜(4-tert-butylcatechol; TBC), 우루시올(urushiol), 알리자린(alizarin), 도파민(dopamine), 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride), 3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine; DOPA), 카페익산(caffeic acid), 노르에피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrine), 3,4-디하이드록시페닐아세트산(3,4-dihydroxyphenylacetic acid; DOPAC), 이소프레날린(isoprenaline), 이소프로 테레놀(isoproterenol) 및 3,4-디하이드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 본 발명에서는 카테콜계 화합물로서, 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride)를 사용하였고, 이때, 상기 도파민 하이드로클로라이드의 말단 작용기 중에 -NH₂가 상기 생체적합성 고분자(특히, 히알루론산)와 반응할 수 있다.

또한, 상기 파이로갈롤계 화합물은 파이로갈롤(pyrogallol), 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine), 타닌산 (tannic acid), 갈산 (gallic acid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate), 2,3,4-트리하이드록시벤즈알데하이드(2,3,4-trihydroxybenzaldehyde), 2,3,4-트리하이드록시벤조산(2,3,4-Trihydroxybenzoic acid), 3,4,5-트리하이드록시벤즈알데하이드(3,4,5-Trihydroxybenzaldehyde), 3,4,5-트리하이드록시벤즈아마이드(3,4,5-Trihydroxybenzamide), 5-tert-부틸파이로갈롤(5-tert-Butylpyrogallol) 및 5-메틸파이로갈롤(5-Methylpyrogallol)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 본 발명에서는 파이로갈롤계 화합물로서, 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine)을 사 용하였고, 이때, 상기 5-하이드록시도파민의 말단 작용기 중에 -NH₂가 상기 생체적 합성 고분자(특히, 히알루론산)와 반응할 수 있다.

특히, 상기 페놀기가 파이로갈롤기인 경우, 특히 빠르게 산화되는 특성으로 인해 생체 내와 같이 산소농도가 높은 환경에서는 산화제 처리 없이 자연산화가 수 분내로 이루어질 수 있으므로 하이드로젤 패치를 실제 임상에 적용할 때 별도의 산화제 처리 없이 바로 적용이 가능한 장점이 있다.

본 명세서 내 “생체적합성 고분자”라 함은 상기 페놀계 화합물에 존재하는 말단 작용기와 반응하여 페놀기가 수식될 수 있고, 구체적으로, 히알루론산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 알지네이트, 키토산, 키틴, 콜라겐, 젤라틴, 콘드로이틴황산, 펙틴, 케라틴 및 피브린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 히알루론산인 것이 바람직하고, 분자량이 100 kDa 내지 10 MDa인 히알루론산인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 히알루론산의 말단 작용기 중에 -COOH가 상기 페놀계 화합물과 반응할 수 있다.

본 명세서 내 “하이드로젤 패치”라 함은 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 것으로, 일정 두께를 갖는 얇은 막 형태의 구조물을 말하며, 공지의 방법을 이용하여, 예컨대, 잘라서 또는 몰드를 통해, 원하는 형태로 사용할 수 있는 장점이 있다. 용액 기반의 벌크 하이드로젤과 비교하여 기계적 물성, 조직 접착력, 생체적합성 및 사용편의성이 우수한 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 상기 하이드로젤 패치는 하기 단계를 통해 제조될 수 있다:

(a) 평평한 표면에 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액을 고르게 붓는 단계; 및

(b) 상기 용액을 영하 0.5℃ 내지 영하 100℃에서 5시간 내지 48시간 동안 동결건조시키는 단계.

구체적으로, 상기 (a) 단계는 원통 몰드에 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액을 40~ 200 ㎕씩 붓는 방식으로 이루어질 수 있으며, 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액은 0.1 내지 5(w/v)% 농도, 바람직하게 0.5 내지 3(w/v)% 농도로 사용될 수 있다. 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액의 용량은 0.8 내지 3.2 ㎜ 두께의 하이드로젤 패치를 만들기 위한 것으로 두께 조절이 용이하다.

또한, 상기 (b) 단계는 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액을 영하 0.5℃ 내지 영하 100℃ 에서 5시간 내지 48 시간 동안 동결건조시키거나, 바람직하게, 영하 50℃ 내지 영하 100℃에서 12시간 내지 36시간 동안 동결건조시키는 방법으로 이루어질 수 있다. 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액을 동결건조시키면 용액의 부피가 축소하면서 일정한 두께를 갖는 얇은 막 형태의 하이드로젤 패치가 만들어질 수 있다.

이로써, 상기 하이드로젤 패치는 ⅰ) 두께가 0.05 내지 10.0 ㎜, 바람직하게, 0.1 내지 5.0 ㎜, 보다 바람직하게, 1.6 mm 내지 5.0 mm 이고, ⅱ) 0.1 Hz 내지 10 Hz의 주파수 범위에서, 1×10³ Pa 내지 1×10⁶ Pa, 바람직하게, 1×10⁴ Pa 내지 1×10⁶ Pa, 보다 바람직하게, 3×10⁴ Pa 내지 1×10⁶ Pa의 저장 탄성률(G’)을 가지며, ⅲ) 5N의 수직항력 하에 0.01 m/s의 속도에서 측정된 마찰계수가 0.2 내지 0.4, 바람직하게, 0.3 내지 0.4일 수 있다. 상기 하이드로젤 패치가 파이로갈롤기 수식 생체 적합성 고분자 하이드로젤 패치인 경우, 특히, 여기에 무기 미네랄 입자 (특히, 휘틀록석(Whitlockite))를 첨가한 경우, 기계적 물성을 더욱 향상시킬 수 있다.

상기 하이드로젤 패치에 무기 미네랄 입자를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 무기 미네랄 입자에서 방출되는 무기 이온이 페놀기 또는 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물과 이온성 상호 작용할 수 있어 기계적 물성뿐만 아니라, 해당 효능을 더욱 증진시킬 수 있는 것을 특징으로 한다. 상기 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액에 대하여, 상기 무기 미네랄 입자는 0.1 내지 10(w/v)% 농도, 바람직하게 0.5 내지 5(w/v)% 농도로 첨가될 수 있다. 즉, 상기 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 및 상기 무기 미네랄 입자의 중량비는 1:1 내지 1:100, 바람직하게, 1:1 내지 1:5일 수 있다.

