KR20220023472A - 병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩 활성 유도 및 정량분석 방법 - Google Patents
병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩 활성 유도 및 정량분석 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220023472A KR20220023472A KR1020200105227A KR20200105227A KR20220023472A KR 20220023472 A KR20220023472 A KR 20220023472A KR 1020200105227 A KR1020200105227 A KR 1020200105227A KR 20200105227 A KR20200105227 A KR 20200105227A KR 20220023472 A KR20220023472 A KR 20220023472A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- alpha
- synuclein
- pathogenic
- aggregates
- reaction
- Prior art date
Links
- 102000003802 alpha-Synuclein Human genes 0.000 title claims abstract description 159
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 title claims abstract description 159
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 79
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 45
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 29
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 26
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 26
- 208000032859 Synucleinopathies Diseases 0.000 claims description 17
- JADVWWSKYZXRGX-UHFFFAOYSA-M thioflavine T Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=[N+](C)C2=CC=C(C)C=C2S1 JADVWWSKYZXRGX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- 208000009829 Lewy Body Disease Diseases 0.000 claims description 11
- 201000002832 Lewy body dementia Diseases 0.000 claims description 11
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 11
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 claims description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 102000019355 Synuclein Human genes 0.000 claims description 2
- 108050006783 Synuclein Proteins 0.000 claims description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 claims description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 30
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 10
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 4
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 3
- 206010061592 cardiac fibrillation Diseases 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002600 fibrillogenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004558 lewy body Anatomy 0.000 description 3
- 102200036626 rs104893877 Human genes 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 2
- 208000001089 Multiple system atrophy Diseases 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007082 Aβ accumulation Effects 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 1
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 210000004002 dopaminergic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 208000018620 early-onset Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000008316 intracellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000006432 protein unfolding Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 102200036624 rs104893875 Human genes 0.000 description 1
- 102200036620 rs104893878 Human genes 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/0078—Testing material properties on manufactured objects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
- G01N33/552—Glass or silica
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
-
- G01N2033/0088—
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
본 발명은 병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩 활성 유도 및 정량 분석방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료에 기질인 비병원성 재조합 알파-시누클린 단량체, 글래스 비드(glass bead) 및 형광염료(fluorescent dye)를 첨가하고 진탕 반응시키면서 실시간 형광신호를 검출하는 단계를 포함하는 병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩 활성 유도 및 정량화 방법에 관한 것이며, 또한 본 발명은 시누클린병증의 치료제를 스크리닝하는 방법 및 의료도구용 소독제의 병원성 알파-시누클린 응집체에 대한 불활성화 정도를 정량 분석하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩 활성(seeding activity)을 유도하고 이를 정량적으로 분석하는 방법에 관한 것이다.
시누클린병증으로는 파킨슨병, 루이소체치매, 다계통위축증 등이 있으며, 알파-시누클린 단백질 응집체의 뇌내 침착이 대표적인 병리학적 특징을 갖는 질환으로 알려져 있다.
대표적인 시누클린병증인 파킨슨병의 경우, 알츠하이머병 다음으로 흔히 발생하는 신경퇴행성질환으로 60세 이상 인구에서 유병률이 1%정도에 이르고, 이후 연령 증가에 따라 그 유병률이 크게 증가하며 향후 고령화와 맞물려 사회 경제적으로 큰 부담을 야기할 질환 중 하나로 여겨지고 있다.
또한, 파킨슨병(Parkinson' disease) 환자의 경우, 질환의 전개과정에 따라 뇌의 흑질영역 내 도파민성 신경세포의 심각한 퇴화(약 70~80%)가 관찰되며, 이들 신경세포 내에는 루이소체(Lewy bodies)라고 하는 단백질의 비정상적 침착이 확인되는 것으로 알려져 있고, 도파민 세포가 퇴화하는 정확한 원인은 아직까지 밝혀지지 않고 있지만, 알파-시누클린(α-synuclein)이 루이소체를 구성하는 주요 성분으로 밝혀지면서 알파-시누클린의 아밀로이드 형성 및 축적을 제어하고, 그에 따른 세포사멸의 억제를 통한 치료제 개발이 큰 관심을 받고 있다.
특히 알파-시누클린(α-synuclein)은 파킨슨병 가계에서 관찰되는 돌연변이성으로 밝혀진 첫 번째 단백질로서, 알파-시누클린의 대표적인 돌연변이 형태인 A30P, A53T 및 E46K의 경우, 조기발병 파킨슨병의 위험인자로 알려지고 있다. 또한, 이 단백질을 형질전환 마우스 또는 초파리(Drosophila)에서 과발현시킬 경우, 파킨슨병 환자에서와 같이 도파민 세포의 선택적 손상을 동반한 운동능력 저하를 보이며, 초파리의 경우에는 신경세포 내에서 섬유상 단백질 침착이 관찰된다. 이러한 사실들로부터 알파-시누클린이 파킨슨병과 밀접한 관련이 있음을 확인할 수 있다. 또한 알파-시누클린은 본래 '천연의 비접합(natural unfolded)' 구조를 가지고 있으나, 자가조립(self-assembly)되어 섬유화(fibrillation)를 거쳐 아밀로이드(amyloid)를 형성하고, 형성된 아밀로이드는 교차 β쉬트(cross β sheet) 구조를 보임으로써 단백질들이 섬유축에 대해 직각으로 위치하는 것으로 알려져 있다. 또한, 아밀로이드는 단백질 접힘(folding)과 풀어짐(unfolding) 과정에 의해 형성되는 구조물로서 일종의 단백질이 무질서 상태에서 질서상태로의 전이(disorder-to-order transition)된 산물이며, 아밀로이드 형성은 여러 리간드 결합 연구를 통하여 생화학적으로 특이한 현상임이 보고되어 왔다. 이러한 단백질의 섬유화(fibrillation)는 구별되는 입체배치를 가지는 다양한 형태이성질체를 생산하며, 생산된 형태이성질체는 특정한 생물학적 특성을 가질 수 있으며 이는 시누클린병증의 다양한 표현형(파킨슨병↔루이소체치매↔다계통위축증)과 연관되어 있다고 볼 수 있다.
