KR20220024539A

KR20220024539A - 약물 제조에서 글루칸의 적용

Info

Publication number: KR20220024539A
Application number: KR1020227001244A
Authority: KR
Inventors: 진보 양; 구앙리 우; 치아오링 송; 리주안 우; 준 자오; 유징 리브; 첸양 자오; 후아시 구안
Original assignee: 씨피 파마슈티칼 칭다오 컴퍼니., 리미티드.; 마린 바이오메디컬 리서치 인스티튜트 오브 칭다오 씨오., 엘티디.
Priority date: 2019-06-13
Filing date: 2020-06-15
Publication date: 2022-03-03
Also published as: JP2022536777A; AU2020291757A1; CA3143308A1; WO2020249132A1; CN114026129A; EP3985031A4; CN112076208A; CN114026129B; JP7358516B2; AU2020291757B2; JP2023165905A; US20220331352A1; EP3985031A1; AU2024201840A1

Abstract

본 발명은 약물 제조에서 글루칸의 적용을 제공한다. 상기 β-1,3/1,6-글루칸은 약학 조성물 또는 제제의 제조에 사용되고, 상기 약학 조성물 또는 제제는 면역 치료, 방사선 치료, 또는 화학요법의 항종양 효과를 강화시킬 수 있어 백혈구 및/또는 혈소판의 감소증 치료에 사용된다.

Description

약물 제조에서 글루칸의 적용

본 발명은 해양 약물 분야에 관한 것으로, 구체적으로 β-1,3/1,6-글루칸의 적용에 관한 것이고, 상기 β-1,3/1,6-글루칸은 약학 조성물 또는 제제의 제조에 사용되어, 면역 치료, 방사선 치료, 또는 화학요법의 항종양 효과를 강화시키며, 백혈구 및/또는 혈소판의 감소증 치료에 사용될 수 있다.

β-글루칸은 진균, 효모, 일부 세균과 식물의 세포벽에서 유래된 글루코오스으로 구성된 장쇄 다당류이다. 이러한 폴리머의 주쇄는 선형 β-D-(1,3) 글루코실 단위를 포함하며, 이는 O-6에서 β-D-(1,6) 글루코실 단위로 연결된 측쇄로 치환되고, 그 분자량 크기와 분포는 변경될 수 있다.

β-글루칸은 호중구, 대식세포 및 과립구와 같은 선천적 면역 세포를 촉발하여 숙주의 면역 반응을 조절하는 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)으로 간주된다. 현재 시중에 있는 β-1,3-글루칸은 대부분 보리, 귀리, 식용 진균(표고버섯, 잎새버섯(Grifola frondosa), 치마버섯(Schizophyllum commune)), 효모와 같은 육상 생물에서 유래되고, 원료의 공급원이 상이하며 얻어진 β-1,3-글루칸의 분자량, 연결 방식 및 분기도 등의 차이가 매우 크므로, 품질 제어가 어렵고, 예를 들어 주사제에 사용되는 β-글루칸은 주로 표고버섯에서 유래하는데 β-1,6-분기를 가진 β-1,3-글루칸이며, 그 분자량은 400-800kDa로 높기 때문에 수용성이 떨어진다.

외인성으로 면역 시스템을 자극하여 암을 치료하는 암 면역 요법은 유망한 암 치료 전략이 되었다. 예를 들어, 세포독성 T 림프구 항원 4(CTLA4), 프로그램된 세포 사멸 수용체 1(PD-1) 및 그 리간드(PD-L1)와 같은 면역 관문 억제제는 면역 억제 신호를 차단하고 자율적인 항종양 반응을 강화함으로써 다양한 암에서 큰 성공을 거두었다.

PD-1을 표적으로 하는 암 면역 요법은 면역 환경을 조절하여 보다 효과적인 항종양 반응을 일으킴으로써 큰 성공을 거두었지만, 일부 환자만이 단일 제제 PD-1 차단의 이점을 누릴 수 있다. 화학방사선요법은 가장 일반적으로 사용되는 암 치료 방법이지만 화학방사선요법의 높은 독성으로 인해 암 환자가 화학방사선요법 동안 다양한 정도의 부작용을 경험하게 되며, 가장 흔한 것은 백혈구가 감소되는 것으로 이는 환자의 생명을 위협하는 감염으로 이어질 수 있다.