구체적으로, 상기 무기 미네랄 입자는 칼슘, 마그네슘 및 인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 무기 이온을 포함할 수 있고, 이러한 무기 이온은 골 재생에 도움이 된다. 예컨대, 상기 무기 미네랄 입자가 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 또는 휘틀록석(whitlockite)인 경우, 칼슘 및 인 등을 포함하는바, 이들을 방출시킬 수 있다. 특히, 상기 무기 미네랄 입자가 휘틀록석(whitlockite)인 경우, 마그네슘을 추가로 방출시킬 수 있는 이점이 있다. 상기 무기 이온 중 칼슘 또는 마그네슘은 양이온성 표면전하를 가지는바, 상기 산화된 페놀기와 상호 작용을 할 수 있고, 구체적으로, 상기 무기 이온 중 칼슘 또는 마그네슘과 상기 산화된 인접 위치한 두개의 하이드록시기(-OH) 간의 배위 결합(예컨대, 무기 이온(Ca²⁺, Mg²⁺ 등) - 옥사이드 배위 결합)을 통한 착화합물을 형성할 수 있고, 보다 구체적으로, 하나의 생체적합성 고분자에 수식된 인접 위치한 두개의 하이드록시기(-OH)와 다른 생체적합성 고분자에 수식된 인접 위치한 두개의 하이드록시기(-OH)가 모두 산화된 상태에서 총 4개의 리간드로 작용하여, 상기 무기 이온 중 칼슘 또는 마그네슘 간의 배위 결합을 통한 착화합물을 형성할 수 있다. 결과적으로, 상기 무기 이온은 서로 다른 생체적합성 고분자에 수식된 페놀기들을 가교시킬 수 있다.

따라서, 기계적 물성을 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 무기 이온 중 인은 음이온성 표면전하를 가지는바, 후술하는 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물(특히, 골형성단백질)과 이온성 상호 작용을 하여, 후술하는 약물의 서방출을 가능하게 할 수 있다.

다음으로, 본 발명에 따른 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 하이드로젤 패치는 상기 하이드로젤 패치에 담지된 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물을 포함한다. 상기 하이드로젤 패치의 총 함량에 대하여, 상기 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물의 함량은 0.002 중량% 내지 10 중량%일 수 있고, 0.002 중량% 내지 4 중량%인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 다시 말해, 상기 하이드로젤 패치(0.05~10.0 mm 직경 및 0.05~10.0 ㎜ 두께 기준, 바람직하게, 0.1~5.0 mm 직경 및 0.1~5.0 ㎜ 두께 기준) 당, 상기 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물 100 ng 내지 2 mg을 담지시킬 수 있다.

이는 생체 내에서 효과적으로 서방출될 수 있어 지속적인 치료 효과를 유도할 수 있다. 상기 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물에는 다양한 친핵성 작용기들이 존재할 수 있어, 산화된 페놀기와 강한 결합을 일으킬 수 있다.

구체적으로, 상기 연골 질환 예방 또는 치료용 약물은 덱사메타손, 코르티코손(cortisone), 프레드니솔론(prednisolone), 하이드로코르티코손(hydrocortisone), 트리암시놀론(triamcinolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 프레드니손(prednisone) 및 베타메타손(betamethasone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 항염증제일 수 있는데, 특히, 연골 질환 예방 또는 치료를 위해, 덱사메타손 등 코르티코스테로이드계(corticosteroid-based) 항염증제를 담지한 경우, 우수한 담지 효율을 가지면서, 우수한 염증성 관절염 치료 효능을 가질 뿐만 아니라, 보행 기능을 증진시킬 수 있으며, 연골 손상을 감소시키고 연골조직 재생을 증진시킬 수 있다. 이러한 항염증제에 존재하는 친핵성 작용기들(카르복실기, 하이드록시기 등)은 산화된 페놀기와 강한 결합을 일으킬 수 있으므로, 생체 내에서 효과적으로 서방출될 수 있다.

또한, 상기 골 질환 예방 또는 치료용 약물은 BMP-2(BMP-2a), BMP-3(Osteogenin), BMP-4(BMP-2b), BMP-6(human homologue of the murine, Vgr-1), BMP-7(Osteogenic protein-1) 및 BMP-9(Growth differentiation factor 2) 로 이루어진 군으로부터 선택된 골형성단백질을 포함할 수 있는데, 골 질환 예방 또는 치료를 위해, 골형성단백질을 담지한 경우, 골 분화 증진 효과를 가질 뿐만 아니라, 골 재생을 증진시킬 수 있다. 이러한 골형성단백질에 존재하는 친핵성 작용기들(티올기, 아민기 등)은 산화된 페놀기와 강한 결합을 일으킬 수 있으므로, 생체 내에서 효과적으로 서방출될 수 있다.

상기 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물(특히, 골형성단백질)은 상기 무기 이온 중 인과 이온성 상호 작용을 할 수 있다.

구체적으로, 상기 하이드로젤 패치에 상기 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물을 담지하는 방법은 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액과 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물을 혼합시켜 하이드로젤 패치를 제조하거나, 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 하이드로젤 패치에 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물을 도포한 후 산화제를 처리하여 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 하이드로젤 패치에 약물을 가교시키는 방법을 사용할 수 있다. 이때, 산화제의 처리는 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물이 도포된 하이드로젤 패치에 산화제 용액을 도포하거나 분사하는 방식으로 이루어질 수 있다. 다만, 상기 하이드로젤 패치에서 파이로갈롤기가 수식된 경우, 별도의 산화제 처리 없이도 생체 내 환경에서 자연산화되므로 실제 임상에서 간편하게 사용할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 연골 또는 골 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치(특히, 페놀기 수식 생체 적합성 고분자 하이드로젤 패치)는 용액 기반의 벌크 하이드로젤과 비교하여 기계적 물성, 조직 접착력, 생체적합성 및 사용편의성이 우수할 뿐만 아니라, 생체 내에서 연골 또는 골 질환 예방 또는 치료용 약물을 효과적으로 서방출시킬 수 있어 지속적인 치료 효과를 유도할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

제조예 1

(1) HA-CA 하이드로젤 패치 제작

도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride)를 사용하여 카테콜기가 수식된 히알루론산(catechol-functionalized hyaluronic acid; 이하, HA-CA로 기재함)(분자량 = 200 kDa)을 증류수에 1(w/v)% 농도로 용해시키고, 8 ㎜ 원통 몰드에 1(w/v)% HA-CA 용액을 80 ㎕ 부은 후 -80℃에서 하룻밤 동안 동결건조시켜 8 mm 직경 및 1.6 ㎜ 두께의 HA-CA 하이드로젤 패치를 제작하였다. 제작된 HA-CA 하이드로젤 패치는 건조된 상태이므로 보관이 용이하고, 얇은 막 형태이므로 원하는 모양으로 용이하게 자를 수 있어 사용이 간편한 것을 특징으로 한다.

한편, HA-CA를 인산완충생리식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)에 용해시키고, 이 용액에 4.5 mg/ml의 과요오드산 나트륨 용액을 첨가하여 HA-CA 벌크 하이드로젤을 제작하였다. 제작된 HA-CA 벌크 하이드로젤에서 HA-CA의 최종 농도는 1(w/v)%이다(도 1).