최근의 연구결과에 따르면 알파-시누클린 응집체(아밀로이드)는 변형프리온단백질과 유사하게 뇌에서 자가 촉매적 방식으로 증식하며(auto-catalytic self-propagation), 신경 세포 사이를 건너 확산할 수 있음이 밝혀지고 있다. 알파-시누클린 응집체의 이러한 특징이 프리온과 유사하다고 하여 프리온 유사 특징(prion-like properties)이라고 부른다. 이러한 알파-시누클린 응집체의 특성을 적절히 활용하면 시험관에서 알파-시누클린 응집체의 씨딩(seeding) 활성을 유도하고 이를 정량적으로 분석할 수 있으며, 이는 다양한 분야에 적용이 가능하다.
이에 본 발명자들은 시험관 내에서 알파-시누클린 응집체의 자가 촉매적 증식 특성을 이용, 시료 내 씨딩(seeding) 활성이 있는 병원성 알파-시누클린 응집체를 정량적으로 측정할 수 있는 방법을 최초로 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
그러므로 본 발명의 목적은 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체의 씨딩 활성을 유도하고 이를 정량적으로 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 시누클린병증의 치료후보물질을 신속하게 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 의료기구용 소독제의 병원성 알파-시누클린 응집체에 대한 불활성화 정도를 정량분석하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 미량의 시료에 재조합 알파-시누클린 단량체, 글래스 비드(glass bead) 및 형광염료(fluorescent dye)를 첨가하고 진탕 반응시키면서 실시간 형광신호를 검출하는 단계를 포함하는, 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체의 시험관 내 씨딩 활성(seeding activity) 유도 및 정량화하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 뇌 균질액, 뇌척수액, 혈액, 혈장, 혈청 및 조직으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료는 완충 희석액으로 균질화시키고 다시 상기 완충 희석액으로 10-1~10-10의 희석배수로 희석된 시료를 사용하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 알파-시누클린 단량체는 상기 진탕 반응을 위한 총 반응액에 대하여 8uM~12uM 의 농도가 되도록 첨가하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 글래스 비드(glass bead)는 1.0~1.25mm의 직경을 갖는 글래스 비드를 4개 사용하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광염료는 상기 진탕 반응을 통해 시험관 내에서 증폭된 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체에 결합하는 티오플라빈 T(Thioflavin T)시약을 사용하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 진탕 반응은 37℃의 온도에서 350~450rpm의 속도로 1분간 교반 및 1분간 정지를 40시간~75시간까지 연속적으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 정량 분석은 완충 희석액으로 10-1~10-10의 희석배수로 희석된 각 시료에서의 증폭된 알파-시누클린 응집체에 대한 실시간 형광신호를 측정하여 반응물(reaction mixtures)이 들어있는 테스트 웰(test wells) 중 50%에서 씨딩 활성이 관찰되는 median seeding dose(SD50)로 제시되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은, (1) 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료에 후보물질과 함께 기질인 재조합 알파-시누클린 단량체, 글래스 비드(glass bead) 및 형광염료(fluorescent dye)를 첨가하고 진탕 반응시켜 증폭된 병원성 알파-시누클린에 대한 실시간 형광신호를 검출하는 단계; 및 (2) 상기 형광신호를 검출하여, 후보물질을 처리하지 않고 반응시킨 대조군의 형광신호와 비교하는 단계를 포함하는, 시누클린병증의 치료제를 신속하게 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 대조군의 형광신호에 비해 후보물질을 첨가한 군에서의 형광신호가 감소된 경우, 상기 후보물질은 알파-시누클린 응집체의 자가 촉매적 증식 억제를 통해 시누클린병증을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로 판단하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 알파-시누클린 단량체는 상기 진탕 반응을 위한 총 반응액에 대하여 8uM~12uM 의 농도가 되도록 첨가하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 글래스 비드(glass bead)는 1.0~1.25mm의 직경을 갖는 글래스 비드를 4개 사용하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광염료는 상기 진탕 반응을 통해 시험관 내에서 증폭된 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체에 결합하는 티오플라빈 T(Thioflavin T)시약을 사용하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 진탕 반응은 37℃의 온도에서 350~450rpm의 속도로 1분간 교반 및 1분간 정지를 40시간~75시간까지 연속적으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 시누클린병증은 파킨슨병, 루이소체 치매 또는 다계통위축증일 수 있다.
또한 본 발명은, 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료에 노출된 의료기구에 대한 소독제의 효능 평가에 활용될 수 있다. 이를 위해 적절한 의료기구 유래물(예: 통상적인 의료기구와 동일한 재질의 수술용 바늘을 작게 자른 조각)을 뇌유제에 노출시킨 후 다시 검사 대상 소독제에 노출시킨다. 이후 의료기구 유래물을 재조합 알파-시누클린 단량체, 글래스 비드(glass bead) 및 형광염료(fluorescent dye)와 함께 반응물(reaction mixture)를 구성한 후, 진탕 반응시켜 증폭된 병원성 알파-시누클린에 대한 실시간 형광신호를 검출하는 단계를 포함하는, 의료도구용 소독제의 병원성 알파-시누클린 응집체에 대한 불활성화 정도를 정량적으로 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 병원성 알파-시누클린(alpha- synuclein) 응집체를 포함하는 시료는 완충 희석액으로 균질화시키고 다시 상기 완충 희석액으로 10-1~10-10의 희석배수로 희석된 시료를 사용하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비병원성 재조합 알파-시누클린은 상기 진탕 반응을 위한 총 반응액에 대하여 8uM~12uM 의 농도가 되도록 첨가하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 글래스 비드(glass bead)는 1.0~1.25mm의 직경을 갖는 글래스 비드를 4개 사용하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광염료는 상기 진탕 반응을 통해 시험관 내에서 증폭된 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체에 결합하는 티오플라빈 T(Thioflavin T)시약을 사용하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 진탕 반응은 37℃의 온도에서 350~450rpm의 속도로 1분간 교반 및 1분간 정지를 40시간~75시간까지 연속적으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명은 알파-시누클린 응집체의 자가 촉매적 방식의 증식 특성을 이용하여 시험관 내에서 이들의 씨딩 활성(seeding activity)을 유도하고, 이를 정량적으로 분석할 수 있는 방법을 개발한 것으로, 파킨슨병과 같은 시누클린병증 질환을 고감도로 정확하게 진단할 수 있는 방법을 제공할 수 있으며, 시누클린병증 질환에 대한 새로운 신약 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있고, 나아가 소독제의 알파-시누클린 응집체의 증식 불활성화 효능을 정량적으로 평가하는 방법으로도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 병원성 알파-시누클린 응집체가 뇌에서 자가 촉매적 방식으로 증식(auto-catalytic self-propagation)하는 과정에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 알파-시누클린 응집체의 시험관 내 씨딩(seeding) 활성 유도 및 실시간 확인 과정을 모식화하고, 그 전형적인 결과를 제시한다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 있어서 루이소체 치매 환자 유래 뇌조직 균질물에 대한 각 희석배수별 희석액을 이용하여 증폭한 알파-시누클린 응집체를 검출한 결과를 나타낸 것으로, 해당 뇌조직 내 병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩역가(seeding titre)는 108.45 SD50/g 이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 있어서 12개월령 G2-3 마우스 유래 뇌조직 균질물에 대한 각 희석배수별 희석액을 이용하여 증폭한 알파-시누클린 응집체를 검출한 결과를 나타낸 것으로, 해당 뇌조직 내 병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩 역가(seeding titre)는 109.45 SD50/g 이다.