본 발명의 목적은 항종양, 백혈구 증가와 혈소판 감소 저항성을 포함하는 β-1,3/1,6-글루칸의 용도이며, 상기 β-1,3/1,6-글루칸은 수용성이 좋고 안전성이 높은 특성을 갖는다.

본 발명의 제1 양태는 상기 β-1,3/1,6-글루칸은 남극 갈조류에서 유래되고, 상기 β-1,3/1,6-글루칸은 약학 조성물 또는 제제를 제조하는데 사용되며, 상기 약학 조성물 또는 제제는 백혈구 및/또는 혈소판 감소증을 치료하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 β-1,3/1,6-글루칸의 적용을 제공한다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 H1 신호는 1H-NMR에서 4.40-4.64 ppm 영역에 위치하고, 13C-NMR에서 C1 신호는 102.4-102.67 ppm 영역에 위치한다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 남극 갈조류는 바다 벨벳, 바닥 죽순 또는 Lessonia, Durvillaea Antarctica이다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸은 식 (I) 및/또는 식 (II)으로 표시되는 β-글루칸이고,

식 (I)

식 (II)

여기서, n은 1-20으로부터 선택되는 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20)이며, R은 H 및/또는 4개를 초과하지 않는 글루코오스 잔기(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 글루코오스 잔기)이다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 식 (I) 또는 식 (II) 구조 중의 R은 식 (III) 또는 식 (Ⅳ) 또는 식 (V) 또는 식 (Ⅵ) 구조 중 하나 이상이고, 여기서,

식 (III): Glcβ1-;

식 (Ⅳ): Glcβ1-3Glcβ1- 또는 Glcβ1-6Glcβ1-;

식 (V): Glcβ1-3Glcβ1-3Glcβ1- 또는 Glcβ1-6Glcβ1-3Glcβ1- 또는

Glcβ1-3Glcβ1-6Glcβ1- 또는 Glcβ1-6Glcβ1-6Glcβ1-;

식 (Ⅵ):

Glcβ1-3Glcβ1-3Glcβ1-3Glcβ1- 또는

Glcβ1-6Glcβ1-3Glcβ1-3Glcβ1- 또는

Glcβ1-3Glcβ1-6Glcβ1-3Glcβ1- 또는

Glcβ1-3Glcβ1-3Glcβ1-6Glcβ1- 또는

Glcβ1-6Glcβ1-6Glcβ1-3Glcβ1- 또는

Glcβ1-6Glcβ1-3Glcβ1-6Glcβ1- 또는

Glcβ1-3Glcβ1-6Glcβ1-6Glcβ1- 또는

Glcβ1-6Glcβ1-6Glcβ1-6Glcβ-.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 분자량은 1-50 kDa이고; 비교적 바람직하게는 2 ~ 30kDa이며; 보다 바람직하게는 2-10kDa이고; 가장 바람직하게는 4-7kDa이다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 비선광도는 -15.0°보다 낮지 않고; 비교적 바람직하게는 -15° ~ 25°이며; 보다 바람직하게는 -15 ~ -21°이다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 자외선 전파장 스캐닝 아틀라스는 300 ~ 900nm 파장 범위 내에서 명백한 흡수가 없고; 보다 바람직하게는 230 ~ 900nm 파장 범위 내에서 명백한 흡수가 없다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 자외선 전파장 스캐닝 아틀라스는 260 ~ 280nm 파장 범위 내에서 흡수 피크가 없다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 측쇄 길이는 ≤5이다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸은 하기와 같은 단계에 의해 제조될 수 있다.

(1) 탈지 단계: 남극 갈조류를 건조 및 분쇄하고, 유기 용매에 침포시키며 교반하여 탈지 조류 분말을 얻는다.

(2) 물 추출 단계: 상기 탈지 조류 분말을 실온에서 물로 교반하고 추출하여 물 추출액을 얻는다.

(3) 분급 단계: 단계 (2)에서 얻은 물 추출액을 원심분리하고, 원심분리하여 얻은 상청액에 1 ~ 3 mol/L의 염화칼슘 수용액을 첨가하며; 교반한 후 원심분리하여 상청액을 취하여 투석 또는 한외여과 탈염을 수행하고, 감압하에 농축 및 건조시켜 조 다당류를 얻는다.