(2) HA-CA 하이드로젤 패치의 물리적 특성 분석

생체내 조건과 유사한 37℃의 PBS에 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤을 14일 동안 담그고, 12시간, 1일, 3일, 7일 및 14일 후에 팽윤도를 측정하였다. 측정 결과, HA-CA 하이드로젤 패치(Patch)의 팽윤도가 HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel)에 비해 높은 것으로 확인된다(도 2의 b).

한편, 실제 생체내 환경은 다양한 분해효소가 존재하므로 37℃의 PBS에 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤을 담그고, 분해될 때까지 히알루론산 분해효소를 처리하였다(100 U/샘플). 일정 시간마다 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤의 무게를 측정하여 시간 경과에 따른 분해 정도를 측정하였다. 측정 결과, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel)은 히알루론산 분해효소를 처리한 후 2시간 이내에 빠르게 분해되어 6시간 후에는 완전히 분해되나, HA-CA 하이드로 젤 패치(Patch)는 히알루론산 분해효소 처리 24시간 이후에도 남아 있어 효소에 의한 분해 속도가 느려지는 것으로 확인된다(도 2의 c).

따라서, HA-CA 하이드로젤 패치는 연골 치료에 적용되었을 때 형태를 잘 유지하여 분해에 따라 담지된 약물을 서방출하는 거동을 보여줄 수 있을 것으로 기대된다.

(3) HA-CA 하이드로젤 패치의 기계적 물성 분석

레오미터를 사용하여 주파수 0.1 내지 10 Hz 사이에서 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤의 탄성계수를 측정하였다. 분석 결과, HA-CA 하이드로젤 패치(Patch) 및 HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel)은 모두 저장탄성률(G’)가 손실탄성률(G”)에 비해 높아 내부 구조가 안정적인 고분자 네트워크가 형성된 것으로 확인된다(도 3의 a).

또한, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel)의 평균 저장탄성률(G’)은 약 450 Pa 수준인 반면, HA-CA 하이드로젤 패치(Patch)의 평균 저장탄성률(G’)은 약 2500~2600 Pa 수준인 것으로 나타나 평균 저장탄성률(G’)이 약 5배 이상 증가한 것으로 확인된다(도 3의 b).

따라서, HA-CA 하이드로젤 패치는 약물 전달 시스템으로서의 역할 외에 연골 조직의 마모로 인한 손상을 완화시키는 완충 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.

한편, HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤이 코팅된 스틸 표면 사이에 5N의 수직항력을 가한 상태에서 0.01 m/s의 속도로 마찰력 분석 장비를 이동시켜 마찰계수를 측정하였다. 측정 결과, 코팅되지 않은 경우(No treatment) 마찰계수가 가장 높게 나왔고, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel) 및 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch) 순이였다(도 4의 a). 또한, 코팅되지 않은 경우(No treatment) 마찰로 인해 마모도(wear scar)가 크게 생겼고, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel) 및 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch)의 경우 마모도(wear scar)가 적게 생긴 것으로 확인된다(도 4의 b). 따라서, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel) 및 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch)의 경우, 코팅되지 않은 경우(No treatment)에 비해 마모도 면적이 유의미하게 감소한 것으로 확인된다(도 4의 c).

따라서, HA-CA 하이드로젤 패치는 관절 사이에 마찰을 줄여 내마모성을 향상시키는 완충 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 1

(1) 덱사메타손이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치의 약물 서방출 양상 평가

제조예 1에서 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤 제작에 있어, 덱사메타손이 첨가된 HA-CA 용액을 사용하였다(패치 당 덱사메타손 함량 = 0.5 mg). 이후, 4.5 mg/ml의 과요오드산 나트륨 용액을 도포하여 약물 서방출 양상을 확인하였다.

이후, 37℃의 PBS에 덱사메타손이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤을 담그고, 분해될 때까지 히알루론산 분해효소를 처리하였다(100 U/샘플). UV-vis 분석을 통한 약물 서방출 양상 평가 결과, 카테콜기와 단백질의 다양한 친핵성 작용기들의 강한 결합으로 인해 분해효소가 없는 환경에서는 덱사메타손의 방출이 거의 일어나지 않은데 비해, 생체 내 환경을 모사하여 분해효소를 처리하였을 때는 효과적으로 약물이 방출되는 것으로 확인된다. 특히, 젤 제형의 하이드로젤 분해속도가 패치 제형의 하이드로젤 분해속도에 비해 빠르기 때문에, 덱 사메타손이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch-Dex)의 경우, 덱사메타손이 담지된 HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel-Dex)에 비해, 덱사메타손을 서방출시킬 수 있는 것으로 확인된다(도 5).

따라서, 염증 부위와 같이 히알루론산 분해효소의 활성이 증가된 질환 부위에 약물이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치를 적용하였을 때, 효과적인 약물 서방출을 통해 지속적인 치료 효과를 유도할 수 있을 것으로 기대된다.

(2) 덱사메타손이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치의 염증성 관절염 치료 효능, 보행 기능 증진 및 연골 손상 감소/연골 조직 재생 증진 평가

마우스의 전방십자인대(Anterior cruciate ligament)를 절단하여 염증성 관절염을 유발시켰다. 절단 부위에 덱사메타손이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤을 처리하였다(마우스 당 덱사메타손 함량 = 0.5 mg).

8주 후 micro-CT를 통한 염증성 관절염 치료 효능 평가 결과, 어떤 처리도 하지 않은 경우(No treatment) 무릎 관절의 연하골 플레이트(subchondral bone plate)가 두꺼워지거나 골소주(trabecular bone, 붉은색 영역)층이 얇아지고 반달 연골(meniscus, 붉은색 화살표) 조직이 비정상적으로 손상된 것으로 확인된다. 또한, 덱사메타손(Dexamethasone), HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel only), 또는 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch only)를 단독으로 처리한 경우 조직 손상이 일부 감소하였으나 치료 효과는 크지 않은 것으로 확인된다. 반면, 덱사메타손이 담지된 HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel-Dex) 또는 덱사메타손이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch-Dex)를 처리한 경우 염증성 관절염 질환 부위에 덱사메타손의 서방출을 유도하여 치료 효능을 증진시키고 조직 손상을 최소화한 것으로 확인된다. 특히, 덱사메타손이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch-Dex)를 처리한 경우, 정상 그룹(Sham) 수준으로 조직 재생을 유도한 것으로 확인된다(도 6).

한편, 보행 기능 증진을 평가하기 위해, 2주 간격으로 총 8주간 마우스 보행 기능 분석을 수행하였다. 보폭(stride length)과 뒷발 사이의 간격(stance length)을 분석한 결과, 덱사메타손(Dex), 덱사메타손이 담지된 HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel-Dex) 또는 덱사메타손이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch-Dex)을 처리한 경우 보행 기능 개선 효과가 확인된다. 특히, 덱사메타손이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch-Dex)를 처리한 경우, 정상 그룹(Sham) 수준으로 유의미한 보행 기능 개선 효과를 유도한 것을 확인된다(도 7).