도 5은 본 발명의 일실시예에 있어서 알파 시누클린의 시험관 내 씨딩(seeding) 활성 유도 반응을 각기 다른 온도에서 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 있어서 알파 시누클린의 시험관 내 씨딩(seeding) 활성 유도 반응을 각기 다른 기질 농도에서 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 있어서 알파 시누클린의 시험관 내 씨딩(seeding) 활성 유도 반응을 글래스 비드 수를 달리하여 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 알파-시누클린 응집체의 시험관 내 씨딩(seeding) 활성 유도 및 실시간 확인 과정을 모식화하고, 그 전형적인 결과를 제시한다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 있어서 루이소체 치매 환자 유래 뇌조직 균질물에 대한 각 희석배수별 희석액을 이용하여 증폭한 알파-시누클린 응집체를 검출한 결과를 나타낸 것으로, 해당 뇌조직 내 병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩역가(seeding titre)는 108.45 SD50/g 이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 있어서 12개월령 G2-3 마우스 유래 뇌조직 균질물에 대한 각 희석배수별 희석액을 이용하여 증폭한 알파-시누클린 응집체를 검출한 결과를 나타낸 것으로, 해당 뇌조직 내 병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩 역가(seeding titre)는 109.45 SD50/g 이다.
도 5은 본 발명의 일실시예에 있어서 알파 시누클린의 시험관 내 씨딩(seeding) 활성 유도 반응을 각기 다른 온도에서 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 있어서 알파 시누클린의 시험관 내 씨딩(seeding) 활성 유도 반응을 각기 다른 기질 농도에서 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 있어서 알파 시누클린의 시험관 내 씨딩(seeding) 활성 유도 반응을 글래스 비드 수를 달리하여 수행한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 알파-시누클린 응집체의 자가 촉매적 증식 특성을 이용, 미량의 응집체를 시험관 내에서 증폭하고, 이를 통해 씨딩(seeding) 활성이 있는 병원성 응집체를 정량적으로 측정할 수 있는 방법을 제공함에 특징이 있다.
알파-시누클린(alpha-synuclein)은 본래는 '천연의 비접힘(natural unfolded)' 구조를 가지고 있으나, 자가조립(self-assembly)되어 섬유화(fibrillation)를 거쳐 아밀로이드(amyloid)를 형성하며 이러한 아밀로이드의 형성과 축적은 다양한 퇴행성 뇌질환의 발병과 직접적인 원인물질로 밝혀지고 있다.
한편, 변형프리온은 단백질성 감염성 입자로서 열, 자외선, 소독물질, pH의 변화 등 외부환경에 대단히 강한 내성을 가지고 있어 바이러스를 포함한 일반적인 미생물의 소독 방법으로는 불활화가 쉽지 않다.
이러한 변형프리온은 건강한 사람이나 동물의 신체 구석구석에서 발견되는 정상적인 프리온 단백질에서 만들어진다. 그러나 감염물질 또는 병변부위에서 발견되는 변형프리온은 정상 프리온 단백질과는 구조가 다르며, 단백질분해효소(protease)에 의해 잘 분해되지 않는 변형된 단백질로 존재한다.
변형프리온은 정상적인 프리온 단백질에 결합하여 정상 구조를 비정상적인 구조를 갖는 단백질로 변형시키고, 이러한 과정이 반복됨으로써 단백질 응집체(아밀로이드 섬유화)를 형성하면서 성장하게 된다. 이러한 단백질 응집체는 세포 내 기전에 의해 작은 상태로 분해되고 다시 단백질 응집체의 성장을 촉진시키는 자가 촉매적 방식으로 증식되는 것으로 알려져 있다(도 1 참조).
시누클린 병증에서 관찰되는 알파-시누클린 응집체도 변형된 프리온과 유사하게 뇌에서 자가 촉매적 방식으로 뇌에서 증식한다(프리온-유사 특성).
한편, 이러한 알파-시누클린 응집체의 뇌내 침착을 특징으로 하는 시누클린병증은 아직까지 효과적으로 치료할 수 있는 치료제가 개발되지 못하고 있는 실정이며, 신뢰성 있는 실험실적 진단기술도 없는 실정이다. 게다가 시누클린병증 환자의 뇌를 수술한 의료도구의 경우, 병원성 알파-시누클린에 오염될 수 있으며, 기존의 소독제로 소독을 한다고 할지라도 이러한 씨딩(seeding) 활성이 얼마나 제거되었는지를 확인할 수 있는 방법이 전무한 실정이다.
이러한 점에서 본원발명은 씨딩 활성이 있는 병원성 알파-시누클린의 시험관 내 증폭 및 이의 정량적 분석 방법을 개발하였고, 이러한 방법은 시누클린병증 치료 후보 물질의 신속하게 스크리닝할 수 있는 방법의 개발 및 실제 환자 적용 시 환자의 반응 정도, 치료제 처리에 따른 질병 증상의 개선 또는 치료효능에 관한 정보를 제공하는 방법에도 활용될 수 있다.
구체적으로 본 발명은, 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료에 재조합 알파-시누클린 단량체, 글래스 비드(glass bead) 및 형광염료(fluorescent dye)를 첨가하고 진탕 반응시키면서 실시간 형광신호를 검출하는 단계를 포함하는, 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체의 씨딩 활성을 정량 분석하는 방법을 제공한다.
여기서 상기 시료는 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 뇌 균질액, 뇌척수액, 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직일 수 있으며, 또는 시험관 내에서 병원성 알파-시누클린 응집체를 포함하고 있는 용액도 포함될 수 있다.
또한, 상기 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체는 상기 시료 내에 극미량으로 포함된 상태일 수도 있다.