(4) 정제 단계: 단계 (3)의 상기 조 다당류를 증류수로 용해시키고, 증류수와 염화나트륨 수용액을 이동상으로 하여, 음이온 교환 수지로 분리 정제함으로써 물로 용출한 성분을 수집하여, 감압하에 농축 및 동결건조시켜 상기 β-1,3/1,6-글루칸을 얻는다.

다른 바람직한 일 예에서, 단계 (4)의 정제는, 단계 (3)의 상기 조 다당류를 증류수로 용해시키고, 증류수와 염화나트륨 수용액을 이동상으로 하여, 음이온 교환 수지로 분리 정제하며, 황산 페놀로 검출하여 물로 용출한 성분을 수집하고, 감압하에 농축 및 동결건조시켜 상기 β-1,3/1,6-글루칸을 얻는 것이다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 음이온 수지 분리 정제는, 강음이온 수지 분리 정제이다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 음이온 수지 분리 정제는, 먼저 강음이온 수지로 분리 정제한 다음 약음이온 수지로 분리 정제하거나; 약음이온 하위 수지로 분리 정제한 다음 강음이온 하위 수지로 분리 정제하는 것이다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 강음이온 수지는 4차 암모늄기를 함유한 음이온 수지이다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 약음이온 수지는 디에틸아미노에틸(diethylaminoethyl)을 함유한 음이온 수지이다.

다른 바람직한 일 예에서, 본 발명은 β-1,3/1,6-글루칸의 적용을 제공하며, 상기 백혈구는 림프구인 것을 특징으로 한다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 림프구는 B 세포 및/또는 T 세포이다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 적용에 있어서, 상기 약학 조성물 또는 제제는 항종양 효과를 더 갖는 것을 특징으로 한다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 적용에 있어서, 상기 약학 조성물 또는 제제는 또한 면역 관문 약물과 병용하여 적용될 수 있는 것을 특징으로 한다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 적용에 있어서, 상기 면역 관문 약물은 프로그램된 세포 사멸 1 단백질(PD-1) 길항제, 또는 PD-L1 길항제, 또는 세포 독성 T 림프구 항원(CTLA-4) 길항제, 또는 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3) 길항제, 또는 T 세포 면역글로불린-3(TIM-3) 길항제, 또는 T 세포 면역글로불린 및 ITIM 도메인 단백질(TIGIT) 길항제로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 적용에 있어서, 상기 면역 관문 약물은 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

다른 바람직한 일 예에서, 백혈구 및 혈소판 감소증 치료 약물 제조에서 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 적용에 있어서, 상기 항-PD-1 항체 또는 PD-L1 항체는 더발루맙(Durvalumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), BMS202, 스파탈리주맙(Spartalizumab), 캄렐리주맙(camrelizumab)으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 약학 조성물 또는 제제와 프로그램된 세포 사멸 1 단백질(PD-1) 또는 PD-L1의 길항제의 병용 적용은 동시에, 순차적으로 또는 독립적으로 투여된다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 적용에 있어서, 상기 약학 조성물 또는 제제는 또한 적어도 하나의 화학요법제와 병용하여 적용될 수 있는 것을 특징으로 한다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 적용에 있어서, 상기 화학요법제는 세포 독성 화학요법제로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 적용에 있어서, 상기 화학요법제는 안트라시클린(Anthracyclines)계, 5-Fu계, 알칼로이드계 중 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 적용에 있어서, 상기 화학요법제는 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(carboplatin) 중 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 적용, 상기 약학 조성물 또는 제제와 화학요법제의 병용 적용은 동시에, 순차적으로 또는 독립적으로 투여된다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 적용에 있어서, 상기 약학 조성물 또는 제제는 또한 방사선 요법과 병용하여 적용될 수 있는 것을 특징으로 한다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 적용, 상기 약학 조성물 또는 제제와 방사선 요법의 병용 적용은 동시에, 순차적으로 또는 독립적으로 투여된다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸의 적용에 있어서, 상기 약학 조성물 또는 제제는 개체의 암을 치료하는데 사용되는 것을 특징으로 한다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 암은 흑색종, 결장직장암, 폐암, 신장암, 간암, 유방암 중 하나 이상이다.