한편, 연골 손상 감소/연골 조직 재생 증진을 평가하기 위해, 8주 후 조직학 분석을 수행하였다. 구체적으로, Safranin O 염색법과 Hematoxylin & Eosin 염색법을 이용하여 관절면에서 proteoglycan의 발현량 변화(Safranin O 염색 결과의 붉은 색 부분), 세포배열의 변화, 연골 조직의 변화 및 손상된 양상을 분석하였다. 분석 결과, 어떤 처리도 하지 않은 경우(No treatment) 연하골 플레이트(subchondral bone plate) 두께가 비정상적으로 두꺼워졌으며, 덱사메타손(Dex), HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel only), 또는 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch only)를 단독으로 처리한 경우 연하골 플레이트의 두께는 일부 감소하였으나 연골 손상 및 세포외기질 손실이 회복되지 않은 것으로 확인된다(Osteoarthritis Research Society International score; OARSI score). 반면, 덱사메타손이 담지된 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch-Dex)를 처리한 경우 덱사메타손의 서방출과 히알루론산 공급 효과로 인해 골관절염 치료 효능이 크게 증진되고 정상 그룹(Sham) 수준의 연골 조직 재생이 유도된 것으로 확인된다(도 8).

제조예 2

(1) HA-PG 하이드로젤 패치 제작

5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine)을 사용하여 파이로갈롤기가 수식된 히알루론산(pyrogallol-functionalized hyaluronic acid; 이하, HA-PG로 기재함)(분자량 = 200 kDa 및 1 MDa)을 증류수에 1(w/v)% 농도로 용해시키고, 8 ㎜ 원통 몰드에 1(w/v)% HA-PG 용액을 80 ㎕ 부은 후 -80℃에서 하룻밤 동안 동결건조시켜 8 mm 직경 및 1.6 ㎜ 두께의 HA-PG 하이드로젤 패치를 제작하였다. 제작된 HA-PG 하이드로젤 패치는 건조된 상태이므로 보관이 용이하고, 얇은 막 형태이므로 원하는 모양으로 용이하게 자를 수 있어 사용이 간편한 것을 특징으로 한다.

한편, HA-PG를 인산완충생리식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)에 용해시키고, 이 용액에 4.5 mg/ml의 과요오드산 나트륨 용액을 첨가하여 HA-PG 벌크 하이드로젤을 제작하였다. 제작된 HA-PG 벌크 하이드로젤에서 HA-PG의 최종 농도는 1(w/v)%이다(도 1).

(2) HA-PG 하이드로젤 패치의 물리적 특성 분석

생체내 조건과 유사한 37℃의 PBS에 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤을 14일 동안 담그고, 12시간, 1일, 3일, 7일 및 14일 후에 팽윤도를 측정하였다. 측정 결과, HA-PG 하이드로젤 패치(Patch)의 팽윤도가 HA-PG 벌크 하이드로젤(Gel)에 비해 높은 것으로 확인된다(도 9의 b).

한편, 실제 생체내 환경은 다양한 분해효소가 존재하므로 37℃의 PBS에 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤을 담그고, 분해될 때까지 히알루론산 분해효소를 처리하였다(200 U/샘플). 일정 시간마다 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤의 무게를 측정하여 시간 경과에 따른 분해 정도를 측정하였다. 측정 결과, HA-PG 벌크 하이드로젤(200 kDa 및 1 MDa Gel)은 히알루론산 분해효소를 처리한 후 초기에 빠르게 분해되나, HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch)는 히알루론산 분해효소 처리 28일 이후에도 남아 있어 효소에 의한 분해 속도가 상당히 느려지는 것으로 확인된다(도 9의 c).

따라서, HA-PG 하이드로젤 패치는 연골 치료에 적용되었을 때 형태를 잘 유지하여 분해에 따라 담지된 약물을 서방출하는 거동을 보여줄 수 있을 것으로 기대된다.

(3) HA-PG 하이드로젤 패치의 기계적 물성 분석

레오미터를 사용하여 주파수 0.1 내지 10 Hz 사이에서 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤의 탄성계수를 측정하였다. 분석 결과, HA-PG 하이드로젤 패치(Patch) 및 HA-PG 벌크 하이드로젤(Gel)은 모두 저장탄성률(G’)가 손 실탄성률(G”)에 비해 높아 내부 구조가 안정적인 고분자 네트워크가 형성된 것으로 확인된다(도 10의 a).

또한, HA-PG 벌크 하이드로젤(200 kDa 및 1 MDa Gel)의 평균 저장탄성률(G’)은 모두 매우 낮은 수준인 반면, HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch)의 평균 저장탄성률(G’)은 각각 약 14kPa 및 약 24kPa 수준인 것으로 나타나 평균 저장탄성률(G’)이 상당히 증가한 것으로 확인된다(도 10의 b).

따라서, HA-PG 하이드로젤 패치는 약물 전달 시스템으로서의 역할 외에 연골 조직의 마모로 인한 손상을 완화시키는 완충 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.

한편, HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤이 코팅된 스틸 표면 사이에 5N의 수직항력을 가한 상태에서 0.01 m/s의 속도로 마찰력 분석 장비를 이동시켜 마찰계수를 측정하였다. 측정 결과, 코팅되지 않은 경우(No treatment) 마찰계수가 가장 높게 나왔고, HA-CA 벌크 하이드로젤(200 kDa 및 1 MDa Gel) 및 HA-CA 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch) 순이였다(도 11의 a). 또한, 코팅되지 않은 경우(No treatment) 마찰로 인해 마모도(wear scar)가 크게 생겼고, HA-PG 벌크 하이드로젤(200 kDa 및 1 MDa Gel) 및 HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch)의 경우 마모도(wear scar)가 적게 생긴 것으로 확인된다(도 11의 b). 따라서, HA-PG 벌크 하이드로젤(200 kDa 및 1 MDa Gel) 및 HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch)의 경우, 코팅되지 않은 경우(No treatment)에 비해 마모도 면적이 유의미하게 감소한 것으로 확인된다(도 11의 c).

따라서, HA-PG 하이드로젤 패치는 관절 사이에 마찰을 줄여 내마모성을 향상시키는 완충 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 2

(1) 덱사메타손이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치의 약물 서방출 양상 평가

제조예 2에서 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤 제작에 있어, 덱사메타손이 첨가된 HA-PG 용액을 사용하였다(패치 당 덱사메타손 함량 = 0.5 mg). 이후, 약물 서방출 양상을 확인하였다.