본 발명에 따른 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체의 증폭 및 정량 분석을 위해, 먼저 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료를 준비하는데, 상기 시료가 조직인 경우 버퍼완충액을 이용하여 상기 조직을 균질화시켜 균질물을 제조한 후, 상기 균질물을 다시 버퍼완충액(버퍼희석액)을 이용하여 연속 희석시키는데, 10-1~10-10의 희석배수로 희석된 시료의 형태로 준비한다.
그런 뒤 상기 희석된 시료에 재조합 알파-시누클린 단량체, 글래스 비드(glass bead) 및 형광염료(fluorescent dye)를 첨가하여 반응액을 제조한 후, 이를 플레이트에 첨가한 다음, 진탕 반응시켜 시험관 내에서 알파-시누클린 응집체를 증폭시킨다.
여기서 상기 재조합 알파-시누클린 단량체는 시중에서 판매하는 재조합 알파-시누클린 단백질을 구입하여 사용할 수 있으며, 상기 병원성 알파-시누클린에 대한 기질로 사용한 것이다. 즉, 병원성 알파-시누클린 응집체에 의해 비병원성 재조합 알파-시누클린 단량체는 병원성 알파-시누클린으로 변형되며, 단백질 응집체로 증폭되어 성장된다.
또한 이때 상기 비병원성 재조합 알파-시누클린(재조합 알파-시누클린 단량체)은 진탕 반응을 위한 총 반응액에 대하여 8uM~12uM 의 농도가 되도록 첨가하여 반응시킨다. 만일 8uM 미만의 농도 및 12uM 초과의 농도로 사용하게 될 경우, 검출 특이도 및 민감도가 낮은 문제가 있어 상기 농도로 사용하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 10uM 의 농도로 사용한다.
또한 상기 글래스 비드는 1.0~1.25mm의 직경을 갖는 글래스 비드를 각 반응 당 4개씩 사용하는 것이 좋다.
만일 글래스 비드를 4개 미만으로 사용하게 되면 검출신호가 너무 미약하여 분석이 어려운 문제점이 있고, 4개를 초과하여 사용하게 되면 비특이적 신호가 검출되어 정확한 분석이 어렵다는 문제점이 있다.
또한, 상기 형광염료는 진탕 반응을 통해 시험관 내에서 자가 촉매적 증폭 반응에 의해 증가된 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체에 결합할 수 있는 시약이라면 모두 사용 가능하며, 바람직하게는 티오플라빈 T(Thioflavin T)시약을 사용할 수 있다.
상기 진탕 반응은 37℃의 온도에서 350~450rpm의 속도로 1분간 교반 및 1분간 정지를 40시간~75시간까지 연속적으로 수행하여 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 증폭할 수 있다.
이때 상기 반응을 37℃의 온도를 벗어난 조건에서 수행하게 되면 민감도 및 특이도에서 미비한 결과를 보임으로 정확한 분석이 어렵다는 문제점이 있다.
따라서 진탕 반응 조건, 기질의 농도 및 글래스 비드의 개수는 정확한 분석결과를 얻기 위한 중요한 요소로 작용된다.
또한 병원성 알파-시누클린 응집체의 정량적 분석은 완충 희석액으로 10-1~10-10의 희석배수로 희석된 각 시료에서의 증폭된 알파-시누클린 응집체에 대한 실시간 형광신호를 측정하며, 반응물(reaction mixture)이 들어있는 테스트 웰(test wells) 중 50%에서 씨딩 활성이 관찰되는 median seeding dose(SD50)로 제시되는 씨딩역가(seeding titre)일 수 있다. 이 때 역가 계가는 바이러스 역가분석에 사용되는 Spearman karber 방법을 이용할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 상기 알파-시누클린 응집체의 병원성은 알파-시누클린 응집체의 씨딩 활성(seeding activity)이라고도 할 수 있으며, 상기 씨딩 활성(seeding activity)은 병원성 알파-시누클린의 감염력을 표현하는 지표로 사용될 수 있고, SD50 기반의 씨딩역가(seeding titre)로도 표현할 수 있다.
이러한 본 발명의 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체의 씨딩 활성을 정량 분석하는 방법은 시누클린병증의 치료제를 스크리닝하는 방법에도 활용될 수 있다.
따라서 본 발명은, (1) 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료에 후보물질과 함께 재조합 알파-시누클린 단량체, 글래스 비드(glass bead) 및 형광염료(fluorescent dye)를 첨가하고 진탕 반응시켜 증폭된 병원성 알파-시누클린에 대한 실시간 형광신호를 검출하는 단계; 및 (2) 상기 형광신호를 검출하여, 후보물질을 처리하지 않고 반응시킨 대조군의 형광신호와 비교하는 단계를 포함하는, 시누클린병증 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 대조군의 형광신호에 비해 후보물질을 첨가한 군에서의 형광신호가 감소된 경우, 또는 상기 기술한 바와 같이 SD50으로 표현되는 씨딩역가(seeding titre)가 감소한 경우, 상기 후보물질은 알파-시누클린 응집체의 자가 촉매적 증식 억제를 통해 시누클린 병증을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로 판단할 수 있다.
또한 본 발명은 시누클린병증의 치료제에 대한 치료 효능을 정량적으로 분석하여, 시누클린병증의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법도 제공할 수 있다.
구체적으로, 약물 투여 후, 환자로부터 수득한 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료에 재조합 알파-시누클린 단량체, 글래스 비드(glass bead) 및 형광염료(fluorescent dye)를 첨가하고 진탕 반응시켜 증폭된 병원성 알파-시누클린에 대한 실시간 형광신호를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
이때 약물 투여 이전에 수득한 시료를 이용한 분석결과와 약물 투여 후 수득한 시료를 이용한 분석결과를 비교하여, 약물 투여에 따른 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체의 씨딩 활성 용량을 확인함으로써 약물 투여에 따른 치료 효과 또는 질환의 진행 정도를 진단할 수 있는 정보를 제공할 수 있다.
나아가 본 발명은 의료도구용 소독제의 병원성 알파-시누클린 응집체에 대한 불활성화를 정량 분석하는 방법을 제공할 수 있다.
수술과정에서 수술도구는 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료에 노출될 수 있다. 이러한 수술도구에 남아있는 병원성 알파-시누클린 응집체를 완전하게 소독 및 멸균(즉, 씨딩 활성 제거)하는 것은 매우 중요하다.