다른 바람직한 일 예에서, 상기 약학 조성물 또는 제제는 안전 유효량의 β-1,3/1,6-글루칸, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유한다.

이해해야 할 것은, 본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 각 기술특징과 아래(예를 들어, 실시예)에서 구체적으로 설명되는 각 기술특징은 서로 조합될 수 있어, 새로운 또는 바람직한 기술적 해결수단을 구성한다. 편폭의 제한으로 인해 여기서 더이상 일일이 설명하지 않는다.

도 1은 B16 동계 종양 모델에 대한 β-1,3/1,6-글루칸과 항-PD-1 항체의 병용 사용의 효과를 보여준다.
도 2는 B16 동계 종양 모델의 T 림프구에 대한 β-1,3/1,6-글루칸과 항-PD-1 항체의 병용 사용의 효과를 보여준다.
도 3은 B16 동계 종양 모델의 혈소판에 대한 β-1,3/1,6-글루칸과 항-PD-1 항체의 병용 사용의 효과를 보여준다.
도 4는 B16 동계 종양 모델의 림프구에 대한 β-1,3/1,6-글루칸과 항-PD-1 항체의 병용 사용의 효과를 보여준다.
도 5-7은 B16 동계 종양 모델에 대한 β-1,3/1,6-글루칸과 방사선 요법의 병용 사용의 항종양 효과를 보여준다.
도 8-15는 B16 동계 종양 모델의 백혈구에 대한 β-1,3/1,6-글루칸과 방사선 요법의 병용 사용의 효과를 보여준다.
도 16은 B16 동계 종양 모델의 말초혈액에 대한 β-1,3/1,6-글루칸과 방사선 요법의 병용 사용의 효과를 보여준다.
도 17 내지 도 21은 B16 동계 종양 모델에 대한 β-1,3/1,6-글루칸과 화학요법의 병용 사용의 효과를 보여준다.

용어

달리 정의되지 않는 한, 명세서와 청구범위에서 사용되는 하기 용어가 갖는 의미는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 의미이다. 달리 설명되지 한, 본문의 전체 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 발명의 재료는 전체가 인용 방식을 통해 본문에 포함된다. 본 발명에서 PLT는 혈소판수이고 NEUT는 호중구이며 LYMPH는 림프구이고 MONO는 단핵구이며 WBC는 백혈구이다.

본문에서, 용어 “강음이온 수지” 및 “강음이온 교환 수지”는 교환하여 사용될 수 있고, 4차 아민기와 같은 비교적 강한 반응기를 함유하는 음이온 수지를 의미한다.

본문에서, 용어 “약음이온 수지” 및 “약음이온 교환 수지”는 교환하여 사용될 수 있고, 디에틸아미노에틸과 같은 비교적 약한 반응기를 함유하는 음이온 수지를 의미한다.

본 발명의 주요 이점

(1) 본 발명에 따른 β-1,3/1,6-글루칸은 해양의 남극 갈조류에서 유래되고, 분자량이 작고 수용성이 양호하며 안전성이 높은 특성을 가지며, 백혈구 감소증과 혈소판 감소증에 저항하는 효과가 있고, 특히 종양 치료로 인한 T 림프구 및 B 림프구 감소에 양호한 효과를 갖는다.

아래에 구체적인 실시예를 결부하여 본 발명을 더 설명하고, 첨부된 도면을 결합하여 본 발명의 구체적인 실시예를 열독한 후, 본 발명의 다른 이점과 특성은 더욱 명확해질 것이다. 이해해야 할 것은, 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다. 아래 실시예에서 구체적인 조건을 표기하지 않은 실험 방법은 일반적으로 기존 조건에 따르거나 제조업체에서 권장하는 조건에 따른다.