이후, 37℃의 PBS에 덱사메타손이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤을 담그고, 분해될 때까지 히알루론산 분해효소를 처리하였다(20 U/샘플). UV-vis 분석을 통한 약물 서방출 양상 평가 결과, 파이로갈롤기와 단백질의 다양한 친핵성 작용기들의 강한 결합으로 인해 분해효소가 없는 환경에서는 덱사메타손의 방출이 거의 일어나지 않은데 비해, 생체 내 환경을 모사하여 분해효소를 처리하였을 때는 효과적으로 약물이 방출되는 것으로 확인된다. 특히, 젤 제형의 하이드로젤 분해속도가 패치 제형의 하이드로젤 분해속도에 비해 빠르기 때문에, 덱 사메타손이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch-Dex)의 경우, 덱사메타손이 담지된 HA-PG 벌크 하이드로젤(200 kDa 및 1 MDa Gel-Dex)에 비해, 덱사메타손을 서방출시킬 수 있는 것으로 확인된다(도 12).

따라서, 염증 부위와 같이 히알루론산 분해효소의 활성이 증가된 질환 부위에 약물이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치를 적용하였을 때, 효과적인 약물 서방출을 통해 지속적인 치료 효과를 유도할 수 있을 것으로 기대된다.

(2) 덱사메타손이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치의 염증성 관절염 치료 효능, 보행 기능 증진 및 연골 손상 감소/연 골 조직 재생 증진 평가

마우스의 전방십자인대(Anterior cruciate ligament)를 절단하여 염증성 관절염을 유발시켰다. 절단 부위에 덱사메타손이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤을 처리하였다(마우스 당 덱사메타손 함량 = 0.5 mg).

8주 후 micro-CT를 통한 염증성 관절염 치료 효능 평가 결과, 어떤 처리도 하지 않은 경우(No treatment) 반달연골(Meniscus, 붉은색 화살표) 조직이 비정상적으로 손상되고, 경골 근위 골단부(Proximal epiphysis)의 골 함량(Bone volume/Tissue volume; BV/TV)이 감소되는 것으로 확인된다. 또한, 골소주(trabecular bone)의 다공성 구조가 무너지면서(Total porosity; Po(tot), 노란색 화살표) 골 표면적(Bone surface/volume; BS/BV)이 감소하여 결과적으로 골소주 연 결도(trabecular pattern factor; Tb.Pf) 값이 감소되는 것으로 확인된다. 반면, 덱사메타손이 담지된 HA-PG 벌크 하이드로젤(200 kDa Gel-Dex) 또는 덱사메타손이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa Patch-Dex)를 처리한 경우 질환 부위에서 덱사메타손의 서방출을 유도하여 염증을 치료하고 정상 그룹(Sham) 수준으로 조직 재생을 유도한 것으로 확인된다(도 13). 200 kDa 분자량을 가지는 히알루론산 대신, 임상적으로 많이 이용되는 1 MDa 분자량을 가지는 히알루론산을 사용한 경우에도 동일한 치료 효능 양상을 보인다.

한편, 보행 기능 증진을 평가하기 위해, 2주 간격으로 총 8주간 마우스 보행 기능 분석을 수행하였다. 보폭(stride length)과 뒷발 사이의 간격(stance length)을 분석한 결과, 덱사메타손이 담지된 HA-PG 벌크 하이드로젤(200 kDa 및 1 MDa Gel-Dex) 또는 덱사메타손이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch-Dex)을 처리한 경우 보행 기능 개선 효과가 확인된다. 특히, 덱사메타손이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch-Dex)를 처리한 경우, 정상 그룹(Sham) 수준으로 유의미한 보행 기능 개선 효과를 유도한 것을 확인된다(도 14).

한편, 연골 손상 감소/연골 조직 재생 증진을 평가하기 위해, 8주 후 조직학 분석을 수행하였다. 구체적으로, Safranin O 염색법과 Hematoxylin & Eosin 염색법을 이용하여 관절면에서 proteoglycan의 발현량 변화(Safranin O 염색 결과의 붉은 색 부분), 세포배열의 변화, 연골 조직의 변화 및 손상된 양상을 분석하였다. 분석 결과, 어떤 처리도 하지 않은 경우(No treatment) 연하골 플레이트(subchondral bone plate) 두께가 비정상적으로 두꺼워졌으며, 덱사메타손(Dex), HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel only), 또는 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch only)를 단독으로 처리한 경우 연하골 플레이트의 두께는 일부 감소하였으나 연골 손상 및 세포외기질 손실이 회복되지 않은 것으로 확인된다(OARSI score). 반면, 덱사메타손이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch-Dex)를 처리한 경우 덱사메타손의 서방출과 히알루론산 공급 효과로 인해 골관절염 치료 효능이 크게 증진되고 정상 그룹(Sham) 수준의 연골 조직 재생이 유도된 것으로 확인된다(도 15).

제조예 3

(1) 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 제작

5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine)을 사용하여 파이로갈롤기가 수식된 히알루론산(pyrogallol-functionalized hyaluronic acid; 이하, HA-PG로 기재함)(분자량 = 200 kDa)을 증류수에 1(w/v)% 농도로 용해시키고, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 또는 휘틀록석(whitlockite)를 1(w/v)% 또는 5(w/v)% 농도로 첨가한 다음, 8 ㎜ 원통 몰드에 HAP 또는 WKT 첨가 1(w/v)% HA-PG 용액을 80 ㎕ 부은 후 -80℃에서 하룻밤 동안 동결건조시켜 8 mm 직경 및 1.6 ㎜ 두께의 HAP 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(HAP-patch 또는 WKT-patch)를 제작하였다(도 16의 a). 제작된 HAP 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치는 건조된 상태이므로 보관이 용이하고, 얇은 막 형태이므로 원하는 모양으로 용이하게 자를 수 있어 사용이 간편한 것을 특징으로 한다. 또한, 산화된 파이로갈롤기의 뛰어난 조직 접착성으로 인해 질환 부위에 직접 부착시키는 방식으로 적용가능한 것을 특징으로 한다(도 16의 b).

(2) 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 물리적 특성 분석

생체내 조건과 유사한 37℃의 PBS에 HA-PG 하이드로젤 패치, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치를 14일 동안 담그고, 12시간, 7일 및 14일 후에 팽윤도를 측정하였다. 측정 결과, WKT가 5(w/v)% 농도로 첨가된 HA-PG 하이드로젤 패치(5% WKT-patch)의 팽윤도가 다른 그룹에 비해 높은 것으로 확인된다(도 17의 a). 이는 무기 이온 및 산화된 파이로갈롤기 간 상호작용이 중요한 고농도 조건에서, PBS의 전해질이 이러한 상호작용을 약화시킴으로써 팽윤도를 증가시킨 것으로 볼 수 있다.