한편, 현재 사용되고 있는 소독제들의 경우, 실제적으로 병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩 활성을 얼마나 제거하는 효능이 있는지 정량적으로 평가할 수 있는 방법이 없다.
그러나 본 발명에서는 의료도구용 소독제의 병원성 알파-시누클린 응집체에 대한 소독 및 멸균 정도를 정량적으로 분석할 수 있는 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명에 따른 상기 방법은, 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료에 의료기구 유래물(예컨대: 통상 의료기구와 동일한 재질의 수술용 바늘을 작게 자른 조각)을 노출시킨 후 다시 상기 의료기구 유래물을 검사 대상 소독제에 노출시킨다. 이후 의료기구 유래물을 재조합 알파-시누클린 단량체, 글래스 비드(glass bead) 및 형광염료(fluorescent dye)와 함께 반응물(reaction mixture)를 구성한 후, 진탕 반응시켜 증폭된 병원성 알파-시누클린에 대한 실시간 형광신호를 검출한다.
여기서 상기 노출은 상기 시료 또는 검사 대상 소독제와의 접촉을 의미하는 것으로, 상기 시료 또는 검사 대상 소독제가 액체인 경우, 분무 또는 침지시켜 노출시킬 수 있다.
상기 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료는 앞서 기술한 바와 같이, 완충 희석액으로 균질화시키고 다시 상기 완충 희석액으로 10-1~10-10의 희석배수로 희석된 시료를 사용할 수 있고, 재조합 알파-시누클린 단량체, 글래스 비드 및 형광염료도 상기 기술된 바와 같다.
상기 진탕 반응은 37℃의 온도에서 350~450rpm의 속도로 1분간 교반 및 1분간 정지를 40시간~75시간까지 연속적으로 수행할 수 있다.
또한 상기 정량 분석은 완충 희석액으로 10-1~10-10의 희석배수로 희석된 각 시료에서의 증폭된 알파-시누클린 응집체에 대한 실시간 형광신호를 측정하여median seeding dose(SD50)로 표현되는 제시되는 씨딩역가(seeding titer)로 산출되는 것일 수 있다.
이렇듯 본 발명에 따른 의료도구용 소독제의 효능 평가는 병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩 활성 역가(Seeding activity titer) 분석을 통해 병원성 알파-시누클린 응집체의 불활화되는 정도를 정량적으로 제시할 수 있으므로 종래 제시된 바 없는 수술도구용 또는 의료기기용 소독제의 효능평가를 위한 새로운 지표를 제공할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<준비예>
장비 및 시료 준비
(1) 사용 장비
FLUOstar Omega plate reader(BMG Labtech) 기기를 사용하였다.
(2) 시료 준비
하기와 같은 뇌조직 시료를 수득하여 사용하였다.
-루이소체 치매(Lewy body dementia) 환자의 뇌 조직
-시누클린병증이 없는 인간 뇌 조직
-A53T돌연변이 인간 알파-시누클린을 발현하는 G2-3 마우스 유래 뇌조직
-비형질전환된 한 배에서 태어난 대조군 마우스 유래 뇌조직
(3) 시료의 균질화(homogenization)
상기 뇌조직을 프로테아제(protease) 및 포스파타제 억제제(phosphatase inhibitors)가 포함된 PBS 용액을 이용하여 10%(w/v)로 균질화시켰다. 이후 10%의 균질물을 Precellys 24 균질화기(Precellys 24 homogenizer)를 이용하여 균질화시키고 2,000g에서 2분 동안 원심분리한 후, 10ul씩 분주하여 -80℃에 보관하였다.
(4) 뇌조직의 균질물에 대한 연속 희석액 제조
상기 제조한 각 뇌조직의 균질물에 대해서는 하기와 같은 방법으로 10-8이 될 때까지 각 조직의 희석액을 제조하였다.
10% [10-1] -> 1%[10-2]) 4ul 10% BH + PBS 36ul
1% [10-2] -> 0.1%[10-3]) 4ul 1% BH + PBS 36ul
0.1% [10-3] -> 0.01%[10-4]) 4ul 0.1% BH + PBS 36ul
0.01% [10-4] -> 0.001%[10-5]) 4ul 0.01% BH + PBS 36ul
0.001% [10-5] -> 0.0001%[10-6]) 4ul 0.001% BH + PBS 36ul
0.0001% [10-6] -> 0.00001% [10-7]) 4ul 0.0001% BH + PBS 36ul
0.00001% [10-7] -> 0.000001% [10-8]) 4ul 0.00001% BH + PBS 36ul
(5) 기질인 재조합 알파-시누클린의 준비
전장 야생형 재조합 인간 알파-시누클린 및 전장 A53T 돌연변이 인간 알파-시누클린 단백질은 분말형태로 시중에 판매되는 것을 구입하여 사용하였다(제조사: rPeptide, 전장 야생형 제품번호: S-1001, 전장 A53T 돌연변이: S-1002). 실험 시에는 상기 분말 형태의 단백질을 최종 농도 100uM이 되도록 증류수를 이용하여 용해시켜 사용하였고, 용해된 단백질 용액은 여과지를 사용하여 여과 후 사용하였으며 실험 직전까지 냉장상태로 보관하였다.
(6) ThT(thioflavin T) 스탁 준비
0.032g의 ThT를 10ml의 증류수를 이용하여 빛이 없는 후드 내에서 녹여 10mM ThT 용액을 제조하였다. 이후 볼텍싱 후, 0.22um 여과지를 이용하여 필터링하였고, 여과된 용액은 알루미늄 호일로 싸서 암 조건의 4℃ 온도에서 보관하였다. 이후 사용 전에는 상기 10mM ThT 용액을 1mM 용액이 되도록 희석하여 사용하였고, 암 조건(알루미늄 호일로 쌈)의 콜드룸(cold room)에 보관하였다.
<실시예 1>
병원성 알파 시누클린 응집체의 시험관 내 씨딩 활성 유도를 통한 증폭
본 발명자들은 상기 재료 준비과정에서 병원성 알파 시누클린 응집체를 포함하는 병변부위의 뇌조직을 대상으로, 하기와 같이 뇌조직에 함유된 미량의 알파 시누클린 응집체를 시험관 내에서 증폭시켰고, 병원성 알파 시누클린 응집체에 대한 씨딩 활성(seeding activity)을 정량 분석하였으며, 전체적인 실험모식도는 도 2에 나타내었다.