실시예 1. B16 동계 종양 모델에 대한 β-1,3/1,6-글루칸과 항-PD-1 항체의 병용 사용의 효과

3x10⁵개의 마우스 흑색종 세포주 B16(PerkinElmer 제공)의 세포 현탁액을 C57BL/6J 마우스(암컷, 6-8주령, 지난 펑웨(朋悅) 실험동물회사에서 구입)에 피하 주사하였다. 종양이 이식된지 약 4일 후 B16 종양이 만져질 정도로 성장한 후 약물 투여 실험을 수행하였다. 마우스를 4개 그룹으로 나누고, 각각 용매 또는 β-1,3/1,6-글루칸(4 mg/kg, 정맥 주사, 주 2회)을 독립적으로 사용하거나, 항-PD-1 항체(항-마우스 PD-1 항체는 BioxCell에서 구입, 마우스 당 200 μg, 주 1회, 정맥 주사)와 병용하여 마우스를 처리하였다. 종양 부피를 평가하고 종양 무게를 기록한다. 마우스를 죽인 후, 혈액과 종양 샘플을 수집하여 유세포 분석에 사용한다.

심장 천자로 혈액 샘플을 수집하고 EDTA-항응고 튜브에 수집하며 50 μl 전혈을 채취하여 혈액 분석을 수행하고, 50 μl 전혈을 채취하여 적혈구 용해를 수행하며(적혈구 용해 완충액, Meltenyi), 나머지 전혈을 3500 rpm에서 7분 동안 원심분리하여 혈장을 취하고 -80 ℃의 온도에 보관한다. 비장과 흉선의 무게를 측정하고 기록한다. 마우스 피하 종양을 취하고, 약 0.2 ~ 0.5 g의 종양 조직을 취하여, 마우스 종양 해리 키트(Meltenyi)를 통해 종양 샘플로부터의 단일 세포 현탁액을 얻는다. 적혈구가 용해된 후의 혈액세포 및 해리된 종양 세포 현탁액에 대해 후속 처리 및 유세포 검출을 수행하였다.

차단 완충액(20 % FBS, 1:100 CD16/CD32 항체 및 1:100 랫트 IgG)으로 단일 세포 현탁액을 20분 동안 차단하고, 4 ℃의 온도에서 대응되는 면역 세포 표면 단백질 항체(CD11b-PE, CD4-BV510, CD8-PerCP-Cy5.5, CD19-APC, CD3-FITC, CD206-PE-Cy7, Ly6C-APC)로 30분 동안 배양하고 염색하였다. FACS Arial III(BD Biosciences)를 통해 면역 세포 군체의 비율을 분석하였다. 구체적인 과정은 FSC/SSC 사분면에서 세포 군체를 묘사하고, FSC-H와 FSC-A를 통해 단일 세포 군체를 묘사하며, 면역 세포 표면 마커를 통해 해당 면역 세포를 묘사하고, 세포 비율 또는 상대 농도를 계산하는 것이다.

도 1a 및 도 1b에 도시된 바와 같이, 용매, β-1,3/1,6-글루칸(4 mg/kg, 정맥 주사, 주 2회), 항-PD-1 항체(200 ㎍/마우스, 정맥 주사, 주 1회), 또는 β-1,3/1,6-글루칸 및 항-PD-1 항체를 병용하여 B16 동계 종양 마우스를 처리하였고(4일째부터 투여 시작하고, 4일째에 용매군, β-1,3/1,6-글루칸과 PD-1 병용 투여군 및 독립적 투여군에 꼬리 정맥 주사하며, 7일째에 용매군 및 PD-1군에 용매를 투여하고, β-1,3/1,6-글루칸 및 β-1,3/1,6-글루칸 및 PD-1 병용 투여군에 β-1,3/1,6-글루칸을 투여하며, 10일째에는 4일째와 동일하게 투여하고, 13일째에는 7일째와 동일하게 투여함), 투여 중 종양 부피를 평가하고, 14일째에 마우스를 죽여 종양 무게 등 지표를 평가하였다. 결과, β-1,3/1,6-글루칸은 B16 동계 종양 모델 중 항-PD-1 항체에 의해 유도된 종양의 퇴행을 강화시키고, 항-PD-1 항체의 조합은 단일 치료에 비해 종양 성장을 더 효과적으로 억제하였다. 치료 기간 동안 마우스 체중과 사망에 현저한 변화가 없었는데, 이는 상기 조합 요법이 심각한 독성(도 1c)을 일으키지 않았음을 의미한다. 유세포 기기로 혈액과 종양 중 면역 세포 아군을 분석한 결과, 병용 치료는 마우스 혈액 중 CD19+ 세포의 백분율을 증가시키고 CD11b+ 세포의 백분율을 감소시키는 것으로 나타났다(도 1d). 병용 치료는 또한 말초 혈액 중 염증을 촉진하는 단핵 세포 유래의 대식세포(CD11b+Ly6Chi, 도 1e)를 상향 조절하였다. 종양 침윤 면역 세포의 검출 결과, 종양 내부에는 더 많은 골수 세포(CD11b +), 특히 염증 촉진 대식세포(CD11b + Ly6Chi)(도 1f)가 침윤되어 있는 것을 발견하였으며, 독립적인 항-PD-1 항체 처리에 비해, 병용 처리 후 면역 억제성 종양 관련 대식세포TAM(CD11b + CD206 +)의 백분율도 감소되었다(도 1g). 이 밖에, β-1,3/1,6-글루칸 및 PD-1 항체 병용 적용은 혈액과 종양 중 CD4 및 CD8 T세포의 비율을 강화시키는 것을 검출하였다(도 2). 이는 β-1,3/1,6-글루칸 및 항-PD-1 항체가 협동하여 염증 촉진성 대식세포의 종양 침윤을 증가시키고, 면역 억제성 TAM의 백분율을 감소시키며, 후천성 면역 세포 T 세포 및 B 세포의 비율을 증가시킬 수 있어, 염증 촉진성 및 항종양 성능을 가진 종양 미세 환경을 확립한다.