한편, 실제 생체내 환경은 다양한 분해효소가 존재하므로 37℃의 PBS에 HA-PG 하이드로젤 패치, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치를 담그고, 분해될 때까지 히알루론산 분해효소를 처리하였다(300 U/샘플). 일정 시간마다 HA-PG 하이드로젤 패치, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 무게를 측정하여 시간 경과에 따른 분해 정도를 측정하였다. 측정 결과, WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(1% 및 5% WKT-Patch)는 파이로갈롤기 간의 가교 결합 외에, 무기 이온 및 파이로갈롤기 간 상호작용으로 인해 효소에 의한 분해 속도가 상당히 느려지는 것으로 확인된다(도 17의 c).

(3) 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 내부 구조 분석

주사전자현미경(SEM) 분석을 통해, HA-PG 하이드로젤 패치, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 내부 구조를 분석한 결과, 모든 패치에서 마이크로 수준의 조밀한 다공성 구조를 가지고 있는 것으로 확인된다. 특히, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(HAP-patch)와 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(WKT-patch)의 경우, 무기 이온 및 산화된 파이로갈롤기 간 상호작용으로 인해 조밀한 내부 구조를 형성하는 것으로 확인된다(도 18).

(4) 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 내 무기 미네랄 입자 분포도

HAP 또는 WKT에 형광물질인 Alexa Fluor 594를 화학 결합한 후, 이를 HA-PG 하이드로젤 패치에 첨가하여, 형광물질로 표지된 HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 형광물질로 표지된 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치를 제작하였고, 무기 미네랄 입자 분포도를 공초점 현미경으로 관찰하였다. 관찰 결과, 모든 패치 내 무기 미네랄 입자가 고르게 분포된 것으로 확인된다(도 19).

(5) 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 가교 기전 분석

UV-vis spectrophotometry 분석을 통해, HA-PG 용액에 무기 미네랄 입자인 HAP 또는 WKT를 혼합하고 6시간 또는 24시간 동안 반응시킨 후 무기 미네랄 입자에서 방출되는 무기 이온(Ca, Mg, P) 및 산화된 파이로갈롤기 간 일어나는 화학 반응을 분석하였다. HAP 또는 WKT의 혼합 후 반응 시간이 지날수록 ~280 nm 피크가 짧은 파장대로 이동하는 것으로 관찰된다(도 20의 a).

Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR) 분석을 통해, HA-PG 하이드로젤 패치, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 화학 구조를 분석하였다. 모든 패치에서 -OH 그룹을 나타내는 3400 cm^-1 피크가 관찰되었고, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(HAP-patch)와 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(WKT-patch)에서 PO₄ ^3- 그룹을 나타내는 471 cm^-1피크와 1000-1100 cm^-1피크가 증가됨을 확인하였다. 또한, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(HAP-patch)와 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(WKT-patch)에서 모두 Ca²⁺-O 피크가 관찰되었고, WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(WKT-patch)에서만 Mg²⁺-O 피크가 관찰되었다(도 20의 b).

따라서, 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치는 산화된 파이로갈롤기 간의 가교 반응 이외에도 무기 미네랄 입자에서 방출되는 무기 이온 및 산화된 파이로갈롤기 간의 상호작용(즉, 배위 결합을 통한 착화합물 형성)을 통해 기계적 강도를 더욱 증가시킬 수 있을 것이며, 결과적으로, 골 재생 효능을 증진시킬 수 있을 것으로 기대된다(도 20의 c).

(6) 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 화학적 조성 분석

X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) 분석을 통해, HA-PG 하이드로젤 패치, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 화학적 조성을 분석하였다. P 피크 및 Ca 피크를 분석했을 때, WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(WKT-patch)에서 증가되는 것으로 확인된다(도 21의 a). 골 조직의 미네랄화(mineralization)를 촉진시킬 수 있는 무기 이온인 Ca, P, Mg의 양을 측정한 결과, Ca, P 원소의 증가는 HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(HAP-patch)와 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(WKT-patch)에서 측정되었고, Mg 원소의 증가는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(WKT-patch)에서만 측정되었다(도 21의 b).

따라서, 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치는 골 재생을 증진시킬 수 있는 무기 이온을 탑재하고 있어, 결과적으로, 골 재생 효능을 증진시킬 수 있을 것으로 기대된다.

(7) 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 무기 이온 방출 양상 평가

Tris-HCl 완충액에서 HA-PG 하이드로젤 패치, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치로부터 무기 이온 방출 양상을 유도결합 플라즈마 방출 분광기(ICP-AES)를 이용하여 분석하였다. 분석 결과, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(HAP-patch) 및 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(WKT-patch)에서 무기 미네랄 이온에 존재하는 P^3-, Ca²⁺ 이온을 지속적으로 방출시키는 것으로 확인된다(도 22의 a, b). HAP에는 Mg²⁺이 포함되어 있지 않고 WKT에만 Mg²⁺이 포함되어 있는바, 이에 맞게 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(WKT-patch)에서만 Mg²⁺이 방출되는 것으로 확인된다(도 22의 c). 한편, HA-PG 하이드로젤 패치(Patch)에서는 무기 이온이 거의 방출되지 않는 것으로 확인된다.

따라서, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(HAP-patch) 및 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(WKT-patch)는 골 재생에 도움이 되는 무기 이온을 지속적으로 방출할 수 있으므로, 결과적으로, 골 재생 효능을 증진시킬 수 있을 것으로 기대된다.

(8) 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 기계적 물성 분석

레오미터를 사용하여 주파수 0.1 내지 10 Hz 사이에서 HA-PG 하이드로젤 패치, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 탄성계수를 측정하였다. 분석 결과, HA-PG 하이드로젤 패치, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 및 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치는 모두 저장탄성률(G’)가 손실탄성률(G”)에 비해 높아 내부 구조가 안정적인 고분자 네트워크가 형성된 것으로 확인된다(도 23의 a).

또한, HAP 또는 WKT가 1(w/v)% 농도로 첨가된 HA-PG 하이드로젤 패치(1% HAP-patch 또는 1% WKT-patch)의 평균 저장탄성률(G’)은 약 40~50 kPa 수준이고, HAP 또는 WKT가 5(w/v)% 농도로 첨가된 HA-PG 하이드로젤 패치(5% HAP-patch 또는 5% WKT-patch)의 평균 저장탄성률(G’)은 약 100 kPa 수준인 것으로, HA-PG 하이드로젤 패치(Patch)의 평균 저장탄성률(G’)에 비해, 상당히 증가한 것으로 확인된다(도 23의 b).

따라서, 무기 미네랄 입자가 첨가된 HA-PG 하이드로젤 패치는 향상된 평균 탄성 계수를 기반으로 기계적 강도가 요구되는 골 결손 부위에서 골 재생을 촉진시킬 수 있을 것으로 기대된다.