이를 위해, 먼저 96웰 플레이트의 웰 각각에는 하기 표 1과 같은 반응액을 각각 분주하였고, 여기서 알파-시누클린 함유 뇌조직 균질물은 상기 준비예의 각 뇌조직의 균질물에 대한 각각의 희석액을 사용하였다.
| 성분 | 함량 |
| 글래스 비드(1.0~1.25mm; 직경) | 웰당 4개 |
| 증류수 | 67㎕ |
| Sorenson’s 버퍼(pH 8.2) | 20㎕ (최종 0.1M) |
| 기질(100uM 재조합 a-syn) | 10㎕ (최종: 10uM) |
| 1mM ThT | 1㎕ (최종: 10uM) |
| seeds: 알파-시누클린 응집체 함유 뇌조직 균질물 | 2㎕ |
또한, 상기 성분들이 포함된 최종 반응액은 Tris-HCl(2.86 mM) 및 NaCl(14.5mM)이 포함되도록 하였다.
각 플레이트 웰에 상기 반응액을 분주한 다음, FLUOstar Omega plate reader 기기를 이용하여 진탕하면서 반응을 수행하였는데, 이때 상기 진탕은 1분 동안 흔들고 1분 동안 정지하는 과정을 반복 수행하였고, 400rpm의 교반속도에서 37℃의 온도를 유지하면서 진탕반응 시켰다.
이후, 각 웰에서 반응에 의한 형광신호 검출은 FLUOstar Omega plate reader 기기를 이용하여 검출하였는데, 이때 440nm의 Excitation filter 및 480nm의 Emission filter 파장 조건에서 확인하였고, 진탕 반응 매 1시간 마다 형광신호를 측정하였다.
분석 결과, 도 2의 우측 결과의 그래프로 나타낸 바와 같이, 루이소체치매 환자 유래 뇌조직 균질물의 희석액을 시료로 사용하여 분석한 결과, 최대 10-8까지 희석한 시료에서도 알파-시누클린 응집체를 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다. 따라서 이러한 결과는 본 발명의 방법을 사용할 경우, 극미량의 알파-시누클린 응집체를 고감도로 검출가능하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 2>
본 발명의 방법에 따른 알파 시누클린 응집체의 씨딩 역가(SD
50
)분석
상기 실시예 1를 통해 본 발명자들은 본 발명의 방법을 통해 미량의 병원성알파-시누클린 응집체를 시험관에서 증폭할 수 있음을 확인하였고, 실제적으로 알파-시누클린 응집체의 씨딩 활성을 정량화 할 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
반응물(reaction mixture)이 들어있는 테스트 웰(test wells) 중 50%(예: 4개의 test wells 중 2개)에서 씨딩 활성이 관찰되는 median seeding dose(SD50)를 spearman karber 분석법을 이용하여 산출하고, SD50기반의 씨딩역가(seeding titre)로 제시한다.
이를 위해 루이소체 치매 환자(99/20)의 시상(thalamus) 부위 유래 뇌조직 및 12개월령 G2-3 mouse(216) 유래 뇌조직을 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 증폭 및 형광검출을 수행하였고, 바이러스 역가분석에 사용되는 Spearman karber 방법을 이용하여 알파-시누클린 응집체의 씨딩 활성을 정량화하였다. 씨딩 활성은 반응물(reaction mixture)이 들어있는 테스트 웰 중 50%에서 증폭이 관찰되는 씨딩 활성도(SD50)로 제시하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 루이소체 치매 환자(99/20)의 시상(thalamus) 부위 유래 뇌조직에 존재하는 알파-시누클린 응집체의 씨딩 역가(seeding titre)는 108.45 SD50/g 조직인 것으로 나타났다.
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 2개월령 G2-3 mouse(216) 유래 뇌조직에 존재하는 알파-시누클린 응집체의 씨딩 역가(seeding titre)는 109.45 SD50/g 조직인 것으로 나타났다.
<실시예 3>
알파 시누클린 응집체의 시험관내 씨딩 활성 유도 및 정량적 분석을 위한 최적의 반응조건 확립
나아가 본 발명자들은 상기 실시예 1에 의한 본 발명의 분석방법을 확립하기 위한 다양한 조건에서는 분석을 수행하였다. 이는 최적의 분석조건을 확립하기 위한 것으로 반응온도, 기질(재조합 알파-시누클린 단량체) 농도 및 비드 조건을 각기 달리한 상황에서 정량분석을 수행하였다.
<3-1> 최적의 반응온도 확립
G2-3 마우스 뇌조직의 균질물에 대한 희석액을 씨드(seeds)로 사용하여 각기 다른 온도 조건(30℃, 33.5℃, 37℃)에서 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 시험관 내 증폭을 수행하였고 형광검출을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 37℃의 온도에서 수행한 결과와 비교하여 30℃에서 수행한 결과는 형광검출 값이 미비하여 매우 낮은 민감도를 보이는 것으로 나타났고, 33.5℃는 특이도에서 큰 이점은 없고 민감도는 오히려 저하되는 결과를 나타내었다. 한편, 37℃의 온도에서 수행한 결과는 30℃ 및 33.5℃ 보다 높은 특이도 및 높은 민감도를 보이는 것으로 나타남에 따라, 최적의 반응온도는 37℃라는 것을 알 수 있었다.
<3-2> 최적의 기질 농도 확립
최적의 기질농도를 확립하기 위해, 루이소체치매 환자 유래 뇌조직의 균질물에 대한 희석액을 씨드(seeds)로 사용하고, 서로 다른 농도의 기질(재조합 알파-시누클린 단량체; 10uM, 5uM, 2.5uM)을 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 시험관 내 증폭을 수행하였고 형광검출을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 10uM의 기질농도를 처리한 군과 비교하여 기질 농도가 5uM 및 2.5uM인 경우에는 특이도 및 민감도 모두 매우 낮은 것으로 나타났다. 한편 기질농도를 10uM로 하여 수행한 군만이 우수한 특이도 및 민감도가 있음을 알 수 있었다.