실시예 2. B16 동계 종양 모델 중 혈소판에 대한 β-1,3/1,6-글루칸과 항-PD-1 항체의 병용 사용의 효과

실험 방법은 실시예 1과 동일하며, 14일째에, 동물을 죽인 후 심장에서 혈액을 채취하여 EDTA-항응고 튜브에 넣고 균일하게 혼합한 후 50 μl를 취하여 혈액 분석기로 혈소판 농도를 검출하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, PD-1 항체의 독립적 사용은 혈소판 농도를 감소시키고, β-1,3/1,6-글루칸의 독립적 사용은 혈소판 농도에 영향을 미치지 않지만, PD-1 항체와 병용하면 PD-1 항체의 혈소판 저하 부작용을 역전시킬 수 있다.

실시예 3. β-1,3/1,6-글루칸과 항-PD-1 항체의 병용 사용이 말초 혈액 중의 림프구 수에 미치는 영향

실험 방법은 실시예 1과 동일하며, 14일째에, 동물을 죽인 후 심장에서 혈액을 채취하여 EDTA-항응고 튜브에 넣고 균일하게 혼합한 후 50 μl 전혈을 채취하고, 각 샘플에 5 μl의 GFP 마이크로스피어를 첨가하여 적혈구 용해를 수행하였다.

차단 완충액(20 % FBS, 1:100 CD16/CD32 항체 및 1:100 랫트 IgG)으로 단일 세포 현탁액을 20분 동안 차단하고, 4 ℃의 온도에서 대응되는 면역 세포 표면 단백질 항체(CD4-BV510, CD8-PerCP-Cy5.5, CD19-APC, CD3-FITC)로 30분 동안 배양하고 염색하였다. FACS Arial III(BD Biosciences)를 통해 면역 세포 군체의 비율을 분석하였다. 구체적인 과정은 FSC/SSC 사분면에서 세포 군체를 묘사하고, FSC-H와 FSC-A를 통해 단일 세포 군체를 묘사하며, 면역 세포 표면 마커를 통해 해당 면역 세포를 묘사하고, 상대적 면역 세포 농도를 계산하는 것이다.

도 4 실험 결과, PD-1 항체의 독립적 투여는 혈액 중의 CD3, CD4 및 CD8의 상대 농도를 증가시킬 수 있는 반면, 8 mg/kg β-1,3/1,6-글루칸과 PD-1 항체의 병용 투여는 혈액 중의 CD3, CD4, CD8 및 CD19의 상대 농도를 추가로 증가시킬 수 있으며, 이는 β-1,3/1,6-글루칸이 PD-1 항체의 면역 활성화 효과를 더욱 강화시킬 수 있음을 설명한다.