한편, 압축(Indentation) 분석 장비를 사용하여 HA-PG 하이드로젤 패치, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 응력-변형률(Stress-strain)을 분석하였고, 응력-변형률 선도를 통해 압축 강도를 확인하였다(도 24의 a). HA-PG 하이드로젤 패치(HA-PG patch)의 평균 압축 강도가 약 2.5 kPa 수준인데 반해, HAP 또는 WKT가 1(w/v)% 농도로 첨가된 HA-PG 하이드로젤 패치(1% HAP-patch 또는 1% WKT-patch)의 평균 압축 강도는 약 2.5~3 kPa 수준이고, HAP 또는 WKT가 5(w/v)% 농도로 첨가된 HA-PG 하이드로젤 패치(5% HAP-patch 또는 5% WKT-patch)의 평균 압축 강도는 약 4~5 kPa 수준인 것으로 확인된다(도 24의 b). 즉, 추가된 무기 미네랄 입자의 농도에 비례하여 압축 강도가 증가한다고 볼 수 있다.

따라서, 무기 미네랄 입자가 첨가된 HA-PG 하이드로젤 패치는 향상된 압축 강도를 기반으로 기계적 강도가 요구되는 골 결손 부위에서 골 재생을 촉진시킬 수 있을 것으로 기대된다.

(9) 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 조직 접착력 측정

마우스 등 부위 피하 조직에 HA-PG 하이드로젤 패치, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치를 부착시키고, 자연산화를 통해 가교시킨 후 인접한 피부 조직과 함께 적출하여 Tack test를 수행하였다(도 25의 a). 패치는 모두 약 13 ~ 15 kPa 수준의 유사한 조직 접착력을 가지는 것으로 확인된다(도 25의 b). 또한, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(HAP-patch) 및 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(WKT-patch)의 경우, 마우스 피부 조직으로부터 떼어내는데 드는 에너지가 HA-PG 하이드로젤 패치(Patch)와 유사한 수준인 것으로 측정되었다. 이를 통해, 무기 미네랄 입자를 첨가하더라도 HA-PG 하이드로젤 패치의 조직 접착력은 그대로 유지된다고 볼 수 있다(도 25의 c).

(10) 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 생체적합성 평가

6-웰 세포 배양 플레이트의 바닥에 HA-PG 하이드로젤 패치, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치를 놓고, 인간 지방 유래 줄기세포 (human adipose derived stem cell, hADSC)를 파종하고 4.5 mg/ml의 과요오드산 나트륨 용액을 도포하여 가교시킨 후 7일 동안 삼차원 배양하였다. 배양 0일, 3일 및 7일 차에 Live/Dead assay 및 MTT assay를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포 생존율을 확인하였다. 확인 결과, 무기 미네랄 입자의 첨가 유무와 관계 없이 모두 배양 기간 내내 줄기세포의 높은 생존율이 관찰되었는바, 패치는 모두 세포 독성이 없으며 우수한 생체적합성을 가진다고 볼 수 있다(도 26의 a, b, c)

실시예 3

(1) BMP-2가 담지된 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 약물 서방출 양상 평가

제조예 2에서 HA-PG 하이드로젤 패치 제작에 있어, 또는 HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 제작에 있어, BMP-2가 첨가된 HA-PG 용액을 사용하였다(패치 당 BMP-2 함량 = 0.5 ug). 이후, 약물 서방출 양상을 확인하였다.

이후, 37℃의 PBS에 BMP-2가 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치, BMP-2가 담지된 HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 BMP-2가 담지된 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치를 담그고, 분해될 때까지 히알루론산 분해효소를 처리하였다(40 U/샘플). UV-vis 분석을 통한 약물 서방출 양상 평가 결과, BMP-2가 담지된 HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(HAP-patch) 또는 BMP-2가 담지된 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치(WKT-patch)의 경우, BMP-2가 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치(Patch)에 비해, BMP-2를 서방출시킬 수 있는 것으로 확인된다(도 27의 a). 따라서, 효과적인 약물 서방출을 통해 지속적인 치료 효과를 유도할 수 있을 것으로 기대된다.

이러한 메커니즘을 규명하고자, HAP 또는 WKT와 BMP-2를 혼합한 경우 제타 전위(zeta potential) 변화를 측정한 결과, HAP 또는 WKT와 BMP-2 간에 이온성 상호작용이 확인되었다(도 27의 b). 또한, 음이온성 표면전하를 가지는 HAP 또는 WKT와 양이온성 BMP-2의 이온성 상호작용뿐만 아니라, 산화된 파이로갈롤기와 BMP-2의 다양한 친핵성 작용기들 간에 강한 결합으로 인해 BMP-2의 방출이 보다 오래 지속될 수 있는 것으로 보았다(도 27의 c).

따라서, 무기 미네랄 입자가 첨가된 HA-PG 하이드로젤 패치는 골 결손 부위와 같이 히알루론산 분해 효소의 활성이 증가된 질환 부위에서 향상된 약물 서방출 양상을 보이는바, 효과적인 약물(특히, 골형성단백질) 전달을 통해 증진된 재생 효능을 보일 것으로 기대된다.

(2) BMP-2가 담지된 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 골 분화 증진 효과 검증

HA-PG 하이드로젤 패치, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치, WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치, BMP-2가 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치, BMP-2가 담지된 HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 BMP-2가 담지된 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치에서 21일 동안 인간 지방유래 줄기세포(hADSC)를 골 분화 유도 배양액 조건으로 배양하면서 분화 효율을 확인하였다.

qPCR 분석을 통해, 골 분화 마커인 collagen type 1 (Col1), runt-related transcription factor 2 (RUNX2), osteopontin (OPN) 및 osteocalcin (OCN) 발현이 HAP 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치에서 증가하는 것으로 확인된다. 특히, BMP-2가 담지된 경우 더욱 증가하는 것으로 확인된다(도 28).

한편, 형광 면역염색 및 qPCR 분석을 통해, 골 분화 마커인 osteopontin (OPN) 발현이 HAP 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치에서 증가하는 것으로 확인된다. 특히, BMP-2가 담지된 경우 더욱 증가하는 것으로 확인된다(도 29의 a, b).

한편, Alizarin Red S 염색을 통해 줄기세포 골 분화에 따른 칼슘 침착 정도가 HAP 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치에서 증가하는 것으로 확인된다. 특히, BMP-2가 담지된 경우 칼슘 침착을 통한 골 미네랄화가 더욱 증진되는 것으로 확인된다(도 30의 a). Alizarin Red S 염색 이미지 기반 정량 분석을 통하여 HAP 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치에서, 특히, BMP-2가 담지된 경우, 2D 플레이트 배양(2D)과 HA-PG 하이드로젤 패치(Patch)와 비교하여, 골 미네랄화가 더욱 증진되는 것으로 확인된다(도 30의 b).

(3) BMP-2가 담지된 무기 미네랄 입자 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치의 골 결손 모델 치료 효능 평가

HA-PG 하이드로젤 패치, HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치, WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치, BMP-2가 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치, BMP-2가 담지된 HAP 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 BMP-2가 담지된 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치를 결손 부위에 적용하고 8주 뒤 샘플링하였을 때, 패치가 결손 부위에 잘 고정되어 있음을 확인하였고, 골 재생이 된 정도를 육안으로 확인하였다(도 31의 a). 8주 뒤 micro-CT를 촬영한 결과, 패치를 적용한 경우 모두 유의미하게 결손 크기가 줄어든 것으로 확인된다. 특히, HAP 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치에서, 특히, BMP-2가 담지된 경우, 더욱 유의미하게 결손 크기가 줄어든 것으로 확인된다(도 31의 b). Micro-CT 이미지 기반 정량분석을 통해, BMP-2가 담지된 HAP 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치에서 유의미하게 골 재생이 증진되는 것으로 확인된다(도 31의 c).

한편, 골 결손 부위에서의 골 재생 정도를 평가하기 위해 치료 8주차에 Goldner’s trichrome 염색 및 이미지 기반 정량분석을 통해, BMP-2가 담지된 HAP 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치에서 콜라겐 재생이 크게 증진되는 것으로 확인된다(도 32의 a, b). 마찬가지로 골 재생 마커(OPN)에 대한 면역 염색을 진행한 경우, BMP-2가 담지된 HAP 또는 WKT 첨가 HA-PG 하이드로젤 패치에서 골 재생이 크게 증진되는 것으로 확인된다(도 32의 a, b).

따라서, HA-PG 하이드로젤 패치가 결손 부위에 잘 고정되어 효과적으로 무기 이온 및 약물(특히, 골형성단백질)을 전달하고 골 형성을 위한 미세환경을 제공하여 골 재생을 촉진시킨다고 볼 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치; 및
상기 하이드로젤 패치에 담지된 연골 또는 골 질환 치료용 약물을 포함하는 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 하이드로젤 패치.
제1항에 있어서,
상기 페놀기는 카테콜(catechol), 4-tert-부틸카테콜(4-tert-butylcatechol; TBC), 우루시올(urushiol), 알리자린(alizarin), 도파민(dopamine), 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride), 3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine; DOPA), 카페익산(caffeic acid), 노르에피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrine), 3,4-디하이드록시페닐아세트산(3,4-dihydroxyphenylacetic acid; DOPAC), 이소프레날린(isoprenaline), 이소프로 테레놀(isoproterenol) 및 3,4-디하이드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 카테콜계 화합물 유래 카테콜기; 또는
파이로갈롤(pyrogallol), 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine), 타닌산 (tannic acid), 갈산 (gallic acid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate), 2,3,4-트리하이드록시벤즈알데하이드(2,3,4-trihydroxybenzaldehyde), 2,3,4-트리하이드록시벤조산(2,3,4-Trihydroxybenzoic acid), 3,4,5-트리하이드록시벤즈알데하이드(3,4,5-Trihydroxybenzaldehyde), 3,4,5-트리하이드록시벤즈아마이드(3,4,5-Trihydroxybenzamide), 5-tert-부틸파이로갈롤(5-tert-Butylpyrogallol) 및 5-메틸파이로갈롤(5-Methylpyrogallol)로 이루어진 군으로부터 선택된 파이로갈롤계 화합물 유래 파이로갈롤기인, 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 하이드로젤 패치.
제1항에 있어서,
상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 알지네이트, 키토산, 키틴, 콜라겐, 젤라틴, 콘드로이틴황산, 펙틴, 케라틴 및 피브린으로 이루어진 군으로부터 선택된, 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 하이드로젤 패치.
제1항에 있어서,
상기 하이드로젤 패치는
ⅰ) 두께가 0.05 내지 10.0 ㎜이고,
ⅱ) 0.1 Hz 내지 10 Hz의 주파수 범위에서, 1×10³ Pa 내지 1×10⁶ Pa의 저장 탄성률(G’)을 가지며,
ⅲ) 5N의 수직항력 하에 0.01 m/s의 속도에서 측정된 마찰계수가 0.2 내지 0.4인, 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 하이드로젤 패치.
제1항에 있어서,
상기 하이드로젤 패치에 무기 미네랄 입자를 추가로 포함하는, 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 하이드로젤 패치.
제5항에 있어서,
상기 무기 미네랄 입자는 칼슘, 마그네슘 및 인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 무기 이온을 포함하는, 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 하이드로젤 패치.
제6항에 있어서,
상기 무기 이온은 상기 페놀기와 상호 작용을 하여 배위 결합을 통한 착화합물을 형성하는, 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 하이드로젤 패치.
제6항에 있어서,
상기 무기 이온은 상기 약물과 이온성 상호 작용을 하는, 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 하이드로젤 패치.
제1항에 있어서,
상기 약물은 덱사메타손(dexamethasone), 코르티코손(cortisone), 프레드니솔론(prednisolone), 하이드로코르티코손(hydrocortisone), 트리암시놀론(triamcinolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 프레드니손(prednisone) 및 베타메타손(betamethasone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 항염증제; 또는 BMP-2(BMP-2a), BMP-3(Osteogenin), BMP-4(BMP-2b), BMP-6(human homologue of the murine, Vgr-1), BMP-7(Osteogenic protein-1) 및 BMP-9(Growth differentiation factor 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 골형성단백질을 포함하는, 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 하이드로젤 패치.
제1항에 있어서,
상기 연골 질환은 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 퇴행성 관절염(degenerative arthritis), 골연골종증(osteochondromatosis), 염좌(distortion), 윤활낭염(bursitis), 반월상 연골 손상(menstruation), 원판형 반월상 연골파열 (meniscal tear), 반월상 연골 낭포(meniscus cyst), 측부 인대 손상(collateral ligament rupture), 전방십자인대 손상(anterior cruciate ligament injury), 후방 뒤십자인대 손상(posterior cruciate ligament injury), 관절 내 유리체 (intra-articular vitreous), 박리성 뼈연골염(exfoliation osteochondritis), 추벽 증후군(plica syndrome), 내반슬(genu varum), 외반슬(knock-knee) 및 발음성 슬관절(snapping knee)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 골 질환은 성장기 발육부진, 골감소증, 골 취약증, 골 괴사, 골절, 과 도한 파골세포의 골 흡수에 의한 골다공증(osteoporosis), 골형성부전증, 뼈의 손 상, 외상에 의한 관절손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사 성 골질환, 신성골이영양증(renal osteodystrophy), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease) 및 전이성 골암(metastatic bone cancers)로 이루어진 군으로부터 선택된, 연골 또는 골 질환의 예방 또는 치료용 하이드로젤 패치.