<3-3> 최적의 비드 개수 확립
비드를 사용함에 있어서, 최적의 비드 조건을 확인하기 위해, 루이소체치매 환자 유래 뇌조직 균질물의 희석액을 씨드(seeds)로 사용하고, 서로 다른 조건의 비드(6개, 3개, 0개; 50mM NaCl 존재)를 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 시험관 내 증폭을 수행하였고 형광검출을 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 비드를 사용하지 않는 경우에는 형광신호의 증가가 관찰되지 않았으며, 6개의 비드를 사용한 반응에서는 30시간부터 급격한 신호 증폭이 확인되었으나 동시에 일부 대조군에서도 비특이적인 신호 증가가 관찰되었다. 3개의 비드를 사용한 반응에서는 40-50시간부터 점진적인 신호 증폭이 확인되었으나 전반적으로 형광 신호 증가가 약하였다. 비드를 넣지 않은 반응에서는 아예 형광신호의 증가가 확인되지 않았다. 따라서 이러한 결과를 통해서 볼 때, 비드는 4개를 사용하는 것이 비특이적 신호 없이 정확하게 본 발명의 형광신호를 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (21)
- 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료에 기질인 비병원성 재조합 알파-시누클린 단량체, 글래스 비드(glass bead) 및 형광염료(fluorescent dye)를 첨가하고 진탕 반응시키면서 실시간 형광신호를 검출하는 단계를 포함하는,
병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체의 시험관 내 씨딩 활성(seeding activity) 유도 및 정량화하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 시료는 뇌 균질액, 뇌척수액, 혈액, 혈장, 혈청 및 조직으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체의 시험관 내 씨딩 활성(seeding activity) 유도 및 정량화하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료는 완충 희석액으로 균질화시키고 다시 상기 완충 희석액으로 10-1~10-10의 희석배수로 희석된 시료를 사용하는 것을 특징으로 하는, 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체의 시험관 내 씨딩 활성(seeding activity) 유도 및 정량화하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 비병원성 재조합 알파-시누클린 단량체는 상기 진탕 반응을 위한 총 반응액에 대하여 8uM~12uM 의 농도가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는, 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체의 시험관 내 씨딩 활성(seeding activity) 유도 및 정량화하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 글래스 비드(glass bead)는 1.0~1.25mm의 직경을 갖는 글래스 비드를 4개 사용하는 것을 특징으로 하는, 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체의 시험관 내 씨딩 활성(seeding activity) 유도 및 정량화하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 형광염료는 상기 진탕 반응을 통해 시험관 내에서 증폭된 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체에 결합하는 티오플라빈 T(Thioflavin T)시약을 사용하는 것을 특징으로 하는, 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체의 시험관 내 씨딩 활성(seeding activity) 유도 및 정량화하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 진탕 반응은 37℃의 온도에서 350~450rpm의 속도로 1분간 교반 및 1분간 정지를 40시간~75시간까지 연속적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체의 시험관 내 씨딩 활성(seeding activity) 유도 및 정량화하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 정량 분석은 완충 희석액으로 10-1~10-10의 희석배수로 희석된 각 시료에서의 증폭된 알파-시누클린 응집체에 대한 실시간 형광신호를 측정하여 반응물(reaction mixtures)이 들어있는 테스트 웰(test wells)에 대하여 50%에서 씨딩(seeding) 활성을 보이는 희석배수를 역가(titer)로 산출하는 것을 특징으로 하는, 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체의 시험관 내 씨딩 활성(seeding activity) 유도 및 정량화하는 방법. - (1) 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료에 후보물질과 함께 기질인 비병원성 재조합 알파-시누클린 단량체, 글래스 비드(glass bead) 및 형광염료(fluorescent dye)를 첨가하고 진탕 반응시켜 증폭된 병원성 알파-시누클린에 대한 실시간 형광신호를 검출하는 단계; 및
(2) 상기 형광신호를 검출하여, 후보물질을 처리하지 않고 반응시킨 대조군의 형광신호와 비교하는 단계를 포함하는,
시누클린병증 치료제를 스크리닝하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 대조군의 형광신호에 비해 후보물질을 첨가한 군에서의 형광신호가 감소된 경우, 상기 후보물질은 알파-시누클린 응집체의 자가 촉매적 증식 억제를 통해 시누클린병증을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 시누클린병증 치료제를 스크리닝하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 비병원성 재조합 알파-시누클린 단량체는 상기 진탕 반응을 위한 총 반응액에 대하여 8uM~12uM 의 농도가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는, 시누클린병증 치료제를 스크리닝하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 글래스 비드(glass bead)는 1.0~1.25mm의 직경을 갖는 글래스 비드를 4개 사용하는 것을 특징으로 하는, 시누클린병증 치료제를 스크리닝하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 형광염료는 상기 진탕 반응을 통해 시험관 내에서 증폭된 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체에 결합하는 티오플라빈 T(Thioflavin T)시약을 사용하는 것을 특징으로 하는, 시누클린병증 치료제를 스크리닝하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 진탕 반응은 37℃의 온도에서 350~450rpm의 속도로 1분간 교반 및 1분간 정지를 40시간~75시간까지 연속적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 시누클린병증 치료제를 스크리닝하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 시누클린병증은 파킨슨병, 알츠하이머병, 루이소체 치매 또는 다발성기관위축인 것을 특징으로 하는, 시누클린병증 치료제를 스크리닝하는 방법. - 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료에 노출된 의료기구 유래물을 뇌유제에 노출시킨 후, 검사 대상의 의료도구용 소독제에 다시 노출시킨 다음, 상기 의료기구 유래물을 비병원성 재조합 알파-시누클린 단량체, 글래스 비드(glass bead) 및 형광염료(fluorescent dye)와 함께 혼합하여 반응물을 제조한 다음, 진탕 반응시켜 증폭된 병원성 알파-시누클린에 대한 실시간 형광신호를 검출하는 단계를 포함하는,
의료도구용 소독제의 병원성 알파-시누클린 응집체에 대한 불활성화 정도를 정량분석하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 병원성 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체를 포함하는 시료는 완충 희석액으로 균질화시키고 다시 상기 완충 희석액으로 10-1~10-10의 희석배수로 희석된 시료를 사용하는 것을 특징으로 하는, 의료도구용 소독제의 병원성 알파-시누클린 응집체에 대한 불활성화 정도를 정량분석하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 비병원성 재조합 알파-시누클린 단량체는 상기 진탕 반응을 위한 총 반응액에 대하여 8uM~12uM 의 농도가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는, 의료도구용 소독제의 병원성 알파-시누클린 응집체에 대한 불활성화 정도를 정량분석하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 글래스 비드(glass bead)는 1.0~1.25mm의 직경을 갖는 글래스 비드를 4개 사용하는 것을 특징으로 하는, 의료도구용 소독제의 병원성 알파-시누클린 응집체에 대한 불활성화 정도를 정량분석하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 형광염료는 상기 진탕 반응을 통해 시험관 내에서 증폭된 알파-시누클린(alpha-synuclein) 응집체에 결합하는 티오플라빈 T(Thioflavin T)시약을 사용하는 것을 특징으로 하는, 의료도구용 소독제의 병원성 알파-시누클린 응집체에 대한 불활성화 정도를 정량분석하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 진탕 반응은 37℃의 온도에서 350~450rpm의 속도로 1분간 교반 및 1분간 정지를 40시간~75시간까지 연속적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 의료도구용 소독제의 병원성 알파-시누클린 응집체에 대한 불활성화 정도를 정량분석하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200105227A KR102376482B1 (ko) | 2020-08-21 | 2020-08-21 | 병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩 활성 유도 및 정량분석 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200105227A KR102376482B1 (ko) | 2020-08-21 | 2020-08-21 | 병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩 활성 유도 및 정량분석 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220023472A true KR20220023472A (ko) | 2022-03-02 |