실시예 4. 방사선 요법 후의 마우스 모델에 β-1,3/1,6-글루칸 적용

3x10⁵개의 마우스 흑색종 세포주 B16(PerkinElmer 제공)의 세포 현탁액을 C57BL/6J 마우스(암컷, 6-8주령, 지난 펑웨(朋悅) 실험동물회사에서 구입) 중 (Overwijk & Restifo, 2001)에 피하 주사하였다. 종양이 이식된지 약 5일 후 국부적 방사선 요법(종양 주사 영역, 10 Gy)을 사용하였다. 6일째 및 14일째에 용매 또는 β-1,3/1,6-글루칸(꼬리 정맥 주사, 주 1회)을 투여하여, 기간에 종양 부피와 마우스 체중을 검출하였으며, 17일째에 동물을 죽인 후 종양 질량을 검출하였다.

도 5-7에 도시된 바와 같이, 방사선 요법은 종양 세포 성장을 현저하게 억제할 수 있는 반면, β-1,3/1,6-글루칸은 방사선 요법의 항종양 효과를 강화시킬 수 있다.

3x10⁵개의 마우스 흑색종 세포주 B16(PerkinElmer 제공)의 세포 현탁액을 C57BL/6J 마우스(암컷, 6-8주령, 지난 펑웨(朋悅) 실험동물회사에서 구입) 중 (Overwijk & Restifo, 2001)에 피하 주사하였다. 종양이 이식된지 약 5일 후 국부적 방사선 요법(종양 주사 영역, 10 Gy)을 사용하였다. 6일째 및 14일째에 용매 또는 β-1,3/1,6-글루칸(꼬리 정맥 주사, 주 1회)을 투여하고, 17일째에 동물을 죽인 후 종양 질량을 검출하였다. 동물을 죽인 후 심장에서 혈액을 채취하여 EDTA-항응고 튜브에 넣고 균일하게 혼합한 후 50 μl 전혈을 채취하여 혈액 분석기로 면역 세포 농도를 검출하였다.

도 8-15에 도시된 바와 같이, 방사선 요법은 종양을 저항하는 동시에 동물 체내의 면역 세포 농도를 낮추어, 마우스의 생존 상태에 불리한 반면, β-1,3/1,6-글루칸은 면역 자극제로 면역 세포를 자극하여 면역 세포 농도를 높이는 효과를 일으켜 방사선 요법의 부작용을 효과적으로 감소시킬 수 있다.

14일째에, 동물을 죽인 후 심장에서 혈액을 채취하여 EDTA-항응고 튜브에 넣고 균일하게 혼합한 후 50 μl 전혈을 채취하고, 각 샘플에 5 μl의 GFP 마이크로스피어를 첨가하여 적혈구 용해를 수행하였다.

차단 완충액(20 % FBS, 1:100 CD16/CD32 항체 및 1:100 랫트 IgG)으로 단일 세포 현탁액을 20분 동안 차단하고, 4 ℃의 온도에서 대응되는 면역 세포 표면 단백질 항체(CD4-BV510, CD8-PerCP-Cy5.5, CD19-APC)로 30분 동안 배양하고 염색하였다. FACS Arial III(BD Biosciences)를 통해 면역 세포 군체의 비율을 분석하였다. 구체적인 과정은 FSC/SSC 사분면에서 세포 군체를 묘사하고, FSC-H와 FSC-A를 통해 단일 세포 군체를 묘사하며, 면역 세포 표면 마커를 통해 해당 면역 세포를 묘사하고, 상대적 면역 세포 농도를 계산하는 것이다.

도 16의 결과, 방사선 요법은 CD4, CD8 및 CD19의 세포 농도를 감소시키는 반면, 8 mg/kg β-1,3/1,6-글루칸은 해당 세포의 농도를 높일 수 있어 면역 시스템을 자극하는 효과를 일으킨다.

실시예 5. 마우스 종양 모델에 대한 β-1,3/1,6-글루칸과 화학요법의 병용 적용

백혈구 및 혈소판에 대한 β-1,3/1,6-글루칸과 화학요법의 병용 효과

3x10⁵개의 마우스 흑색종 세포주 B16(PerkinElmer 제공)의 세포 현탁액을 C57BL/6J 마우스(암컷, 6-8주령, 지난 펑웨(朋悅) 실험동물회사에서 구입) 중 (Overwijk & Restifo, 2001)에 피하 주사하였다. 종양이 이식된지 약 2일 후 카보플라틴(30 mg/kg, 주 2회)를 복강 주사하고 BG136(4 mg/kg) 또는 렌티난 LNT(2 mg/kg)를 꼬리 정맥 주사한 후, 투여 기간에 종양 부피를 검출하였으며, 15일 째에 동물을 죽인 후 종양 질량을 검출하였다. 동물을 죽인 후 심장에서 혈액을 채취하여 EDTA-항응고 튜브에 넣고 균일하게 혼합한 후 50 μl 전혈을 채취하여 혈액 분석기로 면역 세포 농도를 검출하였다.

도 17-21에 도시된 바와 같이, BG136은 카보플라틴의 종양 억제 효과를 강화시킬 수 있고, 면역 반응을 자극하여 카보플라틴 투여 후의 면역 억제 및 혈소판의 감소증을 역전시킬 수 있다.

실시예 6.

면역 세포는 다양한 종양 세포 유형에서 중요한 역할을 하기 때문에 β-1,3/1,6-글루칸의 항종양, 미백 및 혈소판 증가 효과는 다양한 종양 세포(예를 들어, 폐암, 신장암, 간암, 유방암 등)에서 역할을 일으킨다.

또한 면역세포는 종양의 전이와 발생을 조절하는 역할을 하므로 β-1,3/1,6-글루칸은 종양 세포의 전이와 발생을 억제할 수 있다.

본 발명에서 언급된 모든 문헌은 모두 본 발명에 참조로서 인용되고, 각 문헌이 참조로서 독립적으로 인용되는 바와 같다. 이 밖에, 이해해야 할 것은, 본 발명의 상기 교시 내용을 열독한 후, 본 기술분야의 기술자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 수정을 수행할 수 있고, 이러한 등가 형태는 마찬가지로 본 발명의 첨부된 청구보호범위에 의해 한정된 범위에 포함된다.

Claims

β-1,3/1,6-글루칸의 적용에 있어서,
상기 β-1,3/1,6-글루칸은 남극 갈조류에서 유래되고, 상기 β-1,3/1,6-글루칸은 약학 조성물 또는 제제를 제조하는데 사용되며, 상기 약학 조성물 또는 제제는 백혈구 및/또는 혈소판 감소증을 치료하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 β-1,3/1,6-글루칸의 적용.
제1항에 있어서,
상기 백혈구는 림프구인 것을 특징으로 하는 β-1,3/1,6-글루칸의 적용.
제1항에 있어서,
상기 약학 조성물 또는 제제는 또한 면역 관문 약물과 병용하여 적용될 수 있는 것을 특징으로 하는 β-1,3/1,6-글루칸의 적용.
제1항에 있어서,
상기 면역 관문 약물은 프로그램된 세포 사멸 1 단백질(PD-1) 길항제, 또는 PD-L1 길항제, 또는 세포 독성 T 림프구 항원(CTLA-4) 길항제, 또는 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3) 길항제, 또는 T 세포 면역글로불린-3(TIM-3) 길항제, 또는 T 세포 면역글로불린 및 ITIM 도메인 단백질(TIGIT) 길항제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 β-1,3/1,6-글루칸의 적용.
제3항에 있어서,
상기 면역 관문 약물은 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 β-1,3/1,6-글루칸의 적용.
제1항에 있어서,
상기 약학 조성물 또는 제제는 또한 적어도 하나의 화학요법제와 병용하여 적용될 수 있는 것을 특징으로 하는 β-1,3/1,6-글루칸의 적용.
제6항에 있어서,
상기 화학요법제는 세포 독성 화학요법제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 β-1,3/1,6-글루칸의 적용.
제1항에 있어서,
상기 약학 조성물 또는 제제는 또한 방사선 요법과 병용하여 적용될 수 있는 것을 특징으로 하는 β-1,3/1,6-글루칸의 적용.
제1항 내지 제8항 있어서,
상기 약학 조성물 또는 제제는 개체의 암을 치료하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 β-1,3/1,6-글루칸의 적용.
제9항에 있어서,
상기 암은 흑색종, 결장직장암, 폐암, 신장암, 간암, 유방암 중 하나 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암.