| KR102376482B1 KR102376482B1 (ko) | 2022-03-17 |
Family
ID=80815495
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200105227A KR102376482B1 (ko) | 2020-08-21 | 2020-08-21 | 병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩 활성 유도 및 정량분석 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102376482B1 (ko) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101956768B1 (ko) | 2016-12-30 | 2019-03-11 | 서울대학교산학협력단 | 알파-시뉴클레인 응집체의 대량 증폭방법 |
| KR20190027847A (ko) * | 2016-07-07 | 2019-03-15 | 더 유니버시티 코트 오브 더 유니버시티 오브 에딘버그 | 알파-시뉴클레인 검출 분석 및 알파-시뉴클레인병증의 진단 방법 |
| WO2019070480A1 (en) * | 2017-10-02 | 2019-04-11 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | ASSAY FOR DETECTION OF ALPHA-SYNUCLEIN SELF-ACTIVATION ACTIVITY ASSOCIATED WITH SYNUCLEINOPATHIES |
-
2020
- 2020-08-21 KR KR1020200105227A patent/KR102376482B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190027847A (ko) * | 2016-07-07 | 2019-03-15 | 더 유니버시티 코트 오브 더 유니버시티 오브 에딘버그 | 알파-시뉴클레인 검출 분석 및 알파-시뉴클레인병증의 진단 방법 |
| KR101956768B1 (ko) | 2016-12-30 | 2019-03-11 | 서울대학교산학협력단 | 알파-시뉴클레인 응집체의 대량 증폭방법 |
| WO2019070480A1 (en) * | 2017-10-02 | 2019-04-11 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | ASSAY FOR DETECTION OF ALPHA-SYNUCLEIN SELF-ACTIVATION ACTIVITY ASSOCIATED WITH SYNUCLEINOPATHIES |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HAN, JUNG-YOUN et al., ‘RT-QuIC-based detection of alpha-synuclein seeding activity in brains of dementia with Lewy Body patients and of a transgenic mouse model of synucleinopathy’, Prion, 2020, Vol.* * |
| THOMZIG, ACHIM, et al., ‘Decontamination of medical devices from pathological amyloid-β-, tau- and α-synuclein aggregates’, Acta neuropathologica communications, 2014, Vol. 2, pp 1-5. 1부.* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102376482B1 (ko) | 2022-03-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kim et al. | Caspase-cleaved tau exhibits rapid memory impairment associated with tau oligomers in a transgenic mouse model | |
| Hughson et al. | Inactivation of prions and amyloid seeds with hypochlorous acid | |
| JP4790966B2 (ja) | 構造疾患の検出方法、構造疾患マーカーのアッセイ、診断キット、構造変化調節化合物の同定方法、プリオンタンパク質の病原性形態の検出方法、及びβ−アミロイドタンパク質の病原性形態の検出方法 | |
| Means et al. | Caspase-3-dependent proteolytic cleavage of tau causes neurofibrillary tangles and results in cognitive impairment during normal aging | |
| Giles et al. | Bioassays and inactivation of prions | |
| EP3014279A2 (de) | Verfahren zur bestimmung von proteinaggregaten unter verwendung von oberflächen-fida | |
| Dučić et al. | Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis | |
| EP3260865A2 (de) | Verfahren zur behandlung von blut, blutprodukten und organen | |
| Reddy et al. | Experimental and clinical biomarkers for progressive evaluation of neuropathology and therapeutic interventions for acute and chronic neurological disorders | |
| Han et al. | Prion-like strain effects in tauopathies | |
| Lee et al. | Disease-related Huntingtin seeding activities in cerebrospinal fluids of Huntington’s disease patients | |
| Hidisoglu et al. | Alterations in spontaneous delta and gamma activity might provide clues to detect changes induced by amyloid‐β administration | |
| KR102376482B1 (ko) | 병원성 알파-시누클린 응집체의 씨딩 활성 유도 및 정량분석 방법 | |
| Kumaran et al. | DJ-1 (PARK7) is associated with 3R and 4R tau neuronal and glial inclusions in neurodegenerative disorders | |
| Moudjou et al. | Improving the predictive value of prion inactivation validation methods to minimize the risks of iatrogenic transmission with medical instruments | |
| Cross et al. | Neurotransmitter metabolites, enzymes and receptors in experimental scrapie | |
| Miller‐Rhodes et al. | URMC‐099 prophylaxis prevents hippocampal vascular vulnerability and synaptic damage in an orthopedic model of delirium superimposed on dementia | |
| Liu et al. | Detecting bioactive amyloid β peptide species in Alzheimer's disease | |
| KR101956768B1 (ko) | 알파-시뉴클레인 응집체의 대량 증폭방법 | |
| Fernandes et al. | Impact of Sterilization Methods on the Seeding Ability of Human Tau Proteopathic Seeds | |
| Secker et al. | Sensitive microscopic quantification of surface-bound prion infectivity for the assessment of surgical instrument decontamination procedures | |
| Hervé et al. | A rapid dual staining procedure for the quantitative discrimination of prion amyloid from tissues reveals how interactions between amyloid and lipids in tissue homogenates may hinder the detection of prions | |
| Hinners et al. | Tau kinase inhibitors protect hippocampal synapses despite of insoluble tau accumulation | |
| Zou et al. | Seeding Activity of Skin Misfolded Proteins as a Biomarker in Prion and Prion-Like Diseases | |
| Adams et al. | Synaptophysin is a β-Amyloid Target that Regulates Synaptic Plasticity and Seizure Susceptibility in an Alzhiemer’s Model |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |